特開 2022-187126 抗血小板剤、血小板粘着抑制剤、血小板凝集抑制剤、抗血栓剤、血小板粘着および／または血小板凝集を抑制するための食品組成物ならびに血栓症を予防または改善するための食品組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022187126

(43)【公開日】2022-12-19

(54)【発明の名称】抗血小板剤、血小板粘着抑制剤、血小板凝集抑制剤、抗血栓剤、血小板粘着および／または血小板凝集を抑制するための食品組成物ならびに血栓症を予防または改善するための食品組成物

(51)【国際特許分類】

   A23L 33/125 20160101AFI20221212BHJP

   A61K 31/726 20060101ALI20221212BHJP

   A61P 7/02 20060101ALI20221212BHJP

   A61K 31/702 20060101ALI20221212BHJP

【ＦＩ】

A23L33/125

A61K31/726

A61P7/02

A61K31/702

【審査請求】未請求

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021094977

(22)【出願日】2021-06-07

(71)【出願人】

【識別番号】300079508

【氏名又は名称】丸共水産株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100110766

【弁理士】

【氏名又は名称】佐川 慎悟

(74)【代理人】

【識別番号】100165515

【弁理士】

【氏名又は名称】太田 清子

(74)【代理人】

【識別番号】100169340

【弁理士】

【氏名又は名称】川野 陽輔

(74)【代理人】

【識別番号】100195682

【弁理士】

【氏名又は名称】江部 陽子

(74)【代理人】

【識別番号】100206623

【弁理士】

【氏名又は名称】大窪 智行

(72)【発明者】

【氏名】宮本 宜之

(72)【発明者】

【氏名】堤 尚信

【テーマコード（参考）】

4B018

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B018LB10

4B018MD31

4B018ME14

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA02

4C086EA26

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA52

4C086NA14

4C086ZA54

(57)【要約】

【課題】 経口摂取された場合であっても有効な抗血小板剤、血小板粘着抑制剤、血小板凝集抑制剤、抗血栓剤、血小板粘着および／または血小板凝集を抑制するための食品組成物ならびに血栓症を予防または改善するための食品組成物を提供する。
【解決手段】 コンドロイチン硫酸オリゴ糖を有効成分とする抗血小板剤。本発明によれば、有効成分を、簡便かつ非侵襲な使用形態である経口摂取の形態で用いて、血小板粘着または血小板凝集を抑制することができる。
【選択図】 図５

【特許請求の範囲】

【請求項1】

コンドロイチン硫酸オリゴ糖を有効成分とする、抗血小板剤。

【請求項2】

コンドロイチン硫酸オリゴ糖を有効成分とする、血小板粘着抑制剤。

【請求項3】

コンドロイチン硫酸オリゴ糖を有効成分とする、血小板凝集抑制剤。

【請求項4】

コンドロイチン硫酸オリゴ糖を有効成分とする、抗血栓剤。

【請求項5】

経口摂取により用いられることを特徴とする、請求項１～４のいずれかに記載の剤。

【請求項6】

前記コンドロイチン硫酸オリゴ糖の構成糖の数が２～１２個である、請求項１～５のいずれかに記載の剤。

【請求項7】

コンドロイチン硫酸オリゴ糖を有効成分とする、血小板粘着および／または血小板凝集を抑制するための食品組成物。

【請求項8】

コンドロイチン硫酸オリゴ糖を有効成分とする、血栓症を予防または改善するための食品組成物。

【請求項9】

前記コンドロイチン硫酸オリゴ糖の構成糖の数が２～１２個である、請求項７または請求項８に記載の食品組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、コンドロイチン硫酸オリゴ糖を有効成分とする、抗血小板剤、血小板粘着抑制剤、血小板凝集抑制剤、抗血栓剤、血小板粘着および／または血小板凝集を抑制するための食品組成物ならびに血栓症を予防または改善するための食品組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

コンドロイチン硫酸（ＣＳ）は、ウロン酸とＮ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミンとの二糖繰り返し構造からなる長い糖鎖に硫酸基が結合した構造を持つグリコサミノグリカンの一種である。多数の硫酸基を持つことから強く負に帯電して、保水性および弾力性に富む性質を有する。生体内の分布は、軟骨のほか、皮膚などの結合組織、脳などあらゆる組織に広く見られ、細胞増殖因子や細胞外マトリックス成分と相互作用し、細胞接着、移動、増殖、分化、形態形成といった様々な細胞活動を制御しており、特に、軟骨ではクッション作用に重要な役割を果たしていることが知られている。

【0003】

また、従来より、ＣＳは弱い血液凝固抑制作用を有することが知られ（非特許文献１）、特許文献１には、ＣＳを過硫酸化した過硫酸化ＣＳが、より高い抗血液凝固活性を有することが開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開平１１－１６６００１号公報

