特開 2022-185711 遺伝子組換えレンギョウおよびそれを用いる有用二次代謝産物の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022185711

(43)【公開日】2022-12-15

(54)【発明の名称】遺伝子組換えレンギョウおよびそれを用いる有用二次代謝産物の製造方法

(51)【国際特許分類】

   A01H 5/00 20180101AFI20221208BHJP

   A01H 1/00 20060101ALI20221208BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20221208BHJP

【ＦＩ】

A01H5/00 A

A01H1/00 A ZNA

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021093493

(22)【出願日】2021-06-03

(71)【出願人】

【識別番号】511046058

【氏名又は名称】公益財団法人サントリー生命科学財団

(74)【代理人】

【識別番号】100077012

【弁理士】

【氏名又は名称】岩谷 龍

(72)【発明者】

【氏名】小山 知嗣

(72)【発明者】

【氏名】村田 純

(72)【発明者】

【氏名】堀川 学

(72)【発明者】

【氏名】松本 えりか

(72)【発明者】

【氏名】奥田 利美

(72)【発明者】

【氏名】佐竹 炎

【テーマコード（参考）】

2B030

【Ｆターム（参考）】

2B030AA03

2B030AB03

2B030AD08

2B030CA17

2B030CB02

2B030CD17

(57)【要約】

【課題】非内因性の有用二次代謝産物を産生できる遺伝子組換え木本植物提供することを課題とする。また、本発明は、該遺伝子組換え木本植物を用いて、非内因性の有用二次代謝産物を製造する方法を提供すること。
【解決手段】非内因性の有用二次代謝産物を産生するための外来遺伝子が、発現可能にゲノムに導入されていることを特徴とする遺伝子組換えレンギョウ、ならびに、（１）請求項４～６のいずれかに記載の遺伝子組換えレンギョウを栽培する工程、および（２）前記遺伝子組換えレンギョウから、ピペリトール、セサミンまたはピペリトールとセサミンの混合物を精製する工程を含む、ピペリトールおよび／またはセサミンの製造方法。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

非内因性の有用二次代謝産物を産生するための外来遺伝子が、発現可能にゲノムに導入されていることを特徴とする遺伝子組換えレンギョウ。

【請求項2】

栄養繁殖個体である、請求項１に記載の遺伝子組換えレンギョウ。

【請求項3】

非内因性の有用二次代謝産物が非内因性リグナンである、請求項１または２に記載の遺伝子組換えレンギョウ。

【請求項4】

外来遺伝子がゴマセサミン合成酵素をコードする遺伝子である、請求項１～３のいずれかに記載の遺伝子組換えレンギョウ。

【請求項5】

ゴマセサミン合成酵素が配列番号１または配列番号３に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる、請求項４に記載の遺伝子組換えレンギョウ。

【請求項6】

非内因性リグナンがピペリトールおよびセサミンである、請求項４または５に記載の遺伝子組換えレンギョウ。

【請求項7】

Ｆｉ３５Ｓ：ＣＹＰ８１Ｑ１（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ－２２３８２）またはＦｋ３５Ｓ：ＣＹＰ８１Ｑ１（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ－２２３８３）である請求項５または６に記載の遺伝子組換えレンギョウ。

【請求項8】

以下の工程（１）および（２）を含むピペリトールおよび／またはセサミンの製造方法：
（１）請求項４～６のいずれかに記載の遺伝子組換えレンギョウを栽培する工程、
（２）前記遺伝子組換えレンギョウから、ピペリトール、セサミンまたはピペリトールとセサミンの混合物を精製する工程。

【請求項9】

前記遺伝子組換えレンギョウが栄養繁殖個体である、請求項８に記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、遺伝子組換えレンギョウおよびそれを用いる有用二次代謝産物の製造方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

ゴマ（Sesamum indicum）種子中に含まれているセサミンは、多様な生理活性を有することが明らかにされており、コレステロール代謝、肝機能、免疫機能等の改善に有効であることが知られている。セサミンをゴマ種子あるいはゴマ種子の絞り粕から分離精製する方法はすでに実用化されており（特許文献１、２参照）、セサミンを主成分とする、アルコール分解促進作用などを有する肝機能活性増強剤が市販されている。しかし、セサミンの原料素材として供給可能であるのは、ゴマ油製品類の精製工程での副産物であり、ゴマ油製品類の需要の変動により供給が困難となることが危惧される。さらに、通常ゴマ種子は１年に１回しか収穫されない。しかも日本では、使用するゴマ種子のほとんどを輸入に依存している。それゆえ、今後のセサミンの需要増加を考慮すれば、安定的な原材料供給源の確保が課題となる。

【0003】

これまでに、持続可能なセサミン供給体として、レンギョウ遺伝子組換え細胞U18i-CPi-Fkを開発した（特許文献３、非特許文献１）。同生産体は、赤色LED下で高いセサミン生産能力を示すとともに、アルギン酸ナトリウムビーズを用いた液体窒素下で長期保存できる性質を有していた。一方、大量培養するためには大規模な培養施設が必要になることや、大規模培養した場合に均一な赤色LED照射が不可能であるため、生産効率が非常に低下する可能性があるいう欠点があった。

【0004】

近年、酵母などの微生物に合成生物学的な手法で目的物質を多数導入して植物二次代謝産物を生産する報告が相次いでいるが、有用ゴマ由来リグナンを生産する微生物の開発に至っていない。また、このような微生物が開発されたとしても、商用ベースに耐える大規模な培養が困難であることに加え、多種の植物由来遺伝子を微生物に導入するため、これらの遺伝子が欠損・変異することで目的とする物質の生産効率が著しく低下することが懸念される。これまでにシロイヌナズナにゴマ由来生合成酵素遺伝子(CYP81Q1)を導入しセサミンを生産した例があるものの非常に微量であるため、生産体としては脆弱なものであった。以上の背景から、効率的にセサミンを生産する遺伝子組換え植物体の開発が望まれた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開平１０－７６７６号公報

【特許文献2】特開２００１－１３９５７９公報

【特許文献3】特開２０１５－１８８４４２公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Murata J, Matsumoto E, Morimoto K, Koyama T, Satake H. Generation of triple-transgenic Forsythia cell cultures as a platform for the efficient, stable, and sustainable production of lignans. PLOS One 10 e0144519 (2016)

