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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022176873
(43)【公開日】2022-11-30
(54)【発明の名称】ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子及びその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/115 20100101AFI20221122BHJP
C12Q 1/6811 20180101ALI20221122BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221122BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20221122BHJP
A61P 13/08 20060101ALI20221122BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20221122BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20221122BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20221122BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221122BHJP
A61K 31/593 20060101ALI20221122BHJP
G01N 33/573 20060101ALI20221122BHJP
【ＦＩ】
C12N15/115 Z ZNA
C12Q1/6811 Z
A61P35/00
A61P11/00
A61P13/08
A61P13/12
A61P19/08
A61K31/7088
A61P43/00 121
A61K31/593
G01N33/573 A
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021197996
(22)【出願日】2021-12-06
(31)【優先権主張番号】P 2021082904
(32)【優先日】2021-05-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】515157758
【氏名又は名称】公立大学法人 富山県立大学
(71)【出願人】
【識別番号】504160781
【氏名又は名称】国立大学法人金沢大学
(71)【出願人】
【識別番号】519164415
【氏名又は名称】ＢｉｏＳｅｅｄｓ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100115255
【弁理士】
【氏名又は名称】辻丸 光一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100154081
【弁理士】
【氏名又は名称】伊佐治 創
(74)【代理人】
【識別番号】100194515
【弁理士】
【氏名又は名称】南野 研人
(72)【発明者】
【氏名】安田 佳織
(72)【発明者】
【氏名】ビヤニ マドゥ
(72)【発明者】
【氏名】ビヤニ マニッシュ
(72)【発明者】
【氏名】榊 利之
(72)【発明者】
【氏名】中島 美紀
【テーマコード（参考）】
4B063
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ79
4B063QR32
4B063QS32
4B063QX01
4C086AA01
4C086AA02
4C086DA16
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA21
4C086MA22
4C086MA24
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZA59
4C086ZA75
4C086ZA81
4C086ZA96
4C086ZB26
4C086ZC75
(57)【要約】
【課題】 ＣＹＰ２４Ａ１に特異的に結合可能な新たな核酸分子を提供する。
【解決手段】 本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、下記（ａ）のＤＮＡ鎖を含む：
（ａ）下記（ａ１）、（ａ２）又は（ａ３）のＤＮＡ鎖：
（ａ１）配列番号１～１８のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ鎖；
（ａ２）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖；
（ａ３）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖。
【選択図】 なし
【解決手段】 本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、下記（ａ）のＤＮＡ鎖を含む：
（ａ）下記（ａ１）、（ａ２）又は（ａ３）のＤＮＡ鎖：
（ａ１）配列番号１～１８のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ鎖；
（ａ２）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖；
（ａ３）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記（ａ）のＤＮＡ鎖を含む、ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子：
（ａ）下記（ａ１）、（ａ２）又は（ａ３）のＤＮＡ鎖：
（ａ１）配列番号１～１８のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ鎖；
（ａ２）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖；
（ａ３）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖。
（ａ）下記（ａ１）、（ａ２）又は（ａ３）のＤＮＡ鎖：
（ａ１）配列番号１～１８のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ鎖；
（ａ２）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖；
（ａ３）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖。
【請求項2】
さらに、キャリアを含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項3】
前記キャリアは、ミセル、リポソーム、エマルション、及びニオソームからなる群から選択された少なくとも１つである、請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項4】
請求項１から３のいずれか一項に記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む、ＣＹＰ２４Ａ１の活性抑制剤。
【請求項5】
請求項１から３のいずれか一項に記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子と、薬学的に許容される添加剤とを含む、医薬。
【請求項6】
請求項１から３のいずれか一項に記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む、肺がんの治療薬。
【請求項7】
さらに、１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３を含む、請求項６記載の肺がんの治療薬。
【請求項8】
請求項１から３のいずれか一項に記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む、前立腺がんの治療薬。
【請求項9】
請求項１から３のいずれか一項に記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む、慢性腎臓病の治療薬。
【請求項10】
請求項１から３のいずれか一項に記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む、くる病の治療薬。
【請求項11】
請求項１から３のいずれか一項に記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む、骨軟化症の治療薬。
【請求項12】
請求項１から３のいずれか一項に記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む、ＣＹＰ２４Ａ１の検出試薬。
【請求項13】
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のＣＹＰ２４Ａ１を検出する工程を含み、
前記核酸分子が、請求項１から３のいずれか一項に記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のＣＹＰ２４Ａ１と前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＣＹＰ２４Ａ１を検出することを特徴とする、ＣＹＰ２４Ａ１の検出方法。
前記核酸分子が、請求項１から３のいずれか一項に記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のＣＹＰ２４Ａ１と前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＣＹＰ２４Ａ１を検出することを特徴とする、ＣＹＰ２４Ａ１の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子及びその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
ビタミンＤを不活性化する酵素ＣＹＰ２４Ａ１に対する阻害剤として、ケトコナゾール等の低分子化合物が知られている（非特許文献１）。
【0003】
ビタミンＤは、高齢化に伴う骨や筋力低下、がんの罹患に関与していることが知られており、ビタミンＤに作用して不活化させる酵素であるＣＹＰ２４Ａ１の活性を阻害することにより、前立腺がん、慢性腎臓病、くる病、骨軟化症を治療できることが知られている（非特許文献２、３、４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】D S Loose, et al. “Ketoconazole blocks adrenal steroidogenesis by inhibiting cytochrome P450-dependent enzymes.” The Journal of Clinical Investigation, 1983;71(5):1495-1499.
【非特許文献2】Aruna V Krishnan, et al. “The role of vitamin D in prostate cancer” Recent Results in Cancer Research, Vol. 164, 2003;164:205-21
【非特許文献3】Gary H.Posner, et al. “Vitamin D analogues targeting CYP24 in chronic kidney disease” The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology Volume 121, Issues 1-2, July 2010, Pages 13-19
【非特許文献4】Xiuying Bai, et al. “CYP24 inhibition as a therapeutic target in FGF23-mediated renal phosphate wasting disorders” The Journal of Clinical Investigation, 2016;126(2):667-680.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、低分子化合物によるＣＹＰ２４Ａ１阻害剤は、特異性が低く、ＣＹＰ２４Ａ１だけでなく、例えば、ビタミンＤを体内で活性化型へ代謝する際に関与する酵素ＣＹＰ２７Ｂ１等を阻害する場合があるという問題がある。
【0006】
そこで、本発明は、ＣＹＰ２４Ａ１に特異的に結合可能な核酸分子の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子（以下、「本発明の核酸分子」ともいう）は、下記（ａ）のＤＮＡ鎖を含む：
（ａ）下記（ａ１）、（ａ２）又は（ａ３）のＤＮＡ鎖：
（ａ１）配列番号１～１８のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ鎖；
（ａ２）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖；
（ａ３）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖。
（ａ）下記（ａ１）、（ａ２）又は（ａ３）のＤＮＡ鎖：
（ａ１）配列番号１～１８のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ鎖；
（ａ２）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖；
（ａ３）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖。
【0008】
本発明のＣＹＰ２４Ａ１の活性抑制剤（以下、「活性抑制剤」ともいう）は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む。
【0009】
本発明の医薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子と、薬学的に許容される添加剤とを含む。
【0010】
本発明の肺がん治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む。
【0011】
本発明の前立腺がん治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む。
【0012】
本発明の慢性腎臓病治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む。
【0013】
本発明のくる病治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む。
【0014】
本発明の骨軟化症治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む。
【0015】
本発明のＣＹＰ２４Ａ１の検出試薬（以下、「検出試薬」ともいう）は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む。
【0016】
本発明のＣＹＰ２４Ａ１の検出方法（以下、「検出方法」ともいう）は、試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のＣＹＰ２４Ａ１を検出する工程を含み、前記核酸分子が、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子であり、前記検出工程において、前記試料中のＣＹＰ２４Ａ１と前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＣＹＰ２４Ａ１を検出する。
【発明の効果】
【0017】
本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、ＣＹＰ２４Ａ１に特異的に結合できる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【発明を実施するための形態】
【0019】
＜ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子＞
本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、下記（ａ）のＤＮＡ鎖を含む。本発明の核酸分子は、下記（ａ）のＤＮＡ鎖を含み、ＤＮＡから構成されることが特徴であり、その他の構成及び条件は、特に制限されない。本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、例えば、以下、ＤＮＡアプタマーともいう。
（ａ）下記（ａ１）、（ａ２）又は（ａ３）のＤＮＡ鎖：
（ａ１）配列番号１～１８のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ鎖；
（ａ２）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖
（ａ３）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖。
本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、下記（ａ）のＤＮＡ鎖を含む。本発明の核酸分子は、下記（ａ）のＤＮＡ鎖を含み、ＤＮＡから構成されることが特徴であり、その他の構成及び条件は、特に制限されない。本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、例えば、以下、ＤＮＡアプタマーともいう。
（ａ）下記（ａ１）、（ａ２）又は（ａ３）のＤＮＡ鎖：
（ａ１）配列番号１～１８のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ鎖；
（ａ２）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖
（ａ３）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖。
【0020】
本発明において、ＣＹＰ２４Ａ１（Cytochrome P450 family 24 subfamily A member 1）は、ＣＹＰ２４Ａ１遺伝子によりコードされる、チトクロームＰ４５０スーパーファミリーに属する酵素を意味する。ＣＹＰ２４Ａ１の由来は、例えば、ヒトでもよいし、非ヒト動物でもよい。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ等があげられる。前記ヒト由来ＣＹＰ２４Ａ１としては、例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋにアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０００７８２で登録されている塩基配列（配列番号１９）によりコードされるアミノ酸配列（配列番号２０）からなるタンパク質があげられる。
【0021】
ヒト由来ＣＹＰ２４Ａ１遺伝子（配列番号１９）
atgcctcagccgcgagaggtgccagtctgcccgctgacagctggtggcgagactcagaacgcggccgccctgccgggccccaccagctggccactgctgggcagcctgctgcagattctctggaaagggggtctcaagaaacagcacgacaccctggtggagtaccacaagaagtatggcaagattttccgcatgaagttgggttcctttgagtcggtgcacctgggctcgccatgcctgctggaagcgctgtaccgcaccgagagcgcgtacccgcagcggctggagatcaaaccgtggaaggcctatcgcgactaccgcaaagaaggctacgggctgctgatcctggaaggggaagactggcagcgggtccggagtgcctttcaaaagaaactaatgaaaccaggggaagtgatgaagctggacaacaaaatcaatgaggtcttggccgattttatgggcagaatagatgagctctgtgatgaaagaggccacgttgaagacttgtacagcgaactgaacaaatggtcgtttgaaagtatctgcctcgtgttgtatgagaagagatttgggcttctccagaagaatgcaggggatgaagctgtgaacttcatcatggccatcaaaacaatgatgagcacgtttgggaggatgatggtcactccagtcgagctgcacaagagcctcaacaccaaggtctggcaggaccacactctggcctgggacaccattttcaaatcagtcaaagcttgtatcgacaaccggttagagaagtattctcagcagcctagtgcagatttcctttgtgacatttatcaccagaatcggctttcaaagaaagaattgtatgctgctgtcacagagctccagctggctgcggtggaaacgacagcaaacagtctaatgtggattctctacaatttatcccgtaatccccaagtgcaacaaaagcttcttaaggaaattcaaagtgtattacctgagaatcaggtgccacgggcagaagatttgaggaatatgccgtatttaaaagcctgtctgaaagaatctatgaggcttacgccgagtgtaccatttacaactcggactcttgacaaggcaacagttctgggtgaatatgctttacccaaaggaacagtgctcatgctaaatacccaggtgttgggatccagtgaagacaattttgaagattcaagtcagtttagacctgaacgttggcttcaggagaaggaaaaaattaatccttttgcgcatcttccatttggcgttggaaaaagaatgtgcattggtcgccgattagcagagcttcaactgcatttggctctttgttggattgtccgcaaatacgacatccaggccacagacaatgagcctgttgagatgctacactcaggcaccctggtgcccagccgggaactccccatcgcgttttgccagcgataa
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【0022】
ヒト由来ＣＹＰ２４Ａ１（配列番号２０）
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【0023】
本発明の核酸分子は、ＣＹＰ２４Ａ１に結合可能であればよく、ＣＹＰ２４Ａ１における結合位置は特に制限されない。
【0024】
本発明の核酸分子は、前記ＣＹＰ２４Ａ１の検出限界濃度が、例えば、０．５ｎＭである。
【0025】
本発明において、「結合する」又は「結合可能」は、本発明の核酸分子が、ＣＹＰ２４Ａ１に対して実際に結合することを意味してもよいし、分子ドッキング法等を用いたシミュレーションにおいて結合することを意味してもよいが、好ましくは、前者である。前記核酸分子とＣＹＰ２４Ａ１との結合は、例えば、タンパク質間相互作用の解析方法を利用して検出でき、例えば、共免疫沈降、プルダウンアッセイ、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー等の抗体抗原反応と同様のメカニズムを利用した方法を利用して検出できる。具体例として、前記核酸分子とＣＹＰ２４Ａ１との結合は、例えば、ＣＹＰ２４Ａ１を発現する細胞と、標識化した核酸分子とを接触後、前記細胞において、標識を検出することにより検出できる。また、本発明の核酸分子とＣＹＰ２４Ａ１との結合は、例えば、後述する実施例１に記載の方法により検出してもよい。
【0026】
本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子について、具体例を以下に示す。本発明の核酸分子は、下記（ａ）のＤＮＡ鎖を含む核酸分子である。本発明において、前記（ａ）のＤＮＡ鎖を含む核酸分子は、例えば、（ａ１）～（ａ４）からなる群から選択された少なくとも一つのＤＮＡ鎖を含む核酸分子、の意味も含む。
（ａ）下記（ａ１）、（ａ２）又は（ａ３）のＤＮＡ鎖。
（ａ１）配列番号１～１８のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ鎖。
（ａ２）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖。
（ａ３）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖。
（ａ４）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖。
（ａ）下記（ａ１）、（ａ２）又は（ａ３）のＤＮＡ鎖。
（ａ１）配列番号１～１８のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ鎖。
（ａ２）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖。
（ａ３）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖。
（ａ４）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖。
【0027】
本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基及びリボヌクレオチド残基があげられる。前記ポリヌクレオチドは、後述するように、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、デオキシリボヌクレオチド残基及びリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡであり、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよく、これらの組合せでもよい。
【0028】
本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ１）～（ａ４）のいずれかのＤＮＡ鎖からなる分子でもよいし、前記（ａ１）～（ａ４）のいずれかのＤＮＡ鎖を含む分子でもよい。後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、後述するように、前記（ａ１）～（ａ４）のいずれかのＤＮＡ鎖を２つ以上含んでもよい。前記２つ以上のＤＮＡ鎖は、同じ配列でもよいし、異なる配列でもよい。また、後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、さらに、リンカー、付加配列及び／又はプライマー結合配列等を有してもよい。
【0029】
前記（ａ１）のＤＮＡ鎖は、配列番号１～１８のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ鎖である。前記（ａ１）のＤＮＡ鎖は、例えば、後述する実施例に示すように、ＣＹＰ２４Ａ１の活性抑制能が高いことから、配列番号５、７、１２、及び１８のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ鎖（AptCYP24-#5（配列番号５）、AptCYP24-#7（配列番号７）、AptCYP24-#12（配列番号１２）、AptCYP24-#18（配列番号１８））であることが好ましい。
【0030】
AptCYP24-#1（配列番号１）
5′-CGCCTGGGACCAACATCATGTCATCGTCTA-3′
AptCYP24-#2（配列番号２）
5′-CGCAAGCCACACTTTGTATGGACCAGTATC-3′
AptCYP24-#3（配列番号３）
5′-CAGGGCCATAAGCTGACCCAATCTTGTCGG-3′
AptCYP24-#4（配列番号４）
5′-AGACCAAGTTATGCAAGCTCATCTGTTGT-3′
AptCYP24-#5（配列番号５）
5′-CAGGACAGCACCCTGACCCAGTTCTGTATA-3′
AptCYP24-#6（配列番号６）
5′-CAGGGTCAATGGTCCCCAATCTACACAGAT-3′
AptCYP24-#7（配列番号７）
5′-CATGCAGGAAGTAACCCAATGTCCGTTAAC-3′
AptCYP24-#8（配列番号８）
5′-CAGCGTCACCATACCCTTTAACACCACGCA-3′
AptCYP24-#9（配列番号９）
5′-ACCTATACACCGACGAACCCTACTTCCTGA-3′
AptCYP24-#10（配列番号１０）
5′-CTTTTACCCCCCCGCTGCCTTTATACTTGA-3′
AptCYP24-#11（配列番号１１）
5′-CAAGCCGAAGTTACACACGGACCAATATGT-3′
AptCYP24-#12（配列番号１２）
5′-GCCACTCTTCGTACTCCTCCCTCTATCCGA-3′
AptCYP24-#13（配列番号１３）
5′-TCCCCCCCATAACCAACATTTAGCATCATG-3′
AptCYP24-#14（配列番号１４）
5′-TAGGTAGCAAGCAAACATGTATTCCTTTTC-3′
AptCYP24-#15（配列番号１５）
5′-GTAGCGCGACGTACAATATTTCTTTCCTCC-3′
AptCYP24-#16（配列番号１６）
5′-TGGACTTTTTCCGGTGGGAGACGAGGTTGC-3′
AptCYP24-#17（配列番号１７）
5′-ACCCAAGGACGTCACCGACTGCAGTGTTAT-3′
AptCYP24-#18（配列番号１８）
5′-ACCCTTAGCTCACCCTTCCCCGCCCGCCAC-3′
5′-CGCCTGGGACCAACATCATGTCATCGTCTA-3′
AptCYP24-#2（配列番号２）
5′-CGCAAGCCACACTTTGTATGGACCAGTATC-3′
AptCYP24-#3（配列番号３）
5′-CAGGGCCATAAGCTGACCCAATCTTGTCGG-3′
