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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022182687
(43)【公開日】2022-12-08
(54)【発明の名称】ペプチド化合物
(51)【国際特許分類】
C07K 2/00 20060101AFI20221201BHJP
C07K 4/00 20060101ALI20221201BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20221201BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221201BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221201BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20221201BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20221201BHJP
【ＦＩ】
C07K2/00 ZNA
C07K4/00
C12M3/00 Z
A61P43/00 111
A61P35/00
A61P35/04
A61K38/02
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021090384
(22)【出願日】2021-05-28
(71)【出願人】
【識別番号】592068200
【氏名又は名称】学校法人東京薬科大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000671
【氏名又は名称】八田国際特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】山田 雄二
(72)【発明者】
【氏名】野水 基義
(72)【発明者】
【氏名】吉川 大和
(72)【発明者】
【氏名】▲浜▼田 圭佑
【テーマコード（参考）】
4B029
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B029AA21
4B029BB11
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA03
4C084BA44
4C084NA14
4C084ZB26
4C084ZC42
4H045AA10
4H045BA13
4H045BA14
4H045BA15
4H045BA16
4H045BA17
4H045BA18
4H045BA33
4H045EA60
(57)【要約】 （修正有）
【課題】インテグリンαｖβ５結合能を有する最適化されたペプチドリガンドを含むペプチド化合物を提供する。
【解決手段】下記式（Ｉ）で表されるペプチド化合物。式（Ｉ）中、Ｘ１は、Ｇｌｙ、ＡｌａおよびＰｒｏからなる群から選択されるアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基数が２～１５である、ペプチド；Ｘ２は、ＲＧＤＶＦ、ＲＧＤＡＦ、ＲＧＤＳＦ、ＲＧＤＴＦ、ＲＧＤＤＦ、ＲＧＤＶＰ、およびＲＧＤＮＹのいずれか一つで表されるアミノ酸配列であり、Ｘ３は、独立して、任意のアミノ酸残基から選択され、ｍは、０または１であり、ｎは、０～５の整数である。
【選択図】なし
【解決手段】下記式（Ｉ）で表されるペプチド化合物。式（Ｉ）中、Ｘ１は、Ｇｌｙ、ＡｌａおよびＰｒｏからなる群から選択されるアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基数が２～１５である、ペプチド；Ｘ２は、ＲＧＤＶＦ、ＲＧＤＡＦ、ＲＧＤＳＦ、ＲＧＤＴＦ、ＲＧＤＤＦ、ＲＧＤＶＰ、およびＲＧＤＮＹのいずれか一つで表されるアミノ酸配列であり、Ｘ３は、独立して、任意のアミノ酸残基から選択され、ｍは、０または１であり、ｎは、０～５の整数である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の式（Ｉ）で表されるペプチド化合物：
式（Ｉ）中、
Ｘ１は、Ｇｌｙ、ＡｌａおよびＰｒｏからなる群から選択されるアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基数が２～１５である、ペプチド；（ＧＧＧＧＳ）ｏ、（ＥＡＡＡＫ）ｏまたは（ＡＰ）ｑで表されるペプチドであり、ｏは、１～３の整数であり、ｑは、１～７の整数である；およびポリエチレングリコール；ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つであり、
Ｘ２は、ＲＧＤＶＦ（配列番号１）、ＲＧＤＡＦ（配列番号２）、ＲＧＤＳＦ（配列番号３）、ＲＧＤＴＦ（配列番号４）、ＲＧＤＤＦ（配列番号５）、ＲＧＤＶＰ（配列番号６）、およびＲＧＤＮＹ（配列番号７）のいずれか一つで表されるアミノ酸配列であり、
Ｘ３は、独立して、任意のアミノ酸残基から選択され、
ｍは、０または１であり、
ｎは、０～５の整数である。
【化1】
式（Ｉ）中、
Ｘ１は、Ｇｌｙ、ＡｌａおよびＰｒｏからなる群から選択されるアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基数が２～１５である、ペプチド；（ＧＧＧＧＳ）ｏ、（ＥＡＡＡＫ）ｏまたは（ＡＰ）ｑで表されるペプチドであり、ｏは、１～３の整数であり、ｑは、１～７の整数である；およびポリエチレングリコール；ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つであり、
Ｘ２は、ＲＧＤＶＦ（配列番号１）、ＲＧＤＡＦ（配列番号２）、ＲＧＤＳＦ（配列番号３）、ＲＧＤＴＦ（配列番号４）、ＲＧＤＤＦ（配列番号５）、ＲＧＤＶＰ（配列番号６）、およびＲＧＤＮＹ（配列番号７）のいずれか一つで表されるアミノ酸配列であり、
Ｘ３は、独立して、任意のアミノ酸残基から選択され、
ｍは、０または１であり、
ｎは、０～５の整数である。
【請求項2】
前記ペプチド化合物のＮ末端および／またはＣ末端にＣｙｓ残基が付加されている、請求項１に記載のペプチド化合物。
【請求項3】
前記ペプチド化合物は、環状構造を有する、請求項１または２に記載のペプチド化合物。
【請求項4】
前記Ｘ２は、配列番号１～６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列である、請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチド化合物。
【請求項5】
前記ペプチド化合物は、配列番号１～７５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列からなる、請求項１～３のいずれか１項に記載のペプチド化合物。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載のペプチド化合物を含む、細胞培養用基材。
【請求項7】
前記細胞は、インテグリンαｖβ５を発現する細胞である、請求項６のいずれか１項に記載の細胞培養用基材。
【請求項8】
前記細胞は、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞である、請求項６または７に記載の基材。
【請求項9】
請求項１～５のいずれか１項に記載のペプチド化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、インテグリンαｖβ５阻害剤。
【請求項10】
請求項１～５のいずれか１項に記載のペプチド化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、腫瘍の転移の抑制および／または予防用医薬組成物。
【請求項11】
請求項１～５のいずれか１項に記載のペプチド化合物および薬物を含み、インテグリンαｖβ５を発現する細胞に前記薬物を送達するための薬物送達システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ペプチド化合物に関する。
【背景技術】
【0002】
アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）の３残基のＲＧＤモチーフはインテグリンα５β１、αｖβ１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６、αｖβ８、αＩＩβ３のリガンドとして知られている。このようなＲＧＤモチーフを含むペプチド（ＲＧＤ含有ペプチド）は、細胞接着基材への固相化により細胞接着因子として広く使われている。例えば、非特許文献１には、ビトロネクチン由来の１２残基のＲＧＤ含有ペプチドのＮ末端にグリシン２残基を介してリジン残基を導入し、リジン残基の側鎖を介して合成ポリマーに結合させたものがインテグリンαｖβ５を介したヒトｉＰＳ細胞の接着を媒介し、培養基材として有用であることが報告されており、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）という名で商品化されている。液性因子としてもこれまでに様々なＲＧＤアナログが開発されており、例えば環状化ＲＧＤ含有ペプチドであるシレンギチドは、インテグリンαｖβ３の阻害剤としてがん治療への応用が期待され、臨床研究が行われている。薬物送達の分野においてもＲＧＤ含有ペプチドは、がんへの標的分子として広く利用されており、例えば表面にＲＧＤペプチドが修飾された薬物内封リポソーム等が開発されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【非特許文献1】Melkoumian Z. et al., "Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells", Nature Biotechnology, 30 May 2010, p. 606-610
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
非特許文献１に記載されているように、ＲＧＤ含有ペプチドがインテグリンαｖβ５に結合することは知られている。しかし、その結合に必要なＲＧＤモチーフ周辺配列の解析が詳細に行われていない。すなわち、ＲＧＤ含有ペプチドの十分な最適化が行われていない。そのため、インテグリンαｖβ５を高発現する細胞に対する培養基材、阻害剤、標的分子などに用いるＲＧＤ含有ペプチドとしては、さらなる改良が求められている。