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】竹下 剛、コンドロイチン硫酸およびそのスルフォン化物の生体における血液凝固阻止作用について(コンドロイチン硫酸に関する研究 その２）、法医・鑑識並びに社会医学雑誌、第６巻、第１・２号、第４８～６４頁、１９６８年３月

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

上述のとおりＣＳあるいはその誘導物について、血液凝固抑制作用を有することは知られていたが、血小板に対する作用は知られておらず、これらを有効成分とする抗血小板剤も無かった。また、高分子のＣＳは、経口摂取してもそのほぼ全てが腸内細菌によって利用され、血中に移行しない（国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ２０２１／３４１４号明細書）。このことから、経口摂取の使用形態では高分子のＣＳによって血液凝固抑制作用を得ることができない。

【0007】

一方、本発明者らは、ＣＳを高温高圧条件下で加水分解して低分子化し、コンドロイチン硫酸オリゴ糖（ＣＳオリゴ糖）を製造する技術開発に成功している（特許第６１４６７３３号）。そして今般、本発明者らは、鋭意研究の結果、ＣＳオリゴ糖が、経口摂取された場合であっても生体内に吸収されて血中に存在すること、および血小板の粘着や血小板の凝集を抑制できることを見出した。

【0008】

すなわち、本発明は、上記課題を解決するために成されたものであって、経口摂取された場合であっても有効な、ＣＳオリゴ糖を有効成分とする抗血小板剤、血小板粘着抑制剤、血小板凝集抑制剤、抗血栓剤、血小板粘着および／または血小板凝集を抑制するための食品組成物ならびに血栓症を予防または改善するための組成物を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

（１）本発明に係る抗血小板剤は、コンドロイチン硫酸オリゴ糖を有効成分とする。

【0010】

（２）本発明に係る血小板粘着抑制剤は、コンドロイチン硫酸オリゴ糖を有効成分とする。

【0011】

（３）本発明に係る血小板凝集抑制剤は、コンドロイチン硫酸オリゴ糖を有効成分とする。

【0012】

（４）本発明に係る抗血栓剤は、コンドロイチン硫酸オリゴ糖を有効成分とする。

【0013】

（５）本発明に係る剤は、経口摂取により用いられるものであってもよい。

【0014】

（６）本発明において、コンドロイチン硫酸オリゴ糖の構成糖の数は、２～１２個であってもよい。

【0015】

（７）本発明に係る血小板粘着および／または血小板凝集を抑制するための食品組成物は、コンドロイチン硫酸オリゴ糖を有効成分とする。

【0016】

（８）本発明に係る血栓症を予防または改善するための食品組成物は、コンドロイチン硫酸オリゴ糖を有効成分とする。

【発明の効果】

【0017】

本発明によれば、血小板のコラーゲンへの粘着または血小板の凝集を抑制することができる。すなわち、本発明によれば、血小板血栓の不必要な形成や過剰な形成を抑制することができる。このことから、血栓がその発症や悪化の要因となる疾病や不健康状態の予防や改善に寄与することができる。

【0018】

有効成分であるＣＳオリゴ糖は、後述する実施例で示すように、経口摂取によって血中に移行する。よって、本発明によれば、有効成分を、簡便かつ非侵襲な使用形態である経口摂取の形態で用いて、血小板粘着または血小板凝集を抑制することができる。

【0019】

また、ＣＳオリゴ糖は、プラセボ二重盲検でのヒト介入試験において、経口摂取における安全性が確認されている（Mie Nishimura, Nobuyuki Miyamoto, Jun Nishihira , Daily Oral Chondroitin Sulfate Oligosaccharides for Knee Joint Pain in Healthy Subjects: A Randomized, Blinded, Placebo-Controlled Study , The Open Nutrition Journal, 2018, 12, 10-20）。よって、本発明によれば、安全性への懸念なく、血小板粘着または血小板凝集を抑制することができる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】実施例で用いたオリゴ糖製造装置を模式的に示す図である。

【図2】４糖のコンドロイチン硫酸（ＣＳ４糖）の希釈列に係るＨＰＬＣクロマトグラムにおけるピーク面積と、サンプルに含まれるＣＳ４糖量との関係を示すグラフ（検量線）である。

【図3】ＣＳ４糖を経口投与した被験者の血漿のＨＰＬＣクロマトグラムである。上図が被験者１の血漿（検体１）をサンプルとしたクロマトグラムであり、下図が被験者２の血漿（検体２）をサンプルとしたクロマトグラムである。また、点線がＣＳ４糖の投与前の血漿をサンプルとしたクロマトグラムであり、実線がＣＳ４糖を経口投与した後の血漿をサンプルとしたクロマトグラムである。

