特開2022-178126分子間相互作用検出に用いられるポリペプチドを含む試薬キット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022178126
(43)【公開日】2022-12-02
(54)【発明の名称】分子間相互作用検出に用いられるポリペプチドを含む試薬キット
(51)【国際特許分類】
C12M 1/34 20060101AFI20221125BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20221125BHJP
C12N 9/02 20060101ALI20221125BHJP
C12Q 1/66 20060101ALI20221125BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20221125BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20221125BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20221125BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20221125BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221125BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20221125BHJP
C07K 14/435 20060101ALI20221125BHJP
C12N 15/53 20060101ALI20221125BHJP
【ＦＩ】
C12M1/34 E ZNA
C12N15/62 Z
C12N9/02
C12Q1/66
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K19/00
C07K14/435
C12N15/53
【審査請求】未請求
【請求項の数】14
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021084687
(22)【出願日】2021-05-19
(71)【出願人】
【識別番号】000001993
【氏名又は名称】株式会社島津製作所
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】大室 有紀
【テーマコード（参考）】
4B029
4B050
4B063
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB16
4B029CC01
4B029FA13
4B029GA08
4B029GB06
4B050CC04
4B050CC05
4B050DD11
4B050EE10
4B050JJ10
4B050LL03
4B063QA20
4B063QQ22
4B063QR02
4B063QR58
4B063QR66
4B063QS07
4B063QS15
4B063QS28
4B063QS36
4B063QX02
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA28
4B065CA46
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045CA51
4H045DA89
4H045EA50
4H045EA65
4H045FA74
(57)【要約】 （修正有）
【課題】分子間相互作用検出に用いることができる、分子量が小さい新たなプローブを提供する。
【解決手段】（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含む第１ポリペプチドと、（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含み、前記第１ポリペプチドとは異なる配列を有し、前記第１ポリペプチドとの接触により発光酵素活性を生じる第２ポリペプチドとを含む、試薬キットが提供される。（Ａ）特定のアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸配列が欠損したアミノ酸配列、（Ｂ）特定のアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸配列が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列、（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に示されたアミノ酸配列において、７０位～７４位のアミノ酸残基の少なくとも１個がさらに欠損したアミノ酸配列。
【選択図】図２
【解決手段】（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含む第１ポリペプチドと、（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含み、前記第１ポリペプチドとは異なる配列を有し、前記第１ポリペプチドとの接触により発光酵素活性を生じる第２ポリペプチドとを含む、試薬キットが提供される。（Ａ）特定のアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸配列が欠損したアミノ酸配列、（Ｂ）特定のアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸配列が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列、（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に示されたアミノ酸配列において、７０位～７４位のアミノ酸残基の少なくとも１個がさらに欠損したアミノ酸配列。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含む第１ポリペプチドと、
（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含み、前記第１ポリペプチドとは異なる配列を有し、前記第１ポリペプチドとの接触により発光酵素活性を生じる第２ポリペプチドとを含む、試薬キット；
（Ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸配列が欠損したアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸配列が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列、
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に示されたアミノ酸配列において、７０位～７４位のアミノ酸残基の少なくとも１個がさらに欠損したアミノ酸配列。
（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含み、前記第１ポリペプチドとは異なる配列を有し、前記第１ポリペプチドとの接触により発光酵素活性を生じる第２ポリペプチドとを含む、試薬キット；
（Ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸配列が欠損したアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸配列が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列、
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に示されたアミノ酸配列において、７０位～７４位のアミノ酸残基の少なくとも１個がさらに欠損したアミノ酸配列。
【請求項2】
前記（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列は、（ａ）～（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列である、請求項１に記載の試薬キット；
（ａ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列。
（ａ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項3】
前記第１ポリペプチドおよび前記第２ポリペプチドの少なくとも１つは、配列番号５１～５３に記載のアミノ酸配列において、配列番号５１に記載のアミノ酸配列の４位～２０位、４位～２１位、４位～２２位、４位～２３位、４位～２４位、４位～３３位、４位～３４位、４位～３５位、４位～３６位、４位～３７位、４位～４５位、４位～４６位、４位～４７位、４位～４８位、４位～４９位、４位～５６位、４位～５７位、４位～５８位、４位～５９位、４位～６０位、４位～６２位、４位～６３位、４位～６４位、４位～６５位、４位～６６位、４位～６７位、４位～７０位、４位～７１位、４位～７２位、４位～７３位、４位～７４位、４位～７５位、４位～７６位、４位～７７位、４位～７８位、４位～７９位、４位～８８位、４位～８９位、４位～９０位、４位～９１位、４位～９２位、４位～１０１位、４位～１０２位、４位～１０３位、４位～１０４位、４位～１０５位、２１位～１２０位、２２位～１２０位、２３位～１２０位、２４位～１２０位、２５位～１２０位、３４位～１２０位、３５位～１２０位、３６位～１２０位、３７位～１２０位、３８位～１２０位、４６位～１２０位、４７位～１２０位、４８位～１２０位、４９位～１２０位、５０位～１２０位、５７位～１２０位、５８位～１２０位、５９位～１２０位、６０位～１２０位、６１位～１２０位、６３位～１２０位、６４位～１２０位、６５位～１２０位、６６位～１２０位、６７位～１２０位、６８位～１２０位、６９位～１２０位、７０位～１２０位、７１位～１２０位、７２位～１２０位、７３位～１２０位、７４位～１２０位、７５位～１２０位、７６位～１２０位、７７位～１２０位、７８位～１２０位、７９位～１２０位、８０位～１２０位、８９位～１２０位、９０位～１２０位、９１位～１２０位、９２位～１２０位、９３位～１２０位、１０２位～１２０位、１０３位～１２０位、１０４位～１２０位、１０５位～１２０位および１０６位～１２０位から選択されるいずれかに相当するアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の試薬キット。
【請求項4】
前記第１ポリペプチドおよび前記第２ポリペプチドの少なくとも１つは、（１）～（３）のいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の試薬キット；
（１）配列番号７６～８５のいずれかに記載のアミノ酸配列、
（２）配列番号７６～８５のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（３）配列番号７６～８５のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列。
（１）配列番号７６～８５のいずれかに記載のアミノ酸配列、
（２）配列番号７６～８５のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（３）配列番号７６～８５のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列。
【請求項5】
前記第１ポリペプチドを構成するアミノ酸配列と、前記第２ポリペプチドを構成するアミノ酸配列とは一部が重複する、請求項１～４のいずれか１項に記載の試薬キット。
【請求項6】
前記第１ポリペプチドを構成するアミノ酸配列と、前記第２ポリペプチドを構成するアミノ酸配列とは重複しない、請求項１～４のいずれか１項に記載の試薬キット。
【請求項7】
前記第１ポリペプチドと前記第２ポリペプチドとは、リンカー配列によって接続されている、請求項１～６のいずれか１項に記載の試薬キット。
【請求項8】
前記第１ポリペプチドは、第１標的タンパク質に接続され、
前記第２ポリペプチドは、第２標的タンパク質に接続される、請求項１～７のいずれか１項に記載の試薬キット。
前記第２ポリペプチドは、第２標的タンパク質に接続される、請求項１～７のいずれか１項に記載の試薬キット。
【請求項9】
（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含む第１ポリペプチドであって、
（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含む第２ポリペプチドとの接触により発光酵素活性を生じ、
前記第２ポリペプチドとは異なる配列を有する第１ポリペプチド；
（Ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸配列が欠損したアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸配列が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列、
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に示されたアミノ酸配列において、７０位～７４位のアミノ酸残基の少なくとも１個がさらに欠損したアミノ酸配列。
（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含む第２ポリペプチドとの接触により発光酵素活性を生じ、
前記第２ポリペプチドとは異なる配列を有する第１ポリペプチド；
（Ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸配列が欠損したアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸配列が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列、
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に示されたアミノ酸配列において、７０位～７４位のアミノ酸残基の少なくとも１個がさらに欠損したアミノ酸配列。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか１項に記載の第１ポリペプチドと、第１標的タンパク質とを含む、融合タンパク質。
【請求項11】
請求項１～９のいずれか１項に記載の第１ポリペプチドまたは請求項１０に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項12】
請求項１１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項13】
請求項１１に記載の核酸が導入された形質転換細胞。
【請求項14】
請求項１～８のいずれか１項に記載の試薬キットを用いた、タンパク質相互作用解析法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、分子間相互作用検出に用いられるポリペプチドを含む試薬キットに関する。
【背景技術】
【0002】
基礎生物学分野、診断技術、検査技術において、標的タンパク質を検出するためにレポータータンパク質として発光酵素が利用される。レポータータンパク質としては、発光酵素の他に、蛍光タンパク質、蛍光色素、ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ、ペルオキシダーゼ等が汎用されている。蛍光タンパク質、蛍光色素およびｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔは、蛍光強度が高いものの、励起光が必要であるため、（１）細胞への光毒性がある、（２）励起光スペクトルが蛍光スペクトルに重なり、Ｓｉｇｎａｌ／Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ比が低くなりやすく、微量検出に不適である、（３）検出器に励起光照射機および分光フィルターを内蔵する必要がある等の短所があった。発光酵素は、励起光が不必要なため、上記の短所がない。また、一般に発光酵素による検出は、ペルオキシダーゼ等を利用した比色法よりも微量検出に適している。
【0003】
これまでに、発光酵素として野生型ホタル由来発光酵素（ＦＬｕｃ）、ＮａｎｏＬｕｃ、ＴｕｒｂｏＬｕｃ、カイアシ類（Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ）由来発光酵素（ＧＬｕｃ）、ウミシイタケ科（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来発光酵素（）、カイアシ類（Ｍｅｔｒｉｄｉａ ｌｏｎｇａ）由来発光酵素（ＭＬｕｃ）が報告されている。特許文献１および２には、カイアシ類の発光酵素のアミノ酸配列から頻出アミノ酸を選定して作製した人工発光酵素（Ａｌｕｃ）が開示されている。
【0004】
発光酵素は分割して、分子間相互作用を検出するためのプローブとして用いることができる。例えばＰＣＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）では、相互作用を検出したい分子に、分割された発光酵素を付加し、発光シグナルによって分子間相互作用を検出することができる。特許文献１、特許文献２および非特許文献１には、分子間相互作用の検出に用いられるプローブが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２０１４－１００１３７号公報
【特許文献2】国際公開第２０１７／０５７７５２号
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Remy and Michnick, Nat Methods. 2006 Dec;3(12):977-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
分子間相互作用解析を行う場合、プローブのサイズが大きいと、プローブと標的タンパク質との融合タンパク質が細胞内で正常に発現しなかったり、立体障害により標的タンパク質が正常に機能しないことがある。
【0008】
プローブのサイズが小さいことは、分子間相互作用解析に際して有用である。本発明は、分子間相互作用検出に用いることができる、分子量が小さいプローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明は、
（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含む第１ポリペプチドと、
（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含み、前記第１ポリペプチドとは異なる配列を有し、前記第１ポリペプチドとの接触により発光酵素活性を生じる第２ポリペプチドとを含む、試薬キットに関する。
（Ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸配列が欠損したアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸配列が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列、
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に示されたアミノ酸配列において、７０位～７４位のアミノ酸残基の少なくとも１個がさらに欠損したアミノ酸配列。
（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含む第１ポリペプチドと、
（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含み、前記第１ポリペプチドとは異なる配列を有し、前記第１ポリペプチドとの接触により発光酵素活性を生じる第２ポリペプチドとを含む、試薬キットに関する。
（Ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸配列が欠損したアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸配列が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列、
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に示されたアミノ酸配列において、７０位～７４位のアミノ酸残基の少なくとも１個がさらに欠損したアミノ酸配列。
【0010】
本発明は、
（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含む第１ポリペプチドであって、
