(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022186461
(43)【公開日】2022-12-15
(54)【発明の名称】前立腺がん治療用医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20221208BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20221208BHJP
A61P 13/08 20060101ALI20221208BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20221208BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221208BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20221208BHJP
A61K 31/381 20060101ALI20221208BHJP
A61K 31/519 20060101ALI20221208BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20221208BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00 ZNA
A61K48/00
A61P13/08
A61P35/00
A61P43/00 111
A61K31/713
A61K31/381
A61K31/519
C12N15/113 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021094694
(22)【出願日】2021-06-04
(71)【出願人】
【識別番号】509111744
【氏名又は名称】地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(74)【代理人】
【識別番号】100090251
【氏名又は名称】森田 憲一
(72)【発明者】
【氏名】井上 聡
(72)【発明者】
【氏名】高山 賢一
(72)【発明者】
【氏名】木村 直樹
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZA811
4C084ZA812
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC201
4C084ZC202
4C086AA01
4C086AA02
4C086BB02
4C086CB26
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA81
4C086ZB26
4C086ZC20
(57)【要約】
【課題】本発明の目的は、去勢抵抗性前立腺がんを含む前立腺がんの治療薬を提供することである。
【解決手段】前記課題は、本発明のＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質を有効成分として含む前立腺がん治療用医薬組成物によって解決することができる。
【選択図】なし
【解決手段】前記課題は、本発明のＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質を有効成分として含む前立腺がん治療用医薬組成物によって解決することができる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質を有効成分として含む前立腺がん治療用医薬組成物。
【請求項2】
前記ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質が、ＲＮａｓｅ Ｈ２遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸であって、配列番号１３の標的配列に対応する塩基配列を含むセンス鎖と、前記センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖とを含む二本鎖核酸である、請求項１に記載の前立腺がん治療用医薬組成物。
【請求項3】
前記二本鎖核酸が、配列番号１及び２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのｓｉＲＮＡ、配列番号３及び４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのｓｉＲＮＡ、配列番号５及び６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのｓｉＲＮＡ、配列番号７及び８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのｓｉＲＮＡ、配列番号９及び１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのｓｉＲＮＡ、及び配列番号１１及び１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのｓｉＲＮＡ、からなる群から選択される二本鎖核酸である、請求項２に記載の前立腺がん治療用医薬組成物。
【請求項4】
前記ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質が、
下記式（１）：
（式中、Ｘは単結合、炭素数１～３のアルキレン基、又は－ＮＨ－ＣＯ－Ｃ－であり、
Ｙは単結合、又は－Ｃ－Ｓ－であり、
Ｒ１は、置換基を有することのある５～６員の芳香族複素環基、置換基を有することのあるフェニル基、置換基を有することのある炭素数５～６のシクロアルキル基、又は炭素数３～８のアルキル基であり、
Ｒ２は、置換基を有することのある炭素数５～６のシクロアルキル基、置換基を有することのある５～６員の芳香族複素環基、置換基を有することのあるフェニル基、又は炭素数３～８のアルキル基であり、
－ＮＨ－の水素原子（Ｈ）が解離し、窒素原子（Ｎ）がＲ２基の置換基の硫黄原子（Ｓ）と結合して環構造を形成してもよい）
で表される化合物である、請求項１に記載の前立腺がん治療用医薬組成物。
下記式（１）：
【化1】
Ｙは単結合、又は－Ｃ－Ｓ－であり、
Ｒ１は、置換基を有することのある５～６員の芳香族複素環基、置換基を有することのあるフェニル基、置換基を有することのある炭素数５～６のシクロアルキル基、又は炭素数３～８のアルキル基であり、
Ｒ２は、置換基を有することのある炭素数５～６のシクロアルキル基、置換基を有することのある５～６員の芳香族複素環基、置換基を有することのあるフェニル基、又は炭素数３～８のアルキル基であり、
－ＮＨ－の水素原子（Ｈ）が解離し、窒素原子（Ｎ）がＲ２基の置換基の硫黄原子（Ｓ）と結合して環構造を形成してもよい）
で表される化合物である、請求項１に記載の前立腺がん治療用医薬組成物。
【請求項5】
前記ＲＮａｓｅＨ２阻害化合物が、下記式（２）：
で表される２－シクロペンタンアミド－４－エチル－５－メチルチオフェン－３－カルボキサミド、又は下記式（３）：
で表されるＮ－［（フラン－２－イル）メチル］－２－｛８－チア－４，６－ジアザトリシクロ［７．４．０．０２，７］トリデカ－１（９），２（７），３，５－テトラエン－３－イルスルファニル｝アセトアミドである、請求項４に記載の前立腺がん治療用医薬組成物。
【化2】
【化3】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、前立腺がん治療用医薬組成物に関する。本発明によれば、難治性の前立腺がんを治療することができる。
【背景技術】
【0002】
日本における、２０１７年の前立腺がん罹患数は９１，２１５例で、男性における第１位のがんであり、１０人に１人が罹患すると言われている。前立腺がんは、アンドロゲン依存性に増殖する悪性腫瘍である。そのため、がんが前立腺にとどまっている限局性の前立腺がんに対しては、手術や放射線療法を行うが、進行した前立腺がんに対しては、アンドロゲン遮断療法（androgen deprivation therapy；ＡＤＴ）を行う。ＡＤＴは初期には非常に有効であるが、次第に効果がなくなり、去勢抵抗性前立腺がん（castration resistant prostate cancer；ＣＲＰＣ）となることが、臨床上、非常に重要な問題となっている（特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特開２０１９－１７２７００号公報
【特許文献2】特開２０１９－１２３６７１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
従って、本発明の目的は、去勢抵抗性前立腺がんを含む前立腺がんの治療薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者は、去勢抵抗性前立腺がんの治療薬について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、ＲＮａｓｅ Ｈ２の阻害物質が、前立腺がんの治療に有効であることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質を有効成分として含む前立腺がん治療用医薬組成物、
［２］前記ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質が、ＲＮａｓｅ Ｈ２遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸であって、配列番号１３の標的配列に対応する塩基配列を含むセンス鎖と、前記センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖とを含む二本鎖核酸である、［１］に記載の前立腺がん治療用医薬組成物、
［３］前記二本鎖核酸が、配列番号１及び２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのｓｉＲＮＡ、配列番号３及び４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのｓｉＲＮＡ、配列番号５及び６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのｓｉＲＮＡ、配列番号７及び８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのｓｉＲＮＡ、配列番号９及び１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのｓｉＲＮＡ、及び配列番号１１及び１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのｓｉＲＮＡ、からなる群から選択される二本鎖核酸である、［２］に記載の前立腺がん治療用医薬組成物、
［４］前記ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質が、
下記式（１）：
（式中、Ｘは単結合、炭素数１～３のアルキレン基、又は－ＮＨ－ＣＯ－Ｃ－であり、
Ｙは単結合、又は－Ｃ－Ｓ－であり、Ｒ１は、置換基を有することのある５～６員の芳香族複素環基、置換基を有することのあるフェニル基、置換基を有することのある炭素数５～６のシクロアルキル基、又は炭素数３～８のアルキル基であり、Ｒ２は、置換基を有することのある炭素数５～６のシクロアルキル基、置換基を有することのある５～６員の芳香族複素環基、置換基を有することのあるフェニル基、又は炭素数３～８のアルキル基であり、－ＮＨ－の水素原子（Ｈ）が解離し、窒素原子（Ｎ）がＲ２基の置換基の硫黄原子（Ｓ）と結合して環構造を形成してもよい）で表される化合物である、［１］に記載の前立腺がん治療用医薬組成物、及び