【非特許文献2】Tera M, Koyama T, Murata J, Furukawa A, Mori S, Azuma T, Watanabe T, Hori K, Okazawa A, Kabe Y, Suematsu M, Satake H, Ono E, Horikawa M. Identification of a binding protein for sesamin and characterization of its roles in plant growth. Scientific Reports 9 8631 (2019)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、非内因性の有用二次代謝産物を産生できる遺伝子組換え木本植物提供することを課題とする。また、本発明は、該遺伝子組換え木本植物を用いて、非内因性の有用二次代謝産物を製造する方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、上記の課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］非内因性の有用二次代謝産物を産生するための外来遺伝子が、発現可能にゲノムに導入されていることを特徴とする遺伝子組換えレンギョウ。
［２］栄養繁殖個体である、前記［１］に記載の遺伝子組換えレンギョウ。
［３］非内因性の有用二次代謝産物が非内因性リグナンである、前記［１］または［２］に記載の遺伝子組換えレンギョウ。
［４］外来遺伝子がゴマセサミン合成酵素をコードする遺伝子である、前記［１］～［３］のいずれかに記載の遺伝子組換えレンギョウ。
［５］ゴマセサミン合成酵素が配列番号１または配列番号３に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる、前記［４］に記載の遺伝子組換えレンギョウ。
［６］非内因性リグナンがピペリトールおよびセサミンである、前記［４］または［５］に記載の遺伝子組換えレンギョウ。
［７］Ｆｉ３５Ｓ：ＣＹＰ８１Ｑ１（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ－２２３８２）またはＦｋ３５Ｓ：ＣＹＰ８１Ｑ１（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ－２２３８３）である前記［５］または［６］に記載の遺伝子組換えレンギョウ。
［８］以下の工程（１）および（２）を含むピペリトールおよび／またはセサミンの製造方法：
（１）請求項４～６のいずれかに記載の遺伝子組換えレンギョウを栽培する工程、
（２）前記遺伝子組換えレンギョウから、ピペリトール、セサミンまたはピペリトールとセサミンの混合物を精製する工程。
［９］前記遺伝子組換えレンギョウが栄養繁殖個体である、前記［８］に記載の製造方法。

【発明の効果】

【0009】

本発明により、非内因性の有用二次代謝産物を産生できる遺伝子組換え木本植物を提供することができる。また、本発明により該遺伝子組換え木本植物を用いる非内因性の有用二次代謝産物を製造する方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】リグナン代謝経路を示す模式図である。

【図2】核局在型ＧＦＰ（ｎＧＦＰ）遺伝子発現用プラスミドの構造を示す図である。

【図3】レンギョウから切り出した葉片をアグロバクテリウム懸濁液に浸漬し、カルス誘導培地で共存培養した後、除菌用のシュート誘導培地に静置した葉片の画像である。

【図4】（Ａ）は葉片をカナマイシン入り選択培地で培養し、カルス形成を経て不定芽が形成された状態を示す画像であり、（Ｂ）は不定芽が成長して茎が伸長した状態を示す画像であり、（Ｃ）は不定芽におけるＧＦＰ蛍光を示す図である。

【図5】（Ａ）は発根したｎＧＦＰ組換えアイノコレンギョウを土に植え替え、健全に生育した状態を示す図であり、（Ｂ）は野生型アイノコレンギョウ（左）およびｎＧＦＰ組換えアイノコレンギョウ（右）の展開様におけるＧＦＰ蛍光を検出した画像である。

【図6】ｎＧＦＰ遺伝子組換えアイノコレンギョウおよび野生型（ＷＴ）アイノコレンギョウからそれぞれゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡを抽出し、ｎＧＦＰ遺伝子、ＮＰＴＩＩ遺伝子およびｎＧＦＰ遺伝子転写産物の存在を確認した結果を示す図であり、（Ａ）はゲノムＰＣＲの結果、（Ｂ）はＲＴ－ＰＣＲの結果を示す図である。

【図7】ゴマセサミン生合成酵素（ＣＹＰ８１Ｑ１）遺伝子発現用プラスミドの構造を示す図である。

【図8】（Ａ）はＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えアイノコレンギョウ（右）およびｎＧＦＰ遺伝子遺伝子組換えアイノコレンギョウ（左）の各植物体の画像であり、（Ｂ）はＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えチョウセンレンギョウ（右）および野生型（ＷＴ）チョウセンレンギョウ（左）の各植物体の画像である。

【図9】ＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えアイノコレンギョウ、ｎＧＦＰ遺伝子組換えアイノコレンギョウ、ＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えチョウセンレンギョウおよび野生型（ＷＴ）チョウセンレンギョウからそれぞれゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡを抽出し、ＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子、ＮＰＴＩＩ遺伝子およびＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子転写産物の存在を確認した結果を示す図であり、（Ａ）はアイノコレンギョウのゲノムＰＣＲの結果、（Ｂ）はアイノコレンギョウのＲＴ－ＰＣＲの結果、（Ｃ）はチョウセンレンギョウのゲノムＰＣＲの結果、（Ｄ）はチョウセンレンギョウのＲＴ－ＰＣＲの結果を示す図である。

【図10】土に植えて２か月生育させたＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えアイノコレンギョウ、ｎＧＦＰ遺伝子組換えアイノコレンギョウ、ＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えチョウセンレンギョウおよび野生型（ＷＴ）チョウセンレンギョウからそれぞれ若い展開葉を収穫し、リグナン類を抽出・精製したサンプルをＨＰＬＣに供し、ピペリトール（Ｐ１）とセサミン（Ｐ２）を検出した結果を示す図である。

【図11】図１０で用いたサンプルをＬＣ－ＭＳに供し、ピペリトール（Ｐ１）とセサミン（Ｐ２）を検出した結果を示す図である。

【図12】アグロバクテリウムを感染させた葉片を培養して作製した遺伝子組換えレンギョウ（オリジナル）、オリジナルを挿し木して生育させた栄養繁殖レンギョウ（２回目）および２回目を挿し木して生育させた栄養繁殖レンギョウ（３回目）から葉を収穫し、リグナン類を抽出・精製したサンプルをＨＰＬＣに供し、ピペリトールとセサミンを測定した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

