特開2022-188174ヒト対象において非加齢性聴力障害を治療するための組成物および方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022188174
(43)【公開日】2022-12-20
(54)【発明の名称】ヒト対象において非加齢性聴力障害を治療するための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
A61K 48/00 20060101AFI20221213BHJP
A61P 27/16 20060101ALI20221213BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20221213BHJP
A61K 38/17 20060101ALN20221213BHJP
A61K 31/711 20060101ALN20221213BHJP
A61K 35/761 20150101ALN20221213BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20221213BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20221213BHJP
C12N 15/86 20060101ALN20221213BHJP
C12N 15/861 20060101ALN20221213BHJP
C12N 15/864 20060101ALN20221213BHJP
C12N 15/867 20060101ALN20221213BHJP
【ＦＩ】
A61K48/00
A61P27/16 ZNA
A61K35/76
A61K38/17
A61K31/711
A61K35/761
C12N15/63 Z
C12N15/12
C12N15/86 Z
C12N15/861
C12N15/864 100Z
C12N15/867 Z
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022159473
(22)【出願日】2022-10-03
(62)【分割の表示】P 2019531871の分割
【原出願日】2017-08-23
(31)【優先権主張番号】62/494,866
(32)【優先日】2016-08-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519062144
【氏名又は名称】アコーオス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】エマニュエル ジョン シモンズ
(72)【発明者】
【氏名】エレン ライシンガー
(72)【発明者】
【氏名】ハナン モイド
(72)【発明者】
【氏名】セバスチャン クーグラー
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ヒト対象において非加齢性聴力障害を治療するための組成物および方法の提供。
【解決手段】本明細書において、少なくとも2つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、該少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含む、組成物；および、対象において難聴を治療するためのこれらの組成物の使用が提供される。本発明は、概して、ヒト対象において難聴（ｈｅａｒｉｎｇｌｏｓｓ）を治療するための核酸の使用に関する。
【選択図】図４
【解決手段】本明細書において、少なくとも2つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、該少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含む、組成物；および、対象において難聴を治療するためのこれらの組成物の使用が提供される。本発明は、概して、ヒト対象において難聴（ｈｅａｒｉｎｇｌｏｓｓ）を治療するための核酸の使用に関する。
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、2016年8月23日に出願された米国特許仮出願第62/494,866号の優先権を主張
し、その全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、2016年8月23日に出願された米国特許仮出願第62/494,866号の優先権を主張
し、その全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【0002】
技術分野
本発明は、概して、ヒト対象において難聴（hearing loss）を治療するための核酸の使
用に関する。
本発明は、概して、ヒト対象において難聴（hearing loss）を治療するための核酸の使
用に関する。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
耳は複雑な器官であり、古典的には、外耳、中耳、内耳、聴神経、および聴覚系（耳か
ら脳へ移動しながら音を加工処理する）を含むと説明される。耳は、音を検出することに
加えて、平衡を維持する手助けもする。したがって、内耳の障害は、難聴、耳鳴り、めま
い、および平衡異常を引き起こし得る。めまいは、運動の幻覚であり、前庭系疾患の主症
状である。めまいは、内耳または中枢神経系における問題によって引き起こされ得る。め
まいの一般的な内耳の原因には、以下が含まれる：前庭神経炎（突発性片側性前庭損失）
、メニエール病（偶発性めまい）、良性発作性頭位めまい症（BPPV）、および両側性前庭
損失。めまいの一般的な中枢神経系の原因には、以下が含まれる：脳振盪後症候群、頸性
めまい、前庭偏頭痛、脳血管疾患、および聴神経腫。
耳は複雑な器官であり、古典的には、外耳、中耳、内耳、聴神経、および聴覚系（耳か
ら脳へ移動しながら音を加工処理する）を含むと説明される。耳は、音を検出することに
加えて、平衡を維持する手助けもする。したがって、内耳の障害は、難聴、耳鳴り、めま
い、および平衡異常を引き起こし得る。めまいは、運動の幻覚であり、前庭系疾患の主症
状である。めまいは、内耳または中枢神経系における問題によって引き起こされ得る。め
まいの一般的な内耳の原因には、以下が含まれる：前庭神経炎（突発性片側性前庭損失）
、メニエール病（偶発性めまい）、良性発作性頭位めまい症（BPPV）、および両側性前庭
損失。めまいの一般的な中枢神経系の原因には、以下が含まれる：脳振盪後症候群、頸性
めまい、前庭偏頭痛、脳血管疾患、および聴神経腫。
【0004】
難聴は、最も一般的なヒト感覚欠損の1つであり、多くの理由のために起こり得る。生
まれつき難聴を有する人もあり得るし、時間がたつにつれてゆっくりと聴力を失う人もあ
り得る。老人性難聴は、加齢性の難聴である。およそ3600万人のアメリカの成人が、ある
程度の難聴を報告しており、60歳よりも高齢の3人に1人および85歳よりも高齢の人の半分
が、難聴を経験している。
まれつき難聴を有する人もあり得るし、時間がたつにつれてゆっくりと聴力を失う人もあ
り得る。老人性難聴は、加齢性の難聴である。およそ3600万人のアメリカの成人が、ある
程度の難聴を報告しており、60歳よりも高齢の3人に1人および85歳よりも高齢の人の半分
が、難聴を経験している。
【0005】
難聴は、環境要因、または遺伝要因および環境要因の組み合わせの結果であり得る。耳
鳴り、すなわちその聴覚系における錯覚の騒音（鳴り響く音（ringing）、ブーンという
音（buzzing）、チュンチュンさえずる音（chirping）、ブンブンいう音（humming）、ま
たはビート音（beating））を有するすべての人々の約半分はまた、聴覚過敏として公知
である、ある特定の音の周波数および音量範囲に対する過敏症/耐性低下も有する。ウィ
リアムズ症候群（ウィリアムズ・ビューレン症候群としても公知である）は、LIMキナー
ゼ1（LIMK1）をコードする遺伝子を含む、約26遺伝子を包含する7q11.23の1.6Mb領域の
半接合性欠失によって引き起こされる多系統障害である。ウィリアムズ症候群を有する個
体は、聴覚過敏および進行性難聴を現し、聴覚過敏の早期の発症により、それが欠失した
遺伝子のうちの1つと関連し得るであろうことが示唆される。
鳴り、すなわちその聴覚系における錯覚の騒音（鳴り響く音（ringing）、ブーンという
音（buzzing）、チュンチュンさえずる音（chirping）、ブンブンいう音（humming）、ま
たはビート音（beating））を有するすべての人々の約半分はまた、聴覚過敏として公知
である、ある特定の音の周波数および音量範囲に対する過敏症/耐性低下も有する。ウィ
リアムズ症候群（ウィリアムズ・ビューレン症候群としても公知である）は、LIMキナー
ゼ1（LIMK1）をコードする遺伝子を含む、約26遺伝子を包含する7q11.23の1.6Mb領域の
半接合性欠失によって引き起こされる多系統障害である。ウィリアムズ症候群を有する個
体は、聴覚過敏および進行性難聴を現し、聴覚過敏の早期の発症により、それが欠失した
遺伝子のうちの1つと関連し得るであろうことが示唆される。
【0006】
難聴の環境的な原因には、ある特定の薬物療法、誕生前または誕生後の特定の感染症、
および長期間にわたる大きな騒音への曝露が含まれる。難聴は、騒音、聴器毒性作用物質
、老人性難聴、疾患、感染症、または耳の特定の部分に影響を及ぼすがんに起因し得る。
虚血性損傷は、それによって開始される病態生理学的機構を介して難聴を引き起こし得る
。別の例として、自己免疫内耳疾患（AIED）は、身体の免疫系が、ウイルスまたは細菌と
間違えられている内耳中の細胞を攻撃する場合に起こる、急速に進行する両側性感音難聴
を特徴とする。
および長期間にわたる大きな騒音への曝露が含まれる。難聴は、騒音、聴器毒性作用物質
、老人性難聴、疾患、感染症、または耳の特定の部分に影響を及ぼすがんに起因し得る。
虚血性損傷は、それによって開始される病態生理学的機構を介して難聴を引き起こし得る
。別の例として、自己免疫内耳疾患（AIED）は、身体の免疫系が、ウイルスまたは細菌と
間違えられている内耳中の細胞を攻撃する場合に起こる、急速に進行する両側性感音難聴
を特徴とする。
【0007】
1,000人の小児におけるおよそ1.5人は、生まれつき重度の難聴を有し、1,000人の小児
当たりの別の2～3人は、生まれつき部分的難聴を有する（Smithet al., 2005, Lancet 3
65:879-890（非特許文献1））。これらの症例の半分よりも多くは、遺伝的基盤に帰する
（DiDomenico, et al., 2011, J. Cell. Physiol. 226:2494-2499（非特許文献2））。
当たりの別の2～3人は、生まれつき部分的難聴を有する（Smithet al., 2005, Lancet 3
65:879-890（非特許文献1））。これらの症例の半分よりも多くは、遺伝的基盤に帰する
（DiDomenico, et al., 2011, J. Cell. Physiol. 226:2494-2499（非特許文献2））。
【0008】
非症候性難聴（Nonsyndromicdeafness）は、他の徴候および症状と関連していない難
聴である。対照的に、症候性難聴は、身体の他の部分における異常と共に起こる難聴を含
む。遺伝性難聴の大部分の症例（70～80％）は非症候性であり；残りの症例は、特定の遺
伝的症候群によって引き起こされる。
聴である。対照的に、症候性難聴は、身体の他の部分における異常と共に起こる難聴を含
む。遺伝性難聴の大部分の症例（70～80％）は非症候性であり；残りの症例は、特定の遺
伝的症候群によって引き起こされる。
【0009】
難聴は、伝音性（外耳道もしくは中耳から生じる）、感音性（内耳もしくは聴神経から
生じる）、または混合型であり得る。非症候性難聴の大部分の形態は、内耳における構造
に対する損傷によって引き起こされる永久的難聴と関連している（感音難聴）。ヒト感音
難聴の大多数は、蝸牛中のコルチ器の有毛細胞における異常によって引き起こされる。ま
た、第8脳神経（前庭蝸牛神経）または脳の聴覚部分を含む、非常に珍しい感音聴覚障害
もある。これらの種類の難聴のうちの最もまれなものにおいては、脳の聴覚中枢のみが影
響を受ける。この状況である皮質聾において、音は正常な閾値で聞こえ得るが、知覚され
る音の品質が非常に不十分であるため、言語を理解することができない。しかし、大部分
の感音難聴は、不十分な有毛細胞機能によるものである。有毛細胞は、誕生時に異常であ
る可能性があり、または個体の生涯の最中に損傷を受ける可能性がある。騒音外傷および
感染症のような損傷の外因、ならびに、蝸牛の解剖学または生理学において重要な役割を
果たす遺伝子に対する先天性変異のような内因性異常の両方がある。
生じる）、または混合型であり得る。非症候性難聴の大部分の形態は、内耳における構造
に対する損傷によって引き起こされる永久的難聴と関連している（感音難聴）。ヒト感音
難聴の大多数は、蝸牛中のコルチ器の有毛細胞における異常によって引き起こされる。ま
た、第8脳神経（前庭蝸牛神経）または脳の聴覚部分を含む、非常に珍しい感音聴覚障害
もある。これらの種類の難聴のうちの最もまれなものにおいては、脳の聴覚中枢のみが影
響を受ける。この状況である皮質聾において、音は正常な閾値で聞こえ得るが、知覚され
る音の品質が非常に不十分であるため、言語を理解することができない。しかし、大部分
の感音難聴は、不十分な有毛細胞機能によるものである。有毛細胞は、誕生時に異常であ
る可能性があり、または個体の生涯の最中に損傷を受ける可能性がある。騒音外傷および
感染症のような損傷の外因、ならびに、蝸牛の解剖学または生理学において重要な役割を
果たす遺伝子に対する先天性変異のような内因性異常の両方がある。
【0010】
中耳における変化に起因する難聴は、伝音難聴と呼ばれる。非症候性難聴のいくつかの
形態は、混合型難聴と呼ばれる、内耳および中耳の両方における変化を含む。子供が話す
ことを学習する前に存在する難聴は、言語習得前または先天性として分類される。言語の
発達後に起こる難聴は、言語習得後として分類される。大部分の常染色体劣性遺伝子座は
、言語習得前の高度から重度の難聴を引き起こす。
形態は、混合型難聴と呼ばれる、内耳および中耳の両方における変化を含む。子供が話す
ことを学習する前に存在する難聴は、言語習得前または先天性として分類される。言語の
発達後に起こる難聴は、言語習得後として分類される。大部分の常染色体劣性遺伝子座は
、言語習得前の高度から重度の難聴を引き起こす。
【0011】
非症候性難聴は、さまざまな遺伝のパターンを有し得、どの年齢でも起こり得る。非症
候性難聴のタイプは、その遺伝パターンにしたがって名づけられる。常染色体優性型はDF
NAと称され、常染色体劣性型はDFNBであり、X連鎖型はDFNである。各タイプはまた、それ
が記述された順序で番号付与もされる。例えば、DFNA1は、最初に記述された常染色体優
性型の非症候性難聴であった。
候性難聴のタイプは、その遺伝パターンにしたがって名づけられる。常染色体優性型はDF
NAと称され、常染色体劣性型はDFNBであり、X連鎖型はDFNである。各タイプはまた、それ
が記述された順序で番号付与もされる。例えば、DFNA1は、最初に記述された常染色体優
性型の非症候性難聴であった。
【0012】
症例の75％～80％は常染色体劣性パターンで遺伝し、これは、各細胞における遺伝子の
両方のコピーが変異を有することを意味する。通常、常染色体劣性難聴を有する個体の各
親は、1コピーの変異した遺伝子の保有者であるが、この型の難聴によって影響を受けて
いない。
両方のコピーが変異を有することを意味する。通常、常染色体劣性難聴を有する個体の各
親は、1コピーの変異した遺伝子の保有者であるが、この型の難聴によって影響を受けて
いない。
【0013】
非症候性難聴の症例の別の20％から25％は、常染色体優性であり、これは、各細胞にお
ける1コピーの変更された遺伝子が、難聴をもたらすのに十分であることを意味する。常
染色体優性難聴を有する人々は、最も多くの場合、難聴を有する親から遺伝子の変更され
たコピーを受け継ぐ。
ける1コピーの変更された遺伝子が、難聴をもたらすのに十分であることを意味する。常
染色体優性難聴を有する人々は、最も多くの場合、難聴を有する親から遺伝子の変更され
たコピーを受け継ぐ。
【0014】
症例の1％～2％はX連鎖パターンの遺伝を示し、これは、状態の原因である変異した遺
伝子がX染色体（2つの性染色体のうちの1つ）上に位置していることを意味する。X連鎖非
症候性難聴を有する男性は、同じ遺伝子変異のコピーを受け継ぐ女性よりも人生において
早期に、より高度の難聴を発症する傾向がある。X連鎖遺伝の特徴は、父親はX連鎖形質を
その息子に渡せないことである。
伝子がX染色体（2つの性染色体のうちの1つ）上に位置していることを意味する。X連鎖非
症候性難聴を有する男性は、同じ遺伝子変異のコピーを受け継ぐ女性よりも人生において
早期に、より高度の難聴を発症する傾向がある。X連鎖遺伝の特徴は、父親はX連鎖形質を
その息子に渡せないことである。
【0015】
ミトコンドリアDNAに対する変化に起因するミトコンドリア性非症候性難聴は、米国に
おいては症例の1％未満において起こる。変更されたミトコンドリアDNAは、母親から彼女
の息子および娘のすべてに渡される。このタイプの難聴は、父親から遺伝しない。
おいては症例の1％未満において起こる。変更されたミトコンドリアDNAは、母親から彼女
の息子および娘のすべてに渡される。このタイプの難聴は、父親から遺伝しない。
【0016】
正常な外有毛細胞機能、および異常なまたは欠如した聴性脳幹反応を特徴とする聴力障
害であるオーディトリーニューロパチースペクトラム障害（ANSD）は、乳児および幼い小
児において聴力および言語のコミュニケーション障壁をもたらす最も一般的な疾患の1つ
である。永久的難聴を有する小児のおよそ10％が、ANSDを有する可能性がある。OTOF遺伝
子は、常染色体劣性非症候性ANSDについて特定された最初の遺伝子であり、OTOFにおける
変異は、いくつかの集団において常染色体劣性非症候性難聴のすべての症例のうちのおよ
そ5％を占めることが見出されている（Rodriguez-Ballesteroset al. 2008 Human Mut 2
9(6):823-831（非特許文献3））。
害であるオーディトリーニューロパチースペクトラム障害（ANSD）は、乳児および幼い小
児において聴力および言語のコミュニケーション障壁をもたらす最も一般的な疾患の1つ
である。永久的難聴を有する小児のおよそ10％が、ANSDを有する可能性がある。OTOF遺伝
子は、常染色体劣性非症候性ANSDについて特定された最初の遺伝子であり、OTOFにおける
変異は、いくつかの集団において常染色体劣性非症候性難聴のすべての症例のうちのおよ
そ5％を占めることが見出されている（Rodriguez-Ballesteroset al. 2008 Human Mut 2
9(6):823-831（非特許文献3））。
【0017】
非症候性難聴の原因は、複雑である。研究者は、変更された場合に非症候性難聴と関連
する、30種類よりも多い遺伝子を特定している；しかし、これらの遺伝子のうちのいくつ
かは、完全には特徴決定されていない。同じ遺伝子における異なる変異が、異なるタイプ
の難聴と関連している場合があり、いくつかの遺伝子は、症候性難聴および非症候性難聴
の両方と関連している。
する、30種類よりも多い遺伝子を特定している；しかし、これらの遺伝子のうちのいくつ
かは、完全には特徴決定されていない。同じ遺伝子における異なる変異が、異なるタイプ
の難聴と関連している場合があり、いくつかの遺伝子は、症候性難聴および非症候性難聴
の両方と関連している。
【0018】
例えば、非症候性難聴と関連する遺伝子には、これらに限定されないが、ATP2B2、ACTG
1、CDH23、CLDN14、COCH、COL11A2、DFNA5、DFNB31、DFNB59、ESPN、EYA4、GJB3、KCNQ4
、LHFPL5、MYO1A、MYO15A、MYO6、MYO7A、OTOF、PCDH15、SLC26A4、STRC、TECTA、TMC1、
TMIE、TMPRSS3、TRIOBP、USH1C、およびWFS1が含まれる。
1、CDH23、CLDN14、COCH、COL11A2、DFNA5、DFNB31、DFNB59、ESPN、EYA4、GJB3、KCNQ4
、LHFPL5、MYO1A、MYO15A、MYO6、MYO7A、OTOF、PCDH15、SLC26A4、STRC、TECTA、TMC1、
TMIE、TMPRSS3、TRIOBP、USH1C、およびWFS1が含まれる。
【0019】
難聴の最も一般的な原因は、非症候性難聴（Nonsyndromic Hearing Loss and Deafness
）DFNB1（GJB2関連DFNB1非症候性難聴；常染色体劣性難聴1；神経感覚非症候性劣性難聴1
とも呼ばれる）である。非症候性難聴（DFNB1）は、先天性で非進行性の、軽度から重度
の感音聴力障害を特徴とする。これは、（コネキシン26タンパク質をコードする）GJB2お
よび（コネキシン30をコードする）GJB6における変異によって引き起こされる。DFNB1の
診断は、ギャップジャンクションβ-2タンパク質（コネキシン26）を変化させる、GJB2お
よび上流シス調節エレメントにおける、難聴を引き起こす変異を特定するための分子遺伝
学的試験に依拠している。GJB2の分子遺伝学的試験は、これらの遺伝子における難聴を引
き起こす変異のうちの99％よりも多くを検出する。難聴のいくつかの他の形態とは異なり
、DFNB1非症候性難聴は、平衡または運動には影響を及ぼさない。難聴の程度は、人がど
の遺伝子変異を有するかに基づいて予測することが困難である。たとえ同じファミリーの
メンバーがDFNB1非症候性難聴による影響を受けたとしても、難聴の程度はメンバー間で
異なる場合がある。
）DFNB1（GJB2関連DFNB1非症候性難聴；常染色体劣性難聴1；神経感覚非症候性劣性難聴1
とも呼ばれる）である。非症候性難聴（DFNB1）は、先天性で非進行性の、軽度から重度
の感音聴力障害を特徴とする。これは、（コネキシン26タンパク質をコードする）GJB2お
よび（コネキシン30をコードする）GJB6における変異によって引き起こされる。DFNB1の
診断は、ギャップジャンクションβ-2タンパク質（コネキシン26）を変化させる、GJB2お
よび上流シス調節エレメントにおける、難聴を引き起こす変異を特定するための分子遺伝
学的試験に依拠している。GJB2の分子遺伝学的試験は、これらの遺伝子における難聴を引
き起こす変異のうちの99％よりも多くを検出する。難聴のいくつかの他の形態とは異なり
、DFNB1非症候性難聴は、平衡または運動には影響を及ぼさない。難聴の程度は、人がど
の遺伝子変異を有するかに基づいて予測することが困難である。たとえ同じファミリーの
メンバーがDFNB1非症候性難聴による影響を受けたとしても、難聴の程度はメンバー間で
異なる場合がある。
【0020】
コネキシン26（Cx26）および/またはCx30をコードする遺伝子における変異は、ヒト常
染色体性非症候性言語習得前難聴のすべての症例のうちのほぼ半分と関連している。Cx26
およびCx30は、蝸牛において見出される2つの主要なCxアイソフォームであり、共集合し
てハイブリッド（ヘテロマーおよびヘテロタイプ）ギャップジャンクション（GJ）を形成
する（Ahmad,et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2007, 104(4):1337-1341（非特許文献4
））。非症候性難聴DFNA3は、それぞれタンパク質コネキシン26（Cx26）またはコネキシ
ン30（Cx30）のいずれかを変更する、GJB2またはGJB6遺伝子におけるドミナントネガティ
ブ病原性バリアントによって引き起こされ、言語習得前または言語習得後の、軽度から重
度の進行性高周波感音聴覚障害を特徴とする。
染色体性非症候性言語習得前難聴のすべての症例のうちのほぼ半分と関連している。Cx26
およびCx30は、蝸牛において見出される2つの主要なCxアイソフォームであり、共集合し
てハイブリッド（ヘテロマーおよびヘテロタイプ）ギャップジャンクション（GJ）を形成
する（Ahmad,et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2007, 104(4):1337-1341（非特許文献4
））。非症候性難聴DFNA3は、それぞれタンパク質コネキシン26（Cx26）またはコネキシ
ン30（Cx30）のいずれかを変更する、GJB2またはGJB6遺伝子におけるドミナントネガティ
ブ病原性バリアントによって引き起こされ、言語習得前または言語習得後の、軽度から重
度の進行性高周波感音聴覚障害を特徴とする。
【0021】
OTOF関連難聴（DFNB9非症候性難聴）は、2つの表現型：言語習得前非症候性難聴、およ
びそれほど頻繁ではない、温度感受性非症候性オーディトリーニューロパチー（TS-NSAN
）を特徴とする。オトフェリン遺伝子における変異（例えば、I1573T変異もしくはP1987R
変異、および/またはE1700Q変異）と関連する進行性聴力障害の別の形態は、温度感受性
ではない。
びそれほど頻繁ではない、温度感受性非症候性オーディトリーニューロパチー（TS-NSAN
）を特徴とする。オトフェリン遺伝子における変異（例えば、I1573T変異もしくはP1987R
変異、および/またはE1700Q変異）と関連する進行性聴力障害の別の形態は、温度感受性
ではない。
【0022】
ペンドレッド症候群/DFNB4（甲状腺腫を伴う難聴）は、常染色体劣性遺伝障害であり、
先天性難聴のすべての症例のうちの7.5％を占める。ペンドレッド症候群は、ペンドリン
タンパク質をコードする染色体7の長腕（7q31）上のPDS遺伝子（DFNB4、EVA、PDS、TDH2B
、および溶質輸送体ファミリー26メンバー4、SLC26A4としても公知である）における変異
に連鎖している。この遺伝子における変異はまた、難聴の別の先天性原因である前庭水管
拡大症（EVAまたはEVAS）も引き起こし；特定の変異は、EVASを引き起こす可能性がより
高いが、他のものは、ペンドレッド症候群とより連鎖している（Azaiez, et al. (Decemb
er 2007), Hum.Genet. 122 (5): 451-7（非特許文献5））。
先天性難聴のすべての症例のうちの7.5％を占める。ペンドレッド症候群は、ペンドリン
タンパク質をコードする染色体7の長腕（7q31）上のPDS遺伝子（DFNB4、EVA、PDS、TDH2B
、および溶質輸送体ファミリー26メンバー4、SLC26A4としても公知である）における変異
に連鎖している。この遺伝子における変異はまた、難聴の別の先天性原因である前庭水管
拡大症（EVAまたはEVAS）も引き起こし；特定の変異は、EVASを引き起こす可能性がより
高いが、他のものは、ペンドレッド症候群とより連鎖している（Azaiez, et al. (Decemb
er 2007), Hum.Genet. 122 (5): 451-7（非特許文献5））。
【0023】
膜貫通プロテアーゼ、セリン3は、TMPRSS3遺伝子（DFNB10、DFNB8、ECHOS1、およびTAD
G12としても公知である）によってコードされる酵素である。遺伝子は、先天性および小
児期発症の両方の常染色体劣性難聴とのその関連によって特定された。TMPRSS3における
変異は、言語習得後かつ急速進行性の聴力障害と関連している。TMPRSS3遺伝子によって
コードされるタンパク質は、セリンプロテアーゼドメイン、膜貫通ドメイン、LDL受容体
様ドメイン、およびスカベンジャー受容体システインリッチドメインを含有する。セリン
プロテアーゼは、種々の生物学的プロセスに関与していることが公知であり、その機能不
全は、多くの場合、ヒトの疾患および障害をもたらす。この遺伝子は、胎児蝸牛および多
くの他の組織において発現しており、内耳または外リンパおよび内リンパの内容物の発生
および維持に関与していると考えられている。この遺伝子はまた、卵巣腫瘍において過剰
発現している腫瘍関連遺伝子としても特定された。4種類のオルタナティブスプライシン
グバリアントが記述されており、そのうちの2種類は同一の産物をコードする。
G12としても公知である）によってコードされる酵素である。遺伝子は、先天性および小
児期発症の両方の常染色体劣性難聴とのその関連によって特定された。TMPRSS3における
変異は、言語習得後かつ急速進行性の聴力障害と関連している。TMPRSS3遺伝子によって
コードされるタンパク質は、セリンプロテアーゼドメイン、膜貫通ドメイン、LDL受容体
様ドメイン、およびスカベンジャー受容体システインリッチドメインを含有する。セリン
プロテアーゼは、種々の生物学的プロセスに関与していることが公知であり、その機能不
全は、多くの場合、ヒトの疾患および障害をもたらす。この遺伝子は、胎児蝸牛および多
くの他の組織において発現しており、内耳または外リンパおよび内リンパの内容物の発生
および維持に関与していると考えられている。この遺伝子はまた、卵巣腫瘍において過剰
発現している腫瘍関連遺伝子としても特定された。4種類のオルタナティブスプライシン
グバリアントが記述されており、そのうちの2種類は同一の産物をコードする。
【0024】
DFN3難聴は、X染色体上に位置するPOU3F4遺伝子における変異によって引き起こされる
。この状態を有する人々においては、中耳における小さな骨（アブミ骨）のうちの1つが
正常に動くことができず、そのために聴覚に支障をきたす。DFN3のこの特徴的な徴候は、
アブミ骨固着と呼ばれる。X染色体の少なくとも4つの他の領域が、難聴に関与しているが
、原因となる遺伝子は発見されていない。PejvakinまたはPJVKとしても公知であるDFNB59
（常染色体劣性難聴59（deafness,autosomal recessive 59））は、脊椎動物においてガ
スダーミン（gasdermin）ファミリーに属する352アミノ酸のタンパク質である。DFNB59は
、聴覚路ニューロンの適正な機能および外有毛細胞機能に不可欠である、ヒト染色体2q31
.2にマッピングされる遺伝子によってコードされる。DFNB59における変異は、欠如してい
るかまたは重篤に異常の聴性脳幹反応を特徴とするが、正常な耳音響放射を特徴とする感
音聴覚障害の形態（オーディトリーニューロパチーまたは聴覚同期不全（auditory dys-s
ynchrony））である、非症候性感音難聴常染色体劣性型59を引き起こすと考えられている
。DFNB59は、DFNA5と有意な類似性を共有し、これらの遺伝子が共通の起源を共有するこ
とを示す。
。この状態を有する人々においては、中耳における小さな骨（アブミ骨）のうちの1つが
正常に動くことができず、そのために聴覚に支障をきたす。DFN3のこの特徴的な徴候は、
アブミ骨固着と呼ばれる。X染色体の少なくとも4つの他の領域が、難聴に関与しているが
、原因となる遺伝子は発見されていない。PejvakinまたはPJVKとしても公知であるDFNB59
（常染色体劣性難聴59（deafness,autosomal recessive 59））は、脊椎動物においてガ
スダーミン（gasdermin）ファミリーに属する352アミノ酸のタンパク質である。DFNB59は
、聴覚路ニューロンの適正な機能および外有毛細胞機能に不可欠である、ヒト染色体2q31
.2にマッピングされる遺伝子によってコードされる。DFNB59における変異は、欠如してい
るかまたは重篤に異常の聴性脳幹反応を特徴とするが、正常な耳音響放射を特徴とする感
音聴覚障害の形態（オーディトリーニューロパチーまたは聴覚同期不全（auditory dys-s
ynchrony））である、非症候性感音難聴常染色体劣性型59を引き起こすと考えられている
。DFNB59は、DFNA5と有意な類似性を共有し、これらの遺伝子が共通の起源を共有するこ
とを示す。
【0025】
アルポート症候群は、コラーゲン生合成に関与しているCOL4A3、COL4A4、およびCOL4A5
遺伝子における変異によって引き起こされる。これらの遺伝子のうちのいずれかにおける
変異により、腎臓、内耳、および眼における基底膜の重要な構造的構成要素であるIV型コ
ラーゲンネットワークの適正な生成またはアセンブリが阻止される。アルポート症候群の
診断に用いられる基準のうちの1つは、2000 Hzから8000 Hzの範囲における両側性感音難
聴である。難聴は、徐々に発症し、乳児期早期には存在せず、一般的に30歳よりも前に現
れる。
遺伝子における変異によって引き起こされる。これらの遺伝子のうちのいずれかにおける
変異により、腎臓、内耳、および眼における基底膜の重要な構造的構成要素であるIV型コ
ラーゲンネットワークの適正な生成またはアセンブリが阻止される。アルポート症候群の
診断に用いられる基準のうちの1つは、2000 Hzから8000 Hzの範囲における両側性感音難
聴である。難聴は、徐々に発症し、乳児期早期には存在せず、一般的に30歳よりも前に現
れる。
【0026】
イオンチャンネルにおける欠陥が、難聴と関連しており：DFNA2非症候性難聴は、電位
開口型カリウムチャンネルサブユニットKv7.4としても公知であるカリウム電位開口型チ
ャンネルサブファミリーKQTメンバー4をコードする、KCNQ4遺伝子における常染色体優性
変異として遺伝する。DFNA2非症候性難聴は、すべての周波数にわたって進行性である、
対称性の主に高周波感音難聴（SNHL）を特徴とする。より若い年齢では、難聴は、低周波
で軽度であり、高周波で中等度である傾向があり；高齢者においては、難聴は、低周波で
中等度であり、高周波では高度から重度である。聴力障害は、多くの場合、学童期小児の
日常的な聴力評価の最中に検出されるが、聴力は、特に高周波で、誕生から損なわれてい
る可能性が高い。最も影響を受ける人は、10歳～40歳の間に、音増幅を助けるための補聴
器を最初に必要とする。70歳までに、DFNA2難聴を有する人はすべて、高度から重度の聴
力障害を有する。
開口型カリウムチャンネルサブユニットKv7.4としても公知であるカリウム電位開口型チ
ャンネルサブファミリーKQTメンバー4をコードする、KCNQ4遺伝子における常染色体優性
変異として遺伝する。DFNA2非症候性難聴は、すべての周波数にわたって進行性である、
対称性の主に高周波感音難聴（SNHL）を特徴とする。より若い年齢では、難聴は、低周波
で軽度であり、高周波で中等度である傾向があり；高齢者においては、難聴は、低周波で
中等度であり、高周波では高度から重度である。聴力障害は、多くの場合、学童期小児の
日常的な聴力評価の最中に検出されるが、聴力は、特に高周波で、誕生から損なわれてい
る可能性が高い。最も影響を受ける人は、10歳～40歳の間に、音増幅を助けるための補聴
器を最初に必要とする。70歳までに、DFNA2難聴を有する人はすべて、高度から重度の聴
力障害を有する。
【0027】
KCNE1遺伝子およびKCNQ1遺伝子における変異は、高度の両側性難聴と関連するQT延長症
候群のタイプである、ジャーベル・ランゲニールセン症候群（JLNS）を引き起こす。この
状態は、100万人の小児において推定1.6～6人に影響を及ぼす常染色体劣性障害であり、Q
T延長症候群のすべての症例のうちの10％未満の原因である。これは、ノルウェーおよび
スウェーデンにおいて顕著により高い発生率を有し、最大で1:200,000である。KCNE1遺伝
子およびKCNQ1遺伝子によって産生されるタンパク質は、共に働いて、正電荷を持つカリ
ウムイオンを細胞の外へ輸送するカリウムチャンネルを形成する。これらのチャンネルを
通るカリウムイオンの移動は、内耳および心筋の正常な機能を維持するために重要である
。
候群のタイプである、ジャーベル・ランゲニールセン症候群（JLNS）を引き起こす。この
状態は、100万人の小児において推定1.6～6人に影響を及ぼす常染色体劣性障害であり、Q
T延長症候群のすべての症例のうちの10％未満の原因である。これは、ノルウェーおよび
スウェーデンにおいて顕著により高い発生率を有し、最大で1:200,000である。KCNE1遺伝
子およびKCNQ1遺伝子によって産生されるタンパク質は、共に働いて、正電荷を持つカリ
ウムイオンを細胞の外へ輸送するカリウムチャンネルを形成する。これらのチャンネルを
通るカリウムイオンの移動は、内耳および心筋の正常な機能を維持するために重要である
。
【0028】
精神遅滞、運動失調、発作、難聴、および腎性塩喪失（renal salt waste）を特徴とす
るEAST/SeSAME症候群は、カリウムチャンネルを内向きに整流するKCNJ10における変異に
よって引き起こされると考えられている。
るEAST/SeSAME症候群は、カリウムチャンネルを内向きに整流するKCNJ10における変異に
よって引き起こされると考えられている。
【0029】
感音難聴を伴うバーター症候群4型（バーター症候群IVまたはBSNDとしても公知である
）を有する対象は、Cl-チャンネルアクセサリーサブユニットにおける欠陥を有する。
）を有する対象は、Cl-チャンネルアクセサリーサブユニットにおける欠陥を有する。
【0030】
腎臓および蝸牛の両方に発現しているATP6V1B1遺伝子における変異は、遠位尿細管性ア
シドーシス（DRTA）と関連している。常染色体劣性DRTAを有する小児のうちの有意なパー
センテージが、進行性両側性感音難聴を経験することもまた見出された。
シドーシス（DRTA）と関連している。常染色体劣性DRTAを有する小児のうちの有意なパー
センテージが、進行性両側性感音難聴を経験することもまた見出された。
【0031】
アッシャー症候群（ハルグレン症候群、アッシャー・ハルグレン症候群、色素性網膜炎
-聴覚不全症候群、および網膜ジストロフィー聴覚不全症候群としても公知である）は、
難聴および漸進的な視覚障害の組み合わせをもたらす、少なくとも10種類の遺伝子のいず
れか1つにおける変異によって引き起こされるまれな障害であり、盲聾の筆頭の原因であ
る。難聴は、欠陥内耳によって引き起こされ、他方、視力損失は、網膜細胞の変性である
色素性網膜炎（RP）に起因する。アッシャー症候群は、I、II、およびIIIとして表される
3つの臨床サブタイプを有する。アッシャーIを有する対象は、生まれつき重度に耳が聞こ
えず、人生の最初の10年でその視力を失い始め、その前庭系における問題のために子供と
して歩くことを学習するのがゆっくりであり、かつ平衡障害を呈する。アッシャーIIを有
する対象は、生まれつき耳が聞こえないわけではないが、難聴を有し、しかし平衡につい
て注目に値する問題を有するようには見えない。彼らはまた、その視力を後に（10歳代に
おいて）失い始め、たとえ中年になってもいくらかの視力を保持している場合がある。ア
ッシャー症候群IIIを有する対象は、生まれつき耳が聞こえないわけではないが、その聴
力および視力の漸進的な損失を経験する。彼らは、平衡障害を有する場合があり、または
有さない場合もある。
-聴覚不全症候群、および網膜ジストロフィー聴覚不全症候群としても公知である）は、
難聴および漸進的な視覚障害の組み合わせをもたらす、少なくとも10種類の遺伝子のいず
れか1つにおける変異によって引き起こされるまれな障害であり、盲聾の筆頭の原因であ
る。難聴は、欠陥内耳によって引き起こされ、他方、視力損失は、網膜細胞の変性である
色素性網膜炎（RP）に起因する。アッシャー症候群は、I、II、およびIIIとして表される
3つの臨床サブタイプを有する。アッシャーIを有する対象は、生まれつき重度に耳が聞こ
えず、人生の最初の10年でその視力を失い始め、その前庭系における問題のために子供と
して歩くことを学習するのがゆっくりであり、かつ平衡障害を呈する。アッシャーIIを有
する対象は、生まれつき耳が聞こえないわけではないが、難聴を有し、しかし平衡につい
て注目に値する問題を有するようには見えない。彼らはまた、その視力を後に（10歳代に
おいて）失い始め、たとえ中年になってもいくらかの視力を保持している場合がある。ア
ッシャー症候群IIIを有する対象は、生まれつき耳が聞こえないわけではないが、その聴
力および視力の漸進的な損失を経験する。彼らは、平衡障害を有する場合があり、または
有さない場合もある。
【0032】
先天性難聴のマウスモデルは、小胞グルタミン酸輸送体-3（VGLUT3）をコードする遺伝
子において無発現変異を作ることによって作製されている。近年、ウイルス媒介性遺伝子
治療を用いて、VGLUT3ノックアウトマウスにおいて聴力が回復された（Akil,et al., 20
12, Neuron75:283-293（非特許文献6））。
子において無発現変異を作ることによって作製されている。近年、ウイルス媒介性遺伝子
治療を用いて、VGLUT3ノックアウトマウスにおいて聴力が回復された（Akil,et al., 20
12, Neuron75:283-293（非特許文献6））。
【0033】
Math1（ATH1のマウスホモログ；HATH1、またはATOH1のAtonalショウジョウバエ（Droso
phila）ホモログとしても公知である）は、内耳における有毛細胞発生に不可欠であり；
そのため、Math1は、感覚上皮の発生において「有毛細胞促進性（pro-haircell）遺伝子
」として作用することが提唱された（Bermingham et al., 1999, Science 284:1837-1841
（非特許文献7））。いくつかの研究により、現在、Math1のウイルス媒介性送達での、負
傷したマウス蝸牛における有毛細胞の再生、ならびに聴力および平衡の両方の改善が実証
されている（Bakeret al., 2009, Adv. Otorhinolaryngol. 66:52-63（非特許文献8）；
Husseman andRaphael, 2009, Adv. Otorhinolaryngol. 66:37-51（非特許文献9）；Izum
ikawa et al.,2008, Hear. Res. 240:52-56（非特許文献10）；Kawamoto et al., 2003,
J. Neurosci.23:4395-4400（非特許文献11）；Praetorius et al., 2010, Acta Otolar
yngol.130:215-222（非特許文献12）；Staecker et al., 2007, Otol. Neurotol. 28:22
3-231（非特許文献13））。
phila）ホモログとしても公知である）は、内耳における有毛細胞発生に不可欠であり；
そのため、Math1は、感覚上皮の発生において「有毛細胞促進性（pro-haircell）遺伝子
」として作用することが提唱された（Bermingham et al., 1999, Science 284:1837-1841
（非特許文献7））。いくつかの研究により、現在、Math1のウイルス媒介性送達での、負
傷したマウス蝸牛における有毛細胞の再生、ならびに聴力および平衡の両方の改善が実証
されている（Bakeret al., 2009, Adv. Otorhinolaryngol. 66:52-63（非特許文献8）；
Husseman andRaphael, 2009, Adv. Otorhinolaryngol. 66:37-51（非特許文献9）；Izum
ikawa et al.,2008, Hear. Res. 240:52-56（非特許文献10）；Kawamoto et al., 2003,
J. Neurosci.23:4395-4400（非特許文献11）；Praetorius et al., 2010, Acta Otolar
yngol.130:215-222（非特許文献12）；Staecker et al., 2007, Otol. Neurotol. 28:22
3-231（非特許文献13））。
【0034】
WFS1遺伝子における変異は、ウォルフラム症候群1型症例の90％よりも多くを引き起こ
し；ウォルフラム症候群は、ホルモンであるインスリンの不足に起因する高い血糖レベル
（真性糖尿病）、および眼から脳へ情報を運ぶ神経の変性による進行性視力損失（視神経
萎縮症）を最も多くの場合に特徴とする、身体の系の多くに影響を及ぼす状態である。し
かし、ウォルフラム症候群を有する人々はまた、多くの場合、過剰量の尿の排泄（尿崩症
）、内耳における変化によって引き起こされる難聴（感音難聴）、尿路の問題、男性にお
ける性ホルモンであるテストステロンの量の低下（性機能低下症）、または神経障害もし
くは精神障害をもたらす、下垂体機能不全も有する。ウォルフラム症候群を有する人々の
約65％は、重症度が、誕生時に始まる難聴から、青年期に始まり経時的に悪くなる軽度の
難聴までの範囲であり得る、感音難聴を有する。さらに、ウォルフラム症候群を有する人
々の約60％は、典型的には成人期早期に始まる、神経障害または精神障害、最も一般的に
は平衡および協調についての問題（運動失調症）を発症する。
し；ウォルフラム症候群は、ホルモンであるインスリンの不足に起因する高い血糖レベル
（真性糖尿病）、および眼から脳へ情報を運ぶ神経の変性による進行性視力損失（視神経
萎縮症）を最も多くの場合に特徴とする、身体の系の多くに影響を及ぼす状態である。し
かし、ウォルフラム症候群を有する人々はまた、多くの場合、過剰量の尿の排泄（尿崩症
）、内耳における変化によって引き起こされる難聴（感音難聴）、尿路の問題、男性にお
ける性ホルモンであるテストステロンの量の低下（性機能低下症）、または神経障害もし
くは精神障害をもたらす、下垂体機能不全も有する。ウォルフラム症候群を有する人々の
約65％は、重症度が、誕生時に始まる難聴から、青年期に始まり経時的に悪くなる軽度の
難聴までの範囲であり得る、感音難聴を有する。さらに、ウォルフラム症候群を有する人
々の約60％は、典型的には成人期早期に始まる、神経障害または精神障害、最も一般的に
は平衡および協調についての問題（運動失調症）を発症する。
【0035】
WFS1遺伝子は、細胞においてカルシウムの量を調節すると考えられるウォルフラミン（
wolframin）と呼ばれるタンパク質をコードする。ウォルフラム症候群が、WFS1遺伝子に
おける変異によって引き起こされる場合、それは常染色体劣性パターンにおいて遺伝し、
ウォルフラミンタンパク質は、機能が低下しているかまたは欠如している。結果として、
細胞内のカルシウムレベルが調節されず、小胞体が正確に働かない。小胞体が十分な機能
的ウォルフラミンを有していない場合、細胞は、それ自体の細胞死（アポトーシス）を誘
発する。膵臓における細胞、具体的にはインスリンを作る細胞（β細胞）の死は、ウォル
フラム症候群を有する人々において真性糖尿病を引き起こす。視神経に沿った細胞の漸進
的な損失は、影響を受けた個体において視覚消失を最終的にもたらす。他の身体系におけ
る細胞の死は、ウォルフラム症候群1型のさまざまな徴候および症状を引きおこす可能性
が高い。
wolframin）と呼ばれるタンパク質をコードする。ウォルフラム症候群が、WFS1遺伝子に
おける変異によって引き起こされる場合、それは常染色体劣性パターンにおいて遺伝し、
ウォルフラミンタンパク質は、機能が低下しているかまたは欠如している。結果として、
細胞内のカルシウムレベルが調節されず、小胞体が正確に働かない。小胞体が十分な機能
的ウォルフラミンを有していない場合、細胞は、それ自体の細胞死（アポトーシス）を誘
発する。膵臓における細胞、具体的にはインスリンを作る細胞（β細胞）の死は、ウォル
フラム症候群を有する人々において真性糖尿病を引き起こす。視神経に沿った細胞の漸進
的な損失は、影響を受けた個体において視覚消失を最終的にもたらす。他の身体系におけ
る細胞の死は、ウォルフラム症候群1型のさまざまな徴候および症状を引きおこす可能性
が高い。
【0036】
ミトコンドリア遺伝子であるMT-TS1およびMT-RNR1における変異は、非症候性難聴を発
症するリスクを増大させることが見出されている。非症候性ミトコンドリア性難聴は、中
等度から重度の難聴を特徴とする。MT-TS1における病原性バリアントは、通常、感音難聴
の小児期の発症と関連している。MT-RNR1における病原性バリアントは、彼らがアミノグ
リコシドと呼ばれるある特定の抗生物質薬物療法に曝露された場合の難聴（聴器毒性）、
および/または遅発性感音難聴に対する素因と関連している；しかし、MT-RNR1遺伝子にお
ける変異を有するいくらかの人々は、たとえこれらの抗生物質に対する曝露がなくても難
聴を発症する。アミノグリコシド聴器毒性と関連する難聴は、両側性かつ高度から重度で
あり、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、カナマイシン、またはストレプト
マイシンなどのアミノグリコシド抗生物質の任意の量（たとえ単一用量でも）の投与後数
日から数週間以内に起こる。
症するリスクを増大させることが見出されている。非症候性ミトコンドリア性難聴は、中
等度から重度の難聴を特徴とする。MT-TS1における病原性バリアントは、通常、感音難聴
の小児期の発症と関連している。MT-RNR1における病原性バリアントは、彼らがアミノグ
リコシドと呼ばれるある特定の抗生物質薬物療法に曝露された場合の難聴（聴器毒性）、
および/または遅発性感音難聴に対する素因と関連している；しかし、MT-RNR1遺伝子にお
ける変異を有するいくらかの人々は、たとえこれらの抗生物質に対する曝露がなくても難
聴を発症する。アミノグリコシド聴器毒性と関連する難聴は、両側性かつ高度から重度で
あり、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、カナマイシン、またはストレプト
マイシンなどのアミノグリコシド抗生物質の任意の量（たとえ単一用量でも）の投与後数
日から数週間以内に起こる。
【0037】
難聴の治療は、現在、軽度から高度の損失のための聴力増幅、および高度から重度の損
失のための蝸牛インプラント術からなる（Kral and O'Donoghue, 2010, N. Engl. J. Med
. 363:1438-1450（非特許文献14））。現在まで、本領域における研究の大部分が、老人
性難聴、騒音損傷、感染症、および聴器毒性を含む最も一般的な形態の難聴に適用可能で
ある、蝸牛有毛細胞再生に焦点を合わせている。
失のための蝸牛インプラント術からなる（Kral and O'Donoghue, 2010, N. Engl. J. Med
. 363:1438-1450（非特許文献14））。現在まで、本領域における研究の大部分が、老人
性難聴、騒音損傷、感染症、および聴器毒性を含む最も一般的な形態の難聴に適用可能で
ある、蝸牛有毛細胞再生に焦点を合わせている。
【0038】
蝸牛虚血についての動物モデルにおいて、虚血性損傷が、インスリン様成長因子（IGF-
1）、AM-111（アポトーシス阻害剤）、エダラボン（フリーラジカルスカベンジャー）、
ギンセノシドRB1（Kappo）、グリア細胞由来神経栄養因子（GDNF）、BDNF、CNTF、SOD1
、SOD2、ネクロスタチン-1、DFNA5、およびMSRB3などの化合物によって阻止され得る。し
かし、物質の組み合わせは、単一の化合物よりも有効であり得るように見られる（例えば
、酸化ストレス、外毒素性（exotoxicity）、血流、カルシウムおよび刺激の過負荷、ア
ポトーシス経路、神経栄養制御機構またはホルモン制御機構を調節するための補完療法）
。
1）、AM-111（アポトーシス阻害剤）、エダラボン（フリーラジカルスカベンジャー）、
ギンセノシドRB1（Kappo）、グリア細胞由来神経栄養因子（GDNF）、BDNF、CNTF、SOD1
、SOD2、ネクロスタチン-1、DFNA5、およびMSRB3などの化合物によって阻止され得る。し
かし、物質の組み合わせは、単一の化合物よりも有効であり得るように見られる（例えば
、酸化ストレス、外毒素性（exotoxicity）、血流、カルシウムおよび刺激の過負荷、ア
ポトーシス経路、神経栄養制御機構またはホルモン制御機構を調節するための補完療法）
。
【0039】
JNK-1誘導性アポトーシス（ミトコンドリア誘導性）の阻害は、ドミナントネガティブJ
NK-1およびd-立体異性体JNK-1などの化合物によって阻止され得る（Mol.Pharmacol. 200
7 March;71(3):654-66（非特許文献15）；この内容はその全体が参照により本明細書に
組み入れられる）。
NK-1およびd-立体異性体JNK-1などの化合物によって阻止され得る（Mol.Pharmacol. 200
7 March;71(3):654-66（非特許文献15）；この内容はその全体が参照により本明細書に
組み入れられる）。
【0040】
難聴を阻止するかまたは逆転させるための作用物質および方法について、長年にわたる
切実な必要性が残されている。
切実な必要性が残されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0041】
【非特許文献1】Smith et al., 2005, Lancet 365:879-890
【非特許文献2】Di Domenico, et al., 2011, J. Cell. Physiol. 226:2494-2499
【非特許文献3】Rodriguez-Ballesteros et al. 2008 Human Mut 29(6):823-831
【非特許文献4】Ahmad, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2007, 104(4):1337-1341
【非特許文献5】Azaiez, et al. (December 2007), Hum. Genet. 122 (5): 451-7
【非特許文献6】Akil, et al., 2012, Neuron 75:283-293
【非特許文献7】Bermingham et al., 1999, Science 284:1837-1841
【非特許文献8】Baker et al., 2009, Adv. Otorhinolaryngol. 66:52-63
【非特許文献9】Husseman and Raphael, 2009, Adv. Otorhinolaryngol. 66:37-51
【非特許文献10】Izumikawa et al., 2008, Hear. Res. 240:52-56
【非特許文献11】Kawamoto et al., 2003, J. Neurosci. 23:4395-4400
【非特許文献12】Praetorius et al., 2010, Acta Otolaryngol. 130:215-222
【非特許文献13】Staecker et al., 2007, Otol. Neurotol. 28:223-231
【非特許文献14】Kral and O'Donoghue, 2010, N. Engl. J. Med. 363:1438-1450
【非特許文献15】Mol. Pharmacol. 2007 March; 71(3):654-66
【図面の簡単な説明】
【0042】
【図1】トランススプライシングアプローチを用いる、内有毛細胞（IHC）におけるデュアルAAV形質導入のための5'ベクターおよび3'ベクターの遺伝子マップの例示的な模式図である。5'ベクターにおいては、ヒトβ-アクチンプロモーター（hbA）およびCMVエンハンサー（CMVe）が、eGFPおよび翻訳の最中に切断されるP2AペプチドをコードするmRNAの転写を駆動する。5'ベクターはまた、オトフェリンのN末端部分およびスプライスドナー部位（SD）をコードするcDNAも含有する。SDDNA配列は、Trapani et al. (2014) EMBO Mol Med 6194-211によって提供された。3'ベクターにおいては、スプライスアクセプター部位（SA）を、第1の末端逆位配列（ITR）の後かつオトフェリンのコード配列のうちの3'部分の前にサブクローニングした。この後に、mRNA安定化配列、ウッドチャック肝炎ウイルス翻訳後調節エレメント（WPRE）、およびポリアデニル化シグナル（pA）が続く。
