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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022183360
(43)【公開日】2022-12-08
(54)【発明の名称】統合型プラスミド
(51)【国際特許分類】
C12N 15/86 20060101AFI20221201BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20221201BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20221201BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20221201BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20221201BHJP
【ＦＩ】
C12N15/86 Z ZNA
C12N15/861 Z
C12N15/864 100Z
C12N15/867 Z
C12N1/21
【審査請求】未請求
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022169231
(22)【出願日】2022-10-21
(62)【分割の表示】P 2022506963の分割
【原出願日】2021-11-02
(31)【優先権主張番号】P 2020184491
(32)【優先日】2020-11-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】517235683
【氏名又は名称】株式会社シンプロジェン
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100118371
【弁理士】
【氏名又は名称】▲駒▼谷 剛志
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】齋藤 俊介
(72)【発明者】
【氏名】柘植 謙爾
(57)【要約】
【課題】ウイルスベクタープラスミドを生産すること。
【解決手段】一つの局面において、本開示は、枯草菌内で複製する配列を有するウイルスベクタープラスミドを作製する方法を提供し、この方法は、枯草菌内で複製する配列を有する、ウイルスベクターを生産するための核酸配列を含む核酸を宿主細胞に導入して、前記宿主細胞においてプラスミドを形成させるステップを含む。一つの実施形態において、枯草菌は外部から取り込んだ核酸からプラスミドを形成する能力を有し得るので、この方法において、導入する核酸はプラスミドでなくてもよい。
【選択図】なし
【解決手段】一つの局面において、本開示は、枯草菌内で複製する配列を有するウイルスベクタープラスミドを作製する方法を提供し、この方法は、枯草菌内で複製する配列を有する、ウイルスベクターを生産するための核酸配列を含む核酸を宿主細胞に導入して、前記宿主細胞においてプラスミドを形成させるステップを含む。一つの実施形態において、枯草菌は外部から取り込んだ核酸からプラスミドを形成する能力を有し得るので、この方法において、導入する核酸はプラスミドでなくてもよい。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ウイルスベクターを生産するためのプラスミドを提供する。本開示は、またプラスミドから生産されたウイルスベクターおよびこれを含む組成物を提供する。
【背景技術】
【0002】
遺伝子治療およびワクチン療法などのためにアデノウイルスベクター（特許文献１）など種々のウイルスベクターが開発されている。
【0003】
ウイルスベクターの調製のためには、通常、プロデューサー細胞にウイルスベクタープラスミドを導入する必要がある。そのため、ウイルスベクタープラスミドの合成・構築が必要である。設計されたウイルスベクタープラスミドは、大腸菌などにおいて合成・構築されることが多く、枯草菌において合成・構築されたことはなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】国際公開第２００１／０９０３９２号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者らは、枯草菌においてウイルスベクタープラスミドを生産できることを見出した。この知見に基づき、本開示は、枯草菌において複製できるウイルスベクタープラスミドを提供する。また、本開示は、ウイルスベクタープラスミドを含む枯草菌、およびウイルスベクタープラスミドから生産されたウイルスベクターも提供する。
【0006】
したがって、本発明は以下を提供する。
（項目Ａ１）
枯草菌においてプラスミド複製を促進する核酸配列と、
ウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列のうちの少なくとも１つと、
を含むプラスミド。
（項目Ａ２）
前記ウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列は、
前記ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列と、
前記ウイルスのゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列と、
前記ウイルスの２つの末端反復配列と、
ヘルパー遺伝子をコードする核酸配列と、
を含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ３）
前記ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列、
前記ウイルスのゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列、
前記ウイルスの２つの末端反復配列、および
ヘルパー遺伝子をコードする核酸配列
のうちの少なくとも２つを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ４）
前記ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列、
前記ウイルスのゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列、
前記ウイルスの２つの末端反復配列、および
ヘルパー遺伝子をコードする核酸配列
のうちの少なくとも３つを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ５）
前記ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列と、
前記ウイルスのゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列と、
前記ウイルスの２つの末端反復配列と、
ヘルパー遺伝子をコードする核酸配列と、
を含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ６）
前記ウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列が、約１０ｋｂ以上である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ７）
前記カプシドタンパク質をコードする核酸配列、前記ゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列および前記ヘルパー遺伝子の少なくとも１つが、前記２つの末端反復配列に挟まれる領域の外にある、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ８）
枯草菌においてプラスミド複製を促進する前記核酸配列が、枯草菌において作動する複製起点を含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ９）
大腸菌においてプラスミドを増幅する核酸配列をさらに含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ１０）
前記ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列が、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、ｃａｐおよびｇａｇのうちの少なくとも１つを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ１１）
前記ウイルスのゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列が、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ４、ｒｅｐ、ψ、ＡＰＰ、ＭＡＡＰ、ｐｏｌおよびｒｅｖのうちの少なくとも１つを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ１２）
前記末端反復配列が、末端逆位反復配列（ＩＴＲ）または長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ１３）
前記ヘルパー遺伝子が、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ＲＰＥ、ＰＰＴ、ＰＲＥおよびｐｒｏのうちの少なくとも１つを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ１４）
前記ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列および前記ウイルスのゲノムを転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列のうちの少なくとも１つが、アデノウイルスの血清型１～５２またはアデノ随伴ウイルスの血清型１～１２およびその改変体のいずれかに由来する、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ１５）
前記プラスミドが、前記ウイルスの全ゲノムのうち少なくとも一部の遺伝子の配列を含まない、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ１６）
前記ウイルスが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスまたはセンダイウイルスである、項目Ａ１～１５のいずれか一項に記載のプラスミド。
（項目Ａ１７）
前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ１８）
前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルスである、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ１９）
前記末端反復配列が、アデノ随伴ウイルスの血清型１～１２およびその改変体のいずれかに由来する末端逆位反復配列（ＩＴＲ）である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ２０）
５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に上流からプロモーター、所望の遺伝子およびターミネーターを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ２１）
前記ヘルパー遺伝子が、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡのうちの少なくとも１つを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ２２）
前記ヘルパー遺伝子が、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ２３）
前記ヘルパー遺伝子のそれぞれが、アデノウイルスの血清型１～５２およびその改変体のいずれかに由来する、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ２４）
前記ウイルスのゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列が、ｒｅｐを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ２５）
前記ｒｅｐが、アデノ随伴ウイルスの血清型１～１２およびその改変体のいずれかに由来する、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ２６）
前記ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列が、ｃａｐを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ２７）
前記ｃａｐが、アデノ随伴ウイルスの血清型１～１２およびその改変体のいずれかに由来する、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ２８）
前記ウイルスの２つの末端反復配列の間に所望の遺伝子を含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ２９）
前記所望の遺伝子が、２～１００個の遺伝子である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ３０）
前記所望の遺伝子が、１０～１００個の遺伝子である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ３１）
前記所望の遺伝子が、プロモーター配列を含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ３２）
前記プラスミドおよびプロデューサー細胞が、一緒になって前記ウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列を含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ３３）
前記プラスミドを導入したプロデューサー細胞から生産される全ウイルスベクター粒子のうち、核酸を含まないウイルスベクター粒子が６５％以下である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ３４）
プロデューサー細胞に導入した場合に、生産される全ウイルスベクター粒子のうち、全ての所望の遺伝子を含む核酸を含むウイルスベクター粒子が９０％以上である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ３５）
プロデューサー細胞に導入した場合に、生産される全ウイルスベクター粒子のうち、所望の核酸以外の前記プラスミド由来の核酸を含むウイルスベクター粒子が２％以下である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ３６）
ＣＣＣ（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ）純度が、８０％以上である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ３７）
所望の遺伝子を発現するための、前記項目のいずれかのプラスミドを含む組成物であって、前記所望の遺伝子は前記プラスミド上で前記ウイルスの２つの末端反復配列の間に配置される、組成物。
（項目Ａ３８）
前記項目のいずれかの核酸配列を作動可能に連結するステップを含む、前記項目のいずれかのプラスミドを生産する方法。
（項目Ａ３９）
項目Ａ３８に記載の方法によって生産されるプラスミド含有組成物。
（項目Ａ４０）
プラスミドのＣＣＣ（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ）純度が、８０％以上である、前記項目のいずれかのプラスミド含有組成物。
（項目Ａ４１）
前記項目のいずれかのプラスミドを作製するためのキットであって、
枯草菌においてプラスミド複製を促進する核酸配列と、
ウイルスを構成するのに必要な核酸配列と、
を含む少なくとも１つの核酸を含む、キット。
（項目Ａ４２）
前記項目のいずれかのプラスミドを含む、ウイルスベクターを調製するための組成物。
（項目Ａ４３）
前記項目のいずれかのプラスミドを用いてウイルスベクターを生産するステップを含む、ウイルスベクターを調製するための方法。
（項目Ａ４４）
前記プラスミドに含まれる核酸の少なくとも一部が、前記プラスミドを導入したプロデューサー細胞の染色体に組み込まれる、前記項目のいずれかの方法。
（項目Ａ４５）
項目Ａ１～３６のいずれか一項に記載のプラスミドを用いて生産される、または項目Ａ４３または４４に記載の方法を用いて生産される、ウイルスベクター。
（項目Ａ４６）
前記項目のいずれかのプラスミドを用いて生産される、または前記項目のいずれかの方法を用いて生産される、ウイルスベクター含有組成物。
（項目Ａ４７）
全ウイルスベクター粒子のうち核酸を含まないウイルスベクター粒子が６５％以下である、前記項目のいずれかの組成物。
（項目Ａ４８）
全ウイルスベクター粒子のうち、全ての所望の遺伝子を含む核酸を含むウイルスベクター粒子が９０％以上である、前記項目のいずれかの組成物。
（項目Ａ４９）
全ウイルスベクター粒子のうち、所望の核酸以外の前記プラスミド由来の核酸を含むウイルスベクター粒子が２％以下である、前記項目のいずれかの組成物。
（項目Ａ５０）
前記項目のいずれかのプラスミドを含む枯草菌または大腸菌。
（項目Ａ５１）
前記項目のいずれかのプラスミドが導入されたプロデューサー細胞であって、前記プラスミドに含まれる核酸の少なくとも一部が、前記プロデューサー細胞の染色体に組み込まれている、プロデューサー細胞。
（項目１）
枯草菌においてプラスミド増幅を促進する核酸配列と、
ウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列のうちの少なくとも１つと、
を含むプラスミド。
（項目２）
前記ウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列は、
前記ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列と、
前記ウイルスのゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列と、
前記ウイルスの２つの末端反復配列と、
ヘルパー遺伝子と、
を含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目３）
枯草菌においてプラスミド増幅を促進する前記核酸配列が、枯草菌において作動する複製起点を含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目４）
前記ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列が、Ｌ２、Ｌ３、ｃａｐおよびｇａｇのうちの少なくとも１つを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目５）
前記ウイルスのゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列が、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ４、ｒｅｐ、ψ、ＡＰＰ、ＭＡＡＰ、ｐｏｌおよびｒｅｖのうちの少なくとも１つを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目６）
前記末端反復配列が、末端逆位反復配列（ＩＴＲ）または長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目７）
前記ヘルパー遺伝子が、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ＲＰＥ、ＰＰＴ、ＰＲＥおよびｐｒｏのうちの少なくとも１つを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目８）
前記ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列および前記ウイルスのゲノムを転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列のうちの少なくとも１つが、アデノウイルスの血清型１～５１またはアデノ随伴ウイルスの血清型１～１１のいずれかに由来する、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目９）
前記ウイルスが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスまたはセンダイウイルスである、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目１０）
前記ウイルスの２つの末端反復配列の間に所望の遺伝子を含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目１１）
前記所望の遺伝子が、２～１００個の遺伝子である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目１２）
前記所望の遺伝子が、プロモーター配列を含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目１３）
前記プラスミドおよびプロデューサー細胞が前記ウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列を含むようなプロデューサー細胞において機能するように構成される、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目１４）
前記プラスミドを導入したプロデューサー細胞から生産される全ウイルスベクター粒子のうち、核酸を含まないウイルスベクター粒子が６５％以下である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目１５）
プロデューサー細胞に導入した場合に、生産される全ウイルスベクター粒子のうち、全ての所望の遺伝子を含む核酸を含むウイルスベクター粒子が９０％以上である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目１６）
プロデューサー細胞に導入した場合に、生産される全ウイルスベクター粒子のうち、所望の核酸以外の前記プラスミド由来の核酸を含むウイルスベクター粒子が２％以下である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目１７）
前記項目のいずれかの核酸配列を作動可能に連結するステップを含む、前記項目のいずれかのプラスミドを生産する方法。
（項目１８）
前記項目のいずれかの方法によって生産されるプラスミド含有組成物。
（項目１９）
プラスミドのＣＣＣ（covalently closed circular）純度が、８０％以上である、前記項目のいずれかのプラスミド含有組成物。
（項目２０）
前記項目のいずれかのプラスミドを作製するためのキットであって、
枯草菌においてプラスミド増幅を促進する核酸配列と、
ウイルスを構成するのに必要な核酸配列と、
を含む少なくとも１つの核酸を含む、キット。
（項目２１）
前記項目のいずれかのプラスミドを含む、ウイルスベクターを調製するための組成物。（項目２２）
前記項目のいずれかのプラスミドを用いてウイルスベクターを生産するステップを含む、ウイルスベクターを調製するための方法。
（項目２３）
前記項目のいずれかのプラスミドを用いて生産される、または前記項目のいずれかの方法を用いて生産される、ウイルスベクター。
（項目２４）
前記項目のいずれかのプラスミドを用いて生産される、または前記項目のいずれかの方法を用いて生産される、ウイルスベクター含有組成物。
（項目２５）
全ウイルスベクター粒子のうち核酸を含まないウイルスベクター粒子が６５％以下である、前記項目のいずれかの組成物。
（項目２６）
全ウイルスベクター粒子のうち、全ての所望の遺伝子を含む核酸を含むウイルスベクター粒子が９０％以上である、前記項目のいずれかの組成物。
（項目２７）
全ウイルスベクター粒子のうち、所望の核酸以外の前記プラスミド由来の核酸を含むウイルスベクター粒子が２％以下である、前記項目のいずれかの組成物。
（項目２８）
前記項目のいずれかのプラスミドを含む枯草菌。
（項目Ａ１）
枯草菌においてプラスミド複製を促進する核酸配列と、
ウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列のうちの少なくとも１つと、
を含むプラスミド。
（項目Ａ２）
前記ウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列は、
前記ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列と、
前記ウイルスのゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列と、
前記ウイルスの２つの末端反復配列と、
ヘルパー遺伝子をコードする核酸配列と、
を含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ３）
前記ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列、
前記ウイルスのゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列、
前記ウイルスの２つの末端反復配列、および
ヘルパー遺伝子をコードする核酸配列
のうちの少なくとも２つを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ４）
前記ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列、
前記ウイルスのゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列、
前記ウイルスの２つの末端反復配列、および
ヘルパー遺伝子をコードする核酸配列
のうちの少なくとも３つを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ５）
前記ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列と、
前記ウイルスのゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列と、
前記ウイルスの２つの末端反復配列と、
ヘルパー遺伝子をコードする核酸配列と、
を含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ６）
前記ウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列が、約１０ｋｂ以上である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ７）
前記カプシドタンパク質をコードする核酸配列、前記ゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列および前記ヘルパー遺伝子の少なくとも１つが、前記２つの末端反復配列に挟まれる領域の外にある、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ８）
枯草菌においてプラスミド複製を促進する前記核酸配列が、枯草菌において作動する複製起点を含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ９）
大腸菌においてプラスミドを増幅する核酸配列をさらに含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ１０）
前記ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列が、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、ｃａｐおよびｇａｇのうちの少なくとも１つを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ１１）
前記ウイルスのゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列が、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ４、ｒｅｐ、ψ、ＡＰＰ、ＭＡＡＰ、ｐｏｌおよびｒｅｖのうちの少なくとも１つを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ１２）
前記末端反復配列が、末端逆位反復配列（ＩＴＲ）または長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ１３）
前記ヘルパー遺伝子が、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ＲＰＥ、ＰＰＴ、ＰＲＥおよびｐｒｏのうちの少なくとも１つを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ１４）
前記ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列および前記ウイルスのゲノムを転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列のうちの少なくとも１つが、アデノウイルスの血清型１～５２またはアデノ随伴ウイルスの血清型１～１２およびその改変体のいずれかに由来する、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ１５）
前記プラスミドが、前記ウイルスの全ゲノムのうち少なくとも一部の遺伝子の配列を含まない、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ１６）
前記ウイルスが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスまたはセンダイウイルスである、項目Ａ１～１５のいずれか一項に記載のプラスミド。
（項目Ａ１７）
前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスである、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ１８）
前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルスである、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ１９）
前記末端反復配列が、アデノ随伴ウイルスの血清型１～１２およびその改変体のいずれかに由来する末端逆位反復配列（ＩＴＲ）である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ２０）
５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に上流からプロモーター、所望の遺伝子およびターミネーターを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ２１）
前記ヘルパー遺伝子が、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡのうちの少なくとも１つを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ２２）
前記ヘルパー遺伝子が、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ２３）
前記ヘルパー遺伝子のそれぞれが、アデノウイルスの血清型１～５２およびその改変体のいずれかに由来する、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ２４）
前記ウイルスのゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列が、ｒｅｐを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ２５）
前記ｒｅｐが、アデノ随伴ウイルスの血清型１～１２およびその改変体のいずれかに由来する、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ２６）
前記ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列が、ｃａｐを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ２７）
前記ｃａｐが、アデノ随伴ウイルスの血清型１～１２およびその改変体のいずれかに由来する、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ２８）
前記ウイルスの２つの末端反復配列の間に所望の遺伝子を含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ２９）
前記所望の遺伝子が、２～１００個の遺伝子である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ３０）
前記所望の遺伝子が、１０～１００個の遺伝子である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ３１）
前記所望の遺伝子が、プロモーター配列を含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ３２）
前記プラスミドおよびプロデューサー細胞が、一緒になって前記ウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列を含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ３３）
前記プラスミドを導入したプロデューサー細胞から生産される全ウイルスベクター粒子のうち、核酸を含まないウイルスベクター粒子が６５％以下である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ３４）
プロデューサー細胞に導入した場合に、生産される全ウイルスベクター粒子のうち、全ての所望の遺伝子を含む核酸を含むウイルスベクター粒子が９０％以上である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ３５）
プロデューサー細胞に導入した場合に、生産される全ウイルスベクター粒子のうち、所望の核酸以外の前記プラスミド由来の核酸を含むウイルスベクター粒子が２％以下である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ３６）
ＣＣＣ（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ）純度が、８０％以上である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目Ａ３７）
所望の遺伝子を発現するための、前記項目のいずれかのプラスミドを含む組成物であって、前記所望の遺伝子は前記プラスミド上で前記ウイルスの２つの末端反復配列の間に配置される、組成物。
（項目Ａ３８）
前記項目のいずれかの核酸配列を作動可能に連結するステップを含む、前記項目のいずれかのプラスミドを生産する方法。
（項目Ａ３９）
項目Ａ３８に記載の方法によって生産されるプラスミド含有組成物。
（項目Ａ４０）
プラスミドのＣＣＣ（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｃｌｏｓｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ）純度が、８０％以上である、前記項目のいずれかのプラスミド含有組成物。
（項目Ａ４１）
前記項目のいずれかのプラスミドを作製するためのキットであって、
枯草菌においてプラスミド複製を促進する核酸配列と、
ウイルスを構成するのに必要な核酸配列と、
を含む少なくとも１つの核酸を含む、キット。
（項目Ａ４２）
前記項目のいずれかのプラスミドを含む、ウイルスベクターを調製するための組成物。
（項目Ａ４３）
前記項目のいずれかのプラスミドを用いてウイルスベクターを生産するステップを含む、ウイルスベクターを調製するための方法。
（項目Ａ４４）
前記プラスミドに含まれる核酸の少なくとも一部が、前記プラスミドを導入したプロデューサー細胞の染色体に組み込まれる、前記項目のいずれかの方法。
（項目Ａ４５）
項目Ａ１～３６のいずれか一項に記載のプラスミドを用いて生産される、または項目Ａ４３または４４に記載の方法を用いて生産される、ウイルスベクター。
（項目Ａ４６）
前記項目のいずれかのプラスミドを用いて生産される、または前記項目のいずれかの方法を用いて生産される、ウイルスベクター含有組成物。
（項目Ａ４７）
全ウイルスベクター粒子のうち核酸を含まないウイルスベクター粒子が６５％以下である、前記項目のいずれかの組成物。
（項目Ａ４８）
全ウイルスベクター粒子のうち、全ての所望の遺伝子を含む核酸を含むウイルスベクター粒子が９０％以上である、前記項目のいずれかの組成物。
（項目Ａ４９）
全ウイルスベクター粒子のうち、所望の核酸以外の前記プラスミド由来の核酸を含むウイルスベクター粒子が２％以下である、前記項目のいずれかの組成物。
（項目Ａ５０）
前記項目のいずれかのプラスミドを含む枯草菌または大腸菌。
（項目Ａ５１）
前記項目のいずれかのプラスミドが導入されたプロデューサー細胞であって、前記プラスミドに含まれる核酸の少なくとも一部が、前記プロデューサー細胞の染色体に組み込まれている、プロデューサー細胞。
（項目１）
枯草菌においてプラスミド増幅を促進する核酸配列と、
ウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列のうちの少なくとも１つと、
を含むプラスミド。
（項目２）
前記ウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列は、
前記ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列と、
前記ウイルスのゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列と、
前記ウイルスの２つの末端反復配列と、
ヘルパー遺伝子と、
を含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目３）
枯草菌においてプラスミド増幅を促進する前記核酸配列が、枯草菌において作動する複製起点を含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目４）
前記ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列が、Ｌ２、Ｌ３、ｃａｐおよびｇａｇのうちの少なくとも１つを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目５）
