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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022184852
(43)【公開日】2022-12-13
(54)【発明の名称】改変ナチュラルキラー細胞及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/24 20060101AFI20221206BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20221206BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221206BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20221206BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20221206BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20221206BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20221206BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20221206BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20221206BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221206BHJP
【ＦＩ】
C12N15/24
C12N5/0783 ZNA
C12N5/10
C12N15/62 Z
C12N15/12
C12N15/86 Z
C12N15/867 Z
A61K35/17 Z
A61P35/02
A61P35/00
【審査請求】有
【請求項の数】20
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022137956
(22)【出願日】2022-08-31
(62)【分割の表示】P 2020074650の分割
【原出願日】2015-05-14
(31)【優先権主張番号】61/993,494
(32)【優先日】2014-05-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】507421865
【氏名又は名称】ナショナル ユニヴァーシティ オブ シンガポール
(71)【出願人】
【識別番号】516092670
【氏名又は名称】セント ジュード チルドレンズ リサーチ ホスピタル インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100162422
【弁理士】
【氏名又は名称】志村 将
(72)【発明者】
【氏名】カンパナ ダリオ
(72)【発明者】
【氏名】シュック デイヴィッド
(72)【発明者】
【氏名】イマムラ マサル
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでのＮＫ細胞の増殖及び活性を促進する方法を提供する。
【解決手段】本発明は、特定の態様において、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）の全て又は機能性部分を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びそのような細胞を作製する方法を提供する。本発明は、患者においてがんを治療するために又はＮＫ細胞の増殖及び／若しくは生存を強化するためにインターロイキン１５（ＩＬ－１５）の全て又は機能性部分を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を使用する方法をさらに提供する。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、特定の態様において、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）の全て又は機能性部分を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びそのような細胞を作製する方法を提供する。本発明は、患者においてがんを治療するために又はＮＫ細胞の増殖及び／若しくは生存を強化するためにインターロイキン１５（ＩＬ－１５）の全て又は機能性部分を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を使用する方法をさらに提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
インターロイキン１５（ＩＬ－１５）の全て又は機能性部分を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。
【請求項2】
前記ＩＬ－１５が膜結合ポリペプチド及び／又は分泌ポリペプチドとして発現される、請求項１に記載のＮＫ細胞。
【請求項3】
前記ＩＬ－１５の全て又は機能性部分が膜貫通タンパク質の全て又は一部に融合される、請求項１及び２のいずれか一項に記載のＮＫ細胞。
【請求項4】
インターロイキン１５（ＩＬ－１５）の全て又は機能性部分を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の作製方法であって、
（ａ）ＩＬ－１５の全て又は機能性部分をコードする核酸をＮＫ細胞に導入すること、及び
（ｂ）前記ＮＫ細胞を、前記ＩＬ－１５の全て又は機能性部分が発現される条件下で維持すること
を含み、これによりＩＬ－１５の全て又は機能性部分を発現するＮＫ細胞を作製することを含む、前記方法。
（ａ）ＩＬ－１５の全て又は機能性部分をコードする核酸をＮＫ細胞に導入すること、及び
（ｂ）前記ＮＫ細胞を、前記ＩＬ－１５の全て又は機能性部分が発現される条件下で維持すること
を含み、これによりＩＬ－１５の全て又は機能性部分を発現するＮＫ細胞を作製することを含む、前記方法。
【請求項5】
前記ＮＫ細胞に導入される前記核酸が、ＣＤ８αのシグナルペプチド、ＩＬ－１５の全て又は機能性部分、及びＣＤ８αの膜貫通ドメインの全て又は一部を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ＮＫ細胞を、前記膜貫通ドメインの全て又は一部に連結された（例えば、融合された）前記ＩＬ－１５の全て又は機能性部分を発現するベクターで形質導入する、請求項４及び５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
請求項４～７のいずれか一項に記載の方法により作製されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。
【請求項9】
請求項１～３又は８のいずれか一項に記載のＮＫ細胞を含む組成物。
【請求項10】
請求項１～３又は８のいずれか一項に記載のＮＫ細胞を含む医薬組成物。
【請求項11】
ＩＬ－２の全て又は機能性部分をさらに含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
がんを治療することを必要とする個体においてがんを治療する方法であって、前記個体にインターロイキン１５（ＩＬ－１５）の全て又は機能性部分を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を投与することを含む、前記方法。
【請求項13】
前記がんが、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、骨髄異形成症候群、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫）、固形腫瘍（例えば、乳がん、前立腺がん、胃がん、結腸がん、肝細胞がん、上咽頭がん、神経芽細胞腫、高悪性度グリオーマ）、肉腫（例えば、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、非横紋筋肉腫軟部肉腫、骨肉腫）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
ＩＬ－２を前記個体に投与することをさらに含む、請求項１２及び１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記がんを対象とした１つ以上の抗体を前記個体に投与することをさらに含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
ＮＫ細胞の増殖及び／又は生存を強化する方法であって、
（ａ）ＩＬ－１５の全て又は機能性部分をコードする核酸を導入すること、及び
（ｂ）ＮＫ細胞を、前記ＩＬ－１５の全て又は機能性部分が発現され且つ前記ＮＫ細胞が増殖する条件下で維持すること
を含み、これにより前記ＮＫ細胞の増殖及び／又は生存を強化することを含む、前記方法。
（ａ）ＩＬ－１５の全て又は機能性部分をコードする核酸を導入すること、及び
（ｂ）ＮＫ細胞を、前記ＩＬ－１５の全て又は機能性部分が発現され且つ前記ＮＫ細胞が増殖する条件下で維持すること
を含み、これにより前記ＮＫ細胞の増殖及び／又は生存を強化することを含む、前記方法。
【請求項17】
前記ＮＫ細胞に導入される前記核酸が、ＣＤ８αのシグナルペプチド、ＩＬ－１５の全て又は機能性部分、及びＣＤ８αの膜貫通ドメインの全て又は一部を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記ＮＫ細胞を、前記膜貫通ドメインの全て又は一部に連結された（例えば、融合された）前記ＩＬ－１５の全て又は機能性部分を発現するベクターで形質導入する、請求項１６及び１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記ＮＫ細胞をＩＬ－２と接触させることをさらに含む、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、２０１４年５月１５日に出願の米国仮特許出願第６１／９９３４９４号の利益を主張するものである。上記の出願の教示は全て参照により本願に援用される。
【背景技術】
【0002】
ｉｎ ｖｉｖｏでのＮＫ細胞の生存及び増殖は、サイトカイン、例えばＩＬ－２及びＩＬ－１５による刺激を必要とする。例えば、免疫不全マウスへの注射後、活性化されたＮＫ細胞は１週間後には検出不可能となったが、ヒトＩＬ－２も投与すると最高で１ヶ月にわたって残った。ゆえに、ＮＫ細胞の注入を用いた臨床プロトコルは典型的には、患者の体内でのＮＫ細胞の生存を長引かせるのにＩＬ－２の投与に依存している。しかしながら、ＩＬ－２では少なからぬ副作用が起きる場合がある。発熱及び悪寒に加えて、ＩＬ－２の投与は、より深刻で場合によっては命にかかわる結果、例えば毛細管漏出症候群につながる可能性がある。ＩＬ－２の用量を減らせば副作用のリスクは抑えられるが、ＮＫ細胞の機能を阻害し場合によってはその抗ガン作用を無効にする制御性Ｔ細胞を刺激しかねない。
【発明の概要】
【0003】
したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでのＮＫ細胞の増殖及び活性を促進する代替の方法を開発することが重要であると考えられる。
【0004】
特許又は出願ファイルにはカラーで描かれた少なくとも１枚の図面が含まれる。カラーの図面が付属するこの特許又は特許出願公報の写しは、請求及び所要の費用の納付により特許庁から入手可能である。
【0005】
上記の内容は、添付の図面に描かれた後出の本発明の実施形態例のより具体的な説明から明らかとなる。図面において、異なる図であっても同様の参照符号は同じ部分を指す。図面は必ずしも縮尺通りではなく、本発明の実施形態を図示することを重視している。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1】図１Ａ－１Ｃ：ＩＬ－１５コンストラクトの設計及び発現。１Ａ：本研究で使用する野生型及び膜結合型ＩＬ－１５コンストラクトの概略図（「ｗｔＩＬ１５」及び「ｍｂＩＬ１５」）。１Ｂ：ｍｂＩＬ１５を形質導入したＮＫ細胞の表面でのＩＬ－１５の発現。増殖したＮＫ細胞の形質導入をｗｔＩＬ１５、ｍｂＩＬ１５又はＧＦＰだけを含むベクター（「Ｍｏｃｋ」）で行った。フローサイトメトリのドットプロットは、抗ＩＬ１５抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びフィコエリトリンにコンジュゲートさせたヤギ－抗マウス二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）で検出したＧＦＰ及びＩＬ－１５の発現示す。各クワドラントにおける細胞の割合（＞９８％ ＣＤ５６＋ＣＤ３－ＮＫ細胞）を示す。１Ｃ：ｗｔＩＬ１５を形質導入したＮＫ細胞によるＩＬ－１５の分泌。３人の異なるドナーからのＮＫ細胞を三重で試験した。バーは、ＩＬ－２不在下での培養から２４時間及び４８時間後に回収した上清において行ったＥＬＩＳＡ測定の平均±ＳＤを示す。ｍｏｃｋ形質導入細胞の上清においてＩＬ－１５は検出されなかった。
【図2】図２Ａ－２Ｃ：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ－１５を発現するＮＫ細胞の生存及び増殖。２Ａ：１５人のドナーからのｍｏｃｋ及びｍｂＩＬ１５形質導入細胞の場合（左のパネル）並びに９人のドナーからのｍｂＩＬ１５又はｗｔＩＬ１５形質導入細胞の場合（右のパネル）のＩＬ－２不在下での７日間の並行培養後の、投入した細胞と比較したＮＫ細胞回収率。水平方向のバーは中央値を示す。対応ｔ検定の結果を示す。ＩＬ－２（１０及び１００ＩＵ／ｍＬ）を加えた培養の結果を補足的な図Ｓ１に示す。２Ｂ：低用量のＩＬ－２（１０ＩＵ／ｍＬ）存在下での、６人のドナーからのｍｏｃｋ及びｍｂＩＬ１５形質導入ＮＫ細胞の生存及び増殖。２Ｃ：ＩＬ－２不在下又は低用量のＩＬ－２の存在下で培養した１人のドナーからのｍｂＩＬ１５、ｗｔＩＬ１５を形質導入したＮＫ細胞又はｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞の増殖及び長期生存（１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２での結果は図６に示す）。指定した培養日数でのＮＫ細胞回収率を示す。
