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特開2022-185604新規フェニルプロパノイド化合物

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022185604

(43)【公開日】2022-12-15

(54)【発明の名称】新規フェニルプロパノイド化合物

(51)【国際特許分類】

C07H 15/203 20060101AFI20221208BHJP

A61Q 19/02 20060101ALI20221208BHJP

A61K 8/60 20060101ALI20221208BHJP

A61P 17/18 20060101ALI20221208BHJP

A61P 17/00 20060101ALI20221208BHJP

A61K 31/7034 20060101ALI20221208BHJP

A61K 36/48 20060101ALI20221208BHJP

A61Q 19/00 20060101ALI20221208BHJP

A23L 33/105 20160101ALI20221208BHJP

【ＦＩ】

C07H15/203 CSP

A61Q19/02

A61K8/60

A61P17/18

A61P17/00

A61K31/7034

A61K36/48

A61Q19/00

A23L33/105

【審査請求】有

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021093326

(22)【出願日】2021-06-03

(11)【特許番号】

(45)【特許公報発行日】2021-08-18

(71)【出願人】

【識別番号】390010124

【氏名又は名称】株式会社ナボカルコスメティックス

(74)【代理人】

【識別番号】100205914

【弁理士】

【氏名又は名称】堀越総明

(74)【代理人】

【識別番号】100162189

【弁理士】

【氏名又は名称】堀越真弓

(72)【発明者】

【氏名】センカキョウ

(72)【発明者】

【氏名】堺孝子

(72)【発明者】

【氏名】トウテイカ

(72)【発明者】

【氏名】ホウチテン

(72)【発明者】

【氏名】オウカイユウ

(72)【発明者】

【氏名】ジェームスウエイ

【テーマコード（参考）】

4B018

4C057

4C083

4C086

4C088

【Ｆターム（参考）】

4B018MD08

4B018MD57

4B018ME06

4B018ME11

4B018ME14

4B018MF01

4C057BB02

4C057DD01

4C057JJ23

4C083AA111

4C083AA112

4C083AD201

4C083AD202

4C083CC04

4C083CC05

4C083CC07

4C083CC23

4C083DD08

4C083DD12

4C083DD14

4C083DD15

4C083DD16

4C083DD17

4C083DD22

4C083DD23

4C083DD27

4C083DD31

4C083DD41

4C083EE12

4C083EE13

4C083EE16

4C083FF01

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA08

4C086GA17

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA13

4C086MA16

4C086MA17

4C086MA22

4C086MA28

4C086MA32

4C086MA35

4C086MA37

4C086MA41

4C086MA43

4C086MA52

4C086MA63

4C086NA14

4C086ZA89

4C086ZC37

4C086ZC41

4C088AB59

4C088AC04

4C088BA09

4C088BA10

4C088BA12

4C088BA32

4C088CA08

4C088MA13

4C088MA16

4C088MA17

4C088MA22

4C088MA28

4C088MA32

4C088MA35

4C088MA37

4C088MA41

4C088MA43

4C088MA52

4C088MA63

4C088NA14

4C088ZA89

4C088ZC37

4C088ZC41

(57)【要約】

【課題】イナゴマメ由来の新規な活性成分及びその用途を提供すること。
【解決手段】本発明は、下記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物である。

【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物。

【化1】

【請求項2】

下記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する美白剤。

【化2】

【請求項3】

前記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物の濃度が０．００１ｍＭ～１ｍＭである請求項２に記載の美白剤。

【請求項4】

下記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有するメラニン生成抑制剤。

【化3】

【請求項5】

下記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する抗酸化剤。

【化4】

【請求項6】

皮膚外用剤である請求項２～５のいずれか１項に記載の剤。

【請求項7】

化粧料である、請求項２～６のいずれか１項に記載の剤。

【請求項8】

下記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する皮膚美白用飲食品組成物。

【化5】

【請求項9】

イナゴマメ（Ｃｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａ）の莢果の含水アルコール抽出物を得る工程、
前記含水アルコール抽出物を、石油エーテル、酢酸エチルの順に液液抽出を行い、酢酸エチル画分を回収する工程、及び、
前記酢酸エチル画分から下記式（Ｉ）で表される化合物を分離する工程、を有することを特徴とする該化合物の製造方法。

【化6】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、マメ科植物であるイナゴマメ（ＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＬ．）から分離、精製して得られる新規なフェニルプロパノイド化合物及びその用途に関し、さらに、この化合物の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

イナゴマメ（ＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＬ．）は、主に地中海地方を原産とするマメ科植物である。イナゴマメの莢果、すなわち、イナゴマメの莢及び果肉はキャロブ（ｃａｒｏｂ）と呼ばれ、古くから食用又は食品原料として利用されてきた。成熟した莢果は長さ１０～２５ｃｍ程度で、甘味を呈する。イナゴマメの莢果には、多糖類、セルロース及びミネラル類が多く含まれ、タンパク質や非炭水化物系の低分子化合物等が少量含まれている。近年、イナゴマメの新たな機能に関する研究が進められており、イナゴマメの莢果（ｐｏｄ）の水抽出物が、消化管における止瀉、抗酸化、抗菌、抗潰瘍及び抗炎症作用等の複数の薬理作用を有しており、潰瘍性大腸炎や胃潰瘍などの消化器疾患の予防及び治療効果を有することが報告されている（非特許文献１、２）。また、特許文献１には、イナゴマメの種子抽出物にα－グルコシダーゼ阻害活性があり、体重増加の抑制効果を有することが記載されている（特許文献１）。

【0003】

他方、フリーラジカルとは、体内での代謝の過程で生成される中間生成物であり、不対電子を含んだ、非常に活発な化学的性質を有する原子、原子団又は分子である。体内で生成した過剰なフリーラジカルは、正常細胞の細胞膜を損傷し、タンパク質を変性させ、酵素機能の喪失及びＤＮＡや細胞外マトリックスの損傷を引き起こしている。フリーラジカルによる損傷は、老化、発癌、アルツハイマー病、心血管や脳血管の疾患及び皮膚病などと密接に関連している。人体にはフリーラジカルによる損傷を防ぐための抗酸化メカニズムが備わっているが、絶え間ない老化や病的状態等により、過剰なフリーラジカルによって引き起こされる損傷を完全に排除することは困難である。よって、人体の正常な機能を維持するため、抗酸化剤によるフリーラジカルの除去は非常に有効である。現在利用されている抗酸化剤としては、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）やブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）等が挙げられるが、これらは高価であり、安全性に劣る等の課題を有している。

