(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022183762
(43)【公開日】2022-12-13
(54)【発明の名称】核内ノンコーディングＲＮＡの抽出方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20221206BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20221206BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20221206BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20221206BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 100Z
C12Q1/6844 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12Q1/6869 Z
C12N15/10 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】25
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021091242
(22)【出願日】2021-05-31
(71)【出願人】
【識別番号】000003160
【氏名又は名称】東洋紡株式会社
(72)【発明者】
【氏名】武田 貴成
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA08
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ52
4B063QR16
4B063QR52
4B063QS14
4B063QS25
4B063QS26
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】 抽出の困難な核内ｎｃＲＮＡを安定的に効率よく細胞から抽出する方法を提供すること。
【解決手段】 本発明では、核内構造体の分解に適したプロテアーゼ（例えば、サブチリシン）及び細胞溶解剤を含む反応液で細胞試料を処理することにより、一般に抽出が困難な核内ｎｃＲＮＡを含む全ＲＮＡを細胞から安定的・効率的に抽出する手法を提供する。核内ｎｃＲＮＡとしてはパラスペックルを構成するＮＥＡＴ１、核スペックルを構成するＭＡＬＡＴ１などの核内ｌｎｃＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【選択図】 なし
【解決手段】 本発明では、核内構造体の分解に適したプロテアーゼ（例えば、サブチリシン）及び細胞溶解剤を含む反応液で細胞試料を処理することにより、一般に抽出が困難な核内ｎｃＲＮＡを含む全ＲＮＡを細胞から安定的・効率的に抽出する手法を提供する。核内ｎｃＲＮＡとしてはパラスペックルを構成するＮＥＡＴ１、核スペックルを構成するＭＡＬＡＴ１などの核内ｌｎｃＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞溶解剤および非特異的プロテアーゼを含む反応液で細胞試料を処理する工程を包含する、核内ノンコーディングＲＮＡの抽出方法。
【請求項2】
該細胞試料中における被験細胞数が、１～５００細胞である請求項１記載の方法。
【請求項3】
該細胞試料が、動物細胞を含む試料である請求項１または２記載の方法。
【請求項4】
該反応液中における非特異的プロテアーゼの濃度が、０．０００１ｍｇ／ｍＬ以上、１ｍｇ／ｍＬ以下である請求項１～３のいずれか記載の方法。
【請求項5】
該非特異的プロテアーゼが、サブチリシン又はその変異体である、請求項１～４のいずれか記載の方法。
【請求項6】
該反応液中におけるサブチリシン又はその変異体の濃度が、０．０００５ｍｇ／ｍＬ以上、０．５ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項５記載の方法。
【請求項7】
該細胞溶解剤として、界面活性剤を含む請求項１～６のいずれか記載の方法。
【請求項8】
該界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である請求項７記載の方法。
【請求項9】
該非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリエチレングリコールモノ－ｐ－イソオクチルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートからなる群より選択される少なくとも１種である請求項８記載の方法。
【請求項10】
該細胞溶解剤として、カオトロピック剤を含む請求項１～９のいずれか記載の方法。
【請求項11】
該カオトロピック剤が尿素、及び過塩素酸リチウム塩からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１０記載の方法。
【請求項12】
核内ノンコーディングＲＮＡを含む全ＲＮＡの抽出方法である請求項１～１１のいずれか記載の方法。
【請求項13】
該核内ノンコーディングＲＮＡが、５ｋｂ以上の核内長鎖ノンコーディングＲＮＡである、請求項１～１２のいずれか記載の方法。
【請求項14】
該核内ノンコーディングＲＮＡが、ＮＥＡＴ１及びＭＡＬＡＴ１からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１～１３のいずれか記載の方法。
【請求項15】
該反応液で処理した細胞試料を６５℃以上で１分間以上インキュベートする工程を更に包含する請求項１～１４のいずれか記載の方法。
【請求項16】
該インキュベートを７０℃以上で行う請求項１５記載の方法。
【請求項17】
該反応液が酸性溶液である、請求項１～１６のいずれか記載の方法。
【請求項18】
該酸性溶液がｐＨ４．０～６．０である請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
該反応液が、デオキシリボヌクレアーゼ及びＲＮａｓｅ阻害剤からなる群より選択される少なくとも一種を更に含む、請求項１～１８のいずれかに記載の方法。
【請求項20】
該反応液が、ポリイノシン酸、ポリシチジル酸、ポリグアニル酸、ポリアデニル酸、ポリチミジル酸、ポリウリジル酸、ポリデオキシイノシン酸、ポリデオキシシチジル酸、ポリデオキシグアニル酸、ポリデオキシアデニル酸、ポリデオキシチミジル酸、ポリデオキシウリジル酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の核酸ホモポリマーを更に含有する、請求項１～１９のいずれか記載の方法。
【請求項21】
デオキシリボヌクレアーゼで処理する工程を更に包含する請求項１～２０のいずれか記載の方法。
【請求項22】
請求項１～２１のいずれか記載の方法で抽出したＲＮＡを逆転写する工程を包含するＤＮＡ合成方法。
【請求項23】
該逆転写が、ＲＴ－ＰＣＲ法又はＲＴ－ＲａｍＤＡ法において行われる、請求項２２記載の方法。
【請求項24】
請求項１～２１のいずれかに記載の方法で抽出したＲＮＡ、又は請求項２２若しくは２３に記載の方法により合成したＤＮＡを用いる、核内ノンコーディングＲＮＡの解析方法。
【請求項25】
細胞溶解剤および非特異的プロテアーゼを含有する、核内ノンコーディングＲＮＡを抽出するために用いられるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、核内複合体を形成するタンパク質の溶解により、核内ノンコーディングＲＮＡ（核内ｎｃＲＮＡともいう）を含む全ＲＮＡの効率的な抽出および解析を可能にする分子生物学的な改良技術に関する。本発明により、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）やリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの技術を用いた遺伝子解析による研究を促進することができる。
【背景技術】
【0002】
分子生物学分野において、ＰＣＲ技術を利用した遺伝子解析は広く用いられる技術となった。特にリバーストランスクリプターゼ（ＲＴ）を利用したＲＴ－ＰＣＲは、ＲＮＡの発現量およびその配列を解析する上で、ＮＧＳやリアルタイムＰＣＲとともに必須の技術として確立されている。
【0003】
ＲＴ－ＰＣＲなどに供するため、細胞から核酸を抽出する手法が数多く樹立されている。広く知られているＲＮＡ抽出法の一つが、プロテアーゼなどで細胞を破砕して抽出する方法であるが、この手法では細胞に含まれるすべてのＲＮＡ（全ＲＮＡともいう）を一様に効率よく抽出できていない。抽出されにくいＲＮＡの一例として、核内ＲＮＡなどが挙げられる。
【0004】
核内には多量のＲＮＡ、特にＮＥＡＴ１やＭＡＬＡＴ１のようなノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）が含まれることが知られている（非特許文献１、２）。しかし、これらの核内ｎｃＲＮＡは様々なタンパク質と結合し、核内構造体を形成しているため、抽出されにくい。典型的な例として、ＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡを多量に含む核スペックルや、ＮＥＡＴ１を中心に形成されるパラスペックルは、ＲＮＡおよびタンパク質の密度が高く、それらに含まれるＲＮＡの抽出が困難である。
【0005】
そして、生物学的試料に含まれるＲＮＡは、種々のヌクレアーゼによる分解や、液体中での自然分解を受け易い。この点は核内ｎｃＲＮＡの抽出でも同様である。従って、抽出困難でありながら分解され易い核内ｎｃＲＮＡの抽出には、特に迅速かつ確実な細胞溶解による抽出が必要となる。
【0006】
近年、ＮＥＡＴ１やＭＡＬＡＴ１などの核内ＲＮＡは、腫瘍や糖尿病のような難治性疾患と関連することが示唆されている。しかし、核内ＲＮＡの詳細な機能や意義は依然として不明な点が多い。核内ＲＮＡを解析することは、分子生物学的に重要であり、難治性疾患の治療においても有用な知見を提供する可能性がある。従って、核内ＲＮＡを含む全ＲＮＡを迅速かつ効率よく抽出できる手法の提供により、分子生物学ひいては難治性疾患の治療に貢献できることが期待される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｗｅｓｔ Ｊ． Ａ． ｅｔ． ａｌ．， Ｔｈｅ Ｌｏｎｇ Ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ ＮＥＡＴ１ ａｎｄ ＭＡＬＡＴ１ Ｂｉｎｄ Ａｃｔｉｖｅ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｓｉｔｅｓ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ， ２０１４
【非特許文献2】Ｙａｍａｚａｋｉ Ｔ． ｅｔ． ａｌ．， Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ＮＥＡＴ１ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒａｌ ｌｎｃＲＮＡ Ｉｎｄｕｃｅ Ｐａｒａｓｐｅｃｋｌｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｐｈａｓｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ， ２０１８
【非特許文献3】Ｈａｙａｓｈｉ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｕｎｃｏｖｅｒｓ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｒ ＲＮＡｓ， Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
細胞試料からの全ＲＮＡ抽出を行う際に、核内ｎｃＲＮＡを安定的・効率的に抽出するための新たな方法の開発が求められている（非特許文献３）。この抽出効率が安定しない原因として、核内構造体は核酸およびタンパク質の凝集体であり、完全な溶解が困難であることが想定される。よって本発明では、従来からＲＮＡ抽出に用いられているプロテアーゼよりも核内構造体の分解により適したプロテアーゼを見出し、このプロテアーゼを含む反応液で処理することにより、抽出の困難な核内ｎｃＲＮＡを含めた全ＲＮＡを細胞から安定的・効率的に抽出できる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者は、核内構造体の分解に適し、核内ｎｃＲＮＡ、例えばパラスペックルの形成に関わるＮＥＡＴ１ ＲＮＡや核スペックルの形成に関わるＭＡＬＡＴ１ ＲＮＡの抽出に優れたプロテアーゼを見出し、このプロテアーゼを細胞溶解剤と共に用いることで、核内ｎｃＲＮＡを含めた全ＲＮＡの安定的・効率的な抽出が可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0010】
即ち、代表的な本発明は以下の態様を包含する。
［項１］細胞溶解剤および非特異的プロテアーゼを含む反応液で細胞試料を処理する工程を包含する、核内ノンコーディングＲＮＡの抽出方法。
［項２］該細胞試料中における被験細胞数が、１～５００細胞である項１記載の方法。
［項３］該細胞試料が、動物細胞を含む試料である項１または２記載の方法。
［項４］該反応液中における非特異的プロテアーゼの濃度が、０．０００１ｍｇ／ｍＬ以上、１ｍｇ／ｍＬ以下である項１～３のいずれか記載の方法。
［項５］該非特異的プロテアーゼが、サブチリシン又はその変異体である、項１～４のいずれか記載の方法。
［項６］該反応液中におけるサブチリシン又はその変異体の濃度が、０．０００５ｍｇ／ｍＬ以上、０．５ｍｇ／ｍＬ以下である、項５記載の方法。
［項７］該細胞溶解剤として、界面活性剤を含む項１～６のいずれか記載の方法。
［項８］該界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である項７記載の方法。
［項９］該非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリエチレングリコールモノ－ｐ－イソオクチルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートからなる群より選択される少なくとも１種である項８記載の方法。
［項１０］該細胞溶解剤として、カオトロピック剤を含む項１～９のいずれか記載の方法。
［項１１］該カオトロピック剤が尿素、及び過塩素酸リチウム塩からなる群より選択される少なくとも１種である項１０記載の方法。
［項１２］核内ノンコーディングＲＮＡを含む全ＲＮＡの抽出方法である項１～１１のいずれか記載の方法。
［項１３］ 該核内ノンコーディングＲＮＡが、５ｋｂ以上の核内長鎖ノンコーディングＲＮＡである、項１～１２のいずれか記載の方法。
［項１４］該核内ノンコーディングＲＮＡが、ＮＥＡＴ１及びＭＡＬＡＴ１からなる群より選択される少なくとも１種である項１～１３のいずれか記載の方法。
［項１５］該反応液で処理した細胞試料を６５℃以上で１分間以上インキュベートする工程を更に包含する項１～１４のいずれか記載の方法。
［項１６］該インキュベートを７０℃以上で行う項１５記載の方法。
［項１７］該反応液が酸性溶液である、項１～１６のいずれか記載の方法。
［項１８］該酸性溶液がｐＨ４．０～６．０である項１７に記載の方法。
［項１９］該反応液が、デオキシリボヌクレアーゼ及びＲＮａｓｅ阻害剤からなる群より選択される少なくとも一種を更に含む、項１～１８のいずれかに記載の方法。
［項２０］ 該反応液が、ポリイノシン酸、ポリシチジル酸、ポリグアニル酸、ポリアデニル酸、ポリチミジル酸、ポリウリジル酸、ポリデオキシイノシン酸、ポリデオキシシチジル酸、ポリデオキシグアニル酸、ポリデオキシアデニル酸、ポリデオキシチミジル酸、ポリデオキシウリジル酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の核酸ホモポリマーを更に含有する、項１～１９のいずれか記載の方法。
［項２１］デオキシリボヌクレアーゼで処理する工程を更に包含する項１～２０のいずれか記載の方法。
［項２２］項１～２１のいずれか記載の方法で抽出したＲＮＡを逆転写する工程を包含するＤＮＡ合成方法。
［項２３］該逆転写が、ＲＴ－ＰＣＲ法又はＲＴ－ＲａｍＤＡ法において行われる、項２２記載の方法。
［項２４］項１～２１のいずれかに記載の方法で抽出したＲＮＡ、又は項２２若しくは２３に記載の方法により合成したＤＮＡを用いる、核内ノンコーディングＲＮＡの解析方法。
［項２５］ 細胞溶解剤および非特異的プロテアーゼを含有する、核内ノンコーディングＲＮＡを抽出するために用いられるキット。
［項１］細胞溶解剤および非特異的プロテアーゼを含む反応液で細胞試料を処理する工程を包含する、核内ノンコーディングＲＮＡの抽出方法。
［項２］該細胞試料中における被験細胞数が、１～５００細胞である項１記載の方法。
［項３］該細胞試料が、動物細胞を含む試料である項１または２記載の方法。
［項４］該反応液中における非特異的プロテアーゼの濃度が、０．０００１ｍｇ／ｍＬ以上、１ｍｇ／ｍＬ以下である項１～３のいずれか記載の方法。
［項５］該非特異的プロテアーゼが、サブチリシン又はその変異体である、項１～４のいずれか記載の方法。
［項６］該反応液中におけるサブチリシン又はその変異体の濃度が、０．０００５ｍｇ／ｍＬ以上、０．５ｍｇ／ｍＬ以下である、項５記載の方法。