【図2】ハイブリッドアプローチを用いる、IHCにおけるデュアルAAV形質導入のための5'ベクターおよび3'ベクターの遺伝子マップの例示的な模式図である。図1に記載されているエレメントに加えて、F1ファージ由来の高度に組換え誘導性（recombinogenic）の配列（AK）を5'ベクターの3'末端および3'ベクターの5'末端に含めて、正確なベクターアセンブリをさせた（Trapaniet al. (2014) EMBO Mol Med 6 194-211）。
【図3】非形質導入Otof-/-マウス（n＝25；細い黒線）およびデュアルAAVを介したオトフェリンの発現後のOtof-/-マウス（n＝14；灰色線は個々の動物を表し、太い黒線はすべての動物にわたる平均の応答である）における経時的な聴性脳幹反応（ABR）振幅を示すグラフである。
【図4】非形質導入Otof-/-マウス（n＝25；長い破線）、デュアルAAVを介したオトフェリンの発現後のOtof-/-マウス（n＝14；短い破線）、および高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP）のデュアルAAV形質導入後の野生型Otofwt/wtマウス（n＝5；細い黒線は個々の動物を表し、太い黒線はすべての動物にわたる平均の振幅である）における経時的なABR振幅を示すグラフである。
【図5】純音またはクリック刺激に応答した周波数（kHzにおける）にわたるABR閾値（dB SPLにおける）を示す例示的なグラフである。純音またはクリック刺激に応答した、デュアルAAVを介したオトフェリンの発現を有する個々のOtof-/-動物について（白丸は個々の動物を表し、斜線塗りつぶしの丸はすべての動物にわたる平均の閾値である）、非形質導入Otof-/-動物について（黒丸）、およびeGFPのデュアルAAV形質導入後のOtofwt/wt動物について（チェック塗りつぶしの丸）、波を検出することができる最小の音圧レベル（SPL）を提示する。
【図6】1種類はN末端オトフェリン断片に結合し、もう1種類はオトフェリンの超C末端部分に結合する、2種類の異なる抗体を用いた免疫組織化学によって判定した、蝸牛（例えば、コルチ器全体、頂回転、および中/基底回転）に沿ったIHCの形質導入率を示すグラフである。
【図7】デュアルAAVを介したオトフェリンの発現後のOtof-/-マウス由来の1つのコルチ器の免疫組織化学画像のセットである。カルビンジンを、内有毛細胞および外有毛細胞についてのマーカーとして用いた。eGFPを発現する細胞は、少なくとも5'ウイルスのウイルス形質導入を示す。左および中央のパネルは、オトフェリンのN末端半分における抗オトフェリン抗体染色（Abcam）を示す。右のパネルは、C末端抗オトフェリン抗体染色（SynapticSystems）を示す。合わせて、3つのパネルすべては、全長オトフェリンがIHCにおいて発現していることを実証する。重要なことに、AAVはコルチ器におけるいくつかの細胞タイプに形質導入する（eGFP蛍光によって示される）にもかかわらず、オトフェリン発現は内有毛細胞に制限された。スケールバー：100μm。
【図8】Otof-/-IHC（白色；n＝10）、デュアルAAVを介したオトフェリンの発現後のOtof-/-IHC（斜線；n＝8）、およびバックグラウンドが一致した対照動物由来の野生型IHC（黒色；n＝6）について、脱分極刺激にわたるCa2+電流を示すグラフである。
【図9】Otof-/-マウスのデュアルAAV形質導入IHC（黒線、個々のIHC；斜線塗りつぶしの菱形：平均±s.e.m；n＝8）、少量のエキソサイトーシスのみを提示した、注射されたOtof-/-マウス由来の2種類の個々のデュアルAAV形質導入IHC（破線）、およびバックグラウンドが一致した野生型対照（黒菱形；n＝6）における、脱分極の持続時間にわたる形質膜キャパシタンス（ΔCm）を示すグラフである。Strenzke et al. (2016) EMBO J. 35 2519-2535由来の野生型データを、比較のために黒丸で示す。
【図10】Otof-/-IHC（白菱形）、Otof-/-マウスのデュアルAAV形質導入IHC（黒丸）、およびバックグラウンドが一致した野生型対照（黒菱形）における、脱分極の持続時間（ms）にわたるQrealを示す代表的なグラフである。
【図11】pAAV-AK-SA-3'mOTOF-EWBの代表的なプラスミドマップである。
【図12】pAAV-SA-3'mOTOF-EWBの代表的なプラスミドマップである。
【図13】pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SDの代表的なプラスミドマップである。
【図14】pAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD-AKの代表的なプラスミドマップである。
【発明の概要】
【0043】
概要
本発明は、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコ
ードする配列を哺乳動物細胞内で生成し、それによって、その必要がある対象における非
症候性感音難聴を治療するために、少なくとも2つの異なる核酸ベクターを含む組成物で
あって、該少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、オトフェリンタンパク質の異
なる部分をコードするコード配列を含む、前記組成物を使用することができる、という発
見に基づく。
本発明は、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコ
ードする配列を哺乳動物細胞内で生成し、それによって、その必要がある対象における非
症候性感音難聴を治療するために、少なくとも2つの異なる核酸ベクターを含む組成物で
あって、該少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、オトフェリンタンパク質の異
なる部分をコードするコード配列を含む、前記組成物を使用することができる、という発
見に基づく。
【0044】
本明細書において、少なくとも2つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、該少
なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコ
ードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも30アミノ酸
残基であり、該コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が、任意で、該コードされる
部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と部分的に重複してもよく；該少なくとも2つの
異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコー
ドしておらず；該コード配列のうちの少なくとも1つが、オトフェリンゲノムDNAの2つの
隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ該2つの隣接するエクソンの間の
イントロン配列を欠いており；かつ、該少なくとも2つの異なるベクターが、哺乳動物細
胞内に導入されたときに相互にコンカテマー化または相同組換えを受け、それによって、
全長オトフェリンタンパク質をコードする組換え核酸が形成される、前記組成物が提供さ
れる。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、少
なくとも2つの異なるベクターのそれぞれは、プラスミド、トランスポゾン、コスミド、
人工染色体、またはウイルスベクターである。本明細書に記載されている組成物のうちの
いずれかのいくつかの態様において、少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれは、ヒ
ト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、またはP1由来
人工染色体（PAC）である。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつ
かの態様において、少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれは、アデノ随伴ウイルス
（AAV）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはレトロウ
イルスベクターから選択されるウイルスベクターである。本明細書に記載されている組成
物のうちのいずれかのいくつかの態様において、少なくとも2つの異なるベクターのそれ
ぞれは、AAVベクターである。
なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコ
ードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも30アミノ酸
残基であり、該コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が、任意で、該コードされる
部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と部分的に重複してもよく；該少なくとも2つの
異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコー
ドしておらず；該コード配列のうちの少なくとも1つが、オトフェリンゲノムDNAの2つの
隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ該2つの隣接するエクソンの間の
イントロン配列を欠いており；かつ、該少なくとも2つの異なるベクターが、哺乳動物細
胞内に導入されたときに相互にコンカテマー化または相同組換えを受け、それによって、
全長オトフェリンタンパク質をコードする組換え核酸が形成される、前記組成物が提供さ
れる。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、少
なくとも2つの異なるベクターのそれぞれは、プラスミド、トランスポゾン、コスミド、
人工染色体、またはウイルスベクターである。本明細書に記載されている組成物のうちの
いずれかのいくつかの態様において、少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれは、ヒ
ト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、またはP1由来
人工染色体（PAC）である。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつ
かの態様において、少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれは、アデノ随伴ウイルス
（AAV）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはレトロウ
イルスベクターから選択されるウイルスベクターである。本明細書に記載されている組成
物のうちのいずれかのいくつかの態様において、少なくとも2つの異なるベクターのそれ
ぞれは、AAVベクターである。
【0045】
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、コード
される部分のうちの1つのアミノ酸配列は、コードされる部分のうちの異なるもののアミ
ノ酸配列と重複する。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態
様において、コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列は、異なるコードされる部分の
アミノ酸配列と部分的に重複する。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかの
いくつかの態様において、重複するアミノ酸配列の長さは、約30アミノ酸残基～約1000ア
ミノ酸残基である。
される部分のうちの1つのアミノ酸配列は、コードされる部分のうちの異なるもののアミ
ノ酸配列と重複する。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態
様において、コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列は、異なるコードされる部分の
アミノ酸配列と部分的に重複する。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかの
いくつかの態様において、重複するアミノ酸配列の長さは、約30アミノ酸残基～約1000ア
ミノ酸残基である。
【0046】
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、ベクタ
ーは、2つの異なるベクターを含み、該異なるベクターはそれぞれ、イントロンの異なる
セグメントを含み、該イントロンは、オトフェリンゲノムDNA中に存在するイントロンの
ヌクレオチド配列を含み、かつ2つの異なる該セグメントの配列は、少なくとも100ヌクレ
オチド重複する。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様に
おいて、2つの異なるセグメントの配列は、約100ヌクレオチド～約800ヌクレオチド重複
する。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、少
なくとも2つの異なるベクターのそれぞれのヌクレオチド配列の長さは、約500ヌクレオチ
ド～約10,000ヌクレオチドである。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかの
いくつかの態様において、少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれのヌクレオチド配
列の長さは、500ヌクレオチド～5,000ヌクレオチドである。
ーは、2つの異なるベクターを含み、該異なるベクターはそれぞれ、イントロンの異なる
セグメントを含み、該イントロンは、オトフェリンゲノムDNA中に存在するイントロンの
ヌクレオチド配列を含み、かつ2つの異なる該セグメントの配列は、少なくとも100ヌクレ
オチド重複する。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様に
おいて、2つの異なるセグメントの配列は、約100ヌクレオチド～約800ヌクレオチド重複
する。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、少
なくとも2つの異なるベクターのそれぞれのヌクレオチド配列の長さは、約500ヌクレオチ
ド～約10,000ヌクレオチドである。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかの
いくつかの態様において、少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれのヌクレオチド配
列の長さは、500ヌクレオチド～5,000ヌクレオチドである。
【0047】
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、組成物
中の異なるベクターの数は2つである。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれ
かのいくつかの態様において、2つの異なるベクターのうちの第1のベクターは、オトフェ
リンタンパク質のN末端部分をコードするコード配列を含む。本明細書に記載されている
組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、オトフェリンタンパク質のN末端部
分の長さは、30アミノ酸～1600アミノ酸である。本明細書に記載されている組成物のうち
のいずれかのいくつかの態様において、オトフェリンタンパク質のN末端部分の長さは、2
00アミノ酸～1500アミノ酸である。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかの
いくつかの態様において、第1のベクターは、プロモーターおよびKozak配列のうちの一方
または両方をさらに含む。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつか
の態様において、第1のベクターは、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または
組織特異的プロモーターであるプロモーターを含む。
中の異なるベクターの数は2つである。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれ
かのいくつかの態様において、2つの異なるベクターのうちの第1のベクターは、オトフェ
リンタンパク質のN末端部分をコードするコード配列を含む。本明細書に記載されている
組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、オトフェリンタンパク質のN末端部
分の長さは、30アミノ酸～1600アミノ酸である。本明細書に記載されている組成物のうち
のいずれかのいくつかの態様において、オトフェリンタンパク質のN末端部分の長さは、2
00アミノ酸～1500アミノ酸である。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかの
いくつかの態様において、第1のベクターは、プロモーターおよびKozak配列のうちの一方
または両方をさらに含む。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつか
の態様において、第1のベクターは、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または
組織特異的プロモーターであるプロモーターを含む。
【0048】
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、2つの
異なるベクターのうちの第2のベクターは、オトフェリンタンパク質のC末端部分をコード
するコード配列を含む。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの
態様において、オトフェリンタンパク質のC末端部分の長さは、30アミノ酸～1600アミノ
酸である。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において
、オトフェリンタンパク質のC末端部分の長さは、200アミノ酸～1500アミノ酸である。本
明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、第2のベク
ターは、ポリ(dA)シグナル配列をさらに含む。本明細書に記載されている組成物のうちの
いずれかのいくつかの態様において、第2のベクターは、mRNA安定化のための配列をさら
に含む。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様は、薬学的
に許容される賦形剤をさらに含む。
異なるベクターのうちの第2のベクターは、オトフェリンタンパク質のC末端部分をコード
するコード配列を含む。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの
態様において、オトフェリンタンパク質のC末端部分の長さは、30アミノ酸～1600アミノ
酸である。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において
、オトフェリンタンパク質のC末端部分の長さは、200アミノ酸～1500アミノ酸である。本
明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、第2のベク
ターは、ポリ(dA)シグナル配列をさらに含む。本明細書に記載されている組成物のうちの
いずれかのいくつかの態様において、第2のベクターは、mRNA安定化のための配列をさら
に含む。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様は、薬学的
に許容される賦形剤をさらに含む。
【0049】
また、本明細書において、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを含むキ
ットも提供される。本明細書に記載されているキットのうちのいずれかのいくつかの態様
は、組成物を含有する充填済みシリンジをさらに含む。
ットも提供される。本明細書に記載されているキットのうちのいずれかのいくつかの態様
は、組成物を含有する充填済みシリンジをさらに含む。
【0050】
また、本明細書において、治療的有効量の本明細書に記載されている組成物のうちのい
ずれかを哺乳動物の蝸牛内に導入する工程を含む方法も提供される。本明細書に記載され
ている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、哺乳動物はヒトである。本明
細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、哺乳動物は、
欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている。
ずれかを哺乳動物の蝸牛内に導入する工程を含む方法も提供される。本明細書に記載され
ている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、哺乳動物はヒトである。本明
細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、哺乳動物は、
欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている。
【0051】
また、本明細書において、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを哺乳動
物細胞内に導入する工程を含む、哺乳動物細胞において全長オトフェリンタンパク質の発
現を増大させる方法も提供される。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのい
くつかの態様において、哺乳動物細胞は蝸牛内有毛細胞である。本明細書に記載されてい
る方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。本
明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、哺乳動物細胞
は、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に判定されている。
物細胞内に導入する工程を含む、哺乳動物細胞において全長オトフェリンタンパク質の発
現を増大させる方法も提供される。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのい
くつかの態様において、哺乳動物細胞は蝸牛内有毛細胞である。本明細書に記載されてい
る方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。本
明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、哺乳動物細胞
は、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に判定されている。
【0052】
また、本明細書において、治療的有効量の本明細書に記載されている組成物のうちのい
ずれかを哺乳動物の蝸牛内に導入する工程を含む、哺乳動物の蝸牛の内有毛細胞において
全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法も提供される。本明細書に記載され
ている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、哺乳動物は、欠陥オトフェリン
遺伝子を有すると以前に特定されている。本明細書に記載されている方法のうちのいずれ
かのいくつかの態様において、哺乳動物はヒトである。
ずれかを哺乳動物の蝸牛内に導入する工程を含む、哺乳動物の蝸牛の内有毛細胞において
全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法も提供される。本明細書に記載され
ている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、哺乳動物は、欠陥オトフェリン
遺伝子を有すると以前に特定されている。本明細書に記載されている方法のうちのいずれ
かのいくつかの態様において、哺乳動物はヒトである。
【0053】
また、本明細書において、治療的有効量の本明細書に記載されている組成物のうちのい
ずれか1つの組成物を対象の蝸牛内に投与する工程を含む、欠陥オトフェリン遺伝子を有
すると特定された対象において非症候性感音難聴を治療する方法も提供される。本明細書
に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、対象はヒトである。
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様は、投与する工程の前
に、対象が欠陥オトフェリン遺伝子を有することを判定する工程をさらに含む。
ずれか1つの組成物を対象の蝸牛内に投与する工程を含む、欠陥オトフェリン遺伝子を有
すると特定された対象において非症候性感音難聴を治療する方法も提供される。本明細書
に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、対象はヒトである。
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様は、投与する工程の前
に、対象が欠陥オトフェリン遺伝子を有することを判定する工程をさらに含む。
【0054】
また、本明細書において、2つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、該2つの異
なる核酸ベクターのうちの第1の核酸ベクターが、プロモーター、該プロモーターの3'側
に位置づけられたオトフェリンタンパク質のN末端部分をコードする第1のコード配列、お
よび該第1のコード配列の3'末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列を
含み；かつ該2つの異なる核酸ベクターのうちの第2の核酸ベクターが、スプライシングア
クセプターシグナル配列、該スプライシングアクセプターシグナル配列の3'末端に位置づ
けられたオトフェリンタンパク質のC末端部分をコードする第2のコード配列、および該第
2のコード配列の3'末端のポリアデニル化配列を含み；コードされる部分のそれぞれの長
さが少なくとも30アミノ酸残基であり、該コードされる部分のアミノ酸配列が重複せず、
該2つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク
質をコードしておらず、かつ、該コード配列が哺乳動物細胞において転写されてRNA転写
産物が生成されると、一方の転写産物上のスプライシングドナーシグナル配列ともう一方
の転写産物上のスプライシングアクセプターシグナル配列との間でスプライシングが起こ
り、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換えRNA分子が形成され
る、前記組成物も提供される。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいく
つかの態様において、ベクターのうちの少なくとも1つのベクターのコード配列は、オト
フェリンゲノムDNAの2つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ該2つ
の隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いている。
なる核酸ベクターのうちの第1の核酸ベクターが、プロモーター、該プロモーターの3'側
に位置づけられたオトフェリンタンパク質のN末端部分をコードする第1のコード配列、お
よび該第1のコード配列の3'末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列を
含み；かつ該2つの異なる核酸ベクターのうちの第2の核酸ベクターが、スプライシングア
クセプターシグナル配列、該スプライシングアクセプターシグナル配列の3'末端に位置づ
けられたオトフェリンタンパク質のC末端部分をコードする第2のコード配列、および該第
2のコード配列の3'末端のポリアデニル化配列を含み；コードされる部分のそれぞれの長
さが少なくとも30アミノ酸残基であり、該コードされる部分のアミノ酸配列が重複せず、
該2つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク
質をコードしておらず、かつ、該コード配列が哺乳動物細胞において転写されてRNA転写
産物が生成されると、一方の転写産物上のスプライシングドナーシグナル配列ともう一方
の転写産物上のスプライシングアクセプターシグナル配列との間でスプライシングが起こ
り、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換えRNA分子が形成され
る、前記組成物も提供される。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいく
つかの態様において、ベクターのうちの少なくとも1つのベクターのコード配列は、オト
フェリンゲノムDNAの2つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ該2つ
の隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いている。
【0055】
また、本明細書において、プロモーター、該プロモーターの3'側に位置づけられたオト
フェリンタンパク質のN末端部分をコードする第1のコード配列、該第1のコード配列の3'
末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列、および該スプライシングドナ
ーシグナル配列の3'側に位置づけられた第1の検出可能なマーカー遺伝子を含む、第1の核
酸ベクター；ならびに、第2の検出可能なマーカー遺伝子、該第2の検出可能なマーカー遺
伝子の3'側に位置づけられたスプライシングアクセプターシグナル配列、該スプライシン
グアクセプターシグナル配列の3'末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質のC末端
部分をコードする第2のコード配列、および該第2のコード配列の3'末端に位置づけられた
ポリアデニル化配列を含む、該第1の核酸ベクターとは異なる第2の核酸ベクターを含む組
成物であって；コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも30アミノ酸残基であり、
該コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が相互に重複せず、2つの異なるベクター
のうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず、
かつ、該コード配列が哺乳動物細胞において転写されてRNA転写産物が生成されると、一
方の転写産物上のスプライシングドナーシグナルともう一方の転写産物上のスプライシン
グアクセプターシグナルとの間でスプライシングが起こり、それによって、全長オトフェ
リンタンパク質をコードする組換えRNA分子が形成される、前記組成物も提供される。本
明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、ベクターの
うちの少なくとも1つのベクターのコード配列は、オトフェリンゲノムDNAの2つの隣接す
るエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ該2つの隣接するエクソンの間のイント
ロン配列を欠いている。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの
態様において、第1または第2の検出可能なマーカー遺伝子はアルカリホスファターゼをコ
ードする。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において
、第1および第2の検出可能なマーカー遺伝子は同じである。
フェリンタンパク質のN末端部分をコードする第1のコード配列、該第1のコード配列の3'
末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列、および該スプライシングドナ
ーシグナル配列の3'側に位置づけられた第1の検出可能なマーカー遺伝子を含む、第1の核
酸ベクター；ならびに、第2の検出可能なマーカー遺伝子、該第2の検出可能なマーカー遺
伝子の3'側に位置づけられたスプライシングアクセプターシグナル配列、該スプライシン
グアクセプターシグナル配列の3'末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質のC末端
部分をコードする第2のコード配列、および該第2のコード配列の3'末端に位置づけられた
ポリアデニル化配列を含む、該第1の核酸ベクターとは異なる第2の核酸ベクターを含む組
成物であって；コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも30アミノ酸残基であり、
該コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が相互に重複せず、2つの異なるベクター
のうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず、
かつ、該コード配列が哺乳動物細胞において転写されてRNA転写産物が生成されると、一
方の転写産物上のスプライシングドナーシグナルともう一方の転写産物上のスプライシン
グアクセプターシグナルとの間でスプライシングが起こり、それによって、全長オトフェ
リンタンパク質をコードする組換えRNA分子が形成される、前記組成物も提供される。本
明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、ベクターの
うちの少なくとも1つのベクターのコード配列は、オトフェリンゲノムDNAの2つの隣接す
るエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ該2つの隣接するエクソンの間のイント
ロン配列を欠いている。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの
態様において、第1または第2の検出可能なマーカー遺伝子はアルカリホスファターゼをコ
ードする。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において
、第1および第2の検出可能なマーカー遺伝子は同じである。
【0056】
また、本明細書において、プロモーター、該プロモーターの3'側に位置づけられたオト
フェリンタンパク質のN末端部分をコードする第1のコード配列、該第1のコード配列の3'
末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列、および該スプライシングドナ
ーシグナル配列の3'側に位置づけられた高度に組換え誘導性の配列（例えば、F1ファージ
の組換え誘導性領域）を含む、第1の核酸ベクター；ならびに、第2の高度に組換え誘導性
の配列（例えば、F1ファージの組換え誘導性領域）、該第2の高度に組換え誘導性の配列
（例えば、F1ファージの組換え誘導性領域）の3'側に位置づけられたスプライシングアク
セプターシグナル配列、該スプライシングアクセプターシグナル配列の3'末端に位置づけ
られたオトフェリンタンパク質のC末端部分をコードする第2のコード配列、および該第2
のコード配列の3'末端に位置づけられたポリアデニル化配列を含む、該第1の核酸ベクタ
ーとは異なる第2の核酸ベクターを含む組成物であって；コードされる部分のそれぞれの
長さが少なくとも30アミノ酸残基であり、該コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列
が相互に重複せず、2つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オト
フェリンタンパク質をコードしておらず、かつ、該コード配列が哺乳動物細胞において転
写されてRNA転写産物が生成されると、一方の転写産物上のスプライシングドナーシグナ
ルともう一方の転写産物上のスプライシングアクセプターシグナルとの間でスプライシン
グが起こり、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換えRNA分子が
形成される、前記組成物も提供される。
フェリンタンパク質のN末端部分をコードする第1のコード配列、該第1のコード配列の3'
末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列、および該スプライシングドナ
ーシグナル配列の3'側に位置づけられた高度に組換え誘導性の配列（例えば、F1ファージ
の組換え誘導性領域）を含む、第1の核酸ベクター；ならびに、第2の高度に組換え誘導性
の配列（例えば、F1ファージの組換え誘導性領域）、該第2の高度に組換え誘導性の配列
（例えば、F1ファージの組換え誘導性領域）の3'側に位置づけられたスプライシングアク
セプターシグナル配列、該スプライシングアクセプターシグナル配列の3'末端に位置づけ
られたオトフェリンタンパク質のC末端部分をコードする第2のコード配列、および該第2
のコード配列の3'末端に位置づけられたポリアデニル化配列を含む、該第1の核酸ベクタ
ーとは異なる第2の核酸ベクターを含む組成物であって；コードされる部分のそれぞれの
長さが少なくとも30アミノ酸残基であり、該コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列
が相互に重複せず、2つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オト
フェリンタンパク質をコードしておらず、かつ、該コード配列が哺乳動物細胞において転
写されてRNA転写産物が生成されると、一方の転写産物上のスプライシングドナーシグナ
ルともう一方の転写産物上のスプライシングアクセプターシグナルとの間でスプライシン
グが起こり、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換えRNA分子が
形成される、前記組成物も提供される。
【0057】
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、ベクタ
ーのうちの少なくとも1つのベクターのコード配列は、オトフェリンゲノムDNAの2つの隣
接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ該2つの隣接するエクソンの間のイ
ントロン配列を欠いている。
ーのうちの少なくとも1つのベクターのコード配列は、オトフェリンゲノムDNAの2つの隣
接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ該2つの隣接するエクソンの間のイ
ントロン配列を欠いている。
【0058】
また、本明細書において、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを含むキ
ットも提供される。本明細書に記載されているキットのうちのいずれかのいくつかの態様
は、組成物を含有する充填済みシリンジをさらに含む。
ットも提供される。本明細書に記載されているキットのうちのいずれかのいくつかの態様
は、組成物を含有する充填済みシリンジをさらに含む。
【0059】
また、本明細書において、治療的有効量の本明細書に記載されている組成物のうちのい
ずれかを哺乳動物の蝸牛内に導入する工程を含む方法も提供される。本明細書に記載され
ている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、哺乳動物はヒトである。本明細
書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、哺乳動物は、欠陥
オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている。
ずれかを哺乳動物の蝸牛内に導入する工程を含む方法も提供される。本明細書に記載され
ている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、哺乳動物はヒトである。本明細
書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、哺乳動物は、欠陥
オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている。
【0060】
また、本明細書において、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを哺乳動
物細胞内に導入する工程を含む、哺乳動物細胞において全長オトフェリンタンパク質の発
現を増大させる方法も提供される。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのい
くつかの態様において、哺乳動物細胞は蝸牛内有毛細胞である。本明細書に記載されてい
る方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。本
明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、哺乳動物細胞
は、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に判定されている。
物細胞内に導入する工程を含む、哺乳動物細胞において全長オトフェリンタンパク質の発
現を増大させる方法も提供される。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのい
くつかの態様において、哺乳動物細胞は蝸牛内有毛細胞である。本明細書に記載されてい
る方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。本
明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、哺乳動物細胞
は、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に判定されている。
【0061】
また、本明細書において、治療的有効量の本明細書に記載されている組成物のうちのい
ずれかを蝸牛内に導入する工程を含む、哺乳動物の蝸牛の内有毛細胞において全長オトフ
ェリンタンパク質の発現を増大させる方法も提供される。本明細書に記載されている方法
のうちのいずれかのいくつかの態様において、哺乳動物は、欠陥オトフェリン遺伝子を有
すると以前に特定されている。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつ
かの態様において、哺乳動物はヒトである。
ずれかを蝸牛内に導入する工程を含む、哺乳動物の蝸牛の内有毛細胞において全長オトフ
ェリンタンパク質の発現を増大させる方法も提供される。本明細書に記載されている方法
のうちのいずれかのいくつかの態様において、哺乳動物は、欠陥オトフェリン遺伝子を有
すると以前に特定されている。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつ
かの態様において、哺乳動物はヒトである。
【0062】
また、本明細書において、治療的有効量の本明細書に記載されている組成物のうちのい
ずれかを対象の蝸牛内に投与する工程を含む、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると特定さ
れた対象において非症候性感音難聴を治療する方法も提供される。本明細書に記載されて
いる方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、対象はヒトである。本明細書に記
載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様は、投与する工程の前に、対象が欠
陥オトフェリン遺伝子を有することを判定する工程をさらに含む。
ずれかを対象の蝸牛内に投与する工程を含む、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると特定さ
れた対象において非症候性感音難聴を治療する方法も提供される。本明細書に記載されて
いる方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、対象はヒトである。本明細書に記
載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様は、投与する工程の前に、対象が欠
陥オトフェリン遺伝子を有することを判定する工程をさらに含む。
【0063】
本明細書において、複数のアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを含む治療用組成物で
あって、該複数のAAVベクターが、該治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞にお
いて聴覚系ポリペプチド（auditory polypeptide）のメッセンジャーRNAを構成する能力
を有する、前記治療用組成物が提供される。
あって、該複数のAAVベクターが、該治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞にお
いて聴覚系ポリペプチド（auditory polypeptide）のメッセンジャーRNAを構成する能力
を有する、前記治療用組成物が提供される。
【0064】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、
複数のAAVベクターは、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において全長聴覚
系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力を有する。
複数のAAVベクターは、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において全長聴覚
系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力を有する。
【0065】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様は、第1のA
AVベクターおよび第2のAAVベクターをさらに含み、該第1および第2のAAVベクターは独立
して、約6kb未満のパッケージング能力を有する。
AVベクターおよび第2のAAVベクターをさらに含み、該第1および第2のAAVベクターは独立
して、約6kb未満のパッケージング能力を有する。
【0066】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、
聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAは、オトフェリンおよびそのオルソログまたは
ホモログの群から選択される聴覚系ポリペプチドをコードする。
聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAは、オトフェリンおよびそのオルソログまたは
ホモログの群から選択される聴覚系ポリペプチドをコードする。
【0067】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様は、Cav1.3
；バスーン（bassoon）、ピッコロ（piccolo）、リブアイ（ribeye）、およびハーモニン
（harmonin）から選択される足場タンパク質；Vglut3；シナプトタグミン；小胞テザリン
グ/ドッキングタンパク質；小胞プライミングタンパク質；小胞融合タンパク質；GluA2/3
；ならびにGluA4からなる群より選択される聴覚系ポリペプチドをコードする聴覚系ポリ
ペプチドのメッセンジャーRNAをコードする核酸配列を含む、核酸（例えば、ベクター）
をさらに含むことができる。
；バスーン（bassoon）、ピッコロ（piccolo）、リブアイ（ribeye）、およびハーモニン
（harmonin）から選択される足場タンパク質；Vglut3；シナプトタグミン；小胞テザリン
グ/ドッキングタンパク質；小胞プライミングタンパク質；小胞融合タンパク質；GluA2/3
；ならびにGluA4からなる群より選択される聴覚系ポリペプチドをコードする聴覚系ポリ
ペプチドのメッセンジャーRNAをコードする核酸配列を含む、核酸（例えば、ベクター）
をさらに含むことができる。
【0068】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、
第1のAAVベクターは、CBA、CMV、またはCB7プロモーターから選択される少なくとも1つの
プロモーター配列をさらに含む。
第1のAAVベクターは、CBA、CMV、またはCB7プロモーターから選択される少なくとも1つの
プロモーター配列をさらに含む。
【0069】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、
第1のAAVベクターは、蝸牛特異的プロモーターから選択される少なくとも1つのプロモー
ター配列をさらに含む。
第1のAAVベクターは、蝸牛特異的プロモーターから選択される少なくとも1つのプロモー
ター配列をさらに含む。
【0070】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、
治療用組成物は、蝸牛内投与用に製剤化されている。本明細書に記載されている治療用組
成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、治療用組成物は、脂質ナノ粒子を含む
ように製剤化されている。本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのい
くつかの態様において、治療用組成物は、ポリマーナノ粒子を含むように製剤化されてい
る。本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において
、治療用組成物は、小環状DNAを含むように製剤化されている。本明細書に記載されてい
る治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、治療用組成物は、CELiD DN
Aを含むように製剤化されている。本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいず
れかのいくつかの態様において、治療用組成物は、合成外リンパ液を含むように製剤化さ
れている。本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様に
おいて、治療用組成物は、20～200 mM NaCl；1～5 mM KCl；0.1～10 mM CaCl2；1～10 mM
グルコース；および2～50mM HEPESを含み、約6～約9のpHを有する合成外リンパ液を含む
ように製剤化されている。
治療用組成物は、蝸牛内投与用に製剤化されている。本明細書に記載されている治療用組
成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、治療用組成物は、脂質ナノ粒子を含む
ように製剤化されている。本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのい
くつかの態様において、治療用組成物は、ポリマーナノ粒子を含むように製剤化されてい
る。本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において
、治療用組成物は、小環状DNAを含むように製剤化されている。本明細書に記載されてい
る治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、治療用組成物は、CELiD DN
Aを含むように製剤化されている。本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいず
れかのいくつかの態様において、治療用組成物は、合成外リンパ液を含むように製剤化さ
れている。本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様に
おいて、治療用組成物は、20～200 mM NaCl；1～5 mM KCl；0.1～10 mM CaCl2；1～10 mM
グルコース；および2～50mM HEPESを含み、約6～約9のpHを有する合成外リンパ液を含む
ように製剤化されている。
【0071】
また、本明細書において、聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを含む治療用組成
物も提供される。
物も提供される。
【0072】
また、本明細書において、1つまたは複数のアデノウイルス（AV）ベクターを含む治療
用組成物であって、該1つまたは複数のAVベクターが、該治療用組成物が投与されるヒト
対象の標的細胞において聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力を有す
る、前記治療用組成物も提供される。
用組成物であって、該1つまたは複数のAVベクターが、該治療用組成物が投与されるヒト
対象の標的細胞において聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力を有す
る、前記治療用組成物も提供される。
【0073】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、
1つまたは複数のAVベクターは、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において
全長聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力を有する。
1つまたは複数のAVベクターは、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において
全長聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力を有する。
【0074】
また、本明細書において、1つまたは複数のレンチウイルスベクターを含む治療用組成
