特開2022-181578５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を測定するための基質組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022181578
(43)【公開日】2022-12-08
(54)【発明の名称】５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を測定するための基質組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20221201BHJP
C12Q 1/34 20060101ALI20221201BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 Z ZNA
C12Q1/34
【審査請求】未請求
【請求項の数】14
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021088604
(22)【出願日】2021-05-26
(71)【出願人】
【識別番号】000003160
【氏名又は名称】東洋紡株式会社
(72)【発明者】
【氏名】吉兼 峻史
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QA20
4B063QQ34
4B063QQ42
4B063QR14
4B063QR32
4B063QS16
(57)【要約】
【課題】 ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を測定するための基質組成物を提供する。
【解決手段】 本発明の５’→３’エキソヌクレアーゼの活性を測定するための基質組成物は、第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドから構成される二本鎖ポリヌクレオチドを基質として含み、ここで第２ポリヌクレオチドは、第１ポリヌクレオチドの５’末端側から連続する少なくとも一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列と、該相補的な塩基配列の３’末端側に該第１ポリヌクレオチドの塩基配列に対して非相補的で一本鎖ポリヌクレオチド領域を形成する塩基配列とを含む塩基配列からなることを特徴とする。
【選択図】 なし
【解決手段】 本発明の５’→３’エキソヌクレアーゼの活性を測定するための基質組成物は、第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドから構成される二本鎖ポリヌクレオチドを基質として含み、ここで第２ポリヌクレオチドは、第１ポリヌクレオチドの５’末端側から連続する少なくとも一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列と、該相補的な塩基配列の３’末端側に該第１ポリヌクレオチドの塩基配列に対して非相補的で一本鎖ポリヌクレオチド領域を形成する塩基配列とを含む塩基配列からなることを特徴とする。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
５’→３’エキソヌクレアーゼの活性を測定するための基質組成物であって、第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドから構成される二本鎖ポリヌクレオチドを基質として含み、ここで第２ポリヌクレオチドは、第１ポリヌクレオチドの５’末端側から連続する少なくとも一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列と、該相補的な塩基配列の３’末端側に該第１ポリヌクレオチドの塩基配列に対して非相補的で一本鎖ポリヌクレオチド領域を形成する塩基配列とを含む塩基配列からなることを特徴とする、５’→３’エキソヌクレアーゼの活性を測定するための基質組成物。
【請求項2】
前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドから構成される二本鎖ポリヌクレオチドの全長が１０～１００塩基長である、請求項１に記載の基質組成物。
【請求項3】
前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性がＤＮＡポリメラーゼ由来である、請求項１又は２に記載の基質組成物。
【請求項4】
前記ＤＮＡポリメラーゼがＦａｍｉｌｙＡに属するＤＮＡポリメラーゼである、請求項３に記載の基質組成物。
【請求項5】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｚ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体からなる群から選択される、請求項３又は４に記載の基質組成物。
【請求項6】
前記第１ポリヌクレオチドの塩基長と前記第２ポリヌクレオチドの塩基長が互いに異なる、請求項１～５のいずれかに記載の基質組成物。
【請求項7】
前記第１ポリヌクレオチドの塩基配列が、前記第２ポリヌクレオチドの塩基配列の一部に対して完全に相補的である、請求項１～６のいずれかに記載の基質組成物。
【請求項8】
前記第２ポリヌクレオチドが、３’末端側及び５’末端側の両方において、前記第１ポリヌクレオチドの塩基配列に対して非相補的で一本鎖ポリヌクレオチド領域を形成する塩基配列を有している、請求項１～７のいずれかに記載の基質組成物。
【請求項9】
前記第１ポリヌクレオチドが、第２ポリヌクレオチドの５’末端側から連続する少なくとも一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列と、該相補的な塩基配列の３’末端側に該第２ポリヌクレオチドの塩基配列に対して非相補的で一本鎖ポリヌクレオチド領域を形成する塩基配列とを含む塩基配列からなる、請求項１～６のいずれかに記載の基質組成物。
【請求項10】
一本鎖ポリヌクレオチド領域の長さが１～１０塩基長である、請求項１～９のいずれかに記載の基質組成物。
【請求項11】
第２ポリヌクレオチドが、３’末端側に１～１０塩基長の一本鎖ポリヌクレオチド領域及び５’末端側に１～１０塩基長の一本鎖ポリヌクレオチド領域を有している、請求項８に記載の基質組成物。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれかに記載の基質組成物を基質として用いることを特徴とする、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を測定する方法。
【請求項13】
請求項１～１１のいずれかに記載の基質組成物を基質として用いることを特徴とする、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングする方法。
【請求項14】
請求項１～１１のいずれかに記載の基質組成物を基質として用いることを特徴とする、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する物質の効果を定量する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の活性の評価に用いる基質に関する。より詳細には、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下「ＰＣＲ」と表記する）等の核酸増幅法に用いられるＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を定量可能な基質組成物及びそれに関連する技術等に関する。
【背景技術】
【0002】
ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸テンプレートからのＤＮＡの合成は、分子生物学の分野において、シーケンシング法や核酸増幅法等、様々な方法に利用・応用されている。中でも、核酸増幅法は、研究分野のみならず、遺伝子診断、親子鑑定といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において、既に実用化されている。
【0003】
代表的な核酸増幅法は、ＰＣＲである。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。（２）アニーリングと（３）伸長を同温度かつ１ステップで行い、２ステップを１サイクルとする場合もある。
【0004】
ＰＣＲは、原理的には１コピー、現実でも数コピー相当の核酸サンプルから増幅できる感度、特定部分のみを増幅する特異性などの特徴から、広く医学・生物学の研究や臨床診断等に利用されてきた。現在、ＰＣＲは更なる開発が行われており、複数のプライマーを同時に増幅するＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ法や、蛍光色素や蛍光標識プローブを用いて、増幅産物の生成過程を経時的にモニタリングするリアルタイムＰＣＲ法など、様々な技術が存在する。
【0005】
これらの核酸増幅法は、ＨＴＳ（Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）などの大量サンプルの遺伝子解析や、多検体を処理する必要がある食品検査や環境検査等にも広く使用されている。大量サンプルを解析する場合、核酸増幅反応液を調製後に長時間（例えば、数時間から数日間）放置されることが想定される。しかしながら、前記反応液を常温で放置することで、前記反応液の安定性が低下することが懸念される。例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法（例えば非特許文献１を参照）では、調製後の反応液を常温で放置することで、Ｃｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）値が遅れる、あるいは、Ｃｔ値の検出そのものが不能になる現象が複数例確認されている（特許文献１及び２）。
【0006】
特許文献１、２では、上記のような長時間の放置で生じる反応液の安定性低下の一因として、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が完全に抑制されておらず核酸テンプレート、プライマー、プローブ等を経時的に分解してしまうためと推察している。そして、これらの文献では、硫酸アンモニウム、酢酸テトラメチルアンモニウム、キレート剤といった特定の成分を共存させることにより、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を抑制して、核酸検出反応液中での核酸プローブを安定化したことを記載している。
【0007】
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を含みながら、長時間放置しても安定な核酸増幅検出試薬は、大量サンプルの遺伝子解析等の様々な場面において今後益々重要となり得る。従って、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を抑制できる更なる有用な手法の開発が求められている。そしてこのような手法の開発には、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を高精度に定量し評価できる手法の開発が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】特開２０１７－１６３９０４号公報
【特許文献2】再表２０１６／１３６３２４号公報