［５］前記ＲＮａｓｅＨ２阻害化合物が、下記式（２）：
で表される２－シクロペンタンアミド－４－エチル－５－メチルチオフェン－３－カルボキサミド、又は下記式（３）：
で表されるＮ－［（フラン－２－イル）メチル］－２－｛８－チア－４，６－ジアザトリシクロ［７．４．０．０２，７］トリデカ－１（９），２（７），３，５－テトラエン－３－イルスルファニル｝アセトアミドである、［４］に記載の前立腺がん治療用医薬組成物、
に関する。
前記去勢抵抗性前立腺がんの原因の１つにアンドロゲン受容体（androgen receptor；ＡＲ）の変異体（ＡＲ ｖａｒｉａｎｔｓ；ＡＲ－Ｖｓ）の出現が報告されている。ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ及びＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＲＮａｓｅ）Ｈ２阻害薬は、前立腺がん細胞において、がん抑制遺伝子ｐ５３発現量の増加、及びＡＲ発現量を減少させることで、前立腺がん細胞の増殖を抑制した。更に、ＣＲＰＣ細胞において、ＡＲ－Ｖｓ発現量を抑制した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質を有効成分として含む前立腺がん治療用医薬組成物、
［２］前記ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質が、ＲＮａｓｅ Ｈ２遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸であって、配列番号１３の標的配列に対応する塩基配列を含むセンス鎖と、前記センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖とを含む二本鎖核酸である、［１］に記載の前立腺がん治療用医薬組成物、
［３］前記二本鎖核酸が、配列番号１及び２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのｓｉＲＮＡ、配列番号３及び４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのｓｉＲＮＡ、配列番号５及び６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのｓｉＲＮＡ、配列番号７及び８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのｓｉＲＮＡ、配列番号９及び１０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのｓｉＲＮＡ、及び配列番号１１及び１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのｓｉＲＮＡ、からなる群から選択される二本鎖核酸である、［２］に記載の前立腺がん治療用医薬組成物、
［４］前記ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質が、
下記式（１）：
【化1】
Ｙは単結合、又は－Ｃ－Ｓ－であり、Ｒ１は、置換基を有することのある５～６員の芳香族複素環基、置換基を有することのあるフェニル基、置換基を有することのある炭素数５～６のシクロアルキル基、又は炭素数３～８のアルキル基であり、Ｒ２は、置換基を有することのある炭素数５～６のシクロアルキル基、置換基を有することのある５～６員の芳香族複素環基、置換基を有することのあるフェニル基、又は炭素数３～８のアルキル基であり、－ＮＨ－の水素原子（Ｈ）が解離し、窒素原子（Ｎ）がＲ２基の置換基の硫黄原子（Ｓ）と結合して環構造を形成してもよい）で表される化合物である、［１］に記載の前立腺がん治療用医薬組成物、及び
［５］前記ＲＮａｓｅＨ２阻害化合物が、下記式（２）：
【化2】
【化3】
に関する。
前記去勢抵抗性前立腺がんの原因の１つにアンドロゲン受容体（androgen receptor；ＡＲ）の変異体（ＡＲ ｖａｒｉａｎｔｓ；ＡＲ－Ｖｓ）の出現が報告されている。ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ及びＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＲＮａｓｅ）Ｈ２阻害薬は、前立腺がん細胞において、がん抑制遺伝子ｐ５３発現量の増加、及びＡＲ発現量を減少させることで、前立腺がん細胞の増殖を抑制した。更に、ＣＲＰＣ細胞において、ＡＲ－Ｖｓ発現量を抑制した。
【発明の効果】
【0006】
本発明の前立腺がん治療用医薬組成物によれば、前立腺がん、特に去勢抵抗性前立腺がんを効果的に治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】ｓｉＲＮＡによるＡＲ陽性の前立腺がん細胞（ＬＮＣａＰ細胞及び２２Ｒｖ１細胞）のＲＮＡＳＥＨ２Ａ及びＡＲのｍＲＮＡ（Ａ、Ｄ）、及びタンパク質発現量（Ｂ、Ｅ）の変化、及び細胞増殖（Ｃ、Ｆ）への影響を示したグラフである。
【図2】ｓｉＲＮＡによるＡＲ陽性の前立腺がん細胞（ＬＮＣａＰ細胞及び２２Ｒｖ１細胞）のがん抑制遺伝子であるｐ５３及びＡｃ－ｐ５３タンパク質の発現（Ａ、Ｃ）の写真、並びにｐ５３下流シグナル（ｐ５３、ｐ２１、ＢＡＸ）のｍＲＮＡ発現（Ｂ、Ｄ）を示したグラフである。
【図3】ｓｉＲＮＡによるＡＲおよびＡＲ－Ｖ７のタンパク質（A）およびｍＲＮＡ（B）発現への影響ならびにアンドロゲンであるジヒドロテストステロン（DHT）刺激による前立腺がん細胞の増殖促進効果に与える影響（C）を示したグラフである。
【図4】ｓｉＲＮＡによる去勢抵抗性前立腺がん細胞へのin vivoでの治療効果を示した図である。
【図5】ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害化合物（ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１及びＲＮａｓｅＨ２ｉ＃２）によるＡＲ陽性の前立腺がん細胞（ＬＮＣａＰ細胞及び２２Ｒｖ１細胞）の細胞増殖への影響を示したグラフである。
【図6】ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害化合物（ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１及びＲＮａｓｅＨ２ｉ＃２）によるｐ５３及びＡＲの発現への影響を示したウエスタンブロットの写真である。
【図7】ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害化合物（ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１及びＲＮａｓｅＨ２ｉ＃２）によるＤＮＡ損傷（γＨ２ＡＸ）及びアポトーシス（c-PARP）への影響を示したグラフである。本実施例では、ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害化合物がＤＮＡ損傷とアポトーシスへ与える影響を検討した。ＤＮＡ損傷へ与える影響はγＨ２ＡＸで検出し、アポトーシスをＰｏｌｙ（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰＡＲＰ）の分解により生じるcleaved-Poly（ADP-ribose）polymerase（c-PARP）の発現量、及びＴＵＮＥＬ法により検討した。２２Ｒｖ１においてＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１及び＃２共に（１及び５μＭ）でγＨ２ＡＸ、ｃ－ＰＡＲＰの発現増加が認められた（図７Ａ）。ＬＮＣａＰ細胞では、ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１（５μＭ）、ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃２（５μＭ）でγＨ２ＡＸの発現増加が認められ、ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１（１及び５μＭ）、ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃２（５μＭ）でｃ－ＰＡＲＰの発現増加が認められた（図７Ｂ）。また、ＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙでは、ＲＮａｓｅ Ｈ２ｉ＃１及び＃２（１及び５μＭ）共に有意にアポトーシス細胞数を増加させることが分かった（図８）。
【図8】ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害化合物（ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１及びＲＮａｓｅＨ２ｉ＃２）によるアポトーシスへの影響をＴＵＮＥＬアッセイによって測定した写真及びグラフである。
【図9】ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害化合物による去勢抵抗性前立腺がん細胞へのin vivoでの治療効果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0008】
本発明の前立腺がん治療用医薬組成物は、ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質を有効成分として含む。
【0009】
《ＲＮａｓｅ Ｈ２》
ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリットのＲＮＡ鎖を加水分解する酵素である。真核生物はＲＮａｓｅ Ｈ１とＲＮａｓｅ Ｈ２の２つを持ち、ヒトの細胞では主にＲＮａｓｅ Ｈ２がＲＮａｓｅ Ｈの酵素活性を有する。ＲＮａｓｅ Ｈ２はＡ、Ｂ、Ｃの ３つのサブユニットから構成され、それぞれのタンパク質は、ＲＮａｓｅＨ２Ａが２９９アミノ酸、Ｈ２Ｂが３０８アミノ酸、Ｈ２Ｃが１６４アミノ酸で構成され、いずれもドメイン構造を持たない単一な巨大タンパクである。３つのタンパクが複合体を形成することによってＲＮａｓｅ Ｈ２活性を示す。
ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリットのＲＮＡ鎖を加水分解する酵素である。真核生物はＲＮａｓｅ Ｈ１とＲＮａｓｅ Ｈ２の２つを持ち、ヒトの細胞では主にＲＮａｓｅ Ｈ２がＲＮａｓｅ Ｈの酵素活性を有する。ＲＮａｓｅ Ｈ２はＡ、Ｂ、Ｃの ３つのサブユニットから構成され、それぞれのタンパク質は、ＲＮａｓｅＨ２Ａが２９９アミノ酸、Ｈ２Ｂが３０８アミノ酸、Ｈ２Ｃが１６４アミノ酸で構成され、いずれもドメイン構造を持たない単一な巨大タンパクである。３つのタンパクが複合体を形成することによってＲＮａｓｅ Ｈ２活性を示す。
【0010】
前立腺がん、特にＣＲＰＣにおいては、ＲＮａｓｅ Ｈ２Ａ遺伝子の発現が上昇しているものがある。本発明においては、ＲＮａｓｅ Ｈ２を抑制することによって、前立腺がんを治療することができる。また、ＲＮａｓｅ Ｈ２の発現又は活性を抑制することにより、がん抑制遺伝子ｐ５３発現量の増加、及び／又はＡＲ発現量の減少がみられる。限定されるものではないが、これらの現象により、前立腺がん、特にＣＲＰＣが治療できる可能性がある。
