(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022185009
(43)【公開日】2022-12-13
(54)【発明の名称】安定したアザシチジン含有医薬組成物の製造方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/706 20060101AFI20221206BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20221206BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20221206BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20221206BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20221206BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20221206BHJP
A61K 47/10 20060101ALI20221206BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20221206BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20221206BHJP
A61P 35/02 20060101ALN20221206BHJP
A61P 35/00 20060101ALN20221206BHJP
【ＦＩ】
A61K31/706
A61K9/19
A61K47/26
A61K47/02
A61K47/42
A61K47/12
A61K47/10
A61K47/36
A61K47/22
A61P35/02
A61P35/00
【審査請求】有
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022152920
(22)【出願日】2022-09-26
(62)【分割の表示】P 2020566917の分割
【原出願日】2019-05-29
(31)【優先権主張番号】10-2018-0061784
(32)【優先日】2018-05-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(71)【出願人】
【識別番号】521274533
【氏名又は名称】サムヤン ホールディングス コーポレイション
【氏名又は名称原語表記】ＳＡＭＹＡＮＧ ＨＯＬＤＩＮＧＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】３１，Ｊｏｎｇ－ｒｏ ３３－ｇｉｌ，Ｊｏｎｇｎｏ－ｇｕ，Ｓｅｏｕｌ，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002837
【氏名又は名称】弁理士法人アスフィ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チョ，ジュンウン
(72)【発明者】
【氏名】キム，ギョンヒェ
(72)【発明者】
【氏名】イ，イルウン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】安定したアザシチジン含有医薬組成物を製造する方法を提供する。
【解決手段】アセトニトリルを含む溶媒及び低温工程を使用して製造する。すなわち、
１）－８℃～－１℃の温度に維持されるアセトニトリルと水との混合溶媒に、アザシチジンを溶解させる工程；及び
２）工程１）の溶液を外気温度が１５℃以下に維持される条件下で、容器に充填する工程；
を含むアザシチジン含有医薬組成物の製造方法とする。
【選択図】なし
【解決手段】アセトニトリルを含む溶媒及び低温工程を使用して製造する。すなわち、
１）－８℃～－１℃の温度に維持されるアセトニトリルと水との混合溶媒に、アザシチジンを溶解させる工程；及び
２）工程１）の溶液を外気温度が１５℃以下に維持される条件下で、容器に充填する工程；
を含むアザシチジン含有医薬組成物の製造方法とする。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１）－８℃～－１℃の温度に維持されるアセトニトリルと水との混合溶媒に、アザシチジンを溶解させる工程；及び
２）工程１）の溶液を外気温度が１５℃以下に維持される条件下で、容器に充填する工程；
を含むアザシチジン含有医薬組成物の製造方法。
２）工程１）の溶液を外気温度が１５℃以下に維持される条件下で、容器に充填する工程；
を含むアザシチジン含有医薬組成物の製造方法。
【請求項2】
工程２）において、溶液を３時間以内に充填する請求項１に記載のアザシチジン含有医薬組成物の製造方法。
【請求項3】
