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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022184558
(43)【公開日】2022-12-13
(54)【発明の名称】クロマグロの遺伝的性判別に用いる雄特異的塩基配列
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6879 20180101AFI20221206BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20221206BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20221206BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6879 Z ZNA
C12Q1/6851 Z
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021092491
(22)【出願日】2021-06-01
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、水産庁、「国際漁業資源評価調査・情報提供委託事業」委託事業、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】501168814
【氏名又は名称】国立研究開発法人水産研究・教育機構
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】藤原 篤志
(72)【発明者】
【氏名】中村 洋路
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR56
4B063QR62
4B063QS26
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】クロマグロの遺伝的性の判別に有用な性別特異的なＤＮＡ及び高精度で迅速、簡便なクロマグロの遺伝的性判別方法の提供。
【解決手段】クロマグロ被検体より採取された試料において、雄特異的ＤＮＡを検出することを含む、クロマグロの性判別方法。
【選択図】なし
【解決手段】クロマグロ被検体より採取された試料において、雄特異的ＤＮＡを検出することを含む、クロマグロの性判別方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
クロマグロ被検体より採取された試料において、雄特異的なＤＮＡを検出することを含む、クロマグロの性判別方法であって、
該ＤＮＡが以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種のＤＮＡである、方法：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列又はその部分塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列又はその部分塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
該ＤＮＡが以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種のＤＮＡである、方法：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列又はその部分塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列又はその部分塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項2】
前記検出の結果に基づいて前記被検体の雌雄を判別することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項3】
前記ＤＮＡが配列番号１で表される塩基配列又はその部分塩基配列からなるＤＮＡである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項4】
前記検出をＬＡＭＰ法により行うものである、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
【請求項5】
以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種のＤＮＡである、クロマグロの雄特異的なＤＮＡ：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列又はその部分塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列又はその部分塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列又はその部分塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列又はその部分塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項6】
請求項５記載のＤＮＡを含む、クロマグロの性判別用マーカー。
【請求項7】
請求項５記載のＤＮＡのクロマグロの性判別のための使用。
【請求項8】
請求項５記載のＤＮＡを特異的に増幅することができる、クロマグロの性判別用プライマー。
【請求項9】
請求項５記載のＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる、クロマグロの性判別用プローブ。
【請求項10】
請求項８記載のプライマー及び／又は請求項９記載のプローブを含む、クロマグロの性判別用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、クロマグロの遺伝的性判別に用いる雄特異的塩基配列に関する。
【背景技術】
【0002】
日本は世界最大のマグロ消費国であることから、マグロ類の資源管理や持続的利用に関して国際的な責任を負っている。資源管理施策の立案には、漁獲物や資源調査サンプルから取得された各種の生物情報を必要とし、体長、年齢、種等のデータとともに、性別データは重要な情報の１つである。
【0003】
現在、マグロ類の性判別は、生殖腺の目視あるいは組織学的切片観察という古典的な手法により行われている。しかし、これらの手法には、１）生殖腺が発達していない稚仔魚及び若齢個体、並びに市場流通する内臓処理済み個体の性判別には利用できない、２）検査に労力と時間がかかる、３）個体を生かした状態で性判別することが困難である、という欠点がある。そのため、例えば、クロマグロ（Ｔｈｕｎｎｕｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）資源調査サンプルの大部分で性別データが欠損したままとなり、クロマグロ生活史における時間的・空間的な移動・分布や成長特性などにおける性別の影響は分かっていない。また、近年のマグロ養殖では、天然ヨコワから人工種苗への転換が進められているが、飼育個体を生かした状態で性判別することが困難であるため、養成中の親魚群が産卵に適した性比で構成されているかどうかを調べることも出来ない。このような理由から、マグロ類の簡便で高精度な性判別方法の開発が望まれている。
【0004】
本発明者らは、これまでに、ゲノム中の性別特異的なＤＮＡ多型を検出することによるマグロ類の遺伝的性判別方法を開発している（特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２０１９－０８８２３４号公報
【特許文献2】特開２０２０－１８４９１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
ゲノム中の性別特異的ＤＮＡ多型を検出することによるマグロ類の遺伝的性判別方法では、該ＤＮＡ多型を検出するための特定の系を構築しなければならず、その実施にＰＣＲ装置、リアルタイムＰＣＲ装置などの高額機器や電気泳動などの煩雑な操作が必要であった。本発明の課題は、斯かる方法を実施できないあるいは実施が難しい調査船、漁港、養殖場などのサンプリング現場においてもクロマグロの性判別を可能とする性別特異的なＤＮＡ及び性判別方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
そこで、本発明者らは、上記課題を解決するために種々検討した結果、クロマグロゲノムに約２３０ｋｂの雄特異的ＤＮＡを初めて見出した。また、該ＤＮＡを利用することで、クロマグロの遺伝的性を高い精度で迅速、簡便に判別でき、汎用性の高い性判別方法を構築できることを見出し、本発明を完成した。
【0008】
すなわち、本発明は、次の〔１〕～〔１０〕を提供するものである。
〔１〕クロマグロ被検体より採取された試料において、雄特異的なＤＮＡを検出することを含む、クロマグロの性判別方法であって、
該ＤＮＡが以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種のＤＮＡである、方法：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列又はその部分塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列又はその部分塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