（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含む第２ポリペプチドとの接触により発光酵素活性を生じ、
前記第２ポリペプチドとは異なる配列を有する第１ポリペプチドにも関する。
（Ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸配列が欠損したアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸配列が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列、
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に示されたアミノ酸配列において、７０位～７４位のアミノ酸残基の少なくとも１個がさらに欠損したアミノ酸配列。
（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含む第１ポリペプチドであって、
（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含む第２ポリペプチドとの接触により発光酵素活性を生じ、
前記第２ポリペプチドとは異なる配列を有する第１ポリペプチドにも関する。
（Ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸配列が欠損したアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸配列が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列、
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に示されたアミノ酸配列において、７０位～７４位のアミノ酸残基の少なくとも１個がさらに欠損したアミノ酸配列。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、分子量が小さい新たなプローブを用いて、分子間相互作用を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドの接触による発光の一例を示す図である。
【図2】第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを用いた分子間相互作用検出の一例を示す模式図である。
【図3】第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを用いた分子間相互作用検出の一例を示す模式図である。
【図4】実施例において作製したＡＬｕｃ３０の変異体の構造を示す模式図である。
【図5】ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０とｍｉｎｉＡＬｕｃ１６とのアミノ酸配列同一性を示す図である。
【図6】ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０とｍｉｎｉＡＬｕｃ４８とのアミノ酸配列同一性を示す図である。
【図7】ｍｉｎｉＡＬｕｃ４８とｍｉｎｉＡＬｕｃ１６とのアミノ酸配列同一性を示す図である。
【図8】実験２において、ｍｉｎｉＡＬｕｃの発光値を示すグラフである。
【図9】ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０の立体構造を示す図である。
【図10】実験４において、ΔｌｏｏｐＮ１の発光値を示すグラフである。
【図11】実験５において、セレンテラジン（０．５μＭ）を基質としたときの発光値を示すグラフである。
【図12】実験５において、セレンテラジン（５μＭ）を基質としたときの発光値を示すグラフである。
【図13】実験５において、セレンテラジンｈ（５μＭ）を基質としたときの発光値を示すグラフである。
【図14】実験５において、セレンテラジンｈ（２５μＭ）を基質としたときの発光値を示すグラフである。
【図15】実験５において、フリマジンを基質としたときの発光値を示すグラフである。
【図16】実験５において、フリマジンを基質としたときの発光値を示すグラフである。
【図17】実験６において、上清中の酵素タンパク質をウエスタンブロットにより検出した図である。左の図はｆｌａｇ－ｔａｇを、右の図はＨｉｓ－ｔａｇを検出した。
【図18】実験７において、セレンテラジンを基質としたときの比活性を示すグラフである。
【図19】実験７において、セレンテラジンｈを基質としたときの比活性を示すグラフである。
【図20】実験８において、セレンテラジンを基質としたときの発光スペクトルを示す図である。
【図21】実験８において、セレンテラジンｈを基質としたときの発光スペクトルを示す図である。
【図22】実験９において、分泌発現させたｍｉｎｉＡＬｕｃの熱処理後の発光値を示すグラフである。
【図23】実験１０において、分泌発現させたｍｉｎｉＡＬｕｃおよび大腸菌発現させたｍｉｎｉＡＬｕｃの発光値を示すグラフである。
【図24】実験１０において、大腸菌発現させたｍｉｎｉＡＬｕｃの熱処理後の発光値を示すグラフである。
【図25】実験１１－１において、分割したｍｉｎｉＡＬｕｃおよびその組み合わせの発光値を示すグラフである。
【図26】実験１１－２において、分割したｍｉｎｉＡＬｕｃおよびその組み合わせの発光値を示すグラフである。
【図27】実験１１－２において、分割したｍｉｎｉＡＬｕｃおよびその組み合わせの発光値を示すグラフである。
【図28】実験１１－２において、分割したｍｉｎｉＡＬｕｃおよびその組み合わせの発光値を示すグラフである。
【図29】実験１２において、分割したｍｉｎｉＡＬｕｃを用いて二分子間の相互作用を検出した結果を示すグラフである。
【図30】実験１２において、分割したｍｉｎｉＡＬｕｃを用いて二分子間の相互作用を検出した結果を示すグラフである。
【図31】実験１２において、分割したｍｉｎｉＡＬｕｃを用いて二分子間の相互作用を検出した結果を示すグラフである。
【図32】実験１２において、分割したｍｉｎｉＡＬｕｃを用いて二分子間の相互作用を検出した結果を示すグラフである。
【図33】実験１２において、分割したｍｉｎｉＡＬｕｃを用いて二分子間の相互作用を検出した結果を示すグラフである。
【図34】実験１２において、分割したｍｉｎｉＡＬｕｃを用いて二分子間の相互作用を検出した結果を示すグラフである。
【図35】実験１２において、分割したｍｉｎｉＡＬｕｃを用いて二分子間の相互作用を検出した結果を示すグラフである。
【図36】実験１２において、分割したｍｉｎｉＡＬｕｃを用いて二分子間の相互作用を検出した結果を示すグラフである。
【図37】実験１３において、分割したｍｉｎｉＡＬｕｃを含む円順列変異体を用いて分子間相互作用を検出した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0013】
＜発光酵素Ａ＞
本発明に係る試薬キットは、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとを含む。第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドは、発光酵素活性を有する発光酵素Ａの一部である。
本発明に係る試薬キットは、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとを含む。第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドは、発光酵素活性を有する発光酵素Ａの一部である。
【0014】
発光酵素（ルシフェラーゼ）とは、発光基質（ルシフェリン）を酸化する酵素であり、その酸化過程において発光を生ずる。本明細書における発光酵素活性とは、発光酵素と基質による酵素反応の活性を表し、基質が発光酵素との酵素反応によって励起状態になった後、基底状態に戻る際に発する光（発光スペクトル）を検出することによって測定される。基底状態に戻る際に発する光は、公知のルミノメーター（例えばＰｒｏｍｅｇａ社製、「ＧｌｏＭａｘ」シリーズ）、または分光光度計（例えばＴＥＣＡＮ社製、「Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００ＰＲＯ」）を用いて検出することができる。特定の波長での強度を毎分計測することで、発光の経時的変化およびその安定性を検出できる。長波長へのシフトは、全波長を測定することにより検出することができる。
【0015】
発光酵素活性の至適ｐＨおよび至適温度は、公知の発光酵素（例えばカイアシ類の発光酵素または人工発光酵素）と同じであってよい。発光酵素活性は、好ましくはカイアシ類の発光酵素活性を有する。発光酵素活性の至適ｐＨは５．０～８．０であり、好ましくはｐＨ７．０であり、至適温度は４℃～３０℃であり、好ましくは２５℃である。
【0016】
発光基質は特に限定されず、発光酵素に合わせて適宜選択すればよい。発光基質は、セレンテラジン系、ホタルルシフェリン系、ウミホタルルシフェリン系、フリマジン等公知の基質であってよいが、好ましくはセレンテラジン系の基質である。セレンテラジン系の基質としては、天然型のセレンテラジン、セレンテラジンｉｐ、セレンテラジンｉ、セレンテラジンｈｃｐ、セレンテラジン４００Ａ、セレンテラジン、セレンテラジンｃｐ、セレンテラジンｆ、セレンテラジンｈ、セレンテラジンｎ等が挙げられ、好ましくはセレンテラジンまたはセレンテラジンｈを含む。
【0017】
発光酵素Ａの一態様は、
（Ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸配列が欠損したアミノ酸配列を含む。
（Ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸配列が欠損したアミノ酸配列を含む。
【0018】
発光酵素Ａの一態様は、
（Ａ１）配列番号１に示されたアミノ酸配列の７５位～２０３位のアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基数が１４０個以下であってもよい。発光酵素Ａは、配列番号１に示されたアミノ酸配列の７５位～２０３位のアミノ酸配列からなってもよい。
（Ａ１）配列番号１に示されたアミノ酸配列の７５位～２０３位のアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基数が１４０個以下であってもよい。発光酵素Ａは、配列番号１に示されたアミノ酸配列の７５位～２０３位のアミノ酸配列からなってもよい。
【0019】
（Ａ２）発光酵素Ａは、配列番号１に示されたアミノ酸配列の７５位～２０３位のアミノ酸配列を含み、分子量が２０ｋＤａ以下であってもよい。
【0020】
発光酵素Ａの一態様は、
（Ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸配列が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列を含む。
（Ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸配列が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列を含む。
【0021】
発光酵素Ａの一態様は、
（Ｂ１）配列番号１に示されたアミノ酸配列の７０位～２２１位のアミノ酸配列を含み、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列であってよい。発光酵素Ａは、配列番号１に示されたアミノ酸配列の７０位～２２１位のアミノ酸配列からなり、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列からなってもよい。
（Ｂ１）配列番号１に示されたアミノ酸配列の７０位～２２１位のアミノ酸配列を含み、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列であってよい。発光酵素Ａは、配列番号１に示されたアミノ酸配列の７０位～２２１位のアミノ酸配列からなり、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列からなってもよい。
【0022】
発光酵素Ａは、
（Ｃ）上述の（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列において、配列番号１に示されたアミノ酸配列の７０位～７４位のアミノ酸残基の少なくとも１個がさらに欠損していてもよく、７０位～７４位のアミノ酸配列の全てが欠損していてもよい。
（Ｃ）上述の（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列において、配列番号１に示されたアミノ酸配列の７０位～７４位のアミノ酸残基の少なくとも１個がさらに欠損していてもよく、７０位～７４位のアミノ酸配列の全てが欠損していてもよい。
【0023】
発光酵素Ａは、配列番号１に示されたアミノ酸配列の１４６位～１５６位のアミノ酸残基が、好ましくは２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上または７個以上欠損している。欠損した部位に１～数塩基のリンカー配列が挿入されていてもよい。発光酵素Ａは、配列番号１に示されたアミノ酸配列の１４６位～１５６位の間のアミノ酸残基数が６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、１個以下または０個であってもよい。
【0024】
発光酵素Ａの分子量は、好ましくは２０ｋＤａ以下であり、より好ましくは１８ｋＤａ以下であり、さらに好ましくは１５ｋＤａ以下であり、さらに好ましくは１４ｋＤａ以下であり、特に好ましくは１３ｋＤａ以下である。発光酵素Ａの分子量は、例えば１０ｋＤａ以上である。
【0025】
発光酵素Ａのアミノ酸残基数は、例えば１６０個以下であり、好ましくは１５５個以下、１５０個以下、１４６個以下、１４３個以下、１４０個以下、１３６個以下、１３３個以下、１３０個以下、１２６個以下、１２３個以下、１２２個以下、１２１個以下、１２０個以下、１１９個以下、１１８個以下、１１７個以下である。発光酵素Ａのアミノ酸残基数は、例えば１００個以上である。
【0026】
配列番号１中のＸａａで表されるアミノ酸のうち、３，２０－２９，３１，３２，３５，３７，６４－６６，６９，７６－７７，８５－８６，８９－９０，１２９，１４０－１４４，１４８－１５１，１５９，１６１，１８８，１９１，２０２，２０６位のアミノ酸はどのようなアミノ酸であってもよい。このうち、２２－２３，３９－４０，７６－７７，１４０，１４８－１５１位は欠失していてもよい。好ましくは、３位がＥまたはＧであり、２０－２９位がＰＴＥＮＫＤＤＩ配列（２残基欠失、配列番号２），ＡＴＩＮＥＥＤＩ配列（２残基欠失、配列番号３），ＡＴＩＮＥＮＦＥＤＩ配列（配列番号４），ＨＨＨＨＨＨＨＨ配列（２残基欠失、配列番号５），ＥＫＬＩＳＥＥ配列（２残基欠失、配列番号６），ＭＭＹＰＹＤＶＰ配列（２残基欠失、配列番号７）またはＭＭＤＹＫＤＤＤ配列（２残基欠失、配列番号８）であり、３１位がＩ，Ｌ，ＹまたはＫであり、３２位がＶまたはＡであり、３５位がＥまたはＧであり、３７位がＫまたはＳであり、６４－６６位がＡＮＳ配列またはＤＡＮ配列であり、６９位がＤまたはＧであり、７６－７７位がＧＧ配列若しくはＫ（１残基欠失）であるかまたは欠失していてもよく、８５－８６位がＬＥ，ＫＡまたはＫＥ配列であり、８９－９０位がＫＥ配列，ＩＥ配列，ＬＥ配列またはＫＩ配列であり、１２９位がＥ，ＧまたはＡであり、１４０－１４４位がＴＥＥＥＴ配列（配列番号９），ＧＥＡＩ配列（１残基欠失、配列番号１０）またはＶＧＡＩ配列（１残基欠失、配列番号１１）であり、１４８－１５１位がＧＶＬＧ配列（配列番号１２）もしくはＩ（３残基欠失）であるかまたはすべて欠失してもよく、１５９位がＤ，Ｅ，Ｎ，Ｆ，ＹまたはＷであり、１６１位がＥ，ＡまたはＬであり、１８８位がＫ，Ｆ，ＹまたはＷであり、１９１位がＤ，Ａ，Ｎ，Ｆ，ＹまたはＷであり、２０２位がＡまたはＫであり、２０６位はＳ，Ｄ，Ｎ，Ｆ，ＹまたはＷである。
【0027】
配列番号１の１３，１６，１７４，２１８位のアミノ酸は、疎水性アミノ酸（例えば、Ｖ，Ｆ，Ａ，Ｌ，Ｉ，Ｇ。）であって、好ましくは、１３位がＶまたはＦであり、１６位がＶまたはＡであり、１７４位がＶまたはＡであり、２１８位がＡまたはＬである。
【0028】
配列番号１の５，６７，７５，１０１，１１９，２１４位は、親水性アミノ酸（例えばＱ，Ｋ，Ｄ，Ｒ，Ｈ，Ｅ，Ｔ。）であって、好ましくは、５位がＱまたはＫであり、６７位がＤまたはＲであり、７５位がＫ，Ｈ，ＲまたはＥであり、１０１位がＴまたはＨであり、１１９位がＫ，ＥまたはＱであり、２１１位がＫまたはＴである。
【0029】
配列番号１の４，６，７，１０，１１，１５，３３，３４，３９－４１，６３，６８，７４，７８，８３，１３７，１６０，２０３位は、脂肪族アミノ酸である。ただし、３９，４０，７０位は、欠失していてもよい。好ましくは、４，６，７，１０，１１，１５，３４，６３，７８，８３，１６０位が、高分子量脂肪族アミノ酸（例えば、Ｉ，Ｖ，Ｌ，Ｍ。）が好ましいが、低頻度の低分子量脂肪族アミノ酸が入る場合もある。より好ましくは、４位がＩまたはＶであり、６位がＶまたはＬであり、７位がＬまたはＩであり、１０位がＬまたはＶであり、１１位がＩまたはＬであり、１５位がＬまたはＶであり、３４位がＩまたはＶであり、６３位がＬまたはＶであり、７８位がＬまたはＭであり、８３位がＬまたはＭであり、１６０位がＬまたはＭである。また、好ましくは、３３，３９－４１，６８，７４，１３７，２０３位が低分子量脂肪族アミノ酸（例えば、Ａ，Ｇ，Ｔ）が好ましいが、低頻度の高分子量脂肪族アミノ酸が入る場合もある。より好ましくは、３３位がＧ，ＬまたはＡであり、３９位がＧもしくはＡであるかまたは欠失していてもよく，ＳまたはＦであり、４０位がＴであるかまたは欠失していてもよく、４１位がＴまたはＡであり、６８位がＡまたはＧであり、７４位がＧであるかまたは欠失していてもよく、１３７位がＧまたはＡであり、２０３位がＴまたはＧである。
【0030】
配列番号１の７２，７３，９７，１１０位は、正電荷を有するアミノ酸（塩基性アミノ酸。例えば、Ｋ，Ｒ，Ｈ。）である。ただし、７２位および７３位は、欠失していてもよい。好ましくは、７２位および７３位がＲであるかまたは欠失していてもよく、９７位がＫまたはＲであり、１１０位がＨまたはＫである。
【0031】
配列番号１の６２位および２１１位は負電荷を有するアミノ酸（酸性アミノ酸。例えば、Ｎ，Ｄ，Ｑ，Ｅ。）であり、好ましくは、６２位がＮまたはＤであり、２１１位がＱまたはＥである。
【0032】
配列番号１に示されたアミノ酸配列を有する発光酵素の具体例として、ＡＬｕｃ１０（配列番号１３），ＡＬｕｃ１５（配列番号１４），ＡＬｕｃ１６（配列番号１５），ＡＬｕｃ１７（配列番号１６），ＡＬｕｃ１８（配列番号１７），ＡＬｕｃ１９（配列番号１８），ＡＬｕｃ２１（配列番号１９），ＡＬｕｃ２２（配列番号２０），ＡＬｕｃ２３（配列番号２１），ＡＬｕｃ２４（配列番号２２），ＡＬｕｃ２５（配列番号２３），ＡＬｕｃ２６（配列番号２４），ＡＬｕｃ２７（配列番号２５），ＡＬｕｃ２８（配列番号２６），ＡＬｕｃ２９（配列番号２７），ＡＬｕｃ３０（配列番号２８），ＡＬｕｃ３１（配列番号２９），ＡＬｕｃ３２（配列番号３０），ＡＬｕｃ３３（配列番号３１）、ＡＬｕｃ３４（配列番号３２）、ＡＬｕｃ４１（配列番号３３）、Ａｌｕｃ４２（配列番号３４）、ＡＬｕｃ４３（配列番号３５）、Ａｌｕｃ４４（配列番号３６）、ＡＬｕｃ４５（配列番号３７）、Ａｌｕｃ４６（配列番号３８）、ＡＬｕｃ４７（配列番号３９）、ＡＬｕｃ４８（配列番号４０）、ＡＬｕｃ４９（配列番号４１）、Ａｌｕｃ５０（配列番号４２）、ＡＬｕｃ５１（配列番号４３）、Ａｌｕｃ５２（配列番号４４）、ＡＬｕｃ５３（配列番号４５）、ＡＬｕｃ５５（配列番号４６）、Ａｌｕｃ５６（配列番号４７）、ＡＬｕｃ５７（配列番号４８）等が挙げられる。配列番号１に示されたアミノ酸配列を有する発光酵素は、１位～１９位（分泌シグナル）、２０位～３１位（抗原認識部位等）、２１７位～２２１位（ＧＳリンカー配列）の一部または全部が欠損していてもよい。
【0033】
配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち１－７１位の領域として、配列番号４９に示すアミノ酸配列を有してもよい。この配列を有する発光酵素の典型例として、ＡＬｕｃ１５，ＡＬｕｃ１６，ＡＬｕｃ１７，ＡＬｕｃ１８，ＡＬｕｃ２４が挙げられる。
【0034】
配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち１－１５７位の領域として、配列番号５０に示すアミノ酸配列を有してもよい。この配列を有する発光酵素の典型例として、ＡＬｕｃ２２，ＡＬｕｃ２５，ＡＬｕｃ２６，ＡＬｕｃ２７，ＡＬｕｃ２８，ＡＬｕｃ２９が挙げられる。
【0035】