【図4】種々の濃度となるようＣＳ４糖を添加した、ＣＳオリゴ糖の常用者の血小板粘着能を示す棒グラフである。

【図5】ＣＳオリゴ糖の常用者、服用中止後８日間経過した常用者、非常用者および服用開始後６日間経過した非常用者の血液の血小板粘着能を示す棒グラフである。

【図6】種々の濃度となるようＣＳ４糖を添加した、ＣＳオリゴ糖の常用者および非常用者の血液の血小板凝集能を示す棒グラフである。

【0021】

以下、本発明について詳細に説明する。

【0022】

本発明は、抗血小板剤、血小板粘着抑制剤、血小板凝集抑制剤、抗血栓剤、血小板粘着および／または血小板凝集を抑制するための食品組成物ならびに血栓症を予防または改善するための食品組成物を提供する。以下、これらの剤および食品組成物をまとめて、あるいはこれらの剤および食品組成物のうちのいずれかを指して「本発明の剤等」あるいは「本発明に係る剤等」という場合がある。

【0023】

抗血小板剤は、血小板の働きを低下させて血栓の形成を抑制する作用を有する剤、あるいは当該作用を生体にもたらす目的で用いられる剤をいう。

【0024】

血小板粘着抑制剤は、血小板粘着を抑制する作用を有する剤、あるいは当該作用を生体にもたらす目的で用いられる剤をいう。

【0025】

血小板凝集抑制剤は、血小板凝集を抑制する作用を有する剤、あるいは当該作用を生体にもたらす目的で用いられる剤をいう。

【0026】

抗血栓剤は、血栓の形成を抑制する作用を有する剤、血栓症を予防または改善する作用を有する剤、あるいは前記の作用を生体にもたらす目的で用いられる剤をいう。

【0027】

血小板の粘着（血小板粘着）とは、血小板が、コラーゲンや血管内皮細胞、血管内皮細胞下組織などの生体内物質に直接あるいは他因子を介して粘着することをいう。また、血小板粘着を抑制するとは、左記物質に血小板が粘着する程度（粘着した血小板数や粘着強度など）を小さくすることをいう。

【0028】

被験物質により血小板粘着が抑制されたか否かは、例えば、後述する実施例に示すように、コラーゲンビーズを用いた血小板粘着能検査により確認することができる。当該検査において、被験物質の存在によりビーズを通過する血小板数が増大すれば、被験物質により血小板粘着が抑制されたと判断することができる。

【0029】

血小板の凝集（血小板凝集）とは、血小板同士が直接あるいは他因子を介して凝集して凝集塊を形成することをいう。また、血小板凝集を抑制するとは、凝集塊を形成する程度（凝集した血小板数など）を小さくすることをいう。

【0030】

被験物質により血小板凝集が抑制されたか否かは、例えば、後述する実施例に示すように、光透過法による血小板凝集能検査により確認することができる。当該検査において、血小板刺激物質（アデノシン二リン酸など）添加時の光透過率（凝集率）が被験物質の存在により小さくなれば、被験物質により血小板凝集が抑制されたと判断することができる。

【0031】

血小板粘着および血小板凝集が起こると血栓が形成される。形成された血栓が血管に詰まると、そこから先の血流が著しく悪くなり、組織に重大な障害を引き起こす。例えば、心臓や脳、肺の血管に血栓が詰まると、心筋梗塞、脳梗塞、肺塞栓症を引き起こし、生命に危険をもたらす。このような、血管が血栓で閉塞することにより発症する疾病を血栓症という。血栓症は、動脈血栓症（脳梗塞、心筋梗塞、末梢動脈血栓症など）と静脈血栓症（深部静脈血栓症、術後深部静脈血栓症、肺塞栓、エコノミークラス症候群など）とに分けられる場合がある。

【0032】

また、疾病まではいかずとも、正常状態よりも血栓の量が増加すると、動脈硬化、痴呆、血圧異常、めまい、肩こり、頭痛、腰痛、関節痛、目のかすみ、不眠、動悸、息切れ、不整脈、皮膚のくすみ、くまなどの不健康状態を引き起こす。

【0033】

ＣＳオリゴ糖は、血小板粘着を抑制、あるいは血小板凝集を抑制できることから、血小板血栓の生成を抑制することができる。よって、ＣＳオリゴ糖は、抗血小板剤や抗血栓剤の有効成分とすることができる。

【0034】

すなわち、本発明の剤等は、血小板血栓がその発症または悪化の要因となる疾患や不健康状態を予防または改善する用途の剤や食品組成物として用いることができる。本発明は、血小板粘着を抑制することまたは血小板凝集を抑制することに意義のあるすべての用途に用いることができる。