［項７］該細胞溶解剤として、界面活性剤を含む項１～６のいずれか記載の方法。
［項８］該界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である項７記載の方法。
［項９］該非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリエチレングリコールモノ－ｐ－イソオクチルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートからなる群より選択される少なくとも１種である項８記載の方法。
［項１０］該細胞溶解剤として、カオトロピック剤を含む項１～９のいずれか記載の方法。
［項１１］該カオトロピック剤が尿素、及び過塩素酸リチウム塩からなる群より選択される少なくとも１種である項１０記載の方法。
［項１２］核内ノンコーディングＲＮＡを含む全ＲＮＡの抽出方法である項１～１１のいずれか記載の方法。
［項１３］ 該核内ノンコーディングＲＮＡが、５ｋｂ以上の核内長鎖ノンコーディングＲＮＡである、項１～１２のいずれか記載の方法。
［項１４］該核内ノンコーディングＲＮＡが、ＮＥＡＴ１及びＭＡＬＡＴ１からなる群より選択される少なくとも１種である項１～１３のいずれか記載の方法。
［項１５］該反応液で処理した細胞試料を６５℃以上で１分間以上インキュベートする工程を更に包含する項１～１４のいずれか記載の方法。
［項１６］該インキュベートを７０℃以上で行う項１５記載の方法。
［項１７］該反応液が酸性溶液である、項１～１６のいずれか記載の方法。
［項１８］該酸性溶液がｐＨ４．０～６．０である項１７に記載の方法。
［項１９］該反応液が、デオキシリボヌクレアーゼ及びＲＮａｓｅ阻害剤からなる群より選択される少なくとも一種を更に含む、項１～１８のいずれかに記載の方法。
［項２０］ 該反応液が、ポリイノシン酸、ポリシチジル酸、ポリグアニル酸、ポリアデニル酸、ポリチミジル酸、ポリウリジル酸、ポリデオキシイノシン酸、ポリデオキシシチジル酸、ポリデオキシグアニル酸、ポリデオキシアデニル酸、ポリデオキシチミジル酸、ポリデオキシウリジル酸、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の核酸ホモポリマーを更に含有する、項１～１９のいずれか記載の方法。
［項２１］デオキシリボヌクレアーゼで処理する工程を更に包含する項１～２０のいずれか記載の方法。
［項２２］項１～２１のいずれか記載の方法で抽出したＲＮＡを逆転写する工程を包含するＤＮＡ合成方法。
［項２３］該逆転写が、ＲＴ－ＰＣＲ法又はＲＴ－ＲａｍＤＡ法において行われる、項２２記載の方法。
［項２４］項１～２１のいずれかに記載の方法で抽出したＲＮＡ、又は項２２若しくは２３に記載の方法により合成したＤＮＡを用いる、核内ノンコーディングＲＮＡの解析方法。
［項２５］ 細胞溶解剤および非特異的プロテアーゼを含有する、核内ノンコーディングＲＮＡを抽出するために用いられるキット。
【発明の効果】
【0011】
本発明により、核内ｎｃＲＮＡを含めた全ＲＮＡの安定的かつ効率的な抽出が可能となり、全ＲＮＡを用いた遺伝子解析の精度をより高めることができる。これにより、従来は解析が困難であった多種多様な遺伝子の詳細な解析が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図2】図２は、実施例１におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。核酸ポリマー及び界面活性剤の存在下でネガティブコントロール（プロテアーゼなし）、サブチリシン（条件１）、プロテイナーゼＫ（条件２）またはプロナーゼ（条件３）を用いて細胞からＲＮＡの抽出を行い、逆転写反応を行った後、リアルタイムＰＣＲにてＣｔ値を測定した。ネガティブコントロールにおけるＣｔ値からサブチリシン、プロテイナーゼＫまたはプロナーゼを用いた場合のＣｔ値を引き、ΔＣｔ値を求めることで、ＮＥＡＴ１遺伝子の５’領域、中央領域（ｍｉｄ）、３’領域、ＭＡＬＡＴ１遺伝子の１領域、およびβＡＣＴＩＮ遺伝子の１領域の抽出量を比較した。
【図3】図３は、実施例２におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。核酸ポリマー及び界面活性剤の存在下でネガティブコントロール（プロテアーゼなし）、サブチリシン（条件１）、プロテイナーゼＫ（条件２）またはプロナーゼ（条件３）を用いて細胞からＲＮＡの抽出を行い、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行った後、リアルタイムＰＣＲにてＣｔ値を測定した。ネガティブコントロールにおけるＣｔ値からサブチリシン、プロテイナーゼＫまたはプロナーゼを用いた場合のＣｔ値を引き、ΔＣｔ値を求めることで、ＮＥＡＴ１遺伝子の５’領域、中央領域（ｍｉｄ）、３’領域、およびＭＡＬＡＴ１遺伝子の１領域の抽出量を比較した。
【図4】図４は、実施例３におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。界面活性剤の存在下でネガティブコントロール（プロテアーゼなし）、サブチリシン（条件１）、プロテイナーゼＫ（条件２）またはプロナーゼ（条件３）を用いて細胞からＲＮＡの抽出を行い、逆転写反応を行った後、リアルタイムＰＣＲにてＣｔ値を測定した。ネガティブコントロールにおけるＣｔ値からサブチリシン、プロテイナーゼＫまたはプロナーゼを用いた場合のＣｔ値を引き、ΔＣｔ値を求めることで、ＮＥＡＴ１遺伝子の５’領域、中央領域（ｍｉｄ）、３’領域、およびＭＡＬＡＴ１遺伝子の１領域の抽出量を比較した。
【図5】図５は、実施例４におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。界面活性剤の存在下でネガティブコントロール（プロテアーゼなし）、サブチリシン（条件１）、プロテイナーゼＫ（条件２）またはプロナーゼ（条件３）を用いて細胞からＲＮＡの抽出を行い、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行った後、リアルタイムＰＣＲにてＣｔ値を測定した。ネガティブコントロールにおけるＣｔ値からサブチリシン、プロテイナーゼＫまたはプロナーゼを用いた場合のＣｔ値を引き、ΔＣｔ値を求めることで、ＮＥＡＴ１遺伝子の５’領域、中央領域（ｍｉｄ）、３’領域、およびＭＡＬＡＴ１遺伝子の１領域の抽出量を比較した。
【図6】図６は、実施例５におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。ネガティブコントロール（プロテアーゼおよび細胞溶解剤なし）、条件１（サブチリシン添加）、条件２（サブチリシン＋ポリオキシエチレンオレイルエーテル）、条件３（サブチリシン＋ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）の抽出反応液を用いて細胞からＲＮＡの抽出を行い、逆転写反応を行った後、リアルタイムＰＣＲにてＣｔ値を測定することで、ＮＥＡＴ１遺伝子の中央領域（ｍｉｄ）およびＭＡＬＡＴ１遺伝子の１領域の抽出量を比較した。
【図7】図７は、実施例６におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。条件１（ｐＨ５．５）、条件２（ｐＨ６．５）、条件３（ｐＨ７．０）の抽出反応液を用いて細胞からＲＮＡの抽出を行い、逆転写反応を行った後、リアルタイムＰＣＲにてＣｔ値を測定することで、ＮＥＡＴ１遺伝子の中央領域（ｍｉｄ）の抽出量を比較した。
【図8】図８は、実施例７におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。条件１（ｐＨ７．０）、条件２（ｐＨ７．５）、条件３（ｐＨ８．０）、条件４（ｐＨ８．５）の抽出反応液を用いて細胞からＲＮＡの抽出を行い、逆転写反応を行った後、リアルタイムＰＣＲにてＣｔ値を測定することで、ＮＥＡＴ１遺伝子の中央領域（ｍｉｄ）の抽出量を比較した。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
＜核内ノンコーディングＲＮＡの抽出方法＞
本発明は、細胞試料から核内ノンコーディングＲＮＡ（核内ｎｃＲＮＡ）を安定的・効率的に抽出する方法を提供する。本方法は、核内ｎｃＲＮＡのみを細胞試料から抽出するわけではなく、核外輸送されたｍＲＮＡ等の他のＲＮＡも核内ｎｃＲＮＡと共に抽出する。従って、本発明の核内ｎｃＲＮＡの抽出方法は、核内ｎｃＲＮＡを含む全ＲＮＡの抽出方法ということもできる。本発明により、従来の核外輸送されるｍＲＮＡを中心としたＲＮＡ抽出法よりも、核内ＲＮＡを含む多種多様なＲＮＡの抽出が可能となる。
＜核内ノンコーディングＲＮＡの抽出方法＞
本発明は、細胞試料から核内ノンコーディングＲＮＡ（核内ｎｃＲＮＡ）を安定的・効率的に抽出する方法を提供する。本方法は、核内ｎｃＲＮＡのみを細胞試料から抽出するわけではなく、核外輸送されたｍＲＮＡ等の他のＲＮＡも核内ｎｃＲＮＡと共に抽出する。従って、本発明の核内ｎｃＲＮＡの抽出方法は、核内ｎｃＲＮＡを含む全ＲＮＡの抽出方法ということもできる。本発明により、従来の核外輸送されるｍＲＮＡを中心としたＲＮＡ抽出法よりも、核内ＲＮＡを含む多種多様なＲＮＡの抽出が可能となる。
【0014】
１．細胞試料から核内ｎｃＲＮＡを抽出する方法
一つの実施形態において、本発明の核内ｎｃＲＮＡを抽出する方法は、細胞試料と、細胞溶解剤及び非特異的なプロテアーゼを含む反応液とを接触させて、該反応液で該細胞試料を処理する工程を少なくとも包含する。本発明の方法は、特定の反応液で処理するという比較的簡便な方法でありながら、核内構造体において凝縮しており、通常は抽出が困難なｎｃＲＮＡを安定的・効率的に抽出できるという点で優れている。
一つの実施形態において、本発明の核内ｎｃＲＮＡを抽出する方法は、細胞試料と、細胞溶解剤及び非特異的なプロテアーゼを含む反応液とを接触させて、該反応液で該細胞試料を処理する工程を少なくとも包含する。本発明の方法は、特定の反応液で処理するという比較的簡便な方法でありながら、核内構造体において凝縮しており、通常は抽出が困難なｎｃＲＮＡを安定的・効率的に抽出できるという点で優れている。
【0015】
１－１．核内構造体
対象となる核内構造体は特に限定されず、ｎｃＲＮＡとタンパク質等が凝集して形成された任意の核内に存在する構造体であり得る。例えば、好ましい核内構造体の例として、パラスペックルおよび核スペックルが挙げられる。核内構造体は、ｎｃＲＮＡを含む核酸とタンパク質の集合体であり、溶出が困難であることが知られている（Ｕｎｕｓｕａｌ ｓｅｍｉ－ｅｘｔｒａｃｔａｂｉｌｉｔｙ ａｓ ａ ｈａｌｌｍａｒｋ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｂｏｄｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒａｌ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ， Ｔａｋｅｓｈｉ Ｃｈｕｊｏ ｅｔ． ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， ２０１７（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）など）。またパラスペックル含有ｎｃＲＮＡとしてＮＥＡＴ１およびそのトランスクリプトバリアントが、核スペックル含有ｎｃＲＮＡとしてＭＡＬＡＴ１およびそのトランスクリプトバリアントが広く知られている。パラスペックルにおいては、多数のＮＥＡＴ１のｎｃＲＮＡおよびそのトランスクリプトバリアントが中央領域に疎水性タンパク質を結合させることで中心部に集合させ、外側に３’領域と５’領域を向けるミセル構造をとることが示されており、他の核スペックルなどの核内構造体も類似した構造をとると考えられている（Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒａｌ ＲＮＡｓ ｆｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅｌｅｓｓ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｂｏｄｙ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｔｏｍｏｈｉｒｏ Ｙａｍａｚａｋｉ ｅｔ． ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ． Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ．， ２０１９、Ｐａｒａｓｐｅｃｋｌｅｓ ａｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｓ ｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｍｉｃｅｌｌｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｉｃｒｏｐｈａｓｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ， Ｔｏｍｏｈｉｒｏ Ｙａｍａｚａｋｉ ｅｔ． ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， ２０２１（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）など）。本発明により、細胞試料においてこのミセル構造を溶解し、核内ｎｃＲＮＡを含めた全ＲＮＡを効率よく抽出することができると考えられる。
対象となる核内構造体は特に限定されず、ｎｃＲＮＡとタンパク質等が凝集して形成された任意の核内に存在する構造体であり得る。例えば、好ましい核内構造体の例として、パラスペックルおよび核スペックルが挙げられる。核内構造体は、ｎｃＲＮＡを含む核酸とタンパク質の集合体であり、溶出が困難であることが知られている（Ｕｎｕｓｕａｌ ｓｅｍｉ－ｅｘｔｒａｃｔａｂｉｌｉｔｙ ａｓ ａ ｈａｌｌｍａｒｋ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｂｏｄｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒａｌ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ， Ｔａｋｅｓｈｉ Ｃｈｕｊｏ ｅｔ． ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， ２０１７（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）など）。またパラスペックル含有ｎｃＲＮＡとしてＮＥＡＴ１およびそのトランスクリプトバリアントが、核スペックル含有ｎｃＲＮＡとしてＭＡＬＡＴ１およびそのトランスクリプトバリアントが広く知られている。パラスペックルにおいては、多数のＮＥＡＴ１のｎｃＲＮＡおよびそのトランスクリプトバリアントが中央領域に疎水性タンパク質を結合させることで中心部に集合させ、外側に３’領域と５’領域を向けるミセル構造をとることが示されており、他の核スペックルなどの核内構造体も類似した構造をとると考えられている（Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒａｌ ＲＮＡｓ ｆｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅｌｅｓｓ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｂｏｄｙ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ， Ｔｏｍｏｈｉｒｏ Ｙａｍａｚａｋｉ ｅｔ． ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ． Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ．， ２０１９、Ｐａｒａｓｐｅｃｋｌｅｓ ａｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｓ ｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｍｉｃｅｌｌｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｉｃｒｏｐｈａｓｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ， Ｔｏｍｏｈｉｒｏ Ｙａｍａｚａｋｉ ｅｔ． ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， ２０２１（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）など）。本発明により、細胞試料においてこのミセル構造を溶解し、核内ｎｃＲＮＡを含めた全ＲＮＡを効率よく抽出することができると考えられる。
【0016】
１－２．核内ノンコーディングＲＮＡ