〔２〕前記検出の結果に基づいて前記被検体の雌雄を判別することをさらに含む、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記ＤＮＡが配列番号１で表される塩基配列又はその部分塩基配列からなるＤＮＡである、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕前記検出をＬＡＭＰ法により行うものである、〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種のＤＮＡである、クロマグロの雄特異的なＤＮＡ：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列又はその部分塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列又はその部分塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
〔６〕〔５〕記載のＤＮＡを含む、クロマグロの性判別用マーカー。
〔７〕〔５〕記載のＤＮＡのクロマグロの性判別のための使用。
〔８〕〔５〕記載のＤＮＡを特異的に増幅することができる、クロマグロの性判別用プライマー。
〔９〕〔５〕記載のＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる、クロマグロの性判別用プローブ。
〔１０〕〔８〕記載のプライマー及び／又は〔９〕記載のプローブを含む、クロマグロの性判別用キット。
〔１〕クロマグロ被検体より採取された試料において、雄特異的なＤＮＡを検出することを含む、クロマグロの性判別方法であって、
該ＤＮＡが以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種のＤＮＡである、方法：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列又はその部分塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列又はその部分塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
〔２〕前記検出の結果に基づいて前記被検体の雌雄を判別することをさらに含む、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記ＤＮＡが配列番号１で表される塩基配列又はその部分塩基配列からなるＤＮＡである、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕前記検出をＬＡＭＰ法により行うものである、〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種のＤＮＡである、クロマグロの雄特異的なＤＮＡ：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列又はその部分塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列又はその部分塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
〔６〕〔５〕記載のＤＮＡを含む、クロマグロの性判別用マーカー。
〔７〕〔５〕記載のＤＮＡのクロマグロの性判別のための使用。
〔８〕〔５〕記載のＤＮＡを特異的に増幅することができる、クロマグロの性判別用プライマー。
〔９〕〔５〕記載のＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる、クロマグロの性判別用プローブ。
〔１０〕〔８〕記載のプライマー及び／又は〔９〕記載のプローブを含む、クロマグロの性判別用キット。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、クロマグロの雄特異的ＤＮＡ、該ＤＮＡを検出するクロマグロの遺伝的性判別方法、並びに該方法に利用できるプライマー、プローブ及びキットが提供される。該ＤＮＡを性判別の指標とすれば、性別特異的ＤＮＡ多型を指標とする従来技術と比較して、性判別の精度を損なうことなく汎用性の高い性判別方法を構築することができる。ＰＣＲなどを用いた性判別だけでなく、標的配列に高い特異性が求められるため、従来、系構築が困難であったＬＡＭＰ法を用いた性判別も可能となる。ＬＡＭＰ法は、特異性が高く、迅速かつ簡便で、実験リソースの限られる調査船、漁港、養殖場などのサンプリング現場における実施にも適している。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】太平洋クロマグロ雌雄計１４個体について、性判別のためのＰＣＲを行い、増幅産物をアガロースゲル電気泳動した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本明細書における塩基配列（ヌクレオチド配列）、核酸などの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ規定（IUPAC-IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138:9-37, 1984）、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作製のためのガイドライン」（特許庁編）などの、当該分野で慣用される記号で記載されている。本明細書において「デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）」は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖という各１本鎖ＤＮＡを包含する。
【0012】
本明細書において、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、核酸と同義であって、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含むものとする。当該ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また当該ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。また、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は２本鎖であっても１本鎖であってもよく、ある配列を有する「ヌクレオチド」（又は「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」）といった場合、特に言及しない限り、これに相補的な配列を有する「ヌクレオチド」（又は「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」）も包括的に意味するものとする。
【0013】
本明細書において、「遺伝子」とは、ゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡの他、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、当該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片を包含するものであって、ＤＮＡを構成する塩基の配列情報の中に、何らかの生物学的情報が含まれているものを意味する。また、本明細書で「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エキソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。
【0014】
本明細書において「クロマグロ」は、太平洋クロマグロ（Ｔｈｕｎｎｕｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）を指す。クロマグロには、天然魚及び養殖魚のいずれもが包含される。以下、太平洋クロマグロを単にクロマグロと記載することがある。クロマグロの染色体数は１組２４本であり、ゲノムサイズは約８億塩基対である。
【0015】
本発明者らは、後述の実施例に示すとおり、クロマグロのゲノムＤＮＡにおいて、配列番号１で表される２３２６４７塩基の塩基配列からなるＤＮＡが雄にのみ存在することを見出した。また、該雄特異的ＤＮＡを検出することで、クロマグロの遺伝的性を高い精度で迅速、簡便に判別できることを見出した。よって、該雄特異的ＤＮＡは、クロマグロの遺伝的性を判別するための指標（マーカー）として有用である。ここで、「遺伝的性」とは、遺伝によって決まる性別のことをいい、以下、単に「性」あるいは「性別」ともいう。
【0016】
本発明のクロマグロの性判別マーカー（以下、本発明のマーカーと称する）は、以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１種のＤＮＡを含む。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列又はその部分塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列又はその部分塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
（ａ）～（ｄ）のＤＮＡは、雄特異的ＤＮＡである。（ｂ）～（ｄ）のＤＮＡには、クロマグロの性判別マーカーとして機能する限りにおいて、（ａ）の変異体が含まれる。当該変異体には、天然の対立遺伝子変異体や、当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る天然に存在しない変異体が包含される。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列又はその部分塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列又はその部分塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ。