物であって、該1つまたは複数のレンチウイルスベクターが、該治療用組成物が投与され
るヒト対象の標的細胞において聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力
を有する、前記治療用組成物も提供される。
物であって、該1つまたは複数のレンチウイルスベクターが、該治療用組成物が投与され
るヒト対象の標的細胞において聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力
を有する、前記治療用組成物も提供される。
【0075】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、
1つまたは複数のレンチウイルスベクターは、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的
細胞において全長聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力を有する。
1つまたは複数のレンチウイルスベクターは、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的
細胞において全長聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力を有する。
【0076】
また、本明細書において、i）第1の切開点で第1の切開部をヒト対象の蝸牛内に導入す
る工程；ii）有効用量の治療用組成物（例えば、本明細書に記載されている治療用組成物
のうちのいずれか）を蝸牛内投与する工程を含む、外科的方法も提供される。
る工程；ii）有効用量の治療用組成物（例えば、本明細書に記載されている治療用組成物
のうちのいずれか）を蝸牛内投与する工程を含む、外科的方法も提供される。
【0077】
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、治療用組
成物は、第1の切開点で対象に投与される。本明細書に記載されている方法のうちのいず
れかのいくつかの態様において、治療用組成物は、第1の切開部中にまたはそれを通して
対象に投与される。
成物は、第1の切開点で対象に投与される。本明細書に記載されている方法のうちのいず
れかのいくつかの態様において、治療用組成物は、第1の切開部中にまたはそれを通して
対象に投与される。
【0078】
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、治療用組
成物は、蝸牛卵円窓膜内にまたはそれを通して対象に投与される。本明細書に記載されて
いる方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、治療用組成物は、蝸牛正円窓膜内
にまたはそれを通して対象に投与される。
成物は、蝸牛卵円窓膜内にまたはそれを通して対象に投与される。本明細書に記載されて
いる方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、治療用組成物は、蝸牛正円窓膜内
にまたはそれを通して対象に投与される。
【0079】
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、治療用組
成物は、正円窓膜に複数の切開部を作出する能力を有する医療用デバイスを用いて投与さ
れる。
成物は、正円窓膜に複数の切開部を作出する能力を有する医療用デバイスを用いて投与さ
れる。
【0080】
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、医療用デ
バイスは、複数のマイクロニードルを含む。本明細書に記載されている方法のうちのいず
れかのいくつかの態様において、医療用デバイスは、概ね円形の第1の面を含む複数のマ
イクロニードルを含み、ここで、各マイクロニードルは、少なくとも約10ミクロンの直径
を有する。
バイスは、複数のマイクロニードルを含む。本明細書に記載されている方法のうちのいず
れかのいくつかの態様において、医療用デバイスは、概ね円形の第1の面を含む複数のマ
イクロニードルを含み、ここで、各マイクロニードルは、少なくとも約10ミクロンの直径
を有する。
【0081】
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、医療用デ
バイスは、治療用組成物を保持する能力を有する基部および/またはリザーバーを含む。
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、医療用デバ
イスは、治療用組成物を移す能力を有する内腔を個々に含む、複数の中空マイクロニード
ルを含む。
バイスは、治療用組成物を保持する能力を有する基部および/またはリザーバーを含む。
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、医療用デバ
イスは、治療用組成物を移す能力を有する内腔を個々に含む、複数の中空マイクロニード
ルを含む。
【0082】
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、医療用デ
バイスは、少なくとも不完全真空を発生させるための手段を含む。
バイスは、少なくとも不完全真空を発生させるための手段を含む。
【0083】
また、本明細書において、i）その必要があるヒト対象の内耳の円形窓膜に複数の切開
部を作出する能力を有する医療用デバイス、およびii）複数のアデノ随伴ウイルス（AAV
）ベクターを含む治療用組成物であって、該複数のAAVベクターが内耳の標的細胞におい
て全長聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力を有する、前記治療用組
成物の有効用量を含む、治療用送達システムも提供される。
部を作出する能力を有する医療用デバイス、およびii）複数のアデノ随伴ウイルス（AAV
）ベクターを含む治療用組成物であって、該複数のAAVベクターが内耳の標的細胞におい
て全長聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力を有する、前記治療用組
成物の有効用量を含む、治療用送達システムも提供される。
【0084】
また、本明細書において、i）有効用量の治療用組成物（例えば、本明細書に記載され
ている治療用組成物のうちのいずれか）を、その必要があるヒト対象に蝸牛内投与する工
程であって、該治療用組成物が、a）正円窓膜に複数の切開部を作出するための手段、お
よびb）有効用量の該治療用組成物を含む、医療用デバイスを用いることによって投与さ
れ得る、前記工程を含む、外科的方法を実施するための手段も提供される。
ている治療用組成物のうちのいずれか）を、その必要があるヒト対象に蝸牛内投与する工
程であって、該治療用組成物が、a）正円窓膜に複数の切開部を作出するための手段、お
よびb）有効用量の該治療用組成物を含む、医療用デバイスを用いることによって投与さ
れ得る、前記工程を含む、外科的方法を実施するための手段も提供される。
【0085】
本明細書に記載されている外科的方法を実施するための手段のうちのいずれかのいくつ
かの態様において、医療用デバイスは、複数のマイクロニードルを含む。
かの態様において、医療用デバイスは、複数のマイクロニードルを含む。
【0086】
また、本明細書において、単一のアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを含む治療用組
成物であって、該AAVベクターが、該治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞にお
いて聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力を有する、前記治療用組成
物も提供される。
成物であって、該AAVベクターが、該治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞にお
いて聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力を有する、前記治療用組成
物も提供される。
【0087】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、
単一のAAVベクターが、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において全長聴覚
系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力を有する。本明細書に記載されてい
る方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、活性オトフェリンタンパク質（例え
ば、本明細書に記載されている短縮された活性オトフェリンタンパク質のうちのいずれか
）をコードする配列を含む単一のベクター（例えば、本明細書に記載されているベクター
のうちのいずれか）を、対象に投与することができる。
単一のAAVベクターが、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において全長聴覚
系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力を有する。本明細書に記載されてい
る方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、活性オトフェリンタンパク質（例え
ば、本明細書に記載されている短縮された活性オトフェリンタンパク質のうちのいずれか
）をコードする配列を含む単一のベクター（例えば、本明細書に記載されているベクター
のうちのいずれか）を、対象に投与することができる。
【0088】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、
治療用組成物は、AAVベクター以外の第2のベクターをさらに含み、ここで、単一のAAVベ
クターおよび第2のベクターは独立して、約6kb未満のパッケージング能力を有する。
治療用組成物は、AAVベクター以外の第2のベクターをさらに含み、ここで、単一のAAVベ
クターおよび第2のベクターは独立して、約6kb未満のパッケージング能力を有する。
【0089】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、
聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAは、オトフェリンおよびそのオルソログまたは
ホモログの群から選択される聴覚系ポリペプチドをコードする。
聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAは、オトフェリンおよびそのオルソログまたは
ホモログの群から選択される聴覚系ポリペプチドをコードする。
【0090】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、
聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAは、オトフェリンおよびその短縮変異体の群か
ら選択される聴覚系ポリペプチドをコードする。
聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAは、オトフェリンおよびその短縮変異体の群か
ら選択される聴覚系ポリペプチドをコードする。
【0091】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、
オトフェリン短縮変異体は、以下のうちの少なくとも1つのC2ドメインを含む。
オトフェリン短縮変異体は、以下のうちの少なくとも1つのC2ドメインを含む。
【0092】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、
オトフェリン短縮変異体は、内在性オトフェリンポリペプチドのC末端領域を含まない。
オトフェリン短縮変異体は、内在性オトフェリンポリペプチドのC末端領域を含まない。
【0093】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、
聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAは、Cav1.3；バスーン、ピッコロ、リブアイ、
およびハーモニンから選択される足場タンパク質；Vglut3；シナプトタグミン；小胞テザ
リング/ドッキングタンパク質；小胞プライミングタンパク質；小胞融合タンパク質；Glu
A2/3；ならびにGluA4からなる群より選択される聴覚系ポリペプチドをコードする。
聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAは、Cav1.3；バスーン、ピッコロ、リブアイ、
およびハーモニンから選択される足場タンパク質；Vglut3；シナプトタグミン；小胞テザ
リング/ドッキングタンパク質；小胞プライミングタンパク質；小胞融合タンパク質；Glu
A2/3；ならびにGluA4からなる群より選択される聴覚系ポリペプチドをコードする。
【0094】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、
単一のAAVベクターは、CBA、CMV、またはCB7プロモーターから選択される少なくとも1つ
のプロモーター配列をさらに含む。
単一のAAVベクターは、CBA、CMV、またはCB7プロモーターから選択される少なくとも1つ
のプロモーター配列をさらに含む。
【0095】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、
単一のAAVベクターは、蝸牛特異的プロモーターから選択される少なくとも1つのプロモー
ター配列をさらに含む。
単一のAAVベクターは、蝸牛特異的プロモーターから選択される少なくとも1つのプロモー
ター配列をさらに含む。
【0096】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、
治療用組成物は、蝸牛内投与用に製剤化されている。
治療用組成物は、蝸牛内投与用に製剤化されている。
【0097】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、
治療用組成物は、脂質ナノ粒子を含むように製剤化されている。
治療用組成物は、脂質ナノ粒子を含むように製剤化されている。
【0098】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、
治療用組成物は、ポリマーナノ粒子を含むように製剤化されている。
治療用組成物は、ポリマーナノ粒子を含むように製剤化されている。
【0099】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、
治療用組成物は、小環状DNAを含むように製剤化されている。
治療用組成物は、小環状DNAを含むように製剤化されている。
【0100】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、
治療用組成物は、CELiDDNAを含むように製剤化されている。
治療用組成物は、CELiDDNAを含むように製剤化されている。
【0101】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、
治療用組成物は、合成外リンパ液を含むように製剤化されている。
治療用組成物は、合成外リンパ液を含むように製剤化されている。
【0102】
本明細書に記載されている治療用組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、
治療用組成物は、20～200mM NaCl；1～5 mM KCl；0.1～10 mM CaCl2；1～10 mM グルコ
ース；2～50mM HEPESを含み、約6～約9のpHを有する合成外リンパ液を含むように製剤化
されている。
治療用組成物は、20～200mM NaCl；1～5 mM KCl；0.1～10 mM CaCl2；1～10 mM グルコ
ース；2～50mM HEPESを含み、約6～約9のpHを有する合成外リンパ液を含むように製剤化
されている。
【0103】
また、本明細書において、オトフェリン短縮変異体をコードする聴覚系ポリペプチドの
メッセンジャーRNAを含む治療用組成物も提供される。
メッセンジャーRNAを含む治療用組成物も提供される。
【0104】
特に定義されない限り、本明細書において用いられるすべての技術用語および科学用語
は、本発明が属する技術分野において当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味
を有する。
は、本発明が属する技術分野において当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味
を有する。
【0105】
「1つの（a）」および「1つの（an）」という用語は、当該冠詞の文法的対象の1つまた
は複数（すなわち、少なくとも1つ）を指す。例として、「要素（an element）」は、1つ
の要素および複数の要素を包含する。
は複数（すなわち、少なくとも1つ）を指す。例として、「要素（an element）」は、1つ
の要素および複数の要素を包含する。
【0106】
量、時間的持続期間などの測定可能な値に言及する場合の「約」という用語などは、最
大で±20％の変動を包含することを意味している。これらの変動は、指定された値から、
例えば、最大で±10％、またはいくつかの例では±5％、またはいくつかの例では±1％、
またはいくつかの例では±0.1％であることができ、それは、そのような変動が、開示さ
れている方法を実施するのに適切であるためである。
大で±20％の変動を包含することを意味している。これらの変動は、指定された値から、
例えば、最大で±10％、またはいくつかの例では±5％、またはいくつかの例では±1％、
またはいくつかの例では±0.1％であることができ、それは、そのような変動が、開示さ
れている方法を実施するのに適切であるためである。
【0107】
「シグナル伝達ドメイン」という用語は、二次メッセンジャーを生じさせること、また
はそのようなメッセンジャーへの応答によりエフェクターとして機能することによって、
定義されたシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するように、細胞内の情報を伝達す
ることによって作用する、タンパク質の機能的部分を指す。オトフェリンは、内有毛細胞
におけるエキソサイトーシス、および未熟な外有毛細胞における神経伝達物質放出のため
に必要とされるカルシウムセンサーであると考えられている。オトフェリンタンパク質の
6個のC2ドメインのうちの5個（C2B～F）は、溶液中で中程度および低い親和定数でカルシ
ウムイオンに結合する（それぞれ、Kd＝25～95μMおよび400～700μM）（Padmanarayana
et al. 2014Biochem 53:5023-5033）。ホスファチジルセリン（PS）の存在下で、10μM
のカルシウム濃度は、オトフェリンのC2C～C2Eドメインについて有意なC2-リポソーム相
互作用をもたらす。したがって、オトフェリンは、「静電スイッチ」機構を用いて作動す
るように見られるドメイン、およびカルシウムにかかわらず結合するドメインを持つ。プ
レシナプスでの主要なシグナル伝達分子であるPI(4,5)P2は、カルシウム非依存的様式で
、オトフェリンのC2CドメインおよびC2Fドメインと相互作用することが示されている（Pa
dmanarayana etal. 2014 Biochem 53:5023-5033）。
はそのようなメッセンジャーへの応答によりエフェクターとして機能することによって、
定義されたシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するように、細胞内の情報を伝達す
ることによって作用する、タンパク質の機能的部分を指す。オトフェリンは、内有毛細胞
におけるエキソサイトーシス、および未熟な外有毛細胞における神経伝達物質放出のため
に必要とされるカルシウムセンサーであると考えられている。オトフェリンタンパク質の
6個のC2ドメインのうちの5個（C2B～F）は、溶液中で中程度および低い親和定数でカルシ
ウムイオンに結合する（それぞれ、Kd＝25～95μMおよび400～700μM）（Padmanarayana
et al. 2014Biochem 53:5023-5033）。ホスファチジルセリン（PS）の存在下で、10μM
のカルシウム濃度は、オトフェリンのC2C～C2Eドメインについて有意なC2-リポソーム相
互作用をもたらす。したがって、オトフェリンは、「静電スイッチ」機構を用いて作動す
るように見られるドメイン、およびカルシウムにかかわらず結合するドメインを持つ。プ
レシナプスでの主要なシグナル伝達分子であるPI(4,5)P2は、カルシウム非依存的様式で
、オトフェリンのC2CドメインおよびC2Fドメインと相互作用することが示されている（Pa
dmanarayana etal. 2014 Biochem 53:5023-5033）。
【0108】
本明細書において用いられる「抗体」という用語は、抗原と特異的に結合する、免疫グ
ロブリン分子に由来するタンパク質またはポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクロー
ナルもしくはモノクローナル、複数鎖もしくは一本鎖、またはインタクトの免疫グロブリ
ンであることができ、天然供給源または組換え供給源に由来してもよい。抗体は、免疫グ
ロブリン分子の四量体であることができる。「抗体断片」という用語は、インタクト抗体
の少なくとも一部分、またはその組換えバリアントを指し、かつ、抗原などの標的に対す
る抗体断片の認識および特異的結合を付与するのに十分な抗原結合ドメイン（例えば、イ
ンタクト抗体の抗原決定可変領域）を指す。抗体断片の例には、これらに限定されないが
、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片、scFv抗体断片、直鎖状抗体、sdAb（VLまたはVHの
いずれか）などの単一ドメイン抗体、ラクダ科VHHドメイン、および抗体断片から形成さ
れる多重特異性抗体が含まれる。「scFv」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくと
も1つの抗体断片、および重鎖の可変領域を含む少なくとも1つの抗体断片を含む融合タン
パク質を指し、ここで、該軽鎖および重鎖可変領域は、短い可撓性ポリペプチドリンカー
を介して近接して連結されており、一本鎖ポリペプチドとして発現することができ、かつ
、scFvは、それが由来するインタクト抗体の特異性を保持している。指定されない限り、
本明細書において用いられる場合、scFvは、例えば、ポリペプチドのN末端およびC末端に
関して、いずれかの順序でVLおよびVH可変領域を有してもよく、scFvは、VL-リンカー-VH
を含んでもよく、またはVH-リンカー-VLを含んでもよい。
ロブリン分子に由来するタンパク質またはポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクロー
ナルもしくはモノクローナル、複数鎖もしくは一本鎖、またはインタクトの免疫グロブリ
ンであることができ、天然供給源または組換え供給源に由来してもよい。抗体は、免疫グ
ロブリン分子の四量体であることができる。「抗体断片」という用語は、インタクト抗体
の少なくとも一部分、またはその組換えバリアントを指し、かつ、抗原などの標的に対す
る抗体断片の認識および特異的結合を付与するのに十分な抗原結合ドメイン（例えば、イ
ンタクト抗体の抗原決定可変領域）を指す。抗体断片の例には、これらに限定されないが
、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片、scFv抗体断片、直鎖状抗体、sdAb（VLまたはVHの
いずれか）などの単一ドメイン抗体、ラクダ科VHHドメイン、および抗体断片から形成さ
れる多重特異性抗体が含まれる。「scFv」という用語は、軽鎖の可変領域を含む少なくと
も1つの抗体断片、および重鎖の可変領域を含む少なくとも1つの抗体断片を含む融合タン
パク質を指し、ここで、該軽鎖および重鎖可変領域は、短い可撓性ポリペプチドリンカー
を介して近接して連結されており、一本鎖ポリペプチドとして発現することができ、かつ
、scFvは、それが由来するインタクト抗体の特異性を保持している。指定されない限り、
本明細書において用いられる場合、scFvは、例えば、ポリペプチドのN末端およびC末端に
関して、いずれかの順序でVLおよびVH可変領域を有してもよく、scFvは、VL-リンカー-VH
を含んでもよく、またはVH-リンカー-VLを含んでもよい。
【0109】
「組換えポリペプチド」という用語は、組換えDNA技術を用いて作製されるポリペプチ
ド（例えば、ウイルスベクター発現系によって発現するポリペプチド）を指す。この用語
はまた、ポリペプチドをコードするDNA分子の合成によって作製されたポリペプチド（当
該DNA分子によってタンパク質が発現する）、または当該ポリペプチドを特定するアミノ
酸配列を意味するようにも解釈されるべきであり、ここで、該DNAまたはアミノ酸配列は
、当技術分野において利用可能でありかつ周知である組換えDNAまたはアミノ酸配列技術
を用いて得たものである。
ド（例えば、ウイルスベクター発現系によって発現するポリペプチド）を指す。この用語
はまた、ポリペプチドをコードするDNA分子の合成によって作製されたポリペプチド（当
該DNA分子によってタンパク質が発現する）、または当該ポリペプチドを特定するアミノ
酸配列を意味するようにも解釈されるべきであり、ここで、該DNAまたはアミノ酸配列は
、当技術分野において利用可能でありかつ周知である組換えDNAまたはアミノ酸配列技術
を用いて得たものである。
【0110】
「オトフェリン遺伝子における変異」という用語は、野生型オトフェリンタンパク質と
比較して、1個もしくは複数個のアミノ酸の欠失、1個もしくは複数個のアミノ酸置換、お
よび1個もしくは複数個のアミノ酸挿入のうちの1つまたは複数を有するオトフェリンタン
パク質の生成をもたらし、かつ/または、変異を有さない哺乳動物細胞におけるコードさ
れるオトフェリンタンパク質の発現レベルと比較して、哺乳動物細胞におけるコードされ
るオトフェリンタンパク質の発現レベルの減少をもたらす、野生型オトフェリン遺伝子に
おける改変を指す。いくつかの態様において、変異は、1個または複数個のアミノ酸（例
えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個
のアミノ酸）の欠失を有するオトフェリンタンパク質の生成をもたらし得る。いくつかの
態様において、変異は、オトフェリン遺伝子におけるフレームシフトをもたらし得る。「
フレームシフト」という用語は、コード配列のリーディングフレームのシフトをもたらす
、コード配列における任意の変異を包含することが、当技術分野において公知である。い
くつかの態様において、フレームシフトは、非機能的タンパク質をもたらし得る。いくつ
かの態様において、点変異は、ナンセンス変異であり得る（すなわち、遺伝子のエクソン
の途中に終止コドンをもたらす）。ナンセンス変異は、（対応する野生型タンパク質と比
較して）機能的である場合があり、または機能的ではない場合もある短縮型タンパク質の
生成をもたらし得る。いくつかの態様において、変異は、オトフェリンmRNAまたはオトフ
ェリンタンパク質またはmRNAおよびタンパク質の両方の、発現の損失（またはレベルの減
少）をもたらし得る。いくつかの態様において、変異は、野生型オトフェリンタンパク質
と比較して1つまたは複数の生物学的活性（機能）が損失または低下している、変更され
たオトフェリンタンパク質の生成をもたらし得る。
比較して、1個もしくは複数個のアミノ酸の欠失、1個もしくは複数個のアミノ酸置換、お
よび1個もしくは複数個のアミノ酸挿入のうちの1つまたは複数を有するオトフェリンタン
パク質の生成をもたらし、かつ/または、変異を有さない哺乳動物細胞におけるコードさ
れるオトフェリンタンパク質の発現レベルと比較して、哺乳動物細胞におけるコードされ
るオトフェリンタンパク質の発現レベルの減少をもたらす、野生型オトフェリン遺伝子に
おける改変を指す。いくつかの態様において、変異は、1個または複数個のアミノ酸（例
えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個
のアミノ酸）の欠失を有するオトフェリンタンパク質の生成をもたらし得る。いくつかの
態様において、変異は、オトフェリン遺伝子におけるフレームシフトをもたらし得る。「
フレームシフト」という用語は、コード配列のリーディングフレームのシフトをもたらす
、コード配列における任意の変異を包含することが、当技術分野において公知である。い
くつかの態様において、フレームシフトは、非機能的タンパク質をもたらし得る。いくつ
かの態様において、点変異は、ナンセンス変異であり得る（すなわち、遺伝子のエクソン
の途中に終止コドンをもたらす）。ナンセンス変異は、（対応する野生型タンパク質と比
較して）機能的である場合があり、または機能的ではない場合もある短縮型タンパク質の
生成をもたらし得る。いくつかの態様において、変異は、オトフェリンmRNAまたはオトフ
ェリンタンパク質またはmRNAおよびタンパク質の両方の、発現の損失（またはレベルの減
少）をもたらし得る。いくつかの態様において、変異は、野生型オトフェリンタンパク質
と比較して1つまたは複数の生物学的活性（機能）が損失または低下している、変更され
たオトフェリンタンパク質の生成をもたらし得る。
【0111】
いくつかの態様において、変異は、1個または複数個のヌクレオチドのオトフェリン遺
伝子への挿入である。いくつかの態様において、変異は、オトフェリン遺伝子の調節配列
、すなわち、コード配列ではない遺伝子の部分にある。いくつかの態様において、調節配
列における変異は、プロモーターまたはエンハンサー領域にあってもよく、オトフェリン
遺伝子の適正な転写を阻止または低下させ得る。
伝子への挿入である。いくつかの態様において、変異は、オトフェリン遺伝子の調節配列
、すなわち、コード配列ではない遺伝子の部分にある。いくつかの態様において、調節配
列における変異は、プロモーターまたはエンハンサー領域にあってもよく、オトフェリン
遺伝子の適正な転写を阻止または低下させ得る。
【0112】
改変は、部位特異的変異誘発およびPCR媒介性変異誘発などの当技術分野において公知
の標準的な技法によって、ヌクレオチド配列に導入することができる。
の標準的な技法によって、ヌクレオチド配列に導入することができる。
【0113】
「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体または抗体断片の結合
特性に有意に影響を及ぼさないかまたはそれを有意に変更しない、アミノ酸改変を指す。
そのような保存的改変には、アミノ酸置換、付加、および欠失が含まれる。改変は、部位
特異的変異誘発およびPCR媒介性変異誘発などの当技術分野において公知の標準的な技法
によって、本発明の抗体または抗体断片に導入することができる。保存的アミノ酸置換と
は、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものであ
る。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されて
いる。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギ
ニン、およびヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸および
グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、
グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、およびトリプトファン）、非
極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロ
リン、フェニルアラニン、およびメチオニン）、β-分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば
、スレオニン、バリン、およびイソロイシン）、ならびに芳香族側鎖を有するアミノ酸（
例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびヒスチジン）が含まれる
。
特性に有意に影響を及ぼさないかまたはそれを有意に変更しない、アミノ酸改変を指す。
そのような保存的改変には、アミノ酸置換、付加、および欠失が含まれる。改変は、部位
特異的変異誘発およびPCR媒介性変異誘発などの当技術分野において公知の標準的な技法
によって、本発明の抗体または抗体断片に導入することができる。保存的アミノ酸置換と
は、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものであ
る。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されて
いる。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギ
ニン、およびヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸および
グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、
グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、およびトリプトファン）、非
極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロ
リン、フェニルアラニン、およびメチオニン）、β-分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば
、スレオニン、バリン、およびイソロイシン）、ならびに芳香族側鎖を有するアミノ酸（
例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびヒスチジン）が含まれる
。
【0114】
「コードする」という用語は、遺伝子、cDNA、またはmRNAなどのポリヌクレオチドにお
けるヌクレオチドの特定の配列の、遺伝コードにしたがって、アミノ酸の定義された配列
の合成のための鋳型として働く固有の特性を指す。したがって、遺伝子、cDNA、またはRN
Aは、その遺伝子、cDNA、またはRNAに対応するmRNAの転写および翻訳によってタンパク質
が生成されるならば、タンパク質をコードしている。そのヌクレオチド配列が、mRNA配列
と同一であり、配列表において通常提供されるコード鎖、および、転写のための鋳型とし
て用いられる非コード鎖は両方とも、タンパク質産物をコードするとして言及され得る。
けるヌクレオチドの特定の配列の、遺伝コードにしたがって、アミノ酸の定義された配列
の合成のための鋳型として働く固有の特性を指す。したがって、遺伝子、cDNA、またはRN
Aは、その遺伝子、cDNA、またはRNAに対応するmRNAの転写および翻訳によってタンパク質
が生成されるならば、タンパク質をコードしている。そのヌクレオチド配列が、mRNA配列
と同一であり、配列表において通常提供されるコード鎖、および、転写のための鋳型とし
て用いられる非コード鎖は両方とも、タンパク質産物をコードするとして言及され得る。
【0115】
「相同」または「同一性」という用語は、2つのポリマー分子間、例えば、2つのDNA分
子もしくは2つのRNA分子などの2つの核酸分子間、または2つのポリペプチド分子間のサブ
ユニット配列同一性を指す。2つの分子の両方におけるサブユニットの位置が、同じ単量
体サブユニットによって占められている場合；例えば、2つのDNA分子のそれぞれにおける
ある位置がアデニンによって占められている場合、それらは、その位置で相同または同一
である。2つの配列間の相同性は、一致するかまたは相同な位置の数の一次関数であり；
例えば、2つの配列における位置の半分（例えば、10個のサブユニットの長さのポリマー
における5個の位置）が相同であるならば、2つの配列は50％相同であり；位置の90％（例
えば、10個のうち9個）が一致するかまたは相同であるならば、2つの配列は90％相同であ
る。
子もしくは2つのRNA分子などの2つの核酸分子間、または2つのポリペプチド分子間のサブ
ユニット配列同一性を指す。2つの分子の両方におけるサブユニットの位置が、同じ単量
体サブユニットによって占められている場合；例えば、2つのDNA分子のそれぞれにおける
ある位置がアデニンによって占められている場合、それらは、その位置で相同または同一
である。2つの配列間の相同性は、一致するかまたは相同な位置の数の一次関数であり；
例えば、2つの配列における位置の半分（例えば、10個のサブユニットの長さのポリマー
における5個の位置）が相同であるならば、2つの配列は50％相同であり；位置の90％（例
えば、10個のうち9個）が一致するかまたは相同であるならば、2つの配列は90％相同であ
る。
【0116】
特に指定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、相互の縮
重バージョンであり、したがって同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配
列を含む。タンパク質をコードするヌクレオチド配列はまた、イントロンを含んでもよい
。
重バージョンであり、したがって同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配
列を含む。タンパク質をコードするヌクレオチド配列はまた、イントロンを含んでもよい
。
【0117】
「内在性」という用語は、生物、細胞、組織、または系由来であるか、またはその内部
で生成される任意の物質を指す。
で生成される任意の物質を指す。
【0118】
「外来性」という用語は、生物、細胞、組織、または系の外部由来であるか、またはそ
の外部で生成される任意の物質を指す。
の外部で生成される任意の物質を指す。
【0119】
「単離された」という用語は、天然の状態から変更されたかまたは取り出されたことを
意味する。例えば、生きている動物中に天然に存在する核酸またはペプチドは、「単離さ
れて」いないが、その天然の状態の共存する物質から部分的にまたは完全に分離された同
じ核酸またはペプチドは、「単離されて」いる。単離された核酸またはタンパク質は、実
質的に精製された形態で存在することができ、または、例えば、宿主細胞などのネイティ
ブではない環境中に存在することができる。
意味する。例えば、生きている動物中に天然に存在する核酸またはペプチドは、「単離さ
れて」いないが、その天然の状態の共存する物質から部分的にまたは完全に分離された同
じ核酸またはペプチドは、「単離されて」いる。単離された核酸またはタンパク質は、実
質的に精製された形態で存在することができ、または、例えば、宿主細胞などのネイティ
ブではない環境中に存在することができる。
【0120】
「実質的に精製された細胞」という用語は、他の細胞タイプを本質的に含まない細胞を
指す。実質的に精製された細胞はまた、その天然に存在する状態で通常会合している他の
細胞タイプから分離されている細胞も指す。いくつかの例では、実質的に精製された細胞
の集団は、細胞の均質な集団を指す。他の例では、この用語は、単純に、その天然の状態
で天然で会合している細胞から分離されている細胞を指す。いくつかの局面において、細
胞はインビトロで培養される。他の局面において、細胞はインビトロで培養されない。
指す。実質的に精製された細胞はまた、その天然に存在する状態で通常会合している他の
細胞タイプから分離されている細胞も指す。いくつかの例では、実質的に精製された細胞
の集団は、細胞の均質な集団を指す。他の例では、この用語は、単純に、その天然の状態
で天然で会合している細胞から分離されている細胞を指す。いくつかの局面において、細
胞はインビトロで培養される。他の局面において、細胞はインビトロで培養されない。
【0121】
「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」とい
う用語は、それによって外来性核酸が宿主細胞内に移入されるかまたは導入されるプロセ
スを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入され
た」細胞とは、外来性核酸を用いてトランスフェクトされた、形質転換された、または形
質導入された細胞である。細胞には、初代対象細胞およびその子孫が含まれる。
う用語は、それによって外来性核酸が宿主細胞内に移入されるかまたは導入されるプロセ
スを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入され
た」細胞とは、外来性核酸を用いてトランスフェクトされた、形質転換された、または形
質導入された細胞である。細胞には、初代対象細胞およびその子孫が含まれる。
【0122】
「発現」という用語は、プロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転
写および/または翻訳を指す。
写および/または翻訳を指す。
【0123】
本明細書において用いられる場合、「一過性」とは、ある期間の時間、日、または週に
わたる、組み込まれていない導入遺伝子の発現を指し、該発現の期間は、宿主細胞におい
てゲノム中に組み込まれているか、または安定なプラスミドレプリコン内に含有されてい
る場合の遺伝子の発現の期間未満である。
わたる、組み込まれていない導入遺伝子の発現を指し、該発現の期間は、宿主細胞におい
てゲノム中に組み込まれているか、または安定なプラスミドレプリコン内に含有されてい
る場合の遺伝子の発現の期間未満である。
【0124】
「対象」という用語は、その中で免疫応答が惹起され得る、生きている生物（例えば、
哺乳動物、ヒト）を含むように意図されている。いくつかの態様において、対象は、齧歯
類（例えば、ラットもしくはマウス）、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、非ヒト霊長
類、またはヒトである。いくつかの態様において、対象は、非症候性難聴を有するか、ま
たはそれを発症するリスクがある。いくつかの態様において、対象は、オトフェリン遺伝
子に変異を有すると以前に特定されている。いくつかの態様において、対象は、オトフェ
リン遺伝子に変異を有すると特定されており、かつ非症候性感音難聴を有すると診断され
ている。いくつかの態様において、対象は、非症候性感音難聴を有すると特定されている
。
哺乳動物、ヒト）を含むように意図されている。いくつかの態様において、対象は、齧歯
類（例えば、ラットもしくはマウス）、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、非ヒト霊長
類、またはヒトである。いくつかの態様において、対象は、非症候性難聴を有するか、ま
たはそれを発症するリスクがある。いくつかの態様において、対象は、オトフェリン遺伝
子に変異を有すると以前に特定されている。いくつかの態様において、対象は、オトフェ
リン遺伝子に変異を有すると特定されており、かつ非症候性感音難聴を有すると診断され
ている。いくつかの態様において、対象は、非症候性感音難聴を有すると特定されている
。
【0125】
本明細書において用いられる「治療の（therapeutic）」という用語は、治療（treatme
nt）を意味する。治療効果は、疾患状態の軽減、抑制、寛解、または根絶によって得られ
る。
nt）を意味する。治療効果は、疾患状態の軽減、抑制、寛解、または根絶によって得られ
る。
【0126】
本明細書において用いられる「予防（prophylaxis）」という用語は、疾患もしくは疾
患状態の予防（prevention）、または疾患もしくは疾患状態のための保護的処置（protec
tive treatment）を意味する。本文脈における「予防（prevention）」には、対象が疾患
を経験する可能性を低下させることが含まれる。
患状態の予防（prevention）、または疾患もしくは疾患状態のための保護的処置（protec
tive treatment）を意味する。本文脈における「予防（prevention）」には、対象が疾患
を経験する可能性を低下させることが含まれる。
【0127】
「有効量」または「治療的有効量」という用語は、本明細書において互換的に用いられ
、特定の生物学的結果を達成するために有効な、本明細書に記載されている化合物、製剤
、物質、または組成物の量を指す。
、特定の生物学的結果を達成するために有効な、本明細書に記載されている化合物、製剤
、物質、または組成物の量を指す。
【0128】
いくつかの態様において、治療的有効量の組成物は、活性オトフェリンタンパク質（例
えば、野生型全長オトフェリンタンパク質、または所望の活性を有するオトフェリンタン
パク質のバリアント）の発現レベルの増大（例えば、組成物で処置する前の発現レベルと
比較して）をもたらし得る。いくつかの態様において、治療的有効量の組成物は、標的細
胞（例えば、蝸牛内有毛細胞）における活性オトフェリンタンパク質（例えば、野生型全
長オトフェリンタンパク質または活性バリアント）の発現レベルの増大をもたらし得る。
いくつかの態様において、治療的有効量の組成物は、標的細胞（例えば、蝸牛内有毛細胞
）における活性オトフェリンタンパク質（例えば、野生型全長オトフェリンタンパク質ま
たは活性バリアント）の異なる細胞局在をもたらし得る。いくつかの態様において、治療
的有効量の組成物は、活性オトフェリンタンパク質（例えば、野生型全長オトフェリンタ
ンパク質または活性バリアント）の発現レベルの増大、および/または標的細胞における
オトフェリンタンパク質の1つまたは複数の活性の増大（例えば、処置前の対象における
レベル、オトフェリン遺伝子に変異を有する対象におけるレベル、または非症候性感音難
聴を有する対象もしくは対象の集団におけるレベルなどの参照レベルと比較して）をもた
らし得る。
えば、野生型全長オトフェリンタンパク質、または所望の活性を有するオトフェリンタン
パク質のバリアント）の発現レベルの増大（例えば、組成物で処置する前の発現レベルと
比較して）をもたらし得る。いくつかの態様において、治療的有効量の組成物は、標的細
胞（例えば、蝸牛内有毛細胞）における活性オトフェリンタンパク質（例えば、野生型全
長オトフェリンタンパク質または活性バリアント）の発現レベルの増大をもたらし得る。
いくつかの態様において、治療的有効量の組成物は、標的細胞（例えば、蝸牛内有毛細胞
）における活性オトフェリンタンパク質（例えば、野生型全長オトフェリンタンパク質ま
たは活性バリアント）の異なる細胞局在をもたらし得る。いくつかの態様において、治療
的有効量の組成物は、活性オトフェリンタンパク質（例えば、野生型全長オトフェリンタ
ンパク質または活性バリアント）の発現レベルの増大、および/または標的細胞における
オトフェリンタンパク質の1つまたは複数の活性の増大（例えば、処置前の対象における
レベル、オトフェリン遺伝子に変異を有する対象におけるレベル、または非症候性感音難
聴を有する対象もしくは対象の集団におけるレベルなどの参照レベルと比較して）をもた
らし得る。
【0129】
組成物の「非経口」投与という用語には、例えば、皮下（s.c.）、静脈内（i.v.）、筋
肉内（i.m.）、または胸骨内への注射または注入の技法が含まれる。
肉内（i.m.）、または胸骨内への注射または注入の技法が含まれる。
【0130】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖形態または二本鎖形態のう
ちのいずれかの、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）およびそのポリマーを
指す。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似した結合特性を有し、か
つ天然に存在するヌクレオチドと類似した様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知の
類似体を含有する核酸を包含する。特に示されない限り、特定の核酸配列はまた、保存的
に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）、アリル、オルソログ、SNP、
および相補的配列、ならびに明示的に示される配列も、暗黙のうちに包含する。具体的に
は、縮重コドン置換が、1個または複数個の選択された（またはすべての）コドンの3番目
の位置が、混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製す
ることによって達成されてもよい（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)
；Ohtsuka etal., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；およびRossolini et al., M
ol. Cell.Probes 8:91-98 (1994)）。
ちのいずれかの、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）およびそのポリマーを
指す。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似した結合特性を有し、か
つ天然に存在するヌクレオチドと類似した様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知の
類似体を含有する核酸を包含する。特に示されない限り、特定の核酸配列はまた、保存的
に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）、アリル、オルソログ、SNP、
および相補的配列、ならびに明示的に示される配列も、暗黙のうちに包含する。具体的に
は、縮重コドン置換が、1個または複数個の選択された（またはすべての）コドンの3番目
の位置が、混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製す
ることによって達成されてもよい（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)
；Ohtsuka etal., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；およびRossolini et al., M
ol. Cell.Probes 8:91-98 (1994)）。
【0131】
本明細書に記載されている核酸のうちのいずれかのいくつかの態様において、核酸はDN
Aである。本明細書に記載されている核酸のうちのいずれかのいくつかの態様において、
核酸はRNAである。
Aである。本明細書に記載されている核酸のうちのいずれかのいくつかの態様において、
核酸はRNAである。
【0132】
本発明の文脈において、一般的に存在する核酸塩基について以下の略語が用いられる。
「A」はアデノシンを指し、「C」はシトシンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」は
チミジンを指し、「U」はウリジンを指す。
「A」はアデノシンを指し、「C」はシトシンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」は
チミジンを指し、「U」はウリジンを指す。
【0133】
本明細書において用いられる場合、「インビトロで転写されたRNA」とは、インビトロ
で合成されたRNA、好ましくはmRNAを指す。概して、インビトロで転写されたRNAは、イン
ビトロ転写ベクターから作製される。インビトロ転写ベクターは、インビトロで転写され
たRNAを作製するために用いられる鋳型を含む。
で合成されたRNA、好ましくはmRNAを指す。概して、インビトロで転写されたRNAは、イン
ビトロ転写ベクターから作製される。インビトロ転写ベクターは、インビトロで転写され
たRNAを作製するために用いられる鋳型を含む。
【0134】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、互換的に用い
られ、ペプチド結合によって共有結合で連結されたアミノ酸残基から構成される化合物を
指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2個のアミノ酸を含有しなければならず
、タンパク質またはペプチドの配列を構成することができるアミノ酸の最大数に制限は設
けられていない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって相互に連結された2個以上の
アミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書において用いられ
る場合、この用語は、当技術分野において、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、および
オリゴマーとも一般的に呼ばれる短い鎖、ならびに、当技術分野においてタンパク質と概
して呼ばれる、より長い鎖の両方を指し、タンパク質には多くのタイプがある。「ポリペ
プチド」には、とりわけ、例えば、生物学的に活性を有する断片、実質的に相同なポリペ
プチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、改変
ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペ
プチド、組換えペプチド、またはその組み合わせが含まれる。
られ、ペプチド結合によって共有結合で連結されたアミノ酸残基から構成される化合物を
指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2個のアミノ酸を含有しなければならず
、タンパク質またはペプチドの配列を構成することができるアミノ酸の最大数に制限は設
けられていない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって相互に連結された2個以上の
アミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書において用いられ
る場合、この用語は、当技術分野において、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、および
オリゴマーとも一般的に呼ばれる短い鎖、ならびに、当技術分野においてタンパク質と概
して呼ばれる、より長い鎖の両方を指し、タンパク質には多くのタイプがある。「ポリペ
プチド」には、とりわけ、例えば、生物学的に活性を有する断片、実質的に相同なポリペ
プチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、改変
ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペ
プチド、組換えペプチド、またはその組み合わせが含まれる。
【0135】
「シグナル伝達経路」という用語は、細胞の1つの部分から細胞の別の部分へのシグナ