【0035】

本発明において、ＣＳオリゴ糖とは、ウロン酸とＮ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミンとの二糖繰り返し構造からなる糖鎖に硫酸基が結合した構造（コンドロイチン硫酸構造）をもち、かつ、構成糖の個数が、コンドロイチン硫酸よりも少ないものをいう。ＣＳオリゴ糖の構成糖の個数は、単糖よりも多く、コンドロイチン硫酸よりも少ない数であればよく、例えば、２糖、３糖、４糖、５糖、６糖、７糖、８糖、９糖、１０糖、１１糖、１２糖、１３糖、１４糖、１５糖、１６糖、１７糖、１８糖、１９糖、２０糖・・・４８糖などを挙げることができる。これらのうち、構成糖の個数が２～１２個のＣＳオリゴ糖は、腸管膜の透過性が高いことから（特許第６１４６７３３号明細書：段落［００８１］－［００８６］、［図１８］）、経口摂取により生体に吸収されやすいと考えられる。よって、２～１２糖のＣＳオリゴ糖を有効成分とすれば、本発明の剤等を、経口摂取により簡便に用いられる形態とすることができる。

【0036】

ＣＳオリゴ糖は、化学合成して得てもよく、高分子のＣＳを公知の方法により分解して低分子化することにより得てもよい。ＣＳを低分子化する方法としては、例えば、温度Ｔが１７５℃≦Ｔ≦２２０℃でありかつ圧力Ｐが５ＭＰａ≦Ｐ≦２５ＭＰａ高温高圧条件で加水分解する方法（特許第６１４６７３３号公報）や、塩酸などの酸により加水分解する方法（Ｃｉｆｏｎｅｌｌｉ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．、第２巻、第１５０－１６１頁、１９６６年）、コンドロイチナーゼＡＢＣやコンドロイチナーゼＡＣＩＩ、精巣ヒアルロニダーゼ、ＣＳ分解酵素（特開平９－１６８３８４号公報）などの酵素により脱離分解あるいは加水分解する方法、ｐＨ２．５～１２．０のＣＳ水溶液を１００～１６０℃未満の水熱条件下に５～２０分未満保つ方法（特開２０１０－７７２５６号公報）を例示することができる。

【0037】

原料のＣＳは、動物の軟骨等から抽出して得てもよく、市販品を用いてもよい。ＣＳの由来としては、例えば、エイやサメ、ウシ、クジラ、ウサギ、ヒツジ、カブトガニ、ブタ、イカ、ニワトリなどの動物を挙げることができるが、いずれの生物であってもよい。また、ＣＳが有する構造としては、例えば、グルクロン酸－Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン４－硫酸構造（いわゆるコンドロイチン硫酸Ａ構造）や、グルクロン酸－Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン６－硫酸構造（いわゆるコンドロイチン硫酸Ｃ構造）、グルクロン酸２－硫酸－Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン６－硫酸構造（いわゆるコンドロイチン硫酸Ｄ構造）、グルクロン酸－Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン４，６－硫酸構造（いわゆるコンドロイチン硫酸Ｅ構造）、上記の構造において、グルクロン酸がエピマー化してイズロン酸である構造（いわゆるコンドロイチン硫酸Ｂ構造）を挙げることができるが、これらのいずれであってもよい。

【0038】

本発明の剤は、ヒトもしくは動物の生体、または生体から採取した血小板を含む細胞や組織・器官に投与することにより使用することができる。投与方法としては、例えば、経口、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、舌下投与、口腔粘膜投与、経直腸投与、経膣投与、点眼、点耳、経鼻、経口吸入、噴霧吸入、経皮などを例示することができる。本発明の剤の形態としては、有効成分であるＣＳオリゴ糖のみからなるもののほか、適当な賦形剤や担体と合わせてなる、医薬品や医薬部外品、サプリメント、食品添加剤、飼料添加物、化粧品などの形態を挙げることができる。係る医薬品や医薬部外品、サプリメント、食品添加剤、飼料添加物、化粧品は、当業者に公知の方法で製造することができる。

【0039】

医薬品や医薬部外品、サプリメント、食品添加剤、飼料添加物におけるＣＳオリゴ糖の含有量は、その剤型により異なるが、例えば、乾燥質量を基準として０．００１～９０質量％、０．０１～８５質量％、０．１～８０質量％などとすることができる。

【0040】

また、化粧品におけるＣＳオリゴ糖の含有量は、その剤型により異なるが、例えば、乾燥質量を基準として０.０００１～８０質量％、０.００１～６０質量％、０．０１～５０質量％などとすることができる。

【0041】

本発明の食品組成物の形態としては、有効成分であるＣＳオリゴ糖のみからなるもののほか、菓子や飲料、加工食品、健康食品、乳幼児食品などの通常の飲食物の形態を挙げることができる。飲食物の形態とする場合は、通常の製造過程で、有効成分を添加して製造することができる。この場合の食品組成物には、人用の飲食物のみならず、家畜、競走馬、愛玩動物などの飼料、ペットフード、飲料など（動物用飼料等）も包含する。動物用飼料等は、対象が動物である以外は飲食物とほぼ等しいことから、本明細書における食品組成物に関する記載は、動物用飼料等についても同様に当てはめることができる。