工程１）において、アセトニトリルと水との体積比（アセトニトリル：水）が、５：９５～３０：７０である請求項１に記載のアザシチジン含有医薬組成物の製造方法。
【請求項4】
工程１）の溶液を滅菌ろ過する工程をさらに含む請求項１に記載のアザシチジン含有医薬組成物の製造方法。
【請求項5】
工程２）の充填物を凍結乾燥する工程をさらに含む請求項１に記載のアザシチジン含有医薬組成物の製造方法。
【請求項6】
工程１）において、混合溶媒が凍結乾燥補助剤をさらに含む請求項５に記載のアザシチジン含有医薬組成物の製造方法。
【請求項7】
凍結乾燥補助剤が、マンニトール、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、酒石酸、ゼラチン、グリセリン、デキストロース、デキストラン、クエン酸、アスコルビン酸、酒石酸リン酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、及びこれらの混合物よりなる群から選ばれる請求項６に記載のアザシチジン含有医薬組成物の製造方法。
【請求項8】
工程１）が、
１－ａ）凍結乾燥補助剤を水に溶解させて溶液を得る工程；
１－ｂ）前記溶液に、アセトニトリルを加えて、混合溶媒を得る工程；
１－ｃ）前記混合溶媒の温度を－８℃～－１℃に下げる工程；及び
１－ｄ）前記温度の混合溶媒に、アザシチジンを溶解させる工程；
を含む請求項１に記載のアザシチジン含有医薬組成物の製造方法。
１－ａ）凍結乾燥補助剤を水に溶解させて溶液を得る工程；
１－ｂ）前記溶液に、アセトニトリルを加えて、混合溶媒を得る工程；
１－ｃ）前記混合溶媒の温度を－８℃～－１℃に下げる工程；及び
１－ｄ）前記温度の混合溶媒に、アザシチジンを溶解させる工程；
を含む請求項１に記載のアザシチジン含有医薬組成物の製造方法。
【請求項9】
アザシチジン含有医薬組成物が、注射用製剤である請求項１に記載のアザシチジン含有医薬組成物の製造方法。
【請求項10】
工程２）の容器は、ガラスバイアルである請求項１に記載のアザシチジン含有医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アセトニトリルを含む溶媒及び低温工程を使用して、安定したアザシチジン含有医薬組成物を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
下記化学構造を有するアザシチジン（ＡＺＡ）は、４－アミノ－１－（３，４－ジヒドロキシ－５－ヒドロキシメチル－テトラヒドロフラン－２－イル）－１Ｈ－［１，３，５］トリアジン－２－オン又は５－アザシチジンなどとしても公知であり、現在、医薬品ＶＩＤＡＺＡ（登録商標）として市販されている。
【0003】
【化1】
【0004】
アザシチジンは、ＤＮＡ及びＲＮＡに存在するヌクレオシドであるシチジンの化学的類似体である。アザシチジンとこのジオキシ誘導体である５－アザ－２’デオキシシチジンは、ＤＮＡメチル化を低減させるためにデザインされたヌクレオシドアナログであり、急性骨髄性白血病などを治療するために、臨床的に利用されてきた（非特許文献１）。アザシチジンは、複製ＤＮＡ内に混入された後、ＤＮＡメチルトランスフェフーゼとの共有結合複合体を形成し、その活性を抑制し、ＤＮＡヒポメチル化を誘導することによって、正常な細胞周期の調節、分化及び死滅に関与する遺伝子の再－発現により、細胞が正常機能を回復するようにする。また、アザシチジンの細胞毒性効果は、正常細胞成長の制御メカニズムに対してそれ以上反応しない、癌細胞をはじめとする急速に分割する細胞の死滅を来すことがある。したがって、アザシチジンは、臨床試験でテストされてきており、特に骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の治療などで相当な抗腫瘍活性を示したことがある。
【0005】
しかし、アザシチジンは、加水分解されやすい特性のため、商業的目的の大規模な合成、処理及び保管が困難であるという問題があった。アザシチジンのｓ－トリアジン環は、水で分解される傾向にあるが、中性ｐＨの水溶液中でアザシチジンの５，６－イミンの二重結合の水和が急速に起こった後、結合が開裂し、ホルミル誘導体であるＮ－（ホルミルアミジノ）－Ｎ’－β－Ｄ－リボフラノシルウレア（ＲＧＵ－ＣＨＯ）が得られ、これは、次に、脱ホルミル化されることによって、１－β－Ｄ－リボフラノシル－３－グアニルウレア（ＲＧＵ）を非可逆的に生成する。このような水溶液中のアザシチジンの不安定性により、水を含有する溶媒内でのアザシチジンの処理及び保管が容易ではなかった。
【0006】
したがって、安定的、且つ簡単であり、産業的規模で実行可能なアザシチジンの処理及び保管方法に対する必要性が存在した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｖ．１９，ｎｏ．３，ｐｐ．３１４９－３１５９，２０１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