発光酵素Ａによれば、発光酵素のサイズを小さくすることができる。小さい発光酵素であれば、発光酵素と標的タンパク質、抗体等との融合タンパク質を細胞内で発現させた場合、融合タンパク質が正常に発現しやすく、また、標的タンパク質が正常に機能しない可能性を下げることができる。小さい発光酵素は、発光値が低分子化合物の影響を受けにくいため、薬剤またはリガンドスクリーニングのレポータータンパク質に好適に用いることができる。生体発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）を利用して分子間相互作用の解析を行う場合にも、小さい発光酵素を用いれば、強いシグナルを検出することができる。小さい発光酵素は、分泌型の発光酵素に用いられ得る。分泌型の発光酵素によれば、発光値の測定のために細胞を溶解する必要がなく、遺伝子発現の経時的変化を測定することができる。小さい発光酵素は、細胞内で発現しやすいため、大量の発現および精製を行うことができる。小さい発光酵素は、様々な発現系で発現が可能である。また、小さい発光酵素は、構造安定性にも優れる。
【0036】
発光酵素Ａは、好ましくは高い発光値を有する。発光酵素Ａは、発光のピーク値が好ましくは公知の発光酵素、例えばＮａｎｏＬｕｃ、ＡＬｕｃ等と同程度以上である。発光値が高い発光酵素は、発光の高感度検出が可能であり、検出限界濃度を低くすることができる。
【0037】
発光酵素Ａは、好ましくは熱安定性が高く、例えば温度５０℃、１０分間の熱処理により８０％以上の残存活性を有し、好ましくは温度６０℃、１０分間の熱処理により８０％以上の残存活性を有する。熱安定性が高い発光酵素は、輸送時の温度上昇にも失活しにくく、診断および検査等の現場において実用性に優れる。
【0038】
発光酵素Ａの酵素活性は、好ましくは発光スペクトルの長波長側の裾野が広く、例えば従来のカイアシ類の発光酵素に比べて発光スペクトルが長波長側にシフトする。長波長は生体透過性に優れるため、長波長側の裾野が広い発光スペクトルを有する発光酵素は、ライブイメージングに適する。発光酵素Ａは、セレンテラジンを基質としたときに発光の波長ピークが好ましくは４７０ｎｍ以上４９０ｎｍ以下であり、より好ましくは約４８２ｎｍである。発光酵素Ａは、セレンテラジンｈを基質としたときに発光の波長ピークが４７０ｎｍ以上４９０ｎｍ以下であり、好ましくは約４８８ｎｍである。
【0039】
ＡＬｕｃのＣ末端は、基質との結合に必須であると考えられていた。発光酵素Ａの一態様は、ＡＬｕｃのＣ末端を有さず、発光酵素活性を有する。従って、ＡＬｕｃのＣ末端を有さないポリペプチドの基質結合部位は、ＡＬｕｃとは異なる構造を有すると考えられる。
【0040】
発光酵素Ａは、その内部または端部に抗体認識部位を有してもよい。抗体認識部位の例としては、Ｈｉｓ－ｔａｇ（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号６７）、ＦＬＡＧ－ｔａｇ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号６８）、Ｍｙｃ－ｔａｇ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（配列番号６９）、ＨＡ－ｔａｇ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号７０）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【0041】
発光酵素Ａは、Ｎ末端またはＣ末端に機能性ペプチドが付加されてもよい。例えばＮ末端またはＣ末端に、細胞膜局在化シグナル（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ；ＭＬＳ）をつけることによって発光酵素を細胞膜に局在させることができる。なお、本明細書において、特に明記していない場合でも、シグナルペプチドを含め２種類以上のペプチドを結合する場合には、適宜周知のリンカーを用いてその長さ、読み枠などを調節してよい。発光酵素が細胞膜に局在することによって、外部からの基質や酸素の供給が円滑になり、発光酵素を基盤とした発光プローブ（例えば、発光カプセル）においては、外部の信号に速やかに反応できる利点がある。
【0042】
発光酵素Ａは、（ａ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むことが好ましく、配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなってもよい。配列番号５１に記載のアミノ酸配列は、人工発光酵素のひとつであるＡＬｕｃ３０のアミノ酸配列から、Ｎ末端およびＣ末端を除いた配列（ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０）である。配列番号５４に記載のアミノ酸配列は、ＡＬｕｃ３０のアミノ酸配列から、Ｎ末端配列および中間の配列を除いた配列（ＡＬｕｃ３０Δｌｏｏｐ２Ｎ１）である。同様に、配列番号５２および５３に記載のアミノ酸配列は人工発光酵素のひとつであるＡＬｕｃ１６およびＡＬｕｃ４８のアミノ酸配列から、それぞれＮ末端およびＣ末端を除いた配列であり、配列番号５５および５６に記載のアミノ酸配列は、ＡＬｕｃ１６およびＡＬｕｃ４８のアミノ酸配列から、それぞれＮ末端配列および中間の配列を除いた配列である。
【0043】
発光酵素Ａは、（ｂ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましく、配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなってもよい。発光酵素Ａは、配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または９９．５％以上の同一性を有する。
【0044】
発光酵素Ａは、（ｃ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むことが好ましく、配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列であってもよい。本明細書において数個とは、例えば２～２０個、２～１０個、２～５個、または２～３個であってよい。
【0045】
発光酵素Ａは、１位のアミノ酸配列の前に、開始コドンに相当するアミノ酸（多くはメチオニン）を含んでもよい。配列番号５１～５６のアミノ酸配列の１位にメチオニンが付加された配列を配列番号５７～６２に示す。
発光酵素Ａの一態様は、下記（ａ１）～（ｃ１）を含んでもよく、下記（ａ１）～（ｃ１）からなってもよい。
（ａ１）配列番号５７～６２のいずれかに記載のアミノ酸配列、
（ｂ１）配列番号５７～６２のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｃ１）配列番号５７～６２のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列。
発光酵素Ａは、配列番号５７～６２のいずれかに記載のアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または９９．５％以上の同一性を有する。
発光酵素Ａの一態様は、下記（ａ１）～（ｃ１）を含んでもよく、下記（ａ１）～（ｃ１）からなってもよい。
（ａ１）配列番号５７～６２のいずれかに記載のアミノ酸配列、
（ｂ１）配列番号５７～６２のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｃ１）配列番号５７～６２のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列。
発光酵素Ａは、配列番号５７～６２のいずれかに記載のアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または９９．５％以上の同一性を有する。
【0046】
＜ポリペプチド＞
第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドは、発光酵素Ａの一部である。第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドは、例えば上記の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含み、好ましくは上記の（ａ）～（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含む。第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドは、通常、単独で発光酵素活性を有さない。図１に示すように、第１ポリペプチド１１は、第２ポリペプチド１２との接触により発光酵素活性を生じる。すなわち、第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドおよび基質の存在下で発光できる。第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとの接触または近接は、例えば第１ポリペプチドを含む溶液と第２ポリペプチドを含む溶液とを混合することによって行えばよい。
第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドは、発光酵素Ａの一部である。第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドは、例えば上記の（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含み、好ましくは上記の（ａ）～（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含む。第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドは、通常、単独で発光酵素活性を有さない。図１に示すように、第１ポリペプチド１１は、第２ポリペプチド１２との接触により発光酵素活性を生じる。すなわち、第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドおよび基質の存在下で発光できる。第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとの接触または近接は、例えば第１ポリペプチドを含む溶液と第２ポリペプチドを含む溶液とを混合することによって行えばよい。
【0047】
本明細書において、「発光酵素活性を有さない」とは、例えば後述の実験１１－１の方法において、４位～１２０位のサンプルと同程度の発光値であるとき、発光酵素活性を有さないと判断する。「発光酵素活性を有する」とは、例えば後述の実験１１－１の方法において、発光活性を有さないと判断されたサンプルの発光値よりも十分に高く、例えば２倍以上、好ましくは３倍以上の発光値を示すとき、発光酵素活性を有すると判断することができる。
【0048】
第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドは、小さい発光酵素Ａのさらに一部であるため、サイズが小さい。小さいポリペプチドをプローブとして用いれば、標的タンパク質との融合タンパク質が正常に発現しやすい。また、小さいポリペプチドは、標的タンパク質の機能を阻害しにくい。小さいポリペプチドは、標的タンパク質と他の分子との相互作用を阻害しにくい。第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとの接触または近接により生じる発光酵素活性は、好ましくは発光酵素Ａの活性と同じ性質を有する。それぞれのポリペプチドには、発光酵素Ａと同じように機能性ペプチドまたは抗体認識部位が付加されていてもよい。
【0049】
第１ポリペプチドを構成するアミノ酸配列は、通常、第２ポリペプチドを構成するアミノ酸配列と異なる配列である。第１ポリペプチドを構成するアミノ酸配列と、第２ポリペプチドを構成するアミノ酸配列とは一部が重複してもよいし、重複しなくてもよい。重複しない場合、第１ポリペプチドを構成するアミノ酸配列と第２ポリペプチドを構成するアミノ酸配列とは、発光酵素Ａを構成するアミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列）において連続していてもよいし、１または数個のアミノ酸残基が欠損してもよい。第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドの組み合わせの一例は、発光酵素Ａを二つに分割した際のＮ末端側のポリペプチドおよびＣ末端側のポリペプチドの組み合わせである。
【0050】
第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドの少なくとも１つは、配列番号１または配列番号５１～５３に記載のアミノ酸配列において、配列番号５１に記載のアミノ酸配列の４位～２０位、４位～２１位、４位～２２位、４位～２３位、４位～２４位、４位～３３位、４位～３４位、４位～３５位、４位～３６位、４位～３７位、４位～４５位、４位～４６位、４位～４７位、４位～４８位、４位～４９位、４位～５６位、４位～５７位、４位～５８位、４位～５９位、４位～６０位、４位～６２位、４位～６３位、４位～６４位、４位～６５位、４位～６６位、４位～６７位、４位～７０位、４位～７１位、４位～７２位、４位～７３位、４位～７４位、４位～７５位、４位～７６位、４位～７７位、４位～７８位、４位～７９位、４位～８０位、４位～８４位、４位～８８位、４位～８９位、４位～９０位、４位～９１位、４位～９２位、４位～９３位、４位～１０１位、４位～１０２位、４位～１０３位、４位～１０４位および４位～１０５位から選択されるいずれかに相当するアミノ酸配列を有してもよく、そのアミノ酸配列からなってもよい。第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドの少なくとも１つは、上記配列に加えて、配列番号５１に記載のアミノ酸配列の１～３位に相当するアミノ酸残基をＮ末端に１つ以上有してもよい。
第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドの少なくとも１つは、配列番号１または配列番号５１～５３に記載のアミノ酸配列において、配列番号５１に記載のアミノ酸配列の２１位～１２０位、２２位～１２０位、２３位～１２０位、２４位～１２０位、２５位～１２０位、３４位～１２０位、３５位～１２０位、３６位～１２０位、３７位～１２０位、３８位～１２０位、４６位～１２０位、４７位～１２０位、４８位～１２０位、４９位～１２０位、５０位～１２０位、５７位～１２０位、５８位～１２０位、５９位～１２０位、６０位～１２０位、６１位～１２０位、６３位～１２０位、６４位～１２０位、６５位～１２０位、６６位～１２０位、６７位～１２０位、６８位～１２０位、６９位～１２０位、７０位～１２０位、７１位～１２０位、７２位～１２０位、７３位～１２０位、７４位～１２０位、７５位～１２０位、７６位～１２０位、７７位～１２０位、７８位～１２０位、７９位～１２０位、８０位～１２０位、８１位～１２０位、８５位～１２０位、８９位～１２０位、９０位～１２０位、９１位～１２０位、９２位～１２０位、９３位～１２０位、９４位～１２０位、１０２位～１２０位、１０３位～１２０位、１０４位～１２０位、１０５位～１２０位および１０６位～１２０位から選択されるいずれかに相当するアミノ酸配列を有してもよく、そのアミノ酸配列からなってもよい。第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドの少なくとも１つは、上記配列に加えて、配列番号５１に記載のアミノ酸配列の１２１位および１２２位に相当するアミノ酸残基をＣ末端に１つ以上有してもよい。
第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドの少なくとも１つは、配列番号１または配列番号５１～５３に記載のアミノ酸配列において、配列番号５１に記載のアミノ酸配列の２１位～１２０位、２２位～１２０位、２３位～１２０位、２４位～１２０位、２５位～１２０位、３４位～１２０位、３５位～１２０位、３６位～１２０位、３７位～１２０位、３８位～１２０位、４６位～１２０位、４７位～１２０位、４８位～１２０位、４９位～１２０位、５０位～１２０位、５７位～１２０位、５８位～１２０位、５９位～１２０位、６０位～１２０位、６１位～１２０位、６３位～１２０位、６４位～１２０位、６５位～１２０位、６６位～１２０位、６７位～１２０位、６８位～１２０位、６９位～１２０位、７０位～１２０位、７１位～１２０位、７２位～１２０位、７３位～１２０位、７４位～１２０位、７５位～１２０位、７６位～１２０位、７７位～１２０位、７８位～１２０位、７９位～１２０位、８０位～１２０位、８１位～１２０位、８５位～１２０位、８９位～１２０位、９０位～１２０位、９１位～１２０位、９２位～１２０位、９３位～１２０位、９４位～１２０位、１０２位～１２０位、１０３位～１２０位、１０４位～１２０位、１０５位～１２０位および１０６位～１２０位から選択されるいずれかに相当するアミノ酸配列を有してもよく、そのアミノ酸配列からなってもよい。第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドの少なくとも１つは、上記配列に加えて、配列番号５１に記載のアミノ酸配列の１２１位および１２２位に相当するアミノ酸残基をＣ末端に１つ以上有してもよい。
【0051】
第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドの少なくとも１つは、好ましくは
（１）配列番号５１に記載のアミノ酸配列の４位～７７位（配列番号７６）、４位～２２位（配列番号７７）、４位～５８位（配列番号７８）、４位～６４位（配列番号７９）、４位～７２位（配列番号８０）、２３位～１２０位（配列番号８１）、７８位～１２０位（配列番号８２）、６５位～１２０位（配列番号８３）、７３位～１２０位（配列番号８４）および１０４位～１２０位（配列番号８５）のいずれかのアミノ酸配列、
（２）配列番号７６～配列番号８５のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（３）配列番号７６～配列番号８５のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有する。
第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドの少なくとも１つは、配列番号７６～８５のいずれかに記載のアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または９９．５％以上の同一性を有する。
（１）配列番号５１に記載のアミノ酸配列の４位～７７位（配列番号７６）、４位～２２位（配列番号７７）、４位～５８位（配列番号７８）、４位～６４位（配列番号７９）、４位～７２位（配列番号８０）、２３位～１２０位（配列番号８１）、７８位～１２０位（配列番号８２）、６５位～１２０位（配列番号８３）、７３位～１２０位（配列番号８４）および１０４位～１２０位（配列番号８５）のいずれかのアミノ酸配列、
（２）配列番号７６～配列番号８５のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（３）配列番号７６～配列番号８５のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有する。
第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドの少なくとも１つは、配列番号７６～８５のいずれかに記載のアミノ酸配列と好ましくは９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または９９．５％以上の同一性を有する。
【0052】
第１ポリペプチドが配列番号７６または配列番号７７に記載のアミノ酸配列を有するとき、第２ポリペプチドは配列番号８１または配列番号８２に記載のアミノ酸配列を有してもよい。第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとの組み合わせは、互いに入れ替えられてもよい。第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとの好ましい組み合わせは、配列番号７７と配列番号８１との組み合わせ、または配列番号７６と配列番号８１との組み合わせである。第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとの他の好ましい組み合わせは、配列番号７８と配列番号８１との組み合わせ、配列番号７９と配列番号８３または配列番号８４との組み合わせ、配列番号８０と配列番号８１、配列番号８４または配列番号８５との組み合わせである。
【0053】
