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特開2022-17865ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の細胞傷害性Ｔ細胞エピトープペプチド及びその利用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022017865
(43)【公開日】2022-01-26
(54)【発明の名称】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の細胞傷害性Ｔ細胞エピトープペプチド及びその利用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/50 20060101AFI20220119BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20220119BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220119BHJP
C12N 5/078 20100101ALI20220119BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20220119BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220119BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20220119BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20220119BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20220119BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20220119BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220119BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20220119BHJP
【ＦＩ】
C12N15/50
C07K7/06 ZNA
C12N15/63 Z
C12N5/078
C07K14/705
A61P37/04
A61P31/14
A61K9/127
A61K31/7088
A61K38/08
A61K48/00
A61K35/15 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020120675
(22)【出願日】2020-07-14
(71)【出願人】
【識別番号】504013775
【氏名又は名称】学校法人 埼玉医科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100107515
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100107733
【弁理士】
【氏名又は名称】流 良広
(74)【代理人】
【識別番号】100115347
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 奈緒子
(72)【発明者】
【氏名】松井 政則
(72)【発明者】
【氏名】高木 徹
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AC20
4B065BA30
4B065BB19
4B065CA44
4B065CA45
4C076AA19
4C076BB01
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB21
4C076BB24
4C076BB25
4C076BB27
4C076BB31
4C076BB40
4C076CC06
4C076CC35
4C076FF31
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA07
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA17
4C084BA23
4C084CA53
4C084MA24
4C084MA31
4C084MA52
4C084MA56
4C084MA58
4C084MA59
4C084MA63
4C084MA65
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZB091
4C084ZB092
4C084ZB331
4C084ZB332
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB09
4C086ZB33
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB64
4C087BB65
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB33
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA15
4H045CA01
4H045DA86
4H045EA22
4H045EA29
4H045FA20
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の新規な細胞傷害性Ｔ細胞エピトープペプチド、前記ペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、前記ペプチドを内包するペプチド内包リポソーム、前記ペプチドとＨＬＡ－Ａ２分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞の製造方法及び前記抗原提示細胞製造用剤、ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法及び前記細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤、並びに前記ペプチドとＨＬＡ－Ａ２分子との複合体のテトラマーを提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなり、ヒト白血球抗原－Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）分子に結合でき、かつ細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しさらに細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるペプチドである。
【選択図】なし
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなり、ヒト白血球抗原－Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）分子に結合でき、かつ細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しさらに細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるペプチドである。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２、３、４、５、９、１３、１６、２０、３５、５２、５３、５８、６３、６４、６７、７０、７１、及び７２からなる群から選択されるいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなり、
ヒト白血球抗原－Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）分子に結合でき、かつ細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しさらに細胞傷害性Ｔ細胞に認識されることを特徴とするペプチド。
ヒト白血球抗原－Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）分子に結合でき、かつ細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しさらに細胞傷害性Ｔ細胞に認識されることを特徴とするペプチド。
【請求項2】
請求項１に記載のペプチドをコードする塩基配列からなることを特徴とする核酸分子。
【請求項3】
請求項２に記載の核酸分子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項4】
請求項１に記載のペプチドを内包することを特徴とするペプチド内包リポソーム。
【請求項5】
請求項１に記載のペプチドと、ＨＬＡ－Ａ２分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を製造するための抗原提示細胞製造用剤であって、
請求項１に記載のペプチド、請求項３に記載のベクター、及び請求項４に記載のペプチド内包リポソームからなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする抗原提示細胞製造用剤。
請求項１に記載のペプチド、請求項３に記載のベクター、及び請求項４に記載のペプチド内包リポソームからなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする抗原提示細胞製造用剤。
【請求項6】
請求項１に記載のペプチドと、ＨＬＡ－Ａ２分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞の製造方法であって、
ＨＬＡ－Ａ２分子を発現する細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて請求項５に記載の抗原提示細胞製造用剤と接触させることを含むことを特徴とする抗原提示細胞の製造方法。
ＨＬＡ－Ａ２分子を発現する細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて請求項５に記載の抗原提示細胞製造用剤と接触させることを含むことを特徴とする抗原提示細胞の製造方法。
【請求項7】
前記ＨＬＡ－Ａ２分子を発現する細胞が、自己由来である請求項６に記載の抗原提示細胞の製造方法。
【請求項8】
前記ＨＬＡ－Ａ２分子を発現する細胞が、同種由来である請求項６に記載の抗原提示細胞の製造方法。
【請求項9】
請求項１に記載のペプチド、請求項２に記載の核酸分子、請求項３に記載のベクター、請求項４に記載のペプチド内包リポソーム、及び請求項６から８のいずれかに記載の製造方法で製造された抗原提示細胞からなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項10】
重症呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の感染を予防するためのワクチンである請求項９に記載の新型コロナウイルス感染症の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項11】
更に、アジュバントを含む請求項１０に記載の新型コロナウイルス感染症の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項12】
請求項１に記載のペプチド、請求項４に記載のペプチド内包リポソーム、及び請求項６から８のいずれかに記載の製造方法で製造された抗原提示細胞からなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤。
【請求項13】
更に、アジュバントを含む請求項１２に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤。
【請求項14】
ＨＬＡ－Ａ２陽性の新型コロナウイルス感染症患者より採取された末梢血単核球細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて請求項１２から１３のいずれかに記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤と接触させることを含むことを特徴とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法。
【請求項15】
請求項１に記載のペプチドとＨＬＡ－Ａ２分子との複合体の四量体であることを特徴とするテトラマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の細胞傷害性Ｔ細胞エピトープペプチド、前記ペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、前記ペプチドを内包するペプチド内包リポソーム、前記ペプチドとＨＬＡ－Ａ２分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞の製造方法及び前記抗原提示細胞製造用剤、新型コロナウイルス感染症の予防又は治療用医薬組成物、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法及び前記細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤、並びに前記ペプチドとＨＬＡ－Ａ２分子との複合体のテトラマーに関する。
【背景技術】
【0002】
新型コロナウイルス感染症（Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９；ＣＯＶＩＤ－１９）は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を起因ウイルスとする感染症である。２０１９年１１月２２日に、中華人民共和国湖北省武漢市で初めて検出された新興感染症であり、以降世界各地で感染が拡大している。
【0003】
これまでに、ＣＯＶＩＤ－１９の患者の免疫反応を調べた結果が報告されている（非特許文献１参照）。前記報告では、ウイルスに対する抗体（ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体）は日が経過するにつれて増えていること、前記抗体を産生するＢ細胞はｄ７、ｄ８、ｄ９と日が経つにつれて増え、ｄ２０で減っているとされている。また、Ｔ細胞についても調べられており、ＣＤ４陽性Ｔ細胞もＣＤ８陽性Ｔ細胞も日が経つにつれて増え、症状が改善されると減っている。前記報告によれば、インフルエンザの場合と同様に、Ｂ細胞とＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が上手く働くことで、ウイルスを駆逐したとされている。
【0004】