アザシチジンのような化合物の凍結乾燥製剤を製造するためには、溶液状態の化合物を調製し、これを滅菌した後、凍結乾燥して、溶媒を除去する工程を経ることになる。このような過程で、アザシチジンが水溶液に数時間暴露されると、加水分解により類縁物質（不純物，ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ）が生成される問題があった。
そこで、本発明の目的は、アザシチジンの加水分解を抑制することができる温度及び溶媒条件を見出すことによって、類縁物質形成を最小化して、アザシチジン含有医薬組成物を製造できる方法を提供することである。
そこで、本発明の目的は、アザシチジンの加水分解を抑制することができる温度及び溶媒条件を見出すことによって、類縁物質形成を最小化して、アザシチジン含有医薬組成物を製造できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
明示的な他の記載がない限り、本明細書の全体で使用されるいくつかの用語は、以下の通りに定義することができる。
【0010】
本明細書の全体において、特別な言及がない限り、「含むこと」又は「含有すること」は、どの構成要素（又は構成成分）を特別な制限なく含むことを意味し、他の構成要素（又は構成成分）の付加を排除するものとして解釈されない。
【0011】
また、「アザシチジン」は、アザシチジン遊離塩基だけでなく、アザシチジンの塩、多形体、異性体（ｉｓｏｍｅｒ）、エナンチオマー、無水物、半水和物、溶媒和物、プロドラッグ又はこれらの任意の混合物であってもよい。ここで、アザシチジンの「塩」は、無機酸及び／又は有機酸から由来したアザシチジンの酸付加塩を意味し、塩酸、臭素化水素酸、ホウ酸、リン酸、又は硫酸から形成されてもよい。又は、塩は、酢酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、シュウ酸、コハク酸、酒石酸、ｐ－トルエンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、又はトリフルオロ酢酸から形成されてもよい。ここで、アザシチジンの「多形体」は、アザシチジンの固体結晶質形態又はその塩又は複合体を意味する。また、アザシチジンの「溶媒和物」は、非共有性分子間力により結合された化学量論的又は非－化学量論的量の溶媒をさらに含む、アザシチジン又はその塩を意味する。溶媒が水のとき、溶媒和物は、水和物、例えば、一水和物、二水和物、三水和物又は四水和物であってもよい。また、アザシチジンの「プロドラッグ」は、アザシチジンの機能性誘導体であり、生体内でアザシチジンに容易に転換可能な化合物を意味する。
【0012】
前記課題を解決するために、本発明は、１）温度が－８℃～－１℃に維持されるアセトニトリルと水との混合溶媒に、アザシチジンを溶解させる工程；及び２）工程１）の溶液を外気温度が１５℃以下に維持される条件下で、容器に充填する工程；を含むアザシチジン含有医薬組成物の製造方法を提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。
以下、本発明を詳細に説明する。
【0013】
一実施形態において、前記工程２）において、外気温度が１０℃以下に維持されるものであってもよいが、これに限定されない。外気温度が前記温度以下に維持される場合、容器充填工程中のアザシチジンの加水分解を抑制することができる。前記工程１）におけるアザシチジン溶解が低温で行われたとしても、容器充填工程で外気温度が１５℃超、例えば、室温のとき、アザシチジンが急速に加水分解され、類縁物質生成が増加されるので、
工程２）における外気温度を一定温度以下に維持することが重要である。前記外気温度は、１５℃以下又は１０℃以下であってもよく、また、一実施形態において、前記外気温度は、０℃以上、３℃以上、又は５℃以上であってもよい。
工程２）における外気温度を一定温度以下に維持することが重要である。前記外気温度は、１５℃以下又は１０℃以下であってもよく、また、一実施形態において、前記外気温度は、０℃以上、３℃以上、又は５℃以上であってもよい。
【0014】
一実施形態において、前記工程２）において、溶液を３時間以内、好ましくは２時間以内に充填してもよいが、これに限定されない。
【0015】
アザシチジン含有医薬組成物の産業的製造時、充填作業にある程度の時間が必要とされており、このとき、充填作業の温度と所要時間に応じてアザシチジンが加水分解され、所望しない類縁物質が生成されるが、本発明の一実施形態により、工程２）を行う際に、１５℃又は１０℃以下の外気温度で３時間又は２時間以内に充填作業を完了し、凍結乾燥を開始する場合、類縁物質の生成を最小化することができる。
【0016】