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｈｏｌｌａｎｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第８８巻，１９９１年，第７２７６－７２８０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、上記従来技術を鑑みてなされたものであり、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性をより高精度に評価できる更なる有用な手法を提供することを目的とする。加えて、本発明は、この手法を用いて５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害できる物質を効率よくスクリーニングする手法などを提供することを更なる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による分解を受け易く、その活性の定性的及び／又は定量的な評価に適した、特定構造の二本鎖ポリヌクレオチドを特定した。そして、この知見に基づいてさらに鋭意研究を重ねた結果、ＤＮＡポリメラーゼ等の酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を定量的に測定できる手法、及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する物質の効果を定量できる手法等を開発した。
【0012】
代表的な本発明は、以下の通りである。
［項１］ ５’→３’エキソヌクレアーゼの活性を測定するための基質組成物であって、第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドから構成される二本鎖ポリヌクレオチドを基質として含み、ここで第２ポリヌクレオチドは、第１ポリヌクレオチドの５’末端側から連続する少なくとも一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列と、該相補的な塩基配列の３’末端側に該第１ポリヌクレオチドの塩基配列に対して非相補的で一本鎖ポリヌクレオチド領域を形成する塩基配列とを含む塩基配列からなることを特徴とする、５’→３’エキソヌクレアーゼの活性を測定するための基質組成物。
［項２］ 前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドから構成される二本鎖ポリヌクレオチドの全長が１０～１００塩基長である、項１に記載の基質組成物。
［項３］ 前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性がＤＮＡポリメラーゼ由来である、項１又は２に記載の基質組成物。
［項４］ 前記ＤＮＡポリメラーゼがＦａｍｉｌｙＡに属するＤＮＡポリメラーゼである、項３に記載の基質組成物。
［項５］ 前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｚ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体からなる群から選択される、項３又は４に記載の基質組成物。
［項６］ 前記第１ポリヌクレオチドの塩基長と前記第２ポリヌクレオチドの塩基長が互いに異なる、項１～５のいずれかに記載の基質組成物。
［項７］ 前記第１ポリヌクレオチドの塩基配列が、前記第２ポリヌクレオチドの塩基配列の一部に対して完全に相補的である、項１～６のいずれかに記載の基質組成物。
［項８］ 前記第２ポリヌクレオチドが、３’末端側及び５’末端側の両方において、前記第１ポリヌクレオチドの塩基配列に対して非相補的で一本鎖ポリヌクレオチド領域を形成する塩基配列を有している、項１～７のいずれかに記載の基質組成物。
［項９］ 前記第１ポリヌクレオチドが、第２ポリヌクレオチドの５’末端側から連続する少なくとも一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列と、該相補的な塩基配列の３’末端側に該第２ポリヌクレオチドの塩基配列に対して非相補的で一本鎖ポリヌクレオチド領域を形成する塩基配列とを含む塩基配列からなる、項１～６のいずれかに記載の基質組成物。
［項１０］ 一本鎖ポリヌクレオチド領域の長さが１～１０塩基長である、項１～９のいずれかに記載の基質組成物。
［項１１］ 第２ポリヌクレオチドが、３’末端側に１～１０塩基長の一本鎖ポリヌクレオチド領域及び５’末端側に１～１０塩基長の一本鎖ポリヌクレオチド領域を有している、項８に記載の基質組成物。
［項１２］ 項１～１１のいずれかに記載の基質組成物を基質として用いることを特徴とする、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を測定する方法。
［項１３］ 項１～１１のいずれかに記載の基質組成物を基質として用いることを特徴とする、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングする方法。
［項１４］ 項１～１１のいずれかに記載の基質組成物を基質として用いることを特徴とする、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する物質の効果を定量する方法。
［項１］ ５’→３’エキソヌクレアーゼの活性を測定するための基質組成物であって、第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドから構成される二本鎖ポリヌクレオチドを基質として含み、ここで第２ポリヌクレオチドは、第１ポリヌクレオチドの５’末端側から連続する少なくとも一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列と、該相補的な塩基配列の３’末端側に該第１ポリヌクレオチドの塩基配列に対して非相補的で一本鎖ポリヌクレオチド領域を形成する塩基配列とを含む塩基配列からなることを特徴とする、５’→３’エキソヌクレアーゼの活性を測定するための基質組成物。
［項２］ 前記第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドから構成される二本鎖ポリヌクレオチドの全長が１０～１００塩基長である、項１に記載の基質組成物。
［項３］ 前記５’→３’エキソヌクレアーゼ活性がＤＮＡポリメラーゼ由来である、項１又は２に記載の基質組成物。
［項４］ 前記ＤＮＡポリメラーゼがＦａｍｉｌｙＡに属するＤＮＡポリメラーゼである、項３に記載の基質組成物。
［項５］ 前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｚ０５ポリメラーゼ、及びそれらの変異体からなる群から選択される、項３又は４に記載の基質組成物。
［項６］ 前記第１ポリヌクレオチドの塩基長と前記第２ポリヌクレオチドの塩基長が互いに異なる、項１～５のいずれかに記載の基質組成物。
［項７］ 前記第１ポリヌクレオチドの塩基配列が、前記第２ポリヌクレオチドの塩基配列の一部に対して完全に相補的である、項１～６のいずれかに記載の基質組成物。
［項８］ 前記第２ポリヌクレオチドが、３’末端側及び５’末端側の両方において、前記第１ポリヌクレオチドの塩基配列に対して非相補的で一本鎖ポリヌクレオチド領域を形成する塩基配列を有している、項１～７のいずれかに記載の基質組成物。
［項９］ 前記第１ポリヌクレオチドが、第２ポリヌクレオチドの５’末端側から連続する少なくとも一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列と、該相補的な塩基配列の３’末端側に該第２ポリヌクレオチドの塩基配列に対して非相補的で一本鎖ポリヌクレオチド領域を形成する塩基配列とを含む塩基配列からなる、項１～６のいずれかに記載の基質組成物。
［項１０］ 一本鎖ポリヌクレオチド領域の長さが１～１０塩基長である、項１～９のいずれかに記載の基質組成物。
［項１１］ 第２ポリヌクレオチドが、３’末端側に１～１０塩基長の一本鎖ポリヌクレオチド領域及び５’末端側に１～１０塩基長の一本鎖ポリヌクレオチド領域を有している、項８に記載の基質組成物。
［項１２］ 項１～１１のいずれかに記載の基質組成物を基質として用いることを特徴とする、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を測定する方法。
［項１３］ 項１～１１のいずれかに記載の基質組成物を基質として用いることを特徴とする、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングする方法。
［項１４］ 項１～１１のいずれかに記載の基質組成物を基質として用いることを特徴とする、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する物質の効果を定量する方法。
【発明の効果】
【0013】
本発明によって、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による分解を受け易く、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の定性的及び／又は定量的な評価に適した二本鎖ポリヌクレオチドが提供される。この二本鎖ポリヌクレオチドを用いることで、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ等の酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を高精度に定量できる。また、この二本鎖ポリヌクレオチドを使用することで、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する化合物のスクリーニング及びその阻害化合物の効果の定量等も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】本発明の基質である二本鎖ポリヌクレオチドの構成を示す模式図である。
【図2】試験例２において使用した、配列番号４のオリゴＤＮＡと、配列番号８から１４の各オリゴＤＮＡとの組み合わせによって設計された基質ＤＮＡの構成を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
（定義等）
本発明における基質は、広義のポリヌクレオチドである。従って、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの混合物であってもよく、次に例示するように公知の化学修飾が施されている類似体類であってもよい。例えば、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えばホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換したものであってもよい。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の２位の水酸基を、－ＯＲ（Ｒは、例えば－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、－ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ等であり得る）に置換してたものであってもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン塩基、プリン塩基）に化学修飾を施したものであってもよく、例えば、ピリミジン塩基の５位にメチル基やカチオン性官能基導入したもの、あるいは２位のカルボニル基のチオカルボニルを置換したもの等が挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えばビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の基質はＤＮＡで構成されたポリヌクレオチドであり得る。なお、ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドを含む概念である。
