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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022182361
(43)【公開日】2022-12-08
(54)【発明の名称】微小有用物質の分離精製方法と分離精製装置
(51)【国際特許分類】
C07K 1/34 20060101AFI20221201BHJP
B01D 61/14 20060101ALI20221201BHJP
B01D 61/58 20060101ALI20221201BHJP
B01D 63/02 20060101ALI20221201BHJP
B01D 69/00 20060101ALI20221201BHJP
B01D 69/02 20060101ALI20221201BHJP
B01D 69/08 20060101ALI20221201BHJP
C12M 1/12 20060101ALI20221201BHJP
C12N 15/10 20060101ALN20221201BHJP
C12N 5/071 20100101ALN20221201BHJP
【ＦＩ】
C07K1/34
B01D61/14 500
B01D61/58
B01D63/02
B01D69/00
B01D69/02
B01D69/08
C12M1/12
C12N15/10 120Z
C12N5/071
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021089878
(22)【出願日】2021-05-28
(71)【出願人】
【識別番号】594152620
【氏名又は名称】ダイセン・メンブレン・システムズ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100087642
【弁理士】
【氏名又は名称】古谷 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100098408
【弁理士】
【氏名又は名称】義経 和昌
(72)【発明者】
【氏名】中塚 修志
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
4D006
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B029AA09
4B029AA27
4B029BB11
4B029BB13
4B029BB15
4B029BB17
4B029BB20
4B029CC01
4B029DG08
4B029HA05
4B029HA06
4B065AA90X
4B065AA95X
4B065BD18
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4D006GA07
4D006HA01
4D006JA13Z
4D006JA15Z
4D006JA18Z
4D006JA25Z
4D006JA67C
4D006JA67Z
4D006JB04
4D006KA12
4D006KA17
4D006KA33
4D006KA52
4D006KA54
4D006KA56
4D006KB30
4D006KD30
4D006KE02R
4D006KE07R
4D006KE09R
4D006KE22Q
4D006KE23Q
4D006MA01
4D006MA22
4D006MA33
4D006MB09
4D006MB10
4D006MC11
4D006MC12
4D006MC17
4D006MC18
4D006MC63
4D006PA04
4D006PB20
4D006PB52
4D006PB55
4D006PB59
4D006PC41
4H045AA20
4H045AA40
4H045CA01
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA72
4H045GA10
(57)【要約】
【課題】微小有用物質の分離精製方法の提供。
【解決手段】微小有用物質を含む液体を中空糸膜によりろ過する微小有用物質の分離精製方法であって、前記中空糸膜が、内径が0.2～1.4mm、分画分子量が10万～100万のものであり、前記ろ過方法が、微小有用物質を含む液体を中空糸膜の一端側の第１開口部から圧入してろ過し、透過液と第１濃縮液に分離する第１ろ過工程と、第１濃縮液を中空糸膜の他端側の第２開口部から圧入してろ過し、透過液と第２濃縮液に分離する第２ろ過工程を有しており、第１ろ過工程と第２ろ過工程を膜面速度が0.3～2m/secで交互に複数回実施するろ過により前記微小有用物質の濃度が高められた濃縮液を得る方法。
【選択図】なし
【解決手段】微小有用物質を含む液体を中空糸膜によりろ過する微小有用物質の分離精製方法であって、前記中空糸膜が、内径が0.2～1.4mm、分画分子量が10万～100万のものであり、前記ろ過方法が、微小有用物質を含む液体を中空糸膜の一端側の第１開口部から圧入してろ過し、透過液と第１濃縮液に分離する第１ろ過工程と、第１濃縮液を中空糸膜の他端側の第２開口部から圧入してろ過し、透過液と第２濃縮液に分離する第２ろ過工程を有しており、第１ろ過工程と第２ろ過工程を膜面速度が0.3～2m/secで交互に複数回実施するろ過により前記微小有用物質の濃度が高められた濃縮液を得る方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
微小有用物質を含む液体を中空糸膜によりろ過する微小有用物質の分離精製方法であって、
前記中空糸膜が、内径が０．２ｍｍ～１．４ｍｍ、分画分子量が１０万～１００万のものであり、
前記ろ過方法が、
前記微小有用物質を含む液体を前記中空糸膜の一端側の第１開口部から圧入してろ過し、透過液と第１濃縮液に分離する第１ろ過工程と、
前記第１濃縮液を前記中空糸膜の他端側の第２開口部から圧入してろ過し、透過液と第２濃縮液に分離する第２ろ過工程を有しており、
前記第１ろ過工程と前記第２ろ過工程を交互に複数回実施する交互タンジェンシャルフローろ過により前記微小有用物質の濃度が高められた濃縮液を得る方法であり、
前記第１ろ過工程と前記第２ろ過工程における膜面速度が０．３ｍ／sec～２ｍ／secである、微小有用物質の分離精製方法。
前記中空糸膜が、内径が０．２ｍｍ～１．４ｍｍ、分画分子量が１０万～１００万のものであり、
前記ろ過方法が、
前記微小有用物質を含む液体を前記中空糸膜の一端側の第１開口部から圧入してろ過し、透過液と第１濃縮液に分離する第１ろ過工程と、
前記第１濃縮液を前記中空糸膜の他端側の第２開口部から圧入してろ過し、透過液と第２濃縮液に分離する第２ろ過工程を有しており、
