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特開2022-185420蛍光プローブ、液相の極性及び粘性を評価する方法、並びに化合物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022185420
(43)【公開日】2022-12-14
(54)【発明の名称】蛍光プローブ、液相の極性及び粘性を評価する方法、並びに化合物
(51)【国際特許分類】
C08G 65/28 20060101AFI20221207BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20221207BHJP
【ＦＩ】
C08G65/28
G01N33/48 P
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021093100
(22)【出願日】2021-06-02
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （１）発行物名：第４３回日本分子生物学会年会のオンライン要旨、掲載ウェブサイトのアドレス：ｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ２．ａｅｐｌａｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｍｂｓｊ２０２０／、掲載年月日：令和２年１１月１９日 （２）集会名：第４３回日本分子生物学会年会のオンライン年会、掲載ウェブサイトのアドレス：ｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ２．ａｅｐｌａｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｍｂｓｊ２０２０／、掲載年月日：令和２年１２月４日
(71)【出願人】
【識別番号】504160781
【氏名又は名称】国立大学法人金沢大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106909
【弁理士】
【氏名又は名称】棚井 澄雄
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(74)【代理人】
【識別番号】100139686
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 史朗
(72)【発明者】
【氏名】羽澤 勝治
(72)【発明者】
【氏名】雨森 翔悟
(72)【発明者】
【氏名】西山 嘉男
(72)【発明者】
【氏名】伊賀 祥紘
(72)【発明者】
【氏名】水野 元博
(72)【発明者】
【氏名】高橋 憲司
(72)【発明者】
【氏名】ウォング ウィン チェン リチャード
【テーマコード（参考）】
2G045
4J005
【Ｆターム（参考）】
2G045AA24
2G045BA13
2G045BB25
2G045CB01
2G045FB12
4J005AA12
(57)【要約】
【課題】細胞内の液－液相分離の動態又は物性を評価可能な蛍光プローブ、前記蛍光プローブを用いた液相の極性及び粘性を評価する方法、及び前記蛍光プローブに用いられる化合物を提供する。
【解決手段】下記一般式（ｐ）で表される化合物（Ｐ）からなる、液相の極性及び粘性を評価するための蛍光プローブ。Ｐｙ１はピレンから（ｎ１＋１）個の水素原子を除いた基を表し、Ｐｙ２はピレンから（ｎ２＋１）個の水素原子を除いた基を表し、Ｌは２価の有機基を表し、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、１価の有機基を表す。ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立に、１～９の整数を表す。
［化１］
【選択図】なし
【解決手段】下記一般式（ｐ）で表される化合物（Ｐ）からなる、液相の極性及び粘性を評価するための蛍光プローブ。Ｐｙ１はピレンから（ｎ１＋１）個の水素原子を除いた基を表し、Ｐｙ２はピレンから（ｎ２＋１）個の水素原子を除いた基を表し、Ｌは２価の有機基を表し、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、１価の有機基を表す。ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立に、１～９の整数を表す。
［化１］
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記一般式（ｐ）で表される化合物（Ｐ）からなる、液相の極性及び粘性を評価するための蛍光プローブ。
［式中、Ｐｙ１はピレンから（ｎ１＋１）個の水素原子を除いた基を表し、Ｐｙ２はピレンから（ｎ２＋１）個の水素原子を除いた基を表し、Ｌは２価の有機基を表し、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、１価の有機基を表す。ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立に、１～９の整数を表す。］
【化1】
【請求項2】
前記化合物（Ｐ）が、下記一般式（ｐ－１）で表される化合物である、請求項１に記載の蛍光プローブ。
［式中、Ｌ１は２価の有機基を表し、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、１価の有機基を表す。］
【化2】
【請求項3】
前記化合物（Ｐ）が、下記式（Ｐｙｒ－Ａ）で表される化合物である、請求項２に記載の蛍光プローブ。
［式中、ＰＥＧは、ポリエチレングリコール基を表す。］
【化3】
【請求項4】
前記液相が、細胞内に存在する液相である、請求項１～３のいずれか一項に記載の蛍光プローブ。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載の蛍光プローブを用いて、液相の極性及び粘性を評価する方法であって、
対象試料中で、前記蛍光プローブのモノマー発光による蛍光（ｍ）を測定する工程（ｉ）と、
前記対象試料中で、前記蛍光プローブのエキシマー発光による蛍光（ｅ）を測定する工程（ｉｉ）と、
を含む、液相の極性及び粘性を評価する方法。
対象試料中で、前記蛍光プローブのモノマー発光による蛍光（ｍ）を測定する工程（ｉ）と、
前記対象試料中で、前記蛍光プローブのエキシマー発光による蛍光（ｅ）を測定する工程（ｉｉ）と、
を含む、液相の極性及び粘性を評価する方法。
【請求項6】
前記工程（ｉ）で測定された蛍光（ｍ）と、前記工程（ｉｉ）で測定された蛍光（ｅ）との蛍光強度比に基づいて、前記液相の極性及び粘性を評価する工程（ｉｉｉ）をさらに含む、請求項５に記載の液相の極性及び粘性を評価する方法。
【請求項7】
前記液相が、細胞内に存在する液相である、請求項５又は６に記載の液相の極性及び粘性を評価する方法。
【請求項8】
下記式（Ｐｙｒ－Ａ）で表される化合物。
［式中、ＰＥＧは、ポリエチレングリコール基を表す。］
【化4】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、蛍光プローブ、液相の極性及び粘性を評価する方法、並びに化合物に関する。
【背景技術】
【0002】
多くの細胞内コンパートメントは、生体分子の液－液相分離（ｌｉｑｕｉｄ－ｌｉｑｕｉｄ ｐｈａｓｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ：ＬＬＰＳ）によって形成される。ＬＬＰＳにより生じる凝集体は、脂質二重膜を有さないため、膜のないオルガネラ（ｍｅｍｂｒａｎｅｌｅｓｓ ｏｒｇａｎｅｌｌｅ）とも呼ばれる。膜のないオルガネラとしては、コアクチベーター凝縮体、中心体、ストレス顆粒、核小体等が挙げられる。原理的には、相分離した凝集体は、タンパク質合成の制御を伴うことなく、生体分子を局所的に高濃度に存在させることができる。ＬＬＰＳは、細胞内における動的な生命反応場を提供する。
【0003】
ＬＬＰＳの動態または物性を評価する方法としては、明視野イメージング又は蛍光顕微鏡を用いた相分離アッセイ、マイクロレオロジーを用いた粒子トラッキング、ＮＭＲ解析による方法等が提案されている。しかしながら、これらの方法には、バックグラウンドの高さ、操作の煩雑さ、試料調製の困難さ、データ処理の困難さ等の様々な技術的課題が存在する。また、細胞内のＬＬＰＳの動態及び物性の評価に適用することは難しい。
【0004】
ピレンは、４個のベンゼン環が縮合した多環芳香族炭化水素である。ピレンは、溶媒環境によって変調される二重の蛍光活性を有する。ピレンは、励起状態のピレンモノマーが基底状態の別のピレンモノマーと濃度依存的に相互作用することで、エキシマーを形成することができる（非特許文献１）。このようなピレンの性質を利用して、脂質ラベル（非特許文献１）、テロメアリピートＲＮＡの検出プローブ（非特許文献２）、相補鎖ＤＮＡ配列検出用プローブ（特許文献１）等に適用した例が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２００５－０８０６３７号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Pentti Somerharju, Pyrene-labeled lipids as tools in membrane biophysics and cell biology. Chem Phys Lipids. 2002 Jun; 116(1-2):57-74.