【0011】
ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質は、ＲＮａｓｅ Ｈ２の活性を抑制及び／又は阻害する限りにおいて特に限定されるものではないが、例えばＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸、抗ＲＮａｓｅ Ｈ抗体、又はＲＮａｓｅ Ｈ阻害化合物などが挙げられる。ＲＮａｓｅ Ｈ２の活性の抑制又は阻害とは、具体的には、例えばＲＮａｓｅ Ｈ２のｍＲＮＡの発現の抑制、ＲＮａｓｅ Ｈ２のタンパク質の発現の抑制、ＲＮａｓｅ Ｈ２のタンパク質の機能の抑制又は阻害などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0012】
《ＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸》
前記二本鎖核酸は、ＲＮａｓｅ Ｈ２遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸であって、配列番号１３の標的配列に対応する塩基配列を含むセンス鎖と、前記センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖とを含むことを特徴とする。なお、本明細書において「二本鎖核酸」とは、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイズしてなる二本鎖核酸領域を含む核酸分子を意味し、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）であることが好ましい。
前記二本鎖核酸は、ＲＮａｓｅ Ｈ２遺伝子に対してＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸であって、配列番号１３の標的配列に対応する塩基配列を含むセンス鎖と、前記センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖とを含むことを特徴とする。なお、本明細書において「二本鎖核酸」とは、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイズしてなる二本鎖核酸領域を含む核酸分子を意味し、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）であることが好ましい。
【0013】
本発明の二本鎖核酸は、配列番号１３の標的配列に対応する塩基配列を含むセンス鎖と、前記センス鎖に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖とを含む。ここで、「標的配列に対応する塩基配列」とは、標的配列と同一の塩基配列であるか、あるいは、前記標的配列において１若しくは数個（例えば、２～３個）の塩基が置換された塩基配列を意味する。二本鎖核酸がｓｉＲＮＡである場合、１～数塩基のミスマッチを含んでいても、ＲＮＡｉ効果が得られることが知られている。本発明では、標的配列と同一の塩基配列だけでなく、ＲＮＡｉ効果が得られる限り、ミスマッチを含む塩基配列であってもよい。
【0014】
また、アンチセンス鎖における「センス鎖に相補的な塩基配列」とは、センス鎖とハイブリダイズすることができる程度に相補的な塩基配列であればよく、センス鎖に完全に相補的な塩基配列であるか、あるいは、前記センス鎖に完全に相補的な塩基配列において１若しくは数個（例えば、２～３個）の塩基が置換された塩基配列であることができる。
【0015】
（核酸の種類と修飾）
二本鎖核酸を構成する核酸の種類は、特に限定されるものではなく、適宜選択することができ、例えば、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡキメラ型二本鎖核酸を挙げることができる。キメラ型はＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡの一部をＤＮＡに換えたものであり、血清中での安定性が高く、免疫応答誘導性が低いことが知られている。
また、二本鎖核酸は、例えば、２’－ＯＨ基の修飾、バックボーンのホスホロチオエートによる置換やボラノホスフェート基による修飾、リボースの２位と４位が架橋されたＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）の導入などによって、ヌクレアーゼに対する耐性や安定化を高めることもできる。あるいは、細胞への導入効率を高める等の目的から、二本鎖核酸のセンス鎖の５’端、或いは３’端に、例えば、ナノ粒子、コレステロール、細胞膜通過ペプチド等の修飾を施すこともできる。
二本鎖核酸を構成する核酸の種類は、特に限定されるものではなく、適宜選択することができ、例えば、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡキメラ型二本鎖核酸を挙げることができる。キメラ型はＲＮＡｉ効果を有する二本鎖ＲＮＡの一部をＤＮＡに換えたものであり、血清中での安定性が高く、免疫応答誘導性が低いことが知られている。
また、二本鎖核酸は、例えば、２’－ＯＨ基の修飾、バックボーンのホスホロチオエートによる置換やボラノホスフェート基による修飾、リボースの２位と４位が架橋されたＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）の導入などによって、ヌクレアーゼに対する耐性や安定化を高めることもできる。あるいは、細胞への導入効率を高める等の目的から、二本鎖核酸のセンス鎖の５’端、或いは３’端に、例えば、ナノ粒子、コレステロール、細胞膜通過ペプチド等の修飾を施すこともできる。
【0016】
（ｓｉＲＮＡ）
本発明の二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（キメラ型を含む）であることが好ましい。ここで、「ｓｉＲＮＡ」とは、１８塩基長～２９塩基長（好ましくは２１～２３塩基長）の小分子二本鎖ＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（ガイド鎖）と相補的な配列をもつ標的遺伝子のｍＲＮＡを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。すなわちｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を破壊し、配列特異的に遺伝子の発現を抑制することができる。ｓｉＲＮＡの塩基配列は、ＲＮａｓｅＨ２ＡのｍＲＮＡの塩基配列（配列番号１３）から、適宜設計することができる。前記ｓｉＲＮＡは、先述したようなセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、かつ所望のＲＮＡｉ効果を示すものであれば、その末端構造に特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、前記ｓｉＲＮＡは、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。中でも、前記ｓｉＲＮＡは、各鎖の３’末端が２塩基～６塩基突出した構造を有することが好ましく、各鎖の３’末端が２塩基突出した構造を有することがより好ましい。また、ＲＮａｓｅＨ２ＡのｍＲＮＡの塩基配列から作製されたｓｉＲＮＡであれば、効果の多寡があっても、前立腺がん治療用医薬組成物の有効成分として用いることができる。
本発明の二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（キメラ型を含む）であることが好ましい。ここで、「ｓｉＲＮＡ」とは、１８塩基長～２９塩基長（好ましくは２１～２３塩基長）の小分子二本鎖ＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（ガイド鎖）と相補的な配列をもつ標的遺伝子のｍＲＮＡを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。すなわちｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を破壊し、配列特異的に遺伝子の発現を抑制することができる。ｓｉＲＮＡの塩基配列は、ＲＮａｓｅＨ２ＡのｍＲＮＡの塩基配列（配列番号１３）から、適宜設計することができる。前記ｓｉＲＮＡは、先述したようなセンス鎖及びアンチセンス鎖を含み、かつ所望のＲＮＡｉ効果を示すものであれば、その末端構造に特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、前記ｓｉＲＮＡは、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよい。中でも、前記ｓｉＲＮＡは、各鎖の３’末端が２塩基～６塩基突出した構造を有することが好ましく、各鎖の３’末端が２塩基突出した構造を有することがより好ましい。また、ＲＮａｓｅＨ２ＡのｍＲＮＡの塩基配列から作製されたｓｉＲＮＡであれば、効果の多寡があっても、前立腺がん治療用医薬組成物の有効成分として用いることができる。
【0017】
本発明のｓｉＲＮＡとしては、表１に示すように、例えば、配列番号１４（２３塩基）を標的配列とする配列番号１（２１塩基）のセンス鎖と配列番号２（２１塩基）のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ（後述する実施例におけるｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃１）、配列番号１５（２３塩基）を標的配列とする配列番号３（２１塩基）のセンス鎖と配列番号４（２１塩基）のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ（同ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃２）、配列番号１６（２３塩基）を標的配列とする配列番号５（２１塩基）のセンス鎖と配列番号６（２１塩基）のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ（同ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃３）、配列番号１７（２３塩基）を標的配列とする配列番号７（２１塩基）のセンス鎖と配列番号８（２１塩基）のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ（同ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃４）、配列番号１８（２３塩基）を標的配列とする配列番号９（２１塩基）のセンス鎖と配列番号１０（２１塩基）のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ（同ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃５）、配列番号１９（２３塩基）を標的配列とする配列番号１１（２１塩基）のセンス鎖と配列番号１２（２１塩基）のアンチセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡ（同ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃６）を挙げることができる。