前記ウイルスのゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列が、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ４、ｒｅｐ、ψ、ＡＰＰ、ＭＡＡＰ、ｐｏｌおよびｒｅｖのうちの少なくとも１つを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目６）
前記末端反復配列が、末端逆位反復配列（ＩＴＲ）または長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目７）
前記ヘルパー遺伝子が、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ＲＰＥ、ＰＰＴ、ＰＲＥおよびｐｒｏのうちの少なくとも１つを含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目８）
前記ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列および前記ウイルスのゲノムを転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列のうちの少なくとも１つが、アデノウイルスの血清型１～５１またはアデノ随伴ウイルスの血清型１～１１のいずれかに由来する、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目９）
前記ウイルスが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスまたはセンダイウイルスである、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目１０）
前記ウイルスの２つの末端反復配列の間に所望の遺伝子を含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目１１）
前記所望の遺伝子が、２～１００個の遺伝子である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目１２）
前記所望の遺伝子が、プロモーター配列を含む、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目１３）
前記プラスミドおよびプロデューサー細胞が前記ウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列を含むようなプロデューサー細胞において機能するように構成される、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目１４）
前記プラスミドを導入したプロデューサー細胞から生産される全ウイルスベクター粒子のうち、核酸を含まないウイルスベクター粒子が６５％以下である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目１５）
プロデューサー細胞に導入した場合に、生産される全ウイルスベクター粒子のうち、全ての所望の遺伝子を含む核酸を含むウイルスベクター粒子が９０％以上である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目１６）
プロデューサー細胞に導入した場合に、生産される全ウイルスベクター粒子のうち、所望の核酸以外の前記プラスミド由来の核酸を含むウイルスベクター粒子が２％以下である、前記項目のいずれかのプラスミド。
（項目１７）
前記項目のいずれかの核酸配列を作動可能に連結するステップを含む、前記項目のいずれかのプラスミドを生産する方法。
（項目１８）
前記項目のいずれかの方法によって生産されるプラスミド含有組成物。
（項目１９）
プラスミドのＣＣＣ（covalently closed circular）純度が、８０％以上である、前記項目のいずれかのプラスミド含有組成物。
（項目２０）
前記項目のいずれかのプラスミドを作製するためのキットであって、
枯草菌においてプラスミド増幅を促進する核酸配列と、
ウイルスを構成するのに必要な核酸配列と、
を含む少なくとも１つの核酸を含む、キット。
（項目２１）
前記項目のいずれかのプラスミドを含む、ウイルスベクターを調製するための組成物。（項目２２）
前記項目のいずれかのプラスミドを用いてウイルスベクターを生産するステップを含む、ウイルスベクターを調製するための方法。
（項目２３）
前記項目のいずれかのプラスミドを用いて生産される、または前記項目のいずれかの方法を用いて生産される、ウイルスベクター。
（項目２４）
前記項目のいずれかのプラスミドを用いて生産される、または前記項目のいずれかの方法を用いて生産される、ウイルスベクター含有組成物。
（項目２５）
全ウイルスベクター粒子のうち核酸を含まないウイルスベクター粒子が６５％以下である、前記項目のいずれかの組成物。
（項目２６）
全ウイルスベクター粒子のうち、全ての所望の遺伝子を含む核酸を含むウイルスベクター粒子が９０％以上である、前記項目のいずれかの組成物。
（項目２７）
全ウイルスベクター粒子のうち、所望の核酸以外の前記プラスミド由来の核酸を含むウイルスベクター粒子が２％以下である、前記項目のいずれかの組成物。
（項目２８）
前記項目のいずれかのプラスミドを含む枯草菌。
【0007】
本発明において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【0008】
本開示は、枯草菌において複製できるウイルスベクタープラスミドを提供する。このウイルスベクタープラスミドに基づいて、従来にない改善された様式でウイルスベクター生産が可能である。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】ｐＡＡＶ－ＣＭＶプラスミドの構造を示す。
【図2】ｐＲＣ２－ｍｉ３４２プラスミドの構造を示す。
【図3】ｐＨｅｌｐｅｒプラスミドの構造を示す。
【図4】ｐＧＥＴＳ１０３－ＡＶプラスミドの構造を示す。
【図5】ｐＧＥＴＳ１０３－ＲＣ２プラスミドの構造を示す。
【図6】ｐＧＥＴＳ１０３－ＡＡＶ－ＲＣ２プラスミドの構造を示す。
【図7】ｐＧＥＴＳ１０３－ＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒ－ＲＣ２プラスミドの構造を示す（オールインワン構造）。
【図8】ｐＧＥＴＳ１０３－ＡＡＶプラスミドの構造を示す。
【図9】ｐＧＥＴＳ１０３－Ｈｅｌｐｅｒプラスミドの構造を示す。
【図10】ｐＧＥＴＳ１０３－ＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒ－ＲＣ２プラスミドを２２の断片からＯＧＡＢ法によって構築する概略を示す。点線の囲みは、ＡａｒＩ切断によって取り除かれる部分を示す（大文字はリンカー由来配列を示し、小文字はベクター由来配列を示す）。第１、第３および第１６の断片は化学合成およびＭＡＰ法によって取得した。その他の断片は、ＰＣＲによって取得した。
【図11】ＯＧＡＢ法によって構築したｐＧＥＴＳ１０３－ＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒ－ＲＣ２プラスミドの電気泳動の結果を示す。
【図12】ｐＧＥＴＳ１０３ΔＡａｒＩをベースに構築した例示的なレンチウイルスベクタープラスミドの構造を示す。
【図13】ｐＧＥＴＳ１０３ΔＡａｒＩをベースに構築した例示的なレトロウイルスベクタープラスミドの構造を示す。
【図14】ｐＧＥＴＳ１０３ΔＡａｒＩをベースに構築した例示的なセンダイウイルスベクタープラスミドの構造を示す。
【図15】ｐＧＥＴＳ１０３ΔＡａｒＩをベースに構築した例示的なアデノウイルスベクタープラスミドの構造を示す。
【図16】プラスミドｐＧＥＴＳ１１８－ＡａｒＩの構造および核酸導入箇所を示す。点線囲み部分は、ＡａｒＩ切断によって取り除かれる部分を示す。
【図17】ｐＧＥＴＳ１１８－ＡａｒＩに導入したＡＡＶベクターを生産するための追加の７種のオールインワン構造を示す。各オールインワン構造の下に示す白抜きの四角は、構築に使用した単位ＤＮＡの数およびおおよその対応領域を示す。
【図18】追加のベクタープラスミド（２～８）を使用した場合においてもｐＧＥＴＳ１０３－ＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒ－ＲＣ２プラスミド（１）と同様にウイルスベクターが生産されることを示す。
【図19】アデノウイルスベクターを生産するためのオールインワン構造を示す。下に示す白抜きの四角は、構築に使用した単位ＤＮＡの数およびおおよその対応領域を示す。ＧＯＩは所望の遺伝子を示す。
【図20】プラスミドｐＢＥＴ１３１－ＡａｒＩの構造および核酸導入箇所を示す。点線囲み部分は、ＡａｒＩ切断によって取り除かれる部分を示す。
【図21】ｐＧＥＴＳ１０３－ΔＡａｒＩに基づくＡＡＶ１のＲｅｐおよびＡＡＶ６のＣａｐを使用したＡＡＶウイルスオールインワンベクタープラスミドの構造を示す。オールインワン構造の下に示す白抜きの四角は、構築に使用する単位ＤＮＡの数およびおおよその対応領域を示す。
【図22】ｐＧＥＴＳ１０３－ΔＡａｒＩに基づくＣＡＧプロモーター、ＡＡＶ５のＲｅｐおよびＡＡＶ１のＣａｐを使用したＡＡＶウイルスオールインワンベクタープラスミドの構造を示す。オールインワン構造の下に示す白抜きの四角は、構築に使用する単位ＤＮＡの数およびおおよその対応領域を示す。
【図23】ｐＧＥＴＳ１０３－ΔＡａｒＩに基づくＥＦ１αプロモーター、ＡＡＶ８のＲｅｐおよびＡＡＶ９のＣａｐを使用したＡＡＶウイルスオールインワンベクタープラスミドの構造を示す。オールインワン構造の下に示す白抜きの四角は、構築に使用する単位ＤＮＡの数およびおおよその対応領域を示す。
【図24】ｐＧＥＴＳ１０３－ΔＡａｒＩに基づくＲｅｐ、ＣａｐおよびＨｅｌｐｅｒを異なる順序で配置したＡＡＶウイルスオールインワンベクタープラスミドの構造を示す。ＳＶ４０プロモーターを使用した例でもある。オールインワン構造の下に示す白抜きの四角は、構築に使用する単位ＤＮＡの数およびおおよその対応領域を示す。
【図25】ｐＢＥＴＳ１３１－ＡａｒＩに基づくＲｅｐ、ＣａｐおよびＨｅｌｐｅｒを異なる順序で配置したＡＡＶウイルスオールインワンベクタープラスミドの構造を示す。オールインワン構造の下に示す白抜きの四角は、構築に使用する単位ＤＮＡの数およびおおよその対応領域を示す。
【図26】ｐＢＥＴＳ１０３－ΔＡａｒＩに基づくＨｅｌｐｅｒ遺伝子の要素を変更したＡＡＶウイルスオールインワンベクタープラスミドの構造を示す。オールインワン構造の下に示す白抜きの四角は、構築に使用する単位ＤＮＡの数およびおおよその対応領域を示す。
【図27】ｐＧＥＴＳ１０３－ΔＡａｒＩに基づくＡＡＶ１のＲｅｐおよびＡＡＶ６のＣａｐを使用したコロナウイルスオールインワンベクタープラスミドの構造を示す。構造タンパク質領域に所望の遺伝子（ＧＯＩ）をプロモーターとともに位置付けた例である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【0011】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
【0012】
本明細書において「枯草菌」とは、土壌や植物に普遍的に存在し、反芻動物やヒトの胃腸管に存在する、好気性のグラム陽性のカタラーゼ陽性の細菌であり、０．７～０．８×２～３μｍの大きさであり、中温性で、最適生育温度は２５～４０℃であり、芽胞を形成するとされ、学名Bacillus subtilisまたはこれと近縁なBacillus属細菌であるBacillus amyloliquefaciens、Bacillus licheniformis、Bacillus pumilusなどを含む、病原性を有せず、自然形質転換能を有する任意の細菌をさす。好ましい実施形態では、枯草菌は、Bacillus subtilisの中で高い自然形質転換能を有する株であるMarburg 168株またはその派生株のRM125株である。168株は、遺伝的に最も研究されたグラム陽性菌であり、RM125株とともにATCC（American Type Culture Collection）などから入手可能であり、それ自体は人畜無害であること、ＯＧＡＢ法が適応可能であることが判っていることなどからも、本開示において好適に使用され得る。
【0013】
本明細書において使用する場合、「プラスミド」とは、細胞中で染色体とは別個に存在するか、または細胞に導入した場合に染色体とは別個に存在する環状ＤＮＡを指す。
【0014】
本明細書において「プラスミド複製を促進する核酸配列」とは、「プラスミド増幅を促進する核酸配列」と同じ意味で用いられ、宿主細胞（例えば、枯草菌）に導入されたときに、宿主細胞内に存在するプラスミドの複製（この文脈においては、増幅と同じである。）を促進する任意の核酸配列をいう。好ましくは、このプラスミド複製を促進する核酸配列は、対象となるプラスミドをコードする核酸配列と作動可能に連結されているがこれに限定されない。プラスミド複製を促進する核酸配列、対象となるプラスミド、それらの関係などの詳細は、本明細書の別の箇所に記載される。プラスミド複製を促進する核酸配列としては、対象となる宿主細胞（例えば、枯草菌）において作動する複製起点を含む核酸配列などをあげることができる。例えば、枯草菌においてプラスミド複製を促進する核酸配列は、枯草菌におけるプラスミド複製の促進を可能にする能力を有するが、枯草菌以外の微生物（例えば、大腸菌）においてプラスミド複製の促進を可能にする能力をさらに有してもよい。枯草菌および他の生物（例えば、大腸菌）においてプラスミド複製を促進する核酸配列は、枯草菌および他の生物（例えば、大腸菌）の両方において同じ領域がプラスミド複製の促進のために利用される核酸配列でもよいし、本開示のベクタープラスミド上の連続配列であってもよいし、離れた箇所に位置付けられる配列であってもよい。例えば、プラスミドｐＳＴＫ１（Issay Narumtら、BIOTECHNOLOGY LETTERS、Volume 17 No.5 (May 1995) pp.475-480）、およびプラスミドｐＢＳ１９５（Molekuliarnaia Genetikaら、01 May 1991, (5):26-29、PMID:1896058）は、枯草菌および大腸菌の両方において同じ複製開始領域で複製可能であることが示されており、このような核酸配列は、枯草菌および大腸菌の両方においてプラスミド複製を促進する核酸配列として使用され得る。また、ＢＲ３２２（大腸菌プラスミド）およびｐＣ１９４（枯草菌プラスミド）を連結して作製されたシャトルプラスミド（P Trieu-Cuotら、EMBO J. 1985 Dec 16;4(13A):3583-3587.）、およびタカラバイオ（滋賀県）から提供されるｐＵＢｏｒｉおよびＣｏｌＥ１ ｏｒｉを含むＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍのプラスミドは、大腸菌および枯草菌の両方において複製可能であり、このような離れて位置付けられる核酸配列も、枯草菌および大腸菌の両方においてプラスミド複製を促進する核酸配列として使用され得る。枯草菌における核酸（プラスミド）の複製機構としては、ローリングサークル型、シータ型、ｏｒｉＣ、ファージによるものなどが挙げられ、枯草菌内で複製される配列としていずれの機構を利用するものでも使用することができる。ローリングサークル型の複製機構は、二本鎖ＤＮＡの片側の一本鎖の複製を行ったのち、もう一方の鎖の複製を行う機構であり、核酸が一本鎖ＤＮＡとして存在する時間が長いためプラスミドが不安定化になる傾向がある。シータ型の複製機構は、細菌染色体の複製の場合と同じように複製起点から２方向に同時に二本鎖ＤＮＡ（プラスミド）の複製が開始される機構であり、本開示のように長いＤＮＡ（例えば、１０ｋｂ以上）の複製の際には好ましく使用され得る（Janniere, L., A. Gruss, and S. D. Ehrlich. 1993. Plasmids, p. 625-644. InA. L. Sonenshein, J. A. Hoch, and R. Losick (ed.), Bacillus subtilis and othergram-positive bacteria: biochemistry, physiology and molecular genetics.American Society for Microbiology, Washington, D.C.）。ｏｒｉＣの複製機構は、宿主細菌（例えば、枯草菌）染色体の複製の場合と同じように作動する。枯草菌内でプラスミド複製を促進する核酸配列としては、ローリングサークル型、シータ型、ｏｒｉＣ、ファージなどによる複製機構を作動させることが公知である、プラスミドもしくはその部分または複製起点あるいはそれらの改変体などが挙げられる。ローリングサークル型プラスミドとして、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、ｐＥ１９４、ｐＴ１８１などが公知であり、シータ型プラスミドとして、ｐＡＭβ１、ｐＴＢ１９、ｐＬＳ３２、ｐＬＳ２０などが公知である。枯草菌内でプラスミド複製を促進する核酸配列は、公知の複製開始点と同一または類似の配列（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上の配列同一性）を有し得る。例えば、候補ＤＮＡ断片と、薬剤耐性遺伝子などの枯草菌で有効な選択マーカー遺伝子とを連結したＤＮＡ断片を枯草菌に導入した後、（薬剤などを添加して）培養した後に、これが染色体外で複製される場合、この候補ＤＮＡ断片は枯草菌内でプラスミド複製を促進する核酸配列を有すると判定できる。プラスミド増幅を促進する核酸配列は、複製開始点を有するＤＮＡ断片であり、染色体ＤＮＡとは独立して複製可能なＤＮＡ断片を指す。これらのＤＮＡ断片が複製可能かどうかは、これらのＤＮＡ断片に薬剤耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子を連結し、薬剤などの選択条件で培養した後、プラスミドＤＮＡを精製し、電気泳動によりそのＤＮＡのバンドを観察するなどの手法により確認することが出来る。プラスミドは、複製開始点の他に、複製開始点に宿主のＤＮＡ複製酵素を誘導するｒｅｐタンパク質の遺伝子や、プラスミドの娘細胞への分配を確実に行うための分配機構遺伝子、選択マーカー遺伝子などを含んでもよい。ｒｅｐタンパク質の遺伝子内に複製開始点が融合していてもよい。
【0015】
本明細書において使用する場合、「パッケージング細胞」とは、ベクタープラスミドを生産するための細胞を指す。
【0016】
本明細書において使用する場合、「ベクタープラスミド」または「ウイルスベクタープラスミド」とは、ウイルスベクターに搭載する遺伝子を含む、プロデューサー細胞においてウイルスベクターを生産するためのプラスミドを指す。ベクタープラスミドは、２つの末端反復配列の間にウイルスベクターの標的細胞内で発現させる遺伝子（所望の遺伝子）の配列を含み、その他にプロモーターを含み、さらに他の要素（例えば、エンハンサー、ターミネーター等）を含んでもよい。
【0017】
本明細書において使用する場合、「プロデューサー細胞」とは、所望のウイルスベクターを産生できる細胞を意味し、ウイルスベクターの産生に必要な遺伝子が、染色体および導入したプラスミドから発現される細胞であり得る。プロデューサー細胞に本開示のベクタープラスミドを導入することで、所望のウイルスベクターが生産され得る。例えば、ＡＡＶウイルスベクターの場合、その産生にＥ１ＡとＥ１Ｂが必要であるが、ＨＥＫ２９３はこれらを有するため、これらをヘルパープラスミドから除くことができる。他の細胞でも、このようなヘルパー因子を有するように改変すれば、プロデューサー細胞として機能する。
【0018】
本明細書において使用する場合、「ウイルスベクター」とは、ウイルスに由来する構造を少なくとも部分的に有し、標的細胞に核酸を導入できる構築物を指す。典型的には、ウイルスベクターは、ウイルスのカプシドおよび異種遺伝子を含む核酸を含むウイルス粒子の形態である。本明細書において使用する場合、「起源ウイルス」とは、ウイルスベクターが有するウイルス由来構造を天然に有するウイルスを指す。ウイルスベクターにおいて、カプシドに包有される核酸（搭載核酸）は、２つの末端反復配列の間にウイルスベクターの標的細胞内で発現させる遺伝子（所望の遺伝子）配列を含み、その他に、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等を含んでもよいし、起源ウイルスに由来する遺伝子を含んでもよい。
【0019】
本明細書において、「ウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列」とは、これを含むプロデューサー細胞がウイルスベクターを生産できる核酸配列（例えば、核酸配列の組合せ）を指す。一つの実施形態において、ウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列は、ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列と、ウイルスのゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列と、ウイルスの２つの末端反復配列と、ヘルパー遺伝子の核酸配列とを含む。「ヘルパー遺伝子の核酸配列」とは、例えば、ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列、ウイルスのゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列、およびウイルスの２つの末端反復配列以外の任意のウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列を含みうるかあるいは本質的になる。これらのそれぞれの核酸配列は、ウイルスベクターごとに異なり得る。これらの詳細は、本明細書の別の箇所に記載される。好ましい実施形態では、ウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列は、ＡＡＶおよびアデノウイルスに共通する有利な配列が利用され、より好ましくはＡＡＶに有利な配列が利用され得る。このようなＡＡＶおよびアデノウイルスに共通する有利な配列は、末端逆位反復配列（ＩＴＲ）の間に所望の遺伝子を含み、ヘルパー遺伝子、ｒｅｐ、ｃａｐまたはＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５を含でもよいという特徴を有し、ＡＡＶに有利な配列は、ＩＴＲの間に所望の遺伝子を含み、ヘルパー遺伝子、ｒｅｐ、ｃａｐを含んでもよい。ヘルパー遺伝子、ｒｅｐ、ｃａｐの配置は２つのＩＴＲの外側でもよいという特徴を有する。例えば、このような例としては、特定のヘルパー遺伝子Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４の配列が挙げられるがこれに限定されない。
【0020】
本明細書において「ウイルスのゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質」とは、ウイルスのゲノムをカプシドに内包させるタンパク質、転写するタンパク質、ウイルスのゲノムを複製するタンパク質、その両方の機能を有するタンパク質を含み、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ４、ｒｅｐ、ｐｏｌ、ψ、ＡＰＰ、ＭＡＡＰおよびｒｅｖなどを挙げることができる。限定を意図しないが、ウイルスのゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質はアデノウイルスの血清型１～５２またはアデノ随伴ウイルスの血清型１～１２、あるいはその改変体（ｒｈ１０、ＤＪ、ＤＪ／８、ＰＨＰ．ｅＢ、ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ２－ＱｕａｄＹＦ、ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ６．２、ｒｈ．７４、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ－ＴＴ、Ａｎｃ８０など）のいずれかに由来するものが利用され得る。このタンパク質は、天然のものであっても、人工的に変異を導入したものであってもよい。「人工的に変異」を導入したものは、例えば公知の文献に記載されている天然のものの配列に対して適宜の変異を導入することで作製することができる。
【0021】
本明細書において使用する場合、「カプシド」は、ウイルスまたはウイルスベクターの表面に存在する（必要に応じてエンベロープに封入されている）ウイルスが有する遺伝子から生産されるタンパク質を指し、「カプシドタンパク質」ともいう。カプシドは細胞への感染性を担い得る。カプシドタンパク質には、Ｌ２、Ｌ３、ｃａｐおよびｇａｇをあげることができるがこれらに限定されない。限定を意図しないが、ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列は、アデノウイルスの血清型１～５２またはアデノ随伴ウイルスの血清型１～１２、あるいはその改変体（ｒｈ１０、ＤＪ、ＤＪ／８、ＰＨＰ．ｅＢ、ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ２－ＱｕａｄＹＦ、ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ６．２、ｒｈ．７４、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ－ＴＴ、Ａｎｃ８０など）のいずれかに由来するものが利用され得る。カプシドは、天然のものであっても、人工的に変異を導入したものであってもよい。「人工的に変異」を導入したものは、例えば公知の文献に記載されている天然のものの配列に対して適宜の変異を導入することで作製することができる。
【0022】
本明細書において「反復配列」または「タンデムリピート」（な核酸配列）とは、生物ゲノムの核酸配列で、同じ配列が反復して（特に数回以上）見られるものの総称である。当該分野で使用される任意の反復配列を本開示において使用することができる。典型的には、プロモーター配列が反復して出現する。
【0023】
本明細書において「末端反復配列」は、生物ゲノムの核酸配列で、同じ配列が反復して（特に数回以上）見られるもののうち、末端に存在するものの総称である。末端反復配列としては、末端逆位反復配列（ＩＴＲ）または長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）などをあげることができるがこれらに限定されない。末端反復配列は、アデノウイルスの血清型１～５２またはアデノ随伴ウイルスの血清型１～１２、あるいはその改変体（ｒｈ１０、ＤＪ、ＤＪ／８、ＰＨＰ．ｅＢ、ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ２－ＱｕａｄＹＦ、ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ６．２、ｒｈ．７４、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ－ＴＴ、Ａｎｃ８０など）のいずれかに由来するものが利用され得る。末端反復配列としては、天然のものであっても、人工的に変異を導入したものであってもよい。「人工的に変異」を導入したものは、例えば公知の文献に記載されている天然のものの配列に対して適宜の変異を導入することで作製することができる。
【0024】
本明細書において「ヘルパー遺伝子」とは、単独では増殖できないウイルスの増幅を支援する遺伝子をいう。本開示において、ヘルパー遺伝子には、例えば、そのウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列、そのウイルスのゲノムをパッケージング、転写および／または複製するタンパク質をコードする核酸配列、ならびにそのウイルスの２つの末端反復配列以外の任意のウイルスベクターを構成、増殖、活性向上、毒性低減するのに必要な核酸配列が挙げられ得るがこれらに限定されない。使用され得るヘルパー遺伝子としては、例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ４、ＲＰＥ、ＷＲＰＥ、ＰＰＴ、ｏＰＲＥ、エンハンサー、インスレーター、サイレンサー配列等を挙げることができるがこれらに限定されない。
【0025】
本明細書において使用する場合、「搭載（ｌｏａｄｅｄ）核酸」とは、ウイルスベクターに担持されている核酸を意味する。搭載核酸であるかどうかは、ウイルスベクター調製物をＤＮａｓｅ処理してカプシド外の核酸を分解した後、ＤＮａｓｅを不活化し、その後カプシドから抽出した核酸を確認することによって確認することができる。搭載核酸であるかどうかは、得られた核酸生成物の配列（好ましくは全長または全長に近い長さのもの）を調べることによって確認することもできる。
【0026】
本明細書において使用する場合、「宿主細胞」とは、外来性の核酸またはタンパク質またはウイルスもしくはウイルスベクターが導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）をさす。
【0027】
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、天然または人工的に改変されたポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）が包含される。
【0028】
本明細書において「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。核酸の例として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｌｎｃＲＮＡが挙げられる。この用語はまた、「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチド誘導体を含むか、またはヌクレオチド間結合が通常とは異なるポリヌクレオチドをいう。「ヌクレオチド誘導体」とは、天然のＤＮＡまたはＲＮＡにおいて使用される通常のヌクレオチドとは異なる構造を有するヌクレオチドをいい、例えば、ロックト核酸（ＬＮＡ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン架橋核酸(2'-O,4'-C-ethylene bridged nucleic acid、ENA)などのエチレン核酸、その他の架橋核酸（bridged nucleic acid、BNA)、ヘキシトール核酸（hexitol nucleic acid、HNA）、アミド架橋核酸（Amido-bridged nucleic acid、AmNA）、モルホリノ核酸、トリシクロ-DNA（tcDNA）、ポリエーテル核酸（例えば、米国特許第5,908,845号参照）、シクロヘキセン核酸（CeNA）などが挙げられる。ヌクレオチド間結合が通常とは異なる例として、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド間結合、リン酸ジエステル結合がＮ３’－Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド間結合、リボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド間結合などが挙げられる。
【0029】
他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る。例えば、アデノウイルスの血清型１～５２およびアデノ随伴ウイルスの血清型１～１２など具体的な野生型配列に基づく改変体には、公知の改変体（例えば、ｒｈ１０、ＤＪ、ＤＪ／８、ＰＨＰ．ｅＢ、ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ２－ＱｕａｄＹＦ、ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ６．２、ｒｈ．７４、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ－ＴＴ、Ａｎｃ８０など）以外にも、元となる配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％の配列同一性を有する配列を含む核酸も含まれる。
【0030】
本明細書において「遺伝子」とは、一定の生物学的機能を果たす核酸部分を指す。この生物学的機能として、ポリペプチドまたはタンパク質をコードすること、タンパク質非コード機能性ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｌｎｃＲＮＡなど）をコードすること、ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質非コード機能性ＲＮＡの生産を制御すること、特定のタンパク質に特異的に結合されること、核酸の切断または複製を制御することが挙げられる。そのため、本明細書における遺伝子には、タンパク質またはタンパク質非コード機能性ＲＮＡをコードする核酸部分以外にも、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、インスレーター、サイレンサー、複製起点、内部リボソーム侵入部位などの転写翻訳調節配列、およびウイルス粒子へのパッケージングに必要となる核酸部分が含まれる。本明細書において「遺伝子産物」とは、遺伝子にコードされるポリペプチド、タンパク質、またはタンパク質非コード機能性ＲＮＡを指し得る。
【0031】
本明細書において２つの遺伝子がシスであるとは、同一の核酸分子または相補鎖（二本鎖核酸の場合）の核酸分子上にそれらの遺伝子が存在することを指す。また、本明細書において２つの遺伝子がトランスであるとは、（ある生物における）ある細胞において、これらの遺伝子が、同一の核酸分子または相補鎖（二本鎖核酸の場合）の核酸分子上に存在しないことを指す。例えば、ゲノム上に存在する遺伝子と、ウイルスベクターで導入された核酸上の遺伝子はトランスであり得る。必要に応じて、２つの遺伝子がトランスであるかどうかは、２つの遺伝子が細胞に同時に存在するようになった（例えば、細胞への核酸の導入）時点における状態において判断され得る。
【0032】
本明細書において遺伝子の数について言及する場合、１つの遺伝子は、ある生物のゲノム上に通常（最も高い頻度または５０％以上の確率）存在する形態において連続配列を有する遺伝子を指す。例えば、あるタンパク質をコードする２つのエクソンは、２つの遺伝子であり得る。例えば、プロモーター配列とタンパク質をコードする配列とが連続配列を形成している場合、プロモーター配列およびタンパク質をコードする配列を含む核酸部分は、１つの遺伝子であり得る。例えば、切断されることで機能的になるタンパク質がゲノム上で連続配列によってコードされる場合、このタンパク質は、１つの遺伝子にコードされ得る。機能の側面から遺伝子に言及する場合、核酸配列は連続配列である必要はなく、例えば、あるタンパク質をコードする複数のエクソンは集合的にそのタンパク質の遺伝子として言及される。
【0033】
本明細書において使用する場合、遺伝子を「欠損する」とは、核酸がその遺伝子を含まないか、またはその遺伝子の正常な機能（例えば、機能的なタンパク質を生産する機能）を発揮しないように改変された遺伝子を含むことを指す。
【0034】
本明細書において使用する場合、「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【0035】
本明細書において使用する場合、「転写翻訳調節配列」は、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、エンハンサー、IRESなどを総称し、それらが協働して、レシピエント細胞でコード配列の複製、転写及び翻訳を可能にする。選択されるコード配列の複製、転写および翻訳が適当な宿主細胞において可能である限り、これらの転写翻訳調節配列のすべてが必ずしも存在する必要があるわけではない。当業者は、公開情報から調節核酸配列を容易に同定することができる。さらに、当業者は、例えばin vivo、ex vivoまたはin vitroで、使用目的に適用できる転写翻訳調節配列を同定することができる。
【0036】
本明細書において使用する場合、「プロモーター」は、作動可能に連結された核酸配列の転写を制御する核酸配列のセグメントを指す。プロモーターは、RNAポリメラーゼによる認識、結合および転写開始のために十分である特定の配列を含む。プロモーターは、RNAポリメラーゼの認識、結合または転写開始を調節する配列を含んでもよい。
【0037】
本明細書において使用する場合、「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高める機能を有する核酸配列のセグメントを指す。
【0038】
本明細書において使用する場合、「サイレンサー」は、エンハンサーとは逆に目的遺伝子の発現効率を低下させる機能を有する核酸配列のセグメントを指す。
【0039】
本明細書において使用する場合、「インスレーター」は、ＤＮＡの配列上の離れた位置にある遺伝子の発現の調節を行うシス調節の機能を有する核酸配列のセグメントを指す。
【0040】
本明細書において使用する場合、「ターミネーター」は、タンパク質をコードする領域の下流に位置し、核酸がｍＲＮＡに転写される際の転写の終結に関与する核酸配列のセグメントを指す。
【0041】
本明細書において使用する場合、「複製起点」は、その核酸配列を認識するタンパク質（例えば、イニシエーターＤｎａＡタンパク質など）が結合することや、ＲＮＡが合成されることで部分的にＤＮＡ二重らせんが解かれ、複製が開始される核酸配列のセグメントを指す。
【0042】
本明細書において使用する場合、内部リボソーム侵入部位(「IRES」)は、その下流の核酸配列の翻訳の際、リボソームの侵入または保持を促進する核酸セグメントを指す。
【0043】
本明細書において核酸の「相同性」とは、２以上の核酸配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。従って、ある２つの核酸の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。「類似性」は、同一性に加え、類似の塩基についても計算に入れた数値であり、ここで類似の塩基とは、混合塩基（例えば、Ｒ＝Ａ＋Ｇ、Ｍ＝Ａ＋Ｃ、Ｗ＝Ａ＋Ｔ、Ｓ＝Ｃ＋Ｇ、Ｙ＝Ｃ＋Ｔ、Ｋ＝Ｇ＋Ｔ、Ｈ＝Ａ＋Ｔ＋Ｃ、Ｂ＝Ｇ＋Ｔ＋Ｃ、Ｄ＝Ｇ＋Ａ＋Ｔ、Ｖ＝Ａ＋Ｃ＋Ｇ、Ｎ＝Ａ＋Ｃ＋Ｇ＋Ｔ）において、一部が一致する場合をいう。２種類の核酸が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの核酸配列を直接比較する場合、その核酸配列間で、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【0044】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはIUPAC－IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのBLAST 2．10.1＋（2020．6.18発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記BLASTを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメータの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。類似性は、同一性に加え、類似のアミノ酸についても計算に入れた数値である。
【0045】