本発明における基質は、広義のポリヌクレオチドである。従って、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの混合物であってもよく、次に例示するように公知の化学修飾が施されている類似体類であってもよい。例えば、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えばホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換したものであってもよい。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の２位の水酸基を、－ＯＲ（Ｒは、例えば－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、－ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ等であり得る）に置換してたものであってもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン塩基、プリン塩基）に化学修飾を施したものであってもよく、例えば、ピリミジン塩基の５位にメチル基やカチオン性官能基導入したもの、あるいは２位のカルボニル基のチオカルボニルを置換したもの等が挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えばビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の基質はＤＮＡで構成されたポリヌクレオチドであり得る。なお、ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドを含む概念である。
【0016】
（５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を測定するための基質組成物）
本発明の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を測定するための基質組成物は、所定の構造を有する二本鎖ポリヌクレオチドを基質として含む。具体的には、本発明の基質組成物は、第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドから構成される二本鎖ポリヌクレオチドを基質として含み、ここで前記第２ポリヌクレオチドは、前記第１ポリヌクレオチドの５’末端側から連続する少なくとも一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列（図１においてI-b、II-b、III-ｂで示される領域（以下、まとめてｂ領域ともいう）の塩基配列）と、該相補的な塩基配列の３’末端側に該第１ポリヌクレオチドの塩基配列に対して非相補的で一本鎖ポリヌクレオチド領域を形成する塩基配列（図１においてI-a、II-a、III-aで示される領域（以下、まとめてａ領域ともいう）の塩基配列）とを少なくとも含む塩基配列からなることを特徴とする。本発明の基質組成物は、上記二本鎖ポリヌクレオチドで構成される基質からなるものであってもよいし、この基質を任意の溶媒（例えば、水、緩衝剤など）に溶解したもの又はこれを凍結乾燥させたもの等であってもよい。
本発明の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を測定するための基質組成物は、所定の構造を有する二本鎖ポリヌクレオチドを基質として含む。具体的には、本発明の基質組成物は、第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドから構成される二本鎖ポリヌクレオチドを基質として含み、ここで前記第２ポリヌクレオチドは、前記第１ポリヌクレオチドの５’末端側から連続する少なくとも一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列（図１においてI-b、II-b、III-ｂで示される領域（以下、まとめてｂ領域ともいう）の塩基配列）と、該相補的な塩基配列の３’末端側に該第１ポリヌクレオチドの塩基配列に対して非相補的で一本鎖ポリヌクレオチド領域を形成する塩基配列（図１においてI-a、II-a、III-aで示される領域（以下、まとめてａ領域ともいう）の塩基配列）とを少なくとも含む塩基配列からなることを特徴とする。本発明の基質組成物は、上記二本鎖ポリヌクレオチドで構成される基質からなるものであってもよいし、この基質を任意の溶媒（例えば、水、緩衝剤など）に溶解したもの又はこれを凍結乾燥させたもの等であってもよい。
【0017】
上記の二本鎖ポリヌクレオチドで構成される本発明の基質は、第１ポリヌクレオチドと第２ポリヌクレオチドとの間で部分的に二本鎖構造を形成すると共に、少なくとも一方の鎖の３’末端において一本鎖構造を有することを特徴としている。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは通常、二本鎖ポリヌクレオチドを認識して結合し、二本鎖のうちの片方の鎖を分解する。従って、本発明の基質は、二本鎖構造を有している必要がある。なお、後述の実施例の結果に示されるように、一本鎖領域を有さず二本鎖構造の両端が共に平滑末端となっている場合には、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を適切に評価できなかったことが分かっている。従って、本発明は、単に二本鎖構造を有すればよいという訳ではないという予想外の知見に基づくものである。
【0018】
本発明の基質は、二本鎖構造を形成する少なくとも一方のポリヌクレオチドの３’末端側に一本鎖領域を形成するように構成されている。このような一本鎖領域が存在することで、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを有するＤＮＡポリメラーゼ等）が二本鎖構造の５’末端付近に結合し易くなり、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が発揮され易くなる。従って、本発明の基質は、上記第２ポリヌクレオチドが、３’末端側に一本鎖領域（図１、ａ領域）を有し、且つ、第１ポリヌクレオチドの５’末端側から連続する塩基配列領域と相補的で対合可能な領域（図１、ｂ領域）を有する限り、特に限定されない。よって、第２ポリヌクレオチドの５’末端側にも一本鎖領域（図１の例においてII-cで示される領域）を有していても良いし（図１の例II）、又は第１ポリヌクレオチドの３’末端側に第２ポリヌクレオチドとは非相補的な塩基配列を有し一本鎖を形成する領域（図１の例においてIII-cで示される領域）を有していても良いし（図１の例III）、或いはこのような更なる一本鎖を有さず、第１ポリヌクレオチドの３’末端及び第２ポリヌクレオチドの５’末端が平滑末端を形成していてもよい（図１の例I）。
【0019】
本発明の基質において二本鎖を形成する領域は、第１ポリヌクレオチドの全長と同じ（即ち、第１ポリヌクレオチドの塩基配列が、第２ポリヌクレオチドの塩基配列の一部に対して完全に相補的な塩基配列となる）であってもよいし（図１の例I、II）、第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドのそれぞれ一部の重なりで形成される領域であってもよい（図１の例III）。好ましくは、第１ポリヌクレオチドの塩基配列が、第２ポリヌクレオチドの塩基配列の一部に対して完全に相補的であるように構成されていることが望ましい。
【0020】
特定の実施形態において、本発明の基質は、前記第２ポリヌクレオチドが、３’末端側及び５’末端側の両方において、前記第１ポリヌクレオチドの塩基配列に対して非相補的で一本鎖ポリヌクレオチド領域を形成する塩基配列を有するものであり得る（図１の例II）。ここで、短鎖となる第１ポリヌクレオチドの塩基配列はその全領域が、長鎖の第２ポリヌクレオチドの塩基配列の一部と完全に相補的となり、強固な相補鎖を形成して安定な構造となり得る。そして、このような構造の二本鎖ポリヌクレオチドを基質とすることで、短鎖となる第１ポリヌクレオチドの５’末端のみが分解されるので、より安定して５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を定量的に評価できる。
【0021】
別の実施形態において、本発明の基質は、前記第１ポリヌクレオチドが、第２ポリヌクレオチドの５’末端側から連続する少なくとも一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列と、該相補的な塩基配列の３’末端側に該第２ポリヌクレオチドの塩基配列に対して非相補的で一本鎖ポリヌクレオチド領域を形成する塩基配列とを含む塩基配列からなるものであり得る（図１の例III）。このような構造の二本鎖ポリヌクレオチドを基質とすることによって、第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの両方の５’末端が分解されるので、定量的な評価がやや複雑にはなるが、定性的により高感度に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を評価することが可能となり得る。
【0022】
本発明の基質を構成する第１ポリヌクレオチドの塩基長と第２ポリヌクレオチドの塩基長は、同じであってもよいし、互いに異なっていてもよい。一つの実施形態では、第１ポリヌクレオチドの塩基長と第２ポリヌクレオチドの塩基長は互いに異なることが好ましい。
【0023】
本発明の基質の全長（塩基長）は特に限定されず、任意の長さであり得る。ここで、本発明の基質を構成する二本鎖ポリヌクレオチドの全長とは、２つのポリヌクレオチドの塩基配列が非相補的で対合しない一本鎖領域（突出末端又は粘着末端領域などともいう）を含む。従って、本明細書において全長（塩基長）とは、図１の例IではI-a及びI-bを足した領域、例IIではII-a、II-b及びII-cを足した領域、例IIIではIII-a、III-b及びIII-cを足した領域の塩基長を指す。好ましい実施形態では、本発明の基質の全長は、１０～１０００塩基であり得、より好ましくは１０～５００塩基、さらに好ましくは１０～１００塩基であることが望ましい。
【0024】
本発明の基質において、２つのポリヌクレオチドが二本鎖を形成する領域（図１、ｂ領域）の長さは特に限定されないが、あまり短すぎない方が望ましく、例えば、５～９５０塩基であり得、好ましくは１０～４５０塩基、より好ましくは１５～１００塩基、更に好ましくは２０～５０塩基であることが望ましい。このような長さで相補鎖を形成するように設計することで、基質を構成する二本鎖ポリヌクレオチドがより安定した構造になると共に、十分な感度で５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を評価することが可能となる。
【0025】