【図3】図３Ａ－３Ｃ：ｍｂ－ＩＬ１５を発現するＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの生存及び増殖。３Ａ：ｍｏｃｋ又はｍｂＩＬ１５形質導入ＮＫ細胞をＩＬ－２存在下又は不在下で注射したマウス（全部で１６匹）の末梢血における注入から７日目及び１１日目のヒトＣＤ４５＋細胞の絶対数（７日目はＰ＝０．００４（ＩＬ－２不在下）、Ｐ＝０．０２１（ＩＬ－２存在下）。１１日目はＰ＝０．０４４及び０．０２６）。３Ｂ：フローサイトメトリのドットプロットは、ＩＬ－２処置なし（上）及びあり（下）の場合のマウス末梢血におけるヒトＣＤ４５＋、ＧＦＰ＋ＮＫ細胞の存在を示す。ＧＦＰ発現がある又はないヒトＣＤ４５＋細胞の割合を示す。３Ｃ：注射から１１日後に回収された、ＩＬ－２を伴って又は伴わずにｍｏｃｋ又はｍｂＩＬ１５形質導入ＮＫ細胞を注射されたマウスの様々な組織におけるヒト４５＋細胞の割合。全体的に、ヒトＣＤ４５＋細胞の割合はｍｂＩＬ１５で有意に高かった（Ｐ＜０．００１（ＩＬ－２不在）、Ｐ＝０．００２（ＩＬ－２存在））。
【図4】図４Ａ－４Ｃ：ｍｂＩＬ１５を発現するＮＫ細胞の性質。４Ａ：ｍｂＩＬ１５を形質導入したＮＫ細胞集団又はｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞集団における、培養前及び培養から７日後のＧＦＰ＋細胞の相対的な割合。１３人のドナーからのＮＫ細胞での結果を示す。ｍｂＩＬ１５の場合はＰ＜０．００１であり、ｍｏｃｋと比較して有意ではなかった。４Ｂ：ｍｂＩＬ１５形質導入ＮＫ細胞の免疫表現的な特徴。ＩＬ－２不在下で４８時間にわたって培養したＮＫ細胞に、フローサイトメトリによる細胞マーカー分析を行った。全ての結果を表４Ｃにまとめた。ｍｏｃｋ及びｍｂＩＬ１５形質導入ＮＫ細胞を４８時間にわたってＩＬ－２不在下で培養し、細胞ライセートをＫｉｎｅｘ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（Ｋｉｎｅｘｕｓ）により分析した。試験した８０９個の抗リン酸化タンパク質抗体のうち、Ｚ比＞０．５及び％エラー範囲＜１００のシグナルのものを示した。バーは、ｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞における正規化された強度と比較した、ｍｂＩＬ１５を発現するＮＫ細胞における％シグナル変化を示す。
【図5】図５Ａ－５Ｄ：ｍｂＩＬ１５を発現するＮＫ細胞の抗腫瘍能。９人のドナーからのｍｂＩＬ１５及びｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞のＮａｌｍ－６、Ｕ９３７、Ｋ５６２、Ｄａｕｄｉ、ＳＫ－ＢＲ－３及びＥＳ８細胞株に対する１：４及び１：１のＥ：Ｔ比での（各比での１５の実験。両方についてＰ＜０．００１）２４時間細胞障害性アッセイの結果。４時間及び２４時間細胞障害性アッセイにおける個々の細胞株について得られた結果を図７．５Ｂに示す。ｍｂＩＬ１５を発現するＮＫ細胞は標的細胞の存在下、細胞障害顆粒をより多く放出する。１：１での４時間細胞障害性アッセイ後のＣＤ１０７ａ＋ＮＫ細胞の割合。２つの細胞株に対する３人のドナーからのＮＫ細胞の結果を示す（Ｐ＝０．００７）。５Ｃ：ｍｂＩＬ１５を発現するＮＫ細胞は抗腫瘍活性をｉｎ ｖｉｖｏで発揮する。ＮＯＤ－ＳＣＩＤ－ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウスに、ルシフェラーゼで標識した１ｘ１０4のＵ９３７細胞を腹腔内注射した。３匹のマウスにおいて、処置は行われず（「ＮＫなし」）、４匹のマウスはｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞を３日目及び７日目に投与され（１ｘ１０7腹腔内）、４匹の別のマウスはｍｂＩＬ１５形質導入ＮＫ細胞を同じ用量及びスケジュールで投与された。腫瘍成長のｉｎ ｖｉｖｏイメージングの結果を示す（腹側の画像）。５Ｄ：異なる処置グループにおけるマウスの全体的な生存率比較。バイオルミネセンスが１ｘ１０11光子／秒に達した時にマウスを安楽死させた。３つの曲線のログランク検定及び２つの曲線のそれぞれの間での比較についてのＰ値を示す。
【図6】図６Ａ－６Ｃ：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ－１５を発現するＮＫ細胞の生存及び増殖。６Ａ：ＩＬ－２の不在下でのｍｂＩＬ１５を発現するＮＫ細胞の増殖は、抗ＩＬ－１５中和抗体により抑制された。記号は、ｍｂＩＬ１５を形質導入したＮＫ細胞での実験における投入細胞と比較した場合の、培養中の平均（±ＳＤ、ｎ＝３）ＮＫ細胞回収率を示す。６Ｂ：６人のドナーからのｍｏｃｋ、ｍｂＩＬ１５及びｗｔＩＬ１５形質導入細胞についての、低用量（１０ＩＵ／ｍＬ）及び高用量（１００ＩＵ／ｍＬ）のＩＬ２存在下での７日間の並行培養後の投入細胞と比較したＮＫ細胞回収率。水平方向のバーは中央値を示す。対応ｔ検定の結果を示す。６Ｃ：ｍｂＩＬ１５又はｗｔＩＬ１５を形質導入し、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２存在下で培養した１人のドナーからのＮＫ細胞の増殖及び長期生存。指定した培養日数でのＮＫ細胞回収率を示す。
【図7】図７Ａ－７Ｂ：ｍｂＩＬ１５を発現するＮＫ細胞の抗腫瘍能。Ｎａｌｍ－６、Ｕ９３７、Ｋ５６２、Ｄａｕｄｉ、ＳＫ－ＢＲ－３及びＥＳ８細胞株に対する１：４、１：２及び１：１のＥ：Ｔ比でのｍｂＩＬ１５及びｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞についての４時間（７Ａ）及び２４時間細胞障害性アッセイ（７Ｂ）の結果を示す。各記号は、Ｕ９３７、Ｋ５６２、ＥＳ８についての３人の異なるドナー、Ｎａｌｍ－６、Ｄａｕｄｉ及びＳＫ－ＢＲ－３についての２人のドナーからのＮＫ細胞での実験における平均±ＳＤ細胞障害性を示し、実験は全て三重で行われた（全ての実験についてＰ＜０．００１）。
【図8】図８Ａ－８Ｃ：ｍｂＩＬ１５を発現するＮＫ細胞の抗腫瘍能。ＮＯＤ－ＳＣＩＤ－ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウスに、ルシフェラーゼで標識した１ｘ１０5のＥＳ８細胞を腹腔内注射した。７匹のマウスにおいて、処置は行われず（「ＮＫなし」）、１１匹のマウスはｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞を３日目に投与され（１ｘ１０7腹腔内）、１２匹の別のマウスはｍｂＩＬ１５形質導入ＮＫ細胞を同じ用量及びスケジュールで投与された。腫瘍成長のｉｎ ｖｉｖｏイメージングの結果。各グループにおける腫瘍シグナルが最も高い４匹のマウスの腹側画像を示す。８Ｂ：腫瘍成長のｉｎ ｖｉｖｏイメージングの結果。各記号は１回のバイオルミネセンス測定に対応する（光子／秒、各マウスにおける相対的３日目測定）。８Ｃ：異なる処置グループにおけるマウスの全体的な生存率比較。バイオルミネセンスが１ｘ１０10光子／秒に達した時にマウスを安楽死させた。３つの曲線のログランク検定及び２つの曲線のそれぞれの間での比較についてのＰ値を示す。
【図9】膜結合ＩＬ－１５のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を示す。
【図10】ヒトＩＬ－１５（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＮＭ＿０００５８５．４）のヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）及びアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を示す。
【図11】図１１Ａ－１１Ｃ：ｍｂＩＬ１５はＮＫ細胞をシス提示により刺激する。１１Ａ：ＮＫ９２細胞にｍｂＩＬ１５（左）又はｗｔＩＬ１５（右）をＧＦＰを含むベクターで形質導入し、選別して１００％ＧＦＰ＋細胞を得て、非形質導入ＮＫ９２細胞と１：１の比で共培養した。ＧＦＰ＋及びＧＦＰ－細胞についての、培養開始時の細胞数に対する培養後の細胞回収率を示す（±ＳＤ、ｎ＝３）。１１Ｂ：ｍｂＩＬ１５を発現するＮＫ９２細胞又は非形質導入細胞を、ｍｂＩＬ１５を形質導入したＫ５６２細胞（「Ｋ」）又は非形質導入細胞と１：２の比で、示した組み合わせで共培養した。Ｋ５６２細胞をＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）で標識し、Ｓｔｒｅｃｋ ｃｅｌｌ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ（Ｓｔｒｅｃｋ、オマハ、ネブラスカ州）で処理することで培養前の細胞分裂を防止した。培養開始時の細胞数に対する、培養後のＮＫ９２細胞回収率（±ＳＤ、ｎ＝３）を示す。１１Ｃ：高くなる濃度の外来性のＩＬ－１５の存在下での非形質導入ＮＫ９２細胞のものと比較した、ｍｂＩＬ１５を発現するＮＫ９２細胞の増殖。培養を、ＩＬ－２（左）の不在下又は１０ＩＵ／ｍＬ（中央）若しくは１００ＩＵ／ｍＬ（右）のＩＬ－２の存在下で行った。培養開始時の細胞数に対する、培養後の細胞回収率（±ＳＤ、ｎ＝３）を示す。
【図12】図１２Ａ－１２Ｃ：ｍｂ１５－ＮＫ細胞におけるＫＩＲの発現及び機能。形質導入前、ｍｏｃｋ又はｍｂ１５形質導入後のそのＫＩＲ発現により定義されるＮＫ細胞サブセット。フローサイトメトリのドットプロットは、２人のドナーからのＣＤ５６＋ＣＤ３－細胞における抗ＫＩＲ抗体での染色の結果を示す。ＫＩＲ＋細胞の割合を示す。１２Ｂ：ＣＤ１５８ａポジティブ及びｃＤ１５８ａネガティブサブセットにおける、７２１．２２１細胞又はＣＤ１５８ａ結合Ｃｗ６ ＨＬＡを発現する同じ細胞との４時間の培養後のＣＤ１０７ａ発現の結果。３人のドナーからのＮＫ細胞での独立した４つの実験の平均（±ＳＤ）を示す（**Ｐ＜０．０００１、*Ｐ＝０．０００２）。１２Ｃ：１２Ｂに示す同じ実験におけるＩＦＮγ分泌の結果（**Ｐ＜０．０００１）。
【図13】図１３Ａ－１３Ｂ：ｍｂＩＬ１５を発現するＮＫ細胞の抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）。それぞれリツキシマブ又はトラスツズマブの存在下での（１３Ａ）Ｄａｕｄｉ及び（１３Ｂ）ＳＫ－ＢＲ－３に対するｍｂＩＬ１５及びｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞での４時間ＡＤＣＣアッセイ。同じ濃度の免疫療法抗体（１μｇ／ｍＬ）でのＩｇＧをコントロールとして使用した。各記号は、各ドナーからのＮＫ細胞での三重の実験における平均±ＳＤ細胞障害性を示す。免疫療法抗体の存在下、ｍｂＩＬ１５－ＮＫ細胞はｍｏｃｋ形質導入細胞より有意に高いＡＤＣＣを発揮した（Ｄａｕｄｉ又はＳＫ－ＢＲ－３での試験における各ドナーについてＰ＜０．００１）。抗体なしのｍｂＩＬ１５－ＮＫ細胞による細胞障害性も有意に高かった（Ｄａｕｄｉ又はＳＫ－ＢＲ－３での試験における各ドナーについてＰ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【0007】
以下、本発明の実施形態例について説明する。
【0008】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の定評のある抗白血病活性は、ＮＫ細胞の注入を治療に用い得ることを示している。ＮＫ細胞の生存及びそれゆえの細胞障害性はサイトカインによる支援を必要とする。本明細書では、非分泌、膜結合型のインターロイキン１５（ＩＬ－１５）の発現がＮＫ細胞の成長を持続させることができるかを調査した実験について説明する。ヒトＩＬ１５遺伝子を、ＣＤ８α膜貫通ドメインをコードするものに連結した（「ｍｂＩＬ１５」）。レトロウイルスによる形質導入後、ヒトＮＫ細胞はｍｂＩＬ－１５を細胞表面で発現したが、ＩＬ－１５の分泌はごくわずかであった。ＩＬ－２を使用しないｍｂＩＬ１５－ＮＫ細胞の生存及び増殖は、ｍｏｃｋ形質導入細胞のもの（７日間にわたる培養後、Ｐ＜０．０００１、ｎ＝１５）、また非膜結合ＩＬ－１５を分泌するＮＫ細胞のもの（Ｐ＝０．０２５、ｎ＝９）よりはるかに良好であった。生存ｍｂＩＬ１５－ＮＫ細胞は２ヶ月もの間、検出可能であった。免疫不全マウスにおいて、ｍｂＩＬ１５－ＮＫ細胞はＩＬ－２がなくとも増殖され、検査した全ての組織（脳以外）で、ｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞よりはるかに多い数で検出可能であった（Ｐ＜０．００１）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの増殖はＩＬ－２を用いるとさらに増大した。ｍｂＩＬ１５刺激の基本的なメカニズムはオートクリンである。ｍｂＩＬ１５はＩＬ－１５シグナル伝達及び抗アポトーシスシグナル伝達を活性化させる。白血病、リンパ腫及び固形腫瘍細胞株に対する細胞障害性はｍｂＩＬ１５－ＮＫ細胞で一貫して高かった。１：４Ｅ：Ｔでの２４時間細胞障害性中央値は、ｍｏｃｋ形質導入細胞の２２％に対して７１％であり、１：１Ｅ：Ｔでは５４％に対して９９％であった（Ｐ＜０．０００１）。上昇した抗腫瘍能は、白血病（Ｕ９３７）又は肉腫（ＥＳ８）細胞を移植した免疫不全マウスでも明白であった。したがって、ｍｂＩＬ１５によりＮＫ細胞は独立した成長ができ、またその抗腫瘍能は増強された。ｍｂＩＬ１５－ＮＫ細胞の注入は、ＩＬ－２の有害作用を伴うことのないＮＫ細胞療法を可能にする。
【0009】
したがって、本発明で提供するのは、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）の全て又は機能性部分を発現する（１つ以上の、複数の）細胞であり、この細胞は、ＩＬ－１５に応答する細胞である。ＩＬ－１５に応答する細胞には、その活性の１つ以上がＩＬ－１５により制御される細胞が含まれる。そのような細胞の例には、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、樹状細胞及び単球が含まれる。１つ以上の（例えば、単離された）細胞は、ＩＬ－１５の全て又は機能性部分を膜結合ポリペプチド、分泌タンパク質又はこれらの組み合わせとして発現することができる。