図２に示すように、第１ポリペプチド１１は他の分子、例えば第１標的タンパク質２１と接続されていてもよい。ポリペプチド１１と第１標的タンパク質２１とを含む融合タンパク質は、第１ポリペプチド１１と第１標的タンパク質２１との間がリンカー配列によって接続されていてもよい。第１標的タンパク質は、他の標的分子、例えば第２標的タンパク質２２との相互作用を検出したい対象であってよい。第１標的タンパク質２１と第２標的タンパク質２２とは、二量体が形成されてよく、小分子３０の存在下でのみ二量体が形成されてもよい。第２標的タンパク質２２は第２ポリペプチド１２と接続されている。第２標的タンパク質２２と第２ポリペプチド１２とはリンカー配列によって接続されていてもよい。第１標的タンパク質２１と第２標的タンパク質２２とが相互作用するとき、第１ポリペプチド１１と第２ポリペプチド１２とが近接または接触し、基質の存在下で発光が検出される。
【0054】
第１ポリペプチド１１と第２ポリペプチド１２とは、接続されていなくてもよい。第１ポリペプチド１１と第２ポリペプチド１２とは、接続されていてもよく、例えばリンカー配列によって接続されていてもよい。図３に示すように、第１標的タンパク質２１と第１ポリペプチド１１と第２ポリペプチド１２と第２標的タンパク質２２とが接続されていてもよい。このような融合タンパク質を円順列変異体ともいう。第１標的タンパク質２１と第１ポリペプチド１１と第２ポリペプチド１２と第２標的タンパク質２２とを含む融合タンパク質は、それぞれがリンカー配列によって接続されていてもよい。第１標的タンパク質２１と第２標的タンパク質２２とが相互作用するとき、第１ポリペプチド１１と第２ポリペプチド１２とが近接または接触し、基質の存在下で発光が検出される。第１標的タンパク質２１と第２標的タンパク質２２とが二つに分かれている場合に比べて、円順列変異体は、第１標的タンパク質２１と第２標的タンパク質２２との相互作用の検出が容易である。
【0055】
＜ポリペプチドをコードする核酸＞
本発明の一実施形態に係る核酸は、上述のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする。核酸からは、上述のポリペプチドまたは融合タンパク質を製造できる。核酸は、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡである。ポリペプチドをコードする核酸は、上述のポリペプチド対応する塩基配列の５’末端側に開始コドンおよび塩基配列の３’末端に終止コドンを含んでいてもよい。核酸はイントロン配列を含んでもよい。
本発明の一実施形態に係る核酸は、上述のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする。核酸からは、上述のポリペプチドまたは融合タンパク質を製造できる。核酸は、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡである。ポリペプチドをコードする核酸は、上述のポリペプチド対応する塩基配列の５’末端側に開始コドンおよび塩基配列の３’末端に終止コドンを含んでいてもよい。核酸はイントロン配列を含んでもよい。
【0056】
一実施形態に係る核酸には、コード領域において各アミノ酸をコードするコドンを同じアミノ酸をコードする他のコドンに置換した塩基配列を含む核酸が含まれる。ポリペプチドの発現を向上させる観点から、一実施形態に係る核酸は、宿主生物または形質転換細胞種に適するようにコドン出現頻度（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を変更した塩基配列を含む核酸であってもよい。
【0057】
本実施形態に係る核酸は、化学合成またはＰＣＲ等によって得ることができる。
【0058】
＜ベクター＞
本発明の一実施形態に係るベクターは、上述の核酸を含む。ベクターは、ＤＮＡを増幅、維持できる核酸分子であり、例えば発現ベクターおよびクローニングベクターが挙げられる。一例において、上述の核酸は、発現ベクターに挿入された形で宿主細胞等に導入され、上記ポリペプチドまたは融合タンパク質を発現する。発現ベクターは、組み込まれた遺伝子を発現するためのプロモーター配列およびターミネーター配列を有してもよい。本実施形態に係るベクターは，上述の核酸を適当なベクターに挿入して得ることができる。
本発明の一実施形態に係るベクターは、上述の核酸を含む。ベクターは、ＤＮＡを増幅、維持できる核酸分子であり、例えば発現ベクターおよびクローニングベクターが挙げられる。一例において、上述の核酸は、発現ベクターに挿入された形で宿主細胞等に導入され、上記ポリペプチドまたは融合タンパク質を発現する。発現ベクターは、組み込まれた遺伝子を発現するためのプロモーター配列およびターミネーター配列を有してもよい。本実施形態に係るベクターは，上述の核酸を適当なベクターに挿入して得ることができる。
【0059】
ベクターは、例えば細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、ファージミドベクター、人工染色体ベクター等であってよい。ベクターとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＥＴ系プラスミドベクター等が挙げられる。具体的には、大腸菌を宿主細胞とする場合にはｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ３２等を挙げることができる。哺乳動物細胞を宿主細胞とする場合には、例えばｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等を挙げることができる。
【0060】
第２ポリペプチド、または第２ポリペプチドと第２標的タンパク質とを含む融合タンパク質をコードする核酸は、第１ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターと同じベクターに含まれてもよいし、異なるベクターに含まれてもよい。
【0061】
＜形質転換細胞＞
本発明の一実施形態に係る形質転換細胞は、上述の核酸が導入された細胞である。核酸は、ベクターに含まれた形態で細胞に導入されてもよい。形質転換細胞は、第１ポリペプチドまたはこれを含む融合タンパク質を発現できる。好ましくは、同じ形質転換細胞に第２ポリペプチド、または第２ポリペプチドと第２標的タンパク質とを含む融合タンパク質がさらに発現する。これらは上清中に分泌されてもよい。細胞に核酸を導入する方法としては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、カチオニックリポソーム法などの化学的手法；アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ＨＶＪリポソームなどの生物学的手法；エレクトロポレーション、ＤＮＡ直接注射、遺伝子銃などの物理的手法などが例示される。導入する細胞に応じて、適切な導入方法を選択することができる。
本発明の一実施形態に係る形質転換細胞は、上述の核酸が導入された細胞である。核酸は、ベクターに含まれた形態で細胞に導入されてもよい。形質転換細胞は、第１ポリペプチドまたはこれを含む融合タンパク質を発現できる。好ましくは、同じ形質転換細胞に第２ポリペプチド、または第２ポリペプチドと第２標的タンパク質とを含む融合タンパク質がさらに発現する。これらは上清中に分泌されてもよい。細胞に核酸を導入する方法としては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、カチオニックリポソーム法などの化学的手法；アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ＨＶＪリポソームなどの生物学的手法；エレクトロポレーション、ＤＮＡ直接注射、遺伝子銃などの物理的手法などが例示される。導入する細胞に応じて、適切な導入方法を選択することができる。
【0062】
核酸が導入される細胞としては、真核生物または原核生物の細胞を用いることができ、細菌、真菌、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞が挙げられる。細胞は、酵母、大腸菌または哺乳動物の細胞であってよく、哺乳動物としては、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ブタ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ等が含まれる。
【0063】
＜タンパク質相互作用解析法＞
本発明の一実施形態に係るタンパク質相互作用解析法は、上述の試薬キットを利用する。この方法によれば、二つのタンパク質間の相互作用を発光により検出することができる。二つのタンパク質の相互作用には小分子（リガンド）が介在していてもよい。この方法によれば、小分子の存在を発光により検出することができる。本方法に用いられるポリペプチドは、分子量が小さいため、標的タンパク質との融合タンパク質が正常に発現しやすい。また、本方法に用いられるポリペプチドは、標的タンパク質の機能を阻害しにくい。
本発明の一実施形態に係るタンパク質相互作用解析法は、上述の試薬キットを利用する。この方法によれば、二つのタンパク質間の相互作用を発光により検出することができる。二つのタンパク質の相互作用には小分子（リガンド）が介在していてもよい。この方法によれば、小分子の存在を発光により検出することができる。本方法に用いられるポリペプチドは、分子量が小さいため、標的タンパク質との融合タンパク質が正常に発現しやすい。また、本方法に用いられるポリペプチドは、標的タンパク質の機能を阻害しにくい。
【0064】
タンパク質相互作用解析方法の一例は、上記第１ポリペプチドまたは第１ポリペプチドを含む融合タンパク質と、上記第２ポリペプチドまたは第２ポリペプチドを含む融合タンパク質とを、発光基質の存在下で混合する工程を含む。タンパク質相互作用解析方法は、上記融合タンパク質を発現するプラスミドを作成する工程、第１ポリペプチドまたは第１ポリペプチドを含む融合タンパク質を細胞で発現させる工程、第２ポリペプチドまたは第２ポリペプチドを含む融合タンパク質を細胞で発現させる工程、第１ポリペプチドまたは第１ポリペプチドを含む融合タンパク質を細胞またはその培養上清から回収する工程、第２ポリペプチドまたは第２ポリペプチドを含む融合タンパク質を細胞またはその培養上清から回収する工程、発光を検出する工程等をさらに含んでもよい。
【0065】
＜レポーター分析＞
上記ポリペプチドをプローブとして用いて、各種のレポーター分析を行うこともできる。第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドと組み合わせて、従来の発光酵素または各種蛍光タンパク質を用いたレポーター分析法において、発光または蛍光物質の代替として用いることができる。
上記ポリペプチドをプローブとして用いて、各種のレポーター分析を行うこともできる。第１ポリペプチドは、第２ポリペプチドと組み合わせて、従来の発光酵素または各種蛍光タンパク質を用いたレポーター分析法において、発光または蛍光物質の代替として用いることができる。
【0066】
本明細書においてレポーター分析法とは、第１ポリペプチドまたは第２ポリペプチドをレポータータンパク質として用いて、外部刺激に応じた細胞内における標的タンパク質または標的遺伝子の挙動を、発光の有無もしくは発光量、発光時期またはその発光位置に置き換えて観察する分析法である。具体的には、レポーター分析法は、標的遺伝子の発現位置、発現時期または発現量を、発光位置、発光時期または発光量として定性的または定量的に測定する方法であるといえる。レポーター分析は、異なる波長の光を発する複数の酵素またはタンパク質と多重化して使用してもよい。
【0067】
レポーター分析は、哺乳動物等の生体内、培養細胞内または試験管内で行い得る。生体内等のｉｎ ｖｉｖｏ条件で用いる場合には、上述のポリペプチドを構成するアミノ酸配列をコードする核酸からなるレポーター遺伝子と標的遺伝子とを繋いでベクターに組み込み、ターゲットとなる細胞内に導入する。培養細胞としては、一般的な遺伝子組換えに用いられる哺乳動物細胞のＣＯＳ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、酵母、大腸菌等の細菌、昆虫細胞が挙げられる。
【0068】
以下、本発明に係るレポーター分析法を、Ｎｉｕら、Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ，２、２０１２、４１３．において示された３つの分類である“ｂａｓｉｃ”、“ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ”および“ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ”の３種類に分けて、上記ポリペプチドのそれぞれの分析法への適用について説明する。
【0069】
（１）ｂａｓｉｃ法
ｂａｓｉｃ法とは、もっとも単純なレポーター分析系であって、挙動を調べたい標的タンパク質にプローブを繋いで標識するレポーター分析系である。第１ポリペプチドをプローブとしてｂａｓｉｃ法に適用する場合、第１ポリペプチドと標的タンパク質または標的タンパク質に結合するタンパク質とを含む融合タンパク質を作製すればよい。融合タンパク質が非制御型プロモーターで発現する点が他のレポーター分析法とは異なる。融合タンパク質は、標的タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏイメージングにも使用できる。
ｂａｓｉｃ法とは、もっとも単純なレポーター分析系であって、挙動を調べたい標的タンパク質にプローブを繋いで標識するレポーター分析系である。第１ポリペプチドをプローブとしてｂａｓｉｃ法に適用する場合、第１ポリペプチドと標的タンパク質または標的タンパク質に結合するタンパク質とを含む融合タンパク質を作製すればよい。融合タンパク質が非制御型プロモーターで発現する点が他のレポーター分析法とは異なる。融合タンパク質は、標的タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏイメージングにも使用できる。
【0070】
融合タンパク質は、（ｉ）第１ポリペプチドと、標的タンパク質または標的タンパク質を認識するタンパク質（ペプチドを含む。）とを含む融合タンパク質をコードする核酸から一体として発現させたもの、（ｉｉ）第１ポリペプチドと、標的タンパク質または標的タンパク質を認識するタンパク質とを別々に発現させ、これらを化学反応により連結させたものを包含する。別々に発現させたタンパク質等を化学反応により連結させる手段としては、例えばクロスリンカーによる連結、アビジン－ビオチンの結合能を利用した連結、アミノ酸残基の化学反応性を利用した結合などが例示される。
【0071】
融合タンパク質としては、プローブを抗体に繋げたプローブ標識抗体が挙げられる。この融合タンパク質においては、抗体の単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）のｃＤＮＡの上流または下流にプローブ配列を繋げたキメラＤＮＡを作成する。ＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、細胞に導入し、発現させて融合タンパク質を得ることができる。
【0072】
（２）ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ法
ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ法は、ｂａｓｉｃ法と比較して、レポーターの発現がプロモーターによって制御されている点が異なる。発光酵素をレポータータンパク質としてｉｎｄｕｃｉｂｌｅ法に適用することは、組換えＤＮＡ技術によって組換えタンパク質が作製される際の遺伝子発現の時期および発現量の解析のために従来から用いられており、特に外部刺激に応答した発現時期および発現量変化を示す指標として広く用いられている。ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ法に含まれる分析システムとしては、レポータージーンアッセイ、酵母ツーハイブリットアッセイ、哺乳類ツーハイブリットアッセイ、生体発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）、タンパク質スプライシングアッセイ（ＰＳＡ）、タンパク質相補性アッセイ（ＰＣＡ）、ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ等が挙げられる。これらの分析法に用いられるレポーター遺伝子として、本発明のポリペプチドを用いることで、アッセイの計測性能を飛躍的に向上できる。
ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ法は、ｂａｓｉｃ法と比較して、レポーターの発現がプロモーターによって制御されている点が異なる。発光酵素をレポータータンパク質としてｉｎｄｕｃｉｂｌｅ法に適用することは、組換えＤＮＡ技術によって組換えタンパク質が作製される際の遺伝子発現の時期および発現量の解析のために従来から用いられており、特に外部刺激に応答した発現時期および発現量変化を示す指標として広く用いられている。ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ法に含まれる分析システムとしては、レポータージーンアッセイ、酵母ツーハイブリットアッセイ、哺乳類ツーハイブリットアッセイ、生体発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）、タンパク質スプライシングアッセイ（ＰＳＡ）、タンパク質相補性アッセイ（ＰＣＡ）、ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ等が挙げられる。これらの分析法に用いられるレポーター遺伝子として、本発明のポリペプチドを用いることで、アッセイの計測性能を飛躍的に向上できる。
【0073】
（ｉ）レポータージーンアッセイ
レポータージーンアッセイ法は、外部刺激による転写因子の活性化および遺伝子の発現調節の解析手段として汎用されている。一例としては核内受容体を介したシグナル伝達を攪乱する内分泌攪乱物質（環境ホルモン）の検出に用いられている。核内受容体を介したシグナル伝達に関連した標的遺伝子（例えば、ホルモン応答性遺伝子）の発現は、リガンドと受容体との複合体が当該遺伝子の転写調節するシス領域（ホルモン応答配列；ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）に結合することで引き起こされる。この各種ホルモン応答性遺伝子のシス領域の下流にレポーター遺伝子を組み込んだプラスミドを細胞内に導入し、リガンドとなり得るホルモン分子または内分泌攪乱物質の量を発光値として検出する。
レポータージーンアッセイ法は、外部刺激による転写因子の活性化および遺伝子の発現調節の解析手段として汎用されている。一例としては核内受容体を介したシグナル伝達を攪乱する内分泌攪乱物質（環境ホルモン）の検出に用いられている。核内受容体を介したシグナル伝達に関連した標的遺伝子（例えば、ホルモン応答性遺伝子）の発現は、リガンドと受容体との複合体が当該遺伝子の転写調節するシス領域（ホルモン応答配列；ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）に結合することで引き起こされる。この各種ホルモン応答性遺伝子のシス領域の下流にレポーター遺伝子を組み込んだプラスミドを細胞内に導入し、リガンドとなり得るホルモン分子または内分泌攪乱物質の量を発光値として検出する。
【0074】
レポータージーンアッセイ法において、従来から広く用いられていたホタルルシフェラーゼの場合、［１］分子量が大きくて発現までに時間がかかるので、宿主細胞に大きな負担をかけることになり、［２］発光強度が低いため、十分ルシフェラーゼ（レポーター）量が蓄積するまでに、通常刺激後１～２日の時間を待つ必要がある、という欠点があったが、上記ポリペプチドをプローブとして選択することでこれらの問題点が解消される。
【0075】
上記ポリペプチドをプローブとして使用すれば、レポーターの発光強度が極めて高いため、刺激後にごく短時間で測定ができる利点がある。そのため、従来のレポータータンパク質より大幅に計測時間を短縮でき、かつ経時的な発光の安定性も高いことから、遺伝子導入効率の悪い細胞株においても発光測定ができる。また、長波長側にシフトしているので、細胞膜、皮膚を通しての透過性が高まっているため、バックグラウンド値が下がり測定精度も高い。
【0076】
具体的に、上記ポリペプチドをレポータージーンアッセイに適用するためには、上流に特殊なプロモーターを搭載している既知の真核細胞発現ベクターに当該プローブ配列を繋いで、真核細胞に導入し、一定時間が過ぎた後、信号（刺激）有り無しの条件で発光値を測定すればよい。ポリペプチドを搭載できる、レポータージーンアッセイ用の発現ベクターとしては、公知のｐＴｒａｎｓＬｕｃｅｎｔベクターを利用し、既知の方法を使って簡単に搭載させることができる。
【0077】
（ｉｉ）ツーハイブリッド法