【非特許文献2】Yan Xu, Yuta Suzuki, Kenichiro Ito, and Makoto Komiyama. Telomeric repeat-containing RNA structure in living cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Aug 17;107(33):14579-84.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
細胞内のＬＬＰＳの動態及び物性は、細胞内の生命反応の理解に重要である。近年、神経変性疾患及びがん等の疾患においても、相転移及び／又は相転移の制御異常が関連していると考えられている。そのため、ＬＬＰＳの動態及び物性を簡易に検出可能な技術の開発が求められている。
【0008】
そこで、本発明は、細胞内のＬＬＰＳの動態又は物性を評価可能な蛍光プローブ、前記蛍光プローブを用いた液相の極性及び粘性を評価する方法、並びに前記蛍光プローブに用いられる化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明は以下の態様を含む。
［１］下記一般式（ｐ）で表される化合物（Ｐ）からなる、液相の極性及び粘性を評価するための蛍光プローブ。
［１］下記一般式（ｐ）で表される化合物（Ｐ）からなる、液相の極性及び粘性を評価するための蛍光プローブ。
【0010】
【化1】
［２］前記化合物（Ｐ）が、下記一般式（ｐ－１）で表される化合物である、［１］に記載の蛍光プローブ。
【0011】
【化2】
［３］前記化合物（Ｐ）が、下記式（Ｐｙｒ－Ａ）で表される化合物である、［２］に記載の蛍光プローブ。
【0012】
【化3】
［４］前記液相が、細胞内に存在する液相である、［１］～［３］いずれか１つに記載の蛍光プローブ。
［５］［１］～［４］いずれか１つに記載の蛍光プローブを用いて、液相の極性及び粘性を評価する方法であって、対象試料中で、前記蛍光プローブのモノマー発光による蛍光（ｍ）を測定する工程（ｉ）と、前記対象試料中で、前記蛍光プローブのエキシマー発光による蛍光（ｅ）を測定する工程（ｉｉ）と、を含む、液相の極性及び粘性を評価する方法。
［６］前記工程（ｉ）で測定された蛍光（ｍ）と、前記工程（ｉｉ）で測定された蛍光（ｅ）との蛍光強度比に基づいて、前記液相の極性及び粘性を評価する工程（ｉｉｉ）をさらに含む、［５］に記載の液相の極性及び粘性を評価する方法。
［７］前記液相が、細胞内に存在する液相である、［５］又は［６］に記載の液相の極性及び粘性を評価する方法。
［８］下記式（Ｐｙｒ－Ａ）で表される化合物。
【0013】
【化4】
【発明の効果】
【0014】
本発明によれば、細胞内のＬＬＰＳの動態又は物性を評価可能な蛍光プローブ、前記蛍光プローブを用いた液相の極性及び粘性を評価する方法、並びに前記蛍光プローブに用いられる化合物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】液相の粘性及び極性と、化合物（Ｐ）のモノマー発光及びエキシマー発光との関係を示す模式図である。
【図2】各種溶媒中での化合物（Ｐｙｒ－Ａ）の蛍光スペクトルを示す。励起波長３５８ｎｍ。
【図3】各種溶媒のＥＴ（３０）に対して、モノマー発光（検出波長４００ｎｍ）の蛍光強度とエキシマー発光（検出波長４７０ｎｍ）の蛍光強度との合計値に対するエキシマー発光の蛍光強度の割合を示す値［Ｉ４７０（Ｉ４００／Ｉ４７０）］をプロットしたグラフである。
【図4】メタノールとポリエチレングリコール４０００（ＰＥＧ４０００）との混合溶媒（ＰＥＧ４０００濃度：０ｇＬ－１、２５ｇＬ－１、５０ｇＬ－１、１００ｇＬ－１）中での化合物（Ｐｙｒ－Ａ）の蛍光スペクトルを示す。励起波長３５８ｎｍ。
【図5】化合物（Ｐｙｒ－Ａ）の存在下（＋）及び非存在下（－）で、ＢＲＤ４－ＩＤＲ－ｍＥＧＦＰの液滴を形成させて撮像した蛍光顕微鏡画像を示す。
【図6】ＢＲＤ４－ＩＤＲ－ｍＥＧＦＰの液滴サイズに対して、エキシマー発光（蛍光（ｅ））とモノマー発光（蛍光（ｍ））との蛍光強度比（蛍光（ｅ）／蛍光（ｍ））をプロットしたグラフである。Ｐｅａｒｓｏｎ ｒ＝－０．８３、ｐ＝０．０１１。
【図7A】化合物（Ｐｙｒ－Ａ）で処理した細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。間期（上段）及び有糸分裂期（下段）の細胞を用いた。
【図7B】有糸分裂期における中心体の成熟を模式的に示す図である。
【図8】中心体におけるエキシマー発光（蛍光（ｅ））とモノマー発光（蛍光（ｍ））との蛍光強度比（蛍光（ｅ）／蛍光（ｍ））を解析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0016】
「芳香族炭化水素基」は、芳香環を少なくとも１つ有する炭化水素基を意味する。芳香環は、４ｎ＋２個のπ電子をもつ環状共役系であれば特に限定されず、単環式でもよいし、多環式でもよい。
「脂肪族炭化水素基」とは、芳香環を含まない炭化水素基を意味する。
「置換基を有してもよい」と記載する場合、水素原子（－Ｈ）を１価の基で置換する場合と、メチレン基（－ＣＨ２－）を２価の基で置換する場合との両方を含む。
本明細書及び本特許請求の範囲において、化学式で表される構造によっては、不斉炭素が存在し、エナンチオ異性体（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ）やジアステレオ異性体（ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒ）が存在し得るものがある。その場合は一つの化学式でそれら異性体を代表して表す。それらの異性体は単独で用いてもよいし、混合物として用いてもよい。
「脂肪族炭化水素基」とは、芳香環を含まない炭化水素基を意味する。
「置換基を有してもよい」と記載する場合、水素原子（－Ｈ）を１価の基で置換する場合と、メチレン基（－ＣＨ２－）を２価の基で置換する場合との両方を含む。
本明細書及び本特許請求の範囲において、化学式で表される構造によっては、不斉炭素が存在し、エナンチオ異性体（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ）やジアステレオ異性体（ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒ）が存在し得るものがある。その場合は一つの化学式でそれら異性体を代表して表す。それらの異性体は単独で用いてもよいし、混合物として用いてもよい。
【0017】
［蛍光プローブ］
本発明の第１の態様は、下記一般式（ｐ）で表される化合物（Ｐ）からなる、液相の極性及び粘性を評価するための蛍光プローブ（以下、「蛍光プローブ（Ｐ）」ともいう）である。
本発明の第１の態様は、下記一般式（ｐ）で表される化合物（Ｐ）からなる、液相の極性及び粘性を評価するための蛍光プローブ（以下、「蛍光プローブ（Ｐ）」ともいう）である。
【0018】
【化5】
【0019】
前記式（ｐ）中、Ｐｙ１は、ピレンから（ｎ１＋１）個の水素原子を除いた基を表す。Ｐｙ２は、ピレンから（ｎ２＋１）個の水素原子を除いた基を表す。
ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立に、１～９の整数を表す。ｎ１及びｎ２は、１～５の整数が好ましく、１～３の整数がより好ましく、１又は２がさらに好ましく、１が特に好ましい。ｎ１及びｎ２は、同じであってもよく、異なっていてもよい。合成容易性の観点から、ｎ１及びｎ２は、同じであることが好ましい。
ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立に、１～９の整数を表す。ｎ１及びｎ２は、１～５の整数が好ましく、１～３の整数がより好ましく、１又は２がさらに好ましく、１が特に好ましい。ｎ１及びｎ２は、同じであってもよく、異なっていてもよい。合成容易性の観点から、ｎ１及びｎ２は、同じであることが好ましい。
【0020】
前記式（ｐ）中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、１価の有機基を表す。前記１価の有機基としては、置換基を有してもよい炭化水素基が挙げられる。前記炭化水素基は、脂肪族炭化水素基であってもよく、芳香族炭化水素基であってもよい。
【0021】
Ｒ１及びＲ２における１価の有機基が、置換基を有してもよい脂肪族炭化水素基である場合、前記脂肪族炭化水素基は、飽和であってもよく、不飽和であってもよい。前記脂肪族炭化水素基は、直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基であってもよく、環構造（脂肪族環）を含む脂肪族炭化水素基であってもよい。
【0022】
直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基は、炭化水素鎖を構成するメチレン基（－ＣＨ２－）の一部が２価の置換基で置換されてもよい。前記２価の置換基としては、例えば、－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（Ｈはアルキル基、アシル基等の置換基で置換されていてもよい。）、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、－Ｓ（＝Ｏ）２－Ｏ－等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0023】
環構造を含む脂肪族炭化水素基が含む脂肪族環は、単環式基であってもよく、多環式基であってもよい。前記脂肪族環は、炭化水素環であってもよく、ヘテロ原子を含む複素環であってもよい。前記ヘテロ原子としては、例えば、酸素原子、窒素原子、硫黄原子等が挙げられる。前記脂肪族環は、炭素原子数３～１０が好ましく、炭素原子数３～８がより好ましく、炭素原子数３～６がさらに好ましい。脂肪族環の炭素原子数には、置換基の炭素原子数を含まないものとする。
環構造を含む脂肪族炭化水素基としては、脂肪族炭化水素環又は脂肪族複素環から１個の水素原子を除いた基；脂肪族炭化水素環又は脂肪族複素環から１個の水素原子を除いた基の水素原子の一部が直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基に置換された基；脂肪族炭化水素環又は脂肪族複素環が直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基の末端に結合した基；脂肪族炭化水素環又は脂肪族複素環が直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基の途中に介在する基等が挙げられる。直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基としては、上記と同様のものが挙げられる。