【0010】
一態様において、本発明は、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）の全て又は機能性部分）を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を対象としている。１つ以上の（例えば、単離された）ＮＫ細胞は、ＩＬ－１５の全て又は機能性部分を膜結合ポリペプチド、分泌タンパク質又はこれらの組み合わせとして発現することができる。
【0011】
本明細書において、「ナチュラルキラー細胞」（「ＮＫ細胞」）とは、免疫系の細胞障害性リンパ球の１つのタイプのことである。ＮＫ細胞は、ウイルス感染した細胞に迅速に応答し、またトランスフォーム細胞に応答する。典型的には、免疫細胞は、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子が感染細胞の表面上で提示する病原体からのペプチドを検知し、サイトカインの放出を誘発し、溶解又はアポトーシスを引き起こす。しかしながら、ＮＫ細胞は病原体由来のペプチドがＭＨＣ分子上に存在するか否かに関係なくストレス細胞を認識する能力を有し、他に類を見ない。最初は標的を殺すのに事前の活性化を必要としないと考えられたため、「ナチュラルキラー」と名付けられた。ＮＫ細胞は大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）であり、骨髄で分化、成熟し、次にそこから血液循環に入ると知られている。
【0012】
幾つかの態様において、ＮＫ細胞は哺乳類ＮＫ細胞である。「哺乳類」の例には、霊長類（例えば、ヒト）、イヌ、ネコ、齧歯類、ブタ、反芻動物等が含まれる。具体例には、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、雌牛、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ラット及びマウスが含まれる。特定の態様において、哺乳類ＮＫ細胞はヒトＮＫ細胞である。
【0013】
本明細書において、「インターロイキン１５」（「ＩＬ－１５」）とは、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化及び増殖を制御するサイトカインのことである。このサイトカイン及びインターロイキン２は数多くの生物学的活性を共有している。これらのサイトカインは共通の受容体サブユニットに結合すると判明しており、同じ受容体を巡って競合して互いの活性を負に制御する場合がある。ＣＤ８＋メモリー細胞の数は、ＩＬ－１５とＩＬ－２とのバランスにより制御されると判明している。このサイトカインはＪＡＫキナーゼの活性化、また転写アクチベータＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５及びＳＴＡＴ６のリン酸化及び活性化を誘発し、またアポトーシス阻害物質ＢＣＬ２Ｌ１／ＢＣＬ－ｘ（Ｌ）の発現をおそらくはＳＴＡＴ６の転写活性化活性を通して増加させることでアポトーシスを防止する。
【0014】
ＩＬ－１５の「機能性部分」（「生物学的に活性な部分」）とは、全長又は成熟ＩＬ－１５の１つ以上の機能を保持するＩＬ－１５の一部のことである。そのような機能にはＮＫ細胞の生存の促進、ＮＫ細胞及びＴ細胞の活性化及び増殖の制御、また造血幹細胞からのＮＫ細胞の発達の支援が含まれる。
【0015】
当業者ならばわかるように、多種多様なＩＬ－１５分子の配列は当該分野で公知である。一態様において、ＩＬ－１５は野生型ＩＬ－１５である。幾つかの態様において、ＩＬ－１５は哺乳類ＩＬ－１５（例えば、ホモ・サピエンスインターロイキン１５（ＩＬ１５）、転写変異体３、ｍＲＮＡ、ＮＣＢＩリファレンス配列：ＮＭ＿０００５８５．４；イヌインターロイキン１５（ＩＬ１５）、ｍＲＮＡ，ＮＣＢＩリファレンス配列：ＮＭ＿００１１９７１８８．１；ネコインターロイキン１５（ＩＬ１５）、ｍＲＮＡ、ＮＣＢＩリファレンス配列：ＮＭ＿００１００９２０７．１）である。「哺乳動物」の例には、霊長類（例えば、ヒト）、イヌ、ネコ、齧歯類、ブタ、反芻動物等が含まれる。具体例には、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、雌牛、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ラット及びマウスが含まれる。特定の態様において、哺乳類ＩＬ－１５はヒトＩＬ－１５である。
【0016】
ＩＬ－１５の全て又は機能性部分は、１つ以上のＮＫ細胞により様々な形で発現させることができる（膜結合及び／又は分泌ポリペプチドとして）。例えば、ＩＬ－１５の全て又は機能性部分をＮＫ細胞内で発現させ、ＮＫ細胞から分泌させる及び／又は当該分野で公知の多種多様なリンカーのいずれかを使用して（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９６）ＮＫ細胞の表面（例えば、ＮＫ細胞の表面又は膜内で）に直接若しくは間接的に（例えば、イオン、非イオン、共有結合）連結（共役、融合）することができる。特定の態様においては、ＩＬ－１５の全て又は機能性部分を膜貫通タンパク質の全て又は一部に連結する。一態様において、ＮＫ細胞は、膜貫通タンパク質の全て又は一部に融合したＩＬ－１５の全て又は一部を含む融合タンパク質を発現する。特定の態様において、膜貫通タンパク質のこの部分は、膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインの全て又は一部を含む。
【0017】
本明細書において、「膜貫通タンパク質」又は「膜タンパク質」は、生体膜のリン脂質二重層等の膜（例えば、細胞の膜等の生体膜）に及び／又は内に位置するタンパク質である。膜タンパク質が、膜によるその膜特有の活動の実行を可能にする。膜に付着したタンパク質の補体は、細胞型及び細胞内位置に応じて異なる。一部のタンパク質は膜表面にのみ結合するが、他は膜及び／又は膜の片面若しくは両面上のドメイン内に埋没している１つ以上の領域を有する。細胞外膜表面上のタンパク質ドメインは一般に、細胞間シグナル伝達又は相互作用に関与している。膜の細胞質側に沿って広がっているドメインは、細胞骨格タンパク質の膜へのアンカリングから細胞内シグナル伝達経路の誘発に及ぶ幅広い機能を有している。本明細書において「膜貫通ドメイン」と称される膜内のドメイン、特にはチャネル及びポアを形成するものは、分子を膜内外に移動させる。「膜貫通ドメイン」は三次元タンパク質構造体であり、膜において熱力学的に安定している（例えば、細胞等の小胞の膜）。膜貫通ドメインの例には、一重アルファへリックス、幾つかの膜貫通アルファへリックスの安定した複合体、膜貫通ベータバレル、グラミシジンＡのベータへリックス又は他の構造体が含まれる。膜貫通へリックスは通常、約２０アミノ酸長である。
【0018】
典型的には、膜タンパク質は、膜－タンパク質相互作用の性質に基づいて、２つの広いカテゴリ：内在性（内因性）及び周辺（外因性）膜タンパク質に分類される。殆どの生体膜は両方のタイプの膜タンパク質を含む。
【0019】
内因性タンパク質とも称される内在性膜タンパク質は、リン脂質二重層に埋め込まれた１つ以上のセグメントを有する。内在性膜タンパク質には膜貫通タンパク質及び脂質アンカータンパク質が含まれる。殆どの内在性タンパク質は、膜リン脂質の脂肪酸アシル基と相互作用する疎水性側鎖を有する残基を含むため、タンパク質は膜にアンカリングされる。殆どの内在性タンパク質はリン脂質二重層全体をまたぐように広がる。これらの膜貫通タンパク質は１つ以上の膜貫通ドメイン、また二重層の各面上の水性媒質内へとのびる４～数百残基長のドメインを含む。典型的には、膜貫通ドメインは、１つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のαへリックス及び／又はβストランドである。膜貫通αへリックスドメインは典型的には、二重層の脂質内部との疎水性相互作用、またおそらくはリン脂質の極性頭部基（例えば、グリコホリン）とのイオン相互作用により膜に埋め込まれる。βストランドの構造は典型的には、膜貫通バレル（例えば、ポリン）の形態である。一部の内在性タンパク質は、共有結合された脂肪酸により膜を構成している層の１つにアンカリングされる。これらのタンパク質において、結合している脂肪酸は膜に埋め込まれるが、ポリペプチド鎖はリン脂質二重層には進入しない。一部の細胞表面タンパク質は、Ｃ末端に連結している複合グリコシル化リン脂質により細胞膜の細胞外（ｅｘｏｐｌａｓｍｉｃ）側にアンカリングされる（例えば、グリコシルホスファチジルイノシトール、アルカリホスファターゼ）。一部の細胞質タンパク質は、Ｃ末端近くのシステインに共有結合した炭化水素部分により膜の細胞質側にアンカリングされる（例えば、プレニル、ファルネシル及びゲラニルゲラニル基）。別の脂質アンカー細胞質タンパク質群において、脂肪酸アシル基（例えば、ミリステート又はパルミテート）はアミド結合によりＮ末端グリシン残基に連結している。
【0020】
周辺膜タンパク質又は外因性タンパク質はリン脂質二重層の疎水性コアと相互作用しない。ただし周辺膜タンパク質は通常、内在性膜タンパク質との相互作用により間接的に又は脂質極性頭部基との相互作用により直接、膜に結合している。細胞膜の細胞質側に局在している周辺タンパク質には、赤血球中の細胞骨格タンパク質スペクトリン及びアクチン並びに酵素であるタンパク質キナーゼＣが含まれる。この酵素はサイトゾルと細胞膜の細胞質側との間での輸送を行い、またシグナル伝達において役割を果たす。細胞外マトリックスの特定のタンパク質を含めた他の周辺タンパク質は、細胞膜の外面（細胞外）に局在している。
【0021】
膜貫通タンパク質の例には、受容体、リガンド、免疫グロブリン、グリコホリン又はこれらの組み合わせが含まれる。膜貫通タンパク質の具体例には、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲα及び／又はＴＣＲβ等のＴＣＲ）、ニコチン性アセチルコリン受容体、ＧＡＢＡ受容体又はこれらの組み合わせが含まれる。免疫グロブリンの具体例にはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はこれらの組み合わせが含まれる。グリコホリンの具体例には、グリコホリンＡ、グリコホリンＤ又はこれらの組み合わせが含まれる。
【0022】
膜貫通タンパク質の全て又は一部に連結されていることに加えて、ＩＬ－１５の全て又は機能性部分を他の構成成分、例えばシグナルペプチド（例えば、ＣＤ８αシグナル配列）、リーダー配列、分泌シグナル、標識（例えば、レポーター遺伝子）等に連結し得る。特定の態様においては、ＩＬ－１５の全て又は機能性部分をＣＤ８αのシグナルペプチド並びにＣＤ８αの膜貫通ドメインの全て又は一部に融合させる。
【0023】
別の態様において、本発明はインターロイキン１５（ＩＬ－１５）の全て又は機能性部分を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を作製する方法を対象とする。ＩＬ－１５の全て又は一部を、膜結合ポリペプチド、分泌ポリペプチド又はこれらの組み合わせとして発現させ得る。この方法は、ＩＬ－１５の全て又は機能性部分をコードする核酸を１つ以上のＮＫ細胞に導入することを含む。一態様においては、ＩＬ－１５の全て又は機能性部分をコードする核酸を、膜貫通タンパク質の全て又は一部に連結する（例えば、融合）。あるいは又は加えて、ＩＬ－１５の全て又は機能性部分をコードする核酸をＮＫ細胞（例えば、野生型ＩＬ－１５）に導入する。当業者には明白であるように、ＩＬ－１５の全て又は機能性部分及び膜貫通タンパク質の全て若しくは一部に融合させたＩＬ－１５の全て若しくは機能性部分をコードする核酸をＮＫ細胞に導入する態様は、１つの核酸又は複数（例えば、別々、２つ）の核酸を使用して実行し得る。ＮＫ細胞を、ＩＬ－１５の全て又は機能性部分が膜結合ポリペプチド及び／又は分泌ポリペプチドとして発現される条件下で維持し、これにより、ＩＬ－１５の全て又は機能性部分を膜結合ポリペプチド及び／又は分泌ポリペプチドとして発現するＮＫ細胞を産生する。特定の態様においては、ＩＬ－１５の全て又は機能性部分をコードする核酸をＣＤ８αのシグナルペプチドに融合させ、ＣＤ８αの膜貫通ドメインの全て又は一部をＮＫ細胞に導入する。
【0024】
さらに別の態様において、本発明は、ＮＫ細胞の増殖及び／又は生存を強化する方法を対象とする（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ）。この方法は、ＩＬ－の全て又は機能性部分をコードする核酸を導入することを含む。ＩＬ－１５（例えば、野生型ＩＬ－１５）の全て若しくは一部及び／又は膜貫通タンパク質の全て若しくは一部に融合させたＩＬ－１５の全て若しくは機能性部分をコードする核酸をＮＫ細胞に導入し得る。したがって、ＮＫ細胞は、ＩＬ－１５の全て又は機能性部分を膜結合ポリペプチド、分泌ポリペプチド又はこれらの組み合わせとして発現させることができる。ＮＫ細胞を、ＩＬ－１５の全て又は一部が膜結合ポリペプチド、分泌ポリペプチド又はこれらの組み合わせとして発現され、またＮＫ細胞が増殖する条件下で維持する。特定の態様においては、ＩＬ－１５の全て又は機能性部分をコードする核酸をＣＤ８αのシグナルペプチドに融合させ、ＣＤ８αの膜貫通ドメインの全て又は一部をＮＫ細胞に導入する。幾つかの態様において、この方法はさらに、膜結合ＩＬ－１５及び／又は分泌ＩＬ－１５を含むＮＫ細胞をＩＬ－２と接触させることを含み得る。幾つかの態様において、ＩＬ－２の濃度は約１０～約１０００ＩＵ／ｍｌである。他の態様において、ＩＬ－２の濃度は、約２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、６００、６２０、６４０、６６０、６８０、７００、７２０ ７４０、７６０、７８０、８００、８２０、８４０、８６０、８８０、９００、９２０、９４０、９６０、９８０ＩＵ／ｍｌである。
【0025】