ツーハイブリッド法（ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法）はタンパク質間の相互作用を調べる手法の１つであり、１９８９年に酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いたｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ（Ｙ２Ｈ）システムがまず構築された。転写活性化因子であるＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ ＤＢＤ）と転写活性化ドメインが分離可能であることを利用して、ＧＡＬ４ ＤＢＤと任意のタンパク質Ａ（ｂａｉｔ）を融合タンパク質として発現させ、同時に細胞内で発現させた転写活性化ドメイン（ＴＡ）と融合タンパク質としたタンパク質Ｂ（ｐｒｅｙ）と相互作用をするかどうかを判定できる。タンパク質Ａとタンパク質Ｂとが結合する場合にはＤＢＤとＴＡが近接してＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）が、「ＵＡＳＧ」塩基配列に結合するのでその下流に連結したポリペプチドの発現を促すことになる。第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとを組み合わせて、その特異的な基質存在下で生物発光をモニターすれば、タンパク質Ａおよびタンパク質Ｂの両タンパク質の親和性が測定でき、タンパク質Ａ（ｂａｉｔ）と相互作用をするタンパク質またはペプチドのスクリーニングができる。その際のタンパク質Ｂ（ｐｒｅｙ）は発現ライブラリーによって提供させることもできる。
ツーハイブリッド法（ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法）はタンパク質間の相互作用を調べる手法の１つであり、１９８９年に酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いたｙｅａｓｔ ｔｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ（Ｙ２Ｈ）システムがまず構築された。転写活性化因子であるＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ ＤＢＤ）と転写活性化ドメインが分離可能であることを利用して、ＧＡＬ４ ＤＢＤと任意のタンパク質Ａ（ｂａｉｔ）を融合タンパク質として発現させ、同時に細胞内で発現させた転写活性化ドメイン（ＴＡ）と融合タンパク質としたタンパク質Ｂ（ｐｒｅｙ）と相互作用をするかどうかを判定できる。タンパク質Ａとタンパク質Ｂとが結合する場合にはＤＢＤとＴＡが近接してＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）が、「ＵＡＳＧ」塩基配列に結合するのでその下流に連結したポリペプチドの発現を促すことになる。第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとを組み合わせて、その特異的な基質存在下で生物発光をモニターすれば、タンパク質Ａおよびタンパク質Ｂの両タンパク質の親和性が測定でき、タンパク質Ａ（ｂａｉｔ）と相互作用をするタンパク質またはペプチドのスクリーニングができる。その際のタンパク質Ｂ（ｐｒｅｙ）は発現ライブラリーによって提供させることもできる。
【0078】
宿主細胞としては、酵母細胞に限らず、大腸菌など細菌類や、哺乳動物細胞、昆虫細胞も用いられる。その際、酵母由来の転写活性化因子であるＧＡＬ４ ＤＢＤ以外に、大腸菌由来のリプレッサータンパク質の「ＬｅｘＡ」等を用いることもできる。これらをコードするＤＮＡと、リガンド応答性転写調節因子のリガンド結合領域などｂａｉｔタンパク質（即ち、前記の任意のタンパク質Ａ）をコードするＤＮＡとを連結し、宿主細胞内で機能可能なプロモーターの下流に連結する。一方、「転写活性化因子の転写活性化領域」としては、例えば、ＧＡＬ４の転写活性化領域、大腸菌由来のＢ４２酸性転写活性化領域、ヘルペス単純ウイルスＶＰ１６の転写活性化領域等を用いることができる。これら転写活性化領域をコードするＤＮＡと、ｐｒｅｙタンパク質（即ち、前記の任意のタンパク質Ｂ）をコードするＤＮＡとを連結し、宿主細胞内で機能可能なプロモーターの下流に連結する。
【0079】
具体的には、転写調節因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域をコードするＤＮＡを有し、出芽酵母を宿主細胞において利用可能なベクターとして、プラスミドｐＧＢＴ９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を挙げることができる。ＧＡＬ４の転写活性化領域をコードするＤＮＡを有し、出芽酵母において利用可能なベクターとして、プラスミドｐＧＡＤ４２４（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等を挙げることができる。また、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域をコードするＤＮＡを有し、哺乳類動物細胞において利用可能なベクターとして、ｐＭ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、ｐＢＩＮＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等をあげることができ、単純ヘルペスウィルスＶＰ１６の転写活性化領域をコードするＤＮＡを有し、哺乳類動物細胞において利用可能なベクターとして、ｐＶＰ１６（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、ｐＡＣＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等をあげることができる。また、ＬｅｘＡのＤＮＡ結合領域をコードするＤＮＡを有し、哺乳類動物細胞において利用可能なベクターとして、ｐＬｅｘＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等をあげることができ、Ｂ４２をコードするＤＮＡを有し、哺乳類動物細胞において利用可能なベクターとして、ｐＢ４２ＡＤ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等をあげることができる。
【0080】
例えば第１ポリペプチドを、ＧＡＬ４が結合する領域（「ＵＡＳＧ」）などの下流に挿入したベクターを構築すればよく、哺乳動物宿主の場合であれば、市販のｐＧ５Ｌｕｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）やｐＦＲ－Ｌｕｃベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を利用し、当該ベクターに搭載されているホタルルシフェラーゼの代わりに周知の方法で簡単に第１ポリペプチドを搭載して使用することができる。また、市販のｐＧ５ＣＡＴベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＣｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＡＴ）の代わりに用いることもできる。
【0081】
（３）ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ法
ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ法は、第１ポリペプチドが第２ポリペプチドと組み合わせてリガンド刺激に能動的に反応して発光することを利用するレポーター分析法である。典型的には、一分子型生物発光プローブ、発光カプセルがあげられ、他にタンパク質相補性アッセイ（ＰＣＡ），ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｓｓａｙ（ＰＳＡ）などに適用できる。
ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ法は、第１ポリペプチドが第２ポリペプチドと組み合わせてリガンド刺激に能動的に反応して発光することを利用するレポーター分析法である。典型的には、一分子型生物発光プローブ、発光カプセルがあげられ、他にタンパク質相補性アッセイ（ＰＣＡ），ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｓｓａｙ（ＰＳＡ）などに適用できる。
【0082】
（ｉ）発光性融合タンパク質（発光カプセル）の製造
上記ポリペプチドのＣ末端側に膜局在シグナル（ＭＬＳ）を結合することで、ポリペプチドを細胞膜に局在させることができる。発光酵素を細胞膜に局在する分子設計を行うことによって、基質と酸素の供給が円滑になるため、極めて高輝度で安定的な生物発光可視化が可能になる。その際、ポリペプチドとシグナルペプチドをコードする核酸の間に任意のポリペプチドやタンパク質の遺伝子をカーゴ（貨物という）として挿入することが可能である。これによりカーゴとなるタンパク質を細胞膜表面に効率的に運ぶことができ、しかも運ばれた場所が光るようになる。一例としては、各タンパク質の繋ぎ目に細胞死に応答するＤＥＶＤ配列やＩＥＴＤ配列をカーゴとして入れ込んだ場合、細胞死の際のｃａｓｐａｓｅ－３やｃａｓｐａｓｅ－８の活性を信号として能動的に応答し、可視化するシステムとして働く。この構造の発光性融合タンパク質を「発光カプセル」ともいう。発光カプセルは、化学物質の毒性評価にも使用できる。
上記ポリペプチドのＣ末端側に膜局在シグナル（ＭＬＳ）を結合することで、ポリペプチドを細胞膜に局在させることができる。発光酵素を細胞膜に局在する分子設計を行うことによって、基質と酸素の供給が円滑になるため、極めて高輝度で安定的な生物発光可視化が可能になる。その際、ポリペプチドとシグナルペプチドをコードする核酸の間に任意のポリペプチドやタンパク質の遺伝子をカーゴ（貨物という）として挿入することが可能である。これによりカーゴとなるタンパク質を細胞膜表面に効率的に運ぶことができ、しかも運ばれた場所が光るようになる。一例としては、各タンパク質の繋ぎ目に細胞死に応答するＤＥＶＤ配列やＩＥＴＤ配列をカーゴとして入れ込んだ場合、細胞死の際のｃａｓｐａｓｅ－３やｃａｓｐａｓｅ－８の活性を信号として能動的に応答し、可視化するシステムとして働く。この構造の発光性融合タンパク質を「発光カプセル」ともいう。発光カプセルは、化学物質の毒性評価にも使用できる。
【0083】
発光カプセルは、従来の発光プローブと比較し、極めて高輝度で安定な発光特質を示し、細胞膜を透過できない検体に対しても応答する利点を持つ。この発光カプセルは「発光酵素本体のＣ末端」に「膜局在シグナル（ＭＬＳ）」をつけた構造を基本骨格とする。上記ポリペプチドは、タンデムに繋いで発光量を増強してもよい。発光カプセルは、細胞死等の細胞表面の形態変化を引き起こす化合物の作用を、細胞膜表面の形態変化として可視化できるため、観察が容易になる。好ましくは、発光酵素本体のＣ末端とＭＬＳとの間に、細胞膜表面の形態変化を引き起こすポリペプチドもしくはその一部認識配列、具体的には、Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧＰＣＲ）やｃ－Ｓｒｃなどの全長もしくは一部認識配列を挿入することが可能である。発光酵素本体のＣ末端とＭＬＳとの間に細胞死を誘発するポリペプチド、もしくはその認識配列を貨物として挿入することで、細胞死の可視化が可能である。より具体的には、各種ｃａｓｐａｓｅやプロテアーゼ（セリンプロティアーゼ、システインプロティアーゼなど）、消化酵素（トリプシン、アミラーゼなど）によって認識されるペプチド配列（通常２０アミノ酸以下、好ましくは１０アミノ酸以下）またはＤＥＶＤ配列もしくはＩＥＴＤ配列を含むアミノ酸配列をカーゴとして挿入した場合、ｃａｓｐａｓｅ－３活性による細胞死の可視化が可能である。さらにポリペプチドとＭＬＳとの間に蛍光タンパク質もしくは他の発光酵素をカーゴとしてつなげることによって、細胞膜表面での光発生量が強力となるため、より細胞膜の形態観察が容易となる。発光カプセルは、細胞膜を透過できないリガンドに対しても応答するため、幅広い刺激物に対するスクリーニングが可能である。
【0084】
発光カプセルは、上記ポリペプチドのＣ末端側と膜局在シグナル（ＭＬＳ）との間に、細胞膜表面で発現させたい任意のタンパク質またはポリペプチドが挿入された発光性融合タンパク質であり、典型的には、
（ａ）ポリペプチドのＣ末端側と膜局在シグナル（ＭＬＳ）との間に、蛍光タンパク質または発光酵素（上記ポリペプチド以外の酵素であってよい。）が挿入された発光性融合タンパク質、または
（ｂ）ポリペプチドのＣ末端側と膜局在シグナル（ＭＬＳ）との間に、細胞膜の形態を変化させるポリペプチドまたは当該ポリペプチドが認識する２０アミノ酸以下の、好ましくは１０アミノ酸以下のポリペプチドが挿入された発光性融合タンパク質であってよい。細胞膜の形態を変化させるポリペプチドとして、細胞死を誘発するポリペプチドが好ましく、ｃａｓｐａｓｅおよびその認識配列である「ＤＥＶＤ」または「ＩＥＴＤ」を含む２０アミノ酸以下のポリペプチドが特に好ましい。
（ａ）ポリペプチドのＣ末端側と膜局在シグナル（ＭＬＳ）との間に、蛍光タンパク質または発光酵素（上記ポリペプチド以外の酵素であってよい。）が挿入された発光性融合タンパク質、または
（ｂ）ポリペプチドのＣ末端側と膜局在シグナル（ＭＬＳ）との間に、細胞膜の形態を変化させるポリペプチドまたは当該ポリペプチドが認識する２０アミノ酸以下の、好ましくは１０アミノ酸以下のポリペプチドが挿入された発光性融合タンパク質であってよい。細胞膜の形態を変化させるポリペプチドとして、細胞死を誘発するポリペプチドが好ましく、ｃａｓｐａｓｅおよびその認識配列である「ＤＥＶＤ」または「ＩＥＴＤ」を含む２０アミノ酸以下のポリペプチドが特に好ましい。
【0085】
（ｉｉ）発光プローブへの応用
上記ポリペプチドを一分子型発光プローブ、または二分子型発光プローブに組み込むことによって、リガンドの有無およびリガンドの活性強度を高輝度で観測できる。当該プローブの構成要素として、［１］２つに分割された発光酵素（ＮとＣ末側断片）の近傍に、［２］標的リガンドに応答するリガンド結合タンパク質と、［３］リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識する認識タンパク質を繋げた形態で高性能の発光プローブを構成できる。この発光プローブ中、前記リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを前記認識タンパク質が認識した場合に、２つに分割された酵素断片が相補して酵素活性を変化させることができる。この時、当該分割酵素の高輝度と安定性のため、検出限界の向上と信頼性の高い計測が可能となる。
上記ポリペプチドを一分子型発光プローブ、または二分子型発光プローブに組み込むことによって、リガンドの有無およびリガンドの活性強度を高輝度で観測できる。当該プローブの構成要素として、［１］２つに分割された発光酵素（ＮとＣ末側断片）の近傍に、［２］標的リガンドに応答するリガンド結合タンパク質と、［３］リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識する認識タンパク質を繋げた形態で高性能の発光プローブを構成できる。この発光プローブ中、前記リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを前記認識タンパク質が認識した場合に、２つに分割された酵素断片が相補して酵素活性を変化させることができる。この時、当該分割酵素の高輝度と安定性のため、検出限界の向上と信頼性の高い計測が可能となる。
【0086】
一分子型発光プローブは、可視化イメージングするために用いられる全構成要素を単一融合分子内に集積したことを特徴とする、公知の生物発光プローブの一つである。例えば、発光酵素を２分割したＮとＣ末側断片と、リガンド結合タンパク質およびリガンド結合タンパク質の認識タンパク質を基本構成要素として含む融合タンパク質である。二分子型発光プローブは、発光酵素のＮ末側断片とＣ末側断片を、リガンド結合タンパク質を含む融合タンパク質、および認識タンパク質を含む融合タンパク質内にそれぞれ存在させたタイプの生物発光プローブを指す。
【0087】
上記ポリペプチドを一分子型発光プローブとして用いる際の具体的な手法は、公知の手法に従う。具体的には、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドと、リガンド結合性のタンパク質および当該タンパク質にリガンドが結合した場合の立体構造変化を認識するペプチド配列とを直線上に結合させた発光プローブ（融合タンパク質）をコードするキメラＤＮＡを設計する。一般には、そのキメラＤＮＡを発現させたい細胞に適したベクター内にサブクローンし、当該ベクターを細胞内に導入して、細胞内で発現させるが、キメラＤＮＡの上流に制御配列を繋いで細胞内に直接導入することもできる。ここで、対象の細胞としては、ヒトを含めた哺乳動物由来の細胞が好ましく、生体内に存在する状態の細胞であっても、細胞本来の機能を維持した状態の培養細胞であってもよい。酵母細胞、昆虫細胞の他、大腸菌などの原核細胞であってもよい。ベクターの具体的な種類も特に限定されず、発現に用いる宿主中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。細胞内への導入法としては、マイクロインジェクション法やエレクトロポーレーション法等の公知のトランスフェクション法を用いることができる。あるいは脂質による細胞内導入法（ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｃｈａｒｉｏｔ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社）等）を採用することもできる。
【0088】
上記ポリペプチドを用いた生物発光プローブは、キメラＤＮＡとして細胞内に導入された後に細胞内で融合タンパク質として発現されるため、当該形質転換細胞に対してリガンド刺激を行った後、当該細胞からの発光量の変化を測定することによって、リガンドの性質、活性の程度等を評価することができる。
【0089】
上記ポリペプチドを生物発光プローブ内に構成する際、当該ポリペプチドと共に搭載できる「リガンド結合タンパク質」としては、そのリガンド結合部位にリガンドが結合するタンパク質が意図される。リガンド結合タンパク質は、例えば、リガンドが結合することによって立体構造が変化するか、リン酸化を起こすか、タンパク質間相互作用を促すものであり得る。このようなリガンド結合タンパク質としては、例えば、ホルモン、化学物質または信号伝達タンパク質をリガンドとする核内受容体（ＮＲ）、サイトカイン受容体、あるいは各種タンパク質キナーゼが用いられる。リガンド結合タンパク質は、対象とするリガンドによって適宜選択される。リガンド結合タンパク質に結合するリガンドとしては、リガンド結合タンパク質に結合するものであれば特に限定されず、細胞外から細胞内に取り込まれる細胞外リガンドであってもよく、細胞外からの刺激により細胞内で産生される細胞内リガンドであってもよい。細胞外リガンドは、例えば、受容体タンパク質（例えば核内受容体、Ｇタンパク質結合型受容体等）に対するアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。細胞内の情報伝達に関与するタンパク質に特異的に結合するサイトカイン、ケモカイン、インシュリン等の信号伝達タンパク質、細胞内セカンドメッセンジャー、脂質セカンドメッセンジャー、リン酸化アミノ酸残基、Ｇタンパク質結合型受容体リガンド等であり得る。
【0090】
例えば、リガンドとして細胞内セカンドメッセンジャー、脂質セカンドメッセンジャー等を対象とする場合には、リガンド結合タンパク質として、各セカンドメッセンジャーの結合ドメインを使用することができる。セカンドメッセンジャーとは、ホルモン、神経伝達物質等の細胞外情報伝達物質が細胞膜に存在する受容体と結合することによって、細胞内で新たに生成される別種の細胞内情報伝達物質を意図している。このセカンドメッセンジャーとして、例えば、ｃＧＭＰ、ＡＭＰ、ＰＩＰ、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、イノシトール３リン酸（ＩＰ３：ｉｎｏｓｉｔｏｌ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＩＰ４、Ｃａ２＋、ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ、ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｈｉｄ等が挙げられる。例えば、セカンドメッセンジャーのＣａ２＋に対しては、リガンド結合タンパク質としてカルモジュリン（ＣａＭ）を用いることができる。
【0091】
（ｉｉｉ）生体発光共鳴エネルギー転移（ＢＲＥＴ）
