(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022180013
(43)【公開日】2022-12-06
(54)【発明の名称】酵母用培地
(51)【国際特許分類】
C12N 1/16 20060101AFI20221129BHJP
【ＦＩ】
C12N1/16 D
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021086889
(22)【出願日】2021-05-24
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】518148478
【氏名又は名称】シーシーアイホールディングス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100162396
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 泰之
(74)【代理人】
【識別番号】100194803
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 理弘
(72)【発明者】
【氏名】若尾 保乃佳
(72)【発明者】
【氏名】尾崎 弘貴
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA72X
4B065AC20
4B065BB08
4B065BB19
4B065BB20
4B065BB23
4B065BC12
4B065CA55
4B065CA56
(57)【要約】
【課題】アステロトレメラ・ヒュミコラ２－１４１－１株を、迅速に培養することができ、増えた菌体濃度を維持することができる培地を提供すること。
【解決手段】炭素源、窒素源、フマル酸、アスコルビン酸を含み、
受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２６４１として寄託された酵母菌２－１４１－１株用である酵母用培地。
【選択図】なし
【解決手段】炭素源、窒素源、フマル酸、アスコルビン酸を含み、
受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２６４１として寄託された酵母菌２－１４１－１株用である酵母用培地。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
炭素源、窒素源、フマル酸、アスコルビン酸を含み、
受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２６４１として寄託された酵母菌２－１４１－１株用であることを特徴とする酵母用培地。
受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２６４１として寄託された酵母菌２－１４１－１株用であることを特徴とする酵母用培地。
【請求項2】
抗菌剤として、白子由来タンパク質を含むことを特徴とする請求項１に記載の酵母用培地。
【請求項3】
フマル酸濃度が、０．０３重量％以上０．６重量％以下であることを特徴とする請求項１または２に記載の酵母用培地。
【請求項4】
アスコルビン酸濃度が、０．０３重量％以上１．０重量％以下であることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載の酵母用培地。
【請求項5】
炭素源、窒素源、フマル酸、アスコルビン酸、クエン酸、クエン酸塩を含む粉末状であり、
受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２６４１として寄託された酵母菌２－１４１－１株用であることを特徴とする粉末培地。
受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２６４１として寄託された酵母菌２－１４１－１株用であることを特徴とする粉末培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、酵母菌の一種であるアステロトレメラ・ヒュミコラ２－１４１－１株用の培地に関する。
【背景技術】
【0002】
食品工場等からの排水（廃水）には多量の油脂が含まれている場合がある。日本国では、下水道法、水質汚濁防止法により、事業所からの排水に含まれる油脂の量について基準が定められており、油分分離槽や流動調整槽などの処理槽を備える除害施設が設けられている。
除害施設は、除去性能を維持するために定期的に集積した油脂を取り除く必要があり、手間とコストがかかる。そこで、処理槽に集積した油脂を減量してメンテナンス頻度を少なくするために、集積した油脂を微生物で生分解する方法が検討されている。