前記第１ろ過工程と前記第２ろ過工程を交互に複数回実施する交互タンジェンシャルフローろ過により前記微小有用物質の濃度が高められた濃縮液を得る方法であり、
前記第１ろ過工程と前記第２ろ過工程における膜面速度が０．３ｍ／sec～２ｍ／secである、微小有用物質の分離精製方法。
【請求項2】
前記ろ過方法が、前記微小有用物質を含む液体を孔径０．１μm～０．５μmの精密ろ過膜によりろ過した後、前記精密ろ過膜のろ過液を使用し、前記第１ろ過工程と前記第２ろ過工程を交互に複数回実施する工程である、請求項１記載の微小有用物質の分離精製方法。
【請求項3】
前記第１ろ過工程を実施するとき、微小有用物質を含む液体または前記第２ろ過工程で得られた第２濃縮液に対して緩衝液を加えて希釈した後、前記第１ろ過工程を実施する、請求項１または２記載の微小有用物質の分離精製方法。
【請求項4】
前記第１ろ過工程と前記第２ろ過工程が、窒素ガス、不活性ガス、二酸化炭素、ＨＥＰＡフィルターでろ過された空気から選ばれるガスを導入することで圧入して実施されるものである、請求項１～３のいずれか１項記載の微小有用物質の分離精製方法。
【請求項5】
前記微小有用物質が、エクソソーム、抗体、ウィルス、タンパク質、核酸から選ばれるものである、請求項１～３のいずれか１項記載の微小有用物質の分離精製方法。
【請求項6】
前記中空糸膜が、複数の液出入口を有するケースハウジング内に複数本の中空糸膜が収容されている中空糸膜モジュールである、請求項１～３のいずれか１項記載の微小有用物質の分離精製方法。
【請求項7】
前記第１ろ過工程と前記第２ろ過工程を交互に実施するとき、前記実施回数が増加するにつれて第１ろ過工程におけるろ過対象の希釈倍数を増加させる、請求項１～６のいずれか１項記載の微小有用物質の分離精製方法。
【請求項8】
前記第１ろ過工程と前記第２ろ過工程を交互に実施するとき、前記実施回数が増加するにつれて２容量倍～１５容量倍の範囲で第１ろ過工程におけるろ過対象の希釈倍数を増加させる、請求項１～６のいずれか１項記載の微小有用物質の分離精製方法。
【請求項9】
請求項１記載の微小有用物質の分離精製方法を実施するための分離精製装置であって、
前記微小有用物質を含む液体が入る第１タンクと、
前記第１タンクとは間隔をおいて配置されている第２タンクと、
前記第１タンクの液体出入口と前記第２タンクの液体出入口を接続して配置されている中空糸膜と、
前記第１タンクと送液ラインにより送液可能に接続されている緩衝液タンクと、
前記中空糸膜によりろ過された透過液を貯める透過液タンクと、
前記第１タンク内部の液体と前記第２タンク内部の液体の一方に対して加圧することができる加圧装置を有している、微小有用物質を分離精製するための分離精製装置。
前記微小有用物質を含む液体が入る第１タンクと、
前記第１タンクとは間隔をおいて配置されている第２タンクと、
前記第１タンクの液体出入口と前記第２タンクの液体出入口を接続して配置されている中空糸膜と、
前記第１タンクと送液ラインにより送液可能に接続されている緩衝液タンクと、
前記中空糸膜によりろ過された透過液を貯める透過液タンクと、
前記第１タンク内部の液体と前記第２タンク内部の液体の一方に対して加圧することができる加圧装置を有している、微小有用物質を分離精製するための分離精製装置。
【請求項10】
請求項２記載の微小有用物質の分離精製方法を実施するための分離精製装置であって、
孔径０．１μm～０．５μmの精密ろ過膜と、
前記精密ろ過膜のろ過液出口と送液ラインで接続されている、前記微小有用物質を含む液体が入る第１タンクと、
前記第１タンクとは間隔をおいて配置されている第２タンクと、
前記第１タンクの液体出入口と前記第２タンクの液体出入口を接続して配置されている中空糸膜と、
前記第１タンクと送液ラインにより送液可能に接続されている緩衝液タンクと、
前記中空糸膜によりろ過された透過液を貯める透過液タンクと、
前記第１タンク内部の液体と前記第２タンク内部の液体の一方に対して加圧することができる加圧装置を有している、微小有用物質の分離精製方法を実施するための分離精製装置。
孔径０．１μm～０．５μmの精密ろ過膜と、
前記精密ろ過膜のろ過液出口と送液ラインで接続されている、前記微小有用物質を含む液体が入る第１タンクと、
前記第１タンクとは間隔をおいて配置されている第２タンクと、
前記第１タンクの液体出入口と前記第２タンクの液体出入口を接続して配置されている中空糸膜と、
前記第１タンクと送液ラインにより送液可能に接続されている緩衝液タンクと、
前記中空糸膜によりろ過された透過液を貯める透過液タンクと、
前記第１タンク内部の液体と前記第２タンク内部の液体の一方に対して加圧することができる加圧装置を有している、微小有用物質の分離精製方法を実施するための分離精製装置。
【請求項11】
前記第１タンクと前記第２タンクが、目視で内部の液面が観察できる透明性を有しているものである、請求項９または１０記載の微小有用物質の分離精製方法を実施するための分離精製装置。
【請求項12】
前記第１タンクの液体出入口を含む部分の前記中空糸膜との接続部分が、前記第１タンク側から前記中空糸膜側に径が小さくなるような円錐状の傾斜面を有しているものであり、
前記第２タンクの液体出入口を含む部分の前記中空糸膜との接続部分が、前記第２タンク側から前記中空糸膜側に径が小さくなるような円錐状の傾斜面を有しているものである、請求項９または１０記載の微小有用物質の分離精製方法を実施するための分離精製装置。
前記第２タンクの液体出入口を含む部分の前記中空糸膜との接続部分が、前記第２タンク側から前記中空糸膜側に径が小さくなるような円錐状の傾斜面を有しているものである、請求項９または１０記載の微小有用物質の分離精製方法を実施するための分離精製装置。
【請求項13】
前記中空糸膜が、少なくとも一端部側が接着剤で封止された、５～５０本の中空糸膜からなる中空糸膜束がケースハウジング内に収容された中空糸膜モジュールであって、
前記ケースハウジングが三方の液出入口を有し、前記三方の液出入口の中の一つが透過液口であり、前記透過液口が透過液タンクと接続されており、
前記透過液口を除いた二つの液出入口が、それぞれ前記第１タンクの液体出入口および前記第２タンクの液体出入口に接続されているものである、請求項９～１２のいずれか１項記載の微小有用物質の分離精製方法を実施するための分離精製装置。
前記ケースハウジングが三方の液出入口を有し、前記三方の液出入口の中の一つが透過液口であり、前記透過液口が透過液タンクと接続されており、
前記透過液口を除いた二つの液出入口が、それぞれ前記第１タンクの液体出入口および前記第２タンクの液体出入口に接続されているものである、請求項９～１２のいずれか１項記載の微小有用物質の分離精製方法を実施するための分離精製装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、エクソソーム、抗体、ウィルス、タンパク質、核酸などから選ばれるものである微小有用物質を分離精製するための分離精製方法と、前記分離精製方法を実施するための分離精製装置に関する。