〔遺伝子組換えレンギョウ〕
本発明は、非内因性の有用二次代謝産物を産生する遺伝子組換えレンギョウを提供する。本発明の遺伝子組換えレンギョウは、非内因性の有用二次代謝産物を産生するための外来遺伝子が、発現可能にゲノムに導入されているものであればよい。本発明の遺伝子組換えレンギョウは、挿し木や水耕栽培で栄養繁殖することができ、栄養繁殖した次世代以降の遺伝子組換えレンギョウにおいても有用二次代謝産物の産生能が維持される点で、非常に有用である。

【0012】

レンギョウはモクセイ科レンギョウ属の多年生木本植物の総称であり、丈夫で繁殖力が高く、栽培が容易な落葉性低木広葉樹である。代表的な種としては中国原産種であるレンギョウ（Forsythia suspensa）、シナレンギョウ（Forsythia viridissima）、朝鮮半島原産種であるチョウセンレンギョウ（Forsythia koreana）、日本原産種であるヤマトレンギョウ（Forsythia japonica）、ショウドシマレンギョウ（Forsythia togashii）、ヨーロッパ原産種であるセイヨウレンギョウ（Forsythia europaea）などが知られている。本国においては、チョウセンレンギョウ（Forsythia koreana）がいわゆる「レンギョウ」として一般に植栽されている。また園芸種としては、レンギョウとシナレンギョウを交配し品種改良を行ったアイノコレンギョウ（Forsythia intermedia）が広く流通している。

【0013】

レンギョウは、ピノレジノール・ラリシレジノール還元酵素およびピノレジノール配糖化酵素を発現する木本植物であって、ピノレジノールを多く蓄積し、二次代謝物としてトリテルペン、モノテルペングリコシド、リグナンなどを蓄積している。これらの成分は解熱剤、消炎剤、利尿剤、排膿剤、鎮痛薬として漢方医薬に用いられるほか、強い抗菌作用を示す生薬として古くから用いられている。

【0014】

非内因性の有用二次代謝産物は特に限定されず、レンギョウの植物体において天然には見出されない有用二次代謝産物であればよい。非内因性の有用二次代謝産物はリグナンでもよく、非リグナンでもよい。非内因性のリグナンとしては、例えばセサミン（sesamin）、ピペリトール（piperitol）、セサモリン（sesamolin）、セサミノール（sesaminol）、セサミノールトリグルコシド（sesaminol triglucoside）、プルビアチロール（pluviatilol）、ヒノキニン（hinokinin）、プルビアトリド（pluviatolide）、ヤテイン（yatein）、５’－デスメチルヤテイン（5'-desmethyl-yatein）、デオキシポドフィロトキシン（Deoxypodophyllotoxin）、４’－デスメチルデオキシポドフィロトキシン（4'-desmethyldeoxypodophyllotoxin）、４’－デスメチルエピポドフィロトキシン（4'-desmethylepipodophyllotoxin）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。非リグナンとしては、レチクリン（reticuline）、ベルベリン（berberine）、リモネン（limonene）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0015】

セサミンはゴマ種子中に含まれる主要なリグナンであり、上記のとおり多様な生理活性を有することが知られている。ピペリトールは、セサミンを中間産物とするリグナン代謝経路におけるセサミン前駆体である（図１参照）。セサミンおよびピペリトールは、レンギョウにセサミン合成酵素遺伝子（例えば、ＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子またはＣＹＰ８１Ｑ２遺伝子）を導入することにより産生させることができる。

【0016】

セサモリン、セサミノール、セサミノールトリグルコシドもゴマ種子中に含まれるリグナンであり、セサモリンはセサミノールの前駆体、セサミノールトリグルコシドはセサミノール配糖体である。セサモリンおよびセサミノールは、例えばＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子とＣＹＰ９２Ｂ１４遺伝子をレンギョウに導入することにより産生させることができる（図１参照）。セサミノールトリグルコシドは、例えばＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子とＣＹＰ９２Ｂ１４遺伝子を導入したレンギョウに、ＵＧＴ７１Ａ９遺伝子、ＵＧＴ９４ＡＧ１遺伝子およびＵＧＴ９４ＡＡ２遺伝子を導入することにより産生させることができる。

【0017】

プルビアチロールは、例えばＣＹＰ８１Ｑ３遺伝子をレンギョウに導入することにより産生させることができる。ヒノキニンは、例えばＰＣＢＥＲ遺伝子をレンギョウに導入することにより産生させることができる。プルビアトリドは、例えばＣＹＰ７１９Ａ２３遺伝子をレンギョウに導入することにより産生させることができる。ヤテインは、例えばＯＭＴ１遺伝子をレンギョウに導入することにより産生させることができる。５’－デスメチルヤテインは、例えばＣＹＰ７１ＣＵ１遺伝子をレンギョウに導入することにより産生させることができる。デオキシポドフィロトキシンは、例えば２－ＯＤＤ遺伝子をレンギョウに導入することにより産生させることができる。４’－デスメチルデオキシポドフィロトキシンは、例えばＣＹＰ７１ＢＥ５４遺伝子をレンギョウに導入することにより産生させることができる。４’－デスメチルエピポドフィロトキシンは、例えばＣＹＰ８２Ｄ６１遺伝子をレンギョウに導入することにより産生させることができる。レチクリンは、例えば４’ＯＭＴ遺伝子をレンギョウに導入することにより産生させることができる。ベルベリンは、例えばＴＨＢＯ遺伝子をレンギョウに導入することにより産生させることができる。リモネンは、例えばリモネン合成酵素遺伝子をレンギョウに導入することにより産生させることができる。

【0018】

上記例示した各外来遺伝子の塩基配列は、公知のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等）から容易に取得することができる。取得した塩基配列情報に基づき、所望の外来遺伝子が挿入させた発現ベクターを構築することができる。