【0018】
【表1】
＃１：CTCAGCATCCGAGAATCAGGAGG（８５８－８８０）（配列番号14）
＃２：CCGTTCTTCCCACCGATATTTCC（９３３－９３５）（配列番号15）
＃３：GTCTACGCCATCTGTTATTGTCC（２２６－２４８）（配列番号16）
＃４：GCCACTGGGCTTATACAGTATGC（４５１－４７３）（配列番号17）
＃５：CTGCAGGACTTGGATACTGATTA（６８５－７０７）（配列番号18）
＃６：TGGGTGTTGGTTGATTAATTTTA（１１４７－１１６９）（配列番号19）
【0019】
（製造方法）
本発明の二本鎖ＲＮＡ（特にはｓｉＲＮＡ）は、従来公知の手法に基づき作製することができる。
例えば、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とに相当する１８塩基長～２９塩基長の一本鎖ＲＮＡを、それぞれ既存のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置等を利用して化学的に合成し、それらをアニーリングすることにより作製することができる。また、後述する本発明のベクターのような、所望のｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、前記発現ベクターを細胞内に導入することにより、細胞内の反応を利用してｓｉＲＮＡを作製することもできる。
本発明の二本鎖ＲＮＡ（特にはｓｉＲＮＡ）は、従来公知の手法に基づき作製することができる。
例えば、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とに相当する１８塩基長～２９塩基長の一本鎖ＲＮＡを、それぞれ既存のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置等を利用して化学的に合成し、それらをアニーリングすることにより作製することができる。また、後述する本発明のベクターのような、所望のｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、前記発現ベクターを細胞内に導入することにより、細胞内の反応を利用してｓｉＲＮＡを作製することもできる。
【0020】
前記ベクターに含まれるＤＮＡは、前記二本鎖核酸をコードする塩基配列の上流（５’側）に、前記二本鎖核酸の転写を制御するためのプロモーター配列が連結されていることが好ましい。前記プロモーター配列としては、特に制限はなく、適宜選択することができ、例えば、ＣＭＶプロモーター等のｐｏｌ ＩＩ系プロモーター、Ｈ１プロモーター、Ｕ６プロモーター等のｐｏｌ ＩＩＩ系プロモーターなどが挙げられる。更に、前記二本鎖核酸をコードする塩基配列の下流（３’側）に、前記二本鎖核酸の転写を終結させるためのターミネーター配列が連結されていることがより好ましい。前記ターミネーター配列としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【0021】
前記ベクターとしては、前記ＤＮＡを含むものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。前記ベクターは、前記二本鎖核酸（特にｓｉＲＮＡ）を発現可能な発現ベクターであることが好ましい。
前記二本鎖核酸の発現様式としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば二本鎖核酸としてｓｉＲＮＡを発現させる方法として、短い一本鎖ＲＮＡを二本発現させる方法（タンデム型）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）として一本鎖ＲＮＡを発現させる方法（ヘアピン型）等が挙げられる。ここで、ｓｈＲＮＡとは、１８塩基～２９塩基程度のｄｓＲＮＡ領域と３塩基～９塩基程度のｌｏｏｐ領域を含む一本鎖ＲＮＡであるが、ｓｈＲＮＡは、生体内で発現されることにより、塩基対を形成してヘアピン状の二本鎖ＲＮＡとなる。その後、ｓｈＲＮＡはＤｉｃｅｒ（ＲＮａｓｅ ＩＩＩ酵素）により切断されてｓｉＲＮＡとなり、標的遺伝子の発現抑制に機能することができる。
前記二本鎖核酸の発現様式としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば二本鎖核酸としてｓｉＲＮＡを発現させる方法として、短い一本鎖ＲＮＡを二本発現させる方法（タンデム型）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）として一本鎖ＲＮＡを発現させる方法（ヘアピン型）等が挙げられる。ここで、ｓｈＲＮＡとは、１８塩基～２９塩基程度のｄｓＲＮＡ領域と３塩基～９塩基程度のｌｏｏｐ領域を含む一本鎖ＲＮＡであるが、ｓｈＲＮＡは、生体内で発現されることにより、塩基対を形成してヘアピン状の二本鎖ＲＮＡとなる。その後、ｓｈＲＮＡはＤｉｃｅｒ（ＲＮａｓｅ ＩＩＩ酵素）により切断されてｓｉＲＮＡとなり、標的遺伝子の発現抑制に機能することができる。
【0022】
前記タンデム型ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、前記ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖をコードするＤＮＡ配列と、アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とを含み、かつ、各鎖をコードするＤＮＡ配列の上流（５’側）にプロモーター配列がそれぞれ連結され、また、各鎖をコードするＤＮＡ配列の下流（３’側）にターミネーター配列がそれぞれ連結されたＤＮＡを含む。
【0023】
また、前記ヘアピン型ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、前記ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖をコードするＤＮＡ配列と、アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とが逆向きに配置され、前記センス鎖ＤＮＡ配列とアンチセンス鎖ＤＮＡ配列とがループ配列を介して接続されており、かつ、それらの上流（５’側）にプロモーター配列が、また、下流（３’側）にターミネーター配列が連結されたＤＮＡを含む。
【0024】
《ＲＮａｓｅＨ２阻害化合物》
本発明の医薬組成物は、ＲＮａｓｅＨ２阻害化合物を含んでもよい。ＲＮａｓｅＨ２阻害化合物は、特に限定されるものではないが、下記式（１）：
（式中、Ｘは単結合、炭素数１～３のアルキレン基、又は－ＮＨ－ＣＯ－Ｃ－であり、
Ｙは単結合、又は－Ｃ－Ｓ－であり、
Ｒ１は、置換基を有することのある５～６員の芳香族複素環基、置換基を有することのあるフェニル基、置換基を有することのある炭素数５～６のシクロアルキル基、又は炭素数３～８のアルキル基であり、
Ｒ２は、置換基を有することのある炭素数５～６のシクロアルキル基、置換基を有することのある５～６員の芳香族複素環基、置換基を有することのあるフェニル基、又は炭素数３～８のアルキル基であり、
－ＮＨ－の水素原子（Ｈ）が解離し、窒素原子（Ｎ）がＲ２基の置換基の硫黄原子（Ｓ）と結合して環構造を形成してもよい）
で表される化合物が挙げられる。
本発明の医薬組成物は、ＲＮａｓｅＨ２阻害化合物を含んでもよい。ＲＮａｓｅＨ２阻害化合物は、特に限定されるものではないが、下記式（１）：
【化4】
Ｙは単結合、又は－Ｃ－Ｓ－であり、
Ｒ１は、置換基を有することのある５～６員の芳香族複素環基、置換基を有することのあるフェニル基、置換基を有することのある炭素数５～６のシクロアルキル基、又は炭素数３～８のアルキル基であり、
Ｒ２は、置換基を有することのある炭素数５～６のシクロアルキル基、置換基を有することのある５～６員の芳香族複素環基、置換基を有することのあるフェニル基、又は炭素数３～８のアルキル基であり、
－ＮＨ－の水素原子（Ｈ）が解離し、窒素原子（Ｎ）がＲ２基の置換基の硫黄原子（Ｓ）と結合して環構造を形成してもよい）
で表される化合物が挙げられる。
【0025】
本明細書において「Ｘが単結合である」とは、Ｒ１と窒素原子（Ｎ）とが、そのまま結合することを意味する。また、「Ｙが単結合である」とは、Ｒ２と炭素原子（Ｃ）とが、そのまま結合することを意味する。
炭素数１～３のアルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、又はプロピレン基が挙げられる。
置換基を有することのある５～６員の芳香族複素環基とは、ヘテロ原子を環内に含む芳香族複素環から水素原子１個を除いた基を意味する。ヘテロ原子としては、酸素原子、硫黄原子、又は窒素原子が挙げられる。具体的な芳香族複素環基又はその縮合環としては、ピリジル基、ピラジル基、ピリミジル基、キノリル基、イソキノリル基、ピロリル基、インドレニル基、イミダゾリル基、カルバゾリル基、チエニル基、又はフリル基が挙げられる。置換基を有する場合は、芳香族複素環基の水素原子が他の基に置換されるが、置換基の数は限定されるものではなく、例えば１～５のいずれかである。また、２つの置換基が一緒になって、芳香族環、芳香族複素環、飽和複素環、又はシクロアルキル環として、５～６員の芳香族複素環基と縮合してもよく、２環、又は３環以上の縮合でもよい。
炭素数５～６のシクロアルキル基としては、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基が挙げられる。
炭素数３～８のアルキル基としては、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、又はオクチル基が挙げられる。
炭素数１～３のアルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、又はプロピレン基が挙げられる。
置換基を有することのある５～６員の芳香族複素環基とは、ヘテロ原子を環内に含む芳香族複素環から水素原子１個を除いた基を意味する。ヘテロ原子としては、酸素原子、硫黄原子、又は窒素原子が挙げられる。具体的な芳香族複素環基又はその縮合環としては、ピリジル基、ピラジル基、ピリミジル基、キノリル基、イソキノリル基、ピロリル基、インドレニル基、イミダゾリル基、カルバゾリル基、チエニル基、又はフリル基が挙げられる。置換基を有する場合は、芳香族複素環基の水素原子が他の基に置換されるが、置換基の数は限定されるものではなく、例えば１～５のいずれかである。また、２つの置換基が一緒になって、芳香族環、芳香族複素環、飽和複素環、又はシクロアルキル環として、５～６員の芳香族複素環基と縮合してもよく、２環、又は３環以上の縮合でもよい。
炭素数５～６のシクロアルキル基としては、シクロペンチル基又はシクロヘキシル基が挙げられる。
炭素数３～８のアルキル基としては、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、又はオクチル基が挙げられる。
【0026】
前記置換基としては、炭素数１～３のアルキル基、ハロゲン原子（例えば、塩素原子、フッ素原子、又は臭素原子）、アミド基（－ＣＯ－ＮＨ２）、カルボキシ基、メトキシカルボニル基、又はエトシキカルボニル基が挙げられる。