（ａ）～（ｄ）のＤＮＡは、雄特異的ＤＮＡである。（ｂ）～（ｄ）のＤＮＡには、クロマグロの性判別マーカーとして機能する限りにおいて、（ａ）の変異体が含まれる。当該変異体には、天然の対立遺伝子変異体や、当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る天然に存在しない変異体が包含される。
【0017】
ここで、「雄特異的ＤＮＡ」とは、その存在が雄という性別と関連づけられていることを意味し、被験体由来の試料において該ＤＮＡが検出されると該被検体が雄であると判定できるものである。
【0018】
配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列中の連続する塩基からなる塩基配列であればよく、配列番号１で表される塩基配列のうち、好ましくは連続する５０塩基以上の塩基配列であり、より好ましくは連続する５０～１０００００塩基の塩基配列であり、さらに好ましくは連続する５０～５００００塩基の塩基配列であり、さらに好ましくは連続する５０～１００００塩基の塩基配列であり、さらに好ましくは連続する５０～５０００塩基の塩基配列であり、さらに好ましくは連続する５０～３０００塩基の塩基配列であり、さらに好ましくは連続する５０～１５００塩基の塩基配列であり、さらに好ましくは連続する５０～１０００塩基の塩基配列であり、さらに好ましくは連続する５０～５００塩基の塩基配列であり、さらに好ましくは連続する１００～５００塩基の塩基配列である。部分塩基配列の一例としては、配列番号１で表される塩基配列において遺伝子と予測された領域である９３９０～９８１８位、１６３８９～１７６０３位、３２６１４～６４６２８位、７６８５２～７７９６３位、８２４９０～８２９１９位、１１８９５４～１１９８４１位、１６８１２７～１６８４５６位、１７６６４５～１７６９７４位、１８６２４３～１８６５７２位、１９５８５９～１９６１８８位、２００９４０～２０１２６９位、２０７３２５～２０７６５４位の塩基配列、及びそれらの部分塩基配列が挙げられる。このうち、配列番号１の３２６１４～６４６２８位の塩基配列からなる遺伝子は、メダカ（Ｏｒｙｚｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓ）のｅｓｔｒｏｇｅｎ ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅをコードするｓｕｌｔ１ｓｔ６遺伝子と塩基配列の同一性が高く、実際にクロマグロの近縁種であるミナミマグロでｅｓｔｒｏｇｅｎ ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの発現が確認されているため、クロマグロにおいても遺伝子として機能していると考えられる。一般的に非遺伝子領域よりも遺伝子領域の方が、また、イントロン領域よりもエキソン領域の方が、配列保存性が高いことから、配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列としては、配列番号１の３２６１４～６４６２８位の塩基配列又はその部分塩基配列が好ましく、エキソン領域である配列番号１の３２６１４～３２８００位、３４０５８～３４１８６位、４６４０９～４６５０６位、４６７０７～４６８３３位、６１２８２～６１３７６位、６１４７1～６１６５１位、６４５１９～６４６２８位の塩基配列、又はそれらの部分塩基配列がより好ましい。
【0019】
配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列又は配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列としては、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列が挙げられる。塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ(Pro.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90:5873-5877)を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている(J.Mol.Biol.,1990,215,p.403-410)。また、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘのホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(www.ncbi.nlm.nih.gov参照）。
【0020】
本明細書において、別途定義されない限り、塩基配列における塩基の欠失、置換又は付加に関して使用される「１又は数個」とは、例えば、１～１２０個、好ましくは１～９０個、より好ましくは１～６０個、さらに好ましくは１～３０個、さらに好ましくは、１～１０個、さらに好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個、さらに好ましくは１個であり得る。また本明細書において、塩基の「付加」には、配列の一末端及び両末端への１又は数個の塩基の付加が含まれる。
【0021】
本明細書において、ストリンジェントな条件とは、同一性が高い塩基配列同士がハイブリダイズし、それより同一性が低い塩基配列同士がハイブリダイズしない条件をいう。「ストリンジェントな条件」とは、求める同一性の高低によって、適宜条件を変えることができる。より高ストリンジェントな条件であるほど、より同一性の高い配列のみがハイブリダイズすることになる。例えば、ストリンジェントな条件として、Molecular Cloning:A Laboratory Manual (Second Edition,J.Sambrook et.al,1989)に記載の条件等が挙げられる。すなわち、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８～１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件等が挙げられる。洗浄条件としては、１×ＳＳＣ、６０℃以上が好ましく、１×ＳＳＣ、７３℃以上がより好ましい。
【0022】
本発明のマーカーとしては、（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される１種のＤＮＡを用いてもよく、２種以上のＤＮＡを組み合わせて用いてもよい。本発明のマーカーは、好ましくは（ａ）のＤＮＡであり、より好ましくは配列番号１の３２６１４～６４６２８位の塩基配列又はその部分塩基配列からなるＤＮＡであり、さらに好ましくは配列番号１の３２６１４～３２８００位、３４０５８～３４１８６位、４６４０９～４６５０６位、４６７０７～４６８３３位、６１２８２～６１３７６位、６１４７１～６１６５１位、及び６４５１９～６４６２８位の塩基配列、又はそれらの部分塩基配列からなるＤＮＡである。
【0023】
本発明のクロマグロの性判別方法（以下、本発明の方法と称する）は、クロマグロ被検体より採取された試料において、上記の本発明のマーカーを検出することを含む。ここで、「マーカーの検出」とは、試料におけるマーカーの存在又は不存在を明らかにする意味である。本発明のマーカーは雄特異的なマーカーであるため、該マーカーの検出結果に基づいて、クロマグロ被検体が雄であるか雌であるかを判別することができる。具体的には、本発明のマーカーが検出されれば被験体は雄であると判別でき、検出されなければ被験体は雌であると判別できる。
【0024】
本発明の方法に供されるクロマグロ被検体は、性別を確認したいクロマグロの個体であり、天然魚であってもよいし、養殖魚であってもよく、その生育ステージは制限されない。被検体から採取される試料としては、ゲノムＤＮＡを含有する試料である限り特に制限されず、細胞、組織、ヒレ、筋肉、内臓、体表粘液などを例示することができる。該試料より、公知の方法によりゲノムＤＮＡを抽出すればよい。ゲノムＤＮＡの抽出法としては、例えば、フェノール法、ＣＴＡＢ法、アルカリＳＤＳ法等が挙げられる。ゲノムＤＮＡは、必要に応じて、公知の方法により精製してもよい。ゲノムＤＮＡ抽出のための試薬やキットは市販されており、これを用いてもよい。本発明の方法は、クロマグロ被検体より試料を採取することをさらに含んでいてもよい。また、本発明の方法は、クロマグロ被検体より採取された試料からゲノムＤＮＡを抽出することをさらに含んでいてもよい。
【0025】
本発明のマーカーは、当該分野で通常用いられる核酸の検出方法に従って検出することができる。斯かる検出方法の例としては、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ（例えばＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ(Loop-mediated Isothermal Amplification)法、ＩＣＡＮ（登録商標）(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)法、ＲＣＡ(Rolling Circle Amplification)法、ＬＣＲ(Ligase Chain Reaction)法、ＳＤＡ(Strand Displacement Amplification)法、ＨＲＭ（High Resolution Melting）法、サザンブロットハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、スロットブロットハイブリダイゼーション、ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ダイレクトシークエンスなどの核酸又はその増幅産物を検出する方法が挙げられる。核酸検出のための試薬やキットは、市販されており、これを用いてもよい。核酸の検出方法は、これらに限定されるものではなく、他の公知の方法を利用してもよい。また、これらの方法を単独で用いても、２以上の方法を組み合わせて用いてもよい。