除害施設は、除去性能を維持するために定期的に集積した油脂を取り除く必要があり、手間とコストがかかる。そこで、処理槽に集積した油脂を減量してメンテナンス頻度を少なくするために、集積した油脂を微生物で生分解する方法が検討されている。
【0003】
排水は、排出される食品残渣等によってｐＨが大きく変化する場合がある。そのため、油脂を生分解するための微生物には、広範なｐＨ（例えば、ｐＨ２．０以上１１．０未満）の水質環境においても油脂を分解できることが求められる。そして、出願人は、ｐＨ２以上１１未満という広範な条件下において、油脂を分解できる酵母であるアステロトレメラ・ヒュミコラ（Ａｓｔｅｒｏｔｒｅｍｅｌｌａ ｈｕｍｉｃｏｌａ）２－１４１－１株（受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２６４１、以下、２－１４１－１株ともいう）を報告している（特許文献１）。
【0004】
ここで、処理槽中の２－１４１－１株を投入した場合、２－１４１－１株は、排水とともに少しずつ流出するため、定期的に一定量の２－１４１－１株を処理槽に投入する必要がある。そのため、投入する菌体量を確保するために培養を行う必要がある。
そして、培養の頻度を減らすために、短い期間で菌体を増やすことができ、かつ、培養した菌体濃度を１週間程度維持できることが求められる。
そして、培養の頻度を減らすために、短い期間で菌体を増やすことができ、かつ、培養した菌体濃度を１週間程度維持できることが求められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２０１９／２２０８３１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、アステロトレメラ・ヒュミコラ２－１４１－１株を、迅速に培養することができ、増えた菌体濃度を維持することができる培地を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
１．炭素源、窒素源、フマル酸、アスコルビン酸を含み、
受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２６４１として寄託された酵母菌２－１４１－１株用であることを特徴とする酵母用培地。
２．抗菌剤として、白子由来タンパク質を含むことを特徴とする１．に記載の酵母用培地。
３．フマル酸濃度が、０．０３重量％以上０．６重量％以下であることを特徴とする１．または２．に記載の酵母用培地。
４．アスコルビン酸濃度が、０．０３重量％以上１．０重量％以下であることを特徴とする１．～３．のいずれかに記載の酵母用培地。
５．炭素源、窒素源、フマル酸、アスコルビン酸、クエン酸、クエン酸塩を含む粉末状であり、
受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２６４１として寄託された酵母菌２－１４１－１株用であることを特徴とする粉末培地。
受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２６４１として寄託された酵母菌２－１４１－１株用であることを特徴とする酵母用培地。
２．抗菌剤として、白子由来タンパク質を含むことを特徴とする１．に記載の酵母用培地。
３．フマル酸濃度が、０．０３重量％以上０．６重量％以下であることを特徴とする１．または２．に記載の酵母用培地。
４．アスコルビン酸濃度が、０．０３重量％以上１．０重量％以下であることを特徴とする１．～３．のいずれかに記載の酵母用培地。
５．炭素源、窒素源、フマル酸、アスコルビン酸、クエン酸、クエン酸塩を含む粉末状であり、
受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２６４１として寄託された酵母菌２－１４１－１株用であることを特徴とする粉末培地。
【発明の効果】
【0008】
本発明の酵母用培地により、アステロトレメラ・ヒュミコラ２－１４１－１株を、迅速に増やすことができ、さらに、その増えた菌体濃度を１週間程度維持することができる。本発明の酵母用培地は、コンタミネーション（雑菌の繁殖）が起こりにくく、２－１４１－１株の培養に適している。本発明の酵母用培地により、アステロトレメラ・ヒュミコラ２－１４１－１株を迅速に増やすことができ、その高い菌体濃度を１週間程度維持することができるため、例えば、１週間に一度培養を仕込み、この培養液から毎日一定量を処理槽に投入することにより、高い生分解処理能力を維持することができる。そのため、培養を仕込む頻度を少なくすることができる。