一実施形態において、前記工程１）において、混合溶媒の温度が－８℃～－１℃、好ましくは－７℃～－１℃、より好ましくは－５℃～－１℃に維持されるものであってもよいが、これに限定されない。混合溶媒の温度が前記範囲以内のとき、アザシチジン溶解工程中の加水分解をより抑制することができる。
【0017】
一実施形態において、前記工程１）において、アセトニトリルと水の体積比（アセトニトリル：水）が５：９５～３０：７０であってもよいが、これに限定されない。水に対するアセトニトリルの体積比が、前記範囲を超えると、アザシチジンの安定性が低減されるだけでなく、その後の残留溶媒の除去問題が発生する可能性がある。水に対するアセトニトリルの体積比が、前記範囲未満のとき、アザシチジンの安定性が十分に確保できない可能性もある。アセトニトリルと水の体積比は、好ましくは１０：９０～２５：７５、より好ましくは１５：８５～２５：７５、さらに好ましくは２０：８０であってもよいが、これに限定されない。
【0018】
一実施形態において、前記医薬組成物内のアザシチジン濃度は、約０．００１～５０ｍｇ／ｍＬであることができ、好ましくは約０．１～１０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約１～１０ｍｇ／ｍＬ、約２～７ｍｇ／ｍＬ、又は約３～５ｍｇ／ｍＬであってもよいが、これに限定されなく、投与対象及び目的などに応じて適宜調節することができる。
【0019】
一実施形態において、本発明の方法は、前記工程１）の溶液を滅菌ろ過する工程をさらに含むが、これに限定されない。前記滅菌ろ過する工程は、単純フィルタリング（ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）により行われてもよいが、これに限定されなく、所望の滅菌の程度に応じてフィルターの気孔サイズを選択することができ、その他にも、本発明の属する分野で通常的に行われる滅菌ろ過方法により、特に制限なく行うことができる。
【0020】
一実施形態において、本発明の方法は、前記工程２）の充填物を凍結乾燥する工程をさらに含んでもよいが、これに限定されない。前記凍結乾燥する工程は、本発明の属する分野で通常的に行われる凍結乾燥方法により、特に制限なく行うことができる。
【0021】
一実施形態において、前記工程１）において、混合溶媒が凍結乾燥補助剤をさらに含むが、これに限定されない。
【0022】
一実施形態において、前記凍結乾燥補助剤は、マンニトール、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、酒石酸、ゼラチン、グリセリン、デキストロース、デキストラン、クエン酸、アスコルビン酸、酒石酸リン酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、及びこれらの混合物よりなる群から選ばれるが、これらに限定されなく、通常的に使用される凍結乾燥補助剤から通常の技術者が適宜選択して使用することができる。
【0023】
例えば、前記凍結乾燥補助剤は、工程１）の混合溶媒内に１～１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは２～８ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｍｇ／ｍＬで含まれてもよいが、これに限定されず、有効成分の濃度及び凍結乾燥補助剤の種類などを考慮して通常の技術者がその量を適宜調節して使用することができる。
【0024】
一実施形態において、前記工程１）が、１－ａ）凍結乾燥補助剤を水に溶解させて溶液を得る工程；１－ｂ）前記溶液に、アセトニトリルを加えて、混合溶媒を得る工程；１－ｃ）前記混合溶媒の温度を－８℃～－１℃に下げる工程；及び１－ｄ）前記温度の混合溶媒に、アザシチジンを溶解させる工程；を含むが、これに限定されない。
【0025】
本発明による医薬組成物は、骨髄異形成症候群及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を含む様々な癌及び腫瘍関連疾患の治療又は改善のために用いることができる。より具体的に、前記医薬組成物は、非正常的細胞増殖に関連する障害及び血液障害のような疾患を治療又は改善のために用いることができる。
【0026】
一実施形態において、前記医薬組成物に含まれたアザシチジン－由来類縁物質の含量が、２．５％未満、２％未満、１．５％未満、１．２％未満、１％未満、０．８％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満又は０．１％未満であってもよい。このような類縁物質の含量は、類縁物質の判断基準、工程に必要とされた時間、工程温度及びアセトニトリルの濃度のような条件に応じて変わる。
【0027】
前記医薬組成物の投与経路は、特に限定されず、経口又は非経口投与であってもよい。非経口的投与経路には、注射投与、例えば、経皮、鼻腔、腹腔、筋肉、皮下、経静脈注射などの様々な経路が含まれるが、これに限定されない。