【0026】
ＰＣＲを用いて本発明のマーカーを検出する場合、試料由来のゲノムＤＮＡを鋳型とし、本発明のマーカーの全部又は一部の領域を標的としてこれを特異的に増幅するように設計したプライマーペアを用いて該領域をＰＣＲにて増幅し、次いで増幅産物を検出すればよい。所望のサイズの増幅産物が検出される場合、被験体は雄と判別でき、増幅産物が検出されない又は増幅産物が所望のサイズではない場合、被験体は雌と判別できる。
【0027】
ＰＣＲに用いるプライマーは、標的とする領域に応じて、ＧＣ含有率、塩基の偏り、Ｔｍ値、二次構造などを考慮して適宜設計すればよく、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３（https://primer3.ut.ee）などのプライマー設計支援ソフトを用いて設計することができる。ＰＣＲの特異性を高めるため、設計したプライマーについて、該プライマー及び該プライマーによる増幅領域が標的領域に特異的であることを確認することが好ましい。特異的であるか否かは、例えば上述のＢＬＡＳＴを用いた検索によって確認することができる。
プライマーの塩基長は、通常１５～５０塩基であり、好ましくは１５～３５塩基である。該プライマーは、標的領域を特異的に増幅できる限りにおいて、鋳型ＤＮＡの塩基配列と１～数個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個のミスマッチを有していてもよい。
増幅サイズとしては、約５０～３０００ｂｐが好ましく、約５０～１５００ｂｐがより好ましく、約５０～５００ｂｐがさらに好ましい。
プライマーの塩基長は、通常１５～５０塩基であり、好ましくは１５～３５塩基である。該プライマーは、標的領域を特異的に増幅できる限りにおいて、鋳型ＤＮＡの塩基配列と１～数個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個のミスマッチを有していてもよい。
増幅サイズとしては、約５０～３０００ｂｐが好ましく、約５０～１５００ｂｐがより好ましく、約５０～５００ｂｐがさらに好ましい。
【0028】
ＰＣＲに用いるプライマーの具体的な例としては、本発明のマーカーの部分配列からなるオリゴヌクレオチド又はその相補鎖を利用することができる。該「相補鎖」とは、本発明のマーカーを特異的に認識する限り、完全に相補的な配列に限られず、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有する配列であればよい。
プライマーのさらに具体的な例としては、これらに限定されるものではないが、配列番号２～５のいずれかで表される塩基配列からなるプライマーが挙げられる。プライマーペアとしては、例えば、配列番号２で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーを含むプライマーペア、並びに配列番号４で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号５で表される塩基配列からなるプライマーを含むプライマーペアが挙げられる。
プライマーのさらに具体的な例としては、これらに限定されるものではないが、配列番号２～５のいずれかで表される塩基配列からなるプライマーが挙げられる。プライマーペアとしては、例えば、配列番号２で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーを含むプライマーペア、並びに配列番号４で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号５で表される塩基配列からなるプライマーを含むプライマーペアが挙げられる。
【0029】
ＰＣＲの反応条件は、特に限定されず、使用するプライマーペアや増幅領域の長さなどに応じて最適条件を定めればよいが、例えば、以下の条件が挙げられる。
１）２本鎖ＤＮＡの１本鎖ＤＮＡへの熱変性：通常９４～９８℃程度で、通常１０秒間～１分間程度加熱する。
２）アニーリング：通常５０～６５℃程度で、通常１０秒間～１分間程度加熱する。
３）ＤＮＡ伸長反応：通常６８～７２℃程度で、通常１０秒間～３分間程度加熱する。
ここで、アニーリングとＤＮＡ伸長反応は分けずに同時に行うことも可能である。
上記１）～３）の反応を、通常２５～４０サイクル程度行うことにより、標的領域を検出可能な程度に増幅することができる。
上記のような一連の操作は、一般的にＰＣＲに使用されるサーマルサイクラーを用いて実施することができる。
１）２本鎖ＤＮＡの１本鎖ＤＮＡへの熱変性：通常９４～９８℃程度で、通常１０秒間～１分間程度加熱する。
２）アニーリング：通常５０～６５℃程度で、通常１０秒間～１分間程度加熱する。
３）ＤＮＡ伸長反応：通常６８～７２℃程度で、通常１０秒間～３分間程度加熱する。
ここで、アニーリングとＤＮＡ伸長反応は分けずに同時に行うことも可能である。
上記１）～３）の反応を、通常２５～４０サイクル程度行うことにより、標的領域を検出可能な程度に増幅することができる。
上記のような一連の操作は、一般的にＰＣＲに使用されるサーマルサイクラーを用いて実施することができる。
【0030】
ＰＣＲ増幅産物の検出には、増幅産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、得られた増幅産物を電気泳動し、二本鎖ＤＮＡにインターカレートして蛍光を発するエチジウムブロマイド、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩなどの試薬で染色し、蛍光をＵＶ装置、蛍光プレートリーダーなどを用いて検出することで本発明のマーカーを検出することができる。あるいは、増幅反応の過程で取り込まれるｄＮＴＰに、放射性同位体、蛍光物質、発光物質等の標識体を作用させ、この標識体を検出することもできる。標識したｄＮＴＰを取り込んだ増幅産物を観察する方法としては、上述した標識体を検出するための当技術分野で公知の方法であればいずれの方法でもよい。例えば、標識体として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ－カウンター等により計測することができる。また標識体として蛍光を用いた場合には、その蛍光をＵＶ装置、蛍光プレートリーダー等を用いて検出することができる。
【0031】
尚、ＰＣＲ増幅産物が見られないことがＰＣＲの失敗に起因するものでないことを示すため、ＰＣＲ増幅反応時に、コントロールとして、雌雄の別なく存在する遺伝子や塩基配列を同時に増幅してもよい。このような遺伝子の例として、ミトコンドリアのＣＯＩ遺伝子、ＮＤ４遺伝子などが挙げられる。
【0032】
本発明のマーカーは、増幅産物量をリアルタイムでモニターし解析するリアルタイムＰＣＲによって検出することもできる。ＰＣＲの反応条件は、上述のとおりである。リアルタイムＰＣＲは、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化したリアルタイムＰＣＲ専用の装置を用いて行うことができる。
【0033】
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲを用いて本発明のマーカーを検出する場合、試料由来のゲノムＤＮＡを鋳型とし、本発明のマーカーの全部又は一部の領域を標的としてこれを増幅するように設計したプライマーペアと、増幅領域内部に特異的にハイブリダイズするように設計したプローブであって５’末端が蛍光物質で、３’末端がクエンチャー（消光物質）で標識されたプローブを用いて、該領域をＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲにて増幅し、次いで増幅に伴い発せられる蛍光を検出すればよい。蛍光が検出される場合、被験体は雄と判別でき、蛍光が検出されない場合、被験体は雌と判別できる。
【0034】
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲに用いるプライマー、増幅サイズ、ＰＣＲ反応条件は、上述のＰＣＲの場合と同様である。
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲに用いるプローブは、標的とする領域に応じて適宜設計すればよい。ＴａｑＭａｎ ＰＣＲの特異性を高めるため、設計したプローブが標的領域に特異的であることを確認することが好ましい。特異的であるか否かは、例えば上述のＢＬＡＳＴを用いた検索によって確認することができる。
プローブの塩基長は、通常１５～５０塩基であり、好ましくは１５～３５塩基である。該プライマーは、標的領域と特異的にハイブリダイズできる限りにおいて、鋳型ＤＮＡの塩基配列と１～数個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個のミスマッチを有していてもよい。該プローブは、５'末端がＦＩＴＣやＶＩＣなどの蛍光物質で、３'末端がＴＡＭＲＡなどのクエンチャー（消光物質）でそれぞれ標識されている。
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲに用いるプローブは、標的とする領域に応じて適宜設計すればよい。ＴａｑＭａｎ ＰＣＲの特異性を高めるため、設計したプローブが標的領域に特異的であることを確認することが好ましい。特異的であるか否かは、例えば上述のＢＬＡＳＴを用いた検索によって確認することができる。
プローブの塩基長は、通常１５～５０塩基であり、好ましくは１５～３５塩基である。該プライマーは、標的領域と特異的にハイブリダイズできる限りにおいて、鋳型ＤＮＡの塩基配列と１～数個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個のミスマッチを有していてもよい。該プローブは、５'末端がＦＩＴＣやＶＩＣなどの蛍光物質で、３'末端がＴＡＭＲＡなどのクエンチャー（消光物質）でそれぞれ標識されている。