環構造を含む脂肪族炭化水素基としては、脂肪族炭化水素環又は脂肪族複素環から１個の水素原子を除いた基；脂肪族炭化水素環又は脂肪族複素環から１個の水素原子を除いた基の水素原子の一部が直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基に置換された基；脂肪族炭化水素環又は脂肪族複素環が直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基の末端に結合した基；脂肪族炭化水素環又は脂肪族複素環が直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基の途中に介在する基等が挙げられる。直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基としては、上記と同様のものが挙げられる。
【0024】
Ｒ１及びＲ２における１価の有機基が、置換基を有してもよい芳香族炭化水素基である場合、前記芳香族炭化水素基が含む芳香環は、芳香族炭化水環であってもよく、芳香族複素環であってもよい。芳香族複素環が含むヘテロ原子としては、酸素原子、窒素原子、硫黄原子等が挙げられる。芳香環は、単環であってもよく、多環であってもよい。
芳香環の炭素原子数は５～３０であることが好ましく、炭素原子数５～２０がより好ましく、炭素原子数６～１５がさらに好ましく、炭素原子数６～１２が特に好ましい。芳香環の炭素原子数には、置換基の炭素原子数を含まないものとする。
芳香族炭化水素基として、芳香族炭化水素環又は芳香族複素環から１個の水素原子を除いた基；芳香族炭化水素環又は芳香族複素環から１個の水素原子を除いた基の水素原子の一部が直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基に置換された基；芳香族炭化水素環又は芳香族複素環が直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基の末端に結合した基；芳香族炭化水素環又は芳香族複素環が直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基の途中に介在する基等が挙げられる。直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基としては、上記と同様のものが挙げられる。
芳香環の炭素原子数は５～３０であることが好ましく、炭素原子数５～２０がより好ましく、炭素原子数６～１５がさらに好ましく、炭素原子数６～１２が特に好ましい。芳香環の炭素原子数には、置換基の炭素原子数を含まないものとする。
芳香族炭化水素基として、芳香族炭化水素環又は芳香族複素環から１個の水素原子を除いた基；芳香族炭化水素環又は芳香族複素環から１個の水素原子を除いた基の水素原子の一部が直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基に置換された基；芳香族炭化水素環又は芳香族複素環が直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基の末端に結合した基；芳香族炭化水素環又は芳香族複素環が直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基の途中に介在する基等が挙げられる。直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基としては、上記と同様のものが挙げられる。
【0025】
前記脂肪族炭化水素基及び前記芳香族炭化水素基は、水素原子の一部が１価の置換基で置換されてもよい。前記１価の置換基は、特に限定されない。前記１価の置換基としては、例えば、アミノ基、ヒドロキシ基、ニトロ基、ニトリル基、カルボキシ基、オキソ基、チオール基、アルコキシ基、アシル基等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0026】
Ｒ１及びＲ２は、同じであってもよく、異なっていてもよい。合成容易性の観点から、Ｒ１及びＲ２は、同じであることが好ましい。
【0027】
Ｒ１及びＲ２は、上記の直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基、環構造を脂肪族炭化水素基、及び芳香族炭化水素基が組み合わされたものであってもよい。
Ｒ１及びＲ２は、置換基を有してもよい、直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基を含むことが好ましい。前記直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基は、炭化水素鎖を構成するメチレン基（－ＣＨ２－）の一部が、親水性を付与する２価の置換基で置換されていることが好ましい。前記２価の置換基としては、例えば、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（Ｈはアルキル基、アシル基等の置換基で置換されていてもよい。）、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、又は－Ｓ（＝Ｏ）２－Ｏ－等が挙げられる。前記２価の置換基としては、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－が好ましく、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－がより好ましく、－Ｏ－がさらに好ましい。直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基は、直鎖状の脂肪族炭化水素基であることが好ましい。
Ｒ１及びＲ２は、置換基を有してもよい、直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基を含むことが好ましい。前記直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基は、炭化水素鎖を構成するメチレン基（－ＣＨ２－）の一部が、親水性を付与する２価の置換基で置換されていることが好ましい。前記２価の置換基としては、例えば、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－（Ｈはアルキル基、アシル基等の置換基で置換されていてもよい。）、－Ｓ－、－Ｓ（＝Ｏ）２－、又は－Ｓ（＝Ｏ）２－Ｏ－等が挙げられる。前記２価の置換基としては、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－が好ましく、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－がより好ましく、－Ｏ－がさらに好ましい。直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基は、直鎖状の脂肪族炭化水素基であることが好ましい。
【0028】
Ｒ１及びＲ２は、下記一般式（ｒ）で表される基が好ましい。
【0029】
【化6】
【0030】
式（ｒ）中、Ｙ０は置換基を有してもよい炭化水素基を表す。前記炭化水素基は、脂肪族炭化水素基であってもよく、芳香族炭化水素基であってもよい。脂肪族炭化水素基及び芳香族炭化水素基としては、上記Ｒ１及びＲ２における脂肪族炭化水素基及び芳香族炭化水素基とそれぞれ同様のものが挙げられる。
【0031】
Ｙ０における炭化水素基は、炭素原子数１～２０が好ましく、炭素原子数３～１５がより好ましく、炭素原子数６～１０がより好ましい。Ｙ０は、芳香族炭化水素基が好ましく、芳香環と直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基が結合した基がより好ましく、芳香環と直鎖状の脂肪族炭化水素基が結合した基がより好ましい。Ｙ０が芳香族炭化水素基である場合、Ｙ０が含む芳香環の数は特に限定されないが、１～３個が好ましく、１又は２個がより好ましく、１個がさらに好ましい。Ｙ０が芳香環と直鎖状の脂肪族炭化水素基が結合した基である場合、Ｙ０が含む直鎖状の脂肪族炭化水素基は、炭素原子数１～６が好ましく、炭素原子数１～３がより好ましく、炭素原子数１又は２がさらに好ましい。
【0032】
式（ｒ）中、Ｒ０は親水性基を表す。親水性基は、特に限定されない。親水性基としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ（２－オキサゾリン）、ポリビニルピロリドン、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリアミノ酸、ポリサッカライド等の親水性ポリマーを含む基が挙げられる。Ｒ０は、細胞透過性ペプチド（ポリアルギニン、ポリリジン、Ｔａｔペプチド等）を含む基であってもよい。蛍光プローブ（Ｐ）を細胞に適用する場合、Ｒ０は、生体適合性が高い基であることが好ましく、細胞膜透過性を有する基がより好ましい。細胞膜透過性を有する基としては、ポリエチレングリコール基が好ましい。
【0033】
前記式（ｐ）中、Ｌは２価の有機基を表す。前記２価の有機基は、炭素原子数５～５０が好ましく、炭素原子数６～４０がより好ましく、炭素原子数８～３０がさらに好ましい。前記２価の有機基としては、置換基を有してもよい２価の炭化水素基が挙げられる。前記炭化水素基は、脂肪族炭化水素基であってもよく、芳香族炭化水素基であってもよい。
【0034】
Ｌにおける２価の有機基が、置換基を有してもよい脂肪族炭化水素基である場合、前記脂肪族炭化水素基は、飽和であってもよく、不飽和であってもよい。前記脂肪族炭化水素基は、直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基であってもよく、環構造（脂肪族環）を含む脂肪族炭化水素基であってもよい。
【0035】
直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基は、炭化水素鎖を構成するメチレン基（－ＣＨ２－）の一部が２価の置換基で置換されてもよい。前記２価の置換基としては、上記と同様のものが挙げられる。
【0036】
環構造を含む脂肪族炭化水素基が含む脂肪族環は、単環式基であってもよく、多環式基であってもよい。前記脂肪族環は、炭化水素環であってもよく、ヘテロ原子を含む複素環であってもよい。前記ヘテロ原子としては、例えば、酸素原子、窒素原子、硫黄原子等が挙げられる。前記脂肪族環は、炭素原子数３～１０が好ましく、炭素原子数３～８がより好ましく、炭素原子数３～６がさらに好ましい。脂肪族環の炭素原子数には、置換基の炭素原子数を含まないものとする。
環構造を含む脂肪族炭化水素基としては、脂肪族炭化水素環又は脂肪族複素環から２個の水素原子を除いた基；脂肪族炭化水素環又は脂肪族複素環から１個の水素原子を除いた基の水素原子の一部が直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基に置換された基；脂肪族炭化水素環又は脂肪族複素環が直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基の途中に介在する基等が挙げられる。直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基としては、上記と同様のものが挙げられる。