【0019】

本発明の遺伝子組換えレンギョウに産生させる非内因性の有用二次代謝産物は、非内因性リグナンであることが好ましい。なかでも、ゴマのリグナンが好ましく、ゴマのリグナンとしては、セサミンおよびピペリトールが好ましい。セサミンおよびピペリトールを産生する遺伝子組換えレンギョウは、レンギョウにセサミン合成酵素遺伝子を導入することにより作製することができる。例えば、ゴマのセサミン合成酵素遺伝子を好適に用いることができる。ゴマのセサミン合成酵素としては、Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍから単離されたチトクロームＰ－４５０であるＣＹＰ８１Ｑ１およびＳｅｓａｍｕｍ ｒａｄｉａｔｕｍから単離されたチトクロームＰ－４５０であるＣＹＰ８１Ｑ２が知られている（Ono, E. et al., (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 10116-10121.）。

【0020】

ゴマのセサミン合成酵素遺伝子は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。配列番号１に示されるアミノ酸配列はＳｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ ＣＹＰ８１Ｑ１のアミノ酸配列であり、アクセッション番号ＢＡＥ４８２３４．１としてＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースに登録されている。また、ゴマのセサミン合成酵素遺伝子は、配列番号３に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。配列番号３に示されるアミノ酸配列はＳｅｓａｍｕｍ ｒａｄｉａｔｕｍ ＣＹＰ８１Ｑ２のアミノ酸配列であり、アクセッション番号ＢＡＥ４８２３５．１としてＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースに登録されている。

【0021】

配列番号１に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質であることが好ましい。具体的には、セサミン合成酵素活性が、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質のセサミン合成酵素活性と同等（例えば、約０．５～２倍）であることが好ましい。配列番号３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質についても同じである。

【0022】

配列番号１に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。「１～数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。このような変異タンパク質は、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するタンパク質に限定されるものではなく、天然に存在するタンパク質を単離精製したものであってもよい。また、実質的に同一のアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列が挙げられる。配列番号３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列についても同じである。

【0023】

配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍのセサミン合成酵素であるＣＹＰ８１Ｑ１）をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号２で示される塩基配列を含むＤＮＡを用いることができ、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｓｅｓａｍｕｍ ｒａｄｉａｔｕｍのセサミン合成酵素であるＣＹＰ８１Ｑ２）をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号４で示される塩基配列を含むＤＮＡを用いることができる。配列番号２で示される塩基配列はアクセッション番号ＡＢ１９４７１４．１として、配列番号４で示される塩基配列はアクセッション番号ＡＢ１９４７１５．１として、としてＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースに登録されている。

【0024】

本発明の遺伝子組換えレンギョウを作製する方法は特に限定されず、公知の植物遺伝子組み換え技術、植物細胞培養技術および植物再分化技術を用いて行うことができる。例えば、目的の非内因性の有用二次代謝産物を産生するための外来遺伝子発現ベクターを作製し、これをレンギョウ細胞に導入し、形質転換レンギョウ細胞を取得し、これを培養してレンギョウ植物体を再分化させる方法が挙げられる。ただし、これに限定されるものではない。

【0025】

発現ベクターは、植物細胞内で発現を可能とするプロモーターと、植物細胞内で発現させる遺伝子を含むように構築する。発現ベクターの母体となるベクターには、公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、コスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。特に、植物細胞へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１等を挙げることができる。

【0026】

プロモーターは、植物細胞内で導入した遺伝子を発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、各種アクチン遺伝子プロモーター、各種ユビキチン遺伝子プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、ナピン遺伝子プロモーター、オレオシン遺伝子プロモーター等を挙げることができる。この中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、アクチン遺伝子プロモーターまたはユビキチン遺伝子プロモーターを好ましく用いることができる。上記各プロモーターを用いれば、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。

【0027】

発現ベクターは、プロモーターおよび植物細胞内で発現させる遺伝子に加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、例えば、ターミネーター、選別マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、発現ベクターは、さらにＴ－ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ－ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて発現ベクターを植物細胞に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。

【0028】

転写ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものを好適に用いることができる。例えば、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。なかでもＮｏｓターミネーターがより好ましい。発現ベクターに転写ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成されることを防止することができる。

【0029】

選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。具体的には、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。発現ベクターが薬剤耐性遺伝子を含むことにより、選択薬剤を含む培地中で生育する植物細胞を選択すれば、目的の形質転換植物細胞を容易に取得することができる。

【0030】

翻訳効率を高めるための塩基配列としては、例えば、タバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーターの非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、目的遺伝子の翻訳効率を高めることができる。

【0031】

発現ベクターを、レンギョウ培養細胞またはレンギョウ植物体の一部（例えば、葉、茎など）に導入し、カルス誘導を経て再分化させる方法を用いて本発明の遺伝子組換えレンギョウを作製することができる。発現ベクターは、一般的な形質転換方法によって植物体の一部または植物培養細胞に導入することができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接植物細胞に導入する方法を用いることができる。発現ベクターを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。発現ベクターを導入したアグロバクテリウムを植物へ感染させる手法としては、例えば、リーフディスク法（Horsch, R.＆B.、 et al.: A simple and general method for trams-ferring cloned genes into plants. Science,227、 1229-1231, 1985）、プロトプラスト共存培養法（Marton, L., et al.: In vitro transformation of cultured cell from Nicotiana tabacum by Agrobacterium tumefaciens. Nature,277, 129-131, 1981）、カルス再生法（Plant Cell Reports, 12,7-11,1992）、減圧浸潤法（The Plant Journal, 19(3), 249-257, 1999）等を採用することができるがこれらに限定されない。

【0032】

例えばレンギョウの葉片にアグロバクテリウムを感染させて発現ベクターを導入する場合、レンギョウの葉の表面を７０％アルコール、１％次亜塩素酸ナトリウム溶液等を用いて滅菌した後、メス等を用いて適当な大きさの葉片を切り出し、アグロバクテリウム懸濁液に浸漬してアグロバクテリウムに感染させる。アグロバクテリウムに感染した葉片を、カルス誘導培地およびシュート誘導培地（再分化用培地）で培養してレンギョウ植物体を再分化させる。遺伝子組換え体を選択するために、発現ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の種類に応じて、抗生物質等の薬剤を添加した培地を用いることが好ましい。