芳香族複素環基、フェニル基、又はシクロアルキル基の置換基としては、２つの置換基が一緒になって、芳香族環、芳香族複素環、飽和複素環、又はシクロアルキル環として、芳香族複素環基、フェニル基、又はシクロアルキル基と縮合してもよく、２環、又は３環以上の縮合環でもよい。芳香族環、芳香族複素環、飽和複素環、又はシクロアルキル環は、５員又は６員が好ましい。これらの縮合環は、されに前記置換基を有してもよい。
芳香族複素環基、フェニル基、又はシクロアルキル基の置換基としては、２つの置換基が一緒になって、芳香族環、芳香族複素環、飽和複素環、又はシクロアルキル環として、芳香族複素環基、フェニル基、又はシクロアルキル基と縮合してもよく、２環、又は３環以上の縮合環でもよい。芳香族環、芳香族複素環、飽和複素環、又はシクロアルキル環は、５員又は６員が好ましい。これらの縮合環は、されに前記置換基を有してもよい。
【0027】
前記－ＮＨ－の水素原子（Ｈ）が解離し、窒素原子（Ｎ）がＲ２基の置換基の硫黄原子（Ｓ）と結合して環構造を形成する場合、Ｒ２のシクロアルキル基、芳香族複素環基、又はフェニル基と縮合環を形成することになる。
【0028】
前記式（１）の化合物としては、具体的には下記の化学式で表される化合物が挙げられる。
【化5】
【0029】
前記式（１）で表される化合物は、好ましくは下記式（２）：
で表される２－シクロペンタンアミド－４－エチル－５－メチルチオフェン－３－カルボキサミド（2-cyclopentaneamido-4-ethyl-5-methylthiophene-3-carboxamide）（以下、化合物Ａと称することがある）又は
下記式（３）：
で表されるＮ－［（フラン－２－イル）メチル］－２－｛８－チア－４，６－ジアザトリシクロ［７．４．０．０２，７］トリデカ－１（９）、２（７）、３，５－テトラエン－ ３－イルスルファニル｝アセトアミド（N-[(furan-2-yl)methyl]-2-{8-thia-4,6-diazatricyclo[7.4.0.02,7]trideca-1(9),2(7),3,5-tetraen-3-ylsulfanyl}acetamide）（以下、化合物Ｂと称することがある）である。
【化6】
下記式（３）：
【化7】
【0030】
本発明に用いられるＲＮａｓｅＨ２阻害化合物は、それらの塩を含む。前記ＲＮａｓｅＨ２阻害化合物の塩は、製薬学的に許容される塩であり、置換基の種類によって、酸付加塩又は塩基との塩を形成する場合がある。具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、マンデル酸、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジトルオイル酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の有機酸との酸付加塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等の無機塩基、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、リシン、オルニチン等の有機塩基との塩、アセチルロイシン等の各種アミノ酸及びアミノ酸誘導体との塩やアンモニウム塩等が挙げられる。
【0031】
更に、本発明に用いられる化合物は、前記のＲＮａｓｅＨ２阻害化合物、並びにその塩の各種の水和物や溶媒和物、及び結晶多形の物質も包含する。また前記化合物は、種々の放射性又は非放射性同位体でラベルされた化合物も包含する。
【0032】
前記ＲＮａｓｅＨ２阻害化合物、又はその塩の１種又は２種以上を有効成分として含有する医薬組成物は、当分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用されている方法によって調製することができる。
投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等による経口投与、又は、関節内、静脈内、筋肉内等の注射剤、坐剤、点眼剤、眼軟膏、経皮用液剤、軟膏剤、経皮用貼付剤、経粘膜液剤、経粘膜貼付剤、吸入剤等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。
投与は錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等による経口投与、又は、関節内、静脈内、筋肉内等の注射剤、坐剤、点眼剤、眼軟膏、経皮用液剤、軟膏剤、経皮用貼付剤、経粘膜液剤、経粘膜貼付剤、吸入剤等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。
【0033】
経口投与のための固体組成物としては、錠剤、散剤、顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては、１種又は２種以上の有効成分を、少なくとも１種の不活性な賦形剤、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、及び／又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウム等と混合される。組成物は、常法に従って、不活性な添加剤、例えばステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤やカルボキシメチルスターチナトリウム等のような崩壊剤、安定化剤、溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被膜してもよい。
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤又はエリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水又はエタノールを含む。当該液体組成物は不活性な希釈剤以外に可溶化剤、湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤又はエリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水又はエタノールを含む。当該液体組成物は不活性な希釈剤以外に可溶化剤、湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。
【0034】
非経口投与のための注射剤は、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤又は乳濁剤を含有する。水性の溶剤としては、例えば注射用蒸留水又は生理食塩液が含まれる。非水性の溶剤としては、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール又はオリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、又はポリソルベート８０（局方名）等がある。このような組成物は、更に等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、又は溶解補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。また、これらは無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解又は懸濁して使用することもできる。
【0035】
外用剤としては、軟膏剤、硬膏剤、クリーム剤、ゼリー剤、パップ剤、噴霧剤、ローション剤、点眼剤、眼軟膏等を包含する。一般に用いられる軟膏基剤、ローション基剤、水性又は非水性の液剤、懸濁剤、乳剤等を含有する。例えば、軟膏又はローション基剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、白色ワセリン、サラシミツロウ、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、モノステアリン酸グリセリン、ステアリルアルコール、セチルアルコール、ラウロマクロゴール、セスキオレイン酸ソルビタン等が挙げられる。
【0036】
吸入剤や経鼻剤等の経粘膜剤は固体、液体又は半固体状のものが用いられ、従来公知の方法に従って製造することができる。例えば公知の賦形剤や、更に、pH調整剤、防腐剤、界面活性剤、滑沢剤、安定剤や増粘剤等が適宜添加されていてもよい。投与は、適当な吸入又は吹送のためのデバイスを使用することができる。例えば、計量投与吸入デバイス等の公知のデバイスや噴霧器を使用して、化合物を単独で又は処方された混合物の粉末として、もしくは医薬的に許容し得る担体と組み合わせて溶液又は懸濁液として投与することができる。乾燥粉末吸入器等は、単回又は多数回の投与用のものであってもよく、乾燥粉末又は粉末含有カプセルを利用することができる。あるいは、適当な駆出剤、例えば、クロロフルオロアルカン、ヒドロフルオロアルカン又は二酸化炭素等の好適な気体を使用した加圧エアゾールスプレー等の形態であってもよい。
【0037】
投与量は病気の種類、症状、年齢、性別など個々の患者によって異なるが、通常、経口投与の場合、成人１日あたり０．００１ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ程度であり、これを１回、あるいは２回から４回に分けて投与する。注射で投与する場合は、成人１日あたり０．０００１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ程度を１回乃至２回、急速静注するかあるいは点滴静注する。吸入の場合は成人１日あたり０．０００１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ程度を１回、又は複数回投与する。経皮剤の場合は成人１日あたり０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ程度を１日１回乃至２回貼付する。
【0038】
前記ＲＮａｓｅＨ２阻害化合物、又はその塩は、前記ＲＮａｓｅＨ２阻害化合物、又はその塩が有効性を示すと考えられる疾患の種々の治療剤又は予防剤と併用することができる。当該併用は、同時投与、或いは別個に連続して、若しくは所望の時間間隔をおいて投与してもよい。同時投与製剤は、配合剤であっても別個に製剤化されていてもよい。
【0039】
本発明の医薬組成物の治療対象である前立腺がんは、前立腺に発生する癌であり、ホルモン療法として、抗アンドロゲン剤の投与が行われることもある。治療対象の前立腺がんの種類は、特に限定されるものではないが、ホルモン療法耐性を獲得したアンドロゲン非依存性前立腺がん（ＣＲＰＣ）に特に有効である。ＡＲ陽性ＣＲＰＣ及びＡＲ陰性のＣＲＰＣに顕著な抗がん作用を示し、本発明の医薬組成物は、ホルモン療法耐性を獲得したＣＲＰＣに有効に用いることができる。しかしながら、ホルモン療法耐性ではない前立腺がんやその他の機序による治療抵抗性前立腺がんも治療することができる。
【0040】
《前立腺がんの治療方法》
前記ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質を前立腺がんの治療方法に用いることができる。すなわち、本明細書は、前記ＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸、抗ＲＮａｓｅ Ｈ抗体、又はＲＮａｓｅ Ｈ阻害化合物等のＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質の治療有効量を前立腺がん患者に投与する工程を含む、前立腺がんの治療方法を開示する。