ルの伝達において役割を果たす、さまざまなシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。
「細胞表面受容体」という句は、シグナルを受け取り、細胞膜を横切ってシグナルを伝達
する能力を有する分子および分子の複合体を含む。
ルの伝達において役割を果たす、さまざまなシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。
「細胞表面受容体」という句は、シグナルを受け取り、細胞膜を横切ってシグナルを伝達
する能力を有する分子および分子の複合体を含む。
【0136】
「活性オトフェリンタンパク質」という用語は、さもなければ野生型哺乳動物のもので
ある、聴覚有毛細胞（例えば、聴覚内有毛細胞）において全長オトフェリンタンパク質を
コードする両方の野生型アリルが置換されている場合、および、その哺乳動物の聴覚有毛
細胞において発現している場合に、その哺乳動物が、全体的に野生型である類似した哺乳
動物の正常レベルの聴力に近いレベルの聴力を有することをもたらす、DNAによってコー
ドされるタンパク質を意味する。活性オトフェリンタンパク質の非限定的な例は、全長オ
トフェリンタンパク質（例えば、本明細書に記載されている全長オトフェリンタンパク質
のいずれか）である。
ある、聴覚有毛細胞（例えば、聴覚内有毛細胞）において全長オトフェリンタンパク質を
コードする両方の野生型アリルが置換されている場合、および、その哺乳動物の聴覚有毛
細胞において発現している場合に、その哺乳動物が、全体的に野生型である類似した哺乳
動物の正常レベルの聴力に近いレベルの聴力を有することをもたらす、DNAによってコー
ドされるタンパク質を意味する。活性オトフェリンタンパク質の非限定的な例は、全長オ
トフェリンタンパク質（例えば、本明細書に記載されている全長オトフェリンタンパク質
のいずれか）である。
【0137】
例えば、活性オトフェリンタンパク質は、1アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、1アミ
ノ酸置換～約235アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約
225アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約215アミノ酸
置換、1アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、1アミ
ノ酸置換～約200アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約
190アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約180アミノ酸
置換、1アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、1アミ
ノ酸配列置換から約165アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、1アミノ酸置
換～約155アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約145ア
ミノ酸置換、1アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、
1アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、1アミノ酸置
換～約120アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約110ア
ミノ酸置換、1アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、
1アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約90アミノ酸置換、1アミノ酸置換
～約85アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約75アミノ酸
置換、1アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、1アミノ
酸置換～約60アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約55アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約50ア
ミノ酸置換、1アミノ酸置換～約45アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約40アミノ酸置換、1
アミノ酸置換～約35アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約30アミノ酸置換、1アミノ酸置換～
約25アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約20アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約15アミノ酸置
換、1アミノ酸置換～約10アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約9アミノ酸置換、1アミノ酸置
換～約8アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約7アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約6アミノ酸
置換、1アミノ酸置換～約5アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約4アミノ酸置換、1アミノ酸
置換～約3アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約23
5アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約225アミノ
酸置換、約2アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、
約2アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約2アミ
ノ酸置換～約200アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約2アミノ酸置換
～約190アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約180
アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約170アミノ酸
置換、約2アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約
2アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約2アミノ
酸置換～約145アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～
約135アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約125ア
ミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約115アミノ酸置
換、約2アミノ酸置換～約110アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約2
アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約2アミノ酸
置換～約90アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約80
アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約75アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約70アミノ酸置
換、約2アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約60アミノ酸置換、約2ア
ミノ酸置換～約55アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約50アミノ酸置換、約2アミノ酸置換
～約45アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約40アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約35アミ
ノ酸置換、約2アミノ酸置換～約30アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約25アミノ酸置換、
約2アミノ酸置換～約20アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約15アミノ酸置換、約2アミノ
酸置換～約10アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約9アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約8
アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約7アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約6アミノ酸置換
、約2アミノ酸置換～約5アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約4アミノ酸置換、約3アミノ
酸置換～約240アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～
約230アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約220ア
ミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約210アミノ酸置
換、約3アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約3
アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約3アミノ酸
置換～約185アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約
175アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約165アミ
ノ酸置換、約3アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約155アミノ酸置換
、約3アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約3ア
ミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約3アミノ酸置
換～約130アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約12
0アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約110アミノ
酸置換、約3アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、
約3アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約3アミノ
酸置換～約85アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約
75アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約65アミノ酸
置換、約3アミノ酸置換～約60アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約55アミノ酸置換、約3
アミノ酸置換～約50アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約45アミノ酸置換、約3アミノ酸置
換～約40アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約35アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約30ア
ミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約25アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約20アミノ酸置換
、約3アミノ酸置換～約15アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約10アミノ酸置換、約3アミ
ノ酸置換～約9アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約8アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約
7アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約6アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約5アミノ酸置
換、約4アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約4
アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約4アミノ酸
置換～約220アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約
210アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約200アミ
ノ酸置換、約4アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約190アミノ酸置換
、約4アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約4ア
ミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約4アミノ酸置
換～約165アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約15
5アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約145アミノ
酸置換、約4アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、
約4アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約4アミ
ノ酸置換～約120アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約4アミノ酸置換
～約110アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約100
アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約90アミノ酸置
換、約4アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約4ア
ミノ酸置換～約75アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、約4アミノ酸置換
～約65アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約60アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約55アミ
ノ酸置換、約4アミノ酸置換～約50アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約45アミノ酸置換、
約4アミノ酸置換～約40アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約35アミノ酸置換、約4アミノ
酸置換～約30アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約25アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約
20アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約15アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約10アミノ酸
置換、約4アミノ酸置換～約9アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約8アミノ酸置換、約4ア
ミノ酸置換～約7アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約6アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～
約240アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約230ア
ミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約220アミノ酸置
換、約5アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約5
アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約5アミノ酸
置換～約195アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約
185アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約175アミ
ノ酸置換、約5アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約165アミノ酸置換
、約5アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約5ア
ミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約5アミノ酸置
換～約140アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約13
0アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約120アミノ
酸置換、約5アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約110アミノ酸置換、
約5アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、約5アミ
ノ酸置換～約95アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～
約85アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約75アミノ
酸置換、約5アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、約
5アミノ酸置換～約60アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約55アミノ酸置換、約5アミノ酸
置換～約50アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約45アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約40
アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約35アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約30アミノ酸置
換、約5アミノ酸置換～約25アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約20アミノ酸置換、約5ア
ミノ酸置換～約15アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約10アミノ酸置換、約5アミノ酸置換
～約9アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約8アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約7アミノ
酸置換、約6アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、
約6アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約6アミ
ノ酸置換～約220アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約6アミノ酸置換
～約210アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約200
アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約190アミノ酸
置換、約6アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約
6アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約6アミノ
酸置換～約165アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～
約155アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約145ア
ミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約135アミノ酸置
換、約6アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約6
アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約6アミノ酸
置換～約110アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約
100アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約6ア
ミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約6アミノ酸置換
～約80アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約75アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約70アミ
ノ酸置換、約6アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約60アミノ酸置換、
約6アミノ酸置換～約55アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約50アミノ酸置換、約6アミノ
酸置換～約45アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約40アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約
35アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約30アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約25アミノ酸
置換、約6アミノ酸置換～約20アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約15アミノ酸置換、約6
アミノ酸置換～約10アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約9アミノ酸置換、約6アミノ酸置
換～約8アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約235
アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約225アミノ酸
置換、約7アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約
7アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約7アミノ
酸置換～約200アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～
約190アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約180ア
ミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約170アミノ酸置
換、約7アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約7
アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約7アミノ酸
置換～約145アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約
135アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約125アミ
ノ酸置換、約7アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約115アミノ酸置換
、約7アミノ酸置換～約110アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約7ア
ミノ酸置換～約100アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約7アミノ酸置
換～約90アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約80ア
ミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約75アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約70アミノ酸置換
、約7アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約60アミノ酸置換、約7アミ
ノ酸置換～約55アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約50アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～
約45アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約40アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約35アミノ
酸置換、約7アミノ酸置換～約30アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約25アミノ酸置換、約
7アミノ酸置換～約20アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約15アミノ酸置換、約7アミノ酸
置換～約10アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約9アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約240
アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約230アミノ酸
置換、約8アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約
8アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約8アミノ
酸置換～約205アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～
約195アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約185ア
ミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約175アミノ酸置
換、約8アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約8
アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約8アミノ酸
置換～約150アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約
140アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約130アミ
ノ酸置換、約8アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約120アミノ酸置換
、約8アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約110アミノ酸置換、約8ア
ミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、約8アミノ酸置
換～約95アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約85ア
ミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約75アミノ酸置換
、約8アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、約8アミ
ノ酸置換～約60アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約55アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～
約50アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約45アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約40アミノ
酸置換、約8アミノ酸置換～約35アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約30アミノ酸置換、約
8アミノ酸置換～約25アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約20アミノ酸置換、約8アミノ酸
置換～約15アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約10アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約2
40アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約230アミ
ノ酸置換、約10アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約220アミノ酸置
換、約10アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約
10アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約10アミ
ノ酸置換～約195アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約10アミノ酸置
換～約185アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約
175アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約165ア
ミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約155アミノ酸
置換、約10アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、
約10アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約10ア
ミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約10アミノ酸
置換～約120アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～
約110アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約100
アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約90アミノ酸
置換、約10アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約
10アミノ酸置換～約75アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、約10アミノ
酸置換～約65アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約60アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～
約55アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約50アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約45アミ
ノ酸置換、約10アミノ酸置換～約40アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約35アミノ酸置換
、約10アミノ酸置換～約30アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約25アミノ酸置換、約10ア
ミノ酸置換～約20アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約15アミノ酸置換、約15アミノ酸置
換～約240アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約
230アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約220ア
ミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約210アミノ酸
置換、約15アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、
約15アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約15ア
ミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約15アミノ酸
置換～約175アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～
約165アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約155
アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約145アミノ
酸置換、約15アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約135アミノ酸置換
、約15アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約15
アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約15アミノ
酸置換～約110アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約15アミノ酸置換
～約100アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約90
アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約80アミノ酸
置換、約15アミノ酸置換～約75アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、約
15アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約60アミノ酸置換、約15アミノ
酸置換～約55アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約50アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～
約45アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約40アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約35アミ
ノ酸置換、約15アミノ酸置換～約30アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約25アミノ酸置換
、約15アミノ酸置換～約20アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約20
アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約20アミノ
酸置換～約225アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約20アミノ酸置換
～約215アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約20
5アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約195アミ
ノ酸置換、約20アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約185アミノ酸置
換、約20アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約
20アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約20アミ
ノ酸置換～約160アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約20アミノ酸置
換～約150アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約
140アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約130ア
ミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約120アミノ酸
置換、約20アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約110アミノ酸置換、
約20アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、約20ア
ミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約20アミノ酸置
換～約85アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約75
アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約65アミノ酸
置換、約20アミノ酸置換～約60アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約55アミノ酸置換、約
20アミノ酸置換～約50アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約45アミノ酸置換、約20アミノ
酸置換～約40アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約35アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～
約30アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約25アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約240ア
ミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約230アミノ酸
置換、約25アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、
約25アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約25ア
ミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約10アミノ酸
置換～約195アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～
約185アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約175
アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約165アミノ
酸置換、約25アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約155アミノ酸置換
、約25アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約25
アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約25アミノ
酸置換～約130アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約25アミノ酸置換
～約120アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約11
0アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約100アミ
ノ酸置換、約25アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約90アミノ酸置換
、約25アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約25ア
ミノ酸置換～約75アミノ酸置換、約
25アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、約25アミノ
酸置換～約60アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約55アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～
約50アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約45アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約40アミ
ノ酸置換、約25アミノ酸置換～約35アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約30アミノ酸置換
、約30アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約30
アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約30アミノ
酸置換～約220アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約30アミノ酸置換
～約210アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約20
0アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約190アミ
ノ酸置換、約30アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約180アミノ酸置
換、約30アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約
30アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約30アミ
ノ酸置換～約155アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約30アミノ酸置
換～約145アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約
135アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約125ア
ミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約115アミノ酸
置換、約30アミノ酸置換～約110アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、
約30アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約30ア
ミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約30アミノ酸置
換～約80アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約75アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約70
アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約60アミノ酸
置換、約30アミノ酸置換～約55アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約50アミノ酸置換、約
30アミノ酸置換～約45アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約40アミノ酸置換、約30アミノ
酸置換～約35アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約35アミノ酸置換
～約235アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約22
5アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約215アミ
ノ酸置換、約35アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約205アミノ酸置
換、約35アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約
35アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約35アミ
ノ酸置換～約180アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約35アミノ酸置
換～約170アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約
160アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約150ア
ミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約140アミノ酸
置換、約35アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、
約35アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約35ア
ミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約110アミノ酸置換、約35アミノ酸
置換～約105アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～
約95アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約85アミ
ノ酸置換、約35アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約75アミノ酸置換
、約35アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、約35ア
ミノ酸置換～約60アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約55アミノ酸置換、約35アミノ酸置
換～約50アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約45アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約40
アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約235アミノ
酸置換、約40アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約225アミノ酸置換
、約40アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約40
アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約40アミノ
酸置換～約200アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約40アミノ酸置換
～約190アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約18
0アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約170アミ
ノ酸置換、約40アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約160アミノ酸置
換、約40アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約
40アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約40アミ
ノ酸置換～約135アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約40アミノ酸置
換～約125アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約
115アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約110アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約105ア
ミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約95アミノ酸
置換、約40アミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約
40アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約75アミノ酸置換、約40アミノ
酸置換～約70アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～
約60アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約55アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約50アミ
ノ酸置換、約40アミノ酸置換～約45アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約240アミノ酸置
換、約45アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約
45アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約45アミ
ノ酸置換～約215アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約45アミノ酸置
換～約205アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約
195アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約185ア
ミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約175アミノ酸
置換、約45アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、
約45アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約45ア
ミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約45アミノ酸
置換～約140アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～