環構造を含む脂肪族炭化水素基としては、脂肪族炭化水素環又は脂肪族複素環から２個の水素原子を除いた基；脂肪族炭化水素環又は脂肪族複素環から１個の水素原子を除いた基の水素原子の一部が直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基に置換された基；脂肪族炭化水素環又は脂肪族複素環が直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基の途中に介在する基等が挙げられる。直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基としては、上記と同様のものが挙げられる。
【0037】
Ｌにおける２価の有機基が、置換基を有してもよい芳香族炭化水素基である場合、前記芳香族炭化水素基が含む芳香環は、芳香族炭化水環であってもよく、芳香族複素環であってもよい。芳香族複素環が含むヘテロ原子としては、酸素原子、窒素原子、硫黄原子等が挙げられる。芳香環は、単環であってもよく、多環であってもよい。
芳香環の炭素原子数は５～３０であることが好ましく、炭素原子数５～２０がより好ましく、炭素原子数６～１５がさらに好ましく、炭素原子数６～１２が特に好ましい。芳香環の炭素原子数には、置換基の炭素原子数を含まないものとする。
芳香族炭化水素基として、芳香族炭化水素環又は芳香族複素環から２個の水素原子を除いた基；芳香族炭化水素環又は芳香族複素環から１個の水素原子を除いた基の水素原子の一部が直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基に置換された基；芳香族炭化水素環又は芳香族複素環が直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基の途中に介在する基等が挙げられる。直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基としては、上記と同様のものが挙げられる。
芳香環の炭素原子数は５～３０であることが好ましく、炭素原子数５～２０がより好ましく、炭素原子数６～１５がさらに好ましく、炭素原子数６～１２が特に好ましい。芳香環の炭素原子数には、置換基の炭素原子数を含まないものとする。
芳香族炭化水素基として、芳香族炭化水素環又は芳香族複素環から２個の水素原子を除いた基；芳香族炭化水素環又は芳香族複素環から１個の水素原子を除いた基の水素原子の一部が直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基に置換された基；芳香族炭化水素環又は芳香族複素環が直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基の途中に介在する基等が挙げられる。直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基としては、上記と同様のものが挙げられる。
【0038】
前記脂肪族炭化水素基及び前記芳香族炭化水素基は、水素原子の一部が１価の置換基で置換されてもよい。前記１価の置換基としては、上記と同様のものが挙げられる。
【0039】
Ｌは、上記の直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基、環構造を脂肪族炭化水素基、及び芳香族炭化水素基が組み合わされたものであってもよい。
Ｌは、置換基を有してもよい、直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基を含むことが好ましい。前記直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基は、炭化水素鎖を構成するメチレン基（－ＣＨ２－）の一部が、親水性を付与する２価の置換基で置換されていることが好ましい。前記２価の置換基としては、上記と同様のものが挙げられる。前記２価の置換基としては、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－が好ましく、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－がより好ましく、－Ｏ－がさらに好ましい。
Ｌは、置換基を有してもよい、直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基を含むことが好ましい。前記直鎖状若しくは分岐鎖状の脂肪族炭化水素基は、炭化水素鎖を構成するメチレン基（－ＣＨ２－）の一部が、親水性を付与する２価の置換基で置換されていることが好ましい。前記２価の置換基としては、上記と同様のものが挙げられる。前記２価の置換基としては、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－が好ましく、－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－がより好ましく、－Ｏ－がさらに好ましい。
【0040】
化合物（Ｐ）は、下記一般式（ｐ－１）で表される化合物が好ましい。
【0041】
【化7】
【0042】
式中、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、１価の有機基を表す。前記１価の有機基としては、前記Ｒ１及びＲ２における１価の有機基と同様のものが挙げられる。
【0043】
式中、Ｌ１は２価の有機基を表す。前記２価の有機基としては、前記Ｌ１における２価の有機基と同様のものが挙げられる。
【0044】
化合物（Ｐ）の具体例を以下に示すが、これに限定されない。
【0045】
【化8】
【0046】
前記式（Ｐｙｒ－Ａ）中、ＰＥＧは、ポリエチレングリコール基を表す。ＰＥＧで表されるポリエチレングリコール基は、ポリエチレングリコールから誘導される。前記ポリエチレングリコール基を誘導するポリエチレングリコールの数平均分子量（Ｍｎ）は、特に限定されないが、２００～４０００が好ましく、４００～２０００がより好ましく、６００～１５００がさらに好ましく、８００～１０００が特に好ましい。
【0047】
＜化合物（Ｐ）の合成方法＞
化合物（Ｐ）は、公知の化学反応を組み合わせて合成することができる。化合物（Ｐ）の合成方法の一例を以下に示す。下記反応式中、Ｐｙ１、Ｒ１、ｎ１、Ｐｙ２、Ｒ２、及びｎ２は、前記式（ｐ）におけるものと同様である。
化合物（Ｐ）は、公知の化学反応を組み合わせて合成することができる。化合物（Ｐ）の合成方法の一例を以下に示す。下記反応式中、Ｐｙ１、Ｒ１、ｎ１、Ｐｙ２、Ｒ２、及びｎ２は、前記式（ｐ）におけるものと同様である。
【0048】
まず、化合物（ａ１）を化合物（ｃ１）と反応させて、化合物（ｂ１）を得る（Ｒｅａｃｔｉｏｎ １）。反応は、例えば、トルエン／エタノールの混合溶媒中で、Ｋ２ＣＯ３等による塩基性条件下、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｐｄ（ＰＰｈ３）４）等の触媒を用いて行うことができる。
【0049】
【化9】
【0050】
同様に、化合物（ａ２）を化合物（ｃ２）と反応させて、化合物（ｂ２）を得る（Ｒｅａｃｔｉｏｎ ２）。反応は、例えば、トルエン／エタノール混合溶媒等の有機溶媒中で、炭酸カリウム等による塩基性条件下Ｐｄ（ＰＰｈ３）４等のパラジウム触媒を用いて行うことができる。
【0051】
【化10】
【0052】
化合物（ｄ）を化合物（ｅ）と反応させて、化合物（ｆ）を得る（Ｒｅａｃｔｉｏｎ ３）。反応は、例えば、ジオキサン等の有機溶媒中で、酢酸カリウム等による塩基性条件下、［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（Ｐｄ（ｄｐｐｆ）２Ｃｌ２）等のパラジウム触媒を用いて行うことができる。
【0053】
【化11】
【0054】
次に、化合物（ｆ）を、化合物（ｂ１）及び化合物（ｂ２）と反応させることにより、一般式（ｐ）で表される化合物（Ｐ）を得ることができる（Ｒｅａｃｔｉｏｎ ４）。反応は、例えば、トルエン／エタノール混合溶媒等の有機溶媒中で、炭酸カリウム等による塩基性条件下、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４等のパラジウム触媒を用いて行うことができる。
【0055】
【化12】
【0056】
式（ｐ）中、（Ｒ１）ｎ１－Ｐｙ１－と（Ｒ２）ｎ２－Ｐｙ２－とが、同一の基である場合、Ｒｅａｃｔｉｏｎ １とＲｅａｃｔｉｏｎ ２とは同一の反応となる。
【0057】
式（ｐ）中のＲ１に、ポリエチレングリコール基等の親水性ポリマーを導入する場合、Ｒｅａｃｔｉｏｎ １において、化合物（ｃ１）に替えて化合物（ｃ１’）を用いてもよい。同様に、式（ｐ）中のＲ２に、ポリエチレングリコール基等の親水性ポリマーを導入する場合、Ｒｅａｃｔｉｏｎ ２において、化合物（ｃ２）に替えて化合物（ｃ２’）を用いてもよい。
【0058】
【化13】
【0059】
前記式（ｃ１’）及び（ｃ２’）中のＹ０１及びＹ０２は、前記式（ｒ）中のＹ０と同様である。
前記式（ｃ１’）及び（ｃ２’）中、Ｘは、官能基である。Ｘにおける官能基は、親水性ポリマーの導入に使用され得る。Ｘの具体例としては、例えば、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基、アジド基、アルキニル基、チオール基等が挙げられる。
前記式（ｃ１’）及び（ｃ２’）中、Ｘは、官能基である。Ｘにおける官能基は、親水性ポリマーの導入に使用され得る。Ｘの具体例としては、例えば、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基、アジド基、アルキニル基、チオール基等が挙げられる。
【0060】
Ｒｅａｃｔｉｏｎ ４の後、前記式（ｃ１’）及び（ｃ２’）中のＸで表される官能基を利用して、式（ｐ）で表される化合物（Ｐ）に親水性ポリマーを導入することができる。
【0061】
化合物（Ｐ）は、ピレン環を含む２個の原子団（（Ｒ１）ｎ１－Ｒｙ１－、及び（Ｒ２）ｎ２－Ｒｙ２－）が、リンカー（Ｌ）で結合した構造を有している。化合物（Ｐ）は、液相中において、液相の物性に応じて、分子内の２個のピレン環が会合してエキシマーを形成した状態と、２個のピレン環が解離した状態とに変化する。「エキシマー発光」は、化合物（Ｐ）の２個のピレン環がエキシマーを形成した状態で発生する蛍光である。「モノマー発光」は、化合物（Ｐ）の２個のピレン環がエキシマーを形成していない状態（２個のピレン環が解離した状態）で発生する蛍光である。
【0062】
図１に示すように、液相中に存在する化合物（Ｐ）は、液相の粘性が高くなるとエキシマーを形成しない分子の割合が高くなる。そのため、粘性の高い液相では、モノマー発光の蛍光強度が大きくなる。一方、液相中に存在する化合物（Ｐ）は、液相の粘性が低くなると、エキシマーを形成する分子の割合が高くなる。そのため、粘性の低い液相では、エキシマー発光の蛍光強度が大きくなる。
液相中に存在する化合物（Ｐ）は、液相の極性が低くなるとエキシマーを形成しない分子の割合が高くなる。そのため、極性の低い液相では、モノマー発光の蛍光強度が大きくなる。一方、液相中に存在する化合物（Ｐ）は、液相の極性が高くなると、エキシマーを形成する分子の割合が高くなる。そのため、極性の高い液相では、エキシマー発光の蛍光強度が大きくなる。
化合物（Ｐ）は、上記のような性質を有することから、化合物（Ｐ）からなる蛍光プローブは、液相の粘性及び極性を評価するために使用することができる。
