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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022187903
(43)【公開日】2022-12-20
(54)【発明の名称】核酸増幅方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6844 20180101AFI20221213BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALN20221213BHJP
C12N 15/50 20060101ALN20221213BHJP
C12N 9/12 20060101ALN20221213BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6844 Z ZNA
C12Q1/6876 Z
C12N15/50
C12N9/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】3
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021096136
(22)【出願日】2021-06-08
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、研究成果展開事業「高感度ＦＥＴと等温増幅法によるウイルス・病原菌センサー開発」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】504132272
【氏名又は名称】国立大学法人京都大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】滝田 禎亮
(72)【発明者】
【氏名】保川 清
(72)【発明者】
【氏名】兒島 憲二
【テーマコード（参考）】
4B050
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B050CC07
4B050KK02
4B050KK03
4B050KK07
4B050LL03
4B063QA01
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR07
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR79
4B063QS24
(57)【要約】
【課題】リコンビナーゼと一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の効率の良い製造法を提供すること。特に、ＲＰＡ法による核酸増幅試薬が十分な性能を有する場合の成分の種類や濃度の範囲を提供すること。また、ＲＰＡ法を用いた汎用性が高い核酸増幅検出キットを提供すること。
【解決手段】特定の組成を有する溶液中で、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（ＲＰＡ法）により、ＤＮＡを増幅させる方法。
【選択図】なし
【解決手段】特定の組成を有する溶液中で、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（ＲＰＡ法）により、ＤＮＡを増幅させる方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の組成を有する溶液中で、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（ＲＰＡ法）により、ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡを増幅させる方法。
（１）ｕｖｓＸ濃度が２２６ｎｇ／μＬ以上１２００ｎｇ／μＬ以下
（２）ｕｖｓＹ濃度が２０ｎｇ／μＬ以上１２００ｎｇ／μＬ以下
（３）ｇｐ３２濃度が３００ｎｇ／μＬ以上６００ｎｇ／μＬ以下
（４）Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ濃度が０．２ｕｎｉｔｓ／μＬ以上０．８ｕｎｉｔｓ／μＬ以下
（５）クレアチンキナーゼ濃度が６０ｎｇ／μＬ以上２４０ｎｇ／μＬ以下
（６）ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の濃度が０．５ｍＭ以上８ｍＭ以下
（７）ＰＥＧ３５０００の濃度が５．５％以上６．５％以下
（８）ｄＮＴＰ濃度が５５０μＭ以上７５０μＭ以下
（９）トリス塩酸緩衝液の濃度が４０ｍＭ以上６０ｍＭ以下
（１０）ＡＴＰ濃度が０．３ｍＭ以上４ｍＭ以下
（１１）酢酸カリウムの濃度が３０ｍＭ以上５０ｍＭ以下
（１２）ホスフォクレアチンの濃度が１５ｍＭ以上２５ｍＭ以下
（１３）酢酸マグネシウム濃度が５ｍＭ以上１１ｍＭ以下
（１４）プライマー濃度が０．４μＭ以上１．６μＭ以下
（１）ｕｖｓＸ濃度が２２６ｎｇ／μＬ以上１２００ｎｇ／μＬ以下
（２）ｕｖｓＹ濃度が２０ｎｇ／μＬ以上１２００ｎｇ／μＬ以下
（３）ｇｐ３２濃度が３００ｎｇ／μＬ以上６００ｎｇ／μＬ以下
（４）Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ濃度が０．２ｕｎｉｔｓ／μＬ以上０．８ｕｎｉｔｓ／μＬ以下
（５）クレアチンキナーゼ濃度が６０ｎｇ／μＬ以上２４０ｎｇ／μＬ以下
（６）ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の濃度が０．５ｍＭ以上８ｍＭ以下
（７）ＰＥＧ３５０００の濃度が５．５％以上６．５％以下
（８）ｄＮＴＰ濃度が５５０μＭ以上７５０μＭ以下
（９）トリス塩酸緩衝液の濃度が４０ｍＭ以上６０ｍＭ以下
（１０）ＡＴＰ濃度が０．３ｍＭ以上４ｍＭ以下
（１１）酢酸カリウムの濃度が３０ｍＭ以上５０ｍＭ以下
（１２）ホスフォクレアチンの濃度が１５ｍＭ以上２５ｍＭ以下
（１３）酢酸マグネシウム濃度が５ｍＭ以上１１ｍＭ以下
（１４）プライマー濃度が０．４μＭ以上１．６μＭ以下
【請求項2】
以下の組成を有する溶液中で、逆転写－リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（ＲＴ－ＲＰＡ法）により、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを増幅させる方法。
（１）ｕｖｓＸ濃度が２２６ｎｇ／μＬ以上１２００ｎｇ／μＬ以下
（２）ｕｖｓＹ濃度が２０ｎｇ／μＬ以上１２００ｎｇ／μＬ以下
（３）ｇｐ３２濃度が３００ｎｇ／μＬ以上６００ｎｇ／μＬ以下
（４）Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ濃度が０．２ｕｎｉｔｓ／μＬ以上０．８ｕｎｉｔｓ／μＬ以下
（５）クレアチンキナーゼ濃度が６０ｎｇ／μＬ以上２４０ｎｇ／μＬ以下
（６）ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の濃度が０．５ｍＭ以上８ｍＭ以下
（７）ＰＥＧ３５０００の濃度が５．５％以上６．５％以下
（８）ｄＮＴＰ濃度が５５０μＭ以上７５０μＭ以下
（９）トリス塩酸緩衝液の濃度が４０ｍＭ以上６０ｍＭ以下
（１０）ＡＴＰ濃度が０．３ｍＭ以上４ｍＭ以下
（１１）酢酸カリウムの濃度が３０ｍＭ以上５０ｍＭ以下
（１２）ホスフォクレアチンの濃度が１５ｍＭ以上２５ｍＭ以下
（１３）酢酸マグネシウム濃度が５ｍＭ以上１１ｍＭ以下
（１４）プライマー濃度が０．４μＭ以上１．６μＭ以下
（１５）逆転写酵素の濃度が１ｎＭ以上１００ｎＭ以下
（１）ｕｖｓＸ濃度が２２６ｎｇ／μＬ以上１２００ｎｇ／μＬ以下
（２）ｕｖｓＹ濃度が２０ｎｇ／μＬ以上１２００ｎｇ／μＬ以下
（３）ｇｐ３２濃度が３００ｎｇ／μＬ以上６００ｎｇ／μＬ以下
（４）Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ濃度が０．２ｕｎｉｔｓ／μＬ以上０．８ｕｎｉｔｓ／μＬ以下
（５）クレアチンキナーゼ濃度が６０ｎｇ／μＬ以上２４０ｎｇ／μＬ以下
（６）ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の濃度が０．５ｍＭ以上８ｍＭ以下
（７）ＰＥＧ３５０００の濃度が５．５％以上６．５％以下
（８）ｄＮＴＰ濃度が５５０μＭ以上７５０μＭ以下
（９）トリス塩酸緩衝液の濃度が４０ｍＭ以上６０ｍＭ以下
（１０）ＡＴＰ濃度が０．３ｍＭ以上４ｍＭ以下
（１１）酢酸カリウムの濃度が３０ｍＭ以上５０ｍＭ以下
（１２）ホスフォクレアチンの濃度が１５ｍＭ以上２５ｍＭ以下
（１３）酢酸マグネシウム濃度が５ｍＭ以上１１ｍＭ以下
（１４）プライマー濃度が０．４μＭ以上１．６μＭ以下
（１５）逆転写酵素の濃度が１ｎＭ以上１００ｎＭ以下
【請求項3】
増幅される核酸がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸である、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、核酸増幅方法（特に、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）法による核酸増幅方法）に関する。
【背景技術】
【0002】
最も代表的な核酸増幅法はＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲは温度の上げ下げを行うための装置が必須であるという欠点をもつ。この欠点を克服するために、温度の上げ下げが不要な一定温度での核酸増幅法が開発されてきた。このような核酸増幅法として、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（例えば非特許文献１）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（例えば非特許文献２）、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（例えば非特許文献３）、ＨＡＤ（Ｈｅｌｉｃａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（例えば非特許文献４）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（例えば非特許文献５）、ＲＰＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（例えば非特許文献６）が挙げられる。このうちＲＰＡ法が近年最も注目されている。ＲＰＡ法は、リコンビナーゼ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ＤＮＡを熱変性させることなく、標的配列から成るＤＮＡを増幅させる方法である。ＲＰＡ法は他の一定温度増幅法と異なり、プライマーの設計が容易であることと、体温付近の一定温度で反応が進行するという長所をもつ。
【0003】