また、本発明の基質において、第２ポリヌクレオチドの３’末端側に形成される一本鎖領域（図１、ａ領域）の長さも特に限定されないが、あまり長すぎない方が望ましい。例えば、この一本鎖領域の塩基長は、１～１００塩基であり得、より好ましくは１～５０塩基、さらに好ましくは１～１０塩基であることが望ましい。このような長さで第２ポリヌクレオチドの３’末端に一本鎖領域を有することで、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを有するＤＮＡポリメラーゼ）が第１ポリヌクレオチドの５’末端付近に作用し易くなるというメリットがある。また、第１ポリヌクレオチドの３’末端側にも一本鎖領域を有するように設計する場合、この第１ポリヌクレオチドの一本鎖領域（図１、III-c領域）の長さも上記と同様の長さであることが、上記と同じ理由により望ましい。ここで、第２ポリヌクレオチドの３’末端側の一本鎖領域の長さと第１ポリヌクレオチドの３’末端側の一本鎖領域の長さは、同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【0026】
本発明の基質を構成する第２ポリヌクレオチドが３’末端側及び５’末端側の両方に一本鎖領域を有する場合も、それぞれ上記と同様の長さの一本鎖領域を有することが好ましく、例えば、３’末端側に１～５０塩基長の一本鎖ポリヌクレオチド領域及び５’末端側に１～５０塩基長の一本鎖ポリヌクレオチド領域を有するように設計されたものであり得、好ましくは３’末端側に１～１０塩基長の一本鎖ポリヌクレオチド領域及び５’末端側に１～１０塩基長の一本鎖ポリヌクレオチド領域を有するように設計されたものであり得る。ここで、３’末端側の一本鎖領域の長さと５’末端側の一本鎖領域の長さは、同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【0027】
特定の実施形態では、本発明の基質を構成する二本鎖ポリヌクレオチドの好ましい例として、配列番号１及び配列番号５の組み合わせ；配列番号２及び６の組み合わせ：配列番号３及び７の組み合わせ：配列番号４及び８の組み合わせ：配列番号４及び９の組み合わせ：配列番号４及び１２の組み合わせ：配列番号４及び１４の組み合わせで構成される基質ＤＮＡが挙げられるが、特に限定されない。
【0028】
本発明の基質はプローブのように構成されたものであってもよく、該プローブは、少なくとも１種類の標識物質で標識されたハイブリダイゼーションプローブのように構成されたものであってもよい。標識としては蛍光色素や放射性同位元素が挙げられるが特に限定されない。このようなプローブを用いることによって、リアルタイムＰＣＲ法を利用して５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を評価することができる。ハイブリダイゼーションプローブとしては、例えば、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ［米国特許第５，２１０，０１５号公報、米国特許第５，５３８，８４８号公報、米国特許第５，４８７，９７２号公報、米国特許第５，８０４，３７５号公報（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）］、モレキュラービーコン［米国特許第５，１１８，８０１号公報（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）］、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ［国際公開第９７／４６７０７号、国際公開第９７／４６７１２号、国際公開第９７／４６７１４号（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）］等が挙げられる。
【0029】
好ましい実施形態では、第１ポリヌクレオチドの５’末端を蛍光物質で標識し、且つ３’末端を消光物質（クエンチャー）で標識するように設計する。このように蛍光標識することで、リアルタイムＰＣＲを用いて評価する場合にも５’→３’エキソヌクレアーゼ活性をより確実に評価することが可能となる。また、第１ポリヌクレオチド及び第２ポリヌクレオチドの両方の５’末端を蛍光標識し、且つ両方の３’末端を消光物質で標識してもよく、この場合、５’末端における蛍光標識は、第１ポリヌクレオチドと第２ポリヌクレオチドとで互いに異なる蛍光標識で標識してもよい。
【0030】
本発明の基質を蛍光標識する場合、標識に使用される蛍光物質は、特に限定されないが、例えば、ローダミン若しくはその誘導体（例えば、５－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン、５－カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））、又はそれらの塩などのローダミン系化合物；フルオロセイン又はその誘導体（例えば、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ２’，７’－ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５’－ヘキサクロロ－フルオレセイン－ＣＥホスホロアミダイト））、ＶＩＣ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）シリーズ、ローダミン又はその誘導体（例えば、５－カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）やテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））、Ｃｙ（登録商標）色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５）、若しくはそれらの誘導体、又はそれらの塩等の非ローダミン系化合物等があげられる。標識に使用される消光物質もまた特に限定されないが、例えば、ＴＡＭＲＡ（テトラメチル－ローダミン）、ＤＡＢＣＹＬ（４－（４－ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸）、ＢＨＱ１（ＢＨＱ：Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標））、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３等を用いることができる。
【0031】
本発明の基質を標識ハイブリダイゼーションプローブとして設計する場合、二本鎖ポリヌクレオチドは特に限定されないが、例えば、配列番号２及び６の組み合わせ；配列番号３及び７の組み合わせ；配列番号４及び８の組み合わせで構成される蛍光標識された基質ＤＮＡが挙げられるが、特に限定されない。
【0032】
（５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を測定する方法）
一つの実施形態において、本発明は、前記基質組成物を用いて５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を測定する方法を提供する。この測定方法は、例えば、本発明の基質組成物と、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素とを共存させる工程を包含し得る。一例として、当該酵素が活性を発揮しない温度条件下（例えば、冷凍又は冷却条件下）で本発明の基質組成物及び当該酵素を一定期間共存させた場合と、当該酵素の至適温度付近（例えば、２０℃以上、又は３０℃以上）で本発明の基質組成物及び当該酵素を同じ期間共存させた場合とを比較し、本発明の基質組成物の分解を示す指標の差を判定することで、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を評価することができる。
一つの実施形態において、本発明は、前記基質組成物を用いて５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を測定する方法を提供する。この測定方法は、例えば、本発明の基質組成物と、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素とを共存させる工程を包含し得る。一例として、当該酵素が活性を発揮しない温度条件下（例えば、冷凍又は冷却条件下）で本発明の基質組成物及び当該酵素を一定期間共存させた場合と、当該酵素の至適温度付近（例えば、２０℃以上、又は３０℃以上）で本発明の基質組成物及び当該酵素を同じ期間共存させた場合とを比較し、本発明の基質組成物の分解を示す指標の差を判定することで、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を評価することができる。
【0033】
特定の実施形態では、本発明の基質を用いて、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を下記のように確認することができる。
下記の成分：
ＤＮＡポリメラーゼ単独（１ユニット(Ｕ)）、又は、ＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ）及びホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体又はその断片（０．００５μｇ／μＬ）；
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；及び
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２
０．３μＭ 本発明の基質組成物（基質ＤＮＡ）；
を含む溶液を調製し、これを３７℃及び－２０℃で２４時間インキュベートする。インキュベート後に、ゲル電気泳動において基質ＤＮＡを示すバンドを定量、もしくは、標識した基質ＤＮＡから遊離した標識化合物を定量する。そして、３７℃でインキュベートした場合と－２０℃でインキュベートした場合の定量値（強度）を単に比較することによって、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を評価することができる。また、下記の式に数値を当てはめることで、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を定量することもできる。
活性（％）＝｛（－２０℃で２４時間曝露した場合のバンドの定量値）－（３７℃で２４時間曝露した場合のバンドの定量値）｝／｛－２０℃で２４時間曝露した場合のバンドの定量値｝×１００
もしくは、
活性（％）＝｛（３７℃で２４時間曝露した場合の基質ＤＮＡから遊離した標識化合物の定量値）－（－２０℃で２４時間曝露した場合の基質ＤＮＡから遊離した標識化合物）｝／｛３７℃で２４時間曝露した場合の基質ＤＮＡから遊離した標識化合物の定量値｝×１００
なお上記においてバンドの強度は、目視判定で定性的に評価することもできるが、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置（ＭｕｌｔｉＮＡ、株式会社島津製作所）およびＤＮＡ－５００キット（製品コード：Ｓ２９２－２７９１０－９１、株式会社島津製作所）などの市販の測定機器を使用して評価することもできる。
下記の成分：
ＤＮＡポリメラーゼ単独（１ユニット(Ｕ)）、又は、ＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ）及びホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体又はその断片（０．００５μｇ／μＬ）；