液相中に存在する化合物（Ｐ）は、液相の極性が低くなるとエキシマーを形成しない分子の割合が高くなる。そのため、極性の低い液相では、モノマー発光の蛍光強度が大きくなる。一方、液相中に存在する化合物（Ｐ）は、液相の極性が高くなると、エキシマーを形成する分子の割合が高くなる。そのため、極性の高い液相では、エキシマー発光の蛍光強度が大きくなる。
化合物（Ｐ）は、上記のような性質を有することから、化合物（Ｐ）からなる蛍光プローブは、液相の粘性及び極性を評価するために使用することができる。
【0063】
化合物（Ｐ）は、前記式（ｐ）中のＲ１及びＲ２に親水性基（好ましくは、親水性ポリマーを含む基）を導入することにより、細胞膜透過性を向上させることができる。そのため、Ｒ１及びＲ２に親水性基が導入された化合物（Ｐ）からなる蛍光プローブ（Ｐ）は、細胞内に存在する液相の粘性及び極性を評価するために用いることができる。
ＬＬＰＳは、溶液中の溶質が均一に混ざり合わず、熱力学的な安定性に従って溶液が２相に分離する現象である。ＬＬＰＳにより溶質が濃縮されると、溶液の粘性及び極性が変化する。このようなＬＬＰＳによる溶液特性の変化についても、蛍光プローブ（Ｐ）のエキシマー発光及びモノマー発光を測定することにより、評価することができる。
細胞内では、ＬＬＰＳは細胞膜のないオルガネラの形成に関与し、様々な生命反応の足場を提供している。蛍光プローブ（Ｐ）を細胞に取り込ませ、蛍光プローブ（Ｐ）のエキシマー発光及びモノマー発光を測定することにより、細胞内ＬＬＰＳの動態及び物性を簡易に評価することができる。
ＬＬＰＳは、溶液中の溶質が均一に混ざり合わず、熱力学的な安定性に従って溶液が２相に分離する現象である。ＬＬＰＳにより溶質が濃縮されると、溶液の粘性及び極性が変化する。このようなＬＬＰＳによる溶液特性の変化についても、蛍光プローブ（Ｐ）のエキシマー発光及びモノマー発光を測定することにより、評価することができる。
細胞内では、ＬＬＰＳは細胞膜のないオルガネラの形成に関与し、様々な生命反応の足場を提供している。蛍光プローブ（Ｐ）を細胞に取り込ませ、蛍光プローブ（Ｐ）のエキシマー発光及びモノマー発光を測定することにより、細胞内ＬＬＰＳの動態及び物性を簡易に評価することができる。
【0064】
［液相の極性及び粘性を評価する方法］
本発明の第２の態様は、前記第１の態様の蛍光プローブを用いて、液相の極性及び粘性を評価する方法である。本態様の方法は、対象試料中で、前記蛍光プローブのモノマー発光による蛍光（ｍ）を測定する工程（ｉ）と、前記対象試料中で、前記蛍光プローブのエキシマー発光による蛍光（ｅ）を測定する工程（ｉｉ）と、を含む。
本発明の第２の態様は、前記第１の態様の蛍光プローブを用いて、液相の極性及び粘性を評価する方法である。本態様の方法は、対象試料中で、前記蛍光プローブのモノマー発光による蛍光（ｍ）を測定する工程（ｉ）と、前記対象試料中で、前記蛍光プローブのエキシマー発光による蛍光（ｅ）を測定する工程（ｉｉ）と、を含む。
【0065】
（工程（ｉ））
工程（ｉ）では、対象試料中で、蛍光プローブ（Ｐ）のモノマー発光による蛍光（ｍ）を測定する。
工程（ｉ）では、対象試料中で、蛍光プローブ（Ｐ）のモノマー発光による蛍光（ｍ）を測定する。
【0066】
対象試料は、極性及び粘性の評価対象となる試料である。対象試料は、液相を含む試料であれば、特に限定されない。対象試料としては、例えば、細胞、高分子化合物溶液等が挙げられる。前記細胞は、由来する生物種は特に限定されない。細胞は、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、原生生物細胞、及び細菌細胞のいずれであってもよい。前記高分子化合物溶液が含む高分子化合物としては、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖などの生体高分子；合成ポリマー等が挙げられる。対象試料は、ＬＬＰＳが生じる試料が好ましい。
【0067】
蛍光プローブ（Ｐ）を対象試料に添加し、蛍光プローブ（Ｐ）のモノマー発光による蛍光（ｍ）を測定する。対象試料が細胞である場合、蛍光プローブ（Ｐ）を含む培地で培養することにより、蛍光プローブ（Ｐ）を細胞に取り込ませる。培養時間は、特に限定されないが、例えば、１５分以上、３０分以上、４５分以上、又は６０分以上が挙げられる。培養時間の上限は、特に限定されないが、例えば、１８０分以下、１５０分以下、１２０分以下、又は１００分以下等が挙げられる。
【0068】
蛍光プローブ（Ｐ）を含む対象試料に、励起光を照射し、モノマー発光による蛍光（ｍ）を測定する。励起光の波長は、化合物（Ｐ）の構造に応じて設定することができる。励起光の波長としては、例えば、３００～４００ｎｍが挙げられる。励起光の波長は、３４０～３８０ｎｍが好ましい。励起光の波長の具体例としては、３５８ｎｍが挙げられる。
モノマー発光による蛍光（ｍ）の測定に用いる波長は、化合物（Ｐ）の構造に応じて設定することができる。蛍光（ｍ）の測定に用いる波長としては、例えば、３８０～４２０ｎｍが挙げられ、３９０～４１０ｎｍが好ましい。蛍光（ｍ）の測定に用いる波長の具体例としては、４００ｎｍが挙げられる。
モノマー発光による蛍光（ｍ）の測定に用いる波長は、化合物（Ｐ）の構造に応じて設定することができる。蛍光（ｍ）の測定に用いる波長としては、例えば、３８０～４２０ｎｍが挙げられ、３９０～４１０ｎｍが好ましい。蛍光（ｍ）の測定に用いる波長の具体例としては、４００ｎｍが挙げられる。
【0069】
（工程（ｉｉ））
工程（ｉｉ）では、対象試料中で、蛍光プローブ（Ｐ）のエキシマー発光による蛍光（ｅ）を測定する。
工程（ｉｉ）では、対象試料中で、蛍光プローブ（Ｐ）のエキシマー発光による蛍光（ｅ）を測定する。
【0070】
対象試料は、工程（ｉ）の試料と同じである。対象試料の液相中に蛍光プローブ（Ｐ）を存在させた後、工程（ｉ）の前、工程（ｉ）の後、又は工程（ｉ）と同時に、工程（ｉｉ）を行うことができる。
【0071】
蛍光プローブ（Ｐ）を含む対象試料に、励起光を照射し、エキシマー発光による蛍光（ｅ）を測定する。励起光は、工程（ｉ）と同じ波長を用いることができる。
エキシマー発光による蛍光（ｅ）の測定に用いる波長は、化合物（Ｐ）の構造に応じて設定することができる。蛍光（ｅ）の測定に用いる波長としては、例えば、４５０～４９０ｎｍが挙げられ、４６０～４８０ｎｍが好ましい。蛍光（ｅ）の測定に用いる波長の具体例としては、４７０ｎｍが挙げられる。
エキシマー発光による蛍光（ｅ）の測定に用いる波長は、化合物（Ｐ）の構造に応じて設定することができる。蛍光（ｅ）の測定に用いる波長としては、例えば、４５０～４９０ｎｍが挙げられ、４６０～４８０ｎｍが好ましい。蛍光（ｅ）の測定に用いる波長の具体例としては、４７０ｎｍが挙げられる。
【0072】
蛍光プローブ（Ｐ）は、液相の粘度が高くなると蛍光（ｍ）の蛍光強度が高くなり、液相の粘度が低くなると蛍光（ｅ）の蛍光強度が高くなる。蛍光プローブ（Ｐ）は、液相の極性が高くなると蛍光（ｅ）の蛍光強度が高くなり、液相の極性が低くなると蛍光（ｍ）の蛍光強度が高くなる。
したがって、モノマー発光による蛍光（ｍ）及びエキシマー発光による蛍光（ｅ）の蛍光強度に基づいて、液相の粘性及び極性を評価することができる。
したがって、モノマー発光による蛍光（ｍ）及びエキシマー発光による蛍光（ｅ）の蛍光強度に基づいて、液相の粘性及び極性を評価することができる。
【0073】
（任意工程）
本態様の方法は、上記工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）に加えて、他の工程を含んでもよい。他の工程としては、例えば、前記工程（ｉ）で測定された蛍光（ｍ）と、前記工程（ｉｉ）で測定された蛍光（ｅ）との蛍光強度比に基づいて、液相の極性及び粘性を評価する工程（ｉｉｉ）が挙げられる。
本態様の方法は、上記工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）に加えて、他の工程を含んでもよい。他の工程としては、例えば、前記工程（ｉ）で測定された蛍光（ｍ）と、前記工程（ｉｉ）で測定された蛍光（ｅ）との蛍光強度比に基づいて、液相の極性及び粘性を評価する工程（ｉｉｉ）が挙げられる。
【0074】
蛍光（ｍ）と蛍光（ｅ）との蛍光強度比を算出することにより、液相の極性及び粘性をより的確に把握することができる。蛍光強度比は、蛍光（ｍ）に対する蛍光（ｅ）の比（蛍光（ｅ）／蛍光（ｍ））であってもよく、蛍光（ｅ）に対する蛍光（ｍ）の比（蛍光（ｍ）／蛍光（ｅ））であってもよい。例えば、「蛍光（ｅ）／蛍光（ｍ）」の値が大きくなる場合、液相は低粘性、高極性であると評価することができる。「蛍光（ｅ）／蛍光（ｍ）」の値が小さくなる場合、液相は高粘性、低極性であると評価することができる。
例えば、「蛍光（ｍ）／蛍光（ｅ）」の値が大きくなる場合、液相は高粘性、低極性であると評価することができる。「蛍光（ｍ）／蛍光（ｅ）」の値が小さくなる場合、液相は低粘性、高極性であると評価することができる。
例えば、「蛍光（ｍ）／蛍光（ｅ）」の値が大きくなる場合、液相は高粘性、低極性であると評価することができる。「蛍光（ｍ）／蛍光（ｅ）」の値が小さくなる場合、液相は低粘性、高極性であると評価することができる。
【0075】
対象試料の液相に蛍光プローブ（Ｐ）を存在させた状態で、モノマー発光による蛍光（ｍ）及びエキシマー発光による蛍光（ｅ）を経時的に測定することで、液相の極性及び粘性の特性変化を経時的に追跡することができる。また、細胞に蛍光プローブ（Ｐ）を取り込ませて、蛍光（ｍ）及び蛍光（ｅ）を経時的に測定することで、細胞内のＬＬＰＳの動態を経時的に追跡することができる。
【0076】
［化合物］
本発明の第３の態様は、下記式（Ｐｙｒ－Ａ）で表される化合物（化合物（Ｐｙｒ－Ａ））である。
［式中、ＰＥＧは、ポリエチレングリコール基を表す。］
本発明の第３の態様は、下記式（Ｐｙｒ－Ａ）で表される化合物（化合物（Ｐｙｒ－Ａ））である。
【化14】
【0077】
化合物（Ｐｙｒ－Ａ）は、実施例に記載した方法により合成することができる。
化合物（Ｐｙｒ－Ａ）は、蛍光プローブ（Ｐ）として用いることができる。
化合物（Ｐｙｒ－Ａ）は、蛍光プローブ（Ｐ）として用いることができる。
【実施例0078】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0079】
［合成例］
（化合物（１）の合成）
１，６－ジブロモピレン（１．８０ｇ，５．０ｍｍｏｌ）、４－（ヒドロキシメチル）フェニルボロン酸（０．７６ｇ，５．０モｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２Ｍ水溶液，１３ｍＬ）及びトルエン（８０ｍＬ）の混合物を、窒素ガスで４０分間バブリングして脱酸素化した。混合物に、Ｐｄ（Ｐｐｈ３）４（２０８ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）を添加し、窒素ガスで１０分間バブリングして脱酸素化し、Ｎ２下で１００℃に加熱した。加熱中、脱酸素化したエタノール（１０ｍＬ）を混合物に添加した。２０時間加熱した後、得られた混合物を室温に冷却し、水中に滴下し、ＣＨ２Ｃｌ２の混合物で抽出した。有機層を水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、次いで蒸発乾燥固した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、淡黄色固体として化合物（１）を得た（１．０５ｇ，２，７ｍｍｏｌ，５４％）。