ＲＰＡ法はあらかじめ酵素、基質、塩を含む試薬キットがＴｗｉｓｔ（ツイスト）社から市販されている。本試薬は成分の種類や濃度を変えることができないので、本試薬を用いて作製された核酸増幅試薬は最適化ができない。実際、ＲＰＡ法に関連する論文はすべてがツイスト社の試薬キットを用いたものである。本試薬キットの利用者は、自身の研究で扱う標的核酸に対応するプライマーを合成し、これを試薬に添加する。このような利用形態は測定数が少ない（例えば１００程度の）研究においては通常支障はないが、測定数が多い（例えば１００００程度の）研究においては試薬キットのコストが負担になると思われる。また、核酸増幅試薬は、標的核酸の違いや増幅された核酸を検出する方法の違いにより、要求される感度、特異性、迅速性、生産コストが異なる。これらは核酸検査を商業利用する場合に顕著である。要求される性能を満たすためには、核酸増幅試薬の成分の最適化が必要となる。しかしながら、ＲＰＡ法は、基本原理は公知であるが、試薬成分の種類や濃度は限定的に開示されているだけであり、これらの情報だけでは最適化はできない。その結果、ＰＣＲ法を用いた、標的核酸があらかじめ設定された商用キットは多く開発されているが、ＲＰＡ法を用いた同様の商用キットは開発されていない。
【0004】
これまでに、リコンビナーゼであるＴ４ファージ由来のｕｖｓＸとｕｖｓＹ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質であるＴ４ファージ由来のｇｐ３２の製造法が報告されている（非特許文献７）。この論文に基づく製造法の特徴は以下のとおりである。
１）ＨｉｓタグをＮ末端あるいはＣ末端あるいは両末端に付加させたものを発現させる。
２）核酸除去のためにポリエチレンイミンを用いる。
３）ニッケルアフィニティーカラムクロマトグラフィーを行う。
４）ｕｖｓＸとｇｐ３２については上記３）のニッケルアフィニティーカラムクロマトグラフィーの活性画分にトロンビンを加えて作用させ、付加させたＨｉｓタグを切断する。
５）さらに、上記４）の切断物をそのまま陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、トロンビンと切断されたＨｉｓタグを除く。
６）さらに、上記陰イオン交換クロマトグラフィーの活性画分を、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．３）中で限外ろ過により濃縮し、精製標品とする。
７）ｕｖｓＹについては、上記３）のニッケルアフィニティーカラムクロマトグラフィーの活性画分にトロンビンを作用させると沈殿するので、上記３）のニッケルアフィニティーカラムクロマトグラフィーの活性画分を精製標品とする。
一方、上記論文では最適な試薬組成として下記が開示されている。
８）反応試薬の成分は、トリス塩酸緩衝液、酢酸カリウム、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ｄＮＴＰ、ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、ｇｐ３２、Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ、クレアチンキナーゼ、ホスフォクレアチン、フォワードプライマー、リバースプライマー、ＰＥＧ３５０００、ＡＴＰ、及び酢酸マグネシウムから構成される。ただし、ＤＴＴ、ｕｖｓＹ、クレアチンキナーゼは除いてもよい。
９）反応液のｐＨは７．０以上９．０以下であり、７．５以上８．０以下が最も好ましい水準である。
１０）酢酸カリウムの濃度は２０ｍＭ以上１４０ｍＭ以下であり、４０ｍＭ以上８０ｍＭ以下が最も好ましい水準である。
１１）反応温度は３７℃以上４５℃以下であり、３９℃以上４５℃以下が最も好ましい水準である。
１）ＨｉｓタグをＮ末端あるいはＣ末端あるいは両末端に付加させたものを発現させる。
２）核酸除去のためにポリエチレンイミンを用いる。
３）ニッケルアフィニティーカラムクロマトグラフィーを行う。
４）ｕｖｓＸとｇｐ３２については上記３）のニッケルアフィニティーカラムクロマトグラフィーの活性画分にトロンビンを加えて作用させ、付加させたＨｉｓタグを切断する。
５）さらに、上記４）の切断物をそのまま陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、トロンビンと切断されたＨｉｓタグを除く。
６）さらに、上記陰イオン交換クロマトグラフィーの活性画分を、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．３）中で限外ろ過により濃縮し、精製標品とする。
７）ｕｖｓＹについては、上記３）のニッケルアフィニティーカラムクロマトグラフィーの活性画分にトロンビンを作用させると沈殿するので、上記３）のニッケルアフィニティーカラムクロマトグラフィーの活性画分を精製標品とする。
一方、上記論文では最適な試薬組成として下記が開示されている。
８）反応試薬の成分は、トリス塩酸緩衝液、酢酸カリウム、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ｄＮＴＰ、ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、ｇｐ３２、Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ、クレアチンキナーゼ、ホスフォクレアチン、フォワードプライマー、リバースプライマー、ＰＥＧ３５０００、ＡＴＰ、及び酢酸マグネシウムから構成される。ただし、ＤＴＴ、ｕｖｓＹ、クレアチンキナーゼは除いてもよい。
９）反応液のｐＨは７．０以上９．０以下であり、７．５以上８．０以下が最も好ましい水準である。
１０）酢酸カリウムの濃度は２０ｍＭ以上１４０ｍＭ以下であり、４０ｍＭ以上８０ｍＭ以下が最も好ましい水準である。
１１）反応温度は３７℃以上４５℃以下であり、３９℃以上４５℃以下が最も好ましい水準である。
【0005】
ここで問題となるのは、ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、ｇｐ３２、Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ、クレアチンキナーゼ、ＤＴＴ、ＰＥＧ３５０００、ｄＮＴＰ、ＡＴＰ、ＣＨ３ＣＯＯＫ、及びホスフォクレアチンについての最適条件が開示されていないことである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｔ．Ｋｉｅｖｉｔｓら、ＮＡＳＢＡ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ＨＩＶ－１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、ジャーナル・オブ・バイロロジカル・メソッド（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）、１９９１年発行、第３５巻、ｐｐ．２７３－２８６
【非特許文献2】Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒら、Ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ－ａｎ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ， ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９９２年発行、第２０巻、ｐｐ．１６９１－１６９６
【非特許文献3】Ｐ．Ｍ．Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｒｏｌｌｉｎｇ－ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ネイチャー・ジェネティックス（Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ）、１９９８年発行、第１９巻、ｐｐ．２２５－２３２
【非特許文献4】Ｍ．Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｈｅｌｉｃａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、エンボ・レポート（ＥＭＢＯ Ｒｅｐｏｒｔｓ）、２００４年発行、第５巻、ｐｐ．７９５－８００
【非特許文献5】Ｔ．Ｎｏｔｏｍｉら、Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０００年発行、第２８巻、ｐｐ．Ｅ８３
【非特許文献6】Ｏ．Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇ ら、ＤＮＡ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、プロス・バイオロジー（ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２００６年発行、第４巻、ｐｐ．ｅ２０４
【非特許文献7】Ｋ．Ｋｏｊｉｍａら、Ｓｏｌｖｅｎｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ジャーナル・オブ・バイオサイエンス・アンド・バイオエンジニアリング（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、２０２１年発行、第１３１巻、ｐｐ．２１９－２２４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
以上のように、ＲＰＡ法の試薬成分であるリコンビナーゼと一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の効率の良い製造法が求められている。また、核酸増幅試薬が十分な性能を有する場合のリコンビナーゼ濃度、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質濃度、ｐＨ、塩濃度、温度の範囲の情報が求められている。しかしながら、先行論文にはこれらの情報が開示されていない。
【0008】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、リコンビナーゼと一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の効率の良い製造法を提供する。ＲＰＡ法による核酸増幅試薬が十分な性能を有する場合の成分の種類や濃度の範囲を提供することを目的とする。また、本発明は、ＲＰＡ法を用いた汎用性が高い核酸増幅検出キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、リコンビナーゼであるＴ４ファージ由来のｕｖｓＸとｕｖｓＹ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質であるＴ４ファージ由来のｇｐ３２の効率的な製造法を見出し、さらに、酵素濃度と塩濃度の最適反応条件を見出すことにより、改良されたＲＰＡ法の発明を完成させるに至った。
【0010】