本明細書において、特に断らない限り、ある生物学的物質（例えば、タンパク質、核酸、遺伝子）についての言及は、その生物学的物質の生物学的機能と同様の機能（同じ程度でなくてもよい）を発揮するその生物学的物質のバリアント（例えば、アミノ酸配列に修飾を有するバリアント）についての言及でもあることが理解される。このようなバリアントには、元の分子のフラグメント、同一サイズの元の生物学的物質のアミノ酸配列または核酸配列にわたり、または当該分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによってアラインメントを行ってアラインされる元の分子の配列と比較した際、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である分子が含まれ得る。バリアントには、改変されたアミノ酸（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化またはリン酸化による改変）または改変されたヌクレオチド（例えば、メチル化による改変）を有する分子が含まれ得る。
【0046】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。ストリンジェントな条件は、例えば、以下の条件を採用することができる。(1)洗浄のために低イオン強度および高温度を用いる(例えば、50℃で、0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1％のドデシル硫酸ナトリウム)、(2)ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いる(例えば、42℃で、50％(v/v)ホルムアミドと0.1％ウシ血清アルブミン/0.1％フィコール/0.1％のポリビニルピロリドン/50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、および750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウム)、または(3)20％ホルムアミド、5×SSC、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハード液、10％硫酸デキストラン、および20mg/mlの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベーションし、次に約37-50℃で1×SSCでフィルターを洗浄する。なお、ホルムアミド濃度は50％またはそれ以上であってもよい。洗浄時間は、5、15、30、60、もしくは120分、またはそれら以上であってもよい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに影響する要素としては温度、塩濃度など複数の要素が考えられ、詳細はAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers,(1995)を参照することができる。「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、６５～６８℃、または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド、４２℃である。ハイブリダイゼーション、Molecular Cloning 2nd ed.,Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, DNA Cloning 1:Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press(1995)などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、A配列のみまたはT配列のみを含む配列が除外される。中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することができ、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第３番、Vol．１、７．４２－７．４５ Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０－５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ－６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。従って、本開示において使用されるポリペプチドには、本開示で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、高度または中程度でストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。
【0047】
本明細書において「対応する」アミノ酸または核酸とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸またはヌクレオチドと同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドをいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。対応するアミノ酸は、例えば、システイン化、グルタチオン化、Ｓ－Ｓ結合形成、酸化（例えば、メチオニン側鎖の酸化）、ホルミル化、アセチル化、リン酸化、糖鎖付加、ミリスチル化などがされる特定のアミノ酸であり得る。あるいは、対応するアミノ酸は、二量体化を担うアミノ酸であり得る。このような「対応する」アミノ酸または核酸は、一定範囲にわたる領域またはドメインであってもよい。従って、そのような場合、本明細書において「対応する」領域またはドメインと称される。
【0048】
本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。例えば、血清型１のＡＡＶのｃａｐは血清型２のＡＡＶのｃａｐに対応し得る。例えば、あるウイルスにおける対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となるウイルスの遺伝子配列をクエリ配列として用いてそのウイルスの配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【0049】
本発明に従って、用語「活性」は、本明細書において、最も広い意味での分子の機能を指す。活性は、限定を意図するものではないが、概して、分子の生物学的機能、生化学的機能、物理的機能または化学的機能を含む。活性は、例えば、酵素活性、他の分子と相互作用する能力、および他の分子の機能を活性化するか、促進するか、安定化するか、阻害するか、抑制するか、または不安定化する能力、安定性、特定の細胞内位置に局在する能力を含む。適用可能な場合、この用語はまた、最も広い意味でのタンパク質複合体の機能にも関する。
【0050】
本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、特異的な細胞表面構造認識能、酵素活性、特定のタンパク質との結合能等を挙げることができるがそれらに限定されない。本開示においては、例えば、あるプロモーターが特定の宿主細胞において認識される機能などを挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含され、例えば、ある分子との相互作用によって別の分子が活性化または不活化される活性も包含される。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドの対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。従って、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、宿主細胞における上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度が挙げられる。
【0051】
本発明において使用する場合、ウイルスまたはウイルスベクターの「感染性」とは、ウイルスまたはウイルスベクターの細胞への接着または膜融合によって、ウイルスまたはウイルスベクター内の核酸を細胞内に導入する能力を指す。センダイウイルスベクターは、野生型ベクターと同じ複製能力を有しても良く、また遺伝子変異によって弱くなっても良い。ウイルスまたはウイルスベクターの「複製能力」とは、感染細胞内で感染性のウイルス粒子またはウイルスベクター粒子を産生する能力を指す。
【0052】
本明細書において使用する場合、用語「形質転換」、「形質導入」および「トランスフェクション」は、特に言及しない限り互換可能に使用され、宿主細胞への核酸の導入（必要に応じてウイルスまたはウイルスベクターを介した）を意味する。形質転換方法としては、宿主細胞に核酸を導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、コンピテント化細胞の使用、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法、リン酸カルシウム法などの種々の周知の技術が挙げられる。
【0053】
本明細書において「精製された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。従って、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本発明で用いられる物質は、好ましくは「精製された」物質である。
【0054】
本明細書において「医薬成分」とは、医薬を構成し得る任意の成分を意味し、例えば、有効成分（それ自体が薬効を示すもの）、添加成分（それ自体は、薬効を期待されていないが、医薬として含まれる場合一定の役割（例えば、賦形剤、滑沢剤、界面活性剤等）を果たすことが期待される成分）等を例示することができる。医薬成分は、単独の物質であってもよく、複数の物質や剤の組み合わせであってもよい。有効成分と添加成分との組み合わせ、アジュバントと有効成分との組み合わせなどの任意の組み合わせも含まれ得る。
【0055】
本明細書では、「有効成分」は、意図される薬効を発揮する成分をいい、単独または複数の成分が該当し得る。
【0056】
本明細書において「添加成分」とは、薬効を期待されていないが、医薬として含まれる場合一定の役割を果たす任意の成分をいい、例えば、薬学的に受容可能なキャリア、安定化剤、（補）助剤、溶解度改善剤、可溶化剤、希釈剤、賦形剤、緩衝剤、結合剤、希釈剤、香味料、潤滑剤を挙げることができる。
【0057】
本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではａｇｅｎｔに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子およびこれらの混合物が挙げられるがそれらに限定されない。
【0058】
本明細書において使用される場合、「複合体」または「複合分子」とは、２以上の部分を含む任意の構成体を意味する。例えば、一方の部分がポリペプチドである場合は、他方の部分は、ポリペプチドであってもよく、それ以外の物質（例えば、基材、糖、脂質、核酸、他の炭化水素等）であってもよい。本明細書において複合体を構成する２以上の部分は、共有結合で結合されていてもよくそれ以外の結合（例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力等）で結合されていてもよい。
【0059】
本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（例えば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができる。標的タンパク質またはそれを捕捉する因子または手段を複数、蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、１０ｎｍ以上であることが好ましい。機能に影響を与えない任意の標識が使用できるが、蛍光物質としては、ＡｌｅｘａＴＭＦｌｕｏｒが挙げられる。ＡｌｅｘａＴＭＦｌｕｏｒは、クマリン、ローダミン、フルオレセイン、シアニンなどを修飾して得られた水溶性の蛍光色素であり、広範囲の蛍光波長に対応したシリーズであり、他の該当波長の蛍光色素に比べ、非常に安定で、明るく、またｐＨ感受性が低い。蛍光極大波長が１０ｎｍ以上ある蛍光色素の組み合わせとしては、ＡｌｅｘａＴＭ５５５とＡｌｅｘａＴＭ６３３の組み合わせ、ＡｌｅｘａＴＭ４８８とＡｌｅｘａＴＭ５５５との組み合わせ等を挙げることができる。他の蛍光標識として、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ－アセトキシ－Ｎ２－アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）等が挙げられる。本開示では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。
【0060】
本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、ウイルスベクター、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分をどのように使用するか、あるいは、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、ウイルスベクター等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。
【0061】
本明細書において「指示書」は、本開示を使用する方法を医師または他の使用者に対する説明を記載したものである。この指示書は、本開示の医薬などを投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与形態を指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本開示が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【0062】
用語「約」は、示された値プラスまたはマイナス１０％を指す。「約」が、温度について使用される場合、示された温度プラスまたはマイナス５℃を指し、「約」が、ｐＨについて使用される場合、示されたｐＨプラスまたはマイナス０．５を指す。
【0063】
（好ましい実施形態）
以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
【0064】
（ベクタープラスミド）
一つの局面において、本開示は、枯草菌において複製できるウイルスベクタープラスミドを提供する。１つの実施形態では、本開示は、Bacillus subtilisにおいて複製できるウイルスベクタープラスミドを提供する。これを達成するための任意の手段が本開示の範囲であると企図される。例えば、明示的な記載がなくとも、ある成分を使用する方法の記載は、同成分を含む組成物、同成分の使用および同方法に使用するための同成分など、他の手段を反映した実施形態も同時に企図するものである。
一つの局面において、本開示は、枯草菌において複製できるウイルスベクタープラスミドを提供する。１つの実施形態では、本開示は、Bacillus subtilisにおいて複製できるウイルスベクタープラスミドを提供する。これを達成するための任意の手段が本開示の範囲であると企図される。例えば、明示的な記載がなくとも、ある成分を使用する方法の記載は、同成分を含む組成物、同成分の使用および同方法に使用するための同成分など、他の手段を反映した実施形態も同時に企図するものである。
【0065】
一つの局面において、本開示は、枯草菌においてプラスミド複製を促進する核酸配列と、ウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列とを含むプラスミドを提供する。一つの実施形態において、枯草菌においてプラスミド複製を促進する核酸配列は、枯草菌において作動する複製起点、例えば、ｏｒｉＣ、およびｐＴＢ１９（Ｉｍａｎａｋａ，Ｔ．， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｉ． １３０， １３９９－１４０８． （１９８４））やｐＬＳ３２（Ｔａｎａｋａ， Ｔ ａｎｄ Ｏｇｒａ， Ｍ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４２２， ２４３－２４６． （１９９８））、ｐＡＭβ１（Ｓｗｉｎｆｉｅｌｄ， Ｔ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ ８７， ７９－９０． （１９９０））等のプラスミドに含まれる複製起点を含み得る。枯草菌においてプラスミド複製を促進する核酸配列としては、ローリングサークル型、シータ型、ｏｒｉＣ、ファージなどによる複製機構を作動させることが公知である、プラスミドもしくはその部分または複製起点あるいはそれらの改変体などが挙げられる。一つの実施形態において、枯草菌においてプラスミド複製を促進する核酸配列は、公知の複製開始点と同一または類似の配列（例えば、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上の配列同一性）を有し得る。
【0066】
一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、枯草菌において作動するプロモーターおよび／またはエンハンサーを有し得る。例えば、枯草菌のプロモーターとして、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｓ－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）で発現制御可能なＰｓｐａｃ（Ｙａｎｓｕｒａ， Ｄ． ａｎｄ Ｈｅｎｎｅｒ， Ｄ． Ｊ． Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ ８１， ４３９－４４３．（１９８４．））、あるいはＰｒプロモーター（Ｉｔａｙａ， Ｍ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６３， ６０２－６０４． （１９９９））等が挙げられる。枯草菌において作動する核酸エレメントは枯草菌に由来する必要はなく、高効率に作動するものなどが選択され得る。一つの実施形態において、ベクタープラスミド中の枯草菌において作動する複製起点、プロモーターおよび／またはエンハンサーは、ウイルスベクターの起源ウイルスのゲノム（改変を含んでもよい）またはその一部をコードする領域の外側に位置付けられる。
【0067】
一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、枯草菌以外の生物の細胞において作製または使用され得るので、それら生物において作動する複製起点、プロモーター、転写終結配列などの転写翻訳調節配列を含み得る。生物ごとの転写翻訳調節配列は、公知であり、当業者が適宜選択できる。一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、大腸菌、酵母などにおいて作製または複製され得るので、これらの微生物において作動する転写翻訳調節配列を含み得る。一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、プロデューサー細胞に導入され得るので、プロデューサー細胞において作動する転写翻訳調節配列を含み得る。一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、ウイルスの全ゲノムのうち少なくとも一部の遺伝子の配列を含まない。
【0068】
一つの実施形態において、ウイルスを構成するのに必要な核酸配列は、ベクタープラスミド上のまとまった領域に配置される。ウイルスを構成するのに必要な核酸配列を含む核酸断片を元となるプラスミドに組み込むことでこのような構造のベクタープラスミドが形成され得る。一つの実施形態において、ウイルスを構成するのに必要な核酸配列は、ベクタープラスミドの全塩基長の約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、または約５％以下の塩基長の連続領域内に存在する。一つの実施形態において、枯草菌内で複製される配列は、ウイルスを構成するのに必要な核酸配列が存在する連続領域内に配置されてもよいし、この連続領域外に配置されてもよい。一つの実施形態において、ウイルスを構成するのに必要な核酸配列の末端反復配列以外の要素（例えば、ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列、ウイルスのゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列およびヘルパー遺伝子のうちの１つまたは複数）は、各々、２つの末端反復配列の間に配置されてもよいし、外側に配置されてもよい。本開示のベクタープラスミドにおいて、ウイルスを構成するのに必要な核酸配列の各要素は、任意の順序および位置で配置してもよく、図面などにおいて具体的に示した配置以外の種々の配置のものが使用できると理解される。ヘルパー遺伝子など特定の機能で記載される核酸配列が複数の要素を含む場合、特段記載しない限り、ベクタープラスミドにおける各要素の順序および位置は任意であり得るが、任意の要素（例えば、ＶＡ、Ｅ２Ａ、Ｅ４）同士を連続して（間に他の遺伝子を挟まずに）配置してもよい。
【0069】
一つの実施形態において、ウイルスを構成するのに必要な核酸配列は、ウイルスの２つの末端反復配列を含み、２つの末端反復配列に挟まれる領域の塩基長（末端反復配列自体は除く）は、約５ｋｂ以上、約１０ｋｂ以上、約２０ｋｂ以上、約３０ｋｂ以上、約４０ｋｂ以上、約５０ｋｂ以上、約７０ｋｂ以上、または約１００ｋｂ以上であり得る。一つの実施形態において、ウイルスを構成するのに必要な核酸配列は、ウイルスの２つの末端反復配列およびその他の部分を含み、その他の部分は、前記２つの末端反復配列に挟まれる領域の外に位置付けられる。一つの実施形態において、ウイルスを構成するのに必要な核酸配列は、ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列（例えば、ｃａｐ、アデノ随伴ウイルスの血清型１～１２またはその改変体のいずれかに由来し得る）と、ウイルスのゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列（例えば、ｒｅｐ、アデノ随伴ウイルスの血清型１～１２またはその改変体８のいずれかに由来し得る）と、ウイルスの２つの末端反復配列（例えば、血清型１～１２またはその改変体のいずれかに由来する）と、ヘルパー遺伝子（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡのうちの少なくとも１つ、アデノウイルスの血清型１～５２またはその改変体のいずれかに由来し得る）と、を含む。一つの実施形態において、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に上流からプロモーター、所望の遺伝子およびターミネーターを含む。特に、ウイルスのカプシドタンパク質をコードする核酸配列は、野生型配列（例えば、アデノ随伴ウイルスの血清型１～１２）の改変体であってもよいことが企図される。
【0070】
一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、所望の遺伝子は、２つの末端反復配列の間に配置され得る。一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドにおける所望の遺伝子は、最終的にウイルスベクターの搭載核酸に含まれ得る。このような所望の遺伝子は、治療用タンパク質がコードされていてもよいし、遺伝子治療用遺伝子がコードされていてもよいし、ＣＡＲＴ療法など遺伝子細胞治療用遺伝子がコードされていてもよいし、タンパク質非コード機能性ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｌｎｃＲＮＡなど）をコードしていてもよいし、これらと組み合わせてまたは独立にプロモーター、ターミネーター、インスレーター、エンハンサー、サイレンサー、複製起点などの転写翻訳調節配列を含んでもよい。一つの実施形態において、所望の遺伝子は、サイトメガロウイルスプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーターなどのウイルスプロモーターを含む（必要に応じて、タンパク質コード遺伝子の上流に）。一つの実施形態において、所望の遺伝子は、ＩＲＥＳを含む（必要に応じて、タンパク質コード遺伝子の上流に）。一つの実施形態において、所望の遺伝子は、ウイルスベクターを投与する被験体の染色体に組み込まれ得る。この実施形態において、所望の遺伝子は、被験体が元来有する遺伝子の発現を制御する機能を有してもよいし、長期にわたるタンパク質発現をもたらしてもよい。例えば、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスなどに基づくウイルスベクターは、被験体の染色体に組み込まれ得る。一つの実施形態において、所望の遺伝子は、治療用細胞（例えば、染色体）に組み込まれ得る（例えば、体外でのウイルスベクターによる細胞の処理を介して）。一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、ウイルスベクターの起源ウイルスが増殖するために必要な遺伝子を全て含むことはなく、そうすることで生産されるウイルスベクターが増殖能を備えないように構成されてもよい。
【0071】
一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、前記プラスミドを導入したプロデューサー細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）から生産される全ウイルスベクター粒子のうち核酸を含まないウイルスベクター粒子が、約９０％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、または約５０％以下であり得る。一つの実施形態において、前記核酸を含まないウイルスベクター粒子の割合は、前記プロデューサー細胞を３回凍結融解した後、３７℃で１時間Ｂｅｎｚｏｎａｚｅで処理し、１２５００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行った後に上清を取得し、前記上清を２８０００ｒｐｍで１８時間塩化セシウム密度勾配超遠心に供してウイルスベクター画分を取得した場合に達成される。一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、プロデューサー細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）に導入した場合に、生産される全ウイルスベクター粒子のうち、全ての所望の遺伝子を含む核酸を含むウイルスベクター粒子が、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９２％以上、約９５％以上、約９７％以上、または約９９％以上であり得る。一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、プロデューサー細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）に導入した場合に、生産される全ウイルスベクター粒子のうち、所望の核酸以外の本開示のプラスミド由来の核酸を含むウイルスベクター粒子が、約１０％以下、約７％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１．５％以下、約１％以下、約０．７％以下、約０．５％以下、約０．４％以下、約０．３％以下、約０．２％以下、または約０．１％以下であり得る。
【0072】
一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドにおける所望の遺伝子は、複数の遺伝子を含み得る。一つの実施形態において、所望の遺伝子は、２～１００、例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、７以上、１０以上、１２以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、４０以上または５０以上、かつ１００以下、９０以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３５以下、３０以上、２５以下、２０以下、１７以下、１５以下、１２以下または１０以下の遺伝子を含み得る。一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドにおける所望の遺伝子は、約０．１～１０００ｋｂｐ、例えば、約０．１ｋｂｐ以上、約０．３ｋｂｐ以上、約１ｋｂｐ以上、約２ｋｂｐ以上、約５ｋｂｐ以上、約７ｋｂｐ以上、約１０ｋｂｐ以上、約２０ｋｂｐ以上、約５０ｋｂｐ以上または約１００ｋｂｐ以上、かつ約１０００ｋｂｐ以下、約７００ｋｂｐ以下、約５００ｋｂｐ以下、約２００ｋｂｐ以下、約１００ｋｂｐ以下、約７０ｋｂｐ以下、約５０ｋｂｐ以下、約２０ｋｂｐ以下または約１０ｋｂｐ以下の塩基長を含み得る。本開示のベクタープラスミドは、ＯＧＡＢ法によって複数の遺伝子を含む複雑な構造に構築され得るので、所望の遺伝子も複雑な構造に構築され得る。ウイルスベクターの種類によって搭載核酸のサイズは制限され得るので、所望の遺伝子のサイズに応じてウイルスベクターの種類が選択されてもよい。一つの実施形態において、所望の遺伝子が複数の遺伝子を含むことで、被験体の組織（例えば、がん組織）特異的または時期特異的なプロモーターとこれに作動可能に連結された治療用遺伝子（治療用タンパク質コード配列、遺伝子治療用遺伝子、遺伝子細胞治療用遺伝子など）との組合せ、代謝カスケードを制御する一連の酵素の協調発現を可能と一連の酵素をコードする配列など、高度な機能性を有する核酸を被験体に送達可能であり得る。
【0073】
一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドにおける所望の遺伝子にコードされるタンパク質としては、治療用ポリペプチド（例えば、補充療法）、免疫原性ポリペプチド（例えば、病原体ポリペプチド、がん抗原ポリペプチド）などが挙げられる。治療用ポリペプチドとしては、嚢胞性線維症膜貫通制御タンパク質（ＣＦＴＲ）、ジストロフィン（ミニジストロフィンおよびマイクロジストロフィン、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ－１、抗炎症性ポリペプチド、サルコスパン、ユートロフィン、ミニユートロフィン、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子など）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β－グロビン、α－グロビン、スペクトリン、α１－アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼＡ、分岐鎖ケト酸脱水素酵素、ＲＰ６５タンパク質、サイトカイン（例えば、α－インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシンなど）、ペプチド増殖因子、神経栄養因子およびホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様増殖因子１および２、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経増殖因子、神経栄養因子－３および－４、脳由来神経栄養因子、骨形態形成タンパク質、グリア由来増殖因子、形質転換増殖因子－αおよび－βなど）、リソソーム酸α－グルコシダーゼ、α－ガラクトシダーゼＡ、腫瘍壊死増殖因子α可溶性受容体、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、抗炎症性因子、抗ミオスタチンタンパク質、アスパルトアシラーゼ、自殺遺伝子産物（例えば、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、腫瘍壊死因子）、腫瘍抑制遺伝子産物（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ－１）、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ－リガンドなどが挙げられる。
【0074】
病原体ポリペプチドとしては、細菌、真菌、寄生虫などの病原生物の細胞表面タンパク質、およびウイルスの表面に発現するタンパク質（例えば、スパイクタンパク質、エンベロープタンパク質、カプシドタンパク質など）が挙げられる。病原体ポリペプチドの具体例としては、オルソミクソウイルス免疫原（例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）、核タンパク質）、レンチウイルス免疫原（例えば、ＨＩＶもしくはＳＩＶのエンベロープＧＰ１６０タンパク質、マトリックス／カプシドタンパク質、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝子産物）、アレナウイルス免疫原（例えば、ラッサ熱ウイルス核カプシドタンパク質、エンベロープ糖タンパク質）、ポックスウイルス免疫原（例えば、ワクシニアＬ１またはＬ８遺伝子産物）、フラビウイルス免疫原（例えば、黄熱病ウイルスまたは日本脳炎ウイルス免疫原）、フィロウイルス免疫原（例えば、ＮＰおよびＧＰ遺伝子産物などのエボラウイルスまたはマールブルグウイルス免疫原）、ブニヤウイルス免疫原（例えば、ＲＶＦＶ、ＣＣＨＦ、ＳＦＳウイルス免疫原）、コロナウイルス免疫原（例えば、ヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質などのヒトコロナウイルス免疫原）、ポリオ免疫原、ヘルペスウイルス免疫原（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ免疫原）、ムンプスウイルス免疫原、麻疹ウイルス免疫原、風疹ウイルス免疫原、ジフテリア毒素もしくは他のジフテリア免疫原、百日咳抗原、および肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎など）免疫原などが挙げられる。
【0075】
がん抗原ポリペプチドとして、ＢＲＣＡ１遺伝子産物、ＢＲＣＡ２遺伝子産物、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＡＧＥ－１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤＫ－４、β－カテニン、ＭＵＭ－１、カスパーゼ－８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ、ＳＡＲＴ－１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５、メラノーマ腫瘍抗原、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００ ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＣＥＡ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、Ｐ－１５、チロシナーゼ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ遺伝子産物、ＣＡ１２５、ＬＫ２６、ＦＢ５（エンドシアリン）、ＴＡＧ７２、ＡＦＰ、ＣＡ１９－９、ＮＳＥ、ＤＵ－ＰＡＮ－２、ＣＡ５０、ＳＰａｎ－１、ＣＡ７２－４、ＨＣＧ、ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）、ｃ－ｅｒｂＢ－２タンパク質、ＰＳＡ、Ｌ－ＣａｎＡｇ、エストロゲン受容体、乳脂肪グロブリン、ｐ５３腫瘍抑制因子タンパク質、ムチン抗原、テロメラーゼ、核マトリックスタンパク質、前立腺酸性ホスファターゼ、パピローマウイルス抗原などが挙げられる。
【0076】
一つの実施形態において、所望の遺伝子は、特定の疾患を治療するための遺伝子（例えば、遺伝子治療遺伝子）であり得る。特定の疾患に対して選択するべき遺伝子は当業者が適宜選択し得る。このような疾患として、例えば、各種病原体による感染症、嚢胞性線維症、血友病Ａ、血友病Ｂ、サラセミア、貧血、アルツハイマー病、多発性硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、癲癇、がん（メラノーマ、腺がん腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頚がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、脳がんなど）、糖尿病、筋ジストロフィー、ゴーシェ病、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠乏症、糖原貯蔵疾患、先天性肺気腫、レッシュ・ナイハン症候群、ニーマン・ピック病、テイ・サックス病、アンジェルマン症候群、メープルシロップ尿症、加齢黄斑変性、黒内障、糖尿病性網膜症、網膜変性疾患、星状細胞腫、膠芽腫、心不全、末梢動脈疾患、関節炎、関節障害、内膜過形成、ＡＩＤＳ、筋消耗、腎臓欠損症、肝炎、ＬＤＬ受容体欠乏症、高アンモニア血症、クラッベ病、バッテン病、脊髄性大脳性運動失調症、フェニルケトン尿症、自己免疫疾患、アミノ酸代謝異常症、有機酸代謝異常症、脂肪酸代謝異常症、ミトコンドリア病、糖質代謝異常症、ライソゾーム病、ペルオキシソーム病、金属代謝異常症、プリンピリミジン代謝異常症、ビタミン代謝異常症、神経伝達物質異常症、脂質代謝異常症、結合組織異常症、先天性ポルフィリン症、α1-アンチトリプシン欠損症、リソソーム蓄積症、ムコ多糖症障害、ファブリー病、カナバン病、リー病、レフサム病、トゥレット症候群、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮症、ピック病、筋ジストロフィー、重症筋無力症、ビンスワンガー病、脳梗塞、気分障害、うつ病、双極性感情障害、持続性感情障害、二次的気分障害、統合失調症、薬物依存性、不安症、強迫障害、身体表現性障害、解離性障害、悲嘆、産後うつ病、幻覚、妄想、認知症、パラノイア、自閉症スペクトラム障害、注意欠陥障害、精神性的障害、睡眠障害、疼痛性障害、摂食障害、体重障害、肥満症、悪液質、神経性食欲不振症、過食症などが挙げられる。一つの実施形態において、所望の遺伝子は、ＣＡＲＴ療法などで使用する治療用細胞（例えば、染色体）に組み込まれ得る（例えば、体外でのウイルスベクターによる細胞の処理を介して）。
【0077】
（ウイルスベクター）
本開示のベクタープラスミドは、ウイルスベクターを生産するために使用される。一つの実施形態において、本開示は、本開示のベクタープラスミドを使用してウイルスベクターを作製する方法を提供する。一つの実施形態において、本開示は、このように作製されたウイルスベクター含有組成物またはウイルスベクターを提供する。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルスまたはセンダイウイルスに基づくウイルスベクターが挙げられる。