前記ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質を前立腺がんの治療方法に用いることができる。すなわち、本明細書は、前記ＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸、抗ＲＮａｓｅ Ｈ抗体、又はＲＮａｓｅ Ｈ阻害化合物等のＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質の治療有効量を前立腺がん患者に投与する工程を含む、前立腺がんの治療方法を開示する。
【0041】
《前立腺癌の治療方法における使用のためのＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質》
前記ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質は、前立腺がんの治療方法に使用することができる。すなわち、前立腺がんの治療方法に使用するための、前記ＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸、抗ＲＮａｓｅ Ｈ抗体、又はＲＮａｓｅ Ｈ阻害化合物等のＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質を開示する。
前記ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質は、前立腺がんの治療方法に使用することができる。すなわち、前立腺がんの治療方法に使用するための、前記ＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸、抗ＲＮａｓｅ Ｈ抗体、又はＲＮａｓｅ Ｈ阻害化合物等のＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質を開示する。
【0042】
《ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質の医薬組成物の製造への使用》
前記ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質は、前立腺がんの治療用医薬組成物の製造へ使用することができる。すなわち、本明細書は、前記前記ＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸、抗ＲＮａｓｅ Ｈ抗体、又はＲＮａｓｅ Ｈ阻害化合物等のＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質の、前立腺がんの治療用医薬組成物の製造への使用を開示する。
前記ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質は、前立腺がんの治療用医薬組成物の製造へ使用することができる。すなわち、本明細書は、前記前記ＲＮＡｉ効果を有する二本鎖核酸、抗ＲＮａｓｅ Ｈ抗体、又はＲＮａｓｅ Ｈ阻害化合物等のＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質の、前立腺がんの治療用医薬組成物の製造への使用を開示する。
【0043】
《作用》
ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質が前立腺癌の治療に有効であるメカニズムは、詳細に解析されているわけではないが、以下のように推定することができる。ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質は、ＲＮａｓｅ Ｈ２のｍＲＮＡの発現を阻害すること、ＲＮａｓｅ Ｈ２タンパク質の発現を阻害すること、ＲＮａｓｅ Ｈ２の機能（活性）を阻害することによって、ＲＮａｓｅ Ｈ２の活性が亢進している前立腺がんを抑制することができる。例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ２の発現又は活性を抑制することによって、がん抑制遺伝子ｐ５３発現量を増加、及び／又はＡＲ発現量を減少させることで、前立腺がん細胞の増殖を抑制できると推定される。
本発明のＲＮａｓｅ Ｈ２阻害化合物は、ＲＮａｓｅ Ｈ２の機能（活性）を阻害することによって、ＲＮａｓｅ Ｈ２の活性が亢進している前立腺がんを抑制することができるが、特に下記式（１）のＲ１及びＲ２に、それぞれ５～６員の芳香族複素環基、フェニル基、炭素数５～６のシクロアルキル基、又は炭素数３～８のアルキル基を有することにより、ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害活性を示すものと推定される。
ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質が前立腺癌の治療に有効であるメカニズムは、詳細に解析されているわけではないが、以下のように推定することができる。ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害物質は、ＲＮａｓｅ Ｈ２のｍＲＮＡの発現を阻害すること、ＲＮａｓｅ Ｈ２タンパク質の発現を阻害すること、ＲＮａｓｅ Ｈ２の機能（活性）を阻害することによって、ＲＮａｓｅ Ｈ２の活性が亢進している前立腺がんを抑制することができる。例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ２の発現又は活性を抑制することによって、がん抑制遺伝子ｐ５３発現量を増加、及び／又はＡＲ発現量を減少させることで、前立腺がん細胞の増殖を抑制できると推定される。
本発明のＲＮａｓｅ Ｈ２阻害化合物は、ＲＮａｓｅ Ｈ２の機能（活性）を阻害することによって、ＲＮａｓｅ Ｈ２の活性が亢進している前立腺がんを抑制することができるが、特に下記式（１）のＲ１及びＲ２に、それぞれ５～６員の芳香族複素環基、フェニル基、炭素数５～６のシクロアルキル基、又は炭素数３～８のアルキル基を有することにより、ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害活性を示すものと推定される。
【化8】
【実施例0044】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【0045】
《実施例１》
本実施例では、ＲＮａｓｅ Ｈ２Ａに対するｓｉＲＮＡを用いて、ＡＲ陽性の前立腺がん細胞（ＬＮＣａＰ細胞及び２２Ｒｖ１細胞）のｍＲＮＡ及びタンパク質の発現及び細胞の増殖に対する影響を検討した。
アンドロゲン受容体陽性前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰ（ヒト左鎖骨リンパ節転移由来前立腺がん細胞）と２２Ｒｖ１細胞（ヒト前立腺がん由来上皮細胞）は、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。１０％Fetal bovine serum（FBS）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Thermofisher, Tokyo, Japan）を加えたRoswell Park Memorial Institute（ＲＰＭＩ）１６４０（Sigma-Aldrich Japan, Tokyo, Japan）をメディウムとして使用した。
本実施例では、ＲＮａｓｅ Ｈ２Ａに対するｓｉＲＮＡを用いて、ＡＲ陽性の前立腺がん細胞（ＬＮＣａＰ細胞及び２２Ｒｖ１細胞）のｍＲＮＡ及びタンパク質の発現及び細胞の増殖に対する影響を検討した。
アンドロゲン受容体陽性前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰ（ヒト左鎖骨リンパ節転移由来前立腺がん細胞）と２２Ｒｖ１細胞（ヒト前立腺がん由来上皮細胞）は、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。１０％Fetal bovine serum（FBS）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Thermofisher, Tokyo, Japan）を加えたRoswell Park Memorial Institute（ＲＰＭＩ）１６４０（Sigma-Aldrich Japan, Tokyo, Japan）をメディウムとして使用した。
【0046】
以下のｓｉＲＮＡを作製した。
ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃１（８５８－８８０）
5’-CAGCAUCCGAGAAUCAGGAGG-3’
5’-UCCUGAUUCUCGGAUGCUGAG-3’
ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃２（９３３－９３５）
5’-GUUCUUCCCACCGAUAUUUCC-3’
5’-AAAUAUCGGUGGGAAGAACGG-3’
ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃３（２２６－２４８）
5’-CUACGCCAUCUGUUAUUGUCC-3’
5’-ACAAUAACAGAUGGCGUAGAC-3’
ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃４（４５１－４７３）
5’-CACUGGGCUUAUACAGUAUGC-3’
5’-AUACUGUAUAAGCCCAGUGGC-3’
ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃５（６８５－７０７）
5’-GCAGGACUUGGAUACUGAUUA-3’
5’-AUCAGUAUCCAAGUCCUGCAG-3’
ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃６（１１４７－１１６９）
5’-GGUGUUGGUUGAUUAAUUUUA-3’
5’-AAAUUAAUCAACCAACACCCA-3’
ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃１（８５８－８８０）
5’-CAGCAUCCGAGAAUCAGGAGG-3’
5’-UCCUGAUUCUCGGAUGCUGAG-3’
ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃２（９３３－９３５）
5’-GUUCUUCCCACCGAUAUUUCC-3’
5’-AAAUAUCGGUGGGAAGAACGG-3’
ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃３（２２６－２４８）
5’-CUACGCCAUCUGUUAUUGUCC-3’
5’-ACAAUAACAGAUGGCGUAGAC-3’
ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃４（４５１－４７３）
5’-CACUGGGCUUAUACAGUAUGC-3’
5’-AUACUGUAUAAGCCCAGUGGC-3’
ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃５（６８５－７０７）
5’-GCAGGACUUGGAUACUGAUUA-3’