当業者には明白であるように、ＩＬ－１５の全て又は機能性部分を膜貫通ポリペプチド及び／又は分泌ポリペプチドとしてコードする核酸をＮＫ細胞に導入するための多種多様な方法（例えば、トランスフェクション、形質導入及び／又はトランスポゾン系）を用い得る。そのような方法の例には、化学的方法（例えば、リン酸カルシウム、高度に分岐した有機化合物（例えばデンドリマー）、リポソーム（リポフェクション法）及び／又はカチオンポリマー（例えば、ＤＥＡＥデキストラン、ポリエチレンイミン）の使用を伴う）、非化学的方法（例えば、エレクトロポレーション、セルスクイージング（Ｃｅｌｌ Ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、光学的トランスフェクション、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、ハイドロダイナミック法（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、粒子を利用した方法（例えば、遺伝子銃、マグネトフェクション、微粒子銃）、ベクターを利用した方法（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターその他等のウイルスベクターを含めたベクター）、ヌクレオトランスフェクション（ｎｕｃｌｅｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、トランスポゾンを利用した方法（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅｕａｔｙ、ＰｉｇｇｙＢＡＣ等）及び／又はＲＮＡトランスフェクションが含まれる。
【0026】
当業者には、（ｉ）ＩＬ－１５の全て又は機能性部分が膜結合ポリペプチド及び／若しくは分泌ポリペプチドとして発現される、並びに／又は（ｉｉ）膜結合ＩＬ－１５及び／若しくは分泌ＩＬ－１５を含むＮＫ細胞が増殖する条件下でＮＫ細胞を維持する多種多様な方法を用い得ることも明白である。例えば、ＮＫ細胞は、適切な温度及びガス混合物下で成長させ及び／又は維持し得る（例えば、細胞インキュベータにおいて約２５～約３７℃、約５％ＣＯ2）。培養条件は幅広く変化し得て、特定の細胞型について条件を変化させると表現型が異なるものになる場合がある。温度及びガス混合物に加えて、培養系において通常異なる要素は細胞増殖培地である。増殖培地の処方はｐＨ、グルコース濃度、増殖因子及び他の栄養素の存在により変化し得る。培地の補充に使用する増殖因子は動物の血液の血清由来であることが多く、例えばウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、仔ウシ血清、ウマ血清、ブタ血清及び／又はヒト血小板ライセート（ｈＰＬ）である。細胞を維持するにあたって考慮すべき他の要素には、プレーティング密度（培地の１単位体積あたりの細胞数）及び懸濁又は付着培養における細胞の成長が含まれる。
【0027】
この方法は、本発明で提供する方法により作製される１つ以上のＮＫ細胞を単離又は分離することをさらに含み得る。加えて、この方法は、この１つ以上のＮＫ細胞を培養することをさらに含み得る。幾つかの態様においては、ＮＫ細胞株を作製する。
【0028】
本発明は、本明細書に記載の方法により作製した（１つ以上の）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は細胞株及び本発明で提供するＮＫ細胞を含む組成物も包含する。特定の態様において、組成物は、本発明で提供するＮＫ細胞又は細胞株の１つ以上を含む医薬組成物である。医薬組成物は、ＩＬ－２の全て又は機能性部分（例えば、（１つ以上の）ＩＬ－２タンパク質の全て又は機能性部分；ＩＬ－２の全て又は機能性部分をコードする核酸）をさらに含み得る。
【0029】
本明細書において、「ＩＬ－２」とは、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１も含むサイトカインファミリーのメンバーのことである。ＩＬ－２は、アルファ、ベータ及びガンマと名付けられた３本の鎖から成る受容体複合体を通してシグナル伝達を行う。ガンマ鎖はこのファミリーのサイトカイン受容体の全てのメンバーが共通して有する。ＩＬ－１５と同様のＩＬ－２はＢ細胞によりつくられる免疫グロブリンの産生を促進し、またＮＫ細胞の分化及び増殖を誘発する。ＩＬ－２とＩＬ－１５との主な違いは、適応免疫応答に見られる。例えば、ＩＬ－２は外から来る病原体に対する適応免疫に必要である。免疫記憶の発達の基本だからである。他方、ＩＬ－１５は、ＣＤ８メモリーＴ細胞の生存を支援することによる高度に特異的なＴ細胞応答の維持に必要である。
【0030】
別の態様において、本発明は、それを必要とする個体において、ＮＫ細胞療法が関わる疾患及び／又は状態を治療する方法を対象とし、個体に、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）の全て又は機能性部分を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を投与することを含む。特定の態様において、ＮＫ細胞は、ＩＬ－１５の全て又は機能性部分を膜結合ポリペプチド及び／又は分泌ポリペプチドとして発現する。当該分野で公知であるように、ＮＫ細胞療法が関わる疾患及び／又は状態には、ＮＫ細胞欠乏症、がん、自己免疫疾患、感染性疾患等が含まれる。
【0031】
特定の態様において、本発明は、それを必要とする個体において、がん（例えば、腫瘍）を治療する方法を対象とし、この方法は、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）の全て又は機能性部分を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を個体に投与することを含む。ＩＬ－１５の全て又は機能性部分は、膜結合ポリペプチド及び／又は分泌ポリペプチドとして発現させることができる。
【0032】
この方法は、がん（例えば、腫瘍）に特異的な１つ以上の抗体、抗原フラグメント及び／又はこれらの融合物を投与することをさらに含み得る。例えば、この方法は、１つ以上の腫瘍抗原を対象とした１つ以上の抗体を投与することをさらに含み得る。当業者ならばわかるように、１つ以上の抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多価（例えば、二価、三価）抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等及びこれらの組み合わせになり得る。多種多様な抗原フラグメント及び／又は融合体も当該分野で公知であり、またＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、多価ｓｃＦｖ（例えば、ジ－ｓｃＦｖ、トリ－ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体（ナノボディ）等が含まれる。
【0033】
幾つかの態様において、がんは白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、骨髄異形成症候群、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫）、固形腫瘍（例えば、乳がん、前立腺がん、胃がん、結腸がん、肝細胞がん、上咽頭がん、神経芽細胞腫、高悪性度グリオーマ）、肉腫（例えば、ユーイング肉腫、横紋筋肉腫、非横紋筋肉腫、軟部肉腫、骨肉腫）である。
【0034】
がんを治療する方法は、ＩＬ－２（ＩＬ－２タンパク質の全て又は機能性部分；ＩＬ－２の全て又は機能性部分をコードする核酸）を個体に投与することをさらに含み得る。一態様において、ＩＬ－２は哺乳類ＩＬ－２、例えばヒトＩＬ－２である。特定の態様においては、低用量のＩＬ－２を個体に投与する。本明細書において、ＩＬ－１２の「低用量」とは、約１００万ＩＵ／ｍ2以下（例えば、約８００，０００ＩＵ／ｍ2、６００，０００ＩＵ／ｍ2、４００，０００ＩＵ／ｍ2、２００，０００ＩＵ／ｍ2、１００，０００ＩＵ／ｍ2、８０，０００ＩＵ／ｍ2、６０，０００ＩＵ／ｍ2、４０，０００ＩＵ／ｍ2、２０，０００ＩＵ／ｍ2、１０，０００ＩＵ／ｍ2、８，０００ＩＵ／ｍ2、６，０００ＩＵ／ｍ2、４，０００ＩＵ／ｍ2、２，０００ＩＵ／ｍ2、１，０００ＩＵ／ｍ2、８００ＩＵ／ｍ2、６００ＩＵ／ｍ2、４００ＩＵ／ｍ2、２００ＩＵ／ｍ2、１００ＩＵ／ｍ2）のＩＬ－２の用量のことである。対照的に、ＩＬ－２の通常の用量は、約１００万～約５００万ＩＵ／ｍ2である。
【0035】
インターロイキン１５（ＩＬ－１５）の全て又は機能性部分を発現する１つ以上のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（例えば、治療化合物、医薬組成物）を、治療有効量（すなわち、例えばガンに関係する症状を改善する、がんの発症を予防若しくは遅延させる、また、がんの症状の重症度若しくは頻度を低下させる及び／又はがんの転移を予防、遅延若しくは克服することでがんを治療するのに十分な量）で投与する。特定の個体の治療において治療的に有効な量は、その状態（例えば、がん）の症状及び重篤度に左右され、また標準的な臨床技法により求めることができる。加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイを任意で用いることは最適な用量範囲の割り出しに役立ち得る。処方で用いる精確な用量は投与経路及びがんの重症度にも左右され、また従事者の判断及び各患者の環境により決定すべきである。有効な用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は動物モデル試験系で得た用量反応曲線から推定し得る。
【0036】
治療化合物は、上述したように、組成物にして（例えば、医薬組成物）又はそれだけで送達し得る。治療化合物は全身投与し得て、あるいは特定の組織を標的にし得る。治療化合物は多種多様な手段で製造し得て、例えば化学合成、組み換えによる製造、ｉｎ ｖｉｖｏでの製造（例えば、Ｍｅａｄｅらによる米国特許第４，８７３，３１６号等のトランスジェニック動物）が含まれ、また本明細書に記載するような標準的な手段を用いて単離し得る。上記治療方法のいずれの組み合わせも用い得る。
【0037】
本明細書に記載の方法で使用するための化合物を生理学的に許容可能な担体又は賦形剤と共に処方することで医薬組成物を調製し得る。担体及び組成物は無菌になり得る。処方は、投与様式に沿ったものでなくてはならない。
【0038】
適切な医薬的に許容可能な担体には、以下に限定するものではないが、水、食塩水（例えば、ＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物、例えば乳糖、アミロース又はデンプン、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等及びこれらの組み合わせが含まれる。所望するならば、医薬製剤は助剤、例えば滑沢剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を変えるための塩、バッファ、着色料、香味料及び／又は芳香物質並びに活性化合物と有害な形で反応することのない同様のものと混合し得る。
【0039】
所望するならば、組成物は少量の湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝剤も含有し得る。組成物は溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤又は粉末になり得る。組成物は、慣用のバインダ及び担体、例えばトリグリセリドと共に坐薬として処方し得る。経口製剤は標準的な担体、例えば医薬品グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等を含み得る。
【0040】
これらの組成物の導入方法には、以下に限定するものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、局所、経口及び鼻腔内投与が含まれる。他の適切な導入方法は、（後述するような）遺伝子療法、再装填式又は生分解性のデバイス、粒子加速デバイス（「遺伝子銃」）及び徐放性ポリマーデバイスも含み得る。本発明の医薬組成物は、他の化合物との併用療法の一部として投与することもできる。
【0041】
組成物は、ヒトへの投与向けに適合させた医薬組成物としてルーチンの手順にしたがって処方し得る。例えば、静脈内投与用の組成物は典型的には滅菌等張水性バッファ中の溶液である。必要に応じて、組成物は、可溶化剤及び注射部位の痛みを和らげるための局所麻酔剤も含み得る。概して、成分は、単位剤形、例えばアンプル又はサシェ等の有効成分の量を示す密封容器に入った凍結乾燥粉末又は水非含有濃縮物として別々に又は混合して供給する。組成物を注入で投与する場合は、医薬品グレードの滅菌水、生理食塩水又はブドウ糖／水のはいった点滴容器で分注し得る。組成物を注射で投与する場合は、成分を投与前に混合できるように注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルを用意し得る。
【0042】
局所的に適用する場合は、局所適用可能であり且つ好ましくは水より高い動的粘性を有する担体を含む非噴霧形態、粘性～半固形又は固形形態を利用できる。適切な製剤には、以下に限定するものではないが、望むならば滅菌され又は助剤（例えば、保存料、安定剤、湿潤剤、バッファ又は浸透圧等を変化させるための塩等）と混合する溶液、懸濁液、エマルション、クリーム、軟膏、粉末、浣腸剤、ローション、ゾル、リニメント剤、膏薬、エアゾール剤等が含まれる。
【0043】
本明細書に記載の化合物は、中性又は塩の形態で処方し得る。医薬的に許容可能な塩には遊離アミノ基と生成されたものが含まれ、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等由来のもの、遊離カルボキシル基と生成されたもの、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等由来のものである。
【0044】
さらに別の態様において、本発明は、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）の全て又は機能性部分を膜結合ポリペプチドとして発現する１つ以上のＮＫ細胞を含む医薬組成物を対象とする。本発明は、療法において薬物として使用するための組成物（例えば、医薬組成物）も対象とする。例えば、本明細書で同定した物質はがんの治療で使用し得る。加えて、本明細書で同定した物質は、がん治療用の薬物の製造に使用し得る。