本開示のベクタープラスミドは、ウイルスベクターを生産するために使用される。一つの実施形態において、本開示は、本開示のベクタープラスミドを使用してウイルスベクターを作製する方法を提供する。一つの実施形態において、本開示は、このように作製されたウイルスベクター含有組成物またはウイルスベクターを提供する。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルスまたはセンダイウイルスに基づくウイルスベクターが挙げられる。
【0078】
一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、プロデューサー細胞に導入されてウイルスベクターを生産する。プロデューサー細胞の例として、例えば、９１１細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、Ｅ１形質転換羊膜細胞、Ｅ１形質転換Ａ５４９細胞、ＧＨ３２９：ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＩＴ２９３ＳＦ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｓｆ９細胞、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３－Ｆ、Ｅｘｐｉ２９３－Ｆ（商標）、Ｅｘｐｉ２９３ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ、Ｅｘｐｉ２９３ ＮＧＴ－Ｖｉｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ １．０、Ｖｉｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｅｌｌｓ ２．０、ＡＡＶｐｒｏ（登録商標）２９３Ｔ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ（商標）２９３Ｔ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ－Ｓ ｃｅｌｌｓ、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）などが挙げられるが、これらに限定されない。生産するウイルスベクターの種類に応じて、任意の公知の好適なプロデューサー細胞が選択され得る。一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、ウイルスベクターの起源ウイルスの遺伝子のうちの少数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ）を欠損し、他の全ての遺伝子を含んでもよい。一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、ウイルスベクターを生産するために必要な遺伝子セットのうちの一部を欠損しており、遺伝子セットのうちのベクタープラスミドが欠損している遺伝子は、ベクタープラスミドとはトランスにプロデューサー細胞において供給される。一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、その他のプラスミドと組み合わせることなく単独でプロデューサー細胞に導入することでウイルスベクター生産を可能にし得る。一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、ウイルスベクターを生産するために必要な遺伝子セットのうちベクタープラスミドが欠損した遺伝子全てを発現するプロデューサー細胞に導入され得る。例えば、ＡＡＶのｃａｐおよびｒｅｐ、ならびにアデノウイルスのＥ２Ａ、Ｅ４およびＶＡを含む本開示のベクタープラスミドは単独で、アデノウイルスのＥ１ＡおよびＥ１Ｂを発現するＨＥＫ２９３細胞に導入することでウイルスベクターを生産し得る。一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、ウイルスベクターを生産するために必要な遺伝子セットのうちベクタープラスミドが欠損した遺伝子を含む別の核酸またはその遺伝子の産物（例えば、ウイルス粒子）とともにプロデューサー細胞に導入され得る。
【0079】
一つの実施形態において、ウイルスベクターは、ベクタープラスミドを、ウイルスベクターの起源ウイルスを感染させたプロデューサー細胞の中に導入し、その細胞の中で相同組み換えを生じさせることにより作製することができる。この実施形態において使用するウイルスベクタープラスミドは、所望の遺伝子および起源ウイルスのゲノムのいずれかの領域（例えば、遺伝子間の領域）に相同性を有する核酸配列を含む。一つの実施形態において、ベクタープラスミドは、生産するウイルスベクターの起源ウイルスのゲノムのいずれかの遺伝子の間に所望の遺伝子を含む構造を有し得る。一つの実施形態において、ベクタープラスミドに含まれる核酸の少なくとも一部がプロデューサー細胞の染色体に組み込まれる。
【0080】
一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、生産するウイルスベクターの起源ウイルスの搭載核酸切り出しのためのセグメント（レトロウイルスにおけるＬＴＲ、ＡＡＶウイルスにおけるＩＴＲなど）を含み、一つの実施形態において、このセグメントの間に所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、このセグメントの間に所望の遺伝子ならびにこれに作動可能に連結したプロモーターおよび／またはターミーター（例えば、ウイルスベクターが標的とする対象において作動可能であるもの）を含む。一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、このセグメントの間にウイルスベクターの起源ウイルスの複製のために必要な遺伝子を含まない。一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、生産するウイルスベクターの起源ウイルスのパッケージングシグナルを含む。
【0081】
生産されるウイルスベクターはカプシドを有し、カプシドは組織または細胞との結合に関与し得る。そのため、カプシドを改変して組織または細胞（またはその表面構造）との結合性を改変することでウイルスベクターの組織または細胞への標的化を調整することができる。一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、カプシドをコードする遺伝子を有してもよく、このカプシドは改変されていてもよい。例えば、組織または細胞標的化を調整するカプシド改変として、他のタンパク質（他のウイルスカプシド（例えば、他の血清型のウイルスのカプシド、ＶＳＶ－Ｇ）、抗体の抗原結合領域、被験体生物のリガンドタンパク質（がん抗原に対するリガンド）など）との置換または融合が挙げられる。また、エンベロープを有するウイルスベクターは、プロデューサー細胞の細胞膜成分をエンベロープに含み得る。そのため、プロデューサー細胞の細胞膜成分を改変することで、エンベロープを有するウイルスベクターの組織または細胞への標的化を調整することができる。一つの実施形態において、ウイルスベクターは、神経細胞（末梢神経系または中枢神経系の細胞、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトなどの脳細胞など）、肺細胞、眼の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮、角膜細胞など）、上皮細胞（例えば、腸または呼吸器の上皮細胞）、筋細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、横隔膜筋細胞）、樹状細胞、膵臓細胞（島細胞など）、肝細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞、がん細胞などを標的とするように設計されてもよい。それぞれの細胞に特異的な表面構造（受容体など）は、公知であり、当業者は、その表面構造に強力にまたは特異的に結合するタンパク質を適宜選択できる。
【0082】
一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、生産するウイルスベクターの起源ウイルスのタンパク質を弱毒化したタンパク質をコードする遺伝子を含んでもよい。本開示のベクタープラスミドは、任意の公知の弱毒化ウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含むことができる。
【0083】
一つの実施形態において、本開示は、本開示のベクタープラスミドの集団を含むプラスミド含有組成物を提供する。一つの実施形態において、プラスミド含有組成物は、プラスミドのＣＣＣ（covalently closed circular）純度が、約６０％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上または約９５％以上であり得る。
【0084】
・アデノウイルスベクター
アデノウイルスは、アデノウイルス科マストアデノウイルス属のウイルスであり、ウイルス粒子は、ヌクレオキャプシドおよび二本鎖線状ＤＮＡゲノムから構成され、９０～１００ｎｍの正２０面体の構造を有する。アデノウイルスの感染は細胞表面のｃｏｘａｃｋｉｅ－ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）にウイルスカプシドが吸着することにより開始され、次いで細胞表面のインテグリンを介してウイルスは細胞内に侵入し得る。その後、ライソゾームから脱出したウイルスゲノムは核内に到達しウイルスゲノムの複製をもたらし得る。ウイルス複製は、まずＥ１Ａ蛋白質が発現し、他の初期蛋白質であるＥ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の発現を活性化することで開始される。ウイルスゲノムは、Ｅ２から発現した末端タンパク質（ＴＰ）とデオキシシチジンとが共有結合し、これにさらにポリメラーゼが結合した複合体が形成されて複製が開始される。ゲノムはまた、ペントン（Ｌ２）、ヘキソン（Ｌ３）、骨格タンパク質（Ｌ４）、および繊維タンパク質（Ｌ５）を含む構造タンパク質をコードし、単一プロモーターの制御下にある、５つの後期転写単位（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５）も含む。ゲノムの両端は、ウイルスの複製に必要な逆向き末端配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ： ＩＴＲ）を含む。ウイルスの構造タンパク質は細胞質で翻訳された後、核内に移行してウイルス粒子を構成し、ウイルスゲノムのパッケージングシグナル（ψ）を認識してゲノムをパッケージングする。また、アデノウイルスは、タンパク質非コードＶＡ ＲＮＡを生産し、これは、ＶＡ遺伝子にコードされている。アデノウイルス粒子は、Ｌ２およびＬ３のカプシドを有し得る。
アデノウイルスは、アデノウイルス科マストアデノウイルス属のウイルスであり、ウイルス粒子は、ヌクレオキャプシドおよび二本鎖線状ＤＮＡゲノムから構成され、９０～１００ｎｍの正２０面体の構造を有する。アデノウイルスの感染は細胞表面のｃｏｘａｃｋｉｅ－ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）にウイルスカプシドが吸着することにより開始され、次いで細胞表面のインテグリンを介してウイルスは細胞内に侵入し得る。その後、ライソゾームから脱出したウイルスゲノムは核内に到達しウイルスゲノムの複製をもたらし得る。ウイルス複製は、まずＥ１Ａ蛋白質が発現し、他の初期蛋白質であるＥ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４の発現を活性化することで開始される。ウイルスゲノムは、Ｅ２から発現した末端タンパク質（ＴＰ）とデオキシシチジンとが共有結合し、これにさらにポリメラーゼが結合した複合体が形成されて複製が開始される。ゲノムはまた、ペントン（Ｌ２）、ヘキソン（Ｌ３）、骨格タンパク質（Ｌ４）、および繊維タンパク質（Ｌ５）を含む構造タンパク質をコードし、単一プロモーターの制御下にある、５つの後期転写単位（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５）も含む。ゲノムの両端は、ウイルスの複製に必要な逆向き末端配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ： ＩＴＲ）を含む。ウイルスの構造タンパク質は細胞質で翻訳された後、核内に移行してウイルス粒子を構成し、ウイルスゲノムのパッケージングシグナル（ψ）を認識してゲノムをパッケージングする。また、アデノウイルスは、タンパク質非コードＶＡ ＲＮＡを生産し、これは、ＶＡ遺伝子にコードされている。アデノウイルス粒子は、Ｌ２およびＬ３のカプシドを有し得る。
【0085】
現在までに５２のヒトアデノウイルスの抗原型が同定され、それは血球凝集反応の性質と配列相同性に基づいて６つのサブグループ：サブグループＡ（例えば、血清型１２、１８および３１）、サブグループＢ（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５および５０）、サブグループＣ（例えば、血清型１、２、５および６）、サブグループＤ（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２～３０、３２、３３、３６～３９および４２～４８）、サブグループＥ（例えば、血清型４）、サブグループＦ（例えば、血清型４０および４１）、および未分類の血清型群（例えば、血清型４９および５１）に分類されている。
【0086】
一つの実施形態において、アデノウイルスベクタープラスミドは、アデノウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列のうちの少なくとも１つおよび所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、アデノウイルスベクタープラスミドは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、アデノウイルスベクタープラスミドは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に所望の遺伝子、プロモーターおよびターミネーターを含む。一つの実施形態において、アデノウイルスベクタープラスミドは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間にアデノウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列のうちの１つまたは複数（例えば全て）を含まない。一つの実施形態において、アデノウイルスベクタープラスミドは、ベクタープラスミドおよびプロデューサー細胞がアデノウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列を含むようなプロデューサー細胞において機能するように構成される。一つの実施形態において、アデノウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列のうちベクタープラスミドに含まれない遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、全て）は、プロデューサー細胞の染色体にコードされていてもよい。
【0087】
一つの実施形態において、アデノウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、ＩＸ、ＩＶａ２をコードする遺伝子を含み得る。一つの実施形態において、アデノウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列は、Ｅ３以外のアデノウイルスの全ての遺伝子であり得る。一つの実施形態において、アデノウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列は、カプシドタンパク質をコードする核酸配列（Ｌ２、Ｌ３）と、ゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ４）と、２つの末端反復配列（５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ）と、ヘルパー遺伝子の核酸配列とを含み得る。一つの実施形態において、ヘルパー遺伝子の核酸配列は、Ｌ２、Ｌ３、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ３、Ｅ２Ｂ、Ｅ４、５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ以外の全てのアデノウイルス遺伝子であり得る。一つの実施形態において、アデノウイルスベクタープラスミドは、ＶＡ、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ４のうちの１つまたは複数を含まなくてもよく、一つの実施形態において、アデノウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列はこれらを含む。特定の実施形態において、アデノウイルスベクタープラスミドは、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを含まない。一つの実施形態において、アデノウイルスベクタープラスミドは、Ｅ１Ａを欠損しており、この欠損箇所に所望の遺伝子が挿入されていてもよい。ＶＡ ＲＮＡは、ヒトにおいてエクスポーチン、ＲＩＳＫ、Ｄｉｃｅｒなどと相互作用することが知られており、アデノウイルスベクタープラスミドからＶＡを欠損させることでアデノウイルスベクター感染細胞への副作用が低減され得る。Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ４は、アデノウイルスの複製に必要な遺伝子であり得るので、これらを欠損させたアデノウイルスベクタープラスミドは、感染細胞における複製能力が低減され得る。
【0088】
一つの実施形態において、本開示のアデノウイルスベクターはヒトのサブグループＣ、例えば、血清型２または血清型５由来であり得る。一つの実施形態において、本開示のアデノウイルスベクターは血清型１２（サブグループＡ）、血清型７または血清型３５（サブグループＢ）、血清型３０または血清型３６（サブグループＤ）、血清型４（サブグループＥ）、あるいは血清型４１（サブグループＦ）由来であり得る。アデノウイルスベクターを生産するためのプロデューサー細胞として、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、Ｈｅｌａ、Ｓｆ９などの細胞が挙げられる。
【0089】
・アデノ随伴ウイルスベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は，パルボウイルス科ディペンドウイルス属の線状一本鎖ＤＮＡウイルスであり、ウイルス粒子は直径２０～２６ｎｍである。ＡＡＶの増殖にはアデノウイルスエレメントが必要である。ＡＡＶゲノムの量末端にはＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）と呼ばれるＴ字型のヘアピン構造が存在する。このＩＴＲの部分が複製の開始点となり、プライマーの役割を果たす。また、ウイルス粒子へのパッケージングや宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組込みにもこのＩＴＲが必要である。ゲノムの左半分に非構造蛋白質、すなわち複製や転写を司る調節タンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０）をコードするｒｅｐ遺伝子が存在し、ゲノムの右半分に構造蛋白質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の三つのカプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子が存在する。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は，パルボウイルス科ディペンドウイルス属の線状一本鎖ＤＮＡウイルスであり、ウイルス粒子は直径２０～２６ｎｍである。ＡＡＶの増殖にはアデノウイルスエレメントが必要である。ＡＡＶゲノムの量末端にはＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）と呼ばれるＴ字型のヘアピン構造が存在する。このＩＴＲの部分が複製の開始点となり、プライマーの役割を果たす。また、ウイルス粒子へのパッケージングや宿主細胞の染色体ＤＮＡへの組込みにもこのＩＴＲが必要である。ゲノムの左半分に非構造蛋白質、すなわち複製や転写を司る調節タンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０）をコードするｒｅｐ遺伝子が存在し、ゲノムの右半分に構造蛋白質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の三つのカプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子が存在する。
【0090】
ＡＡＶの生活環は潜伏感染と溶解感染に分けられる。前者は単独で感染した場合であり、宿主細胞の第１９番染色体長腕のＡＡＶＳ１領域（１９ｑ１３．３－ｑｔｅｒ）へ組み込まれるのが特徴的である。この組込みは非相同組換えによるものでありＲｅｐが関与している。ＡＡＶＳ１領域とＩＴＲのＲｅｐ結合領域とに共通して存在する塩基配列（ＧＡＧＣ繰返し配列）に，Ｒｅｐ７８／Ｒｅｐ６８が結合することが報告されている。したがって、野生型ＡＡＶが標的細胞に感染した際には、ＲｅｐがＡＡＶのＩＴＲおよびＡＡＶＳ１に結合し、Ｒｅｐが介在することによりＡＡＶゲノムの第１９番染色体への部位特異的組込みが起こるものと考えられている。アデノウイルスなどのヘルパーウイルスが同時に感染した場合、ＡＡＶが潜伏感染している細胞にさらにヘルバーウイルスが重複感染した場合にＡＡＶの複製が起こり、細胞破壊により大量のウイルスが放出される（溶解感染）。
【0091】
一つの実施形態において、ＡＡＶベクタープラスミドは、ＡＡＶベクターを構成するのに必要な核酸配列のうちの少なくとも１つおよび所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、ＡＡＶベクタープラスミドは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、ＡＡＶベクタープラスミドは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間に所望の遺伝子、プロモーターおよびターミネーターを含む。一つの実施形態において、ＡＡＶベクタープラスミドは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの間にＡＡＶベクターを構成するのに必要な核酸配列のうちの１つまたは複数（例えば全て）を含まない。一つの実施形態において、ＡＡＶベクタープラスミドは、ベクタープラスミドおよびプロデューサー細胞がＡＡＶベクターを構成するのに必要な核酸配列を含むようなプロデューサー細胞において機能するように構成される。一つの実施形態において、ＡＡＶベクターを構成するのに必要な核酸配列のうちベクタープラスミドに含まれない遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、全て）は、プロデューサー細胞の染色体にコードされていてもよい。
【0092】
一つの実施形態において、ＡＡＶベクターを構成するのに必要な核酸配列は、ＡＡＶの５’ＩＴＲ、ｒｅｐ、ｃａｐ、ＡＡＰ（アセンブリ活性化タンパク質）、ＭＡＡＰ（膜会合アクセサリータンパク質）および３’ＩＴＲ、ならびにアデノウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、ＶＡおよびＥ４であり得る。一つの実施形態において、ＡＡＶベクターを構成するのに必要な核酸配列は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列（ｃａｐ）と、ゲノムをパッケージング、転写および複製するＡＡＶタンパク質をコードする核酸配列（ｒｅｐ）と、ＡＡＶの２つの末端反復配列（５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ）と、ヘルパー遺伝子の核酸配列（アデノウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、ＶＡ、Ｅ４）とを含み得る。一つの実施形態において、ＡＡＶベクタープラスミドは、ｒｅｐ、ｃａｐ、ＶＡ、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４のうちの１つまたは複数を含まなくてもよく、一つの実施形態において、アデノウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列はこれらを含む。
【0093】
ＡＡＶは、カプシドに基づいて１～１２型までの血清型が報告されている。また、ｒｈ１０、ＤＪ、ＤＪ／８、ＰＨＰ．ｅＢ、ＰＨＰ．Ｓ、ＡＡＶ２－ｒｅｔｒｏ、ＡＡＶ２－ＱｕａｄＹＦ、ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ６．２、ｒｈ．７４、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ－ＴＴ、Ａｎｃ８０の血清型も報告されている。本開示のＡＡＶベクターは、標的組織に応じて好適な血清型のＡＡＶに基づいて作製されてもよい。例えば、（血清型）：（標的組織）の関係は以下の通りに選択されてもよい；（ＡＡＶ１）：（筋肉、肝臓、気道、神経細胞）、（ＡＡＶ２）：（筋肉、肝臓、神経細胞）、（ＡＡＶ３）：（筋肉、肝臓、神経細胞）、（ＡＡＶ４）：（筋肉、脳室上衣細胞）、（ＡＡＶ５）：（筋肉、肝臓、神経細胞、グリア細胞、気道）、（ＡＡＶ６）：（筋肉、肝臓、気道、神経細胞）、（ＡＡＶ７）：（筋肉、肝臓）、（ＡＡＶ８）：（筋肉、肝臓）、（ＡＡＶ９）：（筋肉、肝臓、気道）。ＡＡＶベクターを生産するためのプロデューサー細胞として、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ｆ、Ｈｅｌａ、Ｓｆ９などの細胞が挙げられる。ＡＡＶのカプシドとして、野生型の他に、標的化変異を加えたカプシド（ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶ９．ＨＲなど）、ランダム変異を加えたカプシド（ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂなど）、インシリコで設計したカプシド（Ａｎｃ８０など）が挙げられ、一つの実施形態において、本開示のＡＡＶベクターはこれらの改変カプシドを含んでもよく、本開示のＡＡＶベクタープラスミドはこれらの改変カプシドをコードするように構築されてもよい。本明細書において、核酸配列が特定の血清型に由来すると記載する場合、核酸配列は、野生型のカプシドをコードしてもよいし、野生型のカプシドに基づき上記のような改変が施されたカプシドをコードしてもよいことが企図される。
【0094】
・レトロウイルスベクター
本明細書において、「レトロウイルス」は、一般にレトロウイルス科のウイルスを指す。トロウイルスは、主にゲノムをＲＮＡからＤＮＡに逆転写する能力を特徴とする二本鎖ＲＮＡエンベロープウイルスである。ビリオンの長さは直径約１００～１２０ｎｍであり、ヌクレオキャプシドタンパク質と複合体を形成した同一のプラスＲＮＡ鎖の二量体ゲノムを含有する。ゲノムは、ウイルス感染に必要な酵素タンパク質、すなわち逆転写酵素、インテグラーゼおよびプロテアーゼを含有するキャプシドに封入されている。マトリックスタンパク質が、ウイルス核粒子の周りを囲む、宿主細胞膜に由来する脂質二重層であるエンベロープと相互作用するキャプシドコアの外側の層を形成する。この二重層には、宿主細胞上の特異的受容体を認識し、感染プロセスを開始させるウイルスエンベロープ糖タンパク質が固定されている。エンベロープタンパク質は、タンパク質を脂質膜内に固定させる膜貫通（ＴＭ）と細胞受容体に結合する表面（ＳＵ）の２つのサブユニットによって形成される。
本明細書において、「レトロウイルス」は、一般にレトロウイルス科のウイルスを指す。トロウイルスは、主にゲノムをＲＮＡからＤＮＡに逆転写する能力を特徴とする二本鎖ＲＮＡエンベロープウイルスである。ビリオンの長さは直径約１００～１２０ｎｍであり、ヌクレオキャプシドタンパク質と複合体を形成した同一のプラスＲＮＡ鎖の二量体ゲノムを含有する。ゲノムは、ウイルス感染に必要な酵素タンパク質、すなわち逆転写酵素、インテグラーゼおよびプロテアーゼを含有するキャプシドに封入されている。マトリックスタンパク質が、ウイルス核粒子の周りを囲む、宿主細胞膜に由来する脂質二重層であるエンベロープと相互作用するキャプシドコアの外側の層を形成する。この二重層には、宿主細胞上の特異的受容体を認識し、感染プロセスを開始させるウイルスエンベロープ糖タンパク質が固定されている。エンベロープタンパク質は、タンパク質を脂質膜内に固定させる膜貫通（ＴＭ）と細胞受容体に結合する表面（ＳＵ）の２つのサブユニットによって形成される。
【0095】
レトロウイルスとして、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、Ｆｕｊｉｎａｍｉ肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス（Ｍｏ－ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ ＭＳＶ）、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ－ＭＳＶ）、Ａｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウイルス（Ａ－ＭＬＶ）、トリ骨髄細胞腫症ウイルス２９（ＭＣ２９）、およびトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）、およびレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。レンチウイルスは、「霊長類」および「非霊長類」に分けることができる。霊長類レンチウイルスの例としては、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因物質であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。非霊長類レンチウイルス群には、プロトタイプ「遅発性ウイルス」のビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、ならびに関連するヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、およびより最近になって記述されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。
【0096】
感染プロセスの間、レトロウイルスは最初に特定の細胞表面受容体に付着する。感受性の宿主細胞に侵入すると、レトロウイルスＲＮＡゲノムは、逆転写酵素によってＤＮＡにコピーされる。このＤＮＡは宿主細胞核に輸送され、次いで宿主ゲノムに組み入れられ、この状態はプロウイルスと呼ばれる。プロウイルスは、細胞分裂中の宿主染色体において安定であり、他の細胞タンパク質のように転写される。プロウイルスは、より多くのウイルスを作製するために必要とされるタンパク質およびパッケージング機構をコードし、出芽して細胞から離れることができる。レトロウイルスが宿主細胞から出芽すると、それらは宿主細胞脂質膜を含む。このようにして、宿主細胞由来膜タンパク質がレトロウイルス粒子の一部となる。
【0097】
レトロウイルスのゲノムは、ｇａｇ（群特異的抗原）、ｐｒｏ（プロテアーゼ）、ｐｏｌ（ポリメラーゼ）およびｅｎｖ（エンベロープ）の４つの遺伝子を含む。ｇａｇ配列は、マトリックスタンパク質、ヌクレオキャプシドタンパク質、およびキャプシドタンパク質の３つの主要な構造タンパク質をコードする。ｐｒｏ配列は、粒子の集合、出芽および成熟の間にＧａｇおよびＧａｇ－Ｐｏｌを切断する役割を担うプロテアーゼをコードする。ｐｏｌ配列は、逆転写酵素およびインテグラーゼの酵素をコードし、前者は、感染プロセスの間にウイルスゲノムのＲＮＡからＤＮＡへの逆転写を触媒し、後者はＬＴＲをプロセシングし、プロウイルスＤＮＡを宿主細胞ゲノムへ組み入れる役割を担う。ｅｎｖ配列は、エンベロープ糖タンパク質のＳＵおよびＴＭサブユニットの両方をコードする。レトロウイルスが特異的な細胞表面受容体を使用してその標的宿主細胞に結合する能力はＥｎｖタンパク質の表面成分（ＳＵ）によって与えられるが、レトロウイルスが膜融合を介して細胞に進入する能力は、膜アンカー型膜貫通成分（ＴＭ）によって付与され得る。レトロウイルスゲノムは、遺伝子発現、逆転写および宿主細胞染色体への組み入れを促進するために必要な要素を含有し、この要素として、２つのＬＴＲ（長い末端反復）、新たに形成するビリオンへのウイルスＲＮＡの特異的パッケージングに必要なパッケージングシグナル（ψ）配列、および逆転写の間にプラス鎖ＤＮＡ合成を開始する部位として機能するポリプリントラクト（ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔ；ＰＰＴ）のような非コーディングシス作用性配列が挙げられる。長鎖末端反復（ＬＴＲ）は約６００ｎｔの長さであり、そのうちＵ３領域が４５０、Ｒ配列が１００、Ｕ５領域がおよそ７０ｎｔの長さである。
【0098】
レンチウイルスなどの複合レトロウイルスのゲノムは、ｇａｇ、ｐｒｏ、ｐｏｌおよびｅｎｖに加えて、ウイルス遺伝子発現、感染性粒子の集合を調節し、感染細胞におけるウイルス複製をモジュレートするアクセサリー遺伝子を含み得る。代表的なレンチウイルスはＨＩＶ－１である。レンチウイルスは、２つの制御遺伝子、ｔａｔおよびｒｅｖを含み得る。例えば、ＨＩＶ－１はｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆをさらに含む。他にもｖｐｘなどのアクセサリー遺伝子が存在する。これらのアクセサリー遺伝子は、ウイルスＲＮＡの合成およびプロセシングならびに他の複製機能の制御に関与している。特に、ＨＩＶはその他にも構造的ランドマーク（ＴＡＲ、ＲＲＥ、ＰＥ、ＳＬＩＰ、ＣＲＳ、ＩＮＳ）などを含む。レンチウイルス粒子は、ｐ２４のカプシドタンパク質を含み得る。
【0099】
一つの実施形態において、レトロウイルスベクタープラスミドは、レトロウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列のうちの少なくとも１つおよび所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、レトロウイルスベクタープラスミドは、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの間に所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、レトロウイルスベクタープラスミドは、５’ＬＴＲおよび所望の遺伝子の間にｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ（ＰＢＳ）および／またはポリプリントラクト（ＰＰＴ）を含んでもよい。一つの実施形態において、レトロウイルスベクタープラスミドは、所望の遺伝子および３’ＬＴＲの間にウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含んでもよい。一つの実施形態において、レトロウイルスベクタープラスミドは、ベクタープラスミドおよびプロデューサー細胞がレトロウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列を含むようなプロデューサー細胞において機能するように構成される。一つの実施形態において、レトロウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列のうちベクタープラスミドに含まれない遺伝子のうち１つまたは複数（例えば、全て）は、プロデューサー細胞の染色体にコードされていてもよい。一つの実施形態において、レトロウイルスベクターの構築の際に、ｅｎｖをＶＳＶ－Ｇ（水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の糖タンパク質Ｇ）をコードする遺伝子と取り換えてもよい。一つの実施形態において、レトロウイルスベクター（レンチウイルスを含む）プラスミドは、ＶＳＶ－Ｇ遺伝子を追加で含んでもよい。一つの実施形態において、レトロウイルスベクター（レンチウイルスを含む）の構築の際に、ｅｎｖに加えてまたはこれと置き換えて、狂犬病ウイルスの糖タンパク質遺伝子（ＲＶ－Ｇ）またはＲＶ－Ｇの細胞内ドメインを水泡性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）のもので置換した融合糖タンパク質（ＦｕＧ－Ｂ）を使用してもよく、レトロウイルスベクター（レンチウイルスを含む）プラスミドは、これらの遺伝子を含んでもよい。
【0100】
一つの実施形態において、レトロウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列は、カプシドタンパク質をコードする核酸配列（ｇａｇ）と、ゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列（ｐｏｌ）と、２つの末端反復配列（５’ＬＴＲ、３’ＬＴＲ）と、ヘルパー遺伝子の核酸配列とを含み得る。一つの実施形態において、ヘルパー遺伝子の核酸配列は、パッケージングシグナル（ψ）配列、ｐｒｏ、ｐｏｌおよびｅｎｖであり得る。一つの実施形態において、レトロウイルスベクタープラスミドは、ｇａｇ、ｐｒｏ、ｐｏｌ、ｅｎｖのうちの１つまたは複数を含まなくてもよく、一つの実施形態において、レトロウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列はこれらを含む。ｐｏｌは、レトロウイルスの複製に必要な遺伝子であり得るので、これを欠損させたレトロウイルスベクタープラスミドは、感染細胞における複製能力が低減され得る。一つの実施形態において、レトロウイルスベクタープラスミドは、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの間にレトロウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列のうちの１つまたは複数（例えば全て）を含まない。一つの実施形態において、レトロウイルスベクタープラスミドは、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの間に所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、レトロウイルスベクタープラスミドは、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの間に所望の遺伝子、プロモーター、およびターミネーターを含む。一つの実施形態において、レトロウイルスベクタープラスミドは、ＬＴＲのＵ３領域が欠損するように改変されていてもよい。レトロウイルスベクターを生産するためのプロデューサー細胞として、ＨＥＫ２９３Ｔなどの細胞が挙げられる。
【0101】