【0005】
そこで、本発明では、インテグリンαｖβ５結合能を有する最適化されたペプチドリガンドを含む、ペプチド化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、配列番号１～７で表されるアミノ酸配列を含むペプチド化合物によって、上記課題を解決することを見出し、本発明の完成に至った。
【0007】
すなわち、本発明の一形態は、以下の式（Ｉ）で表されるペプチド化合物である。
【0008】
【化1】
【0009】
式（Ｉ）中、
Ｘ１は、Ｇｌｙ、ＡｌａおよびＰｒｏからなる群から選択されるアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基数が２～１５である、ペプチド；（ＧＧＧＧＳ）ｏ、（ＥＡＡＡＫ）ｏまたは（ＡＰ）ｑで表されるペプチドであり、ｏは、１～３の整数であり、ｑは、１～７の整数である；およびポリエチレングリコール；ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つであり、
Ｘ２は、ＲＧＤＶＦ（配列番号１）、ＲＧＤＡＦ（配列番号２）、ＲＧＤＳＦ（配列番号３）、ＲＧＤＴＦ（配列番号４）、ＲＧＤＤＦ（配列番号５）、ＲＧＤＶＰ（配列番号６）、およびＲＧＤＮＹ（配列番号７）のいずれか一つで表されるアミノ酸配列であり、
Ｘ３は、独立して、任意のアミノ酸残基から選択され、
ｍは、０または１であり、
ｎは、０～５の整数である。
Ｘ１は、Ｇｌｙ、ＡｌａおよびＰｒｏからなる群から選択されるアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基数が２～１５である、ペプチド；（ＧＧＧＧＳ）ｏ、（ＥＡＡＡＫ）ｏまたは（ＡＰ）ｑで表されるペプチドであり、ｏは、１～３の整数であり、ｑは、１～７の整数である；およびポリエチレングリコール；ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つであり、
Ｘ２は、ＲＧＤＶＦ（配列番号１）、ＲＧＤＡＦ（配列番号２）、ＲＧＤＳＦ（配列番号３）、ＲＧＤＴＦ（配列番号４）、ＲＧＤＤＦ（配列番号５）、ＲＧＤＶＰ（配列番号６）、およびＲＧＤＮＹ（配列番号７）のいずれか一つで表されるアミノ酸配列であり、
Ｘ３は、独立して、任意のアミノ酸残基から選択され、
ｍは、０または１であり、
ｎは、０～５の整数である。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、インテグリンαｖβ５結合能を有する最適化されたペプチドリガンドを含むペプチド化合物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】試験例１における細胞接着活性の評価結果を示す。
【図2】試験例２における細胞増殖の評価結果を示す。
【図3】試験例３における細胞接着活性の評価結果、抗インテグリン抗体による細胞接着阻害効果の評価結果およびフローサイトメトリーによるインテグリンαｖβ３とαｖβ５との発現解析の結果を示す。
【図4】試験例４におけるＲＧＤＶＦのＶＦ部分を置換したペプチドの細胞接着活性の評価の結果を示す。
【図5】試験例５におけるペプチドの液性因子としての阻害活性評価の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明者らは、インテグリンαｖβ５受容体に対する結合において、ＲＧＤ配列だけではなく、そのＣ末端に続く２残基のアミノ酸が大きな役割を果たしていることを見出した。具体的には、インテグリンαｖβ５に強力に結合するペプチドリガンドとして、配列番号１～７で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを見出した。これらのペプチドを足場に共有結合することによって、インテグリンαｖβ５依存的な細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞など）の接着および増殖を促進することができる。また、これらのペプチドを液性因子として用いることで、インテグリンαｖβ５を介した細胞接着などの生物活性の阻害剤として使用することができる。さらに、インテグリンαｖβ５を発現する細胞・組織への標的分子として使用することができる。
【0013】
以下、本発明の一形態に係る実施の形態を説明する。本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。
【0014】
本明細書において、範囲を示す「Ｘ～Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０～２５℃）／相対湿度４０～５０％ＲＨの条件で測定する。
【0015】
本明細書において、「式（Ｉ）で表されるペプチド化合物」を、単に「本発明に係るペプチド化合物」とも称する。
【0016】
本発明における「アミノ酸残基」とは、ペプチドまたはタンパク質分子上で、ペプチドまたはタンパク質を構成しているアミノ酸の一単位に当たる部分を意味する。より具体的には、以下の式のように表される、α－アミノ酸から誘導される２価の基を意味する：
【0017】
【化2】
【0018】
ただし、上記Ｒ０はアミノ酸の側鎖であり、例えばＧｌｙであれば水素原子、Ａｌａであればメチル基である。
【0019】
「アミノ酸残基」は、天然もしくは非天然のα－アミノ酸に由来し、光学活性体があり得る場合、Ｌ体およびＤ体の何れであってもよいが、Ｌ体が好ましい。
【0020】
より具体的には、「アミノ酸残基」は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、およびＩｌｅ、ならびにこれらの類縁体が例示できる。上記の類縁体としては、例えば上記２０種のアミノ酸残基の側鎖が任意の置換基で置換された誘導体等であってもよく、例えば、上記２０種のアミノ酸残基のハロゲン化誘導体（例えば、３－クロロアラニン）、２－アミノ酪酸、ノルロイシン、ノルバリン、イソバリン、２－アミノイソ酪酸、ホモフェニルアラニン、２，３－ジアミノプロピオン酸、２，４－ジアミノブタン酸、オルニチン、２－ヒドロキシグリシン、ホモセリン、ヒドロキシリジン、ヒドロキシプロリン、３，４－ジデヒドロプロリン、ホモプロリン、ホモシステイン、ホモメチオニン、アスパラギン酸エステル（例えば、アスパラギン酸－メチルエステル、アスパラギン酸－エチルエステル、アスパラギン酸－プロピルエステル、アスパラギン酸－シクロヘキシルエステル、アスパラギン酸－ベンジルエステルなど）、グルタミン酸エステル（グルタミン酸－シクロヘキシルエステル、グルタミン酸－エチルエステル、グルタミン酸－プロピルエステル、グルタミン酸－メチルエステル、グルタミン酸－ベンジルエステルなど）、ホルミルトリプトファン、２－シクロペンチルグリシン、２－シクロヘキシルグリシン、２－フェニルグリシン、２－ピリジルアラニン、３－シクロペンチルアラニン、３－シクロヘキシルアラニン、３－ピリジルアラニン、３－ピラゾリルアラニン、３－フラニルアラニン、３－チエニルアラニン、メトキシフェニルアラニン、３－ナフチルアラニン、および４－ピリジルアラニン等のアミノ酸に由来するアミノ酸残基が例示できるが、これらに制限されない。また、ＩｌｅやＴｈｒのように、側鎖に不斉炭素を有するジアステレオマーが存在するものについては、天然型（例えば、（２Ｒ＊，３Ｒ＊）－２－アミノ－３－メチルペンタン酸、および（２Ｒ＊，３Ｓ＊）－２－アミノ－３－ヒドロキシブタン酸）および非天然型（例えば、（２Ｒ＊，３Ｓ＊）－２－アミノ－３－メチルペンタン酸、および（２Ｒ＊，３Ｒ＊）－２－アミノ－３－ヒドロキシブタン酸）が特に区別なく使用され得る。すなわち、「Ｉｌｅ」は（２Ｒ＊，３Ｒ＊）－２－アミノ－３－メチルペンタン酸および（２Ｒ＊，３Ｓ＊）－２－アミノ－３－メチルペンタン酸の両方を含む意味として使用され、「Ｔｈｒ」は（２Ｒ＊，３Ｓ＊）－２－アミノ－３－ヒドロキシブタン酸および（２Ｒ＊，３Ｒ＊）－２－アミノ－３－ヒドロキシブタン酸の両方を含む意味として使用される。好ましくは、天然型ジアステレオマー（すなわち、Ｉｌｅであれば（２Ｒ＊，３Ｒ＊）－２－アミノ－３－メチルペンタン酸、Ｔｈｒであれば（２Ｒ＊，３Ｓ＊）－２－アミノ－３－ヒドロキシブタン酸）が使用される。
【0021】
本明細書に記載のアミノ酸配列は、特に言及がない限り、慣例に従ってＮ末端（アミノ末端）側からＣ末端（カルボキシル末端）側への方向に表記される。
【0022】
本明細書において「薬学的に許容される塩」は、患者や被験体へ投与された後、望ましくない生理学的効果を生じさせない、金属塩、アンモニウム塩、有機酸塩、無機酸塩、または有機塩基もしくは無機塩基との塩である。より具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、アンモニウム塩、メチルアミン塩、エチルアミン塩、アニリン塩、ジメチルアミン塩、ジエチルアミン塩、ピロリジン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩、ピペラジン塩、トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、フタル酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、およびｐ－トルエンスルホン酸塩等が例示できるが、これらに限定されない。
【0023】
本発明に係るペプチドのＮ末端の構造は特に制限されず、例えば、水素原子（すなわち、未修飾）、または従来公知の手法により修飾基を導入した構造であってもよい。Ｎ末端の修飾基としては、炭素数１～２０のアルキル基、炭素数１～２０のアルケニル基、炭素数１～２０のアルキニル基、炭素数６～２０の芳香族炭化水素基、複素環基、スルホニル基、カルボキシル基、グリオキシル基、ホルミル基；ポリエチレングリコール基（ＰＥＧ化）、ポリオキシエチレングリコール基、ポリプロピレングリコール基；ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）、フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）のような保護基；シクロペンチルオキシカルボニル基、シクロヘキシルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基、ノルボルニルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基等のシクロアルキルオキシカルボニル基；ピログルタミン酸やモロタン酸などのアミノ酸から誘導される保護基；カルバメート系保護基；ベンゼンスルホン酸などのスルホン酸やリン酸から誘導される保護基等、が例示できる。