【0033】

カルス誘導培地およびシュート誘導培地には、植物組織培養に通常用いられるムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地、リンズマイヤー・スクーグ（ＬＳ）培地、ホワイト培地、ガンボーグＢ５培地、ニッチェ培地、ヘラー培地、モーレル培地等の基本培地（必要に応じて、カゼイン分解酵素、コーンスティープリカー、ビタミン類等をさらに補充することができる）に、オーキシン類および必要に応じてサイトカイニン類等の植物生長調節物質（植物ホルモン）を適当な濃度で添加した培地を用いることができる。オーキシン類としては、例えば、３－インドール酢酸（ＩＡＡ）、３－インドール酪酸（ＩＢＡ）、１－ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）等が挙げられるが、それらに限定されない。オーキシン類は、例えば、約０．１～約１０ｐｐｍの濃度で培地に添加され得る。サイトカイニン類としては、例えば、カイネチン、ベンジルアデニン（ＢＡ）、ゼアチン等が挙げられるが、それらに限定されない。サイトカイニン類は、例えば、約０．１～約１０ｐｐｍの濃度で培地に添加され得る。

【0034】

カルスから伸長した不定芽を切り取って培地に植え継ぎ、発根が認められるまで継代培養を続ける。さらに培養を続け、高さが１０～１５ｃｍ程度になったレンギョウ培養植物の先端部（約５ｃｍ）を土に移植し、定法にしたがって栽培を行う。得られたレンギョウ植物体のゲノムに外来遺伝子が導入されていることは、対象のレンギョウ植物体からゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション、塩基配列解析等によって確認することができる。

【0035】

本発明の遺伝子組換えレンギョウは、挿し木や水耕栽培で栄養繁殖することができる。それゆえ、遺伝子組み換え技術を用いて目的の遺伝子組換えレンギョウを樹立した後は、栄養繁殖により、遺伝的に同一である遺伝子組換えレンギョウを容易に増やすことができる。したがって、本発明の遺伝子組換えレンギョウは、栄養繁殖個体であってもよい。挿し木による栄養繁殖の方法は特に限定されず、枝を土に挿し、水やり等の通常の栽培を行えばよい。水耕栽培による栄養繁殖の方法は特に限定されず、枝を水に漬けて発根させればよい。十分に発根させた後土に植え替えることができる。植物による有用物質の製造を産業として実施するためにはスケールアップが必要であり、遺伝的背景が同一で目的の有用物質を製造する能力を保持する多数の植物を栽培し、いわゆる植物工場を立ち上げることが必須である。本発明の遺伝子組換えレンギョウは、上記の通り、挿し木や水耕栽培で栄養繁殖することができるので、産業として植物工場を立ち上げるための植物として非常に有用である。

【0036】

本発明の遺伝子組換えレンギョウは、本発明者らにより作製された、ゴマＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子がゲノムに導入され、セサミンおよびピペリトールを産生する遺伝子組換えアイノコレンギョウ（識別の表示Ｆｉ３５Ｓ：ＣＹＰ８１Ｑ１、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－２２３８２として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託済み。受託日：２０１９年９月１８日）であってもよく、本発明者らにより作製された、ゴマＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子がゲノムに導入され、セサミンおよびピペリトールを産生する遺伝子組換えチョウセンレンギョウ（識別の表示Ｆｋ３５Ｓ：ＣＹＰ８１Ｑ１、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－２２３８３として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託済み。受託日：２０１９年９月１８日）であってもよい。

【0037】

〔ピペリトールおよび／またはセサミンの製造方法〕
本発明は、ピペリトールおよび／またはセサミンの製造方法を提供する。本発明の製造方法は、以下の工程（１）および（２）を含むものであればよい。
（１）ゴマセサミン合成酵素をコードする遺伝子が発現可能にゲノムに導入されている遺伝子組換えレンギョウを栽培する工程、
（２）前記遺伝子組換えレンギョウから、ピペリトール、セサミンまたはピペリトールとセサミンの混合物を精製する工程。

【0038】

工程（１）では、ゴマセサミン合成酵素をコードする遺伝子が、発現可能にゲノムに導入されている遺伝子組換えレンギョウを栽培する。当該遺伝子組換えレンギョウは、前段で説明したとおり、公知の植物遺伝子組み換え技術、植物細胞培養技術および植物再分化技術を用いて作製して用いることができる。また、作製した遺伝子組換えレンギョウから挿し木や水耕栽培で栄養繁殖させた遺伝子組換えレンギョウ（栄養繁殖個体）を用いてもよい。当該遺伝子組換えレンギョウは、上記の寄託株であるＦｉ３５Ｓ：ＣＹＰ８１Ｑ１またはＦｋ３５Ｓ：ＣＹＰ８１Ｑ１を用いてもよく、これらから挿し木で繁殖させた遺伝子組換えレンギョウを用いてもよい。

【0039】

工程（１）の栽培方法には、公知のレンギョウの栽培方法を用いることができ、園芸関連の書籍や、園芸関連のウェブサイトから容易に取得することができる。工程（１）の栽培期間は特に限定されず、栽培環境に応じて適宜設定することができる。例えば、高さが５０ｃｍ程度になるまで栽培してもよい。挿し木から高さが５０ｃｍ程度になるまでの期間は、通常４～５か月程度である。また、例えば、成熟葉を収穫できるようになるまで栽培してもよい。挿し木から成熟葉を収穫できるまでの期間は、通常１～２か月程度である。工程（２）において葉からピペリトール、セサミンまたはピペリトールとセサミンの混合物を精製する場合、葉を収穫した後、再度葉を収穫できるようになるまで、工程（１）を繰り返し行うことができる。

【0040】

工程（２）では、工程（１）で栽培した遺伝子組換えレンギョウから、ピペリトール、セサミンまたはピペリトールとセサミンの混合物を精製する。最初に、工程（１）の栽培期間を経た植物からその一部を回収する。回収する植物の部位は特に限定されず、葉、枝、根、花等のいずれの部位であってもよいが、回収の簡便性と通年の回収が可能である点で葉を回収することが好ましい。回収した植物の部位に対して、抽出に適した処理を行ってもよい。抽出に適した処理としては、例えば細切、破砕、乾燥、凍結粉砕、凍結乾燥などが挙げられる。