【0042】

食品組成物におけるＣＳオリゴ糖の含有量は、飲食物の形態により異なるが、例えば、乾燥質量を基準として０．００１～９９質量％、０．０１～８０質量％、１～８０質量％などとすることができる。１日当たりの摂取量は、１回で摂取してもよいが、数回に分けて摂取してもよい。

【0043】

以下、本発明について各実施例に基づいて説明する。本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。

【実施例0044】

本実施例において、「％」は、特段の記載のない限り質量％（（ｗ／ｗ）％）を表す。また、単位の「Ｍ」はmol/Lを意味する。本実施例において、「コンドロイチン硫酸オリゴ糖（ＣＳオリゴ糖）の常用者」は、ＣＳオリゴ糖を約３００ｍｇ／日の摂取量で約１２ヶ月間、毎日経口摂取している者を被験者とした。「ＣＳオリゴ糖の非常用者」は、ＣＳオリゴ糖の摂取経験が無い者、または摂取経験があるとしても前回の摂取から３０日以上経過している者を被験者とした。血小板粘着能および血小板凝集能の測定は株式会社保健科学研究所にて行った。健常者における基準値は当該測定機関にて設定された値である。

【0045】

＜実施例１＞被験物質の調製
（１）高分子のコンドロイチン硫酸
エイの軟骨２８０ｋｇを斜軸ニーダーに入れ、攪拌しながらパパイン３００ｇを投入して、５５℃で３時間反応させた。９２℃に１０分間保つことにより失活処理したのち、金網を通過させて粗ろ過し、ろ液を回収した。ろ液を５０℃に冷却し、ろ過助剤として珪藻土１０ｋｇを加えてよく攪拌した後、加圧型ろ過装置フィルタープレスを用いて清澄ろ過し、淡黄色清明なろ液を得た。ろ液を分画分子量１３０００の限外ろ過膜を備えた濾過装置に供して、適宜加水しながら１２時間透析した。内液（透析保持液）を回収して９２℃で加熱殺菌した後、スプレードライヤーにより噴霧乾燥し、白色粉末１０．２ｋｇを得て、これを粗精製コンドロイチン硫酸とした。

【0046】

粗精製コンドロイチン硫酸１０ｇをイオン交換水５００ｍＬに溶解し、活性炭５ｇを加え、４℃で一晩攪拌した。続いて、ろ過助剤として珪藻土を加えて清澄ろ過し、ろ液を回収した。エタノールを終濃度７０（ｖ／ｖ）％となるよう加え、よく攪拌したのち４℃で一晩静置した。白色沈殿をガラスフィルターでろ過して集め、冷却した７０（ｖ／ｖ）％エタノールで洗った。これを４００ｍＬのイオン交換水に溶解し、エタノールを終濃度８０（ｖ／ｖ）％となるよう加え、よく攪拌したのち４℃で一晩静置した。白色沈殿をガラスフィルターでろ過して集め、冷却した８０（ｖ／ｖ）％エタノールで洗った。これを４００ｍＬのイオン交換水に溶解し、エタノールを終濃度９０（ｖ／ｖ）％となるよう加え、よく攪拌したのち４℃で一晩静置した。白色沈殿をガラスフィルターでろ過して集め、別に冷却した９０（ｖ／ｖ）％エタノールで洗った。これをエタノール中で良く攪拌したのち、白色沈殿をガラスフィルターでろ過して集め、デシケーターで乾燥して、精製したコンドロイチン硫酸の白色粉末３．８ｇを得た。これを高分子のコンドロイチン硫酸とした。

【0047】

（２）ＣＳオリゴ糖およびＣＳ４糖
高分子のコンドロイチン硫酸を、１７５～２２０℃かつ５～２５ＭＰａの高温高圧条件で加水分解して、オリゴ糖のコンドロイチン硫酸（ＣＳオリゴ糖）を得た。具体的には、まず、特許第６１４６７３３号公報に記載のオリゴ糖製造装置（図１）を用意した。すなわち、当該装置は、図１に示すように、蒸留水を収容する水容器、高圧ポンプＡ（ミルフロー制御容量ポンプ Ｍ１５０ パルスレスＣ２４－Ｚ３、日機装）、ヒーター（電気ヒーター）、センサーＡ、原料を収容する原料容器、高圧ポンプＢ（ミルフロー制御容量ポンプ Ｍ１５０ パルスレスＣ２３－Ｘ１、日機装）、混合Ｔ字管、反応部（内腔径０．５ｍｍのステンレス３１６製配管（内腔の空間体積４６８００ｍｍ^３～１９１０００ｍｍ^３）からなる）、センサーＢ、センサーＣ、ウォーターバス、センサーＤ、背圧弁（Ｈｉｇｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ／Ｂａｃｋ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ２６－１７６２－６６－３１４、ＴＥＳＣＯＭ）および反応生成物を収容する生成物容器を備えるものであり、水容器、原料容器および生成物容器はすべてステンレス製配管でつながれた構造である。反応部の入り口温度をセンサーＢ、出口温度をセンサーＣで確認する。圧力はセンサーＤにより確認する。