一つの実施形態において、レンチウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列は、カプシドタンパク質をコードする核酸配列（ｇａｇ）と、ゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列（ｐｏｌ、ｒｅｖ、パッケージングシグナル（ψ）配列、ＡＰＰ、ＭＡＡＰのうちの少なくとも１つ）と、２つの末端反復配列（５’ＬＴＲ、３’ＬＴＲ）と、ヘルパー遺伝子の核酸配列とを含み得る。一つの実施形態において、ヘルパー遺伝子の核酸配列は、ｐｒｏ、ｐｏｌおよびｅｎｖであり得る。一つの実施形態において、レンチウイルスベクタープラスミドは、ｒｅｖ、ｇａｇ、ｐｒｏ、ｐｏｌ、ｅｎｖのうちの１つまたは複数を含まなくてもよく、一つの実施形態において、レンチウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列はこれらを含む。ｐｏｌおよびｒｅｖは、レンチウイルスの複製に必要な遺伝子であり得るので、これらを欠損させたレンチウイルスベクタープラスミドは、感染細胞における複製能力が低減され得る。一つの実施形態において、レンチウイルスベクタープラスミドは、ｔａｔ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、ｖｐｘ、ＴＡＲ、ＲＲＥ、ＰＥ、ＳＬＩＰ、ＣＲＳ、ＩＮＳ、ＡＰＰ、ＭＡＡＰ、ＲＰＥ、ＰＰＴ、ＰＲＥ、ＷＲＰＥ、ｏＰＲＥのうちの１つまたは複数を含んでもよい。一つの実施形態において、レンチウイルスベクタープラスミドは、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの間にレンチウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列のうちの１つまたは複数（例えば全て）を含まない。一つの実施形態において、レンチウイルスベクタープラスミドは、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの間に所望の遺伝子を含む。一つの実施形態において、レンチウイルスベクタープラスミドは、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲの間に所望の遺伝子、プロモーター、ターミネーター、およびＷＰＲＥを含む。一つの実施形態において、レンチウイルスベクタープラスミドは、ＬＴＲのＵ３領域、ＴＡＴが欠損するように改変されていてもよい。一つの実施形態において、レトロウイルスベクタープラスミドは、ＬＴＲのＵ３領域が欠損するように改変されていてもよい。レンチウイルスベクターを生産するためのプロデューサー細胞として、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３、Ｈｅｌａなどの細胞が挙げられる。
【0102】
・センダイウイルスベクター
センダイウイルス（ＳｅＶ）は、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）レスピロウイルス属（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）に分類されるマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。センダイウイルスはニューロンを含む非分裂細胞にも感染し得る。センダイウイルスの感染後、ウイルスゲノムは宿主細胞の染色体に組み込まれずＲＮＡの状態で細胞質に留まる。
センダイウイルス（ＳｅＶ）は、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）レスピロウイルス属（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）に分類されるマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。センダイウイルスはニューロンを含む非分裂細胞にも感染し得る。センダイウイルスの感染後、ウイルスゲノムは宿主細胞の染色体に組み込まれずＲＮＡの状態で細胞質に留まる。
【0103】
センダイウイルスのタンパク質をコードする遺伝子としては、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子が挙げられる。Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子は、それぞれヌクレオキャプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼおよびラージ蛋白質をコードする。一般的に野生型センダイウイルスのゲノム上には、３’の短いリーダー領域（ＬＥ）に続き、Ｎ（ヌクレオカプシドタンパク質）、Ｐ（ホスホタンパク質）、Ｍ（マトリックスタンパク質）、Ｆ（フュージョンタンパク質）、ＨＮ（ヘマグルチニン・ノイラミニダーゼ）およびＬ（ラージタンパク質）をコードする６つの遺伝子が並んでおり、他端に短い５’トレイラー領域（ＴＲ）が存在する。Ｐ遺伝子の領域からはＣおよびＶと呼ばれるアクセサリータンパク質も翻訳される。
【0104】
センダイウイルスは、宿主細胞の細胞質におけるチューブリンおよびセンダイウイルスのＲＮＡポリメラーゼ（Ｌタンパク質）の両方によって遺伝子を発現する。センダイウイルスは、宿主細胞のゲノムと相互作用せず、ヒトに対して病原性ではない。センダイウイルスのこれらの特徴は、センダイウイルスベクターのヒトに対する安全性を示唆する。Ｍタンパク質、Ｆタンパク質、およびＨＮタンパク質は、センダイウイルスのウイルス粒子の形成およびウイルス感染を担い得る。Ｎタンパク質、Ｐタンパク質およびＬタンパク質は、ウイルスゲノムの発現および複製を担い得る。
【0105】
一つの実施形態では、プロデューサー細胞においてセンダイウイルスベクタープラスミドから転写された核酸は、センダイウイルスベクターの搭載核酸となる。そのため、以下のセンダイウイルスベクタープラスミドに関する特徴は、センダイウイルスベクターの搭載核酸の特徴でもあり得る。
【0106】
一つの実施形態において、センダイウイルスベクタープラスミドは、センダイウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列のうちの少なくとも１つおよび所望の遺伝子を含む。一つの実施形態では、所望の遺伝子は、センダイウイルス遺伝子（Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子）のいずれかの上流および／または下流に位置付けられ得る。一つの実施形態では、センダイウイルスベクタープラスミドは、所望の遺伝子の上流または下流にＥＩＳ配列（転写終結（Ｅ）配列－介在（Ｉ）配列－転写開始（Ｓ）配列）を含むことができ、そうすることで所望の遺伝子の上流または下流の遺伝子の発現が促進され得る。一つの実施形態では、センダイウイルスベクタープラスミドは、６の倍数の塩基数を有する配列（例えば、所望の遺伝子を含む配列）を挿入するように改変され得る。一つの実施形態において、センダイウイルスベクタープラスミドは、ベクタープラスミドおよびプロデューサー細胞がセンダイウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列を含むようなプロデューサー細胞において機能するように構成される。一つの実施形態において、センダイウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列のうちベクタープラスミドに含まれない遺伝子またはその遺伝子産物のうち１つまたは複数（例えば、全て）は、ベクタープラスミドとトランスにプロデューサー細胞において供給され得る。
【0107】
一つの実施形態において、センダイウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列は、カプシドタンパク質をコードする核酸配列（Ｎ、ＨＮ）と、ゲノムをパッケージング、転写および複製するタンパク質をコードする核酸配列（Ｐ、Ｌ）と、２つの末端配列（ＬＥ、ＴＲ）と、ヘルパー遺伝子の核酸配列とを含み得る。一つの実施形態において、ヘルパー遺伝子の核酸配列は、Ｆ、Ｖ、ＣおよびＭであり得る。一つの実施形態において、センダイウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列は、センダイウイルスの全ての遺伝子であり得る。一つの実施形態において、センダイウイルスベクタープラスミドは、ＬＥおよびＴＲの間にセンダイウイルスを構成するのに必要な核酸配列を含む。一つの実施形態において、センダイウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列は、Ｎ、Ｐ、Ｖ、Ｃ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、Ｌの遺伝子を含み得る。一つの実施形態において、センダイウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列は、Ｍ、ＦおよびＨＮのうちの１つまたは複数以外のセンダイウイルスの全ての遺伝子であり得る。Ｍ、ＦおよびＨＮ遺伝子のうちの一つまたは複数を欠損するセンダイウイルスベクタープラスミドを使用する場合、搭載核酸は宿主における伝播性を喪失し得る。一つの実施形態において、センダイウイルスベクタープラスミドは、Ｍ、ＦおよびＨＮのうちの１つまたは複数を含まなくてもよく、一つの実施形態において、センダイウイルスベクターを構成するのに必要な核酸配列はこれらを含む。一つの実施形態において、センダイウイルスベクタープラスミドは、バクテリオファージＴ７のＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含んでもよい。一つの実施形態において、センダイウイルスベクタープラスミドは、自己切断リボザイムＲｂｚを含んでもよい。
【0108】
一つの実施形態では、センダイウイルスタンパク質の抗原性を低下させるために、またはＲＮＡの転写効率および複製効率を高めるために、センダイウイルス遺伝子を改変してもよい。一つの実施形態では、転写または複製の機能を増強するために、複製因子であるＮ遺伝子、Ｐ遺伝子およびＬ遺伝子の一つまたは複数を改変してもよい。一つの実施形態では、構造タンパク質であるＨＮタンパク質を改変してもよく、そうすることで、ヘマグルチニン活性および／またはノイラミニダーゼ活性が変化し得、ヘマグルチニン活性を弱めることで血中のウイルスの安定性が向上し得、ノイラミニダーゼ活性が変化することでウイルスの感染性が変化し得る。一つの実施形態では、膜融合に関わるＦタンパク質を改変してもよい。一つの実施形態では、アクセサリー遺伝子であるＶ遺伝子を欠損させるように改変してもよい。センダイウイルスベクターを生産するためのプロデューサー細胞として、ＢＨＫ／Ｔ７などの細胞が挙げられる。
【0109】
一つの実施形態において、本開示は、本開示のウイルスベクターの集団を含むウイルスベクター含有組成物を提供する。一つの実施形態において、ウイルスベクター含有組成物は、全ウイルスベクター粒子のうち核酸を含まないウイルスベクター粒子が、約９０％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、または約５０％以下であり得る。一つの実施形態において、本開示のウイルスベクター含有組成物は、全ウイルスベクター粒子のうち、全ての所望の遺伝子を含む核酸を含むウイルスベクター粒子が、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９２％以上、約９５％以上、約９７％以上、または約９９％以上であり得る。一つの実施形態において、本開示のウイルスベクター含有組成物は、全ウイルスベクター粒子のうち、所望の核酸以外の本開示のプラスミド由来の核酸を含むウイルスベクター粒子が、約１０％以下、約７％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１．５％以下、約１％以下、約０．７％以下、約０．５％以下、約０．４％以下、約０．３％以下、約０．２％以下、または約０．１％以下であり得る。
【0110】
（ウイルスベクタープラスミドの作製）
一つの実施形態において、本開示は、複数の核酸配列を作動可能に連結するステップを含む、本開示のベクタープラスミドを作製する方法を提供する。一つの実施形態において、本開示は、本開示のベクタープラスミドを枯草菌において複製するステップを含む、本開示のベクタープラスミドを作製する方法を提供する。一つの実施形態において、本開示は、枯草菌内で複製される配列を有する、ウイルスベクターを生産するための核酸配列を含む核酸を宿主細胞に導入して、前記宿主細胞においてプラスミドを形成させるステップを含む、本開示のベクタープラスミドを作製する方法を提供する。本明細書において、一つの実施形態において、枯草菌は外部から取り込んだ核酸からプラスミドを形成する能力を有し得るので、この方法において、導入する核酸はプラスミドでなくてもよい。例えば、枯草菌は、核酸（例えば、タンデムリピートな核酸配列を有する非環状核酸）と接触すると、この核酸を取り込み、枯草菌内でプラスミドを形成し得る（例えば、本明細書に記載のＯＧＡＢ法を参照のこと）。
一つの実施形態において、本開示は、複数の核酸配列を作動可能に連結するステップを含む、本開示のベクタープラスミドを作製する方法を提供する。一つの実施形態において、本開示は、本開示のベクタープラスミドを枯草菌において複製するステップを含む、本開示のベクタープラスミドを作製する方法を提供する。一つの実施形態において、本開示は、枯草菌内で複製される配列を有する、ウイルスベクターを生産するための核酸配列を含む核酸を宿主細胞に導入して、前記宿主細胞においてプラスミドを形成させるステップを含む、本開示のベクタープラスミドを作製する方法を提供する。本明細書において、一つの実施形態において、枯草菌は外部から取り込んだ核酸からプラスミドを形成する能力を有し得るので、この方法において、導入する核酸はプラスミドでなくてもよい。例えば、枯草菌は、核酸（例えば、タンデムリピートな核酸配列を有する非環状核酸）と接触すると、この核酸を取り込み、枯草菌内でプラスミドを形成し得る（例えば、本明細書に記載のＯＧＡＢ法を参照のこと）。
【0111】
一つの実施形態において、枯草菌に核酸を導入する方法は、任意の方法であり得るが、例えば、コンピテントな枯草菌の使用、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法、リン酸カルシウム法などが挙げられる。「コンピテント」とは、細胞が外来性の物質（例えば、核酸）に対してより透過性になった状態を指す。枯草菌をコンピテントにするためには、任意の公知の方法を使用することができるが、例えば、Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｕ， Ｃ． ａｎｄ Ｓｐｉｚｉｚｅｎ， Ｊ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， ８１， ７４１－７４６（１９６１）に記載の方法を使用することができる。一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、枯草菌において作製され、そのまま同じ枯草菌において増幅されてもよい。
【0112】
枯草菌に核酸を導入して、この核酸とは異なる構造のウイルスベクタープラスミドを作製する場合、導入する核酸は、以下で詳細に説明するウイルスベクタープラスミドの各要素を含み得る。
【0113】
（ＯＧＡＢ法）
一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、ＯＧＡＢ法によって作製され得る。ＯＧＡＢ（Ordered Gene Assembly in Bacillus subtilis）法は、集積核酸を形質転換生物に取り込ませることでこの生物において環状のプラスミドを生成する方法である。ＯＧＡＢ法は、必ずしも枯草菌（Bacillus subtilis）を使用する必要はなく、非環状の長鎖核酸を取り込み、プラスミドを生成できる任意の生物を使用でき、このような生物を本明細書では「形質転換生物」と呼ぶ。ＯＧＡＢ法では、大きなサイズの核酸を含むプラスミドが簡便に調製され得る。形質転換生物に取り込ませる核酸を本明細書では「集積核酸」と呼び、典型的には、集積核酸は、同じ方向にプラスミドの１単位と、１セットの単位核酸とが繰り返し現れるようなタンデムリピート状の構造を有し、このような構造の集積核酸を使用することで、形質転換生物におけるプラスミドの生成が促進され得る。本明細書において「単位核酸」とは、集積核酸の配列を構成する一部の配列を有する核酸分子または核酸分子の部分を指し、以下で詳細に説明されるように、複数種類の単位核酸が単位ベクターとして調製され、その後集積核酸が構築される。
一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドは、ＯＧＡＢ法によって作製され得る。ＯＧＡＢ（Ordered Gene Assembly in Bacillus subtilis）法は、集積核酸を形質転換生物に取り込ませることでこの生物において環状のプラスミドを生成する方法である。ＯＧＡＢ法は、必ずしも枯草菌（Bacillus subtilis）を使用する必要はなく、非環状の長鎖核酸を取り込み、プラスミドを生成できる任意の生物を使用でき、このような生物を本明細書では「形質転換生物」と呼ぶ。ＯＧＡＢ法では、大きなサイズの核酸を含むプラスミドが簡便に調製され得る。形質転換生物に取り込ませる核酸を本明細書では「集積核酸」と呼び、典型的には、集積核酸は、同じ方向にプラスミドの１単位と、１セットの単位核酸とが繰り返し現れるようなタンデムリピート状の構造を有し、このような構造の集積核酸を使用することで、形質転換生物におけるプラスミドの生成が促進され得る。本明細書において「単位核酸」とは、集積核酸の配列を構成する一部の配列を有する核酸分子または核酸分子の部分を指し、以下で詳細に説明されるように、複数種類の単位核酸が単位ベクターとして調製され、その後集積核酸が構築される。
【0114】
以下で、形質転換生物に取り込ませるための集積核酸の作製手順を説明する。
【0115】
・単位核酸の調製
集積核酸に組み込むための単位核酸を調製する。単位核酸は任意の公知の方法によって作製でき、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）や化学合成により作製することができる。単位核酸は、所望のタンパク質（治療用タンパク質、ウイルスベクターを構成するタンパク質など）をコードする配列またはその部分、遺伝子を制御する配列（プロモーター、エンハンサーなど）、核酸を操作するための配列（制限酵素認識配列など）など任意の所望の配列を有し得る。集積核酸に組み込んだときに、複数種類の単位核酸が特定の順番および/または特性の方向に並ぶように、それぞれの単位核酸の末端は、特定の突出配列を生じるように構成され得る。
集積核酸に組み込むための単位核酸を調製する。単位核酸は任意の公知の方法によって作製でき、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）や化学合成により作製することができる。単位核酸は、所望のタンパク質（治療用タンパク質、ウイルスベクターを構成するタンパク質など）をコードする配列またはその部分、遺伝子を制御する配列（プロモーター、エンハンサーなど）、核酸を操作するための配列（制限酵素認識配列など）など任意の所望の配列を有し得る。集積核酸に組み込んだときに、複数種類の単位核酸が特定の順番および/または特性の方向に並ぶように、それぞれの単位核酸の末端は、特定の突出配列を生じるように構成され得る。
【0116】
最終的にプラスミド上に多数の単位核酸が集積され得るので、１つまたは複数の単位核酸は塩基長の長い１つまたは複数の遺伝子をコードするように設計されてもよい。塩基長の長い遺伝子としては、例えば、一連の代謝経路を構成する遺伝子群などが挙げられる。
【0117】
・単位ベクターの調製
単位核酸と、それとは異なる付加核酸とを連結することで単位ベクターを調製することができる。単位ベクターを使用することで、単位核酸をより容易に取り扱うことが可能になり得る。
単位核酸と、それとは異なる付加核酸とを連結することで単位ベクターを調製することができる。単位ベクターを使用することで、単位核酸をより容易に取り扱うことが可能になり得る。
【0118】
付加核酸は、直鎖状核酸であってもよいし、環状のプラスミドであってもよい。環状のプラスミドを付加核酸として使用する場合、単位ベクターも環状構造を有し得るため、例えば、大腸菌等の形質転換に使用できる。一つの実施形態において、導入された宿主中で単位ベクターが複製されるように、付加核酸は複製開始点を含み得る。一つの実施形態において、ある集積核酸を構築するための全ての単位核酸は、同一種類の付加核酸に連結してもよく、そうすることで単位ベクター間のサイズ差を小さくし、複数種類の単位ベクターの取り扱いが容易になり得る。一つの実施形態において、ある集積核酸を構築するための単位核酸は、異なる種類の付加核酸に連結してもよい。一つの実施形態において、ある集積核酸を構築するための１つまたは複数の単位核酸について、（単位核酸の塩基長）/（単位ベクターの塩基長）の割合またはその平均は、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、７％以下、５％以下、２％以下、１．５％以下、１％以下または０．５％以下であり得る。付加核酸のサイズが単位核酸より大きいほど、異なる種類の単位ベクターのより均一な取り扱いが可能になり得る。単位核酸と付加核酸との連結は、例えば、ＤＮＡリガーゼを用いたライゲーション、ＴＡクローニング法など任意の方法で実施できる。一つの実施形態において、ある集積核酸を構築するための１つまたは複数の単位核酸について、（単位核酸の塩基長）/（単位ベクターの塩基長）の割合またはその平均は、１％以上、０．３％以上、０．１％以上、０．０３％以上、０．０１％以上、０．００３％以上または０．００１％以上であり得、単位ベクターの操作が容易になり得る。
【0119】
一つの実施形態において、単位核酸の長さは、１０ｂｐ以上、２０ｂｐ以上、５０ｂｐ以上、７０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、２００ｂｐ以上、５００ｂｐ以上、７００ｂｐ以上、１０００ｂｐ以上または１５００ｂｐ以上、かつ５０００ｂｐ以下、５０００ｂｐ以下、２０００ｂｐ以下、１５００ｂｐ以下、１２００ｂｐ以下、１０００ｂｐ以下、７００ｂｐ以下または５００ｂｐ以下であり得る。
【0120】
一つの実施形態において、集積核酸は、２種以上、４種以上、６種以上、８種以上、１０種以上、１５種以上、２０種以上、３０種以上、４０種以上、５０種以上、６０種以上、７０種以上、８０種以上、９０種以上または１００種以上、かつ１０００種以下、７００種以下、５００種以下、２００種以下、１２０種以下、１００種以下、８０種以下、７０種以下、６０種以下７０種以下または５０種以下の単位核酸から構築され得る。各々の単位核酸（または単位ベクター）のモル数がほぼ同一になるように調整することで、タンデムリピート状の構造を有する所望の集積核酸が効率的に作製され得る。
【0121】
一つの実施形態において、単位核酸は、集積核酸における１セットの反復配列を単位核酸の数でほぼ等分した塩基長を有してもよい。そうすることで、各々の単位核酸（または単位ベクター）のモル数を揃える操作が容易になり得る。一つの実施形態において、単位核酸は、集積核酸における１セットの反復配列を単位核酸の数でほぼ等分した塩基長から３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、７％以下または５％以下の増大または減少した塩基長を有し得る。
【0122】
一つの実施形態において、単位核酸は、単位核酸の端部に非回文配列（パリンドローム配列でない配列）を有するように設計され得る。このように設計された単位核酸は、その非回文配列を突出配列にした場合、集積核酸において単位核酸が互いに順序を保ったまま連結した構造を容易に与え得る。
【0123】
・集積核酸の作製
集積核酸は、単位核酸を互いに連結することによって構築され得る。一つの実施形態において、単位核酸は、単位ベクターから制限酵素などによって切り出されることで調製され得る。集積核酸は、反復配列のセットを１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上または１０つ以上含み得る。集積核酸における反復配列は、単位核酸の配列および必要に応じて集積ベクター核酸の配列を含み得る。集積核酸は、形質転換生物において核酸の複製を可能とする配列を有し得る。一つの実施形態において、形質転換生物において核酸の複製を可能とする配列は、形質転換生物（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌（枯草菌））中で有効な複製開始点を含み得る。枯草菌中で有効な複製開始点の配列は、特に限定されないが、例えば、θ型の複製機構を有するものとしては、ｐＴＢ１９（Imanaka,T., et al. J.Gen.Microbioi. 130, 1399-1408.(1984)）やｐＬＳ３２（Tanaka, T and Ogra, M. FEBS Lett. 422, 243-246.(1998)）、ｐＡＭβ１（Swinfield, T.J., et al. Gene 87, 79-90.(1990)）等のプラスミドに含まれる複製開始点等の配列が挙げられる。
集積核酸は、単位核酸を互いに連結することによって構築され得る。一つの実施形態において、単位核酸は、単位ベクターから制限酵素などによって切り出されることで調製され得る。集積核酸は、反復配列のセットを１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上または１０つ以上含み得る。集積核酸における反復配列は、単位核酸の配列および必要に応じて集積ベクター核酸の配列を含み得る。集積核酸は、形質転換生物において核酸の複製を可能とする配列を有し得る。一つの実施形態において、形質転換生物において核酸の複製を可能とする配列は、形質転換生物（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌（枯草菌））中で有効な複製開始点を含み得る。枯草菌中で有効な複製開始点の配列は、特に限定されないが、例えば、θ型の複製機構を有するものとしては、ｐＴＢ１９（Imanaka,T., et al. J.Gen.Microbioi. 130, 1399-1408.(1984)）やｐＬＳ３２（Tanaka, T and Ogra, M. FEBS Lett. 422, 243-246.(1998)）、ｐＡＭβ１（Swinfield, T.J., et al. Gene 87, 79-90.(1990)）等のプラスミドに含まれる複製開始点等の配列が挙げられる。
【0124】
集積核酸は、単位核酸の他にも、必要に応じて追加の塩基配列を含んでもよい。一つの実施形態において、集積核酸は、プロモーター、オペレーター、アクチベーター、ターミネーター等の転写翻訳を制御する塩基配列を含んでもよい。枯草菌を宿主とした場合のプロモーターとしては、具体的には、ＩＰＴＧ（isopropyl s-D-thiogalactopyranoside）で発現制御可能なＰｓｐａｃ（Yansura, D. and Henner, D.J. Pro. Natl. Acad. Sci, USA 81, 439-443.(1984.)）、あるいはＰｒプロモーター（Itaya, M. Biosci. Biotechnol. Biochem. 63, 602-604.(1999)）等が挙げられる。
【0125】
単位核酸は、集積核酸において一定の順序および向きを保った繰り返し構造を形成し得る。一つの実施形態において、単位ベクターから切り出された単位核酸の突出末端の塩基配列が互いに相補的になるように単位核酸を構築することで、集積核酸における一定の順序および向きを保った繰り返し構造の形成が可能になり得る。一つの実施形態において、異なる単位核酸毎に突出末端の構造をユニークにすることで、効率的に一定の順序および向きを保った繰り返し構造を形成し得る。一つの実施形態において、突出末端は、非回分配列を有してもよく、５’末端突出または３’末端突出のいずれであってもよい。
【0126】
一つの実施形態において、制限酵素を用いて単位ベクターから突出末端を有する単位核酸が切り出され得る。この実施形態において、単位ベクターは、１つまたは複数の制限酵素認識配列を有し得る。単位ベクターが複数の制限酵素認識配列を有する場合、それぞれの制限酵素認識配列は同じ制限酵素によって認識されてもよいし、異なる制限酵素によって認識されてもよい。一つの実施形態において、単位ベクターは、同じ制限酵素によって認識される１対の領域を、完全な単位核酸領域がこれらの領域の間に含まれるように含み得る。使用される制限酵素は、特に限定されないが、タイプＩＩ制限酵素、例えば、ＡａｒＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｔｇＺＩ、ＦｏｋＩ、ＳｆａＮＩなどのタイプＩＩＳ制限酵素を使用でき、これらの制限酵素は、認識配列の外側の認識配列から一定距離離れた部位に突出末端を創出可能であり得る。（例えば単独の）タイプＩＩＳ制限酵素を用いると、切り出した単位核酸の突出末端の配列が単位核酸毎に異なり得るので、複数の単位核酸を一定の順序および向きで集積させるのに有利であり得る。タイプＩＩＳ制限酵素を使用する一つの実施形態において、単位ベクターは単位核酸領域にそのタイプＩＩＳ制限酵素が認識する領域を含まない。認識領域を切断する制限酵素を使用する実施形態において、単位ベクターは単位核酸領域の末端にその制限酵素が認識する領域を含み得る。
【0127】
一つの実施形態において、複数の単位ベクターから単位核酸を切り出すために同じ種類の制限酵素を使用する場合、この複数の単位ベクターを含む溶液中で制限酵素処理を行うことができ、作業の効率が向上し得る。ある集積核酸を作製するために使用する制限酵素の種類は、例えば、５種以下、４種以下、３種以下、２種以下または１種であり得、少ない種類の制限酵素を使用することで、単位核酸間のモル数のばらつきが低減され得る。一つの実施形態において、単位ベクターから切り出された単位核酸は、アガロースゲル電気泳動など任意の公知の分画法により容易に精製され得る。
【0128】
単位核酸および必要に応じて集積ベクター核酸は、ＤＮＡリガーゼ等を用いて互いに連結（ライゲーション）することができる。これにより、集積核酸を作製できる。例えば、単位核酸および必要に応じて集積ベクター核酸の連結は、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ８０００など）および塩（例えば、１価のアルカリ金属、塩化ナトリウムなど）などの成分の存在下で実施することができる。ライゲーション反応液中の各単位核酸の濃度は、特に限定されず、１ｆｍｏｌ／μｌ以上などであり得る。ライゲーションの反応温度および時間は、特に限定されず、３７℃で３０分以上などである。一つの実施形態において、単位核酸および必要に応じて集積ベクター核酸を連結させる前に、単位核酸および必要に応じて集積ベクター核酸を含む組成物を制限酵素を失活させる任意の条件に供してもよい（例えば、フェノール・クロロフォルム処理）。
【0129】
単位核酸は、ＷＯ２０１５／１１１２４８に記載される方法などを使用して、ほぼ同じモル数に調整することができる。単位核酸をほぼ同じモル数に調整することで、タンデムリピート状の構造を有する所望の集積核酸が効率的に作製され得る。単位ベクターまたは単位核酸の濃度を測定することで、単位核酸のモル数を調整することができる。
【0130】
・集積核酸からのプラスミドの作製
集積核酸を形質転換生物と接触させることで、形質転換生物においてプラスミドが形成され得る。一つの実施形態において、形質転換生物として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属細菌、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属などが挙げられる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌としては、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（巨大菌）、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（中度高熱菌）などが挙げられる。好ましい実施形態において、形質転換生物は枯草菌である。一つの実施形態において、集積核酸を取り込ませる形質転換生物は、コンピテント状態であり、能動的に核酸を取り込むことができる。例えば、コンピテント状態の枯草菌は、基質となる２本鎖核酸を細胞上で切断し、２本鎖の内のいずれかの１本鎖をこの切断点から分解し、他方の１本鎖を菌体内に取り込む。取り込まれた1本鎖は、菌体内で環状の２本鎖核酸に修復され得る。形質転換生物をコンピテント状態にするために、任意の公知の方法を使用できるが、例えば、枯草菌は、Anagnostopoulou, C. and Spizizen, J. J. Bacteriol., 81, 741-746(1961)に記載の方法を用いてコンピテント状態にすることができる。形質転換の方法は、それぞれの形質転換生物に適した公知の方法を用いることができる。
集積核酸を形質転換生物と接触させることで、形質転換生物においてプラスミドが形成され得る。一つの実施形態において、形質転換生物として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属細菌、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属細菌、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属などが挙げられる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌としては、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（巨大菌）、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（中度高熱菌）などが挙げられる。好ましい実施形態において、形質転換生物は枯草菌である。一つの実施形態において、集積核酸を取り込ませる形質転換生物は、コンピテント状態であり、能動的に核酸を取り込むことができる。例えば、コンピテント状態の枯草菌は、基質となる２本鎖核酸を細胞上で切断し、２本鎖の内のいずれかの１本鎖をこの切断点から分解し、他方の１本鎖を菌体内に取り込む。取り込まれた1本鎖は、菌体内で環状の２本鎖核酸に修復され得る。形質転換生物をコンピテント状態にするために、任意の公知の方法を使用できるが、例えば、枯草菌は、Anagnostopoulou, C. and Spizizen, J. J. Bacteriol., 81, 741-746(1961)に記載の方法を用いてコンピテント状態にすることができる。形質転換の方法は、それぞれの形質転換生物に適した公知の方法を用いることができる。
【0131】
一つの実施形態において、パッケージング細胞から生産されたベクタープラスミドは任意の公知の方法を用いて精製でき、本開示は、このように精製されたベクタープラスミドも提供する。一つの実施形態において、精製したベクタープラスミドが所望の核酸配列を有することは、制限酵素切断により発生する断片のサイズパターンを調べること、ＰＣＲ法、塩基配列決定法などにより確認することができる。一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミド作製方法によって調製されたベクタープラスミド含有組成物は、含有エンドトキシンが少量であり得る。一つの実施形態において、本開示のベクタープラスミドを含む枯草菌を提供する。
【0132】
（組成物）
一つの実施形態において、本開示は、本明細書に記載のベクタープラスミドまたはウイルスベクターを含む組成物を提供する。
一つの実施形態において、本開示は、本明細書に記載のベクタープラスミドまたはウイルスベクターを含む組成物を提供する。
【0133】
（剤型等）
本明細書に記載される組成物は、種々の形態で提供され得る。組成物の形態としては、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、吸入剤等であってもよい。注射用の水溶液は、例えば、バイアル、またはステンレス容器で保存してもよい。また注射用の水溶液は、例えば生理食塩水、糖（例えばトレハロース）、ＮａＣｌ、またはＮａＯＨ等を配合してもよい。
本明細書に記載される組成物は、種々の形態で提供され得る。組成物の形態としては、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、吸入剤等であってもよい。注射用の水溶液は、例えば、バイアル、またはステンレス容器で保存してもよい。また注射用の水溶液は、例えば生理食塩水、糖（例えばトレハロース）、ＮａＣｌ、またはＮａＯＨ等を配合してもよい。
【0134】
一つの実施形態では、本開示の組成物は、薬学的に許容しうるキャリアもしくは賦形剤を含む。このようなキャリアは、無菌液体、例えば水および油であることも可能であり、石油、動物、植物または合成起源のものが含まれ、限定されるわけではないが、ピーナツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油等が含まれる。医薬を経口投与する場合は、水が好ましいキャリアである。医薬組成物を静脈内投与する場合は、生理食塩水および水性デキストロースが好ましいキャリアである。好ましくは、生理食塩水溶液、並びに水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、注射可能溶液の液体キャリアとして使用される。適切な賦形剤には、軽質無水ケイ酸、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ポロキサマー、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が含まれる。組成物は、望ましい場合、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝剤もまた含有することも可能である。これらの組成物は、溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、持続放出配合物等の形を取ることも可能である。伝統的な結合剤およびキャリア、例えばトリグリセリドを用いて、組成物を座薬として配合することも可能である。経口配合物は、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的キャリアを含むことも可能である。適切なキャリアの例は、E.W.Martin, Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mark Publishing Company, Easton, U.S.A)に記載される。これらのほか、例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含んでいてもよい。一つの実施形態では、本開示の任意の液体組成物のｐＨは、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０、約１０．５、約１１またはこれらの任意の２つの値の間の範囲であり得る。
【0135】