【背景技術】
【0002】
培養液から有用物を分離精製する方法として、分離膜を使用した方法が知られている。
特許文献１は、単細胞藻類の培養液を分画分子量10,000～1,000,000の中空糸型限外濾過膜（UF膜）モジュールを用いてクロスフロー濾過することにより濃縮するに際して、定期的な伏流洗浄を行う単細胞藻類培養液の濃縮方法の発明が記載されている。
クロスフロー濾過により培養液を濃縮すると、ＵＦ膜の外側に濃縮液が存在し、ＵＦ膜の内側に透過液が入る。
伏流洗浄をすると、洗浄水はＵＦ膜の内側に入った後、ＵＦ膜の外側に出てくることでＵＦ膜が洗浄される。
特許文献１は、単細胞藻類の培養液を分画分子量10,000～1,000,000の中空糸型限外濾過膜（UF膜）モジュールを用いてクロスフロー濾過することにより濃縮するに際して、定期的な伏流洗浄を行う単細胞藻類培養液の濃縮方法の発明が記載されている。
クロスフロー濾過により培養液を濃縮すると、ＵＦ膜の外側に濃縮液が存在し、ＵＦ膜の内側に透過液が入る。
伏流洗浄をすると、洗浄水はＵＦ膜の内側に入った後、ＵＦ膜の外側に出てくることでＵＦ膜が洗浄される。
【0003】
特許文献２は、細胞の培養槽から培養液を排出し、排出した培養液と同量の新鮮培地を前記培養槽に加えるブリーディング工程と、前記培養槽から抽出した培養液を、実質的に緻密層を有しない多孔膜を用いて濾過する濾過工程とを含み、前記濾過工程における濾過がタンジェンシャルフロー濾過であり、前記濾過工程における透過液の速度が１．０ＬＭＨ以下である、有用物質を回収する方法の発明が記載されている。
前記有用物質は、タンパク質、ウイルス、エクソソーム、及び核酸からなる群から選択されることが記載されている。
前記タンジェンシャルフロー濾過は、交互タンジェンシャルフロー濾過も実施できることが記載されている。
前記有用物質は、タンパク質、ウイルス、エクソソーム、及び核酸からなる群から選択されることが記載されている。
前記タンジェンシャルフロー濾過は、交互タンジェンシャルフロー濾過も実施できることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開平３－３９０８４号公報
【特許文献2】特開２０１８－７６２９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本開示は、エクソソーム、抗体、ウィルス、タンパク質、核酸などから選ばれる微小有用物質を分離精製するための分離精製方法と、前記分離精製方法を実施するための分離精製装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本開示は、微小有用物質を含む液体を中空糸膜によりろ過する微小有用物質の分離精製方法であって、
前記中空糸膜が、内径が０．２ｍｍ～１．４ｍｍ、分画分子量が１０万～１００万のものであり、
前記ろ過方法が、
前記微小有用物質を含む液体を前記中空糸膜の一端側の第１開口部から圧入してろ過し、透過液と第１濃縮液に分離する第１ろ過工程と、
前記第１濃縮液を前記中空糸膜の他端側の第２開口部から圧入してろ過し、透過液と第２濃縮液に分離する第２ろ過工程を有しており、
前記第１ろ過工程と前記第２ろ過工程を交互に複数回実施する交互タンジェンシャルフローろ過により前記微小有用物質の濃度が高められた濃縮液を得る方法であり、
前記第１ろ過工程と前記第２ろ過工程における膜面速度が０．３ｍ／sec～２ｍ／secである、微小有用物質の分離精製方法と、前記分離精製方法を実施するための分離精製装置を提供する。
前記中空糸膜が、内径が０．２ｍｍ～１．４ｍｍ、分画分子量が１０万～１００万のものであり、
前記ろ過方法が、
前記微小有用物質を含む液体を前記中空糸膜の一端側の第１開口部から圧入してろ過し、透過液と第１濃縮液に分離する第１ろ過工程と、
前記第１濃縮液を前記中空糸膜の他端側の第２開口部から圧入してろ過し、透過液と第２濃縮液に分離する第２ろ過工程を有しており、
前記第１ろ過工程と前記第２ろ過工程を交互に複数回実施する交互タンジェンシャルフローろ過により前記微小有用物質の濃度が高められた濃縮液を得る方法であり、
前記第１ろ過工程と前記第２ろ過工程における膜面速度が０．３ｍ／sec～２ｍ／secである、微小有用物質の分離精製方法と、前記分離精製方法を実施するための分離精製装置を提供する。
【発明の効果】
【0007】
本開示の微小有用物質の分離精製方法と分離精製装置によれば、エクソソーム、抗体、ウィルス、タンパク質、核酸などの微小有用物質を高い濃度まで濃縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【発明を実施するための形態】
【0009】
図１に示す分離精製装置１を使用した製造フローによって、微小有用物質の分離精製方法の一実施形態を説明する。
第１工程では、微小有用物質を含む液体を第１タンク１０内に入れる。
微小有用物質を含む液体が微小有用物質を含む培養液であるときは、上清液を第１タンク１０内に入れることが好ましい。
微小有用物質は、エクソソーム、抗体、ウィルス、タンパク質、核酸などから選ばれるものを挙げることができる。
第１工程では、微小有用物質を含む液体を第１タンク１０内に入れる。
微小有用物質を含む液体が微小有用物質を含む培養液であるときは、上清液を第１タンク１０内に入れることが好ましい。
微小有用物質は、エクソソーム、抗体、ウィルス、タンパク質、核酸などから選ばれるものを挙げることができる。
【0010】
第１タンク１０は、図１ではシリンダー形状であるが、これに限定されるものではなく、形状および容積は設置場所の状況や処理量に応じて決定することができる。
第１タンク１０は、目視で内部の液面が観察できる透明性を有しているものが好ましく、さらに第１タンク１０の内壁面に液体が付着して残留することを防止するため、撥水性を有している材料からなるものが好ましい。
第１タンク１０は、一部または全部が、ポリアクリロニトリル、ポリアクリル酸エステルなどのアクリル系樹脂、ポリカーボネート、フッ素樹脂からなるものが好ましい。
第１タンク１０には、第１タンク１０内から最終的な濃縮液を取り出すための取り出しラインを設けることができる。
第１タンク１０は、目視で内部の液面が観察できる透明性を有しているものが好ましく、さらに第１タンク１０の内壁面に液体が付着して残留することを防止するため、撥水性を有している材料からなるものが好ましい。
第１タンク１０は、一部または全部が、ポリアクリロニトリル、ポリアクリル酸エステルなどのアクリル系樹脂、ポリカーボネート、フッ素樹脂からなるものが好ましい。