【0041】

ゴマセサミン合成酵素をコードする遺伝子が、発現可能にゲノムに導入されている遺伝子組換えレンギョウからセサミンおよびピペリトールを抽出および精製する方法は特に限定されず、公知の植物細胞抽出物の調製方法およびリグナン類の精製方法から適宜選択して用いることができる。例えば、本発明者らが、後段の実施例２で行った方法等が挙げられる。具体的には、凍結乾燥した葉を粉砕し、５０％メタノールを加えて６０℃に加温して抽出する。遠心分離して上清を凍結乾燥機で乾固させ、５０％メタノールに再懸濁してろ過する。このろ液がピペリトールとセサミンの混合精製物に相当する。ピペリトールおよびセサミンをそれぞれの精製物として回収する場合は、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分離することができる。具体的には、例えばMurataら（PLOS One 10 e0144519 (2016)）に記載された方法を用いることができる。

【0042】

本発明の製造方法を用いれば、セサミンとほぼ同容量のピペリトールを製造することができる。ピペリトールはゴマでは微量しか回収できないので、本発明の製造方法はピペリトールを効率よく製造する方法として有用である。また、本発明の製造方法を用いれば、遺伝子組換えレンギョウの葉からセサミンおよびピペリトールを抽出し、精製することができる。ゴマでは、種子からセサミンを抽出するが、種子は年に１回しか収穫できない。これに対して、遺伝子組換えレンギョウの葉は１年中収穫できるので、植物工場を構成する植物として優れている。また、遺伝子組換えレンギョウは挿し木や水耕栽培で栄養繁殖することができるので、容易にスケールアップできる点においても植物工場を構成する植物として非常に優れている。さらに、微生物や培養植物細胞を用いてセサミンおよびピペリトールを製造する場合と比較して、遺伝子組換えレンギョウの維持は低コストで行うことができるので、コストの大幅な低減が見込まれる。

【実施例0043】

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【0044】

〔参考例１：ゲノムに外来遺伝子が導入された遺伝子組換えレンギョウの作製〕
ゲノムに外来遺伝子が導入された遺伝子組換えレンギョウを作製するために、レンギョウ葉切片を用いた遺伝子組換え系を確立させた。

【0045】

（１）材料および方法
アイノコレンギョウ（Forsythia intermedia; Fi）は新潟植物園から、チョウセンレンギョウ（Forsythia koreana; Fk）は京都大学生存圏研究所・梅澤俊明博士から、それぞれ入手した。レンギョウの栽培条件は、１６時間明条件（照度：５０～７５μｍｏｌ／ｍ^２／秒）と８時間暗条件のサイクルを継続し、室温を２２℃とした。レンギョウを無菌培養するために、表面殺菌した植物体を、１／２濃度のＭＳ塩、ＭＳビタミン、３０ｇ／Ｌスクロース、５ｇ／Ｌアガーゲル、２２．５ｍｇ／Ｌ硫酸銅（II）（CuSO₄・5H₂O）を含む改変ＭＳ固形培地に挿し木し、２か月から３か月ごとに、１０ｃｍほどの植物体を切り取り、新しい培地へ移し継代した。

【0046】

外来遺伝子には、核局在型ＧＦＰ遺伝子（Koyama et al., Plant Physiology 162, 991-1005 (2013)参照）を使用した。核局在型ＧＦＰ遺伝子を、定法に従ってエレクトロポレーションによりアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens GV3101株）へ導入した。アグロバクテリウムに導入したプラスミドの模式図を図２に示す。構成的高発現カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターとノパリン合成酵素遺伝子（ＮＯＳ）ターミネーターの間に核移行型ＧＦＰ（ｎＧＦＰ）遺伝子を挿入した。ＮＬＳは核移行シグナル、ｎｐｔ ＩＩはカナマイシン耐性遺伝子である。得られた遺伝子組換えアグロバクテリウムを５０ｍｇ／Ｌカナマイシン、５０ｍｇ／Ｌゲンタマイシン、１００ｍｇ／Ｌリファンピシリンを含むＬＢ培地で、ＯＤ６００が２．０となるように、２７℃、１８０ｒｐｍで震盪培養した。

【0047】

次に、アグロバクテリウムを、遠心機（ＨＰ２５；Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて、５，０００×ｇで１５分間遠心分離することにより集菌し、ガンボーグＢ５塩、ＭＳビタミン、３０ｇ／Ｌスクロース、２．０ｍｇ／Ｌインドール－３－酢酸、０．５ｍｇ／Ｌ ６－ベンジルアデニン、２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴン、０．０２％ ５００Ｗ Ａｄｄｉｔｉｖｅ（ＤＯＷ Ｃｈｍｉｃａｌ）を含む懸濁液に再懸濁した。

【0048】

アグロバクテリウム懸濁液に、無菌培養したレンギョウから切り出した葉片（１ｃｍ×０．５ｃｍ）を浸し、２分間静置した。葉片をアグロバクテリウム懸濁液から取り出し、滅菌したろ紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．１、直径７０ｍｍ）を敷いたカルス誘導培地（ガンボーグＢ５、Ｂ５ビタミン、３０ｇ／Ｌスクロース、２．０ｍｇ／Ｌインドール－３－酢酸、０．５ｍｇ／Ｌ ６－ベンジルアデニン、２０ｍｇ／Ｌアセトシリンゴン、３ｇ／Ｌジェランガムを含む）に置き、３日間共存培養した。アグロバクテリウムを除菌するために、葉片を１０ｍｇ／Ｌメロペンを含むシュート誘導培地（ＭＳ塩、ＭＳビタミン、３０ｇ／Ｌスクロース、０．５ｍｇ／Ｌインドール‐３－酢酸、２．０ｍｇ／Ｌ ６－ベンジルアデニン、３ｇ／Ｌジェランガム）で、７日間培養した（図３）。