AptCYP24-#4（配列番号４）
5′-AGACCAAGTTATGCAAGCTCATCTGTTGT-3′
AptCYP24-#5（配列番号５）
5′-CAGGACAGCACCCTGACCCAGTTCTGTATA-3′
AptCYP24-#6（配列番号６）
5′-CAGGGTCAATGGTCCCCAATCTACACAGAT-3′
AptCYP24-#7（配列番号７）
5′-CATGCAGGAAGTAACCCAATGTCCGTTAAC-3′
AptCYP24-#8（配列番号８）
5′-CAGCGTCACCATACCCTTTAACACCACGCA-3′
AptCYP24-#9（配列番号９）
5′-ACCTATACACCGACGAACCCTACTTCCTGA-3′
AptCYP24-#10（配列番号１０）
5′-CTTTTACCCCCCCGCTGCCTTTATACTTGA-3′
AptCYP24-#11（配列番号１１）
5′-CAAGCCGAAGTTACACACGGACCAATATGT-3′
AptCYP24-#12（配列番号１２）
5′-GCCACTCTTCGTACTCCTCCCTCTATCCGA-3′
AptCYP24-#13（配列番号１３）
5′-TCCCCCCCATAACCAACATTTAGCATCATG-3′
AptCYP24-#14（配列番号１４）
5′-TAGGTAGCAAGCAAACATGTATTCCTTTTC-3′
AptCYP24-#15（配列番号１５）
5′-GTAGCGCGACGTACAATATTTCTTTCCTCC-3′
AptCYP24-#16（配列番号１６）
5′-TGGACTTTTTCCGGTGGGAGACGAGGTTGC-3′
AptCYP24-#17（配列番号１７）
5′-ACCCAAGGACGTCACCGACTGCAGTGTTAT-3′
AptCYP24-#18（配列番号１８）
5′-ACCCTTAGCTCACCCTTCCCCGCCCGCCAC-3′
【0031】
前記（ａ２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ａ２）のＤＮＡ鎖が、ＣＹＰ２４Ａ１に結合する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、前記（ａ２）のいずれかの塩基配列において、例えば、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１又は２個である。本発明において、塩基数及び配列数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１～５塩基」との記載は、「１、２、３、４、５塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【0032】
前記（ａ３）において、「同一性」は、例えば、前記（ａ３）のＤＮＡ鎖が、ＣＹＰ２４Ａ１に結合する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
【0033】
前記（ａ４）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ａ１）のＤＮＡ鎖に対して、完全又は部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Sambrook）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.）」〔Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
【0034】
前記（ａ４）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度及び長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Sambrook）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed.）」〔Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)〕等に記載の条件を採用することもできる。
【0035】
本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ１）～（ａ４）のいずれかのＤＮＡ鎖の配列を１つ含んでもよいし、前記（ａ１）～（ａ４）のいずれかのＤＮＡ鎖の配列を複数含んでもよい。後者の場合、複数のＤＮＡ鎖の配列が連結して、一本鎖のＤＮＡ鎖を形成していることが好ましい。前記複数のＤＮＡ鎖の配列は、例えば、それぞれが直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。前記ＤＮＡ鎖の配列は、それぞれの末端において、直接的又は間接的に連結していることが好ましい。前記複数のＤＮＡ鎖の配列は、例えば、同じでもよいし、異なってもよい。前記複数のＤＮＡ鎖の配列は、例えば、同じであることが好ましい。前記ＤＮＡ鎖の配列を複数含む場合、前記配列の数は、特に制限されず、例えば、２以上、２～１８、２～１０、２又は３である。
【0036】
前記リンカーは、特に制限されない。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１～２００塩基長、１～２０塩基長、３～１２塩基長、５～９塩基長である。前記リンカーの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基及びリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記リンカーの具体例として、例えば、ポリデオキシチミン（ポリｄＴ）、ポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）、ＡとＴの繰り返し配列であるポリｄＡｄＴ等があげられ、好ましくはポリｄＴ、ポリｄＡｄＴである。
【0037】
本発明の核酸分子において、前記ＤＮＡ鎖は、一本鎖ＤＮＡであることが好ましい。前記一本鎖ＤＮＡは、例えば、自己アニーリングによりステム構造及びループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ＤＮＡ鎖は、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造及び／又はバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。
【0038】
本発明の核酸分子は、例えば、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、例えば、一方の一本鎖ＤＮＡは、前記（ａ１）～（ａ４）のいずれかのＤＮＡ鎖を含み、他方の一本鎖ＤＮＡは、制限されない。前記他方の一本鎖ＤＮＡは、例えば、前記（ａ１）～（ａ４）のいずれかのＤＮＡ鎖に相補的な塩基配列を含むＤＮＡ鎖があげられる。本発明の核酸分子が二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により、一本鎖ＤＮＡに解離させることが好ましい。また、解離した前記（ａ１）～（ａ４）のいずれかの一本鎖ＤＮＡは、例えば、前述のように、ステム構造及びループ構造を形成していることが好ましい。
【0039】
本発明において、「ステム構造及びループ構造を形成可能」とは、例えば、実際にステム構造及びループ構造を形成すること、ならびに、ステム構造及びループ構造が形成されていなくても、条件によってステム構造及びループ構造を形成可能なことも含む。「ステム構造及びループ構造を形成可能」とは、例えば、実験的に確認した場合、及び、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。
【0040】
本発明の核酸分子の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基である。前記ヌクレオチド残基は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基及びリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。後者の場合、「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ＤＮＡ鎖において、例えば、１～３０個、１～１５個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１又は２個である。
【0041】
前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基、すなわち、修飾塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
【0042】
前記天然の塩基は、例えば、アデニン（ａ）、グアニン（ｇ）等のプリン塩基、シトシン（ｃ）、チミン（ｔ）、ウラシル（ｕ）等のピリミジン塩基があげられる。
【0043】
前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、天然塩基（非人工塩基）が修飾された塩基があげられ、前記天然塩基と同様の機能を有することが好ましい。前記修飾塩基は、デオキシリボース又はリボースに代えて、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、プリン、イソグアニン、イソシトシン、７‐デアザアデニン等を有してもよい。前記塩基の修飾部位は、特に制限されない。前記塩基がプリン塩基の場合、前記プリン塩基の修飾部位は、例えば、前記プリン骨格の７位及び８位があげられる。前記塩基がピリミジン塩基の場合、前記ピリミジン塩基の修飾部位は、例えば、前記ピリミジン骨格の５位及び６位があげられる。前記ピリミジン骨格において、４位の炭素に「＝Ｏ」が結合し、５位の炭素に「－ＣＨ３」又は「－Ｈ」以外の基が結合している場合、修飾ウラシル又は修飾チミンということができる。
【0044】
前記修飾塩基の修飾基は、特に制限されず、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基等があげられる。
【0045】
前記修飾塩基は、特に制限されず、例えば、アデニンが修飾された修飾アデニン、チミンが修飾された修飾チミン、グアニンが修飾された修飾グアニン、シトシンが修飾された修飾シトシン及びウラシルが修飾された修飾ウラシル等があげられ、前記修飾チミン、前記修飾ウラシル及び前記修飾シトシンが好ましい。
【0046】
前記修飾塩基の具体例としては、例えば、例えば、２－アミノアデニン、６－メチル化プリン等のアルキル誘導体；２－プロピル化プリン等のアルキル誘導体；５－ハロウラシル及び５－ハロシトシン；５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシン；６－アゾウラシル、６－アゾシトシン及び６－アゾチミン；５－ウラシル（プソイドウラシル）、４－チオウラシル、５－ハロウラシル、５－（２－アミノプロピル）ウラシル、５－アミノアリルウラシル；８－ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化及び他の８－置換プリン；５－トリフルオロメチル化及び他の５－置換ピリミジン；７－メチルグアニン；５－置換ピリミジン；６－アザピリミジン；Ｎ－２、Ｎ－６、及びＯ－６置換プリン（２－アミノプロピルアデニンを含む）；５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；３－デアザ－５－アザシトシン；２－アミノプリン；５－アルキルウラシル；７－アルキルグアニン；５－アルキルシトシン；７－デアザアデニン；Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデニン；２，６－ジアミノプリン；５－アミノ－アリル－ウラシル；Ｎ３－メチルウラシル；置換１，２，４－トリアゾール；２－ピリジノン；５－ニトロインドール；３－ニトロピロール；５－メトキシウラシル；ウラシル－５－オキシ酢酸；５－メトキシカルボニルメチルウラシル；５－メチル－２－チオウラシル；５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウラシル；５－メチルアミノメチル－２－チオウラシル；３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウラシル；３－メチルシトシン；５－メチルシトシン（５－Ｍｅ－ｄＣ）；Ｎ４－アセチルシトシン；２－チオシトシン；Ｎ６－メチルアデニン；Ｎ６－イソペンチルアデニン；２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン；Ｎ－メチルグアニン；Ｏ－アルキル化塩基等があげられる。また、プリン塩基及びピリミジン塩基は、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering」、８５８～８５９頁、クロシュビッツ ジェー アイ（Kroschwitz J．I．）編、John Wiley ＆ Sons、１９９０、及びイングリッシュら（Englischら）、Angewandte Chemie、International Edition、１９９１、３０巻、ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。
【0047】
前記ＤＮＡ鎖は、例えば、いずれか１種類の前記修飾塩基のみを含んでもよいし、２種類以上の前記修飾塩基を含んでもよい。
【0048】
本発明の核酸分子は、例えば、修飾ヌクレオチドを含んでもよい、前記修飾ヌクレオチドは、前述の前記修飾塩基を有するヌクレオチドでもよいし、糖リン酸骨格が修飾された修飾糖リン酸骨格を有するヌクレオチドでもよいし、前記修飾塩基及び前記修飾糖リン酸骨格を有するヌクレオチドでもよい。
【0049】
前記糖リン酸骨格において、例えば、前記核酸分子の安定性を向上できることから、前記デオキシリボース残基及び／又はリボース残基を修飾してもよい。前記糖残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位又は４’位があげられ、いずれか一方でも両方が修飾されてもよい。前記修飾糖の修飾基は、例えば、メチル基、フルオロ基、アミノ基、チオ基等があげられる。具体例として、前記デオキシリボース残基は、２’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、２’位炭素に結合する水素を、フルオロ等のハロゲンに置換できる。また、前記デオキシリボース残基は、例えば、前記２’位炭素の水素を水酸基に置換することで、デオキシリボース残基をリボース残基に置換できる。前記リボース残基は、例えば、２’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、２’位炭素に結合する水酸基を、水素又はフルオロ等のハロゲンに置換できる。また、前記リボース残基は、例えば、２’位炭素に結合する水酸基の水素を置換してもよい。具体例として、例えば、２’－Ｏ－メチルリボース残基、２’－Ｏ－メトキシエチルリボース残基、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルリボース残基、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルリボース残基等があげられる。前記リボース残基は、例えば、前記２’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボース残基に置換できる。前記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。前記修飾ヌクレオチド残基は、この他に、例えば、前記ヌクレオチド残基を構成する糖残基において、前記糖残基の環状構造を架橋した二環式の糖残基としてもよい。前記二環式の糖残基を含む修飾ヌクレオチド残基の具体例は、特に制限されず、公知の二環式人工核酸モノマー残基があげられる。前記二環式人工核酸モノマー残基は、例えば、ｃＥｔ（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｅｔｈｙｌ ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、Ionis Pharmaceuticals社製）、ＬＮＡ（（商標）、Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（登録商標、２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等があげられ、好ましくは、ＬＮＡである。
【0050】
前記修飾ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位及び／又は４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、デオキシリボース残基又はリボース残基の２’位が修飾された、２’－メチル化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－メチル化－シトシンヌクレオチド残基、２’－フルオロ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－フルオロ化－シトシンヌクレオチド残基、２’－アミノ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－アミノ化－シトシンヌクレオチド残基、２’－チオ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－チオ化－シトシンヌクレオチド残基等があげられる。
【0051】
前記糖リン酸骨格は、例えば、非デオキシリボース残基、非リボース残基及び／又は非リン酸を有する非糖リン酸骨格に置換してもよい。前記非糖リン酸骨格は、例えば、前記糖リン酸骨格の非荷電体があげられる。前記非糖リン酸骨格に置換された、前記ヌクレオチドの代替物は、例えば、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等があげられる。
【0052】
前記糖リン酸骨格において、例えば、リン酸基を修飾できる。前記糖リン酸骨格において、糖残基に最も隣接するリン酸基は、αリン酸基と呼ばれる。前記αリン酸基は、負に荷電し、その電荷は、糖残基に非結合の２つの酸素原子にわたって、均一に分布している。前記αリン酸基における４つの酸素原子のうち、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と非結合である２つの酸素原子は、以下、「非結合（ｎｏｎ－ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」ともいう。他方、前記ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と結合している２つの酸素原子は、以下、「結合（ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」という。前記αリン酸基は、例えば、非荷電となる修飾、又は、前記非結合酸素における電荷分布が非対称型となる修飾を行うことが好ましい。
【0053】
前記リン酸基は、例えば、前記非結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｅ（セレン）、Ｂ（ホウ素）、Ｃ（炭素）、Ｈ（水素）、Ｎ（窒素）及びＯＲ（Ｒは、アルキル基又はアリール基）のいずれかの原子で置換でき、好ましくは、Ｓで置換される。前記非結合酸素は、例えば、両方が置換されていることが好ましく、より好ましくは、両方がＳで置換される。前記修飾リン酸基は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキル又はアリールホスホネート、及びホスホトリエステル等があげられ、中でも、ホスホロチオエート、前記２つの非結合酸素が両方ともＳで置換されているホスホロジチオエートが好ましい。
【0054】
前記リン酸基は、例えば、前記結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｃ（炭素）及びＮ（窒素）のいずれかの原子で置換でき、前記修飾リン酸基は、例えば、Ｎで置換した架橋ホスホロアミデート、Ｓで置換した架橋ホスホロチオエート、及びＣで置換した架橋メチレンホスホネート等があげられる。前記結合酸素の置換は、例えば、本発明の核酸分子の５’末端ヌクレオチド残基及び３’末端ヌクレオチド残基の少なくとも一方において行うことが好ましく、５’側の場合、Ｃによる置換が好ましく、３’側の場合、Ｎによる置換が好ましい。
【0055】
前記リン酸基は、例えば、前記リン非含有のリンカーに置換してもよい。前記リンカーは、例えば、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、及びメチレンオキシメチルイミノ等を含み、好ましくは、メチレンカルボニルアミノ基及びメチレンメチルイミノ基を含む。
【0056】
本発明の核酸分子は、例えば、３’末端及び５’末端の少なくとも一方のヌクレオチド残基が修飾されてもよい。前記修飾は、例えば、３’末端及び５’末端のいずれか一方でもよいし、両方でもよい。前記修飾は、例えば、前述の通りであり、好ましくは、末端のリン酸基に行うことが好ましい。前記リン酸基は、例えば、全体を修飾してもよいし、前記リン酸基における１つ以上の原子を修飾してもよい。前者の場合、例えば、リン酸基全体の置換でもよいし、欠失でもよい。
【0057】
前記末端のヌクレオチド残基の修飾は、例えば、他の分子の付加があげられる。前記他の分子は、例えば、後述するような標識物質、保護基等の機能性分子があげられる。前記保護基は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｉ（ケイ素）、Ｂ（ホウ素）、エステル含有基等があげられる。前記標識物質等の機能性分子は、例えば、本発明の核酸分子の検出等に利用できる。
【0058】
前記他の分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のリン酸基に付加してもよいし、スペーサーを介して、前記リン酸基又は前記糖残基に付加してもよい。前記スペーサーの末端原子は、例えば、前記リン酸基の前記結合酸素、又は、糖残基のＯ、Ｎ、ＳもしくはＣに、付加又は置換できる。前記糖残基の結合部位は、例えば、３’位のＣもしくは５’位のＣ、又はこれらに結合する原子が好ましい。前記スペーサーは、例えば、前記ＰＮＡ等のヌクレオチド代替物の末端原子に、付加又は置換することもできる。
【0059】
前記スペーサーは、特に制限されず、例えば、－（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｎＮ－、－（ＣＨ２）ｎＯ－、－（ＣＨ２）ｎＳ－、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、及びモルホリノ等、ならびに、ビオチン試薬及びフルオレセイン試薬等を含んでもよい。前記式において、ｎは、正の整数であり、ｎ＝３又は６が好ましい。
【0060】
前記末端に付加する分子は、これらの他に、例えば、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、抗がん剤、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン）及びペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド、ＲＧＤペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、抗体、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）等、糖（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース）があげられる。
【0061】
本発明の核酸分子は、前記５’末端が、例えば、リン酸基又はリン酸基アナログで修飾されてもよい。前記リン酸基は、例えば、５’一リン酸（(HO)2(O)P-O-5’）、５’二リン酸（(HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’三リン酸（(HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’－グアノシンキャップ（７－メチル化又は非メチル化、7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’－アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、任意の修飾又は非修飾ヌクレオチドキャップ構造（N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’一チオリン酸（ホスホロチオエート：(HO)2(S)P-O-5’）、５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート：(HO)(HS)(S)P-O-5’）、５’－ホスホロチオール酸（(HO)2(O)P-S-5’）、硫黄置換の一リン酸、二リン酸及び三リン酸（例えば、５’－α－チオ三リン酸、５’－γ－チオ三リン酸等）、５’－ホスホルアミデート（(HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’）、５’－アルキルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2、Ｒはアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等））、５’－アルキルエーテルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、Ｒはアルキルエーテル（例えば、メトキシメチル、エトキシメチル等））等があげられる。
【0062】
前記修飾ヌクレオチドの個数は、特に制限されず、例えば、前記ＤＮＡ鎖において、例えば、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個、１～４個、１～３個、１又は２個である。また、前記ＤＮＡ鎖を含む前記核酸分子の全長における前記修飾ヌクレオチドも、特に制限されず、例えば、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個、１～４個、１～３個、１又は２個である。
【0063】
本発明の核酸分子は、例えば、１もしくは数個の人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ＤＮＡ鎖において、例えば、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個、１～４個、１～３個、１又は２個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）、ＥＮＡ（2'-O,４'-C-Ethylenebridged Nucleic Acids）等があげられる。前記モノマー残基における核酸は、例えば、前述と同様である。
【0064】
本発明の核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼ耐性であることが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、前記修飾化ヌクレオチド残基及び／又は前記人工核酸モノマー残基を有することが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、５’末端又は３’末端に、数１０ｋＤａのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）又はデオキシチミジン等が結合してもよいし、前述のように、５’末端がリン酸基で修飾されていてもよい。前記修飾リン酸基は、例えば、ホスホロチオエート基が好ましい。
【0065】
本発明の核酸分子は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端及び３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１～２００塩基長、１～５０塩基長、１～２５塩基長、又は１～１２塩基長である。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基及びリボヌクレオチド残基等があげられる。前記付加配列は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記付加配列の具体例として、例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ等があげられる。
【0066】
本発明の核酸分子は、例えば、さらに、プライマー結合配列を有してもよい。前記プライマー結合配列は、例えば、後述する実施例に記載の方法で本発明の核酸分子を製造（合成）する際に使用するプライマーがハイブリダイズ可能な領域である。前記プライマー結合配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端及び３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは、’末端及び３’末端の両方に結合していることが好ましい。前記プライマー結合配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基及びリボヌクレオチド残基等があげられるが、デオキシリボヌクレオチド残基が好ましい。前記プライマー結合配列の長さは、特に制限されず、例えば、１～４０塩基長、１～３０塩基長、１～２０塩基長、２０塩基長である。本発明の核酸分子が前記プライマー結合配列を有する場合、例えば、前記各配列の５´側末端に配列番号２１（5´-AGCAGCACAG AGGTCAGATG）で表す塩基配列からなるポリヌクレオチドの３´側末端が結合され、前記各配列の３´側末端に、配列番号２２（CCTATCGCTG CTACCGTGAA-3´）で表す塩基配列からなるポリヌクレオチドの５´側末端が結合されていることが好ましい。