第１タンク１０には、第１タンク１０内から最終的な濃縮液を取り出すための取り出しラインを設けることができる。
【0011】
図２に示すとおり、第１タンク１０の液体出入口１０ａを含む部分の中空糸膜３０との接続部１１は、第１タンク１０側から中空糸膜３０側に径が小さくなるような円錐状の傾斜面１１ａと筒状の垂直面１１ｂを有している。
図２では、接続部１１は円錐状の傾斜面１１ａと筒状の垂直面１１ｂを有しているが、円錐状の傾斜面１１ａを有していれば、筒状の垂直面１１ｂはなくてもよい。
図２に示す接続部１１を有していると、微小有用物質を含む液体またはその濃縮液が第１タンク１０の底部側に滞留することが防止でき、微小有用物質の回収率を高めることができるので好ましい。
図２では、接続部１１は円錐状の傾斜面１１ａと筒状の垂直面１１ｂを有しているが、円錐状の傾斜面１１ａを有していれば、筒状の垂直面１１ｂはなくてもよい。
図２に示す接続部１１を有していると、微小有用物質を含む液体またはその濃縮液が第１タンク１０の底部側に滞留することが防止でき、微小有用物質の回収率を高めることができるので好ましい。
【0012】
第１工程の前には、必要に応じて精密ろ過膜（精密ろ過膜モジュール）による前処理工程を実施することができる。
精密ろ過膜（精密ろ過膜モジュール）は、孔径０．１μm～０．５μmのものが好ましい。
前処理工程において、微小有用物質を含む液体を精密ろ過膜（精密ろ過膜モジュール）によりろ過したろ過液（前処理液）は、第１タンク１０に送る。
精密ろ過膜（精密ろ過膜モジュール）は、孔径０．１μm～０．５μmのものが好ましい。
前処理工程において、微小有用物質を含む液体を精密ろ過膜（精密ろ過膜モジュール）によりろ過したろ過液（前処理液）は、第１タンク１０に送る。
【0013】
第２工程では、開閉バルブ（電磁バルブなど）４６を開けた状態で、緩衝液タンク４０内の緩衝液を緩衝液送液ライン４５から第１タンク１０内に供給して微小有用物質を含む液体（または前処理液）を希釈する。
第１タンク１０内に微小有用物質を含む液体（または前処理液）の希釈液が入った状態では、第１タンク１０の上部には前記希釈液が存在していない空間が残っている。
緩衝液タンク４０内の緩衝液は医療用又は生化学用の緩衝液が好ましく、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、トリス塩酸緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液などを使用することができる。
緩衝液タンク４０に緩衝液を補充するときは、緩衝液補充ライン４１から補充する。
なお、第１工程と第２工程の順序は逆にして、緩衝液タンク４０内の緩衝液を緩衝液送液ライン４５から第１タンク１０内に供給した後、微小有用物質を含む液体を第１タンク１０内に入れることもできる。
また、第１工程と第２工程を一つの工程にして、別途設けた混合タンク内に微小有用物質を含む液体と緩衝液を添加混合して、微小有用物質を含む液体の希釈液を調製した後、前記希釈液を第１タンク１０内に入れることもできる。
第１タンク１０内に微小有用物質を含む液体（または前処理液）の希釈液が入った状態では、第１タンク１０の上部には前記希釈液が存在していない空間が残っている。
緩衝液タンク４０内の緩衝液は医療用又は生化学用の緩衝液が好ましく、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、トリス塩酸緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液などを使用することができる。
緩衝液タンク４０に緩衝液を補充するときは、緩衝液補充ライン４１から補充する。
なお、第１工程と第２工程の順序は逆にして、緩衝液タンク４０内の緩衝液を緩衝液送液ライン４５から第１タンク１０内に供給した後、微小有用物質を含む液体を第１タンク１０内に入れることもできる。
また、第１工程と第２工程を一つの工程にして、別途設けた混合タンク内に微小有用物質を含む液体と緩衝液を添加混合して、微小有用物質を含む液体の希釈液を調製した後、前記希釈液を第１タンク１０内に入れることもできる。
【0014】
第３工程では、図示していないポンプなどを作動させ、図示していないガス供給源からガスを第１タンク１０内に供給し、第１タンク１０内の微小有用物質を含む液体を加圧することで、微小有用物質を含む液体を中空糸膜３０の内側に圧入してろ過する第１ろ過工程を実施する。
なお、本開示では、第１タンク１０内の液体を中空糸膜３０でろ過して第２タンク２０に送る工程を全て第１ろ過工程という。
加圧のためのガスは、三方弁６１を切り替えて、圧力計５１を備えたガス供給ライン５２と第１タンクガス供給ライン５３を通して送る。このとき、開閉バルブ４６、第１ガス抜きライン５５の開閉バルブ６２は閉じておき、第２ガス抜きライン５６の開閉バルブ６３は開けておく。
ガスは、窒素ガス、アルゴン、ヘリウムなどの不活性ガス、二酸化炭素、ＨＥＰＡフィルターなどでろ過された清浄な空気などから選ばれるガスを使用することができる。
ろ過した透過液は透過液タンク３５に貯め、微小有用物質を含む濃縮液（第１濃縮液）を第２タンク２０に送る。
第２タンク２０内に第１濃縮液が入った状態では、第２タンク２０の上部には第１濃縮液が存在していない空間が残っている。
なお、本開示では、第１タンク１０内の液体を中空糸膜３０でろ過して第２タンク２０に送る工程を全て第１ろ過工程という。
加圧のためのガスは、三方弁６１を切り替えて、圧力計５１を備えたガス供給ライン５２と第１タンクガス供給ライン５３を通して送る。このとき、開閉バルブ４６、第１ガス抜きライン５５の開閉バルブ６２は閉じておき、第２ガス抜きライン５６の開閉バルブ６３は開けておく。
ガスは、窒素ガス、アルゴン、ヘリウムなどの不活性ガス、二酸化炭素、ＨＥＰＡフィルターなどでろ過された清浄な空気などから選ばれるガスを使用することができる。
ろ過した透過液は透過液タンク３５に貯め、微小有用物質を含む濃縮液（第１濃縮液）を第２タンク２０に送る。
第２タンク２０内に第１濃縮液が入った状態では、第２タンク２０の上部には第１濃縮液が存在していない空間が残っている。
【0015】
中空糸膜３０は、内径０．２ｍｍ～１．４ｍｍが好ましく、内径０．２ｍｍ～１．０ｍｍがより好ましく、内径０．４ｍｍ～１．０ｍｍがさらに好ましい。