【0024】
本発明に係るペプチドのＣ末端の構造もまた特に制限されず、カルボン酸の保護に一般的に使用される保護基で修飾された構造であってもよい。より具体的には、本発明に係るペプチドのＣ末端の構造は、例えば、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（－ＣＯＯ－）、アミド（－ＣＯＮＨ２）、アルキルアミド（－ＣＯＮＨＲ３１、－ＣＯＮＲ３１Ｒ３２）、エステル（－ＣＯＯＲ３１）、ピバロイルオキシメチル基のようなアシルオキシアルキル（－Ｒ３３－ＯＣＯＲ３１）、炭素数１～４のアルキル基もしくはアルコキシ基で置換されてもよいフタリジル基（例えば、フタリジル基、ジメチルフタリジル基、ジメトキシフタリジル基）、または（５－メチル－２－オキソ－１，３－ジオキソレン－４－イル）メチル基であり得る。このうち、ペプチドのＣ末端はアミドであることが好ましい。上記のアルキルアミド、エステル、およびアシルオキシアルキルにおけるＲ３１およびＲ３２は、それぞれ独立に、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、アミル基、イソアミル基、ｔｅｒｔ－アミル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基等の炭素数１～６のアルキル基；フェニル基、ナフチル等の炭素数６～１０のアリール基；ベンジル基、フェネチル基、ベンズヒドリル基等の炭素数７～１８のアラルキル基；グルコース等の糖；炭素数１～６のアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、アミル基、イソアミル基、ｔｅｒｔ－アミル基、ヘキシル基）で修飾されていてもよいポリエチレングリコール基などが挙げられる。アシルオキシアルキルにおけるＲ３３は、メチレン基、エチレン基、ｎ－プロピレン基、イソプロピレン基、ｎ－ブチレン基、イソブチレン基、ｓ－ブチレン基、ｔ－ブチレン基のような炭素数１～４のアルキレン基である。
【0025】
＜ペプチド化合物＞
本発明の第一の態様は、以下の式（Ｉ）で表されるペプチド化合物である。
本発明の第一の態様は、以下の式（Ｉ）で表されるペプチド化合物である。
【0026】
【化3】
【0027】
式（Ｉ）中、
Ｘ１は、Ｇｌｙ、ＡｌａおよびＰｒｏからなる群から選択されるアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基数が２～１５である、ペプチド；（ＧＧＧＧＳ）ｏ、（ＥＡＡＡＫ）ｏまたは（ＡＰ）ｑで表されるペプチドであり、ｏは、１～３の整数であり、ｑは、１～７の整数である；およびポリエチレングリコール；ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つであり、
Ｘ２は、ＲＧＤＶＦ（配列番号１）、ＲＧＤＡＦ（配列番号２）、ＲＧＤＳＦ（配列番号３）、ＲＧＤＴＦ（配列番号４）、ＲＧＤＤＦ（配列番号５）、ＲＧＤＶＰ（配列番号６）、およびＲＧＤＮＹ（配列番号７）のいずれか一つで表されるアミノ酸配列であり、
Ｘ３は、独立して、任意のアミノ酸残基から選択され、
ｍは、０または１であり、
ｎは、０～５の整数である。
Ｘ１は、Ｇｌｙ、ＡｌａおよびＰｒｏからなる群から選択されるアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基数が２～１５である、ペプチド；（ＧＧＧＧＳ）ｏ、（ＥＡＡＡＫ）ｏまたは（ＡＰ）ｑで表されるペプチドであり、ｏは、１～３の整数であり、ｑは、１～７の整数である；およびポリエチレングリコール；ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つであり、
Ｘ２は、ＲＧＤＶＦ（配列番号１）、ＲＧＤＡＦ（配列番号２）、ＲＧＤＳＦ（配列番号３）、ＲＧＤＴＦ（配列番号４）、ＲＧＤＤＦ（配列番号５）、ＲＧＤＶＰ（配列番号６）、およびＲＧＤＮＹ（配列番号７）のいずれか一つで表されるアミノ酸配列であり、
Ｘ３は、独立して、任意のアミノ酸残基から選択され、
ｍは、０または１であり、
ｎは、０～５の整数である。
【0028】
本明細書中、「Ｇｌｙ、ＡｌａおよびＰｒｏからなる群から選択されるアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基数が２～１５である、ペプチド」を「第１のペプチド」、および「（ＧＧＧＧＳ）ｏ、（ＥＡＡＡＫ）ｏまたは（ＡＰ）ｑで表されるペプチド」を「第２のペプチド」とも称する。
【0029】
式（Ｉ）において、Ｘ１は、好ましくは第１のペプチド、第２のペプチドまたはポリエチレングリコールであり、より好ましくは第１のペプチドである。
【0030】
式（Ｉ）において、第１のペプチドのアミノ酸残基数は、好ましくは２～１０であり、より好ましくは２～６である。
【0031】
式（Ｉ）において、第１のペプチドのアミノ酸配列の具体例としては、ＧＧ、ＰＰＰ、ＧＧＡＡＡＡ、ＰＰＰＰＰなどが挙げられる。
【0032】
式（Ｉ）において、ポリエチレングリコールにおけるエチレングリコールの繰り返し数は、好ましくは２～５０である。
【0033】
式（Ｉ）において、Ｘ２は、好ましくは配列番号１～６のいずれか一つで表されるアミノ酸配列である。
【0034】
式（Ｉ）において、Ｘ３は、好ましくはＭｅｔおよびＣｙｓ以外のアミノ酸残基であり、より好ましくはＧｌｙ、ＡｌａおよびＰｒｏからなる群から選択されるアミノ酸残基である。
【0035】
式（Ｉ）において、ｎは、好ましくは０～３の整数であり、より好ましくは０である。
【0036】
一実施形態では、本発明に係るペプチド化合物は、Ｎ末端および／またはＣ末端にＣｙｓ残基が付加されている。Ｃ末端にＣｙｓ残基が付加されている場合、本発明に係るペプチド化合物は、Ｎ末端にクロロアセチル基などのハロアセチル基を導入することで、チオエーテル結合により環化構造を有することができる。Ｎ末端およびＣ末端にＣｙｓ残基が付加されている場合、本発明に係るペプチド化合物は、Ｃｙｓ残基間のジスルフィド結合により環化構造を有することができる。
【0037】
ペプチドを環化させる方法は、上記以外にも、Ｌｙｓ残基の側鎖のアミノ基とＣ末端カルボキシル基とのアミド結合により環化させる方法、Ｎ末端アミノ基とＣ末端カルボキシル基とのアミド結合により環化させる方法などが挙げられる。
【0038】
一実施形態では、本発明に係るペプチドがＮ末端およびＣ末端の少なくとも一方にＣｙｓ残基が付加されている場合、Ｃｙｓ残基を介して他の材料（例えば、マレイミド基を導入した材料）と共有結合することができ、後述の細胞培養用基材として好適である。
【0039】
一実施形態では、本発明に係るペプチド化合物は、環状構造を有する。環状構造を有することにより、インテグリンαｖβ５を介した細胞接着などの生物活性を阻害する効果をより高めることができる。
【0040】
一実施形態では、本発明に係るペプチド化合物のアミノ酸残基数は、５以上１５以下であり、より好ましくは５以上１２以下であり、さらに好ましくは５以上９以下である。本発明に係るペプチド化合物は、インテグリンαｖβ５結合能を有する最適化されたペプチドリガンドを含むため、ペプチドを短鎖化することができる。
【0041】
好ましい実施形態では、本発明に係るペプチド化合物は、配列番号１～７５のいずれか一つで表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。なお、配列番号２１～４８および５５～６１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド化合物は、環状ペプチドであってもよい。
【0042】
【表1】
【0043】
（ペプチド化合物の製造方法）
本発明に係るペプチド化合物のペプチド部分（本明細書中、単に「ペプチド部分」とも称する）は、化学的合成法や組換え技術を含む従来公知の手法によって製造することができる。ペプチド部分を化学合成により調製するには、各アミノ酸をペプチド化学において通常用いられる方法、例えば、「ザ ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」第１巻〔Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｌｕｈｋｅ著， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９６６年）〕、「ペプチド合成の基礎と実験」（泉屋信夫ら著丸善株式会社、１９８５年）等に記載されている方法によって製造することが可能であり、液相法および固相法のいずれによっても製造できる。さらに、カラム法、バッチ法のいずれの方法も用いることができる。
本発明に係るペプチド化合物のペプチド部分（本明細書中、単に「ペプチド部分」とも称する）は、化学的合成法や組換え技術を含む従来公知の手法によって製造することができる。ペプチド部分を化学合成により調製するには、各アミノ酸をペプチド化学において通常用いられる方法、例えば、「ザ ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」第１巻〔Ｓｃｈｒｏｄｅｒ ａｎｄ Ｌｕｈｋｅ著， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９６６年）〕、「ペプチド合成の基礎と実験」（泉屋信夫ら著丸善株式会社、１９８５年）等に記載されている方法によって製造することが可能であり、液相法および固相法のいずれによっても製造できる。さらに、カラム法、バッチ法のいずれの方法も用いることができる。
【0044】