本開示の組成物の任意の成分は、薬学的に許容しうる塩として提供することができ、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する遊離型のカルボキシル基とともに形成される塩、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの遊離型のアミン基とともに形成される塩、並びにナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、および水酸化第二鉄とともに形成される塩であり得る。
【0136】
好ましい実施形態において、公知の方法に従って、ヒトへの投与に適応させた医薬組成物として、組成物を配合することができる。このような組成物は注射により投与することができる。代表的には、注射投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝剤中の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射部位での疼痛を和らげるリドカインなどの局所麻酔剤も含むことも可能である。一般的に、成分を別個に供給するか、または単位投薬型中で一緒に混合して供給し、例えば活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封容器中、凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として供給することができる。組成物を注入によって投与しようとする場合、無菌薬剤等級の水または生理食塩水を含有する注入ビンを用いて、分配することも可能である。組成物を注射によって投与しようとする場合、投与前に、成分を混合可能であるように、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルを提供することも可能である。
【0137】
（使用・用途）
本明細書に記載のベクタープラスミドまたはウイルスベクター、またはこれらを含む組成物は遺伝子治療、機能的ゲノム学、癌ワクチン接種および／または抗ウイルスワクチン接種など、種々の用途で使用することができる。
本明細書に記載のベクタープラスミドまたはウイルスベクター、またはこれらを含む組成物は遺伝子治療、機能的ゲノム学、癌ワクチン接種および／または抗ウイルスワクチン接種など、種々の用途で使用することができる。
【0138】
本開示のウイルスベクターまたはウイルスベクター含有組成物を被験体に適用する場合、被験体は特に限定されず、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ブタ、サル、ヒトなど）、鳥類、爬虫類、両生類、節足動物、魚類などであり得る。
【0139】
本開示のウイルスベクターまたはウイルスベクター含有組成物の量は、処置または予防する障害または状態の性質によって変動しうるが、当業者は本明細書の記載に基づき標準的臨床技術によって決定可能である。場合によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、最適投薬量範囲を同定するのを補助することも可能である。配合物に使用しようとする正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重大性によっても変動しうるため、担当医の判断および各患者の状況に従って、決定すべきである。本開示のウイルスベクターまたはウイルスベクター含有組成物の投与量は特に限定されないが、例えば、１回あたり１×１０５個、１×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、１×１０９個、１×１０１０個、１×１０１１個、１×１０１２個、１×１０１３個、１×１０１４個もしくは１×１０１５個の個数のウイルスベクターであってもよく、それらいずれか２つの値の範囲内であってもよい。投与間隔は特に限定されないが、例えば、１、７、１４、２１、または２８日あたりに１または２回投与してもよく、それらいずれか２つの値の範囲あたりに１または２回投与してもよい。投与量、投与間隔、投与方法は、患者の年齢や体重、症状、対象臓器等により、適宜選択してもよい。
【0140】
本明細書に記載のウイルスベクターまたはウイルスベクター含有組成物の投与経路は、例えば、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、髄腔内、脳室内、脳実質内、経肺、鼻内、硬膜外、または経口投与等であってもよい。一つの実施形態では、本開示の組成物、種々の送達（デリバリー）系をともに使用することができる。このような系には、例えばリポソーム、微小粒子、および微小カプセル中の被包：受容体が仲介するエンドサイトーシスの使用などがある。好適な経路によって、例えば注入によって、ボーラス（ｂｏｌｕｓ）注射によって、上皮または皮膚粘膜裏打ち（例えば口腔、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収によって、医薬を投与することも可能であるし、必要に応じてエアロゾル化剤を用いて吸入器または噴霧器を使用しうるし、そして他の薬剤と一緒に投与することも可能である。投与は全身性または局所であることも可能である。
【0141】
本開示の組成物はキットとして提供することができる。一つの実施形態では、本開示は、ベクタープラスミドを作製するためのキットであって、枯草菌においてプラスミド複製を促進する核酸配列と、ウイルスを構成するのに必要な核酸配列と、を含む少なくとも１つの核酸を含む、キットを提供する。一つの実施形態では、本開示は、本開示の組成物に添加され得る１以上の成分が充填された、１以上の容器を含む、薬剤パックまたはキットを提供する。場合によって、このような容器に付随して、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形で、政府機関による、ヒト投与のための製造、使用または販売の認可を示す情報を示すことも可能である。
【0142】
本開示の組成物の医薬等としての製剤化手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、使用すべき量等の実施形態を決定することができる。
【0143】
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
【0144】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【0145】
以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例0146】
試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、和光純薬、ナカライ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＣＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＩＮＣ等）の同等品でも代用可能である。
【0147】
（実施例１：ＡＡＶベクタープラスミドの増幅）
以下の手順に従ってＡＡＶベクタープラスミドを作製し、大腸菌および枯草菌で増幅した。
以下の手順に従ってＡＡＶベクタープラスミドを作製し、大腸菌および枯草菌で増幅した。
【0148】
材料
ｐＡＡＶ－ＣＭＶベクター、ｐＲＣ２－ｍｉ３４２ベクター、ｐＨｅｌｐｅｒベクターのプラスミド（ＡＡＶｐｒｏ（登録商標）Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ）は、タカラバイオ（滋賀県）より購入した。枯草菌－大腸菌間シャトルプラスミドベクターであるｐＧＥＴＳ１０３ΔＡａｒＩは、プラスミドｐＧＥＴＳ１０３（Tsuge, K., Itaya, M. (2001) Recombinational transfer of 100-kilobase genomic DNA to plasmid in Bacillus subtilis 168, Journal of Bacteriology, 183, 5453-5458.）における唯一の制限酵素ＡａｒＩ認識部位（５’－ＣＡＣＣＴＧＣ－３’）に点突然変異（５’－ＣＡＣＣＡＧＣ－３’）を導入することによりＡａｒＩ認識部位を消失させたプラスミドであり、神戸大学より譲渡を受けた。大腸菌ＪＭ１０９株のケミカルコンピテントセルは、タカラバイオより購入した。枯草菌ＢＵＳＹ９７９７株（Tsuge, K., Sato, Y., Kobayashi, Y., Gondo, M., Hasebe, M., Togashi, T., Tomita, M., Itaya, M. (2015) Method of preparing an equimolar DNA mixture for one-step DNA assembly of over 50 fragments, Scientific Reports, 5, 10655.）は、神戸大学より譲渡を受けた。ＴＡクローニング用ベクターのｐＭＤ１９－Ｔｖ－ｖｅｃｔｏｒ、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞は、タカラバイオより購入した。制限酵素ＡａｒＩは、Thermo Fisher Scientific（米国）から購入した。その他の制限酵素は全てNew England Biolab（米国）より購入した。ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）は、ナカライテスク（京都）より購入した。カルベニシリンおよびテトラサイクリンは、シグマアルドリッチ（米国）より購入した。低融点アガロースとして、２－ヒドロキシエチルアガロース（シグマアルドリッチ）を用いた。他の一般的な電気泳動用アガロースゲルは、インビトロジェン（米国）のＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ａｇａｒｏｓｅを使用した。フェノール飽和ＴＥは、ナカライテスクより購入した。プラスミドのカラム精製キットとして、キアゲン（ドイツ）のＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ｍｉｎｉｐｒｅｐキット、およびＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いた。Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒは、ベクトン・ディッキンソン（米国）より購入した。その他の培地用試薬は、ナカライテスクより購入した。卵白リゾチーム、エチジウムブロマイドは、シグマアルドリッチより購入した。リボヌクレアーゼＡは、ナカライテスより購入した。プラスミド精製に用いる、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３は、キアゲンより購入した。塩化セシウムは、ナカライテスクより購入した。
ｐＡＡＶ－ＣＭＶベクター、ｐＲＣ２－ｍｉ３４２ベクター、ｐＨｅｌｐｅｒベクターのプラスミド（ＡＡＶｐｒｏ（登録商標）Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ）は、タカラバイオ（滋賀県）より購入した。枯草菌－大腸菌間シャトルプラスミドベクターであるｐＧＥＴＳ１０３ΔＡａｒＩは、プラスミドｐＧＥＴＳ１０３（Tsuge, K., Itaya, M. (2001) Recombinational transfer of 100-kilobase genomic DNA to plasmid in Bacillus subtilis 168, Journal of Bacteriology, 183, 5453-5458.）における唯一の制限酵素ＡａｒＩ認識部位（５’－ＣＡＣＣＴＧＣ－３’）に点突然変異（５’－ＣＡＣＣＡＧＣ－３’）を導入することによりＡａｒＩ認識部位を消失させたプラスミドであり、神戸大学より譲渡を受けた。大腸菌ＪＭ１０９株のケミカルコンピテントセルは、タカラバイオより購入した。枯草菌ＢＵＳＹ９７９７株（Tsuge, K., Sato, Y., Kobayashi, Y., Gondo, M., Hasebe, M., Togashi, T., Tomita, M., Itaya, M. (2015) Method of preparing an equimolar DNA mixture for one-step DNA assembly of over 50 fragments, Scientific Reports, 5, 10655.）は、神戸大学より譲渡を受けた。ＴＡクローニング用ベクターのｐＭＤ１９－Ｔｖ－ｖｅｃｔｏｒ、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞は、タカラバイオより購入した。制限酵素ＡａｒＩは、Thermo Fisher Scientific（米国）から購入した。その他の制限酵素は全てNew England Biolab（米国）より購入した。ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）は、ナカライテスク（京都）より購入した。カルベニシリンおよびテトラサイクリンは、シグマアルドリッチ（米国）より購入した。低融点アガロースとして、２－ヒドロキシエチルアガロース（シグマアルドリッチ）を用いた。他の一般的な電気泳動用アガロースゲルは、インビトロジェン（米国）のＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ａｇａｒｏｓｅを使用した。フェノール飽和ＴＥは、ナカライテスクより購入した。プラスミドのカラム精製キットとして、キアゲン（ドイツ）のＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ｍｉｎｉｐｒｅｐキット、およびＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いた。Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒは、ベクトン・ディッキンソン（米国）より購入した。その他の培地用試薬は、ナカライテスクより購入した。卵白リゾチーム、エチジウムブロマイドは、シグマアルドリッチより購入した。リボヌクレアーゼＡは、ナカライテスより購入した。プラスミド精製に用いる、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３は、キアゲンより購入した。塩化セシウムは、ナカライテスクより購入した。
【0149】
培地
ＬＢ培地は、Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ、塩化ナトリウム５ｇを１Ｌの水に溶解し、寒天プレートを形成する場合は、さらにＢａｃｔｏ Ａｇａｒ １５ｇを添加し、オートクレーブ（１２１℃、２０分）したものを使用した。必要に応じて、カルベニシリン（終濃度１００μｇ／ｍｌ）、あるいはテトラサイクリン（終濃度１０μｇ／ｍｌ）を加えた。枯草菌形質転換用のＴＦ－１培地およびＴＦ－ＩＩ培地は、以下のように調製した。まず、１０×Ｓｐｉｚｉｚｅｎ（１Ｌあたり、１４０ｇ Ｋ２ＨＰＯ４（無水）、６０ｇ ＫＨ２ＰＯ４（無水）、２０ｇ （ＮＨ４）２ＳＯ４）、１０ｇ Ｎａ３シトレート・２Ｈ２Ｏ）、５０％グルコース、２％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２％カザミノ酸および水を、それぞれオートクレーブして個別に準備した。トリプトファン、アルギニン、ロイシン、トレオニンの各アミノ酸の水溶液（５ｍｇ／ｍｌ）は、フィルター滅菌により準備した。ＴＦ－Ｉ培地５００ｍｌの調製のためには、１０×Ｓｐｉｚｉｚｅｎを５０ｍｌ、５０％グルコース、２％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２％カザミノ酸、５ｍｇ／ｍｌのトリプトファン、アルギニン、ロイシン、トレオニンの各アミノ酸を、それぞれ５ｍｌづつ使用し、最後に滅菌水４１５ｍｌを混合して、フィルターろ過し、使用までは４℃で保存した。ＴＦ－ＩＩ培地５００ｍｌの調製については、２％カザミノ酸を２．５ｍｌ、各アミノ酸溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を０．５ｍｌ、滅菌水を４３５．５ｍｌにした以外は、ＴＦ－Ｉ培地と同様の量を加えてフィルターろ過し、使用まで４℃で保存した。
ＬＢ培地は、Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎｅ １０ｇ、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ、塩化ナトリウム５ｇを１Ｌの水に溶解し、寒天プレートを形成する場合は、さらにＢａｃｔｏ Ａｇａｒ １５ｇを添加し、オートクレーブ（１２１℃、２０分）したものを使用した。必要に応じて、カルベニシリン（終濃度１００μｇ／ｍｌ）、あるいはテトラサイクリン（終濃度１０μｇ／ｍｌ）を加えた。枯草菌形質転換用のＴＦ－１培地およびＴＦ－ＩＩ培地は、以下のように調製した。まず、１０×Ｓｐｉｚｉｚｅｎ（１Ｌあたり、１４０ｇ Ｋ２ＨＰＯ４（無水）、６０ｇ ＫＨ２ＰＯ４（無水）、２０ｇ （ＮＨ４）２ＳＯ４）、１０ｇ Ｎａ３シトレート・２Ｈ２Ｏ）、５０％グルコース、２％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２％カザミノ酸および水を、それぞれオートクレーブして個別に準備した。トリプトファン、アルギニン、ロイシン、トレオニンの各アミノ酸の水溶液（５ｍｇ／ｍｌ）は、フィルター滅菌により準備した。ＴＦ－Ｉ培地５００ｍｌの調製のためには、１０×Ｓｐｉｚｉｚｅｎを５０ｍｌ、５０％グルコース、２％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２％カザミノ酸、５ｍｇ／ｍｌのトリプトファン、アルギニン、ロイシン、トレオニンの各アミノ酸を、それぞれ５ｍｌづつ使用し、最後に滅菌水４１５ｍｌを混合して、フィルターろ過し、使用までは４℃で保存した。ＴＦ－ＩＩ培地５００ｍｌの調製については、２％カザミノ酸を２．５ｍｌ、各アミノ酸溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を０．５ｍｌ、滅菌水を４３５．５ｍｌにした以外は、ＴＦ－Ｉ培地と同様の量を加えてフィルターろ過し、使用まで４℃で保存した。
【0150】
試験管内遺伝子操作
他の一般的なＤＮＡの操作については、標準プロトコル（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1989)）に従って行った。
他の一般的なＤＮＡの操作については、標準プロトコル（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1989)）に従って行った。
【0151】
電気泳動ゲルからのＤＮＡ断片の切り出しおよび精製
増幅したＤＮＡ断片は、０．７％の低融点アガロースゲル（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ Ａｇａｒｏｓｅ ＴｙｐｅＶＩＩ、シグマアルドリッチ）で、１×ＴＡＥバッファー（Ｔｒｉｓ－Ａｃｅｔａｔｅ－ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ、ナカライテスク）存在下で、汎用アガロースゲル電気泳動装置（ｉ－ＭｙＲｕｎ．Ｎ 核酸用電気泳動システム、コスモバイオ（東京））において、１００Ｖ（約８Ｖ／ｃｍ）の電圧を印加し、１時間泳動することにより、ベクタープラスミドおよび単位ＤＮＡを分離した。この泳動ゲルを、１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドを含む１×ＴＡＥバッファー１００ｍｌで３０分間染色し、長波長の紫外線（３６６ｍｎ）を照射して可視化することで、目的サイズのＰＣＲ産物をカミソリで切り出し、１．５ｍｌチューブに回収した。回収した低融点アガロースゲル（約３００ｍｇ程度）に１×ＴＡＥバッファーを添加して全体積を約７００μｌとし、これを６５℃で１０分間インキュベートすることにより、ゲルを溶解した。その後、等量のＴＥ飽和フェノールを添加し、よく混合することで制限酵素を失活させた。遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分間）によりフェノール相と水相とに分離し、水相（約９００μｌ）を新しい１．５ｍｌチューブに回収した。ここに１－ブタノールを５００μｌ添加し、よく混合した後、遠心分離（２０，０００×ｇ、１分間）により分離し、水分が飽和した１－ブタノール相を取り除くという操作を水相の体積が４５０μｌ以下になるまで繰り返すことで、水相の体積を減少させた。これに、３Ｍ酢酸カリウム－酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）５０μｌおよびエタノール９００μｌを添加し、遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分間）することにより、ＤＮＡを沈殿させ、これを７０％エタノールでリンスして、２０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。この回収ＤＮＡは、使用まで－２０℃で保存した。
増幅したＤＮＡ断片は、０．７％の低融点アガロースゲル（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ Ａｇａｒｏｓｅ ＴｙｐｅＶＩＩ、シグマアルドリッチ）で、１×ＴＡＥバッファー（Ｔｒｉｓ－Ａｃｅｔａｔｅ－ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ、ナカライテスク）存在下で、汎用アガロースゲル電気泳動装置（ｉ－ＭｙＲｕｎ．Ｎ 核酸用電気泳動システム、コスモバイオ（東京））において、１００Ｖ（約８Ｖ／ｃｍ）の電圧を印加し、１時間泳動することにより、ベクタープラスミドおよび単位ＤＮＡを分離した。この泳動ゲルを、１μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドを含む１×ＴＡＥバッファー１００ｍｌで３０分間染色し、長波長の紫外線（３６６ｍｎ）を照射して可視化することで、目的サイズのＰＣＲ産物をカミソリで切り出し、１．５ｍｌチューブに回収した。回収した低融点アガロースゲル（約３００ｍｇ程度）に１×ＴＡＥバッファーを添加して全体積を約７００μｌとし、これを６５℃で１０分間インキュベートすることにより、ゲルを溶解した。その後、等量のＴＥ飽和フェノールを添加し、よく混合することで制限酵素を失活させた。遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分間）によりフェノール相と水相とに分離し、水相（約９００μｌ）を新しい１．５ｍｌチューブに回収した。ここに１－ブタノールを５００μｌ添加し、よく混合した後、遠心分離（２０，０００×ｇ、１分間）により分離し、水分が飽和した１－ブタノール相を取り除くという操作を水相の体積が４５０μｌ以下になるまで繰り返すことで、水相の体積を減少させた。これに、３Ｍ酢酸カリウム－酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）５０μｌおよびエタノール９００μｌを添加し、遠心分離（２０，０００×ｇ、１０分間）することにより、ＤＮＡを沈殿させ、これを７０％エタノールでリンスして、２０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。この回収ＤＮＡは、使用まで－２０℃で保存した。
【0152】
組換えプラスミド構築
ｐＡＡＶ－ＣＭＶプラスミド（図１）、ｐＲＣ２－ｍｉ３４２プラスミド（図２）、ｐＨｅｌｐｅｒプラスミド（図３）から制限酵素による切り出しなどによって取得した必要な断片（ｐＡＡＶ－ＣＭＶからは１．８ｋｂのＳｂｆＩ断片、ｐＲＣ２－ｍｉ３４２からは５．２ｋｂのＥａｇＩ－ＸｍａＩ断片、ｐＨｅｌｐｅｒからは９．３ｋｂのＢａｍＨＩ－ＢａｍＨＩ－ＮｄｅＩ断片）を、集積用のプラスミドに連結することで組換えプラスミドを構築した。ｐＨｅｌｐｅｒ内のＶＡ領域内にＢａｍＨＩサイトが存在していることから、このＢａｍＨＩサイトと近傍のＮｄｅＩサイトまでの０．３ｋｂの断片は、ＰＣＲで増幅して取得した。この断片を、上記の３つの断片を導入可能なように、ＳｂｆＩサイト、ＡａｒＩサイト、ＥａｇＩ－ＸｍａＩサイトを導入したプライマーを使用して増幅することで、配列番号１に示す配列を有するＰＣＲ産物を得た。
ｐＡＡＶ－ＣＭＶプラスミド（図１）、ｐＲＣ２－ｍｉ３４２プラスミド（図２）、ｐＨｅｌｐｅｒプラスミド（図３）から制限酵素による切り出しなどによって取得した必要な断片（ｐＡＡＶ－ＣＭＶからは１．８ｋｂのＳｂｆＩ断片、ｐＲＣ２－ｍｉ３４２からは５．２ｋｂのＥａｇＩ－ＸｍａＩ断片、ｐＨｅｌｐｅｒからは９．３ｋｂのＢａｍＨＩ－ＢａｍＨＩ－ＮｄｅＩ断片）を、集積用のプラスミドに連結することで組換えプラスミドを構築した。ｐＨｅｌｐｅｒ内のＶＡ領域内にＢａｍＨＩサイトが存在していることから、このＢａｍＨＩサイトと近傍のＮｄｅＩサイトまでの０．３ｋｂの断片は、ＰＣＲで増幅して取得した。この断片を、上記の３つの断片を導入可能なように、ＳｂｆＩサイト、ＡａｒＩサイト、ＥａｇＩ－ＸｍａＩサイトを導入したプライマーを使用して増幅することで、配列番号１に示す配列を有するＰＣＲ産物を得た。
【0153】
このＰＣＲ産物をプラスミドｐＭＤ１９にクローニングし、塩基配列が正しいことを確認後、上記ＤＮＡの末端付近に設計されたＢｓａＩで切断することにより、断片を得た。この断片を、ＨｉｎｄＩＩＩによるｐＧＥＴＳ１０３ΔＡａｒＩの切断および脱リン酸化処理を行って取得した断片に連結した。得られたプラスミドは、ｐＧＥＴＳ１０３－ＶＡと命名した（図４）。ｐＧＥＴＳ１０３－ＶＡをＥａｇＩおよびＸｍａＩで切断後、電気泳動により短い断片を除去し、プラスミドｐＲＣ２－ｍｉ３４２をＥａｇＩおよびＸｍａＩで切断後、５．２ｋｂの大きい断片をゲルから切り出して精製し、これらを連結して得られたプラスミドをｐＧＥＴＳ１０３－ＲＣ２と命名した（図５）。ｐＧＥＴＳ１０３－ＲＣ２をＳｂｆＩで切断後、制限酵素失活のためにフェノール処理およびエタノール沈殿を行い精製して得られた断片に、プラスミドｐＡＡＶ－ＣＭＶをＳｂｆＩで切断して得られた１．８ｋｂの断片を連結し、得られたプラスミドをｐＧＥＴＳ１０３－ＡＡＶ－ＲＣ２と命名した（図６）。さらにこれをＡａｒＩで切断して、短いＤＮＡ断片を取り除き、ここにプラスミドｐＨｅｌｐｅｒの９．０ｋｂのＢａｍＨＩ断片を連結し、事前に導入したＢａｍＨＩ－ＮｄｅＩ領域との連結でＶＡ領域が再生する方向にＢａｍＨＩ断片が導入されたものを選択することにより、３つのプラスミドを１つのプラスミドに統合したオールインワンの構造のｐＧＥＴＳ１０３－ＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒ－ＲＣ２を構築した（図７、配列番号２）。さらに、断片を単独で有するプラスミドを構築した。具体的には、ｐＧＥＴＳ１０３－ＶＡをＳｂｆＩで切断したものにプラスミドｐＡＡＶ－ＣＭＶをＳｂｆＩで切断して得られた１．８ｋｂの断片を連結して得られたプラスミドをｐＧＥＴＳ１０３－ＡＡＶと命名した（図８）。また、ｐＧＥＴＳ１０３－ＶＡをＡａｒＩで切断して、短いＤＮＡ断片を取り除き、ここにプラスミドｐＨｅｌｐｅｒの９．０ｋｂのＢａｍＨＩ断片を連結し、事前に導入したＢａｍＨＩ－ＮｄｅＩ領域との連結でＶＡ領域が再生する方向にＢａｍＨＩ断片が導入されたものを選択することにより、ｐＧＥＴＳ１０３－Ｈｅｌｐｅｒを構築した（図９）。
【0154】
大腸菌形質転換法
溶解した大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル５０μｌを氷上に準備した１．５ｍｌの遠心チューブに移し、これに組換えプラスミドを最大で５μｌとなるように添加し、氷上に１５分静置後、４２℃の温浴で４５秒インキュベーション後、氷上に戻して２分経過後に、コンピテントセルに付属しているＳＯＣ培地を２００μｌ添加し、回転培養装置（ＲＴ－５０に試験管用培養ホルダーＳＡ－１８１１を搭載、タイテック（大阪））にセットし、３０ｒｐｍの回転速度で３７℃で１時間培養した。その後、これを、カルベニシリン入りＬＢ培地寒天プレートに塗抹し、３７℃で一晩培養した。
溶解した大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル５０μｌを氷上に準備した１．５ｍｌの遠心チューブに移し、これに組換えプラスミドを最大で５μｌとなるように添加し、氷上に１５分静置後、４２℃の温浴で４５秒インキュベーション後、氷上に戻して２分経過後に、コンピテントセルに付属しているＳＯＣ培地を２００μｌ添加し、回転培養装置（ＲＴ－５０に試験管用培養ホルダーＳＡ－１８１１を搭載、タイテック（大阪））にセットし、３０ｒｐｍの回転速度で３７℃で１時間培養した。その後、これを、カルベニシリン入りＬＢ培地寒天プレートに塗抹し、３７℃で一晩培養した。
【0155】
枯草菌形質転換法
Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）の１４ｍｌ試験管（２０５１）にＬＢ培地２ｍｌを入れ、そこに、－７０℃で保存したグリセロールストックの枯草菌を植菌し、回転培養装置で回転しながら、３７℃で１７時間培養した。新しい１４ｍｌ試験管（Ｆａｌｃｏｎ ２０５１）にＴＦ－Ｉ培地を９００μｌ分注し、２５μｌの２％カザミノ酸を添加し、５０μｌの上記培養液を添加し、回転培養装置で回転しながら、３７℃で４時間培養した。その後、新しい１４ｍｌ試験管にＴＦ－ＩＩ培地を９００μｌ分注し、１００μｌのＴＦ－Ｉ培養液を添加し、回転培養装置で回転しながら、３７℃で１．５時間培養した。１．５ｍｌの遠心チューブにＴＦ－ＩＩ培養液を１００μｌ入れ、８μｌの組換えプラスミドを添加した。回転培養装置で回転しながら、３７℃で３０分培養した後、ＬＢ培地を３００μｌ添加し、さらに回転培養装置で回転しながら、３７℃で１時間培養した。その後、培養物を、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地寒天プレート上に広げて、３７℃で一晩インキュベーションすることで、形質転換体を得た。
Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）の１４ｍｌ試験管（２０５１）にＬＢ培地２ｍｌを入れ、そこに、－７０℃で保存したグリセロールストックの枯草菌を植菌し、回転培養装置で回転しながら、３７℃で１７時間培養した。新しい１４ｍｌ試験管（Ｆａｌｃｏｎ ２０５１）にＴＦ－Ｉ培地を９００μｌ分注し、２５μｌの２％カザミノ酸を添加し、５０μｌの上記培養液を添加し、回転培養装置で回転しながら、３７℃で４時間培養した。その後、新しい１４ｍｌ試験管にＴＦ－ＩＩ培地を９００μｌ分注し、１００μｌのＴＦ－Ｉ培養液を添加し、回転培養装置で回転しながら、３７℃で１．５時間培養した。１．５ｍｌの遠心チューブにＴＦ－ＩＩ培養液を１００μｌ入れ、８μｌの組換えプラスミドを添加した。回転培養装置で回転しながら、３７℃で３０分培養した後、ＬＢ培地を３００μｌ添加し、さらに回転培養装置で回転しながら、３７℃で１時間培養した。その後、培養物を、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地寒天プレート上に広げて、３７℃で一晩インキュベーションすることで、形質転換体を得た。
【0156】
大腸菌のプラスミド少量調製
大腸菌内で構築した組換えプラスミドの構造確認のための少量精製は、キアゲンのＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ、および自動化装置であるＱＩＡ ｃｕｂｅを用いてマニュアルに従い行った。
大腸菌内で構築した組換えプラスミドの構造確認のための少量精製は、キアゲンのＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ、および自動化装置であるＱＩＡ ｃｕｂｅを用いてマニュアルに従い行った。
【0157】
枯草菌および大腸菌からのプラスミド大量調製法
塩化セシウムーエチジウムブロマイド密度勾配超遠心法により高純度のプラスミドＤＮＡを調達した。以下は、ＬＢ培地２００ｍｌの場合の精製方法を示すが、２００ｍｌを超える場合は、２００ｍｌごとに以下の操作を繰り返して行った。ＬＢ培地に抗生物質（テトラサイクリン）を加えたものを２００ｍｌ用意し、５００ｍｌの三角フラスコに１００ｍｌずつ入れて、大腸菌もしくは枯草菌プラスミド保持株を接種し、３７℃で終夜培養した。
塩化セシウムーエチジウムブロマイド密度勾配超遠心法により高純度のプラスミドＤＮＡを調達した。以下は、ＬＢ培地２００ｍｌの場合の精製方法を示すが、２００ｍｌを超える場合は、２００ｍｌごとに以下の操作を繰り返して行った。ＬＢ培地に抗生物質（テトラサイクリン）を加えたものを２００ｍｌ用意し、５００ｍｌの三角フラスコに１００ｍｌずつ入れて、大腸菌もしくは枯草菌プラスミド保持株を接種し、３７℃で終夜培養した。
【0158】
培養終了後、５０ｍｌずつ５０ｍｌチューブ（ファルコン２０７０）４本に分注し、５，０００×ｇで１０分間遠心した。上清を捨てて、菌ペレットをボルテックスにより完全にほぐした。１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、および１０ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ添加Ｐ１溶液を用意し、菌を入れたチューブ４本にそれぞれ５ｍｌずつ添加し、よく混合した。これを室温で５分間インキュベーションした。４本のチューブにそれぞれＰ２を５ｍｌずつ添加し、ゆっくりと混合し、室温で５分間インキュベーションした。さらに、Ｐ３を５ｍｌずつ添加し、白濁物質が均等に分散できるようにある程度強い力で混合した。５，０００×ｇで１０分間遠心して、上清をピペットで吸い、新しい４本のネジ蓋の５０ｍｌチューブ（ファルコン２０７０）に移した。それぞれのチューブに５ｍｌのフェノール飽和ＴＥを添加し、激しく混合した。５，０００×ｇで１０分間遠心して、上清をピペットで吸い、新しい４本のネジ蓋の５０ｍｌチューブ（ファルコン２０７０）に移した。１００％エタノールをそれぞれ２０ｍｌ添加し混合して、５，０００×ｇで１０分間遠心し、上清を取り除いた。沈殿に５．４ｍｌのＴＥを添加し、完全に溶解した。次に、６．４０ｇの塩化セシウムを投入し、完全に溶解した。更に、１．１ｇ／ｍｌの塩化セシウム溶液（１．１ｇの塩化セシウムと１ｍｌの水を混ぜて作製した溶液であり、体積調整せず）を２．６ｍｌ添加した。最後に、１０ｍｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド溶液を６００μｌ添加し、よく混合した。超遠心チューブ（ベックマン３６２１８１）１本に中身を移した。バランスとの重さの違いが２０ｍｇ以内になるように、水、あるいは１．１ｇ／ｍｌ塩化セシウム溶液（比重約１．５ｇ／ｍｌ程度）を添加して重さを微調整した。超遠心装置（ベックマンコールター）で以下の条件で遠心を行った。温度：１８℃、速度：５０，０００ｒｐｍ、加速度：Ｍａｘ、減速度：Ｍａｘ。１５時間以上遠心した。
【0159】
遠心終了後、紫外線（３６５ｎｍ）観察下で、針（２１Ｇ×５／８”）をセットした１ｍｌのシリンジでｃｃｃ型のプラスミドのバンドに挿し、プラスミド溶液を回収し、１５ｍｌチューブに移した。ここにＰ３を５００μｌ添加し、次に、全体が３ｍｌになるように水を添加した。さらに、９ｍｌの１００％エタノールを添加した。５，０００×ｇで１０分間遠心し、上清を取り除いた。得られた沈殿に７００μｌのＴＥを１５ｍｌチューブに添加し、ＤＮＡを溶解した。これを１．５ｍｌのチューブに移し、６００μｌの１－ブタノールを添加して混合し、２０，０００×ｇで１０秒程度遠心して、２層に分離し、上層のブタノール層を捨てた。新たに、６００μｌの１－ブタノールを添加して混合し、２０，０００×ｇで１０秒程度遠心して、２層に分離し、上層のブタノール層を捨てた。この操作を、水層が２００μｌ以下になるまで続けた。水層が２００μｌ以下になったら、１ｍｌのＰＢ（キアゲン）を添加し、よく混合し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔのスピンカラムに、６００μｌのＰＢ混合物をアプライし、２０，０００×ｇで１分間遠心した。フロースルーを捨てて、残りの６００μｌのＰＢ混合物を上記カラムに再アプライし、２０，０００×ｇで１分間遠心した。フロースルーを捨てて、カラムを再度コレクションチューブにセットし、ＰＥを７００μｌアプライし、２０，０００×ｇで１分間遠心した（１回目）。再度フロースルーを捨てて、カラムを再度コレクションチューブにセットし、ＰＥを７００μｌアプライし、２０，０００×ｇで１分間遠心した（２回目）。フロースルーを捨てて、カラムを再度コレクションチューブにセットし、ＰＥ（キアゲン）を７００μｌアプライし、２０，０００×ｇで１分間遠心した（３回目）。フロースルーを捨てて、カラムを再度コレクションチューブにセットし、空の状態で、２０，０００×ｇで１分間遠心し、残渣を完全に払い落とした。ＴＥを５０μｌアプライし、室温で１分間インキュベーション後、２０，０００×ｇで１分間遠心し、プラスミドを溶出した。
【0160】
ＮａｎｏＤｒｏｐに溶出物１μｌをアプライし、濃度、純度を測定した。濃度 数十ｎｇ／μｌ、純度２６０／２８０＝１．８～２．０、２６０／２３０＝２．０～３．０であることを確認した。２６．２μｌのサンプルを１５８μｌのサンプルに溶解し、８μｌずつ以下の制限酵素で消化して構造を確認した；切断せず、ＢａｍＨＩ－ＨＦ、ＢｇｌＩＩ（ＮＥＢ３．１）、ＥｃｏＲＩ－ＨＦ、ＥｃｏＲＶ－ＨＦ、ＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦ、ＫｐｎＩ－ＨＦ、ＮｏｔＩ－ＨＦ、ＰｓｔＩ－ＨＦ、ＰｖｕＩＩ－ＨＦ、ＳａｃＩ－ＨＦ、ＳａｌＩ－ＨＦ、ＳｆｉＩ、ＳｍａＩ、ＸｂａＩ（ＢｇｌＩＩ以外は、ＣｕｔＳｍａｒｔ ｂｕｆｆｅｒ）。
【0161】
（実施例２：増幅したベクタープラスミドからのＡＡＶベクターの生産）
大腸菌および枯草菌で増幅したベクタープラスミドをプロデューサー細胞に導入し、ＡＡＶベクターを生産させた。この実施例の実験は、ＳｉｇｎａＧｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国）に依頼して実施した。
大腸菌および枯草菌で増幅したベクタープラスミドをプロデューサー細胞に導入し、ＡＡＶベクターを生産させた。この実施例の実験は、ＳｉｇｎａＧｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国）に依頼して実施した。
【0162】
大腸菌または枯草菌で増幅したｐＧＥＴＳ１０３－ＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒ－ＲＣ２（１．１９ｘ１０１３コピー）、大腸菌または枯草菌で増幅したｐＧＥＴＳ１０３－ＡＡＶ：ｐＧＥＴＳ１０３－Ｈｅｌｐｅｒ：ｐＧＥＴＳ１０３－ＲＣ２＝１：１：１（合計１．１９ｘ１０１３コピー）、あるいは大腸菌で増幅したｐＡＡＶ－ＣＭＶ：ｐＨｅｌｐｅｒ：ｐＲＣ２－ｍｉ３４２＝１：１：１（合計１．１９ｘ１０１３コピー）をトラスフェクションに使用した。これらのプラスミドＤＮＡに対して、２．７倍（重量比）量のＰｏｌｙＪｅｔ（商標）試薬を混合した。調製したＤＮＡ複合体を、培養した２ｘ１０８細胞のＨＥＫ２９３細胞（継代数１２）にトランスフェクションし、さらに５時間培養を続けた。トランスフェクションした細胞を回収し、３回凍結融解した後、３７℃で１時間、Ｂｅｎｚｏｎａｚｅ（登録商標）で処理した。１２５００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行い、上清を回収した。次に、２８０００ｒｐｍで１８時間塩化セシウム密度勾配超遠心を行った後、ｒＡＡＶ（組換えアデノ随伴ウイルスベクター粒子）を回収し、０．００１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８を含むＰＢＳで分散させた。