【0004】

フリーラジカルの強い酸化力によって、細胞外マトリックス等が損傷すると肌の弾力性が失われる可能性がある。また、老化によって、皮膚がたるみ、キメが粗くなり、肌がくすむことにより、肌の色は暗くなる。同時に、人間の肌の色は、主に体内で生成されるメラニン含有量に依存することから、皮膚にメラニンが蓄積することも、肌の色が暗くなり、弾力性とツヤが失われる重要な理由の１つである。

【0005】

昨今の研究成果によれば、抗酸化活性を有する物質は、体内のフリーラジカルを除去してフリーラジカルによる損傷を低減させることにより、皮膚の老化プロセスを遅らせること、そして、その結果として、美白効果をもたらすことができるとされている。このことから、メラニン生成を抑制すると共に抗酸化活性を有する物質には、相乗的な美白効果が発揮され得る。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２００５－１１９９９９号公報

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Rtibi K, Jabri M A, Selmi S, et al., “Preventive effect of carob (Ceratonia siliqua L.) in dextran sulfate sodium-induced ulcerative colitis in rat”, RSC Advances, 2016年, Vol. 6, p.19992-20000.

【非特許文献2】Rtibi K, Selmi S, Grami D, et al., “Chemical constituents and pharmacological actions of carob pods and leaves (Ceratonia siliqua L.) on the gastrointestinal tract: A review“, Biomedicine & Pharmacotherapy, 2017年, Vol. 93, p.522-528.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

しかしながら、上述した非特許文献１，２では、イナゴマメの莢果抽出物が、消化管における止瀉、抗酸化、抗菌、抗潰瘍及び抗炎症作用等の薬理作用を有し、消化器疾患の治療効果を有すること、並びに特許文献１では、イナゴマメの種子抽出物に体重増加の抑制効果を有することが報告されているが、具体的な活性成分の特定にはまだ至っていない。

【0009】

また、イナゴマメを美白剤として用いることについての検討はこれまでなされておらず、その有効性はまったく不明であった。

【0010】

したがって、本発明は上述した点に鑑みてなされたもので、その目的は、イナゴマメ由来の新規な活性成分及びその用途を提供することにある。

【0011】

また、本発明の他の目的は、メラニン生成抑制作用を有すると共に抗酸化活性をも有する新たな美白剤であって、天然物であるイナゴマメ由来のものを提供することにある。さらに、この美白剤を含む皮膚外用剤、化粧料及び皮膚美白用飲食品組成物を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明者らは、イナゴマメの莢果抽出物から新規なフェニルプロパノイド化合物を分離し、この新規化合物がメラニン生成抑制作用のみならず、抗酸化活性をも有することを見出した。この知見に基づき、本発明を完成するに至った。

【0013】

上記課題を解決するため、本発明は、下記式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物である。

【0014】

【化1】

【0015】

式（Ｉ）で表される化合物は、イナゴマメ（Ｃｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａ）の莢果抽出物から分離、精製された新規フェニルプロパノイド化合物であり、メラニン生成抑制作用及び抗酸化活性を備え、美白効果を有する。

【0016】

また、本発明の美白剤は、上述した式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する。式（Ｉ）で表される化合物を投与することにより、皮膚におけるメラニン生成が抑制されると共に、フリーラジカルが除去されて皮膚の老化が抑制されるため、相乗的な美白効果が発揮され得る。

【0017】

また、本発明の美白剤は、上述した式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物の濃度が０．００１ｍＭ～１ｍＭであることも好ましい。これにより、効果に優れる活性成分の濃度が選択される。

【0018】

また、本発明のメラニン生成抑制剤は、上述した式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する。式（Ｉ）で表される化合物を投与することにより、皮膚におけるメラニン生成が抑制される。

【0019】

また、本発明の抗酸化剤は、上述した式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する。式（Ｉ）で表される化合物を投与することにより、フリーラジカルが除去され、フリーラジカルによって生じる損傷が低減される。

【0020】

また、本発明の美白剤、メラニン生成抑制剤又は抗酸化剤は、皮膚外用剤又は化粧料であることも好ましい。これにより、皮膚の美白効果、皮膚におけるメラニン生成抑制効果又は皮膚の老化防止効果を有する皮膚外用剤又は化粧料が得られる。

【0021】

また、本発明の皮膚美白用飲食品組成物は、上述した式（Ｉ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物を含有する。これにより、皮膚におけるメラニン生成が抑制されると共に、体内のフリーラジカルが除去されて皮膚の老化プロセスを遅らせることにより、相乗的な美白効果が発揮される飲食品組成物が得られる。

【0022】

また、本発明の上述した式（Ｉ）で表される化合物の製造方法は、イナゴマメ（Ｃｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａ）の莢果の含水アルコール抽出物を得る工程、この含水アルコール抽出物を石油エーテル、酢酸エチルの順に液液抽出を行い、酢酸エチル画分を回収する工程、及び、回収された酢酸エチル画分から式（Ｉ）で表される化合物を分離する工程、を有している。これにより、抗酸化活性及びメラニン生成抑制作用を備え、美白効果を有する、新規なフェニルプロパノイド化合物が得られる。

【発明の効果】

【0023】

本発明によれば、以下のような優れた効果を有する新規フェニルプロパノイド化合物並びにこれを含有する美白剤、メラニン生成抑制剤、抗酸化剤、皮膚外用剤、化粧料及び皮膚美白用飲食品組成物を提供することができる。
（１）メラニン生成抑制作用及び抗酸化活性を備え、相乗的な美白効果を有する。
（２）古来から食用とされているイナゴマメの莢果由来の化合物を有効成分とするものであるため、人体に対する安全性が高い。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】本発明の化合物の高分解能ＥＳＩマススペクトルを示す図である。