【0067】
本発明の核酸分子は、例えば、担体に固定化して使用してもよい。前記本発明の核酸分子は、例えば、５’末端及び３’末端のいずれかを固定化する。本発明の核酸分子を固定化する場合、例えば、前記核酸分子は、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、例えば、前記付加配列を介して固定化することが好ましい。
【0068】
本発明の核酸分子は、例えば、さらに標識物質を有してもよい。前記標識物質は、例えば、前記核酸分子の５’末端及び３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは５’末端である。
【0069】
前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体、酵素、タグ等があげられる。前記標識物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、ＦＡＭ色素、ローダミン色素、テキサスレッド色素、ＪＯＥ、ＭＡＸ、ＨＥＸ、ＴＹＥ等の蛍光団があげられる。前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記酵素は、例えば、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ等があげられる。前記同位体は、例えば、安定同位体及び放射性同位体があげられ、好ましくは安定同位体である。前記安定同位体は、例えば、被ばくの危険性が少なく、専用の施設も不要であることから取り扱い性に優れ、また、コストも低減できる。また、前記安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。前記安定同位体は、特に制限されず、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓ及び３６Ｓがあげられる。前記タグは、例えば、ビオチン等のビタミン類があげられる。
【0070】
本発明の核酸分子は、例えば、さらに、キャリアを含んでもよい。この場合、本発明の核酸分子は、キャリアに包含されてもよいし、別々に存在してもよい。前者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、前記キャリアに固定化されてもよいし、封入されてもよい。後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、核酸分子を含むキットということもできる。前記キャリアの大きさは、特に制限されず、例えば、１００ｎｍ～６００ｎｍである。
【0071】
前記キャリアは、例えば、本発明の核酸分子を保持できる構造物があげられ、具体例として、ミセル、リポソーム、エマルション、又はニオソーム等があげられる。前記キャリアの構成成分は、前記キャリアの種類に応じて適宜設定できる。前記構成成分は、例えば、両親媒性ポリマー等のポリマー；界面活性剤；カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール、ポリエチレングリコール（PEG）修飾脂質等の脂質；等があげられる。
【0072】
前記カチオン性脂質は、例えば、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（DOGS）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウム（DOSPA）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（DODAP）１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（DOTAP）、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（DSDMA）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（DODMA）、１，２－リノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（DLinDMA）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（DLenDMA）、Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（DODAC）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（DDAB）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（シス，シス－９，１２－オクタデカジエンオキシ）プロパン（CLinDMA）、２－［５’－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ］－３－ジメチル－１－（シス，シス－９’，１－２’－オクタデカジエンオキシ）プロパン（CpLinDMA）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（DMOBA）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（DOcarbDAP）、２，３－ジリノレオイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロピルアミン（DLinDAP）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（DLincarbDAP）、１，２－ジリノレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（DLinCDAP）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（DLin-DMA）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（DLin-K-XTC２-DMA）、２－（２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミン（DLin-KC２-DMA）等があげられる。
【0073】
前記非カチオン性脂質は、例えば、中性、両性イオン性、又はアニオン性脂質があげられる。前記非カチオン性脂質は、例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（DSPC）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（DOPG）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（POPC）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（POPE）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（DOPE-mal）、ジパルミトイル－ホスファチジル－エタノールアミン（DPPE）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（DMPE）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（DSPE）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（SOPE）等があげられる。
【0074】
前記コレステロールは、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－エチルカルボキサミドコレステロール（DC-Choi）、１，４－ビス（３－Ｎ－オレイルアミノ－プロピル）ピペラジン等があげられる。
【0075】
前記ポリマーは、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルジネート、コラーゲン、キトサン、線状シクロデキストリンコポリマー、線状酸化シクロデキストリンコポリマー、シクロデキストリン、プロタミン、ＰＥＧ化プロタミン、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）、ＰＥＧ化ＰＬＬ、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等があげられる。
【0076】
本発明の核酸分子の前記キャリアへの保持方法は、例えば、リポソームの製造方法に準じて実施できる。
【0077】
本発明の核酸分子の製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成を利用した核酸合成方法等、遺伝子工学的手法、公知の方法により合成できる。本発明の核酸分子は、例えば、いわゆるＳＥＬＥＸ法によっても得ることができる。この場合、ターゲットは、ＣＹＰ２４Ａ１が好ましい。また、本発明の核酸分子は、例えば、下記参考文献１に示す、ＳＥＬＣＯＳ法（Systematic Evolution of Ligands by COmpetitive Selection）と呼ばれる競合的非ＳＥＬＥＸ法により得ることが好ましい。この場合、ターゲットとして、ＣＹＰ２４Ａ１を用い、競合させる対照ターゲットとして、ＣＹＰ２７Ｂ１を用いることが好ましい。前記ＣＹＰ２７Ｂ１は、生体内においてビタミンＤを活性化型に代謝する際に関与する酵素である。前記ＳＥＬＣＯＳ法の具体的な手順は、例えば、後述する実施例に記載の手順を参照できる。前記ＳＥＬＣＯＳ法により本発明の核酸分子を製造することにより、例えば、よりＣＹＰ２４Ａ１に特異的に結合する核酸分子を得ることができる。
参考文献１：Ankita Kushwaha et al. “Competitive non-SELEX for the selective and rapid enrichment of DNA aptamers and its use in electrochemical aptasensor”, SCIENTIFIC REPORT, 2019 Apr 30, doi: 10.1038/s41598-019-43187-6
参考文献１：Ankita Kushwaha et al. “Competitive non-SELEX for the selective and rapid enrichment of DNA aptamers and its use in electrochemical aptasensor”, SCIENTIFIC REPORT, 2019 Apr 30, doi: 10.1038/s41598-019-43187-6
【0078】
本発明の核酸分子は、前述のように、ＣＹＰ２４Ａ１に結合性を示す。このため、本発明の核酸分子の用途は、ＣＹＰ２４Ａ１への結合性を利用する用途であれば、特に制限されない。本発明の核酸分子は、例えば、ＣＹＰ２４Ａ１に対する抗体等に代えて、種々の方法に使用できる。
【0079】
＜医薬＞
本発明の医薬は、前述のように、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子と、薬学的に許容される添加剤とを含む。本発明の医薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成及び条件は、特に制限されない。本発明の医薬は、前記本発明の核酸分子を含むため、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を制御しうる。また、ＣＹＰ２４Ａ１は、ビタミンＤの代謝産物である１，２５（ＯＨ）２Ｄ３及び２５（ＯＨ）Ｄ３に作用して不活性化することが知られている。このため、本発明の医薬は、ビタミンＤ欠乏に起因する疾患用の医薬として使用可能である。また、ＣＹＰ２４Ａ１は、がん細胞で過剰発現していることも報告されている。このため、本発明の医薬は、がんに対する医薬として機能することも期待される。本発明の医薬は、前記本発明の核酸分子の説明を援用できる。
本発明の医薬は、前述のように、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子と、薬学的に許容される添加剤とを含む。本発明の医薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成及び条件は、特に制限されない。本発明の医薬は、前記本発明の核酸分子を含むため、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を制御しうる。また、ＣＹＰ２４Ａ１は、ビタミンＤの代謝産物である１，２５（ＯＨ）２Ｄ３及び２５（ＯＨ）Ｄ３に作用して不活性化することが知られている。このため、本発明の医薬は、ビタミンＤ欠乏に起因する疾患用の医薬として使用可能である。また、ＣＹＰ２４Ａ１は、がん細胞で過剰発現していることも報告されている。このため、本発明の医薬は、がんに対する医薬として機能することも期待される。本発明の医薬は、前記本発明の核酸分子の説明を援用できる。
【0080】
前記ビタミンＤの欠乏に起因する疾患は、例えば、慢性腎臓病、くる病、骨軟化症等があげられる。
【0081】
前記がんは、例えば、肺がん、前立腺がんがあげられる。
【0082】
本発明の医薬の使用方法（投与条件）は、特に制限されず、例えば、前記投与対象に、前記核酸分子を投与すればよい。
【0083】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織又は器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ブタ、サル等の非ヒト哺乳類動物等があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。
【0084】
前記細胞は、特に制限されず、例えば、ヒト及びマウス由来の細胞があげられ、具体例として、近位尿細管上皮細胞、小腸上皮細胞、大腸上皮細胞、表皮角化細胞等があげられる。前記細胞は、例えば、ヒト受精卵、ならびに、ヒト胚及びヒト個体内の細胞を除く。
【0085】
前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与対象が、生体から分離された細胞等の場合、例えば、トランスフェクション試薬を使用する方法、エレクトロポレーション法、ナノバブル法等があげられる。前記投与対象が生体の場合、例えば、非経口投与、経口投与等があげられる。前記非経口投与は、例えば、局所投与、皮下投与、静脈内投与等があげられる。本発明の医薬の投与条件、例えば、投与回数、投与量等は、特に制限されない。
【0086】
本発明の医薬の形態は、特に制限されず、例えば、注射液、点滴静注液、点眼液、眼軟膏、皮膚用軟膏、貼付剤、吸入剤、液剤、エアゾール剤、ポンプスプレー剤、経口剤等である。
【0087】
本発明の医薬において、前記核酸分子の配合量は、特に制限されない。また、前記核酸分子の投与条件は、特に制限されない。具体例として、本発明の医薬を皮下注射又は静脈注射等によりヒトに全身投与する場合、１回あたりの投与量（合計）は、例えば、１００～５００ｍｇである。本発明の医薬の投与回数は、例えば、２週間～８週間に１回である。本発明の医薬において、前記核酸分子の配合量は、例示した投与条件を実現できるような濃度で含まれていることが好ましい。
【0088】
前記薬学的に許容される添加剤は、例えば、複合化剤、担体、標的細胞への結合物質、縮合剤、融合剤、賦形剤、基剤、安定化剤、保存剤等があげられる。
【0089】
前記添加剤は、例えば、前記核酸分子と複合体を形成するものでもよい。この場合、前記添加剤は、例えば、複合化剤ともいえる。本発明の組成物において、前記核酸分子を複合体とすることによって、例えば、前記核酸分子を効率よくデリバリーできる。前記核酸分子と前記複合化剤との結合は、特に制限されず、例えば、非共有結合があげられる。前記複合体は、例えば、包接複合体があげられる。前記複合化剤は、例えば、前述のキャリアの説明を援用できる。
【0090】
前記添加剤の配合量は、前記核酸分子の機能を妨げるものでなければ、特に制限されない。前記添加剤の種類は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
【0091】
本発明の医薬は、例えば、ビタミンＤの欠乏に起因する疾患又は前記がんの治療に好適に使用できると期待される。なお、本発明において、前記「治療」は、例えば、予防、改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【0092】
＜ＣＹＰ２４Ａ１活性抑制剤＞
本発明のＣＹＰ２４Ａ１活性抑制剤は、前述のように、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む。本発明の活性抑制剤は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成及び条件は、特に制限されない。本発明の活性抑制剤は、前記本発明の核酸分子を含むため、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制しうる。また、ＣＹＰ２４Ａ１は、ビタミンＤの不活性化において機能している。このため、本発明の活性抑制剤は、ビタミンＤの不活性化抑制剤として機能すると期待される。本発明の活性抑制剤は、前記本発明の核酸分子及び医薬の説明を援用できる。
本発明のＣＹＰ２４Ａ１活性抑制剤は、前述のように、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む。本発明の活性抑制剤は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成及び条件は、特に制限されない。本発明の活性抑制剤は、前記本発明の核酸分子を含むため、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制しうる。また、ＣＹＰ２４Ａ１は、ビタミンＤの不活性化において機能している。このため、本発明の活性抑制剤は、ビタミンＤの不活性化抑制剤として機能すると期待される。本発明の活性抑制剤は、前記本発明の核酸分子及び医薬の説明を援用できる。
【0093】
本発明において、前記「活性の抑制」とは、前記ＣＹＰ２４Ａ１に対象の核酸分子を導入した場合に、前記核酸分子を未導入又は対照の核酸分子を導入したＣＹＰ２４Ａ１と比較して、ＣＹＰ２４Ａ１の活性が有意に低下している場合、前記核酸分子は、例えば、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制していると評価できる。
【0094】
本発明の活性抑制剤の使用方法は、前記本発明の医薬の説明を援用できる。
【0095】
＜肺がん治療薬＞
本発明の肺がん治療薬は、前述のように、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む。本発明の治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成及び条件は、特に制限されない。本発明の肺がん治療薬は、例えば、１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオールともいう）を含むことが好ましい。本発明の治療薬は、前記本発明の核酸分子を含むため、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制しうる。後述する実施例に示すように、本発明の核酸分子は、肺がん細胞の増殖を抑制でき、例えば、１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の存在下においては、さらに肺がん細胞の増殖を抑制できる。本発明の肺がん治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１を含み、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制することが可能なため、肺がんを治療できる。本発明の治療薬は、前記本発明の核酸分子及び医薬の説明を援用できる。
本発明の肺がん治療薬は、前述のように、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む。本発明の治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成及び条件は、特に制限されない。本発明の肺がん治療薬は、例えば、１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオールともいう）を含むことが好ましい。本発明の治療薬は、前記本発明の核酸分子を含むため、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制しうる。後述する実施例に示すように、本発明の核酸分子は、肺がん細胞の増殖を抑制でき、例えば、１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３の存在下においては、さらに肺がん細胞の増殖を抑制できる。本発明の肺がん治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１を含み、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制することが可能なため、肺がんを治療できる。本発明の治療薬は、前記本発明の核酸分子及び医薬の説明を援用できる。
【0096】
本発明の治療薬の使用方法は、前記本発明の医薬の説明を援用できる。
【0097】
＜前立腺がん治療薬＞
本発明の前立腺がん治療薬は、前述のように、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む。本発明の治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成及び条件は、特に制限されない。本発明の治療薬は、前記本発明の核酸分子を含むため、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制しうる。下記参考文献２に記載のように、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制することにより、前立腺がんの治療が可能なことが知られている。本発明の前立腺がん治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１を含み、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制することが可能なため、前立腺がんを治療できる。本発明の治療薬は、前記本発明の核酸分子及び医薬の説明を援用できる。
参考文献２ Aruna V Krishnan, et al. “The role of vitamin D in prostate cancer” Recent Results in Cancer Research, Vol. 164, 2003;164:205-21
本発明の前立腺がん治療薬は、前述のように、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む。本発明の治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成及び条件は、特に制限されない。本発明の治療薬は、前記本発明の核酸分子を含むため、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制しうる。下記参考文献２に記載のように、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制することにより、前立腺がんの治療が可能なことが知られている。本発明の前立腺がん治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１を含み、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制することが可能なため、前立腺がんを治療できる。本発明の治療薬は、前記本発明の核酸分子及び医薬の説明を援用できる。
参考文献２ Aruna V Krishnan, et al. “The role of vitamin D in prostate cancer” Recent Results in Cancer Research, Vol. 164, 2003;164:205-21
【0098】
本発明の治療薬の使用方法は、前記本発明の医薬の説明を援用できる。
【0099】
＜慢性腎臓病治療薬＞
本発明の慢性腎臓病治療薬は、前述のように、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む。本発明の治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成及び条件は、特に制限されない。本発明の治療薬は、前記本発明の核酸分子を含むため、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制しうる。下記参考文献３及び４に記載のように、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制することにより、慢性腎臓病の治療が可能なことが知られている。本発明の慢性腎臓病治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１を含み、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制することが可能なため、慢性腎臓病を治療できる。本発明の治療薬は、前記本発明の核酸分子及び医薬の説明を援用できる。
参考文献３ Gary H.Posner, et al. “Vitamin D analogues targeting CYP24 in chronic kidney disease” The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology Volume 121, Issues 1-2, July 2010, Pages 13-19
参考文献４ Xiuying Bai, et al. “CYP24 inhibition as a therapeutic target in FGF23-mediated renal phosphate wasting disorders” The Journal of Clinical Investigation, 2016;126(2):667-680.
本発明の慢性腎臓病治療薬は、前述のように、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む。本発明の治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成及び条件は、特に制限されない。本発明の治療薬は、前記本発明の核酸分子を含むため、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制しうる。下記参考文献３及び４に記載のように、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制することにより、慢性腎臓病の治療が可能なことが知られている。本発明の慢性腎臓病治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１を含み、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制することが可能なため、慢性腎臓病を治療できる。本発明の治療薬は、前記本発明の核酸分子及び医薬の説明を援用できる。
参考文献３ Gary H.Posner, et al. “Vitamin D analogues targeting CYP24 in chronic kidney disease” The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology Volume 121, Issues 1-2, July 2010, Pages 13-19
参考文献４ Xiuying Bai, et al. “CYP24 inhibition as a therapeutic target in FGF23-mediated renal phosphate wasting disorders” The Journal of Clinical Investigation, 2016;126(2):667-680.
【0100】
本発明の治療薬の使用方法は、前記本発明の医薬の説明を援用できる。
【0101】
＜くる病治療薬＞
本発明のくる病治療薬は、前述のように、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む。本発明の治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成及び条件は、特に制限されない。本発明の治療薬は、前記本発明の核酸分子を含むため、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制しうる。下記参考文献４に記載のように、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制することにより、くる病の治療が可能なことが知られている。本発明のくる病治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１を含み、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制することが可能なため、くる病を治療できる。本発明の治療薬は、前記本発明の核酸分子及び医薬の説明を援用できる。
参考文献４ Xiuying Bai, et al. “CYP24 inhibition as a therapeutic target in FGF23-mediated renal phosphate wasting disorders” The Journal of Clinical Investigation, 2016;126(2):667-680.