中空糸膜３０は、分画分子量が１０万～１００万の限外濾過膜が好ましく、分画分子量が２０万～８０万の限外濾過膜がより好ましく、分画分子量が３０万～６０万の限外濾過膜がさらに好ましい。分画分子量は、リン酸緩衝液中のγグロブリン（SIGMA製 牛血清γグロブリン、分子量１５万）１００mg/Lの溶液を中空糸膜３０にろ過圧力０．１MPaでクロスフロー透過（膜面速度：0.2m/s）させた場合のγブロブリンの透過率％（（透過液中のγグロブリン濃度／溶液中のγグロブリン濃度（１００mg/L）×１００）によって評価される。中空糸膜３０は、γグロブリンの透過率が５％～９５％、１０～８０％がより好ましく、３０～７０％がさらに好ましい。
中空糸膜３０は、ポリエーテルスルホン膜などの疎水性膜でもよいし、セルロース系の親水性膜でもよいが、セルロース系の親水性膜が好ましい。セルロース系の親水性膜としては、酢酸セルロース膜、再生セルロース膜、セルロースプロピオネート膜、セルロースブチレート膜、セルロースベンゾエート膜などを挙げることができる。
中空糸膜３０は、ダイセン・メンブレン・システムズ（株）のFUS5082（ポリエーテルスルホン膜；分画分子量５０万、γグロブリン透過率７０％）、ダイセン・メンブレン・システムズ（株）のFUC1582（酢酸セルロース膜；分画分子量１５万、γグロブリン透過率１０％）などを使用することができる。
中空糸膜３０は、分画分子量が１０万～１００万の限外濾過膜が好ましく、分画分子量が２０万～８０万の限外濾過膜がより好ましく、分画分子量が３０万～６０万の限外濾過膜がさらに好ましい。分画分子量は、リン酸緩衝液中のγグロブリン（SIGMA製 牛血清γグロブリン、分子量１５万）１００mg/Lの溶液を中空糸膜３０にろ過圧力０．１MPaでクロスフロー透過（膜面速度：0.2m/s）させた場合のγブロブリンの透過率％（（透過液中のγグロブリン濃度／溶液中のγグロブリン濃度（１００mg/L）×１００）によって評価される。中空糸膜３０は、γグロブリンの透過率が５％～９５％、１０～８０％がより好ましく、３０～７０％がさらに好ましい。
中空糸膜３０は、ポリエーテルスルホン膜などの疎水性膜でもよいし、セルロース系の親水性膜でもよいが、セルロース系の親水性膜が好ましい。セルロース系の親水性膜としては、酢酸セルロース膜、再生セルロース膜、セルロースプロピオネート膜、セルロースブチレート膜、セルロースベンゾエート膜などを挙げることができる。
中空糸膜３０は、ダイセン・メンブレン・システムズ（株）のFUS5082（ポリエーテルスルホン膜；分画分子量５０万、γグロブリン透過率７０％）、ダイセン・メンブレン・システムズ（株）のFUC1582（酢酸セルロース膜；分画分子量１５万、γグロブリン透過率１０％）などを使用することができる。
【0016】
中空糸膜３０は、第１タンク１０の液体出入口１０ａと第２タンク２０の液体出入口２０ａを接続して配置されている。
中空糸膜３０と第１タンク１０の液体出入口１０ａとの接続は、例えば、第１タンク１０の液体出入口１０ａ側に固定された注射針のような細管に中空糸膜３０の開口端部を嵌め込むことで接続されている。中空糸膜３０と第２タンク２０の液体出入口２０ａとの接続も同様に実施することができる。
透過液タンク３５は、中空糸膜３０においてろ過して得られた透過液を貯めるためのものである。
図１では、透過液タンク３５は小さく示しているが、中空糸膜３０の大部分が中に入るような大きなタンクにすることもできる。
中空糸膜３０と第１タンク１０の液体出入口１０ａとの接続は、例えば、第１タンク１０の液体出入口１０ａ側に固定された注射針のような細管に中空糸膜３０の開口端部を嵌め込むことで接続されている。中空糸膜３０と第２タンク２０の液体出入口２０ａとの接続も同様に実施することができる。
透過液タンク３５は、中空糸膜３０においてろ過して得られた透過液を貯めるためのものである。
図１では、透過液タンク３５は小さく示しているが、中空糸膜３０の大部分が中に入るような大きなタンクにすることもできる。
【0017】
図１では、中空糸膜３０は１本が示されているが、複数本でもよく、例えば２～１５０本からなる中空糸膜束として使用することができる。
また、複数本の中空糸膜（中空糸膜束）３０が、複数の液出入口を有するケースハウジング中に収容された中空糸膜モジュールでもよい。前記中空糸膜束として使用するときは、一端部または両端部を接着剤で一体化することができる。
前記中空糸膜モジュールを使用する場合には、中空糸膜モジュールの複数の液出入口と第１タンク１０の液体出入口１０ａと第２タンク２０の液体出入口２０ａを接続し、さらに中空糸膜モジュールの残部の液出入口（液透過出口）と透過液タンク３５を接続する。
また、複数本の中空糸膜（中空糸膜束）３０が、複数の液出入口を有するケースハウジング中に収容された中空糸膜モジュールでもよい。前記中空糸膜束として使用するときは、一端部または両端部を接着剤で一体化することができる。
前記中空糸膜モジュールを使用する場合には、中空糸膜モジュールの複数の液出入口と第１タンク１０の液体出入口１０ａと第２タンク２０の液体出入口２０ａを接続し、さらに中空糸膜モジュールの残部の液出入口（液透過出口）と透過液タンク３５を接続する。
【0018】
第３工程のろ過は、膜面速度が０．３ｍ／sec～２ｍ／secの範囲でろ過することが好ましく、膜面速度が０．５ｍ／sec～１．５ｍ／secの範囲でろ過することがより好ましい。膜面速度が０．３ｍ／secを下回ると精製効率が低下し、逆に２ｍ／secを上回ると、膜面速度を上昇させるための圧力レベルが高くなりすぎてしまい、ろ過時において微小有用物質に対して加えられる剪断力も高くなりすぎる結果、微小有用物質を変質させるおそれがある。
前記膜面速度を前記範囲内に維持する方法は、中空糸膜３０の入口圧力（第１タンク１０の液体出入口１０ａ側）の圧力を０．０１ＭＰａ～０．２ＭＰａに調整することが好ましく、０．０２ＭＰａ～０．１５ＭＰａに調整することがより好ましく、０．０３ＭＰａ～０．１２ＭＰａに調整することがさらに好ましい。
前記膜面速度を前記範囲内に維持する方法は、中空糸膜３０の出口圧力（第２タンク２０の液体出入口２０ａ側）の圧力を０．０３ＭＰａ以下に調整することが好ましく、０．０１ＭＰａ以下に調整することがより好ましく、０ＭＰａに調整することがさらに好ましい。
前記膜面速度を前記範囲内に維持する方法は、中空糸膜３０の入口圧力（第１タンク１０の液体出入口１０ａ側）の圧力を０．０１ＭＰａ～０．２ＭＰａに調整することが好ましく、０．０２ＭＰａ～０．１５ＭＰａに調整することがより好ましく、０．０３ＭＰａ～０．１２ＭＰａに調整することがさらに好ましい。
前記膜面速度を前記範囲内に維持する方法は、中空糸膜３０の出口圧力（第２タンク２０の液体出入口２０ａ側）の圧力を０．０３ＭＰａ以下に調整することが好ましく、０．０１ＭＰａ以下に調整することがより好ましく、０ＭＰａに調整することがさらに好ましい。
【0019】
第４工程では、図示していないポンプなどを作動させ、図示していないガス供給源からガスを第２タンク２０内に供給し、第２タンク２０内の微小有用物質を含む液体（第１濃縮液）を加圧して、微小有用物質を含む液体を中空糸膜３０の内側に通してろ過する第２ろ過工程を実施する。