【図2】本発明の化合物の紫外吸収スペクトルを示す図である。

【図3】本発明の化合物の赤外吸収スペクトルを示す図である。

【図4】本発明の化合物の^１Ｈ－ＮＭＲスペクトル（ＣＤ_３ＯＤ、６００ＭＨｚ）を示す図である。

【図5】本発明の化合物の^１３Ｃ－ＮＭＲスペクトル（ＣＤ_３ＯＤ、１５０ＭＨｚ）を示す図である。

【図6】本発明の化合物のＨＳＱＣスペクトルを示す図である。

【図7】本発明の化合物のＨＭＢＣスペクトルを示す図である。

【図8】本発明の化合物の^１Ｈ－ＮＭＲシグナル及び^１３Ｃ－ＮＭＲシグナルを一覧にまとめた図である。

【図9】本発明の化合物のＨＭＢＣ相関を示す図である。

【図10】実施例４における、本発明の化合物によるＤＰＰＨラジカル消去活性を示すグラフである。

【図11】実施例５における、ＨｅｐＧ２細胞に対する本発明の化合物の細胞毒性試験の結果を示すグラフである。

【図12】実施例５における、本発明の化合物によるＨｅｐＧ２細胞におけるＲＯＳ生成抑制効果を示すグラフである。

【図13】実施例６における、Ｂ１６メラノーマ細胞に対する本発明の化合物の細胞毒性試験の結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0025】

以下、本発明の新規フェニルプロパノイド化合物及びこれを含む美白剤、メラニン生成抑制剤、抗酸化剤、皮膚外用剤、化粧料及び皮膚美白用飲食品組成物並びにこの化合物の製造方法について説明する。

【0026】

本発明に係る下記式（Ｉ）で表される新規フェニルプロパノイド化合物は、グルコースと２－メチルプロピオン酸とがそれぞれシナピルアルコールにエステル結合した化合物である。

【0027】

【化2】

【0028】

本発明に係る新規フェニルプロパノイド化合物は塩であってもよく、薬理学的に許容される塩であることが好ましい。この新規フェニルプロパノイド化合物の薬理学的に許容される塩としては、酸又は塩基と形成される塩であればよく、特に限定されない。また、この新規フェニルプロパノイド化合物又はその塩は、溶媒和物であってもよく、特に限定されないが、例えば、水和物、エタノール等の有機溶媒和物が挙げられる。

【0029】

本発明に係る新規フェニルプロパノイド化合物は優れたメラニンの生成抑制作用を有しており、さらに抗酸化作用をも併せ持つことから、複数のメカニズムによる美白効果が得られる美白剤として用いることができる。すなわち、本発明に係る新規フェニルプロパノイド化合物により、皮膚におけるメラニン生成が抑制されると共に、抗酸化作用によってフリーラジカルが除去されるため、フリーラジカルによる損傷によって引き起こされる皮膚の老化による肌の暗色化が抑制され、相乗的な美白効果が発揮され得る。

【0030】

本発明において、メラニン生成抑制作用とは、本発明の新規フェニルプロパノイド化合物を添加又は投与されない状態のコントロールと比較して、例えば、Ｂ１６メラノーマ細胞等のメラニン生成細胞におけるメラニン生成量が低減する作用を意味する。より具体的には、メラニン生成量がコントロールの８０％以下であることが好ましく、７０％以下であることがより好ましい。

【0031】

また、本発明において、抗酸化作用とは、本発明の新規フェニルプロパノイド化合物を添加又は投与されない状態のコントロールと比較して、例えば、ＤＰＰＨラジカル消去率が高いこと、又は細胞内ＲＯＳを低減させる作用を意味する。

【0032】

本発明の新規フェニルプロパノイド化合物は、イナゴマメの莢果から分離、精製することにより得ることができる。本発明で用いられるイナゴマメとは、学名をＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａといい、マメ科ジャケツイバラ亜科イナゴマメ属の植物である。地中海沿岸地方を原産とする植物であるが、本発明においては、産地や栽培環境は特に限定されず、あらゆる産地及び栽培環境のイナゴマメを用いることができる。

【0033】

本発明の新規フェニルプロパノイド化合物のイナゴマメからの分離方法について説明する。まず、イナゴマメの莢果から含水アルコール抽出物を得る。本発明におけるイナゴマメ莢果の含水アルコール抽出物とは、イナゴマメの莢果に抽出溶媒として含水アルコールを加え、抽出処理を施すことによって得られた抽出物をいう。イナゴマメの莢果とは、イナゴマメの莢付果実の莢と果肉のことを意味し、莢又は果肉のいずれか一方を抽出材料として用いることも可能であるが、莢及び果肉を用いることがより好ましい。抽出処理は、採取された状態、すなわち、生の状態のイナゴマメ莢果、又は乾燥状態のイナゴマメ莢果に対して行われるが、抽出効率の向上を図るため、又は取り扱いを容易とするために種々の前処理が施されたイナゴマメ莢果に対して抽出処理を施すことも可能である。前処理としては、特に限定されないが、乾燥処理、破砕処理又は粉砕処理等が挙げられ、これら前処理が施されたイナゴマメの莢果に抽出処理を施して抽出物を得てもよい。

【0034】

抽出溶媒として用いられる含水アルコールを構成するアルコールとしては、本発明のフェニルプロパノイド化合物を抽出できるものであれば特に限定されず、例えば、エタノール、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール又はイソブタノール等が挙げられる。このうち、人体への安全性及び抽出効率等の観点から、抽出溶媒としては、含水エタノールが好適に選択される。また、含水アルコールのアルコール濃度としては、５０～９９％が好ましく、６０～９７％がより好ましく、７０～９５％が特に好ましい。また、抽出溶媒には、本発明の化合物の抽出を妨げない範囲において、他の成分を含有させることも可能である。

【0035】

含水アルコールによる抽出方法としては、イナゴマメの莢果に抽出溶媒である含水アルコールを加えて浸漬させ、抽出を行う。例えば、イナゴマメ莢果を含水率１０％未満の乾燥破砕物とした場合には、植物体１重量部に対し、抽出溶媒を５～１０重量部用いることが好ましい。また、抽出方法としては、室温での抽出、加熱抽出、加圧加熱抽出又は亜臨界抽出等のいずれの方法でも行うことが可能であるが、抽出効率の観点から、還流操作による加熱抽出が好ましい。また、抽出効率を高めるため、抽出操作は複数回行うことが好ましく、抽出溶媒中のアルコール濃度を変えて複数回の抽出操作を行うことがさらに好ましい。特に限定されないが、具体的には、９５％エタノールによる還流抽出を１～５回行い、引き続いて、７０％エタノールによる還流抽出を１～５回行うといった抽出方法が挙げられる。抽出時間は、抽出方法、抽出材料の態様、抽出溶媒の種類又は抽出温度等に応じて種々設定されるが、例えば、７０～９５％のエタノールを用いて還流抽出を行う場合には、１回の抽出時間として１～３時間程度とすることが好ましく、１．５時間程度とすることが特に好ましい。上述した抽出処理後、残渣をデカンテーション、遠心分離又はろ過等により取り除くことによりイナゴマメの莢果の含水アルコール抽出物が得られる。得られた抽出物には減圧蒸留等の処理を施すことにより、濃縮液や固形物としたものも含まれる。