約130アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約120
アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約110アミノ
酸置換、約45アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約100アミノ酸置換
、約45アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約45ア
ミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約45アミノ酸置
換～約75アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約65
アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約60アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約55アミノ酸
置換、約45アミノ酸置換～約50アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、
約50アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約50ア
ミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約50アミノ酸
置換～約215アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～
約205アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約195
アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約185アミノ
酸置換、約50アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約175アミノ酸置換
、約50アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約50
アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約50アミノ
酸置換～約150アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約50アミノ酸置換
～約140アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約13
0アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約120アミ
ノ酸置換、約50アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約110アミノ酸置
換、約50アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、約
50アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約50アミノ
酸置換～約85アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～
約75アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約65アミ
ノ酸置換、約50アミノ酸置換～約60アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約55アミノ酸置換
、約60アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約60
アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約60アミノ
酸置換～約220アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約60アミノ酸置換
～約210アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約20
0アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約190アミ
ノ酸置換、約60アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約180アミノ酸置
換、約60アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約
60アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約60アミ
ノ酸置換～約155アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約60アミノ酸置
換～約145アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約
135アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約125ア
ミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約115アミノ酸
置換、約60アミノ酸置換～約110アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、
約60アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約60ア
ミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約60アミノ酸置
換～約80アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約75アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約70
アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約240アミノ
酸置換、約70アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約230アミノ酸置換
、約70アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約70
アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約10アミノ
酸置換～約205アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約70アミノ酸置換
～約195アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約18
5アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約175アミ
ノ酸置換、約70アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約165アミノ酸置
換、約70アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約
70アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約70アミ
ノ酸置換～約140アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約70アミノ酸置
換～約130アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約
120アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約110ア
ミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約100アミノ酸
置換、約70アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約
70アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約70アミノ
酸置換～約75アミノ酸置
換、約80アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約
80アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約80アミ
ノ酸置換～約220アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約80アミノ酸置
換～約210アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約
200アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約190ア
ミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約180アミノ酸
置換、約80アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、
約80アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約80ア
ミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約80アミノ酸
置換～約145アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～
約135アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約125
アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約115アミノ
酸置換、約80アミノ酸置換～約110アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約105アミノ酸置換
、約80アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約80
アミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約90アミノ酸
置換～約240アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～
約230アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約220
アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約210アミノ
酸置換、約90アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約200アミノ酸置換
、約90アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約90
アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約90アミノ
酸置換～約175アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約90アミノ酸置換
～約165アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約15
5アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約145アミ
ノ酸置換、約90アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約135アミノ酸置
換、約90アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約
90アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約90アミ
ノ酸置換～約110アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約90アミノ酸置
換～約100アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約
240アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約230
アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約220アミ
ノ酸置換、約100アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約210アミノ酸
置換、約100アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約200アミノ酸置換
、約100アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約
100アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約100
アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約100アミ
ノ酸置換～約165アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約100アミノ酸
置換～約155アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約100アミノ酸置換
～約145アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約
135アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約125
アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約115アミ
ノ酸置換、約100アミノ酸置換～約110アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約105アミノ酸
置換、約110アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約235アミノ酸置換
、約110アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約
110アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約110
アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約110アミ
ノ酸置換～約200アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約110アミノ酸
置換～約190アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約110アミノ酸置換
～約180アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約
170アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約160
アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約150アミ
ノ酸置換、約110アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約140アミノ酸
置換、約110アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約130アミノ酸置換
、約110アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約
110アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約120
アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約120アミ
ノ酸置換～約225アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約120アミノ酸
置換～約215アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約120アミノ酸置換
～約205アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約
195アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約185
アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約175アミ
ノ酸置換、約120アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約165アミノ酸
置換、約120アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約155アミノ酸置換
、約120アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約
120アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約120
アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約130アミ
ノ酸置換～約240アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約130アミノ酸
置換～約230アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約130アミノ酸置換
～約220アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約
210アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約200
アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約190アミ
ノ酸置換、約130アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約180アミノ酸
置換、約130アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約170アミノ酸置換
、約130アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約
130アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約130
アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約130アミ
ノ酸置換～約135アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約140アミノ酸
置換～約235アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約140アミノ酸置換
～約225アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約
215アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約205
アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約195アミ
ノ酸置換、約140アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約185アミノ酸
置換、約140アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約175アミノ酸置換
、約140アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約
140アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約140
アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約150アミ
ノ酸置換～約240アミノ酸置換、約150アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約150アミノ酸
置換～約230アミノ酸置換、約150アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約150アミノ酸置換
～約220アミノ酸置換、約150アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約150アミノ酸置換～約
210アミノ酸置換、約150アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約150アミノ酸置換～約200
アミノ酸置換、約150アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約150アミノ酸置換～約190アミ
ノ酸置換、約150アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約150アミノ酸置換～約180アミノ酸
置換、約150アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約150アミノ酸置換～約170アミノ酸置換
、約150アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約150アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、ま
たは約150アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約160アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、
約160アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約160アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約16
0アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約160アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約160ア
ミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約160アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約160アミノ
酸置換～約205アミノ酸置換、約160アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約160アミノ酸置
換～約195アミノ酸置換、約160アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約160アミノ酸置換～
約185アミノ酸置換、約160アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約160アミノ酸置換～約17
5アミノ酸置換、約160アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約160アミノ酸置換～約165ア
ミノ酸置換、約170アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約170アミノ酸置換～約235アミノ
酸置換、約170アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約170アミノ酸置換～約225アミノ酸置
換、約170アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約170アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、
約170アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約170アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約17
0アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約170アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約170ア
ミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約170アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約170アミノ
酸置換～約180アミノ酸置換、約170アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約180アミノ酸置
換～約240アミノ酸置換、約180アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約180アミノ酸置換～
約230アミノ酸置換、約180アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約180アミノ酸置換～約22
0アミノ酸置換、約180アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約180アミノ酸置換～約210ア
ミノ酸置換、約180アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約180アミノ酸置換～約200アミノ
酸置換、約180アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約180アミノ酸置換～約190アミノ酸置
換、約180アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約190アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、
約190アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約190アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約19
0アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約190アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約190ア
ミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約190アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約190アミノ
酸置換～約205アミノ酸置換、約190アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約190アミノ酸置
換～約195アミノ酸置換、約200アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約200アミノ酸置換～
約235アミノ酸置換、約200アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約200アミノ酸置換～約22
5アミノ酸置換、約200アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約200アミノ酸置換～約215ア
ミノ酸置換、約200アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約200アミノ酸置換～約205アミノ
酸置換、約205アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約205アミノ酸置換～約235アミノ酸置
換、約205アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約205アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、
約205アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約205アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約20
5アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約210アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約210ア
ミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約210アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約210アミノ
酸置換～約225アミノ酸置換、
約210アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約210アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約21
5アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約215アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約215ア
ミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約215アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約215アミノ
酸置換～約220アミノ酸置換、約220アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約220アミノ酸置
換～約235アミノ酸置換、約220アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約220アミノ酸置換～
約225アミノ酸置換、約225アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約225アミノ酸置換～約23
5アミノ酸置換、約225アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約230アミノ酸置換～約240ア
ミノ酸置換、約230アミノ酸置換～約235アミノ酸置換を含む、野生型全長オトフェリンタ
ンパク質（例えば、野生型ヒト全長オトフェリンタンパク質）の配列を含むことができる
。異なる種に由来する野生型オトフェリンタンパク質の間で保存されていないアミノ酸は
、活性を失うことなく変異させることができるが、異なる種に由来する野生型オトフェリ
ンタンパク質の間で保存されているそれらのアミノ酸は、活性に関与している可能性が（
異なる種の間で保存されていないアミノ酸よりも）高いため、変異させるべきではないこ
とを、当業者は認識しているであろう。
ノ酸置換～約235アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約
225アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約215アミノ酸
置換、1アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、1アミ
ノ酸置換～約200アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約
190アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約180アミノ酸
置換、1アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、1アミ
ノ酸配列置換から約165アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、1アミノ酸置
換～約155アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約145ア
ミノ酸置換、1アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、
1アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、1アミノ酸置
換～約120アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約110ア
ミノ酸置換、1アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、
1アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約90アミノ酸置換、1アミノ酸置換
～約85アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約75アミノ酸
置換、1アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、1アミノ
酸置換～約60アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約55アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約50ア
ミノ酸置換、1アミノ酸置換～約45アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約40アミノ酸置換、1
アミノ酸置換～約35アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約30アミノ酸置換、1アミノ酸置換～
約25アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約20アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約15アミノ酸置
換、1アミノ酸置換～約10アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約9アミノ酸置換、1アミノ酸置
換～約8アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約7アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約6アミノ酸
置換、1アミノ酸置換～約5アミノ酸置換、1アミノ酸置換～約4アミノ酸置換、1アミノ酸
置換～約3アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約23
5アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約225アミノ
酸置換、約2アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、
約2アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約2アミ
ノ酸置換～約200アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約2アミノ酸置換
～約190アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約180
アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約170アミノ酸
置換、約2アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約
2アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約2アミノ
酸置換～約145アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～
約135アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約125ア
ミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約115アミノ酸置
換、約2アミノ酸置換～約110アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約2
アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約2アミノ酸
置換～約90アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約80
アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約75アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約70アミノ酸置
換、約2アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約60アミノ酸置換、約2ア
ミノ酸置換～約55アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約50アミノ酸置換、約2アミノ酸置換
～約45アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約40アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約35アミ
ノ酸置換、約2アミノ酸置換～約30アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約25アミノ酸置換、
約2アミノ酸置換～約20アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約15アミノ酸置換、約2アミノ
酸置換～約10アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約9アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約8
アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約7アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約6アミノ酸置換
、約2アミノ酸置換～約5アミノ酸置換、約2アミノ酸置換～約4アミノ酸置換、約3アミノ
酸置換～約240アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～
約230アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約220ア
ミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約210アミノ酸置
換、約3アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約3
アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約3アミノ酸
置換～約185アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約
175アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約165アミ
ノ酸置換、約3アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約155アミノ酸置換
、約3アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約3ア
ミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約3アミノ酸置
換～約130アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約12
0アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約110アミノ
酸置換、約3アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、
約3アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約3アミノ
酸置換～約85アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約
75アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約65アミノ酸
置換、約3アミノ酸置換～約60アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約55アミノ酸置換、約3
アミノ酸置換～約50アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約45アミノ酸置換、約3アミノ酸置
換～約40アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約35アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約30ア
ミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約25アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約20アミノ酸置換
、約3アミノ酸置換～約15アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約10アミノ酸置換、約3アミ
ノ酸置換～約9アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約8アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約
7アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約6アミノ酸置換、約3アミノ酸置換～約5アミノ酸置
換、約4アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約4
アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約4アミノ酸
置換～約220アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約
210アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約200アミ
ノ酸置換、約4アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約190アミノ酸置換
、約4アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約4ア
ミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約4アミノ酸置
換～約165アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約15
5アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約145アミノ
酸置換、約4アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、
約4アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約4アミ
ノ酸置換～約120アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約4アミノ酸置換
～約110アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約100
アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約90アミノ酸置
換、約4アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約4ア
ミノ酸置換～約75アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、約4アミノ酸置換
～約65アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約60アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約55アミ
ノ酸置換、約4アミノ酸置換～約50アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約45アミノ酸置換、
約4アミノ酸置換～約40アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約35アミノ酸置換、約4アミノ
酸置換～約30アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約25アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約
20アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約15アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約10アミノ酸
置換、約4アミノ酸置換～約9アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約8アミノ酸置換、約4ア
ミノ酸置換～約7アミノ酸置換、約4アミノ酸置換～約6アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～
約240アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約230ア
ミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約220アミノ酸置
換、約5アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約5
アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約5アミノ酸
置換～約195アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約
185アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約175アミ
ノ酸置換、約5アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約165アミノ酸置換
、約5アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約5ア
ミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約5アミノ酸置
換～約140アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約13
0アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約120アミノ
酸置換、約5アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約110アミノ酸置換、
約5アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、約5アミ
ノ酸置換～約95アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～
約85アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約75アミノ
酸置換、約5アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、約
5アミノ酸置換～約60アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約55アミノ酸置換、約5アミノ酸
置換～約50アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約45アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約40
アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約35アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約30アミノ酸置
換、約5アミノ酸置換～約25アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約20アミノ酸置換、約5ア
ミノ酸置換～約15アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約10アミノ酸置換、約5アミノ酸置換
～約9アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約8アミノ酸置換、約5アミノ酸置換～約7アミノ
酸置換、約6アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、
約6アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約6アミ
ノ酸置換～約220アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約6アミノ酸置換
～約210アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約200
アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約190アミノ酸
置換、約6アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約
6アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約6アミノ
酸置換～約165アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～
約155アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約145ア
ミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約135アミノ酸置
換、約6アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約6
アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約6アミノ酸
置換～約110アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約
100アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約6ア
ミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約6アミノ酸置換
～約80アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約75アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約70アミ
ノ酸置換、約6アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約60アミノ酸置換、
約6アミノ酸置換～約55アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約50アミノ酸置換、約6アミノ
酸置換～約45アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約40アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約
35アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約30アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約25アミノ酸
置換、約6アミノ酸置換～約20アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約15アミノ酸置換、約6
アミノ酸置換～約10アミノ酸置換、約6アミノ酸置換～約9アミノ酸置換、約6アミノ酸置
換～約8アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約235
アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約225アミノ酸
置換、約7アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約
7アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約7アミノ
酸置換～約200アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～