現在、世界中で、ＣＯＶＩＤ－１９の起因ウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンの開発が盛んに行われている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２００２年に発生したＳＡＲＳの起因ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に酷似し、ウイルス表面にはスパイク領域がある。このスパイク領域にウイルスレセプターに結合する部分があることから、このスパイク部分に対する抗体を誘導する、抗体誘導型ワクチンの開発が進められている（非特許文献２参照）。
【0005】
一方で、抗体誘導型ワクチンは、近縁のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対して十分な効果を示せなかった。また、２００２年のＳＡＲＳでは、抗体の誘導による病状悪化（抗体依存性感染増強）がみられた。さらに、ＳＡＲＳの回復者では、抗ウイルス抗体及びメモリーＢ細胞は１～２年で消失したが、メモリーＴ細胞は１１年以上経っても存在した。
【0006】
また、健常人、軽症者（Ｎｏｎ－ＩＣＵ）、症状が重い人（ＩＣＵに入った人）のＴ細胞について調べた事例についても報告されている（非特許文献３参照）。この報告では、症状が重い人では、ＣＤ４陽性Ｔ細胞やＣＤ８陽性Ｔ細胞が減っていることが示されており、Ｔ細胞が病気の回復に何らかの重要な役割を果たしていると考えられる。
【0007】
したがって、抗体誘導型ワクチンに加えて、ウイルス感染細胞を排除する細胞傷害性Ｔ細胞（以下、「ＣＴＬ」と称することがある）誘導型ワクチンを開発することがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の根絶に有用であると考えられるが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＣＴＬエピトープは未だ同定されていない。ＣＯＶＩＤ－１９の感染拡大は収束の気配すらみえておらず、また今後流行を繰り返す可能性が高く、ＣＴＬ誘導型ワクチンの速やかな開発が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｉｒａｎｉ Ｔｈｅｖａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒｅａｄｔｈ ｏｆ Ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ Ｐｒｉｏｒ ｔｏ Ｐａｔｉｅｎｔ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ： Ａ Ｃａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ Ｎｏｎ－Ｓｅｖｅｒｅ ＣＯＶＩＤ－１９， Ｎａｔ Ｍｅｄ． ２０２０ Ａｐｒ；２６（４）：４５３－４５５（Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ： １６ Ｍａｒｃｈ ２０２０）
【非特許文献2】Ｆａｔｉｍａ Ａｍａｎａｔ ｅｔ ａｌ．， ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｖａｃｃｉｎｅｓ： Ｓｔａｔｕｓ Ｒｅｐｏｒｔ， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． ２０２０ Ａｐｒ １４； ５２（４）： ５８３－５８９
【非特許文献3】Ｂｏ Ｄｉａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９ （ＣＯＶＩＤ－１９）， ｍｅｄＲｘｉｖ Ｆｅｂ． ２０２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の新規な細胞傷害性Ｔ細胞エピトープペプチド、前記ペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、前記ペプチドを内包するペプチド内包リポソーム、前記ペプチドとＨＬＡ－Ａ２分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞の製造方法及び前記抗原提示細胞製造用剤、ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法及び前記細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤、並びに前記ペプチドとＨＬＡ－Ａ２分子との複合体のテトラマーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 配列番号２、３、４、５、９、１３、１６、２０、３５、５２、５３、５８、６３、６４、６７、７０、７１、及び７２からなる群から選択されるいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなり、
ヒト白血球抗原－Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）分子に結合でき、かつ細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しさらに細胞傷害性Ｔ細胞に認識されることを特徴とするペプチドである。
＜２＞ 前記＜１＞に記載のペプチドをコードする塩基配列からなることを特徴とする核酸分子である。
＜３＞ 前記＜２＞に記載の核酸分子を含むことを特徴とするベクターである。
＜４＞ 前記＜１＞に記載のペプチドを内包することを特徴とするペプチド内包リポソームである。
＜５＞ 前記＜１＞に記載のペプチドと、ＨＬＡ－Ａ２分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を製造するための抗原提示細胞製造用剤であって、
前記＜１＞に記載のペプチド、前記＜３＞に記載のベクター、及び前記＜４＞に記載のペプチド内包リポソームからなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする抗原提示細胞製造用剤である。
＜６＞ 前記＜１＞に記載のペプチドと、ＨＬＡ－Ａ２分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞の製造方法であって、
ＨＬＡ－Ａ２分子を発現する細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて前記＜５＞に記載の抗原提示細胞製造用剤と接触させることを含むことを特徴とする抗原提示細胞の製造方法である。
＜７＞ 前記＜１＞に記載のペプチド、前記＜２＞に記載の核酸分子、前記＜３＞に記載のベクター、前記＜４＞に記載のペプチド内包リポソーム、及び前記＜６＞に記載の製造方法で製造された抗原提示細胞からなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とするＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物である。
＜８＞ 前記＜１＞に記載のペプチド、前記＜４＞に記載のペプチド内包リポソーム、及び前記＜６＞に記載の製造方法で製造された抗原提示細胞からなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤である。
＜９＞ ＨＬＡ－Ａ２陽性のＣＯＶＩＤ－１９患者より採取された末梢血単核球細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて前記＜８＞に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤と接触させることを含むことを特徴とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法である。
＜１０＞ 前記＜１＞に記載のペプチドとＨＬＡ－Ａ２分子との複合体の四量体であることを特徴とするテトラマーである。
＜１＞ 配列番号２、３、４、５、９、１３、１６、２０、３５、５２、５３、５８、６３、６４、６７、７０、７１、及び７２からなる群から選択されるいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなり、
ヒト白血球抗原－Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）分子に結合でき、かつ細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しさらに細胞傷害性Ｔ細胞に認識されることを特徴とするペプチドである。
＜２＞ 前記＜１＞に記載のペプチドをコードする塩基配列からなることを特徴とする核酸分子である。
＜３＞ 前記＜２＞に記載の核酸分子を含むことを特徴とするベクターである。
＜４＞ 前記＜１＞に記載のペプチドを内包することを特徴とするペプチド内包リポソームである。
＜５＞ 前記＜１＞に記載のペプチドと、ＨＬＡ－Ａ２分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を製造するための抗原提示細胞製造用剤であって、
前記＜１＞に記載のペプチド、前記＜３＞に記載のベクター、及び前記＜４＞に記載のペプチド内包リポソームからなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする抗原提示細胞製造用剤である。
＜６＞ 前記＜１＞に記載のペプチドと、ＨＬＡ－Ａ２分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞の製造方法であって、
ＨＬＡ－Ａ２分子を発現する細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて前記＜５＞に記載の抗原提示細胞製造用剤と接触させることを含むことを特徴とする抗原提示細胞の製造方法である。
＜７＞ 前記＜１＞に記載のペプチド、前記＜２＞に記載の核酸分子、前記＜３＞に記載のベクター、前記＜４＞に記載のペプチド内包リポソーム、及び前記＜６＞に記載の製造方法で製造された抗原提示細胞からなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とするＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物である。
＜８＞ 前記＜１＞に記載のペプチド、前記＜４＞に記載のペプチド内包リポソーム、及び前記＜６＞に記載の製造方法で製造された抗原提示細胞からなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤である。
＜９＞ ＨＬＡ－Ａ２陽性のＣＯＶＩＤ－１９患者より採取された末梢血単核球細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて前記＜８＞に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤と接触させることを含むことを特徴とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法である。
＜１０＞ 前記＜１＞に記載のペプチドとＨＬＡ－Ａ２分子との複合体の四量体であることを特徴とするテトラマーである。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の新規な細胞傷害性Ｔ細胞エピトープペプチド、前記ペプチドをコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、前記ペプチドを内包するペプチド内包リポソーム、前記ペプチドとＨＬＡ－Ａ２分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞の製造方法及び前記抗原提示細胞製造用剤、ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法及び前記細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤、並びに前記ペプチドとＨＬＡ－Ａ２分子との複合体のテトラマーを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【発明を実施するための形態】
【0013】
（ペプチド）
本発明のペプチドは、下記の配列番号２、３、４、５、９、１３、１６、２０、３５、５２、５３、５８、６３、６４、６７、７０、７１、及び７２からなる群から選択されるいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなり、ＨＬＡ－Ａ２分子に結合でき、かつ細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しさらに細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるペプチドである。
１） ＶＬＳＥＡＲＱＨＬ（配列番号２：Ｓ２ｐｐ１ａ－３８）
２） ＧＬＶＥＶＥＫＧＶ（配列番号３：Ｓ２ｐｐ１ａ－５２）
３） ＶＭＶＥＬＶＡＥＬ（配列番号４：Ｓ２ｐｐ１ａ－８４）
４） ＴＬＧＶＬＶＰＨＶ（配列番号５：Ｓ２ｐｐ１ａ－１０３）
５） ＧＬＮＤＮＬＬＥＩ（配列番号９：Ｓ２ｐｐ１ａ－４４５）
６） ＶＭＡＹＩＴＧＧＶ（配列番号１３：Ｓ２ｐｐ１ａ－５９７）
７） ＦＬＲＤＧＷＥＩＶ（配列番号１６：Ｓ２ｐｐ１ａ－６４１）
８） ＫＬＷＡＱＣＶＱＬ（配列番号２０：Ｓ２ｐｐ１ａ－３８８６）
９） ＹＬＡＴＡＬＬＴＬ（配列番号３５：Ｓ２ｐｐ１ａ－１６７５）
１０） ＡＩＦＹＬＩＴＰＶ（配列番号５２：Ｓ２ｐｐ１ａ－２７８５）
１１） ＦＬＰＲＶＦＳＡＶ（配列番号５３：Ｓ２ｐｐ１ａ－２８８４）
１２） ＬＬＦＬＭＳＦＴＶ（配列番号５８：Ｓ２ｐｐ１ａ－３０８３）
１３） ＦＬＮＧＳＣＧＳＶ（配列番号６３：Ｓ２ｐｐ１ａ－３４０３）
１４） ＶＬＡＷＬＹＡＡＶ（配列番号６４：Ｓ２ｐｐ１ａ－３４６７）
１５） ＬＬＬＴＩＬＴＳＬ（配列番号６７：Ｓ２ｐｐ１ａ－３５８３）
１６） ＲＩＭＴＷＬＤＭＶ（配列番号７０：Ｓ２ｐｐ１ａ－３６６２）
１７） ＴＬＭＮＶＬＴＬＶ（配列番号７１：Ｓ２ｐｐ１ａ－３７１０）
１８） ＳＭＷＡＬＩＩＳＶ（配列番号７２：Ｓ２ｐｐ１ａ－３７３２）
前記ペプチドの中でも、前記配列番号２、４、１６、３５、５３、６４、６７、７０、７１、及び７２からなる群から選択されるいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、前記配列番号２、４、１６、及び７２からなる群から選択されるいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましい。
本発明のペプチドは、下記の配列番号２、３、４、５、９、１３、１６、２０、３５、５２、５３、５８、６３、６４、６７、７０、７１、及び７２からなる群から選択されるいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなり、ＨＬＡ－Ａ２分子に結合でき、かつ細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しさらに細胞傷害性Ｔ細胞に認識されるペプチドである。