【0028】
したがって、本発明による医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体を含んでもよく、その他にも緩衝剤、等張化剤及び／又は抗菌剤をさらに含んでもよい。
【0029】
一実施形態において、前記アザシチジン含有医薬組成物が、注射用製剤であってもよいが、これに限定されない。
【0030】
例えば、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能な非経口用の担体とともに、当業界に公知された方法により、注射用製剤の形態に製剤化することができる。この場合、注射用製剤は、必ず滅菌しなければならず、バクテリア及び真菌のような微生物の汚染から保護しなければならない。適した非経口用の担体の例は、特に限定されず、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、これらの混合物及び／又は植物油を含む溶媒又は分散媒質であってもよい。好ましくは、適した担体には、ハンクス液、点滴溶液、トリエタノールアミンが含まれたＰＢＳ又は注射用滅菌水、１０％エタノール、４０％プロピレングリコール及び５％デキストロースのような等張溶液などを使用することができる。また、前記注射用製剤を微生物汚染から保護するために、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどのような様々な抗菌剤及び抗真菌剤をさらに含むことができる。又は、前記注射用製剤は、マンニトール、ラクトース、デキストロース及びトレハロースからなる群から選ばれた糖又は塩化ナトリウムのような等張化剤をさらに含む。その他の薬学的に許容される担体などとしては、以下の文献に記載されたものを参考にすることができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）。また、前記前記注射用製剤は、薬学的に適した容器内に充填することができる。
【0031】
一実施形態において、前記工程２）の容器は、ガラスバイアルであってもよいが、これに限定されない。
【発明の効果】
【0032】
本発明の一実施形態によれば、アザシチジンの加水分解による類縁物質の発生を最小化し、最も厳格な条件（ＵＳＰ ｍｏｎｏｇｒａｐｈ）の類縁物質基準に適合するアザシチジン含有医薬組成物を製造することができ、複雑であるか、追加の工程を求めないことから、産業的規模で実行可能なアザシチジンの処理及び保管が可能になる。
また、前記のような安定したアザシチジン含有医薬組成物は、哺乳類において様々な種類の癌及び腫瘍関連疾患の治療に用いることができる。
また、前記のような安定したアザシチジン含有医薬組成物は、哺乳類において様々な種類の癌及び腫瘍関連疾患の治療に用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【実施例0033】
製造例１～４： 溶媒による低温調製液の製造
（１）注射用水を用いた低温調製液の製造
調製タンク内の注射用水３０００ｍＬに、マンニトール１５ｇを加え、完全に溶解させた。この調製タンクを５±３℃に維持されるように、十分に温度を低くした。調製液の温度が冷蔵温度（５±３℃）に下がったことを確認した後、アザシチジン１５ｇを加え、５００±５０ｒｐｍで２０±１０分間撹拌した。完全に溶解したことを確認し、この調製液を滅菌フィルタリングした。
（１）注射用水を用いた低温調製液の製造
調製タンク内の注射用水３０００ｍＬに、マンニトール１５ｇを加え、完全に溶解させた。この調製タンクを５±３℃に維持されるように、十分に温度を低くした。調製液の温度が冷蔵温度（５±３℃）に下がったことを確認した後、アザシチジン１５ｇを加え、５００±５０ｒｐｍで２０±１０分間撹拌した。完全に溶解したことを確認し、この調製液を滅菌フィルタリングした。
【0034】
（２）有機溶媒を用いた低温調製液の製造
調製タンク内の注射用水２４００ｍＬに、マンニトール１５ｇを加え、完全に溶解させた。この調製タンクを－３±２℃に維持されるように、十分に温度を低くした。マンニトールが完全に溶解すれば、下記表１のような種類の有機溶媒（アセトニトリル、エタノール又は第三級ブタノール）６００ｍＬをそれぞれ加え、十分に混合した。調製液の温度が－３±２℃に下がったことを確認した後、アザシチジン１５ｇを加え、５００±５０ｒｐｍで７０±１０分間撹拌した。完全に溶解したことを確認し、この調製液を滅菌フィルタリングした。
前記調製液を３０ｍＬずつバイアルに入れた後、５℃、１５℃又は２５℃のチャンバーに保管し、１時間間隔でサンプリングして、４時間まで類縁物質を測定した。