約190アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約180ア
ミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約170アミノ酸置
換、約7アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約7
アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約7アミノ酸
置換～約145アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約
135アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約125アミ
ノ酸置換、約7アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約115アミノ酸置換
、約7アミノ酸置換～約110アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約7ア
ミノ酸置換～約100アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約7アミノ酸置
換～約90アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約80ア
ミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約75アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約70アミノ酸置換
、約7アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約60アミノ酸置換、約7アミ
ノ酸置換～約55アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約50アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～
約45アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約40アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約35アミノ
酸置換、約7アミノ酸置換～約30アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約25アミノ酸置換、約
7アミノ酸置換～約20アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約15アミノ酸置換、約7アミノ酸
置換～約10アミノ酸置換、約7アミノ酸置換～約9アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約240
アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約230アミノ酸
置換、約8アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約
8アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約8アミノ
酸置換～約205アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～
約195アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約185ア
ミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約175アミノ酸置
換、約8アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約8
アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約8アミノ酸
置換～約150アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約
140アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約130アミ
ノ酸置換、約8アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約120アミノ酸置換
、約8アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約110アミノ酸置換、約8ア
ミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、約8アミノ酸置
換～約95アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約85ア
ミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約75アミノ酸置換
、約8アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、約8アミ
ノ酸置換～約60アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約55アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～
約50アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約45アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約40アミノ
酸置換、約8アミノ酸置換～約35アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約30アミノ酸置換、約
8アミノ酸置換～約25アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約20アミノ酸置換、約8アミノ酸
置換～約15アミノ酸置換、約8アミノ酸置換～約10アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約2
40アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約230アミ
ノ酸置換、約10アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約220アミノ酸置
換、約10アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約
10アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約10アミ
ノ酸置換～約195アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約10アミノ酸置
換～約185アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約
175アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約165ア
ミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約155アミノ酸
置換、約10アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、
約10アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約10ア
ミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約10アミノ酸
置換～約120アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～
約110アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約100
アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約90アミノ酸
置換、約10アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約
10アミノ酸置換～約75アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、約10アミノ
酸置換～約65アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約60アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～
約55アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約50アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約45アミ
ノ酸置換、約10アミノ酸置換～約40アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約35アミノ酸置換
、約10アミノ酸置換～約30アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約25アミノ酸置換、約10ア
ミノ酸置換～約20アミノ酸置換、約10アミノ酸置換～約15アミノ酸置換、約15アミノ酸置
換～約240アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約
230アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約220ア
ミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約210アミノ酸
置換、約15アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、
約15アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約15ア
ミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約15アミノ酸
置換～約175アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～
約165アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約155
アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約145アミノ
酸置換、約15アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約135アミノ酸置換
、約15アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約15
アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約15アミノ
酸置換～約110アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約15アミノ酸置換
～約100アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約90
アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約80アミノ酸
置換、約15アミノ酸置換～約75アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、約
15アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約60アミノ酸置換、約15アミノ
酸置換～約55アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約50アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～
約45アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約40アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約35アミ
ノ酸置換、約15アミノ酸置換～約30アミノ酸置換、約15アミノ酸置換～約25アミノ酸置換
、約15アミノ酸置換～約20アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約20
アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約20アミノ
酸置換～約225アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約20アミノ酸置換
～約215アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約20
5アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約195アミ
ノ酸置換、約20アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約185アミノ酸置
換、約20アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約
20アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約20アミ
ノ酸置換～約160アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約20アミノ酸置
換～約150アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約
140アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約130ア
ミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約120アミノ酸
置換、約20アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約110アミノ酸置換、
約20アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、約20ア
ミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約20アミノ酸置
換～約85アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約75
アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約65アミノ酸
置換、約20アミノ酸置換～約60アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約55アミノ酸置換、約
20アミノ酸置換～約50アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約45アミノ酸置換、約20アミノ
酸置換～約40アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約35アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～
約30アミノ酸置換、約20アミノ酸置換～約25アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約240ア
ミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約230アミノ酸
置換、約25アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、
約25アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約25ア
ミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約10アミノ酸
置換～約195アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～
約185アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約175
アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約165アミノ
酸置換、約25アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約155アミノ酸置換
、約25アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約25
アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約25アミノ
酸置換～約130アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約25アミノ酸置換
～約120アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約11
0アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約100アミ
ノ酸置換、約25アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約90アミノ酸置換
、約25アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約25ア
ミノ酸置換～約75アミノ酸置換、約
25アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、約25アミノ
酸置換～約60アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約55アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～
約50アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約45アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約40アミ
ノ酸置換、約25アミノ酸置換～約35アミノ酸置換、約25アミノ酸置換～約30アミノ酸置換
、約30アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約30
アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約30アミノ
酸置換～約220アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約30アミノ酸置換
～約210アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約20
0アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約190アミ
ノ酸置換、約30アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約180アミノ酸置
換、約30アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約
30アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約30アミ
ノ酸置換～約155アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約30アミノ酸置
換～約145アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約
135アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約125ア
ミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約115アミノ酸
置換、約30アミノ酸置換～約110アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、
約30アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約30ア
ミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約30アミノ酸置
換～約80アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約75アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約70
アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約60アミノ酸
置換、約30アミノ酸置換～約55アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約50アミノ酸置換、約
30アミノ酸置換～約45アミノ酸置換、約30アミノ酸置換～約40アミノ酸置換、約30アミノ
酸置換～約35アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約35アミノ酸置換
～約235アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約22
5アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約215アミ
ノ酸置換、約35アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約205アミノ酸置
換、約35アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約
35アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約35アミ
ノ酸置換～約180アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約35アミノ酸置
換～約170アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約
160アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約150ア
ミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約140アミノ酸
置換、約35アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、
約35アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約35ア
ミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約110アミノ酸置換、約35アミノ酸
置換～約105アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～
約95アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約85アミ
ノ酸置換、約35アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約75アミノ酸置換
、約35アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、約35ア
ミノ酸置換～約60アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約55アミノ酸置換、約35アミノ酸置
換～約50アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約45アミノ酸置換、約35アミノ酸置換～約40
アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約235アミノ
酸置換、約40アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約225アミノ酸置換
、約40アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約40
アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約40アミノ
酸置換～約200アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約40アミノ酸置換
～約190アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約18
0アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約170アミ
ノ酸置換、約40アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約160アミノ酸置
換、約40アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約
40アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約40アミ
ノ酸置換～約135アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約40アミノ酸置
換～約125アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約
115アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約110アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約105ア
ミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約95アミノ酸
置換、約40アミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約
40アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約75アミノ酸置換、約40アミノ
酸置換～約70アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～
約60アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約55アミノ酸置換、約40アミノ酸置換～約50アミ
ノ酸置換、約40アミノ酸置換～約45アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約240アミノ酸置
換、約45アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約
45アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約45アミ
ノ酸置換～約215アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約45アミノ酸置
換～約205アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約
195アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約185ア
ミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約175アミノ酸
置換、約45アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、
約45アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約45ア
ミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約45アミノ酸
置換～約140アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～
約130アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約120
アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約110アミノ
酸置換、約45アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約100アミノ酸置換
、約45アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約45ア
ミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約45アミノ酸置
換～約75アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約65
アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約60アミノ酸置換、約45アミノ酸置換～約55アミノ酸
置換、約45アミノ酸置換～約50アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、
約50アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約50ア
ミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約50アミノ酸
置換～約215アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～
約205アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約195
アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約185アミノ
酸置換、約50アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約175アミノ酸置換
、約50アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約50
アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約50アミノ
酸置換～約150アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約50アミノ酸置換
～約140アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約13
0アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約120アミ
ノ酸置換、約50アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約110アミノ酸置
換、約50アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、約
50アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約50アミノ
酸置換～約85アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～
約75アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約70アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約65アミ
ノ酸置換、約50アミノ酸置換～約60アミノ酸置換、約50アミノ酸置換～約55アミノ酸置換
、約60アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約60
アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約60アミノ
酸置換～約220アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約60アミノ酸置換
～約210アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約20
0アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約190アミ
ノ酸置換、約60アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約180アミノ酸置
換、約60アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約
60アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約60アミ
ノ酸置換～約155アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約60アミノ酸置
換～約145アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約
135アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約125ア
ミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約115アミノ酸
置換、約60アミノ酸置換～約110アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、
約60アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約60ア
ミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約60アミノ酸置
換～約80アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約75アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約70
アミノ酸置換、約60アミノ酸置換～約65アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約240アミノ
酸置換、約70アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約230アミノ酸置換
、約70アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約70
アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約10アミノ
酸置換～約205アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約70アミノ酸置換
～約195アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約18
5アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約175アミ
ノ酸置換、約70アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約165アミノ酸置
換、約70アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約
70アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約70アミ
ノ酸置換～約140アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約70アミノ酸置
換～約130アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約
120アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約110ア
ミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約100アミノ酸
置換、約70アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約
70アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約70アミノ酸置換～約80アミノ酸置換、約70アミノ
酸置換～約75アミノ酸置
換、約80アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約
80アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約80アミ
ノ酸置換～約220アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約80アミノ酸置
換～約210アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約
200アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約190ア
ミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約180アミノ酸
置換、約80アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、
約80アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約80ア
ミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約80アミノ酸
置換～約145アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～
約135アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約125
アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約115アミノ
酸置換、約80アミノ酸置換～約110アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約105アミノ酸置換
、約80アミノ酸置換～約100アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約80
アミノ酸置換～約90アミノ酸置換、約80アミノ酸置換～約85アミノ酸置換、約90アミノ酸
置換～約240アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～
約230アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約220
アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約210アミノ
酸置換、約90アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約200アミノ酸置換
、約90アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約90
アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約90アミノ
酸置換～約175アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約90アミノ酸置換
～約165アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約15
5アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約145アミ
ノ酸置換、約90アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約135アミノ酸置
換、約90アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約
90アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約90アミ
ノ酸置換～約110アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約105アミノ酸置換、約90アミノ酸置
換～約100アミノ酸置換、約90アミノ酸置換～約95アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約
240アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約230
アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約220アミ
ノ酸置換、約100アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約210アミノ酸
置換、約100アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約200アミノ酸置換
、約100アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約
100アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約100
アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約100アミ
ノ酸置換～約165アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約100アミノ酸
置換～約155アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約100アミノ酸置換
～約145アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約
135アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約125
アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約115アミ
ノ酸置換、約100アミノ酸置換～約110アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約105アミノ酸
置換、約110アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約235アミノ酸置換
、約110アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約
110アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約110
アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約110アミ
ノ酸置換～約200アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約110アミノ酸
置換～約190アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約110アミノ酸置換
～約180アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約
170アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約160
アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約150アミ
ノ酸置換、約110アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約140アミノ酸
置換、約110アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約130アミノ酸置換
、約110アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約110アミノ酸置換～約120アミノ酸置換、約
110アミノ酸置換～約115アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約120
アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約120アミ
ノ酸置換～約225アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約120アミノ酸
置換～約215アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約120アミノ酸置換
～約205アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約
195アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約185
アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約175アミ
ノ酸置換、約120アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約100アミノ酸置換～約165アミノ酸
置換、約120アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約155アミノ酸置換
、約120アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約
120アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約135アミノ酸置換、約120
アミノ酸置換～約130アミノ酸置換、約120アミノ酸置換～約125アミノ酸置換、約130アミ
ノ酸置換～約240アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約130アミノ酸
置換～約230アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約130アミノ酸置換
～約220アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約
210アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約200
アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約190アミ
ノ酸置換、約130アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約180アミノ酸
置換、約130アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約170アミノ酸置換
、約130アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約
130アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約130
アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約130アミノ酸置換～約140アミノ酸置換、約130アミ
ノ酸置換～約135アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約140アミノ酸
置換～約235アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約140アミノ酸置換
～約225アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約
215アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約205
アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約195アミ
ノ酸置換、約140アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約185アミノ酸
置換、約140アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約175アミノ酸置換
、約140アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約
140アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約140
アミノ酸置換～約150アミノ酸置換、約140アミノ酸置換～約145アミノ酸置換、約150アミ
ノ酸置換～約240アミノ酸置換、約150アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約150アミノ酸
置換～約230アミノ酸置換、約150アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約150アミノ酸置換
～約220アミノ酸置換、約150アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約150アミノ酸置換～約
210アミノ酸置換、約150アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約150アミノ酸置換～約200
アミノ酸置換、約150アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約150アミノ酸置換～約190アミ
ノ酸置換、約150アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約150アミノ酸置換～約180アミノ酸
置換、約150アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約150アミノ酸置換～約170アミノ酸置換
、約150アミノ酸置換～約165アミノ酸置換、約150アミノ酸置換～約160アミノ酸置換、ま
たは約150アミノ酸置換～約155アミノ酸置換、約160アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、
約160アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約160アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約16
0アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約160アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約160ア
ミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約160アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約160アミノ
酸置換～約205アミノ酸置換、約160アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約160アミノ酸置
換～約195アミノ酸置換、約160アミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約160アミノ酸置換～
約185アミノ酸置換、約160アミノ酸置換～約180アミノ酸置換、約160アミノ酸置換～約17
5アミノ酸置換、約160アミノ酸置換～約170アミノ酸置換、約160アミノ酸置換～約165ア
ミノ酸置換、約170アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約170アミノ酸置換～約235アミノ
酸置換、約170アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約170アミノ酸置換～約225アミノ酸置
換、約170アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約170アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、
約170アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約170アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約17
0アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約170アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約170ア
ミノ酸置換～約190アミノ酸置換、約170アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約170アミノ
酸置換～約180アミノ酸置換、約170アミノ酸置換～約175アミノ酸置換、約180アミノ酸置
換～約240アミノ酸置換、約180アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約180アミノ酸置換～
約230アミノ酸置換、約180アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約180アミノ酸置換～約22
0アミノ酸置換、約180アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約180アミノ酸置換～約210ア
ミノ酸置換、約180アミノ酸置換～約205アミノ酸置換、約180アミノ酸置換～約200アミノ