上記ポリペプチドは、リガンド－タンパク質相互作用またはタンパク質－タンパク質相互作用を検出するための任意の方法において使用され得る。発光ドナーから蛍光受容体へのエネルギー移動は、光の放出のスペクトル分布のシフトをもたらす。このエネルギー移動は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質－タンパク質相互作用またはリガンド－タンパク質相互作用のリアルタイムモニタリングを可能にし得る。一例として、第１ポリペプチドと標的分子（標的タンパク質、リガンド等）とを接続した融合タンパク質、および標的分子に結合するタンパク質またはリガンドと蛍光タンパク質とを接続した融合タンパク質を作製し、両者および第２ポリペプチドが近接したときに、ＢＲＥＴシグナルが検出される。
上記ポリペプチドは、リガンド－タンパク質相互作用またはタンパク質－タンパク質相互作用を検出するための任意の方法において使用され得る。発光ドナーから蛍光受容体へのエネルギー移動は、光の放出のスペクトル分布のシフトをもたらす。このエネルギー移動は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質－タンパク質相互作用またはリガンド－タンパク質相互作用のリアルタイムモニタリングを可能にし得る。一例として、第１ポリペプチドと標的分子（標的タンパク質、リガンド等）とを接続した融合タンパク質、および標的分子に結合するタンパク質またはリガンドと蛍光タンパク質とを接続した融合タンパク質を作製し、両者および第２ポリペプチドが近接したときに、ＢＲＥＴシグナルが検出される。
【0092】
（ｉｖ）タンパク質相補性アッセイ（ＰＣＡ）
上記ポリペプチドは、タンパク質相補性アッセイ（ＰＣＡ）または酵素断片化アッセイなどのリガンド－タンパク質相互作用またはタンパク質－タンパク質相互作用あるいは近接を検出するための方法において使用されてよい。ＰＣＡは、２つの生体分子、例えば、ポリペプチドの相互作用を検出するための手段を提供する。例えば第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを、近接を検証したい分子にそれぞれ融合させる。標的の分子が相互作用する場合、２つに分断されていたポリペプチドは相互作用して完全な発光酵素となり、発光が検出される。
上記ポリペプチドは、タンパク質相補性アッセイ（ＰＣＡ）または酵素断片化アッセイなどのリガンド－タンパク質相互作用またはタンパク質－タンパク質相互作用あるいは近接を検出するための方法において使用されてよい。ＰＣＡは、２つの生体分子、例えば、ポリペプチドの相互作用を検出するための手段を提供する。例えば第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを、近接を検証したい分子にそれぞれ融合させる。標的の分子が相互作用する場合、２つに分断されていたポリペプチドは相互作用して完全な発光酵素となり、発光が検出される。
【0093】
（ｖ）細胞内イメージング
上記ポリペプチドをコードする遺伝子は、様々な細胞株に安定的に導入できる。発光酵素を用いた細胞内イメージングは、公知の方法により行えばよい。一例として、胚内未分化細胞、ＥＳ細胞や新型万能細胞（ｉＰＳ）に当該ポリペプチドを安定的に導入できる。前記細胞そのものは、光らないため内部で起こる分子現象、組織特異性を探索するのは大変困難であった。この困難を克服するために、まず、体細胞に当該ポリペプチドを含む分子プローブを導入してから胚を作成し、様々な臓器組織に分化させる。これにより、各臓器ごとに起こる特異的な分子現象を高感度に計測できる。
上記ポリペプチドをコードする遺伝子は、様々な細胞株に安定的に導入できる。発光酵素を用いた細胞内イメージングは、公知の方法により行えばよい。一例として、胚内未分化細胞、ＥＳ細胞や新型万能細胞（ｉＰＳ）に当該ポリペプチドを安定的に導入できる。前記細胞そのものは、光らないため内部で起こる分子現象、組織特異性を探索するのは大変困難であった。この困難を克服するために、まず、体細胞に当該ポリペプチドを含む分子プローブを導入してから胚を作成し、様々な臓器組織に分化させる。これにより、各臓器ごとに起こる特異的な分子現象を高感度に計測できる。
【0094】
上記ポリペプチドに適当なシグナルペプチドを繋げることによって、各細胞小器官の高輝度イメージングに使用できる。例えば、ＧＡＰ－４３由来の「ＭＬＣＣＭＲＲＴＫＱＶ配列」（配列番号６３）をポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加すると、細胞膜に局在化できる。「ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ配列」（配列番号６４）を付加すると細胞質に局在できる。「ＫＤＥＬ」（配列番号６５）の付加により小胞体（ＥＲ）に、「ＤＰＫＫＫＲＫＶ配列」（配列番号６６）の付加により細胞核に局在化させることができる。ＨＩＳ－ｔａｇ（ＨＨＨＨＨＨ）（配列番号６７）、ＦＬＡＧ－ｔａｇ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号６８）、Ｍｙｃ－ｔａｇ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（配列番号６９）、ＨＡ－ｔａｇ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）（配列番号７０）、Ｖ５－ｔａｇ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）（配列番号７１）、Ｔ７－ｔａｇ（ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ）（配列番号７２）などの抗原サイトをつけることによって、非細胞系における免疫染色、分離精製に利用できる。その際には、周知の免疫染色法、ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ等の手法が適用できる。
【0095】
本明細書におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。なお、用語は基本的にはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ ｅｄ．，Ｖｏｌ．１ ｔｏ ４，（Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えＤＮＡ技術）」、東京化学同人（１９９２）；Ｒ．Ｗｕ ｅｄ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．６８（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｒ．Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１００（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｂ） ＆ １０１（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｃ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）；Ｒ．Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．１５３（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｄ），１５４（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｅ） ＆ １５５（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｆ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。また、本発明で使用する各種タンパク質やペプチド、あるいはそれらをコードするＤＮＡについては、既存のデータベース（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／等）から入手することができる。
【実施例0096】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0097】
実験１：ｍｉｎｉＡＬｕｃプラスミドの作製
配列番号１の２０位～２２１位に相当するアミノ酸配列を有する発光酵素のひとつであり、ＡＬｕｃ３０（配列番号２８）からシグナル配列を除いた２０位～２１２位のアミノ酸配列を有する発光酵素をＡＬｕｃ３０ｗｔとした。ＡＬｕｃ３０ｗｔの配列を図４に示す。ＡＬｕｃ３０ｗｔの分子量は約２１ｋＤａである。ＡＬｕｃは、Ｎ末端から順にヘリックス構造２つ、ループ構造、ヘリックス構造、ヘリックス構造・ループ構造・ヘリックス構造、小さなヘリックス構造２つ、ヘリックス構造、小さなヘリックス構造からなる。図４に示すように、ＡＬｕｃ３０ｗｔのＮ末端とＣ末端を除いた、ＡＬｕｃ３０ｗｔの５４位～１７５位のアミノ酸までを含むｍｉｎｉＡＬｕｃ３０（配列番号５１）を作製した。ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０はｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に挿入した。同じ方法で、ＡＬｕｃ３０の代わりにＡＬｕｃ１６（配列番号１５）およびＡＬｕｃ４８（配列番号４０）を用いて、ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０に相当するアミノ酸配列を有するｍｉｎｉＡＬｕｃ１６（配列番号５２）およびｍｉｎｉＡＬｕｃ４８（配列番号５３）の発現プラスミドを作製した。ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０の大きさは、１３ｋＤａであった。各変異体のＮ末端にはＨｉｓ－ｔａｇを、Ｃ末端にはＦｌａｇ－ｔａｇを付加した。
配列番号１の２０位～２２１位に相当するアミノ酸配列を有する発光酵素のひとつであり、ＡＬｕｃ３０（配列番号２８）からシグナル配列を除いた２０位～２１２位のアミノ酸配列を有する発光酵素をＡＬｕｃ３０ｗｔとした。ＡＬｕｃ３０ｗｔの配列を図４に示す。ＡＬｕｃ３０ｗｔの分子量は約２１ｋＤａである。ＡＬｕｃは、Ｎ末端から順にヘリックス構造２つ、ループ構造、ヘリックス構造、ヘリックス構造・ループ構造・ヘリックス構造、小さなヘリックス構造２つ、ヘリックス構造、小さなヘリックス構造からなる。図４に示すように、ＡＬｕｃ３０ｗｔのＮ末端とＣ末端を除いた、ＡＬｕｃ３０ｗｔの５４位～１７５位のアミノ酸までを含むｍｉｎｉＡＬｕｃ３０（配列番号５１）を作製した。ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０はｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に挿入した。同じ方法で、ＡＬｕｃ３０の代わりにＡＬｕｃ１６（配列番号１５）およびＡＬｕｃ４８（配列番号４０）を用いて、ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０に相当するアミノ酸配列を有するｍｉｎｉＡＬｕｃ１６（配列番号５２）およびｍｉｎｉＡＬｕｃ４８（配列番号５３）の発現プラスミドを作製した。ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０の大きさは、１３ｋＤａであった。各変異体のＮ末端にはＨｉｓ－ｔａｇを、Ｃ末端にはＦｌａｇ－ｔａｇを付加した。
【0098】
ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０とｍｉｎｉＡＬｕｃ１６とのアミノ酸配列同一性は９６％（図５）、ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０とｍｉｎｉＡＬｕｃ４８とのアミノ酸配列同一性は８５％（図６）、ｍｉｎｉＡＬｕｃ４８とｍｉｎｉＡＬｕｃ１６とのアミノ酸配列同一性は９０％（図７）であった。
【0099】
実験２：ｍｉｎｉＡＬｕｃの発光値の測定
（１）アフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ－７を２４ウェルディッシュに播種し、次の日にサブコンフルエントとした。
（２）Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）２５μＬとプラスミド４００ｎｇ（２μＬ）とＰ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μＬとを混合した。
（３）Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ２５μＬとｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μＬとを混合した。
（４）（２）と（３）とを混合し、室温で５分間インキュベーションした。
（５）混合物を（１）の培地に加えた。
（６）５００μＬのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍを添加して、１日間３７℃で細胞を培養した後、培地を回収した。培地には分泌発現された発光酵素が含まれる。
（７）培地１００μＬに基質であるセレンテラジンを終濃度５μＭとなるように添加し、Ｅｎｓｐｉｒｅ ｍｕｌｔｉ－ｍｏｄｅ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、発光値を測定した。
（１）アフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ－７を２４ウェルディッシュに播種し、次の日にサブコンフルエントとした。
（２）Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）２５μＬとプラスミド４００ｎｇ（２μＬ）とＰ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μＬとを混合した。
（３）Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ２５μＬとｌｉｐｏｆｅｃｔｏａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１μＬとを混合した。
（４）（２）と（３）とを混合し、室温で５分間インキュベーションした。
（５）混合物を（１）の培地に加えた。
（６）５００μＬのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍを添加して、１日間３７℃で細胞を培養した後、培地を回収した。培地には分泌発現された発光酵素が含まれる。
（７）培地１００μＬに基質であるセレンテラジンを終濃度５μＭとなるように添加し、Ｅｎｓｐｉｒｅ ｍｕｌｔｉ－ｍｏｄｅ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ （ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、発光値を測定した。
【0100】
ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０は、ＡＬｕｃ３０ｗｔと同等以上の発光値を示した（図８）。ｍｉｎｉＡＬｕｃ１６およびｍｉｎｉＡＬｕｃ４８についても、十分に高い発光値が測定された。
【0101】
実験３：Δｌｏｏｐプラスミドの作製
ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０の予想される立体構造を図９に示す。ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０は、複数のループ構造を有していた。このうち３つのループ（ループ１、ループ２およびループ３）を構成するアミノ酸配列を欠損させた変異体を作製した。ＡＬｕｃ３０ｗｔからループ１（ＡＬｕｃ３０ｗｔの９６位～１００位）、ループ２（ＡＬｕｃ３０ｗｔの１２２位～１２８位）またはループ３（ＡＬｕｃ３０ｗｔの１５６位～１６１位）のアミノ酸配列を削除し、Ｇｌｙ－Ｓｅｒを挿入した。さらに、ＡＬｕｃ３０ｗｔのＮ末端（１位～４９位）を除いた。これにより、Ｎ末端とループが欠損したＡＬｕｃ３０Δｌｏｏｐ１Ｎ１、ＡＬｕｃ３０Δｌｏｏｐ２Ｎ１（配列番号５４）およびＡＬｕｃ３０Δｌｏｏｐ３Ｎ１の発現プラスミドを作製した。ＡＬｕｃ３０Δｌｏｏｐ２Ｎ１の大きさは、１４ｋＤａであった。
ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０の予想される立体構造を図９に示す。ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０は、複数のループ構造を有していた。このうち３つのループ（ループ１、ループ２およびループ３）を構成するアミノ酸配列を欠損させた変異体を作製した。ＡＬｕｃ３０ｗｔからループ１（ＡＬｕｃ３０ｗｔの９６位～１００位）、ループ２（ＡＬｕｃ３０ｗｔの１２２位～１２８位）またはループ３（ＡＬｕｃ３０ｗｔの１５６位～１６１位）のアミノ酸配列を削除し、Ｇｌｙ－Ｓｅｒを挿入した。さらに、ＡＬｕｃ３０ｗｔのＮ末端（１位～４９位）を除いた。これにより、Ｎ末端とループが欠損したＡＬｕｃ３０Δｌｏｏｐ１Ｎ１、ＡＬｕｃ３０Δｌｏｏｐ２Ｎ１（配列番号５４）およびＡＬｕｃ３０Δｌｏｏｐ３Ｎ１の発現プラスミドを作製した。ＡＬｕｃ３０Δｌｏｏｐ２Ｎ１の大きさは、１４ｋＤａであった。
【0102】
実験４：ＡＬｕｃΔｌｏｏｐの発光値の測定
実験２と同じ方法により、発光値を測定した。ＡＬｕｃ３０Δｌｏｏｐ２Ｎ１は、Ｎ末端を除いただけのＡＬｕｃ３０ΔＮ１と比較して、半分程度の発光値を維持していた（図１０）。ＡＬｕｃ３０Δｌｏｏｐ１Ｎ１およびＡＬｕｃ３０Δｌｏｏｐ３Ｎ１の発光値は著しく低かった。
実験２と同じ方法により、発光値を測定した。ＡＬｕｃ３０Δｌｏｏｐ２Ｎ１は、Ｎ末端を除いただけのＡＬｕｃ３０ΔＮ１と比較して、半分程度の発光値を維持していた（図１０）。ＡＬｕｃ３０Δｌｏｏｐ１Ｎ１およびＡＬｕｃ３０Δｌｏｏｐ３Ｎ１の発光値は著しく低かった。
【0103】
実験５：公知の発光酵素との比較
公知のＮａｎｏＬｕｃ、ＴｕｒｂｏＬｕｃおよびＧＬｕｃと、実験１で作製したｍｉｎｉＡＬｕｃとを比較した。ＮａｎｏＬｕｃは、サイズが約１９ｋＤａと小さく、発光値が非常に高く、熱安定性も高いことが知られている。ＴｕｒｂｏＬｕｃは、サイズが約１６ｋＤａと小さく、発光値も比較的高く、熱安定性が高いことが知られている。ＧＬｕｃは、サイズが２０ｋＤａと小さく、細胞から分泌発現させた場合、発光値はＡＬｕｃと比較して低く、熱安定性が高いことが知られている。ＮａｎｏＬｕｃ、ＴｕｒｂｏＬｕｃおよびＧＬｕｃはそれぞれ、配列番号７３、配列番号７４および配列番号７５に記載の配列がｐｃＤＮＡ３．１ベクターに挿入されたプラスミドを用いた。
公知のＮａｎｏＬｕｃ、ＴｕｒｂｏＬｕｃおよびＧＬｕｃと、実験１で作製したｍｉｎｉＡＬｕｃとを比較した。ＮａｎｏＬｕｃは、サイズが約１９ｋＤａと小さく、発光値が非常に高く、熱安定性も高いことが知られている。ＴｕｒｂｏＬｕｃは、サイズが約１６ｋＤａと小さく、発光値も比較的高く、熱安定性が高いことが知られている。ＧＬｕｃは、サイズが２０ｋＤａと小さく、細胞から分泌発現させた場合、発光値はＡＬｕｃと比較して低く、熱安定性が高いことが知られている。ＮａｎｏＬｕｃ、ＴｕｒｂｏＬｕｃおよびＧＬｕｃはそれぞれ、配列番号７３、配列番号７４および配列番号７５に記載の配列がｐｃＤＮＡ３．１ベクターに挿入されたプラスミドを用いた。
【0104】
セレンテラジンを終濃度０．５μＭとした以外は、実験２と同じ方法によって発光値を測定した。発光値はＮａｎｏＬｕｃ＞＞ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０＞ＴｕｒｂｏＬｕｃ＞ＡＬｕｃ３０ｗｔ＞ＧＬｕｃの順に高かった（図１１）。セレンテラジンを終濃度５μＭとして、実験２と同じ方法によって発光値を測定した。発光値は、ＡＬｕｃ３０ｗｔ＝ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０＞ＮａｎｏＬｕｃ＞ＴｕｒｂｏＬｕｃ＞ＧＬｕｃの順に高かった（図１２）。
【0105】
基質としてセレンテラジンｈ終濃度５μＭを使用した以外は、実験２と同じ方法によって発光値を測定した。発光値はＴｕｒｂｏＬｕｃ＝ＡＬｕｃ３０ｗｔ＞＞ＮａｎｏＬｕｃ＞ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０＞ＧＬｕｃの順に高かった（図１３）。基質としてセレンテラジンｈ終濃度２５μＭを使用した以外は、実験２と同じ方法によって発光値を測定した。発光値はｍｉｎｉＡＬｕｃ３０＞＞ＮａｎｏＬｕｃ＝ＴｕｒｂｏＬｕｃ＝ＡＬｕｃ３０ｗｔ＞＞ＧＬｕｃの順に高かった（図１４）。
【0106】