【0035】
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲに用いるプローブの具体的な例としては、本発明のマーカーの部分配列からなるオリゴヌクレオチド又はその相補鎖の両末端に上記の標識を有するものを利用することができる。該「相補鎖」とは、本発明のマーカーを特異的に認識する限り、完全に相補的な配列に限られず、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有する配列であればよい。
【0036】
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲにより発せられる蛍光は、ＵＶ装置、蛍光プレートリーダー等の公知の手段を用いて検出することができ、好適には、リアルタイムＰＣＲ専用の装置を用いてリアルタイムに検出することができる。
【0037】
ＬＡＭＰ法を用いて本発明のマーカーを検出する場合、試料由来のゲノムＤＮＡを鋳型とし、本発明のマーカーの全部又は一部の領域を標的としてこれを特異的に増幅するように設計したプライマーセットを用いて該領域を増幅し、次いで増幅産物を検出すればよい。増幅産物が検出される場合、被験体は雄と判別でき、増幅産物が検出されない場合、被験体は雌と判別できる。
【0038】
ＬＡＭＰ法は、４種類又は６種類のプライマーからなるプライマーセットを用い、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによる鎖置換反応を利用して一定温度で標的配列を増幅する方法である（国際公開第２０００／０２８０８２号）。ＬＡＭＰ法では、標的となるＤＮＡ領域の一方の鎖の３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという３つの領域を、５’末端側からＢ３、Ｂ３、Ｂ１という３つの領域をそれぞれ規定する。これらの領域と相補的な領域は、それぞれ、Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ３ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ１ｃと表される。これらの領域の塩基配列に基づいて、ＦＩＰ、Ｆ３プライマー、ＢＩＰ、Ｂ３プライマーの４種類のプライマーを設計する。ＦＩＰは、５’末端側にＦ１ｃ領域の塩基配列を、３’側にＦ２領域の塩基配列を含む塩基配列からなる。Ｆ３プライマーは、Ｆ３領域の塩基配列からなる。ＢＩＰは、５’末端側にＢ１ｃ領域の塩基配列を、３’側にＢ２領域の塩基配列を含む塩基配列からなる。Ｂ３プライマーは、Ｂ３領域の塩基配列からなる。ＬＡＭＰ法においては、上記の４種類のプライマーにループプライマーＦ及びループプライマーＢの２種類のプライマーを加えた６種類のプライマーを用いてもよい。ループプライマーＦは、Ｆ１領域とＦ２領域の間の領域と相補的な塩基配列からなり、ループプライマーＢは、Ｂ１領域とＢ２領域の間の領域と相補的な塩基配列からなる。ループプライマーを用いることで、核酸増幅の起点を増やして増幅反応を促進することができる。これらのプライマーは、Ｔｍ値、末端安定性、ＧＣ含量、二次構造、プライマー間距離などを考慮して適宜設計すればよい。プライマー間距離は、Ｆ２領域の外側からＢ２領域の外側までの距離（ＬＡＭＰ法の増幅領域）を約１００～５００塩基とするのが好ましく、約１２０～１６０塩基とするのがより好ましく、Ｆ２領域の５’末端からＦ１領域の５’末端までの距離（ループ形成領域）を４０～６０塩基とすることが好ましく、Ｆ２領域とＦ３領域の間の距離を０～６０塩基とすることが好ましい。斯かるプライマーは、例えば、ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ（http://primerexplorer.jp）などのプライマー設計支援ソフトを用いて設計することができる。
【0039】
ＬＡＭＰ法に用いるプライマーの具体的な例としては、これらに限定されるものではないが、配列番号８～３７のいずれかで表される塩基配列からなるプライマーが挙げられる。プライマーセットとしては、例えば、配列番号８で表される塩基配列からなるＦ３プライマー、配列番号９で表される塩基配列からなるＢ３プライマー、配列番号１０で表される塩基配列からなるＦＩＰプライマー、及び配列番号１１で表される塩基配列からなるＢＩＰプライマーを含むプライマーセット；配列番号１２で表される塩基配列からなるＦ３プライマー、配列番号１３で表される塩基配列からなるＢ３プライマー、配列番号１４で表される塩基配列からなるＦＩＰプライマー、及び配列番号１５で表される塩基配列からなるＢＩＰプライマーを含むプライマーセット；配列番号１６で表される塩基配列からなるＦ３プライマー、配列番号１７で表される塩基配列からなるＢ３プライマー、配列番号１８で表される塩基配列からなるＦＩＰプライマー、及び配列番号１９で表される塩基配列からなるＢＩＰプライマーを含むプライマーセット；配列番号２０で表される塩基配列からなるＦ３プライマー、配列番号２１で表される塩基配列からなるＢ３プライマー、配列番号２２で表される塩基配列からなるＦＩＰプライマー、及び配列番号２３で表される塩基配列からなるＢＩＰプライマーを含むプライマーセット；配列番号２４で表される塩基配列からなるＦ３プライマー、配列番号２５で表される塩基配列からなるＢ３プライマー、配列番号２６で表される塩基配列からなるＦＩＰプライマー、及び配列番号２７で表される塩基配列からなるＢＩＰプライマーを含むプライマーセット；配列番号２４で表される塩基配列からなるＦ３プライマー、配列番号２５で表される塩基配列からなるＢ３プライマー、配列番号２６で表される塩基配列からなるＦＩＰプライマー、配列番号２７で表される塩基配列からなるＢＩＰプライマー、配列番号３６で表される塩基配列からなるループプライマーＦ、及び配列番号３７で表される塩基配列からなるループプライマーＢを含むプライマーセット；配列番号２８で表される塩基配列からなるＦ３プライマー、配列番号２９で表される塩基配列からなるＢ３プライマー、配列番号３０で表される塩基配列からなるＦＩＰプライマー、及び配列番号３１で表される塩基配列からなるＢＩＰプライマーを含むプライマーセット；並びに配列番号３２で表される塩基配列からなるＦ３プライマー、配列番号３３で表される塩基配列からなるＢ３プライマー、配列番号３４で表される塩基配列からなるＦＩＰプライマー、及び配列番号３５で表される塩基配列からなるＢＩＰプライマーを含むプライマーセットが挙げられる。
【0040】
ＬＡＭＰ法では、鋳型ＤＮＡ、プライマーセット、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、基質等を混合し、約６０～６５℃の一定温度で保温することにより、核酸増幅反応が進行する。等温で増幅反応が進行するため、反応は温度を一定に維持できる装置を用いて実施することができる。該装置としては、インキュベーター、サーマルサイクラー、リアルタイムＰＣＲ装置などが挙げられる。
【0041】
ＬＡＭＰ法による増幅産物の検出には、増幅産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、反応溶液に二本鎖ＤＮＡにインターカレートして蛍光を発するエチジウムブロマイド、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩなどの試薬を共存させておき、増幅反応後に反応チューブをＵＶ装置にかざすなどして蛍光を検出することで、増幅の有無を目視で容易に確認することができる。あるいは、伸長反応の際にｄＮＴＰから遊離されるピロリン酸イオンが反応溶液中のマグネシウムイオンと結合し、ピロリン酸マグネシウムが生成し、反応溶液に白濁が生じる。よって、反応チューブ内の反応溶液の濁度を目視や簡易な測定機器で検出することで、増幅の有無を容易に確認することができる。
【0042】
サザンブロッティング法を用いて本発明のマーカーを検出する場合、例えば、常法に従ってメンブレン上に試料由来のゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化したものをトランスファーし、次いで放射性同位体、蛍光物質、発光物質、酵素、ビオチン等で標識したプローブを該ゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせればよい。形成された標識プローブとゲノムＤＮＡとの二重鎖から該標識に由来するシグナルを検出することにより、本発明のマーカーを検出することができる。ここで、プローブとしては、本発明のマーカーの全部又は一部に特異的にハイブリダイゼーションし、該マーカーを検出できるプローブであることが好ましい。プローブの塩基長は、好ましくは１００～５０００塩基であり、より好ましくは５００～１０００塩基である。該プローブは、本発明のマーカーと特異的にハイブリダイゼーションできる限りにおいて、鋳型ＤＮＡの塩基配列と１～数個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個のミスマッチを有していてもよい。
【0043】
プローブの具体的な例としては、本発明のマーカーの全部又は部分配列からなるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はそれらの相補鎖を利用することができる。該「相補鎖」とは、本発明のマーカーを特異的に認識する限り、完全に相補的な配列に限られず、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有する配列であればよい。
【0044】
