(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022183608
(43)【公開日】2022-12-13
(54)【発明の名称】ナノポア形成方法及びナノポア計測方法
(51)【国際特許分類】
G01N 27/00 20060101AFI20221206BHJP
G01N 33/483 20060101ALI20221206BHJP
C12Q 1/02 20060101ALN20221206BHJP
【ＦＩ】
G01N27/00 Z
G01N33/483 E
C12Q1/02
【審査請求】未請求
【請求項の数】17
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021091022
(22)【出願日】2021-05-31
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＶＩＳＵＡＬ ＢＡＳＩＣ
(71)【出願人】
【識別番号】000005108
【氏名又は名称】株式会社日立製作所
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】手塚 沙也可
(72)【発明者】
【氏名】柳 至
【テーマコード（参考）】
2G045
2G060
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G045CB01
2G045CB21
2G045CB30
2G045DA12
2G045DA13
2G045DA14
2G045DA36
2G045DA80
2G045DB30
2G045FA34
2G060AA06
2G060AA15
2G060AA19
2G060AD06
2G060AF20
2G060AG03
2G060AG11
2G060FA10
2G060FA17
2G060JA07
2G060KA09
4B063QA01
4B063QQ02
4B063QQ04
4B063QQ05
4B063QQ10
4B063QS39
4B063QX04
(57)【要約】
【課題】簡便な手法でナノポアをコーティングする技術を提供する。
【解決手段】本開示のナノポア形成方法は、第１の電解液と第２の電解液との間に膜を配置することと、第１の電極を前記第１の電解液に接触させ、第２の電極を前記第２の電解液に接触させることと、前記第１の電極と前記第２の電極との間に第１の電圧を印加して前記膜にナノポアを形成することと、を含み、前記第１の電解液及び前記第２の電解液の少なくとも一方に、前記膜に対して物理吸着又は化学吸着して分子層を形成する有機物である第１の物質が含まれていることを特徴とする。
【選択図】図９
【解決手段】本開示のナノポア形成方法は、第１の電解液と第２の電解液との間に膜を配置することと、第１の電極を前記第１の電解液に接触させ、第２の電極を前記第２の電解液に接触させることと、前記第１の電極と前記第２の電極との間に第１の電圧を印加して前記膜にナノポアを形成することと、を含み、前記第１の電解液及び前記第２の電解液の少なくとも一方に、前記膜に対して物理吸着又は化学吸着して分子層を形成する有機物である第１の物質が含まれていることを特徴とする。
【選択図】図９
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１の電解液と第２の電解液との間に膜を配置することと、
第１の電極を前記第１の電解液に接触させ、第２の電極を前記第２の電解液に接触させることと、
前記第１の電極と前記第２の電極との間に第１の電圧を印加して前記膜にナノポアを形成することと、を含み、
前記第１の電解液及び前記第２の電解液の少なくとも一方に、前記膜に対して物理吸着又は化学吸着して分子層を形成する有機物である第１の物質が含まれている、ナノポア形成方法。
第１の電極を前記第１の電解液に接触させ、第２の電極を前記第２の電解液に接触させることと、
前記第１の電極と前記第２の電極との間に第１の電圧を印加して前記膜にナノポアを形成することと、を含み、
前記第１の電解液及び前記第２の電解液の少なくとも一方に、前記膜に対して物理吸着又は化学吸着して分子層を形成する有機物である第１の物質が含まれている、ナノポア形成方法。
【請求項2】
前記第１の物質が前記ナノポアの表面と相互作用して吸着可能な構造を有する物質である、請求項１に記載のナノポア形成方法。
【請求項3】
前記第１の物質が親水性構造を有する、請求項１に記載のナノポア形成方法。
【請求項4】
前記第１の物質が、分子構造内の一端部に疎水部を有し他端部に親水部を有するか、又は、立体構造を取ったときに一部分に疎水部が配置され、他の部分に親水部が配置される両親媒性分子である、請求項１に記載のナノポア形成方法。
【請求項5】
前記第１の物質が界面活性剤である、請求項１に記載のナノポア形成方法。
【請求項6】
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、硫酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、臭化アルキルトリメチルアンモニウム、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、コール酸塩、サルコシル、アルキルポリグリコシドＤＤＭ、ジギトニン、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホナート、及び、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホナートからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項５に記載のナノポア形成方法。
【請求項7】
前記第１の物質の濃度が１ｐＭ以上又は０．０００１ｗｔ％以上である、請求項１に記載のナノポア形成方法。
【請求項8】
前記膜の材質がＨｆＯ２、ＳｉＯ２、ＴｉＯ２、ＳｉＮ、ＳｉＯＮ、ＳｉＣ、ＳｉＣＮ、Ａｌ２Ｏ３、ＨｆＡｌＯｘ、ＺｒＡｌＯｘ、ＴａＯ３、グラフェン、カーボン膜又はこれらを含む複合材料である、請求項１に記載のナノポア形成方法。
【請求項9】
前記ナノポアの形成後、前記第１の電解液及び前記第２の電解液を前記第１の物質を含む第３の電解液に置換することと、
前記ナノポアを前記第３の電解液に所定の時間浸漬することと、をさらに含む、請求項１に記載のナノポア形成方法。
前記ナノポアを前記第３の電解液に所定の時間浸漬することと、をさらに含む、請求項１に記載のナノポア形成方法。
【請求項10】
前記第３の電解液のｐＨが前記第１の電解液のｐＨ及び前記第２の電解液のｐＨと異なる、請求項９に記載のナノポア形成方法。
【請求項11】
前記ナノポアの形成後、前記第１の電解液及び前記第２の電解液を前記第１の物質を含まない溶液に置換することをさらに含む、請求項１に記載のナノポア形成方法。
【請求項12】
請求項１に記載のナノポア形成方法を実施することと、
前記ナノポアの形成後、前記第１の電解液及び前記第２の電解液の少なくとも一方を測定対象物を含む計測溶液で置換することと、を含むナノポア計測方法。
前記ナノポアの形成後、前記第１の電解液及び前記第２の電解液の少なくとも一方を測定対象物を含む計測溶液で置換することと、を含むナノポア計測方法。
【請求項13】
前記置換後、前記第１の電極と前記第２の電極との間に第２の電圧を印加して、前記ナノポアを流れる電流信号の変化を測定することをさらに含む、請求項１２に記載のナノポア計測方法。
【請求項14】
前記測定対象物が、前記計測溶液中に分散又は溶解可能であり、直径が０．１ｎｍ～５００ｎｍ程度のひも状の物質である、又は、球形に近似したときの直径が０．１ｎｍ～５００ｎｍである、請求項１２に記載のナノポア計測方法。
【請求項15】
前記測定対象物が、生体ポリマ、生体モノマ又はこれらの誘導体を構造中に有する分子を含む、請求項１２に記載のナノポア計測方法。
【請求項16】
前記測定対象物が、無機物、金属若しくは有機物のナノパーティクル、ナノ構造体若しくは生体分子との複合体からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１２に記載のナノポア計測方法。
【請求項17】
前記測定対象物が、細胞、細胞小器官及びウイルスからなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１２に記載のナノポア計測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ナノポア形成方法及びナノポア計測方法に関する。
【背景技術】
【0002】