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；及び
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２
０．３μＭ 本発明の基質組成物（基質ＤＮＡ）；
を含む溶液を調製し、これを３７℃及び－２０℃で２４時間インキュベートする。インキュベート後に、ゲル電気泳動において基質ＤＮＡを示すバンドを定量、もしくは、標識した基質ＤＮＡから遊離した標識化合物を定量する。そして、３７℃でインキュベートした場合と－２０℃でインキュベートした場合の定量値（強度）を単に比較することによって、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を評価することができる。また、下記の式に数値を当てはめることで、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を定量することもできる。
活性（％）＝｛（－２０℃で２４時間曝露した場合のバンドの定量値）－（３７℃で２４時間曝露した場合のバンドの定量値）｝／｛－２０℃で２４時間曝露した場合のバンドの定量値｝×１００
もしくは、
活性（％）＝｛（３７℃で２４時間曝露した場合の基質ＤＮＡから遊離した標識化合物の定量値）－（－２０℃で２４時間曝露した場合の基質ＤＮＡから遊離した標識化合物）｝／｛３７℃で２４時間曝露した場合の基質ＤＮＡから遊離した標識化合物の定量値｝×１００
なお上記においてバンドの強度は、目視判定で定性的に評価することもできるが、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置（ＭｕｌｔｉＮＡ、株式会社島津製作所）およびＤＮＡ－５００キット（製品コード：Ｓ２９２－２７９１０－９１、株式会社島津製作所）などの市販の測定機器を使用して評価することもできる。
【0034】
（５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングする方法、及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する物質の効果を定量する方法）
本発明の基質組成物は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングする方法、又は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する物質の効果を定量する方法において非常に有用である。例えば、本発明のこれらの方法は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の至適温度付近（例えば、２０℃以上、又は３０℃以上）で、本発明の基質組成物と、当該酵素と、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害剤の候補物質を一定期間共存させた場合における、本発明の基質組成物の分解を示す指標を評価すればよい。
本発明の基質組成物は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する物質をスクリーニングする方法、又は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する物質の効果を定量する方法において非常に有用である。例えば、本発明のこれらの方法は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の至適温度付近（例えば、２０℃以上、又は３０℃以上）で、本発明の基質組成物と、当該酵素と、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害剤の候補物質を一定期間共存させた場合における、本発明の基質組成物の分解を示す指標を評価すればよい。
【0035】
特定の実施形態では、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する候補物質を、３７℃で２４時間にわたり、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及び本発明の基質組成物（基質ＤＮＡ）と共存させて、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する当該候補物質の阻害能を下記（１）又は（２）の方法で定量的に確認することもできる。
（１）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する候補物質及びＤＮＡポリメラーゼを、基質ＤＮＡと共存させて３７℃で２４時間曝露した反応液と、コントロール（例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による分解を受けていない未処理の基質ＤＮＡ）の反応液について、ゲル電気泳動により基質ＤＮＡのバンド強度を比較する。バンド強度の差が小さいほど、当該候補物質は、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能が高いことを意味する。
（２）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する候補物質を、少なくとも一方のポリヌクレオチドが蛍光標識された本発明の基質組成物（二本鎖基質ＤＮＡ）及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと共存させて、３７℃で２４時間曝露した反応液と、コントロール（例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による分解を受けていない未処理の基質ＤＮＡ）の反応液について、リアルタイムＰＣＲでのサイクル初期の蛍光強度を比較する。蛍光強度の差が小さいほど、当該候補物質は、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能が高いことを意味する。
（１）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する候補物質及びＤＮＡポリメラーゼを、基質ＤＮＡと共存させて３７℃で２４時間曝露した反応液と、コントロール（例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による分解を受けていない未処理の基質ＤＮＡ）の反応液について、ゲル電気泳動により基質ＤＮＡのバンド強度を比較する。バンド強度の差が小さいほど、当該候補物質は、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能が高いことを意味する。
（２）５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する候補物質を、少なくとも一方のポリヌクレオチドが蛍光標識された本発明の基質組成物（二本鎖基質ＤＮＡ）及び５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと共存させて、３７℃で２４時間曝露した反応液と、コントロール（例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による分解を受けていない未処理の基質ＤＮＡ）の反応液について、リアルタイムＰＣＲでのサイクル初期の蛍光強度を比較する。蛍光強度の差が小さいほど、当該候補物質は、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能が高いことを意味する。
【0036】
（１）の方法を用いる場合、使用する候補物質によっては基質ＤＮＡの定量値に影響を及ぼす場合がある。その場合には、以下のような数式に基づき、基質ＤＮＡの分解率（％）を算出することができる。基質ＤＮＡの分解率（％）が小さいほど、使用した化合物の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能が高いことを意味する。
分解率（％）＝｛断片化されたバンドの定量値の合計｝／｛基質ＤＮＡのバンドの定量値＋断片化されたバンドの定量値の合計｝×１００
分解率（％）＝｛断片化されたバンドの定量値の合計｝／｛基質ＤＮＡのバンドの定量値＋断片化されたバンドの定量値の合計｝×１００
【0037】
上記分解率（％）における値は、好ましくは３０％以下である。より好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１０％以下である。
【0038】
本発明の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する物質のスクリーニング方法では、上記のような確認方法において５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能が認められた候補物質を選択すればよい。
【0039】
一つの実施形態において、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害剤は、例えば、２５℃で２４時間、４８時間、又は７２時間、或いは、３７℃で２４時間にわたり、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）及び核酸テンプレート、プライマー、プローブ等の核酸と共存させても、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による核酸の分解を抑制することができる。したがって、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害剤は、核酸増幅用試薬等の安定性を向上させるために好適に使用することができる。
【0040】
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素は特に限定されず、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを有するＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼなどの任意の酵素であり得る。好ましくは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼである。一実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。ここで、「耐熱性」とは、例えば６０℃で３０分間のように高温で熱処理しても、ＤＮＡポリメラーゼ活性を好ましくは５０％以上保持している性質をいう。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ Ｚ０５由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５ポリメラーゼ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａポリメラーゼ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤポリメラーゼ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕポリメラーゼ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｗｏポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｂｒポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｉポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｌポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｎｅポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔポリメラーゼ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ＧＢ－Ｄ由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＤＥＥＰＶＥＮＴポリメラーゼ）等が挙げられるが、これらに限定されない。