（化合物（１）の合成）
１，６－ジブロモピレン（１．８０ｇ，５．０ｍｍｏｌ）、４－（ヒドロキシメチル）フェニルボロン酸（０．７６ｇ，５．０モｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２Ｍ水溶液，１３ｍＬ）及びトルエン（８０ｍＬ）の混合物を、窒素ガスで４０分間バブリングして脱酸素化した。混合物に、Ｐｄ（Ｐｐｈ３）４（２０８ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）を添加し、窒素ガスで１０分間バブリングして脱酸素化し、Ｎ２下で１００℃に加熱した。加熱中、脱酸素化したエタノール（１０ｍＬ）を混合物に添加した。２０時間加熱した後、得られた混合物を室温に冷却し、水中に滴下し、ＣＨ２Ｃｌ２の混合物で抽出した。有機層を水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、次いで蒸発乾燥固した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、淡黄色固体として化合物（１）を得た（１．０５ｇ，２，７ｍｍｏｌ，５４％）。
【0080】
１Ｈ ＮＭＲにより、化合物（１）の構造を同定した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ ｓｔａｎｄａｒｄ）：δ（ｐｐｍ）１．７７（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ），４．８６（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２），７．５８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ，ＡｒＨ），７．６３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ，ＡｒＨ），７．９８（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ，ＡｒＨ），８．００（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ，ＡｒＨ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ，ＡｒＨ），８．１８（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ，ＡｒＨ），８．２１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ，ＡｒＨ），８．２５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ，ＡｒＨ），８．２７（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ，ＡｒＨ），８．４８（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ，ＡｒＨ）．
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ ｓｔａｎｄａｒｄ）：δ（ｐｐｍ）１．７７（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ，ＯＨ），４．８６（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２），７．５８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ，ＡｒＨ），７．６３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ，ＡｒＨ），７．９８（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ，ＡｒＨ），８．００（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ，ＡｒＨ），８．０１（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ，ＡｒＨ），８．１８（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ，ＡｒＨ），８．２１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ，ＡｒＨ），８．２５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ，ＡｒＨ），８．２７（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ，ＡｒＨ），８．４８（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ，ＡｒＨ）．
【0081】
【化15】
【0082】
（化合物（２）の合成）
Ｎ２下、ＴＨＦ（７０ｍＬ）中の２，２－ジブチル－１，３－プロパンジオール（３．８５ｇ，２０．５ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１５ｍＬ）中のＮａＨ（６０％ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｉｎ ｏｉｌ，２．４５ｇ，６１．４ｍｍｏｌ）に、０℃でゆっくりと添加した。混合物を０℃で１時間撹拌した後、ＴＨＦ（１５ｍＬ）中の４－ブロモベンジルブロミド（１５．３６ｇ，６１．４ｍｍｏｌ）を０℃でゆっくりと添加した。次いで、室温まで温めた。混合物に、脱水ＤＭＦ（５０ｍＬ）を添加し、室温で１週間撹拌した。得られた混合物を氷水に滴下し、ヘキサンおよび酢酸エチルの混合溶媒（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で抽出した。有機層を水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、次いで蒸発乾固した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン＝５／９５）で精製し、白色固体として化合物（２）を得た（６．８１ｇ，１２．９ｍｍｏｌ，６３％）。
Ｎ２下、ＴＨＦ（７０ｍＬ）中の２，２－ジブチル－１，３－プロパンジオール（３．８５ｇ，２０．５ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１５ｍＬ）中のＮａＨ（６０％ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｉｎ ｏｉｌ，２．４５ｇ，６１．４ｍｍｏｌ）に、０℃でゆっくりと添加した。混合物を０℃で１時間撹拌した後、ＴＨＦ（１５ｍＬ）中の４－ブロモベンジルブロミド（１５．３６ｇ，６１．４ｍｍｏｌ）を０℃でゆっくりと添加した。次いで、室温まで温めた。混合物に、脱水ＤＭＦ（５０ｍＬ）を添加し、室温で１週間撹拌した。得られた混合物を氷水に滴下し、ヘキサンおよび酢酸エチルの混合溶媒（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で抽出した。有機層を水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、次いで蒸発乾固した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン＝５／９５）で精製し、白色固体として化合物（２）を得た（６．８１ｇ，１２．９ｍｍｏｌ，６３％）。
【0083】
１Ｈ ＮＭＲにより、化合物（２）の構造を同定した。
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ ｓｔａｎｄａｒｄ）：δ（ｐｐｍ）０．８８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ３），１．０８－１．３２（ｍ，１２Ｈ，ＣＨ２），３．２５（ｓ，４Ｈ，ＣＨ２），４．４０（ｓ，４Ｈ，ＣＨ２），７．１５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，４Ｈ，ＡｒＨ），７．４３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，４Ｈ，ＡｒＨ）．
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ ｓｔａｎｄａｒｄ）：δ（ｐｐｍ）０．８８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ３），１．０８－１．３２（ｍ，１２Ｈ，ＣＨ２），３．２５（ｓ，４Ｈ，ＣＨ２），４．４０（ｓ，４Ｈ，ＣＨ２），７．１５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，４Ｈ，ＡｒＨ），７．４３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，４Ｈ，ＡｒＨ）．
【0084】
【化16】
【0085】
（化合物（３）の合成）
化合物（２）（１．０５ｇ，２．０ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラート）ジボロン（１．１２ｇ，４．４ｍｍｏｌ）、酢酸カリウム（１．３０ｇ，１３．２ｍｍｏｌ）、及びジオキサン（１４ｍＬ）の混合物を、窒素ガスで４０分間バブリングして脱酸素化した。混合物に、［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）ジクロロメタン付加物（５０ｍｇ）を添加し、窒素ガスで２０分間バブリングして脱酸素化し、Ｎ２下で８０℃に加熱した。追加のＰｄ触媒（５０ｍｇ）及びビス（ピナコラート）ジボロン（６７ｍｇ）を混合物に添加した。３０分間加熱した後、得られた混合物を室温に冷却し、水中に滴下し、ヘキサン及び酢酸エチルの混合溶媒（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で抽出した。有機層をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、次いで蒸発乾固した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５）で精製し、透明オイルとして化合物（３）を得た（０．５６ｇ，０．９ｍｍｏｌ，４５％）。