１） ＶＬＳＥＡＲＱＨＬ（配列番号２：Ｓ２ｐｐ１ａ－３８）
２） ＧＬＶＥＶＥＫＧＶ（配列番号３：Ｓ２ｐｐ１ａ－５２）
３） ＶＭＶＥＬＶＡＥＬ（配列番号４：Ｓ２ｐｐ１ａ－８４）
４） ＴＬＧＶＬＶＰＨＶ（配列番号５：Ｓ２ｐｐ１ａ－１０３）
５） ＧＬＮＤＮＬＬＥＩ（配列番号９：Ｓ２ｐｐ１ａ－４４５）
６） ＶＭＡＹＩＴＧＧＶ（配列番号１３：Ｓ２ｐｐ１ａ－５９７）
７） ＦＬＲＤＧＷＥＩＶ（配列番号１６：Ｓ２ｐｐ１ａ－６４１）
８） ＫＬＷＡＱＣＶＱＬ（配列番号２０：Ｓ２ｐｐ１ａ－３８８６）
９） ＹＬＡＴＡＬＬＴＬ（配列番号３５：Ｓ２ｐｐ１ａ－１６７５）
１０） ＡＩＦＹＬＩＴＰＶ（配列番号５２：Ｓ２ｐｐ１ａ－２７８５）
１１） ＦＬＰＲＶＦＳＡＶ（配列番号５３：Ｓ２ｐｐ１ａ－２８８４）
１２） ＬＬＦＬＭＳＦＴＶ（配列番号５８：Ｓ２ｐｐ１ａ－３０８３）
１３） ＦＬＮＧＳＣＧＳＶ（配列番号６３：Ｓ２ｐｐ１ａ－３４０３）
１４） ＶＬＡＷＬＹＡＡＶ（配列番号６４：Ｓ２ｐｐ１ａ－３４６７）
１５） ＬＬＬＴＩＬＴＳＬ（配列番号６７：Ｓ２ｐｐ１ａ－３５８３）
１６） ＲＩＭＴＷＬＤＭＶ（配列番号７０：Ｓ２ｐｐ１ａ－３６６２）
１７） ＴＬＭＮＶＬＴＬＶ（配列番号７１：Ｓ２ｐｐ１ａ－３７１０）
１８） ＳＭＷＡＬＩＩＳＶ（配列番号７２：Ｓ２ｐｐ１ａ－３７３２）
前記ペプチドの中でも、前記配列番号２、４、１６、３５、５３、６４、６７、７０、７１、及び７２からなる群から選択されるいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが好ましく、前記配列番号２、４、１６、及び７２からなる群から選択されるいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなるペプチドがより好ましい。
【0014】
本発明において、「ペプチドがＨＬＡ－Ａ２分子に結合できる」とは、ペプチドがＨＬＡ－Ａ２分子と複合体を形成し得ることをいう。
【0015】
本発明において、「細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する」とは、ペプチドが特異的なＣＴＬを生体内で誘導することができることをいい、「細胞傷害性Ｔ細胞に認識される」とは、ペプチドが特異的なＣＴＬに認識される、即ち、ペプチド・ＨＬＡ－Ａ２分子複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞又は標的細胞をペプチド特異的ＣＴＬが認識して活性化されることができることをいう。
【0016】
前記ペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ１ａポリプロテイン領域由来のＣＴＬエピトープである。前記ペプチドは、ＨＬＡ－Ａ２拘束性ＣＴＬエピトープであり、より具体的には、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１拘束性ＣＴＬエピトープである。
【0017】
前記ペプチドは、ＣＴＬエピトープとしての機能を損なわれない限り、未変性、融合体、グリコシル化、非グリコシル化などの様々な形態で用いることができる。また、アミド化、エステル化、アルデヒド化等のＣ末端修飾、アセチル化、ビオチン化、蛍光標識等のＮ末端修飾、リン酸化、硫酸化、ビオチン化等の官能基の化学修飾が施されていてもよい。
【0018】
前記ペプチドは、細胞内でプロテアソームなどの作用により切断されて生じるように設計されたものであってもよい。
また、前記ペプチドは、細胞内でＭＨＣ上に提示される際に、ＭＨＣの個人差（多型性）による提示抗原の選別を克服できるような残基を付加配列として有していてもよい。
また、前記ペプチドは、細胞内でＭＨＣ上に提示される際に、ＭＨＣの個人差（多型性）による提示抗原の選別を克服できるような残基を付加配列として有していてもよい。
【0019】
前記ペプチドの製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、化学合成により製造する方法、生合成により製造する方法などが挙げられる。
【0020】
前記ペプチドは、後述する抗原提示細胞製造用剤、ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤、テトラマーなどに好適に用いることができる。
【0021】
（核酸分子）
本発明の核酸分子としては、本発明のペプチドをコードする塩基配列からなるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。なお、前記核酸分子は、必要に応じて本発明のペプチドをコードする塩基配列以外の塩基配列を含んでもよい。
本発明の核酸分子としては、本発明のペプチドをコードする塩基配列からなるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。なお、前記核酸分子は、必要に応じて本発明のペプチドをコードする塩基配列以外の塩基配列を含んでもよい。
【0022】
前記核酸の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【0023】
前記核酸分子の製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【0024】
前記核酸分子は、後述するＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物などに好適に用いることができる。
【0025】
（ベクター）
本発明のベクターは、本発明の核酸分子を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
本発明のベクターは、本発明の核酸分子を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
【0026】
前記ベクターの種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プラスミド、ウイルスベクターなどが挙げられる。
前記ウイルスベクターの具体例としては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどが挙げられる。
前記ウイルスベクターの具体例としては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどが挙げられる。
【0027】
前記ベクターの製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して調製することができる。
【0028】
前記ベクターは、後述する抗原提示細胞製造用剤、ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物などに好適に用いることができる。
【0029】
（ペプチド内包リポソーム）
本発明のペプチド内包リポソームは、本発明のペプチドを内包し、必要に応じて更にその他の構成を含む。
本発明のペプチド内包リポソームは、本発明のペプチドを内包し、必要に応じて更にその他の構成を含む。
【0030】
＜ペプチド＞
前記ペプチド内包リポソームにおけるペプチドは、上記した本発明のペプチドである。前記ペプチドは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記ペプチド内包リポソームにおけるペプチドは、上記した本発明のペプチドである。前記ペプチドは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【0031】
＜リポソーム＞
前記リポソームとは、閉鎖空間を有するリン脂質二重膜のことをいう。前記リポソームを構成するリン脂質膜は、両親媒性界面活性剤であるリン脂質が、極性基を水相側に向けて界面を形成し、疎水基が界面の反対側に向く構造を有する。
前記リポソームとは、閉鎖空間を有するリン脂質二重膜のことをいう。前記リポソームを構成するリン脂質膜は、両親媒性界面活性剤であるリン脂質が、極性基を水相側に向けて界面を形成し、疎水基が界面の反対側に向く構造を有する。
【0032】
前記リポソームにおけるリン脂質としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、リポソームに用いられる公知のリン脂質を適宜選択することができる。前記リン脂質は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【0033】
前記リポソームの製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【0034】
＜その他の成分＞
前記ペプチド内包リポソームにおけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、リポソームの安定化剤などが挙げられる。
前記リポソームの安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ステロール類、トコフェロール類などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記ステロール類の具体例としては、コレステロール、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロールなどが挙げられる。これらの中でも、入手性などの点で、コレステロールが好ましい。
前記トコフェロール類の具体例としては、α－トコフェロールなどが挙げられる。これらの中でも、入手性などの点で、α－トコフェロールが好ましい。
前記ペプチド内包リポソームにおけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、リポソームの安定化剤などが挙げられる。
前記リポソームの安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ステロール類、トコフェロール類などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記ステロール類の具体例としては、コレステロール、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロールなどが挙げられる。これらの中でも、入手性などの点で、コレステロールが好ましい。
前記トコフェロール類の具体例としては、α－トコフェロールなどが挙げられる。これらの中でも、入手性などの点で、α－トコフェロールが好ましい。
【0035】
＜内包＞
前記ペプチド内包リポソームは、前記ペプチドが前記リポソームに内包されている。本発明において、「ペプチドがリポソームに内包されている」とは、ペプチドが、リン脂質二重膜の閉鎖空間内に存在している状態のことをいう。
前記ペプチド内包リポソームは、前記ペプチドが前記リポソームに内包されている。本発明において、「ペプチドがリポソームに内包されている」とは、ペプチドが、リン脂質二重膜の閉鎖空間内に存在している状態のことをいう。
【0036】
前記ペプチドをリポソームに内包する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の方法を適宜選択することができ、例えば、市販のキットを用いる方法などが挙げられる。
前記市販のキットの具体例としては、例えば、リポカプセレーター（Ｌｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ）ＦＤ－Ｓ ＰＥ、ＦＤ－Ｓ ＭＡ、ＦＤ－Ｓ ＰＬ、ＦＤ－Ｕ ＰＥ、ＦＤ－Ｕ ＰＬ（株式会社ヒュギエイアバイオサイエンス）などが挙げられる。前記製造方法によれば、溶液状態のペプチドをリポソームに内包させることができる。
前記市販のキットの具体例としては、例えば、リポカプセレーター（Ｌｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ）ＦＤ－Ｓ ＰＥ、ＦＤ－Ｓ ＭＡ、ＦＤ－Ｓ ＰＬ、ＦＤ－Ｕ ＰＥ、ＦＤ－Ｕ ＰＬ（株式会社ヒュギエイアバイオサイエンス）などが挙げられる。前記製造方法によれば、溶液状態のペプチドをリポソームに内包させることができる。
【0037】
前記ペプチド内包リポソームの形態、粒径などとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0038】
前記ペプチド内包リポソームは、後述する抗原提示細胞製造用剤、ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤などに好適に用いることができる。
【0039】
（抗原提示細胞製造用剤）
本発明の抗原提示細胞製造用剤は、本発明のペプチドと、ＨＬＡ－Ａ２分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を製造するための抗原提示細胞製造用剤であって、本発明のペプチド、本発明のベクター、及び本発明のペプチド内包リポソームからなる群から選択される少なくとも１つを含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
本発明の抗原提示細胞製造用剤は、本発明のペプチドと、ＨＬＡ－Ａ２分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を製造するための抗原提示細胞製造用剤であって、本発明のペプチド、本発明のベクター、及び本発明のペプチド内包リポソームからなる群から選択される少なくとも１つを含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【0040】
＜ペプチド、ベクター、及びペプチド内包リポソームからなる群から選択される少なくとも１つ＞
前記ペプチド、前記ベクター、及び前記ペプチド内包リポソームは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。また、前記ペプチド、前記ベクター、及び前記ペプチド内包リポソームのそれぞれについても、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記抗原提示細胞製造用剤における前記ペプチド、前記ベクター、及び前記ペプチド内包リポソームの合計含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記抗原提示細胞製造用剤は、前記ペプチド、前記ベクター、及び前記ペプチド内包リポソームのいずれかのみからなるものであってもよい。