水溶液中に存在する分子又は粒子を検出する手段として、ナノポアを用いた技術が検討されている。ナノポアデバイスは、メンブレンに、検出対象となる分子や粒子と同程度の大きさの孔（ナノポア）を設け、メンブレンの上下チャンバを水溶液で満たし、両チャンバに水溶液に接触するよう電極を設けたものである。測定時には、チャンバの片側に測定対象である検出対象物を導入し、電極間に電位差を与えて検出対象物を電気泳動させることによりナノポアを通過させる。このときに両電極間に流れるイオン電流（封鎖電流）の時間変化を計測することで、検出対象物の通過を検出したり、検出対象物の構造的な特徴を解析したりすることができる。
【0003】
非特許文献１～３には、メンブレンの絶縁破壊現象を利用したナノポア形成方法が開示されている。これらの方法においては、まず、孔の空いていないＳｉＮｘメンブレンを挟む上下のチャンバに水溶液を満たし、各チャンバの水溶液中に電極を浸し、両電極間に高電圧を印加し続ける。電極間の電流が急激に上昇して（メンブレンが絶縁破壊して）、所定のカットオフ電流に到達したところで所望の大きさのナノポアが形成されたと判断し、高電圧の印加を停止することで、ナノポアを形成する。
【0004】
ナノポアを用いた計測の用途として、水溶液中に存在する検出対象物の存在の有無の確認、大きさ又は形状の計測、及び活性状態の判定が挙げられる。ナノポアの潜在的な応用としては、例えば医薬、バイオテクノロジー、ライフサイエンス、防衛、公衆衛生、及び農業が挙げられる。ナノポアを用いた計測の精度を高めて商業利用化を推進するには、ナノポア計測が長時間に亘って再現よく実施できることが必要である。
【0005】
ナノポア計測において、しばしば測定対象物がナノポアに吸着して、ナノポアから得られる信号の安定性が失われることがある。ゆえに、ナノポアに水溶液中の測定対象物が吸着するのを抑制する技術の開発に注目が集まっている。例えば、非特許文献４には、ナノポアを絶縁破壊方式で形成する際に、開孔溶液にＮａＣｌＯを添加することでナノポア表面を酸化し、水溶液中で負に帯電するナノポアを形成することが記載されている。非特許文献４の手法によれば、負の電荷をもつＤＮＡが計測中にナノポアに吸着することを抑制できることが記載されている。また、非特許文献５～７には、開孔済みのナノポアに対して、界面活性剤又は脂質二重膜のコーティングを実施することで、測定対象物（ＤＮＡ又はタンパク質）のナノポアに対する非特異吸着を抑制できること記載されている。特に、非特許文献５には、電荷をもたない界面活性剤によるコーティングに、正に帯電した測定対象物と負に帯電した測定対象物の両方の吸着の抑制効果があったと記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Harold Kwok, et al., PloS ONE, Vol.9, No.3, e92880. (2013)
【非特許文献2】Kyle Briggs, et al., Nanotechnology, Vol.26, 084004 (2015)
【非特許文献3】Kyle Briggs, et al., Small, 10(10):2077-86 (2014)
【非特許文献4】Y M Nuwan D. Y. Bandara1, et al.Nanotechnology 31 335707(2020)
【非特許文献5】Xiaoqing Li, et al.,Appl. Phys. Lett. 109, 143105 (2016)
【非特許文献6】Jared Houghtaling, et al.,ACS Nano 13, 5, 5231-5242 (2019)
【非特許文献7】Rui Hu, et al.,Sci Rep 6, 20776 (2016)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
計測中にナノポアに測定対象物が吸着すると、後からナノポアを通過する検出対象物のシグナルが、吸着物に由来するノイズに埋もれて検出困難になる場合がある。また、ナノポアが詰まって検出対象物がナノポアを通過しなくなり、計測が中断される場合もある。
【0008】
ナノポアに測定対象物が吸着する原因の一つに、ナノポア表面と測定対象物の相互作用が挙げられる。例えば、半導体ナノポアで高頻度に使用される窒化シリコン（ＳｉＮ）の表面には、酸性表面基の一種であるシラノール基、及び、塩基性表面基の一種であるシラルアミン基が混在しており、ナノポア表面は正又は負に帯電している。そのため、ナノポア表面と逆の電荷を帯びた分子又は粒子がナノポアに近づくと、クーロン力によってナノポアの壁面に引き寄せられ得る。ナノポア壁面に引き寄せられた測定対象物は、クーロン相互作用、疎水相互作用、水素結合、又はファンデルワールス力等によって、ナノポア壁面に吸着することがある。
【0009】
上述のように非特許文献４には、開孔溶液にＮａＣｌＯを添加することで、ＤＮＡのナノポアへの吸着を抑制したことが記載されている。しかしながら、非特許文献４の手法で開孔したナノポアには、正に帯電した分子は吸着すると考えられる。
【0010】
また、非特許文献５～７のようにナノポアにコーティングを形成して測定対象物の吸着を抑制する手法として、開孔後のナノポアデバイスを一度乾燥状態に置いてからコーティングを実施する手法、及び、開孔後に溶液を置換することでコーティングを実施する手法が挙げられる。これらの手法においては、コーティングに１０分から１時間程度の時間を要し、ナノポアデバイスの表面状態によっては、特殊な設備を要する表面清浄化処理を実施するため手間がかかる。
【0011】
そこで、本開示は、簡便な手法でナノポアをコーティングする技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0012】
上記課題を解決するために、本開示のナノポア形成方法は、第１の電解液と第２の電解液との間に膜を配置することと、第１の電極を前記第１の電解液に接触させ、第２の電極を前記第２の電解液に接触させることと、前記第１の電極と前記第２の電極との間に第１の電圧を印加して前記膜にナノポアを形成することと、を含み、前記第１の電解液及び前記第２の電解液の少なくとも一方に、前記膜に対して物理吸着又は化学吸着して分子層を形成する有機物である第１の物質が含まれていることを特徴とする。
【0013】
本開示に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、本開示の態様は、要素及び多様な要素の組み合わせ及び以降の詳細な記述と添付される特許請求の範囲の様態により達成され実現される。本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、本開示の特許請求の範囲又は適用例を如何なる意味に於いても限定するものではない。
【発明の効果】
【0014】
本開示の技術によれば、簡便な手法でナノポアをコーティングすることができる。上記以外の課題、構成及び効果は、以下の実施の形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】ナノポア形成装置の構成を示す模式図である。
【図2】ナノポア形成装置の他の構成を示す模式図である。
【図3】ＤＮＡサンプルを印加電圧１００ｍＶで測定したときの電流波形を示す図である。
【図4】ＤＮＡサンプルの測定時に吸着が発生した際の電流波形を示す図である。
【図5】ＳＡ－ＤＮＡサンプルの測定時に吸着が発生した際の電流波形を示す図である。
【図6】印加電圧の変化によりＳＡ－ＤＮＡの吸着を解消した場合の電流波形を示す図である。
【図7】従来例及び第１の実施形態に係るナノポアのコーティング方法を示すフローチャートである。
【図8】比較例２に係るナノポアのコーティング方法を示す模式図である。
【図9】実施例１に係るナノポアのコーティング方法を示す模式図である。
【図10】実施例２に係るナノポアのコーティング方法を示す模式図である。
【図11】比較例３に係るナノポアのコーティング方法を示す模式図である。
【図12】比較例１～３及び実施例１～４のナノポアデバイスを用いた計測における平均計測可能時間を示すグラフである。
【図13】実施例５においてＭＢＤ２を測定したときの電流波形を示す図である。
【図15】比較例４においてＭＢＤ２を測定したときの電流波形を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下、本開示の実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。実施形態を説明するための全図において同一機能を有するものは同一の符号を付すようにし、その繰り返しの説明は可能な限り省略するようにしている。実施形態に記載する測定方法、デバイスの構造及び材料は、本開示の思想を具現化するための一例であり、測定原理やデバイスの材料及び寸法などを厳密に特定するものではない。
【0017】