化合物（２）（１．０５ｇ，２．０ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラート）ジボロン（１．１２ｇ，４．４ｍｍｏｌ）、酢酸カリウム（１．３０ｇ，１３．２ｍｍｏｌ）、及びジオキサン（１４ｍＬ）の混合物を、窒素ガスで４０分間バブリングして脱酸素化した。混合物に、［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）ジクロロメタン付加物（５０ｍｇ）を添加し、窒素ガスで２０分間バブリングして脱酸素化し、Ｎ２下で８０℃に加熱した。追加のＰｄ触媒（５０ｍｇ）及びビス（ピナコラート）ジボロン（６７ｍｇ）を混合物に添加した。３０分間加熱した後、得られた混合物を室温に冷却し、水中に滴下し、ヘキサン及び酢酸エチルの混合溶媒（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）で抽出した。有機層をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、次いで蒸発乾固した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５）で精製し、透明オイルとして化合物（３）を得た（０．５６ｇ，０．９ｍｍｏｌ，４５％）。
【0086】
１Ｈ ＮＭＲにより、化合物（３）の構造を同定した。
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ ｓｔａｎｄａｒｄ）：δ（ｐｐｍ）０．８７（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ３），１．０８－１．３０（ｍ，１２Ｈ，ＣＨ２），１．３４（ｓ，２４Ｈ，ＣＨ３），３．２６（ｓ，４Ｈ，ＣＨ２），４．４８（ｓ，４Ｈ，ＣＨ２），７．３１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，４Ｈ，ＡｒＨ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，４Ｈ，ＡｒＨ）．
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ ｓｔａｎｄａｒｄ）：δ（ｐｐｍ）０．８７（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ３），１．０８－１．３０（ｍ，１２Ｈ，ＣＨ２），１．３４（ｓ，２４Ｈ，ＣＨ３），３．２６（ｓ，４Ｈ，ＣＨ２），４．４８（ｓ，４Ｈ，ＣＨ２），７．３１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，４Ｈ，ＡｒＨ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，４Ｈ，ＡｒＨ）．
【0087】
【化17】
【0088】
（化合物（４）の合成）
化合物（３）（４００ｍｇ，０．６４ｍｍｏｌ）、化合物（１）（５４８ｍｇ，１．４１ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２Ｍの水溶液，２ｍＬ）エタノール（２ｍＬ）、及びトルエン（４ｍＬ）の混合物を、窒素ガスで３０分間バブリングして脱酸素化した。混合物に、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（４５ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）を添加し、窒素ガスで２０分間バブリングして脱酸素化し、Ｎ２下で１５時間還流した。得られた混合物を室温に冷却し、ろ過した。残留物を水、メタノール及びＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、真空乾燥し、淡黄色固体として化合物（４）を得た（５３１ｍｇ，０．５４ｍｍｏｌ，８４％）。
化合物（３）（４００ｍｇ，０．６４ｍｍｏｌ）、化合物（１）（５４８ｍｇ，１．４１ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２Ｍの水溶液，２ｍＬ）エタノール（２ｍＬ）、及びトルエン（４ｍＬ）の混合物を、窒素ガスで３０分間バブリングして脱酸素化した。混合物に、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（４５ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）を添加し、窒素ガスで２０分間バブリングして脱酸素化し、Ｎ２下で１５時間還流した。得られた混合物を室温に冷却し、ろ過した。残留物を水、メタノール及びＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、真空乾燥し、淡黄色固体として化合物（４）を得た（５３１ｍｇ，０．５４ｍｍｏｌ，８４％）。
【0089】
１Ｈ ＮＭＲにより、化合物（４）の構造を同定した。
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６，ＴＭＳ ｓｔａｎｄａｒｄ）：δ（ｐｐｍ）０．９２（ｂｒ－ｔ，６Ｈ，ＣＨ３），１．２０－１．３８（ｍ，１２Ｈ，ＣＨ２），３．４２（ｓ，４Ｈ，ＣＨ２），４．６３－４．７０（ｂｒ－ｍ，８Ｈ，ＣＨ２），５．３６（ｂｒ－ｔ，３Ｈ，ＯＨ），７．５２－８．７３（ｍ，３２Ｈ，ＡｒＨ）．
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６，ＴＭＳ ｓｔａｎｄａｒｄ）：δ（ｐｐｍ）０．９２（ｂｒ－ｔ，６Ｈ，ＣＨ３），１．２０－１．３８（ｍ，１２Ｈ，ＣＨ２），３．４２（ｓ，４Ｈ，ＣＨ２），４．６３－４．７０（ｂｒ－ｍ，８Ｈ，ＣＨ２），５．３６（ｂｒ－ｔ，３Ｈ，ＯＨ），７．５２－８．７３（ｍ，３２Ｈ，ＡｒＨ）．
【0090】
【化18】
【0091】
（化合物（（Ｐｙｒ－Ａ））の合成）
ＮａＨ（６０％ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｉｎ ｏｉｌ，２０ｍｇ，０．２９ｍｍｏｌ）を、化合物（４）（３６ｍｇ，０．０６ｍｍｏｌ）、脱水ＴＨＦ（０．５ｍＬ）、及び脱水ＤＭＦ（０．６ｍＬ）の混合物に、Ｎ２下、０℃で、ゆっくりと添加した。０℃で２時間撹拌した後、混合物に、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルトシラート（Ｍｎ＝９００ｇｍｏｌ－１，１５６ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）を添加し、室温まで温めて、３５時間撹拌した。得られた混合物を、飽和ＮＨ４Ｃｌ ａｑ．に滴下し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、次いで蒸発乾固した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／ＣＨ２Ｃｌ２＝２／９８～５／９５）及びサイズ排除クロマトグラフィーで精製し、淡黄色固体として化合物（Ｐｙｒ－Ａ）を得た（４８ｍｇ，０．０１９ｍｍｏｌ，３２％）。
ＮａＨ（６０％ ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ ｉｎ ｏｉｌ，２０ｍｇ，０．２９ｍｍｏｌ）を、化合物（４）（３６ｍｇ，０．０６ｍｍｏｌ）、脱水ＴＨＦ（０．５ｍＬ）、及び脱水ＤＭＦ（０．６ｍＬ）の混合物に、Ｎ２下、０℃で、ゆっくりと添加した。０℃で２時間撹拌した後、混合物に、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルトシラート（Ｍｎ＝９００ｇｍｏｌ－１，１５６ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）を添加し、室温まで温めて、３５時間撹拌した。得られた混合物を、飽和ＮＨ４Ｃｌ ａｑ．に滴下し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、次いで蒸発乾固した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／ＣＨ２Ｃｌ２＝２／９８～５／９５）及びサイズ排除クロマトグラフィーで精製し、淡黄色固体として化合物（Ｐｙｒ－Ａ）を得た（４８ｍｇ，０．０１９ｍｍｏｌ，３２％）。
【0092】
１Ｈ ＮＭＲにより、化合物（Ｐｙｒ－Ａ）の構造を同定した。
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ ｓｔａｎｄａｒｄ）：δ（ｐｐｍ）０．９６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ３），１．２４－１．４５（ｍ，１２Ｈ，ＣＨ２），３．３６－３．７８（ｍ，ＣＨ２，ＣＨ３），４．６９（ｓ，４Ｈ，ＣＨ２），４．７２（ｓ，４Ｈ，ＣＨ２），７．５３－７．５７（ｍ，８Ｈ，ＡｒＨ），７．５９－７．６３（ｍ，８Ｈ，ＡｒＨ），７．９０－７．９９（ｍ，８Ｈ，ＡｒＨ），８．０８－８．２０（ｍ，８Ｈ，ＡｒＨ）．
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ ｓｔａｎｄａｒｄ）：δ（ｐｐｍ）０．９６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ３），１．２４－１．４５（ｍ，１２Ｈ，ＣＨ２），３．３６－３．７８（ｍ，ＣＨ２，ＣＨ３），４．６９（ｓ，４Ｈ，ＣＨ２），４．７２（ｓ，４Ｈ，ＣＨ２），７．５３－７．５７（ｍ，８Ｈ，ＡｒＨ），７．５９－７．６３（ｍ，８Ｈ，ＡｒＨ），７．９０－７．９９（ｍ，８Ｈ，ＡｒＨ），８．０８－８．２０（ｍ，８Ｈ，ＡｒＨ）．
【0093】
【化19】
【0094】
［化合物（Ｐｙｒ－Ａ）の蛍光特性］
分光光度計（Ｖ－７５０，日本分光株式会社）を用いて、各種溶媒中での化合物（Ｐｙｒ－Ａ）の紫外可視吸収スペクトルを測定した。分光蛍光光度計（ＦＰ－８３００，日本分光株式会社）を用いて、各種溶媒中での化合物（Ｐｙｒ－Ａ）の蛍光スペクトルを測定した。測定中の温度は、２５±１℃に維持した。溶媒中での化合物（Ｐｙｒ－Ａ）の濃度は、１．０μＭとした。化合物（Ｐｙｒ－Ａ）の蛍光スペクトルは、励起波長３５８ｎｍで測定した。
分光光度計（Ｖ－７５０，日本分光株式会社）を用いて、各種溶媒中での化合物（Ｐｙｒ－Ａ）の紫外可視吸収スペクトルを測定した。分光蛍光光度計（ＦＰ－８３００，日本分光株式会社）を用いて、各種溶媒中での化合物（Ｐｙｒ－Ａ）の蛍光スペクトルを測定した。測定中の温度は、２５±１℃に維持した。溶媒中での化合物（Ｐｙｒ－Ａ）の濃度は、１．０μＭとした。化合物（Ｐｙｒ－Ａ）の蛍光スペクトルは、励起波長３５８ｎｍで測定した。
【0095】
化合物（Ｐｙｒ－Ａ）は、３２０～４００ｎｍの範囲に、１，６－ジフェニルピレン誘導体と同様の強い吸収帯を有していた（データは示さず）。
【0096】
図２に、各種溶媒中での化合物（Ｐｙｒ－Ａ）の蛍光スペクトルを示す。化合物（Ｐｙｒ－Ａ）の蛍光スペクトルは、４００ｎｍ付近及び４７０ｎｍ付近に２つのバンドが確認された。これら２つのバンドは、１．６－ジフェニルピレン誘導体のバンドと類似しており、それぞれモノマーとエキシマーの発光に対応していると考えられた（Imai, K., et al., (2012). Polym. Bull. 68, 158-1601.）。
蛍光強度は、溶媒の種類によって異なっていた。極性の高い溶媒では、極性の低い溶媒と比較して、化合物（Ｐｙｒ－Ａ）のエキシマー発光が増強されていた。一方、極性の低い溶媒では、極性の高い溶媒と比較して、モノマー発光が増強されていた。