なお、Ｔａｑポリメラーゼ等の用語には変異体も含まれる。ここで、変異体とは、元のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ポリメラーゼ活性、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、及び耐熱性等の酵素学的性質が維持されているものをいう。変異体のポリメラーゼ活性ドメインは、元のＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性ドメインのアミノ酸配列に対して８５％以上（好ましくは９０％以上又は９５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。変異体の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインは、元のＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインのアミノ酸配列に対して８５％以上（好ましくは９０％以上又は９５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。変異体におけるアミノ酸の変異は保存的置換であることが好ましい。
【0041】
一実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｆａｍｉｌｙ Ａに属するＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。Ｆａｍｉｌｙ Ａに属するＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｚ０５ポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｂｃａポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。また、野生型であっても変異体であってもよい。
【0042】
ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ（配列番号１５）、Ｔｔｈポリメラーゼ（配列番号１６）、Ｚ０５ポリメラーゼ（配列番号１７）及びそれらの変異体からなる群より選択されることが好ましい。
【0043】
ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性は以下のようにして測定する。
ポリメラーゼ活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ジチオスレイトール，０．１％（ｖ／ｖ） ポリエチレングリコールソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ(商標) ２０），０．１％（ｖ／ｖ） オクチルフェニル－ポリエチレングリコール（Ｎｏｎｉｄｅｔ(商標) Ｐ４０），５０％（ｖ／ｖ） グリセリン）でＤＮＡポリメラーゼ溶液を希釈して測定を行う。
（１）下記のＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ、滅菌水１０μｌ、及びＤＮＡポリメラーゼ溶液５μｌをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。
（２）その後氷冷し、Ｅ液５０μｌ及びＤ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。
（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ 塩酸及びエタノールで十分洗浄する。
（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。ポリメラーゼ活性の１単位（ユニット）はこの条件で３０分当りの１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込むＤＮＡポリメラーゼ量とする。
Ａ液：４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１６ｍＭ 塩化マグネシウム１５ｍＭ ジチオスレイトール１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ液：１．５μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ液：１．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ液：２０％(w/v) トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ液：１ｍｇ／ｍＬ 仔牛胸腺ＤＮＡ
ポリメラーゼ活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ジチオスレイトール，０．１％（ｖ／ｖ） ポリエチレングリコールソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ(商標) ２０），０．１％（ｖ／ｖ） オクチルフェニル－ポリエチレングリコール（Ｎｏｎｉｄｅｔ(商標) Ｐ４０），５０％（ｖ／ｖ） グリセリン）でＤＮＡポリメラーゼ溶液を希釈して測定を行う。
（１）下記のＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ、滅菌水１０μｌ、及びＤＮＡポリメラーゼ溶液５μｌをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。
（２）その後氷冷し、Ｅ液５０μｌ及びＤ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。
（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ 塩酸及びエタノールで十分洗浄する。
（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。ポリメラーゼ活性の１単位（ユニット）はこの条件で３０分当りの１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込むＤＮＡポリメラーゼ量とする。
Ａ液：４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１６ｍＭ 塩化マグネシウム１５ｍＭ ジチオスレイトール１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ液：１．５μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ液：１．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ液：２０％(w/v) トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ液：１ｍｇ／ｍＬ 仔牛胸腺ＤＮＡ
【実施例0044】
以下、試験例をもって、本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記試験例に限定されるものではない。
【0045】
試験例１．基質における配列依存性の検討
配列番号１から８に記載のオリゴＤＮＡを用いて、二本鎖ポリヌクレオチド基質（基質ＤＮＡ）を調製し、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による分解を受けるかを確認した。なお、本試験例で調製した基質はいずれも異なる配列を有するように設計した。
配列番号１から８に記載のオリゴＤＮＡを用いて、二本鎖ポリヌクレオチド基質（基質ＤＮＡ）を調製し、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による分解を受けるかを確認した。なお、本試験例で調製した基質はいずれも異なる配列を有するように設計した。
【0046】
（１）反応液
活性測定用ミックス１：
Ｔｔｈポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＴＨ－３０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３μＭ 基質ＤＮＡ；
活性測定用ミックス１：
Ｔｔｈポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＴＨ－３０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３μＭ 基質ＤＮＡ；
【0047】
［基質ＤＮＡ］
配列番号１から８に記載のオリゴＤＮＡをそれぞれ別個に合成し、下記表１に示す組み合わせとなるように、配列番号１と５、配列番号２と６、配列番号３と７、配列番号４と８をそれぞれ等量に混合して二本鎖を形成させ、基質ＤＮＡとした。
配列番号１から８に記載のオリゴＤＮＡをそれぞれ別個に合成し、下記表１に示す組み合わせとなるように、配列番号１と５、配列番号２と６、配列番号３と７、配列番号４と８をそれぞれ等量に混合して二本鎖を形成させ、基質ＤＮＡとした。
【0048】
（２）反応
前記活性測定ミックス１を２０μＬずつ調製し、－２０℃又は２５℃で２４時間曝露した。その後、ＤＮＡ／ＲＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置（ＭｕｌｔｉＮＡ、株式会社島津製作所）およびＤＮＡ－５００キット（製品コード：Ｓ２９２－２７９１０－９１、株式会社島津製作所）を使用して、各サンプルを分析した。
前記活性測定ミックス１を２０μＬずつ調製し、－２０℃又は２５℃で２４時間曝露した。その後、ＤＮＡ／ＲＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置（ＭｕｌｔｉＮＡ、株式会社島津製作所）およびＤＮＡ－５００キット（製品コード：Ｓ２９２－２７９１０－９１、株式会社島津製作所）を使用して、各サンプルを分析した。
【0049】
（３）結果
各サンプルを分析した際のバンド面積の定量値を表１に示す。いずれの基質ＤＮＡにおいても、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの存在下で、２５℃で２４時間曝露した場合では、－２０℃で２４時間曝露した場合に比べて、バンドの定量値が著しく低下し、基質ＤＮＡの分解が確認された。従って、基質ＤＮＡの配列に依存せずに５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を評価できることを確認した。