本発明のくる病治療薬は、前述のように、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む。本発明の治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成及び条件は、特に制限されない。本発明の治療薬は、前記本発明の核酸分子を含むため、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制しうる。下記参考文献４に記載のように、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制することにより、くる病の治療が可能なことが知られている。本発明のくる病治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１を含み、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制することが可能なため、くる病を治療できる。本発明の治療薬は、前記本発明の核酸分子及び医薬の説明を援用できる。
参考文献４ Xiuying Bai, et al. “CYP24 inhibition as a therapeutic target in FGF23-mediated renal phosphate wasting disorders” The Journal of Clinical Investigation, 2016;126(2):667-680.
【0102】
本発明の治療薬の使用方法は、前記本発明の医薬の説明を援用できる。
【0103】
＜骨軟化症治療薬＞
本発明の骨軟化症治療薬は、前述のように、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む。本発明の治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成及び条件は、特に制限されない。本発明の治療薬は、前記本発明の核酸分子を含むため、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制しうる。下記参考文献４に記載のように、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制することにより、骨軟化症の治療が可能なことが知られている。本発明の骨軟化症治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１を含み、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制することが可能なため、くる病を治療できる。本発明の治療薬は、前記本発明の核酸分子及び医薬の説明を援用できる。
参考文献４ Xiuying Bai, et al. “CYP24 inhibition as a therapeutic target in FGF23-mediated renal phosphate wasting disorders” The Journal of Clinical Investigation, 2016;126(2):667-680.
本発明の骨軟化症治療薬は、前述のように、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む。本発明の治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成及び条件は、特に制限されない。本発明の治療薬は、前記本発明の核酸分子を含むため、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制しうる。下記参考文献４に記載のように、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制することにより、骨軟化症の治療が可能なことが知られている。本発明の骨軟化症治療薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１を含み、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制することが可能なため、くる病を治療できる。本発明の治療薬は、前記本発明の核酸分子及び医薬の説明を援用できる。
参考文献４ Xiuying Bai, et al. “CYP24 inhibition as a therapeutic target in FGF23-mediated renal phosphate wasting disorders” The Journal of Clinical Investigation, 2016;126(2):667-680.
【0104】
本発明の治療薬の使用方法は、前記本発明の医薬の説明を援用できる。
【0105】
＜検出試薬＞
本発明のＣＹＰ２４Ａ１の検出試薬は、前述のように、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む。本発明の検出試薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成及び条件は、特に制限されない。本発明の核酸分子は、ＣＹＰ２４Ａ１に結合する。このため、本発明の検出試薬は、ＣＹＰ２４Ａ１を検出できる。本発明の検出試薬は、例えば、前記本発明の核酸分子の説明を援用できる。
本発明のＣＹＰ２４Ａ１の検出試薬は、前述のように、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む。本発明の検出試薬は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成及び条件は、特に制限されない。本発明の核酸分子は、ＣＹＰ２４Ａ１に結合する。このため、本発明の検出試薬は、ＣＹＰ２４Ａ１を検出できる。本発明の検出試薬は、例えば、前記本発明の核酸分子の説明を援用できる。
【0106】
本発明によれば、前記本発明の核酸分子が、ＣＹＰ２４Ａ１に結合することから、例えば、ＣＹＰ２４Ａ１と前記核酸分子との結合を検出することによって、試料中のＣＹＰ２４Ａ１を検出可能である。具体的には、例えば、試料中のＣＹＰ２４Ａ１の有無又はＣＹＰ２４Ａ１の量を分析可能である。このため、本発明の検出試薬は、例えば、分析試薬ということもできる。本発明の検出試薬によれば、例えば、定性又は定量的な分析が可能といえる。
【0107】
本発明において、前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、前述の細胞、組織抽出物等があげられる。前記試料は、ＣＹＰ２４Ａ１を含む試料でもよいし、ＣＹＰ２４Ａ１を含まない試料でもよいし、ＣＹＰ２４Ａ１を含むか否かが不明の試料でもよい。
【0108】
前記試料は、例えば、液体試料でもよいし、固体試料でもよい。前記試料は、例えば、前記核酸分子と接触させ易く、取扱いが簡便であることから、液体試料が好ましい。前記固体試料の場合、例えば、溶媒を用いて、混合液、抽出液、溶解液等を調製し、これを使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
【0109】
前記検出工程は、例えば、前記試料と前記核酸分子とを接触させて、前記試料中のＣＹＰ２４Ａ１と前記核酸分子とを結合させる接触工程と、ＣＹＰ２４Ａ１と前記核酸分子との結合を検出する結合検出工程とを含む。また、前記検出工程は、例えば、さらに、前記結合検出工程の結果に基づいて、前記試料中のＣＹＰ２４Ａ１の有無又は量を分析する分析工程を含む。
【0110】
前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触方法は、特に制限されない。前記試料と前記核酸分子との接触は、例えば、液体中で行われることが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
【0111】
前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触条件は、特に制限されない。接触温度は、例えば、４～３７℃、１８～２５℃であり、接触時間は、例えば、１０～１２０分、３０～６０分である。
【0112】
前記接触工程において、前記核酸分子は、例えば、担体に固定化された固定化核酸分子でもよいし、未固定の遊離した核酸分子でもよい。後者の場合、例えば、容器内で、前記試料と接触させる。前記核酸分子は、例えば、取扱性に優れることから、前記固定化核酸分子でもよい。前記担体は、特に制限されず、例えば、基板、ビーズ、容器等があげられ、前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。
【0113】
前記結合検出工程は、前述のように、前記試料中のＣＹＰ２４Ａ１と前記核酸分子との結合を検出する工程である。前記両者の結合の有無を検出することによって、例えば、前記試料中のＣＹＰ２４Ａ１の有無を分析（定性）でき、また、前記両者の結合の程度（結合量）を検出することによって、例えば、前記試料中のＣＹＰ２４Ａ１の量を分析（定量）できる。
【0114】
そして、ＣＹＰ２４Ａ１と前記核酸分子との結合が検出できなかった場合は、前記試料中にＣＹＰ２４Ａ１は存在しないと判断でき、前記結合が検出された場合は、前記試料中にＣＹＰ２４Ａ１が存在すると判断できる。
【0115】
ＣＹＰ２４Ａ１と前記核酸分子との結合の分析方法は、特に制限されない。前記方法は、例えば、物質間の結合を検出する従来公知の方法が採用でき、具体例として、前述の検出方法があげられる。また、前記結合は、例えば、ＣＹＰ２４Ａ１と前記核酸分子との複合体の検出でもよい。この場合、前記核酸分子は、標識物質により標識されていることが好ましい。前記核酸分子が標識されている場合、前記ＣＹＰ２４Ａ１と前記核酸分子との結合は、例えば、前記標識を検出することにより分析できる。
【0116】
＜検出キット＞
本発明の検出キットは、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む。本発明の検出キットは、前記本発明の核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成及び条件は、特に制限されない。本発明の検出キットによれば、例えば、ＣＹＰ２４Ａ１の検出等を行うことができる。本発明の検出キットは、前記本発明の核酸分子及び検出試薬の説明を援用できる。
本発明の検出キットは、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む。本発明の検出キットは、前記本発明の核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成及び条件は、特に制限されない。本発明の検出キットによれば、例えば、ＣＹＰ２４Ａ１の検出等を行うことができる。本発明の検出キットは、前記本発明の核酸分子及び検出試薬の説明を援用できる。
【0117】
前記本発明の検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子の他に、その他の構成要素を含んでもよい。前記構成要素は、例えば、前記担体、緩衝液、使用説明書等があげられる。
【0118】
＜処置方法＞
本発明の処置方法は、投与対象に、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を投与する投与工程を含む。本発明の処置方法は、投与対象に、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を投与することが特徴であり、その他の工程及び条件は、特に制限されない。本発明の処置方法は、本発明の核酸分子を投与するため、前記投与対象におけるＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制しうる。本発明の処置方法は、前記本発明の核酸分子、医薬、及び活性制御剤の説明を援用できる。
本発明の処置方法は、投与対象に、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を投与する投与工程を含む。本発明の処置方法は、投与対象に、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を投与することが特徴であり、その他の工程及び条件は、特に制限されない。本発明の処置方法は、本発明の核酸分子を投与するため、前記投与対象におけるＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制しうる。本発明の処置方法は、前記本発明の核酸分子、医薬、及び活性制御剤の説明を援用できる。
【0119】
前記投与対象が、例えば、ビタミンＤの欠乏に起因する疾患を有する患者の場合、本発明の処置方法は、例えば、当該疾患の治療方法ということもできる。
【0120】
本発明の処置方法の投与条件は、前記本発明の医薬の説明を援用できる。
【0121】
＜活性抑制方法＞
本発明のＣＹＰ２４Ａ１の活性抑制方法（以下、「活性抑制方法」ともいう）は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を用いる。本発明の活性抑制方法は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を用いることが特徴であり、その他の工程及び条件は、特に制限されない。本発明の活性抑制方法は、本発明の核酸分子を用いるため、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制しうる。また、ＣＹＰ２４Ａ１は、ビタミンＤの不活性化において機能している。このため、本発明の活性抑制方法は、ビタミンＤの不活性化抑制方法として機能すると期待される。本発明の活性抑制方法は、前記本発明の核酸分子、医薬、及び活性抑制剤の説明を援用できる。
本発明のＣＹＰ２４Ａ１の活性抑制方法（以下、「活性抑制方法」ともいう）は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を用いる。本発明の活性抑制方法は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を用いることが特徴であり、その他の工程及び条件は、特に制限されない。本発明の活性抑制方法は、本発明の核酸分子を用いるため、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を抑制しうる。また、ＣＹＰ２４Ａ１は、ビタミンＤの不活性化において機能している。このため、本発明の活性抑制方法は、ビタミンＤの不活性化抑制方法として機能すると期待される。本発明の活性抑制方法は、前記本発明の核酸分子、医薬、及び活性抑制剤の説明を援用できる。
【0122】
本発明の活性抑制方法の投与条件は、前記本発明の医薬の説明を援用できる。
【0123】
＜肺がん治療方法＞
本発明の肺がん治療方法は、前述のように、対象に肺がん治療薬を投与する投与工程を含み、前記肺がん治療薬が、前記本発明の肺がん治療薬である。本発明の肺がん治療方法は、対象に前記本発明の肺がん治療薬を投与すること、すなわち、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を投与することが特徴であり、その他の工程及び条件は、特に制限されない。本発明の肺がん治療方法は、対象に、前記本発明の肺がん治療薬を投与するため、投与対象の肺がんを治療できる。本発明の肺がん治療方法は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子、医薬、肺がん治療薬の説明を援用できる。
本発明の肺がん治療方法は、前述のように、対象に肺がん治療薬を投与する投与工程を含み、前記肺がん治療薬が、前記本発明の肺がん治療薬である。本発明の肺がん治療方法は、対象に前記本発明の肺がん治療薬を投与すること、すなわち、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を投与することが特徴であり、その他の工程及び条件は、特に制限されない。本発明の肺がん治療方法は、対象に、前記本発明の肺がん治療薬を投与するため、投与対象の肺がんを治療できる。本発明の肺がん治療方法は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子、医薬、肺がん治療薬の説明を援用できる。
【0124】
本発明の肺がん治療方法において、前記投与工程は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで行なってもよい。本発明の肺がん治療薬の投与対象及び投与条件は、例えば、本発明の医薬における投与対象及び投与条件の説明を援用できる。
【0125】
＜前立腺がん治療方法＞
本発明の前立腺がん治療方法は、前述のように、対象に前立腺がん治療薬を投与する投与工程を含み、前記前立腺がん治療薬が、前記本発明の前立腺がん治療薬である。本発明の前立腺がん治療方法は、対象に前記本発明の前立腺がん治療薬を投与すること、すなわち、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を投与することが特徴であり、その他の工程及び条件は、特に制限されない。本発明の前立腺がん治療方法は、対象に、前記本発明の前立腺がん治療薬を投与するため、投与対象の前立腺がんを治療できる。本発明の前立腺がん治療方法は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子、医薬、前立腺がん治療薬の説明を援用できる。
本発明の前立腺がん治療方法は、前述のように、対象に前立腺がん治療薬を投与する投与工程を含み、前記前立腺がん治療薬が、前記本発明の前立腺がん治療薬である。本発明の前立腺がん治療方法は、対象に前記本発明の前立腺がん治療薬を投与すること、すなわち、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を投与することが特徴であり、その他の工程及び条件は、特に制限されない。本発明の前立腺がん治療方法は、対象に、前記本発明の前立腺がん治療薬を投与するため、投与対象の前立腺がんを治療できる。本発明の前立腺がん治療方法は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子、医薬、前立腺がん治療薬の説明を援用できる。
【0126】
本発明の前立腺がん治療方法において、前記投与工程は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで行なってもよい。本発明の前立腺がん治療薬の投与対象及び投与条件は、例えば、本発明の医薬における投与対象及び投与条件の説明を援用できる。
【0127】
＜慢性腎臓病治療方法＞
本発明の慢性腎臓病治療方法は、前述のように、対象に慢性腎臓病治療薬を投与する投与工程を含み、前記慢性腎臓病治療薬が、前記本発明の慢性腎臓病治療薬である。本発明の慢性腎臓病治療方法は、対象に前記本発明の慢性腎臓病治療薬を投与すること、すなわち、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を投与することが特徴であり、その他の工程及び条件は、特に制限されない。本発明の慢性腎臓病治療方法は、対象に、前記本発明の慢性腎臓病治療薬を投与するため、投与対象の慢性腎臓病を治療できる。本発明の慢性腎臓病治療方法は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子、医薬、慢性腎臓病治療薬の説明を援用できる。
本発明の慢性腎臓病治療方法は、前述のように、対象に慢性腎臓病治療薬を投与する投与工程を含み、前記慢性腎臓病治療薬が、前記本発明の慢性腎臓病治療薬である。本発明の慢性腎臓病治療方法は、対象に前記本発明の慢性腎臓病治療薬を投与すること、すなわち、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を投与することが特徴であり、その他の工程及び条件は、特に制限されない。本発明の慢性腎臓病治療方法は、対象に、前記本発明の慢性腎臓病治療薬を投与するため、投与対象の慢性腎臓病を治療できる。本発明の慢性腎臓病治療方法は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子、医薬、慢性腎臓病治療薬の説明を援用できる。
【0128】
本発明の慢性腎臓病治療方法において、前記投与工程は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで行なってもよい。本発明の慢性腎臓病治療薬の投与対象及び投与条件は、例えば、本発明の医薬における投与対象及び投与条件の説明を援用できる。
【0129】
＜くる病治療方法＞
本発明のくる病治療方法は、前述のように、対象にくる病治療薬を投与する投与工程を含み、前記くる病治療薬が、前記本発明のくる病治療薬である。本発明のくる病治療方法は、対象に前記本発明のくる病治療薬を投与すること、すなわち、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を投与することが特徴であり、その他の工程及び条件は、特に制限されない。本発明のくる病治療方法は、対象に、前記本発明のくる病治療薬を投与するため、投与対象のくる病を治療できる。本発明のくる病治療方法は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子、医薬、くる病治療薬の説明を援用できる。
本発明のくる病治療方法は、前述のように、対象にくる病治療薬を投与する投与工程を含み、前記くる病治療薬が、前記本発明のくる病治療薬である。本発明のくる病治療方法は、対象に前記本発明のくる病治療薬を投与すること、すなわち、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を投与することが特徴であり、その他の工程及び条件は、特に制限されない。本発明のくる病治療方法は、対象に、前記本発明のくる病治療薬を投与するため、投与対象のくる病を治療できる。本発明のくる病治療方法は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子、医薬、くる病治療薬の説明を援用できる。
【0130】
本発明のくる病治療方法において、前記投与工程は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで行なってもよい。本発明のくる病治療薬の投与対象及び投与条件は、例えば、本発明の医薬における投与対象及び投与条件の説明を援用できる。
【0131】
＜骨軟化症治療方法＞
本発明の骨軟化症治療方法は、前述のように、対象に骨軟化症治療薬を投与する投与工程を含み、前記骨軟化症治療薬が、前記本発明の骨軟化症治療薬である。本発明の骨軟化症治療方法は、対象に前記本発明の骨軟化症治療薬を投与すること、すなわち、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を投与することが特徴であり、その他の工程及び条件は、特に制限されない。本発明の骨軟化症治療方法は、対象に、前記本発明の骨軟化症治療薬を投与するため、投与対象の骨軟化症を治療できる。本発明の骨軟化症治療方法は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子、医薬、骨軟化症治療薬の説明を援用できる。