酸置換、約180アミノ酸置換～約195アミノ酸置換、約180アミノ酸置換～約190アミノ酸置
換、約180アミノ酸置換～約185アミノ酸置換、約190アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、
約190アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約190アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約19
0アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約190アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約190ア
ミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約190アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約190アミノ
酸置換～約205アミノ酸置換、約190アミノ酸置換～約200アミノ酸置換、約190アミノ酸置
換～約195アミノ酸置換、約200アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約200アミノ酸置換～
約235アミノ酸置換、約200アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約200アミノ酸置換～約22
5アミノ酸置換、約200アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約200アミノ酸置換～約215ア
ミノ酸置換、約200アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約200アミノ酸置換～約205アミノ
酸置換、約205アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約205アミノ酸置換～約235アミノ酸置
換、約205アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約205アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、
約205アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約205アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約20
5アミノ酸置換～約210アミノ酸置換、約210アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約210ア
ミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約210アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約210アミノ
酸置換～約225アミノ酸置換、
約210アミノ酸置換～約220アミノ酸置換、約210アミノ酸置換～約215アミノ酸置換、約21
5アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約215アミノ酸置換～約235アミノ酸置換、約215ア
ミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約215アミノ酸置換～約225アミノ酸置換、約215アミノ
酸置換～約220アミノ酸置換、約220アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約220アミノ酸置
換～約235アミノ酸置換、約220アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約220アミノ酸置換～
約225アミノ酸置換、約225アミノ酸置換～約240アミノ酸置換、約225アミノ酸置換～約23
5アミノ酸置換、約225アミノ酸置換～約230アミノ酸置換、約230アミノ酸置換～約240ア
ミノ酸置換、約230アミノ酸置換～約235アミノ酸置換を含む、野生型全長オトフェリンタ
ンパク質（例えば、野生型ヒト全長オトフェリンタンパク質）の配列を含むことができる
。異なる種に由来する野生型オトフェリンタンパク質の間で保存されていないアミノ酸は
、活性を失うことなく変異させることができるが、異なる種に由来する野生型オトフェリ
ンタンパク質の間で保存されているそれらのアミノ酸は、活性に関与している可能性が（
異なる種の間で保存されていないアミノ酸よりも）高いため、変異させるべきではないこ
とを、当業者は認識しているであろう。
【0138】
活性オトフェリンタンパク質は、例えば、1アミノ酸～約200アミノ酸、1アミノ酸～約1
95アミノ酸、1アミノ酸～約190アミノ酸、1アミノ酸～約185アミノ酸、1アミノ酸～約180
アミノ酸、1アミノ酸～約175アミノ酸、1アミノ酸～約170アミノ酸、1アミノ酸～約165
アミノ酸、1アミノ酸～約160アミノ酸、1アミノ酸～約155アミノ酸、1アミノ酸～約150ア
ミノ酸、1アミノ酸～約145アミノ酸、1アミノ酸～約140アミノ酸、1アミノ酸～約135アミ
ノ酸、1アミノ酸～約130アミノ酸、1アミノ酸～約125アミノ酸、1アミノ酸～約120アミノ
酸、1アミノ酸～約115アミノ酸、1アミノ酸～約110アミノ酸、1アミノ酸～約105アミノ酸
、1アミノ酸～約100アミノ酸、1アミノ酸～約95アミノ酸、1アミノ酸～約90アミノ酸、1
アミノ酸～約85アミノ酸、1アミノ酸～約80アミノ酸、1アミノ酸～約75アミノ酸、1アミ
ノ酸～約70アミノ酸、1アミノ酸～約65アミノ酸、1アミノ酸～約60アミノ酸、1アミノ酸
～約55アミノ酸、1アミノ酸～約50アミノ酸、1アミノ酸～約45アミノ酸、1アミノ酸～約4
0アミノ酸、1アミノ酸～約35アミノ酸、1アミノ酸～約30アミノ酸、1アミノ酸～約25アミ
ノ酸、1アミノ酸～約20アミノ酸、1アミノ酸～約15アミノ酸、1アミノ酸～約10アミノ酸
、1アミノ酸～約9アミノ酸、1アミノ酸～約8アミノ酸、1アミノ酸～約7アミノ酸、1アミ
ノ酸～約6アミノ酸、1アミノ酸～約5アミノ酸、1アミノ酸～約4アミノ酸、1アミノ酸～約
3アミノ酸、約2アミノ酸～約200アミノ酸、約2アミノ酸～約195アミノ酸、約2アミノ酸～
約190アミノ酸、約2アミノ酸～約185アミノ酸、約2アミノ酸～約180アミノ酸、約2アミノ
酸～約175アミノ酸、約2アミノ酸～約170アミノ酸、約2アミノ酸～約165アミノ酸、約2ア
ミノ酸～約160アミノ酸、約2アミノ酸～約155アミノ酸、約2アミノ酸～約150アミノ酸、
約2アミノ酸～約145アミノ酸、約2アミノ酸～約140アミノ酸、約2アミノ酸～約135アミノ
酸、約2アミノ酸～約130アミノ酸、約2アミノ酸～約125アミノ酸、約2アミノ酸～約120ア
ミノ酸、約2アミノ酸～約115アミノ酸、約2アミノ酸～約110アミノ酸、約2アミノ酸～約1
05アミノ酸、約2アミノ酸～約100アミノ酸、約2アミノ酸～約95アミノ酸、約2アミノ酸～
約90アミノ酸、約2アミノ酸～約85アミノ酸、約2アミノ酸～約80アミノ酸、約2アミノ酸
～約75アミノ酸、約2アミノ酸～約70アミノ酸、約2アミノ酸～約65アミノ酸、約2アミノ
酸～約60アミノ酸、約2アミノ酸～約55アミノ酸、約2アミノ酸～約50アミノ酸、約2アミ
ノ酸～約45アミノ酸、約2アミノ酸～約40アミノ酸、約2アミノ酸～約35アミノ酸、約2ア
ミノ酸～約30アミノ酸、約2アミノ酸～約25アミノ酸、約2アミノ酸～約20アミノ酸、約2
アミノ酸～約15アミノ酸、約2アミノ酸～約10アミノ酸、約2アミノ酸～約9アミノ酸、約2
アミノ酸～約8アミノ酸、約2アミノ酸～約7アミノ酸、約2アミノ酸～約6アミノ酸、約2ア
ミノ酸～約5アミノ酸、約2アミノ酸～約4アミノ酸、約3アミノ酸～約200アミノ酸、約3ア
ミノ酸～約195アミノ酸、約3アミノ酸～約190アミノ酸、約3アミノ酸～約185アミノ酸、
約3アミノ酸～約180アミノ酸、約3アミノ酸～約175アミノ酸、約3アミノ酸～約170アミノ
酸、約3アミノ酸～約165アミノ酸、約3アミノ酸～約160アミノ酸、約3アミノ酸～約155ア
ミノ酸、約3アミノ酸～約150アミノ酸、約3アミノ酸～約145アミノ酸、約3アミノ酸～約1
40アミノ酸、約3アミノ酸～約135アミノ酸、約3アミノ酸～約130アミノ酸、約3アミノ酸
～約125アミノ酸、約3アミノ酸～約120アミノ酸、約3アミノ酸～約115アミノ酸、約3アミ
ノ酸～約110アミノ酸、約3アミノ酸～約105アミノ酸、約3アミノ酸～約100アミノ酸、約3
アミノ酸～約95アミノ酸、約3アミノ酸～約90アミノ酸、約3アミノ酸～約85アミノ酸、約
3アミノ酸～約80アミノ酸、約3アミノ酸～約75アミノ酸、約3アミノ酸～約70アミノ酸、
約3アミノ酸～約65アミノ酸、約3アミノ酸～約60アミノ酸、約3アミノ酸～約55アミノ酸
、約3アミノ酸～約50アミノ酸、約3アミノ酸～約45アミノ酸、約3アミノ酸～約40アミノ
酸、約3アミノ酸～約35アミノ酸、約3アミノ酸～約30アミノ酸、約3アミノ酸～約25アミ
ノ酸、約3アミノ酸～約20アミノ酸、約3アミノ酸～約15アミノ酸、約3アミノ酸～約10ア
ミノ酸、約3アミノ酸～約9アミノ酸、約3アミノ酸～約8アミノ酸、約3アミノ酸～約7アミ
ノ酸、約3アミノ酸～約6アミノ酸、約3アミノ酸～約5アミノ酸、約4アミノ酸～約200アミ
ノ酸、約4アミノ酸～約195アミノ酸、約4アミノ酸～約190アミノ酸、約4アミノ酸～約185
アミノ酸、約4アミノ酸～約180アミノ酸、約4アミノ酸～約175アミノ酸、約4アミノ酸～
約170アミノ酸、約4アミノ酸～約165アミノ酸、約4アミノ酸～約160アミノ酸、約4アミノ
酸～約155アミノ酸、約4アミノ酸～約150アミノ酸、約4アミノ酸～約145アミノ酸、約4ア
ミノ酸～約140アミノ酸、約4アミノ酸～約135アミノ酸、約4アミノ酸～約130アミノ酸、
約4アミノ酸～約125アミノ酸、約4アミノ酸～約120アミノ酸、約4アミノ酸～約115アミノ
酸、約4アミノ酸～約110アミノ酸、約4アミノ酸～約105アミノ酸、約4アミノ酸～約100ア
ミノ酸、約4アミノ酸～約95アミノ酸、約4アミノ酸～約90アミノ酸、約4アミノ酸～約85
アミノ酸、約4アミノ酸～約80アミノ酸、約4アミノ酸～約75アミノ酸、約4アミノ酸～約7
0アミノ酸、約4アミノ酸～約65アミノ酸、約4アミノ酸～約60アミノ酸、約4アミノ酸～約
55アミノ酸、約4アミノ酸～約50アミノ酸、約4アミノ酸～約45アミノ酸、約4アミノ酸～
約40アミノ酸、約4アミノ酸～約35アミノ酸、約4アミノ酸～約30アミノ酸、約4アミノ酸
～約25アミノ酸、約4アミノ酸～約20アミノ酸、約4アミノ酸～約15アミノ酸、約4アミノ
酸～約10アミノ酸、約4アミノ酸～約9アミノ酸、約4アミノ酸～約8アミノ酸、約4アミノ
酸～約7アミノ酸、約4アミノ酸～約6アミノ酸、約5アミノ酸～約200アミノ酸、約5アミノ
酸～約195アミノ酸、約5アミノ酸～約190アミノ酸、約5アミノ酸～約185アミノ酸、約5ア
ミノ酸～約180アミノ酸、約5アミノ酸～約175アミノ酸、約5アミノ酸～約170アミノ酸、
約5アミノ酸～約165アミノ酸、約5アミノ酸～約160アミノ酸、約5アミノ酸～約155アミノ
酸、約5アミノ酸～約150アミノ酸、約5アミノ酸～約145アミノ酸、約5アミノ酸～約140ア
ミノ酸、約5アミノ酸～約135アミノ酸、約5アミノ酸～約130アミノ酸、約5アミノ酸～約1
25アミノ酸、約5アミノ酸～約120アミノ酸、約5アミノ酸～約115アミノ酸、約5アミノ酸
～約110アミノ酸、約5アミノ酸～約105アミノ酸、約5アミノ酸～約100アミノ酸、約5アミ
ノ酸～約95アミノ酸、約5アミノ酸～約90アミノ酸、約5アミノ酸～約85アミノ酸、約5ア
ミノ酸～約80アミノ酸、約5アミノ酸～約75アミノ酸、約5アミノ酸～約70アミノ酸、約5
アミノ酸～約65アミノ酸、約5アミノ酸～約60アミノ酸、約5アミノ酸～約55アミノ酸、約
5アミノ酸～約50アミノ酸、約5アミノ酸～約45アミノ酸、約5アミノ酸～約40アミノ酸、
約5アミノ酸～約35アミノ酸、約5アミノ酸～約30アミノ酸、約5アミノ酸～約25アミノ酸
、約5アミノ酸～約20アミノ酸、約5アミノ酸～約15アミノ酸、約5アミノ酸～約10アミノ
酸、約5アミノ酸～約9アミノ酸、約5アミノ酸～約8アミノ酸、約5アミノ酸～約7アミノ酸
、約6アミノ酸～約200アミノ酸、約6アミノ酸～約195アミノ酸、約6アミノ酸～約190アミ
ノ酸、約6アミノ酸～約185アミノ酸、約6アミノ酸～約180アミノ酸、約6アミノ酸～約175
アミノ酸、約6アミノ酸～約170アミノ酸、約6アミノ酸～約165アミノ酸、約6アミノ酸～
約160アミノ酸、約6アミノ酸～約155アミノ酸、約6アミノ酸～約150アミノ酸、約6アミノ
酸～約145アミノ酸、約6アミノ酸～約140アミノ酸、約6アミノ酸～約135アミノ酸、約6ア
ミノ酸～約130アミノ酸、約6アミノ酸～約125アミノ酸、約6アミノ酸～約120アミノ酸、
約6アミノ酸～約115アミノ酸、約6アミノ酸～約110アミノ酸、約6アミノ酸～約105アミノ
酸、約6アミノ酸～約100アミノ酸、約6アミノ酸～約95アミノ酸、約6アミノ酸～約90アミ
ノ酸、約6アミノ酸～約85アミノ酸、約6アミノ酸～約80アミノ酸、約6アミノ酸～約75ア
ミノ酸、約6アミノ酸～約70アミノ酸、約6アミノ酸～約65アミノ酸、約6アミノ酸～約60
アミノ酸、約6アミノ酸～約55アミノ酸、約6アミノ酸～約50アミノ酸、約6アミノ酸～約4
5アミノ酸、約6アミノ酸～約40アミノ酸、約6アミノ酸～約35アミノ酸、約6アミノ酸～約
30アミノ酸、約6アミノ酸～約25アミノ酸、約6アミノ酸～約20アミノ酸、約6アミノ酸～
約15アミノ酸、約6アミノ酸～約10アミノ酸、約6アミノ酸～約9アミノ酸、約6アミノ酸～
約8アミノ酸、約7アミノ酸～約200アミノ酸、約7アミノ酸～約195アミノ酸、約7アミノ酸
～約190アミノ酸、約7アミノ酸～約185アミノ酸、約7アミノ酸～約180アミノ酸、約7アミ
ノ酸～約175アミノ酸、約7アミノ酸～約170アミノ酸、約7アミノ酸～約165アミノ酸、約7
アミノ酸～約160アミノ酸、約7アミノ酸～約155アミノ酸、約7アミノ酸～約150アミノ酸
、約7アミノ酸～約145アミノ酸、約7アミノ酸～約140アミノ酸、約7アミノ酸～約135アミ
ノ酸、約7アミノ酸～約130アミノ酸、約7アミノ酸～約125アミノ酸、約7アミノ酸～約120
アミノ酸、約7アミノ酸～約115アミノ酸、約7アミノ酸～約110アミノ酸、約7アミノ酸～
約105アミノ酸、約7アミノ酸～約100アミノ酸、約7アミノ酸～約95アミノ酸、約7アミノ
酸～約90アミノ酸、約7アミノ酸～約85アミノ酸、約7アミノ酸～約80アミノ酸、約7アミ
ノ酸～約75アミノ酸、約7アミノ酸～約70アミノ酸、約7アミノ酸～約65アミノ酸、約7ア
ミノ酸～約60アミノ酸、約7アミノ酸～約55アミノ酸、約7アミノ酸～約50アミノ酸、約7
アミノ酸～約45アミノ酸、約7アミノ酸～約40アミノ酸、約7アミノ酸～約35アミノ酸、約
7アミノ酸～約30アミノ酸、約7アミノ酸～約25アミノ酸、約7アミノ酸～約20アミノ酸、
約7アミノ酸～約15アミノ酸、約7アミノ酸～約10アミノ酸、約7アミノ酸～約9アミノ酸、
約8アミノ酸～約200アミノ酸、約8アミノ酸～約195アミノ酸、約8アミノ酸～約190アミノ
酸、約8アミノ酸～約185アミノ酸、約8アミノ酸～約180アミノ酸、約8アミノ酸～約175ア
ミノ酸、約8アミノ酸～約170アミノ酸、約8アミノ酸～約165アミノ酸、約8アミノ酸～約1
60アミノ酸、約8アミノ酸～約155アミノ酸、約8アミノ酸～約150アミノ酸、約8アミノ酸
～約145アミノ酸、約8アミノ酸～約140アミノ酸、約8アミノ酸～約135アミノ酸、約8アミ
ノ酸～約130アミノ酸、約8アミノ酸～約125アミノ酸、約8アミノ酸～約120アミノ酸、約8
アミノ酸～約115アミノ酸、約8アミノ酸～約110アミノ酸、約8アミノ酸～約105アミノ酸
、約8アミノ酸～約100アミノ酸、約8アミノ酸～約95アミノ酸、約8アミノ酸～約90アミノ
酸、約8アミノ酸～約85アミノ酸、約8アミノ酸～約80アミノ酸、約8アミノ酸～約75アミ
ノ酸、約8アミノ酸～約70アミノ酸、約8アミノ酸～約65アミノ酸、約8アミノ酸～約60ア
ミノ酸、約8アミノ酸～約55アミノ酸、約8アミノ酸～約50アミノ酸、約8アミノ酸～約45
アミノ酸、約8アミノ酸～約40アミノ酸、約8アミノ酸～約35アミノ酸、約8アミノ酸～約3
0アミノ酸、約8アミノ酸～約25アミノ酸、約8アミノ酸～約20アミノ酸、約8アミノ酸～約
15アミノ酸、約8アミノ酸～約10アミノ酸、約10アミノ酸～約200アミノ酸、約10アミノ酸
～約195アミノ酸、約10アミノ酸～約190アミノ酸、約10アミノ酸～約185アミノ酸、約10
アミノ酸～約180アミノ酸、約10アミノ酸～約175アミノ酸、約10アミノ酸～約170アミノ
酸、約10アミノ酸～約165アミノ酸、約10アミノ酸～約160アミノ酸、約10アミノ酸～約15
5アミノ酸、約10アミノ酸～約150アミノ酸、約10アミノ酸～約145アミノ酸、約10アミノ
酸～約140アミノ酸、約10アミノ酸～約135アミノ酸、約10アミノ酸～約130アミノ酸、約1
0アミノ酸～約125アミノ酸、約10アミノ酸～約120アミノ酸、約10アミノ酸～約115アミノ
酸、約10アミノ酸～約110アミノ酸、約10アミノ酸～約105アミノ酸、約10アミノ酸～約10
0アミノ酸、約10アミノ酸～約95アミノ酸、約10アミノ酸～約90アミノ酸、約10アミノ酸
～約85アミノ酸、約10アミノ酸～約80アミノ酸、約10アミノ酸～約75アミノ酸、約10アミ
ノ酸～約70アミノ酸、約10アミノ酸～約65アミノ酸、約10アミノ酸～約60アミノ酸、約10
アミノ酸～約55アミノ酸、約10アミノ酸～約50アミノ酸、約10アミノ酸～約45アミノ酸、
約10アミノ酸～約40アミノ酸、約10アミノ酸～約35アミノ酸、
約10アミノ酸～約30アミノ酸、約10アミノ酸～約25アミノ酸、約10アミノ酸～約20アミノ
酸、約10アミノ酸～約15アミノ酸、約15アミノ酸～約200アミノ酸、約15アミノ酸～約195
アミノ酸、約15アミノ酸～約190アミノ酸、約15アミノ酸～約185アミノ酸、約15アミノ酸
～約180アミノ酸、約15アミノ酸～約175アミノ酸、約15アミノ酸～約170アミノ酸、約15
アミノ酸～約165アミノ酸、約15アミノ酸～約160アミノ酸、約15アミノ酸～約155アミノ
酸、約15アミノ酸～約150アミノ酸、約15アミノ酸～約145アミノ酸、約15アミノ酸～約14
0アミノ酸、約15アミノ酸～約135アミノ酸、約15アミノ酸～約130アミノ酸、約15アミノ
酸～約125アミノ酸、約15アミノ酸～約120アミノ酸、約15アミノ酸～約115アミノ酸、約1
5アミノ酸～約110アミノ酸、約15アミノ酸～約105アミノ酸、約15アミノ酸～約100アミノ
酸、約15アミノ酸～約95アミノ酸、約15アミノ酸～約90アミノ酸、約15アミノ酸～約85ア
ミノ酸、約15アミノ酸～約80アミノ酸、約15アミノ酸～約75アミノ酸、約15アミノ酸～約
70アミノ酸、約15アミノ酸～約65アミノ酸、約15アミノ酸～約60アミノ酸、約15アミノ酸
～約55アミノ酸、約15アミノ酸～約50アミノ酸、約15アミノ酸～約45アミノ酸、約15アミ
ノ酸～約40アミノ酸、約15アミノ酸～約35アミノ酸、約15アミノ酸～約30アミノ酸、約15
アミノ酸～約25アミノ酸、約15アミノ酸～約20アミノ酸、約20アミノ酸～約200アミノ酸
、約20アミノ酸～約195アミノ酸、約20アミノ酸～約190アミノ酸、約20アミノ酸～約185
アミノ酸、約20アミノ酸～約180アミノ酸、約20アミノ酸～約175アミノ酸、約20アミノ酸
～約170アミノ酸、約20アミノ酸～約165アミノ酸、約20アミノ酸～約160アミノ酸、約20
アミノ酸～約155アミノ酸、約20アミノ酸～約150アミノ酸、約20アミノ酸～約145アミノ
酸、約20アミノ酸～約140アミノ酸、約20アミノ酸～約135アミノ酸、約20アミノ酸～約13
0アミノ酸、約20アミノ酸～約125アミノ酸、約20アミノ酸～約120アミノ酸、約20アミノ
酸～約115アミノ酸、約20アミノ酸～約110アミノ酸、約20アミノ酸～約105アミノ酸、約2
0アミノ酸～約100アミノ酸、約20アミノ酸～約95アミノ酸、約20アミノ酸～約90アミノ酸
、約20アミノ酸～約85アミノ酸、約20アミノ酸～約80アミノ酸、約20アミノ酸～約75アミ
ノ酸、約20アミノ酸～約70アミノ酸、約20アミノ酸～約65アミノ酸、約20アミノ酸～約60
アミノ酸、約20アミノ酸～約55アミノ酸、約20アミノ酸～約50アミノ酸、約20アミノ酸～
約45アミノ酸、約20アミノ酸～約40アミノ酸、約20アミノ酸～約35アミノ酸、約20アミノ
酸～約30アミノ酸、約20アミノ酸～約25アミノ酸、約25アミノ酸～約200アミノ酸、約25
アミノ酸～約195アミノ酸、約25アミノ酸～約190アミノ酸、約25アミノ酸～約185アミノ
酸、約25アミノ酸～約180アミノ酸、約25アミノ酸～約175アミノ酸、約25アミノ酸～約17
0アミノ酸、約25アミノ酸～約165アミノ酸、約25アミノ酸～約160アミノ酸、約25アミノ
酸～約155アミノ酸、約25アミノ酸～約150アミノ酸、約25アミノ酸～約145アミノ酸、約2
5アミノ酸～約140アミノ酸、約25アミノ酸～約135アミノ酸、約25アミノ酸～約130アミノ
酸、約25アミノ酸～約125アミノ酸、約25アミノ酸～約120アミノ酸、約25アミノ酸～約11
5アミノ酸、約25アミノ酸～約110アミノ酸、約25アミノ酸～約105アミノ酸、約25アミノ
酸～約100アミノ酸、約25アミノ酸～約95アミノ酸、約25アミノ酸～約90アミノ酸、約25
アミノ酸～約85アミノ酸、約25アミノ酸～約80アミノ酸、約25アミノ酸～約75アミノ酸、
約25アミノ酸～約70アミノ酸、約25アミノ酸～約65アミノ酸、約25アミノ酸～約60アミノ
酸、約25アミノ酸～約55アミノ酸、約25アミノ酸～約50アミノ酸、約25アミノ酸～約45ア
ミノ酸、約25アミノ酸～約40アミノ酸、約25アミノ酸～約35アミノ酸、約25アミノ酸～約
30アミノ酸、約30アミノ酸～約200アミノ酸、約30アミノ酸～約195アミノ酸、約30アミノ
酸～約190アミノ酸、約30アミノ酸～約185アミノ酸、約30アミノ酸～約180アミノ酸、約3
0アミノ酸～約175アミノ酸、約30アミノ酸～約170アミノ酸、約30アミノ酸～約165アミノ
酸、約30アミノ酸～約160アミノ酸、約30アミノ酸～約155アミノ酸、約30アミノ酸～約15
0アミノ酸、約30アミノ酸～約145アミノ酸、約30アミノ酸～約140アミノ酸、約30アミノ
酸～約135アミノ酸、約30アミノ酸～約130アミノ酸、約30アミノ酸～約125アミノ酸、約3
0アミノ酸～約120アミノ酸、約30アミノ酸～約115アミノ酸、約30アミノ酸～約110アミノ
酸、約30アミノ酸～約105アミノ酸、約30アミノ酸～約100アミノ酸、約30アミノ酸～約95
アミノ酸、約30アミノ酸～約90アミノ酸、約30アミノ酸～約85アミノ酸、約30アミノ酸～
約80アミノ酸、約30アミノ酸～約75アミノ酸、約30アミノ酸～約70アミノ酸、約30アミノ
酸～約65アミノ酸、約30アミノ酸～約60アミノ酸、約30アミノ酸～約55アミノ酸、約30ア
ミノ酸～約50アミノ酸、約30アミノ酸～約45アミノ酸、約30アミノ酸～約40アミノ酸、約
30アミノ酸～約35アミノ酸、約35アミノ酸～約200アミノ酸、約35アミノ酸～約195アミノ
酸、約35アミノ酸～約190アミノ酸、約35アミノ酸～約185アミノ酸、約35アミノ酸～約18
0アミノ酸、約35アミノ酸～約175アミノ酸、約35アミノ酸～約170アミノ酸、約35アミノ
酸～約165アミノ酸、約35アミノ酸～約160アミノ酸、約35アミノ酸～約155アミノ酸、約3
5アミノ酸～約150アミノ酸、約35アミノ酸～約145アミノ酸、約35アミノ酸～約140アミノ
酸、約35アミノ酸～約135アミノ酸、約35アミノ酸～約130アミノ酸、約35アミノ酸～約12
5アミノ酸、約35アミノ酸～約120アミノ酸、約35アミノ酸～約115アミノ酸、約35アミノ
酸～約110アミノ酸、約35アミノ酸～約105アミノ酸、約35アミノ酸～約100アミノ酸、約3
5アミノ酸～約95アミノ酸、約35アミノ酸～約90アミノ酸、約35アミノ酸～約85アミノ酸
、約35アミノ酸～約80アミノ酸、約35アミノ酸～約75アミノ酸、約35アミノ酸～約70アミ
ノ酸、約35アミノ酸～約65アミノ酸、約35アミノ酸～約60アミノ酸、約35アミノ酸～約55
アミノ酸、約35アミノ酸～約50アミノ酸、約35アミノ酸～約45アミノ酸、約35アミノ酸～
約40アミノ酸、約40アミノ酸～約200アミノ酸、約40アミノ酸～約195アミノ酸、約40アミ
ノ酸～約190アミノ酸、約40アミノ酸～約185アミノ酸、約40アミノ酸～約180アミノ酸、
約40アミノ酸～約175アミノ酸、約40アミノ酸～約170アミノ酸、約40アミノ酸～約165ア
ミノ酸、約40アミノ酸～約160アミノ酸、約40アミノ酸～約155アミノ酸、約40アミノ酸～
約150アミノ酸、約40アミノ酸～約145アミノ酸、約40アミノ酸～約140アミノ酸、約40ア
ミノ酸～約135アミノ酸、約40アミノ酸～約130アミノ酸、約40アミノ酸～約125アミノ酸
、約40アミノ酸～約120アミノ酸、約40アミノ酸～約115アミノ酸、約40アミノ酸～約110
アミノ酸、約40アミノ酸～約105アミノ酸、約40アミノ酸～約100アミノ酸、約40アミノ酸
～約95アミノ酸、約40アミノ酸～約90アミノ酸、約40アミノ酸～約85アミノ酸、約40アミ
ノ酸～約80アミノ酸、約40アミノ酸～約75アミノ酸、約40アミノ酸～約70アミノ酸、約40
アミノ酸～約65アミノ酸、約40アミノ酸～約60アミノ酸、約40アミノ酸～約55アミノ酸、
約40アミノ酸～約50アミノ酸、約40アミノ酸～約45アミノ酸、約45アミノ酸～約200アミ
ノ酸、約45アミノ酸～約195アミノ酸、約45アミノ酸～約190アミノ酸、約45アミノ酸～約
185アミノ酸、約45アミノ酸～約180アミノ酸、約45アミノ酸～約175アミノ酸、約45アミ
ノ酸～約170アミノ酸、約45アミノ酸～約165アミノ酸、約45アミノ酸～約160アミノ酸、
約45アミノ酸～約155アミノ酸、約45アミノ酸～約150アミノ酸、約45アミノ酸～約145ア
ミノ酸、約45アミノ酸～約140アミノ酸、約45アミノ酸～約135アミノ酸、約45アミノ酸～
約130アミノ酸、約45アミノ酸～約125アミノ酸、約45アミノ酸～約120アミノ酸、約45ア
ミノ酸～約115アミノ酸、約45アミノ酸～約110アミノ酸、約45アミノ酸～約105アミノ酸
、約45アミノ酸～約100アミノ酸、約45アミノ酸～約95アミノ酸、約45アミノ酸～約90ア
ミノ酸、約45アミノ酸～約85アミノ酸、約45アミノ酸～約80アミノ酸、約45アミノ酸～約
75アミノ酸、約45アミノ酸～約70アミノ酸、約45アミノ酸～約65アミノ酸、約45アミノ酸
～約60アミノ酸、約45アミノ酸～約55アミノ酸、約45アミノ酸～約50アミノ酸、約50アミ
ノ酸～約200アミノ酸、約50アミノ酸～約195アミノ酸、約50アミノ酸～約190アミノ酸、
約50アミノ酸～約185アミノ酸、約50アミノ酸～約180アミノ酸、約50アミノ酸～約175ア
ミノ酸、約50アミノ酸～約170アミノ酸、約50アミノ酸～約165アミノ酸、約50アミノ酸～
約160アミノ酸、約50アミノ酸～約155アミノ酸、約50アミノ酸～約150アミノ酸、約50ア
ミノ酸～約145アミノ酸、約50アミノ酸～約140アミノ酸、約50アミノ酸～約135アミノ酸
、約50アミノ酸～約130アミノ酸、約50アミノ酸～約125アミノ酸、約50アミノ酸～約120
アミノ酸、約50アミノ酸～約115アミノ酸、約50アミノ酸～約110アミノ酸、約50アミノ酸
～約105アミノ酸、約50アミノ酸～約100アミノ酸、約50アミノ酸～約95アミノ酸、約50ア
ミノ酸～約90アミノ酸、約50アミノ酸～約85アミノ酸、約50アミノ酸～約80アミノ酸、約
50アミノ酸～約75アミノ酸、約50アミノ酸～約70アミノ酸、約50アミノ酸～約65アミノ酸
、約50アミノ酸～約60アミノ酸、約50アミノ酸～約55アミノ酸、約55アミノ酸～約200ア
ミノ酸、約55アミノ酸～約195アミノ酸、約55アミノ酸～約190アミノ酸、約55アミノ酸～
約185アミノ酸、約55アミノ酸～約180アミノ酸、約55アミノ酸～約175アミノ酸、約55ア
ミノ酸～約170アミノ酸、約55アミノ酸～約165アミノ酸、約55アミノ酸～約160アミノ酸
、約55アミノ酸～約155アミノ酸、約55アミノ酸～約150アミノ酸、約55アミノ酸～約145
アミノ酸、約55アミノ酸～約140アミノ酸、約55アミノ酸～約135アミノ酸、約55アミノ酸
～約130アミノ酸、約55アミノ酸～約125アミノ酸、約55アミノ酸～約120アミノ酸、約55
アミノ酸～約115アミノ酸、約55アミノ酸～約110アミノ酸、約55アミノ酸～約105アミノ
酸、約55アミノ酸～約100アミノ酸、約55アミノ酸～約95アミノ酸、約55アミノ酸～約90
アミノ酸、約55アミノ酸～約85アミノ酸、約55アミノ酸～約80アミノ酸、約55アミノ酸～
約75アミノ酸、約55アミノ酸～約70アミノ酸、約55アミノ酸～約65アミノ酸、約55アミノ
酸～約60アミノ酸、約60アミノ酸～約200アミノ酸、約60アミノ酸～約195アミノ酸、約60
アミノ酸～約190アミノ酸、約60アミノ酸～約185アミノ酸、約60アミノ酸～約180アミノ
酸、約60アミノ酸～約175アミノ酸、約60アミノ酸～約170アミノ酸、約60アミノ酸～約16
5アミノ酸、約60アミノ酸～約160アミノ酸、約60アミノ酸～約155アミノ酸、約60アミノ
酸～約150アミノ酸、約60アミノ酸～約145アミノ酸、約60アミノ酸～約140アミノ酸、約6
0アミノ酸～約135アミノ酸、約60アミノ酸～約130アミノ酸、約60アミノ酸～約125アミノ
酸、約60アミノ酸～約120アミノ酸、約60アミノ酸～約115アミノ酸、約60アミノ酸～約11
0アミノ酸、約60アミノ酸～約105アミノ酸、約60アミノ酸～約100アミノ酸、約60アミノ
酸～約95アミノ酸、約60アミノ酸～約90アミノ酸、約60アミノ酸～約85アミノ酸、約60ア
ミノ酸～約80アミノ酸、約60アミノ酸～約75アミノ酸、約60アミノ酸～約70アミノ酸、約
60アミノ酸～約65アミノ酸、約65アミノ酸～約200アミノ酸、約65アミノ酸～約195アミノ
酸、約65アミノ酸～約190アミノ酸、約65アミノ酸～約185アミノ酸、約65アミノ酸～約18
0アミノ酸、約65アミノ酸～約175アミノ酸、約65アミノ酸～約170アミノ酸、約65アミノ
酸～約165アミノ酸、約65アミノ酸～約160アミノ酸、約65アミノ酸～約155アミノ酸、約6
5アミノ酸～約150アミノ酸、約65アミノ酸～約145アミノ酸、約65アミノ酸～約140アミノ
酸、約65アミノ酸～約135アミノ酸、約65アミノ酸～約130アミノ酸、約65アミノ酸～約12
5アミノ酸、約65アミノ酸～約120アミノ酸、約65アミノ酸～約115アミノ酸、約65アミノ
酸～約110アミノ酸、約65アミノ酸～約105アミノ酸、約65アミノ酸～約100アミノ酸、約6
5アミノ酸～約95アミノ酸、約65アミノ酸～約90アミノ酸、約65アミノ酸～約85アミノ酸
、約65アミノ酸～約80アミノ酸、約65アミノ酸～約75アミノ酸、約65アミノ酸～約70アミ
ノ酸、約70アミノ酸～約200アミノ酸、約70アミノ酸～
約195アミノ酸、約70アミノ酸～約190アミノ酸、約70アミノ酸～約185アミノ酸、約70ア
ミノ酸～約180アミノ酸、約70アミノ酸～約175アミノ酸、約70アミノ酸～約170アミノ酸
、約70アミノ酸～約165アミノ酸、約70アミノ酸～約160アミノ酸、約70アミノ酸～約155
アミノ酸、約70アミノ酸～約150アミノ酸、約70アミノ酸～約145アミノ酸、約70アミノ酸
～約140アミノ酸、約70アミノ酸～約135アミノ酸、約70アミノ酸～約130アミノ酸、約70
アミノ酸～約125アミノ酸、約70アミノ酸～約120アミノ酸、約70アミノ酸～約115アミノ
酸、約70アミノ酸～約110アミノ酸、約70アミノ酸～約105アミノ酸、約70アミノ酸～約10
0アミノ酸、約70アミノ酸～約95アミノ酸、約70アミノ酸～約90アミノ酸、約70アミノ酸
～約85アミノ酸、約70アミノ酸～約80アミノ酸、約70アミノ酸～約75アミノ酸、約75アミ
ノ酸～約200アミノ酸、約75アミノ酸～約195アミノ酸、約75アミノ酸～約190アミノ酸、
約75アミノ酸～約185アミノ酸、約75アミノ酸～約180アミノ酸、約75アミノ酸～約175ア
ミノ酸、約75アミノ酸～約170アミノ酸、約75アミノ酸～約165アミノ酸、約75アミノ酸～
約160アミノ酸、約75アミノ酸～約155アミノ酸、約75アミノ酸～約150アミノ酸、約75ア
ミノ酸～約145アミノ酸、約75アミノ酸～約140アミノ酸、約75アミノ酸～約135アミノ酸
、約75アミノ酸～約130アミノ酸、約75アミノ酸～約125アミノ酸、約75アミノ酸～約120
アミノ酸、約75アミノ酸～約115アミノ酸、約75アミノ酸～約110アミノ酸、約75アミノ酸
～約105アミノ酸、約75アミノ酸～約100アミノ酸、約75アミノ酸～約95アミノ酸、約75ア
ミノ酸～約90アミノ酸、約75アミノ酸～約85アミノ酸、約75アミノ酸～約80アミノ酸、約
80アミノ酸～約200アミノ酸、約80アミノ酸～約195アミノ酸、約80アミノ酸～約190アミ
ノ酸、約80アミノ酸～約185アミノ酸、約80アミノ酸～約180アミノ酸、約80アミノ酸～約
175アミノ酸、約80アミノ酸～約170アミノ酸、約80アミノ酸～約165アミノ酸、約80アミ
ノ酸～約160アミノ酸、約80アミノ酸～約155アミノ酸、約80アミノ酸～約150アミノ酸、
約80アミノ酸～約145アミノ酸、約80アミノ酸～約140アミノ酸、約80アミノ酸～約135ア
ミノ酸、約80アミノ酸～約130アミノ酸、約80アミノ酸～約125アミノ酸、約80アミノ酸～
約120アミノ酸、約80アミノ酸～約115アミノ酸、約80アミノ酸～約110アミノ酸、約80ア
ミノ酸～約105アミノ酸、約80アミノ酸～約100アミノ酸、約80アミノ酸～約95アミノ酸、
約80アミノ酸～約90アミノ酸、約80アミノ酸～約85アミノ酸、約85アミノ酸～約200アミ
ノ酸、約85アミノ酸～約195アミノ酸、約85アミノ酸～約190アミノ酸、約85アミノ酸～約
185アミノ酸、約85アミノ酸～約180アミノ酸、約85アミノ酸～約175アミノ酸、約85アミ
ノ酸～約170アミノ酸、約85アミノ酸～約165アミノ酸、約85アミノ酸～約160アミノ酸、
約85アミノ酸～約155アミノ酸、約85アミノ酸～約150アミノ酸、約85アミノ酸～約145ア
ミノ酸、約85アミノ酸～約140アミノ酸、約85アミノ酸～約135アミノ酸、約85アミノ酸～
約130アミノ酸、約85アミノ酸～約125アミノ酸、約85アミノ酸～約120アミノ酸、約85ア
ミノ酸～約115アミノ酸、約85アミノ酸～約110アミノ酸、約85アミノ酸～約105アミノ酸
、約85アミノ酸～約100アミノ酸、約85アミノ酸～約95アミノ酸、約85アミノ酸～約90ア
ミノ酸、約90アミノ酸～約200アミノ酸、約90アミノ酸～約195アミノ酸、約90アミノ酸～
約190アミノ酸、約90アミノ酸～約185アミノ酸、約90アミノ酸～約180アミノ酸、約90ア
ミノ酸～約175アミノ酸、約90アミノ酸～約170アミノ酸、約90アミノ酸～約165アミノ酸
、約90アミノ酸～約160アミノ酸、約90アミノ酸～約155アミノ酸、約90アミノ酸～約150
アミノ酸、約90アミノ酸～約145アミノ酸、約90アミノ酸～約140アミノ酸、約90アミノ酸
～約135アミノ酸、約90アミノ酸～約130アミノ酸、約90アミノ酸～約125アミノ酸、約90
アミノ酸～約120アミノ酸、約90アミノ酸～約115アミノ酸、約90アミノ酸～約110アミノ
酸、約90アミノ酸～約105アミノ酸、約90アミノ酸～約100アミノ酸、約90アミノ酸～約95
アミノ酸、約95アミノ酸～約200アミノ酸、約95アミノ酸～約195アミノ酸、約95アミノ酸
～約190アミノ酸、約95アミノ酸～約185アミノ酸、約95アミノ酸～約180アミノ酸、約95
アミノ酸～約175アミノ酸、約95アミノ酸～約170アミノ酸、約95アミノ酸～約165アミノ
酸、約95アミノ酸～約160アミノ酸、約95アミノ酸～約155アミノ酸、約95アミノ酸～約15
0アミノ酸、約95アミノ酸～約145アミノ酸、約95アミノ酸～約140アミノ酸、約95アミノ
酸～約135アミノ酸、約95アミノ酸～約130アミノ酸、約95アミノ酸～約125アミノ酸、約9
5アミノ酸～約120アミノ酸、約95アミノ酸～約115アミノ酸、約95アミノ酸～約110アミノ
酸、約95アミノ酸～約105アミノ酸、約95アミノ酸～約100アミノ酸、約100アミノ酸～約2
00アミノ酸、約100アミノ酸～約195アミノ酸、約100アミノ酸～約190アミノ酸、約100ア
ミノ酸～約185アミノ酸、約100アミノ酸～約180アミノ酸、約100アミノ酸～約175アミノ
酸、約100アミノ酸～約170アミノ酸、約100アミノ酸～約165アミノ酸、約100アミノ酸～
約160アミノ酸、約100アミノ酸～約155アミノ酸、約100アミノ酸～約150アミノ酸、約100
アミノ酸～約145アミノ酸、約100アミノ酸～約140アミノ酸、約100アミノ酸～約135アミ
ノ酸、約100アミノ酸～約130アミノ酸、約100アミノ酸～約125アミノ酸、約100アミノ酸
～約120アミノ酸、約100アミノ酸～約115アミノ酸、約100アミノ酸～約110アミノ酸、約1
00アミノ酸～約105アミノ酸、約105アミノ酸～約200アミノ酸、約105アミノ酸～約195ア
ミノ酸、約105アミノ酸～約190アミノ酸、約105アミノ酸～約185アミノ酸、約105アミノ
酸～約180アミノ酸、約105アミノ酸～約175アミノ酸、約105アミノ酸～約170アミノ酸、
約105アミノ酸～約165アミノ酸、約105アミノ酸～約160アミノ酸、約105アミノ酸～約155
アミノ酸、約105アミノ酸～約150アミノ酸、約105アミノ酸～約145アミノ酸、約105アミ
ノ酸～約140アミノ酸、約105アミノ酸～約135アミノ酸、約105アミノ酸～約130アミノ酸
、約105アミノ酸～約125アミノ酸、約105アミノ酸～約120アミノ酸、約105アミノ酸～約1
15アミノ酸、約105アミノ酸～約110アミノ酸、約110アミノ酸～約200アミノ酸、約110ア
ミノ酸～約195アミノ酸、約110アミノ酸～約190アミノ酸、約110アミノ酸～約185アミノ
酸、約110アミノ酸～約180アミノ酸、約110アミノ酸～約175アミノ酸、約110アミノ酸～
約170アミノ酸、約110アミノ酸～約165アミノ酸、約110アミノ酸～約160アミノ酸、約110
アミノ酸～約155アミノ酸、約110アミノ酸～約150アミノ酸、約110アミノ酸～約145アミ
ノ酸、約110アミノ酸～約140アミノ酸、約110アミノ酸～約135アミノ酸、約110アミノ酸
～約130アミノ酸、約110アミノ酸～約125アミノ酸、約110アミノ酸～約120アミノ酸、約1
10アミノ酸～約115アミノ酸、約115アミノ酸～約200アミノ酸、約115アミノ酸～約195ア
ミノ酸、約115アミノ酸～約190アミノ酸、約115アミノ酸～約185アミノ酸、約115アミノ
酸～約180アミノ酸、約115アミノ酸～約175アミノ酸、約115アミノ酸～約170アミノ酸、
約115アミノ酸～約165アミノ酸、約115アミノ酸～約160アミノ酸、約115アミノ酸～約155
アミノ酸、約115アミノ酸～約150アミノ酸、約115アミノ酸～約145アミノ酸、約115アミ
ノ酸～約140アミノ酸、約115アミノ酸～約135アミノ酸、約115アミノ酸～約130アミノ酸
、約115アミノ酸～約125アミノ酸、約115アミノ酸～約120アミノ酸、約120アミノ酸～約2
00アミノ酸、約120アミノ酸～約195アミノ酸、約120アミノ酸～約190アミノ酸、約120ア
ミノ酸～約185アミノ酸、約120アミノ酸～約180アミノ酸、約120アミノ酸～約175アミノ
酸、約120アミノ酸～約170アミノ酸、約120アミノ酸～約165アミノ酸、約120アミノ酸～
約160アミノ酸、約120アミノ酸～約155アミノ酸、約120アミノ酸～約150アミノ酸、約120
アミノ酸～約145アミノ酸、約120アミノ酸～約140アミノ酸、約120アミノ酸～約135アミ
ノ酸、約120アミノ酸～約130アミノ酸、約120アミノ酸～約125アミノ酸、約125アミノ酸
～約200アミノ酸、約125アミノ酸～約195アミノ酸、約125アミノ酸～約190アミノ酸、約1
25アミノ酸～約185アミノ酸、約125アミノ酸～約180アミノ酸、約125アミノ酸～約175ア
ミノ酸、約125アミノ酸～約170アミノ酸、約125アミノ酸～約165アミノ酸、約125アミノ
酸～約160アミノ酸、約125アミノ酸～約155アミノ酸、約125アミノ酸～約150アミノ酸、
約125アミノ酸～約145アミノ酸、約125アミノ酸～約140アミノ酸、約125アミノ酸～約135
アミノ酸、約125アミノ酸～約130アミノ酸、約130アミノ酸～約200アミノ酸、約130アミ
ノ酸～約195アミノ酸、約130アミノ酸～約190アミノ酸、約130アミノ酸～約185アミノ酸
、約130アミノ酸～約180アミノ酸、約130アミノ酸～約175アミノ酸、約130アミノ酸～約1
70アミノ酸、約130アミノ酸～約165アミノ酸、約130アミノ酸～約160アミノ酸、約130ア
ミノ酸～約155アミノ酸、約130アミノ酸～約150アミノ酸、約130アミノ酸～約145アミノ
酸、約130アミノ酸～約140アミノ酸、約130アミノ酸～約135アミノ酸、約135アミノ酸～
約200アミノ酸、約135アミノ酸～約195アミノ酸、約135アミノ酸～約190アミノ酸、約135
アミノ酸～約185アミノ酸、約135アミノ酸～約180アミノ酸、約135アミノ酸～約175アミ
ノ酸、約135アミノ酸～約170アミノ酸、約135アミノ酸～約165アミノ酸、約135アミノ酸
～約160アミノ酸、約135アミノ酸～約155アミノ酸、約135アミノ酸～約150アミノ酸、約1
35アミノ酸～約145アミノ酸、約135アミノ酸～約140アミノ酸、約140アミノ酸～約200ア
ミノ酸、約140アミノ酸～約195アミノ酸、約140アミノ酸～約190アミノ酸、約140アミノ
酸～約185アミノ酸、約140アミノ酸～約180アミノ酸、約140アミノ酸～約175アミノ酸、
約140アミノ酸～約170アミノ酸、約140アミノ酸～約165アミノ酸、約140アミノ酸～約160
アミノ酸、約140アミノ酸～約155アミノ酸、約140アミノ酸～約150アミノ酸、約40アミノ
酸～約145アミノ酸、約145アミノ酸～約200アミノ酸、約145アミノ酸～約195アミノ酸、
約145アミノ酸～約190アミノ酸、約145アミノ酸～約185アミノ酸、約145アミノ酸～約180
アミノ酸、約145アミノ酸～約175アミノ酸、約145アミノ酸～約170アミノ酸、約145アミ
ノ酸～約165アミノ酸、約145アミノ酸～約160アミノ酸、約145アミノ酸～約155アミノ酸
、約145アミノ酸～約150アミノ酸、約150アミノ酸～約200アミノ酸、約150アミノ酸～約1
95アミノ酸、約150アミノ酸～約190アミノ酸、約150アミノ酸～約185アミノ酸、約150ア
ミノ酸～約180アミノ酸、約150アミノ酸～約175アミノ酸、約150アミノ酸～約170アミノ
酸、約150アミノ酸～約165アミノ酸、約150アミノ酸～約160アミノ酸、約150アミノ酸～
約155アミノ酸、約155アミノ酸～約200アミノ酸、約155アミノ酸～約195アミノ酸、約155
アミノ酸～約190アミノ酸、約155アミノ酸～約185アミノ酸、約155アミノ酸～約180アミ
ノ酸、約155アミノ酸～約175アミノ酸、約155アミノ酸～約170アミノ酸、約155アミノ酸
～約165アミノ酸、約155アミノ酸～約160アミノ酸、約160アミノ酸～約200アミノ酸、約1
60アミノ酸～約195アミノ酸、約160アミノ酸～約190アミノ酸、約160アミノ酸～約185ア
ミノ酸、約160アミノ酸～約180アミノ酸、約160アミノ酸～約175アミノ酸、約160アミノ
酸～約170アミノ酸、約160アミノ酸～約165アミノ酸、約165アミノ酸～約200アミノ酸、
約165アミノ酸～約195アミノ酸、約165アミノ酸～約190アミノ酸、約165アミノ酸～約185
アミノ酸、約165アミノ酸～約180アミノ酸、約165アミノ酸～約175アミノ酸、約165アミ
ノ酸～約170アミノ酸、約170アミノ酸～約200アミノ酸、約170アミノ酸～約195アミノ酸
、約170アミノ酸～約190アミノ酸、約170アミノ酸～約185アミノ酸、約170アミノ酸～約1
80アミノ酸、約170アミノ酸～約175アミノ酸、約175アミノ酸～約200アミノ酸、約175ア
ミノ酸～約195アミノ酸、約175アミノ酸～約190アミノ酸、約175アミノ酸～約185アミノ
酸、約175アミノ酸～約180アミノ酸、約180アミノ酸～約200アミノ酸、約180アミノ酸～
約195アミノ酸、約180アミノ酸～約190アミノ酸、約180アミノ酸～約185アミノ酸、約185
アミノ酸～約200アミノ酸、約185アミノ酸～約195アミノ酸、約185アミノ酸～約190アミ
ノ酸、約
190アミノ酸～約200アミノ酸、約190アミノ酸～約195アミノ酸、約195アミノ酸～約200ア
ミノ酸が欠失している、野生型全長オトフェリンタンパク質（例えば、野生型ヒト全長オ
トフェリンタンパク質）の配列を含むことができる。2個以上のアミノ酸が野生型全長オ
トフェリンタンパク質の配列から欠失しているいくつかの態様において、該2個以上の欠
失したアミノ酸は、野生型全長タンパク質の配列において連続していてもよい。2個以上
のアミノ酸が野生型全長オトフェリンタンパク質の配列から欠失している他の例では、該
2個以上の欠失したアミノ酸は、野生型全長タンパク質の配列において連続していない。
異なる種に由来する野生型全長オトフェリンタンパク質の間で保存されていないアミノ酸
は、活性を失うことなく欠失させることができるが、異なる種に由来する野生型全長オト
フェリンタンパク質の間で保存されているそれらのアミノ酸は、活性に関与している可能
性が（異なる種の間で保存されていないアミノ酸よりも）高いため、欠失させるべきでは
ないことを、当業者は認識しているであろう。
95アミノ酸、1アミノ酸～約190アミノ酸、1アミノ酸～約185アミノ酸、1アミノ酸～約180
アミノ酸、1アミノ酸～約175アミノ酸、1アミノ酸～約170アミノ酸、1アミノ酸～約165
アミノ酸、1アミノ酸～約160アミノ酸、1アミノ酸～約155アミノ酸、1アミノ酸～約150ア
ミノ酸、1アミノ酸～約145アミノ酸、1アミノ酸～約140アミノ酸、1アミノ酸～約135アミ
ノ酸、1アミノ酸～約130アミノ酸、1アミノ酸～約125アミノ酸、1アミノ酸～約120アミノ
酸、1アミノ酸～約115アミノ酸、1アミノ酸～約110アミノ酸、1アミノ酸～約105アミノ酸
、1アミノ酸～約100アミノ酸、1アミノ酸～約95アミノ酸、1アミノ酸～約90アミノ酸、1
アミノ酸～約85アミノ酸、1アミノ酸～約80アミノ酸、1アミノ酸～約75アミノ酸、1アミ
ノ酸～約70アミノ酸、1アミノ酸～約65アミノ酸、1アミノ酸～約60アミノ酸、1アミノ酸
～約55アミノ酸、1アミノ酸～約50アミノ酸、1アミノ酸～約45アミノ酸、1アミノ酸～約4
0アミノ酸、1アミノ酸～約35アミノ酸、1アミノ酸～約30アミノ酸、1アミノ酸～約25アミ
ノ酸、1アミノ酸～約20アミノ酸、1アミノ酸～約15アミノ酸、1アミノ酸～約10アミノ酸
、1アミノ酸～約9アミノ酸、1アミノ酸～約8アミノ酸、1アミノ酸～約7アミノ酸、1アミ
ノ酸～約6アミノ酸、1アミノ酸～約5アミノ酸、1アミノ酸～約4アミノ酸、1アミノ酸～約
3アミノ酸、約2アミノ酸～約200アミノ酸、約2アミノ酸～約195アミノ酸、約2アミノ酸～
約190アミノ酸、約2アミノ酸～約185アミノ酸、約2アミノ酸～約180アミノ酸、約2アミノ
酸～約175アミノ酸、約2アミノ酸～約170アミノ酸、約2アミノ酸～約165アミノ酸、約2ア
ミノ酸～約160アミノ酸、約2アミノ酸～約155アミノ酸、約2アミノ酸～約150アミノ酸、
約2アミノ酸～約145アミノ酸、約2アミノ酸～約140アミノ酸、約2アミノ酸～約135アミノ
酸、約2アミノ酸～約130アミノ酸、約2アミノ酸～約125アミノ酸、約2アミノ酸～約120ア
ミノ酸、約2アミノ酸～約115アミノ酸、約2アミノ酸～約110アミノ酸、約2アミノ酸～約1
05アミノ酸、約2アミノ酸～約100アミノ酸、約2アミノ酸～約95アミノ酸、約2アミノ酸～
約90アミノ酸、約2アミノ酸～約85アミノ酸、約2アミノ酸～約80アミノ酸、約2アミノ酸
～約75アミノ酸、約2アミノ酸～約70アミノ酸、約2アミノ酸～約65アミノ酸、約2アミノ
酸～約60アミノ酸、約2アミノ酸～約55アミノ酸、約2アミノ酸～約50アミノ酸、約2アミ
ノ酸～約45アミノ酸、約2アミノ酸～約40アミノ酸、約2アミノ酸～約35アミノ酸、約2ア
ミノ酸～約30アミノ酸、約2アミノ酸～約25アミノ酸、約2アミノ酸～約20アミノ酸、約2
アミノ酸～約15アミノ酸、約2アミノ酸～約10アミノ酸、約2アミノ酸～約9アミノ酸、約2
アミノ酸～約8アミノ酸、約2アミノ酸～約7アミノ酸、約2アミノ酸～約6アミノ酸、約2ア
ミノ酸～約5アミノ酸、約2アミノ酸～約4アミノ酸、約3アミノ酸～約200アミノ酸、約3ア
ミノ酸～約195アミノ酸、約3アミノ酸～約190アミノ酸、約3アミノ酸～約185アミノ酸、
約3アミノ酸～約180アミノ酸、約3アミノ酸～約175アミノ酸、約3アミノ酸～約170アミノ
酸、約3アミノ酸～約165アミノ酸、約3アミノ酸～約160アミノ酸、約3アミノ酸～約155ア
ミノ酸、約3アミノ酸～約150アミノ酸、約3アミノ酸～約145アミノ酸、約3アミノ酸～約1
40アミノ酸、約3アミノ酸～約135アミノ酸、約3アミノ酸～約130アミノ酸、約3アミノ酸
～約125アミノ酸、約3アミノ酸～約120アミノ酸、約3アミノ酸～約115アミノ酸、約3アミ
ノ酸～約110アミノ酸、約3アミノ酸～約105アミノ酸、約3アミノ酸～約100アミノ酸、約3
アミノ酸～約95アミノ酸、約3アミノ酸～約90アミノ酸、約3アミノ酸～約85アミノ酸、約
3アミノ酸～約80アミノ酸、約3アミノ酸～約75アミノ酸、約3アミノ酸～約70アミノ酸、
約3アミノ酸～約65アミノ酸、約3アミノ酸～約60アミノ酸、約3アミノ酸～約55アミノ酸
、約3アミノ酸～約50アミノ酸、約3アミノ酸～約45アミノ酸、約3アミノ酸～約40アミノ
酸、約3アミノ酸～約35アミノ酸、約3アミノ酸～約30アミノ酸、約3アミノ酸～約25アミ
ノ酸、約3アミノ酸～約20アミノ酸、約3アミノ酸～約15アミノ酸、約3アミノ酸～約10ア
ミノ酸、約3アミノ酸～約9アミノ酸、約3アミノ酸～約8アミノ酸、約3アミノ酸～約7アミ
ノ酸、約3アミノ酸～約6アミノ酸、約3アミノ酸～約5アミノ酸、約4アミノ酸～約200アミ
ノ酸、約4アミノ酸～約195アミノ酸、約4アミノ酸～約190アミノ酸、約4アミノ酸～約185
アミノ酸、約4アミノ酸～約180アミノ酸、約4アミノ酸～約175アミノ酸、約4アミノ酸～
約170アミノ酸、約4アミノ酸～約165アミノ酸、約4アミノ酸～約160アミノ酸、約4アミノ
酸～約155アミノ酸、約4アミノ酸～約150アミノ酸、約4アミノ酸～約145アミノ酸、約4ア
ミノ酸～約140アミノ酸、約4アミノ酸～約135アミノ酸、約4アミノ酸～約130アミノ酸、
約4アミノ酸～約125アミノ酸、約4アミノ酸～約120アミノ酸、約4アミノ酸～約115アミノ
酸、約4アミノ酸～約110アミノ酸、約4アミノ酸～約105アミノ酸、約4アミノ酸～約100ア
ミノ酸、約4アミノ酸～約95アミノ酸、約4アミノ酸～約90アミノ酸、約4アミノ酸～約85
アミノ酸、約4アミノ酸～約80アミノ酸、約4アミノ酸～約75アミノ酸、約4アミノ酸～約7
0アミノ酸、約4アミノ酸～約65アミノ酸、約4アミノ酸～約60アミノ酸、約4アミノ酸～約
55アミノ酸、約4アミノ酸～約50アミノ酸、約4アミノ酸～約45アミノ酸、約4アミノ酸～
約40アミノ酸、約4アミノ酸～約35アミノ酸、約4アミノ酸～約30アミノ酸、約4アミノ酸
～約25アミノ酸、約4アミノ酸～約20アミノ酸、約4アミノ酸～約15アミノ酸、約4アミノ
酸～約10アミノ酸、約4アミノ酸～約9アミノ酸、約4アミノ酸～約8アミノ酸、約4アミノ
酸～約7アミノ酸、約4アミノ酸～約6アミノ酸、約5アミノ酸～約200アミノ酸、約5アミノ
酸～約195アミノ酸、約5アミノ酸～約190アミノ酸、約5アミノ酸～約185アミノ酸、約5ア
ミノ酸～約180アミノ酸、約5アミノ酸～約175アミノ酸、約5アミノ酸～約170アミノ酸、
約5アミノ酸～約165アミノ酸、約5アミノ酸～約160アミノ酸、約5アミノ酸～約155アミノ
酸、約5アミノ酸～約150アミノ酸、約5アミノ酸～約145アミノ酸、約5アミノ酸～約140ア
ミノ酸、約5アミノ酸～約135アミノ酸、約5アミノ酸～約130アミノ酸、約5アミノ酸～約1
25アミノ酸、約5アミノ酸～約120アミノ酸、約5アミノ酸～約115アミノ酸、約5アミノ酸
～約110アミノ酸、約5アミノ酸～約105アミノ酸、約5アミノ酸～約100アミノ酸、約5アミ
ノ酸～約95アミノ酸、約5アミノ酸～約90アミノ酸、約5アミノ酸～約85アミノ酸、約5ア
ミノ酸～約80アミノ酸、約5アミノ酸～約75アミノ酸、約5アミノ酸～約70アミノ酸、約5
アミノ酸～約65アミノ酸、約5アミノ酸～約60アミノ酸、約5アミノ酸～約55アミノ酸、約
5アミノ酸～約50アミノ酸、約5アミノ酸～約45アミノ酸、約5アミノ酸～約40アミノ酸、
約5アミノ酸～約35アミノ酸、約5アミノ酸～約30アミノ酸、約5アミノ酸～約25アミノ酸
、約5アミノ酸～約20アミノ酸、約5アミノ酸～約15アミノ酸、約5アミノ酸～約10アミノ
酸、約5アミノ酸～約9アミノ酸、約5アミノ酸～約8アミノ酸、約5アミノ酸～約7アミノ酸
、約6アミノ酸～約200アミノ酸、約6アミノ酸～約195アミノ酸、約6アミノ酸～約190アミ
ノ酸、約6アミノ酸～約185アミノ酸、約6アミノ酸～約180アミノ酸、約6アミノ酸～約175
アミノ酸、約6アミノ酸～約170アミノ酸、約6アミノ酸～約165アミノ酸、約6アミノ酸～
約160アミノ酸、約6アミノ酸～約155アミノ酸、約6アミノ酸～約150アミノ酸、約6アミノ
酸～約145アミノ酸、約6アミノ酸～約140アミノ酸、約6アミノ酸～約135アミノ酸、約6ア
ミノ酸～約130アミノ酸、約6アミノ酸～約125アミノ酸、約6アミノ酸～約120アミノ酸、
約6アミノ酸～約115アミノ酸、約6アミノ酸～約110アミノ酸、約6アミノ酸～約105アミノ
酸、約6アミノ酸～約100アミノ酸、約6アミノ酸～約95アミノ酸、約6アミノ酸～約90アミ
ノ酸、約6アミノ酸～約85アミノ酸、約6アミノ酸～約80アミノ酸、約6アミノ酸～約75ア
ミノ酸、約6アミノ酸～約70アミノ酸、約6アミノ酸～約65アミノ酸、約6アミノ酸～約60
アミノ酸、約6アミノ酸～約55アミノ酸、約6アミノ酸～約50アミノ酸、約6アミノ酸～約4
5アミノ酸、約6アミノ酸～約40アミノ酸、約6アミノ酸～約35アミノ酸、約6アミノ酸～約
30アミノ酸、約6アミノ酸～約25アミノ酸、約6アミノ酸～約20アミノ酸、約6アミノ酸～
約15アミノ酸、約6アミノ酸～約10アミノ酸、約6アミノ酸～約9アミノ酸、約6アミノ酸～