【0049】

遺伝子組換え体を選抜するために、葉片を１０ｍｇ／Ｌメロペンと、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン（チョウセンレンギョウの場合）あるいは７５ｍｇ／Ｌカナマイシン（アイノコレンギョウの場合）を含むシュート誘導培地に移し、２週間ごとに新鮮な培地に継代して、不定芽を形成するまで６か月間継代培養し（図４（Ａ）、（Ｂ））、ＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡Ｍ２０５ＦＡにより検出した（図４（Ｃ））。不定芽をメスで切り取り、１０ｍｇ／Ｌメロペンと、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン（チョウセンレンギョウの場合）あるいは７５ｍｇ／Ｌカナマイシン（アイノコレンギョウの場合）を含む改変ＭＳ固形培地で発根が認められるまで、６か月から１年６か月継代培養した。発根したレンギョウ培養植物を土に植え替え（図５（Ａ））、そのＧＦＰ蛍光を検出した（図５（Ｂ））。

【0050】

Ｐｒｏ３５Ｓ：ｎＧＦＰ遺伝子組換えアイノコレンギョウと野生型（ＷＴ）アイノコレンギョウから、ゲノムＤＮＡを調製するためにNucleon PhytoPure Genomic DNA Extraction kit（GE Healthcare）を用いた。全ＲＮＡを調製するためにRNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）を用い、さらに４Ｍ塩化リチウム沈殿処理とＤＮａｓｅ Ｉにより全ＲＮＡを精製し、SuperScript III（Thermo Fisher Scientific）により、逆転写した。ゲノムＤＮＡと逆転写産物をそれぞれ鋳型に用いて、ゲノムＰＣＲとＲＴ－ＰＣＲを行った。ＥｘＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Takara）を用いて、９６℃１５秒、６０℃１５秒、７２℃４５秒を１サイクルとして、最大３０サイクル増幅し、ＰＣＲ産物を定法に従ってアガロース電気泳動し、臭化エチジウムにより可視化した。増幅に使用したプライマーを以下に示す。
ＧＦＰ増幅用プライマー
GFP-Fw: 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAG-3'、配列番号５
GFP-Rv: 5'-TTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3'、配列番号６
ＮＰＴＩＩ増幅用プライマー
NPTII-Fw: 5'-CTCCTGCCGAGAAAGTATCC-3'、配列番号７
NPTII-Rv: 5'-CTCGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3'、配列番号８
シトクローム増幅用プライマー
CytDNA-Fw: 5'-AGTTCGAGCCTGATTATCCC-3'、配列番号９
CytDNA-Rv: 5'-GCATGCCGCCAGCGTTCATC-3'、配列番号１０

【0051】

結果を図６に示した。（Ａ）がゲノムＰＣＲの結果、（Ｂ）がＲＴ－ＰＣＲの結果である。ｎＧＦＰのシグナルが１０株中８株で検出されたので、それら８株でｎＧＦＰ遺伝子がアイノコレンギョウゲノムに挿入され、発現されたことが明らかとなった。ｎｐｔＩＩはカナマイシン耐性遺伝子を示しポジティブコントロールとし、Ｃｙｔはシトクローム遺伝子を示し内在遺伝子のコントロールとした。

【0052】

〔実施例１：ゴマセサミン合成酵素を発現する遺伝子組換えレンギョウの作製〕
参考例１において、核局在型ＧＦＰ（ｎＧＦＰ）遺伝子をゴマセサミン合成酵素ＣＹＰ８１Ｑ１（以下「ゴマＣＹＰ８１Ｑ１」）遺伝子（Tera et al., Scientific Reports 9 8631 (2019)）に変更した以外は参考例１と同じ方法で、ゴマＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子を発現する遺伝子組換えアイノコレンギョウ（以下「ＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えＦｉ」）およびゴマＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子を発現する遺伝子組換えチョウセンレンギョウ（以下「ＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えＦｋ」）を作製した。ゴマＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子発現用プラスミドの模式図を図７に示す。構成的高発現カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターとノパリン合成酵素遺伝子（ＮＯＳ）ターミネーターの間にゴマＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子を挿入した。ｎｐｔ ＩＩはカナマイシン耐性遺伝子である。

【0053】

作製した遺伝子組換えレンギョウの植物体を図８に示した。（Ａ）は左がｎＧＦＰ遺伝子組換えＦｉ（図中FinGFP）、右がＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えＦｉ（図中FiCYP81Q1）であり、（Ｂ）は左が野生型Ｆｋ（図中FkWT）、右がＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えＦｋ（図中FkCYP81Q1）である。いずれの植物体も形態に異常を示さず、健全に生育した。

【0054】

ＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えＦｉ（Fi 35S:CYP81Q1）およびＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えＦｋ（Fk 35S:CYP81Q1）から、それぞれ参考例１と同じ方法でゲノムＤＮＡと全ＲＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡと逆転写産物をそれぞれ鋳型に用いて、ゲノムＰＣＲとＲＴ－ＰＣＲを行った。増幅に使用したプライマーを以下に示す。
ＣＹＰ８１Ｑ１増幅用プライマー
CYP81Q1-Fw: 5'-ATGGAAGCTGAAATGCTATATTCAGCTCT-3'、配列番号１１
CYP81Q1-Rv: 5'-TCAAACGTTGGAAACCTGACGAAGAAC-3'、配列番号１２
ＥｘＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Takara）を用いて、９６℃１５秒、６０℃１５秒、７２℃１分を１サイクルとして、最大３０サイクル増幅し、ＰＣＲ産物を定法に従ってアガロース電気泳動し、臭化エチジウムにより可視化した。

【0055】

結果を図９に示した。（Ａ）がＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えＦｉ（Fi 35S:CYP81Q1）のゲノムＰＣＲの結果、（Ｂ）がＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えＦｉ（Fi 35S:CYP81Q1）のＲＴ－ＰＣＲの結果、（Ｃ）がＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えＦｋ（Fk 35S:CYP81Q1）のゲノムＰＣＲの結果、（Ｄ）がＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えＦｋ（Fk 35S:CYP81Q1）のＲＴ－ＰＣＲの結果である。いずれの植物体からもＣＹＰ８１Ｑ１のシグナルが特異的に増幅されたので、ゴマＣＹＰ８１Ｑ１を発現するアイノコレンギョウおよびゴマＣＹＰ８１Ｑ１を発現するチョウセンレンギョウを作製できたことが明らかにとなった。