【0036】

上述のようにして得られたイナゴマメの莢果の含水アルコール抽出物については、イナゴマメの莢果に多量に含まれている糖類等が存在すると考えられるため、これら不要な成分を除去することを目的として、イオン交換樹脂による分離操作を行ってもよい。具体的には、イナゴマメの莢果の含水アルコール抽出物１重量部に対し、１～１０重量部の水を加えて分散させ、マクロポーラス吸着樹脂等のイオン交換樹脂を詰めたカラムに通し、本発明のフェニルプロパノイド化合物を吸着させて、糖類などの不要成分を流出除去させる。その後、９５％エタノール等で溶出させることにより、本発明のフェニルプロパノイド化合物を含む画分が回収される。

【0037】

引き続いて、イナゴマメの莢果の含水アルコール抽出物又は上述したイオン交換樹脂により分離された回収画分のさらなる分離操作について説明する。含水アルコール抽出物又は回収画分を水系溶媒に分散させ、石油エーテル、酢酸エチルの順に溶媒抽出を行う。水系溶媒としては、本発明のフェニルプロパノイド化合物を分散できるものであれば特に限定されないが、５０％含水メタノールが好適に用いられる。石油エーテル／水系溶媒での液液抽出を複数回行った後、酢酸エチル／水系溶媒での液液抽出を複数回行う。この溶媒抽出操作により回収された酢酸エチル画分に本発明の新規なフェニルプロパノイド化合物が含まれる。各溶媒系での液液抽出の回数は２～１０回程度が好ましく、５回程度が特に好ましい。

【0038】

上述のようにして得られた酢酸メチル画分から常法に基づき精製することにより、本発明の新規フェニルプロパノイド化合物が単離され得る。精製方法としては、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー等を挙げることができ、これらのうちの１種又は複数を組み合わせて精製することが可能である。各種クロマトグラフィーに用いられる担体や溶出溶媒等は、各種クロマトグラフィーに対応して適宣選択することができる。

【0039】

なお、上述のようにしてイナゴマメの莢果から分離、精製された本発明のフェニルプロパノイド化合物は、完全な純物質として単離されていなくてもよく、イナゴマメ原料由来の他の成分が一部含まれていてもよい。

【0040】

さらに、本発明の新規フェニルプロパノイド化合物は、公知の方法で合成して得られた合成品であってもよい。

【0041】

本発明の新規フェニルプロパノイド化合物は優れたメラニンの生成抑制作用を有しており、さらに抗酸化作用をも併せ持つことから、複数のメカニズムによる美白作用が得られる美白剤として用いることができる。また、このフェニルプロパノイド化合物は、メラニン生成抑制剤又は抗酸化剤として用いることができる。

【0042】

本発明の新規フェニルプロパノイド化合物を含有する美白剤及びメラニン生成抑制剤は、皮膚におけるメラニン生成を抑制すると共に、フリーラジカルによる損傷によって引き起こされる、皮膚の老化による肌の暗色化を抑制するための皮膚外用剤又は化粧料として用いることができる。また、本発明の新規フェニルプロパノイド化合物を含有する抗酸化剤は、フリーラジカルによる損傷によって引き起こされる皮膚の老化を防ぎ、皮膚を安定した状態に保つための皮膚外用剤として用いることができる。また、本発明の抗酸化剤は、フリーラジカルによる損傷によって引き起こされる皮膚の老化を防ぎ、皮膚のたるみやキメの粗化、肌のくすみを予防し、皮膚を健やかに保つ作用を有する化粧料として用いることができる。

【0043】

本発明の美白剤、メラニン生成抑制剤及び抗酸化剤の投与量は、目標とする効果、治療効果、投与方法又は年齢などによって変化するので一概には規定できないが、外用剤として用いた場合における、通常一日の非経口的な投与量は、本発明のフェニルプロパノイド化合物として、０．２μｇ～３０ｍｇとすることが好ましく、１μｇ～３ｍｇとすることがより好ましく、５μｇ～５００μｇとすることがさらに好ましい。また、内用剤として用いた場合における、経口的な投与量としては、本発明のフェニルプロパノイド化合物として、通常一日１μｇ～１０００ｍｇとすることが好ましく、５μｇ～５００ｍｇとすることがより好ましい。

【0044】

本発明の美白剤、メラニン生成抑制剤及び抗酸化剤並びに皮膚外用剤及び化粧料の剤形は、特に限定されず、例えば、低粘度液体、ローション等の液剤、乳液、ゲル、ペースト、クリーム、フォーム、パック、軟膏、粉剤、エアゾール又は貼付剤等、並びに錠剤、顆粒剤、カプセル剤又は内服用液剤等が挙げられる。なお、本発明に係る美白剤、メラニン生成抑制剤及び抗酸化剤は、化粧品、医薬部外品又は医薬品のいずれにも適用することができる。具体的な製品としては、特に限定されないが、化粧水、化粧クリーム、化粧乳液、美容液、化粧パック、化粧洗浄料、石鹸、ヘアケア剤、浴用剤又はメーキャップ化粧料、抗ニキビスキンケア化粧料等が挙げられる。

【0045】

本発明の美白剤、メラニン生成抑制剤及び抗酸化剤並びに皮膚外用剤及び化粧料中において、本発明の新規フェニルプロパノイド化合物の配合濃度は、好ましくは０．００１ｍＭ～１ｍＭであり、より好ましくは５μＭ～１００μＭであり、さらに好ましくは１０μＭ～１００μＭである。新規フェニルプロパノイド化合物の配合量をこの範囲内とすることにより、本化合物を安定に配合することができ、皮膚への安全性も高く、高い美白効果、メラニン生成抑制作用及び抗酸化作用を発揮することができる。