前記ペプチド、前記ベクター、及び前記ペプチド内包リポソームは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。また、前記ペプチド、前記ベクター、及び前記ペプチド内包リポソームのそれぞれについても、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記抗原提示細胞製造用剤における前記ペプチド、前記ベクター、及び前記ペプチド内包リポソームの合計含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記抗原提示細胞製造用剤は、前記ペプチド、前記ベクター、及び前記ペプチド内包リポソームのいずれかのみからなるものであってもよい。
【0041】
＜その他の成分＞
前記抗原提示細胞製造用剤におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後述するＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物のその他の成分の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。前記その他の成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記抗原提示細胞製造用剤における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記抗原提示細胞製造用剤におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後述するＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物のその他の成分の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。前記その他の成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記抗原提示細胞製造用剤における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0042】
前記抗原提示細胞製造用剤は、後述する抗原提示細胞の製造方法に好適に用いることができる。
【0043】
前記抗原提示細胞製造用剤は、含まれる成分をすべて含む組成物の態様であってもよいし、含まれる成分を１つ又は２つ以上に分けて収容したキットの態様であってもよい。
【0044】
（抗原提示細胞の製造方法）
本発明の抗原提示細胞の製造方法は、本発明のペプチドと、ＨＬＡ－Ａ２分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞の製造方法であって、接触工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
本発明の抗原提示細胞の製造方法は、本発明のペプチドと、ＨＬＡ－Ａ２分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞の製造方法であって、接触工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【0045】
前記接触工程は、ＨＬＡ－Ａ２分子を発現する細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて本発明の抗原提示細胞製造用剤と接触させる工程である。
前記接触工程により、前記抗原提示細胞製造用剤に含まれる前記ペプチド、前記ベクター、及び前記ペプチド内包リポソームからなる群から選択される少なくとも１つが前記細胞に導入される。そして、前記ペプチドと、ＨＬＡ－Ａ２分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を製造することができる。前記抗原提示細胞は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得る。
前記接触工程により、前記抗原提示細胞製造用剤に含まれる前記ペプチド、前記ベクター、及び前記ペプチド内包リポソームからなる群から選択される少なくとも１つが前記細胞に導入される。そして、前記ペプチドと、ＨＬＡ－Ａ２分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を製造することができる。前記抗原提示細胞は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得る。
【0046】
前記抗原提示細胞製造用剤を前記ＨＬＡ－Ａ２分子を発現する細胞と接触させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記細胞を前記抗原提示細胞製造用剤と共に培養する方法、前記細胞に前記抗原提示細胞製造用剤を注入する方法などが挙げられる。
【0047】
前記ＨＬＡ－Ａ２分子を発現する細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｔ細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、樹状細胞などが挙げられる。
前記ＨＬＡ－Ａ２分子を発現する細胞の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、自己由来、同種由来であることが、好ましい。
前記ＨＬＡ－Ａ２分子を発現する細胞の調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
前記ＨＬＡ－Ａ２分子を発現する細胞の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、自己由来、同種由来であることが、好ましい。
前記ＨＬＡ－Ａ２分子を発現する細胞の調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【0048】
＜その他の工程＞
前記抗原提示細胞の製造方法における前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記抗原提示細胞の製造方法における前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0049】
前記抗原提示細胞の製造方法で得られた抗原提示細胞は、後述するＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤などに好適に用いることができる。また、前記ＨＬＡ－Ａ２分子を発現する細胞を採取した個体の体内に戻し、体内でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を促進するためにも好適に用いることができる。
【0050】
（ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物）
本発明のＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物は、本発明のペプチド、本発明の核酸分子、本発明のベクター、本発明のペプチド内包リポソーム、及び本発明の抗原提示細胞の製造方法で製造された抗原提示細胞からなる群から選択される少なくとも１つを含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
本発明において、予防とはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染や増殖を抑えたり、ＣＯＶＩＤ－１９の発症を抑えたりすることをいい、治療とは発症したＣＯＶＩＤ－１９の症状を低減したり、感染したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖を抑えたりすることをいう。
本発明のＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物は、本発明のペプチド、本発明の核酸分子、本発明のベクター、本発明のペプチド内包リポソーム、及び本発明の抗原提示細胞の製造方法で製造された抗原提示細胞からなる群から選択される少なくとも１つを含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
本発明において、予防とはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染や増殖を抑えたり、ＣＯＶＩＤ－１９の発症を抑えたりすることをいい、治療とは発症したＣＯＶＩＤ－１９の症状を低減したり、感染したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖を抑えたりすることをいう。
【0051】
＜ペプチド、核酸分子、ベクター、ペプチド内包リポソーム、及び抗原提示細胞の製造方法で製造された抗原提示細胞からなる群から選択される少なくとも１つ＞
前記ペプチド、前記核酸分子、前記ベクター、前記ペプチド内包リポソーム、及び前記抗原提示細胞は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。また、前記ペプチド、前記核酸分子、前記ベクター、前記ペプチド内包リポソーム、及び前記抗原提示細胞のそれぞれについても、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物における前記ペプチド、前記核酸分子、前記ベクター、前記ペプチド内包リポソーム、及び前記抗原提示細胞の合計含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物は、前前記ペプチド、前記核酸分子、前記ベクター、前記ペプチド内包リポソーム、及び前記抗原提示細胞のいずれかのみからなるものであってもよい。
前記ペプチド、前記核酸分子、前記ベクター、前記ペプチド内包リポソーム、及び前記抗原提示細胞は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。また、前記ペプチド、前記核酸分子、前記ベクター、前記ペプチド内包リポソーム、及び前記抗原提示細胞のそれぞれについても、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物における前記ペプチド、前記核酸分子、前記ベクター、前記ペプチド内包リポソーム、及び前記抗原提示細胞の合計含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物は、前前記ペプチド、前記核酸分子、前記ベクター、前記ペプチド内包リポソーム、及び前記抗原提示細胞のいずれかのみからなるものであってもよい。
【0052】
＜その他の成分＞
前記ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アジュバント、薬理学的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤などが挙げられる。前記その他の成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アジュバント、薬理学的に許容され得る担体、希釈剤、賦形剤などが挙げられる。前記その他の成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0053】
前記ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染を予防するためのワクチンとして使用することが好ましい。前記新型コロナウイルス感染症の予防又は治療用医薬組成物は、ワクチンとして使用する場合、更にアジュバントを含むことが好ましい。
【0054】
前記アジュバントとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水酸化アルミニウムゲル、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、百日咳菌アジュバント、ポリ（Ｉ，Ｃ）、ＣｐＧ－ＤＮＡなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記アジュバントの中でも、ＣｐＧ－ＤＮＡが好ましい。前記ＣｐＧ－ＤＮＡは、細菌の非メチル化ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡであり、特定の受容体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９）のリガンドとして働くことが知られている（Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４８９， １０７－１１６ （１９９９）、 Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６， ４７２－４７７ （２００３）参照）。
【0055】
前記ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物における前記アジュバントの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0056】
前記ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物は、他の成分を有効成分とする医薬組成物と併せて使用されてもよい。
また、前記ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。
また、前記ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。
【0057】
前記ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物の剤形としては、特に制限はなく、公知の剤形を適宜選択することができ、経口又は非経口（例えば、血管内、皮下など）投与に適する剤形とすることができる。前記剤形のＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物は、常法に従い製造することができる。
【0058】
前記ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物の投与方法、投与量、投与時期、投与間隔、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0059】
前記ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物は、免疫応答が効果的に成立するように、従来からワクチン投与に用いられることが知られているアジュバントとともに投与することが好ましく、投与方法としては、例えば、皮内投与、皮下投与などが挙げられる。
また、前記ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物は、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射等の非経口的注射や、経口、経鼻、肺等の粘膜投与、眼を通じた投与、経皮投与、坐剤などで投与することもできる。