なお、本開示では、第２タンク２０内の液体を中空糸膜３０でろ過して第１タンク１０に送る工程を全て第２ろ過工程という。
ろ過した透過液 は透過液タンク３５に貯め、微小有用物質を含む濃縮液（第２濃縮液）を第１タンク１０に送る。
なお、本開示では、第２タンク２０内の液体を中空糸膜３０でろ過して第１タンク１０に送る工程を全て第２ろ過工程という。
ろ過した透過液 は透過液タンク３５に貯め、微小有用物質を含む濃縮液（第２濃縮液）を第１タンク１０に送る。
【0020】
第２タンク２０は、図１ではシリンダー形状であるが、これに限定されるものではなく、形状および容積は設置場所の状況や処理量に応じて決定することができる。
第２タンク２０は、目視で内部の液面が観察できる透明性を有しているものが好ましく、さらに第２タンク２０の内壁面に液体が付着して残留することを防止するため、撥水性を有しているものが好ましい。
第２タンク２０は、一部または全部が、ポリアクリロニトリル、ポリアクリル酸エステルなどのアクリル系樹脂、ポリカーボネート、フッ素樹脂からなるものが好ましい。
第１タンク１０と第２タンク２０は、同一形状で、同一容積であるものが好ましい。
第１タンク１０と第２タンク２０は、それぞれが間隔をおいて、同じ高さ位置になるように配置されている。
第２タンク２０は、目視で内部の液面が観察できる透明性を有しているものが好ましく、さらに第２タンク２０の内壁面に液体が付着して残留することを防止するため、撥水性を有しているものが好ましい。
第２タンク２０は、一部または全部が、ポリアクリロニトリル、ポリアクリル酸エステルなどのアクリル系樹脂、ポリカーボネート、フッ素樹脂からなるものが好ましい。
第１タンク１０と第２タンク２０は、同一形状で、同一容積であるものが好ましい。
第１タンク１０と第２タンク２０は、それぞれが間隔をおいて、同じ高さ位置になるように配置されている。
【0021】
加圧のためのガスは、三方弁６１を切り替えて、ガス供給ライン５２と第２タンクガス供給ライン５４を通して送る。このとき、第２ガス抜きライン５６の開閉バルブ６３、開閉バルブ４６は閉じておき、第１ガス抜きライン５５の開閉バルブ６２は開けておく。
ガスは、窒素ガス、アルゴン、ヘリウムなどの不活性ガス、二酸化炭素、ＨＥＰＡフィルターなどでろ過された清浄な空気などから選ばれるガスを使用することができる。
ガスは、窒素ガス、アルゴン、ヘリウムなどの不活性ガス、二酸化炭素、ＨＥＰＡフィルターなどでろ過された清浄な空気などから選ばれるガスを使用することができる。
【0022】
第４工程における膜面速度は第３工程の膜面速度と同じ範囲にすることが好ましい。
第４工程における中空糸膜３０の入口圧力（第２タンク２０の液体出入口２０ａ側）は、０．０１ＭＰａ～０．２ＭＰａに調整することが好ましく、０．０２ＭＰａ～０．１５ＭＰａに調整することがより好ましく、０．０３ＭＰａ～０．１２ＭＰａに調整することがさらに好ましい。
第４工程における中空糸膜３０の出口圧力（第１タンク１０の液体出入口１０ａ側）の圧力は、０．０３ＭＰａ以下に調整することが好ましく、０．０１ＭＰａ以下に調整することがより好ましく、０ＭＰａに調整することがさらに好ましい。
第３工程と第４工程は、ガス供給源からガス供給ライン５２を通してガスを連続的に供給しながら三方弁６１を切り替えることで、連続的に実施することができる。
第４工程における中空糸膜３０の入口圧力（第２タンク２０の液体出入口２０ａ側）は、０．０１ＭＰａ～０．２ＭＰａに調整することが好ましく、０．０２ＭＰａ～０．１５ＭＰａに調整することがより好ましく、０．０３ＭＰａ～０．１２ＭＰａに調整することがさらに好ましい。
第４工程における中空糸膜３０の出口圧力（第１タンク１０の液体出入口１０ａ側）の圧力は、０．０３ＭＰａ以下に調整することが好ましく、０．０１ＭＰａ以下に調整することがより好ましく、０ＭＰａに調整することがさらに好ましい。
第３工程と第４工程は、ガス供給源からガス供給ライン５２を通してガスを連続的に供給しながら三方弁６１を切り替えることで、連続的に実施することができる。
【0023】
その後、第１ろ過工程（第３工程）および第２ろ過工程（第４工程）を複数回繰り返すことで微小有用物質を含む液体中の微小有用物質を分離精製する。
第１ろ過工程および第２ろ過工程を複数回繰り返すときは、繰り返し回数が増加するにつれて、第１ろ過工程において第１タンク１０内のろ過対象の緩衝液による希釈倍数を増加させることが好ましく、例えば、２容量倍～１５容量倍の範囲で増加させることができ、好ましくは２容量倍～１０容量倍の範囲で増加させることができる。
このように第１ろ過工程と第２ろ過工程を交互に実施する交互タンジェンシャルフローろ過により微小有用物質の濃度が高められた濃縮液を得ることができる。
第１ろ過工程および第２ろ過工程を複数回繰り返すときは、繰り返し回数が増加するにつれて、第１ろ過工程において第１タンク１０内のろ過対象の緩衝液による希釈倍数を増加させることが好ましく、例えば、２容量倍～１５容量倍の範囲で増加させることができ、好ましくは２容量倍～１０容量倍の範囲で増加させることができる。
このように第１ろ過工程と第２ろ過工程を交互に実施する交互タンジェンシャルフローろ過により微小有用物質の濃度が高められた濃縮液を得ることができる。
【0024】
本明細書に開示された各々の態様は、本明細書に開示された他のいかなる特徴とも組み合わせることができる。
各実施形態における各構成およびそれらの組み合わせなどは一例であって、本発明の開示の主旨から逸脱しない範囲内で、適宜、構成の付加、省略、置換およびその他の変更が可能である。本開示は、実施形態によって限定されることはなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
各実施形態における各構成およびそれらの組み合わせなどは一例であって、本発明の開示の主旨から逸脱しない範囲内で、適宜、構成の付加、省略、置換およびその他の変更が可能である。本開示は、実施形態によって限定されることはなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例0025】
実施例１
（図１に示す分離精製装置１）
・第１タンク１０および第２タンク２０
材質：ポリアクリロニトリル
サイズ：長さ２５ｃｍ、内径０．２５ｃｍ、容量１２０ｃｍ3
・緩衝液タンク４０
容量：１．６L
・中空糸膜３０
内径0.8mm，外径1.3mm，長さ50cm，膜面積12.6cm2，分画分子量50万のポリエーテルスルホン（PES）製中空糸膜（品名FUS5081，ダイセン・メンブレン・システムズ株式会社製）
（図１に示す分離精製装置１）