【0046】

本発明の美白剤、メラニン生成抑制剤及び抗酸化剤は、従来慣用されている方法により種々の形態に調製することができる。この場合、通常製剤用の担体や賦形剤など、医薬品の添加剤として許容されている添加剤を用いて製剤化することができる。また、本化合物のバイオアベイラビリティーや安定性を向上させるために、マイクロカプセル、微粉末化、シクロデキストリン等を用いた包接化などの製剤技術を含むドラッグデリバリーシステムを用いることもできる。

【0047】

また、本発明の美白剤、メラニン生成抑制剤及び抗酸化剤並びに皮膚外用剤及び化粧料には、皮膚外用剤及び化粧料に通常用いられる成分である水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、植物抽出エキス類、ビタミン類、水溶性高分子、界面活性剤、金属石鹸、アルコール、多価アルコール、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、粉体、増粘剤、色素又はキレート剤等の成分を適宜配合することができる。さらに、本発明の作用効果を損なわない範囲において、通常用いられる各種の機能性成分、例えば、保湿剤、抗炎症剤、細胞賦活剤、紫外線防御剤、血行促進剤及び他の美白剤・抗酸化剤等から選ばれる機能性成分の一種または二種以上と併用することができる。

【0048】

さらに、本発明の皮膚美白用飲食品組成物は、本発明の新規フェニルプロパノイド化合物を活性成分として含有している。本発明の皮膚美白用飲食品組成物は、錠剤やカプセル剤、顆粒剤、シロップ剤などのサプリメント形態、清涼飲料、果汁飲料、アルコール飲料などの飲料、アメやガム、クッキー、ビスケット、チョコレート等の菓子、パン、粥、シリアル、麺類、ゼリー、スープ、乳製品、調味料等のあらゆる形態とすることができる。このように飲食品として用いる際には、本発明の有効成分の効能に影響を与えない範囲において、他の有効成分や、ビタミン、ミネラル若しくはアミノ酸等の栄養素等を種々組み合わせることも可能である。本発明の飲食品には、サプリメント、健康食品、機能性食品、特定保健用食品等が含まれる。また、本発明の飲食品の１日あたりの摂取量は、本発明のフェニルプロパノイド化合物として、通常一日１μｇ～１０００ｍｇとすることが好ましく、５μｇ～５００ｍｇとすることがより好ましい。

【0049】

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によってなんら限定されるものではない。

【実施例0050】

［実施例１］
１．イナゴマメ莢果の含水アルコール抽出物の調製
採取後、乾燥処理されたイナゴマメ（Ｃｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａ）の莢付果実から種を取り除いた。このイナゴマメの莢果を粉砕機で粉砕して粒径２ｍｍ以下の粉砕物を得た。２０ｋｇの粉砕物に対し、１４０ｋｇ（７倍量）の含水９５％エタノールを加え、１．５時間還流抽出する操作を２回行った後、残渣をさらに１４０ｋｇ（７倍量）の含水７０％エタノールで１．５時間還流抽出した。得られた還流抽出液を合わせた後、溶媒を減圧留去してイナゴマメ莢果の含水エタノール抽出物１２．４ｋｇを得た。

【0051】

［実施例２］
２．イナゴマメ莢果の含水アルコール抽出物の分離及び精製
実施例１で得られたイナゴマメ莢果の含水エタノール抽出物を１～１０倍量の水に分散させ、イオン交換樹脂（マクロポーラス吸着樹脂Ｄ１０１、Cangzhou Bon Adsorber Technology Co., Ltd.）に吸着させた。カラム容量の３倍量の蒸留水で溶出して糖類等の不純物を除去した後、カラム容量の３倍量の含水９５％エタノールで溶出させ、溶媒を減圧留去し、４６２．７ｇのエタノール溶出画分（非炭水化物系低分子化合物画分）を得た。次に、得られたエタノール溶出画分を１．０Ｌの含水５０％メタノールに分散させ、石油エーテル、酢酸エチルの順に、それぞれ５回ずつ液液抽出を行った。各溶媒を減圧留去して、石油エーテル画分２８．４ｇ、酢酸エチル画分１３９．４ｇ及び水系画分２９０．２ｇをそれぞれ得た。

【0052】

次に、１３５．０ｇの酢酸エチル画分について、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（カラム充填材：２００～３００メッシュ、青島海洋化工場製品）に供し、石油エーテル（Ｐ）／酢酸エチル（Ｅ）及びジクロロメタン（Ｃ）／メタノール（Ｍ）の２つの展開溶媒を用いて溶出させ、分画を行った。この結果、１０８個の溶出画分が得られた。得られた１０８個の溶出画分について、薄層クロマトグラフィー（シリカゲルＧＦ_２５４プレート、青島海洋化工場製品）による同定を行い、類似する画分を合わせて１０個の溶出画分Ａ～Ｊを得た。

【0053】

次に、溶出画分Ｉ（２０．０ｇ）について、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（カラム充填材：４０～６３μｍ、メルク社製品）に供し、メタノール：水＝１５：８５→１００：０の勾配溶出により分画を行った。得られた溶出画分について、薄層クロマトグラフィー（シリカゲルＧＦ_２５４プレート、青島海洋化工場製品）による同定を行い、類似する画分を合わせて５つの溶出画分Ｉ１～Ｉ５を得た。

【0054】

次に、溶出画分Ｉ５（２．７ｇ）について、ゲルろ過クロマトグラフィー（カラム充填材：ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ－２０）に供し、ジクロロメタン：メタノール＝１：１で溶出させ、５つの溶出画分Ｉ５ａ～Ｉ５ｅを得た。

【0055】

次に、溶出画分Ｉ５ｂ（０．５ｇ）をセミ分取ＨＰＬＣ（カラムＩ：ＹＭＣ－ＰａｃｋＯＤＳ－Ａ、２５０×２０ｍｍ、５μｍ）に供し、メタノール：水＝５５：４５、検出波長２２０ｎｍで分離し、画分Ｉ５ｂ１を得た。この画分Ｉ５ｂ１をセミ分取ＨＰＬＣ（カラムＩＩ：ＹＭＣ－ＰａｃｋＯＤＳ－Ａ、２５０×１０ｍｍ、５μｍ）に供し、メタノール：水＝５５：４５、検出波長２６７ｎｍで分離して、本発明の化合物（以下、「ＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢ」という。）４８．３ｍｇを得た（保持時間ｔＲ＝２７．２７分）。