すなわち、本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
以下の組成を有する溶液中で、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（ＲＰＡ法）により、ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡを増幅させる方法。
（１）ｕｖｓＸ濃度が２２６ｎｇ／μＬ以上１２００ｎｇ／μＬ以下
（２）ｕｖｓＹ濃度が２０ｎｇ／μＬ以上１２００ｎｇ／μＬ以下
（３）ｇｐ３２濃度が３００ｎｇ／μＬ以上６００ｎｇ／μＬ以下
（４）Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ濃度が０.２ｕｎｉｔｓ／μＬ以上０.８ｕｎｉｔｓ／μＬ以下
（５）クレアチンキナーゼ濃度が６０ｎｇ／μＬ以上２４０ｎｇ／μＬ以下
（６）ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の濃度が０．５ｍＭ以上８ｍＭ以下
（７）ＰＥＧ３５０００の濃度が５．５％以上６．５％以下
（８）ｄＮＴＰ濃度が５５０μＭ以上７５０μＭ以下
（９）トリス塩酸緩衝液の濃度が４０ｍＭ以上６０ｍＭ以下
（１０）ＡＴＰ濃度が０．３ｍＭ以上４ｍＭ以下
（１１）酢酸カリウムの濃度が３０ｍＭ以上５０ｍＭ以下
（１２）ホスフォクレアチンの濃度が１５ｍＭ以上２５ｍＭ以下
（１３）酢酸マグネシウム濃度が５ｍＭ以上１１ｍＭ以下
（１４）プライマー濃度が０．４μＭ以上１．６μＭ以下
項２．
以下の組成を有する溶液中で、逆転写－リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（ＲＴ－ＲＰＡ法）により、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを増幅させる方法。
（１）ｕｖｓＸ濃度が２２６ｎｇ／μＬ以上１２００ｎｇ／μＬ以下
（２）ｕｖｓＹ濃度が２０ｎｇ／μＬ以上１２００ｎｇ／μＬ以下
（３）ｇｐ３２濃度が３００ｎｇ／μＬ以上６００ｎｇ／μＬ以下
（４）Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ濃度が０.２ｕｎｉｔｓ／μＬ以上０.８ｕｎｉｔｓ／μＬ以下
（５）クレアチンキナーゼ濃度が６０ｎｇ／μＬ以上２４０ｎｇ／μＬ以下
（６）ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の濃度が０．５ｍＭ以上８ｍＭ以下
（７）ＰＥＧ３５０００の濃度が５．５％以上６．５％以下
（８）ｄＮＴＰ濃度が５５０μＭ以上７５０μＭ以下
（９）トリス塩酸緩衝液の濃度が４０ｍＭ以上６０ｍＭ以下
（１０）ＡＴＰ濃度が０．３ｍＭ以上４ｍＭ以下
（１１）酢酸カリウムの濃度が３０ｍＭ以上５０ｍＭ以下
（１２）ホスフォクレアチンの濃度が１５ｍＭ以上２５ｍＭ以下
（１３）酢酸マグネシウム濃度が５ｍＭ以上１１ｍＭ以下
（１４）プライマー濃度が０．４μＭ以上１．６μＭ以下
（１５）逆転写酵素の濃度が１ｎＭ以上１００ｎＭ以下
項３．
増幅される核酸がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸である、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
項１．
以下の組成を有する溶液中で、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（ＲＰＡ法）により、ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡを増幅させる方法。
（１）ｕｖｓＸ濃度が２２６ｎｇ／μＬ以上１２００ｎｇ／μＬ以下
（２）ｕｖｓＹ濃度が２０ｎｇ／μＬ以上１２００ｎｇ／μＬ以下
（３）ｇｐ３２濃度が３００ｎｇ／μＬ以上６００ｎｇ／μＬ以下
（４）Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ濃度が０.２ｕｎｉｔｓ／μＬ以上０.８ｕｎｉｔｓ／μＬ以下
（５）クレアチンキナーゼ濃度が６０ｎｇ／μＬ以上２４０ｎｇ／μＬ以下
（６）ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の濃度が０．５ｍＭ以上８ｍＭ以下
（７）ＰＥＧ３５０００の濃度が５．５％以上６．５％以下
（８）ｄＮＴＰ濃度が５５０μＭ以上７５０μＭ以下
（９）トリス塩酸緩衝液の濃度が４０ｍＭ以上６０ｍＭ以下
（１０）ＡＴＰ濃度が０．３ｍＭ以上４ｍＭ以下
（１１）酢酸カリウムの濃度が３０ｍＭ以上５０ｍＭ以下
（１２）ホスフォクレアチンの濃度が１５ｍＭ以上２５ｍＭ以下
（１３）酢酸マグネシウム濃度が５ｍＭ以上１１ｍＭ以下
（１４）プライマー濃度が０．４μＭ以上１．６μＭ以下
項２．
以下の組成を有する溶液中で、逆転写－リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法（ＲＴ－ＲＰＡ法）により、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを増幅させる方法。
（１）ｕｖｓＸ濃度が２２６ｎｇ／μＬ以上１２００ｎｇ／μＬ以下
（２）ｕｖｓＹ濃度が２０ｎｇ／μＬ以上１２００ｎｇ／μＬ以下
（３）ｇｐ３２濃度が３００ｎｇ／μＬ以上６００ｎｇ／μＬ以下
（４）Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ濃度が０.２ｕｎｉｔｓ／μＬ以上０.８ｕｎｉｔｓ／μＬ以下
（５）クレアチンキナーゼ濃度が６０ｎｇ／μＬ以上２４０ｎｇ／μＬ以下
（６）ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の濃度が０．５ｍＭ以上８ｍＭ以下
（７）ＰＥＧ３５０００の濃度が５．５％以上６．５％以下
（８）ｄＮＴＰ濃度が５５０μＭ以上７５０μＭ以下
（９）トリス塩酸緩衝液の濃度が４０ｍＭ以上６０ｍＭ以下
（１０）ＡＴＰ濃度が０．３ｍＭ以上４ｍＭ以下
（１１）酢酸カリウムの濃度が３０ｍＭ以上５０ｍＭ以下
（１２）ホスフォクレアチンの濃度が１５ｍＭ以上２５ｍＭ以下
（１３）酢酸マグネシウム濃度が５ｍＭ以上１１ｍＭ以下
（１４）プライマー濃度が０．４μＭ以上１．６μＭ以下
（１５）逆転写酵素の濃度が１ｎＭ以上１００ｎＭ以下
項３．
増幅される核酸がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸である、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【0011】
本発明に係るＲＰＡ法による核酸増幅方法によれば、標的核酸を非常に効率よく増幅することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】プラスミドｐＥＴ－ｕｖｓＸ－２、ｐＥＴ－ｕｖｓＹ－２、及びｐＥＴ－ｇｐ３２－２の構造を示す。
【図2】実施例（ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、又はｇｐ３２の発現と精製）に示す方法でｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、又はｇｐ３２を精製したときの各工程で得られた画分を１２．５％アクリルアミド電気泳動で解析した結果を示す。
【図3】実施例（ＲＰＡ反応条件の検討）で用いたテンプレート核酸配列及びプライマーの配列を示す。図中の「１Ｆ＋４」はＮ＿Ｓａｒｂｅｃｏ＿Ｆ＋４プライマー（配列番号２）を、「１Ｒ＋８」はＮ＿Ｓａｒｂｅｃｏ＿Ｒ＋８プライマー（配列番号３）を表す。
【図4】実施例（ＲＰＡ反応条件の検討）に示す方法でＤＮＡを鋳型として２７個の実験条件でＲＰＡを行ったときの反応物を２％アガロース電気泳動で解析した結果を示す。
【図5】実施例（最適条件でのＲＰＡ反応）で用いたテンプレート核酸配列及びプライマーの配列を示す。図中の「２Ｆ－１５」はＣＤＣ－Ｆ－１５プライマー（配列番号５）を、「２Ｒ－１１」はＣＤＣ－Ｒ－１１プライマー（配列番号６）を表す。
【図6】実施例（最適条件でのＲＰＡ反応）に示す方法でＤＮＡを鋳型としてＲＰＡを行ったときの反応物を２％アガロース電気泳動で解析した結果を示す。
【図7】実施例（最適条件でのＲＰＡ反応）に示す方法で最適化された条件と最適化前の条件でＲＰＡ反応を行ったときの反応物を２％アガロース電気泳動で解析した結果を示す。
【図8】実施例（最適条件でのＲＴ－ＲＰＡ反応）に示す方法でＲＮＡを鋳型としてＲＴ－ＲＰＡを行ったときの反応物を２％アガロース電気泳動で解析した結果を示す。
【図9】実施例（ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、ｇｐ３２、又はＡＴＰの濃度が反応効率に与える影響）に示す方法でｕｖｓＸ濃度を４０～４０００ｎｇ／μＬとし、ＤＮＡを鋳型としてＲＰＡを行ったときの反応物を２％アガロースゲル電気泳動で解析した結果を示す。
【図10】実施例（ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、ｇｐ３２、又はＡＴＰの濃度が反応効率に与える影響）に示す方法でｕｖｓＹ濃度を４～４００ｎｇ／μＬとし、ＤＮＡを鋳型としてＲＰＡを行ったときの反応物を２％アガロースゲル電気泳動で解析した結果を示す。
【図11】実施例（ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、ｇｐ３２、又はＡＴＰの濃度が反応効率に与える影響）に示す方法でｇｐ３２濃度を４０～４０００ｎｇ／μＬとし、ＤＮＡを鋳型としてＲＰＡを行ったときの反応物を２％アガロースゲル電気泳動で解析した結果を示す。
【図12】実施例（ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、ｇｐ３２、又はＡＴＰの濃度が反応効率に与える影響）に示す方法でＡＴＰ濃度を０．３５～３５ｍＭとし、ＤＮＡを鋳型としてＲＰＡを行ったときの反応物を２％アガロースゲル電気泳動で解析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下、本開示について、さらに詳細に説明する。
【0014】
本開示のＲＰＡ法では、リコンビナーゼであるＴ４ファージ由来のｕｖｓＸ及びｕｖｓＹ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質であるＴ４ファージ由来のｇｐ３２、好熱性細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから単離された耐熱性鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（以下、「Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ」という）、クレアチンキナーゼ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ＰＥＧ３５０００、ｄＮＴＰ、トリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、ＡＴＰ、酢酸カリウム（ＣＨ３ＣＯＯＫ）、ホスフォクレアチン、酢酸マグネシウム（ＭｇＯＡｃ）、及び、プライマーを用いる。