本発明において抽出される核内ｎｃＲＮＡは、特に限定されず、上記のような核内構造体を形成する任意のｎｃＲＮＡが対象となり得る。例えば、好ましい核内ｎｃＲＮＡの例として、ＮＥＡＴ１、ＭＡＬＡＴ１、及びそれらのトランスクリプトバリアントが挙げられる。ＮＥＡＴ１（Ｎｕｃｌｅａｒ－Ｅｎｒｉｃｈｅｄ Ａｂｕｎｄａｎｔ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ １）は、ヒト１１番染色体から転写され、その転写の際の３’末端のプロセシングの違いにより２種類のアイソフォーム（約３．７ｋｂのＮＥＡＴ１＿１及び約２３ｋｂのＮＥＡＴ１＿２）が存在することが知られている長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の一種である。ＭＡＬＡＴ１ （Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｌｕｎｇ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｔａｎｓｃｒｉｐｔ １）もまたヒト１１番染色体から転写される長鎖ノンコーディングＲＮＡの一種であり、約９ｋｂの長さを有することが知られている。本明細書において、ＮＥＡＴ１又はＭＡＬＡＴ１は、それらのトランスクリプトバリアントを含む。本発明によれば、これらの核内ｎｃＲＮＡを安定的・効率的に抽出できるので、各細胞試料の様々なＲＮＡを網羅的に解析することも可能となり得る。
本発明において抽出される核内ｎｃＲＮＡは、特に限定されず、上記のような核内構造体を形成する任意のｎｃＲＮＡが対象となり得る。例えば、好ましい核内ｎｃＲＮＡの例として、ＮＥＡＴ１、ＭＡＬＡＴ１、及びそれらのトランスクリプトバリアントが挙げられる。ＮＥＡＴ１（Ｎｕｃｌｅａｒ－Ｅｎｒｉｃｈｅｄ Ａｂｕｎｄａｎｔ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ １）は、ヒト１１番染色体から転写され、その転写の際の３’末端のプロセシングの違いにより２種類のアイソフォーム（約３．７ｋｂのＮＥＡＴ１＿１及び約２３ｋｂのＮＥＡＴ１＿２）が存在することが知られている長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）の一種である。ＭＡＬＡＴ１ （Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｌｕｎｇ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｔａｎｓｃｒｉｐｔ １）もまたヒト１１番染色体から転写される長鎖ノンコーディングＲＮＡの一種であり、約９ｋｂの長さを有することが知られている。本明細書において、ＮＥＡＴ１又はＭＡＬＡＴ１は、それらのトランスクリプトバリアントを含む。本発明によれば、これらの核内ｎｃＲＮＡを安定的・効率的に抽出できるので、各細胞試料の様々なＲＮＡを網羅的に解析することも可能となり得る。
【0017】
本発明により抽出される核内ｎｃＲＮＡは、任意の長さの核内ｎｃＲＮＡであり得る。後述の試験例の結果に示されるように、本発明では、約９ｋｂの核内ｎｃＲＮＡ（ＭＡＬＡＴ１）も然ることながら、約２３ｋｂの核内ｎｃＲＮＡ（ＮＥＡＴ１）の５’領域、ｍｉｄ領域、及び３’領域を全て安定的・効率的に抽出できたことが確認できている。従って、一つの好ましい実施形態において、本発明は核内長鎖ノンコーディングＲＮＡ（核内ｌｎｃＲＮＡともいう）を含む全ＲＮＡの抽出に好適であり得る。核内ｌｎｃＲＮＡの長さは特に限定されないが、例えば、５ｋｂ以上であり、好ましくは７ｋｂ以上、より好ましくは９ｋｂ以上であり得る。更なる実施形態では、１０ｋｂ以上、又は２０ｋｂ以上の核内ｌｎｃＲＮＡを含む全ＲＮＡの抽出であってもよい。上限は特に限定されないが、例えば５０ｋｂ以下であり得る。
【0018】
１－３．抽出反応液
本発明の核内ｎｃＲＮＡの抽出方法に用いる反応液は、細胞溶解剤及び非特異的なプロテアーゼを含む。またこの抽出反応液は、デオキシリボヌクレアーゼやＲＮａｓｅ阻害剤等の他の成分も任意に含み得る。
本発明の核内ｎｃＲＮＡの抽出方法に用いる反応液は、細胞溶解剤及び非特異的なプロテアーゼを含む。またこの抽出反応液は、デオキシリボヌクレアーゼやＲＮａｓｅ阻害剤等の他の成分も任意に含み得る。
【0019】
（１）非特異的プロテアーゼ
本発明に用いる非特異的プロテアーゼは、切断特異性が高くなく、幅広い基質特異性を示すことが当該分野で公知の任意のプロテアーゼであり得る。非特異的プロテアーゼとして例えば、サブチリシン、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ、又はこれらと同様の基質特異性を示すプロテアーゼであり得るが、これらに限定されない。特定の実施形態では、より高度に核内ｎｃＲＮＡを抽出できるという観点から、非特異的プロテアーゼは、核内構造体の分解に適した非特異的なプロテアーゼであることが好ましく、例えば、プロテイナーゼＫ（ＥＣ３．４．２１．６４）又はプロナーゼ（ＥＣ３．４．２４．４）よりも核内構造体（例えばＮＥＡＴ１のＲＮＡおよびそのトランスクリプトバリアントを多く含むパラスペックルや、ＭＡＬＡＴ１のＲＮＡおよびそのトランスクリプトバリアントを多く含む核スペックル）の分解に適しているプロテアーゼであることが好ましい。このような核内構造体の分解に適した非特異的プロテアーゼの好ましい例としては、サブチリシン（ＥＣ３．４．２１．６２）およびその変異体が挙げられるが、これに限定されない。サブチリシンの変異体は、サブチリシン（配列番号１）のアミノ酸配列と高い相同性を示し、且つ、サブチリシンと類似した基質特異性を持つ酵素であり得る。サブチリシンは、基質ペプチド鎖中のフェニルアラニン残基や、イソロイシン残基に対する親和性が、プロテイナーゼＫよりも高いことが知られており（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ａｑｕａｌｙｓｉｎ Ｉ， ａ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｓｅｒｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＹＴ－１： Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ， Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ＢＰＮ′ ａｎｄ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ， Ｔｅｒａｕｃｈｉ Ｔａｎａｋａ ｅｔ． ａｌ．， Ｂ． Ｂ． Ｂ．， １９９８（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる））、サブチリシンの変異体はこのような基質特異性を持つ酵素であることが好ましい。サブチリシンの変異体のアミノ酸配列は、特に限定されないが、配列番号１に示されるサブチリシンのアミノ酸配列に対して、好ましくは８０％以上の同一性、より好ましくは８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなることが好ましい。特定の実施形態では、サブチリシンの変異体は、配列番号１に示されるサブチリシンのアミノ酸配列において１又は数個（例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個）のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなる変異体であってもよい。
本発明に用いる非特異的プロテアーゼは、切断特異性が高くなく、幅広い基質特異性を示すことが当該分野で公知の任意のプロテアーゼであり得る。非特異的プロテアーゼとして例えば、サブチリシン、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ、又はこれらと同様の基質特異性を示すプロテアーゼであり得るが、これらに限定されない。特定の実施形態では、より高度に核内ｎｃＲＮＡを抽出できるという観点から、非特異的プロテアーゼは、核内構造体の分解に適した非特異的なプロテアーゼであることが好ましく、例えば、プロテイナーゼＫ（ＥＣ３．４．２１．６４）又はプロナーゼ（ＥＣ３．４．２４．４）よりも核内構造体（例えばＮＥＡＴ１のＲＮＡおよびそのトランスクリプトバリアントを多く含むパラスペックルや、ＭＡＬＡＴ１のＲＮＡおよびそのトランスクリプトバリアントを多く含む核スペックル）の分解に適しているプロテアーゼであることが好ましい。このような核内構造体の分解に適した非特異的プロテアーゼの好ましい例としては、サブチリシン（ＥＣ３．４．２１．６２）およびその変異体が挙げられるが、これに限定されない。サブチリシンの変異体は、サブチリシン（配列番号１）のアミノ酸配列と高い相同性を示し、且つ、サブチリシンと類似した基質特異性を持つ酵素であり得る。サブチリシンは、基質ペプチド鎖中のフェニルアラニン残基や、イソロイシン残基に対する親和性が、プロテイナーゼＫよりも高いことが知られており（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ａｑｕａｌｙｓｉｎ Ｉ， ａ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｓｅｒｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＹＴ－１： Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ， Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ＢＰＮ′ ａｎｄ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ， Ｔｅｒａｕｃｈｉ Ｔａｎａｋａ ｅｔ． ａｌ．， Ｂ． Ｂ． Ｂ．， １９９８（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる））、サブチリシンの変異体はこのような基質特異性を持つ酵素であることが好ましい。サブチリシンの変異体のアミノ酸配列は、特に限定されないが、配列番号１に示されるサブチリシンのアミノ酸配列に対して、好ましくは８０％以上の同一性、より好ましくは８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなることが好ましい。特定の実施形態では、サブチリシンの変異体は、配列番号１に示されるサブチリシンのアミノ酸配列において１又は数個（例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個）のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなる変異体であってもよい。
【0020】
本発明に用いる抽出反応液中における非特異的プロテアーゼの濃度については、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、一例として、反応液全体に対して０．０００１ｍｇ／ｍＬ以上、１ｍｇ／ｍＬ以下であることが好ましい。また、非特異的プロテアーゼとしてサブチリシンを用いる場合、より確実に本発明の効果が得られ易いという観点から、反応液全体に対して０．０００５ｍｇ／ｍＬ以上、０．５ｍｇ／ｍＬ以下であることが好ましい。本発明によれば、このような少量の非特異的プロテアーゼであっても細胞溶解剤の作用と相俟って、抽出が困難な核内ｎｃＲＮＡを効率よく抽出することが可能となる。
特定の実施形態において、本発明に用いる抽出反応液中における非特異的プロテアーゼの量は、０．００１Ｕ／ｍＬ以上、１０Ｕ／ｍＬ以下であってもよい。また、非特異的プロテアーゼとしてサブチリシンを用いる場合、より確実に本発明の効果が得られ易いという観点から、抽出反応液中におけるサブチリシンの量を、０．００５Ｕ／ｍＬ以上、５Ｕ／ｍＬ以下とすることが好ましい。
特定の実施形態において、本発明に用いる抽出反応液中における非特異的プロテアーゼの量は、０．００１Ｕ／ｍＬ以上、１０Ｕ／ｍＬ以下であってもよい。また、非特異的プロテアーゼとしてサブチリシンを用いる場合、より確実に本発明の効果が得られ易いという観点から、抽出反応液中におけるサブチリシンの量を、０．００５Ｕ／ｍＬ以上、５Ｕ／ｍＬ以下とすることが好ましい。
【0021】
（２）細胞溶解剤
細胞溶解剤は、細胞膜を溶解して細胞内構造物を溶出させることができる任意の成分であり得る。好ましい細胞溶解剤としては、例えば、界面活性剤、カオトロピック剤などが挙げられる。細胞溶解剤は細胞溶解効果を発揮し得る任意の濃度で使用され得るが、例えば、抽出反応液全体に対して０．００５％以上であることが好ましく、０．０１％以上であることがより好ましい。抽出反応液中における細胞溶解剤の濃度の上限値は特に限定されないが、例えば５％以下であり得る。
細胞溶解剤は、細胞膜を溶解して細胞内構造物を溶出させることができる任意の成分であり得る。好ましい細胞溶解剤としては、例えば、界面活性剤、カオトロピック剤などが挙げられる。細胞溶解剤は細胞溶解効果を発揮し得る任意の濃度で使用され得るが、例えば、抽出反応液全体に対して０．００５％以上であることが好ましく、０．０１％以上であることがより好ましい。抽出反応液中における細胞溶解剤の濃度の上限値は特に限定されないが、例えば５％以下であり得る。
【0022】
界面活性剤には、アニオン性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム）、カチオン性界面活性剤（例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム）、非イオン性界面活性剤（例えば、オクチルフェノールエトキシレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、及び両イオン性界面活性剤（例えば、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホン酸）が含まれる。本発明に用いられ得る界面活性剤は、本発明の効果を奏する限り特に制限されないが、好ましい様態として、非イオン性界面活性剤を用いることができる。非イオン性界面活性剤の中でも、好ましい態様として、ポリオキシエチレン鎖を有する非イオン性界面活性剤が挙げられ、特に好ましい態様として、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリエチレングリコールモノ－ｐ－イソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートが挙げられる。細胞溶解剤として界面活性剤を用いる場合に、抽出反応液中におけるその濃度は特に限定されないが、一例として、反応液全体に対して、０．００５％以上、５％以下であることが好ましく、０．０１％以上、５％以下であることが好ましい。抽出反応液がこのような濃度の界面活性剤を含むことによって、非特異的プロテアーゼの作用と相俟って核内ｎｃＲＮＡを効率よく抽出することが可能となる。
【0023】
カオトロピック剤としては、当該分野で公知の任意のカオトロピック剤を使用することができ、例えば、尿素、過塩素酸リチウム塩などのリチウム塩が挙げられる。カオトロピック剤もまた、細胞膜を溶解する変性剤として、上記の界面活性剤に替えて又は界面活性剤と共に細胞溶解剤として使用することができる。細胞溶解剤としてカオトロピック剤を用いる場合に、抽出反応液中におけるその濃度は特に限定されないが、一例として、反応液全体に対して５０ｍＭ以上、１０Ｍ以下であることが好ましい。
【0024】
（３）デオキシリボヌクレアーゼ
本発明に用いる抽出反応液は更に、デオキシリボヌクレアーゼを含んでいてもよい。このようにデオキシリボヌクレアーゼを含有することによって、ゲノムＤＮＡなどのＤＮＡを分解することができ、ＲＮＡのみを核酸として抽出することができる。また、デオキシリボヌクレアーゼは、抽出反応液に添加されず、細胞試料から核内ｎｃＲＮＡを含む全ＲＮＡを抽出後に別途使用されてもよい。例えば、後述する逆転写用組成物、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法又はＲＴ－ＰＣＲ法において用いられる反応液にデオキシリボヌクレアーゼを添加することも好適であり得る。また、細胞試料から核内ｎｃＲＮＡを含む全ＲＮＡ抽出した後、逆転写反応によるＤＮＡ合成を行う前にデオキシリボヌクレアーゼで処理する工程を行ってもよい。
本発明に用いる抽出反応液は更に、デオキシリボヌクレアーゼを含んでいてもよい。このようにデオキシリボヌクレアーゼを含有することによって、ゲノムＤＮＡなどのＤＮＡを分解することができ、ＲＮＡのみを核酸として抽出することができる。また、デオキシリボヌクレアーゼは、抽出反応液に添加されず、細胞試料から核内ｎｃＲＮＡを含む全ＲＮＡを抽出後に別途使用されてもよい。例えば、後述する逆転写用組成物、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法又はＲＴ－ＰＣＲ法において用いられる反応液にデオキシリボヌクレアーゼを添加することも好適であり得る。また、細胞試料から核内ｎｃＲＮＡを含む全ＲＮＡ抽出した後、逆転写反応によるＤＮＡ合成を行う前にデオキシリボヌクレアーゼで処理する工程を行ってもよい。
【0025】
（４）ＲＮａｓｅ阻害剤
本発明に用いる抽出反応液は更に、ＲＮａｓｅ阻害剤を含んでいてもよい。このようにＲＮａｓｅを含入することによって、細胞試料から抽出された核内ｎｃＲＮＡを含むＲＮＡの分解を高度に抑制することが可能となる。ＲＮａｓｅ阻害剤は、特に制限されず、当該分野で公知の任意のＲＮａｓｅ阻害剤を使用することができ、具体的にはヒト胎盤由来、ラット肺由来、又はブタ肝臓由来のタンパク質等が挙げられる。また、ＲＮａｓｅは、比較的短時間で処理が終わる抽出工程に用いる反応液には添加せず、細胞試料から核内ｎｃＲＮＡを含む全ＲＮＡを抽出した後に別途使用されてもよい。例えば、後述する逆転写用組成物、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法又はＲＴ－ＰＣＲ法において用いられる反応液にＲＮａｓｅを添加することも好適であり得る。