実施形態に記載する具体的な電圧値や電流値、電圧印加時間は、本開示の思想を具現化するための一例であり、それらを厳密に特定するものではない。また、実施形態に記載する具体的なコーティング剤の種類、コーティング剤への浸漬時間、及びコーティング溶液の組成は、本開示の思想を具現化するための一例であり、化学組成及びコーティング時間を厳密に定義するための一例ではない。また、実施形態に記載する具体的な測定対象物の種類、溶液の種類、及びそれらの濃度は、本開示の思想を具現化するための一例であり、化学組成を厳密に定義するための一例ではない。
【0018】
本明細書においては、ナノポアで検出したい物質を検出対象物（例えば核酸、修飾核酸、タンパク質など）と呼び、ナノポア計測時にナノポアが接する溶液に含まれる物質を測定対象物と呼ぶ。測定対象物には、検出対象物も、そうでない物質（例えば、検出対象物の修飾分子若しくは不純物など）も含まれる。
【0019】
本明細書においては、ナノポア表面に物理吸着又は化学吸着し、測定対象物のナノポアへの吸着を抑制する物質をコーティング剤と呼び、コーティング剤をナノポア表面に吸着させて分子層を形成する手順をコーティングと呼ぶ。
【0020】
［第１の実施形態］
＜ナノポア形成装置の構成例＞
図１は、ナノポア形成方法のためのナノポア形成装置の構成を示す簡易的な模式図である。図１に示すように、ナノポア形成装置は、メンブレン１０１、電極１０４及び１０５、チャンバ１２０及び１２１、電流計２０１、電圧源３００を備える。
＜ナノポア形成装置の構成例＞
図１は、ナノポア形成方法のためのナノポア形成装置の構成を示す簡易的な模式図である。図１に示すように、ナノポア形成装置は、メンブレン１０１、電極１０４及び１０５、チャンバ１２０及び１２１、電流計２０１、電圧源３００を備える。
【0021】
チャンバ１２０及び１２１は、メンブレン１０１により隔てられる。メンブレン１０１の材質は、絶縁破壊によってナノポアを形成できる材料であればよく、例えばＳｉＮ、ＳｉＯＮ、ＨｆＯ２、ＳｉＯ２、ＴｉＯ２、ＳｉＣ、ＳｉＣＮ、Ａｌ２Ｏ３、ＨｆＡｌＯｘ、ＺｒＡｌＯｘ、ＴａＯ３、グラフェン、カーボン膜又はこれらを含む複合材料を用いることができる。メンブレン１０１の厚みは、例えば１μｍ以下とすることができる。具体的には、メンブレン１０１としては、例えば厚み３～３０ｎｍのシリコン窒化膜（ＳｉＮ膜）を用いることができる。
【0022】
チャンバ１２０には水溶液１０２が収容され、チャンバ１２１には水溶液１０３が収容される。水溶液１０２及び１０３は、ナノポア形成溶液（開孔溶液）又はナノポア計測溶液として用いられる。水溶液１０２及び１０３中の電解質としては例えば、塩化カリウム（ＫＣｌ）などのカリウム塩、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）などのナトリウム塩、リチウム塩、ルビジウム塩、セシウム塩、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）及び硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）などのアンモニウム塩、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）及び硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）などのマグネシウム塩等、イオン伝導して電極と反応する塩を使用することができる。これらの電解質のうち、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。水溶液１０２及び１０３として、具体的には、例えばＫＣｌ水溶液を用いることができる。電解質の濃度は、例えば０．０１Ｍ以上飽和濃度以下とすることができる。水溶液１０２及び１０３のｐＨは、ナノポア開孔に適した値を適宜選択することができる。特に、水溶液１０２及び１０３のｐＨを１３．９以下とすることにより、ナノポア形成装置の損傷を防止することができる。
【0023】
水溶液１０２及び１０３の溶媒としては、生体ポリマを安定に分散可能であり、かつ電極が溶媒に溶解せず、電極との電子授受を阻害しない溶媒を用いることができる。具体的には、溶媒として、例えば、水、アルコール類（メタノール、エタノール、イソプロパノールなど）、酢酸、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどが挙げられる。生体ポリマとして核酸を測定対象とする場合、典型的には水が用いられる。
【0024】
チャンバ１２０中の水溶液１０２には電極１０４が接触し、チャンバ１２１中の水溶液１０３には電極１０５が接触している。電極１０４及び１０５は、電流計２０１及び電圧源３００に接続される。電極１０４及び１０５としては、例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いることができる。電極１０４及び１０５は、分極電極となる材質で作製されてもよく、例えば金や白金などで作製されてもよい。その場合、安定的なイオン電流を確保するために計測溶液に電子授受反応を補助することができる物質、例えばフェリシアン化カリウム又はフェロシアン化カリウムなどを添加することができる。あるいは、電子授受反応を行うことが可能な物質、例えばフェロセン類をその分極電極表面に固定化することもできる。
【0025】
電圧源３００は、電極１０４及び１０５間に任意の電圧を印加する。電流計２０１は、電極１０４及び１０５間の電流を計測する。図示は省略しているが、コンピュータ装置又は専用のコントロールユニットなどの制御装置を用いて電流計２０１及び電圧源３００を制御することができる。制御装置は、電流計２０１により計測された電流値を不図示の記憶装置に記録したり、計測された電流値の情報に基づいて電圧源３００による印加電圧を変化させたりすることができる。
【0026】
制御装置は、電圧源３００により一定の電圧を電極１０４及び１０５間に印加し続けながら、電流計２０１により電極１０４及び１０５間に流れる電流を計測する。メンブレン１０１の絶縁破壊により電極間の電流値が急激に上昇して、予め設定した所定の閾値電流に到達した時点で、制御装置は、所望の大きさのナノポアが形成されたと判断し、電圧の印加を停止する。これにより、ナノポアが得られる。
【0027】
ナノポアの直径は、検出対象物によって変化させることができる。例えば直径１０ｎｍ程度の生体ポリマ又はビーズなどを分析する場合には、ナノポアの直径は１００ｎｍ以下とすることができる。例えば直径が約１．４ｎｍであるｓｓＤＮＡ（１本鎖ＤＮＡ）の分析に用いるナノポアの直径は、１．４ｎｍ～１０ｎｍ程度とすることができる。
【0028】
検出対象物としては、例えば、核酸、タンパク質及び多糖などの生体ポリマ；アミノ酸、脂質、糖及びヌクレオチドなどの生体モノマ；生体ポリマ及び生体モノマの誘導体；無機物、金属若しくは有機物のナノパーティクル、ナノロッド及びナノ構造体；細胞；細胞小器官；ウイルスなどが挙げられる。なお、検出対象物の大きさ及び長さに特に限定はないが、例えば、検出対象物は、直径が０．１ｎｍ～５００ｎｍ程度のひも状の物質、又は、球形に近似したときの直径が０．１ｎｍ～５００ｎｍの物質とすることができる。
【0029】
図２は、ナノポア形成装置の他の構成を示す模式図である。図２のナノポア形成装置においては、メンブレン１０１が支持基板１１２により支持されている。支持基板１１２の材質としては、例えばシリコン（Ｓｉ）を用いることができる。メンブレン１０１の上面には膜１１３が積層され、膜１１３上には膜１１４が積層されている。膜１１３の材質としては、例えば酸化シリコン（ＳｉＯ２）又はシリコン（Ｓｉ）を用いることができる。膜１１４の材質としては、例えば窒化シリコン（ＳｉＮｘ）を用いることができる。
【0030】
チャンバ１２０には溶液導入口１０６及び溶液出口１０７が設けられ、チャンバ１２１には、溶液導入口１０８及び溶液出口１０９が設けられている。さらに、シール材１３０がメンブレン１０１とチャンバ１２０との間に配置され、シール材１３１が支持基板１１２とチャンバ１２１との間に配置されている。シール材１３０及び１３４は、例えばＯリングであり、それぞれチャンバ１２０及び１２１内の水溶液の漏出を防止する。
【0031】
以下、本明細書においては、図示の簡略化のため、溶液導入口１０６及び１０８、溶液出口１０７及び１０９、支持基板１１２、並びにシール材１３０及び１３１を省略した図１のような簡易図を用いる。また、本明細書において「ナノポアデバイス」とは、ナノポア形成装置の電流計２０１及び電圧源３００以外の構成要素、すなわち、メンブレン１０１、支持基板１１２、膜１１３及び１１４、電極１０４及び１０５、並びにチャンバ１２０及び１２１を含む部分のことを指す。ナノポアデバイスは、配線により電流計２０１及び電圧源３００と接続され、ナノポア形成装置を構成する。
【0032】
＜ナノポアデバイスの作製方法＞