【0045】
本明細書において、「個体」とは動物、また特定の態様において哺乳動物のことである。哺乳動物の例には、霊長類、イヌ、ネコ、齧歯類等が含まれる。具体例には、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、雌牛、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ラット及びマウスが含まれる。「それを必要とする個体」とは、研究者、獣医、医師又は他の臨床家が治療又は予防を必要とすると判断した個体のことである。一実施形態において、それを必要とする個体は哺乳動物、例えばヒトである。
【0046】
本明細書における（１つ以上の）「単離した」、「実質的に純粋な」又は「実質的に純粋な単離した」ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞が自然に生じる複合細胞環境又は組み換え技法で作製する場合に培地又は化学的に合成する場合に化学的前駆体若しくは他の化学物質から分離される（から実質的に単離される）ものである。一部の例において、単離した材料は組成物（例えば、他の物質を含有する粗抽出物）、緩衝系又は試薬混合物の一部となる。他の状況においては、材料を、例えばアガロースゲル電気泳動又はＨＰＬＣ等のカラムクロマトグラフィで確認するように、本質的に均質になるまで精製し得る。好ましくは、ＮＫ細胞は、存在する全ての巨大分子種の少なくとも約５０％、８０％、９０％、９５％、９８％又は９９％を含む（モル基準）。
【0047】
「a」や「an」、「the」等の冠詞は、別段の定めがない限り又はそうではないことが文脈から明らかでない限り１又は１以上を意味し得る。
【0048】
本明細書及び請求項で用いる「及び／又は」という表現は、そのように等位結合した要素の「一方又は両方」を意味すると理解すべきである。「及び／又は」を用いて列挙する複数の要素も同じように、すなわちそのように等位結合した要素の「１つ以上」であると解釈すべきである。「及び／又は」節で具体的に挙げた要素以外の他の要素も任意で存在し得る。本明細書及び請求項で使用の「又は」とは、上で定義した「及び／又は」と同じ意味を有すると理解すべきである。例えば、要素の一覧で使用する場合、「又は」又は「及び／又は」は包括的である、すなわち要素の一覧の少なくとも１つ、ただし任意で２つ以上、また任意で一覧にない追加の要素を含んでいると解釈される。そうではないことを明確に示す語句、例えば「～の１つだけ」又は「～のきっかり１つ」だけが、多数の又は一覧にした要素のきっかり１つの要素を含むことを示す。したがって、別段の定めがない限り、ある群の１つ以上の構成要素の間に「又は」を含む請求項は、その群の構成要素の１つ、２つ以上又は全てが所与の産物又は工程に存在する、用いられる又は別の形で関係するならば満たされたとみなされる。群のきっかり１つの構成要素が所与の産物又は工程に存在する、用いられる又は別の形で関係する実施形態を提供する。所与の産物又は工程において群の構成要素の２つ以上又は全てが存在する、用いられる又は別の形で関係する実施形態を提供する。いずれの１つ以上の請求項も、任意の実施形態、態様、構成、要素、特徴又はこれらの任意の組み合わせを明示的に除外するように補正し得る。いずれの１つ以上の請求項も、任意の物質、組成物、量、用量、投与経路、細胞型、標的、細胞マーカー、抗原、標的部分又はこれらの組み合わせを除外するように補正し得る。
【実施例0049】
材料及び方法
腫瘍細胞株
ヒト細胞株Ｎａｌｍ－６（Ｂ系列急性リンパ芽球性白血病）、Ｄａｕｄｉ（Ｂ細胞リンパ腫）、Ｋ５６２及びＵ９３７（急性骨髄性白血病）並びにＳＫ－ＢＲ－３（乳がん）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、ユーイング肉腫細胞株ＥＳ８をＳｔ．Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌの組織レポジトリから入手した。全ての細胞株を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むＭＳＣＶ配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）－ＧＦＰレトロウイルスベクター（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅから入手）で形質導入した。形質導入細胞を、ＭｏＦｌｏ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、マイアミ、フロリダ州）又はＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンホセ、カリフォルニア州）でそのＧＦＰの発現に関して選択した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州）及び抗生物質を補充したＲＰＭＩ－１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）を使用して全ての細胞株を維持した。細胞株は、供給元により分子及び／又は遺伝子発現の特色について特徴づけられた。白血病及びリンパ腫細胞株の細胞マーカープロファイルを定期的にフローサイトメトリで試験することで何の変化も起きていないことを確認し、ＥＳ８をＤＮＡフィンガープリント法によりＤＳＭＺ（ブラウンシュヴァイク、ドイツ）で検証した。
腫瘍細胞株
ヒト細胞株Ｎａｌｍ－６（Ｂ系列急性リンパ芽球性白血病）、Ｄａｕｄｉ（Ｂ細胞リンパ腫）、Ｋ５６２及びＵ９３７（急性骨髄性白血病）並びにＳＫ－ＢＲ－３（乳がん）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、ユーイング肉腫細胞株ＥＳ８をＳｔ．Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌの組織レポジトリから入手した。全ての細胞株を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含むＭＳＣＶ配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）－ＧＦＰレトロウイルスベクター（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅから入手）で形質導入した。形質導入細胞を、ＭｏＦｌｏ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、マイアミ、フロリダ州）又はＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンホセ、カリフォルニア州）でそのＧＦＰの発現に関して選択した。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州）及び抗生物質を補充したＲＰＭＩ－１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）を使用して全ての細胞株を維持した。細胞株は、供給元により分子及び／又は遺伝子発現の特色について特徴づけられた。白血病及びリンパ腫細胞株の細胞マーカープロファイルを定期的にフローサイトメトリで試験することで何の変化も起きていないことを確認し、ＥＳ８をＤＮＡフィンガープリント法によりＤＳＭＺ（ブラウンシュヴァイク、ドイツ）で検証した。
【0050】
ヒトＮＫ細胞増殖
末梢血サンプルを、健康な成人ドナーからの血小板採取物の不要な副産物から得た。単核細胞をＡｃｃｕ－Ｐｒｅｐデンシティステップ（Ａｃｃｕｒａｔｅ、ウェストバリー、ニューヨーク州）での遠心分離により精製し、ＲＰＭＩ－１６４０中で２回洗浄した。ＣＤ５６＋ＣＤ３－ＮＫ細胞を増殖するために、末梢血単核細胞及び遺伝子組み換えＫ５６２－ｍｂ１５－４１ＢＢＬ細胞株を、過去にＦｕｊｉｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６９（９）：４０１０－４０１７（２００９）；Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０６：３７６－３８３（２００５））に記載されたように共培養した。簡単に説明すると、末梢血単核細胞を１００Ｇｙ照射Ｋ５６２－ｍｂ１５－４１ＢＢＬ細胞と１．５：１の比で、１０％ＦＢＳ、抗生物質及び１０ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン２（ＩＬ－２、Ｒｏｃｈｅ、マンハイム、ドイツ）を含有するＳＣＧＭ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、フライブルグ、ドイツ）中、６ウェル組織培養プレートで培養した。組織培地を部分的に２日毎に交換した。共培養７日後に、残存Ｔ細胞をＤｙｎａｂｅａｄｓ ＣＤ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で除去すると、＞９５％ＣＤ５６＋ＣＤ３－ＮＫ細胞を含む細胞集団が得られた。
末梢血サンプルを、健康な成人ドナーからの血小板採取物の不要な副産物から得た。単核細胞をＡｃｃｕ－Ｐｒｅｐデンシティステップ（Ａｃｃｕｒａｔｅ、ウェストバリー、ニューヨーク州）での遠心分離により精製し、ＲＰＭＩ－１６４０中で２回洗浄した。ＣＤ５６＋ＣＤ３－ＮＫ細胞を増殖するために、末梢血単核細胞及び遺伝子組み換えＫ５６２－ｍｂ１５－４１ＢＢＬ細胞株を、過去にＦｕｊｉｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６９（９）：４０１０－４０１７（２００９）；Ｉｍａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０６：３７６－３８３（２００５））に記載されたように共培養した。簡単に説明すると、末梢血単核細胞を１００Ｇｙ照射Ｋ５６２－ｍｂ１５－４１ＢＢＬ細胞と１．５：１の比で、１０％ＦＢＳ、抗生物質及び１０ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン２（ＩＬ－２、Ｒｏｃｈｅ、マンハイム、ドイツ）を含有するＳＣＧＭ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、フライブルグ、ドイツ）中、６ウェル組織培養プレートで培養した。組織培地を部分的に２日毎に交換した。共培養７日後に、残存Ｔ細胞をＤｙｎａｂｅａｄｓ ＣＤ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で除去すると、＞９５％ＣＤ５６＋ＣＤ３－ＮＫ細胞を含む細胞集団が得られた。
【0051】
プラスミド、ウイルス作製及び遺伝子導入
ｐＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、ｐＥＱ－ＰＡＭ３（－Ｅ）及びｐＲＤＦをＳｔ．Ｊｕｄｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅから入手した。長いシグナルペプチド付きインターロイキン１５（ＩＬ－１５）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりテンプレートとして使用したヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリ（Ｄｒ Ｇ．Ｎｅａｌｅ、Ｓｔ Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌから入手）からサブクローニングした。ＣＤ８αのシグナルペプチドをコードするｃＤＮＡ、ＩＬ－１５の成熟ペプチド及びＣＤ８αの膜貫通ドメインを、ＳＯＥ－ＰＣＲ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｂｙ ＰＣＲ）法によりアセンブルすることで膜貫通型のＩＬ－１５をコードした（「ｍｂＩＬ１５」）。野生型のＩＬ－１５（ＣＤ８α膜貫通ドメインに連結させていない。「ｗｔＩＬ１５」）も試験し、用意した。得られた発現カセットをマウス幹細胞ウイルス配列内リボソーム進入部位緑色蛍光タンパク質（ＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）のＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位にサブクローニングした。
ｐＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ、ｐＥＱ－ＰＡＭ３（－Ｅ）及びｐＲＤＦをＳｔ．Ｊｕｄｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅから入手した。長いシグナルペプチド付きインターロイキン１５（ＩＬ－１５）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりテンプレートとして使用したヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリ（Ｄｒ Ｇ．Ｎｅａｌｅ、Ｓｔ Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌから入手）からサブクローニングした。ＣＤ８αのシグナルペプチドをコードするｃＤＮＡ、ＩＬ－１５の成熟ペプチド及びＣＤ８αの膜貫通ドメインを、ＳＯＥ－ＰＣＲ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｂｙ ＰＣＲ）法によりアセンブルすることで膜貫通型のＩＬ－１５をコードした（「ｍｂＩＬ１５」）。野生型のＩＬ－１５（ＣＤ８α膜貫通ドメインに連結させていない。「ｗｔＩＬ１５」）も試験し、用意した。得られた発現カセットをマウス幹細胞ウイルス配列内リボソーム進入部位緑色蛍光タンパク質（ＭＳＣＶ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰ）のＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位にサブクローニングした。
【0052】