【0015】
本開示のＲＰＡ法に用いられるｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、及び、ｇｐ３２の効率的な製造法の特徴は以下のとおりである。
１）ＨｉｓタグをＮ末端あるいはＣ末端あるいは両末端に付加させたものを発現させる。
２）ポリエチレンイミン等のポリアミンを用いた核酸除去は行わない。
３）ニッケルアフィニティーカラムクロマトグラフィーを行う。ｕｖｓＹについてはトリス緩衝液（ｐＨ８．０）あるいはホウ酸緩衝液（ｐＨ９．３）中で限外ろ過により濃縮し、精製標品とする。
４）ｕｖｓＸとｇｐ３２に対しては、上記３）のニッケルアフィニティーカラムクロマトグラフィーの活性画分にトロンビンを加えて作用させ、付加させたＨｉｓタグを切断する。このとき、ｕｖｓＸについてはＮａＣｌ濃度を０．２～０．８Ｍとする。ｇｐ３２についてはその限りではない。
５）上記４）の切断物を透析してから、陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、トロンビンと切断されたＨｉｓタグを除く。
６）さらに、上記５）の陰イオン交換クロマトグラフィーの活性画分を、トリス緩衝液（ｐＨ８．０）中で限外ろ過により濃縮し、精製標品とする。
１）ＨｉｓタグをＮ末端あるいはＣ末端あるいは両末端に付加させたものを発現させる。
２）ポリエチレンイミン等のポリアミンを用いた核酸除去は行わない。
３）ニッケルアフィニティーカラムクロマトグラフィーを行う。ｕｖｓＹについてはトリス緩衝液（ｐＨ８．０）あるいはホウ酸緩衝液（ｐＨ９．３）中で限外ろ過により濃縮し、精製標品とする。
４）ｕｖｓＸとｇｐ３２に対しては、上記３）のニッケルアフィニティーカラムクロマトグラフィーの活性画分にトロンビンを加えて作用させ、付加させたＨｉｓタグを切断する。このとき、ｕｖｓＸについてはＮａＣｌ濃度を０．２～０．８Ｍとする。ｇｐ３２についてはその限りではない。
５）上記４）の切断物を透析してから、陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、トロンビンと切断されたＨｉｓタグを除く。
６）さらに、上記５）の陰イオン交換クロマトグラフィーの活性画分を、トリス緩衝液（ｐＨ８．０）中で限外ろ過により濃縮し、精製標品とする。
【0016】
本開示に係るＲＰＡ法では、上記成分の量については、特に制限されないが、本発明に係るＲＰＡ法の利用方法（例えばＲＴ－ＲＰＡ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＲＰＡ）法等）も考慮して、適宜設定することが出来る。
【0017】
例えば、ｕｖｓＸ濃度は、２２６～１２００ｎｇ／μＬ程度が好ましく、３００～
９００ｎｇ／μＬ程度がより好ましく、３６０～６００ｎｇ／μＬ程度がさらに好ましい。
９００ｎｇ／μＬ程度がより好ましく、３６０～６００ｎｇ／μＬ程度がさらに好ましい。
【0018】
ｕｖｓＹ濃度は、２０～１２００ｎｇ／μＬ程度が好ましく、３０～６００ｎｇ／μＬ程度がより好ましく、４０～１２０ｎｇ／μＬ程度がさらに好ましい。
【0019】
ｇｐ３２濃度は、３００～６００ｎｇ／μＬ程度が好ましく、３３０～５５０ｎｇ／μＬ程度がより好ましく、３６０～５００ｎｇ／μＬ程度がさらに好ましい。
【0020】
Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ濃度は、０.２～０.８ｕｎｉｔｓ／μＬ程度が好ましく、０．２５～０．７ｕｎｉｔｓ／μＬ程度がより好ましく、０．３～０．６ｕｎｉｔｓ／μＬ程度がさらに好ましい。
【0021】
クレアチンキナーゼ濃度は、６０～２４０ｎｇ／μＬ程度が好ましく、８０～２００ｎｇ／μＬ程度がより好ましく、１００～１６０ｎｇ／μＬ程度がさらに好ましい。
【0022】
ＤＴＴの濃度は、０．５～８ｍＭ程度が好ましく、１～６ｍＭ程度がより好ましく、１．５～４ｍＭ程度がさらに好ましい。
【0023】
ＰＥＧ３５０００の濃度は、５．５～６．５％程度が好ましく、５．７～６．３％程度がより好ましく、５．９～６．１％程度がさらに好ましい。
【0024】
ｄＮＴＰ濃度は、５５０～７５０μＭ程度が好ましく、５７５～７２５μＭ程度がより好ましく、６００～７００μＭ程度がさらに好ましい。
【0025】
トリス塩酸緩衝液の濃度は、４０～６０ｍＭ程度が好ましく、４２～５８ｍＭ程度がより好ましく、４４～５６ｍＭ程度がさらに好ましい。
【0026】
ＡＴＰ濃度は、０．３～４ｍＭ程度が好ましく、０．７～３．８ｍＭ程度がより好ましく、１～３．６ｍＭ程度がさらに好ましい。
【0027】
酢酸カリウムの濃度は、３０～５０ｍＭ程度が好ましく、３２～４８ｍＭ程度がより好ましく、３４～４６ｍＭ程度がさらに好ましい。
【0028】
ホスフォクレアチンの濃度は、１５～２５ｍＭ程度が好ましく、１７～２３ｍＭ程度がより好ましく、１９～２１ｍＭ程度がさらに好ましい。
【0029】
酢酸マグネシウム濃度は、５～１１ｍＭ程度が好ましく、６～１０ｍＭ程度がより好ましく、７～９ｍＭ程度がさらに好ましい。
【0030】
プライマー濃度は、０．４～１．６μＭ程度が好ましく、０．５～１．４μＭ程度がより好ましく、０．６～１．２μＭ程度がさらに好ましい。
【0031】
また、反応温度や反応時間についても、各酵素の反応効率等に基づいて検討し決定し得る。例えば、反応温度は、３９～４３℃が好ましく、４０～４２℃がより好ましい。また、反応時間は、例えば、１５～６０分が好ましく、２０～４０分がより好ましく、３０分程度がさらに好ましい。
【0032】
なお、最も良好な反応条件の一つは、以下の条件である。この条件は、各種要因について要因解析を繰り返して得られたものであり、反応溶液における各成分の濃度が最適化されている。
【0033】
ｕｖｓＸ ４００ｎｇ／μＬ
ｕｖｓＹ ４０ｎｇ／μＬ
ｇｐ３２ ４００ｎｇ／μＬ
Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ ０．４ｕｎｉｔｓ／μＬ
クレアチンキナーゼ １２０ｎｇ／μＬ
ＤＴＴ ２ｍＭ
ＰＥＧ３５０００ ６％
ｄＮＴＰ ６５０μＭ
トリス塩酸緩衝液 ５０ｍＭ
ＡＴＰ ３．５ｍＭ
ＣＨ３ＣＯＯＫ ４０ｍＭ
ホスフォクレアチン ２０ｍＭ
ＭｇＯＡｃ ８ｍＭ
プライマー １μＭ
反応液容量 ３０μＬ
ｕｖｓＹ ４０ｎｇ／μＬ
ｇｐ３２ ４００ｎｇ／μＬ
Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ ０．４ｕｎｉｔｓ／μＬ
クレアチンキナーゼ １２０ｎｇ／μＬ
ＤＴＴ ２ｍＭ
ＰＥＧ３５０００ ６％
ｄＮＴＰ ６５０μＭ
トリス塩酸緩衝液 ５０ｍＭ
ＡＴＰ ３．５ｍＭ
ＣＨ３ＣＯＯＫ ４０ｍＭ
ホスフォクレアチン ２０ｍＭ
ＭｇＯＡｃ ８ｍＭ
プライマー １μＭ
反応液容量 ３０μＬ
【0034】
また、本開示に係るＲＰＡ法を利用することで、様々な応用が可能である。特に、得られうる核酸に対して核酸増幅反応を行うことができる。例えば、ＲＴ－ＲＰＡを行い、ｃＤＮＡを大量に合成することができる。つまり、本開示に係るＲＰＡ法によりｃＤＮＡを合成し、当該ｃＤＮＡに対してＲＰＡを行うことができる。この場合、本開示に係るＲＰＡ法に用いる溶液には、上記成分（ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、ｇｐ３２、Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ、クレアチンキナーゼ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ＰＥＧ３５０００、ｄＮＴＰ、トリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、ＡＴＰ、酢酸カリウム（ＣＨ３ＣＯＯＫ）、ホスフォクレアチン、酢酸マグネシウム（ＭｇＯＡｃ）、及び、プライマー）に加えて、さらに逆転写酵素が含まれ得る。
【0035】
逆転写酵素濃度は、１～１００ｎＭ程度が好ましく、３～７０ｎＭ程度がより好ましく、５～４０ｎＭ程度がさらに好ましい。
【0036】
ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、ｇｐ３２、Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ、クレアチンキナーゼ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ＰＥＧ３５０００、ｄＮＴＰ、トリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、ＡＴＰ、酢酸カリウム（ＣＨ３ＣＯＯＫ）、ホスフォクレアチン、酢酸マグネシウム（ＭｇＯＡｃ）、及び、プライマーの各成分の量については、上記と同様の濃度で用いることが出来る。
【0037】
また、逆転写酵素が含まれる場合、反応温度や反応時間についても、各酵素の反応効率等に基づいて検討し決定し得る。例えば、反応温度は、３９～４３℃が好ましく、４０～４２℃がより好ましい。また、反応時間は、例えば、２０～６０分が好ましく、３０～５０分がより好ましく、４０分程度がさらに好ましい。
【0038】
またさらに、このようにして得られうる増幅した核酸を検出することで、鋳型ＲＮＡの存在を検出することができる。つまり、核酸が増幅している場合には、それを検出することが可能であり、検出されたということは鋳型ＲＮＡが存在していたことを意味する。逆に、核酸が増幅していない場合には、それを検出することは不可能であり、検出できないということは鋳型ＲＮＡが存在していない又はごく微量しか存在していないことを意味する。
【0039】
これを利用すれば、例えば、ウイルスや細菌に特有のＲＮＡや、疾患に特有のＲＮＡを検出することが可能であり、ひいてはウイルスや細菌の感染検査や、特定の疾患の検査（特に診断検査）に用いることが可能である。特に、本願発明に係るＲＰＡ法を利用することで、極めて高感度且つ正確に検査を行うことができる。標的ＲＮＡの種類や反応条件にもよるが、標的ＲＮＡ分子が例えば、１０～１０００分子（あるいは、１０～５００分子、１０～３００分子、１０～１００分子）程度しか存在していなくとも、検出可能であり得る。
【0040】
なお、増幅した核酸の検出方法は特に制限されず、公知の方法を適宜選択して用いることができる。例えば、アガロースゲル電気泳動をして核酸染色試験（例えば越路有無ブロマイド）で染色する、あるいは核酸クロマトグラフィーを用いるなどの方法が例示される。またあるいは、増幅された核酸に相補的であり、かつ蛍光物質又は放射性物質が結合したプローブを、増幅核酸とハイブリダイゼーションさせる、といった方法も例示される。
【0041】
これら以外の様々な反応にも本開示に係るＲＰＡ法は利用することが可能であり、利用形態は特に制限されない。
【0042】