上記のプライマー又はプローブは、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができ、合成されたものでも天然のものでもよい。該プライマー又はプローブは、通常のホスホルアミダイト法、リン酸トリエステル法などの化学合成法によって合成してもよいし、また市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置などを使用して合成してもよい。あるいは、クロマグロのゲノムＤＮＡより常法に従って調製してもよい。
【0045】
前記特許文献１では、性別特異的なＤＮＡ多型という雌雄共通のゲノムＤＮＡ配列中の特定位置の特定塩基が性判別のマーカーであるため、該特定塩基を検出する必要があり、性判別方法の構築に制約があった。一方、本発明のマーカーは、雄特異的なＤＮＡであって約２３０ｋｂの長さを有しており、前記特許文献１に比べて性判別方法の構築の自由度がはるかに高く、汎用性が高い。
【0046】
本発明の方法によれば、雄特異的ＤＮＡを検出とすることで、性判別の精度を損なうことなく、迅速、簡便にクロマグロの性を判別することができる。該ＤＮＡの検出には種々の手法を利用できるが、なかでも、ＬＡＭＰ法は簡易な装置での実施が可能である。また、４種類又は６種類のプライマーを使用して６領域を認識することから、増幅の特異性が極めて高い。さらに、増幅効率が高く、１５分～１時間程度の反応で標的領域を検出可能な程度に増幅することができ、迅速性に優れている。高い増幅効率のため、増幅産物の量が多く、蛍光や濁度を利用して増幅の有無を容易に確認できる。また、一連の操作を反応チューブ内で完結でき、反応溶液のコンタミネーションや取り違えの可能性が低い。斯様に、ＬＡＭＰ法は迅速性及び簡便性に優れ、従来、設備上の理由で実施できなかったあるいは実施が難しかった施設においてもクロマグロの性判別が可能となる。したがって、本発明の雄特異的ＤＮＡの検出には、ＬＡＭＰ法を用いるのが好ましい。
【0047】
本発明の方法は、単独で実施しても、他の性判別方法と組み合わせて行ってもよい。他の性判別方法としては、生殖腺の目視、組織学的切片観察、性別特異的ＤＮＡ多型の検出などが挙げられる。
【0048】
本発明の方法は、本発明のマーカーを検出するための試薬キットを利用することによって、より簡便に実施することができる。該キットは、性判別用プライマー及び／又は性判別用プローブを含む。例えば、該キットとしては、ＰＣＲに用いる性判別用プライマーペアを含むキット、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲなどに用いる性判別用プライマーペア及び性判別用プローブを含むキット、ＬＡＭＰ法に用いる性判別用プライマーセットを含むキット、サザンブロットハイブリダイゼーションに用いる性判別用プローブを含むキットなどが挙げられる。
【0049】
本発明のキットは、任意成分として、標識剤、ＰＣＲに必要な試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰなど）、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲなどに必要な試薬（例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰなど）、ＬＡＭＰ法に必要な試薬（例えば、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰなど）を例示することができる。更に該キットには、測定の実施の便益のために適当な反応希釈液、緩衝液、制限酵素などが含まれていてもよい。
【実施例0050】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【0051】
実施例１ クロマグロの性別特異的な塩基配列の同定
太平洋クロマグロ雄１個体（生殖腺及び特許文献２の方法による性判別済み）を材料に用いてＰａｃＢｉｏロングリードシーケンスを行った。得られた塩基配列データを用いてゲノムアセンブリ作業（ＨＧＡＰ４によるコンティグ作成、Ｐｉｌｏｎによる配列修正、ＬＩＮＫＳによるコンティグ連結作業）を行った結果、雌には存在しない雄特異的なＤＮＡ断片（配列番号１、配列名：Ｍ１７５、約２３０ｋｂ）が得られた。尚、雌のゲノム配列は、ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）にＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＤＤＢＪ：ＢＫＣＫ０１０００００１～ＢＫＣＫ０１０００４４４として登録されている。
太平洋クロマグロ雄１個体（生殖腺及び特許文献２の方法による性判別済み）を材料に用いてＰａｃＢｉｏロングリードシーケンスを行った。得られた塩基配列データを用いてゲノムアセンブリ作業（ＨＧＡＰ４によるコンティグ作成、Ｐｉｌｏｎによる配列修正、ＬＩＮＫＳによるコンティグ連結作業）を行った結果、雌には存在しない雄特異的なＤＮＡ断片（配列番号１、配列名：Ｍ１７５、約２３０ｋｂ）が得られた。尚、雌のゲノム配列は、ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）にＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＤＤＢＪ：ＢＫＣＫ０１０００００１～ＢＫＣＫ０１０００４４４として登録されている。
【0052】
公開データベース（Ｅｎｓｅｍｂｌｅ）のタンパク質データ（アミノ酸配列）を用いて、この領域の遺伝子予測（Ｅｘｏｎａｒａｔｅ）を行った結果、下記表１に示す１２遺伝子が予測された。
【0053】
【表1】
【0054】
表１において、開始位置及び終了位置は、それぞれ、配列番号１における塩基の位置を表している。上記１２遺伝子のうち、ｇ３以外は転位因子に関連する遺伝子と同一性が高かった。一方、ｇ３は、メダカ（Ｏｒｙｚｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓ）のｅｓｔｒｏｇｅｎ ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅをコードするｓｕｌｔ１ｓｔ６遺伝子と同一性が高く、これをｓｕｌｔ１ｓｔ６ｙ遺伝子と命名した。Ｍ１７５は、雄特異的であることから性判別の指標として有用と考えられるが、一般に遺伝子領域は非遺伝子領域に比べて配列保存性が高いことを踏まえ、以下の実施例２～６ではＭ１７５のｓｕｌｔ１ｓｔ６ｙ遺伝子の領域を指標として用いた。
【0055】
実施例２ 性判別解析１
Ｍ１７５の塩基配列のうちｓｕｌｔ１ｓｔ６ｙ遺伝子の塩基配列を標的とし、これをＰＣＲにて増幅するための複数のプライマーペアを設計し、クロマグロ被検体の性判別解析を行った。ｓｕｌｔ１＿ＬＰ２Ｆプライマー（配列番号２）及びｓｕｌｔ１＿ＬＰ２Ｒプライマー（配列番号３）を用いたＰＣＲ増幅では、１３５２ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められた場合に、被検体の遺伝的性は雄であると判定でき、該ＤＮＡ断片の増幅が認められなかった場合に、被検体の遺伝的性は雌であると判定することができる。このとき、性別非特異的な４８６ｂｐのＤＮＡ断片も増幅するため、これによりＰＣＲの成否を確認することができる。また、ｓｕｌｔ１Ｙ＿Ｆ１プライマー（配列番号４）及びｓｕｌｔ１Ｙ＿Ｒ１プライマー（配列番号５）を用いたＰＣＲ増幅では、７７ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められた場合に、被検体の遺伝的性は雄であると判定でき、該ＤＮＡ断片の増幅が認められなかった場合に、被検体の遺伝的性は雌であると判定することができる。尚、人為的ミスでＰＣＲ増幅に失敗し、雄個体から７７ｂｐのＤＮＡ断片が増幅されずに雌と誤判定されてしまう偽陰性を防止するため、ミトコンドリアＤＮＡのＮＤ４遺伝子（内部陽性対照）の増幅用のＮＤ４＿Ｆプライマー（配列番号６）及びＮＤ４＿Ｒプライマー（配列番号７）も作製した。これらプライマーを用いたＰＣＲ増幅では、２６８ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。各プライマーの配列を表２に示す。表２中、５’ｐｏｓは、プライマーの５’末端の塩基の位置を配列番号１の塩基配列における塩基位置で示す。
Ｍ１７５の塩基配列のうちｓｕｌｔ１ｓｔ６ｙ遺伝子の塩基配列を標的とし、これをＰＣＲにて増幅するための複数のプライマーペアを設計し、クロマグロ被検体の性判別解析を行った。ｓｕｌｔ１＿ＬＰ２Ｆプライマー（配列番号２）及びｓｕｌｔ１＿ＬＰ２Ｒプライマー（配列番号３）を用いたＰＣＲ増幅では、１３５２ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められた場合に、被検体の遺伝的性は雄であると判定でき、該ＤＮＡ断片の増幅が認められなかった場合に、被検体の遺伝的性は雌であると判定することができる。このとき、性別非特異的な４８６ｂｐのＤＮＡ断片も増幅するため、これによりＰＣＲの成否を確認することができる。また、ｓｕｌｔ１Ｙ＿Ｆ１プライマー（配列番号４）及びｓｕｌｔ１Ｙ＿Ｒ１プライマー（配列番号５）を用いたＰＣＲ増幅では、７７ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められた場合に、被検体の遺伝的性は雄であると判定でき、該ＤＮＡ断片の増幅が認められなかった場合に、被検体の遺伝的性は雌であると判定することができる。尚、人為的ミスでＰＣＲ増幅に失敗し、雄個体から７７ｂｐのＤＮＡ断片が増幅されずに雌と誤判定されてしまう偽陰性を防止するため、ミトコンドリアＤＮＡのＮＤ４遺伝子（内部陽性対照）の増幅用のＮＤ４＿Ｆプライマー（配列番号６）及びＮＤ４＿Ｒプライマー（配列番号７）も作製した。これらプライマーを用いたＰＣＲ増幅では、２６８ｂｐのＤＮＡ断片が増幅される。各プライマーの配列を表２に示す。表２中、５’ｐｏｓは、プライマーの５’末端の塩基の位置を配列番号１の塩基配列における塩基位置で示す。
【0056】