ＲＤ１４４シュードタイプ化レトロウイルスを作製するために、３．０ｘ１０6個の２９３Ｔ細胞のトランスフェクションをＸ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ９ ＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ、マンハイム、ドイツ）を使用して行い、１０ｃｍ組織培養皿で１８時間にわたってｍｂＩＬ１５コンストラクトをコードする３．５μｇのｃＤＮＡ、３．５μｇのｐＥＱ－ＰＡＭ３（－Ｅ）及び３μｇのｐＲＤＦと共に維持した。培地を１０％ＦＢＳ及び抗生物質を補充したＲＰＭＩ－１６４０と２４時間後に交換した後、レトロウイルスを含む馴化培地を３６～９６時間後に回収し、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ、オオツ、日本）をコーティングしたポリプロピレン管に加え、１４００ｇで１０分間にわたって遠心分離にかけ、３７℃、５％ＣＯ2で４時間にわたってインキュベートした。さらに遠心分離し、上清を除去した後、増殖したＮＫ細胞（０．５～１ｘ１０6）を管に加え、３７℃で１２時間にわたって静置した。これらのステップを最高６回、２～３日かけて繰り返した。次に、細胞を、ＦＢＳ、抗生物質及び１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を加えたＲＰＭＩ－１６４０で維持した。形質導入から３～２９日後、形質導入細胞をアッセイした。
【0053】
ｍｂＩＬ－１５の表面発現をフローサイトメトリにより抗ヒトＩＬ－１５抗体（Ｒ＆Ｄ、ミネアポリス、ミネソタ州）及びフィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ１（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、バーミンガム、アラバマ州）を使用して分析した。抗体染色を、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で検出した。培養上清におけるＩＬ－１５のレベルをＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｒ＆Ｄ）で測定した。
【0054】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＮＫ細胞の機能分析
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＮＫ細胞の生存及び成長を推定するために、形質導入ＮＫ細胞（１ｘ１０6細胞／ｍＬ）を１０％ＦＢＳ及び抗生物質を補充したＲＰＭＩ－１６４０に再懸濁させ、２４又は９６ウェルプレートのウェル（Ｃｏｓｔａｒ、コーニング、ニューヨーク州）に入れ、ＩＬ－２（１０～１００ＩＵ／ｍｌ）不在下又は存在下で培養した。ヨウ化プロピジウムでの染色後、多数の生存ＧＦＰ＋細胞がＡｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で確認された。幾つかの実験においては、培養前に細胞を１０分間にわたって中和抗ＩＬ－１５抗体（Ｒ＆Ｄ）又はアイソタイプにマッチした非反応性の抗体と共にインキュベートした。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＮＫ細胞の生存及び成長を推定するために、形質導入ＮＫ細胞（１ｘ１０6細胞／ｍＬ）を１０％ＦＢＳ及び抗生物質を補充したＲＰＭＩ－１６４０に再懸濁させ、２４又は９６ウェルプレートのウェル（Ｃｏｓｔａｒ、コーニング、ニューヨーク州）に入れ、ＩＬ－２（１０～１００ＩＵ／ｍｌ）不在下又は存在下で培養した。ヨウ化プロピジウムでの染色後、多数の生存ＧＦＰ＋細胞がＡｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で確認された。幾つかの実験においては、培養前に細胞を１０分間にわたって中和抗ＩＬ－１５抗体（Ｒ＆Ｄ）又はアイソタイプにマッチした非反応性の抗体と共にインキュベートした。
【0055】
ＮＫ細胞免疫表現型検査を表に挙げた抗体を使用して行い、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメータで可視化し、Ｄｉｖａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）及びＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ、アッシュランド、オレゴン州）ソフトウェアで分析した。リン酸化タンパク質分析の場合、ｍｏｃｋ及びｍｂＩＬ１５形質導入ＮＫ細胞（１ｘ１０7）をＩＬ－２不在下で４８時間にわたって培養した。細胞ライセートを、２０ｍＭの３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸、２ｍＭのＥＧＴＡ、５ｍＭのＥＤＴＡ、３０ｍＭのフッ化ナトリウム、６０ｍＭのβ－グリセロホスフェート、２０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、マンハイム、ドイツ）及び１ｍＭのジチオスレイトールを含有する溶解バッファを使用して用意した。超音波処理後、ライセートを－８０℃で凍結させ、Ｋｉｎｅｘ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ解析のためにドライアイスに入れてＫｉｎｅｘｕｓ（バンクーバー、カナダ）に輸送した。
【0056】
細胞障害性アッセイについては、ルシフェラーゼ標識標的細胞及びＮＫ細胞（ＩＬ－２不在下で４８時間にわたって培養）を９６ウェル平底黒色Ｖｉｅｗｐｌａｔｅｓ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に様々なエフェクタ：標的（Ｅ：Ｔ）比でプレーティングし、４又は２４時間にわたって培養した。付着細胞株を３７℃、５％ＣＯ2で４時間にわたってインキュベートしてからＮＫ細胞を加え、細胞を付着させた。抗体依存性細胞障害性アッセイについては、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ、Ｒｏｃｈｅ、マンハイム、ドイツ）、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｒｏｃｈｅ）又は精製ヒトＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）を、ＮＫ細胞に先立って加えた（全て１μｇ／ｍＬ）。培養終了時、次に等量のＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン州）を各試験ウェルに加え、５分後、発光をプレートリーダを使用して測定し、Ｇｅｎ５ ２．００ソフトウェア（共にＢｉｏＴｅｋ、ツーソン、アリゾナ州）で分析した。各プレートにおいて、標的細胞の生存率を、標的細胞のみが入ったウェルからの発光シグナルを用いて計算した。すべての実験を三重で行った。
【0057】
細胞障害顆粒の放出を測定するために、ＮＫ細胞（ＩＬ－２不在下で４８時間にわたって培養）をＫ５６２、Ｕ９３７細胞又は７２１．２２１細胞及びそのＣｗ６発現変異体と４時間にわたって共培養した。ＰＥ－又はＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を培養開始時に添加し、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（０．１５μＬ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１時間後に添加した。ＣＤ１０７ａ＋ＮＫ細胞の割合をフローサイトメトリにより求めた。
【0058】
免疫不全マウスにおけるＮＫ細胞の増殖及び細胞障害性
ＮＫ細胞の増殖をｉｎ ｖｉｖｏで試験するために、ｍｂＩＬ１５を形質導入したヒトＮＫ細胞又はｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞（６～９ｘ１０6細胞／マウス）をＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃscidＩＬ２ｒｇtm1Wjl／ＳｚＪ（ＮＯＤ／ｓｃｉｄ ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーハーバー、メイン州）の尾静脈に注射した。一部のマウスには、２００００ＩＵのＩＬ－２を１週間に３回腹腔（ｉ．ｐ．）内注射した。７日目及び１１日目に、セルカウンタ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で血液細胞を数えた。細胞を赤血球溶解液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理し、アロフィコシアニンコンジュゲートマウス抗ヒトＣＤ４５及びフィコエリトリンコンジュゲートラット抗マウスＣＤ４５抗体（共にＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色後、ヒト及びマウスＣＤ４５＋細胞をフローサイトメトリにより数えた。安楽死後、骨髄、肝臓、脾臓、腎臓、肺及び脳におけるヒトＮＫ細胞を上記のように数えた。全ての動物実験を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに認められたプロトコルに準拠して行った。
ＮＫ細胞の増殖をｉｎ ｖｉｖｏで試験するために、ｍｂＩＬ１５を形質導入したヒトＮＫ細胞又はｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞（６～９ｘ１０6細胞／マウス）をＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃscidＩＬ２ｒｇtm1Wjl／ＳｚＪ（ＮＯＤ／ｓｃｉｄ ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーハーバー、メイン州）の尾静脈に注射した。一部のマウスには、２００００ＩＵのＩＬ－２を１週間に３回腹腔（ｉ．ｐ．）内注射した。７日目及び１１日目に、セルカウンタ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で血液細胞を数えた。細胞を赤血球溶解液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理し、アロフィコシアニンコンジュゲートマウス抗ヒトＣＤ４５及びフィコエリトリンコンジュゲートラット抗マウスＣＤ４５抗体（共にＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色後、ヒト及びマウスＣＤ４５＋細胞をフローサイトメトリにより数えた。安楽死後、骨髄、肝臓、脾臓、腎臓、肺及び脳におけるヒトＮＫ細胞を上記のように数えた。全ての動物実験を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに認められたプロトコルに準拠して行った。
【0059】
マウスにおける腫瘍細胞の死滅を試験するために、２つの異種移植モデルを用意した。１つ目のモデルにおいては、ルシフェラーゼを発現するＵ９３７細胞をＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃscidＩＬ２ｒｇtm1Wjl／ＳｚＪ（ＮＯＤ／ｓｃｉｄ ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌ）マウス（１ｘ１０4細胞／マウス）に腹腔内注射した。３日後、ＧＦＰのみ又はｍｂＩＬ１５を含むＭＳＣＶベクターで形質導入したＮＫ細胞を腹腔内注射した（１ｘ１０7細胞／マウス）。ＮＫ細胞注射を７日目に繰り返した。コントロールとして、あるマウス群はＮＫ細胞の代わりに組織培地を注射された。第２のモデルにおいては、マウスにＥＳ８細胞を移植し（腹腔内。１ｘ１０5細胞／マウス）、続いて上記のように１本のＮＫ細胞注射を３日目に行った。腫瘍移植及び進行をＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ－２００システム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ホプキントン、マサチューセッツ州）を用いて評価し、イメージングはＤ－ルシフェリンカリウム塩の水溶液（３ｍｇ／マウス）の腹腔内注射から５分後に開始した。ルシフェラーゼ発現細胞から放出された光子をＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ４．３．１ソフトウェアプログラムを用いて定量化した。
【0060】
結果
ＩＬ－１５コンストラクトの設計及びＮＫ細胞における発現
ここで説明したように、２つの形態のＩＬ１５遺伝子がヒトＮＫ細胞で発現した。ヒトＩＬ１５遺伝子をＣＤ８αの膜貫通ドメインをコードする遺伝子に連結したコンストラクトから得られる膜貫通形態（「ｍｂＩＬ１５」）、そして野生型無修飾形態（「ｗｔＩＬ１５」）である。両方のコンストラクトを、ＧＦＰを含むＭＣＳＶレトロウイルスベクターに挿入し（図１Ａ）、ベクターを使用して、末梢血単核細胞を刺激細胞株Ｋ５６２－ｍｂ１５－４１ＢＢＬ．２８との培養後に得られた増殖ＮＫ細胞の形質導入に使用した。培養終了時、レトロウイルスによる形質導入前に、残存Ｔ細胞を抗ＣＤ３免疫磁気ビーズにより枯渇させると、＞９５％の純粋なＣＤ５６＋ＣＤ３－細胞が得られた。ＧＦＰ発現中央値はｍｂＩＬ１５を含むコンストラクトで７１％（２３～９７％、ｎ＝６０）であり、ｗｔＩＬ１５を含むコンストラクトで６９％（レンジ、２０～９１％、ｎ＝２５）であった。ＧＦＰだけを含むベクターでも形質導入した同一ドナーからのＮＫ細胞はＧＦＰ発現中央値８４％（５３～９８％、ｎ＝６０）を有した（図１Ｂ）。
ＩＬ－１５コンストラクトの設計及びＮＫ細胞における発現
ここで説明したように、２つの形態のＩＬ１５遺伝子がヒトＮＫ細胞で発現した。ヒトＩＬ１５遺伝子をＣＤ８αの膜貫通ドメインをコードする遺伝子に連結したコンストラクトから得られる膜貫通形態（「ｍｂＩＬ１５」）、そして野生型無修飾形態（「ｗｔＩＬ１５」）である。両方のコンストラクトを、ＧＦＰを含むＭＣＳＶレトロウイルスベクターに挿入し（図１Ａ）、ベクターを使用して、末梢血単核細胞を刺激細胞株Ｋ５６２－ｍｂ１５－４１ＢＢＬ．２８との培養後に得られた増殖ＮＫ細胞の形質導入に使用した。培養終了時、レトロウイルスによる形質導入前に、残存Ｔ細胞を抗ＣＤ３免疫磁気ビーズにより枯渇させると、＞９５％の純粋なＣＤ５６＋ＣＤ３－細胞が得られた。ＧＦＰ発現中央値はｍｂＩＬ１５を含むコンストラクトで７１％（２３～９７％、ｎ＝６０）であり、ｗｔＩＬ１５を含むコンストラクトで６９％（レンジ、２０～９１％、ｎ＝２５）であった。ＧＦＰだけを含むベクターでも形質導入した同一ドナーからのＮＫ細胞はＧＦＰ発現中央値８４％（５３～９８％、ｎ＝６０）を有した（図１Ｂ）。