ペプチド部分はまた、例えば下記のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｈａｐｔｅｒ １６に記載されるような手法により、動物細胞、昆虫細胞、または微生物等を利用した組み換え技術により製造してもよい。ペプチドは、培養細胞や微生物によって生成された後、従来公知の方法によって精製し得る。ペプチドの精製および単離法は当分野の技術者に公知であり、例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｈａｐｔｅｒ １６（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００６年）等に記載の手法により行うことができる。
【0045】
ペプチド結合を形成するための縮合方法として、アジド法、酸ハライド法、酸無水物法、カルボジイミド法、カルボジイミド－アディティブ法、活性エステル法、カルボニルイミダゾール法、酸化還元法、酵素法、ウッドワード試薬Ｋ、ＨＡＴＵ試薬、Ｂｏｐ試薬を用いる方法等を例示することができる。なお、固相法での縮合反応は上記した方法のうち、酸無水物法、カルボジイミド法、および活性エステル法が主な方法として挙げられる。
【0046】
さらに、固相法でペプチド鎖を延長するときは、用いる有機溶媒に対して不溶な樹脂等の支持体に、Ｃ末端アミノ酸を結合する。かような樹脂としては、アミノ酸を樹脂に結合させる目的で官能基を導入した樹脂や、樹脂と官能基の間にスペーサーを挿入したもの等を目的に応じて用いることもできる。より具体的には、例えば、クロロメチル樹脂などのハロメチル樹脂、オキシメチル樹脂、４－（オキシメチル）－フェニルアセトアミドメチル樹脂、４－（オキシメチル）－フェノキシメチル樹脂、Ｒｉｎｋアミド樹脂などを挙げることができる。なお、これらの縮合反応を行う前に、通常公知の手段によって当該縮合反応に関与しないカルボキシル基やアミノ基や水酸基やアミジノ基等の保護手段を施すことができる。また逆に当該縮合反応に直接関与するカルボキシル基やアミノ基を活性化することもできる。
【0047】
各ユニットの縮合反応に関与しない官能基の保護手段に用いる保護基としては有機化学において通常用いられている保護基、例えば、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇｒｅｅｎｅ著、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．（１９８１年））等に記載されている保護基によって保護することが可能である。より具体的には、カルボキシル基の保護基としては、例えば、各種のメチルエステル、エチルエステル、ベンジルエステル、ｐ－ニトロベンジルエステル、ｔ－ブチルエステル、シクロヘキシルエステル等の通常公知の保護基を挙げることができる。アミノ基の保護基としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル基、ｔ－ブトキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、９－フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）等を挙げることができる。
【0048】
カルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、当該カルボキシル基に対応する酸無水物；アジド；ペンタフルオロフェノール、２，４－ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、ｐ－ニトロフェノール、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ－ヒドロキシ－５－ノルボルネン－２，３－ジカルボキシミド、Ｎ－ヒドロキシフタルイミド、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール等との活性エステル等が挙げられる。アミノ基の活性化されたものとしては、当該アミノ基に対応する燐酸アミド等を挙げることができる。
【0049】
ペプチド合成の際の縮合反応は、通常溶媒中で行われる。当該溶媒としては、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、Ｎ－メチルピロリドン、水、メタノール等、または、これらの混合物を挙げることができる。また、当該縮合反応の反応温度は、通常の場合と同様に、－３０℃～５０℃の範囲で行なうことができる。
【0050】
さらに、ペプチドの製造工程における保護基の脱離反応の種類は、ペプチド結合に影響を与えずに保護基を脱離させることができる限りにおいて、用いる保護基の種類に応じて選択することができる。例えば、塩化水素、臭化水素、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、またはこれらの混合物等による酸処理、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ヒドラジン、ジエチルアミン、ピペリジン等によるアルカリ処理、液体アンモニア中におけるナトリウム処理やパラジウム炭素による還元および、トリメチルシリルトリフラート、トリメチルシリルブロマイド等のシリル化処理等が挙げられる。なお、上記の酸またはシリル化剤処理による脱保護基反応においては、アニソール、フェノール、クレゾール、チオアニソール、エタンジチオール等のカチオン捕捉剤を添加するのが、脱保護基反応が効率的に行われるという観点から好ましい。
【0051】
なお、固相法で合成したペプチドの固相からの切断方法も通常公知の方法に従う。例えば、上記の酸またはシリル化剤による処理等を当該切断方法として挙げることができる。このようにして製造されたペプチドに対しては、上記の一連の反応の終了後に通常公知の分離、精製手段を駆使することができる。例えば、抽出、分配、再沈澱、再結晶、固相抽出、カラムクロマトグラフィー等によって、より高純度でペプチドを収得することができる。
【0052】
本発明に係るペプチド化合物において、ペプチド部分のＮ末端およびＣ末端の修飾は、従来公知の方法によって行うことができる。Ｎ末端の修飾では、ペプチドを固相法で合成する場合、最後のアミノ酸残基の脱保護の後、ＰＥＧを導入することで得ることができる。また、Ｃ末端の修飾では、例えば、アミド体合成用樹脂であるＲｉｎｋアミド樹脂を用いて固相合成することで、ペプチドのアミド体を得ることができる。
【0053】
本発明に係るペプチド化合物は、単離または精製されていてもよい。「単離または精製」とは、目的とする成分以外の成分を除去する操作が施されていることを意味する。単離または精製された本発明に係るペプチド化合物の純度は、通常５０％以上（例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、１００％）である。
【0054】
本発明に係るペプチド化合物は、インテグリンαｖβ５に強力に結合するため、インテグリンαｖβ５依存的な細胞の接着および増殖を促進するための細胞培養用基材、インテグリンαｖβ５を標的とした阻害剤としてがんなどの疾病の治療、インテグリンαｖβ５を標的とした薬物送達における標的分子などとして使用することができる。
【0055】
＜細胞培養用基材＞
本発明の一実施形態は、本発明に係るペプチド化合物を含む、細胞培養用基材（本明細書中、単に「細胞培養用基材」とも称する）である。
本発明の一実施形態は、本発明に係るペプチド化合物を含む、細胞培養用基材（本明細書中、単に「細胞培養用基材」とも称する）である。
【0056】
細胞培養用基材としては、本発明に係るペプチド化合物を単独で用いてもよく、固定化材料とともに用いてもよい。
【0057】
好ましい実施形態では、細胞培養用基材は、本発明に係るペプチド化合物と固定化材料とを含む。
【0058】
固定化材料は、本発明に係るペプチド化合物を細胞培養用基材の培養表面に固定化するために使用される。本発明に係るペプチド化合物は、共有結合により固定化材料に固定化されていることが好ましい。これにより、インテグリンαｖβ５依存的な細胞の接着および増殖をより促進することができる。
【0059】
固定化材料としては、細胞培養に用いられる従来公知のものを使用することができる。固定化材料の例としては、血清アルブミン、コラーゲン、絹フィブロイン、フィブロイン、アビジン、ストレプトアビジンなどのタンパク質；アルギン酸、スターチ、ヒアルロン酸、デキストラン、セルロースおよびこれらの誘導体などの多糖類；ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸－グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ＰＬＧＡとポリエチレングリコールとの共重合体、ポリ（ε－カプロラクトン）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）、ポリ（ｐ－ジオキサノン）、ポリプロピレンフマレート、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル類；ポリオルトエステル類；ポリ無水物類；ポリアミノ酸類；ポリホスファゼン類；ポリアクリル酸およびその誘導体；ポリエチレン；ポリプロピレン；ポリスチレン；ポリエチレングリコール；ポリアクリルアミド；ポリビニルアルコール誘導体；エチレン－ビニルアルコール共重合体およびその誘導体；ポリテトラフルオロエチレン；ナイロン－６，６などのポリアミド類；ポリイミド類；ポリウレタン類；チタン；酸化チタン；金などの金属類；ヒロキシアパタイト；ガラス；シリコンなどが挙げられる。固定化材料は、１種単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【0060】
本発明に係るペプチド化合物を固定化材料に固定化する方法は、特に制限されず、共有結合を形成する従来公知の反応を用いることができる。共有結合を形成する反応の例としては、マイケル付加反応、アミド結合形成反応、クリック反応（クリックケミストリー）、ライゲーション反応（チアゾリジン環形成）などが挙げられる。
【0061】
これらの反応には、本発明に係るペプチド化合物が有する反応性基と固定化材料が有する反応性基とを結合のために用いてもよく、反応性基を導入したものを用いてもよい。また、本発明に係るペプチド化合物のＮ末端またはＣ末端に反応性基を有するアミノ酸残基を付加してもよい。さらに、本発明に係るペプチド化合物と固定化材料とをスペーサーを介して連結してもよい。スペーサーとしては、従来公知のものを使用することができる。式（Ｉ）におけるＸ１およびＸ３をスペーサーとして利用してもよい。
【0062】