【0163】
作製したｒＡＡＶのゲノムコピータイターを、定量ＰＣＲを用いて定量した。各ｒＡＡＶをＤＮａｓｅＩで処理した後、プロテイナーゼＫを用いてＤＮａｓｅＩを不活性化した。９８℃で１５分間加熱処理し、カプシドを変性させ、検量線の範囲におさまるよう希釈を行った後、定量ＰＣＲで測定した。ターゲットはＩＴＲとし、５’－ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ－３’（配列番号６７）および５’－ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ－３’（配列番号６８）の配列のプライマーを使用した。また、ｒＡＡＶ分散液に含まれるエンドトキシン量を、Ｐｉｅｒｃｅ ＬＡＬ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Thermo Fisher Scientific、米国）を用いて定量した。
【表1】
【0164】
各プラスミド条件において生産されたｒＡＡＶウイルスゲノム量［ＶＧ／ｍＬ］およびエンドトキシン量［Ｕｎｉｔ／ｍＬ］を測定した。全ての条件においてｒＡＡＶウイルスの生産が同様に確認された。いずれの条件においてもエンドトキシンは検出されなかった。
【0165】
（実施例３：構築したプラスミドＤＮＡのＣＣＣ純度）
ｒＡＡＶの作製に用いたプラスミドＤＮＡのＣＣＣ（covalently closed circular）純度を、Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ Ｐｌｕｓ（ＳＣＩＥＸ）およびｄｓＤＮＡ １０００ ｋｉｔ（AB ＳＣＩＥＸ、東京）を用いて定量した。キットに含まれるゲル粉末に超純水を２０ｍＬ加え、終夜撹拌した。ゲルが完全に溶解したことを確認し、１ｘＴＢＥ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で１０倍希釈した。希釈したゲルに、０．０１ｖｏｌ％となるようＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｇｅｌ ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を加えた後、キャピラリーにゲルを充填した。各プラスミドＤＮＡは、超純水で１０ｎｇ／μＬに調整し、Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ Ｐｌｕｓを用いて測定した。
ｒＡＡＶの作製に用いたプラスミドＤＮＡのＣＣＣ（covalently closed circular）純度を、Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ Ｐｌｕｓ（ＳＣＩＥＸ）およびｄｓＤＮＡ １０００ ｋｉｔ（AB ＳＣＩＥＸ、東京）を用いて定量した。キットに含まれるゲル粉末に超純水を２０ｍＬ加え、終夜撹拌した。ゲルが完全に溶解したことを確認し、１ｘＴＢＥ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で１０倍希釈した。希釈したゲルに、０．０１ｖｏｌ％となるようＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｇｅｌ ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を加えた後、キャピラリーにゲルを充填した。各プラスミドＤＮＡは、超純水で１０ｎｇ／μＬに調整し、Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ Ｐｌｕｓを用いて測定した。
【0166】
測定サンプルは、０．２ｐｓｉ、２秒でキャピラリーにインジェクションし、９．０ｋＶで２０分間電気泳動を行った。検出のために蛍光（励起波長：４８８ｎｍ、蛍光波長：５２０ｎｍ、Ｄｙｎａｍｉｃ ｒａｎｇｅ：１０００ＲＦＵ）を用いた。プラスミドＤＮＡのＣＣＣ純度は、ＣＣＣプラスミドＤＮＡのピーク面積値を、その他不純物も含めたピーク面積値の合計で除算することで算出した。
【0167】
結果を以下の表に示す。
【表2】
【0168】
ｐＧＥＴＳ１０３－ＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒ－ＲＣ２およびｐＧＥＴＳ１０３－ＲＣ２の両方のプラスミドについて、大腸菌よりも枯草菌においてＣＣＣ純度が高かった。本開示のプラスミドは、高いＣＣＣ純度を有し得る。ＦＤＡのガイダンスによると、ＣＣＣ純度は８０％を上回ることが定められているが、枯草菌を用いて生産したプラスミドは、高いＣＣＣ純度を有することが観察されたため、ＣＣＣ純度向上のための精製操作の負担及び製造コストを軽減することができる。ＣＣＣ純度はプラスミドＤＮＡの安定性、機能性、トランスフェクション効率にも関係するとされ、高いＣＣＣ純度のプラスミドＤＮＡは有用性が高い。
【0169】
（実施例４：完全ゲノムを含むｒＡＡＶの割合）
ＳｉｇｎａＧｅｎで凍結保存された各ｒＡＡＶを解凍し、Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて、ｒＡＡＶゲノムに対して定量ＰＣＲを行った。２５０Ｕ／ｍＬに調製したＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ）と作製したｒＡＡＶとを等量混合後、ＰＣＲ用サーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて３７℃で３０分間加熱した。次いで、０．０４ＭのＥＤＴＡバッファー（ｐＨ８．０、タカラバイオ）を添加し２倍希釈し、５５℃で３０分間加熱した。さらに、ヌクレアーゼフリーの水（Ｐｒｏｍｅｇａ）で２．５倍希釈し、９５℃で１０分間加熱した。最後に、ＴＥバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えて１０倍希釈を行い、抽出したｒＡＡＶゲノムを定量ＰＣＲ用のテンプレートとして用いた。
ＳｉｇｎａＧｅｎで凍結保存された各ｒＡＡＶを解凍し、Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて、ｒＡＡＶゲノムに対して定量ＰＣＲを行った。２５０Ｕ／ｍＬに調製したＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ）と作製したｒＡＡＶとを等量混合後、ＰＣＲ用サーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて３７℃で３０分間加熱した。次いで、０．０４ＭのＥＤＴＡバッファー（ｐＨ８．０、タカラバイオ）を添加し２倍希釈し、５５℃で３０分間加熱した。さらに、ヌクレアーゼフリーの水（Ｐｒｏｍｅｇａ）で２．５倍希釈し、９５℃で１０分間加熱した。最後に、ＴＥバッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えて１０倍希釈を行い、抽出したｒＡＡＶゲノムを定量ＰＣＲ用のテンプレートとして用いた。
【0170】
定量ＰＣＲの反応液は、プレート１ウェルあたりに、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＱＩＡｇｅｎ） １０μＬ、０．０１ｍＭプライマー（フォワード）１μＬ、０．０１ｍＭプライマー（リバース）１μＬ、水６μＬ、テンプレート２μＬを含み、シールでプレートを密閉後、定量ＰＣＲを行った。反応液は、ＩＴＲをターゲットとしたプライマー（フォワード：５’－ＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴ－３’（配列番号６７）、リバース：５’－ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡ－３’（配列番号６８））を含む反応液と、ＣＭＶをターゲットとしたプライマー（フォワード：５’－ＣＡＴＣＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＧＣ－３’（配列番号６９）、リバース：５’－ＧＧＡＧＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＡＴＴＴＴＧＧＡＡＡ－３’（配列番号７０））を含む反応液の二種類を調製した。
【0171】
ＰＣＲ条件は、９５℃で１５分間加熱した後、（１）９４℃で１５秒、（２）６０℃で３０秒、（３）７２℃で３０秒のサイクルを４０回繰り返した。検量線は、制限酵素でｐＡＡＶ－ＣＭＶ直線状にしたＤＮＡを用いて作成し、それぞれのＣｔ値からｒＡＡＶゲノムコピー濃度を算出した。完全ゲノムを含むｒＡＡＶの割合は、ＣＭＶをターゲットとして算出されたゲノムコピー濃度に対し、ＩＴＲをターゲットとして算出されたゲノムコピー数を除算することで算出した。
【0172】
結果を以下の表に示す。
【表3】
【0173】
ｒＡＡＶ＃１（オールインワン、枯草菌）およびｒＡＡＶ＃３（オールインワン、大腸菌）において特に完全ゲノムの割合が高かった。ゲノムはウイルス粒子内に核酸を含むため、ウイルスベクター作製後に完全ゲノム含有ウイルス粒子と不完全ゲノム含有ウイルス粒子とを分離することは困難であり、ウイルスベクター作製段階で高い割合で完全ゲノムを含むウイルス粒子を調製できることは非常に好ましい。本開示のプラスミドは、完全ゲノムを高効率に含有するウイルスベクターを提供し得る。
【0174】
（実施例５：マーカー遺伝子を含むｒＡＡＶの割合）
ＳｉｇｎａＧｅｎで凍結保存された各ｒＡＡＶを解凍し、Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ ｐｌｕｓを用いて、プラスミドバックボーンに含まれるＡｍｐｒ遺伝子に対して、定量ＰＣＲを行った。作製したｒＡＡＶにＴＥバッファーを加え３倍希釈した後、ＰＣＲ用サーマルサイクラーを用いて９５℃で１０分間加熱した液を、抽出したｒＡＡＶゲノムを定量ＰＣＲ用のテンプレートとして用いた。
ＳｉｇｎａＧｅｎで凍結保存された各ｒＡＡＶを解凍し、Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ ｐｌｕｓを用いて、プラスミドバックボーンに含まれるＡｍｐｒ遺伝子に対して、定量ＰＣＲを行った。作製したｒＡＡＶにＴＥバッファーを加え３倍希釈した後、ＰＣＲ用サーマルサイクラーを用いて９５℃で１０分間加熱した液を、抽出したｒＡＡＶゲノムを定量ＰＣＲ用のテンプレートとして用いた。
【0175】
定量ＰＣＲの反応液は、プレート１ウェルあたりに、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ １０μＬ、０．０１ｍＭプライマー（フォワード：５’－ＴＴＧＡＴＣＧＴＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧＡＧ－３’（配列番号７１））１μＬ、０．０１ｍＭプライマー（リバース：５’－ＴＴＧＴＴＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧ－３’（配列番号７２））１μＬ、水６μＬ、テンプレート２μＬを含み、シールでプレートを密閉した後、ＰＣＲを行った。
【0176】
ＰＣＲ条件は、９５℃で１５分間加熱した後、（１）９４℃で１５秒、（２）６０℃で３０秒、（３）７２℃で３０秒のサイクルを４０回繰り返した。検量線は、制限酵素でｐＡＡＶ－ＣＭＶを直線状にしたＤＮＡを用いて作成し、それぞれのＣｔ値からゲノムコピー濃度を算出した。マーカー遺伝子を含むｒＡＡＶの割合は、Ａｍｐｒをターゲットとして算出されたゲノムコピー濃度を、ＣＭＶをターゲットとして算出されたｒＡＡＶゲノムコピー数で除算することで算出した。
【0177】
結果を以下の表に示す。
【表4】
【0178】
ｒＡＡＶ＃１（オールインワン、枯草菌）およびｒＡＡＶ＃４（３種混合プラスミド、大腸菌）において特に不純物の割合が低かった。オールインワンの構造のプラスミドおよび枯草菌の組み合わせが優れていることが示唆された。
【0179】
（実施例６：空カプシドの割合）
ＳｉｇｎａＧｅｎで凍結保存された各ｒＡＡＶを解凍し、ＡＲＶＯ Ｘ５（パーキンエルマー）を用いて、ＥＬＩＳＡ法にてカプシド粒子濃度の定量を行った。定量キットには、ＡＡＶ２ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ ２．０Ｒ（ＰＲＯＧＥＮ）を利用し、プロトコルに基づき試験を実施した。キットに含まれる抗ＡＡＶ２抗体が固定化された９６ウェルプレートに、ｒＡＡＶおよび標準品（キットに含まれる空カプシド試薬）を１００μＬずつ添加した。３７℃で１時間静置後、液を廃棄し、２００μＬのアッセイバッファーで３回洗浄した。１００μＬのビオチン結合抗ＡＡＶ２抗体を添加し、３７℃で１時間静置後、液を廃棄し、２００μＬのアッセイバッファーで３回洗浄した。さらに、１００μＬのＨＲＰ標識済みのストレプトアビジンを添加し、３７℃で１時間静置後、液を廃棄し、２００μＬのアッセイバッファーで３回洗浄した。最後に、１００μＬのＴＭＢを添加し、室温で１５分間静置後、反応停止試薬を加えて、ＡＲＶＯ Ｘ５で吸光度（４５０ｎｍ、６５０ｎｍ）を測定した。
ＳｉｇｎａＧｅｎで凍結保存された各ｒＡＡＶを解凍し、ＡＲＶＯ Ｘ５（パーキンエルマー）を用いて、ＥＬＩＳＡ法にてカプシド粒子濃度の定量を行った。定量キットには、ＡＡＶ２ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ ２．０Ｒ（ＰＲＯＧＥＮ）を利用し、プロトコルに基づき試験を実施した。キットに含まれる抗ＡＡＶ２抗体が固定化された９６ウェルプレートに、ｒＡＡＶおよび標準品（キットに含まれる空カプシド試薬）を１００μＬずつ添加した。３７℃で１時間静置後、液を廃棄し、２００μＬのアッセイバッファーで３回洗浄した。１００μＬのビオチン結合抗ＡＡＶ２抗体を添加し、３７℃で１時間静置後、液を廃棄し、２００μＬのアッセイバッファーで３回洗浄した。さらに、１００μＬのＨＲＰ標識済みのストレプトアビジンを添加し、３７℃で１時間静置後、液を廃棄し、２００μＬのアッセイバッファーで３回洗浄した。最後に、１００μＬのＴＭＢを添加し、室温で１５分間静置後、反応停止試薬を加えて、ＡＲＶＯ Ｘ５で吸光度（４５０ｎｍ、６５０ｎｍ）を測定した。
【0180】
空カプシドの割合は、ＣＭＶをターゲットとして算出されたｒＡＡＶゲノムコピー濃度（ゲノムコピータイター）に対し、ＥＬＩＺＡ法で定量されたカプシド粒子濃度（ウイルス粒子タイター）で除した値を、１から差し引くことで算出した。
【0181】
結果を以下の表に示す。
【表5】
【0182】
ｒＡＡＶ＃１（オールインワン、枯草菌）において特に空カプシドの割合が低かった。空カプシドは免疫原性であり得るため、低減されることが好ましい。実施例２に記載されるように、ｒＡＡＶの取得の際に塩化セシウム密度勾配超遠心を行い、この操作により部分的に空カプシドが除かれている可能性はあるが、空カプシドは本質的に除去されていないと考えられる。カラムクロマトグラフィーを行っても、空カプシドの効率的な除去は通常困難であるため、上流工程で空カプシドの生成を低減させることが特に好ましい。しかし、本開示の方法で作製したウイルスベクターでは、特に空カプシドの割合が低く、高効率なウイルスベクターの生産が可能であり得る。そのため、僅かな密度の差に基づく分離法など労力を要し得る空カプシドの除去操作の負担が軽減され得る。
【0183】
（実施例７：ＯＧＡＢ法によるプラスミド構築）
ＯＧＡＢ法によりｐＧＥＴＳ１０３－ＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒ－ＲＣ２を構築した（図１０）。
ＯＧＡＢ法によりｐＧＥＴＳ１０３－ＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒ－ＲＣ２を構築した（図１０）。
【0184】
ＯＧＡＢ集積用ベクターＤＮＡの構築
プラスミドｐＧＥＴＳ１０３ΔＡａｒＩを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＴＥ飽和フェノール処理、ブタノール抽出、エタノール沈殿で精製し、これに配列番号３および４で示される一本鎖ＤＮＡをアニールして作製したリンカーＤＮＡを挿入して、ＯＧＡＢ集積用ベクターであるｐＧＥＴＳ１０３－ΔＡａｒＩ－Ｌｉｎｋｅｒを作製した。このプラスミドを制限酵素ＡａｒＩで切断し、低融点アガロースゲル電気泳動によりサイズ分離し、大きい１５ｋｂの断片をゲルから切り出し、精製して、ＯＧＡＢ集積用のベクター断片を取得した。
プラスミドｐＧＥＴＳ１０３ΔＡａｒＩを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＴＥ飽和フェノール処理、ブタノール抽出、エタノール沈殿で精製し、これに配列番号３および４で示される一本鎖ＤＮＡをアニールして作製したリンカーＤＮＡを挿入して、ＯＧＡＢ集積用ベクターであるｐＧＥＴＳ１０３－ΔＡａｒＩ－Ｌｉｎｋｅｒを作製した。このプラスミドを制限酵素ＡａｒＩで切断し、低融点アガロースゲル電気泳動によりサイズ分離し、大きい１５ｋｂの断片をゲルから切り出し、精製して、ＯＧＡＢ集積用のベクター断片を取得した。
【0185】
ＯＧＡＢ用集積断片の準備
ｐＧＥＴＳ１０３－ＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒ－ＲＣ２の塩基配列のうち、ベクター部分のｐＧＥＴＳ１０３の塩基配列を除くＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒ－ＲＣ２の領域（図１０）について、ＯＧＡＢ法による再構成が可能かどうかを検討した。まず、上記ＤＮＡ領域を図１０に示す２２個の断片に分割するように設計した。第３断片はＡＡＶ断片とＨｅｌｐｅｒ断片の境界の領域を含み、第１６断片はＨｅｌｐｅｒ断片とＲＣ２断片の境界の領域を含むため、第１、第３および第１６断片は、以下に示すように材料のＤＮＡを化学合成後、ＭＡＰ法（特願２０１８－９３０２４）により準備した。具体的には、第１断片については配列番号５～１０の、第３断片については配列番号１１～１６の、第１６断片については配列番号１７～２２の、一本鎖ＤＮＡを用いて、ＭＡＰ法によりアセンブリして得られた二本鎖ＤＮＡを用いた。残りの領域については、配列番号２３～６６に示す各断片の番号の付くＦとＲのプライマーの組み合わせを用いて、第２断片についてはｐＡＡＶ－ＣＭＶ Ｖｅｃｔｏｒを、第４～第１５断片はｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒを、第１７～第２２断片についてはｐＲＣ２－ｍｉ３４２ Ｖｅｃｔｏｒをテンプレートとして以下の条件によりＰＣＲにより増幅した。一反応あたり、１０μｌの２×Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒ ｍｉｘ（タカラバイオ）、１μｌのテンプレートＤＮＡ、両方のプライマーを３．２ｐｍｏｌずつ含む１μｌの溶液、８μｌの滅菌水を加えて、９６℃２分ののち、９８℃１０秒、５５℃１５秒、７２℃５秒のサイクルを３０サイクル行った。
ｐＧＥＴＳ１０３－ＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒ－ＲＣ２の塩基配列のうち、ベクター部分のｐＧＥＴＳ１０３の塩基配列を除くＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒ－ＲＣ２の領域（図１０）について、ＯＧＡＢ法による再構成が可能かどうかを検討した。まず、上記ＤＮＡ領域を図１０に示す２２個の断片に分割するように設計した。第３断片はＡＡＶ断片とＨｅｌｐｅｒ断片の境界の領域を含み、第１６断片はＨｅｌｐｅｒ断片とＲＣ２断片の境界の領域を含むため、第１、第３および第１６断片は、以下に示すように材料のＤＮＡを化学合成後、ＭＡＰ法（特願２０１８－９３０２４）により準備した。具体的には、第１断片については配列番号５～１０の、第３断片については配列番号１１～１６の、第１６断片については配列番号１７～２２の、一本鎖ＤＮＡを用いて、ＭＡＰ法によりアセンブリして得られた二本鎖ＤＮＡを用いた。残りの領域については、配列番号２３～６６に示す各断片の番号の付くＦとＲのプライマーの組み合わせを用いて、第２断片についてはｐＡＡＶ－ＣＭＶ Ｖｅｃｔｏｒを、第４～第１５断片はｐＨｅｌｐｅｒ Ｖｅｃｔｏｒを、第１７～第２２断片についてはｐＲＣ２－ｍｉ３４２ Ｖｅｃｔｏｒをテンプレートとして以下の条件によりＰＣＲにより増幅した。一反応あたり、１０μｌの２×Ｐｒｉｍｅ Ｓｔａｒ ｍｉｘ（タカラバイオ）、１μｌのテンプレートＤＮＡ、両方のプライマーを３．２ｐｍｏｌずつ含む１μｌの溶液、８μｌの滅菌水を加えて、９６℃２分ののち、９８℃１０秒、５５℃１５秒、７２℃５秒のサイクルを３０サイクル行った。
【0186】
ＯＧＡＢ用集積断片のベクターへのクローニング
ＤＮＡ断片をＭＡＰ法、もしくはＰＣＲ法により得たのち、これらのＤＮＡをＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて精製し、最終的に１５μｌのＴＥ緩衝液（ナカライテスク）によりカラムから溶出した。得られたＤＮＡ溶液の１．４μｌに０．２μｌの１０×Ｅｘ－Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ）、０．２μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ（タカラバイオ）、０．２μｌの１０ｘＡ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を加えて、６０℃で１時間反応させた。その後、１μｌのｐＭＤ１９ ｓｉｍｐｌｅ（タカラバイオ）をＴＥ緩衝液で２０倍に希釈して、３μｌのＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞を加えて、１６℃で３時間ライゲーション反応を行い、大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ）を用いて形質転換を行った。終夜培養後、カルベニシリン入りＬＢプレートに出現したコロニーについて塩基配列を確認することで、それぞれの断片について正しい配列のクローンを取得した。
ＤＮＡ断片をＭＡＰ法、もしくはＰＣＲ法により得たのち、これらのＤＮＡをＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて精製し、最終的に１５μｌのＴＥ緩衝液（ナカライテスク）によりカラムから溶出した。得られたＤＮＡ溶液の１．４μｌに０．２μｌの１０×Ｅｘ－Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ）、０．２μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ（タカラバイオ）、０．２μｌの１０ｘＡ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を加えて、６０℃で１時間反応させた。その後、１μｌのｐＭＤ１９ ｓｉｍｐｌｅ（タカラバイオ）をＴＥ緩衝液で２０倍に希釈して、３μｌのＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞を加えて、１６℃で３時間ライゲーション反応を行い、大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ）を用いて形質転換を行った。終夜培養後、カルベニシリン入りＬＢプレートに出現したコロニーについて塩基配列を確認することで、それぞれの断片について正しい配列のクローンを取得した。
【0187】
ＯＧＡＢ用断片の等モル混合物の調整
これらのクローンを持つ大腸菌を２ｍｌのＬＢ培地で増殖後、その９００μｌを用いてＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン）により、自動化システムＱＩＡｃｕｂｅによりプラスミドを精製し、最終的に３０μｌのＴＥ緩衝液に溶出した。そのうちの２．５μｇ相当のプラスミドＤＮＡを含む溶液を５０μｌになるようにＴＥ緩衝液を添加した。さらにそこに、６μｌの１０ＸＰｌａｓｍｉｄ ｓａｆｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、２．４μｌの２５ｍＭ ＡＴＰ、２μｌのＰｌａｓｍｉｄ－Ｓａｆｅ ＡＴＰ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮａｓｅ （ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を加えて、３７℃１時間反応後、７０℃３０分失活させることで、環状構造以外のＤＮＡを分解した。その後、反応液をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製し、最終的に１５μｌのＴＥ緩衝液（ナカライテスク）によりカラムから溶出した。得られたＤＮＡ溶液を微量分光光度計（Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ Ｏｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて測定し、１００ｎｇ／μｌとなるようにＴＥ緩衝液を加えて希釈した。その後、再度濃度を測定し、正確に５００ｎｇのＤＮＡを分取する際に必要なＤＮＡ体積を小数点以下２桁μｌまで計算して、マイクロピペットにより分取することで各プラスミドの等モル分取を行った。分取したＤＮＡ溶液は、その後に使用する制限酵素の種類により２つの１．５ｍｌの遠心チューブに分けてプールした。第１、３、５、７、９、１１、１３、１４，１７、１９、２１断片をクローン化するプラスミドは、制限酵素ＡａｒＩで切断するチューブへ、第２、４、６、８、１０、１２，１５、１６、１８、２０、２２断片をクローン化するプラスミドは、制限酵素ＢｓａＩで切断するグループにそれぞれプールした。その後、ＡａｒＩで切断するチューブには、各プラスミドの容積の合計を１体積とした場合に、１．９４体積の滅菌水、０．３３体積の１０×Ｂｕｆｆｅｒ ＡａｒＩ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、０．０６体積の５０×オリゴヌクレオチド（０．０２５ｍＭ）、０．１７体積のＡａｒＩ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を加えて３７℃で２時間反応させた。また、ＢｓａＩで切断するチューブには、各プラスミドの容積の合計を１体積とした場合に、２体積の滅菌水、０．３３体積の１０ＸＣｕｔＳｍａｒｔ ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）、０．１７体積のＢｓａＩ－ＨＦ ｖ２を加えて３７℃で２時間反応させた。それぞれのチューブに制限酵素反応液と等量のＴＥ飽和フェノールを添加して、よく混合することで制限酵素を失活させた後、乳化した状態のフェノールとＤＮＡ溶液の混合物を一つの２ｍｌ遠心チューブに統合して、２０，０００×ｇで１０分間遠心し、フェノール相と水相とに分離した。上層を新しいチューブに移して、そこに等量の１－ブタノールを加え、よく撹拌し、２０，０００×ｇで１分間遠心した。その後、上層をピペットで吸って取り除き、下層の体積が４５０μｌ以下になるまで、再度等量の１－ブタノールを加えて、遠心、上層を捨てる、の操作を繰り返した。その後、５０μｌのＰ３バッファーを加えて、９００μｌのエタノールを加え、２０，０００×ｇで１０分間遠心した。沈殿を失わないように上清を捨てたのち、９００μｌの７０％エタノールでリンス後、上清をピペットで吸って捨てた。その後、再度遠心し、残っている上清を底部に集めて、ピペットで完全に液体を取り除いた。直ちに、ＴＥ５０μｌを加えて沈殿を５分間タッピングすることで完全に溶解した。その後、低融点アガロースゲルによる電気泳動によりｐＭＤ１９から切り出された約７５０ｂｐの２２種類の断片の等モル混合物をサイズ分画し、実施例１に記載の電気泳動ゲルからのＤＮＡ断片の切り出しと精製の方法に従って、２２種類の断片の混合物を精製した。
これらのクローンを持つ大腸菌を２ｍｌのＬＢ培地で増殖後、その９００μｌを用いてＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン）により、自動化システムＱＩＡｃｕｂｅによりプラスミドを精製し、最終的に３０μｌのＴＥ緩衝液に溶出した。そのうちの２．５μｇ相当のプラスミドＤＮＡを含む溶液を５０μｌになるようにＴＥ緩衝液を添加した。さらにそこに、６μｌの１０ＸＰｌａｓｍｉｄ ｓａｆｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、２．４μｌの２５ｍＭ ＡＴＰ、２μｌのＰｌａｓｍｉｄ－Ｓａｆｅ ＡＴＰ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮａｓｅ （ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を加えて、３７℃１時間反応後、７０℃３０分失活させることで、環状構造以外のＤＮＡを分解した。その後、反応液をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製し、最終的に１５μｌのＴＥ緩衝液（ナカライテスク）によりカラムから溶出した。得られたＤＮＡ溶液を微量分光光度計（Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ Ｏｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて測定し、１００ｎｇ／μｌとなるようにＴＥ緩衝液を加えて希釈した。その後、再度濃度を測定し、正確に５００ｎｇのＤＮＡを分取する際に必要なＤＮＡ体積を小数点以下２桁μｌまで計算して、マイクロピペットにより分取することで各プラスミドの等モル分取を行った。分取したＤＮＡ溶液は、その後に使用する制限酵素の種類により２つの１．５ｍｌの遠心チューブに分けてプールした。第１、３、５、７、９、１１、１３、１４，１７、１９、２１断片をクローン化するプラスミドは、制限酵素ＡａｒＩで切断するチューブへ、第２、４、６、８、１０、１２，１５、１６、１８、２０、２２断片をクローン化するプラスミドは、制限酵素ＢｓａＩで切断するグループにそれぞれプールした。その後、ＡａｒＩで切断するチューブには、各プラスミドの容積の合計を１体積とした場合に、１．９４体積の滅菌水、０．３３体積の１０×Ｂｕｆｆｅｒ ＡａｒＩ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、０．０６体積の５０×オリゴヌクレオチド（０．０２５ｍＭ）、０．１７体積のＡａｒＩ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を加えて３７℃で２時間反応させた。また、ＢｓａＩで切断するチューブには、各プラスミドの容積の合計を１体積とした場合に、２体積の滅菌水、０．３３体積の１０ＸＣｕｔＳｍａｒｔ ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）、０．１７体積のＢｓａＩ－ＨＦ ｖ２を加えて３７℃で２時間反応させた。それぞれのチューブに制限酵素反応液と等量のＴＥ飽和フェノールを添加して、よく混合することで制限酵素を失活させた後、乳化した状態のフェノールとＤＮＡ溶液の混合物を一つの２ｍｌ遠心チューブに統合して、２０，０００×ｇで１０分間遠心し、フェノール相と水相とに分離した。上層を新しいチューブに移して、そこに等量の１－ブタノールを加え、よく撹拌し、２０，０００×ｇで１分間遠心した。その後、上層をピペットで吸って取り除き、下層の体積が４５０μｌ以下になるまで、再度等量の１－ブタノールを加えて、遠心、上層を捨てる、の操作を繰り返した。その後、５０μｌのＰ３バッファーを加えて、９００μｌのエタノールを加え、２０，０００×ｇで１０分間遠心した。沈殿を失わないように上清を捨てたのち、９００μｌの７０％エタノールでリンス後、上清をピペットで吸って捨てた。その後、再度遠心し、残っている上清を底部に集めて、ピペットで完全に液体を取り除いた。直ちに、ＴＥ５０μｌを加えて沈殿を５分間タッピングすることで完全に溶解した。その後、低融点アガロースゲルによる電気泳動によりｐＭＤ１９から切り出された約７５０ｂｐの２２種類の断片の等モル混合物をサイズ分画し、実施例１に記載の電気泳動ゲルからのＤＮＡ断片の切り出しと精製の方法に従って、２２種類の断片の混合物を精製した。
【0188】
ＯＧＡＢ法によるｐＧＥＴＳ１０３－ＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒ－ＲＣ２再構成
その後、得られたＤＮＡ溶液の１ｆｍｏｌと、ＡａｒＩで切断し精製したｐＧＥＴＳ１０３ΔＡａｒＩ－Ｌｉｎｋｅｒの１ｆｍｏｌとに合計４μｌとなるようにＴＥ緩衝液を追加し、そこに５μｌの２×ライゲーションバッファー（１５％ポリエチレングリコール６０００、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１３２ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１３．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ ＡＴＰ）を添加してよく混合後、１μｌのＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ）を加え、３７℃で５時間インキュベーションした。ここに枯草菌コンピテントセル１００μｌを添加し、３７℃で、３０分ダックローターにより回転培養した。その後、３００μｌのＬＢ培地を添加して、３７℃で１時間ダックローターで回転培養し、その後、培養液を１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン（シグマアルドリッチ）入りＬＢプレートに広げ、３７℃で一晩培養した。コロニーは９４個得られた。
その後、得られたＤＮＡ溶液の１ｆｍｏｌと、ＡａｒＩで切断し精製したｐＧＥＴＳ１０３ΔＡａｒＩ－Ｌｉｎｋｅｒの１ｆｍｏｌとに合計４μｌとなるようにＴＥ緩衝液を追加し、そこに５μｌの２×ライゲーションバッファー（１５％ポリエチレングリコール６０００、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１３２ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１３．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＤＴＴ、０．２ｍＭ ＡＴＰ）を添加してよく混合後、１μｌのＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（タカラバイオ）を加え、３７℃で５時間インキュベーションした。ここに枯草菌コンピテントセル１００μｌを添加し、３７℃で、３０分ダックローターにより回転培養した。その後、３００μｌのＬＢ培地を添加して、３７℃で１時間ダックローターで回転培養し、その後、培養液を１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン（シグマアルドリッチ）入りＬＢプレートに広げ、３７℃で一晩培養した。コロニーは９４個得られた。
【0189】
形質転換体のプラスミド構造確認
ランダムに１２株のコロニーを選択して、２ｍｌの１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン入りＬＢ培地で一晩培養し、内部のプラスミドのコピー数を増幅するためにＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加して更に３７℃で３時間培養した。得られた菌体から以下の様に少量のプラスミド抽出を行った。９００μｌの菌液を１．５ｍｌ遠心チューブにとり、６８００×ｇで３分遠心し、上清をマイクロピペットで取り除いた。得られた菌体ペレットをよく懸濁後、１０ｍｇ／ｍｌの卵白リゾチーム（ｗａｋｏ）を含むＰ１バッファーを１００μｌ添加後、３７℃で５分間インキュベーションした。そこに、２００μｌのＰ２バッファーを加えて４回転倒混和した。その後、Ｐ３を１５０μｌ添加し、４回転倒混和した。これを２０，０００×ｇで、１０分間遠心することにより、白い沈殿と上清に分離した。上清を新しい１．５ｍｌ遠心チューブに移して、そこに、４５０μｌのＴＥ飽和フェノール（ナカライテスク）を添加し、良く混和した後、２０，０００×ｇで、１０分間遠心することにより、フェノール相と水相とに分離し、水相３２０μｌを新しいチューブに移して、そこに９００μｌのエタノールを加え、２０，０００×ｇで、１０分間遠心した。上清をマイクロピペットで取り除き、９００μｌの７０％エタノールを加え、チューブ全体をリンスした。その後、７０％エタノールをマイクロピペットで取り除き、得られた沈殿を２７μｌのＴＥ緩衝液で溶解した。得られたプラスミド溶液を８μｌとり、そこに１μｌの１０×３．１ ＮＥＢ ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）と、１μｌのＳｍａＩを添加し、３７℃で１時間反応後、アガロースゲル電気泳動により切断バターンを確認した。図１１に示すように、１２個中１個（クローン番号３）が期待した切断パターンを示した。このクローンについて、全塩基配列を決定したところ、ｐＧＥＴＳ１０３－ＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒ－ＲＣ２を再構成していることを確認した。
ランダムに１２株のコロニーを選択して、２ｍｌの１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン入りＬＢ培地で一晩培養し、内部のプラスミドのコピー数を増幅するためにＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加して更に３７℃で３時間培養した。得られた菌体から以下の様に少量のプラスミド抽出を行った。９００μｌの菌液を１．５ｍｌ遠心チューブにとり、６８００×ｇで３分遠心し、上清をマイクロピペットで取り除いた。得られた菌体ペレットをよく懸濁後、１０ｍｇ／ｍｌの卵白リゾチーム（ｗａｋｏ）を含むＰ１バッファーを１００μｌ添加後、３７℃で５分間インキュベーションした。そこに、２００μｌのＰ２バッファーを加えて４回転倒混和した。その後、Ｐ３を１５０μｌ添加し、４回転倒混和した。これを２０，０００×ｇで、１０分間遠心することにより、白い沈殿と上清に分離した。上清を新しい１．５ｍｌ遠心チューブに移して、そこに、４５０μｌのＴＥ飽和フェノール（ナカライテスク）を添加し、良く混和した後、２０，０００×ｇで、１０分間遠心することにより、フェノール相と水相とに分離し、水相３２０μｌを新しいチューブに移して、そこに９００μｌのエタノールを加え、２０，０００×ｇで、１０分間遠心した。上清をマイクロピペットで取り除き、９００μｌの７０％エタノールを加え、チューブ全体をリンスした。その後、７０％エタノールをマイクロピペットで取り除き、得られた沈殿を２７μｌのＴＥ緩衝液で溶解した。得られたプラスミド溶液を８μｌとり、そこに１μｌの１０×３．１ ＮＥＢ ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）と、１μｌのＳｍａＩを添加し、３７℃で１時間反応後、アガロースゲル電気泳動により切断バターンを確認した。図１１に示すように、１２個中１個（クローン番号３）が期待した切断パターンを示した。このクローンについて、全塩基配列を決定したところ、ｐＧＥＴＳ１０３－ＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒ－ＲＣ２を再構成していることを確認した。