基質としてＰｒｏｍｅｇａ社からＮａｎｏＬｕｃ用基質として販売されているフリマジンをメーカー推奨濃度で使用した以外は、実験２と同じ方法によって発光値を測定した。ＧＬｕｃ、ＡＬｕｃ３０ｗｔおよびｍｉｎｉＡＬｕｃ３０は発光が検出されたが、ＮａｎｏＬｕｃおよびＴｕｒｂｏＬｕｃと比較して低かった（図１５および図１６）。ＮａｎｏＬｕｃおよびＴｕｒｂｏＬｕｃは高い発光値を示し、ＮａｎｏＬｕｃの発光値はセレンテラジンまたはセレンテラジンｈ使用時と同程度であった（図１６）。
【0107】
以上の結果から、ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０の基質として、フリマジンよりセレンテラジンおよびセレンテラジンｈが適すること、および分泌発現されたｍｉｎｉＡＬｕｃ３０は、高濃度のセレンテラジンまたはセレンテラジンｈを基質として反応させたとき、ＮａｎｏＬｕｃおよびＴｕｒｂｏＬｕｃ以上の発光値を示すことが明らかになった。
【0108】
実験６：タンパク質の末端の安定性
実験２と同じ方法で、ＣＯＳ－７細胞にプラスミドをトランスフェクションし、培養上清を回収した。分泌発現させた各発光酵素のＮ末端に付加してあるＦｌａｇ－ｔａｇおよびＣ末端に付加してあるＨｉｓ－ｔａｇをウエスタンブロット（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ミニプロティアンＴＧＸゲル ＳｔａｉｎＦｒｅｅ ４－１５％ （Ｂｉｏ－Ｒａｄ））で検出した（図１７）。抗体はそれぞれＡｎｔｉ ６×Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （９Ｃ１１），Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（富士フイルム和光純薬製、１：１０００）およびＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＡＮＴＩ－ＦＬＡＧ（Ｒ） Ｍ２－Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ （ＨＲＰ） ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍｏｕｓｅ，ｃｌｏｎｅ Ｍ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、１／１０００）を用いて、検出にはＡｍｅｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ ６８０ （Ｃｙｔｉｖａ）を使用した。ＧＬｕｃのＦｌａｇ－ｔａｇおよびＨｉｓ－ｔａｇは検出限界以下であった。ＧＬｕｃおよびＴｕｒｂｏＬｕｃについて、Ｆｌａｇ－ｔａｇとＨｉｓ－ｔａｇのシグナル強度を比較すると、ＴｕｒｂｏＬｕｃのＦｌａｇ－ｔａｇは検出値が低く、Ｎ末端が削れていることが示された。一方、ＡＬｕｃ３０ｗｔおよびｍｉｎｉＡＬｕｃ３０の両末端は削れておらず、ＧＬｕｃやＴｕｒｂｏＬｕｃに比べて安定性が高いことが示された。
実験２と同じ方法で、ＣＯＳ－７細胞にプラスミドをトランスフェクションし、培養上清を回収した。分泌発現させた各発光酵素のＮ末端に付加してあるＦｌａｇ－ｔａｇおよびＣ末端に付加してあるＨｉｓ－ｔａｇをウエスタンブロット（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ミニプロティアンＴＧＸゲル ＳｔａｉｎＦｒｅｅ ４－１５％ （Ｂｉｏ－Ｒａｄ））で検出した（図１７）。抗体はそれぞれＡｎｔｉ ６×Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （９Ｃ１１），Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（富士フイルム和光純薬製、１：１０００）およびＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＡＮＴＩ－ＦＬＡＧ（Ｒ） Ｍ２－Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ （ＨＲＰ） ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍｏｕｓｅ，ｃｌｏｎｅ Ｍ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、１／１０００）を用いて、検出にはＡｍｅｓｈａｍ Ｉｍａｇｅｒ ６８０ （Ｃｙｔｉｖａ）を使用した。ＧＬｕｃのＦｌａｇ－ｔａｇおよびＨｉｓ－ｔａｇは検出限界以下であった。ＧＬｕｃおよびＴｕｒｂｏＬｕｃについて、Ｆｌａｇ－ｔａｇとＨｉｓ－ｔａｇのシグナル強度を比較すると、ＴｕｒｂｏＬｕｃのＦｌａｇ－ｔａｇは検出値が低く、Ｎ末端が削れていることが示された。一方、ＡＬｕｃ３０ｗｔおよびｍｉｎｉＡＬｕｃ３０の両末端は削れておらず、ＧＬｕｃやＴｕｒｂｏＬｕｃに比べて安定性が高いことが示された。
【0109】
実験７：比活性の測定
実験６のウエスタンブロットのシグナル強度から各酵素濃度を合わせ、ＮａｎｏＬｕｃ、ＡＬｕｃ３０ｗｔおよびｍｉｎｉＡＬｕｃ３０の比活性を測定した。セレンテラジンまたはセレンテラジンｈをそれぞれ基質として反応させたとき、ＡＬｕｃの比活性とｍｉｎｉＡＬｕｃの比活性は同程度であることが示された（図１８および図１９）。ＡＬｕｃ３０ｗｔおよびｍｉｎｉＡＬｕｃ３０の最大発光値はＮａｎｏＬｕｃと同程度であり、高い発光活性を有していることが示された。
実験６のウエスタンブロットのシグナル強度から各酵素濃度を合わせ、ＮａｎｏＬｕｃ、ＡＬｕｃ３０ｗｔおよびｍｉｎｉＡＬｕｃ３０の比活性を測定した。セレンテラジンまたはセレンテラジンｈをそれぞれ基質として反応させたとき、ＡＬｕｃの比活性とｍｉｎｉＡＬｕｃの比活性は同程度であることが示された（図１８および図１９）。ＡＬｕｃ３０ｗｔおよびｍｉｎｉＡＬｕｃ３０の最大発光値はＮａｎｏＬｕｃと同程度であり、高い発光活性を有していることが示された。
【0110】
実験８：発光スペクトルの測定
ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０の波長ピークは、セレンテラジンと反応させたときは４８２ｎｍであり（図２０）、セレンテラジンｈと反応させたときは４８８ｍであり（図２１）であった。ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０の波長ピークは、ＡＬｕｃ３０ｗｔとほぼ同じであった。発光スペクトルは、長波長側の裾野が短波長側の裾野よりも広い特徴を有していた。
ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０の波長ピークは、セレンテラジンと反応させたときは４８２ｎｍであり（図２０）、セレンテラジンｈと反応させたときは４８８ｍであり（図２１）であった。ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０の波長ピークは、ＡＬｕｃ３０ｗｔとほぼ同じであった。発光スペクトルは、長波長側の裾野が短波長側の裾野よりも広い特徴を有していた。
【0111】
実験９：熱安定性の検証
実験２と同じ方法で、ＣＯＳ－７細胞にプラスミドをトランスフェクションし、培地を回収した。ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０を含む培養上清を室温（２５℃）、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃または９０℃で１０分間インキュベーション後、発光値を測定した。その結果、５０℃１０分間または６０℃１０分間インキュベーションで８０％以上、７０℃１０分間インキュベーションで５０％以上の活性が残存しており（図２２）、十分に実用性を有することが確認された。
実験２と同じ方法で、ＣＯＳ－７細胞にプラスミドをトランスフェクションし、培地を回収した。ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０を含む培養上清を室温（２５℃）、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃または９０℃で１０分間インキュベーション後、発光値を測定した。その結果、５０℃１０分間または６０℃１０分間インキュベーションで８０％以上、７０℃１０分間インキュベーションで５０％以上の活性が残存しており（図２２）、十分に実用性を有することが確認された。
【0112】
実験１０：大腸菌での発光酵素の発現
（１）ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０をコードしたＤＮＡ配列をｐＥＴ３２ベクターに挿入したプラスミドを作製した。大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ Ｔ７ ｅｘｐｒｅｓｓ ｌｙｓＹ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社）に形質転換した。
（２）ＬＢプレート（１００μｇ／μＬアンピシリンを含む。）に（１）の大腸菌を播種した。
（３）次の日、１コロニーをピックアップし、２ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／μＬアンピシリンを含む。）を入れた試験管内において、３０℃で一晩振盪培養した。
（４）１００ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／μＬアンピシリンを含む。）に（３）を１ｍＬ加えて、５００ｍＬのフラスコを用いて吸光度ＯＤ６００が約０．４になるまで、３０℃で振盪培養した。
（５）吸光度ＯＤ６００が約０．４に達したとき、１Ｍイソプロピル－β－チオガラクトピラノシドを４０μＬ添加し、１６℃で一晩培養した。
（６）菌体を回収し、ＨｉｓＴＡＬＯＮ Ｂｕｆｆｅｒ ＳｅｔおよびＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（ともにタカラバイオ株式会社）を用いて、タンパク質を精製した。１００ｍＬの培地からは１．７ｍｇのｍｉｎｉＡＬｕｃ３０が得られた。
（１）ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０をコードしたＤＮＡ配列をｐＥＴ３２ベクターに挿入したプラスミドを作製した。大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ Ｔ７ ｅｘｐｒｅｓｓ ｌｙｓＹ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社）に形質転換した。
（２）ＬＢプレート（１００μｇ／μＬアンピシリンを含む。）に（１）の大腸菌を播種した。
（３）次の日、１コロニーをピックアップし、２ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／μＬアンピシリンを含む。）を入れた試験管内において、３０℃で一晩振盪培養した。
（４）１００ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／μＬアンピシリンを含む。）に（３）を１ｍＬ加えて、５００ｍＬのフラスコを用いて吸光度ＯＤ６００が約０．４になるまで、３０℃で振盪培養した。
（５）吸光度ＯＤ６００が約０．４に達したとき、１Ｍイソプロピル－β－チオガラクトピラノシドを４０μＬ添加し、１６℃で一晩培養した。
（６）菌体を回収し、ＨｉｓＴＡＬＯＮ Ｂｕｆｆｅｒ ＳｅｔおよびＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（ともにタカラバイオ株式会社）を用いて、タンパク質を精製した。１００ｍＬの培地からは１．７ｍｇのｍｉｎｉＡＬｕｃ３０が得られた。
【0113】
ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔで濃度を合わせて比活性を測定した結果、ＣＯＳ－７細胞から分泌発現させたｍｉｎｉＡＬｕｃ３０との比活性と、大腸菌で作製したｍｉｎｉＡＬｕｃ３０の比活性は、ほぼ同じであった（図２３）。ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０は、哺乳動物細胞からの分泌発現だけでなく、大腸菌においても発現可能であり、さらに大量に製造が可能であることがわかった。
【0114】
大腸菌から精製したｍｉｎｉＡＬｕｃ３０を、室温（２５℃）、６０℃、７０℃、８０℃または９０℃で１０分間インキュベーション後、発光値を測定した（図２４）。大腸菌で発現したｍｉｎｉＡＬｕｃ３０は、６０℃で１０分間インキュベーションしてもほとんど活性を失わず、７０℃１０分間インキュベーションで９０％以上、８０℃１０分間インキュベーションで８０％以上の活性が残存しており、熱安定性に優れていることがわかった。
【0115】
実験１１－１：分割した酵素の発光活性
ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０を分割し、配列番号５１に記載のアミノ酸配列の４位～２２位、２３位～１２０位、４位～４７位、４８位～１２０位、４位～７７位、８０位～１２０位、４位～９０位、９１位～１２０位のポリペプチドを発現するプラスミド（ｐＥＴ３２ベクター）を作製した。実験１０と同じ方法で、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｌｙｓＹにプラスミドを導入し、培養した菌体からライセートを得た。単独のライセート１００μＬまたは図２５に示すようにライセートを組み合わせた混合物に基質であるセレンテラジンを終濃度５μＭとなるように添加し、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標） ２００ ＰＲＯ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ＴＥＣＡＮ）を用いて、発光値を測定した。ライセート内には、発光酵素の断片が高濃度で存在することから、各断片を含むライセートを混合した場合、二種の断片が出会う確率が高く、二種の断片から元の発光酵素の構造が再構成されると考えられる。
ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０を分割し、配列番号５１に記載のアミノ酸配列の４位～２２位、２３位～１２０位、４位～４７位、４８位～１２０位、４位～７７位、８０位～１２０位、４位～９０位、９１位～１２０位のポリペプチドを発現するプラスミド（ｐＥＴ３２ベクター）を作製した。実験１０と同じ方法で、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｌｙｓＹにプラスミドを導入し、培養した菌体からライセートを得た。単独のライセート１００μＬまたは図２５に示すようにライセートを組み合わせた混合物に基質であるセレンテラジンを終濃度５μＭとなるように添加し、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標） ２００ ＰＲＯ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ＴＥＣＡＮ）を用いて、発光値を測定した。ライセート内には、発光酵素の断片が高濃度で存在することから、各断片を含むライセートを混合した場合、二種の断片が出会う確率が高く、二種の断片から元の発光酵素の構造が再構成されると考えられる。
【0116】
図２５に示すように、発光酵素の断片ポリペプチドを含むライセートは単独では発光値が低かったが、複数のライセートの混合物は、単独のライセートに比べて高い発光値を示した。配列番号５１に記載のアミノ酸配列の４位～２２位のアミノ酸配列からなるポリペプチドと２３位～１２０位のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組み合わせ（組み合わせ１）、および４位～７７位のアミノ酸配列からなるポリペプチドと７８位～１２２位のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組み合わせ（組み合わせ２）は、アミノ酸配列の重複がなく、合わせるとｍｉｎｉＡＬｕｃ３０からＮ末端の３アミノ酸残基およびＣ末端の２アミノ酸残基を除いたものと同じ配列を有する。配列番号５１に記載のアミノ酸配列の４位～７７位のアミノ酸配列からなるポリペプチドと２３位～１２０位のアミノ酸配列からなるポリペプチドの組み合わせ（組み合わせ３）は、アミノ酸配列が一部重複しているが、高い発光値を示した。発光酵素の一部の配列を含み、発光酵素活性を有さないポリペプチド（第１ポリペプチド）は、発光酵素の一部の配列を含み、発光酵素活性を有さない他のポリペプチド（第２ポリペプチド）の存在下で発光酵素活性を生じることが示された。
【0117】
実験１１－２：分割した酵素の発光活性
ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０を分割し、配列番号５１に記載のアミノ酸配列の４位～５８位、４位～６４位、４位～７２位、６５位～１２０位、７３位～１２０位、１０４位～１２０位のポリペプチドを発現するプラスミド（ｐＥＴ３２ベクター）をさらに作製した。実験１１－２は、Ｅｎｓｐｉｒｅ ｍｕｌｔｉ－ｍｏｄｅ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて発光値を検出した以外は、実験１１－１と同じ方法で発光値の測定を行った。
ｍｉｎｉＡＬｕｃ３０を分割し、配列番号５１に記載のアミノ酸配列の４位～５８位、４位～６４位、４位～７２位、６５位～１２０位、７３位～１２０位、１０４位～１２０位のポリペプチドを発現するプラスミド（ｐＥＴ３２ベクター）をさらに作製した。実験１１－２は、Ｅｎｓｐｉｒｅ ｍｕｌｔｉ－ｍｏｄｅ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて発光値を検出した以外は、実験１１－１と同じ方法で発光値の測定を行った。
【0118】
配列番号５１に記載のアミノ酸配列の４位～５８位のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、２３位～１２０位のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組み合わせは、高い発光値を示した（図２６）。配列番号５１に記載のアミノ酸配列の４位～６４位のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、６５位～１２０位または７３位～１２０位のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組み合わせは、高い発光値を示した（図２７）。配列番号５１に記載のアミノ酸配列の４位～７２位のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、７３位～１２０位、２３位～１２０位または１０４位～１２０位のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの組み合わせは、高い発光値を示した（図２８）。
【0119】
実験１２：分割した発光酵素を用いた分子間相互作用検出
ラパマイシン（Ｒａｐ）依存的に結合することが知られているＦＫＢＰ（ＦＫ５０６－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）およびＦＲＢ（ＦＫＢＰ１２－ｒａｐａｍｙｃｉｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）を用いて、分割された発光酵素によって分子間の相互作用を検出できるかを検証した。ポリペプチドの組み合わせは、上記組み合わせ１および３について検証した。まず、配列番号５１に記載のアミノ酸配列の４位～７７位のアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端にＦＫＢＰが接続された融合タンパク質（ＦＫＢＰ－４－７７ａａ、４－７７ａａ－ＦＫＢＰ）、およびＮ末端にＦＲＢが接続された融合タンパク質（ＦＲＢ－４－７７ａａ）；配列番号５１に記載のアミノ酸配列の４位～２２位のアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端にＦＲＢが接続された融合タンパク質（ＦＲＢ－４－２２ａａ、４－２２ａａ－ＦＲＢ）；配列番号５１に記載のアミノ酸配列の２３位～１２０位のアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端にＦＫＢＰが接続された融合タンパク質（ＦＫＢＰ－２３－１２０ａａ、２３－１２０ａａ－ＦＫＢＰ）、Ｎ末端またはＣ末端にＦＲＢが接続された融合タンパク質（ＦＲＢ－２３－１２０ａａ、２３－１２０ａａ－ＦＲＢ）を作製した。各ポリペプチドとＦＫＢＰまたはＦＲＢとはリンカー配列（配列番号８７）によって接続した。ＦＫＢＰおよびＦＲＢの配列を配列番号８８および配列番号８９にそれぞれ示す。