5’-AUCAGUAUCCAAGUCCUGCAG-3’
ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃６（１１４７－１１６９）
5’-GGUGUUGGUUGAUUAAUUUUA-3’
5’-AAAUUAAUCAACCAACACCCA-3’
【0047】
コントロールｓｉＲＮＡ（silencer select siRNA）はThermofisher（Tokyo, Japan）より購入した。ｓｉＲＮＡの細胞内への導入はLipofectamine RNAiMAX（Thermofisher,Tokyo,Japan）を用い、プロトコルにしたがって行った。
ＲＮＡＳＥＨ２Ａの発現抑制は、ｑＲＴ－ＰＣＲ及びＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＡＲ特異抗体を用いたｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法にて測定した。細胞増殖能の解析は、生細胞数のカウントにより行った。５×１０４個ずつ２４穴プレートに細胞を播種し、翌日にＲＮａｓｅ Ｈ２ｉを加えた。ＲＮａｓｅ Ｈ２ｉ添加３日後にＰＢＳで細胞を回収し、同量の０．５％トリパンブルー染色液（Nacalaitesque, Kyoto, Japan）を加え、死細胞の染色を行った。血球計算版（NanoEnTek, Seoul, Korea）で染色されない細胞数をカウントした。解析は各群において３回のカウントを行い、平均値、標準偏差を計算した。
ＲＮＡＳＥＨ２Ａの発現抑制は、ｑＲＴ－ＰＣＲ及びＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ＡＲ特異抗体を用いたｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法にて測定した。細胞増殖能の解析は、生細胞数のカウントにより行った。５×１０４個ずつ２４穴プレートに細胞を播種し、翌日にＲＮａｓｅ Ｈ２ｉを加えた。ＲＮａｓｅ Ｈ２ｉ添加３日後にＰＢＳで細胞を回収し、同量の０．５％トリパンブルー染色液（Nacalaitesque, Kyoto, Japan）を加え、死細胞の染色を行った。血球計算版（NanoEnTek, Seoul, Korea）で染色されない細胞数をカウントした。解析は各群において３回のカウントを行い、平均値、標準偏差を計算した。
【0048】
ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ処理細胞ではｓｉＣｏｎｔｒｏｌと比較し、ＲＮＡＳＥＨ２Ａ及びＡＲのｍＲＮＡ、タンパク質発現量が抑制されることが確認された（図１Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ）。また、ＲＮＡＳＥＨ２Ａの発現抑制は、２２Ｒｖ１ではいずれのｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａにおいても有意差を持って細胞増殖を抑制し、ＬＮＣａＰではｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃２、＃５で有意差を持って細胞増殖を抑制することが分かった（図１Ｃ及びＦ）。
【0049】
《実施例２》
本実施例では、ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃１及びｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃５を用いて、がん抑制遺伝子ｐ５３の発現に対する影響を検討した。
ＲＮＡＳＥＨ２Ａの発現抑制を行い、ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ｐ５３、Ａｃ－ｐ５３特異抗体を用いたｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法でタンパク質発現を検討した。ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃１及び＃５処理細胞ではｓｉＣｏｎｔｒｏｌに比べ、ｐ５３、Ａｃ－ｐ５３の発現量が増加していた（図２Ａ及びＣ）。更に、ｐ５３下流シグナル（ｐ５３、ｐ２１、ＢＡＸ）のｍＲＮＡ発現量をｑＲＴ－ＰＣＲにて計測したところ、ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃１、＃５処理細胞では、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌに比べｐ５３、ｐ２１、ＢＡＸの発現量が増加していた（図２Ｂ及びＤ）。
本実施例では、ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃１及びｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃５を用いて、がん抑制遺伝子ｐ５３の発現に対する影響を検討した。
ＲＮＡＳＥＨ２Ａの発現抑制を行い、ＲＮＡＳＥＨ２Ａ、ｐ５３、Ａｃ－ｐ５３特異抗体を用いたｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法でタンパク質発現を検討した。ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃１及び＃５処理細胞ではｓｉＣｏｎｔｒｏｌに比べ、ｐ５３、Ａｃ－ｐ５３の発現量が増加していた（図２Ａ及びＣ）。更に、ｐ５３下流シグナル（ｐ５３、ｐ２１、ＢＡＸ）のｍＲＮＡ発現量をｑＲＴ－ＰＣＲにて計測したところ、ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃１、＃５処理細胞では、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌに比べｐ５３、ｐ２１、ＢＡＸの発現量が増加していた（図２Ｂ及びＤ）。
【0050】
《実施例３》
本実施例では、ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃１及びｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃５を用いて、ＡＲ及びＡＲ－Ｖ７の発現に対する影響を検討した。
ＲＮＡＳＥＨ２Ａの発現抑制を行い、ＡＲ及びＡＲ－Ｖ７特異抗体を用いたｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法でタンパク質発現を検討した。また、ＡＲ及びＡＲ－Ｖ７のｍＲＮＡの発現をｑＰＣＲによって測定した。更に、アンドロゲンであるジヒドロテストステロンＤＨＴ添加による増殖抑制効果への影響を調べた。
ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃１及び＃５処理細胞ではｓｉＣｏｎｔｒｏｌに比べ、ＡＲ及びＡＲ－Ｖ７の発現量が減少していた（図３）。更に、ＤＨＴ依存的な増殖促進効果がｓｉＣｏｎｔｒｏｌと比べて有意に抑制を受けていた。
本実施例では、ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃１及びｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃５を用いて、ＡＲ及びＡＲ－Ｖ７の発現に対する影響を検討した。
ＲＮＡＳＥＨ２Ａの発現抑制を行い、ＡＲ及びＡＲ－Ｖ７特異抗体を用いたｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法でタンパク質発現を検討した。また、ＡＲ及びＡＲ－Ｖ７のｍＲＮＡの発現をｑＰＣＲによって測定した。更に、アンドロゲンであるジヒドロテストステロンＤＨＴ添加による増殖抑制効果への影響を調べた。
ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃１及び＃５処理細胞ではｓｉＣｏｎｔｒｏｌに比べ、ＡＲ及びＡＲ－Ｖ７の発現量が減少していた（図３）。更に、ＤＨＴ依存的な増殖促進効果がｓｉＣｏｎｔｒｏｌと比べて有意に抑制を受けていた。
【0051】
《実施例４》
本実施例では、ＲＮａｓｅ Ｈ２Ａに対するｓｉＲＮＡにより、去勢抵抗性前立腺がん細胞へのin vivoでの影響をヌードマウスで検討した。
２２Ｒｖ１細胞をヌードマウスへ皮下注射し、腫瘍形成を確認した後に去勢術を行った（Ｎ＝１０）。４８時間おきにｓｉＣｏｎｔｒｏｌ及びｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃５を腫瘍へ注射し、腫瘍サイズを計測した。ｓｉＣｏｎｔｒｏｌと比較し、ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃５で有意に腫瘍サイズの有意な減少が認められた。更に腫瘍からタンパク質を抽出し、ＡＲ、ｐ５３の発現量の検出を検討したところ、ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃５処理によりｐ５３の発現量の増加、ＡＲ、ＡＲ－Ｖ７の発現量の減少が観察された（図４）。
本実施例では、ＲＮａｓｅ Ｈ２Ａに対するｓｉＲＮＡにより、去勢抵抗性前立腺がん細胞へのin vivoでの影響をヌードマウスで検討した。
２２Ｒｖ１細胞をヌードマウスへ皮下注射し、腫瘍形成を確認した後に去勢術を行った（Ｎ＝１０）。４８時間おきにｓｉＣｏｎｔｒｏｌ及びｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃５を腫瘍へ注射し、腫瘍サイズを計測した。ｓｉＣｏｎｔｒｏｌと比較し、ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃５で有意に腫瘍サイズの有意な減少が認められた。更に腫瘍からタンパク質を抽出し、ＡＲ、ｐ５３の発現量の検出を検討したところ、ｓｉＲＮＡＳＥＨ２Ａ＃５処理によりｐ５３の発現量の増加、ＡＲ、ＡＲ－Ｖ７の発現量の減少が観察された（図４）。
【0052】
《実施例５》
本実施例では、ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害化合物が前立腺がん細胞株へ与える影響の検討を行った。ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害化合物として、２－シクロペンタンアミド－４－エチル－５－メチルチオフェン－３－カルボキサミド（2-cyclopentaneamido-4-ethyl-5-methylthiophene-3-carboxamide；ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１）及びＮ－［（フラン－２－イル）メチル］－２－｛８－チア－４，６－ジアザトリシクロ［７．４．０．０２，７］トリデカ－１（９）、２（７）、３，５－テトラエン－３－イルスルファニル｝アセトアミド（N-[(furan-2-yl)methyl]-2-{8-thia-4,6-diazatricyclo[7.4.0.02,7]trideca-1(9),2(7),3,5-tetraen-3-ylsulfanyl}acetamide；ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃２）を用いた。２２Ｒｖ１、ＬＮＣａＰ、ＲＷＰＥ細胞を２４穴プレートに３×１０４個ずつ播種し、２４時間後に化合物Ａ又は化合物Ｂを１００、５０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５μＭ添加し、３日後にＰＢＳで細胞を回収し、０．５％トリパンブルー染色液で死細胞を染色し、染色されていない細胞数を計測した。それぞれ３度の計測を行い、コントロールでの生細胞数との割合を計測しｔ－ｔｅｓｔによりコントロールにおける生細胞数と比較し統計解析を行った。２２Ｒｖ１細胞では化合物Ａ又は化合物Ｂ共に５μＭでコントロールと比較した細胞数が半数になり、ＬＮＣａＰ細胞ではＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１が１０μＭ、ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃２が５μＭで半数となった。しかし、正常前立腺上皮細胞株であるＲＷＰＥ細胞では細胞増殖抑制効果は認められなかった（図５）。