本発明の骨軟化症治療方法は、前述のように、対象に骨軟化症治療薬を投与する投与工程を含み、前記骨軟化症治療薬が、前記本発明の骨軟化症治療薬である。本発明の骨軟化症治療方法は、対象に前記本発明の骨軟化症治療薬を投与すること、すなわち、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を投与することが特徴であり、その他の工程及び条件は、特に制限されない。本発明の骨軟化症治療方法は、対象に、前記本発明の骨軟化症治療薬を投与するため、投与対象の骨軟化症を治療できる。本発明の骨軟化症治療方法は、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子、医薬、骨軟化症治療薬の説明を援用できる。
【0132】
本発明の骨軟化症治療方法において、前記投与工程は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで行なってもよい。本発明の骨軟化症治療薬の投与対象及び投与条件は、例えば、本発明の医薬における投与対象及び投与条件の説明を援用できる。
【0133】
＜検出方法＞
本発明のＣＹＰ２４Ａ１の検出方法（以下、「検出方法」ともいう）は、試料と、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子とを接触させ、前記試料中のＣＹＰ２４Ａ１と前記核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のＣＹＰ２４Ａ１を検出する工程を含む。本発明の検出方法は、前記本発明の核酸分子を用いることが特徴であり、その他の工程及び条件は、特に制限されない。本発明の核酸分子は、ＣＹＰ２４Ａ１に結合する。このため、本発明の検出方法は、ＣＹＰ２４Ａ１を検出できる。本発明の検出方法は、例えば、前記本発明の核酸分子、検出試薬、及び検出キットの説明を援用できる。
本発明のＣＹＰ２４Ａ１の検出方法（以下、「検出方法」ともいう）は、試料と、前記本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子とを接触させ、前記試料中のＣＹＰ２４Ａ１と前記核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のＣＹＰ２４Ａ１を検出する工程を含む。本発明の検出方法は、前記本発明の核酸分子を用いることが特徴であり、その他の工程及び条件は、特に制限されない。本発明の核酸分子は、ＣＹＰ２４Ａ１に結合する。このため、本発明の検出方法は、ＣＹＰ２４Ａ１を検出できる。本発明の検出方法は、例えば、前記本発明の核酸分子、検出試薬、及び検出キットの説明を援用できる。
【0134】
本発明の検出方法は、前記核酸分子として、前記本発明の検出キットを用いてもよい。
【0135】
＜核酸分子の使用＞
本発明は、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を制御するための、本発明の核酸分子又はその使用であり、ＣＹＰ２４Ａ１の検出のための、本発明の核酸分子又はその使用であり、肺がん治療のための、本発明の核酸分子又はその使用であり、前立腺がん治療のための、本発明の核酸分子又はその使用であり、慢性腎臓病治療のための、本発明の核酸分子又はその使用であり、くる病治療のための、本発明の核酸分子又はその使用であり、骨軟化症治療のための、本発明の核酸分子又はその使用である。本発明は、前記本発明の核酸分子、医薬、活性抑制剤、肺がん治療薬、前立腺がん治療薬、慢性腎臓病治療薬、くる病治療薬、骨軟化症治療薬、検出試薬、検出キット、処置方法、活性抑制方法、肺がん治療方法、前立腺がん治療方法、慢性腎臓病治療方法、くる病治療方法、骨軟化症治療方法、及び検出方法の説明を援用できる。
本発明は、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を制御するための、本発明の核酸分子又はその使用であり、ＣＹＰ２４Ａ１の検出のための、本発明の核酸分子又はその使用であり、肺がん治療のための、本発明の核酸分子又はその使用であり、前立腺がん治療のための、本発明の核酸分子又はその使用であり、慢性腎臓病治療のための、本発明の核酸分子又はその使用であり、くる病治療のための、本発明の核酸分子又はその使用であり、骨軟化症治療のための、本発明の核酸分子又はその使用である。本発明は、前記本発明の核酸分子、医薬、活性抑制剤、肺がん治療薬、前立腺がん治療薬、慢性腎臓病治療薬、くる病治療薬、骨軟化症治療薬、検出試薬、検出キット、処置方法、活性抑制方法、肺がん治療方法、前立腺がん治療方法、慢性腎臓病治療方法、くる病治療方法、骨軟化症治療方法、及び検出方法の説明を援用できる。
【実施例0136】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。
【0137】
［実施例１］
本発明の核酸分子を、前記参考文献１に記載のＳＥＬＣＯＳ法により取得できることを確認した。
本発明の核酸分子を、前記参考文献１に記載のＳＥＬＣＯＳ法により取得できることを確認した。
【0138】
（１）ＤＮＡプールの調製
ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を取得するための一本鎖の核酸プールとして、下記配列番号２３の塩基配列からなるポリヌクレオチドのプールを準備した。下記配列番号２３において、５’末端及び３’末端の２０塩基がプライマー配列であり、中央の３０塩基がランダム配列である。下記塩基配列２３において、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴである。そして、下記フォワードプライマー（配列番号２４）及びビオチン化リバースプライマー（配列番号２５）を用いたＰＣＲ法により、ＤＮＡライブラリーを調製した。前記ＤＮＡライブラリーは、およそ１０１８種類の多様性を有する。
核酸プール（配列番号２３）
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’
フォワードプライマー（配列番号２４）
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’
ビオチン化リバースプライマー（配列番号２５）
5’-TTCACGGTAGCAGCGATAGG-3’
ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を取得するための一本鎖の核酸プールとして、下記配列番号２３の塩基配列からなるポリヌクレオチドのプールを準備した。下記配列番号２３において、５’末端及び３’末端の２０塩基がプライマー配列であり、中央の３０塩基がランダム配列である。下記塩基配列２３において、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴである。そして、下記フォワードプライマー（配列番号２４）及びビオチン化リバースプライマー（配列番号２５）を用いたＰＣＲ法により、ＤＮＡライブラリーを調製した。前記ＤＮＡライブラリーは、およそ１０１８種類の多様性を有する。
核酸プール（配列番号２３）
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’
フォワードプライマー（配列番号２４）
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’
ビオチン化リバースプライマー（配列番号２５）
5’-TTCACGGTAGCAGCGATAGG-3’
【0139】
（２）固定化標的の作成
まず、下記参考文献５を参考にし、ヒト由来ＣＹＰ２４Ａ１を発現する大腸菌を調製し、前記大腸菌からヒト由来ＣＹＰ２４Ａ１を採取した。つぎに、下記参考文献６を参考にし、マウス由来ＣＹＰ２７Ｂ１を発現する大腸菌を調製し、前記大腸菌からマウス由来ＣＹＰ２７Ｂ１を採取した。なお、ＣＹＰ２７Ｂ１は、マウスとヒトとの種差が見られないことが知られており、マウス由来ＣＹＰ２７Ｂ１における結果は、ヒト由来ＣＹＰ２７Ｂ１における結果と同様となることが推定できる。そして、Ｎｉ－ＮＴＡ磁性ビーズ（５０μｍ、QIAGEN社）上に、前記ヒト由来ＣＹＰ２４Ａ１、Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂ビーズ（４５－１６５μｍ、QIAGEN社）上に、前記マウス由来ＣＹＰ２７Ｂ１をそれぞれ、各ビーズのプロトコルに従って固定化し、固定化ＣＹＰ２４Ａ１及び固定化ＣＹＰ２７Ｂ１を調製した。前記固定化ＣＹＰ２４Ａ１は、本発明の結合核酸分子の標的タンパク質であり、前記固定化ＣＹＰ２７Ｂ１は、本発明の結合核酸分子における競合標的タンパク質である。
参考文献５：Kusudo et al.,“Metabolism of A-ring diastereomers of 1α,25-dihydroxyvitamin D3 by CYP24A1”, BBRC 321, 774, 2004
参考文献６：Uchida et al.,“Purification and characterization of mouse CYP27B1 overproduced by an Escherichia coli system coexpressing molecular chaperonins GroEL/ES”, BBRC 323, 505, 2004
まず、下記参考文献５を参考にし、ヒト由来ＣＹＰ２４Ａ１を発現する大腸菌を調製し、前記大腸菌からヒト由来ＣＹＰ２４Ａ１を採取した。つぎに、下記参考文献６を参考にし、マウス由来ＣＹＰ２７Ｂ１を発現する大腸菌を調製し、前記大腸菌からマウス由来ＣＹＰ２７Ｂ１を採取した。なお、ＣＹＰ２７Ｂ１は、マウスとヒトとの種差が見られないことが知られており、マウス由来ＣＹＰ２７Ｂ１における結果は、ヒト由来ＣＹＰ２７Ｂ１における結果と同様となることが推定できる。そして、Ｎｉ－ＮＴＡ磁性ビーズ（５０μｍ、QIAGEN社）上に、前記ヒト由来ＣＹＰ２４Ａ１、Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂ビーズ（４５－１６５μｍ、QIAGEN社）上に、前記マウス由来ＣＹＰ２７Ｂ１をそれぞれ、各ビーズのプロトコルに従って固定化し、固定化ＣＹＰ２４Ａ１及び固定化ＣＹＰ２７Ｂ１を調製した。前記固定化ＣＹＰ２４Ａ１は、本発明の結合核酸分子の標的タンパク質であり、前記固定化ＣＹＰ２７Ｂ１は、本発明の結合核酸分子における競合標的タンパク質である。
参考文献５：Kusudo et al.,“Metabolism of A-ring diastereomers of 1α,25-dihydroxyvitamin D3 by CYP24A1”, BBRC 321, 774, 2004
参考文献６：Uchida et al.,“Purification and characterization of mouse CYP27B1 overproduced by an Escherichia coli system coexpressing molecular chaperonins GroEL/ES”, BBRC 323, 505, 2004
【0140】
（３）セレクション
つぎに、前記（２）で得られた固定化標的と、前記（１）の核酸プールとを用いて、下記参考文献１を参照し、下記のステップでＳＥＬＣＯＳ法を実施した。
参考文献１：Ankita Kushwaha et al. “Competitive non-SELEX for the selective and rapid enrichment of DNA aptamers and its use in electrochemical aptasensor”, SCIENTIFIC REPORT, 2019 Apr 30, doi: 10.1038/s41598-019-43187-6
つぎに、前記（２）で得られた固定化標的と、前記（１）の核酸プールとを用いて、下記参考文献１を参照し、下記のステップでＳＥＬＣＯＳ法を実施した。
参考文献１：Ankita Kushwaha et al. “Competitive non-SELEX for the selective and rapid enrichment of DNA aptamers and its use in electrochemical aptasensor”, SCIENTIFIC REPORT, 2019 Apr 30, doi: 10.1038/s41598-019-43187-6
【0141】
（第１ステップ）
まず、前記（１）で得られたおよそ１０１８種類の核酸プールを、９０℃で５分間加熱した。その後、４℃に冷却して５分間静置し、２５℃で１５分間インキュベートした。そして、１０ｐｍｏｌの核酸分子を含む核酸プール５００μｌと、２０μｌの前記Ｎｉ－ＮＴＡ磁性ビーズ固定化ＣＹＰ２４Ａ１と、及び２０μｌの前記Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂ビーズ固定化ＣＹＰ２７Ｂ１とを、結合緩衝液の存在下で混合し、６０分間、２５℃でインキュベートし、前記核酸プールの候補核酸分子と、ＣＹＰ２４Ａ１又はＣＹＰ２７Ｂ１とを結合させた。前記結合緩衝液の組成は、２０ｍｍｏｌ／ｌ トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ ７．４；０．０１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０を含む）、１００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／ｌ ＣａＣｌ２）であった。
まず、前記（１）で得られたおよそ１０１８種類の核酸プールを、９０℃で５分間加熱した。その後、４℃に冷却して５分間静置し、２５℃で１５分間インキュベートした。そして、１０ｐｍｏｌの核酸分子を含む核酸プール５００μｌと、２０μｌの前記Ｎｉ－ＮＴＡ磁性ビーズ固定化ＣＹＰ２４Ａ１と、及び２０μｌの前記Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂ビーズ固定化ＣＹＰ２７Ｂ１とを、結合緩衝液の存在下で混合し、６０分間、２５℃でインキュベートし、前記核酸プールの候補核酸分子と、ＣＹＰ２４Ａ１又はＣＹＰ２７Ｂ１とを結合させた。前記結合緩衝液の組成は、２０ｍｍｏｌ／ｌ トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ ７．４；０．０１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０を含む）、１００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／ｌ ＣａＣｌ２）であった。
【0142】
（第２ステップ）
つぎに、洗浄緩衝液（２０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．４、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、１００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／ｌ ＣａＣｌ２）で洗浄し、試料溶液を１，０００ｇで１０秒間遠心分離し、上清を注意深く除去し、ＣＹＰ２４Ａ１又はＣＹＰ２７Ｂ１に結合していないか、結合が弱い核酸分子を除去した。前記洗浄は、２回実施した。そして、前記第１ステップ及び第２ステップを５ラウンド繰り返した。また、１ラウンド繰り返すごとに、前記核酸プールを５０ｐｍｏｌ、２５０ｐｍｏｌ、１０００ｐｍｏｌ、及び１０００ｐｍｏｌずつ追加し、さらに、１ラウンド繰り返すごとに、インキュベーション時間及び前記洗浄緩衝液のＮａＣｌ濃度を、３０分（２００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ）、１５分（４００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ）、１５分（８００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ）、及び１５分（２０００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ）にそれぞれ変化させた。
つぎに、洗浄緩衝液（２０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．４、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、１００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／ｌ ＣａＣｌ２）で洗浄し、試料溶液を１，０００ｇで１０秒間遠心分離し、上清を注意深く除去し、ＣＹＰ２４Ａ１又はＣＹＰ２７Ｂ１に結合していないか、結合が弱い核酸分子を除去した。前記洗浄は、２回実施した。そして、前記第１ステップ及び第２ステップを５ラウンド繰り返した。また、１ラウンド繰り返すごとに、前記核酸プールを５０ｐｍｏｌ、２５０ｐｍｏｌ、１０００ｐｍｏｌ、及び１０００ｐｍｏｌずつ追加し、さらに、１ラウンド繰り返すごとに、インキュベーション時間及び前記洗浄緩衝液のＮａＣｌ濃度を、３０分（２００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ）、１５分（４００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ）、１５分（８００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ）、及び１５分（２０００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ）にそれぞれ変化させた。
【0143】
（第３ステップ）
そして、前記洗浄後の上清について、マグネットスタンドを用いて、前記Ｎｉ－ＮＴＡ磁性ビーズ固定化ＣＹＰ２４Ａ１を分離し、さらに、１０００ｇ、１０秒間の遠心分離を行って前記Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂ビーズ固定化ＣＹＰ２７Ｂ１を分離し、上清を除去した。分離した前記Ｎｉ－ＮＴＡ磁性ビーズ固定化ＣＹＰ２４Ａ１及び前記Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂ビーズ固定化ＣＹＰ２７Ｂ１について、熱処理（９０℃、５分間の加熱後、直ちに上清を除去）を行って、各ビーズに結合した核酸分子を回収し、ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子の候補核酸プール及びＣＹＰ２７Ｂ１結合核酸分子の候補核酸プールとした。
そして、前記洗浄後の上清について、マグネットスタンドを用いて、前記Ｎｉ－ＮＴＡ磁性ビーズ固定化ＣＹＰ２４Ａ１を分離し、さらに、１０００ｇ、１０秒間の遠心分離を行って前記Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂ビーズ固定化ＣＹＰ２７Ｂ１を分離し、上清を除去した。分離した前記Ｎｉ－ＮＴＡ磁性ビーズ固定化ＣＹＰ２４Ａ１及び前記Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂ビーズ固定化ＣＹＰ２７Ｂ１について、熱処理（９０℃、５分間の加熱後、直ちに上清を除去）を行って、各ビーズに結合した核酸分子を回収し、ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子の候補核酸プール及びＣＹＰ２７Ｂ１結合核酸分子の候補核酸プールとした。
【0144】
（第４ステップ）
前記第３ステップで得られたＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子の候補核酸プールについて、前記結合緩衝液の存在下で、前記Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂ビーズと２５℃、１５分～２０分間の条件でインキュベートし、その後、前記Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂ビーズを前記第３ステップと同様にして除去することにより、非特異的候補を除去した。そして、得られたＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子の候補核酸プールについて、さらに、前記Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂ビーズ固定化ＣＹＰ２７Ｂ１と２５℃、１０分～１５分インキュベートしたあと、前記Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂ビーズ固定化ＣＹＰ２７Ｂ１を前記第３ステップと同様にして除去することにより、ＣＹＰ２７Ｂ１に結合する非特異的候補を除去し、ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸プールを得た。同様に、ＣＹＰ２７Ｂ１結合核酸分子の候補核酸プールについて、前記結合緩衝液の存在下で、前記Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂ビーズと２５℃、１５分～２０分間の条件でインキュベートし、その後、前記Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂ビーズを前記第３ステップと同様にして除去することにより、非特異的候補を除去した。そして、得られたＣＹＰ２７Ｂ１結合核酸分子の候補核酸プールについて、さらに、前記Ｎｉ－ＮＴＡ磁性ビーズ固定化ＣＹＰ２４Ａ１と２５℃、１０分インキュベートしたあと、前記Ｎｉ－ＮＴＡ磁性ビーズ固定化ＣＹＰ２４Ａ１を前記第３ステップと同様にして除去することにより、ＣＹＰ２４Ａ１に結合する非特異的候補を除去し、ＣＹＰ２７Ｂ１結合核酸プールを得た。
前記第３ステップで得られたＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子の候補核酸プールについて、前記結合緩衝液の存在下で、前記Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂ビーズと２５℃、１５分～２０分間の条件でインキュベートし、その後、前記Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂ビーズを前記第３ステップと同様にして除去することにより、非特異的候補を除去した。そして、得られたＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子の候補核酸プールについて、さらに、前記Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂ビーズ固定化ＣＹＰ２７Ｂ１と２５℃、１０分～１５分インキュベートしたあと、前記Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂ビーズ固定化ＣＹＰ２７Ｂ１を前記第３ステップと同様にして除去することにより、ＣＹＰ２７Ｂ１に結合する非特異的候補を除去し、ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸プールを得た。同様に、ＣＹＰ２７Ｂ１結合核酸分子の候補核酸プールについて、前記結合緩衝液の存在下で、前記Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂ビーズと２５℃、１５分～２０分間の条件でインキュベートし、その後、前記Ｎｉ－ＮＴＡアガロース樹脂ビーズを前記第３ステップと同様にして除去することにより、非特異的候補を除去した。そして、得られたＣＹＰ２７Ｂ１結合核酸分子の候補核酸プールについて、さらに、前記Ｎｉ－ＮＴＡ磁性ビーズ固定化ＣＹＰ２４Ａ１と２５℃、１０分インキュベートしたあと、前記Ｎｉ－ＮＴＡ磁性ビーズ固定化ＣＹＰ２４Ａ１を前記第３ステップと同様にして除去することにより、ＣＹＰ２４Ａ１に結合する非特異的候補を除去し、ＣＹＰ２７Ｂ１結合核酸プールを得た。