本発明の粉末培地は、乾燥した状態で長期間保管することができ、必要なときは水に溶解して使用することができる。
本発明の粉末培地は、乾燥した状態で長期間保管することができ、必要なときは水に溶解して使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本発明は、ＮＩＴＥ ＢＰ－０２６４１として寄託された酵母菌であるアステロトレメラ・ヒュミコラ２－１４１－１株用の培地に関する。
なお、本明細書において、「Ａ～Ｂ」（Ａ、Ｂは数値）との記載は、Ａ以上Ｂ以下を意味する。
なお、本明細書において、「Ａ～Ｂ」（Ａ、Ｂは数値）との記載は、Ａ以上Ｂ以下を意味する。
【0010】
（２－１４１－１株）
アステロトレメラ・ヒュミコラ（Ａｓｔｅｒｏｔｒｅｍｅｌｌａ ｈｕｍｉｃｏｌａ）２－１４１－１株は、ＮＩＴＥ ＢＰ－０２６４１として、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８（郵便番号２９２－０８１８））に、２０１８年２月２１日付で国際寄託されている。
アステロトレメラ・ヒュミコラ（Ａｓｔｅｒｏｔｒｅｍｅｌｌａ ｈｕｍｉｃｏｌａ）２－１４１－１株は、ＮＩＴＥ ＢＰ－０２６４１として、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８（郵便番号２９２－０８１８））に、２０１８年２月２１日付で国際寄託されている。
【0011】
２－１４１－１株は、菜種油：大豆油＝１：１（ｗ／ｗ）の混合物である油脂を１％（ｗ／ｖ）含む排水に対し、１．５×１０６ＣＦＵ／ｍＬの接種量で、ｐＨ２以上１１未満かつ１５～３５℃の範囲内において２４時間で５０重量％以上の油脂を分解することができ、ｐＨ２．５以上９．０以下かつ３０℃において２４時間で９０重量％以上の油脂を分解することができる。
処理槽では、排水とともに少しずつ菌が流出して減少するため、菌体を定期的に補給する必要があるが、２－１４１－１株は、補給してわずか２４時間以内に高い油脂減少率を示すことができるため、実用性に非常に優れている。
処理槽では、排水とともに少しずつ菌が流出して減少するため、菌体を定期的に補給する必要があるが、２－１４１－１株は、補給してわずか２４時間以内に高い油脂減少率を示すことができるため、実用性に非常に優れている。
【0012】
（培地）
本発明の酵母用培地は、２－１４１－１株用であり、炭素源、窒素源、フマル酸、アスコルビン酸を含む。
・炭素源
炭素源は、２－１４１－１株が資化できる炭素源であれば特に制限することなく使用することができる。具体的には、グルコース、フラクトース、セロビオース、ラフィノース、キシロース、マルトース、ガラクトース、ソルボース、グルコサミン、リボース、アラビノース、ラムノース、スクロース、トレハロース、α－メチル－Ｄ－グルコシド、サリシン、メリビオース、ラクトース、メレジトース、イヌリン、エリスリトール、リビトール、キシリトール、グルシトール、マンニトール、ガラクチトール、イノシトール、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、デンプン、デンプン加水分解物、糖蜜、廃糖蜜等の糖類、麦、米等の天然物、グリセロール、メタノール、エタノール等のアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸、グルコン酸、グルクロン酸、ピルビン酸、クエン酸等の有機酸類、ヘキサデカン等の炭化水素などが挙げられ、１種または２種以上を混合して使用することができる。これらの中で、グルコース、ガラクトース、ソルボース、グルコサミン、アラビノース、ラムノース、スクロース、マルトース、トレハロース、α－メチル－Ｄ－グルコシド、セロビオース、サリシン、メリビオース、ラクトース、メレジトース、デンプン加水分解物、グリセロール、エリスリトール、リビトール、キシリトール、グルシトール、マンニトール、ガラクチトール、イノシトール、グルコン酸、グルクロン酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、グルコン酸、エタノールが好ましい。
炭素源の配合量（２種以上用いる場合はその合計量）は、酵母培養用培地全量に対して、例えば０．０１～２０．０ｗ／ｖ％であり、好ましくは０．１～１０．０ｗ／ｖ％であり、より好ましくは０．５～３．０ｗ／ｖ％である。
本発明の酵母用培地は、２－１４１－１株用であり、炭素源、窒素源、フマル酸、アスコルビン酸を含む。
・炭素源