マイケル付加反応の例としては、マレイミド基、アクリルエステル基、ビニルスルホン基などのα，β－不飽和カルボニル基とチオール基とを反応させる方法が挙げられる。
【0063】
マイケル付加反応を用いる場合、本発明に係るペプチド化合物は、Ｎ末端またはＣ末端にシステイン残基を有することが好ましい。
【0064】
アミド結合形成反応の例としては、カルボジイミドなどの縮合剤を用いてアミノ基とカルボキシル基とを縮合させる方法、アミノ基とＮ－ヒドロキシスクシンイミドなどにより活性化されたカルボキシル基とを反応させる方法などが挙げられる。
【0065】
クリック反応の例としては、アルキニル基とアジド基とを付加反応させる方法が挙げられる。
【0066】
クリック反応を用いる場合、本発明に係るペプチド化合物は、Ｎ末端にアルキニル基を有するプロパルギルグリシン、プロピオール酸など、またはアジド基を有するアジドリジン、アジド酢酸などを付加することが好ましい。
【0067】
ライゲーション反応（チアゾリジン環形成）の例としては、システイン残基のアミノ基およびチオール基とアルデヒドとを反応させる方法が挙げられる。
【0068】
ライゲーション反応を用いる場合、本発明に係るペプチド化合物は、Ｎ末端システイン残基を有することが好ましい。
【0069】
一実施形態では、細胞培養用基材に用いられるペプチド化合物は、式（Ｉ）におけるｍが１であり、Ｘ１が第１のペプチドであり、ｎが０である。ペプチド化合物は、好ましくは配列番号８～５４および６２～７５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドであり、より好ましくは配列番号８～２０および６２～７５から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドである。
【0070】
細胞培養用基材を用いて培養される細胞の種類としては、特に制限されない。細胞培養用基材を用いて培養される細胞は、例えばインテグリンαｖβ５を発現する細胞であり、好ましくはｉＰＳ細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：人工多能性幹細胞）またはＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：胚性幹細胞）である。インテグリンαｖβ５の発現は、例えばフローサイトメトリーにより確認することができる（実施例参照）。
【0071】
細胞培養用基材の形状は、特に制限されず、従来公知の基材と同様の形状とすることができる。
【0072】
細胞培養用基材の製造方法は、特に制限されない。例えば、細胞培養用基材が固定化材料を含む場合、細胞培養用基材は、容器（例えば、培養用プレート）に固定化材料をコートした後、本発明に係るペプチドを上述の反応を用いて固定化材料に共有結合させることにより製造することができる。
【0073】
本発明の一実施形態は、上述の細胞培養用基材を含む、細胞培養容器（本明細書中、単に「細胞培養容器」とも称する）である。
【0074】
細胞培養容器は、上述の細胞培養用基材のみより形成されてもよく、上述の細胞培養用基材と他の部材とが組み合わされて構成されていてもよく、上述の細胞培養用基材と他の部材とが一体化されて構成されていてもよい。
【0075】
細胞培養容器の形態は、特に制限されない。細胞培養容器の形態の例としては、シングルプレート、マルチウェルプレート、シャーレ、ディッシュ、フラスコ、バッグなどが挙げられる。また、細胞培養容器は、大量培養装置、潅流培養装置などの培養装置における細胞培養用容器の形態であってもよい。
【0076】
細胞の培養に用いる培地および細胞の培養方法は、特に制限されず、培養する細胞の種類に応じて適宜選択できる。
【0077】
細胞培養用基材および細胞培養容器は、滅菌処理されてもよい。滅菌方法は、特に制限されず、放射線滅菌、エチレンオキサイド滅菌、二酸化窒素滅菌、高圧蒸気滅菌などの従来公知の方法を用いることができる。
【0078】
＜インテグリンαｖβ５阻害剤＞
本発明の一実施形態は、本発明に係るペプチド化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、インテグリンαｖβ５阻害剤（本明細書中、単に「インテグリンαｖβ５阻害剤」とも称する）である。本発明に係るペプチド化合物は、インテグリンαｖβ５に強力に結合することができるため、インテグリンαｖβ５阻害剤は、インテグリンαｖβ５を介した細胞接着などの生物活性を阻害するために使用することができる。
本発明の一実施形態は、本発明に係るペプチド化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、インテグリンαｖβ５阻害剤（本明細書中、単に「インテグリンαｖβ５阻害剤」とも称する）である。本発明に係るペプチド化合物は、インテグリンαｖβ５に強力に結合することができるため、インテグリンαｖβ５阻害剤は、インテグリンαｖβ５を介した細胞接着などの生物活性を阻害するために使用することができる。
【0079】
インテグリンαｖβ５阻害剤は、本発明に係るペプチド化合物またはその薬学的に許容される塩の１種以上から構成されてもよく、本発明に係るペプチド化合物の１種以上またはその薬学的に許容される塩の１種以上と薬学的に許容される担体とから構成されていてもよい。
【0080】
薬学的に許容される担体としては、特に限定されないが、乳糖、ショ糖、マンニトール、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸等の賦形剤；シリカ、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、デキストリン、ゼラチン等の結合剤；アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、トコフェロール等の酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤；ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸等の緩衝剤；注射用水、生理食塩水、エタノール、プロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、マクロゴール、オリーブ油、トウモロコシ油等の溶媒；プルロニック（登録商標）、ポリエチレングリコール、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリソルベート、トリトン（登録商標）、レシチン、コレステロール、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤または湿潤剤；塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、ブドウ糖、ソルビトール、マンニトール等の等張化剤；安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン等の保存剤；錯化剤；アミノ酸；抗菌剤；着色剤；フレーバー剤および希釈剤；乳化剤；ナトリウム等の塩形成対イオン；搬送ビヒクル；希釈剤などが挙げられる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１８版， Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ監修， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９０）。
【0081】
好ましい実施形態では、インテグリンαｖβ５阻害剤に含まれるペプチド化合物は、阻害活性をより高めるとの観点から、環状構造を有する。
【0082】
好ましい実施形態では、インテグリンαｖβ５阻害剤に含まれるペプチド化合物は、配列番号１～７、２１～４８および５５～６１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。かかるペプチドは、環状ペプチドであってもよい。
【0083】
本発明に係るペプチド化合物のインテグリンαｖβ５阻害剤中の含有量は、阻害剤全体に対して０．０１～１００質量％であり得る。
【0084】
＜腫瘍の転移の抑制および／または予防用医薬組成物＞
本発明の一実施形態は、本発明に係るペプチド化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、腫瘍の転移の抑制および／または予防用医薬組成物（本明細書中、単に「医薬組成物」とも称する）である。
本発明の一実施形態は、本発明に係るペプチド化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、腫瘍の転移の抑制および／または予防用医薬組成物（本明細書中、単に「医薬組成物」とも称する）である。
【0085】
本発明に係る医薬組成物の対象となるがんの種類は、特に限定されない。例えば、神経系のがん（例えば、脳腫瘍、頚がん）；消化器系のがん（例えば、口腔がん、咽頭がん、食道がん、胃がん、肝がん、胆嚢がん、胆道がん、脾臓がん、大腸がん、小腸がん、十二指腸がん、結腸がん、結腸腺がん、直腸がん、膵臓がん、肝臓がん）；筋骨格系のがん（例えば、肉腫、骨肉種、骨髄腫）；泌尿器系のがん（例えば、膀胱がん、腎がん）；生殖器系のがん（例えば、乳がん、子宮がん、卵巣がん、精巣がん、前立腺がん）；呼吸器系のがん（例えば、肺がん）；造血器系のがん（例えば、急性または慢性骨髄性白血病、急性前骨髄性白血病、急性または慢性リンパ性白血病等の白血病、悪性リンパ腫（リンパ肉腫）、血管肉腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、原発性骨髄線維症、血管外膜細胞腫）；甲状腺がん、副甲状腺がん、舌がん、悪性黒色腫（メラノーマ）、肥満細胞腫、皮膚組織球腫、脂肪腫、毛包腫瘍、皮膚乳頭腫、皮脂腺腫、基底細胞がんなどが挙げられる。
【0086】
本発明に係る医薬組成物は、上述の薬学的に許容される担体を含んでもよい。
【0087】
本発明に係る医薬組成物の適用対象は、特に制限されず、哺乳動物や鳥類、好ましくはがんに罹患した哺乳動物や鳥類である。ここで、哺乳動物は、ヒト、サル、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン等の霊長類、ならびにマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ラクダ、ヤギなどの非ヒト哺乳動物双方を包含する。鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、ハトなどが挙げられる。