【0061】
ｍｂＩＬ１５の形質導入後、ＩＬ－１５はＮＫ細胞膜上で発現した。４０～６３％（中央値、５２；ｎ＝７）のＧＦＰ＋ＮＫ細胞が、抗ＩＬ１５抗体で検出したところ、ＩＬ－１５を有した（図１Ｂ）。対照的に、ｗｔＩＬ１５を形質導入した細胞（ｎ＝４）又はｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞（ｎ＝７）においてＩＬ－１５は検出不可能であった。形質導入ＮＫ細胞による可溶性ＩＬ－１５の産生は、培養から２４時間後及び４８時間後に回収した上清を試験することとで確認した。図１Ｃに示すように、ｗｔＩＬ１５を発現する細胞はかなりの量のＩＬ－１５を分泌したが、ｍｂＩＬ１５－ＮＫ細胞においては最小限であり、ｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞では検出不可能であった。
【0062】
ＩＬ－１５を発現するＮＫ細胞は自律的な生存及び増殖能を有する
ＩＬ－１５の発現がＮＫ細胞の生存の維持において外来のＩＬ－２の代わりになるか否かを確認するために、１５人のドナーから得たＮＫ細胞にｍｂＩＬ１５コンストラクトを形質導入し、ＩＬ－２の不在下で培養した。次に、培養後の細胞数をｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞での並行培養におけるものと比較した。図２Ａに示すように、ｍｂＩＬ－１５の発現はＮＫ細胞の生存率を劇的に上昇させた。培養から７日後、細胞回収率中央値は８５％であったが、生存ｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞は事実上検出不可能であった（＜１％、Ｐ＜０．０００１、対応ｔ検定）。抗ＩＬ－１５中和抗体を培養物に加えると、ｍｂＩＬ１５の効果は有意に低下した（図６Ａ～６Ｂ）。１５人のドナーのうち９人では、ｍｂＩＬ１５ ＮＫ細胞の回収率をｗｔＩＬ１５を発現するＮＫ細胞のものとも比較した。回収率は前者で有意に高かった（中央値、８５％対５６％、Ｐ＝０．０２６、図２Ａ）。
ＩＬ－１５の発現がＮＫ細胞の生存の維持において外来のＩＬ－２の代わりになるか否かを確認するために、１５人のドナーから得たＮＫ細胞にｍｂＩＬ１５コンストラクトを形質導入し、ＩＬ－２の不在下で培養した。次に、培養後の細胞数をｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞での並行培養におけるものと比較した。図２Ａに示すように、ｍｂＩＬ－１５の発現はＮＫ細胞の生存率を劇的に上昇させた。培養から７日後、細胞回収率中央値は８５％であったが、生存ｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞は事実上検出不可能であった（＜１％、Ｐ＜０．０００１、対応ｔ検定）。抗ＩＬ－１５中和抗体を培養物に加えると、ｍｂＩＬ１５の効果は有意に低下した（図６Ａ～６Ｂ）。１５人のドナーのうち９人では、ｍｂＩＬ１５ ＮＫ細胞の回収率をｗｔＩＬ１５を発現するＮＫ細胞のものとも比較した。回収率は前者で有意に高かった（中央値、８５％対５６％、Ｐ＝０．０２６、図２Ａ）。
【0063】
並行実験において、外来性のＩＬ－２の存在下でのＩＬ１５発現の支持的作用を確認した。培養物が１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む場合、ｍｂＩＬ１５又はｗｔＩＬ１５を発現するＮＫ細胞の７日目回収率はｍｏｃｋ形質導入細胞の回収率より有意に高いままであった。これらの条件下、２つの形態のＩＬ１５の間で有意な差は見られなかった（図６Ａ～６Ｂ）。外来性のＩＬ－２が高濃度（１００ＩＵ／ｍＬ）で存在した場合のみ、ｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞の７日目回収率が、ＩＬ１５を形質導入したＮＫ細胞のものに匹敵した（図６Ａ）。
【0064】
９人のドナーのうち６人からの増殖ＮＫ細胞を用いた実験において、低用量のＩＬ－２（１０ＩＵ／ｍＬ）でｍｂＩＬ１５がＮＫ細胞の生存を７日を超えて支援する能力について確認した。１４日目、ｍｂＩＬ１５ ＮＫ細胞数はそのままであるか、あるいは６個の培養物のうち４個においては増加した。これらの細胞のうち２つは２１日目までにさらに増殖した。同一ドナーからのｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞の６個の培養物のうち２つだけが１４日目及び２１日目に細胞数を維持しており、細胞成長は観察されなかった。２１日目の細胞回収率中央値はｍｂＩＬ１５ ＮＫ細胞で２０５％、ｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞で８０％であった。したがって、低用量のＩＬ－２の存在下であっても、ｍｂＩＬ１５の発現は、生存及び成長に関して大きな利点をもたらした。
【0065】
１人のドナーからのＮＫ細胞の培養物において、特に高い細胞回収率は、ＩＬ１５が発現した場合の７日目に観察された（ＩＬ－２の不在下、ｍｂＩＬ１５で２６１％、ｗｔＩＬ１５で１６１％。１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２で２６６％及び１８８％）。これらの培養物を２ヶ月にわたってモニタしたところ、ｍｂＩＬ１５の発現によりもたらされた細胞増殖及び生存における目覚しい改善が観察された（図２Ｃ）。ＩＬ－２の不在下であっても、ｍｂＩＬ－１５ ＮＫ細胞は２１日目まで生存し続け、培養開始から７５日後も依然として検出可能であったが、ｍｏｃｋ形質導入細胞は７日目には検出不可能となり、ｗｔＩＬ１５形質導入ＮＫ細胞は４２日目に検出不可能になった。低濃度（１０ＩＵ／ｍＬ）のＩＬ－２の存在下、ｍｂＩＬ１５発現ＮＫ細胞の数は培養開始から２ヶ月後、最初に播種したものと同じであったが、生存ｍｏｃｋ形質導入及びｗｔＩＬ１５形質導入ＮＫ細胞はもっと早くに減少した。補足の図６Ｂに示すように、ＩＬ－２を高用量（１００ＩＵ／ｍＬ）で培養物に加えると、ｍｂＩＬ１５又はｗｔＩＬ１５を形質導入したＮＫ細胞は同様の持続性プロファイルを有し、両方の細胞型が、これらの条件下であっても、ｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞より長く生存した。
【0066】
ｍｂＩＬ１５ ＮＫ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの増殖及びホーミング
ｉｎ ｖｉｔｒｏで行った実験は、ＩＬ１５の発現によりＮＫ細胞の生存及び増殖が改善されること、またｍｂＩＬ１５が全体的により良好な刺激を生み出すことを示した。ｍｂＩＬ１５の発現がＮＯＤ／ｓｃｉｄ ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウスにおいてヒトＮＫ細胞の増殖を持続させるか否かを次に確認した。４人のドナーからの活性化ＮＫ細胞にｍｂＩＬ１５（５２～７４％ＧＦＰポジティブ）を形質導入し、４匹のマウス（ドナー１人あたり１匹のマウス）に注射した。４匹のコントロールマウスに、同一ドナーからのｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞を注射した。ｍｂＩＬ１５を発現するＮＫ細胞はｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞よりはるかに多く増殖した。注射から７日後、血液のｍｂＩＬ１５ＮＫ細胞数／μｌ中央値は４４．５（レンジ、４２～６０）であるのに対して、ｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞は６．５（０～１２）であった（Ｐ＝０．００４）（図３Ａ）。並行実験を同じ細胞で行い、今回は２０，０００ＩＵヒトＩＬ－２も２日毎に腹腔内投与した（図３Ａ）。これらの条件下、ｍｂＩＬ１５ ＮＫ細胞はより一層増殖し（ＮＫ細胞／μｌ中央値、１０１；レンジ、６０～１６７）、ｍｏｃｋ形質導入細胞は低いままであった（中央値、１８；レンジ、６～２０；Ｐ＝０．０２１）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで行った実験は、ＩＬ１５の発現によりＮＫ細胞の生存及び増殖が改善されること、またｍｂＩＬ１５が全体的により良好な刺激を生み出すことを示した。ｍｂＩＬ１５の発現がＮＯＤ／ｓｃｉｄ ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウスにおいてヒトＮＫ細胞の増殖を持続させるか否かを次に確認した。４人のドナーからの活性化ＮＫ細胞にｍｂＩＬ１５（５２～７４％ＧＦＰポジティブ）を形質導入し、４匹のマウス（ドナー１人あたり１匹のマウス）に注射した。４匹のコントロールマウスに、同一ドナーからのｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞を注射した。ｍｂＩＬ１５を発現するＮＫ細胞はｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞よりはるかに多く増殖した。注射から７日後、血液のｍｂＩＬ１５ＮＫ細胞数／μｌ中央値は４４．５（レンジ、４２～６０）であるのに対して、ｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞は６．５（０～１２）であった（Ｐ＝０．００４）（図３Ａ）。並行実験を同じ細胞で行い、今回は２０，０００ＩＵヒトＩＬ－２も２日毎に腹腔内投与した（図３Ａ）。これらの条件下、ｍｂＩＬ１５ ＮＫ細胞はより一層増殖し（ＮＫ細胞／μｌ中央値、１０１；レンジ、６０～１６７）、ｍｏｃｋ形質導入細胞は低いままであった（中央値、１８；レンジ、６～２０；Ｐ＝０．０２１）。
【0067】
注射から１１日目、ｍｂＩＬ１５ ＮＫ細胞はＩＬ－２の不在下で１６８．５細胞／μｌ（レンジ、９４～３５５）の末梢血単核細胞を含み、ＩＬ－２も投与すると、３８２細胞／μｌ（１５１～７１０）を含んだ（図３Ａ、Ｂ）。対照的に、ｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞を注射したマウスにおいて、ヒトＣＤ４５細胞は、ＩＬ－２不在下では事実上検出不可能であり、ＩＬ－２も注射した場合は低レベルで存在した（中央値、２７；レンジ９～２０７；Ｐ＝０．０２６）。ヒトＣＤ４５＋細胞もＣＤ５６を発現し、ＣＤ３を欠く（図示せず）。注目すべきは、ＧＦＰ＋の割合が注射前の６６．５％±９．９％から７日目の９３．８％±４．４％、１１日目の９４．８％±３．４％に上昇したことである（両方の比較に関してＰ＜０．０１）。
【0068】
１１日目の安楽死後、４匹のマウスのうち３匹を、各種組織におけるヒトＣＤ４５＋細胞の存在について調べた。ｍｂＩＬ１５が発現したならば、かなりの数のヒトＮＫ細胞が骨髄、肝臓、脾臓、腎臓及び肺で検出された。全ての組織において、数はｍｏｃｋ形質導入細胞で見られたものより際立って多かった（図３Ｃ）。ｍｂＩＬ１５を発現するＣＤ４５＋細胞の割合の平均（±ＳＤ）はＩＬ－２不在下で１．２％±１．５％、ＩＬ－２存在下で３．０％±４．３％であり、それに対してｍｏｃｋ形質導入細胞では０．０４％±０．０９％及び０．４％±０．６％であった（それぞれＰ＜０．００１及びＰ＝０．００２）。唯一の例外は脳であり、ｍｂＩＬ１５ ＮＫ細胞もｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞も検出されなかった。
【0069】
ｍｂＩＬ１５刺激のメカニズム
ｍｂＩＬ１５が主にトランス（１つのＮＫ細胞上に提示されたＩＬ－１５が隣接細胞を刺激（生理学的に起きると報告されているメカニズム））で刺激するかシス（同じ細胞で発現した受容体へのｍｂＩＬ１５の直接結合による）で刺激するかを確認するために、培養物におけるＧＦＰ＋及びＧＦＰ－ＮＫ細胞の割合を培養から７日後に評価した。トランスメカニズムが優勢であるならば、ＧＦＰ＋及びＧＦＰ－ＮＫ細胞間の比は培養中、変化しないはずであった。シスが優勢であるならば、ＧＦＰ＋細胞の割合が増加するはずであった。図４Ａはそのような分析の結果を示す。ＩＬ－２不在下での培養７日後に調べたＮＫ細胞中のＧＦＰ＋細胞の割合は、ｍｂＩＬ１５が発現したならば一貫して上昇し、ｍｏｃｋ形質導入細胞の培養物では上昇しなかった。ＧＦＰ＋細胞は、０日目の８０．５％±１７．１％に対する７１．２％±１９．０％と比較すると、７日目に５７．５％±１８．６％に対して細胞集団全体の９５．９％±３．３％を構成した（Ｐ＜０．０００１）。したがって、ＮＫ細胞で発現したｍｂＩＬ－１５による優勢な刺激メカニズムはオートクリンである。
ｍｂＩＬ１５が主にトランス（１つのＮＫ細胞上に提示されたＩＬ－１５が隣接細胞を刺激（生理学的に起きると報告されているメカニズム））で刺激するかシス（同じ細胞で発現した受容体へのｍｂＩＬ１５の直接結合による）で刺激するかを確認するために、培養物におけるＧＦＰ＋及びＧＦＰ－ＮＫ細胞の割合を培養から７日後に評価した。トランスメカニズムが優勢であるならば、ＧＦＰ＋及びＧＦＰ－ＮＫ細胞間の比は培養中、変化しないはずであった。シスが優勢であるならば、ＧＦＰ＋細胞の割合が増加するはずであった。図４Ａはそのような分析の結果を示す。ＩＬ－２不在下での培養７日後に調べたＮＫ細胞中のＧＦＰ＋細胞の割合は、ｍｂＩＬ１５が発現したならば一貫して上昇し、ｍｏｃｋ形質導入細胞の培養物では上昇しなかった。ＧＦＰ＋細胞は、０日目の８０．５％±１７．１％に対する７１．２％±１９．０％と比較すると、７日目に５７．５％±１８．６％に対して細胞集団全体の９５．９％±３．３％を構成した（Ｐ＜０．０００１）。したがって、ＮＫ細胞で発現したｍｂＩＬ－１５による優勢な刺激メカニズムはオートクリンである。
【0070】