【0145】
（第５ステップ）
前記第４ステップで得られたＣＹＰ２４Ａ１結合核酸プール及びＣＹＰ２７Ｂ１結合核酸プールについて、前記フォワードプライマー（配列番号２４）及び前記ビオチン化リバースプライマー（配列番号２５）を用い、ＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲの条件は、「９８℃ ２分、９８℃ １０秒、５９℃ ５秒、７２℃ １０秒、７２℃ ４分」を２０サイクル繰り返した。そして、６０℃で８ｍｏｌ／ｌの尿素を含む８％ポリアクリルアミドゲルを使用したゲル電気泳動法により、増幅を確認した。
フォワードプライマー（配列番号２４）
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’
ビオチン化リバースプライマー（配列番号２５）
5’-TTCACGGTAGCAGCGATAGG-3’
前記第４ステップで得られたＣＹＰ２４Ａ１結合核酸プール及びＣＹＰ２７Ｂ１結合核酸プールについて、前記フォワードプライマー（配列番号２４）及び前記ビオチン化リバースプライマー（配列番号２５）を用い、ＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲの条件は、「９８℃ ２分、９８℃ １０秒、５９℃ ５秒、７２℃ １０秒、７２℃ ４分」を２０サイクル繰り返した。そして、６０℃で８ｍｏｌ／ｌの尿素を含む８％ポリアクリルアミドゲルを使用したゲル電気泳動法により、増幅を確認した。
フォワードプライマー（配列番号２４）
5’-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-3’
ビオチン化リバースプライマー（配列番号２５）
5’-TTCACGGTAGCAGCGATAGG-3’
【0146】
（４）配列解析
前記（３）で得られたＣＹＰ２４Ａ１結合核酸プール及びＣＹＰ２７Ｂ１結合核酸プールのそれぞれについて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮＧＳにて配列解析し、ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子及びＣＹＰ２７Ｂ１結合核酸分子のそれぞれについて、１０５種類程度の配列を得た。そして、下記に示す、配列番号１～１８のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を得た。なお、各配列の５’末端及び３’末端には、それぞれ、配列番号２１及び２２で示すプライマー結合配列が結合されているが、記載を省略している。
AptCYP24-#1（配列番号１）
5′-CGCCTGGGACCAACATCATGTCATCGTCTA-3′
AptCYP24-#2（配列番号２）
5′-CGCAAGCCACACTTTGTATGGACCAGTATC-3′
AptCYP24-#3（配列番号３）
5′-CAGGGCCATAAGCTGACCCAATCTTGTCGG-3′
AptCYP24-#4（配列番号４）
5′-AGACCAAGTTATGCAAGCTCATCTGTTGT-3′
AptCYP24-#5（配列番号５）
5′-CAGGACAGCACCCTGACCCAGTTCTGTATA-3′
AptCYP24-#6（配列番号６）
5′-CAGGGTCAATGGTCCCCAATCTACACAGAT-3′
AptCYP24-#7（配列番号７）
5′-CATGCAGGAAGTAACCCAATGTCCGTTAAC-3′
AptCYP24-#8（配列番号８）
5′-CAGCGTCACCATACCCTTTAACACCACGCA-3′
AptCYP24-#9（配列番号９）
5′-ACCTATACACCGACGAACCCTACTTCCTGA-3′
AptCYP24-#10（配列番号１０）
5′-CTTTTACCCCCCCGCTGCCTTTATACTTGA-3′
AptCYP24-#11（配列番号１１）
5′-CAAGCCGAAGTTACACACGGACCAATATGT-3′
AptCYP24-#12（配列番号１２）
5′-GCCACTCTTCGTACTCCTCCCTCTATCCGA-3′
AptCYP24-#13（配列番号１３）
5′-TCCCCCCCATAACCAACATTTAGCATCATG-3′
AptCYP24-#14（配列番号１４）
5′-TAGGTAGCAAGCAAACATGTATTCCTTTTC-3′
AptCYP24-#15（配列番号１５）
5′-GTAGCGCGACGTACAATATTTCTTTCCTCC-3′
AptCYP24-#16（配列番号１６）
5′-TGGACTTTTTCCGGTGGGAGACGAGGTTGC-3′
AptCYP24-#17（配列番号１７）
5′-ACCCAAGGACGTCACCGACTGCAGTGTTAT-3′
AptCYP24-#18（配列番号１８）
5′-ACCCTTAGCTCACCCTTCCCCGCCCGCCAC-3′
５´側末端プライマー結合配列（配列番号２１）
5´-AGCAGCACAG AGGTCAGATG
３´側末端プライマー結合配列（配列番号２２）
CCTATCGCTG CTACCGTGAA-3´
前記（３）で得られたＣＹＰ２４Ａ１結合核酸プール及びＣＹＰ２７Ｂ１結合核酸プールのそれぞれについて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮＧＳにて配列解析し、ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子及びＣＹＰ２７Ｂ１結合核酸分子のそれぞれについて、１０５種類程度の配列を得た。そして、下記に示す、配列番号１～１８のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を得た。なお、各配列の５’末端及び３’末端には、それぞれ、配列番号２１及び２２で示すプライマー結合配列が結合されているが、記載を省略している。
AptCYP24-#1（配列番号１）
5′-CGCCTGGGACCAACATCATGTCATCGTCTA-3′
AptCYP24-#2（配列番号２）
5′-CGCAAGCCACACTTTGTATGGACCAGTATC-3′
AptCYP24-#3（配列番号３）
5′-CAGGGCCATAAGCTGACCCAATCTTGTCGG-3′
AptCYP24-#4（配列番号４）
5′-AGACCAAGTTATGCAAGCTCATCTGTTGT-3′
AptCYP24-#5（配列番号５）
5′-CAGGACAGCACCCTGACCCAGTTCTGTATA-3′
AptCYP24-#6（配列番号６）
5′-CAGGGTCAATGGTCCCCAATCTACACAGAT-3′
AptCYP24-#7（配列番号７）
5′-CATGCAGGAAGTAACCCAATGTCCGTTAAC-3′
AptCYP24-#8（配列番号８）
5′-CAGCGTCACCATACCCTTTAACACCACGCA-3′
AptCYP24-#9（配列番号９）
5′-ACCTATACACCGACGAACCCTACTTCCTGA-3′
AptCYP24-#10（配列番号１０）
5′-CTTTTACCCCCCCGCTGCCTTTATACTTGA-3′
AptCYP24-#11（配列番号１１）
5′-CAAGCCGAAGTTACACACGGACCAATATGT-3′
AptCYP24-#12（配列番号１２）
5′-GCCACTCTTCGTACTCCTCCCTCTATCCGA-3′
AptCYP24-#13（配列番号１３）
5′-TCCCCCCCATAACCAACATTTAGCATCATG-3′
AptCYP24-#14（配列番号１４）
5′-TAGGTAGCAAGCAAACATGTATTCCTTTTC-3′
AptCYP24-#15（配列番号１５）
5′-GTAGCGCGACGTACAATATTTCTTTCCTCC-3′
AptCYP24-#16（配列番号１６）
5′-TGGACTTTTTCCGGTGGGAGACGAGGTTGC-3′
AptCYP24-#17（配列番号１７）
5′-ACCCAAGGACGTCACCGACTGCAGTGTTAT-3′
AptCYP24-#18（配列番号１８）
5′-ACCCTTAGCTCACCCTTCCCCGCCCGCCAC-3′
５´側末端プライマー結合配列（配列番号２１）
5´-AGCAGCACAG AGGTCAGATG
３´側末端プライマー結合配列（配列番号２２）
CCTATCGCTG CTACCGTGAA-3´
【0147】
前記１８配列の結合核酸分子を、反復数に従って配列をフィルタリングし、それらの相同性に基づいてクラスター分類した。フィルター処理、クラスタリングにはＣｌｕｓｔａｌＷを使用した。この結果、前記１８配列の結合核酸分子について、推定二次構造及びステムループの位置に基づいて、下記表１に示す６種類のクラスターに分類することができた。
【0148】
【表1】
【0149】
前記６種類のクラスターから、代表的な１１配列、すなわち、AptCYP24-#1（配列番号１）、AptCYP24-#2（配列番号２）、AptCYP24-#3（配列番号３）、AptCYP24-#5（配列番号５）、AptCYP24-#7（配列番号７）、AptCYP24-#11（配列番号１１）、AptCYP24-#12（配列番号１２）、AptCYP24-#15（配列番号１５）、AptCYP24-#16（配列番号１６）、AptCYP24-#17（配列番号１７）、AptCYP24-#18（配列番号１８）について、Ｍｆｏｌｄを使用して二次構造を解析した。各結合核酸分子の推定二次構造を図１（図１Ａ－１、Ａ－２、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ－１、Ｅ－２）に示す。図１Ａ－１の左図は、AptCYP24-#1（配列番号１）の推定二次構造を示し、右図は、AptCYP24-#2（配列番号２）の推定二次構造を示す。図１Ａ－２の左図は、AptCYP24-#3（配列番号３）の推定二次構造を示し、右図は、AptCYP24-#5（配列番号５）の推定二次構造を示す。図１Ｂは、AptCYP24-#7（配列番号７）の推定二次構造を示す。図１Ｃの左図は、AptCYP24-#11（配列番号１１）の推定二次構造を示し、右図は、AptCYP24-#12（配列番号１２）の推定二次構造を示す。図１Ｄは、AptCYP24-#15（配列番号１５）の推定二次構造を示す。図１Ｅ－１の左図は、AptCYP24-#16（配列番号１６）の推定二次構造を示し、右図は、AptCYP24-#17（配列番号１７）の推定二次構造を示す。図１Ｅ－２は、AptCYP24-#18（配列番号１８）の推定二次構造を示す。
【0150】
（５）ＣＹＰ２４Ａ１への結合確認
また、得られたＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子のうち、AptCYP24-#7（配列番号７）を用いて、ＣＹＰ２４Ａ１をターゲットとするゲルシフトアッセイ（electrophoretic mobility shift assay (EMSA)）を行い、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子がＣＹＰ２４Ａに結合することを確認した。具体的には、８０ｎｍｏｌ／ｌのAptCYP24-#7（配列番号７）を、所定濃度（０．１μｍｏｌ／ｌ、０．５μｍｏｌ／ｌ、１μｍｏｌ／ｌ、５μｍｏｌ／ｌ）のＣＹＰ２４Ａ１と混合し、室温で３０分間インキュベートした。つぎに、各サンプル１０μｌと、４μｌのＥＭＳＡサンプルバッファー（０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ／１０％（ｖ／ｖ） ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ （ｐＨ ６．８）とを混合し、１２％ＰＡＧＥゲルにロードし、１００ｖで、１時間泳動した。コントロールは、ＣＹＰ２４Ａ１と混合していないAptCYP24-#7（配列番号７）単独とした。その後、ゲルをSYBR（商標） Gold Nucleic Acid Gel Stainで染色し、UV Transilluminator Imaging Systemで撮影し、Ｉｍａｇｅｊで解析した。
また、得られたＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子のうち、AptCYP24-#7（配列番号７）を用いて、ＣＹＰ２４Ａ１をターゲットとするゲルシフトアッセイ（electrophoretic mobility shift assay (EMSA)）を行い、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子がＣＹＰ２４Ａに結合することを確認した。具体的には、８０ｎｍｏｌ／ｌのAptCYP24-#7（配列番号７）を、所定濃度（０．１μｍｏｌ／ｌ、０．５μｍｏｌ／ｌ、１μｍｏｌ／ｌ、５μｍｏｌ／ｌ）のＣＹＰ２４Ａ１と混合し、室温で３０分間インキュベートした。つぎに、各サンプル１０μｌと、４μｌのＥＭＳＡサンプルバッファー（０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ／１０％（ｖ／ｖ） ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ （ｐＨ ６．８）とを混合し、１２％ＰＡＧＥゲルにロードし、１００ｖで、１時間泳動した。コントロールは、ＣＹＰ２４Ａ１と混合していないAptCYP24-#7（配列番号７）単独とした。その後、ゲルをSYBR（商標） Gold Nucleic Acid Gel Stainで染色し、UV Transilluminator Imaging Systemで撮影し、Ｉｍａｇｅｊで解析した。
【0151】
結果を図２に示す。図２は、ＥＭＳＡの結果を示すゲル画像である。図２のゲル画像において、各レーンは、左から、ＤＮＡマーカ(DNA ladder)、ＣＹＰ２４Ａ１の濃度が０、０．１μｍｏｌ／ｌ、０．５μｍｏｌ／ｌ、１μｍｏｌ／ｌ、５μｍｏｌ／ｌの結果を示す。図２において、矢印で示す70ｂのバンドは、フリーのアプタマー（AptCYP24-#7（配列番号７））を示す。図２に示すように、ＣＹＰ２４Ａ１の濃度が増加するに伴い、フリーのアプタマー（AptCYP24-#7（配列番号７））を示す70bのバンドの量が減っていることから、AptCYP24-#7（配列番号７）がＣＹＰ２４Ａ１に結合することがわかる。これにより、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、ＣＹＰ２４Ａ１に結合することがわかった。
【0152】
（６）ＣＹＰ２４Ａ１への特異的結合の確認
得られたＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子のうち、AptCYP24-#7（配列番号７）について、前記参考文献１を参照して、三電極検出システムＤＥＰＳＯＲ（Disposable Electrochemical Printed Sensor）を用いるＡｐｔａ－ＤＥＰＳＯＲと呼ばれる競合的電気化学アッセイを実施し、ＣＹＰ２４Ａ１への特異的結合を電気的に検出した。
得られたＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子のうち、AptCYP24-#7（配列番号７）について、前記参考文献１を参照して、三電極検出システムＤＥＰＳＯＲ（Disposable Electrochemical Printed Sensor）を用いるＡｐｔａ－ＤＥＰＳＯＲと呼ばれる競合的電気化学アッセイを実施し、ＣＹＰ２４Ａ１への特異的結合を電気的に検出した。
【0153】
（６－１）ＤＥＰチップの調製
まず、炭素ベースの作用電極（直径３ｍｍ)、参照電極、及びＡｇ／ＡｇＣｌ基準電極を備えた電気化学分析用の三電極システムである、ディスポーザブル三電極スクリーン印刷（ＤＥＰ）チップ（バイオデバイステクノロジー社）を用意した。前記ＤＥＰチップにおける作用電極上に、濃度０．５、５、５０、もしくは５００ｎｍｏｌ／ｌのＣＹＰ２４Ａ１又はＣＹＰ２７Ｂ１溶液を滴下し、４℃で１時間インキュベートした。前記インキュベーション後、前記作用電極を１００ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．４）で３回すすいで洗浄し、過剰なＣＹＰ２４Ａ１又はＣＹＰ２７Ｂ１を除去し、チップを風乾させた。その後、非特異的吸着を抑制するために、ブロッキング緩衝液（１％ ＢＳＡを含む１００ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液）３．５μｌを前記チップに加え、４℃で一晩インキュベートした。その後、前記チップを１００ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．４）で３回リンスし、乾燥させた。これにより、ＣＹＰ２４Ａ１固定化ＤＥＰチップ及びＣＹＰ２７Ｂ１固定化ＤＥＰチップを調製した。
まず、炭素ベースの作用電極（直径３ｍｍ)、参照電極、及びＡｇ／ＡｇＣｌ基準電極を備えた電気化学分析用の三電極システムである、ディスポーザブル三電極スクリーン印刷（ＤＥＰ）チップ（バイオデバイステクノロジー社）を用意した。前記ＤＥＰチップにおける作用電極上に、濃度０．５、５、５０、もしくは５００ｎｍｏｌ／ｌのＣＹＰ２４Ａ１又はＣＹＰ２７Ｂ１溶液を滴下し、４℃で１時間インキュベートした。前記インキュベーション後、前記作用電極を１００ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．４）で３回すすいで洗浄し、過剰なＣＹＰ２４Ａ１又はＣＹＰ２７Ｂ１を除去し、チップを風乾させた。その後、非特異的吸着を抑制するために、ブロッキング緩衝液（１％ ＢＳＡを含む１００ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液）３．５μｌを前記チップに加え、４℃で一晩インキュベートした。その後、前記チップを１００ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．４）で３回リンスし、乾燥させた。これにより、ＣＹＰ２４Ａ１固定化ＤＥＰチップ及びＣＹＰ２７Ｂ１固定化ＤＥＰチップを調製した。
【0154】
（６－２）アプタマー修飾金ナノ粒子の調製
AptCYP24-#7（配列番号７）を、金ナノ粒子（４０ｎｍ， ＢＢＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ， ＵＫ）の表面にコーティングし、ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を固定化した、アプタマー修飾金ナノ粒子を調製した。具体的には、まず、チオール修飾したアプタマー（AptCYP24-#7（配列番号７））を、ヌクレアーゼフリーの水に溶解し、暗所で二時間かけてＴＣＥＰにより脱保護した。つぎに、前記金ナノ粒子（ＡｕＮＰ、４０ｎｍ）を、４℃で１０分間遠心分離（８０×１００ｇ）し、上清４５μｌを廃棄した。残部５μｌを、前記脱保護されたアプタマー溶液（３０μｌ、１０μｇ／ｍｌ）に加え、３秒間の超音波処理（４５ｋＨｚ）を行った。その後、混合物を１０秒間ボルテックスにより混合し、回転ホイール上に３分間静置した。つぎに、前記混合物に２６０μｌの蒸留水を添加した。さらに、６０μｌのＮａＣｌ（１ｍｏｌ／ｌ）を１滴ずつ添加した。その後、９０℃で２分間加熱後、室温で１５分間放置して金ナノ粒子に結合したアプタマー分子をフォールディングした。そして、アプタマー結合金ナノ粒子を、４０μｌの１０％ ＢＳＡを添加し、室温で５分間インキュベート、１０秒間のボルテックスを行い、回転ホイール上に２時間静置してブロッキングした。そして、５０μｌの前記洗浄緩衝液で洗浄し、遠心分離後に上澄みを廃棄して金ナノ粒子に結合していないアプタマーを除去した。得られたアプタマー修飾金ナノ粒子は、５０μｌの前記結合緩衝液に懸濁し、使用時まで４℃で保存した。
AptCYP24-#7（配列番号７）を、金ナノ粒子（４０ｎｍ， ＢＢＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ， ＵＫ）の表面にコーティングし、ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を固定化した、アプタマー修飾金ナノ粒子を調製した。具体的には、まず、チオール修飾したアプタマー（AptCYP24-#7（配列番号７））を、ヌクレアーゼフリーの水に溶解し、暗所で二時間かけてＴＣＥＰにより脱保護した。つぎに、前記金ナノ粒子（ＡｕＮＰ、４０ｎｍ）を、４℃で１０分間遠心分離（８０×１００ｇ）し、上清４５μｌを廃棄した。残部５μｌを、前記脱保護されたアプタマー溶液（３０μｌ、１０μｇ／ｍｌ）に加え、３秒間の超音波処理（４５ｋＨｚ）を行った。その後、混合物を１０秒間ボルテックスにより混合し、回転ホイール上に３分間静置した。つぎに、前記混合物に２６０μｌの蒸留水を添加した。さらに、６０μｌのＮａＣｌ（１ｍｏｌ／ｌ）を１滴ずつ添加した。その後、９０℃で２分間加熱後、室温で１５分間放置して金ナノ粒子に結合したアプタマー分子をフォールディングした。そして、アプタマー結合金ナノ粒子を、４０μｌの１０％ ＢＳＡを添加し、室温で５分間インキュベート、１０秒間のボルテックスを行い、回転ホイール上に２時間静置してブロッキングした。そして、５０μｌの前記洗浄緩衝液で洗浄し、遠心分離後に上澄みを廃棄して金ナノ粒子に結合していないアプタマーを除去した。得られたアプタマー修飾金ナノ粒子は、５０μｌの前記結合緩衝液に懸濁し、使用時まで４℃で保存した。
【0155】
（６－３）ＤＥＰＳＯＲによるＣＹＰ２４Ａ１への結合の検出
前記（６－２）で調製したアプタマー修飾金ナノ粒子２μｌを、前記（６－１）で調製したＣＹＰ２４Ａ１固定化ＤＥＰチップ表面に滴下した。そして、前記ＣＹＰ２４Ａ１固定化ＤＥＰチップについて、室温（およそ２５℃）で１５分インキュベートした。そして、洗浄緩衝液（２０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．４）、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、１００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／ｌ ＣａＣｌ２）を用いて、反応後のＤＥＰチップを三回洗浄し、電気化学アナライザー（ＢｉｏＳｅｅｄｓ株式会社）に接続して電流値を測定した。