【0056】

［実施例３］
３．化合物（ＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢ）の構造解析
実施例２で得られた化合物、「ＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢ」の構造解析を行った。構造解析にあたり、高分解能質量分析（ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ；正イオンモード）、紫外吸収スペクトル分析、赤外吸収スペクトル分析、^１Ｈ－ＮＭＲ、^１３Ｃ－ＮＭＲ、ＨＭＢＣ及びＨＳＱＣ分析を行った。これらの分析に用いた装置は次のとおりである。
・高分解能質量分析：エレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型質量分析装置（Bruker Daltonics社製品）
・紫外吸収スペクトル分析：紫外可視分光光度計（ＵＶ－２４０１ＰＣ、株式会社島津製作所製品）
・赤外吸収スペクトル分析：ＦＴ－ＩＲ（ＮＥＸＵＳ４７０、Thermo nicolet社製品）
・ＮＭＲ分析：６００ＭＨｚ核磁気共鳴装置（ＡＶＡＮＣＥＩＩＩ６００、Bruker社製品）

【0057】

ＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢの物理的性質は以下のとおりである。高分解能質量分析（ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ）のスペクトルを図１に、紫外吸収スペクトル分析の結果を図２に、赤外吸収スペクトル分析の結果を図３にそれぞれ示す。
・性状：黄色粉末
・ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）ｍ／ｚ：４６５．１９８３［Ｍ＋Ｎａ］^＋
・紫外吸収スペクトル：λｍａｘ（ＭｅＯＨ）ｎｍ（ｌｏｇε）：１９３．６（３．７３），２１１．６（４．３２），２６９．２（３．９７）
・赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ、ｃｍ^－１）：νｍａｘ：３３９３．１８，２９３３．５２，１７３１．２９，１５８７．２０，１５０６．７１，１４６４．８６，１４２１．１２，１３８８．８１，１３３６．３８，１２４３．０７，１１５８．９７，１１２９．１６，１０７０．１１，６２５．２０，６０９．７８，５９５．２４，５８１．１７，５６６．３５，５３６．５９，５２３．２４

【0058】

高分解能質量分析（図１）の結果、準分子イオンピークが、ｍ／ｚ４６５．１９８３［Ｍ＋Ｎａ］^＋であることから、組成式はＣ_２１Ｈ_３０Ｏ_１０、不飽和度は７と推定された。また、紫外吸収スペクトル（図２）からは、２１１ｎｍ及び２６９ｎｍに最大吸収があることから、ＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢはフェニルプロパノイド系化合物である可能性が示唆された。また、赤外吸収スペクトル（図３）からは、分子構造に、水酸基（３３９３．１８ｃｍ^－１）、ベンゼン環（１５８７．２０ｃｍ^－１、１５０６．７１ｃｍ^－１）及びエステル結合（１７３１．２９ｃｍ^－１、１１２９．１６ｃｍ^－１）等の官能基が含まれることが示された。

【0059】

さらに、^１Ｈ－ＮＭＲ分析（溶媒：ＣＤ_３ＯＤ、観測周波数：６００ＭＨｚ）により得られたスペクトル（図４）からは、一組の１，３，４，５－置換ベンゼン環水素シグナル［δ_Ｈ：６．７６（２Ｈ，ｓ，Ｈ－２，Ｈ－６）］、一組のトランス－オレフィンプロトンシグナル［δ_Ｈ：６．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，Ｈ－７），６．３０（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ－８）］、１つのメチレン水素シグナル［δ_Ｈ：４．７１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，Ｈ－９）］、２つのメトキシ基シグナル［δ_Ｈ：３．８６（６Ｈ，ｓ，ＯＣＨ_３－３，ＯＣＨ_３－５）］、１つのメチン基シグナル［δ_Ｈ：２．６０（１Ｈ，ｍ，Ｈ－２′）］、２つのメチル基シグナル［δ_Ｈ：１．１８（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ_３－１′／Ｈ_３－４′）］、一組のグルコース残基の水素シグナル［δ_Ｈ：４．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ－１″），３．７８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｈ－６α″），３．６７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，Ｈ－６β″），３．４８（１Ｈ，ｍ，Ｈ－２″），３．４３（１Ｈ，ｍ，Ｈ－３″），３．４２（１Ｈ，ｍ，Ｈ－４″），３．２２（１Ｈ，ｍ，Ｈ－５″）］が確認された（図８）。また、^１３Ｃ－ＮＭＲ分析（溶媒：ＣＤ_３ＯＤ、観測周波数：１５０ＭＨｚ）により得られたスペクトル（図５）からは、２１の炭素シグナルが確認された（図８）。その中には、１つのエステルのカルボニル基炭素シグナル（δ_Ｃ：１７８．５）、８個の芳香族又はオレフィンの炭素シグナル（δ_Ｃ：１５４．３×２，１３６．２，１３４．８，１３４．５，１２４．４，１０５．６×２）、１つのメチレン基シグナル（δ_Ｃ：６６．０）、２つのメトキシ基シグナル（δ_Ｃ：５７．０×２）、１つのメチン基シグナル（δ_Ｃ：３５．２）、２つのメチル基シグナル（δ_Ｃ：１９．３×２）、一組のグルコース残基の炭素シグナル（δ_Ｃ：１０５．２，７８．３，７７．８，７５．７，７１．３，６２．５）が含まれていた。これらの解析結果より、本化合物のＮＭＲデータはシリンギン（Ｓｙｒｉｎｇｉｎ）と類似するが、本化合物には、さらに２－メチルプロピオン酸ユニットが含まれている点で、シリンギンとは異なる化合物であることがわかった。

【0060】

また、ＨＭＢＣ分析により得られたスペクトル（図７）からは、Ｈ－２／Ｈ－６とＣ－４、Ｈ－７とＣ－２／Ｃ－６、Ｈ－８とＣ－１、Ｈ－９とＣ－７及びＨ－１″とＣ－４のロングレンジ相関シグナルが確認された。この結果より、本化合物の構造にシリンギンユニットが存在することが示された。また、Ｈ_３－１′とＣ－３′／Ｃ－４′、Ｈ－２′とＣ－３′／Ｃ－４′にロングレンジ相関シグナルが確認されたことから、本化合物の構造に２－メチルプロピオン酸ユニットが存在することが示された。さらに、Ｈ_２－９とＣ－３′とにロングレンジ相関シグナルが確認されたことにより、２－メチルプロピオン酸ユニットがＣ－９位に結合していることが示された。グルコース末端のプロトンの結合定数は７．８Ｈｚであり、グルコースの末端の相対配置はβ型であることがわかった。これらの解析結果から本化合物、ＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢの構造を以下式（Ｉ）のとおり決定した。図８に、ＨＳＱＣスペクトル及びＨＭＢＣスペクトル分析に基づく、^１Ｈ－ＮＭＲのδ_Ｈ及び^１３Ｃ－ＮＭＲのδ_Ｃをまとめた帰属表を示す。また、図９にＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢのＨＭＢＣの解析結果を示す。