また、本開示は、上記ＲＰＡ法に用いるキットも包含する。当該キットには、ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、ｇｐ３２、Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ、クレアチンキナーゼ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ＰＥＧ３５０００、ｄＮＴＰ、トリス塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、ＡＴＰ、酢酸カリウム（ＣＨ３ＣＯＯＫ）、ホスフォクレアチン、及び、酢酸マグネシウム（ＭｇＯＡｃ）など上述した成分のうち少なくとも一つの成分が含まれる。それ以外に、例えば、ＲＰＡ法に用いるプライマー、逆転写酵素などが備わっていてもよい。
【0043】
上記成分は、簡便にその濃度が設定できるようにキットに含まれる。上記成分がキットに含まれる形態は特に制限されず、例えば、複数の成分が同一溶液内に予め混合されて含まれていてもよいし、別々の溶液に含まれており、用いる際に全てを混ぜ合わせることであってもよい。また、上記成分以外の成分についても、上記成分と同様の溶液中に含まれていてもよいし、別の溶液に含まれていてもよい。また、固体や粉体の状態で含まれていてもよい。例えば、当該キットは、Ｒｅａｄｙ ｔｏ ｕｓｅのプレミックスタイプのキットであり、前処理の必要なく標的核酸を直接添加するだけでＲＰＡ法が実施できる形態であってもよいし、あるいは、Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素以外の成分（例えばＰＥＧ３５０００や酢酸カリウムなど）が予め混合された状態で含まれており、ＲＰＡ法の実施の直前に上記酵素及び標的核酸を混ぜ合わせる形態であってもよい。
【0044】
当該キットは、例えば、生体から得られた核酸を含む試料中のマーカーを検出するために好ましく用いることができる。つまり、検出キットとして好ましく用いることができる。本開示に係るＲＰＡ法は、上記成分を用いることにより、高い効率性及び高い正確性を維持した状態でｃＤＮＡを増幅できるため、当該検出キットは、種々の試料に対して用いることができ、汎用性が高い。核酸検出対象試料としては、例えば、食品（飲料を含む）、海水、水、排水、土壌、植物や動物の一部（組織等）、大気等が挙げられるが、特に制限されない。
【0045】
前記マーカーとしては、生体中に含まれるウイルス又は細菌に特有の塩基配列、疾患に特有の塩基配列を有するＲＮＡなどが挙げられる。なお、本明細書において、「ウイルス又は細菌に特有の塩基配列」とは、ウイルス又は細菌には存在するが、生体には存在しない塩基配列、あるいはウイルス又は細菌に感染した生体と感染していない生体での発現量に有意に差異のある塩基配列をいう。また、「疾患に特有の塩基配列」とは疾患に罹患した生体には存在するが、疾患に罹患していない正常な生体には存在しない塩基配列、あるいは疾患に罹患した生体と罹患していない正常な生体での発現量において有意に差異のある塩基配列をいう。
【0046】
前記ウイルスとしては、特に制限されないが、例えば、ＨＰＶ、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ＨＣＶ、ノロウイルス、ウエストナイルウイルスなどが挙げられる。また、前記細菌としては、例えば、食中毒の原因となるバチルス・セレウス、サルモネラ、腸管出血性大腸菌、ビブリオ、カンピロバクター、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌などが挙げられる。前記疾患としては、例えば、癌、糖尿病、心臓病、高血圧、感染症、遺伝性疾患、先天性疾患などが挙げられる。
【0047】
前記マーカーの検出用試薬としては、例えば、前記マーカーとなるＲＮＡに相補的であり、かつ蛍光物質又は放射性物質が結合したプローブ、二本鎖核酸に特異的にインターカレートする蛍光物質（例えば、エチジウムブロマイドなど）などが挙げられる。
【0048】
以上のように、当該検出キットを用いることで、二次構造の形成が抑制される温度条件下においても効率よく逆転写反応を行うことができるため、汎用性が高く、被験試料として用いられるＲＮＡの種類を問わず、ウイルスもしくは細菌に特有の塩基配列又は疾患に特有の塩基配列を高い精度で検出することができる。
【0049】
逆転写酵素としては、特に制限されず、公知の逆転写酵素を適宜選択して用いることができる。４０～４５℃程度で逆転写活性を有する逆転写酵素が好ましく、至適温度が４０～４５℃程度の逆転写酵素がより好ましい。逆転写酵素としては、市販品を購入して用いることもできる。特に好ましい逆転写酵素の一例として、例えば、ＡＭＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＡＭＶ－ＲＴ）を挙げることができる。ＡＭＶ－ＲＴはＤＮＡ及びＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。なお、ＡＭＶはＡｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓの略である。
【0050】
ＮＴＰはＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰのミックスであることが好ましい。また、ｄＮＴＰはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰのミックスであることが好ましい。
【0051】
なお、以上の酵素の市販品の購入先としては、例えばタカラバイオ株式会社、ＮＥＢ、プロメガ株式会社等が挙げられる。
【0052】
標的ＤＮＡは一本鎖でも二本鎖でもよい。
【0053】
標的ＤＮＡの増幅に用いるプライマーセットとしては、特に制限されず、任意のプライマーセットを用いることができる。
【0054】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。また、本開示は、本明細書に説明した構成要件を任意の組み合わせを全て包含する。
【0055】
また、上述した本開示の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本開示に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本開示には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。
【実施例0056】
以下、例を示して本開示の実施形態をより具体的に説明するが、本開示の実施形態は下記の例に限定されるものではない。なお、以下特に断らない限り、％は質量％を示す。
【0057】
ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、又はｇｐ３２の発現と精製
下記（ａ）～（ｃ）の手順により、ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、又はｇｐ３２を発現させた。
（ａ）図１に示すプラスミドをそれぞれ、ＢＬ２１（ＤＥ３）により形質転換菌を得た。コロニーを５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬブロス１０ｍＬが入った試験管６本に播種し、振盪しながら３７℃で１２時間インキュベーションした。
（ｂ）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬブロス３００ｍＬ２本に、前記培養液をそれぞれ３０ｍＬ加え、３７℃で６時間インキュベーションした。
（ｃ）３０℃に保温した５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＬのＬブロスに、前記培養液を６００ｍＬ加え、エアレーションを行った。さらに、１Ｍイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を２．６ｍＬ加え、３０℃で４時間インキュベーションすることにより、タンパク質を発現させた。
（ｄ）培養物から遠心により得られた菌体は、
ｕｖｓＸとｕｖｓＹについては、緩衝液Ａ〔組成：５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ フェニルメチレンスルホニルフオリド〕５０ｍＬに懸濁し、超音波で処理した。
ｇｐ３２については、緩衝液Ｂ〔組成：５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、２ｍＭ フェニルメチレンスルホニルフオリド〕５０ｍＬに懸濁し、超音波で処理した。
（ｅ）得られた破砕物を遠心にかけ、上清を回収した。上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥのパターンを図２のレーン１に示す。
（ｆ）硫酸アンモニウム濃度がｕｖｓＸ、ｕｖｓＹでは４０％飽和、ｇｐ３２では３０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加えた。
（ｇ）ｇｐ３２については上記（ｆ）で得られた溶液を遠心にかけ、上清を回収し、６０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加えた。
（ｈ）ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹについては上記（ｆ）で得られた溶液を、ｇｐ３２については上記（ｇ）で得られた溶液を遠心にかけ、沈殿を回収した。ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹについては、緩衝液Ｃ〔組成：５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、５００ｍＭ ＮａＣｌ〕に溶解させた。ｇｐ３２については、緩衝液Ｄ〔組成：５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）〕に溶解させた。これのＳＤＳ－ＰＡＧＥのパターンを図２のレーン２に示す。
（ｉ）上記（ｈ）で得られた溶液を、緩衝液Ｂで平衡化されたニッケルアフィニティークロマトグラフィーレジン〔Ｂｉｏ－Ｒａｄ製、商品名：Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ＩＭＡＣ ｒｅｓｉｎ〕に添加した。
（ｊ）ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹについては、１００ｍＭのイミダゾールを含む１００ｍＬの緩衝液Ｃでカラムを洗浄して未結合のタンパク質などを除去した。続いて、５００ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＬの緩衝液Ｃを用いて前記カラムに吸着したタンパク質を溶出した。各溶出液１μＬに２×ＳＤＳ緩衝液９μＬを加え、１２．５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。目的のタンパク質が溶出された画分を活性画分として回収した。活性画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥのパターンを図２のｕｖｓＸ及びｕｖｓＹのレーン３に示す。