ナノポアデバイスの作製方法及びナノポアの形成方法は既知であり、例えばItaru Yanagi et al., Sci. Rep. 9:13143 (2019) に記載されている。一般的なナノポアデバイスの作製は、例えば以下の手順で行うことができる。
ナノポアデバイスの作製方法及びナノポアの形成方法は既知であり、例えばItaru Yanagi et al., Sci. Rep. 9:13143 (2019) に記載されている。一般的なナノポアデバイスの作製は、例えば以下の手順で行うことができる。
【0033】
まず、７２５μｍ厚の８インチＳｉウエハの表面に、Ｓｉ３Ｎ４／ＳｉＯ２／Ｓｉ３Ｎ４を１４ｎｍ／２６０ｎｍ／９０ｎｍで成膜し、裏面にＳｉ３Ｎ４を９０ｎｍ成膜する。次に、表面最上部のＳｉ３Ｎ４を６００ｎｍ四方で反応性イオンエッチングし、裏面のＳｉ３Ｎ４を１０３８μｍ四方で反応性イオンエッチングする。さらに、裏面においてエッチングにより露出したＳｉ基板をＴＭＡＨ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）にてエッチングする。次に、６００ｎｍ四方で露出しているＳｉＯ２層をＫＯＨ水溶液（３３ｗｔ％、約７０℃、約３０分間）にて取り除く。これにより、膜厚１４ｎｍのＳｉ３Ｎ４薄膜（メンブレン）が露出した薄膜デバイスが得られる。この段階では、薄膜にナノポアは設けられていない。上記のようにして作製した薄膜デバイスで上下２つのチャンバ（チャンバ１２０及び１２１）を分離するように、薄膜デバイスをナノポア形成装置にセットし、ナノポアデバイスを得る。
【0034】
＜ナノポア形成方法＞
直流電圧の印加による薄膜へのナノポア形成は、例えば以下の手順で行うことができる。まず、１Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ１２．７の開孔溶液を各チャンバに満たし、各チャンバにＡｇ／ＡｇＣｌ電極（電極１０４及び１０５）を導入する。ナノポアを形成するための電圧印加及び形成されたナノポアを介して流れるイオン電流の計測は、このＡｇ／ＡｇＣｌ電極間で行われる。
直流電圧の印加による薄膜へのナノポア形成は、例えば以下の手順で行うことができる。まず、１Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ１２．７の開孔溶液を各チャンバに満たし、各チャンバにＡｇ／ＡｇＣｌ電極（電極１０４及び１０５）を導入する。ナノポアを形成するための電圧印加及び形成されたナノポアを介して流れるイオン電流の計測は、このＡｇ／ＡｇＣｌ電極間で行われる。
【0035】
ここで、下側に位置するチャンバ（チャンバ１２１）をｃｉｓチャンバと呼び、上側に位置するチャンバ（チャンバ１２０）をｔｒａｎｓチャンバと呼ぶ。ｃｉｓチャンバ側の電極へ印加する電圧Ｖｃｉｓを０Ｖに設定し、ｔｒａｎｓチャンバ側の電極へ印加する電圧Ｖｔｒａｎｓを－１１Ｖ（以下、電圧Ｖｃｉｓは０Ｖに固定し、電圧Ｖｔｒａｎｓを変化させる場合を説明する。）に設定する。直流電圧の印加時に流れる電流値は、電流アンプ（アジレント・テクノロジー社製、4156B PRECISION SEMICONDUCTOR ANALYZER）を使用して読み取ることができる。ナノポア形成のための電圧印加及びイオン電流の読取のプロセスは、自作プログラム（Excel VBA, Visual Basic for Applications）で制御する。
【0036】
ナノポアの直径は、イオン電流値から見積もることができる。直流電圧の印加時に、薄膜に形成されているナノポアの直径に応じて取得される電流値の条件（閾値電流）を選択することで、目的とする直径のナノポアを得ることができる。上記の例では、印加した直流電圧は－１１Ｖであり、閾値電流の条件を４５０～６５０ｎＡに設定することで、直径が９～１１ｎｍのナノポアを形成することができる。
【0037】
＜ナノポア計測方法＞
上記手順で形成したナノポアを使用した測定の一例を説明する。まず、０．１Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－１０ｍＭ ＥＤＴＡ－１ｍＭ（トリス－エチレンジアミン四酢酸溶液）、ｐＨ８．０の水溶液に、４１５ｂｐのＤＮＡ（検出対象物）を３ｎＭ混合した計測溶液（以下、ＤＮＡサンプルと呼ぶ）をｃｉｓチャンバに導入する。次に、ｃｉｓチャンバ（チャンバ１２１）に接する電極（電極１０５）を電源の負極に接続し、ｔｒａｎｓチャンバ（チャンバ１２０）に接する電極（電極１０４）を電源の正極に接続し、直流電圧を１００ｍＶ～４００ｍＶの範囲で印加する。ＤＮＡがナノポアを通過するときの電流の時間変化を超低ノイズパッチクランプ用増幅器（Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ）で取得する。ＤＮＡサンプルの測定は、最大２４分間とした。
上記手順で形成したナノポアを使用した測定の一例を説明する。まず、０．１Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－１０ｍＭ ＥＤＴＡ－１ｍＭ（トリス－エチレンジアミン四酢酸溶液）、ｐＨ８．０の水溶液に、４１５ｂｐのＤＮＡ（検出対象物）を３ｎＭ混合した計測溶液（以下、ＤＮＡサンプルと呼ぶ）をｃｉｓチャンバに導入する。次に、ｃｉｓチャンバ（チャンバ１２１）に接する電極（電極１０５）を電源の負極に接続し、ｔｒａｎｓチャンバ（チャンバ１２０）に接する電極（電極１０４）を電源の正極に接続し、直流電圧を１００ｍＶ～４００ｍＶの範囲で印加する。ＤＮＡがナノポアを通過するときの電流の時間変化を超低ノイズパッチクランプ用増幅器（Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ）で取得する。ＤＮＡサンプルの測定は、最大２４分間とした。
【0038】
続いて、末端にビオチン修飾を施した４１５ｂｐのＤＮＡ ５００ｎＭとストレプトアビジン５μＭを混合して、ストレプトアビジンとＤＮＡの複合体（以下、ＳＡ－ＤＮＡと呼ぶ）を形成する。ＳＡ－ＤＮＡ（検出対象物）を０．１Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の水溶液で５００倍に希釈した計測溶液（以下、ＳＡ－ＤＮＡサンプルと呼ぶ）をｃｉｓチャンバに導入する。ＳＡ－ＤＮＡサンプルの測定はＤＮＡサンプルと同様に最大で２４分間実施した。なお、本明細書で使用したストレプトアビジンは等電点がｐＨ６．５～７．５であるため、ｐＨ８．０の計測溶液中では負に帯電していると考えられる。
【0039】
図３は、ＤＮＡサンプルを印加電圧１００ｍＶで測定したときの電流波形を示す図である。図３において、横軸は時間（秒）を示し、縦軸は電流値（ｎＡ）を示す。図３に示されるように、電流波形からは、ベース電流４０１と通過電流波形４０２とを、明確に区別することができる。ベース電流４０１は、測定対象物がナノポアを通過していないときにナノポアを流れる電流である。通過電流波形４０２は、測定対象物がナノポアを通過する際にナノポアの一部が封鎖されることで導電率が下がる波形と、ＤＮＡがナノポア内にイオンを引き込むことで導電率が上がる波形と、から成る。通常、測定対象物がナノポアを通過するのにかかる時間は１秒以下であり、測定対象物の長さ又は印加電圧等の条件によって変化する。
【0040】
検出対象物の検出方法として、上記のように封鎖電流を計測する方式以外に、ナノポア近傍に照射された光の吸収、反射、蛍光特性などの光学的信号を計測することも可能である。
【0041】
＜ナノポアへの測定対象物の吸着について＞
ナノポアがコーティングされていない場合、ナノポア計測時に測定対象物がナノポアに吸着し、明瞭な通過波形が見られなくなる現象がしばしば起こる。
ナノポアがコーティングされていない場合、ナノポア計測時に測定対象物がナノポアに吸着し、明瞭な通過波形が見られなくなる現象がしばしば起こる。
【0042】
図４は、ＤＮＡサンプルの測定時に吸着が発生した際の電流波形を示す図である。図５は、ＳＡ－ＤＮＡサンプルの測定時に吸着が発生した際の電流波形を示す図である。なお、図４及び５は単に吸着の典型的な例を示しており、測定対象物に特有の吸着時の波形を示すものではない。
【0043】
図４に示すように、ｔ＝４０秒まではＤＮＡの通過波形が見られるが、ｔ＝４０秒でベース電流が約２．３ｎＡから約０．５ｎＡまで減少した。これは、ナノポアにＤＮＡ（測定対象物）が吸着し、ナノポアの一部が封鎖されているためであると考えられる。
【0044】
図５に示すように、ｔ＝３８秒まではＳＡ－ＤＮＡが継続的にナノポアを通過する様子が読み取れるが、ｔ＝３８秒以降はベース電流のノイズが大きくなり、ＳＡ－ＤＮＡの通過とノイズが区別できない。このノイズは、ナノポアにＳＡ－ＤＮＡ（測定対象物）が吸着して、激しく振動している様子を反映していると考えられる。このように、ナノポアに測定対象物が吸着すると、（１）ベース電流値が１秒以上に亘って大幅に下がる現象、及び／又は、（２）ベース電流のノイズが大きくなる現象がみられる。