【0061】

【化3】

【0062】

［実施例４］
４．ＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢの抗酸化活性（１）
実施例２で得たＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢを用いて、ＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢのＤＰＰＨラジカル消去活性を測定した。

【0063】

まず、実施例２で得たＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢを正確に秤り取り、メタノールに溶解して、濃度１００μＭのサンプル液を調製した。この濃度１００μＭのサンプル液をさらにメタノールで希釈し、１μＭ、５μＭ、１０μＭ及び５０μＭの異なる濃度のサンプル液を得た。次に、２ｍｇのＤＰＰＨ（２，２－ジフェニル－１－ピクリルヒドラジル）を５０ｍＬのメタノールに溶解させ、１００μＭのＤＰＰＨ溶液を調製した。

【0064】

９６ウェルマイクロプレートのウェルに１９０μＬのＤＰＰＨ溶液を入れ、サンプル液１０μＬをすばやく添加した。ウェル内の反応液の総量は２００μＬであった。プレートを穏やかに振とうし、暗所で室温にて３０分間反応させた。その後、マイクロプレートリーダーにて５１７ｎｍにおける吸光度（Ａ_サンプル）を測定した。また、ブランクとして、サンプル液の代わりにメタノールを添加した反応液を用い、ブランクの吸光度（Ａ_ブランク）を測定した。さらに、サンプルブランクとして、各濃度のサンプル液そのものの着色による吸光度（Ａ_{サンプルブランク}）を測定した。試験は各濃度のサンプル液、ブランク及びサンプルブランクについて、３回（３ウェル）ずつ行った（ｎ＝３）。

【0065】

ラジカル消去率（％）は、以下式で求めた。
ラジカル消去率（％）＝［Ａ_ブランク－（Ａ_サンプル－Ａ_{サンプルブランク}）］／Ａ_ブランク×１００
Ａ_ブランクはブランクの吸光度、Ａ_サンプルはサンプル液の吸光度、Ａ_{サンプルブランク}はサンプルブランクの吸光度である。

【0066】

結果を図１０に示す。本発明の化合物、ＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢは濃度依存的にＤＰＰＨラジカルを消去することが示された。これにより、ＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢはラジカル消去活性、すなわち抗酸化活性を有することがわかった。

【0067】

［実施例５］
５．ＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢの抗酸化活性（２）
実施例２で得たＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢを用いて、ＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢが、生細胞中の活性酸素種（ＲｅａｃｔｉｖｅＯｘｙｇｅｎＳｐｅｃｉｅｓ：ＲＯＳ）の生成に与える影響を調べた。

【0068】

（ア）生細胞及びその細胞培養条件
本試験においては、生細胞として、ヒト肝由来腫瘍細胞株であるＨｅｐＧ２細胞を用いた。ＨｅｐＧ２細胞は、ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μＭ／ｍＬストレプトマイシンを含む）で３７℃、５％ＣＯ_２存在下、飽和湿度条件下で培養した。

【0069】

（イ）サンプル液の調製
ＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢをＤＭＥＭ培地で希釈し、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、５０μＭ及び１００μＭの異なる濃度のサンプル液を得た。

【0070】

（ウ）ＨｅｐＧ２細胞に対する細胞毒性の検討
まず、ＭＴＴ試験により、ＨｅｐＧ２細胞に対するＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢの細胞毒性の有無の確認を行った。３代以上継代培養されたＨｅｐＧ２細胞をトリプシン処理し、１×１０^５個／ｍＬの濃度の単一細胞の懸濁液を調製した。９６ウェルマイクロプレートの各ウェルにこの細胞懸濁液を１００μＬずつ播種し、ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養した。培養後、上清を除去して、対照（ブランクコントロール）群と試験群とに分け、対照群にはＤＭＥＭ培地を２００μＬ添加し、試験群には上記（イ）のサンプル液をそれぞれ２００μＬずつ添加した。ＣＯ_２インキュベーターで４８時間培養した後、上清を除去し、０．５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを１００μＬずつ添加した。４時間後、上清を除去し、ＤＭＳＯを１５０μＬずつ添加し、マイクロプレートリーダーにて５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。試験は対照群、試験群における各濃度のサンプル液について、３回（３ウェル）ずつ行った（ｎ＝３）。

【0071】

結果を図１１に示す。対照（ブランクコントロール）群の値を１００として、試験群の細胞生存率を算出した。１～１００μＭの濃度において、本発明の化合物であるＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢは、ＨｅｐＧ２細胞に対する細胞毒性を有さないことがわかった。

【0072】

（エ）ＨｅｐＧ２細胞中のＲＯＳの測定
１×１０^５個／ｍＬの濃度のＨｅｐＧ２細胞懸濁液を調製し、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルにこの細胞懸濁液を１００μＬずつ播種し、ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養した。これをブランクコントロール群、陽性対照群及び試験群に分け、ブランクコントロール群にはＤＭＥＭ培地を１００μＬ添加し、陽性対照群にはＬ－アスコルビン酸をＤＭＥＭ培地に溶解させた溶液を１００μＬ添加し（Ｌ－アスコルビン酸の最終濃度：１００μＭ）、試験群にはＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢをＤＭＥＭ培地で適宜希釈した溶液を異なる濃度（最終濃度：１μＭ、５μＭ、１０μＭ、５０μＭ及び１００μＭ）となるように１００μＬずつ添加した。ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養した後、各ウェルから培養液を除去し、無血清培地を１００μＬ加えて洗浄することを３回繰り返した。次に、１０μＭのＤＣＦＨ－ＤＡ（2',7'-Dichlorofluorescin diacetate）を１００μＬずつ各ウェルに加え、ＣＯ_２インキュベーターで６０分間インキュベートした後、各ウェルからＤＣＦＨ－ＤＡを除去し、無血清培地を１００μＬ加えて洗浄することを３回繰り返した。最後に無血清培地で希釈した４００μＭの過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を１００μＬずつ各ウェルに添加し、９０分間インキュベートした。その後、ウェル内の培地を除去し、１００μＬのＰＢＳを加え、励起波長４８５ｎｍで５３５ｎｍにおける蛍光強度を測定した。ブランクコントロール群の蛍光強度を１．０（Ｂａｓａｌ）として、陽性対照群及び試験群のＲＯＳ生成量を算出した。試験はブランクコントロール群、陽性対照群及び試験群における各濃度のサンプル液について、３回（３ウェル）ずつ行った（ｎ＝３）。