（ｋ）ｇｐ３２については、１００ｍＬの緩衝液Ｄでカラムを洗浄して未結合のタンパク質などを除去した。続いて、５００ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＬの緩衝液Ｄを用いて前記カラムに吸着したタンパク質を溶出した。各溶出液１μＬに２×ＳＤＳ緩衝液９μＬを加え、１２．５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。目的のタンパク質が溶出された画分を活性画分として回収した。活性画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥのパターンを図２のｇｐ３２のレーン３に示す。
（ｌ）上記（ｊ）と（ｋ）で得られたｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、又はｇｐ３２を含む溶液（２０ｍＬ）に、２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ トロンビン（ナカライテスク）となるように混合物を調製した。
（ｍ）４℃で一晩保温した。
（ｎ）反応後、反応液１μＬに２×ＳＤＳ緩衝液９μＬを加え、１２．５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。結果を図２のレーン４に示す。ｕｖｓＸとｇｐ３２はいずれもトロンビン処理によりバンドの位置が下に移動した。このことから、ｕｖｓＸとｇｐ３２はいずれもトロンビンにより切断されたことを確認した。
（ｏ）上記（ｎ）で得られた反応液を４℃で１Ｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対して一晩透析した。
（ｐ）ｕｖｓＸ、ｇｐ３２については、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化された陰イオン交換レジン〔東ソー社製、商品名：ＤＥＡＥ６５０Ｍ〕に添加した。
（ｑ）１００ｍＬの５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）でカラムを洗浄して未結合のタンパク質などを除去した。
（ｒ）３０ｍＬのＮａＣｌ濃度が異なる３種類の溶出緩衝液〔組成：２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、１００、１５０、２００ｍＭ ＮａＣｌ〕を用いて前記カラムに吸着したタンパク質を溶出した。各溶出液１μＬに２×ＳＤＳ緩衝液９μＬを加え、１２．５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。目的のタンパク質が溶出された画分（ｕｖｓＸは１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｇｐ３２は１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を活性画分として回収した。活性画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥのパターンを図２のｕｖｓＸ及びｇｐ３２のレーン５に示す。
（ｓ）ｕｖｓＹについては、緩衝液Ｃで平衡化されたニッケルアフィニティークロマトグラフィーレジン〔Ｂｉｏ－Ｒａｄ製、商品名：Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ＩＭＡＣ ｒｅｓｉｎ〕に添加した（素通り溶液）。
（ｔ）３０ｍＬの緩衝液Ｃでカラムを洗浄した（洗浄溶液）。
（ｕ）（ｓ）の素通り溶液と（ｔ）の洗浄溶液を活性画分として回収した。活性画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥのパターンを図２のｕｖｓＹのレーン５に示す。
（ｖ）（ｕ）で得た溶液にＮａＣｌを加え２Ｍとした。
（ｗ）緩衝液Ｅ〔組成：５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、２Ｍ ＮａＣｌ〕で平衡化された疎水性レジン〔東ソー社製、商品名：ｐｈｅｎｙｌ６５０Ｍ〕に添加した。
（ｘ）１００ｍＬの緩衝液Ｅでカラムを洗浄して未結合のタンパク質などを除去した。
（ｙ）５０ｍＬの緩衝液Ｆ〔組成：５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、１Ｍ ＮａＣｌ〕でカラムを洗浄して未結合のタンパク質などを除去した。
（ｚ１）３０ｍＬの緩衝液Ｄを用いて前記カラムに吸着したタンパク質を溶出した。各溶出液１μＬに２×ＳＤＳ緩衝液９μＬを加え、１２．５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。目的のタンパク質が溶出された画分を活性画分として回収した。活性画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥのパターンを図２のｕｖｓＹのレーン６に示す。
（ｚ２）得られた活性画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ ＭＷＣＯ １０ｋを用いて溶媒を１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ８．０）に置換するとともに濃縮した。得られた画分を図２のｕｖｓＸ及びｇｐ３２のレーン６に示す。
（ｔ）濃縮液に８０％グリセロールをサンプルの３分の１量加え、３０～５０μＬに分注して－３０℃に保存した。
下記（ａ）～（ｃ）の手順により、ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、又はｇｐ３２を発現させた。
（ａ）図１に示すプラスミドをそれぞれ、ＢＬ２１（ＤＥ３）により形質転換菌を得た。コロニーを５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬブロス１０ｍＬが入った試験管６本に播種し、振盪しながら３７℃で１２時間インキュベーションした。
（ｂ）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬブロス３００ｍＬ２本に、前記培養液をそれぞれ３０ｍＬ加え、３７℃で６時間インキュベーションした。
（ｃ）３０℃に保温した５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＬのＬブロスに、前記培養液を６００ｍＬ加え、エアレーションを行った。さらに、１Ｍイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を２．６ｍＬ加え、３０℃で４時間インキュベーションすることにより、タンパク質を発現させた。
（ｄ）培養物から遠心により得られた菌体は、
ｕｖｓＸとｕｖｓＹについては、緩衝液Ａ〔組成：５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ フェニルメチレンスルホニルフオリド〕５０ｍＬに懸濁し、超音波で処理した。
ｇｐ３２については、緩衝液Ｂ〔組成：５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、２ｍＭ フェニルメチレンスルホニルフオリド〕５０ｍＬに懸濁し、超音波で処理した。
（ｅ）得られた破砕物を遠心にかけ、上清を回収した。上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥのパターンを図２のレーン１に示す。
（ｆ）硫酸アンモニウム濃度がｕｖｓＸ、ｕｖｓＹでは４０％飽和、ｇｐ３２では３０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加えた。
（ｇ）ｇｐ３２については上記（ｆ）で得られた溶液を遠心にかけ、上清を回収し、６０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加えた。
（ｈ）ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹについては上記（ｆ）で得られた溶液を、ｇｐ３２については上記（ｇ）で得られた溶液を遠心にかけ、沈殿を回収した。ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹについては、緩衝液Ｃ〔組成：５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、５００ｍＭ ＮａＣｌ〕に溶解させた。ｇｐ３２については、緩衝液Ｄ〔組成：５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）〕に溶解させた。これのＳＤＳ－ＰＡＧＥのパターンを図２のレーン２に示す。
（ｉ）上記（ｈ）で得られた溶液を、緩衝液Ｂで平衡化されたニッケルアフィニティークロマトグラフィーレジン〔Ｂｉｏ－Ｒａｄ製、商品名：Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ＩＭＡＣ ｒｅｓｉｎ〕に添加した。
（ｊ）ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹについては、１００ｍＭのイミダゾールを含む１００ｍＬの緩衝液Ｃでカラムを洗浄して未結合のタンパク質などを除去した。続いて、５００ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＬの緩衝液Ｃを用いて前記カラムに吸着したタンパク質を溶出した。各溶出液１μＬに２×ＳＤＳ緩衝液９μＬを加え、１２．５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。目的のタンパク質が溶出された画分を活性画分として回収した。活性画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥのパターンを図２のｕｖｓＸ及びｕｖｓＹのレーン３に示す。
（ｋ）ｇｐ３２については、１００ｍＬの緩衝液Ｄでカラムを洗浄して未結合のタンパク質などを除去した。続いて、５００ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＬの緩衝液Ｄを用いて前記カラムに吸着したタンパク質を溶出した。各溶出液１μＬに２×ＳＤＳ緩衝液９μＬを加え、１２．５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。目的のタンパク質が溶出された画分を活性画分として回収した。活性画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥのパターンを図２のｇｐ３２のレーン３に示す。
（ｌ）上記（ｊ）と（ｋ）で得られたｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、又はｇｐ３２を含む溶液（２０ｍＬ）に、２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ トロンビン（ナカライテスク）となるように混合物を調製した。