ｍｂＩＬ１５を発現する細胞は本質的に、活性化されたＮＫ細胞の免疫表現型を保持した。しかしながら、ＩＬ－２離脱から２日後にｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞と比較して調べたところ、ｍｂＩＬ１５ ＮＫ細胞は、やや高いレベルの活性化受容体ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４（ＣＤ３３６）及びＮＫｐ３０（ＣＤ３３７）、またＣＤ１６及びＣＤ５６を発現したが、ＮＫｐ４６（ＣＤ３３５）の発現は低下し、他の分子、例えばＤＮＡＭ－１（ＣＤ２２６）の発現は変化しないままであった（図４Ｂ、表）。ｍｂＩＬ１５の発現により活性化されたシグナル伝達経路も確認した。図４Ｃに示すように、ｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞と比較して、ｍｂＩＬ－１５ ＮＫ細胞は幾つかの高度にリン酸化された分子を有した。これらにはＩＬ－１５シグナル伝達に応答してリン酸化されると知られる分子、例えば転写因子ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ５、キナーゼのｓｒｃ、Ｅｒｋ１／２及びＭｅｋ１が含まれた。とりわけ、Ｂａｄの際立ったリン酸化、またカスパーゼ７及び９のリン酸化（抗アポトーシス効果を集合的に示す）が観察された。ＩＬ－１５シグナル伝達におけるその役割が不明なｍｂＩＬ１５ ＮＫ細胞における他の高度にリン酸化された分子にはＣＤＫ６及びＲａｆＡが含まれた。
【0071】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおけるｍｂＩＬ－１５がＮＫ細胞抗腫瘍細胞障害性に及ぼす作用
ｍｂＩＬ１５の発現によりもたらされるＮＫ細胞の生存及び増殖における改善は、ＮＫ介在性の腫瘍の死滅も増加するであろうことを示した。この考えをまず、ｍｂＩＬ１５－ＮＫ細胞が発揮する腫瘍細胞障害性を同一ドナーからのｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞のものと比較することで試験した。白血病細胞株Ｎａｌｍ－６（Ｂ系列急性リンパ芽球性白血病）、Ｕ９３７及びＫ５６２（急性骨髄性白血病）、またＤａｕｄｉ（Ｂ細胞リンパ腫）、ＳＫＢＲ３（乳がん）及びＥＳ８（ユーイング肉腫）を標的とした異なるＥ：Ｔ比及び共培養時間の実験を、９人のドナーからのＮＫ細胞を用いて全部で９０通り行った。図５Ａは２４時間アッセイの結果を示す。ｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞の場合、１：４のＥ：Ｔで細胞障害性中央値は２２％であり、１：１のＥ：Ｔでは５４％であった。ｍｂＩＬ１５ ＮＫ細胞の場合は、それぞれ７１％及び９９％であった（Ｐ＜０．０００１）。個々の細胞株での結果を図７Ａ～７Ｂに示す。上昇した細胞障害性は培養におけるＮＬ細胞の生存率の上昇に関係しているようではあったが、Ｋ５６２又はＵ９３７細胞との培養後のＣＤ１０７ａ染色で明らかになったように、ｍｂＩＬ１５－ＮＫ細胞による細胞障害顆粒の放出の増加も観察された（Ｐ＝０．００６７、図５Ｂ）。
ｍｂＩＬ１５の発現によりもたらされるＮＫ細胞の生存及び増殖における改善は、ＮＫ介在性の腫瘍の死滅も増加するであろうことを示した。この考えをまず、ｍｂＩＬ１５－ＮＫ細胞が発揮する腫瘍細胞障害性を同一ドナーからのｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞のものと比較することで試験した。白血病細胞株Ｎａｌｍ－６（Ｂ系列急性リンパ芽球性白血病）、Ｕ９３７及びＫ５６２（急性骨髄性白血病）、またＤａｕｄｉ（Ｂ細胞リンパ腫）、ＳＫＢＲ３（乳がん）及びＥＳ８（ユーイング肉腫）を標的とした異なるＥ：Ｔ比及び共培養時間の実験を、９人のドナーからのＮＫ細胞を用いて全部で９０通り行った。図５Ａは２４時間アッセイの結果を示す。ｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞の場合、１：４のＥ：Ｔで細胞障害性中央値は２２％であり、１：１のＥ：Ｔでは５４％であった。ｍｂＩＬ１５ ＮＫ細胞の場合は、それぞれ７１％及び９９％であった（Ｐ＜０．０００１）。個々の細胞株での結果を図７Ａ～７Ｂに示す。上昇した細胞障害性は培養におけるＮＬ細胞の生存率の上昇に関係しているようではあったが、Ｋ５６２又はＵ９３７細胞との培養後のＣＤ１０７ａ染色で明らかになったように、ｍｂＩＬ１５－ＮＫ細胞による細胞障害顆粒の放出の増加も観察された（Ｐ＝０．００６７、図５Ｂ）。
【0072】
ｍｂＩＬ１５の発現と関連したｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞障害性における向上は、ヒト腫瘍細胞を移植したＮＯＤ／ｓｃｉｄ ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウスでの実験に反映された。一連の実験においては、マウスにヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞株Ｕ９３７を注射し、次にｍｂＩＬ１５－又はｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞で処置した。図５Ｃ及び５Ｄに示すように、ｍｂＩＬ１５形質導入ＮＫ細胞を与えられたマウスは無処置のマウス及びｍｏｃ形質導入ＮＫ細胞で処置したマウスより腫瘍成長が緩慢で、有意に長く生存した（Ｐ＝０．０１４、トレンドに関するログランク検定）。細胞を第２の異種移植モデルでも試験し、このモデルにおいてはＮＯＤ／ｓｃｉｄ ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウスに、成長速度がはるかに緩慢なユーイング肉腫細胞株ＥＳ８を注射し、マウスに１本のＮＫ細胞注射を処置した。補足の８Ａ～８Ｃに示すように、ｍｂＩＬ１５ ＮＫ細胞で処置したマウス（ｎ＝１２）の成績は、ｍｏｃｋ形質導入ＮＫ細胞（ｎ＝１１）及び無処置のマウス（ｎ＝７）のものより良好であった。生存日数中央値はそれぞれ１６２、４９及び２１日であった（Ｐ＝０．００５）。
【0073】
論考
がんのＮＫ細胞をベースにした療法の成功を決める要素の中でも、おそらく最も基本的なものは、ＮＫ細胞が、腫瘍細胞切除を引き起こしやすいＥ：Ｔ比を達成するのに十分な数で持続することである。３２ ここで実証されたことは、ヒトＮＫ細胞における膜結合型のＩＬ－１５の発現がその自律的増殖を支援し且つＩＬ－２の不在下で生存期間を延ばすことであった。ｍｂＩＬ１５を発現するＮＫ細胞は、外来性のＩＬ－２不在下で最高２ヶ月にわたってｉｎ ｖｉｔｒｏで維持できた。ｍｂＩＬ１５を発現するＮＫ細胞は免疫不全マウスで増殖し、また様々な組織に浸潤でき、組織においてはｍｏｃｋ形質導入細胞よりはるかに多量に見られた。ｍｂＩＬ－１５ ＮＫ細胞の増殖は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方において、低濃度のＩＬ－２によりさらに増大した。ｍｂＩＬ１５の発現はＮＫ細胞の細胞障害能を損なわなかった。実際、異種移植モデルにおいて、ｍｂＩＬ１５ ＮＫ細胞は、ｍｏｃｋ形質導入細胞のものより強力な抗がん活性を発揮し、これはこのアプローチが、ＩＬ－２投与の副作用を回避しつつＮＫ細胞注入の抗腫瘍能を改善し得ることを示している。
がんのＮＫ細胞をベースにした療法の成功を決める要素の中でも、おそらく最も基本的なものは、ＮＫ細胞が、腫瘍細胞切除を引き起こしやすいＥ：Ｔ比を達成するのに十分な数で持続することである。３２ ここで実証されたことは、ヒトＮＫ細胞における膜結合型のＩＬ－１５の発現がその自律的増殖を支援し且つＩＬ－２の不在下で生存期間を延ばすことであった。ｍｂＩＬ１５を発現するＮＫ細胞は、外来性のＩＬ－２不在下で最高２ヶ月にわたってｉｎ ｖｉｔｒｏで維持できた。ｍｂＩＬ１５を発現するＮＫ細胞は免疫不全マウスで増殖し、また様々な組織に浸潤でき、組織においてはｍｏｃｋ形質導入細胞よりはるかに多量に見られた。ｍｂＩＬ－１５ ＮＫ細胞の増殖は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方において、低濃度のＩＬ－２によりさらに増大した。ｍｂＩＬ１５の発現はＮＫ細胞の細胞障害能を損なわなかった。実際、異種移植モデルにおいて、ｍｂＩＬ１５ ＮＫ細胞は、ｍｏｃｋ形質導入細胞のものより強力な抗がん活性を発揮し、これはこのアプローチが、ＩＬ－２投与の副作用を回避しつつＮＫ細胞注入の抗腫瘍能を改善し得ることを示している。
【0074】
本発明における発見は、ヒトＮＫ細胞におけるＩＬ－１５の異所性発現が、ＩＬ－１５が膜結合型で提示された場合に、分泌型より強力な生存促進作用を引き起こすことを示す。しかしながら、とりわけ、ＮＫ細胞で発現したｍｂＩＬ１５は、ＩＬ－１５が他の細胞で提示された場合、トランスではなく優先的にシスで刺激を行う。すなわち、ｍｂＩＬ１５は同じ細胞上のＩＬ－１５受容体に優先的に結合し、オートクリン刺激を引き起こすと考えられる。ｍｂＩＬ１５形質導入ＮＫ細胞を抗ＩＬ－１５抗体で標識した場合に一貫して観察された、ＧＦＰを強力に発現しているがＩＬ－１５をはっきりと欠いている細胞の割合がかなり高いことを示すＩＬ－１５発現パターンはこのメカニズムで説明される（図１Ｂ）。これらの細胞においてＩＬ－１５は発現するもののその受容体に結合してしまう及び／又は内部移行してしまうため抗体にはアクセスできないという仮説がたてられる。特には２４時間ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて、これらの細胞が発揮するより高い細胞障害性は、ｍｂＩＬ１５がＮＫ細胞の生存能を増進できることで説明されると思われる。しかしながら、ｍｂＩＬ１５－ＮＫ細胞の優位は短期（４時間）アッセイでも明らかであり、これらの細胞はＣＤ１０７ａ試験でより多くの細胞障害顆粒も放出した。したがって、ｍｂＩＬ１５の発現はＮＫ細胞の細胞障害性を、他の方法、おそらくはその活性化状態を強化することで上昇させると考えられる。
【0075】
ＮＫ細胞の臨床投与は典型的にはＩＬ－２に依存してｉｎ ｖｉｖｏでのその生存及び増殖を支援している。しかしながら、ＩＬ－２の投与に関係した複数の副作用は重いものになる可能性があり、またこのサイトカインの投与を耐容性不良なものにしてしまうことが多い。ＩＬ－２の投与を停止する又はその用量を減らすことでＮＫ細胞の増殖が低下し、抗腫瘍作用が不十分なものとなる可能性があり、抗腫瘍作用は制御性Ｔ細胞の刺激によりさらに阻害され得る。そのため、ＩＬ－２をＩＬ－１５で置き換えることは潜在的に魅力ではあるものの、ＩＬ－１５の臨床用の製剤化は依然として試験中である。アカゲザルに投与した場合、全体的に耐容性は良好であったものの、一部のサルでは、下痢、嘔吐、体重減少、一過性の好中球減少、トランスアミナーゼの増加及び低ナトリウム血症を含めた有害作用が観察された。Ｔ及びＮＫ細胞の増殖に加えて、制御性Ｔ細胞の増殖が観察された。ｗｔＩＬ１５を形質導入したＮＫ細胞とは異なり、ｍｂＩＬ１５を形質導入したＮＫ細胞は極めて少量のＩＬ－１５を上清において放出した。このため、ＩＬ－１５のＮＫ細胞以外の細胞との相互作用により引き起こされ得る潜在的な副作用はこのアプローチにより最小限に抑えられる。注目すべきは、マウス大型顆粒リンパ球のＩＬ－１５への長時間にわたる曝露がその白血病の増殖につながることである。これは患者へのＩＬ－１５の投与、またＩＬ－１５を発現するＮＫ細胞の使用に関わる潜在的な安全性に関わる懸念を、特にはそのような細胞を再発のリスクが低い患者に投与する場合に生む。しかしながら、本明細書に記載の実験において、ｍｂＩＬ１５を発現するＮＫ細胞の生存期間は概して、可溶性ＩＬ－１５を発現するＴ細胞クローンに関して報告されている１年以上よりはるかに短い。さらに、免疫不全マウスにおいて、９ヶ月を超える追跡調査で、持続的なＮＫ増殖は観察されなかった。
【0076】
ＮＫ細胞の抗がん能力をサポートする多くの臨床的エビデンスがある。ＮＫ細胞は、モノクローナル抗体を処置された患者における抗体依存性細胞障害性の媒介においても極めて重要な役割を果たしている。したがって、ＮＫ細胞の注入は多種多様な状況で有益となる可能性がある。ｅｘ ｖｉｖｏでのヒトＮＫ細胞の大量増殖は実現可能である。これを目的としたロバストで大規模な方法は確立されており、臨床試験で用いられている。レトロウイルスによる形質導入又はエレクトロポレーションによるＮＫ細胞の遺伝子組み換えも可能である。したがって、本明細書に記載のアプローチの臨床グレード条件への変換は現実的であり、またｍｂＩＬ１５－ＮＫ細胞の優れた増殖及び細胞障害性により保証されている。
【0077】
【表1】
【0078】
1細胞マーカーを、ＩＬ－２不在下の培養から４８時間後に分析した。抗体はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＤ５６ ＰＥ、ＣＤ１６ ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＤ６９ ＰＥ、ＣＤ２５ ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＤ１２２ ＢＶ４２１、ＣＤ１５８ｂ ＰＥ）、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（ＣＤ３３５ ＰＥ、ＣＤ３３６ ＰＥ、ＣＤ３３７ ＰＥ、ＣＤ１５８ａｈ ＰＥ、ＣＤ１５９ａ ＰＥ）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ（ＣＤ２２６ ＰＥ、ＣＤ１５８ｅ ＡＰＣ）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＮＫＧ２Ｄ ＰＥ）及びＢｉｏｌｅｇｅｎｄ（ＣＤ１３２ ＡＰＣ）から入手した。
【0079】
2割合とは、マーカーを発現するＧＦＰ＋細胞のことである。
【0080】
3過剰発現したマーカーは太字で強調している。
【0081】
ＭＦＩは蛍光強度を意味する。
【0082】
本明細書で引用した全ての特許、公開出願及び参考文献の教示は参照により全て本明細書に援用される。
【0083】
本発明をその実施形態例に言及しながら詳しく示し、説明してきたが、当業者ならば、添付の請求項が包含する本発明の範囲から逸脱することなく形態及び細部において様々な変更を加え得ることがわかる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【外国語明細書】