炭素源は、２－１４１－１株が資化できる炭素源であれば特に制限することなく使用することができる。具体的には、グルコース、フラクトース、セロビオース、ラフィノース、キシロース、マルトース、ガラクトース、ソルボース、グルコサミン、リボース、アラビノース、ラムノース、スクロース、トレハロース、α－メチル－Ｄ－グルコシド、サリシン、メリビオース、ラクトース、メレジトース、イヌリン、エリスリトール、リビトール、キシリトール、グルシトール、マンニトール、ガラクチトール、イノシトール、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、デンプン、デンプン加水分解物、糖蜜、廃糖蜜等の糖類、麦、米等の天然物、グリセロール、メタノール、エタノール等のアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸、グルコン酸、グルクロン酸、ピルビン酸、クエン酸等の有機酸類、ヘキサデカン等の炭化水素などが挙げられ、１種または２種以上を混合して使用することができる。これらの中で、グルコース、ガラクトース、ソルボース、グルコサミン、アラビノース、ラムノース、スクロース、マルトース、トレハロース、α－メチル－Ｄ－グルコシド、セロビオース、サリシン、メリビオース、ラクトース、メレジトース、デンプン加水分解物、グリセロール、エリスリトール、リビトール、キシリトール、グルシトール、マンニトール、ガラクチトール、イノシトール、グルコン酸、グルクロン酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、グルコン酸、エタノールが好ましい。
炭素源の配合量（２種以上用いる場合はその合計量）は、酵母培養用培地全量に対して、例えば０．０１～２０．０ｗ／ｖ％であり、好ましくは０．１～１０．０ｗ／ｖ％であり、より好ましくは０．５～３．０ｗ／ｖ％である。
【0013】
・窒素源
窒素源としては、肉エキス、魚肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、トリプトン、酵母エキス、麦芽エキス、麦エキス、大豆加水分解物、大豆粉末、カゼイン、ミルクカゼイン、カザミノ酸、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸等の各種アミノ酸、コーンスティープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解物等の有機窒素源；アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウムなどの硝酸塩、亜硝酸ナトリウムなどの亜硝酸塩、尿素等の無機窒素源などが挙げられ、１種または２種以上を混合して使用することができる。これらの中で、魚肉エキス、トリプトン、酵母エキス、麦芽エキス、塩化アンモニウムが好ましい。
窒素源の配合量は、炭素源１質量部に対して、好ましくは０．０１～５．０質量部であり、より好ましくは０．１～２．５質量部である。
窒素源としては、肉エキス、魚肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、トリプトン、酵母エキス、麦芽エキス、麦エキス、大豆加水分解物、大豆粉末、カゼイン、ミルクカゼイン、カザミノ酸、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸等の各種アミノ酸、コーンスティープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解物等の有機窒素源；アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウムなどの硝酸塩、亜硝酸ナトリウムなどの亜硝酸塩、尿素等の無機窒素源などが挙げられ、１種または２種以上を混合して使用することができる。これらの中で、魚肉エキス、トリプトン、酵母エキス、麦芽エキス、塩化アンモニウムが好ましい。
窒素源の配合量は、炭素源１質量部に対して、好ましくは０．０１～５．０質量部であり、より好ましくは０．１～２．５質量部である。
【0014】
・フマル酸、アスコルビン酸
本発明の培地は、フマル酸とアスコルビン酸をともに含む。フマル酸とアスコルビン酸をともに含むことにより、雑菌の繁殖（コンタミネーション）を抑え、２－１４１－１株を効率的に培養することができる。
フマル酸濃度は、０．０３重量％以上０．６重量％以下であることが好ましく、０．５５重量％以下であることがより好ましく、０．５重量％以下であることがさらに好ましい。
アスコルビン酸濃度は、０．０３重量％以上１．０重量％以下であることが好ましく、０．８重量％以下であることがより好ましく、０．６重量％以下であることがさらに好ましい。
本発明の培地は、フマル酸とアスコルビン酸をともに含む。フマル酸とアスコルビン酸をともに含むことにより、雑菌の繁殖（コンタミネーション）を抑え、２－１４１－１株を効率的に培養することができる。