（ｍ）４℃で一晩保温した。
（ｎ）反応後、反応液１μＬに２×ＳＤＳ緩衝液９μＬを加え、１２．５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。結果を図２のレーン４に示す。ｕｖｓＸとｇｐ３２はいずれもトロンビン処理によりバンドの位置が下に移動した。このことから、ｕｖｓＸとｇｐ３２はいずれもトロンビンにより切断されたことを確認した。
（ｏ）上記（ｎ）で得られた反応液を４℃で１Ｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に対して一晩透析した。
（ｐ）ｕｖｓＸ、ｇｐ３２については、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化された陰イオン交換レジン〔東ソー社製、商品名：ＤＥＡＥ６５０Ｍ〕に添加した。
（ｑ）１００ｍＬの５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）でカラムを洗浄して未結合のタンパク質などを除去した。
（ｒ）３０ｍＬのＮａＣｌ濃度が異なる３種類の溶出緩衝液〔組成：２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、１００、１５０、２００ｍＭ ＮａＣｌ〕を用いて前記カラムに吸着したタンパク質を溶出した。各溶出液１μＬに２×ＳＤＳ緩衝液９μＬを加え、１２．５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。目的のタンパク質が溶出された画分（ｕｖｓＸは１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｇｐ３２は１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を活性画分として回収した。活性画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥのパターンを図２のｕｖｓＸ及びｇｐ３２のレーン５に示す。
（ｓ）ｕｖｓＹについては、緩衝液Ｃで平衡化されたニッケルアフィニティークロマトグラフィーレジン〔Ｂｉｏ－Ｒａｄ製、商品名：Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ＩＭＡＣ ｒｅｓｉｎ〕に添加した（素通り溶液）。
（ｔ）３０ｍＬの緩衝液Ｃでカラムを洗浄した（洗浄溶液）。
（ｕ）（ｓ）の素通り溶液と（ｔ）の洗浄溶液を活性画分として回収した。活性画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥのパターンを図２のｕｖｓＹのレーン５に示す。
（ｖ）（ｕ）で得た溶液にＮａＣｌを加え２Ｍとした。
（ｗ）緩衝液Ｅ〔組成：５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、２Ｍ ＮａＣｌ〕で平衡化された疎水性レジン〔東ソー社製、商品名：ｐｈｅｎｙｌ６５０Ｍ〕に添加した。
（ｘ）１００ｍＬの緩衝液Ｅでカラムを洗浄して未結合のタンパク質などを除去した。
（ｙ）５０ｍＬの緩衝液Ｆ〔組成：５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）、１Ｍ ＮａＣｌ〕でカラムを洗浄して未結合のタンパク質などを除去した。
（ｚ１）３０ｍＬの緩衝液Ｄを用いて前記カラムに吸着したタンパク質を溶出した。各溶出液１μＬに２×ＳＤＳ緩衝液９μＬを加え、１２．５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。目的のタンパク質が溶出された画分を活性画分として回収した。活性画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥのパターンを図２のｕｖｓＹのレーン６に示す。
（ｚ２）得られた活性画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ ＭＷＣＯ １０ｋを用いて溶媒を１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ８．０）に置換するとともに濃縮した。得られた画分を図２のｕｖｓＸ及びｇｐ３２のレーン６に示す。
（ｔ）濃縮液に８０％グリセロールをサンプルの３分の１量加え、３０～５０μＬに分注して－３０℃に保存した。
【0058】
ＲＰＡ反応条件の検討
ＲＰＡ反応系において、反応に影響を与える可能性がある各要因を以下の手法を用いて出来る限り最適化した。
１）反応に影響を与える可能性がある要因を１３個あげ、各要因に対し、３個の水準（それぞれ水準１、水準２、水準３）を設定した。一例を表１にあげる。表１では、要因１～１３が条件検討要因であり、各要因の濃度を３個の水準に分けて検討している。
２）各要因から１個の水準を選び、２７個の異なる反応条件を決定した。一例を表２にあげる。表２から明らかなように、各要因の１個の水準は９個の反応条件に使われている。
３）２７個の反応条件に対してそれぞれ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の遺伝子の一部（ＧＥＮＥ ＢＡＮＫのアクセッション番号ＭＮ９０８９４７の２８５７１～２８９７０）（配列番号１）の配列をもつＤＮＡ６億コピーを鋳型とし、Ｎ＿Ｓａｒｂｅｃｏ＿Ｆ＋４プライマー（配列番号２）とＮ＿Ｓａｒｂｅｃｏ＿Ｒ＋８プライマー（配列番号３）をプライマーとして（図３）、４１℃でＲＰＡ反応を１時間行った。反応物を２％アガロースゲル電気泳動にかけて増幅バンドを観察した。結果の一例を図４に示す。各反応条件に対して、明瞭な増幅バンドが確認されたものには３、薄い増幅バンドが確認されたものには２、バンドが確認されなかったものには１のスコアを与えた。さらに、各要因の各水準について、その水準が使われている反応条件のスコアを合計した。一例を表１にあげる。各要因に対して、最も絶対値が高いスコアである水準（下線で明示）が好ましいといえる。
４）さらに、全体を１００％にしたときの、スコアに対する各要因の寄与率を求めた。一例を表１にあげる。
５）寄与率の大きい要因は、次の要因解析においては、水準をせまい範囲でとり、さらに詳細な条件を検討した。
ＲＰＡ反応系において、反応に影響を与える可能性がある各要因を以下の手法を用いて出来る限り最適化した。
１）反応に影響を与える可能性がある要因を１３個あげ、各要因に対し、３個の水準（それぞれ水準１、水準２、水準３）を設定した。一例を表１にあげる。表１では、要因１～１３が条件検討要因であり、各要因の濃度を３個の水準に分けて検討している。
２）各要因から１個の水準を選び、２７個の異なる反応条件を決定した。一例を表２にあげる。表２から明らかなように、各要因の１個の水準は９個の反応条件に使われている。
３）２７個の反応条件に対してそれぞれ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の遺伝子の一部（ＧＥＮＥ ＢＡＮＫのアクセッション番号ＭＮ９０８９４７の２８５７１～２８９７０）（配列番号１）の配列をもつＤＮＡ６億コピーを鋳型とし、Ｎ＿Ｓａｒｂｅｃｏ＿Ｆ＋４プライマー（配列番号２）とＮ＿Ｓａｒｂｅｃｏ＿Ｒ＋８プライマー（配列番号３）をプライマーとして（図３）、４１℃でＲＰＡ反応を１時間行った。反応物を２％アガロースゲル電気泳動にかけて増幅バンドを観察した。結果の一例を図４に示す。各反応条件に対して、明瞭な増幅バンドが確認されたものには３、薄い増幅バンドが確認されたものには２、バンドが確認されなかったものには１のスコアを与えた。さらに、各要因の各水準について、その水準が使われている反応条件のスコアを合計した。一例を表１にあげる。各要因に対して、最も絶対値が高いスコアである水準（下線で明示）が好ましいといえる。
４）さらに、全体を１００％にしたときの、スコアに対する各要因の寄与率を求めた。一例を表１にあげる。
５）寄与率の大きい要因は、次の要因解析においては、水準をせまい範囲でとり、さらに詳細な条件を検討した。
【0059】
第１回解析の結果に基づいた、新たな要因と水準を表３にあげる。例えば酢酸マグネシウム（ＭｇＯＡｃ）については、寄与率が最も高く、且つ水準１（７ｍＭ）が最もスコアの絶対値が高いことから、次の検討（表４）においては、７ｍＭよりも更に濃度を低くした場合にどのようになるかを検討できるよう条件を設定している。次の検討の一例を表３にあげた。表３では配列番号１の配列をもつＤＮＡ６億コピーを鋳型とした。さらに、その次の検討の一例を表４にあげた。表４では配列番号１の配列をもつＤＮＡ６万コピーを鋳型とした。
【0060】
第一回解析
【表1】
【0061】
２７個の反応条件
【表2】
【0062】
第２回解析
【表3】
【0063】
第３回解析
【表4】
【0064】
上記の検討を３回行った結果、以下の濃度範囲における条件が好ましいことが判明した。
【0065】
ｕｖｓＸ ２２６ｎｇ／μＬ以上１２００ｎｇ／μＬ以下
ｕｖｓＹ ２０ｎｇ／μＬ以上１２００ｎｇ／μＬ以下
ｇｐ３２ ３００ｎｇ／μＬ以上６００ｎｇ／μＬ以下
Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ ０．２ｕｎｉｔｓ／μＬ以上０．８ｕｎｉｔｓ／μＬ以下
クレアチンキナーゼ ６０ｎｇ／μＬ以上２４０ｎｇ／μＬ以下
ＤＴＴ ０．５ｍＭ以上８ｍＭ以下
ＰＥＧ３５０００ ５．５％以上６．５％以下
ｄＮＴＰ ５５０μＭ以上７５０μＭ以下
トリス塩酸緩衝液 ４０ｍＭ以上６０ｍＭ以下
ＡＴＰ ０．３ｍＭ以上４ｍＭ以下
ＣＨ３ＣＯＯＫ ３０ｍＭ以上５０ｍＭ以下
ホスフォクレアチン １５ｍＭ以上２５ｍＭ以下
ＭｇＯＡｃ ５ｍＭ以上１１ｍＭ以下
プライマー ０．４μＭ以上１．６μＭ以下
ｕｖｓＹ ２０ｎｇ／μＬ以上１２００ｎｇ／μＬ以下
ｇｐ３２ ３００ｎｇ／μＬ以上６００ｎｇ／μＬ以下
Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ ０．２ｕｎｉｔｓ／μＬ以上０．８ｕｎｉｔｓ／μＬ以下
クレアチンキナーゼ ６０ｎｇ／μＬ以上２４０ｎｇ／μＬ以下
ＤＴＴ ０．５ｍＭ以上８ｍＭ以下
ＰＥＧ３５０００ ５．５％以上６．５％以下
ｄＮＴＰ ５５０μＭ以上７５０μＭ以下
トリス塩酸緩衝液 ４０ｍＭ以上６０ｍＭ以下
ＡＴＰ ０．３ｍＭ以上４ｍＭ以下
ＣＨ３ＣＯＯＫ ３０ｍＭ以上５０ｍＭ以下
ホスフォクレアチン １５ｍＭ以上２５ｍＭ以下
ＭｇＯＡｃ ５ｍＭ以上１１ｍＭ以下
プライマー ０．４μＭ以上１．６μＭ以下
【0066】
最適条件でのＲＰＡ反応
以下の反応条件でＲＰＡ反応を行った。なお、以下の条件は、上記のようにしてＲＰＡ法における最適条件を探索した結果、得られた最適条件である。
以下の反応条件でＲＰＡ反応を行った。なお、以下の条件は、上記のようにしてＲＰＡ法における最適条件を探索した結果、得られた最適条件である。
【0067】
ｕｖｓＸ ４００ｎｇ／μＬ
ｕｖｓＹ ４０ｎｇ／μＬ
ｇｐ３２ ４００ｎｇ／μＬ
Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ ０．４ｕｎｉｔｓ／μＬ