ラパマイシン（Ｒａｐ）依存的に結合することが知られているＦＫＢＰ（ＦＫ５０６－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）およびＦＲＢ（ＦＫＢＰ１２－ｒａｐａｍｙｃｉｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）を用いて、分割された発光酵素によって分子間の相互作用を検出できるかを検証した。ポリペプチドの組み合わせは、上記組み合わせ１および３について検証した。まず、配列番号５１に記載のアミノ酸配列の４位～７７位のアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端にＦＫＢＰが接続された融合タンパク質（ＦＫＢＰ－４－７７ａａ、４－７７ａａ－ＦＫＢＰ）、およびＮ末端にＦＲＢが接続された融合タンパク質（ＦＲＢ－４－７７ａａ）；配列番号５１に記載のアミノ酸配列の４位～２２位のアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端にＦＲＢが接続された融合タンパク質（ＦＲＢ－４－２２ａａ、４－２２ａａ－ＦＲＢ）；配列番号５１に記載のアミノ酸配列の２３位～１２０位のアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端にＦＫＢＰが接続された融合タンパク質（ＦＫＢＰ－２３－１２０ａａ、２３－１２０ａａ－ＦＫＢＰ）、Ｎ末端またはＣ末端にＦＲＢが接続された融合タンパク質（ＦＲＢ－２３－１２０ａａ、２３－１２０ａａ－ＦＲＢ）を作製した。各ポリペプチドとＦＫＢＰまたはＦＲＢとはリンカー配列（配列番号８７）によって接続した。ＦＫＢＰおよびＦＲＢの配列を配列番号８８および配列番号８９にそれぞれ示す。
【0120】
上記融合タンパク質をコードするプラスミド（ｐＥＴ３２ベクター）を大腸菌に導入し、融合タンパク質を発現させた。大腸菌を回収し、ＨｉｓＴＡＬＯＮ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）およびＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）によってタンパク質を精製した。発光値を測定した。ラパマイシンは、濃度５０ｎＭで精製した融合タンパク質に添加した。エタノールは陰性対照である。その他の実験方法は実験１１－２と同じである。
【0121】
図２９～３６に示すように、ラパマイシンの存在下で融合タンパク質の組み合わせは高い発光値を示した。発光酵素の一部の配列を含み、発光酵素活性を有さないポリペプチド（第１ポリペプチド）は、第２ポリペプチドを利用して、二つの分子の相互作用検出または相互作用を誘導する分子の有無の検出に好適に使用できることが示された。また、ポリペプチドが標的タンパク質のＮ末端およびＣ末端のいずれへの付加でも、相互作用が検出されることが示された。
【0122】
実験１３：分割した発光酵素を用いた分子間相互作用検出
ＦＫＢＰ、ＦＲＢおよび分割されたポリペプチドをリンカー配列によって接続した融合タンパク質を作製した。この融合タンパク質は、配列番号５１に記載のアミノ酸配列の２３位～１２０位のアミノ酸配列のＮ末端にリンカー配列（配列番号８７）によってＦＲＢが接続され、配列番号５１に記載のアミノ酸配列の４位～２２位のアミノ酸配列のＣ末端にリンカー配列（配列番号８７）によってＦＫＢＰが接続され、配列番号５１に記載のアミノ酸配列の１２０位のアミノ酸残基と４位のアミノ酸残基がリンカー配列（配列番号８６）によって接続された円順列変異体である。
ＦＫＢＰ、ＦＲＢおよび分割されたポリペプチドをリンカー配列によって接続した融合タンパク質を作製した。この融合タンパク質は、配列番号５１に記載のアミノ酸配列の２３位～１２０位のアミノ酸配列のＮ末端にリンカー配列（配列番号８７）によってＦＲＢが接続され、配列番号５１に記載のアミノ酸配列の４位～２２位のアミノ酸配列のＣ末端にリンカー配列（配列番号８７）によってＦＫＢＰが接続され、配列番号５１に記載のアミノ酸配列の１２０位のアミノ酸残基と４位のアミノ酸残基がリンカー配列（配列番号８６）によって接続された円順列変異体である。
【0123】
融合タンパク質を大腸菌に発現させ、精製後、実験１２と同じ方法で発光値を測定した。添加したラパマイシンの濃度は０ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭであった。
【0124】
図３４に示すように、ラパマイシン濃度依存的に発光値の上昇が検出された。第１ポリペプチドと、第２ポリペプチドと、標的分子とが接続された融合タンパク質が、標的分子の相互作用または相互作用を誘導する分子の検出に好適に使用できることがわかった。
【0125】
［態様］
上述した複数の例示的な実施形態および実施例は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
上述した複数の例示的な実施形態および実施例は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
【0126】
（第１項）
（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含む第１ポリペプチドと、
（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含み、前記第１ポリペプチドとは異なる配列を有し、前記第１ポリペプチドとの接触により発光酵素活性を生じる第２ポリペプチドとを含む、試薬キット；
（Ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸配列が欠損したアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸配列が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列、
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に示されたアミノ酸配列において、７０位～７４位のアミノ酸残基の少なくとも１個がさらに欠損したアミノ酸配列。
（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含む第１ポリペプチドと、
（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含み、前記第１ポリペプチドとは異なる配列を有し、前記第１ポリペプチドとの接触により発光酵素活性を生じる第２ポリペプチドとを含む、試薬キット；
（Ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸配列が欠損したアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸配列が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列、
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に示されたアミノ酸配列において、７０位～７４位のアミノ酸残基の少なくとも１個がさらに欠損したアミノ酸配列。
【0127】
第１項に記載の試薬キットは、分子間相互作用を検出するためのプローブとして用いることができる。第１項に記載の試薬キットに含まれるポリペプチドは、サイズが小さいため、相互作用の対象分子の発現および機能を阻害しにくい。
【0128】
（第２項）
第１項に記載の試薬キットにおいて、前記（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列は、（ａ）～（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列である。
（ａ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列。
第１項に記載の試薬キットにおいて、前記（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列は、（ａ）～（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列である。
（ａ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（ｃ）配列番号５１～５６のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列。
【0129】
第２項に記載の試薬キットによれば、高い発光活性を生じるプローブを得ることができる。
【0130】
（第３項）
第１項または第２項に記載の試薬キットにおいて、前記第１ポリペプチドおよび前記第２ポリペプチドの少なくとも１つは、配列番号５１～５３に記載のアミノ酸配列において、配列番号５１に記載のアミノ酸配列の４位～２０位、４位～２１位、４位～２２位、４位～２３位、４位～２４位、４位～３３位、４位～３４位、４位～３５位、４位～３６位、４位～３７位、４位～４５位、４位～４６位、４位～４７位、４位～４８位、４位～４９位、４位～５６位、４位～５７位、４位～５８位、４位～５９位、４位～６０位、４位～６２位、４位～６３位、４位～６４位、４位～６５位、４位～６６位、４位～６７位、４位～７０位、４位～７１位、４位～７２位、４位～７３位、４位～７４位、４位～７５位、４位～７６位、４位～７７位、４位～７８位、４位～７９位、４位～８８位、４位～８９位、４位～９０位、４位～９１位、４位～９２位、４位～１０１位、４位～１０２位、４位～１０３位、４位～１０４位、４位～１０５位、２１位～１２０位、２２位～１２０位、２３位～１２０位、２４位～１２０位、２５位～１２０位、３４位～１２０位、３５位～１２０位、３６位～１２０位、３７位～１２０位、３８位～１２０位、４６位～１２０位、４７位～１２０位、４８位～１２０位、４９位～１２０位、５０位～１２０位、５７位～１２０位、５８位～１２０位、５９位～１２０位、６０位～１２０位、６１位～１２０位、６３位～１２０位、６４位～１２０位、６５位～１２０位、６６位～１２０位、６７位～１２０位、６８位～１２０位、６９位～１２０位、７０位～１２０位、７１位～１２０位、７２位～１２０位、７３位～１２０位、７４位～１２０位、７５位～１２０位、７６位～１２０位、７７位～１２０位、７８位～１２０位、７９位～１２０位、８０位～１２０位、８９位～１２０位、９０位～１２０位、９１位～１２０位、９２位～１２０位、９３位～１２０位、１０２位～１２０位、１０３位～１２０位、１０４位～１２０位、１０５位～１２０位および１０６位～１２０位から選択されるいずれかに相当するアミノ酸配列を有する。
第１項または第２項に記載の試薬キットにおいて、前記第１ポリペプチドおよび前記第２ポリペプチドの少なくとも１つは、配列番号５１～５３に記載のアミノ酸配列において、配列番号５１に記載のアミノ酸配列の４位～２０位、４位～２１位、４位～２２位、４位～２３位、４位～２４位、４位～３３位、４位～３４位、４位～３５位、４位～３６位、４位～３７位、４位～４５位、４位～４６位、４位～４７位、４位～４８位、４位～４９位、４位～５６位、４位～５７位、４位～５８位、４位～５９位、４位～６０位、４位～６２位、４位～６３位、４位～６４位、４位～６５位、４位～６６位、４位～６７位、４位～７０位、４位～７１位、４位～７２位、４位～７３位、４位～７４位、４位～７５位、４位～７６位、４位～７７位、４位～７８位、４位～７９位、４位～８８位、４位～８９位、４位～９０位、４位～９１位、４位～９２位、４位～１０１位、４位～１０２位、４位～１０３位、４位～１０４位、４位～１０５位、２１位～１２０位、２２位～１２０位、２３位～１２０位、２４位～１２０位、２５位～１２０位、３４位～１２０位、３５位～１２０位、３６位～１２０位、３７位～１２０位、３８位～１２０位、４６位～１２０位、４７位～１２０位、４８位～１２０位、４９位～１２０位、５０位～１２０位、５７位～１２０位、５８位～１２０位、５９位～１２０位、６０位～１２０位、６１位～１２０位、６３位～１２０位、６４位～１２０位、６５位～１２０位、６６位～１２０位、６７位～１２０位、６８位～１２０位、６９位～１２０位、７０位～１２０位、７１位～１２０位、７２位～１２０位、７３位～１２０位、７４位～１２０位、７５位～１２０位、７６位～１２０位、７７位～１２０位、７８位～１２０位、７９位～１２０位、８０位～１２０位、８９位～１２０位、９０位～１２０位、９１位～１２０位、９２位～１２０位、９３位～１２０位、１０２位～１２０位、１０３位～１２０位、１０４位～１２０位、１０５位～１２０位および１０６位～１２０位から選択されるいずれかに相当するアミノ酸配列を有する。
【0131】
第３項に記載の試薬キットによれば、高い発光活性を生じるプローブを得ることができる。
【0132】
（第４項）
第１項～第３項のいずれかに記載の試薬キットにおいて、前記第１ポリペプチドおよび前記第２ポリペプチドの少なくとも１つは、（１）～（３）のいずれかのアミノ酸配列を有する。
（１）配列番号７６～８５のいずれかに記載のアミノ酸配列、
（２）配列番号７６～８５のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（３）配列番号７６～８５のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列。
第１項～第３項のいずれかに記載の試薬キットにおいて、前記第１ポリペプチドおよび前記第２ポリペプチドの少なくとも１つは、（１）～（３）のいずれかのアミノ酸配列を有する。
（１）配列番号７６～８５のいずれかに記載のアミノ酸配列、
（２）配列番号７６～８５のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または
（３）配列番号７６～８５のいずれかに記載のアミノ酸配列に対して、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列。
【0133】
第４項に記載の試薬キットによれば、高い発光活性を生じるプローブを得ることができる。
【0134】
（第５項）
第１項～第４項のいずれかに記載の試薬キットにおいて、第１ポリペプチドを構成するアミノ酸配列と、第２ポリペプチドを構成するアミノ酸配列とは一部が重複する。
第１項～第４項のいずれかに記載の試薬キットにおいて、第１ポリペプチドを構成するアミノ酸配列と、第２ポリペプチドを構成するアミノ酸配列とは一部が重複する。
【0135】
第５項に記載の試薬キットによれば、高い発光活性を生じることができ、よりサイズが小さいプローブを得ることができる。
【0136】
（第６項）
第１項～第４項のいずれかに記載の試薬キットにおいて、第１ポリペプチドを構成するアミノ酸配列と、第２ポリペプチドを構成するアミノ酸配列とは重複しない。
第１項～第４項のいずれかに記載の試薬キットにおいて、第１ポリペプチドを構成するアミノ酸配列と、第２ポリペプチドを構成するアミノ酸配列とは重複しない。
【0137】
第６項に記載のポリペプチドによれば、より高い発光活性を生じることができ、サイズが小さいプローブを得ることができる。
【0138】
（第７項）
第１項～第６項のいずれかに記載の試薬キットにおいて、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとがリンカー配列によって接続されている。
第１項～第６項のいずれかに記載の試薬キットにおいて、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとがリンカー配列によって接続されている。
【0139】
第７項に記載の試薬キットによれば、発光シグナルの検出が容易である。
【0140】
（第８項）
第１項～第７項のいずれかに記載の試薬キットにおいて、第１ポリペプチドは、第１標的タンパク質に接続され、第２ポリペプチドは、第２標的タンパク質に接続される。
第１項～第７項のいずれかに記載の試薬キットにおいて、第１ポリペプチドは、第１標的タンパク質に接続され、第２ポリペプチドは、第２標的タンパク質に接続される。
【0141】
第８項に記載の試薬キットは、第１標的タンパク質と第２標的タンパク質との相互作用の検出に用いることができる。
【0142】
（第９項）
（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含む第１ポリペプチドであって、
（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含む第２ポリペプチドとの接触により発光酵素活性を生じ、
前記第２ポリペプチドとは異なる配列を有する第１ポリペプチド；
（Ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸配列が欠損したアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸配列が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列、
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に示されたアミノ酸配列において、７０位～７４位のアミノ酸残基の少なくとも１個がさらに欠損したアミノ酸配列。
（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含む第１ポリペプチドであって、
（Ａ）～（Ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の一部を含む第２ポリペプチドとの接触により発光酵素活性を生じ、
前記第２ポリペプチドとは異なる配列を有する第１ポリペプチド；
（Ａ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位および２０４位～２２１位のアミノ酸配列が欠損したアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１位～６９位のアミノ酸配列が欠損し、１４６位～１５６位のアミノ酸残基の少なくとも１個が欠損または置換されたアミノ酸配列、
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に示されたアミノ酸配列において、７０位～７４位のアミノ酸残基の少なくとも１個がさらに欠損したアミノ酸配列。
【0143】
第９項に記載のポリペプチドは、分子間相互作用を検出するためのプローブとして用いることができる。第９項に記載のポリペプチドは、サイズが小さいため、相互作用の対象分子の発現および機能を阻害しにくい。
【0144】
（第１０項）
第１項～第９項のいずれかに記載の第１ポリペプチドと、第１標的タンパク質とを含む、融合タンパク質。
第１項～第９項のいずれかに記載の第１ポリペプチドと、第１標的タンパク質とを含む、融合タンパク質。
【0145】
第１０項に記載の融合タンパク質は、第１標的タンパク質と他の分子との相互作用の検出に用いることができる。
【0146】
（第１１項）
第１項～第９項のいずれかに記載の第１ポリペプチドまたは第１０項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
第１項～第９項のいずれかに記載の第１ポリペプチドまたは第１０項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【0147】
第１１項に記載の核酸によれば、第１項～第９項に記載の第１ポリペプチドまたは第１０項に記載の融合タンパク質を製造することができる。
【0148】
（第１２項）
第１１項に記載の核酸を含むベクター。
第１１項に記載の核酸を含むベクター。
【0149】
第１２項に記載のベクターによれば、第１１項に記載の核酸を容易に増幅および維持することができる。また、第１２項に記載のベクターを用いて、第１項～第９項に記載の第１ポリペプチドまたは第１０項に記載の融合タンパク質を製造することもできる。
【0150】
（第１３項）
第１１項に記載の核酸が導入された形質転換細胞。
第１１項に記載の核酸が導入された形質転換細胞。
【0151】
第１３項に記載の形質転換細胞は、第１項～第９項に記載の第１ポリペプチドまたは第１０項に記載の融合タンパク質を発現することができる。
【0152】
（第１４項）
第１項～第８項に記載の試薬キットを用いた、タンパク質相互作用解析法。
第１項～第８項に記載の試薬キットを用いた、タンパク質相互作用解析法。
【0153】
第１４項に記載のタンパク質相互作用解析法によれば、二つのタンパク質間の相互作用を発光により検出することができる。本方法に用いられるポリペプチドは、分子量が小さいため、標的タンパク質との融合タンパク質が正常に発現しやすい。また、本方法に使用されるポリペプチドは、標的タンパク質の機能を阻害しにくい。
【符号の説明】
【0154】
１１ 第１ポリペプチド、１２ 第２ポリペプチド、２１ 第１標的タンパク質、２２ 第２標的タンパク質、３０ 小分子。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【配列表】