各サンプルを分析した際のバンド面積の定量値を表１に示す。いずれの基質ＤＮＡにおいても、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの存在下で、２５℃で２４時間曝露した場合では、－２０℃で２４時間曝露した場合に比べて、バンドの定量値が著しく低下し、基質ＤＮＡの分解が確認された。従って、基質ＤＮＡの配列に依存せずに５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を評価できることを確認した。
【0050】
【表1】
【0051】
試験例２．基質における構造の検討
配列番号４のオリゴＤＮＡ及び配列番号８から１４のオリゴＤＮＡから構成される基質ＤＮＡを設計し、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による分解を受けるか確認した。
配列番号４のオリゴＤＮＡ及び配列番号８から１４のオリゴＤＮＡから構成される基質ＤＮＡを設計し、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による分解を受けるか確認した。
【0052】
（１）反応液
活性測定用ミックス１：
Ｔｔｈポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＴＨ－３０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３μＭ 基質ＤＮＡ；
活性測定用ミックス１：
Ｔｔｈポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＴＨ－３０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３μＭ 基質ＤＮＡ；
【0053】
［基質ＤＮＡ］
配列番号４及び配列番号８から１４に記載のオリゴＤＮＡをそれぞれ別個に合成し、下記表２に示すように、配列番号４と配列番号８～１４のいずれかをそれぞれ等量に組み合わせて混合して二本鎖を形成させ、基質ＤＮＡとした。
配列番号４及び配列番号８から１４に記載のオリゴＤＮＡをそれぞれ別個に合成し、下記表２に示すように、配列番号４と配列番号８～１４のいずれかをそれぞれ等量に組み合わせて混合して二本鎖を形成させ、基質ＤＮＡとした。
【0054】
（２）反応
前記活性測定ミックス１を２０μＬずつ調製し、－２０℃又は２５℃で２４時間曝露した。その後、ＤＮＡ／ＲＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置（ＭｕｌｔｉＮＡ、株式会社島津製作所）およびＤＮＡ－５００キット（製品コード：Ｓ２９２－２７９１０－９１、株式会社島津製作所）を使用して、各サンプルを分析した。
前記活性測定ミックス１を２０μＬずつ調製し、－２０℃又は２５℃で２４時間曝露した。その後、ＤＮＡ／ＲＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置（ＭｕｌｔｉＮＡ、株式会社島津製作所）およびＤＮＡ－５００キット（製品コード：Ｓ２９２－２７９１０－９１、株式会社島津製作所）を使用して、各サンプルを分析した。
【0055】
（３）結果
各サンプルを分析した際のバンド面積の定量値を表２に示した。
本試験例に用いた各オリゴＤＮＡの組み合わせで構成される二本鎖ポリヌクレオチド基質の構造を図２に示す。各基質ＤＮＡの両末端のうち、少なくとも一方の３’末端が突出した一本鎖ＤＮＡ領域を有する基質ＤＮＡでは、分解が確認された。しかし、いずれの末端にも一本鎖ＤＮＡ領域を有さずに二本鎖ＤＮＡを形成している場合、もしくは３’末端突出を有さずに５’末端が突出した一本鎖ＤＮＡ領域を有する場合には、基質ＤＮＡの分解は確認されなかった。従って、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、少なくとも一方の３’末端が突出した一本鎖ＤＮＡ領域と部分的に相補的な二本鎖ＤＮＡ領域を有した基質ＤＮＡにおいてのみ、二本鎖ＤＮＡの片側の鎖を５’→３’方向に分解することが分かった。また、基質ＤＮＡの両端のうち共に３’末端が突出した一本鎖ＤＮＡ領域を有する配列番号４及び１２の組み合わせでは、最も基質ＤＮＡの分解が顕著となった。これは、基質ＤＮＡが両端から分解されるため、分解量が大きくなるためだと考えられる。従って、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を定量するためには、少なくとも一方の３’末端側に突出した一本鎖ＤＮＡ領域を有し、かつ部分的に相補的な二本鎖ＤＮＡ領域を有する基質ＤＮＡを設計する必要があることが明らかとなった。
各サンプルを分析した際のバンド面積の定量値を表２に示した。
本試験例に用いた各オリゴＤＮＡの組み合わせで構成される二本鎖ポリヌクレオチド基質の構造を図２に示す。各基質ＤＮＡの両末端のうち、少なくとも一方の３’末端が突出した一本鎖ＤＮＡ領域を有する基質ＤＮＡでは、分解が確認された。しかし、いずれの末端にも一本鎖ＤＮＡ領域を有さずに二本鎖ＤＮＡを形成している場合、もしくは３’末端突出を有さずに５’末端が突出した一本鎖ＤＮＡ領域を有する場合には、基質ＤＮＡの分解は確認されなかった。従って、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、少なくとも一方の３’末端が突出した一本鎖ＤＮＡ領域と部分的に相補的な二本鎖ＤＮＡ領域を有した基質ＤＮＡにおいてのみ、二本鎖ＤＮＡの片側の鎖を５’→３’方向に分解することが分かった。また、基質ＤＮＡの両端のうち共に３’末端が突出した一本鎖ＤＮＡ領域を有する配列番号４及び１２の組み合わせでは、最も基質ＤＮＡの分解が顕著となった。これは、基質ＤＮＡが両端から分解されるため、分解量が大きくなるためだと考えられる。従って、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を定量するためには、少なくとも一方の３’末端側に突出した一本鎖ＤＮＡ領域を有し、かつ部分的に相補的な二本鎖ＤＮＡ領域を有する基質ＤＮＡを設計する必要があることが明らかとなった。
【0056】
【表2】
【0057】
試験例３．基質ＤＮＡを分解するポリメラーゼの種類
配列番号４及び配列番号８に記載のオリゴＤＮＡから構成される基質ＤＮＡを設計し、ポリメラーゼの種類により５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による分解の程度が影響を受けるか確認した。
配列番号４及び配列番号８に記載のオリゴＤＮＡから構成される基質ＤＮＡを設計し、ポリメラーゼの種類により５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による分解の程度が影響を受けるか確認した。
【0058】
（１）反応液
活性測定用ミックス１：
Ｔｔｈポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＴＨ－３０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３μＭ 基質ＤＮＡ；
活性測定用ミックス２：
国際公開第２０１８／０９６９６１号に記載のＴｔｈポリメラーゼ（変異体）（０．０５Ｕ／μＬ）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３μＭ 基質ＤＮＡ；
活性測定用ミックス３：
Ｔａｑポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＡＰ－２０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３μＭ 二本鎖基質ＤＮＡ；
活性測定用ミックス１：
Ｔｔｈポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＴＨ－３０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３μＭ 基質ＤＮＡ；
活性測定用ミックス２：
国際公開第２０１８／０９６９６１号に記載のＴｔｈポリメラーゼ（変異体）（０．０５Ｕ／μＬ）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３μＭ 基質ＤＮＡ；
活性測定用ミックス３：
Ｔａｑポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＡＰ－２０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３μＭ 二本鎖基質ＤＮＡ；
【0059】
［基質ＤＮＡ］
配列番号４及び配列番号８に記載のオリゴＤＮＡをそれぞれ別個に合成し、等量を混合して二本鎖を形成させ、基質ＤＮＡとした。
配列番号４及び配列番号８に記載のオリゴＤＮＡをそれぞれ別個に合成し、等量を混合して二本鎖を形成させ、基質ＤＮＡとした。
【0060】
（２）反応
前記活性測定ミックス１を２０μＬずつ調製し、－２０℃又は３７℃で２４時間曝露した。その後、ＤＮＡ／ＲＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置（ＭｕｌｔｉＮＡ、株式会社島津製作所）およびＤＮＡ－５００キット（製品コード：Ｓ２９２－２７９１０－９１、株式会社島津製作所）を使用して、各サンプルを分析した。
前記活性測定ミックス１を２０μＬずつ調製し、－２０℃又は３７℃で２４時間曝露した。その後、ＤＮＡ／ＲＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置（ＭｕｌｔｉＮＡ、株式会社島津製作所）およびＤＮＡ－５００キット（製品コード：Ｓ２９２－２７９１０－９１、株式会社島津製作所）を使用して、各サンプルを分析した。
【0061】
（３）結果
各サンプルを分析した際のバンド面積の定量値を表３に示した。いずれのポリメラーゼにおいても、３７℃で２４時間曝露した場合では、－２０℃で２４時間曝露した場合に比べて、バンドの定量値が低下し、基質ＤＮＡの分解が確認された。ここで、各ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を下記の式で算出した。また、今回の結果から、野生型Ｔｔｈポリメラーゼ及び国際公開第２０１８／０９６９６１号に記載のＴｔｈポリメラーゼ（変異体）は活性がそれぞれ９７％、９９％となり、活性４４％を示したＴａｑポリメラーゼよりも５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が強いことが明らかになった。
活性（％）＝｛（－２０℃で２４時間曝露した場合のバンドの定量値）－（３７℃で２４時間曝露した場合のバンドの定量値）｝／｛－２０℃で２４時間曝露した場合のバンドの定量値｝×１００
各サンプルを分析した際のバンド面積の定量値を表３に示した。いずれのポリメラーゼにおいても、３７℃で２４時間曝露した場合では、－２０℃で２４時間曝露した場合に比べて、バンドの定量値が低下し、基質ＤＮＡの分解が確認された。ここで、各ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を下記の式で算出した。また、今回の結果から、野生型Ｔｔｈポリメラーゼ及び国際公開第２０１８／０９６９６１号に記載のＴｔｈポリメラーゼ（変異体）は活性がそれぞれ９７％、９９％となり、活性４４％を示したＴａｑポリメラーゼよりも５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が強いことが明らかになった。
活性（％）＝｛（－２０℃で２４時間曝露した場合のバンドの定量値）－（３７℃で２４時間曝露した場合のバンドの定量値）｝／｛－２０℃で２４時間曝露した場合のバンドの定量値｝×１００