【0073】

結果を図１２に示す。Ｖｉｔ．Ｃは陽性対照である１００μＭのＬ－アスコルビン酸を示している。本発明の化合物であるＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢは、ＨｅｐＧ２細胞中で過酸化水素によって誘発されるＲＯＳの増加を濃度依存的に阻害することが示された。これにより、ＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢは生細胞中におけるＲＯＳの生成量を低減させる抗酸化活性を有することがわかった。

【0074】

［実施例６］
６．ＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢのメラニン生成抑制効果
実施例２で得たＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢを用いて、ＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢのメラニン生成抑制効果を調べた。

【0075】

（ア）細胞培養条件
本試験においては、Ｂ１６メラノーマ細胞を用いた。Ｂ１６メラノーマ細胞は、マウス皮膚の黒色腫瘍由来細胞株であり、メラニン産生能を有している。Ｂ１６メラノーマ細胞は、ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μＭ／ｍＬストレプトマイシンを含む）で３７℃、５％ＣＯ_２存在下、飽和湿度条件下で培養した。

【0076】

【0077】

（ウ）Ｂ１６メラノーマ細胞に対する細胞毒性の検討
まず、ＭＴＴ試験により、Ｂ１６メラノーマ細胞に対するＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢの細胞毒性の有無の確認を行った。３代以上継代培養されたＢ１６メラノーマ細胞をトリプシン処理し、３×１０^４個／ｍＬの濃度の単一細胞の懸濁液を調製した。９６ウェルマイクロプレートの各ウェルにこの細胞懸濁液を１００μＬずつ播種し、ＣＯ_２インキュベーターで一晩インキュベートした。各ウェルから上清を除去して、対照（ブランクコントロール）群と試験群とに分け、対照群にはＤＭＥＭ培地を２００μＬ添加し、試験群には上記（イ）のサンプル液をそれぞれ２００μＬずつ添加した。ＣＯ_２インキュベーターで４８時間培養した後、上清を除去し、０．５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを１００μＬずつ添加した。４時間後、上清を除去し、ＤＭＳＯを１５０μＬずつ添加し、マイクロプレートリーダーにて５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。試験は対照群及び試験群における各濃度のサンプル液について、３回（３ウェル）ずつ行った（ｎ＝３）。

【0078】

結果を図１３に示す。対照（ブランクコントロール）群の値を１００として、試験群の細胞生存率を算出した。１～１００μＭの濃度において、本発明の化合物であるＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢは、Ｂ１６メラノーマ細胞に対する細胞毒性を有さないことがわかった。

【0079】

（エ）Ｂ１６メラノーマ細胞のメラニン生成量の測定
Ｂ１６メラノーマ細胞の単一細胞の懸濁液を調製し、１２ウェルマイクロプレートの各ウェルに４×１０^４個のＢ１６メラノーマ細胞をそれぞれ播種した。ＣＯ_２インキュベーターで一晩培養した後、上清を除去し、ブランクコントロール群、陽性対照群及び試験群に分けた。ブランクコントロール群にはＤＭＥＭ培地を１ｍＬ添加し、陽性対照群にはＬ－アスコルビン酸を異なる濃度でＤＭＥＭ培地に溶解させた溶液（Ｌ－アスコルビン酸の濃度：０．１μＭ、５μＭ、１０μＭ）を１ｍＬずつ添加し、試験群には上記（イ）のサンプル液をそれぞれ１ｍＬずつ添加した。４８時間培養した後、各ウェルから上清を除去し、ＰＢＳバッファーで２回洗浄した後、トリプシン処理を行い、１．２ｍＬのＰＢＳバッファーを加えて単一細胞の懸濁液を調製した。この細胞懸濁液のうち２００μＬを分取し、蛋白質含有量を決定した。また、残りの細胞懸濁液は３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去した後、１％ＤＭＳＯを含む１ＭのＮａＯＨ溶液を２５０μＬ加え、８０℃に加温したウォーターバスで３０分間溶解させた。この溶解液の２００μＬを取り、４０５ｎｍにおける吸光度（Ａ_試験群、Ａ_{陽性対照群}、Ａ_{ブランクコントロール群}）を測定した。試験はブランクコントロール群、陽性対照群及び試験群における各濃度のサンプル液について、３回（３ウェル）ずつ行った（ｎ＝３）。

【0080】

細胞内のメラニンの生成抑制率（％）は、以下式で求めた。
試験群のメラニンの生成抑制率（％）＝１－［（Ａ_試験群／試験群の蛋白質含有量）／（Ａ_{ブランクコントロール群}／ブランクコントロール群の蛋白質含有量）］。
陽性対照群のメラニンの生成抑制率（％）＝１－［（Ａ_{陽性対照群}／陽性対照群の蛋白質含有量）／（Ａ_{ブランクコントロール群}／ブランクコントロール群の蛋白質含有量）］。
ここで、Ａ_試験群は試験群の吸光度、Ａ_{陽性対照群}は陽性対照群の吸光度、Ａ_{ブランクコントロール群}はブランクコントロール群の吸光度である。

【0081】

結果を以下表１に示す。陽性対照であるＬ－アスコルビン酸は１０μＭの濃度において、メラニン生成に対する有意な抑制効果を示し（Ｐ＜０．０１）、その抑制率は３２．８％であった。他方、本発明の化合物であるＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢについても、１０～１００μＭの濃度において、Ｂ１６メラノーマ細胞のメラニン生成に対する有意な抑制効果が認められた（Ｐ＜０．０５）。ＣｅｒａｔｏｎｉａｓｉｌｉｑｕａＢのメラニン生成抑制効果はその濃度に比例して高くなり、１００μＭの濃度で３０％超ものメラニン生成抑制効果を示した。

【0082】

【表1】