【表2】
【0057】
具体的な試験方法は、以下のとおりである。天然太平洋クロマグロの雌４個体（図１のレーン１～４）、養殖太平洋クロマグロの雌２個体（図１のレーン５及び６）、養殖太平洋クロマグロの雄３個体（図１のレーン７、１１及び１２）及び天然太平洋クロマグロの雄３個体（図１のレーン８～１０）からなる雄６個体及び雌６個体（生殖腺による性判別済み）の計１２個体の各個体より、ハサミ等を用いて筋肉を採取し、ＴＮＥＳ・Ｕｒｅａ ６Ｍ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ、６Ｍ Ｕｒｅａ）中でプロテアーゼ処理を行い、自動ＤＮＡ抽出装置（Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣシステム、Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ ｋｉｔ、プロメガ株式会社製）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。該ゲノムＤＮＡ（最終濃度０．５ｎｇ／μＬ）を鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）と、ｓｕｌｔ１＿ＬＰ２Ｆプライマー（最終濃度０．５μＭ）及びｓｕｌｔ１＿ＬＰ２Ｒプライマー（最終濃度０．５μＭ）を用いて、ＰｒｏｆｌｅｘＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ製）によりＰＣＲ反応（９８℃１０秒、６０℃３０秒、６８℃１分のサイクルを３５サイクル）を行った。得られたＰＣＲ増幅産物を２％アガロースゲルにアプライし、１００Ｖで１５分間、電気泳動を行った。
また、別の養殖太平洋クロマグロの雌１個（図１のレーン１３）体及び雄１個体（図１のレーン１４）（生殖腺による性判別済み）の計２個体の各個体より、上記の手法にてゲノムＤＮＡを調製した。該ゲノムＤＮＡ（最終濃度０．５ｎｇ／μＬ）を鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）と、ｓｕｌｔ１Ｙ＿Ｆ１プライマー（最終濃度０．４μＭ）及びｓｕｌｔ１Ｙ＿Ｒ１プライマー（最終濃度０．４μＭ）並びにＮＤ４＿Ｆプライマー（最終濃度０．０５μＭ）及びＮＤ４＿Ｒプライマー（最終濃度０．０５μＭ）を用いて、ＰｒｏｆｌｅｘＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ製）によりＰＣＲ反応（９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃１５秒のサイクルを３５サイクル）を行った。得られたＰＣＲ増幅産物を２％アガロースゲルにアプライし、１００Ｖで１５分間、電気泳動を行った。
また、別の養殖太平洋クロマグロの雌１個（図１のレーン１３）体及び雄１個体（図１のレーン１４）（生殖腺による性判別済み）の計２個体の各個体より、上記の手法にてゲノムＤＮＡを調製した。該ゲノムＤＮＡ（最終濃度０．５ｎｇ／μＬ）を鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）と、ｓｕｌｔ１Ｙ＿Ｆ１プライマー（最終濃度０．４μＭ）及びｓｕｌｔ１Ｙ＿Ｒ１プライマー（最終濃度０．４μＭ）並びにＮＤ４＿Ｆプライマー（最終濃度０．０５μＭ）及びＮＤ４＿Ｒプライマー（最終濃度０．０５μＭ）を用いて、ＰｒｏｆｌｅｘＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ製）によりＰＣＲ反応（９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃１５秒のサイクルを３５サイクル）を行った。得られたＰＣＲ増幅産物を２％アガロースゲルにアプライし、１００Ｖで１５分間、電気泳動を行った。
【0058】
結果を図１に示す。図１のレーン１～１２は、ｓｕｌｔ１＿ＬＰ２Ｆプライマー及びｓｕｌｔ１＿ＬＰ２Ｒプライマーを用いたＰＣＲ増幅の結果を示す。１３５２ｂｐのＤＮＡ断片は、雌個体（レーン１～６）には認められず、雄個体（レーン７～１２）に特異的に認められた。全レーンに性別非特異的な４８６ｂｐのＤＮＡ断片が認められており、ＰＣＲが正常に実施されたことが明らかである。また、図１のレーン１３及び１４は、ｓｕｌｔ１Ｙ＿Ｆ１プライマー及びｓｕｌｔ１Ｙ＿Ｒ１プライマーを用いたＰＣＲ増幅の結果を示す。７７ｂｐのＤＮＡ断片は、雌個体（レーン１３）には認められず、雄個体（レーン１４）に特異的に認められた。全レーンにＮＤ４遺伝子由来の２６８ｂｐの増幅産物が認められており、ＰＣＲが正常に実施されたことが明らかである。試験した全個体で性を正確に判別でき、今回見出されたＭ１７５を指標とすることで、クロマグロ被検体の遺伝的性を高い精度で判別できることが示された。
【0059】
実施例３ 性判別解析２
ＬＡＭＰ法を用い、クロマグロの性判別解析を行った。雄特異的ＤＮＡを標的としたＬＡＭＰ法による解析では、増幅産物が検出された場合に被検体の性は雄であると判別でき、増幅産物が検出されなった場合に被検体の性は雌であると判別できる。
具体的な試験方法は、以下のとおりである。養殖太平洋クロマグロの雄１個体及び雌１個体（生殖腺及び特許文献２の方法による性判別済み）の計２個体の各個体より、実施例２と同様の手法にてゲノムＤＮＡを調製した。該ゲノムＤＮＡ（最終濃度２ｎｇ／μＬ）を鋳型とし、ＬｏｏｐａｍｐＤＮＡ増幅試薬Ｄ及び蛍光・目視検出試薬（栄研科学株式会社製）と下記表３に示す（ｉ）～（ｖｉｉ）のいずれかのプライマーセット（Ｆ３及びＢ３プライマーは最終濃度０．２μＭ、ＦＩＰ及びＢＩＰプライマーは最終濃度１．６μＭ）を用いて、ＰｒｏｆｌｅｘＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ製）により反応（６３℃５０分、９５℃５分）を行った。ネガティブコントロール（ＮＴＣ）としてＤＮＡなしの反応も行った。得られた増幅産物を反応チューブのまま青色ＬＥＤトランスイルミネーター（ＬＥＤＢ－ＳＢＯＸＨＰ、オプトコード株式会社製）にかざし、蛍光を目視で確認した。尚、表３中、５’ｐｏｓは、プライマーの５’末端の塩基の位置を配列番号１の塩基配列における塩基位置で示す。ＦＩＰ及びＢＩＰは逆方向の２配列を合成したプライマーのため、位置情報は示していない。
ＬＡＭＰ法を用い、クロマグロの性判別解析を行った。雄特異的ＤＮＡを標的としたＬＡＭＰ法による解析では、増幅産物が検出された場合に被検体の性は雄であると判別でき、増幅産物が検出されなった場合に被検体の性は雌であると判別できる。
具体的な試験方法は、以下のとおりである。養殖太平洋クロマグロの雄１個体及び雌１個体（生殖腺及び特許文献２の方法による性判別済み）の計２個体の各個体より、実施例２と同様の手法にてゲノムＤＮＡを調製した。該ゲノムＤＮＡ（最終濃度２ｎｇ／μＬ）を鋳型とし、ＬｏｏｐａｍｐＤＮＡ増幅試薬Ｄ及び蛍光・目視検出試薬（栄研科学株式会社製）と下記表３に示す（ｉ）～（ｖｉｉ）のいずれかのプライマーセット（Ｆ３及びＢ３プライマーは最終濃度０．２μＭ、ＦＩＰ及びＢＩＰプライマーは最終濃度１．６μＭ）を用いて、ＰｒｏｆｌｅｘＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ製）により反応（６３℃５０分、９５℃５分）を行った。ネガティブコントロール（ＮＴＣ）としてＤＮＡなしの反応も行った。得られた増幅産物を反応チューブのまま青色ＬＥＤトランスイルミネーター（ＬＥＤＢ－ＳＢＯＸＨＰ、オプトコード株式会社製）にかざし、蛍光を目視で確認した。尚、表３中、５’ｐｏｓは、プライマーの５’末端の塩基の位置を配列番号１の塩基配列における塩基位置で示す。ＦＩＰ及びＢＩＰは逆方向の２配列を合成したプライマーのため、位置情報は示していない。
【0060】
【表3】
【0061】
結果を表４に示す。表４において、「＋」は緑色の蛍光がみられたことを、「－」は蛍光がみられなかったことを表す。７種類のプライマーセットのいずれを用いた場合でも、雄個体では標的ＤＮＡ断片の増幅に伴う蛍光がみられた一方、雌個体では蛍光がみられなかった。よって、ＬＡＭＰ法によりクロマグロの性を正確に判別できた。
【0062】
【表4】
【0063】
実施例４ 性判別解析３
表３に示すプライマーセットのうち、プライマー領域にイントロンよりも保存性が高いエキソンの配列を含むプライマーセット（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を用い、ＬＡＭＰ法での性判別解析を行った。実施例３で用いたのとは別の天然太平洋クロマグロの雄６個体及び雌７個体（特許文献２の方法による性判別済み）、並びに実施例３で使用した養殖太平洋クロマグロ雄１個体及び雌１個体の計１５個体の各個体より、実施例２と同様の手法によりゲノムＤＮＡを調製した。該ゲノムＤＮＡ（最終濃度１．５～３ｎｇ／μＬ）を鋳型とし、プライマーセット（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）を用いた以外は実施例３と同様の手法によりクロマグロ被検体の性判別解析を行った。ネガティブコントロール（ＮＴＣ）としてＤＮＡなしの反応も行った。
表３に示すプライマーセットのうち、プライマー領域にイントロンよりも保存性が高いエキソンの配列を含むプライマーセット（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を用い、ＬＡＭＰ法での性判別解析を行った。実施例３で用いたのとは別の天然太平洋クロマグロの雄６個体及び雌７個体（特許文献２の方法による性判別済み）、並びに実施例３で使用した養殖太平洋クロマグロ雄１個体及び雌１個体の計１５個体の各個体より、実施例２と同様の手法によりゲノムＤＮＡを調製した。該ゲノムＤＮＡ（最終濃度１．５～３ｎｇ／μＬ）を鋳型とし、プライマーセット（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）を用いた以外は実施例３と同様の手法によりクロマグロ被検体の性判別解析を行った。ネガティブコントロール（ＮＴＣ）としてＤＮＡなしの反応も行った。