また、前記ＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物は、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射等の非経口的注射や、経口、経鼻、肺等の粘膜投与、眼を通じた投与、経皮投与、坐剤などで投与することもできる。
【0060】
前記投与量、投与時期、及び投与間隔としては、特に制限はなく、投与対象の個体の疾患の状態、年齢、体重、体質、他の成分を有効成分とする医薬組成物の投与の有無などを考慮して適宜選択することができ、例えば、投与１回あたり、前記ペプチドの量として、０．０１μｇ～１ｍｇが好ましく、０．１μｇ～５００μｇがより好ましく、１．０μｇ～１００μｇが特に好ましく、これを数日間～数か月間に１回又は複数回投与することが好ましい。
例えば、初期免疫では成人患者に対して、ペプチドの量として１．０μｇ～５００μｇを投与し、患者の血液におけるＣＴＬ活性の測定による患者の応答及び状態に応じて、数週間から数か月間にわたるブースティング療法に従う１．０μｇ～１００μｇのペプチドのブースティング投与がそれに続く。
例えば、初期免疫では成人患者に対して、ペプチドの量として１．０μｇ～５００μｇを投与し、患者の血液におけるＣＴＬ活性の測定による患者の応答及び状態に応じて、数週間から数か月間にわたるブースティング療法に従う１．０μｇ～１００μｇのペプチドのブースティング投与がそれに続く。
【0061】
また、前記抗原提示細胞の投与細胞数としても、投与対象の個体の疾患の状態、年齢、体重、体質、他の成分を有効成分とする医薬組成物の投与の有無などを考慮して適宜選択することができるが、１０６個～１０９個が好ましく、１０７個～１０８個が好ましい。
【0062】
前記投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、ヒト以外の動物などが挙げられる。前記投与対象の中でも、ＨＬＡ－Ａ２を発現するヒトが好ましく、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１を発現するヒトがより好ましい。
【0063】
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤）
本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤（以下、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞活性化剤」と称することもある）は、本発明のペプチド、本発明のペプチド内包リポソーム、及び本発明の抗原提示細胞の製造方法で製造された抗原提示細胞からなる群から選択される少なくとも１つを含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤（以下、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞活性化剤」と称することもある）は、本発明のペプチド、本発明のペプチド内包リポソーム、及び本発明の抗原提示細胞の製造方法で製造された抗原提示細胞からなる群から選択される少なくとも１つを含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【0064】
＜ペプチド、ペプチド内包リポソーム、及び抗原提示細胞からなる群から選択される少なくとも１つ＞
前記ペプチド、前記ペプチド内包リポソーム、及び前記抗原提示細胞は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。また、前記ペプチド、前記ペプチド内包リポソーム、及び前記抗原提示細胞のそれぞれについても、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤における前記ペプチド、前記ペプチド内包リポソーム、及び前記抗原提示細胞の合計含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤は、前記ペプチド、前記ペプチド内包リポソーム、及び前記抗原提示細胞のいずれかのみからなるものであってもよい。
前記ペプチド、前記ペプチド内包リポソーム、及び前記抗原提示細胞は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。また、前記ペプチド、前記ペプチド内包リポソーム、及び前記抗原提示細胞のそれぞれについても、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤における前記ペプチド、前記ペプチド内包リポソーム、及び前記抗原提示細胞の合計含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤は、前記ペプチド、前記ペプチド内包リポソーム、及び前記抗原提示細胞のいずれかのみからなるものであってもよい。
【0065】
＜その他の成分＞
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上述したＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物のその他の成分の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。前記その他の成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤におけるその他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上述したＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療用医薬組成物のその他の成分の項目に記載したものと同様のものが挙げられる。前記その他の成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤における前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0066】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤は、更に、アジュバントを含むことが好ましい。
【0067】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤は、後述するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法に好適に用いることができる。
【0068】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤は、含まれる成分をすべて含む組成物の態様であってもよいし、含まれる成分を１つ又は２つ以上に分けて収容したキットの態様であってもよい。
【0069】
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法）
本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法は、接触工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法は、接触工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【0070】
＜接触工程＞
前記接触工程は、ＨＬＡ－Ａ２陽性のＣＯＶＩＤ－１９患者より採取された末梢血単核球細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤と接触させる工程である。
前記接触工程により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができる。
前記接触工程は、ＨＬＡ－Ａ２陽性のＣＯＶＩＤ－１９患者より採取された末梢血単核球細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤と接触させる工程である。
前記接触工程により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができる。
【0071】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤を前記ＨＬＡ－Ａ２陽性のＣＯＶＩＤ－１９患者より採取された末梢血単核球細胞と接触させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記細胞を前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤の存在下で培養する方法などが挙げられる。
【0072】
＜その他の工程＞
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法における前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法における前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0073】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法で得られたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞は、前記末梢血単核細胞を採取した個体の体内に戻して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した細胞を傷害する方法に好適に用いることができる。
【0074】
（テトラマー）
本発明のテトラマーは、本発明のペプチドとＨＬＡ－Ａ２分子との複合体の四量体であり、ビオチン、アビジンなど必要に応じて更にその他の構成を含む。
本発明のテトラマーは、本発明のペプチドとＨＬＡ－Ａ２分子との複合体の四量体であり、ビオチン、アビジンなど必要に応じて更にその他の構成を含む。
【0075】
前記テトラマーの製造方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、組換えタンパク質として調製したＨＬＡ－Ａ２分子の重鎖とβ２－マイクログロブリン（β２ｍ）に前記ペプチドを加えてフォールディング操作を行い、可溶性のＨＬＡ－Ａ２分子とペプチド複合体のモノマーを形成し、次いで、前記複合体中のＨＬＡ－Ａ２分子の重鎖のＣ末端に予め付加しておいたビオチン化配列中のリジン残基をビオチン化し、カラムクロマトグラフィーにて精製して精製ビオチン化モノマーを得、その後、蛍光標識したアビジンと混合することで四量体化させる方法などが挙げられる。なお、ＣＤ８分子との非特異的な結合を抑えるために、ＨＬＡクラスＩ重鎖α３ドメインに変異を入れてもよい。
【0076】
ＭＨＣクラスＩ分子とペプチドとの複合体の四量体は、プローブとして利用することで抗原特異的ＣＴＬの検出、定量に有用であることが知られている。
【0077】
前記テトラマーは、それを認識するＴ細胞受容体を有するＴ細胞に安定に結合する。したがって、前記テトラマーに蛍光色素などの標識を結合させることで、生体内での前記ペプチド特異的Ｔ細胞の状態を定量的・定性的に解析可能である。
【0078】
そのため、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、前記テトラマーと、ＣＯＶＩＤ－１９患者由来の試料（末梢血）とを接触させることで、前記試料に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＣＴＬの量を測定することができる。ＣＯＶＩＤ－１９の病状はＴ細胞の数によって変わるため、前記テトラマーを用いて、ＣＯＶＩＤ－１９患者由来の試料中の前記ペプチドに対するＣＴＬの量を測定することで、患者の病状を評価することができる。
【0079】
したがって、本発明は、本発明のテトラマーを用いることを含むことを特徴とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の検出方法、本発明のテトラマーを用いて被検体由来の試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の量を測定することを含むことを特徴とする新型コロナウイルス感染症の病状を評価するためのデータを収集する方法にも関する。
また、本発明は、被検体由来の試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の量を指標とすることを含み、前記被検体由来の試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の量が、本発明のテトラマーを用いて測定されたものであることを特徴とする新型コロナウイルス感染症の病状を評価するための方法にも関する。前記指標としては、例えば、被検体由来の試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の量が基準値よりも減っている場合に、病状が重いと評価することができる。前記基準値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、症状が軽い被検体由来の試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の量に基づく値などが挙げられる。
また、本発明は、被検体由来の試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の量を指標とすることを含み、前記被検体由来の試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の量が、本発明のテトラマーを用いて測定されたものであることを特徴とする新型コロナウイルス感染症の病状を評価するための方法にも関する。前記指標としては、例えば、被検体由来の試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の量が基準値よりも減っている場合に、病状が重いと評価することができる。前記基準値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、症状が軽い被検体由来の試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の量に基づく値などが挙げられる。
【0080】
（新型コロナウイルス感染症を予防又は治療するための方法）
本発明は、個体に、本発明の新型コロナウイルス感染症の予防又は治療用医薬組成物を投与することを特徴とする、新型コロナウイルス感染症を予防又は治療するための方法にも関する。また、前記新型コロナウイルス感染症を予防又は治療するための方法は、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するための方法により誘導されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を個体の体内に戻すことにより行ってもよい。