・第１タンク１０および第２タンク２０
材質：ポリアクリロニトリル
サイズ：長さ２５ｃｍ、内径０．２５ｃｍ、容量１２０ｃｍ3
・緩衝液タンク４０
容量：１．６L
・中空糸膜３０
内径0.8mm，外径1.3mm，長さ50cm，膜面積12.6cm2，分画分子量50万のポリエーテルスルホン（PES）製中空糸膜（品名FUS5081，ダイセン・メンブレン・システムズ株式会社製）
【0026】
＜エクソソーム用培地の調製＞
Ultra ExoM（登録商標）Culture Medium for Extracellular Vesicles(EVs)（株式会社サンテジャ製）のBasal mediumとsupplementを９対１（容量比）の混合比で混ぜ、50mlのエクソソーム用培地を調製した。
本培地に含まれるタンパク質をSDS-PAGE（CBB染色）法により分析したところ、主に分子量が約７万のタンパク質が含まれていた。また、Bradford法による定量分析の結果、培地中のタンパク質総量は107mgであった。
また、本培地に含まれるインシュリンを（ELISA）法により定量したところ、3531μgであった。
Ultra ExoM（登録商標）Culture Medium for Extracellular Vesicles(EVs)（株式会社サンテジャ製）のBasal mediumとsupplementを９対１（容量比）の混合比で混ぜ、50mlのエクソソーム用培地を調製した。
本培地に含まれるタンパク質をSDS-PAGE（CBB染色）法により分析したところ、主に分子量が約７万のタンパク質が含まれていた。また、Bradford法による定量分析の結果、培地中のタンパク質総量は107mgであった。
また、本培地に含まれるインシュリンを（ELISA）法により定量したところ、3531μgであった。
【0027】
＜エクソソームを含む液体試料の調製＞
上記で得たエクソソーム用培地50mlにLonza製エクソソームHansaBioMed（Human plasma of health donors 100μg［number of particles >1×1010）］）を添加し、微小有用物質（エクソソーム）を含む液体試料50mlを調製した。
上記で得たエクソソーム用培地50mlにLonza製エクソソームHansaBioMed（Human plasma of health donors 100μg［number of particles >1×1010）］）を添加し、微小有用物質（エクソソーム）を含む液体試料50mlを調製した。
【0028】
＜微小有用物質（エクソソーム）を含む液体試料からエクソソームを分離精製する方法の実施＞
図１に示す分離精製装置を使用して、微小有用物質（エクソソーム）を含む液体試料からエクソソームを分離精製した。分離精製は、室温（約２０℃）で実施した。
（１）前記液体試料を、注射器シリンダーにセットするタイプの孔径0.22μｍ（Millex-GP材質PES ミリポア社製）のMF膜で全量ろ過して、ろ過液（前処理液）を得た。
（２）図１に示してない混合容器中で、前記ろ過液25mlとリン酸緩衝液（PBS）25mlを混合し、液体試料希釈液50mlを作製した。
（３）前記混合容器中の液体試料希釈液50mlを第１タンク１０内に入れた。
（４）第１タンク１０の上部空間に窒素ガスを圧力0.1MPaで供給し、中空糸膜３０の内側に上記の液体試料希釈液を通過させつつタンジェンシャルフローろ過を行った。
この際、第２タンク２０は、開閉バルブ５６を開にして大気開放されており、圧力はゼロであった。また、中空糸膜３０の内側を流れる膜面線速は1.0m/sであった。膜面線速は、第２タンク２０での濃縮液量の増加速度から算出した。
透過液は透過液タンク３５に貯め、濃縮液（第１濃縮液）は第２タンク２０内に移行させた（第１ろ過工程）。
（５）第１タンク１０の液体試料希釈液が中空糸膜３０の内側を通過してろ過され、大部分が第２タンク２０に移行したとき、三方弁６１の切り替えによって、窒素ガスを第２タンク２０に供給し、同時に開閉バルブ６２の開放によって第1タンク１０の圧力を開放した。
（６）この操作によって、第１濃縮液が第２タンク２０から第１タンク１０に移行させながらろ過を行い、透過液は透過液タンク３５に貯め、濃縮液（第２濃縮液）は第１タンク１０内に移行させた（第２ろ過工程）。
第２タンク２０内の第１濃縮液の大部分が第１タンク１０に移行したとき、三方弁６１の切り替えによって、再び第１タンク１０内の第２濃縮液を中空糸膜３０によりろ過して、濃縮液を第２タンク２０内に移行させた（第１ろ過工程）。
同様の第１ろ過工程と第２ろ過工程を複数回繰り返す交互タンジェンシャルフローろ過を行った。
図１に示す分離精製装置を使用して、微小有用物質（エクソソーム）を含む液体試料からエクソソームを分離精製した。分離精製は、室温（約２０℃）で実施した。
（１）前記液体試料を、注射器シリンダーにセットするタイプの孔径0.22μｍ（Millex-GP材質PES ミリポア社製）のMF膜で全量ろ過して、ろ過液（前処理液）を得た。
（２）図１に示してない混合容器中で、前記ろ過液25mlとリン酸緩衝液（PBS）25mlを混合し、液体試料希釈液50mlを作製した。
（３）前記混合容器中の液体試料希釈液50mlを第１タンク１０内に入れた。
（４）第１タンク１０の上部空間に窒素ガスを圧力0.1MPaで供給し、中空糸膜３０の内側に上記の液体試料希釈液を通過させつつタンジェンシャルフローろ過を行った。
この際、第２タンク２０は、開閉バルブ５６を開にして大気開放されており、圧力はゼロであった。また、中空糸膜３０の内側を流れる膜面線速は1.0m/sであった。膜面線速は、第２タンク２０での濃縮液量の増加速度から算出した。
透過液は透過液タンク３５に貯め、濃縮液（第１濃縮液）は第２タンク２０内に移行させた（第１ろ過工程）。
（５）第１タンク１０の液体試料希釈液が中空糸膜３０の内側を通過してろ過され、大部分が第２タンク２０に移行したとき、三方弁６１の切り替えによって、窒素ガスを第２タンク２０に供給し、同時に開閉バルブ６２の開放によって第1タンク１０の圧力を開放した。
（６）この操作によって、第１濃縮液が第２タンク２０から第１タンク１０に移行させながらろ過を行い、透過液は透過液タンク３５に貯め、濃縮液（第２濃縮液）は第１タンク１０内に移行させた（第２ろ過工程）。
第２タンク２０内の第１濃縮液の大部分が第１タンク１０に移行したとき、三方弁６１の切り替えによって、再び第１タンク１０内の第２濃縮液を中空糸膜３０によりろ過して、濃縮液を第２タンク２０内に移行させた（第１ろ過工程）。
同様の第１ろ過工程と第２ろ過工程を複数回繰り返す交互タンジェンシャルフローろ過を行った。
【0029】