調製タンク内の注射用水２４００ｍＬに、マンニトール１５ｇを加え、完全に溶解させた。この調製タンクを－３±２℃に維持されるように、十分に温度を低くした。マンニトールが完全に溶解すれば、下記表１のような種類の有機溶媒（アセトニトリル、エタノール又は第三級ブタノール）６００ｍＬをそれぞれ加え、十分に混合した。調製液の温度が－３±２℃に下がったことを確認した後、アザシチジン１５ｇを加え、５００±５０ｒｐｍで７０±１０分間撹拌した。完全に溶解したことを確認し、この調製液を滅菌フィルタリングした。
前記調製液を３０ｍＬずつバイアルに入れた後、５℃、１５℃又は２５℃のチャンバーに保管し、１時間間隔でサンプリングして、４時間まで類縁物質を測定した。
【0035】
【表1】
【0036】
実験例１： 溶媒の種類による保管温度別の類縁物質の評価
以下の方法で製造例１～４の調製液内類縁物質を分析した。分析時標準液及び検液は、２～８℃に保管した。
以下の方法で製造例１～４の調製液内類縁物質を分析した。分析時標準液及び検液は、２～８℃に保管した。
【0037】
１）希釈液の調製
精製水を用いて亜硫酸水素ナトリウムの濃度を１０．０ｇ／Ｌにし、希釈された硫酸を用いてｐＨ２．５に調整した。
精製水を用いて亜硫酸水素ナトリウムの濃度を１０．０ｇ／Ｌにし、希釈された硫酸を用いてｐＨ２．５に調整した。
【0038】
２）標準液の調製
５０ｍＬメスフラスコに、精密に定量したアザシチジン５．０ｍｇを入れ、２０％アセトニトリルで標線を合わせ、この溶液１ｍＬを１０ｍＬメスフラスコに入れ、そこに２０％アセトニトリル３ｍＬを加えた後、希釈液で標線を合わせた（濃度０．０１ｍｇ／ｍＬ）。
５０ｍＬメスフラスコに、精密に定量したアザシチジン５．０ｍｇを入れ、２０％アセトニトリルで標線を合わせ、この溶液１ｍＬを１０ｍＬメスフラスコに入れ、そこに２０％アセトニトリル３ｍＬを加えた後、希釈液で標線を合わせた（濃度０．０１ｍｇ／ｍＬ）。
【0039】
３）システム適合性溶液の調製
精密に定量したアザシチジン標準品２５ｍｇを５ｍＬメスフラスコに入れ、２０％アセトニトリルを加えて溶解し、標線を合わせた。この溶液を２ｍＬ取り、希釈液が３ｍＬ入っているバイアルに入れ、よく混合した（濃度２ｍｇ／ｍＬ）。
精密に定量したアザシチジン標準品２５ｍｇを５ｍＬメスフラスコに入れ、２０％アセトニトリルを加えて溶解し、標線を合わせた。この溶液を２ｍＬ取り、希釈液が３ｍＬ入っているバイアルに入れ、よく混合した（濃度２ｍｇ／ｍＬ）。
【0040】
４）検液の調製
よく溶解された前記溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を２ｍＬ取り、希釈液が３ｍＬ入っているバイアルに入れ、よく混合して検液とした（濃度２ｍｇ／ｍＬ）。
よく溶解された前記溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を２ｍＬ取り、希釈液が３ｍＬ入っているバイアルに入れ、よく混合して検液とした（濃度２ｍｇ／ｍＬ）。
【0041】
５）液体クロマトグラフィー条件
ａ．カラム： Ｏｒｏｓｉｌ Ｃ１８，４．６ｍｍ×２５ｃｍ，３μｍ，又はこれと類似なカラム
ｂ．検出器： 紫外部吸光光度計（測定波長：２１０ｎｍ）
ｃ．注入量： ５μＬ
ｄ．流速： ０．８ｍＬ／分
ｅ．自動試料注入器の温度： ５℃
ｇ．移動相： 勾配溶出
実行条件は下記表２に示した。
ａ．カラム： Ｏｒｏｓｉｌ Ｃ１８，４．６ｍｍ×２５ｃｍ，３μｍ，又はこれと類似なカラム
ｂ．検出器： 紫外部吸光光度計（測定波長：２１０ｎｍ）
ｃ．注入量： ５μＬ
ｄ．流速： ０．８ｍＬ／分
ｅ．自動試料注入器の温度： ５℃
ｇ．移動相： 勾配溶出
実行条件は下記表２に示した。
【0042】
【表2】
【0043】
移動相Ａ： １．５４ｇ／Ｌ酢酸アンモニウム水溶液
移動相Ｂ： アセトニトリル：メタノール：移動相Ａ＝２０：３０：５０
移動相Ｂ： アセトニトリル：メタノール：移動相Ａ＝２０：３０：５０
【0044】
６）システム適合性及び操作法
システム適合性の溶液を注入し、アザシチジンピークのテーリングが２．０以下、標準液を６回以上注入して、ピーク面積の相手標準偏差が１０．０％以下のとき、システムが適合したと判断し、標準液、検液の順で注入して、ピーク面積を求めた。
システム適合性の溶液を注入し、アザシチジンピークのテーリングが２．０以下、標準液を６回以上注入して、ピーク面積の相手標準偏差が１０．０％以下のとき、システムが適合したと判断し、標準液、検液の順で注入して、ピーク面積を求めた。
【0045】
７）計算
下記計算式を使用して各類縁物質の濃度を計算した。
各類縁物質（％）＝（検液中の各類縁物質の面性／アザシチジン標準液のピーク面積）×（アザシチジン標準液の濃度（ｍｇ／ｍＬ）／検液の理論濃度（ｍｇ／ｍＬ））×標準品の純度（％）
下記計算式を使用して各類縁物質の濃度を計算した。
各類縁物質（％）＝（検液中の各類縁物質の面性／アザシチジン標準液のピーク面積）×（アザシチジン標準液の濃度（ｍｇ／ｍＬ）／検液の理論濃度（ｍｇ／ｍＬ））×標準品の純度（％）
【0046】