本発明に用いる抽出反応液は更に、ＲＮａｓｅ阻害剤を含んでいてもよい。このようにＲＮａｓｅを含入することによって、細胞試料から抽出された核内ｎｃＲＮＡを含むＲＮＡの分解を高度に抑制することが可能となる。ＲＮａｓｅ阻害剤は、特に制限されず、当該分野で公知の任意のＲＮａｓｅ阻害剤を使用することができ、具体的にはヒト胎盤由来、ラット肺由来、又はブタ肝臓由来のタンパク質等が挙げられる。また、ＲＮａｓｅは、比較的短時間で処理が終わる抽出工程に用いる反応液には添加せず、細胞試料から核内ｎｃＲＮＡを含む全ＲＮＡを抽出した後に別途使用されてもよい。例えば、後述する逆転写用組成物、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法又はＲＴ－ＰＣＲ法において用いられる反応液にＲＮａｓｅを添加することも好適であり得る。
【0026】
（５）核酸ポリマー
本発明に用いる抽出反応液は更に、核酸ポリマーを含んでいてもよい。細胞溶解剤および非特異的プロテアーゼを含む反応液で細胞試料を処理し、核内ｎｃＲＮＡを抽出する際、これらの核酸ポリマーを添加することで核内ｎｃＲＮＡに弱くアニーリングされ、二本鎖ＲＮＡとなり親水性が増し、反応液中への抽出が容易となることが期待できる。核酸ポリマーとしては、イノシン酸ポリマー、シチジル酸ポリマー、グアニル酸ポリマー、アデニル酸ポリマー、チミジル酸ポリマー、ウリジル酸ポリマー、デオキシイノシン酸ポリマー、デオキシシチジル酸ポリマー、デオキシグアニル酸ポリマー、デオキシアデニル酸ポリマー、デオキシチミジル酸ポリマー、及びデオキシウリジル酸ポリマーからなる群より選択される少なくとも一種が好ましく、イノシン酸ポリマー又はデオキシイノシン酸ポリマーであることがより好ましく、イノシン酸ポリマーであることが更に好ましい。核酸ポリマーを用いる場合、抽出反応液中におけるその濃度は特に限定されないが、一例として、反応液全体に対して１ｎｇ／μＬ以上、２０ｎｇ／μＬ以下とすることができる。
（６）添加剤
本発明に用いる抽出反応液は、更に他の添加剤を含んでいてもよい。他の添加剤としては、例えば、緩衝剤、塩、ｐＨ調整剤等が挙げられ、これら２種以上の組合せであってもよい。
緩衝剤としては、例えば、トリス（Ｔｒｉｓ）、ビス－トリス（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ビス－トリシン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、モプス（Ｍｏｐｓ）、テス（Ｔｅｓ）、タプス（Ｔａｐｓ）、ピペス（Ｐｉｐｅｓ）、ギャプス（Ｃａｐｓ）、これら２種以上の組合せが挙げられる。緩衝剤は、通常、水（好ましくはヌクレアーゼフリー水）に溶解され、水溶液の形態で使用される。
塩としては、例えば、塩化物（例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン）、酢酸塩（例えば、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、酢酸マンガン）、硫酸塩（例えば、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン）、これら２種以上の組合せが挙げられる。
ｐＨ調整剤としては、例えば、上記のような緩衝剤、塩を用いてもよいし、塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸や、酢酸、乳酸、クエン酸などの有機酸等を用いてもよい。
本発明に用いる抽出反応液は更に、核酸ポリマーを含んでいてもよい。細胞溶解剤および非特異的プロテアーゼを含む反応液で細胞試料を処理し、核内ｎｃＲＮＡを抽出する際、これらの核酸ポリマーを添加することで核内ｎｃＲＮＡに弱くアニーリングされ、二本鎖ＲＮＡとなり親水性が増し、反応液中への抽出が容易となることが期待できる。核酸ポリマーとしては、イノシン酸ポリマー、シチジル酸ポリマー、グアニル酸ポリマー、アデニル酸ポリマー、チミジル酸ポリマー、ウリジル酸ポリマー、デオキシイノシン酸ポリマー、デオキシシチジル酸ポリマー、デオキシグアニル酸ポリマー、デオキシアデニル酸ポリマー、デオキシチミジル酸ポリマー、及びデオキシウリジル酸ポリマーからなる群より選択される少なくとも一種が好ましく、イノシン酸ポリマー又はデオキシイノシン酸ポリマーであることがより好ましく、イノシン酸ポリマーであることが更に好ましい。核酸ポリマーを用いる場合、抽出反応液中におけるその濃度は特に限定されないが、一例として、反応液全体に対して１ｎｇ／μＬ以上、２０ｎｇ／μＬ以下とすることができる。
（６）添加剤
本発明に用いる抽出反応液は、更に他の添加剤を含んでいてもよい。他の添加剤としては、例えば、緩衝剤、塩、ｐＨ調整剤等が挙げられ、これら２種以上の組合せであってもよい。
緩衝剤としては、例えば、トリス（Ｔｒｉｓ）、ビス－トリス（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ビス－トリシン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｃｉｎｅ）、ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、モプス（Ｍｏｐｓ）、テス（Ｔｅｓ）、タプス（Ｔａｐｓ）、ピペス（Ｐｉｐｅｓ）、ギャプス（Ｃａｐｓ）、これら２種以上の組合せが挙げられる。緩衝剤は、通常、水（好ましくはヌクレアーゼフリー水）に溶解され、水溶液の形態で使用される。
塩としては、例えば、塩化物（例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン）、酢酸塩（例えば、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、酢酸マンガン）、硫酸塩（例えば、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン）、これら２種以上の組合せが挙げられる。
ｐＨ調整剤としては、例えば、上記のような緩衝剤、塩を用いてもよいし、塩酸、硫酸、リン酸などの無機酸や、酢酸、乳酸、クエン酸などの有機酸等を用いてもよい。
【0027】
（７）抽出反応液のｐＨ
本発明に用いる抽出反応液のｐＨは、特に制限されず、例えば、ｐＨ４．０～９．０であり得る。好ましい態様として、細胞試料を溶解する際、反応液を酸性条件にすることで核内ｎｃＲＮＡを含むＲＮＡの自然分解が阻害され、安定した抽出が可能となり易いことが分かっている。サブチリシンの至適ｐＨはｐＨ７．０～ｐＨ８．０付近であることが知られているが、後述の試験例の結果に示されるように、本発明ではこの至適ｐＨから少し外れた酸性から中性領域で高い核内ｎｃＲＮＡ抽出効果が得られることを確認している。従って、非特異的プロテアーゼが機能し、且つＲＮＡの自然分解が阻害される最適なｐＨとして、抽出反応液のｐＨはｐＨ５．０～７．０がより好ましい。特にｐＨ５．５付近（例えば、ｐＨ４．０～６．０）が好ましい態様である。
本発明に用いる抽出反応液のｐＨは、特に制限されず、例えば、ｐＨ４．０～９．０であり得る。好ましい態様として、細胞試料を溶解する際、反応液を酸性条件にすることで核内ｎｃＲＮＡを含むＲＮＡの自然分解が阻害され、安定した抽出が可能となり易いことが分かっている。サブチリシンの至適ｐＨはｐＨ７．０～ｐＨ８．０付近であることが知られているが、後述の試験例の結果に示されるように、本発明ではこの至適ｐＨから少し外れた酸性から中性領域で高い核内ｎｃＲＮＡ抽出効果が得られることを確認している。従って、非特異的プロテアーゼが機能し、且つＲＮＡの自然分解が阻害される最適なｐＨとして、抽出反応液のｐＨはｐＨ５．０～７．０がより好ましい。特にｐＨ５．５付近（例えば、ｐＨ４．０～６．０）が好ましい態様である。
【0028】
１－４．細胞試料
本発明において、対象となる細胞試料は特に制限されないが、動物細胞が好ましい。また核内構造体からのＲＮＡの抽出に好ましい態様として、細胞数が１～５００細胞であることが挙げられる。細胞の個数は、セルソーターにより適宜調整することができる。本発明では、安定的・効率的に抽出できるので、例えば、１００個以下、５０個以下、１０個以下の少量の細胞からであっても十分に核内ｎｃＲＮＡを抽出することができる。
本発明において、対象となる細胞試料は特に制限されないが、動物細胞が好ましい。また核内構造体からのＲＮＡの抽出に好ましい態様として、細胞数が１～５００細胞であることが挙げられる。細胞の個数は、セルソーターにより適宜調整することができる。本発明では、安定的・効率的に抽出できるので、例えば、１００個以下、５０個以下、１０個以下の少量の細胞からであっても十分に核内ｎｃＲＮＡを抽出することができる。
【0029】
１－５．抽出反応液での細胞試料の処理
本発明において、細胞溶解剤及び非特異的プロテアーゼを含む反応液で細胞試料を処理する工程は、前記反応液と細胞試料を接触させるように反応させる任意の手法により実施され得る。細胞溶解剤による細胞膜の破壊、及び核内構造体を構成するタンパク質に対する非特異的なプロテアーゼによる分解、更には、細胞溶解剤として界面活性剤を用いる場合にはその界面活性剤による不溶性成分の乳化は、各成分が細胞試料と接触後、直ちに進行する。従って、長時間にわたり抽出反応液で細胞試料を処理する必要はなく、例えば、細胞試料に抽出反応液を添加後、数回（例えば、１～１０回程度、好ましくは１～５回程度）にわたりピペッティングにより混和するか、数分間（例えば、１～５分程度）静置すればよい。処理する際の温度条件も特に限定されないが、氷上で反応させることが好ましい。
本発明において、細胞溶解剤及び非特異的プロテアーゼを含む反応液で細胞試料を処理する工程は、前記反応液と細胞試料を接触させるように反応させる任意の手法により実施され得る。細胞溶解剤による細胞膜の破壊、及び核内構造体を構成するタンパク質に対する非特異的なプロテアーゼによる分解、更には、細胞溶解剤として界面活性剤を用いる場合にはその界面活性剤による不溶性成分の乳化は、各成分が細胞試料と接触後、直ちに進行する。従って、長時間にわたり抽出反応液で細胞試料を処理する必要はなく、例えば、細胞試料に抽出反応液を添加後、数回（例えば、１～１０回程度、好ましくは１～５回程度）にわたりピペッティングにより混和するか、数分間（例えば、１～５分程度）静置すればよい。処理する際の温度条件も特に限定されないが、氷上で反応させることが好ましい。
【0030】
上記のようにして抽出反応液で細胞試料を処理した後、処理後の細胞試料を、高温でインキュベートすることにより、核内構造体のより効率的な溶解、抽出反応液中の非特異的なプロテアーゼの変性を行うことが好ましい。この高温でのインキュベート条件は特に限定されないが、６５℃以上の高温でのインキュベートが好ましく、７０℃以上の高温でのインキュベートがより好ましい。インキュベート時間は特に限定されないが、例えば、１秒～５分間であることが好ましく、３０秒～３分間であることがより好ましく、１分～２分間であることが更に好ましい。
【0031】
＜細胞試料から抽出したＲＮＡを逆転写する工程を包含するＤＮＡ合成方法＞
更なる実施形態として、本発明は、上記方法により細胞試料から抽出した核内ｎｃＲＮＡを鋳型として逆転写することによりＤＮＡを合成する方法を提供する。上記抽出方法では核内ｎｃＲＮＡ以外にも、核外輸送されたｍＲＮＡなども抽出される。従って、本発明のＤＮＡ合成方法は、核内ｎｃＲＮＡを含む全ＲＮＡを鋳型として逆転写を行うＤＮＡ合成方法ということもできる。本発明により、核内ＲＮＡを含む多種多様なＲＮＡからのｃＤＮＡ合成が可能となり、網羅的な遺伝子解析などにおいて有益である。
更なる実施形態として、本発明は、上記方法により細胞試料から抽出した核内ｎｃＲＮＡを鋳型として逆転写することによりＤＮＡを合成する方法を提供する。上記抽出方法では核内ｎｃＲＮＡ以外にも、核外輸送されたｍＲＮＡなども抽出される。従って、本発明のＤＮＡ合成方法は、核内ｎｃＲＮＡを含む全ＲＮＡを鋳型として逆転写を行うＤＮＡ合成方法ということもできる。本発明により、核内ＲＮＡを含む多種多様なＲＮＡからのｃＤＮＡ合成が可能となり、網羅的な遺伝子解析などにおいて有益である。
【0032】
２．抽出されたＲＮＡを鋳型として、逆転写によりＤＮＡを合成する方法
抽出された鋳型ＲＮＡの逆転写によりＤＮＡを合成する方法は、特に制限されず、従来より公知の各種の方法を採用することができる。当該方法は、典型的には、逆転写酵素等の逆転写活性を有するタンパク質を含む逆転写用組成物（又は逆転写反応用溶液）をインキュベーションする工程を含む。
抽出された鋳型ＲＮＡの逆転写によりＤＮＡを合成する方法は、特に制限されず、従来より公知の各種の方法を採用することができる。当該方法は、典型的には、逆転写酵素等の逆転写活性を有するタンパク質を含む逆転写用組成物（又は逆転写反応用溶液）をインキュベーションする工程を含む。
【0033】
２－１．逆転写用組成物
逆転写用組成物は、例えば、鋳型ＲＮＡ、プライマー、デオキシリボヌクレオチド、及び逆転写酵素を含む。また、逆転写用組成物は、ＤＮＡポリメラーゼ、核酸ポリマー等の他の成分等も任意に含み得る。
逆転写用組成物は、例えば、鋳型ＲＮＡ、プライマー、デオキシリボヌクレオチド、及び逆転写酵素を含む。また、逆転写用組成物は、ＤＮＡポリメラーゼ、核酸ポリマー等の他の成分等も任意に含み得る。
【0034】
（１）プライマー
プライマーとしては、鋳型ＲＮＡに対する特異的なプライマー、オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、これら２種以上の組合せが挙げられる。これらのうち、オリゴｄＴプライマーやランダムプライマーは、特定の配列に特異的なプライマーと異なり、任意のＲＮＡにアニールして多種多様なＲＮＡの逆転写を開始できるので、網羅的なＲＮＡの逆転写によるＤＮＡ合成が求められる場面などにおいて好ましい。特定の実施形態では、オリゴｄＴプライマー及びランダムプライマーの組合せを用いて逆転写反応を行うことが特に有益である。オリゴｄＴプライマーとランダムプライマーのモル比は、例えば１：５～１：１５、好ましくは１：８～１：１２である。
ランダムプライマーとしては、例えば、完全ランダムプライマー、ＮＳＲ（Ｎｏｔ Ｓｏ Ｒａｎｄｏｍ）プライマーが挙げられる。
完全ランダムプライマーとは、種々の塩基配列を有するプライマーの混合物であり、各塩基配列は完全にランダムな塩基配列である。完全ランダムプライマーは、例えば、ｒＲＮＡ配列と完全に一致する（又は完全に相補的な）配列を含み得る。完全ランダムプライマーとしては、完全ランダムペンタマー、完全ランダムヘキサマー、完全ランダムヘプタマー、完全ランダムオクタマー、これらの組合せなどが例示できる。例えば、完全ランダムヘキサマーは、４種類のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）で可能な全ての塩基配列（４６種類）の混合物であってもよい。
ＮＳＲプライマーとは、完全ランダムプライマーから、ｒＲＮＡ配列と完全に相補的な配列を有するプライマーを除去したものである。除去するｒＲＮＡ配列としては、例えば、１８Ｓ ｒＲＮＡ配列、２８Ｓ ｒＲＮＡ配列、１２Ｓ ｒＲＮＡ配列、１６Ｓ ｒＲＮＡ配列、これらの組合せが挙げられる。
ＮＳＲプライマーとしては、例えば、完全ランダムヘキサマーからｒＲＮＡ配列と完全に相補的な配列を有するヘキサマーを除外したものが挙げられる。また、完全ランダムペンタマー、完全ランダムヘプタマー、完全ランダムオクタマーなどのプライマーセットからｒＲＮＡ配列と完全に相補的な配列を有するものを除外したものをＮＳＲプライマーとすることもできる。
このようなＮＳＲプライマーを使うことにより、生体内ＲＮＡの約８～９割を占めると言われるｒＲＮＡの転写を抑制できるので、例えば、遺伝子解析対象がｒＲＮＡ以外であってｒＲＮＡの転写が望まれない場面ではＮＳＲプライマーを使うことが好ましい。
ＮＳＲプライマーの詳細については、１）Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｇｉｔａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｅｘａｍｅｒ ｐｒｉｍｉｎｇ ｆｏｒ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｖｏｌ． ６， Ｎｏ． ９， ２００９， ｐｐ． ６４７－６４９、２）Ｏｚｓｏｌａｋ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｇｉｔａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｆｒｏｍ ａｔｔｏｍｏｌｅ－ｌｅｖｅｌＲＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ． ２０， ２０１０， ｐｐ． ５１９－５２５、３）米国特許出願公開公報２０１０／００２９５１１（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）等に記載されている。
プライマーの長さは、アニーリングの観点から、例えば５塩基以上、好ましくは６塩基以上であり、合成の観点から、例えば３０塩基以下、好ましくは２５塩基以下、より好ましくは２０塩基以下である。