本実施例では、ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害化合物が前立腺がん細胞株へ与える影響の検討を行った。ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害化合物として、２－シクロペンタンアミド－４－エチル－５－メチルチオフェン－３－カルボキサミド（2-cyclopentaneamido-4-ethyl-5-methylthiophene-3-carboxamide；ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１）及びＮ－［（フラン－２－イル）メチル］－２－｛８－チア－４，６－ジアザトリシクロ［７．４．０．０２，７］トリデカ－１（９）、２（７）、３，５－テトラエン－３－イルスルファニル｝アセトアミド（N-[(furan-2-yl)methyl]-2-{8-thia-4,6-diazatricyclo[7.4.0.02,7]trideca-1(9),2(7),3,5-tetraen-3-ylsulfanyl}acetamide；ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃２）を用いた。２２Ｒｖ１、ＬＮＣａＰ、ＲＷＰＥ細胞を２４穴プレートに３×１０４個ずつ播種し、２４時間後に化合物Ａ又は化合物Ｂを１００、５０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５μＭ添加し、３日後にＰＢＳで細胞を回収し、０．５％トリパンブルー染色液で死細胞を染色し、染色されていない細胞数を計測した。それぞれ３度の計測を行い、コントロールでの生細胞数との割合を計測しｔ－ｔｅｓｔによりコントロールにおける生細胞数と比較し統計解析を行った。２２Ｒｖ１細胞では化合物Ａ又は化合物Ｂ共に５μＭでコントロールと比較した細胞数が半数になり、ＬＮＣａＰ細胞ではＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１が１０μＭ、ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃２が５μＭで半数となった。しかし、正常前立腺上皮細胞株であるＲＷＰＥ細胞では細胞増殖抑制効果は認められなかった（図５）。
【0053】
《実施例６》
本実施例では、ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害化合物がｐ５３とＡＲに与える影響を検討した。２２Ｒｖ１、ＬＮＣａＰ細胞を６穴プレートに１×１０５個播種し、２４時間後にＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１又は＃２を添加し、４８時間後にタンパク質を回収した。２２Ｒｖ１におけるＡＲ発現減少は、ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１（５μＭ）、ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃２（１及び５μＭ）で認められ、ｐ５３の発現増加はＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１及び＃２共に（１及び５μＭ）認められた（図６Ａ）。ＬＮＣａＰ細胞では、ＡＲ発現減少は、ＲＮａｓｅＨ２ｉ ＃２（１及び５μＭ）で認められ、ｐ５３の発現増加はＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１及び＃２共に（１及び５μＭ）認められた（図６Ｂ）。
本実施例では、ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害化合物がｐ５３とＡＲに与える影響を検討した。２２Ｒｖ１、ＬＮＣａＰ細胞を６穴プレートに１×１０５個播種し、２４時間後にＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１又は＃２を添加し、４８時間後にタンパク質を回収した。２２Ｒｖ１におけるＡＲ発現減少は、ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１（５μＭ）、ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃２（１及び５μＭ）で認められ、ｐ５３の発現増加はＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１及び＃２共に（１及び５μＭ）認められた（図６Ａ）。ＬＮＣａＰ細胞では、ＡＲ発現減少は、ＲＮａｓｅＨ２ｉ ＃２（１及び５μＭ）で認められ、ｐ５３の発現増加はＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１及び＃２共に（１及び５μＭ）認められた（図６Ｂ）。
【0054】
《実施例７》
本実施例では、ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害化合物がＤＮＡ損傷とアポトーシスへ与える影響を検討した。ＤＮＡ損傷へ与える影響はγＨ２ＡＸで検出し、アポトーシスをＰｏｌｙ（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰＡＲＰ）の分解により生じるcleaved-Poly（ADP-ribose）polymerase（c-PARP）の発現量、及びＴＵＮＥＬ法により検討した。２２Ｒｖ１においてＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１及び＃２共に（１及び５μＭ）でγＨ２ＡＸ、ｃ－ＰＡＲＰの発現増加が認められた（図７Ａ）。ＬＮＣａＰ細胞では、ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１（５μＭ）、ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃２（５μＭ）でγＨ２ＡＸの発現増加が認められ、ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１（１及び５μＭ）、ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃２（５μＭ）でｃ－ＰＡＲＰの発現増加が認められた（図７Ｂ）。また、ＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙでは、ＲＮａｓｅ Ｈ２ｉ＃１及び＃２（１及び５μＭ）共に有意にアポトーシス細胞数を増加させることが分かった（図８）。
本実施例では、ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害化合物がＤＮＡ損傷とアポトーシスへ与える影響を検討した。ＤＮＡ損傷へ与える影響はγＨ２ＡＸで検出し、アポトーシスをＰｏｌｙ（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰＡＲＰ）の分解により生じるcleaved-Poly（ADP-ribose）polymerase（c-PARP）の発現量、及びＴＵＮＥＬ法により検討した。２２Ｒｖ１においてＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１及び＃２共に（１及び５μＭ）でγＨ２ＡＸ、ｃ－ＰＡＲＰの発現増加が認められた（図７Ａ）。ＬＮＣａＰ細胞では、ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１（５μＭ）、ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃２（５μＭ）でγＨ２ＡＸの発現増加が認められ、ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１（１及び５μＭ）、ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃２（５μＭ）でｃ－ＰＡＲＰの発現増加が認められた（図７Ｂ）。また、ＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙでは、ＲＮａｓｅ Ｈ２ｉ＃１及び＃２（１及び５μＭ）共に有意にアポトーシス細胞数を増加させることが分かった（図８）。
【0055】
《実施例８》
本実施例では、ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害化合物が前立腺がん細胞の増殖へ与える影響の検討をｉｎ ｖｉｖｏで行った。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの皮下に２２Ｒｖ１細胞を移植し、腫瘍形成を確認後に去勢術を行い、ＣＲＰＣモデルマウスを作成した。ＣＲＰＣモデルマウスの腹腔内へＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１及び＃２をそれぞれ０．５ｍｇ／匹／回ずつ５回／週投与し、腫瘍増殖へ与える影響を検討した。その結果、ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１及び＃２を投与したマウスにおける腫瘍増殖は、コントロールに比べ有意に抑制されていた（図９）。
本実施例では、ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害化合物が前立腺がん細胞の増殖へ与える影響の検討をｉｎ ｖｉｖｏで行った。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの皮下に２２Ｒｖ１細胞を移植し、腫瘍形成を確認後に去勢術を行い、ＣＲＰＣモデルマウスを作成した。ＣＲＰＣモデルマウスの腹腔内へＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１及び＃２をそれぞれ０．５ｍｇ／匹／回ずつ５回／週投与し、腫瘍増殖へ与える影響を検討した。その結果、ＲＮａｓｅＨ２ｉ＃１及び＃２を投与したマウスにおける腫瘍増殖は、コントロールに比べ有意に抑制されていた（図９）。
【産業上の利用可能性】
【0056】
本発明の前立腺がん治療用医薬組成物は、前立腺がんの治療に効果的に用いることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】