蛍光強度は、溶媒の種類によって異なっていた。極性の高い溶媒では、極性の低い溶媒と比較して、化合物（Ｐｙｒ－Ａ）のエキシマー発光が増強されていた。一方、極性の低い溶媒では、極性の高い溶媒と比較して、モノマー発光が増強されていた。
【0097】
図３に、モノマー発光（検出波長４００ｎｍ）の蛍光強度とエキシマー発光（検出波長４７０ｎｍ）の蛍光強度との合計値に対するエキシマー発光の割合を示す値［Ｉ４７０（Ｉ４００／Ｉ４７０）］を、溶媒の極性パラメータＥＴ（３０）の関数としてプロットした結果を示す。［Ｉ４７０（Ｉ４００／Ｉ４７０）］値は、溶媒の極性が高いほど大きくなった。この結果からも、溶媒の極性が高いほど、エキシマー発光が増強されることが確認された。エキシマー発光は、粘度の高いプロトン系の極性溶媒よりも、粘度の低い非プロトン系の極性溶媒で顕著であった。
【0098】
図４は、メタノールとポリエチレングリコール４０００（ＰＥＧ４０００）との混合溶媒（ＰＥＧ４０００濃度：０ｇＬ－１、２５ｇＬ－１、５０ｇＬ－１、１００ｇＬ－１）中での化合物（Ｐｙｒ－Ａ）の蛍光スペクトルを示す。ＰＥＧ４０００の濃度が高くなるほど、モノマー発光が増強され、エキシマー発光が抑制された。
【0099】
以上の結果から、化合物（Ｐｙｒ－Ａ）は、極性が高く粘性が低い環境ではエキシマー発光が優勢となり、極性が低く粘性が高い環境ではモノマー発光が優勢となることが確認された。
【0100】
［液滴アッセイ］
ＢＲＤ４は、転写制御に関与するコアアクティベーターであり、そのＩＤＲはｉｎ ｖｉｔｒｏで液滴を形成する（Wang, Z.A., and Cole, P.A. (2020). Cell Chem. Biol. 27, 953-969.）。そこで、ＢＲＤ４のＩＤＲ（ＢＲＦ４－ＩＤＲ）とｍＥＧＦＰ（monomeric enhanced green fluorescent protein）とを含む組換え融合タンパク質（ＢＲＤ４－ＩＤＲ－ｍＥＧＦＰ）を作製し、化合物（Ｐｙｒ－Ａ）の液滴アッセイを行った。
ＢＲＤ４は、転写制御に関与するコアアクティベーターであり、そのＩＤＲはｉｎ ｖｉｔｒｏで液滴を形成する（Wang, Z.A., and Cole, P.A. (2020). Cell Chem. Biol. 27, 953-969.）。そこで、ＢＲＤ４のＩＤＲ（ＢＲＦ４－ＩＤＲ）とｍＥＧＦＰ（monomeric enhanced green fluorescent protein）とを含む組換え融合タンパク質（ＢＲＤ４－ＩＤＲ－ｍＥＧＦＰ）を作製し、化合物（Ｐｙｒ－Ａ）の液滴アッセイを行った。
【0101】
組換えｍＥＧＦＰタンパク質は、ＯＲＩＧＥＮＥ（Ｓｋｕ＃ＴＰ７９００５０）から入手した。組換えｍＥＧＦＰ融合タンパク質（ＢＲＦ４ａａ６７４－１３５１；ＢＲＤ４－ＩＤＲ－ｍＥＧＦＰ）を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心式フィルター（５０Ｋ ＭＷＣＯ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。組換えタンパク質を、液滴バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ ｐＨ７．５，１０％グリセロール，１ｍＭ ＤＴＴ，１０％ ＰＥＧ）で、最終濃度が１０μＭとなるように希釈した。希釈に用いた液滴バッファーは、１０μＭの化合物（Ｐｙｒ－Ａ）を含むものと、含まないものとを用いた。希釈後直ぐに、ガラス底ディッシュ（松浪硝子工業）に載せ、カバーガラスで覆った。水銀ランプ及びＰｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ １００×／１．４オイル対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ５ ＥＸＣＩＴＥＲ顕微鏡を用いて、液滴を撮像した。モノマー発光は、カスタマイズした蛍光キューブＩ（Ｅｘ３６５／ＤＭ３９０／Ｅｍ４２５，Ｚｅｉｓｓ）を用いて測定した。エキシマー発光は、蛍光キューブＩＩ（Ｅｘ３６５／ＤＭ４００／Ｅｍ４９０，Ｚｅｉｓｓ）を用いて測定した。画像取得には、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ ４．８）を用いた。
【0102】
図５に、液滴アッセイの結果を示す。ＢＲＤ４－ＩＤＲ－ｍＥＧＦＰの液滴内に、化合物（Ｐｙｒ－Ａ）が取り込まれていることが確認された。
【0103】
図６に、エキシマー発光（蛍光（ｅ））とモノマー発光（蛍光（ｍ））の蛍光強度比（蛍光（ｅ）／蛍光（ｍ））と、液滴サイズとの関係を示す。「蛍光（ｅ）／蛍光（ｍ）」は、液滴サイズと負の相関を示した。この結果は、タンパク質の液滴の成熟に伴い、疎水性と粘性が増大することを示唆する。
【0104】
［細胞アッセイ］
化合物（Ｐｙｒ－Ａ）を用いて、細胞内の中心体を観察した。中心体は、一対の中心小体と中心小体周辺物質（ＰＣＭ）により構成される。中心体には、ｃｅｎｔｒｉｎ－１及びｐｅｒｉｃｅｎｔｒｉｎが含まれる。有糸分裂期には、核膜が壊れた後、ＮＵＰ６２等の核膜孔複合体の特定の成分が中心体に局在し、ＰＣＭの成熟に関与する。有糸分裂期の中心体は、間期に比べて顕著に大きくなる。有糸分裂期には、間期と比較して、細胞内の粘性が増大し、極性が低下すると考えられる（図７Ｂ参照）。
化合物（Ｐｙｒ－Ａ）を用いて、細胞内の中心体を観察した。中心体は、一対の中心小体と中心小体周辺物質（ＰＣＭ）により構成される。中心体には、ｃｅｎｔｒｉｎ－１及びｐｅｒｉｃｅｎｔｒｉｎが含まれる。有糸分裂期には、核膜が壊れた後、ＮＵＰ６２等の核膜孔複合体の特定の成分が中心体に局在し、ＰＣＭの成熟に関与する。有糸分裂期の中心体は、間期に比べて顕著に大きくなる。有糸分裂期には、間期と比較して、細胞内の粘性が増大し、極性が低下すると考えられる（図７Ｂ参照）。
【0105】
（細胞培養）
ＨｅＬａ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。細胞は、１０％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）用いて、加湿雰囲気下、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。
ＨｅＬａ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。細胞は、１０％ウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）用いて、加湿雰囲気下、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。
【0106】
（ｃＤＮＡ Ｖｅｃｔｏｒ及び形質転換）
ＫｐｎＩ／ＢａｍＨ１制限サイトを用いて、ＨｅＬａ細胞のｃＤＮＡをＣ１－ＥＧＦＰベクターにクローニングすることにより、ｃｅｎｔｒｉｎ１－ＥＧＦＰベクターを作製した。ＨｅＬａ細胞へのＤＮＡの導入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。形質転換後、Ｇ４１８処理により、Ｃｅｎｔｒｉｎ１－ＥＧＦＰを安定的に発現するＨｅＬａ細胞を選抜した。
ＫｐｎＩ／ＢａｍＨ１制限サイトを用いて、ＨｅＬａ細胞のｃＤＮＡをＣ１－ＥＧＦＰベクターにクローニングすることにより、ｃｅｎｔｒｉｎ１－ＥＧＦＰベクターを作製した。ＨｅＬａ細胞へのＤＮＡの導入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。形質転換後、Ｇ４１８処理により、Ｃｅｎｔｒｉｎ１－ＥＧＦＰを安定的に発現するＨｅＬａ細胞を選抜した。
【0107】
（ライブセル蛍光顕微鏡イメージング）
細胞をガラス底ディッシュ（松浪硝子工業）に播種し、２４時間培養して接着させた。次いで、チミジンブロックにより細胞を同期させ、有糸分裂期の細胞密度を高め、１０μＭの化合物（Ｐｙｒ－Ａ）を含む培地で培養した。１時間培養後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、新鮮な培地を添加した。次いで、水銀ランプ及びＰｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ １００×／１．４オイル対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ５ ＥＸＣＩＴＥＲ顕微鏡を用いて、細胞を撮像した。画像取得には、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ ４．８）を用いた。中心体の領域を特定するために、約３０枚の画像スライス（厚さ０．２ｍｍ）を取得した。ラインプロファイル解析のために、ｃｅｎｔｒｉｎ１－ＧＦＰシグナルが最大となる位置を選択した。
細胞をガラス底ディッシュ（松浪硝子工業）に播種し、２４時間培養して接着させた。次いで、チミジンブロックにより細胞を同期させ、有糸分裂期の細胞密度を高め、１０μＭの化合物（Ｐｙｒ－Ａ）を含む培地で培養した。１時間培養後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、新鮮な培地を添加した。次いで、水銀ランプ及びＰｌａｎ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ １００×／１．４オイル対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ５ ＥＸＣＩＴＥＲ顕微鏡を用いて、細胞を撮像した。画像取得には、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ ４．８）を用いた。中心体の領域を特定するために、約３０枚の画像スライス（厚さ０．２ｍｍ）を取得した。ラインプロファイル解析のために、ｃｅｎｔｒｉｎ１－ＧＦＰシグナルが最大となる位置を選択した。
【0108】
図７Ａに、間期と有糸分裂期の細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。間期及び有糸分裂期のいずれの細胞でも、細胞内でモノマー発光及びエキシマー発光の両方が観察された。この結果から、化合物（Ｐｙｒ－Ａ）は細胞を透過することが確認された。
【0109】
図８に、中心体におけるエキシマー発光（蛍光（ｅ））とモノマー発光（蛍光（ｍ））のと蛍光強度比（蛍光（ｅ）／蛍光（ｍ））を解析した結果を示す。有糸分裂期の細胞では、間期の細胞と比較して、ｃｅｎｔｒｉｎ１－ＧＦＰシグナルを中心とする領域の「蛍光（ｅ）／蛍光（ｍ）」の値が有意に低かった。これらの結果は、有糸分裂期には、ＰＣＭの拡張により中心体が成熟し、中心体周辺の微小環境を、粘性が高く、極性の低い状態に変化させることを示している。
【産業上の利用可能性】
【0110】
本発明によれば、細胞内のＬＬＰＳの動態又は物性を評価可能な蛍光プローブ、前記蛍光プローブを用いた液相の極性及び粘性を評価する方法、及び前記蛍光プローブに用いられる化合物が提供される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】