クレアチンキナーゼ １２０ｎｇ／μＬ
ＤＴＴ ２ｍＭ
ＰＥＧ３５０００ ６％
ｄＮＴＰ ６５０μＭ
トリス塩酸緩衝液 ５０ｍＭ
ＡＴＰ ３．５ｍＭ
ＣＨ３ＣＯＯＫ ４０ｍＭ
ホスフォクレアチン ２０ｍＭ
ＭｇＯＡｃ ８ｍＭ
プライマー １μＭ
反応液容量 ３０μＬ
ｕｖｓＹ ４０ｎｇ／μＬ
ｇｐ３２ ４００ｎｇ／μＬ
Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ ０．４ｕｎｉｔｓ／μＬ
クレアチンキナーゼ １２０ｎｇ／μＬ
ＤＴＴ ２ｍＭ
ＰＥＧ３５０００ ６％
ｄＮＴＰ ６５０μＭ
トリス塩酸緩衝液 ５０ｍＭ
ＡＴＰ ３．５ｍＭ
ＣＨ３ＣＯＯＫ ４０ｍＭ
ホスフォクレアチン ２０ｍＭ
ＭｇＯＡｃ ８ｍＭ
プライマー １μＭ
反応液容量 ３０μＬ
【0068】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の遺伝子の一部（ＧＥＮＥ ＢＡＮＫのアクセッション番号ＭＮ９０８９４７の２８１７１～２８４７０）（配列番号４）の配列をもつＤＮＡ６０～６億分子を鋳型とし、ＣＤＣ－Ｆ－１５プライマー（配列番号６）とＣＤＣ－Ｒ－１１プライマー（配列番号７）をプライマーとして（図５）、４１℃でＲＰＡ反応を１時間行った。反応物を２％アガロースゲル電気泳動にかけて増幅バンドを観察した。反応物を２％アガロース電気泳動にかけた結果を図６に示す。図６において、レーン１はＤＮＡを含まない上記条件、レーン２は６０分子のＤＮＡを含む上記条件、レーン３は６０００分子のＤＮＡを含む上記条件、レーン４は６０万分子のＤＮＡを含む上記条件、レーン５は６０００万分子のＤＮＡを含む上記条件で、ＲＰＡをそれぞれ行ったときの結果を示す。レーン２でバンドが見られたことから、標的ＤＮＡ６０分子を含む試料でＲＰＡにより増幅ＤＮＡが検出されたことが示された。
【0069】
さらに、最適化された条件と最適化前の条件でＲＰＡ反応を行い、感度を比較した。以下の条件は、最適化前の条件である。
【0070】
ｕｖｓＸ ４５２ｎｇ／μＬ
ｕｖｓＹ ７０ｎｇ／μＬ
ｇｐ３２ ２００ｎｇ／μＬ
Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ ０．４ｕｎｉｔｓ／μＬ
クレアチンキナーゼ １２０ｎｇ／μＬ
ＤＴＴ ２ｍＭ
ＰＥＧ３５０００ ６％
ｄＮＴＰ ４５０μＭ
トリス塩酸緩衝液 ５０ｍＭ
ＡＴＰ ２．５ｍＭ
ＣＨ３ＣＯＯＫ ４０ｍＭ
ホスフォクレアチン ３０ｍＭ
ＭｇＯＡｃ １４ｍＭ
プライマー ０．５μＭ
反応液容量 ３０μＬ
ｕｖｓＹ ７０ｎｇ／μＬ
ｇｐ３２ ２００ｎｇ／μＬ
Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ ０．４ｕｎｉｔｓ／μＬ
クレアチンキナーゼ １２０ｎｇ／μＬ
ＤＴＴ ２ｍＭ
ＰＥＧ３５０００ ６％
ｄＮＴＰ ４５０μＭ
トリス塩酸緩衝液 ５０ｍＭ
ＡＴＰ ２．５ｍＭ
ＣＨ３ＣＯＯＫ ４０ｍＭ
ホスフォクレアチン ３０ｍＭ
ＭｇＯＡｃ １４ｍＭ
プライマー ０．５μＭ
反応液容量 ３０μＬ
【0071】
反応物を２％アガロース電気泳動にかけた結果を図７に示す。図７において、レーン１はＤＮＡを含まない上記条件、レーン２は６０分子のＤＮＡを含む上記条件、レーン３は６００分子のＤＮＡを含む上記条件、レーン４は６万分子のＤＮＡを含む上記条件、レーン５は６００万分子のＤＮＡを含む上記条件、レーン６は６億分子のＤＮＡを含む上記条件で、ＲＰＡをそれぞれ行ったときの結果を示す。最適化前の条件では６００分子のレーン３でバンドが見られなかったが、最適化された条件ではレーン２でバンドが見られたことから、最適化により感度が向上したことが示された。
【0072】
最適条件でのＲＴ－ＲＰＡ反応
下記の条件で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の遺伝子の一部（ＧＥＮＥ ＢＡＮＫのアクセッション番号ＭＮ９０８９４７の２８１７１～２８４７０）（配列番号５）の配列をもつＲＮＡ６０～６００万分子を鋳型とし、ＣＤＣ－Ｆ－１５プライマー（配列番号６）とＣＤＣ－Ｒ－１１プライマー（配列番号７）をプライマーとして（図５）、４１℃でＲＴ－ＲＰＡ反応を１時間行った。反応物を２％アガロースゲル電気泳動にかけて増幅バンドを観察した。ＲＴ－ＲＰＡ反応を行った。ここで、ＭＭ４とはＷＯ２０１２／０２０７５９パンフレットの「実施例」欄の記載（特に実施例４の記載）のモロニ―マウス白血病ウイルス逆転写酵素の耐熱型四重変異体（Ｅ２８６Ｒ／Ｅ３０２Ｋ／Ｅ４３４Ｒ／Ｄ５２４Ａ）である。
下記の条件で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の遺伝子の一部（ＧＥＮＥ ＢＡＮＫのアクセッション番号ＭＮ９０８９４７の２８１７１～２８４７０）（配列番号５）の配列をもつＲＮＡ６０～６００万分子を鋳型とし、ＣＤＣ－Ｆ－１５プライマー（配列番号６）とＣＤＣ－Ｒ－１１プライマー（配列番号７）をプライマーとして（図５）、４１℃でＲＴ－ＲＰＡ反応を１時間行った。反応物を２％アガロースゲル電気泳動にかけて増幅バンドを観察した。ＲＴ－ＲＰＡ反応を行った。ここで、ＭＭ４とはＷＯ２０１２／０２０７５９パンフレットの「実施例」欄の記載（特に実施例４の記載）のモロニ―マウス白血病ウイルス逆転写酵素の耐熱型四重変異体（Ｅ２８６Ｒ／Ｅ３０２Ｋ／Ｅ４３４Ｒ／Ｄ５２４Ａ）である。
【0073】
ＭＭ４ １０ｎＭ
ｕｖｓＸ ４００ｎｇ／μＬ
ｕｖｓＹ ４０ｎｇ／μＬ
ｇｐ３２ ４００ｎｇ／μＬ
Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ ０．４ｕｎｉｔｓ／μＬ
クレアチンキナーゼ １２０ｎｇ／μＬ
ＤＴＴ ２ｍＭ
ＰＥＧ３５０００ ６％
ｄＮＴＰ ６５０μＭ
トリス塩酸緩衝液 ５０ｍＭ
ＡＴＰ ３．５ｍＭ
ＣＨ３ＣＯＯＫ ４０ｍＭ
ホスフォクレアチン ２０ｍＭ
ＭｇＯＡｃ ８ｍＭ
プライマー １μＭ
反応液容量 ３０μＬ
ｕｖｓＸ ４００ｎｇ／μＬ
ｕｖｓＹ ４０ｎｇ／μＬ
ｇｐ３２ ４００ｎｇ／μＬ
Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ ０．４ｕｎｉｔｓ／μＬ
クレアチンキナーゼ １２０ｎｇ／μＬ
ＤＴＴ ２ｍＭ
ＰＥＧ３５０００ ６％
ｄＮＴＰ ６５０μＭ
トリス塩酸緩衝液 ５０ｍＭ
ＡＴＰ ３．５ｍＭ
ＣＨ３ＣＯＯＫ ４０ｍＭ
ホスフォクレアチン ２０ｍＭ
ＭｇＯＡｃ ８ｍＭ
プライマー １μＭ
反応液容量 ３０μＬ
【0074】
反応物を２％アガロースゲル電気泳動にかけて増幅バンドを観察し、ＲＴ－ＲＰＡ反応を４１℃で行った。反応物を２％アガロース電気泳動にかけた結果を図８に示す。図８において、レーン１はＲＮＡを含まない上記条件、レーン２は６０分子のＲＮＡを含む上記条件、レーン３は６０００分子のＲＮＡを含む上記条件、レーン４は６０万分子のＲＮＡを含む上記条件、レーン５は６０００万分子のＲＮＡを含む上記条件で、ＲＴ－ＲＰＡをそれぞれ行ったときの結果を示す。レーン２でバンドが見られたことから、標的ＲＮＡ６０分子を含む試料でＲＴ－ＲＰＡにより増幅ＤＮＡが検出されたことが示された。
【0075】
ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、ｇｐ３２、又はＡＴＰの濃度が反応効率に与える影響
ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、ｇｐ３２、ＡＴＰの濃度が反応効率に与える影響を調べるために、下記の条件を基本条件として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の遺伝子の一部（ＧＥＮＥ ＢＡＮＫのアクセッション番号ＭＮ９０８９４７の２８１７１～２８４７０）（配列番号４）の配列をもつＤＮＡ６０００分子を鋳型とし、ＣＤＣ－Ｆ－１５プライマー（配列番号６）とＣＤＣ－Ｒ－１１プライマー（配列番号７）をプライマーとして（図５）、４１℃でＲＰＡ反応を３０分間行った。
ｕｖｓＸ、ｕｖｓＹ、ｇｐ３２、ＡＴＰの濃度が反応効率に与える影響を調べるために、下記の条件を基本条件として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の遺伝子の一部（ＧＥＮＥ ＢＡＮＫのアクセッション番号ＭＮ９０８９４７の２８１７１～２８４７０）（配列番号４）の配列をもつＤＮＡ６０００分子を鋳型とし、ＣＤＣ－Ｆ－１５プライマー（配列番号６）とＣＤＣ－Ｒ－１１プライマー（配列番号７）をプライマーとして（図５）、４１℃でＲＰＡ反応を３０分間行った。
【0076】
ｕｖｓＸ ４００ｎｇ／μＬ
ｕｖｓＹ ４０ｎｇ／μＬ
ｇｐ３２ ４００ｎｇ／μＬ
Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ ０．４ｕｎｉｔｓ／μＬ
クレアチンキナーゼ １２０ｎｇ／μＬ
ＤＴＴ ２ｍＭ
ＰＥＧ３５０００ ６％
ｄＮＴＰ ６５０μＭ
トリス塩酸緩衝液 ５０ｍＭ
ＡＴＰ ３．５ｍＭ
ＣＨ３ＣＯＯＫ ４０ｍＭ
ホスフォクレアチン ２０ｍＭ
ＭｇＯＡｃ ８ｍＭ
プライマー １μＭ
反応液容量 ３０μＬ
ｕｖｓＹ ４０ｎｇ／μＬ
ｇｐ３２ ４００ｎｇ／μＬ
Ｂｓｔ鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ ０．４ｕｎｉｔｓ／μＬ
クレアチンキナーゼ １２０ｎｇ／μＬ
ＤＴＴ ２ｍＭ
ＰＥＧ３５０００ ６％
ｄＮＴＰ ６５０μＭ
トリス塩酸緩衝液 ５０ｍＭ
ＡＴＰ ３．５ｍＭ
ＣＨ３ＣＯＯＫ ４０ｍＭ
ホスフォクレアチン ２０ｍＭ
ＭｇＯＡｃ ８ｍＭ
プライマー １μＭ
反応液容量 ３０μＬ
【0077】
反応物を２％アガロース電気泳動にかけた結果を図９～１２に示す。ここで、図９は基本条件に対してｕｖｓＸ濃度を４０～４０００ｎｇ／μＬとしたときの結果を、図１０は基本条件に対してｕｖｓＹ濃度を４～４００ｎｇ／μＬとしたときの結果を、図１１は基本条件に対してｇｐ３２濃度を４０～４０００ｎｇ／μＬとしたときの結果を、図１２は基本条件に対してＡＴＰ濃度を０．３５～３５ｍＭとしたときの結果をそれぞれ示す。図９ではｕｖｓＸ濃度が４００～４０００ｎｇ／μＬで明瞭な増幅バンドが、１２０ｎｇ／μＬで薄い増幅バンドが観察された。図１０ではｕｖｓＹ濃度が４０～４００ｎｇ／μＬで明瞭な増幅バンドが、１２ｎｇ／μＬで薄い増幅バンドが観察された。図１１ではｇｐ３２濃度が４００ｎｇ／μＬで明瞭な増幅バンドが、１２０ｎｇ／μＬで薄い増幅バンドが観察された。図１２ではＡＴＰ濃度が０．３５～３．５ｍＭで明瞭な増幅バンドが観察された。
【産業上の利用可能性】
【0078】
従来のＰＣＲ法による核酸検査ではサーマルサイクラーが必要なため、現場での病原体等の検出は困難であり、医療、食品製造・保蔵、畜産、環境等の広い分野での利用が制限されていた。特に、新興国での普及は困難であった。本発明により、この問題が解決し、ＲＰＡ法による核酸検査が上記の広い分野で利用され、核酸検査の普及につながることが期待される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】