【0048】

本実施例１（１）に記載の方法により調製した粗精製コンドロイチン硫酸１０ｋｇを５００Ｌの水に溶解し、Ｂｒｉｘ２．０に調整して原料液とした。脱気した蒸留水を水容器に入れ、高圧ポンプＡにより連続的に送液してヒーターで加熱した。原料液を原料容器に入れ、高圧ポンプＢにより連続的に送液した。加熱された蒸留水と常温の原料液とは、反応部入口の混合Ｔ字管で混合され、反応部にて、水と原料液に含まれるコンドロイチン硫酸とを反応させて加水分解を行った。反応条件は、反応部の温度が１７５～２２０℃、反応部の圧力が５～２５ＭＰａ、反応時間が８．８秒間とした。続いて、ステンレス製配管をウォーターバスで直接冷却することにより反応を速やかに終了させた。その後、背圧弁によりステンレス製配管内の圧力を下げて、反応生成物を生成物容器に収容した。なお、蒸留水の流量は原料液の流量の３倍以上とした。

【0049】

反応生成物を分画分子量３０００の限外ろ過膜を備えた濾過装置に供して限外濾過し、外液（透過液）を回収して濃縮した。これを陰イオン交換担体NuviaQ（Bio Rad）を充填したイオン交換クロマトグラフィーに供して精製し、続いて、Biogel P-6（Bio Rad）に通して脱塩処理した後、凍結乾燥して、コンドロイチン硫酸オリゴ糖（ＣＳオリゴ糖）の粉末を得た。また、濃縮後の外液を、Biogel P-6（Bio Rad）を充填したカラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーに供して分画し、四糖画分を分取した。これらを、上記と同様に精製、脱塩処理および凍結乾燥し、コンドロイチン硫酸構造を有する４糖（ＣＳ４糖）の粉末を得た。

【0050】

＜実施例２＞ＣＳオリゴ糖の血中移行の確認
（１）血漿の取得
ＣＳ４糖を文献（河原ら、応用糖質科学、２０２１年、in press）に従い精製した後、超純水に溶解して水溶液とした。ＣＳ４糖１０００ｍｇを含有する水溶液を、健康な成人男性ボランティア２名（被験者１、２）に経口投与した。なお、被験者１は、ＣＳオリゴ糖の服用を２４時間中止した常用者であり、被験者２は非常用者である。投与前と投与から２時間または３時間後とに、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を終濃度１ｍｇ／ｍＬになるように添加した１０ｍＬ容量のシリンジ(テルモ)に血液を採取した。採血後ただちに１０回ほどシリンジを転倒混和した後、１５ｍＬ容量の遠心チューブに血液を移し、１５分間静置した。これを遠心分離（２３７０×ｇ、１５分）し、上清（血漿）を分離回収して、－２０℃で冷凍保存した。被験者１から取得した血漿を検体１、被験者２から取得した血漿を検体２とした。

【0051】

（２）サンプル液の調製
解凍した血漿５００μＬを、分画分子量１００００の限外ろ過膜を備えた遠心濃縮チューブに分取し、２ＭのＮａＣｌ水溶液５００μＬを加え、ピペッティングで攪拌した。その後、遠心分離（８０００×ｇ、２０分、１０℃）を行い、透過液を回収した。保持液約２００μＬに等量の１ＭのＮａＣｌ水溶液を加え、ピペッティングで攪拌し、遠心分離（８０００×ｇ、１５分、１０℃）を行い、透過液を回収した。同様の操作を合計４回繰り返し行って透過液を回収し、合計約１７００μＬの透過液を得た。以上の操作により、血漿中に存在するＣＳ４糖の９９％以上を透過液中に回収したと考えられる。透過液を減圧遠心濃縮（５１０×ｇ、１０時間、室温、２０Ｐａ）した後、凍結乾燥した。乾燥物に３００μＬの超純水を加え、ボルテックスにて溶解してサンプル液とした。

【0052】

（３）ＣＳ４糖の蛍光標識
参考文献（Bigge et al, Analytical Biochemistry, 1995）に従い、サンプル液中の糖の還元末端を２－アミノベンズアミド（２ＡＢ）により蛍光標識した。ただし、水溶液中で還元アミノ化反応を行うため、還元剤として２－ピコリンボラン（２ＰＢ）を用いた。すなわち、３０％酢酸ジメチルスルホキシド溶液に、５０ｍｇ／ｍＬとなるよう２ＡＢを、１１０ｍｇ／ｍＬとなるよう２ＰＢを、それぞれ加えタッピングで攪拌、溶解し、蛍光標識液とした。サンプル液を１００μＬ分取し、蛍光標識液を１００μＬ加え、タッピングで攪拌後、軽度の遠心分離に供して壁面に付着した液を落とした。これを６５℃で１時間置くことにより反応させた。続いて、室温にて放冷後、超純水を１００μＬ加えボルテックスミキサーで攪拌した。過剰に加えた２ＡＢの除去のため、クロロホルム５００μＬを加えボルテックスミキサーで攪拌後、遠心分離に供して水層と有機溶媒層を分離し、ピペットで吸引して有機溶媒層を廃棄した。同様の操作を合計５回行って、水層を回収した。水層を孔径０．２２μｍのメンブレンフィルターGLCTD-MCE1322（島津ジーエルシー）で濾過して有形物を除去し、濾液を回収して血漿サンプルとした。