フマル酸濃度は、０．０３重量％以上０．６重量％以下であることが好ましく、０．５５重量％以下であることがより好ましく、０．５重量％以下であることがさらに好ましい。
アスコルビン酸濃度は、０．０３重量％以上１．０重量％以下であることが好ましく、０．８重量％以下であることがより好ましく、０．６重量％以下であることがさらに好ましい。
【0015】
・白子由来タンパク質
本発明の培地は、抗菌剤として白子由来タンパク質を含むことが好ましい。白子由来タンパク質は、魚類、特に、ニシン、サケ等の白子から得られるタンパク質であり、酵母を含む真菌類、細菌類に対して、広い抗菌性を示すことが知られている。２－１４１－１株は、酵母であるにも関わらず、白子由来タンパク質による影響をほとんど受けない。そのため、抗菌剤として白子由来タンパク質を含む培地を用いることにより、雑菌の繁殖（コンタミネーション）を抑えながら、２－１４１－１株を効率的に培養することができる。
白子由来タンパク質の濃度は、２－１４１－１株の増殖を阻害せず、雑菌の繁殖を抑えられる範囲内であれば特に制限されないが、例えば、０．００１重量％以上０．０５重量％以下であり、０．００２重量％以上０．０３重量％以下が好ましい。
本発明の培地は、抗菌剤として白子由来タンパク質を含むことが好ましい。白子由来タンパク質は、魚類、特に、ニシン、サケ等の白子から得られるタンパク質であり、酵母を含む真菌類、細菌類に対して、広い抗菌性を示すことが知られている。２－１４１－１株は、酵母であるにも関わらず、白子由来タンパク質による影響をほとんど受けない。そのため、抗菌剤として白子由来タンパク質を含む培地を用いることにより、雑菌の繁殖（コンタミネーション）を抑えながら、２－１４１－１株を効率的に培養することができる。
白子由来タンパク質の濃度は、２－１４１－１株の増殖を阻害せず、雑菌の繁殖を抑えられる範囲内であれば特に制限されないが、例えば、０．００１重量％以上０．０５重量％以下であり、０．００２重量％以上０．０３重量％以下が好ましい。
【0016】
本発明の培地は、その他、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、リン、ホウ素、硫黄、銅、鉄、亜鉛などの微量元素、リン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、塩化物、及びこれらのハロゲン化物などの無機塩を含むことができる。
【0017】
本発明の培地は、液体状、固体状、固形状のいずれでも良いが、大量培養が容易なため、液体状であることが好ましい。本発明の培地は、ｐＨが２．５以上４．２以下の範囲内であることが好ましい。ｐＨをこの範囲内とすることにより、雑菌の繁殖（コンタミネーション）をより長期的に抑制し、２－１４１－１株を効率的に培養することができる。
培地のｐＨの調整は、塩酸、硝酸、炭酸、硫酸などの無機酸、およびクエン酸、乳酸などの有機酸等の任意の酸やこれらの塩により行うことができる。これらの中で、クエン酸とクエン酸塩（ナトリウム塩）を用いることが、粉末培地とすることができるため好ましい。粉末培地は、乾燥した状態で長期に亘って保存することができ、保管に必要なスペースが小さい。なお、使用時には、水に溶解して液体培地として使用することが好ましい。
培地のｐＨの調整は、塩酸、硝酸、炭酸、硫酸などの無機酸、およびクエン酸、乳酸などの有機酸等の任意の酸やこれらの塩により行うことができる。これらの中で、クエン酸とクエン酸塩（ナトリウム塩）を用いることが、粉末培地とすることができるため好ましい。粉末培地は、乾燥した状態で長期に亘って保存することができ、保管に必要なスペースが小さい。なお、使用時には、水に溶解して液体培地として使用することが好ましい。
【0018】
・培養方法
２－１４１－１株の培養は、通常の方法によって行うことができ、液体状培地、固体状培地のどちらも使用することができるが、大量培養に適した液体状培地で培養することが好ましい。液体状培地の調製に使用する水は特に制限されず、純水、蒸留水、脱イオン水等を用いることができる。さらに、本発明の培地を用いることにより、雑菌の繁殖を抑えることができるため、水道水をそのまま使用することもできる。
培養条件は、２－１４１－１株が、増殖できる条件であれば特に制限されないが、例えば、培養温度は、通常１５～３５℃であり、好ましくは２０～３０℃である。培養開始時のｐＨは、２．５以上４．２以下であることが好ましい。培養中に、ｐＨは変化するが、培養中にｐＨをこの範囲内で維持してもよく、維持しなくてもよい。