上記の（４）～（６）の第１ろ過工程と第２ろ過工程（交互タンジェンシャルフローろ過）を繰り返す中で、第１タンク１０内の濃縮液の液量が約半分（約25ｍｌ）になったとき、緩衝液タンク４０のリン酸緩衝液（カルシウム，マグネシウム不含リン酸緩衝食塩水）50ml（株式会社ニッポン・ジーン製10×PBS Buffer）を添加した。
なお、緩衝液タンク４０の気相部（緩衝液が入っていない空間部）には、緩衝液が減少した分の窒素ガスを封入した。
なお、緩衝液タンク４０の気相部（緩衝液が入っていない空間部）には、緩衝液が減少した分の窒素ガスを封入した。
【0030】
上記の（４）～（６）の分離精製工程（交互タンジェンシャルフローろ過）は合計９回繰り返し、最終的には当初の液体試料50mlに対して総量で450mlのリン酸緩衝液を加えた。
９回目のリン酸緩衝液を添加した後（濃縮液量75ml）は、希釈することなく、交互タンジェンシャルフローろ過によって、６mlになるまでろ過を行い、エクソソーム濃度が高められた濃縮液を得た。
９回目のリン酸緩衝液を添加した後（濃縮液量75ml）は、希釈することなく、交互タンジェンシャルフローろ過によって、６mlになるまでろ過を行い、エクソソーム濃度が高められた濃縮液を得た。
【0031】
分離精製後の中空糸膜表面を電子顕微鏡（１００００倍）で観察したところ、約100nmの大きさのエクソソームが観察された。
分画分子量50万（相当膜孔径20nm）の中空糸膜を用いてろ過することで、エクソソームの膜透過が阻止され、エクソソームは膜によって十分に回収されたと判断できた。
一方、最終的な試料濃縮液６ml中のタンパク質総量は5.7mg、インシュリン量は20μgであり、エクソソームを含む液体試料50ml（タンパク質総量は107mg、インシュリン量3531μg）に対して、タンパク質総量を5.3％に、インシュリン量を0.6％に低減することができた。
分画分子量50万（相当膜孔径20nm）の中空糸膜を用いてろ過することで、エクソソームの膜透過が阻止され、エクソソームは膜によって十分に回収されたと判断できた。
一方、最終的な試料濃縮液６ml中のタンパク質総量は5.7mg、インシュリン量は20μgであり、エクソソームを含む液体試料50ml（タンパク質総量は107mg、インシュリン量3531μg）に対して、タンパク質総量を5.3％に、インシュリン量を0.6％に低減することができた。
【0032】
上記の交互タンジェンシャルフローろ過過程において、経時的にろ過液量をサンプリングしその質量変化からろ過速度を算出した。
１時間、膜面積１ｍ2、圧力0.1MPa当たりの換算ろ過速度は、初期に著しく低下するものの、ろ過開始25分頃からは、200～230（平均210）L/m2hでほぼ一定となり、ろ過開始約88分後に分離精製を終了した。
１時間、膜面積１ｍ2、圧力0.1MPa当たりの換算ろ過速度は、初期に著しく低下するものの、ろ過開始25分頃からは、200～230（平均210）L/m2hでほぼ一定となり、ろ過開始約88分後に分離精製を終了した。
【0033】
比較例１
実施例１における中空糸膜の長さを50cmから10cmとし、リン酸緩衝液で希釈しないこと以外は、実施例１と同様にして、エクソソームの分離精製を行った。
１時間、膜面積１ｍ2、圧力0.1MPa当たりの換算ろ過速度は、最初の測定値は275L/m2h以上であったが、徐々に減少し、ろ過開始200分を超えると25L/m2h未満となり、分離精製操作を中止した。
実施例１における中空糸膜の長さを50cmから10cmとし、リン酸緩衝液で希釈しないこと以外は、実施例１と同様にして、エクソソームの分離精製を行った。
１時間、膜面積１ｍ2、圧力0.1MPa当たりの換算ろ過速度は、最初の測定値は275L/m2h以上であったが、徐々に減少し、ろ過開始200分を超えると25L/m2h未満となり、分離精製操作を中止した。
【0034】
実施例２
実施例１の中空糸膜に替えて、内径0.8mmおよび外径1.3mm、分画分子量15万の酢酸セルロース（ＣＡ）製中空糸膜（（品名FUC1582、ダイセン・メンブレン・システムズ株式会社製）を用い、実施例１と同様の装置によって、エクソソームの分離精製を行った。その際、エクソソームを含む液体試料3mlにリン酸緩衝液27mlを加えて液体試料希釈液30mlとした。
１時間、膜面積１ｍ2、圧力0.1MPa当たりの換算ろ過速度は、最初の測定値は500L/m2hから大きくは低下せず、約420L/m2hで安定し、実施例１と比べるとろ過速度は約２倍であり、エクソソームを効率的に回収できた。一方、透過液中の蛋白質含有量は実施例１と比べると小さかったが、最終的な試料濃縮液0.1ml中のタンパク質総量は0.25mgであり、エクソソームを含む液体試料3ml（タンパク質総量は3.8mg）に対して、タンパク質総量を6.6％に低減することができた。
実施例１の中空糸膜に替えて、内径0.8mmおよび外径1.3mm、分画分子量15万の酢酸セルロース（ＣＡ）製中空糸膜（（品名FUC1582、ダイセン・メンブレン・システムズ株式会社製）を用い、実施例１と同様の装置によって、エクソソームの分離精製を行った。その際、エクソソームを含む液体試料3mlにリン酸緩衝液27mlを加えて液体試料希釈液30mlとした。
１時間、膜面積１ｍ2、圧力0.1MPa当たりの換算ろ過速度は、最初の測定値は500L/m2hから大きくは低下せず、約420L/m2hで安定し、実施例１と比べるとろ過速度は約２倍であり、エクソソームを効率的に回収できた。一方、透過液中の蛋白質含有量は実施例１と比べると小さかったが、最終的な試料濃縮液0.1ml中のタンパク質総量は0.25mgであり、エクソソームを含む液体試料3ml（タンパク質総量は3.8mg）に対して、タンパク質総量を6.6％に低減することができた。
【0035】
比較例２
実施例２の操作において緩衝液を添加しないこと以外は実施例２と同様に実施して、エクソソームの分離精製を行った。
１時間、膜面積１ｍ2、圧力0.1MPa当たりの換算ろ過速度は、初期値550L/m2hから大きく低下し、ろ過開始6分で約200L/m2hと著しく低下した。
実施例２の操作において緩衝液を添加しないこと以外は実施例２と同様に実施して、エクソソームの分離精製を行った。
１時間、膜面積１ｍ2、圧力0.1MPa当たりの換算ろ過速度は、初期値550L/m2hから大きく低下し、ろ過開始6分で約200L/m2hと著しく低下した。
【産業上の利用可能性】
【0036】
本開示の分離精製方法は、培養液からエクソソーム、抗体、ウィルス、タンパク質、核酸などから選ばれるものを分離精製するときに利用することができる。
【符号の説明】
【0037】
１ 分離精製装置
１０ 第１タンク
２０ 第２タンク
３０ 中空糸膜
３５ 透過液タンク
４０ 緩衝液タンク
１０ 第１タンク
２０ 第２タンク
３０ 中空糸膜
３５ 透過液タンク
４０ 緩衝液タンク
【図1】
【図2】