逆転写用組成物において、プライマーの濃度は、特に制限されないが、例えば１～１０μＭ、好ましくは２～６μＭ、より好ましくは３～５μＭである。
プライマーとしては、鋳型ＲＮＡに対する特異的なプライマー、オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、これら２種以上の組合せが挙げられる。これらのうち、オリゴｄＴプライマーやランダムプライマーは、特定の配列に特異的なプライマーと異なり、任意のＲＮＡにアニールして多種多様なＲＮＡの逆転写を開始できるので、網羅的なＲＮＡの逆転写によるＤＮＡ合成が求められる場面などにおいて好ましい。特定の実施形態では、オリゴｄＴプライマー及びランダムプライマーの組合せを用いて逆転写反応を行うことが特に有益である。オリゴｄＴプライマーとランダムプライマーのモル比は、例えば１：５～１：１５、好ましくは１：８～１：１２である。
ランダムプライマーとしては、例えば、完全ランダムプライマー、ＮＳＲ（Ｎｏｔ Ｓｏ Ｒａｎｄｏｍ）プライマーが挙げられる。
完全ランダムプライマーとは、種々の塩基配列を有するプライマーの混合物であり、各塩基配列は完全にランダムな塩基配列である。完全ランダムプライマーは、例えば、ｒＲＮＡ配列と完全に一致する（又は完全に相補的な）配列を含み得る。完全ランダムプライマーとしては、完全ランダムペンタマー、完全ランダムヘキサマー、完全ランダムヘプタマー、完全ランダムオクタマー、これらの組合せなどが例示できる。例えば、完全ランダムヘキサマーは、４種類のヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）で可能な全ての塩基配列（４６種類）の混合物であってもよい。
ＮＳＲプライマーとは、完全ランダムプライマーから、ｒＲＮＡ配列と完全に相補的な配列を有するプライマーを除去したものである。除去するｒＲＮＡ配列としては、例えば、１８Ｓ ｒＲＮＡ配列、２８Ｓ ｒＲＮＡ配列、１２Ｓ ｒＲＮＡ配列、１６Ｓ ｒＲＮＡ配列、これらの組合せが挙げられる。
ＮＳＲプライマーとしては、例えば、完全ランダムヘキサマーからｒＲＮＡ配列と完全に相補的な配列を有するヘキサマーを除外したものが挙げられる。また、完全ランダムペンタマー、完全ランダムヘプタマー、完全ランダムオクタマーなどのプライマーセットからｒＲＮＡ配列と完全に相補的な配列を有するものを除外したものをＮＳＲプライマーとすることもできる。
このようなＮＳＲプライマーを使うことにより、生体内ＲＮＡの約８～９割を占めると言われるｒＲＮＡの転写を抑制できるので、例えば、遺伝子解析対象がｒＲＮＡ以外であってｒＲＮＡの転写が望まれない場面ではＮＳＲプライマーを使うことが好ましい。
ＮＳＲプライマーの詳細については、１）Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｇｉｔａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｅｘａｍｅｒ ｐｒｉｍｉｎｇ ｆｏｒ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｖｏｌ． ６， Ｎｏ． ９， ２００９， ｐｐ． ６４７－６４９、２）Ｏｚｓｏｌａｋ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｇｉｔａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｆｒｏｍ ａｔｔｏｍｏｌｅ－ｌｅｖｅｌＲＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ． ２０， ２０１０， ｐｐ． ５１９－５２５、３）米国特許出願公開公報２０１０／００２９５１１（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）等に記載されている。
プライマーの長さは、アニーリングの観点から、例えば５塩基以上、好ましくは６塩基以上であり、合成の観点から、例えば３０塩基以下、好ましくは２５塩基以下、より好ましくは２０塩基以下である。
逆転写用組成物において、プライマーの濃度は、特に制限されないが、例えば１～１０μＭ、好ましくは２～６μＭ、より好ましくは３～５μＭである。
【0035】
（２）デオキシリボヌクレオチド
デオキシリボヌクレオチドとしては、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートが好ましい。デオキシリボヌクレオチドトリホスフェートとしては、例えば、デオキシシチジントリホスフェート（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）、デオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）、デオキシチミジントリホスフェート（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジントリホスフェート（ｄＵＴＰ）、これらの誘導体、これら２種以上の組合せが挙げられる。これらのうち、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰの混合物、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＵＴＰの混合物、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰの混合物等が好ましい。
デオキシリボヌクレオチドとしては、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートが好ましい。デオキシリボヌクレオチドトリホスフェートとしては、例えば、デオキシシチジントリホスフェート（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）、デオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）、デオキシチミジントリホスフェート（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジントリホスフェート（ｄＵＴＰ）、これらの誘導体、これら２種以上の組合せが挙げられる。これらのうち、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＴＴＰの混合物、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、及びｄＵＴＰの混合物、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰの混合物等が好ましい。
【0036】
（３）逆転写酵素
逆転写酵素は、逆転写活性（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性）を有する任意のタンパク質（酵素）をいい、特に制限されないが、逆転写酵素活性を示すポリメラーゼが好ましい。また、逆転写酵素は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性が低いか、又はＲＮａｓｅ Ｈ活性がないものが好ましい。逆転写酵素の例としては、例えば、トリ骨髄芽球ウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＡＭＶ－ＲＴ）、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＭＭＬＶ－ＲＴ）、ヒト免疫ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＨＩＶ－ＲＴ）、ＥＩＲＶ－ＲＴ、ＲＡＶ２－ＲＴ、Ｃ．ヒドロゲノホルマンス（Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｇｏｒｍａｎｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）Ｉ、スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）ＩＩ、これらの変異体、及びこれらの誘導体が挙げられる。これらのうち、ＭＭＬＶ－ＲＴが好ましい。
逆転写酵素は、逆転写活性（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性）を有する任意のタンパク質（酵素）をいい、特に制限されないが、逆転写酵素活性を示すポリメラーゼが好ましい。また、逆転写酵素は、ＲＮａｓｅ Ｈ活性が低いか、又はＲＮａｓｅ Ｈ活性がないものが好ましい。逆転写酵素の例としては、例えば、トリ骨髄芽球ウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＡＭＶ－ＲＴ）、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＭＭＬＶ－ＲＴ）、ヒト免疫ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（ＨＩＶ－ＲＴ）、ＥＩＲＶ－ＲＴ、ＲＡＶ２－ＲＴ、Ｃ．ヒドロゲノホルマンス（Ｃ．ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｇｏｒｍａｎｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）Ｉ、スーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）ＩＩ、これらの変異体、及びこれらの誘導体が挙げられる。これらのうち、ＭＭＬＶ－ＲＴが好ましい。
【0037】
（４）ＤＮＡポリメラーゼ
逆転写用組成物は、下記のＤＮＡポリメラーゼを含んでいてもよいし、含まなくてもよい：
Ｔａｑ、Ｔｂｒ、Ｔｆｌ、Ｔｒｕ、Ｔｔｈ、Ｔｌｉ、Ｔａｃ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｋｏｄ、Ｂｓｔ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、Ｐｏｃ、Ｐａｂ、Ｍｔｈ、Ｐｈｏ、ＥＳ４、ＶＥＮＴ（商標）、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）、これらの変異体
逆転写用組成物は、下記のＤＮＡポリメラーゼを含んでいてもよいし、含まなくてもよい：
Ｔａｑ、Ｔｂｒ、Ｔｆｌ、Ｔｒｕ、Ｔｔｈ、Ｔｌｉ、Ｔａｃ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｔｉｈ、Ｔｆｉ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｋｏｄ、Ｂｓｔ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、Ｐｏｃ、Ｐａｂ、Ｍｔｈ、Ｐｈｏ、ＥＳ４、ＶＥＮＴ（商標）、ＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）、これらの変異体
【0038】
（５）ＲＮａｓｅ阻害剤
逆転写用組成物は、ＲＮａｓｅ阻害剤を含んでいてもよい。ＲＮａｓｅ阻害剤は、特に制限されず、例えば、ヒト胎盤由来、ラット肺由来、又はブタ肝臓由来のタンパク質等が挙げられる。
逆転写用組成物は、ＲＮａｓｅ阻害剤を含んでいてもよい。ＲＮａｓｅ阻害剤は、特に制限されず、例えば、ヒト胎盤由来、ラット肺由来、又はブタ肝臓由来のタンパク質等が挙げられる。
【0039】
（６）核酸ポリマー
逆転写反応液は、核酸ポリマーを含んでいてもよい。核酸ポリマーを含むことで、生体内ＲＮＡの約８～９割を占めると言われるｒＲＮＡの転写を抑制できるので、例えば、遺伝子解析対象がｒＲＮＡ以外であってｒＲＮＡの転写が望まれない場面では核酸ポリマーを含むことが好ましい。核酸ポリマーとしては、特に限定されず、例えば、上記抽出反応液において述べたものと同様のものを使用することができる。
逆転写反応液は、核酸ポリマーを含んでいてもよい。核酸ポリマーを含むことで、生体内ＲＮＡの約８～９割を占めると言われるｒＲＮＡの転写を抑制できるので、例えば、遺伝子解析対象がｒＲＮＡ以外であってｒＲＮＡの転写が望まれない場面では核酸ポリマーを含むことが好ましい。核酸ポリマーとしては、特に限定されず、例えば、上記抽出反応液において述べたものと同様のものを使用することができる。
【0040】
（７）添加剤
逆転写用組成物は、更に他の添加剤を含んでいてもよい。他の添加剤としては、例えば、緩衝剤、塩、ｐＨ調整剤等が挙げられ、これら２種以上の組合せであってもよい。
これらの緩衝剤、塩、ｐＨ調整剤は特に限定されず、例えば、上記抽出反応液において述べたものと同様のものを使用することができる。
逆転写用組成物は、更に他の添加剤を含んでいてもよい。他の添加剤としては、例えば、緩衝剤、塩、ｐＨ調整剤等が挙げられ、これら２種以上の組合せであってもよい。
これらの緩衝剤、塩、ｐＨ調整剤は特に限定されず、例えば、上記抽出反応液において述べたものと同様のものを使用することができる。
【0041】
２－２．インキュベーション
逆転写用組成物のインキュベーションの条件は、鋳型ＲＮＡの逆転写が進行する限り特に制限されず、当該分野において知られている、いずれの条件も採用することができる。インキュベーションの温度は、例えば３０～６５℃、好ましくは３５～６０℃である。インキュベーションの時間は、例えば５～１２０分、好ましくは１０～６０分である。
逆転写用組成物のインキュベーションの条件は、鋳型ＲＮＡの逆転写が進行する限り特に制限されず、当該分野において知られている、いずれの条件も採用することができる。インキュベーションの温度は、例えば３０～６５℃、好ましくは３５～６０℃である。インキュベーションの時間は、例えば５～１２０分、好ましくは１０～６０分である。
【0042】
２－３．鋳型ＲＮＡの逆転写がＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを増幅させる増幅逆転写法（ＲＴ－ＲａｍＤＡ法とも言う）において行われる場合
ＲＴ－ＲａｍＤＡ法とは、鋳型ＲＮＡ、プライマー、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素、及び基質を含む混合物をインキュベートする工程を含む、核酸の増幅方法である。ＲＴ－ＲａｍＤＡ法では、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性により鋳型ＲＮＡの相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成し、ＲＮＡとｃＤＮＡとのハイブリッド鎖のうちのｃＤＮＡ鎖をＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素により無作為に切断し、前記の切断部位が起点となり、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素の鎖置換活性により３’側のｃＤＮＡ鎖がＲＮＡから剥がされ、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素により剥がされた部分に新たなｃＤＮＡ鎖が合成される。ＲＴ－ＲａｍＤＡ法の詳細については、米国特許出願公開公報２０１７／０２７５６８５（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）等に記載されている。
ＲＴ－ＲａｍＤＡ法とは、鋳型ＲＮＡ、プライマー、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素、及び基質を含む混合物をインキュベートする工程を含む、核酸の増幅方法である。ＲＴ－ＲａｍＤＡ法では、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性により鋳型ＲＮＡの相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成し、ＲＮＡとｃＤＮＡとのハイブリッド鎖のうちのｃＤＮＡ鎖をＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素により無作為に切断し、前記の切断部位が起点となり、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素の鎖置換活性により３’側のｃＤＮＡ鎖がＲＮＡから剥がされ、ＲＮａｓｅ Ｈマイナス型逆転写酵素により剥がされた部分に新たなｃＤＮＡ鎖が合成される。ＲＴ－ＲａｍＤＡ法の詳細については、米国特許出願公開公報２０１７／０２７５６８５（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）等に記載されている。
【0043】
鋳型ＲＮＡの逆転写がＲＴ－ＲａｍＤＡ法において行われる場合、逆転写用組成物は、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素を含む。
【0044】
ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素は、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖中のＤＮＡ鎖を切断する活性を有する酵素であることが好ましい。当該酵素としては、例えば、二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素、非特異的ＤＮＡ分解酵素を使用することができる。
【0045】