【0056】

本発明者らは、実施例１で作製したゴマＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子がゲノムに導入された遺伝子組換えアイノコレンギョウおよびゴマＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子がゲノムに導入された遺伝子組換えチョウセンレンギョウを独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託している（受託日：２０１９年９月１８日）。該遺伝子組換えアイノコレンギョウの識別の表示はＦｉ３５Ｓ：ＣＹＰ８１Ｑ１、受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ－２２３８２である。該遺伝子組換えチョウセンレンギョウの識別の表示はＦｋ３５Ｓ：ＣＹＰ８１Ｑ１、受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ－２２３８３である。

【0057】

〔実施例２：ＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えレンギョウ葉における非内因性リグナンの検出〕
遺伝子組換えレンギョウの葉における非内因性リグナンの蓄積を明らかにするために、ＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えＦｉ（Fi 35S:CYP81Q1）およびＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えＦｋ（Fk 35S:CYP81Q1）を土に植えて２か月生育させた。コントロールとしてｎＧＦＰ遺伝子組換えＦｉ（Fi 35S:nGFP）および野生型Ｆｋ（Fk WT）も同様に土に植えて２か月生育させた。３番目、４番目、５番目に若い展開葉を３枚収穫し、液体窒素で凍結し、凍結乾燥機ＦＤＵ－２１１０（EYELA）により凍結乾燥させ、乾燥重量を測定した。リグナン類の抽出のため、Teraら（Scientific Reports 9 8631 (2019)）に記載された方法に従って、凍結乾燥した葉を乳鉢と乳棒で粉砕し、５０％メタノールを加えて６０℃で１時間の加温を２回繰り返し抽出した。抽出液を１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して残渣を取り除き、上清を凍結乾燥機により乾固した。乾固した抽出物を３００μＬの５０％メタノールに再懸濁し、Ｍｉｌｌｅｘ－ＬＨフィルター（Millipore）でろ過した。

【0058】

精製した抽出液を、Murataら（PLOS One 10 e0144519 (2016)）に記載された方法に従って、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０－ＵＧ５カラム（４．６×１５０ｍｍ， Nomura Chemical）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムＡｌｌｉａｎｃｅ２９６０（Waters Corporation）に供し、２８３ｎｍにおける吸収によりリグナン類を検出し、Ｅｍｐｏｗｅｒ２ソフトウェア（Waters Corporation）により、データ解析した。

【0059】

結果を図１０に示した。ＨＰＬＣクロマトグラムは、縦軸にシグナル強度、横軸に保持時間を示す。ＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えＦｉ（Fi 35S:CYP81Q1）とＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えＦｋ（Fk 35S:CYP81Q1）の抽出液中に、ピペリトール（Ｐ１）とセサミン（Ｐ２）のピークが認められた一方で、コントロールであるｎＧＦＰ遺伝子組換えＦｉ（Fi 35S:nGFP）と野生型Ｆｋ（Fk WT）にはピペリトール（Ｐ１）とセサミン（Ｐ２）のピークが認められなかった。

【0060】

次に、精製した抽出液を、Murataら（Nat. Commun. 8 2155 (2017)）に記載された方法に従って、液体クロマトグラフィー質量分析計ＬＣ－ＭＳ－ＩＴ－ＴＯＦ（Shimadzu）に供した。
結果を図１１に示した。ＬＣ－ＭＳクロマトグラムは、縦軸にシグナル強度、横軸に保持時間を示す。ＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えＦｉ（Fi 35S:CYP81Q1）とＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えＦｋ（Fk 35S:CYP81Q1）の抽出液中に、ピペリトール（Ｐ１）とセサミン（Ｐ２）のピークが認められた一方で、コントロールであるｎＧＦＰ遺伝子組換えＦｉ（Fi 35S:nGFP）と野生型Ｆｋ（Fk WT）にはピペリトール（Ｐ１）とセサミン（Ｐ２）のピークが認められなかった。

【0061】

〔実施例３：栄養繁殖したＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えレンギョウ葉における非内因性リグナンの検出〕
実施例２により、ＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えレンギョウの葉は、非内因性リグナンのピペリトールとセサミンを蓄積することが明らかとなったので、遺伝子組換えレンギョウを挿し木し、栄養繁殖した後も葉に非内因性リグナンが持続的に蓄積することの確認を行った。

【0062】

参考例１および実施例１で作製した遺伝子組換えレンギョウを「オリジナル」とし、「オリジナル」を挿し木して得られた栄養繁殖レンギョウを「二回目」、「二回目」を挿し木して得られた栄養繁殖レンギョウを「三回目」とした。実施例２と同じ方法で葉からリグナン類を抽出、精製し、ＨＰＬＣで検出した。実施例２と同様に、コントロールとしてｎＧＦＰ遺伝子組換えＦｉ（Fi 35S:nGFP）および野生型Ｆｋ（Fk WT）を用いた。「オリジナル」は１本の植物から得られたサンプルを測定した。「二回目」と「三回目」は６本の植物から得られたサンプルを測定した。「二回目」と「三回目」の測定値は、一元配置分散分析し、スチューデントのｔ－検定によりＰ＜０．０１である場合に有意差ありとした。

【0063】

結果を図１２に示した。グラフの縦軸は、ＨＰＬＣクロマトグラムのピーク面積からリグナンの蓄積量を算出し、葉の乾燥重量当たりの量を示す。図１２に示したように、「二回目」および「三回目」の栄養繁殖レンギョウの葉においてもピペリトールおよびセサミンの蓄積を認めた。本解析により、ＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えＦｉとＣＹＰ８１Ｑ１遺伝子組換えＦｋが非内因性リグナンのピペリトールとセサミンを持続的に蓄積することが認められた。

【0064】

なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

【受託番号】

【0065】

（１）
微生物の表示
識別の表示 Ｆｉ３５Ｓ：ＣＹＰ８１Ｑ１
受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ－２２３８２
受託日
２０１９年９月１８日
国際寄託当局
名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
住所：〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２０号室
（２）
微生物の表示
識別の表示 Ｆｋ３５Ｓ：ＣＹＰ８１Ｑ１
受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ－２２３８３
受託日
２０１９年９月１８日
国際寄託当局
名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
住所：〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２０号室

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

2022185711000001.app