【0045】
ナノポア計測中に発生した測定対象物の吸着を解消する手法として、印加電圧を変化させる方法、より具体的にはＺＡＰを実施する方法がある。ＺＡＰは、印加電圧を例えば±１．３Ｖ以内の範囲で変える（パルス電圧を印加する）手法である。測定対象物の吸着には、印加電圧を変化させることで解消する吸着と、印加電圧を変化させても解消しない吸着がある。ここで、印加電圧の変化によって解消される吸着を可逆的な吸着と呼ぶ。一方、ＺＡＰを２０回以上実施しても解消しない吸着を不可逆的な吸着と呼ぶ。ＺＡＰは、例えば１回につき０．５ミリ秒～１秒間実施することができる。
【0046】
図６は、ナノポアへＳＡ－ＤＮＡが吸着し、印加電圧の変化によりＳＡ－ＤＮＡの吸着を解消した場合の電流波形を示す図である。図６において、０秒から１０秒にかけては、電流波形が明瞭に変化していることから、検出対象物であるＳＡ－ＤＮＡがナノポアを通過する様子が確認できる。しかしながら、時刻ｔ＝５秒で測定対象物（ＳＡ－ＤＮＡ又はその他サンプルに含まれていた物質）の吸着が発生し、ベースライン電流が０．５ｎＡから０．３ｎＡまで減少している。そこで、ｔ＝１３秒とｔ＝１７秒でＺＡＰを実施し、吸着を解消している。
【0047】
測定対象物のナノポアへの吸着が可逆的ものになるか不可逆的ものになるかは、吸着の強さによって決まる。可逆的な吸着の場合は、吸着が解消され次第計測を再開することができるため問題無い。一方、不可逆的な吸着が発生した場合は、測定は中断せざるを得ない。ここで、不可逆的な吸着が発生するまでの各サンプル（ＤＮＡサンプル及びＳＡ－ＤＮＡサンプル）の合計の計測時間を計測可能時間と呼ぶ。計測中に不可逆的な吸着が発生しなかった場合は、計測可能時間は各サンプルの最大計測時間の和となる。
【0048】
上述のＤＮＡサンプル及びＳＡ－ＤＮＡサンプルの例においては、計測可能時間はＤＮＡサンプルの最大計測時間（２４分）とＳＡ－ＤＮＡサンプルの最大計測時間（２４分）の和である４８分である。なお、図６における区間（ｉ）及び（ｉｉｉ）は、ＳＡ－ＤＮＡサンプルの計測時間に含まれる。ナノポアに詰まりが生じてから復帰するまでの区間（図６における区間（ｉｉ））は、計測時間に含まれないようにしてもよいし、当該区間が短ければ（例えば１０秒以下）、計測時間に含まれるようにしてもよい。
【0049】
＜ナノポアのコーティング方法＞
ナノポア計測時のナノポアへの測定対象物の吸着を抑制する手法として、ナノポアのコーティングがある。以下、従来例及び本実施形態に係るナノポアのコーティング方法を説明する。
ナノポア計測時のナノポアへの測定対象物の吸着を抑制する手法として、ナノポアのコーティングがある。以下、従来例及び本実施形態に係るナノポアのコーティング方法を説明する。
【0050】
図７は、従来例及び本実施形態に係るナノポアのコーティング方法を示すフローチャートである。
【0051】
（第１の従来例に係るナノポアのコーティング方法）
第１の従来例として、絶縁破壊方式で形成したナノポアに対して、非特許文献５～７のように界面活性剤をコーティングする方法を説明する。非特許文献５～７には、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）等で形成したナノポアを、界面活性剤の一種であるポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）が０．０１～０．１ｗｔ％含まれた水溶液に１０分～１時間浸漬することでコーティングを実施したことが記載されている。非特許文献５～７のコーティング方法は、絶縁破壊方式で形成したナノポアに対しても同様に実施することができる。
第１の従来例として、絶縁破壊方式で形成したナノポアに対して、非特許文献５～７のように界面活性剤をコーティングする方法を説明する。非特許文献５～７には、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）等で形成したナノポアを、界面活性剤の一種であるポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）が０．０１～０．１ｗｔ％含まれた水溶液に１０分～１時間浸漬することでコーティングを実施したことが記載されている。非特許文献５～７のコーティング方法は、絶縁破壊方式で形成したナノポアに対しても同様に実施することができる。
【0052】
【0053】
ステップＳ２１において、ユーザは、各チャンバに公知の開孔溶液を導入する。次に、ナノポア形成装置の制御装置は、各チャンバの電極に電圧を印加し、メンブレンの絶縁破壊によりナノポアを形成する。開孔溶液のｐＨは、ナノポア開孔に適した値を適宜選択することができる。例えば、開孔溶液のｐＨは１２．７とすることができる。
【0054】
ステップＳ３１において、ユーザは、各チャンバ内の液体を開孔溶液からコーティング剤入り溶液に置換し、例えば３０分間放置（ナノポアを浸漬）する。コーティング剤としては、非特許文献５～７には、界面活性剤であるポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）を使用することが記載されている。
【0055】
ステップＳ４０において、ユーザは、各チャンバ内の液体をコーティング剤入り溶液からコーティング剤を含まない溶液（例えば洗浄液又は計測溶液など）に置換する。
【0056】
ステップＳ５２において、ユーザは、第１の従来例に係るコーティング有りのナノポアデバイスを取得することができる。
【0057】
なお、コーティング無しのナノポアの形成方法は、ステップＳ３１を実施しないこと以外は上述の第１の従来例と同様である。
【0058】
（本実施形態に係るナノポアのコーティング方法）
本実施形態に係るナノポアのコーティング方法は、第１の従来例と異なり、ナノポアの形成時にコーティング剤入りの開孔溶液を用いることが特徴である。本実施形態のコーティング方法は以下の通りである。
本実施形態に係るナノポアのコーティング方法は、第１の従来例と異なり、ナノポアの形成時にコーティング剤入りの開孔溶液を用いることが特徴である。本実施形態のコーティング方法は以下の通りである。
【0059】
ステップＳ１０は、第１の従来例と同様である。ステップＳ１０の後、処理はステップＳ２２に移行する。
【0060】
ステップＳ２２において、ユーザは、各チャンバにコーティング剤入りの開孔溶液（第１の電解液及び第２の電解液）を導入する。コーティング剤の詳細については後述する。ナノポア形成装置の制御装置は、電極に電圧を印加し、メンブレンの絶縁破壊によりナノポアを形成する。コーティング剤入りの開孔溶液のｐＨは、ナノポア開孔に適した値を適宜選択することができる。例えば、コーティング剤入りの開孔溶液のｐＨは１２．７とすることができる。なお、本ステップにおいて、一方のチャンバにコーティング剤入りの開孔溶液を導入し、他方のチャンバにはコーティング剤を含まない開孔溶液を導入してもよい。
【0061】
ステップＳ２２の後、上記と同様にステップＳ４０が実施される。その後、ステップＳ５３において、ユーザは、本実施形態に係るコーティング有りのナノポアデバイスを取得することができる。その後、チャンバ内の溶液を開孔溶液から計測溶液に置換することで、測定対象物のナノポア計測を行うことができる。
【0062】
（本実施形態の変形例に係るコーティング有りナノポアの形成方法）
コーティング剤入りの開孔溶液を用いてナノポアを形成後、チャンバ中の溶液を、開孔溶液とは性質が異なるコーティング溶液（第３の電解液）に置換してナノポアを浸漬することで、さらなるコーティングを実施してもよい。本変形例のコーティング方法は以下の通りである。
コーティング剤入りの開孔溶液を用いてナノポアを形成後、チャンバ中の溶液を、開孔溶液とは性質が異なるコーティング溶液（第３の電解液）に置換してナノポアを浸漬することで、さらなるコーティングを実施してもよい。本変形例のコーティング方法は以下の通りである。
【0063】
ステップＳ１０及びＳ２２は、上述の通りである。ステップＳ２２の後、処理はステップＳ３２に移行する。
【0064】
ステップＳ３２において、ユーザは、各チャンバ内の液体を開孔溶液からコーティング溶液に置換し、例えば３０分間放置（ナノポアを浸漬）する。
【0065】
コーティング溶液のｐＨは、適宜コーティング剤とナノポア表面との親和性が高くなるような値を選択することができる。例えば、正に帯電したコーティング剤を用いる場合は、ナノポアが負に帯電するようなｐＨの水溶液を用いることができ、負に帯電した分子をコーティング剤に用いる場合には、ナノポアが正に帯電するように低いｐＨの水溶液を用いることができる。
【0066】