二本鎖特異的分解酵素（二本鎖特異的ヌクレアーゼ；ＤＳＮとも言う）は、原核生物又は真核生物に由来する酵素を使用することができるが、好ましくは、甲殻類由来の二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体を使用することができる。具体的な例としては、以下のものが挙げられる。
・ Ｓｏｌｅｎｏｃｅｒａ ｍｅｌａｎｔｈｏ（ナミクダヒゲエビ）ＤＮａｓｅ
・ Ｐｅｎａｅｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（クルマエビ）ＤＮａｓｅ
・ Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ（タラバガニ）ＤＳＮ
・ Ｐａｎｄａｌｕｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ（ホッコクアカエビ）ｄｓＤＮａｓｅ
・ Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ ｏｐｉｌｉｏ（ズワイガニ）ＤＳＮ
・ その他のＤＳＮホモログ
二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素は、好ましくは、６０℃未満でもＤＮＡ分解活性を有する酵素である。上記の中では、エビ由来の二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体が好ましい。
二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素としては、市販品を使用することができる。市販品としては、ｄｓＤＮａｓｅ（ＡｒｃｔｉｃＺｙｍｅｓ社）、Ｈｌ－ｄｓＤＮａｓｅ（ＡｒｃｔｉｃＺｙｍｅｓ社）、ｄｓＤＮａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｓｈｒｉｍｐ ＤＮａｓｅ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、Ａｔｌａｎｔｉｓ ｄｓＤＮａｓｅ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社）などを挙げることができる。
・ Ｓｏｌｅｎｏｃｅｒａ ｍｅｌａｎｔｈｏ（ナミクダヒゲエビ）ＤＮａｓｅ
・ Ｐｅｎａｅｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（クルマエビ）ＤＮａｓｅ
・ Ｐａｒａｌｉｔｈｏｄｅｓ ｃａｍｔｓｃｈａｔｉｃｕｓ（タラバガニ）ＤＳＮ
・ Ｐａｎｄａｌｕｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ（ホッコクアカエビ）ｄｓＤＮａｓｅ
・ Ｃｈｉｏｎｏｅｃｅｔｅｓ ｏｐｉｌｉｏ（ズワイガニ）ＤＳＮ
・ その他のＤＳＮホモログ
二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素は、好ましくは、６０℃未満でもＤＮＡ分解活性を有する酵素である。上記の中では、エビ由来の二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体が好ましい。
二本鎖特異的ＤＮＡ分解酵素としては、市販品を使用することができる。市販品としては、ｄｓＤＮａｓｅ（ＡｒｃｔｉｃＺｙｍｅｓ社）、Ｈｌ－ｄｓＤＮａｓｅ（ＡｒｃｔｉｃＺｙｍｅｓ社）、ｄｓＤＮａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｓｈｒｉｍｐ ＤＮａｓｅ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）、Ａｔｌａｎｔｉｓ ｄｓＤＮａｓｅ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）、Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ社）などを挙げることができる。
【0046】
非特異的ＤＮＡ分解酵素としては、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＤＮＡ鎖を切断する活性を有し、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＲＮＡ鎖、一本鎖ＲＮＡを切断する活性を実質的に有さず、好ましくは、一本鎖ＤＮＡを切断する活性がＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド鎖のＤＮＡ鎖を切断する活性に比較して低くなる酵素を挙げることができる。非特異的ＤＮＡ分解酵素は、好ましくは、６０℃未満でもＤＮＡ分解活性を有する酵素である。このような非特異的ＤＮＡ分解酵素としては、市販品を使用することもでき、例えば、ＤＮａｓｅＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製、ＤＮａｓｅＩ）等を用いることが可能である。
非特異的ＤＮＡ分解酵素は、原核生物又は真核生物に由来する酵素を使用することができるが、好ましくは、ほ乳類由来の非特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体、より好ましくはウシ由来の非特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体を使用することができる。
非特異的ＤＮＡ分解酵素は、原核生物又は真核生物に由来する酵素を使用することができるが、好ましくは、ほ乳類由来の非特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体、より好ましくはウシ由来の非特異的ＤＮＡ分解酵素又はその改変体を使用することができる。
【0047】
上記改変体とは、天然由来のアミノ酸配列を改変することによって得られる酵素を意味する。具体的には、天然由来のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる酵素、並びに天然由来のアミノ酸配列において１又は数個（例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個）のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなる酵素である。
【0048】
鋳型ＲＮＡの逆転写がＲＴ－ＲａｍＤＡ法において行われる場合、逆転写用組成物は、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含んでいてもよい。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、通常、ＤＮＡ鎖特異的ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド鎖分解酵素とともに使用される。一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質としては、例えば、Ｔ４ジーン３２プロテイン、ＲｅｃＡ、ＳＳＢ（Ｓｉｎｇｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、これら２種以上の組合せが挙げられる。
【0049】
鋳型ＲＮＡの逆転写がＲＴ－ＲａｍＤＡ法において行われる場合、逆転写用組成物のインキュベーションは、等温条件で行ってもよいし、熱サイクル条件で行ってもよい。
（１）等温条件
インキュベーションを等温条件で行う場合、例えば２５℃以上５０℃未満の間の所定の温度、好ましくは３０～４５℃の間の所定の温度、より好ましくは３５～４０℃の間の所定の温度、例えば３７℃で所定の時間（例えば５～１８０分、好ましくは１０～１５０分）行うことができる。
２５℃以上５０℃未満の間の所定の温度でのインキュベーションは、２以上の段階に分けて行ってもよい。例えば２５℃以上３０℃未満の間の所定の温度で５～１５分、次いで３０℃以上３５℃未満の間の所定の温度で５～１５分、次いで３５℃以上５０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～６０分）インキュベーションしてもよい。
２５℃以上５０℃未満の間の所定の温度でのインキュベーションの後、例えば５０℃以上１００℃未満の間の所定の温度でインキュベーションしてもよい。５０℃以上１００℃未満の間の所定の温度でのインキュベーションは２以上の段階に分けて行ってもよい。例えば５０℃以上８０℃未満の間の所定の温度で５～１５分、次いで８０～９０℃の間の所定の温度で５～１５分インキュベーションしてもよい。
（１）等温条件
インキュベーションを等温条件で行う場合、例えば２５℃以上５０℃未満の間の所定の温度、好ましくは３０～４５℃の間の所定の温度、より好ましくは３５～４０℃の間の所定の温度、例えば３７℃で所定の時間（例えば５～１８０分、好ましくは１０～１５０分）行うことができる。
２５℃以上５０℃未満の間の所定の温度でのインキュベーションは、２以上の段階に分けて行ってもよい。例えば２５℃以上３０℃未満の間の所定の温度で５～１５分、次いで３０℃以上３５℃未満の間の所定の温度で５～１５分、次いで３５℃以上５０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～６０分）インキュベーションしてもよい。
２５℃以上５０℃未満の間の所定の温度でのインキュベーションの後、例えば５０℃以上１００℃未満の間の所定の温度でインキュベーションしてもよい。５０℃以上１００℃未満の間の所定の温度でのインキュベーションは２以上の段階に分けて行ってもよい。例えば５０℃以上８０℃未満の間の所定の温度で５～１５分、次いで８０～９０℃の間の所定の温度で５～１５分インキュベーションしてもよい。
【0050】
（２）熱サイクル条件
インキュベーションを熱サイクル条件で行う場合、例えば２０℃以上３０℃未満の間の所定の温度Ｔ１（例えば２５℃）と３０～４５℃の間の所定の温度Ｔ２（例えば３７℃）とを組み合わせて、Ｔ１で所定の時間（例えば１～３分、一例として２分）とＴ２で所定の時間（例えば１～３分、一例として２分）とを１サイクルとして、これを好ましくは１０～４０サイクル、より好ましくは１５～３５サイクル繰り返して行ってもよい。なお、上記の熱サイクルに先立って、例えば２５℃以上３０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）、次いで３０℃以上３５℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）、次いで３５℃以上５０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば１～５分）インキュベーションしてもよい。また、上記の熱サイクルの後、例えば５０℃以上８０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）、次いで８０～９０℃の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）インキュベーションしてもよい。
インキュベーションを熱サイクル条件で行う場合、例えば２０℃以上３０℃未満の間の所定の温度Ｔ１（例えば２５℃）と３０～４５℃の間の所定の温度Ｔ２（例えば３７℃）とを組み合わせて、Ｔ１で所定の時間（例えば１～３分、一例として２分）とＴ２で所定の時間（例えば１～３分、一例として２分）とを１サイクルとして、これを好ましくは１０～４０サイクル、より好ましくは１５～３５サイクル繰り返して行ってもよい。なお、上記の熱サイクルに先立って、例えば２５℃以上３０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）、次いで３０℃以上３５℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）、次いで３５℃以上５０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば１～５分）インキュベーションしてもよい。また、上記の熱サイクルの後、例えば５０℃以上８０℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）、次いで８０～９０℃の間の所定の温度で所定の時間（例えば５～１５分）インキュベーションしてもよい。
【0051】
２－４．鋳型ＲＮＡの逆転写がＲＴ－ＰＣＲ法において行われる場合
鋳型ＲＮＡの逆転写がＲＴ－ＰＣＲ法において行われる場合、逆転写用組成物のインキュベーションは、２－２．に記載された条件で行うことができ、その後、必要に応じて逆転写酵素を失活してもよい。逆転写の失活方法は、特に限定されるわけではないが、例えば、９０～１００℃で所定時間（例えば１～１０分）インキュベーションする方法であってもよい。
鋳型ＲＮＡの逆転写がＲＴ－ＰＣＲ法において行われる場合、逆転写用組成物のインキュベーションは、２－２．に記載された条件で行うことができ、その後、必要に応じて逆転写酵素を失活してもよい。逆転写の失活方法は、特に限定されるわけではないが、例えば、９０～１００℃で所定時間（例えば１～１０分）インキュベーションする方法であってもよい。
【0052】
鋳型ＲＮＡの逆転写がＲＴ－ＰＣＲ法において行われる場合、鋳型ＲＮＡの逆転写によりＤＮＡを合成する方法は、上記インキュベーションされた逆転写用組成物（逆転写産物とも言う）に含まれるＤＮＡを増幅する工程を含む。ＤＮＡを増幅する工程は、典型的には、ＤＮＡ増幅用組成物を熱サイクル条件でインキュベーションする工程を含む。
【0053】
ＤＮＡ増幅用組成物には、逆転写産物をそのまま含有させてもよく、逆転写産物を水、好ましくはヌクレアーゼフリー水で希釈したものを含有させてもよい。例えば逆転写産物の質量が１／２０～１／３０になるように希釈してもよい。
ＤＮＡ増幅用組成物は、逆転写産物に加えて、例えば、プライマー、デオキシリボヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼを含む。また、上記２－１．に記載した逆転写用組成物がＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡ増幅反応に必要な成分を含んでいる場合には、その逆転写用組成物はそのままＤＮＡ増幅用組成物となり得、両組成物は相互に互換可能に呼称され得る。
プライマーとしては、ＤＮＡ（ＲＮＡから逆転写されたＤＮＡを含む）に対して特異的なプライマー（フォワードプライマー、リバースプライマー）が好ましい。
デオキシリボヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼは、上記２－１．（２）及び（４）に記載したものと同様のものを使用することができる。
ＤＮＡ増幅用組成物は、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体、反応緩衝剤、金属イオン（マグネシウムイオンなど）、蛍光色素、蛍光標識したプローブ、これら２種以上の組合せを含んでいてもよい。
ＤＮＡ増幅用組成物は、逆転写産物に加えて、例えば、プライマー、デオキシリボヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼを含む。また、上記２－１．に記載した逆転写用組成物がＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡ増幅反応に必要な成分を含んでいる場合には、その逆転写用組成物はそのままＤＮＡ増幅用組成物となり得、両組成物は相互に互換可能に呼称され得る。
プライマーとしては、ＤＮＡ（ＲＮＡから逆転写されたＤＮＡを含む）に対して特異的なプライマー（フォワードプライマー、リバースプライマー）が好ましい。
デオキシリボヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼは、上記２－１．（２）及び（４）に記載したものと同様のものを使用することができる。
ＤＮＡ増幅用組成物は、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体、反応緩衝剤、金属イオン（マグネシウムイオンなど）、蛍光色素、蛍光標識したプローブ、これら２種以上の組合せを含んでいてもよい。
【0054】
熱サイクル条件でのインキュベーションは、例えば８０℃以上１００℃未満の間の所定の温度で所定の時間（例えば１０～３０秒）と５０～７０℃の間の所定の温度で所定の時間（例えば３０秒～２分）とを１サイクルとして、これを好ましくは１０～５０サイクル、より好ましくは１５～４０サイクル繰り返して行ってもよい。
【0055】
＜核内ノンコーディングＲＮＡの解析方法＞
更なる実施形態として、本発明は、上記方法により細胞試料から抽出したＲＮＡ又は当該ＲＮＡを鋳型として逆転写することにより合成したＤＮＡを用いて、核内ｎｃＲＮＡを解析する方法を提供する。本解析方法では、核内ｎｃＲＮＡの解析と共に、核外輸送されたｍＲＮＡ等の他のＲＮＡを同時に解析することもできる。
更なる実施形態として、本発明は、上記方法により細胞試料から抽出したＲＮＡ又は当該ＲＮＡを鋳型として逆転写することにより合成したＤＮＡを用いて、核内ｎｃＲＮＡを解析する方法を提供する。本解析方法では、核内ｎｃＲＮＡの解析と共に、核外輸送されたｍＲＮＡ等の他のＲＮＡを同時に解析することもできる。
【0056】