前記（６－２）で調製したアプタマー修飾金ナノ粒子２μｌを、前記（６－１）で調製したＣＹＰ２４Ａ１固定化ＤＥＰチップ表面に滴下した。そして、前記ＣＹＰ２４Ａ１固定化ＤＥＰチップについて、室温（およそ２５℃）で１５分インキュベートした。そして、洗浄緩衝液（２０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．４）、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、１００ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／ｌ ＣａＣｌ２）を用いて、反応後のＤＥＰチップを三回洗浄し、電気化学アナライザー（ＢｉｏＳｅｅｄｓ株式会社）に接続して電流値を測定した。
【0156】
結果を図３に示す。図３（Ａ）は、０．５、５、５０、もしくは５００ｎｍｏｌ／ｌのＣＹＰ２４Ａ１固定化ＤＥＰチップと、アプタマー修飾金ナノ粒子との応答時のＤＰＶ（differential pulse voltammetry）曲線を示すグラフであり、図３（Ｂ）は、ピークシグナルの電流値を示すグラフである。図３（Ｂ）において、縦軸は、電流値（μＡ）を示し、横軸は、ＤＥＰチップに固定化されたＣＹＰ２４Ａ１の濃度を示す。ＤＥＰＳＯＲによる解析においては、電極表面に固定化されたＣＹＰ２４Ａ１により捕捉された金ナノ粒子の量に依存して電気化学的シグナルが増加する。図３に示すように、ＣＹＰ２４Ａ１の濃度に比例してシグナルが増加しており、アプタマー修飾金ナノ粒子の結合量が増加していることがわかる。このことから、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子が、ＣＹＰ２４Ａ１に結合し、０．５ｎｍｏｌ／ｌという極めて低濃度のＣＹＰ２４Ａ１を検出可能であることがわかった。
【0157】
（６－４）ＤＥＰＳＯＲによるＣＹＰ２４Ａ１への特異的結合の確認
つぎに、アプタマー修飾金ナノ粒子に固定化するAptCYP24-#7（配列番号７）の濃度を１０、１００、又は１０００ｎｍｏｌ／ｌに変化させ、５００ｎｍｏｌ／ｌＣＹＰ２４Ａ１を固定化したＣＹＰ２４Ａ１固定化ＤＥＰチップ又は５００ｎｍｏｌ／ｌのＣＹＰ２７Ｂ１を固定化したＣＹＰ２７Ｂ１固定化ＤＥＰチップを用いた以外は同様にして、AptCYP24-#7（配列番号７）のＣＹＰ２４Ａ１又はＣＹＰ２７Ｂ１への結合を検出した。
つぎに、アプタマー修飾金ナノ粒子に固定化するAptCYP24-#7（配列番号７）の濃度を１０、１００、又は１０００ｎｍｏｌ／ｌに変化させ、５００ｎｍｏｌ／ｌＣＹＰ２４Ａ１を固定化したＣＹＰ２４Ａ１固定化ＤＥＰチップ又は５００ｎｍｏｌ／ｌのＣＹＰ２７Ｂ１を固定化したＣＹＰ２７Ｂ１固定化ＤＥＰチップを用いた以外は同様にして、AptCYP24-#7（配列番号７）のＣＹＰ２４Ａ１又はＣＹＰ２７Ｂ１への結合を検出した。
【0158】
結果を図４に示す。図４は、ＤＥＰＳＯＲ解析によるピークシグナルの電流値を示すグラフであり、図４において、縦軸は、電流値（μＡ）を示し、横軸は、金ナノ粒子に固定化されたAptCYP24-#7（配列番号７）の濃度を示す。図４に示すように、AptCYP24-#7（配列番号７）は、ＣＹＰ２４Ａ１に結合したが、ＣＹＰ２７Ｂ１には結合しなかった。すなわち、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、ＣＹＰ２４Ａ１に特異的に結合することがわかった。
【0159】
以上のことから、標的をＣＹＰ２４Ａ１、競合標的をＣＹＰ２７Ｂ１としたＳＥＬＣＯＳ法により、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を取得できること、及び、取得したＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子が、ＣＹＰ２４Ａ１に特異的に結合することがわかった。
【0160】
［実施例２］
本発明の核酸分子が、ＣＹＰ２４Ａ１の阻害能を奏することを確認した。
本発明の核酸分子が、ＣＹＰ２４Ａ１の阻害能を奏することを確認した。
【0161】
実施例１で得られたＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子のうち、AptCYP24-#1（配列番号１）、AptCYP24-#2（配列番号２）、AptCYP24-#3（配列番号３）、AptCYP24-#5（配列番号５）、AptCYP24-#7（配列番号７）、AptCYP24-#11（配列番号１１）、AptCYP24-#12（配列番号１２）、AptCYP24-#15（配列番号１５）、AptCYP24-#16（配列番号１６）、AptCYP24-#17（配列番号１７）、AptCYP24-#18（配列番号１８）を用いて、ＣＹＰ２４Ａ１の活性抑制能を確認した。
【0162】
下記参考文献５を参照して各ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子のＣＹＰ２４Ａ１の活性抑制能を評価した。具体的には、各アプタマーを、９５℃、５分間インキュベーション後、氷上で３分間、室温（およそ２５℃、以下同様）で１５分静置した。つぎに、８９．５μｌの反応組成液（５ｎｍｏｌ．ｌ ＣＹＰ２４Ａ１、０．５μｍｏｌ／ｌ アドレノドキシン、０．０５μｍｏｌ／ｌ アドレノドキシン還元酵素、及び、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡを含む１００ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．５））に、各アプタマーを、濃度が２００ｎｍｏｌ／ｌとなるように添加し、室温で１５分静置した。つぎに、前記反応組成液８９．５μｌに、１０００μｍｏｌ／ｌの１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（基質）を０．５μｌ（終濃度５μｍｏｌ／ｌ）、１０ｍｍｏｌ／ｌのＮＡＤＰＨを１０μｌ（終濃度 １ｍｍｏｌ／ｌ）添加し、３７℃で１０分間反応させた。反応後の混合液にクロロホルム／メタノール（３：１）溶液を添加し、上清を除去した後に有機相を乾固した。前記乾固物をアセトニトリルに溶解させ、ＨＰＬＣ（Waters社）で分析し、基質である１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３と、基質にＣＹＰ２４Ａ１が作用した後の代謝物である１α，２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３のピーク面積値を算出し、各アプタマーの存在下におけるＣＹＰ２４Ａ１活性値を算出した。また、コントロールとして、前記アプタマーを添加しなかったもの（コントロール１、CYP24A1 only）、各アプタマーに代えて前記実施例１（１）で調製した初期ＤＮＡライブラリーを添加したもの（コントロール２、Initial random library）、各アプタマーに代えてポリＴリッチ配列（TTTTTTTTTTTAACATT、配列番号２６）を添加したもの（コントロール３、Poly T rich sequence）を用いた。
参考文献５：Kusudo et al.,“Metabolism of A-ring diastereomers of 1α,25-dihydroxyvitamin D3 by CYP24A1”, BBRC 321, 774, 2004
参考文献５：Kusudo et al.,“Metabolism of A-ring diastereomers of 1α,25-dihydroxyvitamin D3 by CYP24A1”, BBRC 321, 774, 2004
【0163】
結果を図５に示す。図５は、ＣＹＰ２４Ａ１活性値の相対値を示すグラフである。図５において、縦軸は、コントロール１（CYP24A1 only）のＣＹＰ２４Ａ１活性値を１００％としたＣＹＰ２４Ａ１活性値の相対値を示し、横軸は、サンプルの種類を示す。図５に示すように、AptCYP24-#1（配列番号１）は、７２．５±７．３％、AptCYP24-#2（配列番号２）は、５１．４±２．７％、AptCYP24-#3（配列番号３）は、５２．８±１４．２％、ＡptCYP24-#5（配列番号５）は、４７．９±１１．２％、AptCYP24-#7（配列番号７）は、３９．１±２．８％、AptCYP24-#11（配列番号１１）は、６４．２±８．２％、AptCYP24-#12（配列番号１２）は、４２．１±５．７％、AptCYP24-#15（配列番号１５）は、５８．２±９．５％、AptCYP24-#16（配列番号１６）は、７８．８±４．８％、AptCYP24-#17（配列番号１７）は、５４．２±１２．４％、AptCYP24-#18（配列番号１８）は、４２．９±２．９％の阻害活性を示し、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、いずれもＣＹＰ２４Ａ１に結合し、ＣＹＰ２４Ａ１の阻害活性を示すことがわかった。また、中でも、AptCYP24-#5（配列番号５）、AptCYP24-#7（配列番号７）、AptCYP24-#12（配列番号１２）、AptCYP24-#18（配列番号１８）の４つについては、特に高いＣＹＰ２４Ａ１阻害活性を示すことがわかった。
【0164】
つぎに、特にＣＹＰ２４Ａ１の阻害活性が高かった、AptCYP24-#5（配列番号５）、AptCYP24-#7（配列番号７）、AptCYP24-#12（配列番号１２）、AptCYP24-#18（配列番号１８）の４つについて、アプタマー濃度を１０ｎｍｏｌ／ｌ、５０ｎｍｏｌ／ｌ、１００ｎｍｏｌ／ｌ、１２５ｎｍｏｌ／ｌ、１５０ｎｍｏｌ／ｌ、１７５ｎｍｏｌ／ｌ、２００ｎｍｏｌ／ｌに変化させた以外は同様にして、ＣＹＰ２４Ａ１の阻害活性を確認した。コントロールは、前記コントロール１のみとした。
【0165】
結果を図６に示す。図６は、ＣＹＰ２４Ａ１活性値の相対値を示すグラフであり、（Ａ）は、AptCYP24-#7（配列番号７）の結果を示し、（Ｂ）は、AptCYP24-#18（配列番号１８）の結果を示し、（Ｃ）は、AptCYP24-#12（配列番号１２）の結果を示し、（Ｄ）は、AptCYP24-#5（配列番号５）の結果を示す。図６において、縦軸は、ＣＹＰ２４Ａ１単独（コントロール１）のＣＹＰ２４Ａ１活性値を１００％としたＣＹＰ２４Ａ１活性値の相対値を示し、横軸は、各アプタマーの濃度を示す。図６に示すように、AptCYP24-#5（配列番号５）、AptCYP24-#7（配列番号７）、AptCYP24-#12（配列番号１２）、AptCYP24-#18（配列番号１８）は、いずれの濃度においても、高いＣＹＰ２４Ａ１の阻害活性を示し、特に、AptCYP24-#12（配列番号１２）及びAptCYP24-#5（配列番号５）は、１０ｎｍｏｌ／ｌという極めて低い濃度においても、高いＣＹＰ２４Ａ１の阻害活性を示した。また、ＣＹＰ２４Ａ１の相対活性が５０％となるアプタマーの濃度（ＩＣ５０値）は、AptCYP24-#7（配列番号７）が１２３±１３ｎｍｏｌ／ｌであり、AptCYP24-#18（配列番号１８）が７２．７±３７．７ｎｍｏｌ／ｌであり、AptCYP24-#12（配列番号１２）が６２．８±１２．２ｎｍｏｌ／ｌであり、AptCYP24-#5（配列番号５）が９４．２±３２．８ｎｍｏｌ／ｌであり、いずれのアプタマーも、極めて低い濃度で強いＣＹＰ２４Ａ１の阻害活性を示すことがわかった。
【0166】
［参考例］
本発明の核酸分子が、ＣＹＰ２４Ａ１以外の酵素活性を阻害しないことを確認した。
本発明の核酸分子が、ＣＹＰ２４Ａ１以外の酵素活性を阻害しないことを確認した。
【0167】
下記参考文献６を参照して各ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子のＣＹＰ２７Ｂ１の活性抑制能を評価した。具体的には、前記実施例２で使用した反応組成液に代えて、反応組成液（２０ｎｍｏｌ／ｌ ＣＹＰ２７Ｂ１、２μｍｏｌ／ｌ アドレノドキシン、０．２μｍｏｌ／ｌ アドレノドキシン還元酵素、１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ、５μｍｏｌ／ｌ ２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（基質）、１ｍｍｏｌ／ｌ ＮＡＤＰＨを含む１００ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．５））を使用した以外は前記実施例２と同様とした。なお、コントロールは、前記アプタマーを添加しなかったもの（ＣＹＰ２７Ｂ１単独、No Aptamer）を用いた。
参考文献６：Uchida et al.,“Purification and characterization of mouse CYP27B1 overproduced by an Escherichia coli system coexpressing molecular chaperonins GroEL/ES”, BBRC 323, 505, 2004
参考文献６：Uchida et al.,“Purification and characterization of mouse CYP27B1 overproduced by an Escherichia coli system coexpressing molecular chaperonins GroEL/ES”, BBRC 323, 505, 2004
【0168】
結果を図７に示す。図７は、ＣＹＰ２７Ｂ１活性値の相対値を示すグラフである。図７において、縦軸は、ＣＹＰ２７Ｂ１単独（コントロール）のＣＹＰ２７Ｂ１活性値を１００％としたＣＹＰ２７Ｂ１活性値の相対値を示し、横軸は、サンプルの種類を示す。図７に示すように、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、いずれもＣＹＰ２７Ｂ１の活性を阻害しなかった。
【0169】
ＣＹＰ２７Ｂ１は、生体内において、ビタミンＤの体内の貯蔵型である２５（ＯＨ）Ｄ３から１，２５（ＯＨ）２Ｄ３に代謝する際に機能する酵素である。本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、ＣＹＰ２４Ａ１の機能を阻害し、ＣＹＰ２７Ｂ１の機能を阻害しないことから、生体に投与した際に、生体内において、ビタミンＤの活性化型である１，２５（ＯＨ）２Ｄ３の濃度を向上することができる可能性が示唆された。
【0170】
また、ＣＹＰ２７Ｂ１に代えて、ＣＹＰ２７Ｂ１と同じミトコンドリア画分に存在するＰ４５０分子種であるＣＹＰ２７Ａ１を使用した以外は同様にして、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子のＣＹＰ２７Ａ１活性抑制能を確認した。また、ＣＹＰ２７Ｂ１に代えて、ＣＹＰ２７Ｂ１と同じミトコンドリア画分に存在するＰ４５０分子種であるＣＹＰ１１Ａ１を使用し、下記参考文献７を参照してＣＹＰ１１Ａ１の活性を測定した以外は同様にして、ＣＹＰ１１Ａ１活性抑制能を確認した。具体的に、ＣＹＰ１１Ａ１の活性は、２０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液、０．３％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、０．２ｎｍｏｌ／ｌのＣＹＰ１１Ａ１、２μｍｏｌ／ｌのＡＤＸ、０．２μｍｏｌ／ｌのＡＤＲ、１ｍｍｏｌ／ｌのＮＡＤＰＨ、及び１００μｍｏｌ／ｌのコレステロールを含む反応組成液を使用し、３７℃、３０分間インキュベーションした後、９８℃、１０分間インキュベーションさせることで、反応を停止した。その後、前記反応液に、コール酸ナトリウム（終濃度１％）及びコレステロールオキシダーゼ（終濃度８ｕｎｉｔ／ｍｌ）を添加し、３７℃で２０分インキュベーションした。その後ヘキサンを添加して代謝物を抽出した後、ＨＰＬＣにて分析し、ＣＹＰ１１Ａ１の活性を測定した。
【0171】
結果を図８（Ａ）及び（Ｂ）に示す。図８（Ａ）は、ＣＹＰ２７Ａ１の活性値の相対値を示すグラフであり、図８（Ｂ）は、ＣＹＰ１１Ａ１の活性値の相対値を示すグラフである。図８（Ａ）において、縦軸は、ＣＹＰ２７Ａ１単独（コントロール、アプタマーなし）のＣＹＰ２７Ａ１活性値を１００％としたＣＹＰ２７Ａ１活性値の相対値を示し、横軸は、サンプルの種類を示す。図８（Ｂ）において、縦軸は、ＣＹＰ１１Ａ１単独（コントロール、アプタマーなし）のＣＹＰ１１Ａ１活性値を１００％としたＣＹＰ１１Ａ１活性値の相対値を示し、横軸は、サンプルの種類を示す。図８（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、ＣＹＰ２７Ａ１及びＣＹＰ１１Ａ１の活性を阻害しないことが分かった。
【0172】
これらのことから、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を特異的に阻害可能であることがわかった。
【0173】
［実施例３］
本発明の核酸分子が、がん細胞に取り込まれることを確認した。
本発明の核酸分子が、がん細胞に取り込まれることを確認した。
【0174】
（１）ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子の細胞内取り込み
実施例１で得られたＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子のうち、AptCYP24-#7（配列番号７）について、固定細胞共焦点顕微鏡（製品名：Zeiss LSM 700、Zeiss社、ドイツ）による観察のため、その５’末端をＣｙ３（登録商標）により標識したＣｙ３標識ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を作成した。つぎに、ヒト肺胞基底上皮腺がん細胞（Ａ５４９細胞、国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 ＪＣＲＢ細胞バンクから入手）をノンコートのガラスボトムディッシュ（９．５ｍｍ×４ウェル）に、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｈｅｌｌとなるように播種した。細胞播種後２４時間目に、前記ディッシュに、５００ｎｍｏｌ／ｌのＣｙ３標識ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を加え、３７℃で２時間インキュベートした。その後、過剰な蛍光色素を除去するため、細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、小麦胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）コンジュゲート（Biotium社, USA）を用いて、１×ＰＢＳ、３７℃、１０分間の条件で膜染色を行った。染色後、細胞を１×ＰＢＳで２回の洗浄し、ＨＣＨＯ（４％）で細胞を固定し、細胞内のアプタマーシグナルを共焦点顕微鏡で観察した（実施例３－１）。また、参考例として、ＤＭＥＭ中でエンドサイトーシス阻害剤である１００μｍｏｌ／ｌのdynasore（Sigma Aldrich社, Japan）で３０分間前処理したＡ５４９細胞を用意し、同様にアプタマー処理と膜染色を行い、共焦点顕微鏡で細胞を観察した（参考例３）。
実施例１で得られたＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子のうち、AptCYP24-#7（配列番号７）について、固定細胞共焦点顕微鏡（製品名：Zeiss LSM 700、Zeiss社、ドイツ）による観察のため、その５’末端をＣｙ３（登録商標）により標識したＣｙ３標識ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を作成した。つぎに、ヒト肺胞基底上皮腺がん細胞（Ａ５４９細胞、国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 ＪＣＲＢ細胞バンクから入手）をノンコートのガラスボトムディッシュ（９．５ｍｍ×４ウェル）に、１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｈｅｌｌとなるように播種した。細胞播種後２４時間目に、前記ディッシュに、５００ｎｍｏｌ／ｌのＣｙ３標識ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を加え、３７℃で２時間インキュベートした。その後、過剰な蛍光色素を除去するため、細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、小麦胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）コンジュゲート（Biotium社, USA）を用いて、１×ＰＢＳ、３７℃、１０分間の条件で膜染色を行った。染色後、細胞を１×ＰＢＳで２回の洗浄し、ＨＣＨＯ（４％）で細胞を固定し、細胞内のアプタマーシグナルを共焦点顕微鏡で観察した（実施例３－１）。また、参考例として、ＤＭＥＭ中でエンドサイトーシス阻害剤である１００μｍｏｌ／ｌのdynasore（Sigma Aldrich社, Japan）で３０分間前処理したＡ５４９細胞を用意し、同様にアプタマー処理と膜染色を行い、共焦点顕微鏡で細胞を観察した（参考例３）。
【0175】
結果を図９に示す。図９（Ａ）は、実施例３－１の結果を示す写真であり、図９（Ｂ）は、参考例３の結果を示す写真である。図９（Ａ）及び（Ｂ）において、左側の写真は、ＷＧＡにより膜染色された細胞の写真（WGA-membrane）であり、中央の写真は、Ｃｙ３標識ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子（Cy3-AptCYP24-#7）におけるＣｙ３標識の蛍光を示し、右側の写真は、それらをマージした写真（Merged view）である。また、図９の各図において、染色箇所を枠線で示し、Ｃｙ３標識ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子（Cy3-AptCYP24-#7）を示す染色が特に局在する箇所を白抜き矢印で示す。図９（Ａ）に示すように、Ａ５４９細胞において、Ｃｙ３標識ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を示す蛍光が、細胞膜内に存在するため、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子がＡ５４９細胞内に取り込まれたことが確認できた。また、参考例３である図９（Ｂ）に示すように、エンドサイトーシス阻害剤により前処理したＡ５４９細胞では、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を示す蛍光がみられないため、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれていると推定される。なお、本発明は前記推定に何ら制限されない。
【0176】
（２）ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子の細胞内における局在確認
細胞内において、ミトコンドリアは、ＣＹＰ２４Ａ１がビタミンＤ代謝物を不活化する主な場所であることが知られている。このため、ミトコンドリアにおいて、本発明の核酸分子が共局在化していることを確認した。
細胞内において、ミトコンドリアは、ＣＹＰ２４Ａ１がビタミンＤ代謝物を不活化する主な場所であることが知られている。このため、ミトコンドリアにおいて、本発明の核酸分子が共局在化していることを確認した。
【0177】