２－１４１－１株の培養は、通常の方法によって行うことができ、液体状培地、固体状培地のどちらも使用することができるが、大量培養に適した液体状培地で培養することが好ましい。液体状培地の調製に使用する水は特に制限されず、純水、蒸留水、脱イオン水等を用いることができる。さらに、本発明の培地を用いることにより、雑菌の繁殖を抑えることができるため、水道水をそのまま使用することもできる。
培養条件は、２－１４１－１株が、増殖できる条件であれば特に制限されないが、例えば、培養温度は、通常１５～３５℃であり、好ましくは２０～３０℃である。培養開始時のｐＨは、２．５以上４．２以下であることが好ましい。培養中に、ｐＨは変化するが、培養中にｐＨをこの範囲内で維持してもよく、維持しなくてもよい。
【実施例0019】
（生菌製剤の調製）
終濃度が０．１８％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．１２％（ｗ／ｖ）肉エキス、０．０７％（ｗ／ｖ）ＮａＨＣＯ３、０．００５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．００２％（ｗ／ｖ）ＫＣｌ、０．００２％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００３％（ｗ／ｖ））ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏとなるように純水に溶解した。塩酸にてｐＨ５に調整後、オートクレーブ滅菌したものを液体培地とした。
２－１４１－１株を液体培地に接種して、ジャーファーメンターにて３０℃で４８時間（撹拌速度：３００ｒｐｍ）培養し、培養液を得た。
終濃度が０．１８％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．１２％（ｗ／ｖ）肉エキス、０．０７％（ｗ／ｖ）ＮａＨＣＯ３、０．００５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、０．００２％（ｗ／ｖ）ＫＣｌ、０．００２％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．００３％（ｗ／ｖ））ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏとなるように純水に溶解した。塩酸にてｐＨ５に調整後、オートクレーブ滅菌したものを液体培地とした。
２－１４１－１株を液体培地に接種して、ジャーファーメンターにて３０℃で４８時間（撹拌速度：３００ｒｐｍ）培養し、培養液を得た。
【0020】
培養液を１０分間遠心分離（×１０，０００ｇ）し、菌体（固形分３０重量％）を回収した。得られた菌体（固形分３０重量％）を３７重量％、トレハロースを１５重量％、スキムミルクを１重量％となるように蒸留水に添加し、混合して噴霧液を調製した。
【0021】
流動層造粒機（ＦＡ－ＬＡＢ－１、株式会社パウレック社）に３００ｇの珪藻土（平均粒径７５μｍ、嵩密度０．３２ｇ／ｍｌ、ラヂオライト（登録商標）♯３０００、昭和化学工業株式会社）をセットした。珪藻土に対して、１０７７ｇの上記噴霧液を１４３ｇ／分の速度で噴霧するとともに、４０℃の温風を送風して内容物を流動させた状態で乾燥させた。噴霧後、引き続いて流動層造粒機内で４０℃の温風を４０分間送風して、造粒物を乾燥させた。これにより、生菌製剤を得た。生菌製剤の水分含量は５．５重量％であった。
【0022】
（酵母の培養１）
以下の方法により、酵母を培養した。
（１）表１の組成となるように各成分を蒸留水に溶解し、酵母用培地を調製した。
（２）５００ｍＬのトールビーカーに各酵母用培地を２００ｍＬ分注した。
（３）（２）のトールビーカーに上記調製した生菌製剤を６ｍｇ（２－１４１－１株：８．０×１０４ＣＦＵ／ｍＬ）添加した。
（４）３０℃、１６８時間で好気培養した。
以下の方法により、酵母を培養した。
（１）表１の組成となるように各成分を蒸留水に溶解し、酵母用培地を調製した。
（２）５００ｍＬのトールビーカーに各酵母用培地を２００ｍＬ分注した。
（３）（２）のトールビーカーに上記調製した生菌製剤を６ｍｇ（２－１４１－１株：８．０×１０４ＣＦＵ／ｍＬ）添加した。
（４）３０℃、１６８時間で好気培養した。
【表1】
【0023】
（生菌数の算出）
培養開始から２４時間ごとに培養液をサンプリングし、５％Ｔｗｅｅｎ８０溶液で段階希釈し、寒天で固化させたＮＢ培地の表面に塗布した。塗布後３０℃で４８時間培養して培地上に形成された２－１４１－１株のコロニーと、他の菌（雑菌）のコロニーを測定し、全菌量に対する雑菌の割合からコンタミ率（雑菌のコロニー数／全体のコロニー数×１００）を求めた。また、培養開始から２４時間ごとに培養液のｐＨを測定した。