コーティング溶液へのナノポアの浸漬時間は３０分間に限定されず、コーティング剤の種類又はナノポアの材質等の条件に応じて設定することができる。例えば、浸漬時間は５分以上２４０時間以内とすることができる。ステップＳ２２（ナノポアの開孔時）において使用される開孔溶液中のコーティング剤と、ステップＳ３２（開孔後）において使用されるコーティング溶液中のコーティング剤とは、同じであってもよいし異なっていてもよい。
【0067】
ステップＳ３２の後、上記と同様にステップＳ４０が実施される。その後、ステップＳ５４において、ユーザは、変形例に係るコーティング有りのナノポアデバイスを取得することができる。
【0068】
（コーティング剤について）
コーティング剤は、ナノポアが形成されるメンブレンに物理吸着又は化学吸着し分子層を形成可能な有機物である。コーティング剤は、ナノポア表面と相互作用する物質、より具体的には、ナノポア表面に吸着可能な構造を有する物質とすることができる。あるいは、コーティング剤は、親水性構造を有する物質とすることができる。
コーティング剤は、ナノポアが形成されるメンブレンに物理吸着又は化学吸着し分子層を形成可能な有機物である。コーティング剤は、ナノポア表面と相互作用する物質、より具体的には、ナノポア表面に吸着可能な構造を有する物質とすることができる。あるいは、コーティング剤は、親水性構造を有する物質とすることができる。
【0069】
コーティング剤の具体例としては、例えば界面活性剤（非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤又は両性界面活性剤）、生体分子（ペプチド又は脂質など）、並びに、生体分子以外の高分子が挙げられる。
【0070】
非イオン界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（商品名：Ｔｗｅｅｎ（登録商標））、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（商品名：Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標））、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（商品名：Ｂｒｉｊ）、ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（ＤＤＭ）などのアルキルポリグリコシド、ジギトニンが挙げられる。
【0071】
アニオン性界面活性剤としては、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの硫酸エステル、コール酸塩、サルコシルが挙げられる。
【0072】
カチオン性界面活性剤としては、例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）などの臭化アルキルトリメチルアンモニウムが挙げられる。
【0073】
両性界面活性剤としては、例えば３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、及び、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）が挙げられる。
【0074】
ペプチドとしては例えば、固体ナノポアに吸着することが知られているＬ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）及び親水性アミノ酸を配列に有する物質、又は、Yoichi Kumada, et al., J Biotechnol.Aug 20;184:103-10 (2014)に記載されているような固体界面に特異的に吸着するペプチド及びその改変ペプチドを用いることができる。
【0075】
生体分子以外の高分子としては、分子構造内の一端部に疎水部を有し他端部に親水部を有する分子、又は、立体構造を取ったときに一部分に疎水部が位置し、他の部分に親水部が位置するような特徴を持つ両親媒性分子が挙げられる。具体的には、例えば２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）、及び、２－アミノエチルビニルエーテルとイソブチルビニルエーテルとから成る共重合体が挙げられる。
【0076】
測定対象物が正又は負に帯電したものである場合は、測定対象物の電荷と同じに帯電した部位をもつコーティング剤（ＣＴＡＢ、ＳＤＳ、酸アミノ酸／塩基性アミノ酸を配列にもつペプチド等）を使用することにより、コーティング剤と測定対象物との反発力が働くため、高い吸着抑制効果を得ることができる。
【0077】
コーティング剤は上述した物質の１種を単独で用いてもよいし、２種類以上を併用してもよい。コーティング剤の濃度は、例えば１ｐＭ以上飽和濃度以下、又は、０．０００１ｗｔ％以上飽和濃度以下とすることができる。
【0078】
上述したナノポア未開孔のナノポア形成装置は、コーティング剤を含む開孔溶液が各チャンバに充填された状態でユーザに提供されてもよい。代替的に、各チャンバが空でありかつナノポア未開孔のナノポア形成装置と、コーティング剤を含む開孔溶液とを、ナノポア形成キットとしてユーザに提供してもよい。コーティング剤は、使用時に適当な溶媒で希釈するための濃縮液として提供されてもよいし、あるいは使用時に適当な溶媒で再構成するための固形状態（例えば粉末など）であってもよい。
【0079】
＜第１の実施形態のまとめ＞
以上のように、本実施形態に係るナノポア形成方法は、ナノポアを絶縁破壊で形成する際にコーティング剤（有機分子）を溶液中に添加しておくことで、コーティング剤をナノポア表面に吸着させることが可能であることが新たに見出されたことによりなされたものである。本実施形態の手法によれば、ナノポア形成後にナノポアをコーティング溶液に浸漬しなくても、ナノポアの開孔と同時に、すなわち短時間で簡便にコーティングすることができる。これに対し、非特許文献５のナノポアのコーティング方法では、形成後のナノポアを界面活性剤溶液に所定の時間浸漬する必要がある。
以上のように、本実施形態に係るナノポア形成方法は、ナノポアを絶縁破壊で形成する際にコーティング剤（有機分子）を溶液中に添加しておくことで、コーティング剤をナノポア表面に吸着させることが可能であることが新たに見出されたことによりなされたものである。本実施形態の手法によれば、ナノポア形成後にナノポアをコーティング溶液に浸漬しなくても、ナノポアの開孔と同時に、すなわち短時間で簡便にコーティングすることができる。これに対し、非特許文献５のナノポアのコーティング方法では、形成後のナノポアを界面活性剤溶液に所定の時間浸漬する必要がある。
【0080】
また、本実施形態の手法は、ナノポア表面に物理吸着又は化学吸着で有機分子をコーティングする手法であるため、負に帯電した分子だけでなく、正に帯電した分子についても吸着を抑制する効果がある。これに対し、非特許文献４では、絶縁破壊でナノポアを形成する際にＮａＣｌＯを水溶液中に添加しておくことで、ナノポアの表面を酸化し、負に帯電させるため、負に帯電した測定対象物（ＤＮＡ）のみのナノポアへの吸着を抑制することができる。
【0081】
さらに、本実施形態の手法によれば、ナノポアが開孔してすぐに、すなわちナノポア表面に物質が吸着していない状態においてコーティング剤（有機分子）が吸着するため、コーティング剤以外の物質の吸着が抑制される。結果として、本実施形態の手法によれば、高い吸着抑制効果を奏することができる。このように、開孔時に有機分子を水溶液に添加しておくと有機分子のナノポアへのコーティングが促進されるため、ナノポア形成後に有機分子溶液にナノポアデバイスを浸漬してコーティングを実施するよりも、高い詰まりの抑制効果が得られる。この現象は、本開示において新たに見出された現象であり、上述の公知例からは容易に類推することはできない。
【実施例0082】
以下、本開示の技術の実施例を説明する。
【0083】
１．ナノポアデバイスの作製
［比較例１：コーティング無し］
比較例１として、コーティング無しのナノポアデバイスを作製した。具体的には、まず、上述の＜ナノポアデバイスの作製方法＞の欄に記載の方法と同様にして、ナノポア未開孔のナノポアデバイスを準備した。
［比較例１：コーティング無し］
比較例１として、コーティング無しのナノポアデバイスを作製した。具体的には、まず、上述の＜ナノポアデバイスの作製方法＞の欄に記載の方法と同様にして、ナノポア未開孔のナノポアデバイスを準備した。
【0084】
次に、上述の＜ナノポア形成方法＞の欄に記載の方法と同様に、当該ナノポアデバイスをナノポア形成装置にセットし、１Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－１０ｍＭ ＥＤＴＡの開孔溶液（ｐＨ１２．７）を用いて、メンブレンの絶縁破壊によりナノポアを形成した。これにより、比較例１に係るナノポアデバイスを得た。
【0085】
［比較例２：開孔後コーティング］