【0053】

また、ＣＳ４糖を超純水に溶解して希釈列を作製し、同様に蛍光標識して、これを検量線用サンプルとした。

【0054】

（４）糖濃度の測定
検量線用サンプルを下記条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供した。得られたクロマトグラムにおいてＣＳ４糖のピーク面積を測定し、検量線を作製した。その結果を図２に示す。図２に示すように、近似曲線は原点を通り、傾き６９７４の直線であり、その決定係数（Ｒ^２）は０．９９９９であった。このことから、本実施例における蛍光標識手法は、サンプルのＣＳ４糖１００ｎｇから１ｍｇにおいて非常に良い線形性を有することが確認された。
《ＨＰＬＣ分析条件》
システム：株式会社島津製作所 プロミネンス
検出器：蛍光検出器（励起波長330 nm、検出波長 420 nm）
カラム：ゲルろ過カラムSuperdex 30 Increase 10/300 GL (Cytiva)
移動相：５０ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液
流速：０．５ｍＬ／分
カラム温度：室温
サンプル注入量：１００μＬ

【0055】

続いて、血漿サンプルを同条件のＨＰＬＣに供してクロマトグラムを得た。その結果を図３に示す。図３に示すように、検体１、２のどちらにおいても、投与後のみＣＳ４糖に相当する溶出位置（保持時間２５．５分）に強いピークが観測された。ＣＳ４糖に相当する溶出位置のピーク面積を、図３において塗り潰しで示す部分に区切って測定した。続いて、投与後の当該ピーク面積から投与前の当該ピーク面積を減じて実質ピーク面積を算出した。この実質ピーク面積を図２の検量線に当てはめてＣＳ４糖の血漿中濃度を算出した。その結果、検体１の投与２時間後でＣＳ４糖の血漿中濃度は１４０ｎｇ／ｍＬであり、検体２の投与３時間後で１７４ｎｇ／ｍＬであった。すなわち、ＣＳ４糖を経口投与した後の血漿中には、投与前と比較して比較的大量のＣＳ４糖が存在していた。これらの結果から、経口投与したＣＳオリゴ糖は、腸管より吸収されて血中に移行し、血中に存在していることが明らかになった。

【0056】

＜実施例３＞血小板粘着能に対する効果：ＣＳ４糖添加時の評価
（１）全血の取得
ＣＳ４糖を生理食塩水に溶解し、各濃度のＣＳ４糖溶液を調製した。ＣＳオリゴ糖の常用者１名（成人男性）を被験者とした。サイズ２１Ｇの翼状針を用いて被験者腕静脈に穿刺し、真空採血管に数ｍＬの血液を採取したのちこれを捨て、４本の新しい５ｍＬクエン酸含有真空採血管に等圧となるまで採血した。採血後すみやかに採血管を転倒混和したのち、シリンジを用いてＣＳ４糖溶液または生理食塩水５０μＬを注入し、再度転倒混和した。ＣＳ４糖溶液は、添加したＣＳ４糖の終濃度が、５０、２５０および５００μｇ／ｍＬとなるよう全血に添加した。これを４℃で冷蔵保存し、血小板粘着能の測定に供した。

【0057】

（２）血小板粘着能の測定
コラーゲンビーズ法により血小板粘着能を測定した。すなわち、本実施例３（１）のクエン酸含有全血をシリンジに充填し、コラーゲンビーズカラム（プラスチックビーズ表面にコラーゲンを結合させたもの、型番Lot 0012-4D、アイエスケー）に、シリンジポンプ（シリンジポンプMODEL 777、アイエスケー）を用いて流速０．７５ｍＬ／分で１２０秒間（１．５ｍＬ）通液させた。自動血球計数器（型番XE-2100、シスメックス）を用いて、カラム通過前後の血液の血小板数を計測し、下記式１により血小板粘着能を算出した。その結果を図４に示す。なお、このように測定・算出した血小板粘着能の健常者における基準値は２７．０～５９．０％である。
式１：血小板粘着能（％）＝｛（カラム通過前の血小板数－通過後の血小板数）／カラム通過前の血小板数｝×１００