【0062】
【表3】
【0063】
試験例４．蛍光標識基質ＤＮＡを用いた５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の評価
配列番号２から４に記載の蛍光標識基質ＤＮＡプローブ及び配列番号６から８に記載のオリゴＤＮＡを組み合わせて、蛍光標識二本鎖ポリヌクレオチド基質（蛍光標識基質ＤＮＡ）を調製し、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による分解を受けるかを確認した。なお、本試験例で調製した基質はいずれも異なる配列を有するように設計した。
配列番号２から４に記載の蛍光標識基質ＤＮＡプローブ及び配列番号６から８に記載のオリゴＤＮＡを組み合わせて、蛍光標識二本鎖ポリヌクレオチド基質（蛍光標識基質ＤＮＡ）を調製し、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による分解を受けるかを確認した。なお、本試験例で調製した基質はいずれも異なる配列を有するように設計した。
【0064】
（１）反応液
活性測定用ミックス４：
Ｔｔｈポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＴＨ－３０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３μＭ 蛍光標識基質ＤＮＡ；
活性測定用ミックス４：
Ｔｔｈポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＴＨ－３０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３μＭ 蛍光標識基質ＤＮＡ；
【0065】
［蛍光標識基質ＤＮＡ］
配列番号２から４に示される配列の５’末端をＦＡＭ及び３’末端をＢＨＱ１で標識した蛍光標識基質ＤＮＡプローブを設計した。各配列はそれぞれ別個に合成し、下記表４の組み合わせとなるように、配列番号２及び６、配列番号３及び７、配列番号４及び８の組み合わせで等量に混合して二本鎖を形成させ、蛍光標識基質ＤＮＡとした。
配列番号２から４に示される配列の５’末端をＦＡＭ及び３’末端をＢＨＱ１で標識した蛍光標識基質ＤＮＡプローブを設計した。各配列はそれぞれ別個に合成し、下記表４の組み合わせとなるように、配列番号２及び６、配列番号３及び７、配列番号４及び８の組み合わせで等量に混合して二本鎖を形成させ、蛍光標識基質ＤＮＡとした。
【0066】
（２）反応
前記活性測定ミックス４を２０μＬずつ調製し、－２０℃又は３７℃で２４時間曝露した。その後、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。６０℃、４５秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
（温度サイクル）
工程１：９５℃ １分
工程２：９５℃ １５秒－６０℃ ４５秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
前記活性測定ミックス４を２０μＬずつ調製し、－２０℃又は３７℃で２４時間曝露した。その後、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。６０℃、４５秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
（温度サイクル）
工程１：９５℃ １分
工程２：９５℃ １５秒－６０℃ ４５秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
【0067】
（３）結果
リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）で測定したＭｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｄａｔａにおける１０サイクル目の蛍光値を表４に示す。いずれの蛍光標識基質ＤＮＡにおいても、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの存在下で、３７℃で２４時間曝露した場合では、－２０℃で２４時間曝露した場合に比べて、蛍光値の上昇が確認された。従って、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって基質ＤＮＡは分解されており、蛍光標識基質ＤＮＡを用いても５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を評価できることを確認した。
リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）で測定したＭｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｄａｔａにおける１０サイクル目の蛍光値を表４に示す。いずれの蛍光標識基質ＤＮＡにおいても、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの存在下で、３７℃で２４時間曝露した場合では、－２０℃で２４時間曝露した場合に比べて、蛍光値の上昇が確認された。従って、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって基質ＤＮＡは分解されており、蛍光標識基質ＤＮＡを用いても５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を評価できることを確認した。
【0068】
【表4】
【0069】
試験例５．５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害剤の評価
配列番号４及び８に記載のオリゴＤＮＡから構成される二本鎖ポリヌクレオチド基質（基質ＤＮＡ）を設計し、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する化合物の評価を行った。
配列番号４及び８に記載のオリゴＤＮＡから構成される二本鎖ポリヌクレオチド基質（基質ＤＮＡ）を設計し、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する化合物の評価を行った。
【0070】
（１）反応液
活性測定用ミックス１：
Ｔｔｈポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＴＨ－３０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３μＭ 基質ＤＮＡ；
活性測定用ミックス１：
Ｔｔｈポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＴＨ－３０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３μＭ 基質ＤＮＡ；
【0071】
［基質ＤＮＡ］
配列番号４及び配列番号８に示されるオリゴＤＮＡをそれぞれ別個に合成し、等量に組み合わせて混合して二本鎖を形成させ、基質ＤＮＡとした。
配列番号４及び配列番号８に示されるオリゴＤＮＡをそれぞれ別個に合成し、等量に組み合わせて混合して二本鎖を形成させ、基質ＤＮＡとした。
【0072】
［５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害剤］
再表２０１６／１３６３２４号公報において５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害によるプローブ安定化効果を確認しているフェナントロリン、エチレンジアミン四酢酸（以下、ＥＤＴＡ）を選定した。
再表２０１６／１３６３２４号公報において５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害によるプローブ安定化効果を確認しているフェナントロリン、エチレンジアミン四酢酸（以下、ＥＤＴＡ）を選定した。
【0073】
（２）反応
前記活性測定ミックス１において、阻害剤なし（０ｍＭ）、フェナントロリン２０，４０ｍＭ、ＥＤＴＡ２０，４０ｍＭとなるように調整した反応液を２０μＬずつ調製し、２５℃で２４時間曝露した。その後、ＤＮＡ／ＲＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置（ＭｕｌｔｉＮＡ、株式会社島津製作所）およびＤＮＡ－５００キット（製品コード：Ｓ２９２－２７９１０－９１、株式会社島津製作所）を使用して、各サンプルを分析した。
前記活性測定ミックス１において、阻害剤なし（０ｍＭ）、フェナントロリン２０，４０ｍＭ、ＥＤＴＡ２０，４０ｍＭとなるように調整した反応液を２０μＬずつ調製し、２５℃で２４時間曝露した。その後、ＤＮＡ／ＲＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置（ＭｕｌｔｉＮＡ、株式会社島津製作所）およびＤＮＡ－５００キット（製品コード：Ｓ２９２－２７９１０－９１、株式会社島津製作所）を使用して、各サンプルを分析した。
【0074】
（３）結果
各サンプルを分析した際のバンド面積の定量値を表５に示した。ここでは、最も配列長の長いバンドを基質ＤＮＡとして面積値を算出し、基質ＤＮＡよりも短いバンドは断片化されたＤＮＡとして面積値の合計を算出した。下記の式から、基質ＤＮＡ中の分解されたＤＮＡの割合を分解率（％）として算出した。
分解率（％）＝｛断片化された面積値の合計（ｍＶ・μｍ）｝／｛基質ＤＮＡの面積値（ｍＶ・μｍ）＋断片化されたＤＮＡの面積値の合計（ｍＶ・μｍ）｝×１００
阻害剤なしの分解率３６％に対して、フェナントロリン及びＥＤＴＡを２０ｍＭ以上添加した場合では分解率は１～５％まで低減し、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害能を確認できた。
各サンプルを分析した際のバンド面積の定量値を表５に示した。ここでは、最も配列長の長いバンドを基質ＤＮＡとして面積値を算出し、基質ＤＮＡよりも短いバンドは断片化されたＤＮＡとして面積値の合計を算出した。下記の式から、基質ＤＮＡ中の分解されたＤＮＡの割合を分解率（％）として算出した。
分解率（％）＝｛断片化された面積値の合計（ｍＶ・μｍ）｝／｛基質ＤＮＡの面積値（ｍＶ・μｍ）＋断片化されたＤＮＡの面積値の合計（ｍＶ・μｍ）｝×１００
阻害剤なしの分解率３６％に対して、フェナントロリン及びＥＤＴＡを２０ｍＭ以上添加した場合では分解率は１～５％まで低減し、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害能を確認できた。
【0075】
【表5】
【0076】
上記の結果に示されるように、本発明の基質組成物を用いることにより、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する物質を評価でき、そのような阻害物質のクリーニング及び阻害物質の効果の程度を適正に評価できることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【0077】
本発明により、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を高精度にすることができる。本発明は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する物質の効率的なスクリーニングや開発に役立ち、長期間保管しても安定な核酸増幅試薬の開発等に貢献できる。
【図1】
【図2】
【配列表】