【0190】
（実施例８：様々なＡＡＶオールインワンベクタープラスミドの構築）
同様に、ＡＡＶウイルスベクターを生産するためのオールインワン構造の７種類のベクタープラスミドを、他の血清型のＡＡＶゲノムおよびアデノウイルスゲノムから取得した構成要素を使用して構築した。ｐＧＥＴＳ１１８－ＡａｒＩ（Tsuge, K., Sato, Y., Kobayashi, Y.,Gondo,M., Hasebe,M., Togashi,T., Tomita, M., and Itaya, M. Method of preparing an equimolar DNA mixture for one-step DNA assembly of over 50 fragments. Sci Rep 5, 10655 (2015).）に基づき各プラスミドを構築した（図１６に模式図を示す）。ベクタープラスミドの各々において使用したＩＴＲ、Ｒｅｐ、ＣａｐおよびＨｅｌｐｅｒ（ＶＡ、Ｅ２ＡおよびＥ４）の由来となるウイルスゲノムの血清型を以下の表に示す（図１７も参照のこと）。
*1のベクタープラスミドは、上記実施例のものである（ｐＧＥＴＳ１０３－ＡＡＶ－Ｈｅｌｐｅｒ－ＲＣ２）。
AAV：アデノ随伴ウイルス血清型
Ad：アデノウイルス血清型および群
同様に、ＡＡＶウイルスベクターを生産するためのオールインワン構造の７種類のベクタープラスミドを、他の血清型のＡＡＶゲノムおよびアデノウイルスゲノムから取得した構成要素を使用して構築した。ｐＧＥＴＳ１１８－ＡａｒＩ（Tsuge, K., Sato, Y., Kobayashi, Y.,Gondo,M., Hasebe,M., Togashi,T., Tomita, M., and Itaya, M. Method of preparing an equimolar DNA mixture for one-step DNA assembly of over 50 fragments. Sci Rep 5, 10655 (2015).）に基づき各プラスミドを構築した（図１６に模式図を示す）。ベクタープラスミドの各々において使用したＩＴＲ、Ｒｅｐ、ＣａｐおよびＨｅｌｐｅｒ（ＶＡ、Ｅ２ＡおよびＥ４）の由来となるウイルスゲノムの血清型を以下の表に示す（図１７も参照のこと）。
【表6】
AAV：アデノ随伴ウイルス血清型
Ad：アデノウイルス血清型および群
【0191】
上記のそれぞれのオールインワン核酸（全長１５～１６ｋｂ）を設計し、その長さに応じて１８～１９個の単位ＤＮＡ断片（７００～９００ｂｐ）を含むＤＮＡ断片を化学合成した。これらのＤＮＡ断片を、ＡａｒＩ、ＢｂｓＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩのいずれかの制限酵素により切り出して単位ＤＮＡ断片を調製した。これらの単位ＤＮＡ断片をＡａｒＩで切断したｐＧＥＴＳ１１８とタンデムリピートに連結し、その後、上の実施例と同様にＯＧＡＢ法により枯草菌において環状のプラスミドを形成させた。その結果、上記の追加の７種類のＡＡＶのオールインワン構造のベクタープラスミドの構築が確認された。
【0192】
これらのプラスミドを培養細胞（プロデューサー細胞）に導入することにより、それぞれのウイルスベクターが生産されることを確認した（図１８）。
【0193】
（実施例９：アデノウイルスオールインワンベクタープラスミドの構築）
アデノウイルスベクターＡｄ５について、タカラバイオ社のｐＡｘＣＡｗｔｉｔ２にＧＩＯ遺伝子を導入した全長約３６ｋｂのアデノウイルスベクターを生産するためのオールインワン構造を設計した（図１９）。これを４０個の約８００ｂｐに分割し、ＰＣＲまたは化学合成により単位ＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片を調製した。これらのＤＮＡ断片を、ＡａｒＩ、ＢｂｓＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩのいずれかの制限酵素により切り出して単位ＤＮＡ断片を調製した。その後、ＡａｒＩで切断したｐＧＥＴＳ１１８－ＡａｒＩ、またはｐＢＥＴ１３１（Tanaka, T., and M. Ogura.1998. A novel Bacillus natto plasmid pLS32 capable of replication in Bacillus subtilis. FEBS Lett.422:243-246）のＢａｍＨＩサイトにリンカーＤＮＡを導入して新たなＡａｒＩサイトを２か所導入したｐＢＥＴ１３１―ＡａｒＩ(図２０）をＡａｒＩで切断して得られる２つの大きい断片とタンデムリピートに連結し、その後、上の実施例と同様にＯＧＡＢ法により枯草菌において環状のプラスミドを形成させた。その結果、アデノウイルスベクターを生産するためのオールインワン構造を有するクローンの構築が確認された。
アデノウイルスベクターＡｄ５について、タカラバイオ社のｐＡｘＣＡｗｔｉｔ２にＧＩＯ遺伝子を導入した全長約３６ｋｂのアデノウイルスベクターを生産するためのオールインワン構造を設計した（図１９）。これを４０個の約８００ｂｐに分割し、ＰＣＲまたは化学合成により単位ＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片を調製した。これらのＤＮＡ断片を、ＡａｒＩ、ＢｂｓＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩのいずれかの制限酵素により切り出して単位ＤＮＡ断片を調製した。その後、ＡａｒＩで切断したｐＧＥＴＳ１１８－ＡａｒＩ、またはｐＢＥＴ１３１（Tanaka, T., and M. Ogura.1998. A novel Bacillus natto plasmid pLS32 capable of replication in Bacillus subtilis. FEBS Lett.422:243-246）のＢａｍＨＩサイトにリンカーＤＮＡを導入して新たなＡａｒＩサイトを２か所導入したｐＢＥＴ１３１―ＡａｒＩ(図２０）をＡａｒＩで切断して得られる２つの大きい断片とタンデムリピートに連結し、その後、上の実施例と同様にＯＧＡＢ法により枯草菌において環状のプラスミドを形成させた。その結果、アデノウイルスベクターを生産するためのオールインワン構造を有するクローンの構築が確認された。
【0194】
（実施例１０：さらなるＡＡＶウイルスオールインワンベクタープラスミドの構造例）
図２１～２６に示すＡＡＶウイルスオールインワンベクタープラスミドも企図される。
・図２１は、ｐＧＥＴＳ１０３－ΔＡａｒＩに基づくＡＡＶ１のＲｅｐおよびＡＡＶ６のＣａｐを使用した構築例である。
・図２２は、ｐＧＥＴＳ１０３－ΔＡａｒＩに基づくＣＡＧプロモーター、ＡＡＶ５のＲｅｐおよびＡＡＶ１のＣａｐを使用した構築例である。
・図２３は、ｐＧＥＴＳ１０３－ΔＡａｒＩに基づくＥＦ１αプロモーター、ＡＡＶ８のＲｅｐおよびＡＡＶ９のＣａｐを使用した構築例である。
・図２４は、ｐＧＥＴＳ１０３－ΔＡａｒＩに基づくＳＶ４０プロモーターを使用し、Ｒｅｐ、ＣａｐおよびＨｅｌｐｅｒを異なる順序で配置した構築例である。
・図２５は、ｐＧＥＴＳ１３１－ＡａｒＩに基づくＲｅｐ、ＣａｐおよびＨｅｌｐｅｒを異なる順序で配置した構築例である。
・図２６は、ｐＢＥＴＳ１０３－ΔＡａｒＩに基づくＨｅｌｐｅｒ遺伝子の要素を変更した（他の要素と分離してアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂを追加した）構築例である。
図２１～２６に示すＡＡＶウイルスオールインワンベクタープラスミドも企図される。
・図２１は、ｐＧＥＴＳ１０３－ΔＡａｒＩに基づくＡＡＶ１のＲｅｐおよびＡＡＶ６のＣａｐを使用した構築例である。
・図２２は、ｐＧＥＴＳ１０３－ΔＡａｒＩに基づくＣＡＧプロモーター、ＡＡＶ５のＲｅｐおよびＡＡＶ１のＣａｐを使用した構築例である。
・図２３は、ｐＧＥＴＳ１０３－ΔＡａｒＩに基づくＥＦ１αプロモーター、ＡＡＶ８のＲｅｐおよびＡＡＶ９のＣａｐを使用した構築例である。
・図２４は、ｐＧＥＴＳ１０３－ΔＡａｒＩに基づくＳＶ４０プロモーターを使用し、Ｒｅｐ、ＣａｐおよびＨｅｌｐｅｒを異なる順序で配置した構築例である。
・図２５は、ｐＧＥＴＳ１３１－ＡａｒＩに基づくＲｅｐ、ＣａｐおよびＨｅｌｐｅｒを異なる順序で配置した構築例である。
・図２６は、ｐＢＥＴＳ１０３－ΔＡａｒＩに基づくＨｅｌｐｅｒ遺伝子の要素を変更した（他の要素と分離してアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂを追加した）構築例である。
【0195】
（実施例１１：種々のウイルスに基づくウイルスベクタープラスミドの構築）
ＡＡＶウイルスベクタープラスミドは、ＨＥＫ２９３以外のプロデューサー細胞（ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＴ１０８０、Ａ５４９、ＨｅＬａ、ＨＥＫ ２９３Ｔなど）を使用する場合には、上記の実施例の構造に加えて、さらにＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を含むように構築することができる。
ＡＡＶウイルスベクタープラスミドは、ＨＥＫ２９３以外のプロデューサー細胞（ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＴ１０８０、Ａ５４９、ＨｅＬａ、ＨＥＫ ２９３Ｔなど）を使用する場合には、上記の実施例の構造に加えて、さらにＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を含むように構築することができる。
【0196】
例えば、レトロウイルスベクタープラスミド、レンチウイルスベクタープラスミド、センダイウイルスベクタープラスミド、アデノウイルスウイルスベクタープラスミドの具体的な構成として、上記実施例のｐＧＥＴＳ１０３ΔＡａｒＩをベースとして図１２～１５が想定される。
【0197】
レンチウイルスベクタープラスミド（図１２）
ｐＧＥＴＳ１０３ΔＡａｒＩをベースに以下の核酸配列を追加してベクタープラスミドを構築する。
・ＣＭＶプロモーター、ＶＳＶ－Ｇ（水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇ）、ポリＡ・ＣＭＶプロモーター、ｒｅｖ、ポリＡ
・５’ＬＴＲ、Ψ（パッケージングシグナル配列）、ＲＰＥ、ＰＰＴ、ＣＭＶプロモーター、ＷＰＲＥ、３’ＬＴＲ
・ＣＭＶプロモーター、ｇａｇ、ｐｏｌ、ＲＰＥ、ポリＡ
（所望の遺伝子はＬＴＲ間でプロモーターの下流に位置付けられ得る。）
ｐＧＥＴＳ１０３ΔＡａｒＩをベースに以下の核酸配列を追加してベクタープラスミドを構築する。
・ＣＭＶプロモーター、ＶＳＶ－Ｇ（水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇ）、ポリＡ・ＣＭＶプロモーター、ｒｅｖ、ポリＡ
・５’ＬＴＲ、Ψ（パッケージングシグナル配列）、ＲＰＥ、ＰＰＴ、ＣＭＶプロモーター、ＷＰＲＥ、３’ＬＴＲ
・ＣＭＶプロモーター、ｇａｇ、ｐｏｌ、ＲＰＥ、ポリＡ
（所望の遺伝子はＬＴＲ間でプロモーターの下流に位置付けられ得る。）
【0198】
レトロウイルスベクタープラスミド（図１３）
ｐＧＥＴＳ１０３ΔＡａｒＩをベースに以下の核酸配列を追加してベクタープラスミドを構築する。
・ＣＭＶプロモーター、ｅｎｖ、ポリＡ
・５’ＬＴＲ、Ψ（パッケージングシグナル配列）、ＲＰＥ、ＰＰＴ、ＣＭＶプロモーター、ＷＰＲＥ、３’ＬＴＲ
・ＣＭＶプロモーター、ｇａｇ、ｐｏｌ、ＲＰＥ、ポリＡ
（所望の遺伝子はＬＴＲ間でプロモーターの下流に位置付けられ得る。）
ｐＧＥＴＳ１０３ΔＡａｒＩをベースに以下の核酸配列を追加してベクタープラスミドを構築する。
・ＣＭＶプロモーター、ｅｎｖ、ポリＡ
・５’ＬＴＲ、Ψ（パッケージングシグナル配列）、ＲＰＥ、ＰＰＴ、ＣＭＶプロモーター、ＷＰＲＥ、３’ＬＴＲ
・ＣＭＶプロモーター、ｇａｇ、ｐｏｌ、ＲＰＥ、ポリＡ
（所望の遺伝子はＬＴＲ間でプロモーターの下流に位置付けられ得る。）
【0199】
センダイウイルスベクタープラスミド（図１４）
ｐＧＥＴＳ１０３ΔＡａｒＩをベースに以下の核酸配列を追加してベクタープラスミドを構築する。
・ＣＡＧプロモーター、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
・ＣＡＧプロモーター、Ｎ
・ＣＡＧプロモーター、Ｐ、Ｌ、Ｆ
・Ｔ７プロモーター、Ｆを欠失させたセンダイウイルスゲノム、Ｒｂｚ
（所望の遺伝子はセンダイウイルスゲノムのいずれかの遺伝子の間に位置付けられ得る。）
ｐＧＥＴＳ１０３ΔＡａｒＩをベースに以下の核酸配列を追加してベクタープラスミドを構築する。
・ＣＡＧプロモーター、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
・ＣＡＧプロモーター、Ｎ
・ＣＡＧプロモーター、Ｐ、Ｌ、Ｆ
・Ｔ７プロモーター、Ｆを欠失させたセンダイウイルスゲノム、Ｒｂｚ
（所望の遺伝子はセンダイウイルスゲノムのいずれかの遺伝子の間に位置付けられ得る。）
【0200】
アデノウイルスベクタープラスミド（図１５）
ｐＧＥＴＳ１０３ΔＡａｒＩをベースに以下の核酸配列を追加してベクタープラスミドを構築する。
・５’ＩＴＲ、アデノウイルス血清型５のゲノム（Ｅ１遺伝子の部位をプロモーターおよびＥ１Ａ遺伝子で置換する）、３’ＩＴＲ
（Ｅ１Ａ遺伝子に加えて、所望の遺伝子も上記または他のプロモーターの下流に位置付けられ得る。）
ｐＧＥＴＳ１０３ΔＡａｒＩをベースに以下の核酸配列を追加してベクタープラスミドを構築する。
・５’ＩＴＲ、アデノウイルス血清型５のゲノム（Ｅ１遺伝子の部位をプロモーターおよびＥ１Ａ遺伝子で置換する）、３’ＩＴＲ
（Ｅ１Ａ遺伝子に加えて、所望の遺伝子も上記または他のプロモーターの下流に位置付けられ得る。）
【0201】
コロナウイルスベクタープラスミド（図２７）
コロナウイルスベクタープラスミドを、ｐＧＥＴＳ１０３ΔＡａｒＩをベースに以下の核酸配列を追加して構築する。
・非構造タンパク質領域のＯＲＦ１ａ、非構造タンパク質領域のＯＲＦ１ｂおよび構造タンパク質領域を含み、構造タンパク質領域に所望の遺伝子を含む。構造タンパク質領域のスパイク遺伝子Ｓ、エンベロープ遺伝子Ｅ、マトリックス遺伝子Ｍ、ヌクレオカプシド遺伝子Ｎ等は必要に応じて欠損させてもよい。
コロナウイルスベクタープラスミドを、ｐＧＥＴＳ１０３ΔＡａｒＩをベースに以下の核酸配列を追加して構築する。
・非構造タンパク質領域のＯＲＦ１ａ、非構造タンパク質領域のＯＲＦ１ｂおよび構造タンパク質領域を含み、構造タンパク質領域に所望の遺伝子を含む。構造タンパク質領域のスパイク遺伝子Ｓ、エンベロープ遺伝子Ｅ、マトリックス遺伝子Ｍ、ヌクレオカプシド遺伝子Ｎ等は必要に応じて欠損させてもよい。
【0202】
（注記）
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【0203】
本出願は、２０２０年１１月４日に日本国特許庁に出願された特願２０２０－１８４４９１号に対する優先権の利益を主張し、その内容全体が本明細書に参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【0204】
本開示は、新たな構造のベクタープラスミドを提供し、ベクタープラスミドに基づくウイルスベクターの供給を可能とし得る。
【配列表フリーテキスト】
【0205】
配列番号１：PCR産物
tagGGTCTCaAGCTtgCCTGCAGGcaGATCatgcgcaggtgcacctgcatgcGATCCGGGGTTCGAACCCCGGTCGTCCGCCATGATACCCTTGCGAATTTATCCACCAGACCACGGAAGAGTGCCCGCTTACAGGCTCTCCTTTTGCACGGTCTAGAGCGTCAACGACTGCGCACGCCTCACCGGCCAGAGCGTCCCGACCATGGAGCACTTTTTGCCGCTGCGCAACATCTGGAACCGCGTCCGCGACTTTCCGCGCGCCTCCACCACCGCCGCCGGCATCACCTGGATGTCCAGGTACATCTACGGATTACGTCGACGTTTAAACCATATGAGCGGCCGCatatatCCCGGGAGCTaGAGACCtca
配列番号２：pGETS103-AAV-Helper-RC2
（配列表に記載の通り）
配列番号３：リンカーF
AGCTTGCGCAGGTGCACCTGCATGCGG
配列番号４：リンカーR
AGCTCCGCATGCAGGTGCACCTGCGCA
配列番号５：第1-1
TAGAGGCAAGGGTTGTTTTTATTGACTACACCTGCGATCAAGCTTGCCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGG
配列番号６：第1-2
GGTCGTTGGGCGGTCAGCCAGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTATGTAACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACTAATGACCCCGTAATTGATTACTATTAAAGCTTGATATCGATAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCT
配列番号７：第1-3
ATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCAT
配列番号８：第1-4
GTAATAGCGATGACTAATACGTAGATGTACTGCCAAGTAGGAAAGTCCCATAAGGTCATGTACTGGGCATAATGCCAGGCGGGCCATTTACCGTCATTGACGTCAATAGGGGGCGTACTTGGCATATGATACACTTGATGTACTGCCAAGTGGGC
配列番号９：第1-5
GTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACT
配列番号１０：第1-6
TACTGGTTGGAAGAAAGACCTCTATCACCTGCGATCCTGGGCCCTTAAGGATATCCACTAAACCAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCACCGTACACGCCTACCGCCCATTTGCGTCAATGGGGCGGAGTTGTTACGACATTTTGGAAAGTCCCGTTGATTTTGGTGCCAAAACAAAC
配列番号１１：第3-1
TAGAGGCAAGGGTTGTTTTTATTGACTACACCTGCGATCGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTT
配列番号１２：第3-2
AGGGAGCAGTGGTTCACGCCTGTAATCCCAGCAATTTGGGAGGCCAAGGTGGGTAGATCACCTGAGATTAGGAGTTGGAGACCAGCCTGGCCAATATGGTGAAACCCCGTCTCTACCAAAAAAACAAAAATTAGCTGAGCCTGGTCATGC
配列番号１３：第3-3
GGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTATCGATAGATCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGG
配列番号１４：第3-4
GGAAGCTGTAGAGCTGTTCCTGGTTGCGACGCAGGGTGGGCTGTACCTGGGGACTGTTAAGCATGGAGTTGGGTACCGGATCTGCCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACC
配列番号１５：第3-5
CGCAACCAGGAACAGCTCTACAGCTTCCTGGAGCGCCACTCGCCCTACTTCCGCAGCCACAGTGCGCAGATTAGGAGCGCCACTTCTTTTTGTCACTTGAAAAACATGTAAAAATAATGTACTAGGAGACACTTTCAATAAAGGCAAATGT
配列番号１６：第3-6
TACTGGTTGGAAGAAAGACCTCTATCACCTGCGATCTGTCCCTGCCAGTGGCGCATAGCGATGCGCGGCAGAACCCCTTTGATTTTTAAACGGCGCAGACGGCAAGGGTGGGGGGTAAATAATCACCCGAGAGTGTACAAATAAAAACATTTGCCTTTATTGAAAGTGTCTCCT
配列番号１７：第16-1
TAGAGGCAAGGGTTGTTTTTATTGACTAGGTCTCGCAGGTACATCTACGGATTACGTCGACGTTTAAACCATATGAGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGAAGATCAGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCTGATCTGCGCAGCCGCC
配列番号１８：第16-2
CAGAATCTGGCGGCAACTCCCATTCCTTCTCGGCCACCCAGTTCACAAAGCTGTCAGAAATGCCGGGCAGATGCTCGTCAAGGTCGCTGGGGACCTTAATCACAATCTCGTAAAACCCCGGCATGGCGGCTGCGCAGATCAGAAGTTCCTATAC
配列番号１９：第16-3
AGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAAT
配列番号２０：第16-4
CCGCGGTAAATTCTCTGAATCAGTTTTTCGCGAATCTGACTCAGGAAACGTCCCAAAACCATGGATTTCACCCCGGTGGTTTCCACGAGCACGTGCATGTGGAAGTAGCTCTCTCCCTTCTCAAATTGCACAAAGAAAAGGGCCTCCGGGGCCT
配列番号２１：第16-5
CGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAG
配列番号２２：第16-6
TACTGGTTGGAAGAAAGACCTCTATGGTCTCCCTGCTCCTGCGTCTGCGACACGTGCGTCAGATGCTGCGCCACCAACCGTTTACGCTCCGTGAGATTCAAACAGGCGCTTAAATACTGTTCCATATTAGTCCACGCCCACTGGAGCTCAGGCTGGGTTTTGGGGAGCAAGTAATT
配列番号２３：第1-F
TAGCACCTGCATGCAAGCTTGCCTGCAGGCA
配列番号２４：第1-R
TAGCACCTGCGCATCTGGGCCCTTAAGGATATC
配列番号２５：第2-F
TAGGGTCTCGCCAGCCGGCC
配列番号２６：第2-R
TAGGGTCTCCTTCCCAATAGACCCCGCA
配列番号２７：第3-F
TAGCACCTGCATGCGGAACCAAGCTGGAGTG
配列番号２８：第3-R
TAGCACCTGCGCATTGTCCCTGCCAGTGG
配列番号２９：第4-F
TAGGGTCTCGGACACGTTGCGATACTGGT
配列番号３０：第4-R
TAGGGTCTCCCACGAGCCCACGG
配列番号３１：第5-F
TAGCACCTGCATGCCGTGGTGCTTGTAGGTTAC
配列番号３２：第5-R
TAGCACCTGCGCATGAGCGCGGACGC
配列番号３３：第6-F
TAGGGTCTCGGCTCGGGGGTGGT
配列番号３４：第6-R
TAGGGTCTCCTTGCCGCGCGTTTCTC
配列番号３５：第7-F
TAGCACCTGCATGCGCAAACGCTCTGCAACAAGA
配列番号３６：第7-R
TAGCACCTGCGCATGTCCGCCAGGTGC
配列番号３７：第8-F
TAGGGTCTCGGGACATTATCTTCCCCGAAC
配列番号３８：第8-R
TAGGGTCTCCGTGGCGGCGGC
配列番号３９：第9-F
TAGCACCTGCATGCCCACCCACGGACGA
配列番号４０：第9-R
TAGCACCTGCGCATGAGGGAGCGCAGAGA
配列番号４１：第10-F
TAGGGTCTCGCCTCACCCGCAGCTG
配列番号４２：第10-R
TAGGGTCTCCGACTAAAAAATGACGTAACGGTTAAAGTC
配列番号４３：第11-F
TAGCACCTGCATGCAGTCCTATATATACTCGCTCTGTACT
配列番号４４：第11-R
TAGCACCTGCGCATGGAGCTATGCTAACCAGC
配列番号４５：第12-F
TAGGGTCTCGCTCCGAGTATGCGTGTCA
配列番号４６：第12-R
TAGGGTCTCCGTAGTTGTAGTATATCCACTCTCTCA
配列番号４７：第13-F
TAGCACCTGCATGCCTACTACACAGAGCGAGCT
配列番号４８：第13-R
TAGCACCTGCGCATGCACAGCACCACAATATTGTTCA
配列番号４９：第14-F
TAGCACCTGCATGCGTGCTGCAGTTACTGTGCT
配列番号５０：第14-R
TAGCACCTGCGCATTAGCGAGGTAAGCACTTACTCT
配列番号５１：第15-F
TAGGGTCTCGGCTAGTTTCTGTGGATTCACTAGA
配列番号５２：第15-R
TAGGGTCTCCCCTGGACATCCAGGTGA
配列番号５３：第16-F
TAGGGTCTCGCAGGTACATCTACGGATTACGT
配列番号５４：第16-R
TAGGGTCTCCCTGCTCCTGCGTCTG
配列番号５５：第17-F
TAGCACCTGCATGCGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCC
配列番号５６：第17-R
TAGCACCTGCGCATGGTGAGTTCAAATTTGAACATCCG
配列番号５７：第18-F
TAGGGTCTCGCACCCGCCGTCTG
配列番号５８：第18-R
TAGGGTCTCCCGAGGGCCGCG
配列番号５９：第19-F
TAGCACCTGCATGCCTCGAGCACGACAAAGC
配列番号６０：第19-R
TAGCACCTGCGCATTGACTTGAATGTTAAAGAGCTTGAAGTTGA
配列番号６１：第20-F
TAGGGTCTCGGTCAAAGAGGTCACGCAGA
配列番号６２：第20-R
TAGGGTCTCCTTGGTTGTCCTGATTTCCTCTTC
配列番号６３：第21-F
TAGCACCTGCATGCCCAATCCCGTGGCTAC
配列番号６４：第21-R
TAGCACCTGCGCATGCATATGATACACTTGATGTACTGC
配列番号６５：第22-F
TAGGGTCTCGATGCCAAGTACGCCCCCT
配列番号６６：第22-R
TAGGGTCTCCCTCCCGGGCTGTAGT
配列番号６７：ＩＴＲ標的プライマー（フォワード）
GGAACCCCTAGTGATGGAGTT
配列番号６８：ＩＴＲ標的プライマー（リバース）
CGGCCTCAGTGAGCGA
配列番号６９：ＣＭＶ標的プライマー（フォワード）
CATCAATGGGCGTGGATAGC
配列番号７０：ＣＭＶ標的プライマー（リバース）
GGAGTTGTTACGACATTTTGGAAA
配列番号７１：Ａｍｐｒ遺伝子領域標的プライマー（フォワード）
TTGATCGTTGGGAACCGGAG
配列番号７２：Ａｍｐｒ遺伝子領域標的プライマー（リバース）
TTGTTGCCGGGAAGCTAGAG
tagGGTCTCaAGCTtgCCTGCAGGcaGATCatgcgcaggtgcacctgcatgcGATCCGGGGTTCGAACCCCGGTCGTCCGCCATGATACCCTTGCGAATTTATCCACCAGACCACGGAAGAGTGCCCGCTTACAGGCTCTCCTTTTGCACGGTCTAGAGCGTCAACGACTGCGCACGCCTCACCGGCCAGAGCGTCCCGACCATGGAGCACTTTTTGCCGCTGCGCAACATCTGGAACCGCGTCCGCGACTTTCCGCGCGCCTCCACCACCGCCGCCGGCATCACCTGGATGTCCAGGTACATCTACGGATTACGTCGACGTTTAAACCATATGAGCGGCCGCatatatCCCGGGAGCTaGAGACCtca
配列番号２：pGETS103-AAV-Helper-RC2
（配列表に記載の通り）
配列番号３：リンカーF
AGCTTGCGCAGGTGCACCTGCATGCGG
配列番号４：リンカーR
AGCTCCGCATGCAGGTGCACCTGCGCA
配列番号５：第1-1
TAGAGGCAAGGGTTGTTTTTATTGACTACACCTGCGATCAAGCTTGCCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGG
配列番号６：第1-2
GGTCGTTGGGCGGTCAGCCAGGCGGGCCATTTACCGTAAGTTATGTAACGCGGAACTCCATATATGGGCTATGAACTAATGACCCCGTAATTGATTACTATTAAAGCTTGATATCGATAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCT
配列番号７：第1-3
ATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCAT
配列番号８：第1-4
GTAATAGCGATGACTAATACGTAGATGTACTGCCAAGTAGGAAAGTCCCATAAGGTCATGTACTGGGCATAATGCCAGGCGGGCCATTTACCGTCATTGACGTCAATAGGGGGCGTACTTGGCATATGATACACTTGATGTACTGCCAAGTGGGC
配列番号９：第1-5
GTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACT
配列番号１０：第1-6
TACTGGTTGGAAGAAAGACCTCTATCACCTGCGATCCTGGGCCCTTAAGGATATCCACTAAACCAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCACCGTACACGCCTACCGCCCATTTGCGTCAATGGGGCGGAGTTGTTACGACATTTTGGAAAGTCCCGTTGATTTTGGTGCCAAAACAAAC
配列番号１１：第3-1
TAGAGGCAAGGGTTGTTTTTATTGACTACACCTGCGATCGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTT
配列番号１２：第3-2
AGGGAGCAGTGGTTCACGCCTGTAATCCCAGCAATTTGGGAGGCCAAGGTGGGTAGATCACCTGAGATTAGGAGTTGGAGACCAGCCTGGCCAATATGGTGAAACCCCGTCTCTACCAAAAAAACAAAAATTAGCTGAGCCTGGTCATGC
配列番号１３：第3-3
GGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTATCGATAGATCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGG
配列番号１４：第3-4
GGAAGCTGTAGAGCTGTTCCTGGTTGCGACGCAGGGTGGGCTGTACCTGGGGACTGTTAAGCATGGAGTTGGGTACCGGATCTGCCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACC
配列番号１５：第3-5
CGCAACCAGGAACAGCTCTACAGCTTCCTGGAGCGCCACTCGCCCTACTTCCGCAGCCACAGTGCGCAGATTAGGAGCGCCACTTCTTTTTGTCACTTGAAAAACATGTAAAAATAATGTACTAGGAGACACTTTCAATAAAGGCAAATGT
配列番号１６：第3-6
TACTGGTTGGAAGAAAGACCTCTATCACCTGCGATCTGTCCCTGCCAGTGGCGCATAGCGATGCGCGGCAGAACCCCTTTGATTTTTAAACGGCGCAGACGGCAAGGGTGGGGGGTAAATAATCACCCGAGAGTGTACAAATAAAAACATTTGCCTTTATTGAAAGTGTCTCCT
配列番号１７：第16-1
TAGAGGCAAGGGTTGTTTTTATTGACTAGGTCTCGCAGGTACATCTACGGATTACGTCGACGTTTAAACCATATGAGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGAAGATCAGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCTGATCTGCGCAGCCGCC
配列番号１８：第16-2
CAGAATCTGGCGGCAACTCCCATTCCTTCTCGGCCACCCAGTTCACAAAGCTGTCAGAAATGCCGGGCAGATGCTCGTCAAGGTCGCTGGGGACCTTAATCACAATCTCGTAAAACCCCGGCATGGCGGCTGCGCAGATCAGAAGTTCCTATAC
配列番号１９：第16-3
AGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAAT
配列番号２０：第16-4
CCGCGGTAAATTCTCTGAATCAGTTTTTCGCGAATCTGACTCAGGAAACGTCCCAAAACCATGGATTTCACCCCGGTGGTTTCCACGAGCACGTGCATGTGGAAGTAGCTCTCTCCCTTCTCAAATTGCACAAAGAAAAGGGCCTCCGGGGCCT
配列番号２１：第16-5
CGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAG
配列番号２２：第16-6
TACTGGTTGGAAGAAAGACCTCTATGGTCTCCCTGCTCCTGCGTCTGCGACACGTGCGTCAGATGCTGCGCCACCAACCGTTTACGCTCCGTGAGATTCAAACAGGCGCTTAAATACTGTTCCATATTAGTCCACGCCCACTGGAGCTCAGGCTGGGTTTTGGGGAGCAAGTAATT
配列番号２３：第1-F
TAGCACCTGCATGCAAGCTTGCCTGCAGGCA
配列番号２４：第1-R
TAGCACCTGCGCATCTGGGCCCTTAAGGATATC
配列番号２５：第2-F
TAGGGTCTCGCCAGCCGGCC
配列番号２６：第2-R
TAGGGTCTCCTTCCCAATAGACCCCGCA
配列番号２７：第3-F
TAGCACCTGCATGCGGAACCAAGCTGGAGTG
配列番号２８：第3-R
TAGCACCTGCGCATTGTCCCTGCCAGTGG
配列番号２９：第4-F
TAGGGTCTCGGACACGTTGCGATACTGGT
配列番号３０：第4-R
TAGGGTCTCCCACGAGCCCACGG
配列番号３１：第5-F
TAGCACCTGCATGCCGTGGTGCTTGTAGGTTAC
配列番号３２：第5-R
TAGCACCTGCGCATGAGCGCGGACGC
配列番号３３：第6-F
TAGGGTCTCGGCTCGGGGGTGGT
配列番号３４：第6-R
TAGGGTCTCCTTGCCGCGCGTTTCTC
配列番号３５：第7-F
TAGCACCTGCATGCGCAAACGCTCTGCAACAAGA
配列番号３６：第7-R
TAGCACCTGCGCATGTCCGCCAGGTGC
配列番号３７：第8-F
TAGGGTCTCGGGACATTATCTTCCCCGAAC
配列番号３８：第8-R
TAGGGTCTCCGTGGCGGCGGC
配列番号３９：第9-F
TAGCACCTGCATGCCCACCCACGGACGA
配列番号４０：第9-R
TAGCACCTGCGCATGAGGGAGCGCAGAGA
配列番号４１：第10-F
TAGGGTCTCGCCTCACCCGCAGCTG
配列番号４２：第10-R
TAGGGTCTCCGACTAAAAAATGACGTAACGGTTAAAGTC
配列番号４３：第11-F
TAGCACCTGCATGCAGTCCTATATATACTCGCTCTGTACT
配列番号４４：第11-R
TAGCACCTGCGCATGGAGCTATGCTAACCAGC
配列番号４５：第12-F
TAGGGTCTCGCTCCGAGTATGCGTGTCA
配列番号４６：第12-R
TAGGGTCTCCGTAGTTGTAGTATATCCACTCTCTCA
配列番号４７：第13-F
TAGCACCTGCATGCCTACTACACAGAGCGAGCT
配列番号４８：第13-R
TAGCACCTGCGCATGCACAGCACCACAATATTGTTCA
配列番号４９：第14-F
TAGCACCTGCATGCGTGCTGCAGTTACTGTGCT
配列番号５０：第14-R
TAGCACCTGCGCATTAGCGAGGTAAGCACTTACTCT
配列番号５１：第15-F
TAGGGTCTCGGCTAGTTTCTGTGGATTCACTAGA
配列番号５２：第15-R
TAGGGTCTCCCCTGGACATCCAGGTGA
配列番号５３：第16-F
TAGGGTCTCGCAGGTACATCTACGGATTACGT
配列番号５４：第16-R
TAGGGTCTCCCTGCTCCTGCGTCTG
配列番号５５：第17-F
TAGCACCTGCATGCGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCC
配列番号５６：第17-R
TAGCACCTGCGCATGGTGAGTTCAAATTTGAACATCCG
配列番号５７：第18-F
TAGGGTCTCGCACCCGCCGTCTG
配列番号５８：第18-R
TAGGGTCTCCCGAGGGCCGCG
配列番号５９：第19-F
TAGCACCTGCATGCCTCGAGCACGACAAAGC
配列番号６０：第19-R
TAGCACCTGCGCATTGACTTGAATGTTAAAGAGCTTGAAGTTGA
配列番号６１：第20-F
TAGGGTCTCGGTCAAAGAGGTCACGCAGA
配列番号６２：第20-R
TAGGGTCTCCTTGGTTGTCCTGATTTCCTCTTC
配列番号６３：第21-F
TAGCACCTGCATGCCCAATCCCGTGGCTAC
配列番号６４：第21-R
TAGCACCTGCGCATGCATATGATACACTTGATGTACTGC
配列番号６５：第22-F
TAGGGTCTCGATGCCAAGTACGCCCCCT
配列番号６６：第22-R
TAGGGTCTCCCTCCCGGGCTGTAGT
配列番号６７：ＩＴＲ標的プライマー（フォワード）
GGAACCCCTAGTGATGGAGTT
配列番号６８：ＩＴＲ標的プライマー（リバース）
CGGCCTCAGTGAGCGA
配列番号６９：ＣＭＶ標的プライマー（フォワード）
CATCAATGGGCGTGGATAGC
配列番号７０：ＣＭＶ標的プライマー（リバース）
GGAGTTGTTACGACATTTTGGAAA
配列番号７１：Ａｍｐｒ遺伝子領域標的プライマー（フォワード）
TTGATCGTTGGGAACCGGAG
配列番号７２：Ａｍｐｒ遺伝子領域標的プライマー（リバース）
TTGTTGCCGGGAAGCTAGAG
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【配列表】