アザシチジン類縁物質の判定基準は、下記表３に示した（ただし、０．０４％以下のピークは報告していない）。また、用いられたアザシチジン溶媒別及び温度別の類縁物質分析結果を表４～表７に示した。表４は注射用水（製造例１）、表５はアセトニトリル（製造例２）、表６はエタノール（製造例３）、及び表７は第三級ブタノール（製造例４）を溶媒として用いて、調製液製造後、類縁物質分析結果を示したものである。
【0047】
【表3】
【0048】
ａ．１－β－Ｄ－リボフラノシル－３－グアニルウレア
ｂ．Ｎ－（ジアミノエチレン）Ｎ’－（β－Ｄ－リボフラノシル）カルバムイミド酸
ｃ．１－β－Ｄ－リボフラノシル－３－アミノカルボニルグアニジン
ｄ．１－β－Ｄ－リボフラノシル－３－イミノヒドロキシルメチルグアニジン
ｅ．Ｎ－（ホルミルアミジノ）－Ｎ’－β－Ｄ－リボフラノシルウレア（ＲＧＵ－ＣＨＯ）
ｆ．総類縁物質からＮ－（ホルミルアミジノ）－Ｎ’－β－Ｄ－リボフラノシルウレアを除外
ｂ．Ｎ－（ジアミノエチレン）Ｎ’－（β－Ｄ－リボフラノシル）カルバムイミド酸
ｃ．１－β－Ｄ－リボフラノシル－３－アミノカルボニルグアニジン
ｄ．１－β－Ｄ－リボフラノシル－３－イミノヒドロキシルメチルグアニジン
ｅ．Ｎ－（ホルミルアミジノ）－Ｎ’－β－Ｄ－リボフラノシルウレア（ＲＧＵ－ＣＨＯ）
ｆ．総類縁物質からＮ－（ホルミルアミジノ）－Ｎ’－β－Ｄ－リボフラノシルウレアを除外
【0049】
【表4】
【0050】
【表5】
【0051】
【表6】
【0052】
【表7】
【0053】
有機溶媒を用いず、水のみで製造した組成の場合、０℃以下で製造すると、調製液の凍結が生じたので、冷蔵温度以下で製造するのに問題があった。したがって、注射用水で製造した組成物の場合、５℃保管を除いたすべての温度で１時間も類縁物質基準以下を維持することができなかった。反面、有機溶媒を用いて製造した調製液の場合、約－３℃の低温で製造が可能であった。アセトニトリル、エタノール及び第三級ブタノールの３つの溶媒を用いて製造した調製液でアセトニトリルが最も優れた安定性を示した。次に、エタノール、第三級ブタノールの順に優れた安定性を示した。特に、アセトニトリルの場合、水と温度に敏感な名ＲＧＵ－ＣＨを調節するのに非常に効果的であった。
【0054】
製造例５～７： アセトニトリル濃度別調製液製造
調製タンク内の注射用水２１００ｍＬに、マンニトール１５ｇを加え、完全に溶解させた。この調製タンクを－３±２℃に維持されるように、十分に温度を低くした。マンニトールが完全に溶解すれば、下記表８のように注射用水及び／又はアセトニトリルを加え、十分に混合した。調製液の温度が－３±２℃に下がったことを確認し、アザシチジン１５ｇを加えた後、５００±５０ｒｐｍで７０±１０分間撹拌した。完全に溶解したことを確認し、この調製液を滅菌フィルタリングした。
この調製液を３０ｍＬずつバイアルに入れた後、５℃、１０℃又は１５℃チャンバーに保管し、１時間間隔でサンプリングし、３時間まで類縁物質を測定した。
調製タンク内の注射用水２１００ｍＬに、マンニトール１５ｇを加え、完全に溶解させた。この調製タンクを－３±２℃に維持されるように、十分に温度を低くした。マンニトールが完全に溶解すれば、下記表８のように注射用水及び／又はアセトニトリルを加え、十分に混合した。調製液の温度が－３±２℃に下がったことを確認し、アザシチジン１５ｇを加えた後、５００±５０ｒｐｍで７０±１０分間撹拌した。完全に溶解したことを確認し、この調製液を滅菌フィルタリングした。
この調製液を３０ｍＬずつバイアルに入れた後、５℃、１０℃又は１５℃チャンバーに保管し、１時間間隔でサンプリングし、３時間まで類縁物質を測定した。
【0055】
【表8】
【0056】
実験例２： アセトニトリル濃度にともなう保管温度格別類縁物質評価
前記実験例１と同様の方法で製造例５～７による調製液内の類縁物質を分析した。下記表９～表１１に、それぞれ１０％、２０％及び３０％アセトニトリル（ＡＣＮ）を用いた調製液製造後、類縁物質分析結果を示した。
前記実験例１と同様の方法で製造例５～７による調製液内の類縁物質を分析した。下記表９～表１１に、それぞれ１０％、２０％及び３０％アセトニトリル（ＡＣＮ）を用いた調製液製造後、類縁物質分析結果を示した。
【0057】
【表9】
【0058】
【表10】
【0059】
【表11】
【0060】
１０％アセトニトリルを用いて調製した調製液（製造例５）の場合、１０℃で２時間、１５℃では１時間後に類縁物質基準を超えた。３０％アセトニトリル溶液で製造した調製液（製造例７）の場合、１０℃で３時間後に類縁物質が基準を超えたが、２０％アセトニトリル溶液で調製した調製液（製造例６）の場合、１０℃では３時間、１５℃では２時間の安定性を示し、アセトニトリルの割合２０％で最も優れた安定性を示していることを確認することができた。
【0061】
実施例１： ２０％アセトニトリルを用いた低温工程でのサンプル製造