まず、前記Ｃｙ３標識ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子の濃度を１００ｎｍｏｌ／ｌ又は４００ｎｍｏｌ／ｌとした以外は同様にして、Ａ５４９細胞とＣｙ３標識ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子とをインキュベートした。その後、過剰な蛍光色素を除去するため、細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。その後、固定した前記細胞を、１００ｎｍｏｌ／ｌのＭｉｔｏＧｒｅｅｎ（PromoCell社）及び１：２０００の倍率でＰＢＳバッファーにより希釈したHoechst（登録商標）33342（ThermoFisher社）を用いて３０分間処理し、細胞の核及びミトコンドリアを染色した後、前記共焦点顕微鏡で細胞を観察した。
【0178】
結果を図１０に示す。図１０は、前記染色結果を示す写真であり、図１０（Ａ）は、ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子の濃度４００ｎｍｏｌ／ｌの結果を示し、図１０（Ｂ）は、ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子の濃度１００ｎｍｏｌ／ｌの結果を示す。図１０（Ａ）及び（Ｂ）において、左から、核の染色結果（Nucleic（Hoescht3342））、ミトコンドリアの染色結果（Mitochondria（MitoGreen））、Ｃｙ３標識ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子の局在を示すＣｙ３蛍光シグナル（Cy3-AptCYP24-#7）、これらをマージした写真（Merge）を示し、マージした写真の下側の写真は、マージした写真における細胞の拡大図である。また、図１０において、核及びミトコンドリアの染色箇所を枠線で示し、Ｃｙ３標識ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子（Cy3-AptCYP24-#7）を示す染色が特に局在する箇所を白抜き矢印で示す。図１０に示すように、Ａ５４９細胞において、ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、ミトコンドリアにおいて局在していることがわかった。このため、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、ミトコンドリアにおいてＣＹＰ２４Ａ１と共局在しており、細胞内において、ＣＹＰ２４Ａ１と相互作用していると推定される。なお、本発明は前記推定に何ら制限されない。
【0179】
［実施例４］
本発明の核酸分子を修飾することにより、ヌクレアーゼ耐性が向上することを確認した。
本発明の核酸分子を修飾することにより、ヌクレアーゼ耐性が向上することを確認した。
【0180】
本発明の核酸分子の血清中での安定性を評価するため、実施例１で得られたＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子のうち、AptCYP24-#7（配列番号７）をホスホロチオエートで修飾し、ホスホロチオエート修飾ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を作成した。そして、１μｍｏｌ／ｌの前記ホスホロチオエート修飾ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＰＢＳ中で、２時間、４時間、６時間、２４時間、４８時間、又は７２時間インキュベートした。インキュベート時の温度は、３７℃とした。また、ホスホロチオエートで修飾していない、１μｍｏｌ／ｌのAptCYP24-#7（配列番号７）を用い、インキュベート時間を２時間、４時間、８時間、２４時間とした以外は同様にして、未修飾ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子についても同様に処理を行った。所定時間経過後、残存する反応生成物を回収し、直ちに９５℃、５分間の加熱処理を行い、－８０℃で保管した。その後、その後、残留反応物を０．５×ＴＢＥ緩衝液で２％アガロースゲルにロードし、１２０Ｖで１５分間泳動した。その後、ゲルをSYBR（商標） Gold Nucleic Acid Gel Stainで染色し、UV Transilluminator Imaging Systemで撮影し、Ｉｍａｇｅｊで解析した。
【0181】
結果を図１１に示す。図１１（Ａ）は、未修飾ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子の結果を示すゲル画像であり、図１１（Ｂ）は、ホスホロチオエート修飾ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子の結果を示すゲル画像である。図１１において、各ウェル上の数字は、インキュベート時間を示し、０ｈはコントロール（未処理）の結果を示す。また、図１１において、各ウェルの下側の数字は、コントロール（０ｈ）を１００％とした場合におけるアプタマーの残存率（Residual products（％））を示す。図１１（Ａ）に示すように、未修飾のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、血清中で２４時間インキュベートしても、分解されずにアプタマーが残存していることがわかった。また、図１１（Ｂ）に示すように、ホスホロチオエート修飾ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、血清中で２４時間経過後の残存率が未修飾ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子の２倍以上であり、７２時間経過後も分解されずに残存していた。このため、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、生体内においても利用可能であり、また、ホスホロチオエート修飾ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性が向上するため、より生体内での利用適性が高くなることがわかった。
【0182】
［実施例５］
本発明の核酸分子が、内因性（endogenous）のＣＹＰ２４Ａ１の阻害能を有することを確認した。
本発明の核酸分子が、内因性（endogenous）のＣＹＰ２４Ａ１の阻害能を有することを確認した。
【0183】
まず、４８ウェルプレートに、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを１ｗｅｌｌあたり１５０μｌ分注し、前記Ａ５４９細胞を３．３８×１０３個／ｗｅｌｌとなるように播種した。つぎに、ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子（AptCYP24-#7（配列番号７））を４００ｎｍｏｌ／ｌ含み、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭを、培養２４時間後のウェルに添加して、Ａ５４９細胞をアプタマー処理した。その２時間後、１μｍｏｌ／ｌの１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（以下、「１，２５－Ｄ３」ともいう）をウェルに添加した。ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子の添加後１８時間後に、培地を１５０μｌ除去し、クロロホルム／メタノール（３：１）溶液を添加、混合し、上清を除去した後に有機相を乾固した。前記乾固物をアセトニトリルに溶解させ、ＨＰＬＣ（Waters社）でＣＹＰ２４Ａ１活性を分析した。（実施例５－１）。また、ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む培地に代えて、４００ｎｍｏｌ／ｌのケトコナゾール（富士フィルム和光純薬株式会社）を含む培地を使用した以外は同様にして、Ａ５４９細胞を処理し、ＨＰＬＣでＣＹＰ２４Ａ１活性を分析した（比較例５）。また、ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子とケトコナゾールの併用効果を確認するため、４００ｎｍｏｌ／ｌのＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む培地に代えて、１００ｎｍｏｌ／ｌのＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子と１００ｎｍｏｌ／ｌのケトコナゾールと含む培地を使用した以外は同様にしてＡ５４９細胞を処理し、ＨＰＬＣでＣＹＰ２４Ａ１活性を分析した（実施例５－２）。なお、コントロールは、１，２５－Ｄ３添加直後の画分（コントロール１）、ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を添加せずに、１，２５－Ｄ３添加後１８時間経過した画分（コントロール２）とした。
【0184】
ＨＰＬＣの結果を図１２に示す。図１２（Ａ）～（Ｅ）は、ＨＰＬＣの結果を示すグラフであり、図１２（Ａ）は、コントロール１（1,25-D3 only (0h)）の結果を示し、図１２（Ｂ）は、コントロール２（1,25-D3 only (18h)）の結果を示し、図１２（Ｃ）は、実施例５－１（1,25-D3 only (18h)+ AptCYP24-#7(400nM)）の結果を示し、図１２（Ｄ）は、比較例５（1,25-D3 only (18h)+ Ketoconazole(400nM)）の結果を示し、図１２（Ｅ）は、実施例５－２（1,25-D3 only (18h)+ Ketoconazole(400nM) + AptCYP24-#7(400nM)）の結果を示す。図１２の各図において、矢印で示すピークは、１，２５－Ｄ３代謝物の主要なピークである。図１２に示すように、実施例５－１及び５－２は、コントロール１及び２と比較して、１，２５－Ｄ３代謝物の主要なピークが有意に減少していた。すなわち、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、Ａ５４９細胞内因性ＣＹＰ２４Ａ１の活性の阻害能を有しており、また、その阻害能は既知のＣＹＰ２４Ａ１阻害剤であるケトコナゾールと同等程度であることがわかった。
【0185】
つぎに、実施例５－１および５－２について、基質である１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３と、基質にＣＹＰ２４Ａ１が作用した後の代謝物である１α，２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３のピーク面積値を算出し、各アプタマーの存在下におけるＣＹＰ２４Ａ１活性値を算出した。結果を下記表２に示す。下記表２は、コントロール（１，２５－Ｄ３のみ）のＣＹＰ２４Ａ１活性値を１００％としたＣＹＰ２４Ａ１活性値の相対値を示す。下記表２に示すように、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、４１．５±３．６％の内因性ＣＹＰ２４Ａ１阻害活性を示し、コントロールと比較して有意な阻害活性を示した。また、実施例５－２に示すように、本発明のＣＹＰ２４Ａ１とケトコナゾールとを併用した場合、２２．１±４．５％の内因性ＣＹＰ２４Ａ１阻害活性を示し、本発明の核酸分子は、既知のＣＹＰ２４Ａ１阻害剤と併用することにより相乗的な効果を示すことが示された。
【表2】
【0186】
ヒト肺がん細胞においては、ＣＹＰ２４Ａ１が異常に発現しており、ＣＹＰ２４Ａ１が高発現すると、Ａ５４９細胞を含む肺がん細胞において抗増殖性１，２５－Ｄ３シグナルが抑制されることが報告されている。本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、内因性のＣＹＰ２４Ａ１に対して優れた阻害能を有するため、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、肺がんの治療薬として利用可能であることが示唆された。
【0187】
［実施例６］
本発明の核酸分子が、がん細胞の増殖を抑制することを確認した。
本発明の核酸分子が、がん細胞の増殖を抑制することを確認した。
【0188】
前記Ａ５４９細胞を、９６プレートに３×１０３個／ｗｅｌｌとなるように播種した。培養２４時間後、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子（AptCYP24-#7（配列番号７））を５００ｎｍｏｌ／ｌ含み、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭを添加して、Ａ５４９細胞をアプタマー処理した。その２時間後、１００ｎｍｏｌ／ｌの１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３（以下、「１，２５－Ｄ３」ともいう）を添加した。また、前記アプタマー処理から２４時間経過毎に、５００ｎｍｏｌ／ｌのＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子（AptCYP24-#7（配列番号７））を含む前記培地を交換し、継続的にアプタマー処理を行った。培養７２時間後に、Cell Counting Kit-8（ＣＫ－８キット、株式会社同仁化学研究所）を用いて、細胞生存率を評価した（実施例６）。吸光度は、マイクロプレートリーダー（Spark（商標） 10 M、TECAN社）を用いて450nmで測定した。コントロールは、本発明の結合核酸分子を含まない培地を使用した以外は同様にして処理を行った（細胞のみ、コントロール６）。比較例として、本発明の結合核酸分子を含む培地に代えて、実施例１（１）の初期ランダム配列（配列番号２３）を含む培地（比較例６－１）、又は４００ｎｍｏｌ／ｌのケトコナゾールを含む培地（比較例６－２）を使用した以外は同様にして処理を行った。なお、すべての値はコントロール（細胞のみ）に正規化した。
【0189】
結果を図１３に示す。図１３は、培養後のＡ５４９細胞の生存率を示すグラフであり、縦軸は、コントロール６（Vehicle）の吸光度を１とした相対値を示し、横軸は、サンプルの種類を示す。図１３において、各サンプルの値は、３回測定した場合の平均値±ＳＤとし、＊＊は、Ｐ＜０．０１を意味する。図１３に示すように、本発明の結合核酸分子を添加した実施例６（1，25-D3+Apt-7）は、比較例６－１（1，25-D3 only）と比較して、有意にがん細胞の増殖を抑制し、また、比較例６－２（1，25-D3+KCZ）と比較して同等以上にがん細胞の増殖を抑制した。このため、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子によれば、がん細胞の増殖が抑制でき、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、がんの治療薬として使用できることがわかった。
【0190】
以上、実施形態及び実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態及び実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
【0191】
この出願は、２０２１年５月１７日に出願された日本出願特願２０２１－０８２９０４を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
【0192】
＜付記＞
上記の実施形態及び実施例の一部又は全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
（付記１）
下記（ａ）のＤＮＡ鎖を含む、ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子：
（ａ）下記（ａ１）、（ａ２）又は（ａ３）のＤＮＡ鎖：
（ａ１）配列番号１～１８のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ鎖；
（ａ２）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖；
（ａ３）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖。
（付記２）
さらに、キャリアを含む、付記１に記載の核酸分子。
（付記３）
前記キャリアは、ミセル、リポソーム、エマルション、及びニオソームからなる群から選択された少なくとも１つである、付記１又は２に記載の核酸分子。
（付記４）
付記１から３のいずれかに記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む、ＣＹＰ２４Ａ１の活性抑制剤。
（付記５）
付記１から３のいずれかに記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子と、薬学的に許容される添加剤とを含む、医薬。
（付記６）
付記１から３のいずれかに記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む、肺がんの治療薬。
（付記７）
さらに、１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３を含む、付記６記載の肺がんの治療薬。
（付記８）
付記１から３のいずれかに記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む、前立腺がんの治療薬。
（付記９）
付記１から３のいずれかに記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む、慢性腎臓病の治療薬。
（付記１０）
付記１から３のいずれかに記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む、くる病の治療薬。
（付記１１）
付記１から３のいずれかに記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む、骨軟化症の治療薬。
（付記１２）
付記１から３のいずれかに記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む、ＣＹＰ２４Ａ１の検出試薬。
（付記１３）
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のＣＹＰ２４Ａ１を検出する工程を含み、
前記核酸分子が、付記１から３のいずれかに記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のＣＹＰ２４Ａ１と前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＣＹＰ２４Ａ１を検出することを特徴とする、ＣＹＰ２４Ａ１の検出方法。
上記の実施形態及び実施例の一部又は全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
（付記１）
下記（ａ）のＤＮＡ鎖を含む、ＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子：
（ａ）下記（ａ１）、（ａ２）又は（ａ３）のＤＮＡ鎖：
（ａ１）配列番号１～１８のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡ鎖；
（ａ２）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖；
（ａ３）前記（ａ１）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＣＹＰ２４Ａ１に結合するＤＮＡ鎖。
（付記２）
さらに、キャリアを含む、付記１に記載の核酸分子。
（付記３）
前記キャリアは、ミセル、リポソーム、エマルション、及びニオソームからなる群から選択された少なくとも１つである、付記１又は２に記載の核酸分子。
（付記４）
付記１から３のいずれかに記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む、ＣＹＰ２４Ａ１の活性抑制剤。
（付記５）
付記１から３のいずれかに記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子と、薬学的に許容される添加剤とを含む、医薬。
（付記６）
付記１から３のいずれかに記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む、肺がんの治療薬。
（付記７）
さらに、１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３を含む、付記６記載の肺がんの治療薬。
（付記８）
付記１から３のいずれかに記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む、前立腺がんの治療薬。
（付記９）
付記１から３のいずれかに記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む、慢性腎臓病の治療薬。
（付記１０）
付記１から３のいずれかに記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む、くる病の治療薬。
（付記１１）
付記１から３のいずれかに記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む、骨軟化症の治療薬。
（付記１２）
付記１から３のいずれかに記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子を含む、ＣＹＰ２４Ａ１の検出試薬。
（付記１３）
試料と核酸分子とを接触させ、前記試料中のＣＹＰ２４Ａ１を検出する工程を含み、
前記核酸分子が、付記１から３のいずれかに記載のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子であり、
前記検出工程において、前記試料中のＣＹＰ２４Ａ１と前記核酸分子とを結合させて、前記結合により、前記試料中のＣＹＰ２４Ａ１を検出することを特徴とする、ＣＹＰ２４Ａ１の検出方法。
【産業上の利用可能性】
【0193】
本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、ＣＹＰ２４Ａ１に対して結合可能である。本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、ＣＹＰ２４Ａ１の活性を制御しうる。また、ＣＹＰ２４Ａ１は、ビタミンＤの不活化において機能している。このため、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、ビタミンＤの欠乏に起因する疾患に対する新たな医薬として機能すると期待される。また、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子によれば、ＣＹＰ２４Ａ１を検出できる。したがって、本発明のＣＹＰ２４Ａ１結合核酸分子は、例えば、医薬分野及びＣＹＰ２４Ａ１の検出に、極めて有用なツールといえる。
【図1A-1】
【図1A-2】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E-1】
【図1E-2】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】