本解析方法は、当該分野で公知の任意の遺伝子解析法により解析することができる。例えば、ＰＣＲ法、ｑＰＣＲ法、マクロアレイ法、マイクロアレイ法、シーケンス法等により核内ｎｃＲＮＡを定性的又は定量的に解析することが可能である。例えば、ＰＣＲ反応液又はｑＰＣＲ反応液は、標的となる核内ｎｃＲＮＡ及び必要に応じて他の解析を意図するＲＮＡの増幅反応を行うための成分（例えば、プライマー、デオキシリボヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼ等）を添加したものを用いればよい。このＰＣＲ反応液又はｑＰＣＲ反応液等において標的核酸の増幅のために用いられるプライマーとしては、標的となる核内ｎｃＲＮＡに特異的なプライマー（フォワードプライマー、リバースプライマー）及び必要に応じて他の解析を意図するＲＮＡに対して特異的なプライマーが好ましい。
更に、ＰＣＲ反応液又はｑＰＣＲ反応液等は、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体、反応緩衝剤、金属イオン（マグネシウムイオンなど）、蛍光色素、蛍光標識したプローブ、これら２種以上の組合せなどを含んでいてもよい。ＰＣＲ反応又はｑＰＣＲ反応を行う熱サイクル条件等は特に限定されず、標的核酸の増幅及び検出に適した条件を当業者は適宜選択して行うことができる。
更に、ＰＣＲ反応液又はｑＰＣＲ反応液等は、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体、反応緩衝剤、金属イオン（マグネシウムイオンなど）、蛍光色素、蛍光標識したプローブ、これら２種以上の組合せなどを含んでいてもよい。ＰＣＲ反応又はｑＰＣＲ反応を行う熱サイクル条件等は特に限定されず、標的核酸の増幅及び検出に適した条件を当業者は適宜選択して行うことができる。
【0057】
＜核内ノンコーディングＲＮＡを抽出するために用いられるキット＞
更なる実施形態として、本発明は、上記のような細胞試料から核内ｎｃＲＮＡを抽出するためのキットを提供する。本キットは、核内ｎｃＲＮＡだけでなく、核外輸送されたｍＲＮＡ等の他のＲＮＡも同時に抽出することができる。従って、本発明のキットは、核内ｎｃＲＮＡを含む全ＲＮＡを抽出するために用いられるキットということもできる。
更なる実施形態として、本発明は、上記のような細胞試料から核内ｎｃＲＮＡを抽出するためのキットを提供する。本キットは、核内ｎｃＲＮＡだけでなく、核外輸送されたｍＲＮＡ等の他のＲＮＡも同時に抽出することができる。従って、本発明のキットは、核内ｎｃＲＮＡを含む全ＲＮＡを抽出するために用いられるキットということもできる。
【0058】
本発明のキットは、細胞溶解剤及び非特異的プロテアーゼを少なくとも含む。細胞溶解剤及び非特異的プロテアーゼは、１つの容器中に両成分を充填した態様で提供されても良いし、別々の容器にそれぞれの成分を充填した態様で提供されてもよい。また、本発明のキットは、デオキシリボヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、核酸ポリマー、緩衝剤、塩、ｐＨ調整剤等の他の添加剤を含んでいてもよい。更に本発明のキットは、逆転写用組成物、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法又はＲＴ－ＰＣＲ法において用いられる反応液、核内ｎｃＲＮＡの解析に用いられる反応液、或いはこれらに含まれる任意の成分を更に含む態様で提供されてもよい。本発明のキットに用いられる細胞溶解剤、非特異的プロテアーゼ、及び任意の他の成分の具体的な種類等は、上記の核内ｎｃＲＮＡの抽出方法、逆転写によりＤＮＡを合成する方法、核内ｎｃＲＮＡの解析方法において述べたものと同様であり得る。これらの成分は、使用時の反応液中終濃度がそれぞれの好ましい濃度範囲となるように調整された量で提供されることが好ましい。
【実施例0059】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【0060】
実施例１：各プロテアーゼによる細胞からの核内ノンコーディングＲＮＡの抽出効率の評価
本実施例では、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルと共に、サブチリシン（ＥＣ３．４．２１．６２）、プロテイナーゼＫ（ＥＣ３．４．２１．６４）、プロナーゼ（ＥＣ３．４．２４．４）の各種非特異的プロテアーゼを用いて、核内ノンコーディングＲＮＡ抽出効率を比較検討するため、以下の実験を行った。
表１の組成で抽出反応液群１を調製した。次いで、５、５０、５００細胞のＨｅＬａ細胞を３μＬの抽出反応液（ｐＨ５．５）に添加して、氷上で５回ピペッティングすることにより細胞を溶解した。
本実施例では、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルと共に、サブチリシン（ＥＣ３．４．２１．６２）、プロテイナーゼＫ（ＥＣ３．４．２１．６４）、プロナーゼ（ＥＣ３．４．２４．４）の各種非特異的プロテアーゼを用いて、核内ノンコーディングＲＮＡ抽出効率を比較検討するため、以下の実験を行った。
表１の組成で抽出反応液群１を調製した。次いで、５、５０、５００細胞のＨｅＬａ細胞を３μＬの抽出反応液（ｐＨ５．５）に添加して、氷上で５回ピペッティングすることにより細胞を溶解した。
【表1】
【0061】
細胞溶解による抽出後、７５℃で１．５分間処理することによって酵素の失活、細胞の完全な溶解を行った。次いで、細胞溶解した３μＬの反応液に、表２に組成を示した逆転写反応液１を６μＬ加え、３７℃、３０分間逆転写反応を行い、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。オリゴｄＴプライマー及びランダムプライマーを含む逆転写反応液を用いることで、全ＲＮＡを非特異的に逆転写することが可能となる。その後、以下の方法でリアルタイムＰＣＲにてＤＮＡ量（遺伝子領域の抽出量）の比較を行った。
逆転写反応後の反応液をｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）で希釈し、１／２５量をｑＰＣＲ反応に用いた。ｑＰＣＲはＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、以下の条件で行った。
ｑＰＣＲ反応用溶液［２０μｌ（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（商標） ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ （ＴＯＹＯＢＯ社）、６ｐｍｏｌ フォワードプライマー、６ｐｍｏｌ リバースプライマー、２μｌ 希釈逆転写反応液、ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ］を９５℃１分処理して酵素を活性化したのち、９５℃１５秒の変性及び６０℃１分の伸長反応を４０サイクル行った。
融解曲線分析は、９５℃１５秒、６０℃１５秒、及び９５℃１５秒で行った。
標的遺伝子として、核内ノンコーディングＲＮＡであるＮＥＡＴ１遺伝子の３領域、ＭＡＬＡＴ１遺伝子の１領域、核外のｍＲＮＡであるβＡＣＴＩＮ遺伝子の１領域（これらの領域のＲＮＡにおける位置を図１に示す）の抽出量をリアルタイムＰＣＲによって解析した。
各プライマーセットは以下の通りである。（５’→３’）
・ＮＥＡＴ１ ５’領域
フォワードプライマー：ＧＴＡＣＴＧＧＧＡＧＧＧＡＴＧＡＧＧＧＴ（配列番号２）
リバースプライマー：ＡＡＴＴＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＣＣＡＧＡＧ（配列番号３）
・ＮＥＡＴ１ ｍｉｄ領域
フォワードプライマー：ＣＡＧＴＴＡＧＴＴＴＡＴＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＡＴＣＣＡ（配列番号４）
リバースプライマー：ＧＴＴＧＴＴＧＴＣＧＴＣＡＣＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣＴ（配列番号５）
・ＮＥＡＴ１ ３’領域
フォワードプライマー：ＡＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧＡＡＧ（配列番号６）
リバースプライマー：ＣＡＧＣＡＡＡＣＴＧＡＡＣＡＣＧＡＧＧＣ（配列番号７）
・ＭＡＬＡＴ１
フォワードプライマー：ＧＴＧＡＴＧＣＧＡＧＴＴＧＴＴＣＴＣＣＧ（配列番号８）
リバースプライマー：ＣＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＡＡＴＧＣＣＴＡＣ（配列番号９）
・βＡＣＴＩＮ
フォワードプライマー：ＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴ（配列番号１０）
リバースプライマー：ＧＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＧＡＴＡ（配列番号１１）
逆転写反応後の反応液をｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ社）で希釈し、１／２５量をｑＰＣＲ反応に用いた。ｑＰＣＲはＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、以下の条件で行った。
ｑＰＣＲ反応用溶液［２０μｌ（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（商標） ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ （ＴＯＹＯＢＯ社）、６ｐｍｏｌ フォワードプライマー、６ｐｍｏｌ リバースプライマー、２μｌ 希釈逆転写反応液、ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ］を９５℃１分処理して酵素を活性化したのち、９５℃１５秒の変性及び６０℃１分の伸長反応を４０サイクル行った。
融解曲線分析は、９５℃１５秒、６０℃１５秒、及び９５℃１５秒で行った。
標的遺伝子として、核内ノンコーディングＲＮＡであるＮＥＡＴ１遺伝子の３領域、ＭＡＬＡＴ１遺伝子の１領域、核外のｍＲＮＡであるβＡＣＴＩＮ遺伝子の１領域（これらの領域のＲＮＡにおける位置を図１に示す）の抽出量をリアルタイムＰＣＲによって解析した。
各プライマーセットは以下の通りである。（５’→３’）
・ＮＥＡＴ１ ５’領域
フォワードプライマー：ＧＴＡＣＴＧＧＧＡＧＧＧＡＴＧＡＧＧＧＴ（配列番号２）
リバースプライマー：ＡＡＴＴＣＣＣＣＡＡＡＧＣＣＣＣＡＧＡＧ（配列番号３）
・ＮＥＡＴ１ ｍｉｄ領域
フォワードプライマー：ＣＡＧＴＴＡＧＴＴＴＡＴＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＡＴＣＣＡ（配列番号４）
リバースプライマー：ＧＴＴＧＴＴＧＴＣＧＴＣＡＣＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣＴ（配列番号５）
・ＮＥＡＴ１ ３’領域
フォワードプライマー：ＡＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧＡＡＧ（配列番号６）
リバースプライマー：ＣＡＧＣＡＡＡＣＴＧＡＡＣＡＣＧＡＧＧＣ（配列番号７）
・ＭＡＬＡＴ１
フォワードプライマー：ＧＴＧＡＴＧＣＧＡＧＴＴＧＴＴＣＴＣＣＧ（配列番号８）
リバースプライマー：ＣＴＧＧＣＴＧＣＣＴＣＡＡＴＧＣＣＴＡＣ（配列番号９）
・βＡＣＴＩＮ
フォワードプライマー：ＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴ（配列番号１０）
リバースプライマー：ＧＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＧＡＴＡ（配列番号１１）
【表2】
【0062】
実施例１の解析の結果を図２に示す。ＮＥＡＴ１遺伝子の３領域、ＭＡＬＡＴ１遺伝子の１領域、βＡＣＴＩＮ遺伝子の１領域において、プロテアーゼなし（ネガティブコントロール）と比較して条件１、条件２、条件３での抽出率の増加をΔＣｔ値で評価した。この結果、細胞試料の細胞数やプロテアーゼの種類により若干の変動はあるものの、本実施例で使用した全ての非特異的プロテアーゼ及び細胞溶解剤を含む反応液で、核内ノンコーディングＲＮＡを抽出できることが初めて分かった。なかでも、非特異的プロテアーゼとしてサブチリシンを用いた場合に、ＮＥＡＴ１、ＭＡＬＡＴ１などの核内ノンコーディングＲＮＡを最も安定的に効率よく抽出できていることが分かった。
【0063】
実施例２：ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応での各プロテアーゼによる細胞からの核内ノンコーディングＲＮＡの抽出効率の評価
実施例１と同様に、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルと共に、サブチリシン、プロテイナーゼＫ、プロナーゼの各非特異的プロテアーゼを用いて、核内ノンコーディングＲＮＡ抽出効率を比較検討するため、以下の実験を行った。
抽出反応液は、上記実施例１と同じもの（表１）を使用した。５０、５００細胞のＨｅＬａ細胞を３μＬの抽出反応液に添加し、氷上で５回ピペッティングすることにより細胞を溶解した。細胞溶解後、同様に７５℃で１．５分間処理することによって酵素の失活、細胞の完全な溶解を行った。次いで、この細胞溶解した３μＬの反応液に、表３に示したＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液２を６μＬ加え、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法を行った。この方法では２５℃１０分、３０℃１０分、３７℃３０分、５０℃５分、及び８５℃５分で反応を行った。ＲＴ－ＲａｍＤＡ法では、特定のＲＮＡ領域だけではなく、核内ノンコーディングＲＮＡを含む全ＲＮＡを非特異的に逆転写することが可能である。そして、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応後、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液を前記実施例１と同じプライマーセットを用いてＮＥＡＴ１遺伝子の３領域、ＭＡＬＡＴ１遺伝子の１領域の抽出量をリアルタイムＰＣＲによって実施例１と同じ方法で解析した。リアルタイムＰＣＲの反応液及び熱サイクル条件等は実施例１と同様にして行った。
実施例１と同様に、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルと共に、サブチリシン、プロテイナーゼＫ、プロナーゼの各非特異的プロテアーゼを用いて、核内ノンコーディングＲＮＡ抽出効率を比較検討するため、以下の実験を行った。
抽出反応液は、上記実施例１と同じもの（表１）を使用した。５０、５００細胞のＨｅＬａ細胞を３μＬの抽出反応液に添加し、氷上で５回ピペッティングすることにより細胞を溶解した。細胞溶解後、同様に７５℃で１．５分間処理することによって酵素の失活、細胞の完全な溶解を行った。次いで、この細胞溶解した３μＬの反応液に、表３に示したＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液２を６μＬ加え、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法を行った。この方法では２５℃１０分、３０℃１０分、３７℃３０分、５０℃５分、及び８５℃５分で反応を行った。ＲＴ－ＲａｍＤＡ法では、特定のＲＮＡ領域だけではなく、核内ノンコーディングＲＮＡを含む全ＲＮＡを非特異的に逆転写することが可能である。そして、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応後、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液を前記実施例１と同じプライマーセットを用いてＮＥＡＴ１遺伝子の３領域、ＭＡＬＡＴ１遺伝子の１領域の抽出量をリアルタイムＰＣＲによって実施例１と同じ方法で解析した。リアルタイムＰＣＲの反応液及び熱サイクル条件等は実施例１と同様にして行った。
【表3】
【0064】
実施例２の解析の結果を図３に示す。ＮＥＡＴ１遺伝子の３領域、ＭＡＬＡＴ１遺伝子の１領域において、プロテアーゼなし（ネガティブコントロール）と比較して条件１、条件２、条件３でＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行った場合の溶出率の増加をΔＣｔ値で評価した。この結果、実施例１と同様に、本実施例で使用した全ての非特異的プロテアーゼ及び細胞溶解剤を含む反応液で核内ノンコーディングＲＮＡを抽出できることが分かった。本実施例においても、非特異的プロテアーゼとしてサブチリシンを用いた場合に、最も安定的に効率よく核内ノンコーディングＲＮＡを抽出できることが分かった。
【0065】
実施例３：各プロテアーゼによる細胞からの核内ノンコーディングＲＮＡの抽出効率の評価（核酸ポリマーなし）
実施例１、２と同様に、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルと共に、サブチリシン、プロテイナーゼＫ、プロナーゼの各非特異的プロテアーゼを用いて、核内ノンコーディングＲＮＡ抽出効率を比較検討するため、以下の実験を行った。
表４の組成で抽出反応液群２を調製した。５０、５００細胞のＨｅＬａ細胞を３μＬの抽出反応液に添加し、氷上で５回ピペッティングすることにより細胞を溶解した。