図８は、比較例２に係るナノポアのコーティング方法を示す模式図である。図８に示すように、まず、比較例１と同様にしてナノポア１１０の形成済みのナノポアデバイスを作製した（ｉ）。その後、１Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１ｗｔ％ Ｔｗｅｅｎ２０水溶液（ｐＨ４．０）を各チャンバ内に充填し、３０分間浸漬して、コーティングを実施した（ｉｉ）。その後、各チャンバ内の溶液を、Ｔｗｅｅｎ２０を含まない溶液に置換した（ｉｉｉ）。
図８は、比較例２に係るナノポアのコーティング方法を示す模式図である。図８に示すように、まず、比較例１と同様にしてナノポア１１０の形成済みのナノポアデバイスを作製した（ｉ）。その後、１Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１ｗｔ％ Ｔｗｅｅｎ２０水溶液（ｐＨ４．０）を各チャンバ内に充填し、３０分間浸漬して、コーティングを実施した（ｉｉ）。その後、各チャンバ内の溶液を、Ｔｗｅｅｎ２０を含まない溶液に置換した（ｉｉｉ）。
【0086】
［実施例１：開孔時コーティング］
図９は、実施例１に係るナノポアのコーティング方法を示す模式図である。図９に示すように、まず、上述の＜ナノポアデバイスの作製方法＞の欄に記載の方法と同様にして、ナノポア未開孔のナノポアデバイスを準備した。そして、開孔溶液として、１Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１ｗｔ％ Ｔｗｅｅｎ２０水溶液（ｐＨ１２．７）を各チャンバに導入した（ｉ）。
図９は、実施例１に係るナノポアのコーティング方法を示す模式図である。図９に示すように、まず、上述の＜ナノポアデバイスの作製方法＞の欄に記載の方法と同様にして、ナノポア未開孔のナノポアデバイスを準備した。そして、開孔溶液として、１Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１ｗｔ％ Ｔｗｅｅｎ２０水溶液（ｐＨ１２．７）を各チャンバに導入した（ｉ）。
【0087】
次に、電極１０４に－１１Ｖを印加し、電極１０５に０Ｖを印加して、絶縁破壊によりナノポア１１０を形成した（ｉｉ）。ナノポアの開孔後すぐに、各チャンバ内の溶液を、Ｔｗｅｅｎ２０を含まない溶液に置換した（ｉｉｉ）。
【0088】
［実施例２：開孔時及び開孔後コーティング］
図１０は、実施例２に係るナノポアのコーティング方法を示す模式図である。図９に示すように、まず、実施例１と同様にして、ナノポア未開孔のナノポアデバイスを準備し、開孔溶液として、１Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１ｗｔ％ Ｔｗｅｅｎ２０水溶液（ｐＨ１２．７）を各チャンバに導入した（ｉ）。
図１０は、実施例２に係るナノポアのコーティング方法を示す模式図である。図９に示すように、まず、実施例１と同様にして、ナノポア未開孔のナノポアデバイスを準備し、開孔溶液として、１Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１ｗｔ％ Ｔｗｅｅｎ２０水溶液（ｐＨ１２．７）を各チャンバに導入した（ｉ）。
【0089】
次に、電極１０４に－１１Ｖを印加し、電極１０５に０Ｖを印加して、絶縁破壊によりナノポア１１０を形成した後、チャンバ内の溶液を、コーティング溶液（１Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１ｗｔ％ Ｔｗｅｅｎ２０水溶液（ｐＨ４．０））に置換し、３０分間浸漬した（ｉｉ）。
【0090】
３０分浸漬後、各チャンバ内の溶液を、Ｔｗｅｅｎ２０を含まない溶液に置換した（ｉｉｉ）。
【0091】
［比較例３：計測時コーティング］
図１１は、比較例３に係るナノポアのコーティング方法を示す模式図である。図１１に示すように、まず、比較例１と同様にしてナノポア１１０の形成済みのナノポアデバイスを作製した（ｉ）。その後、コーティング剤１４０としてＴｗｅｅｎ２０ ０．０１ｗｔ％を含み、検出対象物１４１として４１５ｂｐのＤＮＡを含む計測溶液を各チャンバ１２０及び１２１に導入した。電極１０４及び１０５間に電圧を印加して、ＤＮＡの封鎖電流の測定と同時に、ナノポア１１０のコーティングを実施した（ｉｉ）。
図１１は、比較例３に係るナノポアのコーティング方法を示す模式図である。図１１に示すように、まず、比較例１と同様にしてナノポア１１０の形成済みのナノポアデバイスを作製した（ｉ）。その後、コーティング剤１４０としてＴｗｅｅｎ２０ ０．０１ｗｔ％を含み、検出対象物１４１として４１５ｂｐのＤＮＡを含む計測溶液を各チャンバ１２０及び１２１に導入した。電極１０４及び１０５間に電圧を印加して、ＤＮＡの封鎖電流の測定と同時に、ナノポア１１０のコーティングを実施した（ｉｉ）。
【0092】
［実施例３：コーティング剤の濃度の変更］
開孔溶液のＴｗｅｅｎ２０の濃度を、０．０１％から０．１％に変更したこと以外は実施例１と同様にして、実施例３に係るナノポアデバイスを得た。
開孔溶液のＴｗｅｅｎ２０の濃度を、０．０１％から０．１％に変更したこと以外は実施例１と同様にして、実施例３に係るナノポアデバイスを得た。
【0093】
［実施例４：コーティング剤の種類の変更］
開孔溶液中のコーティング剤及びコーティング溶液中のコーティング剤をＴｗｅｅｎ２０からドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に変更したこと以外は実施例２と同様にして、実施例４に係るナノポアデバイスを得た。
開孔溶液中のコーティング剤及びコーティング溶液中のコーティング剤をＴｗｅｅｎ２０からドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に変更したこと以外は実施例２と同様にして、実施例４に係るナノポアデバイスを得た。
【0094】
２．計測可能時間の評価
比較例１～３、実施例１及び２に係るナノポアデバイスをそれぞれ６つ作製した。実施例３及び４に係るナノポアデバイスはそれぞれ３つ作製した。各ナノポアデバイスに対し、ＤＮＡサンプル及びＳＡ－ＤＮＡサンプルを導入して、イオン電流の測定を実施した。それぞれのナノポアデバイスについて計測可能時間を記録し、平均の計測可能時間を算出した。この計測可能時間により、各比較例及び実施例におけるコーティングの吸着抑制効果を評価する。
比較例１～３、実施例１及び２に係るナノポアデバイスをそれぞれ６つ作製した。実施例３及び４に係るナノポアデバイスはそれぞれ３つ作製した。各ナノポアデバイスに対し、ＤＮＡサンプル及びＳＡ－ＤＮＡサンプルを導入して、イオン電流の測定を実施した。それぞれのナノポアデバイスについて計測可能時間を記録し、平均の計測可能時間を算出した。この計測可能時間により、各比較例及び実施例におけるコーティングの吸着抑制効果を評価する。
【0095】
図１２は、比較例１～３及び実施例１～４のナノポアデバイスを用いた計測における平均計測可能時間を示すグラフである。
【0096】
図１２に示すように、コーティングを実施した場合（実施例１～４及び比較例２）、コーティング無しの場合（比較例１）と比較して平均計測可能時間が長く、測定対象物の吸着に対して抑制効果があることが確認できた。また、実施例１における平均計測可能時間は比較例２における平均計測可能時間よりも長いことから、ナノポアの開孔時に同時にコーティングを実施することにより、ナノポアの開孔後にコーティングを実施する場合よりも高い吸着抑制効果があることを確認した。以上のことから明らかなように、本開示の技術によるコーティング手法は、浸漬時間が不要であるため短時間での実施が可能であり、かつ従来手法よりも高い吸着抑制効果がある。
【0097】
実施例２における平均計測可能時間は、比較例１の平均計測可能時間及び実施例１の平均計測可能時間よりも長いことが分かる。このことから、実施例２のようにナノポアの開孔時及び開孔後にコーティングを実施することにより、吸着抑制効果を向上できることが確認された。
【0098】
比較例３のように、測定前にコーティングを実施しないで、ＤＮＡサンプルに直接コーティング剤を混合して測定を実施した場合（計測時コーティング）、コーティングを実施しなかった場合（比較例１）よりも平均計測可能時間が短くなった。なお、比較例３のいずれのデバイスも２４分以内に不可逆的な吸着が起こったため、ＳＡ－ＤＮＡサンプルの計測は実施できなかった。この実験結果から、計測溶液中に遊離したコーティング剤は、測定対象物の吸着に関して抑制効果が無いことが示唆された。
【0099】