【0088】
本発明に係る医薬組成物は、経口剤、外用剤、注射剤、吸入剤、点鼻・点眼剤等として提供されることができ、これらの使用方法に応じて、錠剤、液剤、注射剤、軟膏、クリーム、ローション、エアゾール剤、座剤等の所望の剤形にすることができる。
【0089】
好ましい実施形態では、インテグリンαｖβ５阻害剤に含まれるペプチド化合物は、配列番号１～７、２１～４８および５５～６１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである。かかるペプチドは、環状ペプチドであってもよい。
【0090】
本発明に係るペプチド化合物の医薬組成物中の含有量は、阻害剤全体に対して０．０１～１００質量％であり得る。
【0091】
＜薬物送達システム＞
本発明の一実施形態は、本発明に係るペプチド化合物および薬物を含み、インテグリンαｖβ５を発現する細胞に薬物を送達する薬物送達システム（本明細書中、単に「薬物送達システム」とも称する）である。
本発明の一実施形態は、本発明に係るペプチド化合物および薬物を含み、インテグリンαｖβ５を発現する細胞に薬物を送達する薬物送達システム（本明細書中、単に「薬物送達システム」とも称する）である。
【0092】
インテグリンαｖβ５を発現する細胞としては、上述の腫瘍細胞などが挙げられる。
【0093】
本発明に係る薬物送達システムは、本発明に係るペプチド化合物と薬物とが一体化していない形態であってもよく、本発明に係るペプチド化合物と薬物とが相互作用により一体化した形態であってもよい。一体化の形態は、特に限定されず、例えば、本発明に係るペプチド化合物と薬物と薬物を封入したリポソームと本発明との結合体、本発明に係るペプチド化合物と薬物を担持したナノマテリアルとの結合体、本発明に係るペプチド化合物と薬物とが直接結合した結合体などの形態が挙げられる。
【0094】
本発明に係る薬物送達システムに用いられる薬物は、特に制限されず、標的部位であるインテグリンαｖβ５を発現する細胞に送達することが好ましい薬物であればよい。薬物の例としては、疾病治療用の薬物、インテグリンαｖβ５を発現する細胞を可視化するための薬物（蛍光性物質、放射性物質、化学発光性物質、磁性物質など）が挙げられる。
【実施例0095】
以下に具体例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらの例に限定されない。
【0096】
＜ペプチド合成＞
以下の試験例で使用したペプチドはＦｍｏｃ固相合成法によってマニュアル合成し、Ｃ末端はアミドの形に調製した。
以下の試験例で使用したペプチドはＦｍｏｃ固相合成法によってマニュアル合成し、Ｃ末端はアミドの形に調製した。
【0097】
まず始めに、レジン（４－（２，４－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ－Ｆｍｏｃ－ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）－ｐｈｅｎｏｘｙ ｒｅｓｉｎ、ｒｉｎｋ ａｍｉｄｅ ｒｅｓｉｎ）をＰＤ－１０カラム（Ｃｙｔｉｖａ製）に０．０５ｍｍｏｌの置換基となるように秤量した。レジンをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄した後、２０ｖ／ｖ％ピペリジンを含むＤＭＦを加え１５分間振とうし、レジンのＦｍｏｃ基の脱保護を行った。再びレジンをＤＭＦで洗浄し、各アミノ酸をレジンに対して５当量、縮合剤としてジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を加え、約１時間振とうしてアミノ酸を縮合させた。アミノ酸が付加したレジンをＤＭＦで洗浄し、２０％ピペリジンを含むＤＭＦを加え、アミノ酸のＦｍｏｃ基の脱保護を行った。以後、各アミノ酸の縮合とアミノ酸のＦｍｏｃ基の脱保護の操作を繰り返し、最後にメタノールで洗浄し、乾燥させたのち目的のペプチドが付加したレジンを得た。次に、レジン上で合成されたペプチドのレジンからの脱離とペプチドの保護基を除去するために、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：ｍ－クレゾール：１，２－エタンジチオール：チオアニソール：Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水（８０：５：５：５：５ ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）の混合溶液をレジンの入ったカラムに加え、室温で３時間インキュベーションした。さらにレジンをフィルターで除去し、目的のペプチドを含む濾液を得た。濾液に冷ジエチルエーテルを加え、析出物を１０分間、３０００ｒｐｍで遠心分離し沈殿物を得た。さらにこの沈殿物をジエチルエーテルで２回洗浄し、室温で乾燥させて、粗ペプチドを得た。粗ペプチドを０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡを含むＭｉｌｌｉ－Ｑ水とアセトニトリルとを適量加えて溶解させ、粗ペプチド溶液を得た。０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡを含むＭｉｌｌｉ－Ｑ水とアセトニトリルとを用いて逆相系のＨＰＬＣにて精製した後に、得られた精製ペプチド液を凍結乾燥して白色羽毛状の粉末（ペプチド）を得た。
【0098】
なお、後述の試験例５において、ｃ（ＲＧＤＴＦＣ）、ｃ（ＲＧＤＴＦＧＣ）およびｃ（ＲＧＤＴＦＡＣ）は、レジン上でペプチドを合成した後、１０当量の無水クロロ酢酸を添加して、Ｎ末端にクロロアセチル基を導入した。上記と同様にして、ペプチドのレジンからの脱離と側鎖の脱保護とを行って、粗ペプチドを得た。粗ペプチドを１ｍＭの濃度で１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、一時間室温で静置することで環化させ、上記と同様にして、ＨＰＬＣにて精製した。得られた精製ペプチド液を凍結乾燥して白色羽毛状の粉末（ペプチド）を得た。
【0099】
＜マレイミド化ウシ血清アルブミン（Ｍａｌ－ＢＳＡ）の合成＞
４５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に０．５ｇのウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ；ＢＳＡ）を溶解させた。次にＢＳＡの１０当量となる２５．３ｍｇのＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４－（Ｎ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＳＭＣＣ）を５ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶かし、ＢＳＡ溶液に添加した。室温で３０分反応させ、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ透析膜と０．１％ＴＦＡを含むＭｉｌｌｉ－Ｑ水を用いて３日間透析した。透析後、０．２２μｍのフィルターで濾過し、凍結乾燥によりマレイミド化ＢＳＡの粉末を得た。
４５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に０．５ｇのウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ；ＢＳＡ）を溶解させた。次にＢＳＡの１０当量となる２５．３ｍｇのＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４－（Ｎ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（ＳＭＣＣ）を５ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶かし、ＢＳＡ溶液に添加した。室温で３０分反応させ、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ透析膜と０．１％ＴＦＡを含むＭｉｌｌｉ－Ｑ水を用いて３日間透析した。透析後、０．２２μｍのフィルターで濾過し、凍結乾燥によりマレイミド化ＢＳＡの粉末を得た。
【0100】
＜Ｍａｌ－ＢＳＡを用いたペプチドコートプレートの作製＞
Ｍａｌ－ＢＳＡをＰＢＳに溶解させ、１０μｇ／ｍＬのＭａｌ－ＢＳＡ溶液を調製した。Ｍａｌ－ＢＳＡ溶液をノントリートの９６－ｗｅｌｌプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で３０分インキュベーションし、吸着させた。インキュベーション後、Ｍａｌ－ＢＳＡ溶液を吸い、２００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。１０μＭペプチド／１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）をプレートに加え、室温で２時間静置し反応させた。反応後、プレートを２００μＬのＰＢＳで１回洗浄し、細胞接着アッセイに用いた。
Ｍａｌ－ＢＳＡをＰＢＳに溶解させ、１０μｇ／ｍＬのＭａｌ－ＢＳＡ溶液を調製した。Ｍａｌ－ＢＳＡ溶液をノントリートの９６－ｗｅｌｌプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で３０分インキュベーションし、吸着させた。インキュベーション後、Ｍａｌ－ＢＳＡ溶液を吸い、２００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。１０μＭペプチド／１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）をプレートに加え、室温で２時間静置し反応させた。反応後、プレートを２００μＬのＰＢＳで１回洗浄し、細胞接着アッセイに用いた。
【0101】
＜細胞培養＞
ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞（１３８３Ｄ６，ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）は１０μＭ Ｙ－２７６３２、Ｚｅｌｌｓｈｉｅｌｄを含むＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地とヒトビトロネクチンをコートしたプレートとを用いて、３７℃条件下で培養した。
ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞（１３８３Ｄ６，ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）は１０μＭ Ｙ－２７６３２、Ｚｅｌｌｓｈｉｅｌｄを含むＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地とヒトビトロネクチンをコートしたプレートとを用いて、３７℃条件下で培養した。
【0102】
ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）、ＨｅＬａ細胞およびＡ５４９細胞は、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＬｏｗ ｇｌｕｃｏｓｅ ＤＭＥＭを用いて、３７℃条件下で培養した。
【0103】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、１０％ＦＢＳ、２０μｇ／ｍＬ ＢＰＥ（ｂｏｖｉｎｅ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｅｘｔｒａｃｔ）、１０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、５０μｇ／ｍＬ ｈｅｐａｒｉｎ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＭＤＣＢ－１０７培地とヒトコラーゲンをコートしたプレートとを用いて、３７℃条件下で培養した。
【0104】
（試験例１）ｖｎＲＧＤペプチドおよびｂｓｐＲＧＤペプチドの置換ペプチドおよび短縮ペプチドのｉＰＳ細胞接着活性の評価
図１ＡおよびＢのペプチドを用いて、Ｍａｌ－ＢＳＡを用いたペプチドコートプレートを作製した。
図１ＡおよびＢのペプチドを用いて、Ｍａｌ－ＢＳＡを用いたペプチドコートプレートを作製した。
【0105】
図１ＡおよびＢのペプチドのアミノ酸配列と配列番号との関係は、以下のとおりである。
【0106】
【表2】
【0107】
上記細胞培養で培養したｉＰＳ細胞をＰＢＳ（－）で洗浄し、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＥＧＴＡを含むＰＢＳを加えてインキュベーターで１０分間加温した。５ｍＬのＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地によるピペッティングで細胞を剥離し１５ｍＬチューブに回収し、１０００ｒｐｍ×３ｍｉｎで遠心した。遠心した細胞の上清を吸い、１０μＭのＹ－２７６３２を添加した培地でもう一度細胞を懸濁した。細胞数をカウントし、上記で作製したペプチドコートプレートにｉＰＳ細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度で播種し３７℃条件下にて６０分間接着させた。６０分後、０．２％クリスタルバイオレット／２０％メタノール水溶液（５０μＬ／ｗｅｌｌ）で１０分間染色し、水で洗浄後、乾燥させた。染色した接着細胞をＫｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ８１０顕微鏡下でカウントした。結果を図１ＣおよびＤに示す。
【0108】
図１ＣおよびＤに示すように、ＲＧＤＶＦ（配列番号１）およびＲＧＤＮＹ（配列番号７）で表されるアミノ酸配列が最小活性配列であることが分かる。
【0109】
（試験例２）ＲＧＤＶＦペプチド上でのｉＰＳ細胞増殖の評価
ｖｎＲＧＤペプチド（配列番号７６）またはＲＧＤＶＦペプチド（配列番号７７）を用いて、Ｍａｌ－ＢＳＡを用いたペプチドコートプレートを作製した。また、ポジティブコントロールとして、ヒトビトロネクチンをコートしたコントロールプレートを作製した。
ｖｎＲＧＤペプチド（配列番号７６）またはＲＧＤＶＦペプチド（配列番号７７）を用いて、Ｍａｌ－ＢＳＡを用いたペプチドコートプレートを作製した。また、ポジティブコントロールとして、ヒトビトロネクチンをコートしたコントロールプレートを作製した。
【0110】
上記細胞培養で培養したｉＰＳ細胞をＰＢＳ（－）で洗浄し、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＥＧＴＡを含むＰＢＳを加えてインキュベーターで１０分間加温した。５ｍＬのＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地によるピペッティングで細胞を剥離し１５ｍＬチューブに回収し、１０００ｒｐｍ×３ｍｉｎで遠心した。遠心した細胞の上清を吸い、１０μＭのＹ－２７６３２を添加した培地でもう一度細胞を懸濁した。細胞数をカウントし、上記で作製したペプチドコートプレートまたはコントロールプレートにｉＰＳ細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度で播種し３７℃条件下にて３日間培養した。
【0111】
細胞増殖は、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ８１０顕微鏡での撮影とＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８を用いた吸光度測定（４５０ｎｍ）による細胞生存の定量化とにより評価した。結果を図２ＡおよびＢに示す。
【0112】
図２ＡおよびＢに示すように、ＲＧＤＶＦペプチド（配列番号８）は、ｖｎＲＧＤペプチド（配列番号７６）およびヒトビトロネクチンと同様に、ｉＰＳ細胞の培養に使用できることが分かる。
【0113】
（試験例３）ＲＧＤＶＦペプチドおよびＲＧＤＡＡペプチドの細胞接着活性の比較
細胞としては、ｉＰＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）およびヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を使用した。
細胞としては、ｉＰＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）およびヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を使用した。
【0114】
［細胞接着活性の比較］
ＲＧＤＶＦペプチド（配列番号８）またはＲＧＤＡＡペプチド（配列番号９０）を用いて、Ｍａｌ－ＢＳＡを用いたペプチドコートプレートを作製した。
ＲＧＤＶＦペプチド（配列番号８）またはＲＧＤＡＡペプチド（配列番号９０）を用いて、Ｍａｌ－ＢＳＡを用いたペプチドコートプレートを作製した。
【0115】
上記細胞培養で培養したｉＰＳ細胞をＰＢＳ（－）で洗浄し、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＥＧＴＡを含むＰＢＳを加えてインキュベーターで１０分間加温した。５ｍＬのＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地によるピペッティングで細胞を剥離し１５ｍＬチューブに回収し、１０００ｒｐｍ×３ｍｉｎで遠心した。遠心した細胞の上清を吸い、１０μＭのＹ－２７６３２を添加した培地でもう一度細胞を懸濁した。細胞数をカウントし、上記で作製したペプチドコートプレートにｉＰＳ細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度で播種し３７℃条件下にて６０分間接着させた。６０分後、０．２％クリスタルバイオレット／２０％メタノール水溶液（５０μＬ／ｗｅｌｌ）で１０分間染色し、水で洗浄後、乾燥させた。染色した接着細胞をＫｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ８１０顕微鏡下でカウントした。結果を図３Ａに示す。
【0116】
上記細胞培養で培養したＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞、ＨＤＦまたはＨＵＶＥＣをＰＢＳ（－）で洗浄し、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＥＧＴＡを含むＰＢＳを加えてインキュベーターで１０分間加温した。５ｍＬの０．１％ ＢＳＡ／ＤＭＥＭによるピペッティングで細胞を剥離し１５ｍＬチューブに回収した。細胞数をカウントし、上記で作製したペプチドコートプレートにＨＤＦは５×１０３ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度、ならびにＨｅＬａ細胞、Ａ５４９細胞およびＨＵＶＥＣは２×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度で播種し３７℃条件下にて６０分間接着させた。６０分後、０．２％クリスタルバイオレット／２０％メタノール水溶液（５０μＬ／ｗｅｌｌ）で１０分間染色し、水で洗浄後、乾燥させた。染色した接着細胞をＫｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ８１０顕微鏡下でカウントした。結果を図３Ｄ、Ｇ、ＪおよびＭに示す。
【0117】
図３Ａ、Ｄ、Ｇ、ＪおよびＭにおいて、使用したペプチドの濃度は、１μＭ、０．５μＭ、０．２５μＭ、０．１２５μＭ、０．０６２５μＭ、０．０３１２５μＭおよび０．０１５６２５μＭである。
【0118】
［抗インテグリン抗体を用いた細胞接着阻害効果の比較］
抗インテグリン抗体を用いた細胞接着阻害効果の評価は細胞接着活性の評価と同様の条件で行った。各細胞懸濁液に各抗インテグリン抗体（αｖβ３：ＭＡＢ１９７６、αｖβ５：ＭＡＢ１９６１、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を１０μｇ／ｍｌの濃度となるよう加え、細胞を各ｗｅｌｌに播種し３７℃条件下にて６０分間接着させた。６０分後、０．２％クリスタルバイオレット／２０％メタノール水溶液（５０μＬ／ｗｅｌｌ）で１０分間染色し、水で洗浄後、乾燥させた。染色した接着細胞をＫｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ８１０顕微鏡下でカウントした。結果を図３Ｂ、Ｅ、Ｈ、ＫおよびＮに示す。