実施例１、２と同様に、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルと共に、サブチリシン、プロテイナーゼＫ、プロナーゼの各非特異的プロテアーゼを用いて、核内ノンコーディングＲＮＡ抽出効率を比較検討するため、以下の実験を行った。
表４の組成で抽出反応液群２を調製した。５０、５００細胞のＨｅＬａ細胞を３μＬの抽出反応液に添加し、氷上で５回ピペッティングすることにより細胞を溶解した。
【表4】
【0066】
細胞溶解による抽出後、これまでと同様に７５℃で１．５分間処理することによって酵素の失活、細胞の完全な溶解を行った。次いで、細胞溶解した３μＬの反応液に、表１に組成を示した逆転写反応液１を６μＬ加え、３７℃、３０分間逆転写反応を行った。そして、逆転写反応後、前記実施例１と同じプライマーセットを用いてＮＥＡＴ１遺伝子の３領域、ＭＡＬＡＴ１遺伝子の１領域の抽出量を実施例１と同じ方法で解析した。リアルタイムＰＣＲの反応液及び熱サイクル条件等は実施例１と同様にして行った。
【0067】
実施例３の解析の結果を図４に示す。ＮＥＡＴ１遺伝子の３領域、ＭＡＬＡＴ１遺伝子の１領域において、プロテアーゼなし（ネガティブコントロール）と比較して条件１、条件２、条件３で逆転写反応を行った場合の溶出率の増加をΔＣｔ値で評価した。この結果、実施例１と同様に、核酸ポリマーを含まない反応液を用いた場合でも、本実施例で使用した全ての非特異的プロテアーゼ及び細胞溶解剤を含む反応液で核内ノンコーディングＲＮＡを抽出できることが分かった。なかでも、非特異的プロテアーゼとしてサブチリシンを用いた場合に、核内ノンコーディングＲＮＡを最も安定的に効率よく抽出できていることが分かった。
【0068】
実施例４：ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応での各プロテアーゼによる細胞からの核内ノンコーディングＲＮＡの抽出効率の評価（核酸ポリマーなし）
実施例１、２、３と同様に、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルと共に、サブチリシン、プロテイナーゼＫ、プロナーゼの各非特異的プロテアーゼを用いて、核内ノンコーディングＲＮＡ抽出効率を比較検討するため、以下の実験を行った。
抽出反応液は、上記実施例３と同じもの（表４）を使用した。５０、５００細胞のＨｅＬａ細胞を３μＬの抽出反応液に添加し、氷上で５回ピペッティングすることにより細胞を溶解した。細胞溶解による抽出後、これまでと同様に７５℃で１．５分間処理することによって酵素の失活、細胞の完全な溶解を行った。次いで、この細胞溶解した３μＬの反応液に、表３に示したＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液２を６μＬ加え、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法を行った。この方法では実施例２と同様に２５℃１０分、３０℃１０分、３７℃３０分、５０℃５分、及び８５℃５分で反応を行った。ＲＴ－ＲａｍＤＡ法では、特定のＲＮＡ領域だけではなく、核内ノンコーディングＲＮＡを含む全ＲＮＡを非特異的に逆転写することが可能である。そして、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応後、前記実施例１と同じプライマーセットを用いてＮＥＡＴ１遺伝子の３領域、ＭＡＬＡＴ１遺伝子の１領域の抽出量をリアルタイムＰＣＲによって実施例１と同じ方法で解析した。リアルタイムＰＣＲの反応液及び熱サイクル条件等は実施例１と同様にして行った。
実施例１、２、３と同様に、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルと共に、サブチリシン、プロテイナーゼＫ、プロナーゼの各非特異的プロテアーゼを用いて、核内ノンコーディングＲＮＡ抽出効率を比較検討するため、以下の実験を行った。
抽出反応液は、上記実施例３と同じもの（表４）を使用した。５０、５００細胞のＨｅＬａ細胞を３μＬの抽出反応液に添加し、氷上で５回ピペッティングすることにより細胞を溶解した。細胞溶解による抽出後、これまでと同様に７５℃で１．５分間処理することによって酵素の失活、細胞の完全な溶解を行った。次いで、この細胞溶解した３μＬの反応液に、表３に示したＲＴ－ＲａｍＤＡ反応液２を６μＬ加え、ＲＴ－ＲａｍＤＡ法を行った。この方法では実施例２と同様に２５℃１０分、３０℃１０分、３７℃３０分、５０℃５分、及び８５℃５分で反応を行った。ＲＴ－ＲａｍＤＡ法では、特定のＲＮＡ領域だけではなく、核内ノンコーディングＲＮＡを含む全ＲＮＡを非特異的に逆転写することが可能である。そして、ＲＴ－ＲａｍＤＡ反応後、前記実施例１と同じプライマーセットを用いてＮＥＡＴ１遺伝子の３領域、ＭＡＬＡＴ１遺伝子の１領域の抽出量をリアルタイムＰＣＲによって実施例１と同じ方法で解析した。リアルタイムＰＣＲの反応液及び熱サイクル条件等は実施例１と同様にして行った。
【0069】
実施例４の解析の結果を図５に示す。ＮＥＡＴ１遺伝子の３領域、ＭＡＬＡＴ１遺伝子の１領域において、プロテアーゼなし（ネガティブコントロール）と比較して条件１、条件２、条件３でＲＴ－ＲａｍＤＡ反応を行った場合の溶出率の増加をΔＣｔ値で評価した。この結果、実施例１と同様に、核酸ポリマーを含まない反応液を用いた場合でも本実施例で使用した全ての非特異的プロテアーゼ及び細胞溶解剤を含む反応液で核内ノンコーディングＲＮＡを抽出できることが分かった。本実施例でも、非特異的プロテアーゼとしてサブチリシンを用いた場合に、最も効率的かつ安定して核内ノンコーディングＲＮＡを抽出できることが示された。
【0070】
実施例５：細胞溶解剤の添加による核内ノンコーディングＲＮＡの抽出効率への影響の評価
細胞溶解剤の添加による核内ノンコーディングＲＮＡ抽出効率を比較検討するため、以下の実験を行った。
表５の組成で抽出反応液群３を調製した。次いで、５、５０、５００細胞のＨｅＬａ細胞を３μＬの抽出反応液（ｐＨ５．５）に添加して、氷上で５回ピペッティングすることにより細胞を溶解した。
細胞溶解剤の添加による核内ノンコーディングＲＮＡ抽出効率を比較検討するため、以下の実験を行った。
表５の組成で抽出反応液群３を調製した。次いで、５、５０、５００細胞のＨｅＬａ細胞を３μＬの抽出反応液（ｐＨ５．５）に添加して、氷上で５回ピペッティングすることにより細胞を溶解した。
【表5】
【0071】
細胞溶解による抽出後、これまでと同様に７５℃で１．５分間処理することによって酵素の失活、細胞の完全な溶解を行った。次いで、細胞溶解した３μＬの反応液に、表２に組成を示した逆転写反応液１を６μＬ加え、３７℃、３０分間逆転写反応を行った。そして、逆転写反応後、前記実施例１と同じプライマーセットを用いてＮＥＡＴ１遺伝子の１領域（ｍｉｄ）、ＭＡＬＡＴ１遺伝子の１領域の抽出量をリアルタイムＰＣＲによって実施例１と同じ方法で解析した。リアルタイムＰＣＲの反応液及び熱サイクル条件等は実施例１と同様にして行った。
【0072】
実施例５の解析の結果を図６に示す。ＮＥＡＴ１遺伝子の１領域（ｍｉｄ）、ＭＡＬＡＴ１遺伝子の１領域において、プロテアーゼおよび細胞溶解剤なし（ネガティブコントロール）、条件１、条件２、条件３で逆転写反応を行った場合の抽出率をＣｔ値で評価した。なお、５細胞の場合のネガティブコントロールではいずれの領域も検出できず、Ｃｔ値が得られなかった（Ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ）。そして、サブチリシンのみを加えた条件１に比べ、細胞溶解剤を添加した条件２や条件３ではＣｔ値が低くなっており、核内ノンコーディングＲＮＡの抽出率が向上していることがわかった。
【0073】
実施例６：抽出反応液のｐＨ（酸性側）による核内ノンコーディングＲＮＡの抽出効率への影響の評価
抽出反応液のｐＨ（酸性側）による核内ノンコーディングＲＮＡ抽出効率への影響を検討するため、以下の実験を行った。
表６の組成で抽出反応液群４を調製した。ｐＨの調整は１００ｍＭ Ｂｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－（ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ）－（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）－ｍｅｔｈａｎｅ水溶液に１Ｍ ＨＣｌを適量添加することで行った。その後、ｐＨ調整後の緩衝液を１０分の１量（終濃度１０ｍＭ）加えることで抽出反応液のｐＨを調整した。次いで、１、１０、１００細胞のＨｅＬａ細胞を３μＬの抽出反応液（表６）に添加して、氷上で５回ピペッティングすることにより細胞を溶解した。
抽出反応液のｐＨ（酸性側）による核内ノンコーディングＲＮＡ抽出効率への影響を検討するため、以下の実験を行った。
表６の組成で抽出反応液群４を調製した。ｐＨの調整は１００ｍＭ Ｂｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－（ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ）－（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）－ｍｅｔｈａｎｅ水溶液に１Ｍ ＨＣｌを適量添加することで行った。その後、ｐＨ調整後の緩衝液を１０分の１量（終濃度１０ｍＭ）加えることで抽出反応液のｐＨを調整した。次いで、１、１０、１００細胞のＨｅＬａ細胞を３μＬの抽出反応液（表６）に添加して、氷上で５回ピペッティングすることにより細胞を溶解した。
【表6】
【0074】
細胞溶解による抽出後、これまでと同様に７５℃で１．５分間処理することによって酵素の失活、細胞の完全な溶解を行った。次いで、細胞溶解した３μＬの反応液に、表２に組成を示した逆転写反応液１を６μＬ加え、３７℃、３０分間逆転写反応を行った。そして、逆転写反応後、前記実施例１と同じプライマーセットを用いてＮＥＡＴ１遺伝子の１領域（ｍｉｄ）の抽出量をリアルタイムＰＣＲによって実施例１と同じ方法で解析した。リアルタイムＰＣＲの反応液及び熱サイクル条件等は実施例１と同様にして行った。
【0075】
実施例６の解析の結果を図７に示す。ＮＥＡＴ１遺伝子の１領域（ｍｉｄ）において、条件１、条件２、条件３で逆転写反応を行った場合の溶出率をＣｔ値で評価した。この結果、条件１のｐＨ５．５に比べ、条件２（ｐＨ６．５）、条件３（ｐＨ７．０）ではＣｔ値が高くなっており、核内ノンコーディングＲＮＡの溶出においては、ｐＨ５．５からｐＨ７．０の間ではｐＨ５．５が最も適していることがわかった。
【0076】
実施例７：抽出反応液のｐＨ（アルカリ側）による核内ノンコーディングＲＮＡの抽出効率への影響の評価
抽出反応液のｐＨ（アルカリ側）による核内ノンコーディングＲＮＡ抽出効率への影響を検討するため、以下の実験を行った。
表７の組成で抽出反応液群５を調製した。ｐＨの調整は１００ｍＭ Ｂｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－（ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ）－（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）－ｍｅｔｈａｎｅ水溶液に１Ｍ ＨＣｌを適量添加することで行った。その後、ｐＨ調整後の緩衝液を１０分の１量（終濃度１０ｍＭ）加えることで抽出反応液のｐＨを調整した。次いで、１０、１００細胞のＨｅＬａ細胞を３μＬの抽出反応液（表７）に添加して、氷上で５回ピペッティングすることにより細胞を溶解した。
抽出反応液のｐＨ（アルカリ側）による核内ノンコーディングＲＮＡ抽出効率への影響を検討するため、以下の実験を行った。
表７の組成で抽出反応液群５を調製した。ｐＨの調整は１００ｍＭ Ｂｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－（ｉｍｉｎｏｔｒｉｓ）－（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）－ｍｅｔｈａｎｅ水溶液に１Ｍ ＨＣｌを適量添加することで行った。その後、ｐＨ調整後の緩衝液を１０分の１量（終濃度１０ｍＭ）加えることで抽出反応液のｐＨを調整した。次いで、１０、１００細胞のＨｅＬａ細胞を３μＬの抽出反応液（表７）に添加して、氷上で５回ピペッティングすることにより細胞を溶解した。
【表7】
【0077】
細胞溶解による抽出後、これまでと同様に７５℃で１．５分間処理することによって酵素の失活、細胞の完全な溶解を行った。次いで、細胞溶解した３μＬの反応液に、表２に組成を示した逆転写反応液１を６μＬ加え、３７℃、３０分間逆転写反応を行った。そして、逆転写反応後、前記実施例１と同じプライマーセットを用いてＮＥＡＴ１遺伝子の１領域（ｍｉｄ）の抽出量をリアルタイムＰＣＲによって実施例１と同じ方法で解析した。リアルタイムＰＣＲの反応液及び熱サイクル条件等は実施例１と同様にして行った。
【0078】
実施例７の解析の結果を図８に示す。ＮＥＡＴ１遺伝子の１領域（ｍｉｄ）において、条件１、条件２、条件３、条件４で逆転写反応を行った場合の溶出率をＣｔ値で評価した。この結果、条件１（ｐＨ７．０）、条件２（ｐＨ７．５）、条件３（ｐＨ８．０）、条件４（ｐＨ８．５）では、アルカリ側に偏るほどＣｔ値が高くなった。実施例６の結果を踏まえると、核内ノンコーディングＲＮＡの溶出においては、ｐＨ５．５からｐＨ８．０の間ではｐＨ５．５が最も適していることがわかった。
【0079】
実施例８：抽出反応液のサブチリシン濃度による核内ノンコーディングＲＮＡの抽出効率への影響の評価１
抽出反応液のプロテアーゼ濃度による核内ノンコーディングＲＮＡ抽出効率への影響を検討するため、以下の実験を行った。
表８の組成で抽出反応液群６を調製した。次いで、１０、１００細胞のＨｅＬａ細胞を３μＬの抽出反応液（表８）に添加して、氷上で５回ピペッティングすることにより細胞を溶解した。
抽出反応液のプロテアーゼ濃度による核内ノンコーディングＲＮＡ抽出効率への影響を検討するため、以下の実験を行った。
表８の組成で抽出反応液群６を調製した。次いで、１０、１００細胞のＨｅＬａ細胞を３μＬの抽出反応液（表８）に添加して、氷上で５回ピペッティングすることにより細胞を溶解した。
【表8】
【0080】
細胞溶解による抽出後、これまでと同様に７５℃で１．５分間処理することによって酵素の失活、細胞の完全な溶解を行った。次いで、細胞溶解した３μＬの反応液に、表２に組成を示した逆転写反応液１を６μＬ加え、３７℃、３０分間逆転写反応を行った。そして、逆転写反応後、前記実施例１と同じプライマーセットを用いてＮＥＡＴ１遺伝子の１領域（５’）の抽出量をリアルタイムＰＣＲによって実施例１と同じ方法で解析した。リアルタイムＰＣＲの反応液及び熱サイクル条件等は実施例１と同様にして行った。
【0081】
実施例８の解析の結果を図９に示す。ＮＥＡＴ１遺伝子の１領域（５’）において、条件１、条件２、条件３で逆転写反応を行った場合の溶出率をＣｔ値で評価した。この結果、条件１（０．０００１ｍｇ／ｍＬサブチリシン）よりも、条件２（０．０００５ｍｇ／ｍＬサブチリシン）や条件３（０．００１ｍｇ／ｍＬサブチリシン）においてＣｔ値が低く、サブチリシンの濃度は０．０００５ｍｇ／ｍＬ以上が好ましいことがわかった。
【0082】
実施例９：抽出反応液のサブチリシン濃度による核内ノンコーディングＲＮＡの抽出効率への影響の評価２
抽出反応液のプロテアーゼ濃度による核内ノンコーディングＲＮＡ抽出効率への影響を検討するため、以下の実験を行った。
表９の組成で抽出反応液群７を調製した。次いで、１０細胞のＨｅＬａ細胞を３μＬの抽出反応液（表９）に添加して、氷上で５回ピペッティングすることにより細胞を溶解した。
抽出反応液のプロテアーゼ濃度による核内ノンコーディングＲＮＡ抽出効率への影響を検討するため、以下の実験を行った。
表９の組成で抽出反応液群７を調製した。次いで、１０細胞のＨｅＬａ細胞を３μＬの抽出反応液（表９）に添加して、氷上で５回ピペッティングすることにより細胞を溶解した。
【表9】
【0083】
細胞溶解による抽出後、これまでと同様に７５℃で１．５分間処理することによって酵素の失活、細胞の完全な溶解を行った。次いで、細胞溶解した３μＬの反応液に、表２に組成を示した逆転写反応液１を６μＬ加え、３７℃、３０分間逆転写反応を行った。そして、逆転写反応後、前記実施例１と同じプライマーセットを用いてＮＥＡＴ１遺伝子の１領域（５’）の抽出量をリアルタイムＰＣＲによって実施例１と同じ方法で解析した。リアルタイムＰＣＲの反応液及び熱サイクル条件等は実施例１と同様にして行った。
【0084】
実施例９の解析の結果を図１０に示す。ＮＥＡＴ１遺伝子の１領域（５’）において、条件１、条件２、条件３、条件４で逆転写反応を行った場合の溶出率をＣｔ値で評価した。この結果、条件１（０．００５ｍｇ／ｍＬサブチリシン）、条件２（０．０２ｍｇ／ｍＬサブチリシン）、条件３（０．１ｍｇ／ｍＬサブチリシン）、条件４（０．５ｍｇ／ｍＬサブチリシン）においてＣｔ値の差はほとんどなく、サブチリシンの濃度は０．５ｍｇ／ｍＬ程度であってもよいことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【0085】
本発明により、一般に抽出が困難とされている核内構造体含有ＲＮＡを安定的に効率よく抽出することができる。この手法は、核内ノンコーディングＲＮＡを含む、全ＲＮＡのトランスクリプトーム解析などの分子生物学における遺伝子解析、例えばＲＴ－ＰＣＲおよびそれに続くＮＧＳやリアルタイムＰＣＲによるＲＮＡの解析にも利用できる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】