本発明は、個体に、本発明の新型コロナウイルス感染症の予防又は治療用医薬組成物を投与することを特徴とする、新型コロナウイルス感染症を予防又は治療するための方法にも関する。また、前記新型コロナウイルス感染症を予防又は治療するための方法は、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するための方法により誘導されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を個体の体内に戻すことにより行ってもよい。
【実施例0081】
以下、試験例を挙げて、本発明を説明するが、本発明は、以下の試験例に何ら限定されるものではない。
【0082】
（試験例１：ＣＴＬエピトープの予測）
下記の３種類のエピトープ予測コンピュータプログラムを用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＬＣ５２８２３２．１及びＬＣ５２８２３３．１）のＯＲＦ１ａポリプロテイン由来のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１拘束性ＣＴＬエピトープを予測した。優れたスコアを示すエピトープ候補ペプチドを８２種類選抜した。選抜したペプチドのアミノ酸配列を表１－１～１－２に示す。
［コンピュータプログラム］
・ ＹＦＰＥＩＴＨＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ／）（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９）
・ ｎＨＬＡＰｒｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｎｈｌａｐｒｅｄ／）（Ｂｈａｓｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００６）
・ ＰｒｏＰｒｅｄ－Ｉ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂｓ．ｉｉｉｔｄ．ｅｄｕ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｐｒｏｐｒｅｄ１／ｇｌｏｓｓ．ｈｔｍｌ）（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．， ２００３）
下記の３種類のエピトープ予測コンピュータプログラムを用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＬＣ５２８２３２．１及びＬＣ５２８２３３．１）のＯＲＦ１ａポリプロテイン由来のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１拘束性ＣＴＬエピトープを予測した。優れたスコアを示すエピトープ候補ペプチドを８２種類選抜した。選抜したペプチドのアミノ酸配列を表１－１～１－２に示す。
［コンピュータプログラム］
・ ＹＦＰＥＩＴＨＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ／）（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９）
・ ｎＨＬＡＰｒｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｔｅｃｈ．ｒｅｓ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｎｈｌａｐｒｅｄ／）（Ｂｈａｓｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００６）
・ ＰｒｏＰｒｅｄ－Ｉ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂｓ．ｉｉｉｔｄ．ｅｄｕ．ｉｎ／ｒａｇｈａｖａ／ｐｒｏｐｒｅｄ１／ｇｌｏｓｓ．ｈｔｍｌ）（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．， ２００３）
【0083】
【表1-1】
【0084】
【表1-2】
【0085】
（試験例２：ペプチドの製造）
前記試験例１で選抜した８２種類のペプチドを人工合成した（ユーロフィンジェノミクス社）。
前記試験例１で選抜した８２種類のペプチドを人工合成した（ユーロフィンジェノミクス社）。
【0086】
（試験例３：ペプチドのＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子との結合アフィニティの測定）
試験例１で選抜した８２種類のペプチドについて、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子との結合アフィニティを測定した。
試験例１で選抜した８２種類のペプチドについて、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子との結合アフィニティを測定した。
【0087】
測定には、ＴＡＰ遺伝子が欠損したマウスリンパ腫細胞株であるＲＭＡ－Ｓ細胞に、ＨＨＤ遺伝子（α１、α２領域がＨＬＡ－Ａ＊０２：０１でα３領域以下がマウスＭＨＣクラスＩのキメラＨＬＡ－Ａ＊０２：０１遺伝子にヒトβ２－マイクログロブリン（β２－ｍ）遺伝子を融合した遺伝子）を導入した細胞株であるＲＭＡ－Ｓ－ＨＨＤ細胞（Ｐａｓｃｏｌｏ， Ｓ．， Ｂｅｒｖａｓ， Ｎ．， Ｕｒｅ， Ｊ．Ｍ．， Ｓｍｉｔｈ， Ａ．Ｇ．， Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ， Ｆ．Ａ．， Ｐｅｒａｒｎａｕ， Ｂ．，１９９７． ＨＬＡ－Ａ２．１－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＣＤ８＋ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ β２ ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ （β２ｍ） ＨＬＡ－Ａ２．１ ｍｏｎｏｃｈａｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｈ－２Ｄｂ β２ｍ ｄｏｕｂｌｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５， ２０４３－２０５１．）を用いた。なお、ＲＭＡ－Ｓ－ＨＨＤ細胞は、１０％ＦＣＳ及び５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含むＲＰＭＩ－１６４０培地で培養した。
【0088】
ＲＭＡ－Ｓ－ＨＨＤ細胞は、ＴＡＰ遺伝子が欠失しているため、自己ペプチドを結合していない、空のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１が細胞表面に発現する。ＲＭＡ－Ｓ－ＨＨＤ細胞を２６℃で培養すると、空のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１が安定し、抗ＨＬＡ－Ａ２モノクローナル抗体ＢＢ７．２（ＡＴＣＣ：Ｐａｒｈａｍ， Ｐ ａｎｄ Ｂｒｏｄｓｋｙ， ＦＭ （１９８１）． Ｐａｒｔｉａｌ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｏｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＢＢ７．２． Ａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ＨＬＡ－Ａ２ ａｎｄ ａ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ＨＬＡ－Ａ２８． Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３： ２７７－２９９．）で検出できるようになる。このときを、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１の発現の最大値とする。一方、３７℃では、空のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１は不安定であり、前記ＢＢ７．２は結合せず、検出することはできない。
【0089】
細胞外部に添加したペプチドが、空のＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に結合すると、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体を形成し、３７℃で安定化し、前記ＢＢ７．２で検出できる。この原理を利用し、形成されたＨＬＡ－Ａ＊０２：０１複合体量と添加したペプチドの濃度との関係から結合アフィニティを算出した。
【0090】
なお、ポジティブコントロールとして、インフルエンザＡウイルスのマトリックスタンパク質１（ＦＭＰ）由来のペプチド（ＦＭＰ５８－６６；ＦＭＰの５８～６６番目のアミノ酸からなる。配列は「ＧＩＬＦＧＶＦＴＬ」（配列番号８３））と、ＨＩＶ逆転写酵素由来のペプチド（ＨＩＶ ｐｏｌ；ＨＩＶ逆転写酵素の４７６～４８４番目のアミノ酸からなる。配列は「ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ」（配列番号８４））を用いた。
【0091】
具体的には、下記のようにして結合アフィニティを測定した。
（１） ＲＭＡ－Ｓ－ＨＨＤ細胞を２６℃、５％ＣＯ２で、１４～１６時間インキュベートした。
（２） ５０μＬのペプチドを様々な濃度（ＰＢＳで、２００μＭ、２０μＭ、２μＭ、０．２μＭ、０．０２μＭ、又は０μＭ。即ち、最終濃度は、１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、０．１μＭ、０．０１μＭ、又は０μＭ）で、Ｕ型９６ウェルプレートに入れた。
（３） ＲＭＡ－Ｓ－ＨＨＤ細胞懸濁液（２０％ＦＣＳを含むＰＢＳ中）５０μＬを加えた（２×１０５細胞／ウェル）。また、コントロール染色のために４～６ウェルを用意した。
（４） ２６℃で１時間インキュベートした。
（５） １０％ＦＣＳを含むＰＢＳを１００μＬ追加した。３７℃で、ＣＯ２インキュベーター内で、３時間インキュベートした。
（６） スピンダウンし、デカンテーションにより上清を取り除き、プレートをボルテックスした。
（７） 一次抗体であるＢＢ７．２を１００μＬ加え、氷上で３０分間インキュベートした。
（８） ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＣＳ及び０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で２回洗浄した。
（９） ＦＡＣＳバッファーで希釈した、ＦＩＴＣ標識二次抗体（ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体）を５０μＬ加えた。プレートをアルミホイルで覆い、氷上で３０分間インキュベートした。
（１０） ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。
（１１） １００μＬのＦＡＣＳ ｆｉｘ（１％ホルマリンを含むＦＡＣＳバッファー）で細胞を再懸濁した。
（１２） ＲＭＡ－Ｓ－ＨＨＤ細胞の表面に発現しているＨＬＡ－Ａ２＊０２：０１の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭ ＩＩ， ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により測定し、下記の式によって、相対結合率（％）として標準化した。また、５０％の相対結合率となる各ペプチドの濃度を、最大値の半分の結合レベル（ＢＬ５０）として計算した。実験は３回行い、その平均値を下記の表２－１～２－２に示した。
＜式＞
相対結合率（％）＝｛（Ａ－Ｂ）／（Ｃ－Ｂ）｝×１００
前記式中、「Ａ」は「各ペプチドでパルスされた細胞のＭＦＩ」、「Ｂ」は「ペプチドなしで、３７℃でインキュベートした細胞のＭＦＩ」、「Ｃ」は「ペプチドなしで、２６℃でインキュベートした細胞のＭＦＩ」を表す。
（１） ＲＭＡ－Ｓ－ＨＨＤ細胞を２６℃、５％ＣＯ２で、１４～１６時間インキュベートした。
（２） ５０μＬのペプチドを様々な濃度（ＰＢＳで、２００μＭ、２０μＭ、２μＭ、０．２μＭ、０．０２μＭ、又は０μＭ。即ち、最終濃度は、１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、０．１μＭ、０．０１μＭ、又は０μＭ）で、Ｕ型９６ウェルプレートに入れた。
（３） ＲＭＡ－Ｓ－ＨＨＤ細胞懸濁液（２０％ＦＣＳを含むＰＢＳ中）５０μＬを加えた（２×１０５細胞／ウェル）。また、コントロール染色のために４～６ウェルを用意した。
（４） ２６℃で１時間インキュベートした。
（５） １０％ＦＣＳを含むＰＢＳを１００μＬ追加した。３７℃で、ＣＯ２インキュベーター内で、３時間インキュベートした。
（６） スピンダウンし、デカンテーションにより上清を取り除き、プレートをボルテックスした。
（７） 一次抗体であるＢＢ７．２を１００μＬ加え、氷上で３０分間インキュベートした。
（８） ＦＡＣＳバッファー（２％ＦＣＳ及び０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で２回洗浄した。
（９） ＦＡＣＳバッファーで希釈した、ＦＩＴＣ標識二次抗体（ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体）を５０μＬ加えた。プレートをアルミホイルで覆い、氷上で３０分間インキュベートした。
（１０） ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。
（１１） １００μＬのＦＡＣＳ ｆｉｘ（１％ホルマリンを含むＦＡＣＳバッファー）で細胞を再懸濁した。
（１２） ＲＭＡ－Ｓ－ＨＨＤ細胞の表面に発現しているＨＬＡ－Ａ２＊０２：０１の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭ ＩＩ， ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により測定し、下記の式によって、相対結合率（％）として標準化した。また、５０％の相対結合率となる各ペプチドの濃度を、最大値の半分の結合レベル（ＢＬ５０）として計算した。実験は３回行い、その平均値を下記の表２－１～２－２に示した。
＜式＞
相対結合率（％）＝｛（Ａ－Ｂ）／（Ｃ－Ｂ）｝×１００
前記式中、「Ａ」は「各ペプチドでパルスされた細胞のＭＦＩ」、「Ｂ」は「ペプチドなしで、３７℃でインキュベートした細胞のＭＦＩ」、「Ｃ」は「ペプチドなしで、２６℃でインキュベートした細胞のＭＦＩ」を表す。
【0092】
下記の表２－１～２－２中、「結合レベル」は、下記の評価基準にしたがって評価した。
高 ・・・ ＢＬ５０が１０μＭ未満