調製タンク内の注射用水２４００ｍＬに、マンニトール１５ｇを加え、完全に溶解させた。この調製タンクを－３±２℃に維持されるように、十分に温度を低くした。マンニトールが完全に溶解すれば、６００ｍＬアセトニトリルを加え、十分に混合した。調製液の温度が－３±２℃に下がったことを確認した後、アザシチジン１５ｇを加え、５００±５０ｒｐｍで７０±１０分間撹拌した。完全に溶解したことを確認し、この調製液を滅菌フィルタリングした。前記調製液を１０℃以下の条件でバイアルに充填した後、実際の工場で充填にかかる時間を考慮して、１０℃チャンバーに２時間さらに保管し、凍結乾燥器に入れ、凍結乾燥した後、サンプルを取って分析した。
調製タンク内の注射用水２４００ｍＬに、マンニトール１５ｇを加え、完全に溶解させた。この調製タンクを－３±２℃に維持されるように、十分に温度を低くした。マンニトールが完全に溶解すれば、６００ｍＬアセトニトリルを加え、十分に混合した。調製液の温度が－３±２℃に下がったことを確認した後、アザシチジン１５ｇを加え、５００±５０ｒｐｍで７０±１０分間撹拌した。完全に溶解したことを確認し、この調製液を滅菌フィルタリングした。前記調製液を１０℃以下の条件でバイアルに充填した後、実際の工場で充填にかかる時間を考慮して、１０℃チャンバーに２時間さらに保管し、凍結乾燥器に入れ、凍結乾燥した後、サンプルを取って分析した。
【0062】
比較例１： ２０％アセトニトリルを用いた室温工程でのサンプル製造
実施例１と同様に調製液を製造した後、滅菌フィルタリングした。前記調製液を室温でバイアルに充填した後、実際の工場で充填にかかる時間を考慮して、室温で２時間さらに保管し、凍結乾燥器に入れ、凍結乾燥した後、サンプルを取って分析した。
実施例１と同様に調製液を製造した後、滅菌フィルタリングした。前記調製液を室温でバイアルに充填した後、実際の工場で充填にかかる時間を考慮して、室温で２時間さらに保管し、凍結乾燥器に入れ、凍結乾燥した後、サンプルを取って分析した。
【0063】
比較例２： 精製水を用いた低温工程でのサンプル製造
精製水を用い、調製温度を５±３℃に維持したことを除いては、実施例１と同様に調製液を製造した後、滅菌フィルタリングした。前記調製液を１０℃以下の条件でバイアルに充填した後、実際の工場で充填にかかる時間を考慮して、１０℃チャンバーに２時間さらに保管し、凍結乾燥器に入れ、凍結乾燥した後、サンプルを取って分析した。
精製水を用い、調製温度を５±３℃に維持したことを除いては、実施例１と同様に調製液を製造した後、滅菌フィルタリングした。前記調製液を１０℃以下の条件でバイアルに充填した後、実際の工場で充填にかかる時間を考慮して、１０℃チャンバーに２時間さらに保管し、凍結乾燥器に入れ、凍結乾燥した後、サンプルを取って分析した。
【0064】
比較例３： 精製水を用いた室温工程でのサンプル製造
精製水を用い、調製温度を５±３℃に維持したことを除いては、実施例１と同様に調製液を製造した後、滅菌フィルタリングした。前記調製液を室温条件でバイアルに充填した後、実際の工場で充填にかかる時間を考慮して、室温で２時間さらに保管し、凍結乾燥器に入れ、凍結乾燥した後、サンプルを取って分析した。
比較例１～３による調製条件が下記表１２に比較されて示されている。
精製水を用い、調製温度を５±３℃に維持したことを除いては、実施例１と同様に調製液を製造した後、滅菌フィルタリングした。前記調製液を室温条件でバイアルに充填した後、実際の工場で充填にかかる時間を考慮して、室温で２時間さらに保管し、凍結乾燥器に入れ、凍結乾燥した後、サンプルを取って分析した。
比較例１～３による調製条件が下記表１２に比較されて示されている。
【0065】
【表12】
【0066】
実験例３： 最適な温度及び保管条件のための類縁物質の評価
実験例１と同じ方法で実施例１及び比較例１～３による凍結乾燥サンプル内の類縁物質を分析した。このとき、凍結乾燥が終わった試料は、注射器を利用して２０％アセトニトリルを１０ｍＬ程度加え、よく振とうして溶解した後、２０ｍＬメスフラスコに移した。少量の２０％アセトニトリルでバイアルを１～２回洗浄し、メスフラスコに入れ、２０％アセトニトリルで標線を合わせた（濃度５ｍｇ／ｍＬ）。よく溶解したこの溶液を２ｍＬ取り、希釈液が３ｍＬ入っているバイアルに入れ、よく混合して検液とした（濃度２ｍｇ／ｍＬ）。凍結乾燥されたサンプルの類縁物質分析結果を下記表１３に示した。
実験例１と同じ方法で実施例１及び比較例１～３による凍結乾燥サンプル内の類縁物質を分析した。このとき、凍結乾燥が終わった試料は、注射器を利用して２０％アセトニトリルを１０ｍＬ程度加え、よく振とうして溶解した後、２０ｍＬメスフラスコに移した。少量の２０％アセトニトリルでバイアルを１～２回洗浄し、メスフラスコに入れ、２０％アセトニトリルで標線を合わせた（濃度５ｍｇ／ｍＬ）。よく溶解したこの溶液を２ｍＬ取り、希釈液が３ｍＬ入っているバイアルに入れ、よく混合して検液とした（濃度２ｍｇ／ｍＬ）。凍結乾燥されたサンプルの類縁物質分析結果を下記表１３に示した。
【0067】
【表13】