【0064】
結果を表５に示す。表５において、「＋」は緑色の蛍光がみられたことを、「－」は蛍光がみられなかったことを表し、また、個体番号１４及び１５が実施例３で使用した個体を表す。いずれのプライマーセットを用いた場合でも、全ての雄個体では標的ＤＮＡ断片の増幅に伴う蛍光がみられた一方、雌個体では蛍光がみられなかった。よって、ＬＡＭＰ法によりクロマグロの性を正確に判別できた。尚、プライマーセット（ｉｉｉ）を用いた場合、プライマーセット（ｉｖ）を用いた場合よりも蛍光強度が高く、性判別能が高かった。
【0065】
【表5】
【0066】
実施例５ 性判別解析４
表３に示すプライマーセットのうち、性判別能のより高いプライマーセット（ｉｉｉ）を用い、ＬＡＭＰ法での性判別解析を行った。実施例３及び４で用いたのとは別の天然太平洋クロマグロの雄１０個体及び雌１１個体（生殖腺並びに特許文献１及び２の方法による性判別済み）、並びに実施例３で使用した養殖太平洋クロマグロの雄１個体及び雌１個体の計２３個体の各個体より、実施例２と同様の手法によりゲノムＤＮＡを調製した。該ゲノムＤＮＡ（最終濃度０．８～２ｎｇ／μＬ）を鋳型とし、プライマーセット（ｉｉｉ）を用いた以外は実施例３と同様の手法によりクロマグロ被検体の性判別解析を行った。ネガティブコントロール（ＮＴＣ）としてＤＮＡなしの反応も行った。
表３に示すプライマーセットのうち、性判別能のより高いプライマーセット（ｉｉｉ）を用い、ＬＡＭＰ法での性判別解析を行った。実施例３及び４で用いたのとは別の天然太平洋クロマグロの雄１０個体及び雌１１個体（生殖腺並びに特許文献１及び２の方法による性判別済み）、並びに実施例３で使用した養殖太平洋クロマグロの雄１個体及び雌１個体の計２３個体の各個体より、実施例２と同様の手法によりゲノムＤＮＡを調製した。該ゲノムＤＮＡ（最終濃度０．８～２ｎｇ／μＬ）を鋳型とし、プライマーセット（ｉｉｉ）を用いた以外は実施例３と同様の手法によりクロマグロ被検体の性判別解析を行った。ネガティブコントロール（ＮＴＣ）としてＤＮＡなしの反応も行った。
【0067】
結果を表６に示す。表６において、「＋」は緑色の蛍光がみられたことを、「－」は蛍光がみられなかったことを表し、また、個体番号２３及び２４が実施例３で使用した個体を表す。全ての雄個体では標的ＤＮＡ断片の増幅に伴う蛍光がみられた一方、雌個体では蛍光がみられなかった。よって、ＬＡＭＰ法によりクロマグロの性を正確に判別できた。
【0068】
【表6】
【0069】
実施例６ 性判別解析５
表３に示すプライマーセットのうち、プライマーセット（ｖ）について、さらにループプライマーＦ（5-LF: CATCCCAGAATTGGATTTGTGAGT、配列番号３６）及びループプライマーＢ（5-LB: AAAAAGTGCCAAAACTACGGAGC、配列番号３７）を設計し、ループプライマーを用いる場合と用いない場合でＬＡＭＰ法での性判別解析を行った。具体的には、実施例３～５で用いたのとは別の天然太平洋クロマグロの雄２個体及び雌２個体（生殖腺及び特許文献２の方法による性判別済み）、並びに実施例３で使用した養殖太平洋クロマグロの雄１個体及び雌１個体の計６個体の各個体より、実施例２と同様の手法によりゲノムＤＮＡを調製した。該ゲノムＤＮＡ（最終濃度０．２～２ｎｇ／μＬ）を鋳型とし、プライマーセット（ｖ）を用い、ループプライマーを用いない場合には反応時間５０分とし、ループプライマーを用いる場合には各２０ｐｍｏｌを反応系に添加し、反応時間を３０分とした以外は実施例３と同様の手法によりクロマグロ被検体の性判別解析を行った。ネガティブコントロール（ＮＴＣ）としてＤＮＡなしの反応も行った。
表３に示すプライマーセットのうち、プライマーセット（ｖ）について、さらにループプライマーＦ（5-LF: CATCCCAGAATTGGATTTGTGAGT、配列番号３６）及びループプライマーＢ（5-LB: AAAAAGTGCCAAAACTACGGAGC、配列番号３７）を設計し、ループプライマーを用いる場合と用いない場合でＬＡＭＰ法での性判別解析を行った。具体的には、実施例３～５で用いたのとは別の天然太平洋クロマグロの雄２個体及び雌２個体（生殖腺及び特許文献２の方法による性判別済み）、並びに実施例３で使用した養殖太平洋クロマグロの雄１個体及び雌１個体の計６個体の各個体より、実施例２と同様の手法によりゲノムＤＮＡを調製した。該ゲノムＤＮＡ（最終濃度０．２～２ｎｇ／μＬ）を鋳型とし、プライマーセット（ｖ）を用い、ループプライマーを用いない場合には反応時間５０分とし、ループプライマーを用いる場合には各２０ｐｍｏｌを反応系に添加し、反応時間を３０分とした以外は実施例３と同様の手法によりクロマグロ被検体の性判別解析を行った。ネガティブコントロール（ＮＴＣ）としてＤＮＡなしの反応も行った。
【0070】
結果を表７に示す。表７において、「＋」は緑色の蛍光がみられたことを、「－」は蛍光がみられなかったことを表す。全ての雄個体では標的ＤＮＡ断片の増幅に伴う蛍光がみられた一方、雌個体では蛍光がみられなかった。よって、ＬＡＭＰ法によりクロマグロの性を正確に判別できた。また、反応時間３０分での性判別も可能であった。
【0071】
【表7】
【0072】
実施例２～６の結果より、ＬＡＭＰ法を用いることでクロマグロの性を高精度で判別できることが示された。ＬＡＭＰ法は、等温で反応が進行するため、装置としては一定温度を維持できる装置があればよく、ＰＣＲとは異なり高価な機器が必要ない。また、増幅反応が短時間で済む。さらに、増幅反応後、反応チューブをそのままＵＶ装置にかざして蛍光を確認するだけで、増幅の有無を容易に確認できる。斯様に、ＬＡＭＰ法は迅速性と簡便性に優れ、養殖場など実験リソースの限られる状況下でも精度の高い性判別が可能となる。
【0073】
実施例７ プライマー
以下、本発明のクロマグロの性判別方法に用いるプライマーの設計例を挙げる。表８にＰＣＲのためのプライマーペア１～１０を、表９にＬＡＭＰ法のためのプライマーセット１１～１５を示す。表中、５’ｐｏｓは、プライマーの５’末端の塩基の位置を配列番号１の塩基配列における塩基位置で示す。ＦＩＰ及びＢＩＰは逆方向の２配列を合成したプライマーのため、位置情報は示していない。
以下、本発明のクロマグロの性判別方法に用いるプライマーの設計例を挙げる。表８にＰＣＲのためのプライマーペア１～１０を、表９にＬＡＭＰ法のためのプライマーセット１１～１５を示す。表中、５’ｐｏｓは、プライマーの５’末端の塩基の位置を配列番号１の塩基配列における塩基位置で示す。ＦＩＰ及びＢＩＰは逆方向の２配列を合成したプライマーのため、位置情報は示していない。
【0074】
【表8】
【0075】
【表9】
【0076】
参考例１ Ｍ１７５の構造の確認
Ｍ１７５全体は雄特異的な配列である。一方、Ｍ１７５の部分塩基配列を指標としてクロマグロの性判別方法を構築する場合、該部分塩基配列に雌のゲノムＤＮＡと配列同一性の高い配列があると、プライマー又はプローブの設計に注意を要する。そこで、プライマーによる増幅産物の長さを１００ｂｐと仮定し、Ｍ１７５中の任意の連続する１００塩基以上からなる塩基配列が雌のゲノム配列と１００％マッチするか否かをＢＬＡＳＴにより検証した。結果を表１０に示す。
Ｍ１７５全体は雄特異的な配列である。一方、Ｍ１７５の部分塩基配列を指標としてクロマグロの性判別方法を構築する場合、該部分塩基配列に雌のゲノムＤＮＡと配列同一性の高い配列があると、プライマー又はプローブの設計に注意を要する。そこで、プライマーによる増幅産物の長さを１００ｂｐと仮定し、Ｍ１７５中の任意の連続する１００塩基以上からなる塩基配列が雌のゲノム配列と１００％マッチするか否かをＢＬＡＳＴにより検証した。結果を表１０に示す。
【0077】
【表10-1】
【0078】
【表10-2】
【0079】
【表10-3】
【0080】
表１０中、開始位置及び終了位置は、それぞれ、雌のゲノム配列に１００％マッチする塩基配列の５’末端の塩基及び３’末端の塩基の位置を配列番号１における塩基位置で示したものである。表１０に示すように、Ｍ１７５には雌のゲノム配列とマッチする部分塩基配列はあるが、当業者であれば、性判別用マーカーを検出する方法の特性に応じて、Ｍ１７５の全部又は適当な部分塩基配列からなるＤＮＡをマーカーとして選択し、本発明のクロマグロの性判別方法を実施することができる。例えば、性判別にＰＣＲを利用する場合、表１０の部分塩基配列のいずれか１つの領域を標的としてプライマーペアを設計することを回避すればよく、該部分塩基配列のいずれか１つの領域を標的としてプライマーペアの一方のプライマーを設計しても、他方のプライマーを該領域外に設計すれば、性判別可能である。例えば、性判別にＴａｑＭａｎ ＰＣＲを利用する場合、表１０の部分塩基配列のいずれか１つの領域を標的としてプライマーペア及びプローブを設計することを回避すればよく、プローブを表１０の部分塩基配列外の領域を標的として設計するなどすれば、性判別可能である。例えば、性判別にＬＡＭＰ法を利用する場合、該部分塩基配列のいずれか１つの領域を標的としてプライマーセットを設計することを回避するなど、雌雄で増幅の有無の違いが生じるようにプライマーセットを設計すれば、性判別可能である。また、例えば、性判別にサザンブロッティングハイブリダイゼーションを利用する場合、該部分塩基配列のいずれか１つの領域を標的としてプローブを設計しても、ゲノムＤＮＡを消化する際に適当な制限酵素を使用することで、性判別可能である。斯様に、Ｍ１７５は、適当なマーカーの検出方法を用いることで、全部又はその部分塩基配列からなるＤＮＡを性判別マーカーとして使用することができる。該マーカーとしては、表１０のいずれか１つの部分塩基配列に含まれる塩基配列からなるＤＮＡを除くことが好ましく、Ｍ１７５から表１０の部分塩基配列を除いた塩基配列の部分塩基配列からなるＤＮＡがより好ましい。
【図1】
【配列表】