中 ・・・ ＢＬ５０が１０μＭ以上１００μＭ以下
低 ・・・ ＢＬ５０が１００μＭ超、又はＮＤ（検出できなかった）。
高 ・・・ ＢＬ５０が１０μＭ未満
中 ・・・ ＢＬ５０が１０μＭ以上１００μＭ以下
低 ・・・ ＢＬ５０が１００μＭ超、又はＮＤ（検出できなかった）。
【0093】
【表2-1】
【0094】
【表2-2】
【0095】
（試験例４：ペプチド内包リポソームの製造）
試験例３において、結合レベルが「中」又は「高」だったペプチドについて、下記のようにして、ペプチド内包リポソームを製造した。
リポソームカプセル化キットであるリポカプセレーター（Ｌｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ） ＦＤ－Ｕ ＰＬ（株式会社ヒュギエイアバイオサイエンス）を用い、キットの指示書をわずかに変更した以外はキットの指示書に従って、ペプチド内包リポソームを調製した。簡単に説明すると、上記ペプチドのそれぞれを最終濃度が１０ｍＭとなるように、ＤＭＳＯに溶かした。同量の４～５種類の１０ｍＭのペプチドを混合して合計１００μＬとし、１．９ｍＬのＨ２Ｏで希釈した。ペプチドの混合溶液を１０ｍｇの乾燥リポソームを含むＬｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒのバイアルに加え、室温で１５分間インキュベートし、ペプチド内包リポソームを含む溶液を得た。
試験例３において、結合レベルが「中」又は「高」だったペプチドについて、下記のようにして、ペプチド内包リポソームを製造した。
リポソームカプセル化キットであるリポカプセレーター（Ｌｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒ） ＦＤ－Ｕ ＰＬ（株式会社ヒュギエイアバイオサイエンス）を用い、キットの指示書をわずかに変更した以外はキットの指示書に従って、ペプチド内包リポソームを調製した。簡単に説明すると、上記ペプチドのそれぞれを最終濃度が１０ｍＭとなるように、ＤＭＳＯに溶かした。同量の４～５種類の１０ｍＭのペプチドを混合して合計１００μＬとし、１．９ｍＬのＨ２Ｏで希釈した。ペプチドの混合溶液を１０ｍｇの乾燥リポソームを含むＬｉｐｏｃａｐｓｕｌａｔｅｒのバイアルに加え、室温で１５分間インキュベートし、ペプチド内包リポソームを含む溶液を得た。
【0096】
（試験例５）
＜マウスへの免疫＞
マウスには、マウスＭＨＣクラスＩとβ２－マイクログロブリン（β２－ｍ）をノックアウトしたマウスに、ＨＨＤ遺伝子（α１、α２領域がＨＬＡ－Ａ＊０２：０１でα３領域以下がマウスＭＨＣクラスＩのキメラＨＬＡ－Ａ＊０２：０１遺伝子にヒトβ２－ｍ遺伝子を融合した遺伝子）を導入したＨＨＤ ＩＩマウス（フランス・パスツール研究所、Ｆ． Ａ． Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ博士より供与された。）を用いた。６～１０週齢のマウスをすべての実験に使用した。
＜マウスへの免疫＞
マウスには、マウスＭＨＣクラスＩとβ２－マイクログロブリン（β２－ｍ）をノックアウトしたマウスに、ＨＨＤ遺伝子（α１、α２領域がＨＬＡ－Ａ＊０２：０１でα３領域以下がマウスＭＨＣクラスＩのキメラＨＬＡ－Ａ＊０２：０１遺伝子にヒトβ２－ｍ遺伝子を融合した遺伝子）を導入したＨＨＤ ＩＩマウス（フランス・パスツール研究所、Ｆ． Ａ． Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ博士より供与された。）を用いた。６～１０週齢のマウスをすべての実験に使用した。
【0097】
マウスへの免疫は、マウスの足蹠（ｆｏｏｔ ｐａｄ）に、ＣｐＧ－ＯＤＮ（５００２；配列５’－ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＴＴＧＡＴＧＴＴ－３’（配列番号８５）；北海道システムサイエンス株式会社）（５μｇ／マウス）と共に各ペプチド内包リポソーム（１００μＬ／マウス）を１週間間隔で２回（又は１回）皮下投与して行った。
【0098】
＜細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）（ＩＦＮ－γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の検出）＞
下記のようにして、ＩＦＮ－γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の検出を行い、ＣＴＬ誘導活性を調べた。
（１） 免疫１週間後、免疫したマウスから脾臓細胞を調製した。
（２） Ｒ１０で脾臓細胞を２×１０７細胞／ｍＬとなるように再懸濁した。
（３） Ｕ型の９６ウェルプレートの各ウェルに、抗原ペプチド（最終濃度５０μＭ）を含む又は含まないＲ１０を１００μＬ加えた。
（４） 各ウェルに、１：２５に希釈したブレフェルディンＡ（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５μＬを加えた。
（５） 各ウェルに、１００μＬの細胞懸濁液を加えた。
（６） ３７℃で５時間インキュベートした。
（７） ４℃で３０分間、０．５μｇのＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含む５０μＬのＦＡＣＳバッファーで細胞を染色した。
（８） ２００μＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。
（９） １ウェルあたり１００μＬのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、４℃で２０分間、細胞を再懸濁した。
（１０） ２００μＬの１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞を２回洗浄した。
（１１） ０．５μｇのＰＥ－標識抗マウスＩＦＮ－γ抗体を含む５０μＬの１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液に固定及び浸透化処理した細胞を再懸濁し、４℃で３０分間、インキュベートした。
（１２） ２００μＬの１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液で細胞を２回洗浄し、１００μＬのＦＡＣＳ ｆｉｘバッファーに再懸濁した。
（１３） フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭ ＩＩ， ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を行った。結果を表３－１～３－３に示す。
下記のようにして、ＩＦＮ－γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の検出を行い、ＣＴＬ誘導活性を調べた。
（１） 免疫１週間後、免疫したマウスから脾臓細胞を調製した。
（２） Ｒ１０で脾臓細胞を２×１０７細胞／ｍＬとなるように再懸濁した。
（３） Ｕ型の９６ウェルプレートの各ウェルに、抗原ペプチド（最終濃度５０μＭ）を含む又は含まないＲ１０を１００μＬ加えた。
（４） 各ウェルに、１：２５に希釈したブレフェルディンＡ（ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５μＬを加えた。
（５） 各ウェルに、１００μＬの細胞懸濁液を加えた。
（６） ３７℃で５時間インキュベートした。
（７） ４℃で３０分間、０．５μｇのＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含む５０μＬのＦＡＣＳバッファーで細胞を染色した。
（８） ２００μＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。
（９） １ウェルあたり１００μＬのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、４℃で２０分間、細胞を再懸濁した。
（１０） ２００μＬの１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞を２回洗浄した。
（１１） ０．５μｇのＰＥ－標識抗マウスＩＦＮ－γ抗体を含む５０μＬの１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液に固定及び浸透化処理した細胞を再懸濁し、４℃で３０分間、インキュベートした。
（１２） ２００μＬの１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液で細胞を２回洗浄し、１００μＬのＦＡＣＳ ｆｉｘバッファーに再懸濁した。
（１３） フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭ ＩＩ， ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を行った。結果を表３－１～３－３に示す。
【0099】
下記の表３－１～３－３中、「ＩＣＳ」は、ＣＤ８＋細胞全体に占めるＩＦＮ－γ陽性細胞の割合を下記の評価基準にしたがって評価した結果を示す。また、評価結果が、（＋＋＋）、（＋＋）、又は（＋）だった１８種のペプチドについての分析結果を図１～１８に併せて示す。
－評価基準－
ペプチドを加えた場合のＣＤ８＋細胞全体に占めるＩＦＮ－γ陽性細胞の割合（％）から、ペプチドを加えていない場合のＣＤ８＋細胞全体に占めるＩＦＮ－γ陽性細胞の割合（％）を引いた値（以下、「Ａ」と称することがある）を算出し、下記の評価基準にしたがって評価した。
（＋＋＋） ・・・ 前記Ａが、１０％以上
（＋＋） ・・・ 前記Ａが、５％以上１０％未満
（＋） ・・・ 前記Ａが、１％以上５％未満
（±） ・・・ 前記Ａが、０．５％以上１％未満
（－） ・・・ 前記Ａが、０．５％未満
－評価基準－
ペプチドを加えた場合のＣＤ８＋細胞全体に占めるＩＦＮ－γ陽性細胞の割合（％）から、ペプチドを加えていない場合のＣＤ８＋細胞全体に占めるＩＦＮ－γ陽性細胞の割合（％）を引いた値（以下、「Ａ」と称することがある）を算出し、下記の評価基準にしたがって評価した。
（＋＋＋） ・・・ 前記Ａが、１０％以上
（＋＋） ・・・ 前記Ａが、５％以上１０％未満
（＋） ・・・ 前記Ａが、１％以上５％未満
（±） ・・・ 前記Ａが、０．５％以上１％未満
（－） ・・・ 前記Ａが、０．５％未満
【0100】
【表3-1】
【0101】
【表3-2】
【0102】
【表3-3】
【0103】
＜Ｉｎ ｖｉｖｏ ＣＴＬアッセイ＞
上記した細胞内サイトカイン染色において、評価結果が、（＋＋＋）、（＋＋）、又は（＋）だった１８種のペプチドについて、下記のようにして、Ｉｎ ｖｉｖｏ ＣＴＬアッセイを行い、ＣＴＬ応答活性を調べた。
（１） ナイーブマウスから脾臓細胞を調製した。
（２） ２ｍＬのＲＰＭＩで合計２×１０８細胞を再懸濁し、２本のチューブそれぞれにこの懸濁液の１ｍＬのアリコットを入れた。
（３） 最終濃度５０μＭでペプチドを一方のチューブに入れ、両方のチューブを３７℃で１～２時間インキュベートした。
（４） １０ｍＬのＲＰＭＩで細胞を１回洗浄し、遠心分離し、上清を除去した。
（５） ２０ｍＬのＰＢＳ／０．１％ ＢＳＡで各細胞ペレットを再懸濁し、短時間ボルテックスした。
（６） １０μＬの５ｍＭ ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を、ペプチドをパルスした細胞懸濁液に加え、すぐにボルテックスした。
（７） ペプチドとインキュベートしなかった細胞のチューブに、１μＬの５ｍＭ ＣＦＳＥを加え、すぐにボルテックスした。
（８） 両方のチューブを３７℃のウォーターバスで１０分間インキュベートした。
（９） 両方のチューブを遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＬのＲＰＭＩを加えて細胞を１回洗浄し、スピンし、上清を除去した。次いで、生細胞数を数えた。
（１０） それぞれの細胞集団を５×１０７細胞／ｍＬとなるようにＲＰＭＩに再懸濁した。
（１１） 各細胞懸濁液を等量（等しい細胞数）ずつ混ぜ、２００μＬ（１×１０７細胞／マウス）の混合細胞懸濁液を予め免疫した各レシピエントマウスに静脈内注入した。
（１２） 細胞注入から１６時間後、マウスから脾臓細胞を回収した。
（１３） 脾臓細胞を懸濁した細胞懸濁液をＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭ ＩＩ， ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を行った。結果を表４に示す。
上記した細胞内サイトカイン染色において、評価結果が、（＋＋＋）、（＋＋）、又は（＋）だった１８種のペプチドについて、下記のようにして、Ｉｎ ｖｉｖｏ ＣＴＬアッセイを行い、ＣＴＬ応答活性を調べた。
（１） ナイーブマウスから脾臓細胞を調製した。
（２） ２ｍＬのＲＰＭＩで合計２×１０８細胞を再懸濁し、２本のチューブそれぞれにこの懸濁液の１ｍＬのアリコットを入れた。
（３） 最終濃度５０μＭでペプチドを一方のチューブに入れ、両方のチューブを３７℃で１～２時間インキュベートした。
（４） １０ｍＬのＲＰＭＩで細胞を１回洗浄し、遠心分離し、上清を除去した。
（５） ２０ｍＬのＰＢＳ／０．１％ ＢＳＡで各細胞ペレットを再懸濁し、短時間ボルテックスした。
（６） １０μＬの５ｍＭ ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を、ペプチドをパルスした細胞懸濁液に加え、すぐにボルテックスした。
（７） ペプチドとインキュベートしなかった細胞のチューブに、１μＬの５ｍＭ ＣＦＳＥを加え、すぐにボルテックスした。
（８） 両方のチューブを３７℃のウォーターバスで１０分間インキュベートした。
（９） 両方のチューブを遠心分離し、上清を除去した。１０ｍＬのＲＰＭＩを加えて細胞を１回洗浄し、スピンし、上清を除去した。次いで、生細胞数を数えた。
（１０） それぞれの細胞集団を５×１０７細胞／ｍＬとなるようにＲＰＭＩに再懸濁した。
（１１） 各細胞懸濁液を等量（等しい細胞数）ずつ混ぜ、２００μＬ（１×１０７細胞／マウス）の混合細胞懸濁液を予め免疫した各レシピエントマウスに静脈内注入した。
（１２） 細胞注入から１６時間後、マウスから脾臓細胞を回収した。
（１３） 脾臓細胞を懸濁した細胞懸濁液をＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭ ＩＩ， ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を行った。結果を表４に示す。
【0104】
下記の表４中、「Ｋｉｌｌｉｎｇ」は、ＣＴＬによる標的細胞のペプチド特異的溶解率（％）を示す。なお、ＣＴＬによる標的細胞のペプチド特異的溶解率（％）は、下記の式から算出した。
＜式＞
ＣＴＬによる標的細胞のペプチド特異的溶解率（％）＝［１－｛（Ａ）÷（Ｂ）｝÷｛（Ｃ）÷（Ｄ）｝］×１００