以上の結果から、ナノポアに対する測定対象物の吸着の抑制効果は、開孔時及び開孔後コーティング＞開孔時コーティング＞開孔後コーティング＞計測時コーティング、の順に高いことが分かった。吸着抑制効果は、コーティング剤の被覆率とコーティングの持続性に依存すると考えられる。コーティング剤の被覆率は、被覆開始時の表面の活性度の高さと、被覆を行った時間によって変化し、コーティング剤の持続性はコーティング剤のナノポアに対する吸着性や結合力の強さによって変化すると考えられる。ここで、開孔時のコーティングの効果が、開孔後のコーティングよりも高い効果を奏するのは、絶縁破壊で形成したナノポアの表面が、開孔した直後が最も活性度が高く反応性に富むためであると考えられる。すなわち、開孔溶液に、ナノポア表面に吸着しやすい分子が存在すると、開孔後に分子を導入する場合と比較して高い密度でナノポアをコーティングできると考えられる。また、開孔後に時間が経過したナノポア表面は、大気中の汚染物質等の影響によって活性度が落ちる。コーティング分子が汚染物質の上に間接的に接着している状況も想定され、この場合は、コーティング剤の定着が弱くなり、コーティングの効果の持続時間が開孔時のコーティングよりも短いことに影響を及ぼしていると考えられる。
【0100】
また、実施例３のようにコーティング剤の濃度を０．１ｗｔ％とした場合、実施例１の０．０１ｗｔ％の場合と比較して平均計測可能時間が長くなったことが分かる。なお、コーティング剤の濃度が０．０１～０．１ｗｔ％の範囲についてのみ述べたが、この範囲外の濃度に変更した場合（例えば１ｐＭ以上飽和濃度以下、又は０．０００１ｗｔ％以上飽和濃度以下）でも、吸着抑制効果を得ることができると考えられる。
【0101】
実施例４のように、コーティング剤としてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いた場合においても、比較例１と比較して平均計測可能時間が長く、測定対象物がナノポアに吸着するのを抑制する効果があることが確認できた。
【0102】
３．測定対象物の変更
［実施例５：タンパク質の測定］
実施例２と同様にしてナノポアデバイスのコーティングを実施した。測定対象物として、正に帯電したタンパク質であるＭｅｔｈｙｌ－ＣｐＧ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ２（ＭＢＤ２）を準備した。ＭＢＤ２は、メチル化ＤＮＡを特異的に認識して結合するタンパク質であり、ＭＢＤ２の等電点の理論値はｐＨ１０．０６である。その後、計測溶液として、０．１Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｎＭ ＭＢＤ２を含む溶液（ｐＨ８．７）を調製し、当該計測溶液をｃｉｓチャンバに導入した。この計測溶液中では、ＭＢＤ２は正に帯電していると考えられる。次に、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極間に１００～３００ｍＶの範囲の電圧を印加して、イオン電流の測定を行った。
［実施例５：タンパク質の測定］
実施例２と同様にしてナノポアデバイスのコーティングを実施した。測定対象物として、正に帯電したタンパク質であるＭｅｔｈｙｌ－ＣｐＧ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ２（ＭＢＤ２）を準備した。ＭＢＤ２は、メチル化ＤＮＡを特異的に認識して結合するタンパク質であり、ＭＢＤ２の等電点の理論値はｐＨ１０．０６である。その後、計測溶液として、０．１Ｍ ＫＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｎＭ ＭＢＤ２を含む溶液（ｐＨ８．７）を調製し、当該計測溶液をｃｉｓチャンバに導入した。この計測溶液中では、ＭＢＤ２は正に帯電していると考えられる。次に、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極間に１００～３００ｍＶの範囲の電圧を印加して、イオン電流の測定を行った。
【0103】
図１３は、実施例５においてＭＢＤ２を測定したときの電流波形を示す図である。図１３に示すように、区間（ｉ）において１００ｍＶを印加し、区間（ｉ）及び（ｉｉ）の間に２００ｍＶを印加し、区間（ｉｉ）において３００ｍＶを印加し、区間（ｉｉｉ）において１００ｍＶを印加し、区間（ｉｖ）において３００ｍＶを印加し、区間（ｖ）において１００ｍＶを印加し、区間（ｖｉ）において３００ｍＶを印加した。
【0104】
図１４は、図１３の区間（ｉ）～（ｖｉ）をそれぞれ拡大した電流波形を示す図である。図１４に示すように、３００ｍＶの電圧が印加されている区間（ｉｉ）及び区間（ｉｖ）において、電流値が徐々に低下している様子が見られる。これは、ナノポアに多量のＭＢＤ２が引き寄せられ、ナノポアが詰まっているためだと考えられる。ここで、区間（ｉｉｉ）及び区間（ｖ）において、印加電圧を１００ｍＶに変更すると電流値が回復し、詰まる前と同様にタンパク質の通過電流波形を得ることができたことが確認された。
【0105】
［比較例４：コーティング無しナノポアを用いたタンパク質の測定］
比較例１と同様にしてコーティング無しのナノポアデバイスを作製した。その後、実施例５と同じ計測溶液を用いて、電極間に１００～２００ｍＶの範囲の電圧を印加して、イオン電流の測定を行った。
比較例１と同様にしてコーティング無しのナノポアデバイスを作製した。その後、実施例５と同じ計測溶液を用いて、電極間に１００～２００ｍＶの範囲の電圧を印加して、イオン電流の測定を行った。
【0106】
図１５は、比較例４においてＭＢＤ２を測定したときの電流波形を示す図である。図１５に示すように、区間（ｉ）において１００ｍＶを印加し、区間（ｉｉ）において２００ｍＶを印加し、区間（ｉｉｉ）において１００ｍＶを印加し、区間（ｉｖ）において２００ｍＶを印加し、区間（ｖ）において１００ｍＶを印加し、区間（ｖｉ）において２００ｍＶを印加し、区間（ｖｉｉ）において１００ｍＶを印加し、区間（ｖｉｉｉ）において２００ｍＶを印加した。
【0107】
図１６は、図１５の区間（ｉ）～（ｖｉｉｉ）をそれぞれ拡大した電流波形を示す図である。図１６に示すように、区間（ｉｖ）、区間（ｖｉ）及び区間（ｖｉｉｉ）において電圧２００ｍＶを印加した際に、ナノポアの詰まりに由来すると考えられる電流値の減少がみられた。そこで、電圧を１００ｍＶに戻した後に（区間（ｉｉｉ）及び区間（ｉｖ））パルス電圧を印加することで、詰まりの解消を試みた。その結果、電流値は詰まる前の水準に回復したものの、タンパク質の通過電流波形はノイズに埋もれて取得することができなかった。これは、２００ｍＶの電圧を印加してナノポアにＭＢＤ２が引き寄せられた際に、不可逆的な吸着が発生したためであると考えられる。
【0108】
実施例５及び比較例４の結果から、本開示のナノポアのコーティング手法が、正に帯電した測定対象物（タンパク質）に対しても吸着の抑制効果を発揮できることが確認できた。
【0109】
［変形例］
本開示は、上述した実施形態に限定されるものでなく、様々な変形例を含んでいる。例えば、上述した実施形態は、本開示を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備える必要はない。また、ある実施形態の一部を他の実施形態の構成に置き換えることができる。また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることもできる。また、各実施形態の構成の一部について、他の実施形態の構成の一部を追加、削除又は置換することもできる。
本開示は、上述した実施形態に限定されるものでなく、様々な変形例を含んでいる。例えば、上述した実施形態は、本開示を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備える必要はない。また、ある実施形態の一部を他の実施形態の構成に置き換えることができる。また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることもできる。また、各実施形態の構成の一部について、他の実施形態の構成の一部を追加、削除又は置換することもできる。
【符号の説明】
【0110】
１０１…メンブレン（膜）
１０２、１０３…水溶液（第１の電解液、第２の電解液）
１０４、１０５…電極
１０６、１０８…溶液導入口
１０７、１０９…溶液出口
１１０…ナノポア
１１２…支持基板
１１３、１１４…膜
１２０、１２１…チャンバ
１３０、１３１…シール材
１４０…コーティング剤
１４１…検出対象物
２０１…電流計
３００…電圧源
４０１…ベース電流
４０２…通過電流波形
１０２、１０３…水溶液（第１の電解液、第２の電解液）
１０４、１０５…電極
１０６、１０８…溶液導入口
１０７、１０９…溶液出口
１１０…ナノポア
１１２…支持基板
１１３、１１４…膜
１２０、１２１…チャンバ
１３０、１３１…シール材
１４０…コーティング剤
１４１…検出対象物
２０１…電流計
３００…電圧源
４０１…ベース電流
４０２…通過電流波形
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