抗インテグリン抗体を用いた細胞接着阻害効果の評価は細胞接着活性の評価と同様の条件で行った。各細胞懸濁液に各抗インテグリン抗体（αｖβ３：ＭＡＢ１９７６、αｖβ５：ＭＡＢ１９６１、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を１０μｇ／ｍｌの濃度となるよう加え、細胞を各ｗｅｌｌに播種し３７℃条件下にて６０分間接着させた。６０分後、０．２％クリスタルバイオレット／２０％メタノール水溶液（５０μＬ／ｗｅｌｌ）で１０分間染色し、水で洗浄後、乾燥させた。染色した接着細胞をＫｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ８１０顕微鏡下でカウントした。結果を図３Ｂ、Ｅ、Ｈ、ＫおよびＮに示す。
【0119】
図３Ｂ、Ｅ、Ｈ、ＫおよびＮにおいて、各細胞の接着（％）は、抗インテグリン抗体を添加していないコントロールにおける各細胞の接着数を１００％としたときの比率を示す。
【0120】
［フローサイトメトリーによるインテグリン発現評価の比較］
上記細胞培養で培養した各細胞を剥離し、１×１０６ｃｅｌｌｓ／１００μＬの濃度で１ｖ／ｖ％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁し、各抗インテグリン抗体（αｖβ３：ＭＡＢ１９７６、αｖβ５：ＭＡＢ１９６１）を１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。氷上で３０分反応させた後、１ｖ／ｖ％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８でラベルされた二次抗体を２０μｇ／ｍｌの濃度で１ｖ／ｖ％ＢＳＡ／ＰＢＳに添加し、細胞を懸濁させた。再び氷上で３０分反応させた後、１ｖ／ｖ％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏを用いて蛍光強度を測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより解析した。結果を図３Ｃ、Ｆ、Ｉ、ＬおよびＯに示す。
上記細胞培養で培養した各細胞を剥離し、１×１０６ｃｅｌｌｓ／１００μＬの濃度で１ｖ／ｖ％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁し、各抗インテグリン抗体（αｖβ３：ＭＡＢ１９７６、αｖβ５：ＭＡＢ１９６１）を１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。氷上で３０分反応させた後、１ｖ／ｖ％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８でラベルされた二次抗体を２０μｇ／ｍｌの濃度で１ｖ／ｖ％ＢＳＡ／ＰＢＳに添加し、細胞を懸濁させた。再び氷上で３０分反応させた後、１ｖ／ｖ％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏを用いて蛍光強度を測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより解析した。結果を図３Ｃ、Ｆ、Ｉ、ＬおよびＯに示す。
【0121】
［比較結果］
図３に示すように、ＲＧＤＶＦペプチド（配列番号８）に接着するがＲＧＤＡＡペプチド（配列番号５３）には接着しない細胞（ｉＰＳ細胞、ＨｅＬａ細胞およびＡ５４９細胞）は、インテグリンαｖβ３をほとんど発現せず、インテグリンαｖβ５を介してＲＧＤＶＦペプチドに接着していることが明らかとなった。
図３に示すように、ＲＧＤＶＦペプチド（配列番号８）に接着するがＲＧＤＡＡペプチド（配列番号５３）には接着しない細胞（ｉＰＳ細胞、ＨｅＬａ細胞およびＡ５４９細胞）は、インテグリンαｖβ３をほとんど発現せず、インテグリンαｖβ５を介してＲＧＤＶＦペプチドに接着していることが明らかとなった。
【0122】
（試験例４）ＲＧＤＶＦのＶＦ部分を置換したペプチドの細胞接着活性の評価
ＲＧＤＶＦペプチド（配列番号８）のＶＦ部分をＭｅｔおよびＣｙｓを除く他のアミノ酸で置換したペプチドを合成した（表３）。
ＲＧＤＶＦペプチド（配列番号８）のＶＦ部分をＭｅｔおよびＣｙｓを除く他のアミノ酸で置換したペプチドを合成した（表３）。
【0123】
【表3】
【0124】
表３に示すペプチドを用いて、Ｍａｌ－ＢＳＡを用いたペプチドコートプレートを作製した。
【0125】
上記細胞培養で培養したｉＰＳ細胞をＰＢＳ（－）で洗浄し、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＥＧＴＡを含むＰＢＳを加えてインキュベーターで１０分間加温した。５ｍＬのＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地によるピペッティングで細胞を剥離し１５ｍＬチューブに回収し、１０００ｒｐｍ×３ｍｉｎで遠心した。遠心した細胞の上清を吸い、１０μＭのＹ－２７６３２を添加した培地でもう一度細胞を懸濁した。細胞数をカウントし、上記で作製したペプチドコートプレートにｉＰＳ細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度で播種し３７℃条件下にて６０分間接着させた。６０分後、０．２％クリスタルバイオレット／２０％メタノール水溶液（５０μＬ／ｗｅｌｌ）で１０分間染色し、水で洗浄後、乾燥させた。染色した接着細胞をＫｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ８１０顕微鏡下でカウントした。結果を図４Ａに示す。
【0126】
上記細胞培養で培養したＨｅＬａ細胞をＰＢＳ（－）で洗浄し、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＥＧＴＡを含むＰＢＳを加えてインキュベーターで１０分間加温した。５ｍＬの０．１％ ＢＳＡ／ＤＭＥＭによるピペッティングで細胞を剥離し１５ｍＬチューブに回収した。細胞数をカウントし、上記で作製したペプチドコートプレートに２×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度で播種し３７℃条件下にて６０分間接着させた。６０分後、０．２％クリスタルバイオレット／２０％メタノール水溶液（５０μＬ／ｗｅｌｌ）で１０分間染色し、水で洗浄後、乾燥させた。染色した接着細胞をＫｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ８１０顕微鏡下でカウントした。結果を図４Ｂに示す。
【0127】
図４ＡおよびＢに示すように、ＲＧＤＶＦ（配列番号１）のアミノ酸配列に加えて、ＲＧＤＡＦ（配列番号２）、ＲＧＤＳＦ（配列番号３）、ＲＧＤＴＦ（配列番号４）、ＲＧＤＤＦ（配列番号５）およびＲＧＤＶＰ（配列番号６）のアミノ酸配列が高い細胞接着活性を示した。
【0128】
（試験例５）ＨｅＬａ細胞のビトロネクチンへの接着に対するペプチドの阻害効果の評価
阻害実験では、図５Ａのペプチド、ＲＧＤＴＦペプチド（配列番号４）およびシレンギチドを使用した。図５Ａのペプチドは、チオエーテル結合により環化した構造を有する。シレンギチド（ｃ（ＲＧＤｆ（ＮＭｅ）Ｖ））は、Ｎ末端とＣ末端との間のアミド結合により環化した構造を有する。
阻害実験では、図５Ａのペプチド、ＲＧＤＴＦペプチド（配列番号４）およびシレンギチドを使用した。図５Ａのペプチドは、チオエーテル結合により環化した構造を有する。シレンギチド（ｃ（ＲＧＤｆ（ＮＭｅ）Ｖ））は、Ｎ末端とＣ末端との間のアミド結合により環化した構造を有する。
【0129】
図５Ａのペプチドのアミノ酸配列と配列番号との関係は、以下のとおりである。
【0130】
【表4】
【0131】
１μｇ／ｍＬヒトビトロネクチン／ＰＢＳをノントリートの９６－ｗｅｌｌプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃で３０分インキュベーションし、吸着させた。インキュベーション後、２００μＬのＰＢＳで２回洗浄した。上記細胞培養で培養したＨｅＬａ細胞をＰＢＳ（－）で洗浄し、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＥＧＴＡを含むＰＢＳを加えてインキュベーターで１０分間加温した。５ｍＬの０．１％ ＢＳＡ／ＤＭＥＭによるピペッティングで細胞を剥離し１５ｍＬチューブに回収した。細胞数をカウントし、ＨｅＬａ細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬの濃度で懸濁し、各ペプチドを様々な濃度で添加し、ビトロネクチンをコートしたプレートに播種した。３７℃条件下にて６０分間接着させた後、０．２％クリスタルバイオレット／２０％メタノール水溶液（５０μＬ／ｗｅｌｌ）で１０分間染色し、水で洗浄後、乾燥させた。染色した接着細胞をＫｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ８１０顕微鏡下でカウントした。結果を図５Ｂに示す。
【0132】
図５Ｂにおいて、使用したペプチドの濃度は、ＲＧＤＴＦペプチドが１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１２．５μＭ、６．２５μＭ、３．１２５μＭ、１．５６２５μＭおよび０．７８１２５μＭであり、ＲＧＤＴＦペプチド以外のペプチドが１０μＭ、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ、０．６２５μＭ、０．３１２５μＭ、０．１５６２５μＭおよび０．０７８１２５μＭである。
【0133】
図５Ｂにおいて、ＨｅＬａ細胞接着（％）は、ペプチドを添加していないコントロールにおけるＨｅＬａ細胞接着数を１００％としたときの比率を示す。
【0134】
図５Ｂに示すように、ペプチドが環状構造を有することで、よりも高い阻害活性を有することが分かる。特に、ｃ（ＲＧＤＴＦＧＣ）ペプチドおよびｃ（ＲＧＤＴＦＡＣ）ペプチドは、シレンギチドと同等以上の阻害活性を有することが分かる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】