式中、（Ａ）は「非免疫マウスにおける低濃度ＣＦＳＥで染色した細胞の数」を表し、（Ｂ）は「非免疫マウスにおける高濃度ＣＦＳＥで染色した細胞の数」を表し、（Ｃ）は「免疫したマウスにおける低濃度ＣＦＳＥで染色した細胞の数」を表し、（Ｄ）は「免疫したマウスにおける高濃度ＣＦＳＥで染色した細胞の数」を表す。
＜式＞
ＣＴＬによる標的細胞のペプチド特異的溶解率（％）＝［１－｛（Ａ）÷（Ｂ）｝÷｛（Ｃ）÷（Ｄ）｝］×１００
式中、（Ａ）は「非免疫マウスにおける低濃度ＣＦＳＥで染色した細胞の数」を表し、（Ｂ）は「非免疫マウスにおける高濃度ＣＦＳＥで染色した細胞の数」を表し、（Ｃ）は「免疫したマウスにおける低濃度ＣＦＳＥで染色した細胞の数」を表し、（Ｄ）は「免疫したマウスにおける高濃度ＣＦＳＥで染色した細胞の数」を表す。
【0105】
【表4】
【0106】
（試験例６）
試験例５の＜細胞内サイトカイン検出＞において評価結果が良好であった１０種類のペプチド（配列番号２、４、１６、３５、５３、６４、６７、７０、７１、又は７２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド））を等量含むペプチド内包リポソーム溶液を試験例４と同様にして調製した。
前記ペプチド内包リポソーム溶液（１００μＬ／マウス）を用い、投与回数を１回とした以外は、試験例５と同様にして、９匹のマウスを免疫した。
免疫１週間後にマウスから脾臓細胞を調製し、試験例５と同様にして、細胞内サイトカイン染色を行った。結果を図１９に示す。
図１９中、横軸は抗原ペプチドの配列番号を表し、縦軸はペプチドを加えた場合のＣＤ８＋細胞全体に占めるＩＦＮ－γ陽性細胞の割合（％）から、ペプチドを加えていない場合のＣＤ８＋細胞全体に占めるＩＦＮ－γ陽性細胞の割合（％）を引いた値を表し、グラフ中の「○」はマウス１匹における数値を表し、「－」は平均値を表す。
試験例５の＜細胞内サイトカイン検出＞において評価結果が良好であった１０種類のペプチド（配列番号２、４、１６、３５、５３、６４、６７、７０、７１、又は７２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド））を等量含むペプチド内包リポソーム溶液を試験例４と同様にして調製した。
前記ペプチド内包リポソーム溶液（１００μＬ／マウス）を用い、投与回数を１回とした以外は、試験例５と同様にして、９匹のマウスを免疫した。
免疫１週間後にマウスから脾臓細胞を調製し、試験例５と同様にして、細胞内サイトカイン染色を行った。結果を図１９に示す。
図１９中、横軸は抗原ペプチドの配列番号を表し、縦軸はペプチドを加えた場合のＣＤ８＋細胞全体に占めるＩＦＮ－γ陽性細胞の割合（％）から、ペプチドを加えていない場合のＣＤ８＋細胞全体に占めるＩＦＮ－γ陽性細胞の割合（％）を引いた値を表し、グラフ中の「○」はマウス１匹における数値を表し、「－」は平均値を表す。
【0107】
以上の結果から、配列番号２、３、４、５、９、１３、１６、２０、３５、５２、５３、５８、６３、６４、６７、７０、７１、及び７２のいずれかで表されるアミノ酸配列が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ＣＴＬ抗原エピトープであることが確認された。これらの中でも、配列番号２、４、１６、３５、５３、６４、６７、７０、７１、及び７２のいずれかで表されるアミノ酸配列が好ましく、配列番号２、４、１６、及び７２のいずれかで表されるアミノ酸配列がより好ましいことが確認された。
【0108】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞ 配列番号２、３、４、５、９、１３、１６、２０、３５、５２、５３、５８、６３、６４、６７、７０、７１、及び７２からなる群から選択されるいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなり、
ＨＬＡ－Ａ２分子に結合でき、かつ細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しさらに細胞傷害性Ｔ細胞に認識されることを特徴とするペプチドである。
＜２＞ 前記＜１＞に記載のペプチドをコードする塩基配列からなることを特徴とする核酸分子である。
＜３＞ 前記＜２＞に記載の核酸分子を含むことを特徴とするベクターである。
＜４＞ 前記＜１＞に記載のペプチドを内包することを特徴とするペプチド内包リポソームである。
＜５＞ 前記＜１＞に記載のペプチドと、ＨＬＡ－Ａ２分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を製造するための抗原提示細胞製造用剤であって、
前記＜１＞に記載のペプチド、前記＜３＞に記載のベクター、及び前記＜４＞に記載のペプチド内包リポソームからなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする抗原提示細胞製造用剤である。
＜６＞ 前記＜１＞に記載のペプチドと、ＨＬＡ－Ａ２分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞の製造方法であって、
ＨＬＡ－Ａ２分子を発現する細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて前記＜５＞に記載の抗原提示細胞製造用剤と接触させることを含むことを特徴とする抗原提示細胞の製造方法である。
＜７＞ 前記ＨＬＡ－Ａ２分子を発現する細胞が、自己由来である前記＜６＞に記載の抗原提示細胞の製造方法である。
＜８＞ 前記ＨＬＡ－Ａ２分子を発現する細胞が、同種由来である前記＜６＞に記載の抗原提示細胞の製造方法である。
＜９＞ 前記＜１＞に記載のペプチド、前記＜２＞に記載の核酸分子、前記＜３＞に記載のベクター、前記＜４＞に記載のペプチド内包リポソーム、及び前記＜６＞から＜８＞のいずれかに記載の製造方法で製造された抗原提示細胞からなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする新型コロナウイルス感染症の予防又は治療用医薬組成物である。
＜１０＞ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染を予防するためのワクチンである前記＜９＞に記載の新型コロナウイルス感染症の予防又は治療用医薬組成物である。
＜１１＞ 更に、アジュバントを含む前記＜１０＞に記載の新型コロナウイルス感染症の予防又は治療用医薬組成物である。
＜１２＞ 前記＜１＞に記載のペプチド、前記＜４＞に記載のペプチド内包リポソーム、及び前記＜６＞から＜８＞のいずれかに記載の製造方法で製造された抗原提示細胞からなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤である。
＜１３＞ 更に、アジュバントを含む前記＜１２＞に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤である。
＜１４＞ ＨＬＡ－Ａ２陽性の新型コロナウイルス感染症患者より採取された末梢血単核球細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて前記＜１２＞から＜１３＞のいずれかに記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤と接触させることを含むことを特徴とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法である。
＜１５＞ 前記＜１＞に記載のペプチドとＨＬＡ－Ａ２分子との複合体の四量体であることを特徴とするテトラマーである。
＜１６＞ 新型コロナウイルス感染症を予防又は治療するための方法であって、個体に、前記＜９＞から＜１１＞のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを特徴とする方法である。
＜１７＞ 新型コロナウイルス感染症を予防又は治療するための方法であって、個体に、前記＜１４＞に記載の方法で誘導されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を投与することを特徴とする方法である。
＜１８＞ 前記＜１５＞に記載のテトラマーを用いることを含むことを特徴とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の検出方法である。
＜１９＞ 新型コロナウイルス感染症の病状を評価するためのデータを収集する方法であって、
前記＜１５＞に記載のテトラマーを用いて被検体由来の試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の量を測定することを含むことを特徴とする方法である。
＜２０＞ 新型コロナウイルス感染症の病状を評価するための方法であって、
被検体由来の試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の量を指標とすることを含み、
前記被検体由来の試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の量が、前記＜１５＞に記載のテトラマーを用いて測定されたものであることを特徴とする方法である。
＜１＞ 配列番号２、３、４、５、９、１３、１６、２０、３５、５２、５３、５８、６３、６４、６７、７０、７１、及び７２からなる群から選択されるいずれかの配列番号で表されるアミノ酸配列からなり、
ＨＬＡ－Ａ２分子に結合でき、かつ細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しさらに細胞傷害性Ｔ細胞に認識されることを特徴とするペプチドである。
＜２＞ 前記＜１＞に記載のペプチドをコードする塩基配列からなることを特徴とする核酸分子である。
＜３＞ 前記＜２＞に記載の核酸分子を含むことを特徴とするベクターである。
＜４＞ 前記＜１＞に記載のペプチドを内包することを特徴とするペプチド内包リポソームである。
＜５＞ 前記＜１＞に記載のペプチドと、ＨＬＡ－Ａ２分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞を製造するための抗原提示細胞製造用剤であって、
前記＜１＞に記載のペプチド、前記＜３＞に記載のベクター、及び前記＜４＞に記載のペプチド内包リポソームからなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする抗原提示細胞製造用剤である。
＜６＞ 前記＜１＞に記載のペプチドと、ＨＬＡ－Ａ２分子との複合体を細胞表面に提示する抗原提示細胞の製造方法であって、
ＨＬＡ－Ａ２分子を発現する細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて前記＜５＞に記載の抗原提示細胞製造用剤と接触させることを含むことを特徴とする抗原提示細胞の製造方法である。
＜７＞ 前記ＨＬＡ－Ａ２分子を発現する細胞が、自己由来である前記＜６＞に記載の抗原提示細胞の製造方法である。
＜８＞ 前記ＨＬＡ－Ａ２分子を発現する細胞が、同種由来である前記＜６＞に記載の抗原提示細胞の製造方法である。
＜９＞ 前記＜１＞に記載のペプチド、前記＜２＞に記載の核酸分子、前記＜３＞に記載のベクター、前記＜４＞に記載のペプチド内包リポソーム、及び前記＜６＞から＜８＞のいずれかに記載の製造方法で製造された抗原提示細胞からなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする新型コロナウイルス感染症の予防又は治療用医薬組成物である。
＜１０＞ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染を予防するためのワクチンである前記＜９＞に記載の新型コロナウイルス感染症の予防又は治療用医薬組成物である。
＜１１＞ 更に、アジュバントを含む前記＜１０＞に記載の新型コロナウイルス感染症の予防又は治療用医薬組成物である。
＜１２＞ 前記＜１＞に記載のペプチド、前記＜４＞に記載のペプチド内包リポソーム、及び前記＜６＞から＜８＞のいずれかに記載の製造方法で製造された抗原提示細胞からなる群から選択される少なくとも１つを含むことを特徴とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤である。
＜１３＞ 更に、アジュバントを含む前記＜１２＞に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤である。
＜１４＞ ＨＬＡ－Ａ２陽性の新型コロナウイルス感染症患者より採取された末梢血単核球細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて前記＜１２＞から＜１３＞のいずれかに記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞誘導剤と接触させることを含むことを特徴とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法である。
＜１５＞ 前記＜１＞に記載のペプチドとＨＬＡ－Ａ２分子との複合体の四量体であることを特徴とするテトラマーである。
＜１６＞ 新型コロナウイルス感染症を予防又は治療するための方法であって、個体に、前記＜９＞から＜１１＞のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを特徴とする方法である。
＜１７＞ 新型コロナウイルス感染症を予防又は治療するための方法であって、個体に、前記＜１４＞に記載の方法で誘導されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を投与することを特徴とする方法である。
＜１８＞ 前記＜１５＞に記載のテトラマーを用いることを含むことを特徴とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の検出方法である。
＜１９＞ 新型コロナウイルス感染症の病状を評価するためのデータを収集する方法であって、
前記＜１５＞に記載のテトラマーを用いて被検体由来の試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の量を測定することを含むことを特徴とする方法である。
＜２０＞ 新型コロナウイルス感染症の病状を評価するための方法であって、
被検体由来の試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の量を指標とすることを含み、
前記被検体由来の試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的なＨＬＡ－Ａ２拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の量が、前記＜１５＞に記載のテトラマーを用いて測定されたものであることを特徴とする方法である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】