結果を表２に示す。
培養開始から２４時間ごとに培養液をサンプリングし、５％Ｔｗｅｅｎ８０溶液で段階希釈し、寒天で固化させたＮＢ培地の表面に塗布した。塗布後３０℃で４８時間培養して培地上に形成された２－１４１－１株のコロニーと、他の菌（雑菌）のコロニーを測定し、全菌量に対する雑菌の割合からコンタミ率（雑菌のコロニー数／全体のコロニー数×１００）を求めた。また、培養開始から２４時間ごとに培養液のｐＨを測定した。
結果を表２に示す。
【0024】
【表2】
【0025】
アスコルビン酸を含まない比較例１、フマル酸を含まない比較例２の培地を用いると、９６時間頃から雑菌が繁殖し、１６８時間後には全菌量の約３割が雑菌となった。
それに対し、本発明である実施例１～８の培地は、２－１４１－１株を優先的に培養することができ、また、培養１６８時間まで、その菌体濃度を高く維持することができた。特に、白子由来タンパク質を０．３２重量％（＝０．０２×１６％）以上含む実施例１～６、８の培地は、雑菌が全く見られなかった。また、実施例７は僅かに雑菌が繁殖したが、雑菌の割合は１６８時間後も３％程度であった。
それに対し、本発明である実施例１～８の培地は、２－１４１－１株を優先的に培養することができ、また、培養１６８時間まで、その菌体濃度を高く維持することができた。特に、白子由来タンパク質を０．３２重量％（＝０．０２×１６％）以上含む実施例１～６、８の培地は、雑菌が全く見られなかった。また、実施例７は僅かに雑菌が繁殖したが、雑菌の割合は１６８時間後も３％程度であった。
【0026】
（酵母の培養２）
下記表３に示すようにして、クエン酸とクエン酸ナトリウムの配合量によりｐＨを調整した酵母用培地を用いた以外は、上記実施例１と同様にして、２－１４１－１株の培養と生菌数の算出を行った。
実施例１とともに、結果を表３に示す。
下記表３に示すようにして、クエン酸とクエン酸ナトリウムの配合量によりｐＨを調整した酵母用培地を用いた以外は、上記実施例１と同様にして、２－１４１－１株の培養と生菌数の算出を行った。
実施例１とともに、結果を表３に示す。
【表3】
【0027】
【表4】
【0028】
培養開始時のｐＨが２．９～３．７２である実施例１、９、１０は、培養１６８時間後も雑菌の繁殖が抑制され、２－１４１－１株を優先的に増殖することができた。培養開始時のｐＨが４．３８である実施例１１は、培養１６８時間後には雑菌の割合が１１％程度であったが、９６時間まではほぼ雑菌の繁殖を抑えることができた。
また、いずれの実施例も、培養１６８時間まで、２－１４１－１株の菌体濃度を高く維持することができた。
また、いずれの実施例も、培養１６８時間まで、２－１４１－１株の菌体濃度を高く維持することができた。
【0029】
（酵母の培養３）
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ４７４１株（ＡＴＣＣ ２０１３８８）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＣＢＳ７４３５株（ＡＴＣＣ ７６２７３）
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＰＯ１ｆ（ＡＴＣＣ ＭＹＡ－２６１３）を用いた以外は、上記実施例１と同様にして、酵母の培養と生菌数の算出を行った。
実施例１とともに、結果を表５に示す。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ４７４１株（ＡＴＣＣ ２０１３８８）
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＣＢＳ７４３５株（ＡＴＣＣ ７６２７３）
Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＰＯ１ｆ（ＡＴＣＣ ＭＹＡ－２６１３）を用いた以外は、上記実施例１と同様にして、酵母の培養と生菌数の算出を行った。
実施例１とともに、結果を表５に示す。
【0030】
【表5】
【0031】
本発明の２－１４１－１株用培地による培養では、２－１４１－１株は順調に増殖し、また、その数を１６８時間（１週間）維持することができた。
それに対し、本発明の２－１４１－１株用培地を用いた培養では、他の酵母は２－１４１－１株と比較して菌体量を増やすことができず、比較例４のＣＢＳ７４３５株で６％、比較例３、５のＢＹ４７４１株、ＰＯ１ｆ株で３％程度であった。
それに対し、本発明の２－１４１－１株用培地を用いた培養では、他の酵母は２－１４１－１株と比較して菌体量を増やすことができず、比較例４のＣＢＳ７４３５株で６％、比較例３、５のＢＹ４７４１株、ＰＯ１ｆ株で３％程度であった。