【0058】

図４に示すように、血小板粘着能はＣＳ４糖の濃度が高いほど小さくなった。すなわち、血中におけるＣＳ４糖の存在量が大きいほど、血小板のコラーゲンへの粘着反応が抑制された。また、ＣＳ４糖を添加しない場合（０μｇ／ｍＬ）において特に明らかなように、ＣＳオリゴ糖の常用者の血液では、健常者における基準値と比較して、もともとの血小板粘着能が顕著に小さかった。これらの結果から、ＣＳオリゴ糖は、血中において血小板のコラーゲンへの粘着を抑制できる、極めて高い効果を有することが明らかになった。

【0059】

＜実施例４＞血小板粘着能に対する効果：服用中止・服用開始時の評価
実施例３で、ＣＳオリゴ糖の常用者血液の血小板粘着能が、健常者における基準値と比較して顕著に低かったことから、ＣＳオリゴ糖の服用中止および服用開始による血小板粘着能の変化を検討した。

【0060】

すなわち、ＣＳオリゴ糖の常用者１名と非常用者１名と（いずれも成人男性）を被験者とし、試験開始時に両者から採血した。続いて、常用者についてはＣＳオリゴ糖の服用（経口摂取）を中止し、８日間経過後に再度採血した。また、非常用者についてはＣＳオリゴ糖の服用（ＣＳオリゴ糖２００ｍｇ（１錠当たりＣＳオリゴ糖５０ｍｇ含有の錠剤４錠）／日を水とともに毎日経口摂取）を開始し、６日間経過後に再度採血した。採血は、サイズ２１Ｇの翼状針を用いて被験者腕静脈に穿刺し、真空採血管に数ｍＬの血液を採取したのちこれを捨て、１本の新しい５ｍＬクエン酸含有真空採血管に等圧となるまで採血した。採血後すみやかに採血管を転倒混和したのち、４℃で冷蔵保存した。これらのクエン酸含有全血について、実施例３（２）に記載の方法により血小板粘着能を測定した。その結果を図５に示す。

【0061】

図５に示すように、常用者血液の血小板粘着能は、試験開始時に８．１％であったのが、ＣＳオリゴ等の服用中止８日目には２５．５％であった。すなわち、血小板粘着能は、ＣＳオリゴ糖の服用中止後に顕著に増大した。

【0062】

一方、非常用者血液の血小板粘着能は、試験開始時に２８．３％であったのが、ＣＳオリゴ等の服用開始６日目には２１．６％であった。すなわち、血小板粘着能は、ＣＳオリゴ糖の服用開始後に顕著に低下した。

【0063】

これらの結果から、血小板粘着能は、ＣＳオリゴ糖を経口摂取していると低くなり、経口摂取していないと高くなることが明らかになった。すなわち、ＣＳオリゴ糖は、経口摂取により血小板のコラーゲンへの粘着を抑制できる、極めて高い効果を有することが明らかになった。

【0064】

＜実施例５＞血小板凝集能に対する効果
ＣＳオリゴ糖の常用者１名と非常用者１名と（いずれも成人男性）を被験者とし、実施例３（１）に記載の方法によりクエン酸含有全血を取得して、添加したＣＳ４糖の終濃度が０、５０、２５０および５００μｇ／ｍＬとなるよう加えた後、４℃で冷蔵保存した。

【0065】

光透過法により血小板凝集能を測定した。すなわち、クエン酸含有全血を室温で１時間静置後、遠心分離（１９０×ｇ、１０分）して上清を多血小板血漿（ＰＲＰ）として回収した。また、その沈渣部を遠心分離（１４００×ｇ、１０分）して上清を乏血小板血漿（ＰＰＰ）として回収した。ＰＲＰを２００μＬずつ２本のキュベットに分注し、３７℃で１分間インキュベートした。血小板刺激物質としてアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を終濃度が１μＭおよび３μＭとなるよう各キュベットに添加した。ＰＰＰ、ＰＲＰ、ＡＤＰを上記濃度に添加したＰＲＰについて、血小板凝集能測定装置（MCM HEMA TRACER 313M、エム・シー・メディカル）に供して光透過率を測定した。ＰＲＰ、ＰＰＰそれぞれの光透過率を０％、１００％とし、ＡＤＰを添加したＰＲＰの光透過率を百分率に換算して、これを血小板凝集率（％）とした。続いて、下記式２により血小板凝集能を算出した。その結果を図６に示す。なお、このように測定・算出した血小板凝集能の健常者における基準値は１８．７～６８．７％である。
式２：血小板凝集能（％）＝３μＭのＡＤＰ添加ＰＲＰにおける最大血小板凝集率－１μＭのＡＤＰ添加ＰＲＰにおける最大血小板凝集率

【0066】

図６に示すように、ＣＳオリゴ糖の常用者および非常用者のいずれの血液においても、ＣＳ４糖の濃度が高いほど、血小板凝集能の値が小さくなった。すなわち、血中におけるＣＳ４糖の存在量が大きいほど、血小板の凝集反応が抑制された。この結果から、ＣＳオリゴ糖は、血中において血小板の凝集を抑制できることが明らかになった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】