約8アミノ酸、約7アミノ酸～約200アミノ酸、約7アミノ酸～約195アミノ酸、約7アミノ酸
～約190アミノ酸、約7アミノ酸～約185アミノ酸、約7アミノ酸～約180アミノ酸、約7アミ
ノ酸～約175アミノ酸、約7アミノ酸～約170アミノ酸、約7アミノ酸～約165アミノ酸、約7
アミノ酸～約160アミノ酸、約7アミノ酸～約155アミノ酸、約7アミノ酸～約150アミノ酸
、約7アミノ酸～約145アミノ酸、約7アミノ酸～約140アミノ酸、約7アミノ酸～約135アミ
ノ酸、約7アミノ酸～約130アミノ酸、約7アミノ酸～約125アミノ酸、約7アミノ酸～約120
アミノ酸、約7アミノ酸～約115アミノ酸、約7アミノ酸～約110アミノ酸、約7アミノ酸～
約105アミノ酸、約7アミノ酸～約100アミノ酸、約7アミノ酸～約95アミノ酸、約7アミノ
酸～約90アミノ酸、約7アミノ酸～約85アミノ酸、約7アミノ酸～約80アミノ酸、約7アミ
ノ酸～約75アミノ酸、約7アミノ酸～約70アミノ酸、約7アミノ酸～約65アミノ酸、約7ア
ミノ酸～約60アミノ酸、約7アミノ酸～約55アミノ酸、約7アミノ酸～約50アミノ酸、約7
アミノ酸～約45アミノ酸、約7アミノ酸～約40アミノ酸、約7アミノ酸～約35アミノ酸、約
7アミノ酸～約30アミノ酸、約7アミノ酸～約25アミノ酸、約7アミノ酸～約20アミノ酸、
約7アミノ酸～約15アミノ酸、約7アミノ酸～約10アミノ酸、約7アミノ酸～約9アミノ酸、
約8アミノ酸～約200アミノ酸、約8アミノ酸～約195アミノ酸、約8アミノ酸～約190アミノ
酸、約8アミノ酸～約185アミノ酸、約8アミノ酸～約180アミノ酸、約8アミノ酸～約175ア
ミノ酸、約8アミノ酸～約170アミノ酸、約8アミノ酸～約165アミノ酸、約8アミノ酸～約1
60アミノ酸、約8アミノ酸～約155アミノ酸、約8アミノ酸～約150アミノ酸、約8アミノ酸
～約145アミノ酸、約8アミノ酸～約140アミノ酸、約8アミノ酸～約135アミノ酸、約8アミ
ノ酸～約130アミノ酸、約8アミノ酸～約125アミノ酸、約8アミノ酸～約120アミノ酸、約8
アミノ酸～約115アミノ酸、約8アミノ酸～約110アミノ酸、約8アミノ酸～約105アミノ酸
、約8アミノ酸～約100アミノ酸、約8アミノ酸～約95アミノ酸、約8アミノ酸～約90アミノ
酸、約8アミノ酸～約85アミノ酸、約8アミノ酸～約80アミノ酸、約8アミノ酸～約75アミ
ノ酸、約8アミノ酸～約70アミノ酸、約8アミノ酸～約65アミノ酸、約8アミノ酸～約60ア
ミノ酸、約8アミノ酸～約55アミノ酸、約8アミノ酸～約50アミノ酸、約8アミノ酸～約45
アミノ酸、約8アミノ酸～約40アミノ酸、約8アミノ酸～約35アミノ酸、約8アミノ酸～約3
0アミノ酸、約8アミノ酸～約25アミノ酸、約8アミノ酸～約20アミノ酸、約8アミノ酸～約
15アミノ酸、約8アミノ酸～約10アミノ酸、約10アミノ酸～約200アミノ酸、約10アミノ酸
～約195アミノ酸、約10アミノ酸～約190アミノ酸、約10アミノ酸～約185アミノ酸、約10
アミノ酸～約180アミノ酸、約10アミノ酸～約175アミノ酸、約10アミノ酸～約170アミノ
酸、約10アミノ酸～約165アミノ酸、約10アミノ酸～約160アミノ酸、約10アミノ酸～約15
5アミノ酸、約10アミノ酸～約150アミノ酸、約10アミノ酸～約145アミノ酸、約10アミノ
酸～約140アミノ酸、約10アミノ酸～約135アミノ酸、約10アミノ酸～約130アミノ酸、約1
0アミノ酸～約125アミノ酸、約10アミノ酸～約120アミノ酸、約10アミノ酸～約115アミノ
酸、約10アミノ酸～約110アミノ酸、約10アミノ酸～約105アミノ酸、約10アミノ酸～約10
0アミノ酸、約10アミノ酸～約95アミノ酸、約10アミノ酸～約90アミノ酸、約10アミノ酸
～約85アミノ酸、約10アミノ酸～約80アミノ酸、約10アミノ酸～約75アミノ酸、約10アミ
ノ酸～約70アミノ酸、約10アミノ酸～約65アミノ酸、約10アミノ酸～約60アミノ酸、約10
アミノ酸～約55アミノ酸、約10アミノ酸～約50アミノ酸、約10アミノ酸～約45アミノ酸、
約10アミノ酸～約40アミノ酸、約10アミノ酸～約35アミノ酸、
約10アミノ酸～約30アミノ酸、約10アミノ酸～約25アミノ酸、約10アミノ酸～約20アミノ
酸、約10アミノ酸～約15アミノ酸、約15アミノ酸～約200アミノ酸、約15アミノ酸～約195
アミノ酸、約15アミノ酸～約190アミノ酸、約15アミノ酸～約185アミノ酸、約15アミノ酸
～約180アミノ酸、約15アミノ酸～約175アミノ酸、約15アミノ酸～約170アミノ酸、約15
アミノ酸～約165アミノ酸、約15アミノ酸～約160アミノ酸、約15アミノ酸～約155アミノ
酸、約15アミノ酸～約150アミノ酸、約15アミノ酸～約145アミノ酸、約15アミノ酸～約14
0アミノ酸、約15アミノ酸～約135アミノ酸、約15アミノ酸～約130アミノ酸、約15アミノ
酸～約125アミノ酸、約15アミノ酸～約120アミノ酸、約15アミノ酸～約115アミノ酸、約1
5アミノ酸～約110アミノ酸、約15アミノ酸～約105アミノ酸、約15アミノ酸～約100アミノ
酸、約15アミノ酸～約95アミノ酸、約15アミノ酸～約90アミノ酸、約15アミノ酸～約85ア
ミノ酸、約15アミノ酸～約80アミノ酸、約15アミノ酸～約75アミノ酸、約15アミノ酸～約
70アミノ酸、約15アミノ酸～約65アミノ酸、約15アミノ酸～約60アミノ酸、約15アミノ酸
～約55アミノ酸、約15アミノ酸～約50アミノ酸、約15アミノ酸～約45アミノ酸、約15アミ
ノ酸～約40アミノ酸、約15アミノ酸～約35アミノ酸、約15アミノ酸～約30アミノ酸、約15
アミノ酸～約25アミノ酸、約15アミノ酸～約20アミノ酸、約20アミノ酸～約200アミノ酸
、約20アミノ酸～約195アミノ酸、約20アミノ酸～約190アミノ酸、約20アミノ酸～約185
アミノ酸、約20アミノ酸～約180アミノ酸、約20アミノ酸～約175アミノ酸、約20アミノ酸
～約170アミノ酸、約20アミノ酸～約165アミノ酸、約20アミノ酸～約160アミノ酸、約20
アミノ酸～約155アミノ酸、約20アミノ酸～約150アミノ酸、約20アミノ酸～約145アミノ
酸、約20アミノ酸～約140アミノ酸、約20アミノ酸～約135アミノ酸、約20アミノ酸～約13
0アミノ酸、約20アミノ酸～約125アミノ酸、約20アミノ酸～約120アミノ酸、約20アミノ
酸～約115アミノ酸、約20アミノ酸～約110アミノ酸、約20アミノ酸～約105アミノ酸、約2
0アミノ酸～約100アミノ酸、約20アミノ酸～約95アミノ酸、約20アミノ酸～約90アミノ酸
、約20アミノ酸～約85アミノ酸、約20アミノ酸～約80アミノ酸、約20アミノ酸～約75アミ
ノ酸、約20アミノ酸～約70アミノ酸、約20アミノ酸～約65アミノ酸、約20アミノ酸～約60
アミノ酸、約20アミノ酸～約55アミノ酸、約20アミノ酸～約50アミノ酸、約20アミノ酸～
約45アミノ酸、約20アミノ酸～約40アミノ酸、約20アミノ酸～約35アミノ酸、約20アミノ
酸～約30アミノ酸、約20アミノ酸～約25アミノ酸、約25アミノ酸～約200アミノ酸、約25
アミノ酸～約195アミノ酸、約25アミノ酸～約190アミノ酸、約25アミノ酸～約185アミノ
酸、約25アミノ酸～約180アミノ酸、約25アミノ酸～約175アミノ酸、約25アミノ酸～約17
0アミノ酸、約25アミノ酸～約165アミノ酸、約25アミノ酸～約160アミノ酸、約25アミノ
酸～約155アミノ酸、約25アミノ酸～約150アミノ酸、約25アミノ酸～約145アミノ酸、約2
5アミノ酸～約140アミノ酸、約25アミノ酸～約135アミノ酸、約25アミノ酸～約130アミノ
酸、約25アミノ酸～約125アミノ酸、約25アミノ酸～約120アミノ酸、約25アミノ酸～約11
5アミノ酸、約25アミノ酸～約110アミノ酸、約25アミノ酸～約105アミノ酸、約25アミノ
酸～約100アミノ酸、約25アミノ酸～約95アミノ酸、約25アミノ酸～約90アミノ酸、約25
アミノ酸～約85アミノ酸、約25アミノ酸～約80アミノ酸、約25アミノ酸～約75アミノ酸、
約25アミノ酸～約70アミノ酸、約25アミノ酸～約65アミノ酸、約25アミノ酸～約60アミノ
酸、約25アミノ酸～約55アミノ酸、約25アミノ酸～約50アミノ酸、約25アミノ酸～約45ア
ミノ酸、約25アミノ酸～約40アミノ酸、約25アミノ酸～約35アミノ酸、約25アミノ酸～約
30アミノ酸、約30アミノ酸～約200アミノ酸、約30アミノ酸～約195アミノ酸、約30アミノ
酸～約190アミノ酸、約30アミノ酸～約185アミノ酸、約30アミノ酸～約180アミノ酸、約3
0アミノ酸～約175アミノ酸、約30アミノ酸～約170アミノ酸、約30アミノ酸～約165アミノ
酸、約30アミノ酸～約160アミノ酸、約30アミノ酸～約155アミノ酸、約30アミノ酸～約15
0アミノ酸、約30アミノ酸～約145アミノ酸、約30アミノ酸～約140アミノ酸、約30アミノ
酸～約135アミノ酸、約30アミノ酸～約130アミノ酸、約30アミノ酸～約125アミノ酸、約3
0アミノ酸～約120アミノ酸、約30アミノ酸～約115アミノ酸、約30アミノ酸～約110アミノ
酸、約30アミノ酸～約105アミノ酸、約30アミノ酸～約100アミノ酸、約30アミノ酸～約95
アミノ酸、約30アミノ酸～約90アミノ酸、約30アミノ酸～約85アミノ酸、約30アミノ酸～
約80アミノ酸、約30アミノ酸～約75アミノ酸、約30アミノ酸～約70アミノ酸、約30アミノ
酸～約65アミノ酸、約30アミノ酸～約60アミノ酸、約30アミノ酸～約55アミノ酸、約30ア
ミノ酸～約50アミノ酸、約30アミノ酸～約45アミノ酸、約30アミノ酸～約40アミノ酸、約
30アミノ酸～約35アミノ酸、約35アミノ酸～約200アミノ酸、約35アミノ酸～約195アミノ
酸、約35アミノ酸～約190アミノ酸、約35アミノ酸～約185アミノ酸、約35アミノ酸～約18
0アミノ酸、約35アミノ酸～約175アミノ酸、約35アミノ酸～約170アミノ酸、約35アミノ
酸～約165アミノ酸、約35アミノ酸～約160アミノ酸、約35アミノ酸～約155アミノ酸、約3
5アミノ酸～約150アミノ酸、約35アミノ酸～約145アミノ酸、約35アミノ酸～約140アミノ
酸、約35アミノ酸～約135アミノ酸、約35アミノ酸～約130アミノ酸、約35アミノ酸～約12
5アミノ酸、約35アミノ酸～約120アミノ酸、約35アミノ酸～約115アミノ酸、約35アミノ
酸～約110アミノ酸、約35アミノ酸～約105アミノ酸、約35アミノ酸～約100アミノ酸、約3
5アミノ酸～約95アミノ酸、約35アミノ酸～約90アミノ酸、約35アミノ酸～約85アミノ酸
、約35アミノ酸～約80アミノ酸、約35アミノ酸～約75アミノ酸、約35アミノ酸～約70アミ
ノ酸、約35アミノ酸～約65アミノ酸、約35アミノ酸～約60アミノ酸、約35アミノ酸～約55
アミノ酸、約35アミノ酸～約50アミノ酸、約35アミノ酸～約45アミノ酸、約35アミノ酸～
約40アミノ酸、約40アミノ酸～約200アミノ酸、約40アミノ酸～約195アミノ酸、約40アミ
ノ酸～約190アミノ酸、約40アミノ酸～約185アミノ酸、約40アミノ酸～約180アミノ酸、
約40アミノ酸～約175アミノ酸、約40アミノ酸～約170アミノ酸、約40アミノ酸～約165ア
ミノ酸、約40アミノ酸～約160アミノ酸、約40アミノ酸～約155アミノ酸、約40アミノ酸～
約150アミノ酸、約40アミノ酸～約145アミノ酸、約40アミノ酸～約140アミノ酸、約40ア
ミノ酸～約135アミノ酸、約40アミノ酸～約130アミノ酸、約40アミノ酸～約125アミノ酸
、約40アミノ酸～約120アミノ酸、約40アミノ酸～約115アミノ酸、約40アミノ酸～約110
アミノ酸、約40アミノ酸～約105アミノ酸、約40アミノ酸～約100アミノ酸、約40アミノ酸
～約95アミノ酸、約40アミノ酸～約90アミノ酸、約40アミノ酸～約85アミノ酸、約40アミ
ノ酸～約80アミノ酸、約40アミノ酸～約75アミノ酸、約40アミノ酸～約70アミノ酸、約40
アミノ酸～約65アミノ酸、約40アミノ酸～約60アミノ酸、約40アミノ酸～約55アミノ酸、
約40アミノ酸～約50アミノ酸、約40アミノ酸～約45アミノ酸、約45アミノ酸～約200アミ
ノ酸、約45アミノ酸～約195アミノ酸、約45アミノ酸～約190アミノ酸、約45アミノ酸～約
185アミノ酸、約45アミノ酸～約180アミノ酸、約45アミノ酸～約175アミノ酸、約45アミ
ノ酸～約170アミノ酸、約45アミノ酸～約165アミノ酸、約45アミノ酸～約160アミノ酸、
約45アミノ酸～約155アミノ酸、約45アミノ酸～約150アミノ酸、約45アミノ酸～約145ア
ミノ酸、約45アミノ酸～約140アミノ酸、約45アミノ酸～約135アミノ酸、約45アミノ酸～
約130アミノ酸、約45アミノ酸～約125アミノ酸、約45アミノ酸～約120アミノ酸、約45ア
ミノ酸～約115アミノ酸、約45アミノ酸～約110アミノ酸、約45アミノ酸～約105アミノ酸
、約45アミノ酸～約100アミノ酸、約45アミノ酸～約95アミノ酸、約45アミノ酸～約90ア
ミノ酸、約45アミノ酸～約85アミノ酸、約45アミノ酸～約80アミノ酸、約45アミノ酸～約
75アミノ酸、約45アミノ酸～約70アミノ酸、約45アミノ酸～約65アミノ酸、約45アミノ酸
～約60アミノ酸、約45アミノ酸～約55アミノ酸、約45アミノ酸～約50アミノ酸、約50アミ
ノ酸～約200アミノ酸、約50アミノ酸～約195アミノ酸、約50アミノ酸～約190アミノ酸、
約50アミノ酸～約185アミノ酸、約50アミノ酸～約180アミノ酸、約50アミノ酸～約175ア
ミノ酸、約50アミノ酸～約170アミノ酸、約50アミノ酸～約165アミノ酸、約50アミノ酸～
約160アミノ酸、約50アミノ酸～約155アミノ酸、約50アミノ酸～約150アミノ酸、約50ア
ミノ酸～約145アミノ酸、約50アミノ酸～約140アミノ酸、約50アミノ酸～約135アミノ酸
、約50アミノ酸～約130アミノ酸、約50アミノ酸～約125アミノ酸、約50アミノ酸～約120
アミノ酸、約50アミノ酸～約115アミノ酸、約50アミノ酸～約110アミノ酸、約50アミノ酸
～約105アミノ酸、約50アミノ酸～約100アミノ酸、約50アミノ酸～約95アミノ酸、約50ア
ミノ酸～約90アミノ酸、約50アミノ酸～約85アミノ酸、約50アミノ酸～約80アミノ酸、約
50アミノ酸～約75アミノ酸、約50アミノ酸～約70アミノ酸、約50アミノ酸～約65アミノ酸
、約50アミノ酸～約60アミノ酸、約50アミノ酸～約55アミノ酸、約55アミノ酸～約200ア
ミノ酸、約55アミノ酸～約195アミノ酸、約55アミノ酸～約190アミノ酸、約55アミノ酸～
約185アミノ酸、約55アミノ酸～約180アミノ酸、約55アミノ酸～約175アミノ酸、約55ア
ミノ酸～約170アミノ酸、約55アミノ酸～約165アミノ酸、約55アミノ酸～約160アミノ酸
、約55アミノ酸～約155アミノ酸、約55アミノ酸～約150アミノ酸、約55アミノ酸～約145
アミノ酸、約55アミノ酸～約140アミノ酸、約55アミノ酸～約135アミノ酸、約55アミノ酸
～約130アミノ酸、約55アミノ酸～約125アミノ酸、約55アミノ酸～約120アミノ酸、約55
アミノ酸～約115アミノ酸、約55アミノ酸～約110アミノ酸、約55アミノ酸～約105アミノ
酸、約55アミノ酸～約100アミノ酸、約55アミノ酸～約95アミノ酸、約55アミノ酸～約90
アミノ酸、約55アミノ酸～約85アミノ酸、約55アミノ酸～約80アミノ酸、約55アミノ酸～
約75アミノ酸、約55アミノ酸～約70アミノ酸、約55アミノ酸～約65アミノ酸、約55アミノ
酸～約60アミノ酸、約60アミノ酸～約200アミノ酸、約60アミノ酸～約195アミノ酸、約60
アミノ酸～約190アミノ酸、約60アミノ酸～約185アミノ酸、約60アミノ酸～約180アミノ
酸、約60アミノ酸～約175アミノ酸、約60アミノ酸～約170アミノ酸、約60アミノ酸～約16
5アミノ酸、約60アミノ酸～約160アミノ酸、約60アミノ酸～約155アミノ酸、約60アミノ
酸～約150アミノ酸、約60アミノ酸～約145アミノ酸、約60アミノ酸～約140アミノ酸、約6
0アミノ酸～約135アミノ酸、約60アミノ酸～約130アミノ酸、約60アミノ酸～約125アミノ
酸、約60アミノ酸～約120アミノ酸、約60アミノ酸～約115アミノ酸、約60アミノ酸～約11
0アミノ酸、約60アミノ酸～約105アミノ酸、約60アミノ酸～約100アミノ酸、約60アミノ
酸～約95アミノ酸、約60アミノ酸～約90アミノ酸、約60アミノ酸～約85アミノ酸、約60ア
ミノ酸～約80アミノ酸、約60アミノ酸～約75アミノ酸、約60アミノ酸～約70アミノ酸、約
60アミノ酸～約65アミノ酸、約65アミノ酸～約200アミノ酸、約65アミノ酸～約195アミノ
酸、約65アミノ酸～約190アミノ酸、約65アミノ酸～約185アミノ酸、約65アミノ酸～約18
0アミノ酸、約65アミノ酸～約175アミノ酸、約65アミノ酸～約170アミノ酸、約65アミノ
酸～約165アミノ酸、約65アミノ酸～約160アミノ酸、約65アミノ酸～約155アミノ酸、約6
5アミノ酸～約150アミノ酸、約65アミノ酸～約145アミノ酸、約65アミノ酸～約140アミノ
酸、約65アミノ酸～約135アミノ酸、約65アミノ酸～約130アミノ酸、約65アミノ酸～約12
5アミノ酸、約65アミノ酸～約120アミノ酸、約65アミノ酸～約115アミノ酸、約65アミノ
酸～約110アミノ酸、約65アミノ酸～約105アミノ酸、約65アミノ酸～約100アミノ酸、約6
5アミノ酸～約95アミノ酸、約65アミノ酸～約90アミノ酸、約65アミノ酸～約85アミノ酸
、約65アミノ酸～約80アミノ酸、約65アミノ酸～約75アミノ酸、約65アミノ酸～約70アミ
ノ酸、約70アミノ酸～約200アミノ酸、約70アミノ酸～
約195アミノ酸、約70アミノ酸～約190アミノ酸、約70アミノ酸～約185アミノ酸、約70ア
ミノ酸～約180アミノ酸、約70アミノ酸～約175アミノ酸、約70アミノ酸～約170アミノ酸
、約70アミノ酸～約165アミノ酸、約70アミノ酸～約160アミノ酸、約70アミノ酸～約155
アミノ酸、約70アミノ酸～約150アミノ酸、約70アミノ酸～約145アミノ酸、約70アミノ酸
～約140アミノ酸、約70アミノ酸～約135アミノ酸、約70アミノ酸～約130アミノ酸、約70
アミノ酸～約125アミノ酸、約70アミノ酸～約120アミノ酸、約70アミノ酸～約115アミノ
酸、約70アミノ酸～約110アミノ酸、約70アミノ酸～約105アミノ酸、約70アミノ酸～約10
0アミノ酸、約70アミノ酸～約95アミノ酸、約70アミノ酸～約90アミノ酸、約70アミノ酸
～約85アミノ酸、約70アミノ酸～約80アミノ酸、約70アミノ酸～約75アミノ酸、約75アミ
ノ酸～約200アミノ酸、約75アミノ酸～約195アミノ酸、約75アミノ酸～約190アミノ酸、
約75アミノ酸～約185アミノ酸、約75アミノ酸～約180アミノ酸、約75アミノ酸～約175ア
ミノ酸、約75アミノ酸～約170アミノ酸、約75アミノ酸～約165アミノ酸、約75アミノ酸～
約160アミノ酸、約75アミノ酸～約155アミノ酸、約75アミノ酸～約150アミノ酸、約75ア
ミノ酸～約145アミノ酸、約75アミノ酸～約140アミノ酸、約75アミノ酸～約135アミノ酸
、約75アミノ酸～約130アミノ酸、約75アミノ酸～約125アミノ酸、約75アミノ酸～約120
アミノ酸、約75アミノ酸～約115アミノ酸、約75アミノ酸～約110アミノ酸、約75アミノ酸
～約105アミノ酸、約75アミノ酸～約100アミノ酸、約75アミノ酸～約95アミノ酸、約75ア
ミノ酸～約90アミノ酸、約75アミノ酸～約85アミノ酸、約75アミノ酸～約80アミノ酸、約
80アミノ酸～約200アミノ酸、約80アミノ酸～約195アミノ酸、約80アミノ酸～約190アミ
ノ酸、約80アミノ酸～約185アミノ酸、約80アミノ酸～約180アミノ酸、約80アミノ酸～約
175アミノ酸、約80アミノ酸～約170アミノ酸、約80アミノ酸～約165アミノ酸、約80アミ
ノ酸～約160アミノ酸、約80アミノ酸～約155アミノ酸、約80アミノ酸～約150アミノ酸、
約80アミノ酸～約145アミノ酸、約80アミノ酸～約140アミノ酸、約80アミノ酸～約135ア
ミノ酸、約80アミノ酸～約130アミノ酸、約80アミノ酸～約125アミノ酸、約80アミノ酸～
約120アミノ酸、約80アミノ酸～約115アミノ酸、約80アミノ酸～約110アミノ酸、約80ア
ミノ酸～約105アミノ酸、約80アミノ酸～約100アミノ酸、約80アミノ酸～約95アミノ酸、
約80アミノ酸～約90アミノ酸、約80アミノ酸～約85アミノ酸、約85アミノ酸～約200アミ
ノ酸、約85アミノ酸～約195アミノ酸、約85アミノ酸～約190アミノ酸、約85アミノ酸～約
185アミノ酸、約85アミノ酸～約180アミノ酸、約85アミノ酸～約175アミノ酸、約85アミ
ノ酸～約170アミノ酸、約85アミノ酸～約165アミノ酸、約85アミノ酸～約160アミノ酸、
約85アミノ酸～約155アミノ酸、約85アミノ酸～約150アミノ酸、約85アミノ酸～約145ア
ミノ酸、約85アミノ酸～約140アミノ酸、約85アミノ酸～約135アミノ酸、約85アミノ酸～
約130アミノ酸、約85アミノ酸～約125アミノ酸、約85アミノ酸～約120アミノ酸、約85ア
ミノ酸～約115アミノ酸、約85アミノ酸～約110アミノ酸、約85アミノ酸～約105アミノ酸
、約85アミノ酸～約100アミノ酸、約85アミノ酸～約95アミノ酸、約85アミノ酸～約90ア
ミノ酸、約90アミノ酸～約200アミノ酸、約90アミノ酸～約195アミノ酸、約90アミノ酸～
約190アミノ酸、約90アミノ酸～約185アミノ酸、約90アミノ酸～約180アミノ酸、約90ア
ミノ酸～約175アミノ酸、約90アミノ酸～約170アミノ酸、約90アミノ酸～約165アミノ酸
、約90アミノ酸～約160アミノ酸、約90アミノ酸～約155アミノ酸、約90アミノ酸～約150
アミノ酸、約90アミノ酸～約145アミノ酸、約90アミノ酸～約140アミノ酸、約90アミノ酸
～約135アミノ酸、約90アミノ酸～約130アミノ酸、約90アミノ酸～約125アミノ酸、約90
アミノ酸～約120アミノ酸、約90アミノ酸～約115アミノ酸、約90アミノ酸～約110アミノ
酸、約90アミノ酸～約105アミノ酸、約90アミノ酸～約100アミノ酸、約90アミノ酸～約95
アミノ酸、約95アミノ酸～約200アミノ酸、約95アミノ酸～約195アミノ酸、約95アミノ酸
～約190アミノ酸、約95アミノ酸～約185アミノ酸、約95アミノ酸～約180アミノ酸、約95
アミノ酸～約175アミノ酸、約95アミノ酸～約170アミノ酸、約95アミノ酸～約165アミノ
酸、約95アミノ酸～約160アミノ酸、約95アミノ酸～約155アミノ酸、約95アミノ酸～約15
0アミノ酸、約95アミノ酸～約145アミノ酸、約95アミノ酸～約140アミノ酸、約95アミノ
酸～約135アミノ酸、約95アミノ酸～約130アミノ酸、約95アミノ酸～約125アミノ酸、約9
5アミノ酸～約120アミノ酸、約95アミノ酸～約115アミノ酸、約95アミノ酸～約110アミノ
酸、約95アミノ酸～約105アミノ酸、約95アミノ酸～約100アミノ酸、約100アミノ酸～約2
00アミノ酸、約100アミノ酸～約195アミノ酸、約100アミノ酸～約190アミノ酸、約100ア
ミノ酸～約185アミノ酸、約100アミノ酸～約180アミノ酸、約100アミノ酸～約175アミノ
酸、約100アミノ酸～約170アミノ酸、約100アミノ酸～約165アミノ酸、約100アミノ酸～
約160アミノ酸、約100アミノ酸～約155アミノ酸、約100アミノ酸～約150アミノ酸、約100
アミノ酸～約145アミノ酸、約100アミノ酸～約140アミノ酸、約100アミノ酸～約135アミ
ノ酸、約100アミノ酸～約130アミノ酸、約100アミノ酸～約125アミノ酸、約100アミノ酸
～約120アミノ酸、約100アミノ酸～約115アミノ酸、約100アミノ酸～約110アミノ酸、約1
00アミノ酸～約105アミノ酸、約105アミノ酸～約200アミノ酸、約105アミノ酸～約195ア
ミノ酸、約105アミノ酸～約190アミノ酸、約105アミノ酸～約185アミノ酸、約105アミノ
酸～約180アミノ酸、約105アミノ酸～約175アミノ酸、約105アミノ酸～約170アミノ酸、
約105アミノ酸～約165アミノ酸、約105アミノ酸～約160アミノ酸、約105アミノ酸～約155
アミノ酸、約105アミノ酸～約150アミノ酸、約105アミノ酸～約145アミノ酸、約105アミ
ノ酸～約140アミノ酸、約105アミノ酸～約135アミノ酸、約105アミノ酸～約130アミノ酸
、約105アミノ酸～約125アミノ酸、約105アミノ酸～約120アミノ酸、約105アミノ酸～約1
15アミノ酸、約105アミノ酸～約110アミノ酸、約110アミノ酸～約200アミノ酸、約110ア
ミノ酸～約195アミノ酸、約110アミノ酸～約190アミノ酸、約110アミノ酸～約185アミノ
酸、約110アミノ酸～約180アミノ酸、約110アミノ酸～約175アミノ酸、約110アミノ酸～
約170アミノ酸、約110アミノ酸～約165アミノ酸、約110アミノ酸～約160アミノ酸、約110
アミノ酸～約155アミノ酸、約110アミノ酸～約150アミノ酸、約110アミノ酸～約145アミ
ノ酸、約110アミノ酸～約140アミノ酸、約110アミノ酸～約135アミノ酸、約110アミノ酸
～約130アミノ酸、約110アミノ酸～約125アミノ酸、約110アミノ酸～約120アミノ酸、約1
10アミノ酸～約115アミノ酸、約115アミノ酸～約200アミノ酸、約115アミノ酸～約195ア
ミノ酸、約115アミノ酸～約190アミノ酸、約115アミノ酸～約185アミノ酸、約115アミノ
酸～約180アミノ酸、約115アミノ酸～約175アミノ酸、約115アミノ酸～約170アミノ酸、
約115アミノ酸～約165アミノ酸、約115アミノ酸～約160アミノ酸、約115アミノ酸～約155
アミノ酸、約115アミノ酸～約150アミノ酸、約115アミノ酸～約145アミノ酸、約115アミ
ノ酸～約140アミノ酸、約115アミノ酸～約135アミノ酸、約115アミノ酸～約130アミノ酸
、約115アミノ酸～約125アミノ酸、約115アミノ酸～約120アミノ酸、約120アミノ酸～約2
00アミノ酸、約120アミノ酸～約195アミノ酸、約120アミノ酸～約190アミノ酸、約120ア
ミノ酸～約185アミノ酸、約120アミノ酸～約180アミノ酸、約120アミノ酸～約175アミノ
酸、約120アミノ酸～約170アミノ酸、約120アミノ酸～約165アミノ酸、約120アミノ酸～
約160アミノ酸、約120アミノ酸～約155アミノ酸、約120アミノ酸～約150アミノ酸、約120
アミノ酸～約145アミノ酸、約120アミノ酸～約140アミノ酸、約120アミノ酸～約135アミ
ノ酸、約120アミノ酸～約130アミノ酸、約120アミノ酸～約125アミノ酸、約125アミノ酸
～約200アミノ酸、約125アミノ酸～約195アミノ酸、約125アミノ酸～約190アミノ酸、約1
25アミノ酸～約185アミノ酸、約125アミノ酸～約180アミノ酸、約125アミノ酸～約175ア
ミノ酸、約125アミノ酸～約170アミノ酸、約125アミノ酸～約165アミノ酸、約125アミノ
酸～約160アミノ酸、約125アミノ酸～約155アミノ酸、約125アミノ酸～約150アミノ酸、
約125アミノ酸～約145アミノ酸、約125アミノ酸～約140アミノ酸、約125アミノ酸～約135
アミノ酸、約125アミノ酸～約130アミノ酸、約130アミノ酸～約200アミノ酸、約130アミ
ノ酸～約195アミノ酸、約130アミノ酸～約190アミノ酸、約130アミノ酸～約185アミノ酸
、約130アミノ酸～約180アミノ酸、約130アミノ酸～約175アミノ酸、約130アミノ酸～約1
70アミノ酸、約130アミノ酸～約165アミノ酸、約130アミノ酸～約160アミノ酸、約130ア
ミノ酸～約155アミノ酸、約130アミノ酸～約150アミノ酸、約130アミノ酸～約145アミノ
酸、約130アミノ酸～約140アミノ酸、約130アミノ酸～約135アミノ酸、約135アミノ酸～
約200アミノ酸、約135アミノ酸～約195アミノ酸、約135アミノ酸～約190アミノ酸、約135
アミノ酸～約185アミノ酸、約135アミノ酸～約180アミノ酸、約135アミノ酸～約175アミ
ノ酸、約135アミノ酸～約170アミノ酸、約135アミノ酸～約165アミノ酸、約135アミノ酸
～約160アミノ酸、約135アミノ酸～約155アミノ酸、約135アミノ酸～約150アミノ酸、約1
35アミノ酸～約145アミノ酸、約135アミノ酸～約140アミノ酸、約140アミノ酸～約200ア
ミノ酸、約140アミノ酸～約195アミノ酸、約140アミノ酸～約190アミノ酸、約140アミノ
酸～約185アミノ酸、約140アミノ酸～約180アミノ酸、約140アミノ酸～約175アミノ酸、
約140アミノ酸～約170アミノ酸、約140アミノ酸～約165アミノ酸、約140アミノ酸～約160
アミノ酸、約140アミノ酸～約155アミノ酸、約140アミノ酸～約150アミノ酸、約40アミノ
酸～約145アミノ酸、約145アミノ酸～約200アミノ酸、約145アミノ酸～約195アミノ酸、
約145アミノ酸～約190アミノ酸、約145アミノ酸～約185アミノ酸、約145アミノ酸～約180
アミノ酸、約145アミノ酸～約175アミノ酸、約145アミノ酸～約170アミノ酸、約145アミ
ノ酸～約165アミノ酸、約145アミノ酸～約160アミノ酸、約145アミノ酸～約155アミノ酸
、約145アミノ酸～約150アミノ酸、約150アミノ酸～約200アミノ酸、約150アミノ酸～約1
95アミノ酸、約150アミノ酸～約190アミノ酸、約150アミノ酸～約185アミノ酸、約150ア
ミノ酸～約180アミノ酸、約150アミノ酸～約175アミノ酸、約150アミノ酸～約170アミノ
酸、約150アミノ酸～約165アミノ酸、約150アミノ酸～約160アミノ酸、約150アミノ酸～
約155アミノ酸、約155アミノ酸～約200アミノ酸、約155アミノ酸～約195アミノ酸、約155
アミノ酸～約190アミノ酸、約155アミノ酸～約185アミノ酸、約155アミノ酸～約180アミ
ノ酸、約155アミノ酸～約175アミノ酸、約155アミノ酸～約170アミノ酸、約155アミノ酸
～約165アミノ酸、約155アミノ酸～約160アミノ酸、約160アミノ酸～約200アミノ酸、約1
60アミノ酸～約195アミノ酸、約160アミノ酸～約190アミノ酸、約160アミノ酸～約185ア
ミノ酸、約160アミノ酸～約180アミノ酸、約160アミノ酸～約175アミノ酸、約160アミノ
酸～約170アミノ酸、約160アミノ酸～約165アミノ酸、約165アミノ酸～約200アミノ酸、
約165アミノ酸～約195アミノ酸、約165アミノ酸～約190アミノ酸、約165アミノ酸～約185
アミノ酸、約165アミノ酸～約180アミノ酸、約165アミノ酸～約175アミノ酸、約165アミ
ノ酸～約170アミノ酸、約170アミノ酸～約200アミノ酸、約170アミノ酸～約195アミノ酸
、約170アミノ酸～約190アミノ酸、約170アミノ酸～約185アミノ酸、約170アミノ酸～約1
80アミノ酸、約170アミノ酸～約175アミノ酸、約175アミノ酸～約200アミノ酸、約175ア
ミノ酸～約195アミノ酸、約175アミノ酸～約190アミノ酸、約175アミノ酸～約185アミノ
酸、約175アミノ酸～約180アミノ酸、約180アミノ酸～約200アミノ酸、約180アミノ酸～
約195アミノ酸、約180アミノ酸～約190アミノ酸、約180アミノ酸～約185アミノ酸、約185
アミノ酸～約200アミノ酸、約185アミノ酸～約195アミノ酸、約185アミノ酸～約190アミ
ノ酸、約
190アミノ酸～約200アミノ酸、約190アミノ酸～約195アミノ酸、約195アミノ酸～約200ア
ミノ酸が欠失している、野生型全長オトフェリンタンパク質（例えば、野生型ヒト全長オ
トフェリンタンパク質）の配列を含むことができる。2個以上のアミノ酸が野生型全長オ
トフェリンタンパク質の配列から欠失しているいくつかの態様において、該2個以上の欠
失したアミノ酸は、野生型全長タンパク質の配列において連続していてもよい。2個以上
のアミノ酸が野生型全長オトフェリンタンパク質の配列から欠失している他の例では、該
2個以上の欠失したアミノ酸は、野生型全長タンパク質の配列において連続していない。
異なる種に由来する野生型全長オトフェリンタンパク質の間で保存されていないアミノ酸
は、活性を失うことなく欠失させることができるが、異なる種に由来する野生型全長オト
フェリンタンパク質の間で保存されているそれらのアミノ酸は、活性に関与している可能
性が（異なる種の間で保存されていないアミノ酸よりも）高いため、欠失させるべきでは
ないことを、当業者は認識しているであろう。
【0139】
いくつかの例では、活性オトフェリンタンパク質は、例えば、1アミノ酸～約100アミノ
酸、1アミノ酸～約95アミノ酸、1アミノ酸～約90アミノ酸、1アミノ酸～約85アミノ酸、1
アミノ酸～約80アミノ酸、1アミノ酸～約75アミノ酸、1アミノ酸～約70アミノ酸、1アミ
ノ酸～約65アミノ酸、1アミノ酸～約60アミノ酸、1アミノ酸～約55アミノ酸、1アミノ酸
～約50アミノ酸、1アミノ酸～約45アミノ酸、1アミノ酸～約40アミノ酸、1アミノ酸～約3
5アミノ酸、1アミノ酸～約30アミノ酸、1アミノ酸～約25アミノ酸、1アミノ酸～約20アミ
ノ酸、1アミノ酸～約15アミノ酸、1アミノ酸～約10アミノ酸、1アミノ酸～約9アミノ酸、
1アミノ酸～約8アミノ酸、1アミノ酸～約7アミノ酸、1アミノ酸～約6アミノ酸、1アミノ
酸～約5アミノ酸、1アミノ酸～約4アミノ酸、1アミノ酸～約3アミノ酸、約2アミノ酸～約
100アミノ酸、約2アミノ酸～約95アミノ酸、約2アミノ酸～約90アミノ酸、約2アミノ酸～
約85アミノ酸、約2アミノ酸～約80アミノ酸、約2アミノ酸～約75アミノ酸、約2アミノ酸
～約70アミノ酸、約2アミノ酸～約65アミノ酸、約2アミノ酸～約60アミノ酸、約2アミノ
酸～約55アミノ酸、約2アミノ酸～約50アミノ酸、約2アミノ酸～約45アミノ酸、約2アミ
ノ酸～約40アミノ酸、約2アミノ酸～約35アミノ酸、約2アミノ酸～約30アミノ酸、約2ア
ミノ酸～約25アミノ酸、約2アミノ酸～約20アミノ酸、約2アミノ酸～約15アミノ酸、約2
アミノ酸～約10アミノ酸、約2アミノ酸～約9アミノ酸、約2アミノ酸～約8アミノ酸、約2
アミノ酸～約7アミノ酸、約2アミノ酸～約6アミノ酸、約2アミノ酸～約5アミノ酸、約2ア
ミノ酸～約4アミノ酸、約3アミノ酸～約100アミノ酸、約3アミノ酸～約95アミノ酸、約3
アミノ酸～約90アミノ酸、約3アミノ酸～約85アミノ酸、約3アミノ酸～約80アミノ酸、約
3アミノ酸～約75アミノ酸、約3アミノ酸～約70アミノ酸、約3アミノ酸～約65アミノ酸、
約3アミノ酸～約60アミノ酸、約3アミノ酸～約55アミノ酸、約3アミノ酸～約50アミノ酸
、約3アミノ酸～約45アミノ酸、約3アミノ酸～約40アミノ酸、約3アミノ酸～約35アミノ
酸、約3アミノ酸～約30アミノ酸、約3アミノ酸～約25アミノ酸、約3アミノ酸～約20アミ
ノ酸、約3アミノ酸～約15アミノ酸、約3アミノ酸～約10アミノ酸、約3アミノ酸～約9アミ
ノ酸、約3アミノ酸～約8アミノ酸、約3アミノ酸～約7アミノ酸、約3アミノ酸～約6アミノ
酸、約3アミノ酸～約5アミノ酸、約4アミノ酸～約100アミノ酸、約4アミノ酸～約95アミ
ノ酸、約4アミノ酸～約90アミノ酸、約4アミノ酸～約85アミノ酸、約4アミノ酸～約80ア
ミノ酸、約4アミノ酸～約75アミノ酸、約4アミノ酸～約70アミノ酸、約4アミノ酸～約65
アミノ酸、約4アミノ酸～約60アミノ酸、約4アミノ酸～約55アミノ酸、約4アミノ酸～約5
0アミノ酸、約4アミノ酸～約45アミノ酸、約4アミノ酸～約40アミノ酸、約4アミノ酸～約
35アミノ酸、約4アミノ酸～約30アミノ酸、約4アミノ酸～約25アミノ酸、約4アミノ酸～
約20アミノ酸、約4アミノ酸～約15アミノ酸、約4アミノ酸～約10アミノ酸、約4アミノ酸
～約9アミノ酸、約4アミノ酸～約8アミノ酸、約4アミノ酸～約7アミノ酸、約4アミノ酸～
約6アミノ酸、約5アミノ酸～約100アミノ酸、約5アミノ酸～約95アミノ酸、約5アミノ酸
～約90アミノ酸、約5アミノ酸～約85アミノ酸、約5アミノ酸～約80アミノ酸、約5アミノ
酸～約75アミノ酸、約5アミノ酸～約70アミノ酸、約5アミノ酸～約65アミノ酸、約5アミ
ノ酸～約60アミノ酸、約5アミノ酸～約55アミノ酸、約5アミノ酸～約50アミノ酸、約5ア
ミノ酸～約45アミノ酸、約5アミノ酸～約40アミノ酸、約5アミノ酸～約35アミノ酸、約5
アミノ酸～約30アミノ酸、約5アミノ酸～約25アミノ酸、約5アミノ酸～約20アミノ酸、約
5アミノ酸～約15アミノ酸、約5アミノ酸～約10アミノ酸、約5アミノ酸～約9アミノ酸、約
5アミノ酸～約8アミノ酸、約5アミノ酸～約7アミノ酸、約6アミノ酸～約100アミノ酸、約
6アミノ酸～約95アミノ酸、約6アミノ酸～約90アミノ酸、約6アミノ酸～約85アミノ酸、
約6アミノ酸～約80アミノ酸、約6アミノ酸～約75アミノ酸、約6アミノ酸～約70アミノ酸
、約6アミノ酸～約65アミノ酸、約6アミノ酸～約60アミノ酸、約6アミノ酸～約55アミノ
酸、約6アミノ酸～約50アミノ酸、約6アミノ酸～約45アミノ酸、約6アミノ酸～約40アミ
ノ酸、約6アミノ酸～約35アミノ酸、約6アミノ酸～約30アミノ酸、約6アミノ酸～約25ア
ミノ酸、約6アミノ酸～約20アミノ酸、約6アミノ酸～約15アミノ酸、約6アミノ酸～約10
アミノ酸、約6アミノ酸～約9アミノ酸、約6アミノ酸～約8アミノ酸、約7アミノ酸～約100
アミノ酸、約7アミノ酸～約95アミノ酸、約7アミノ酸～約90アミノ酸、約7アミノ酸～約8
5アミノ酸、約7アミノ酸～約80アミノ酸、約7アミノ酸～約75アミノ酸、約7アミノ酸～約
70アミノ酸、約7アミノ酸～約65アミノ酸、約7アミノ酸～約60アミノ酸、約7アミノ酸～
約55アミノ酸、約7アミノ酸～約50アミノ酸、約7アミノ酸～約45アミノ酸、約7アミノ酸
～約40アミノ酸、約7アミノ酸～約35アミノ酸、約7アミノ酸～約30アミノ酸、約7アミノ
酸～約25アミノ酸、約7アミノ酸～約20アミノ酸、約7アミノ酸～約15アミノ酸、約7アミ
ノ酸～約10アミノ酸、約7アミノ酸～約9アミノ酸、約8アミノ酸～約100アミノ酸、約8ア
ミノ酸～約95アミノ酸、約8アミノ酸～約90アミノ酸、約8アミノ酸～約85アミノ酸、約8
アミノ酸～約80アミノ酸、約8アミノ酸～約75アミノ酸、約8アミノ酸～約70アミノ酸、約
8アミノ酸～約65アミノ酸、約8アミノ酸～約60アミノ酸、約8アミノ酸～約55アミノ酸、
約8アミノ酸～約50アミノ酸、約8アミノ酸～約45アミノ酸、約8アミノ酸～約40アミノ酸
、約8アミノ酸～約35アミノ酸、約8アミノ酸～約30アミノ酸、約8アミノ酸～約25アミノ
酸、約8アミノ酸～約20アミノ酸、約8アミノ酸～約15アミノ酸、約8アミノ酸～約10アミ
ノ酸、約10アミノ酸～約100アミノ酸、約10アミノ酸～約95アミノ酸、約10アミノ酸～約9
0アミノ酸、約10アミノ酸～約85アミノ酸、約10アミノ酸～約80アミノ酸、約10アミノ酸
～約75アミノ酸、約10アミノ酸～約70アミノ酸、約10アミノ酸～約65アミノ酸、約10アミ
ノ酸～約60アミノ酸、約10アミノ酸～約55アミノ酸、約10アミノ酸～約50アミノ酸、約10
アミノ酸～約45アミノ酸、約10アミノ酸～約40アミノ酸、約10アミノ酸～約35アミノ酸、
約10アミノ酸～約30アミノ酸、約10アミノ酸～約25アミノ酸、約10アミノ酸～約20アミノ
酸、約10アミノ酸～約15アミノ酸、約20アミノ酸～約100アミノ酸、約20アミノ酸～約95
アミノ酸、約20アミノ酸～約90アミノ酸、約20アミノ酸～約85アミノ酸、約20アミノ酸～
約80アミノ酸、約20アミノ酸～約75アミノ酸、約20アミノ酸～約70アミノ酸、約20アミノ
酸～約65アミノ酸、約20アミノ酸～約60アミノ酸、約20アミノ酸～約55アミノ酸、約20ア
ミノ酸～約50アミノ酸、約20アミノ酸～約45アミノ酸、約20アミノ酸～約40アミノ酸、約
20アミノ酸～約35アミノ酸、約20アミノ酸～約30アミノ酸、約20アミノ酸～約25アミノ酸
、約30アミノ酸～約100アミノ酸、約30アミノ酸～約95アミノ酸、約30アミノ酸～約90ア
ミノ酸、約30アミノ酸～約85アミノ酸、約30アミノ酸～約80アミノ酸、約30アミノ酸～約
75アミノ酸、約30アミノ酸～約70アミノ酸、約30アミノ酸～約65アミノ酸、約30アミノ酸
～約60アミノ酸、約30アミノ酸～約55アミノ酸、約30アミノ酸～約50アミノ酸、約30アミ
ノ酸～約45アミノ酸、約30アミノ酸～約40アミノ酸、約30アミノ酸～約35アミノ酸、約40
アミノ酸～約100アミノ酸、約40アミノ酸～約95アミノ酸、約40アミノ酸～約90アミノ酸
、約40アミノ酸～約85アミノ酸、約40アミノ酸～約80アミノ酸、約40アミノ酸～約75アミ
ノ酸、約40アミノ酸～約70アミノ酸、約40アミノ酸～約65アミノ酸、約40アミノ酸～約60
アミノ酸、約40アミノ酸～約55アミノ酸、約40アミノ酸～約50アミノ酸、約40アミノ酸～
約45アミノ酸、約50アミノ酸～約100アミノ酸、約50アミノ酸～約95アミノ酸、約50アミ
ノ酸～約90アミノ酸、約50アミノ酸～約85アミノ酸、約50アミノ酸～約80アミノ酸、約50
アミノ酸～約75アミノ酸、約50アミノ酸～約70アミノ酸、約50アミノ酸～約65アミノ酸、
約50アミノ酸～約60アミノ酸、約50アミノ酸～約55アミノ酸、約60アミノ酸～約100アミ
ノ酸、約60アミノ酸～約95アミノ酸、約60アミノ酸～約90アミノ酸、約60アミノ酸～約85
アミノ酸、約60アミノ酸～約80アミノ酸、約60アミノ酸～約75アミノ酸、約60アミノ酸～
約70アミノ酸、約60アミノ酸～約65アミノ酸、約70アミノ酸～約100アミノ酸、約70アミ
ノ酸～約95アミノ酸、約70アミノ酸～約90アミノ酸、約70アミノ酸～約85アミノ酸、約70
アミノ酸～約80アミノ酸、約70アミノ酸～約75アミノ酸、約80アミノ酸～約100アミノ酸
、約80アミノ酸～約95アミノ酸、約80アミノ酸～約90アミノ酸、約80アミノ酸～約85アミ
ノ酸、約90アミノ酸～約100アミノ酸、約90アミノ酸～約95アミノ酸、または約95アミノ
酸～約100アミノ酸が、そのN末端および/またはそのC末端から除去されている、野生型全
長オトフェリンタンパク質の配列を含むことができる。
酸、1アミノ酸～約95アミノ酸、1アミノ酸～約90アミノ酸、1アミノ酸～約85アミノ酸、1
アミノ酸～約80アミノ酸、1アミノ酸～約75アミノ酸、1アミノ酸～約70アミノ酸、1アミ
ノ酸～約65アミノ酸、1アミノ酸～約60アミノ酸、1アミノ酸～約55アミノ酸、1アミノ酸
～約50アミノ酸、1アミノ酸～約45アミノ酸、1アミノ酸～約40アミノ酸、1アミノ酸～約3
5アミノ酸、1アミノ酸～約30アミノ酸、1アミノ酸～約25アミノ酸、1アミノ酸～約20アミ
ノ酸、1アミノ酸～約15アミノ酸、1アミノ酸～約10アミノ酸、1アミノ酸～約9アミノ酸、
1アミノ酸～約8アミノ酸、1アミノ酸～約7アミノ酸、1アミノ酸～約6アミノ酸、1アミノ
酸～約5アミノ酸、1アミノ酸～約4アミノ酸、1アミノ酸～約3アミノ酸、約2アミノ酸～約
100アミノ酸、約2アミノ酸～約95アミノ酸、約2アミノ酸～約90アミノ酸、約2アミノ酸～
約85アミノ酸、約2アミノ酸～約80アミノ酸、約2アミノ酸～約75アミノ酸、約2アミノ酸
～約70アミノ酸、約2アミノ酸～約65アミノ酸、約2アミノ酸～約60アミノ酸、約2アミノ
酸～約55アミノ酸、約2アミノ酸～約50アミノ酸、約2アミノ酸～約45アミノ酸、約2アミ
ノ酸～約40アミノ酸、約2アミノ酸～約35アミノ酸、約2アミノ酸～約30アミノ酸、約2ア
ミノ酸～約25アミノ酸、約2アミノ酸～約20アミノ酸、約2アミノ酸～約15アミノ酸、約2
アミノ酸～約10アミノ酸、約2アミノ酸～約9アミノ酸、約2アミノ酸～約8アミノ酸、約2
アミノ酸～約7アミノ酸、約2アミノ酸～約6アミノ酸、約2アミノ酸～約5アミノ酸、約2ア
ミノ酸～約4アミノ酸、約3アミノ酸～約100アミノ酸、約3アミノ酸～約95アミノ酸、約3
アミノ酸～約90アミノ酸、約3アミノ酸～約85アミノ酸、約3アミノ酸～約80アミノ酸、約
3アミノ酸～約75アミノ酸、約3アミノ酸～約70アミノ酸、約3アミノ酸～約65アミノ酸、
約3アミノ酸～約60アミノ酸、約3アミノ酸～約55アミノ酸、約3アミノ酸～約50アミノ酸
、約3アミノ酸～約45アミノ酸、約3アミノ酸～約40アミノ酸、約3アミノ酸～約35アミノ
酸、約3アミノ酸～約30アミノ酸、約3アミノ酸～約25アミノ酸、約3アミノ酸～約20アミ
ノ酸、約3アミノ酸～約15アミノ酸、約3アミノ酸～約10アミノ酸、約3アミノ酸～約9アミ
ノ酸、約3アミノ酸～約8アミノ酸、約3アミノ酸～約7アミノ酸、約3アミノ酸～約6アミノ
酸、約3アミノ酸～約5アミノ酸、約4アミノ酸～約100アミノ酸、約4アミノ酸～約95アミ
ノ酸、約4アミノ酸～約90アミノ酸、約4アミノ酸～約85アミノ酸、約4アミノ酸～約80ア
ミノ酸、約4アミノ酸～約75アミノ酸、約4アミノ酸～約70アミノ酸、約4アミノ酸～約65
アミノ酸、約4アミノ酸～約60アミノ酸、約4アミノ酸～約55アミノ酸、約4アミノ酸～約5
0アミノ酸、約4アミノ酸～約45アミノ酸、約4アミノ酸～約40アミノ酸、約4アミノ酸～約
35アミノ酸、約4アミノ酸～約30アミノ酸、約4アミノ酸～約25アミノ酸、約4アミノ酸～
約20アミノ酸、約4アミノ酸～約15アミノ酸、約4アミノ酸～約10アミノ酸、約4アミノ酸
～約9アミノ酸、約4アミノ酸～約8アミノ酸、約4アミノ酸～約7アミノ酸、約4アミノ酸～
約6アミノ酸、約5アミノ酸～約100アミノ酸、約5アミノ酸～約95アミノ酸、約5アミノ酸
～約90アミノ酸、約5アミノ酸～約85アミノ酸、約5アミノ酸～約80アミノ酸、約5アミノ
酸～約75アミノ酸、約5アミノ酸～約70アミノ酸、約5アミノ酸～約65アミノ酸、約5アミ
ノ酸～約60アミノ酸、約5アミノ酸～約55アミノ酸、約5アミノ酸～約50アミノ酸、約5ア
ミノ酸～約45アミノ酸、約5アミノ酸～約40アミノ酸、約5アミノ酸～約35アミノ酸、約5
アミノ酸～約30アミノ酸、約5アミノ酸～約25アミノ酸、約5アミノ酸～約20アミノ酸、約
5アミノ酸～約15アミノ酸、約5アミノ酸～約10アミノ酸、約5アミノ酸～約9アミノ酸、約
5アミノ酸～約8アミノ酸、約5アミノ酸～約7アミノ酸、約6アミノ酸～約100アミノ酸、約
6アミノ酸～約95アミノ酸、約6アミノ酸～約90アミノ酸、約6アミノ酸～約85アミノ酸、
約6アミノ酸～約80アミノ酸、約6アミノ酸～約75アミノ酸、約6アミノ酸～約70アミノ酸
、約6アミノ酸～約65アミノ酸、約6アミノ酸～約60アミノ酸、約6アミノ酸～約55アミノ
酸、約6アミノ酸～約50アミノ酸、約6アミノ酸～約45アミノ酸、約6アミノ酸～約40アミ
ノ酸、約6アミノ酸～約35アミノ酸、約6アミノ酸～約30アミノ酸、約6アミノ酸～約25ア
ミノ酸、約6アミノ酸～約20アミノ酸、約6アミノ酸～約15アミノ酸、約6アミノ酸～約10
アミノ酸、約6アミノ酸～約9アミノ酸、約6アミノ酸～約8アミノ酸、約7アミノ酸～約100
アミノ酸、約7アミノ酸～約95アミノ酸、約7アミノ酸～約90アミノ酸、約7アミノ酸～約8
5アミノ酸、約7アミノ酸～約80アミノ酸、約7アミノ酸～約75アミノ酸、約7アミノ酸～約
70アミノ酸、約7アミノ酸～約65アミノ酸、約7アミノ酸～約60アミノ酸、約7アミノ酸～
約55アミノ酸、約7アミノ酸～約50アミノ酸、約7アミノ酸～約45アミノ酸、約7アミノ酸
～約40アミノ酸、約7アミノ酸～約35アミノ酸、約7アミノ酸～約30アミノ酸、約7アミノ
酸～約25アミノ酸、約7アミノ酸～約20アミノ酸、約7アミノ酸～約15アミノ酸、約7アミ
ノ酸～約10アミノ酸、約7アミノ酸～約9アミノ酸、約8アミノ酸～約100アミノ酸、約8ア
ミノ酸～約95アミノ酸、約8アミノ酸～約90アミノ酸、約8アミノ酸～約85アミノ酸、約8
アミノ酸～約80アミノ酸、約8アミノ酸～約75アミノ酸、約8アミノ酸～約70アミノ酸、約
8アミノ酸～約65アミノ酸、約8アミノ酸～約60アミノ酸、約8アミノ酸～約55アミノ酸、
約8アミノ酸～約50アミノ酸、約8アミノ酸～約45アミノ酸、約8アミノ酸～約40アミノ酸
、約8アミノ酸～約35アミノ酸、約8アミノ酸～約30アミノ酸、約8アミノ酸～約25アミノ
酸、約8アミノ酸～約20アミノ酸、約8アミノ酸～約15アミノ酸、約8アミノ酸～約10アミ
ノ酸、約10アミノ酸～約100アミノ酸、約10アミノ酸～約95アミノ酸、約10アミノ酸～約9
0アミノ酸、約10アミノ酸～約85アミノ酸、約10アミノ酸～約80アミノ酸、約10アミノ酸
～約75アミノ酸、約10アミノ酸～約70アミノ酸、約10アミノ酸～約65アミノ酸、約10アミ
ノ酸～約60アミノ酸、約10アミノ酸～約55アミノ酸、約10アミノ酸～約50アミノ酸、約10
アミノ酸～約45アミノ酸、約10アミノ酸～約40アミノ酸、約10アミノ酸～約35アミノ酸、
約10アミノ酸～約30アミノ酸、約10アミノ酸～約25アミノ酸、約10アミノ酸～約20アミノ
酸、約10アミノ酸～約15アミノ酸、約20アミノ酸～約100アミノ酸、約20アミノ酸～約95
アミノ酸、約20アミノ酸～約90アミノ酸、約20アミノ酸～約85アミノ酸、約20アミノ酸～
約80アミノ酸、約20アミノ酸～約75アミノ酸、約20アミノ酸～約70アミノ酸、約20アミノ
酸～約65アミノ酸、約20アミノ酸～約60アミノ酸、約20アミノ酸～約55アミノ酸、約20ア
ミノ酸～約50アミノ酸、約20アミノ酸～約45アミノ酸、約20アミノ酸～約40アミノ酸、約
20アミノ酸～約35アミノ酸、約20アミノ酸～約30アミノ酸、約20アミノ酸～約25アミノ酸
、約30アミノ酸～約100アミノ酸、約30アミノ酸～約95アミノ酸、約30アミノ酸～約90ア
ミノ酸、約30アミノ酸～約85アミノ酸、約30アミノ酸～約80アミノ酸、約30アミノ酸～約
75アミノ酸、約30アミノ酸～約70アミノ酸、約30アミノ酸～約65アミノ酸、約30アミノ酸
～約60アミノ酸、約30アミノ酸～約55アミノ酸、約30アミノ酸～約50アミノ酸、約30アミ
ノ酸～約45アミノ酸、約30アミノ酸～約40アミノ酸、約30アミノ酸～約35アミノ酸、約40
アミノ酸～約100アミノ酸、約40アミノ酸～約95アミノ酸、約40アミノ酸～約90アミノ酸
、約40アミノ酸～約85アミノ酸、約40アミノ酸～約80アミノ酸、約40アミノ酸～約75アミ
ノ酸、約40アミノ酸～約70アミノ酸、約40アミノ酸～約65アミノ酸、約40アミノ酸～約60
アミノ酸、約40アミノ酸～約55アミノ酸、約40アミノ酸～約50アミノ酸、約40アミノ酸～
約45アミノ酸、約50アミノ酸～約100アミノ酸、約50アミノ酸～約95アミノ酸、約50アミ
ノ酸～約90アミノ酸、約50アミノ酸～約85アミノ酸、約50アミノ酸～約80アミノ酸、約50
アミノ酸～約75アミノ酸、約50アミノ酸～約70アミノ酸、約50アミノ酸～約65アミノ酸、
約50アミノ酸～約60アミノ酸、約50アミノ酸～約55アミノ酸、約60アミノ酸～約100アミ
ノ酸、約60アミノ酸～約95アミノ酸、約60アミノ酸～約90アミノ酸、約60アミノ酸～約85
アミノ酸、約60アミノ酸～約80アミノ酸、約60アミノ酸～約75アミノ酸、約60アミノ酸～
約70アミノ酸、約60アミノ酸～約65アミノ酸、約70アミノ酸～約100アミノ酸、約70アミ
ノ酸～約95アミノ酸、約70アミノ酸～約90アミノ酸、約70アミノ酸～約85アミノ酸、約70
アミノ酸～約80アミノ酸、約70アミノ酸～約75アミノ酸、約80アミノ酸～約100アミノ酸
、約80アミノ酸～約95アミノ酸、約80アミノ酸～約90アミノ酸、約80アミノ酸～約85アミ
ノ酸、約90アミノ酸～約100アミノ酸、約90アミノ酸～約95アミノ酸、または約95アミノ
酸～約100アミノ酸が、そのN末端および/またはそのC末端から除去されている、野生型全
長オトフェリンタンパク質の配列を含むことができる。
【0140】
いくつかの態様において、活性オトフェリンタンパク質は、例えば、1アミノ酸～50ア
ミノ酸、1アミノ酸～45アミノ酸、1アミノ酸～40アミノ酸、1アミノ酸～35アミノ酸、1ア
ミノ酸～30アミノ酸、1アミノ酸～25アミノ酸、1アミノ酸～20アミノ酸、1アミノ酸～15
アミノ酸、1アミノ酸～10アミノ酸、1アミノ酸～9アミノ酸、1アミノ酸～8アミノ酸、1ア
ミノ酸～7アミノ酸、1アミノ酸～6アミノ酸、1アミノ酸～5アミノ酸、1アミノ酸～4アミ
ノ酸、1アミノ酸～3アミノ酸、約2アミノ酸～50アミノ酸、約2アミノ酸～45アミノ酸、約
2アミノ酸～40アミノ酸、約2アミノ酸～35アミノ酸、約2アミノ酸～30アミノ酸、約2アミ
ノ酸～25アミノ酸、約2アミノ酸～20アミノ酸、約2アミノ酸～15アミノ酸、約2アミノ酸
～10アミノ酸、約2アミノ酸～9アミノ酸、約2アミノ酸～8アミノ酸、約2アミノ酸～7アミ
ノ酸、約2アミノ酸～6アミノ酸、約2アミノ酸～5アミノ酸、約2アミノ酸～4アミノ酸、約
3アミノ酸～50アミノ酸、約3アミノ酸～45アミノ酸、約3アミノ酸～40アミノ酸、約3アミ
ノ酸～35アミノ酸、約3アミノ酸～30アミノ酸、約3アミノ酸～25アミノ酸、約3アミノ酸
～20アミノ酸、約3アミノ酸～15アミノ酸、約3アミノ酸～10アミノ酸、約3アミノ酸～9ア
ミノ酸、約3アミノ酸～8アミノ酸、約3アミノ酸～7アミノ酸、約3アミノ酸～6アミノ酸、
約3アミノ酸～5アミノ酸、約4アミノ酸～50アミノ酸、約4アミノ酸～45アミノ酸、約4ア
ミノ酸～40アミノ酸、約4アミノ酸～35アミノ酸、約4アミノ酸～30アミノ酸、約4アミノ
酸～25アミノ酸、約4アミノ酸～20アミノ酸、約4アミノ酸～15アミノ酸、約4アミノ酸～1
0アミノ酸、約4アミノ酸～9アミノ酸、約4アミノ酸～8アミノ酸、約4アミノ酸～7アミノ
酸、約4アミノ酸～6アミノ酸、約5アミノ酸～50アミノ酸、約5アミノ酸～45アミノ酸、約
5アミノ酸～40アミノ酸、約5アミノ酸～35アミノ酸、約5アミノ酸～30アミノ酸、約5アミ
ノ酸～25アミノ酸、約5アミノ酸～20アミノ酸、約5アミノ酸～15アミノ酸、約5アミノ酸
～10アミノ酸、約5アミノ酸～9アミノ酸、約5アミノ酸～8アミノ酸、約5アミノ酸～7アミ
ノ酸、約6アミノ酸～50アミノ酸、約6アミノ酸～45アミノ酸、約6アミノ酸～40アミノ酸
、約6アミノ酸～35アミノ酸、約6アミノ酸～30アミノ酸、約6アミノ酸～25アミノ酸、約6
アミノ酸～20アミノ酸、約6アミノ酸～15アミノ酸、約6アミノ酸～10アミノ酸、約6アミ
ノ酸～9アミノ酸、約6アミノ酸～8アミノ酸、約7アミノ酸～50アミノ酸、約7アミノ酸～4
5アミノ酸、約7アミノ酸～40アミノ酸、約7アミノ酸～35アミノ酸、約7アミノ酸～30アミ
ノ酸、約7アミノ酸～25アミノ酸、約7アミノ酸～20アミノ酸、約7アミノ酸～15アミノ酸
、約7アミノ酸～10アミノ酸、約7アミノ酸～9アミノ酸、約8アミノ酸～50アミノ酸、約8
アミノ酸～45アミノ酸、約8アミノ酸～40アミノ酸、約8アミノ酸～35アミノ酸、約8アミ
ノ酸～30アミノ酸、約8アミノ酸～25アミノ酸、約8アミノ酸～20アミノ酸、約8アミノ酸
～15アミノ酸、約8アミノ酸～10アミノ酸、約10アミノ酸～50アミノ酸、約10アミノ酸～4
5アミノ酸、約10アミノ酸～40アミノ酸、約10アミノ酸～35アミノ酸、約10アミノ酸～30
アミノ酸、約10アミノ酸～25アミノ酸、約10アミノ酸～20アミノ酸、約10アミノ酸～15ア
ミノ酸、約15アミノ酸～50アミノ酸、約15アミノ酸～45アミノ酸、約15アミノ酸～40アミ
ノ酸、約15アミノ酸～35アミノ酸、約15アミノ酸～30アミノ酸、約15アミノ酸～25アミノ
酸、約15アミノ酸～20アミノ酸、約20アミノ酸～50アミノ酸、約20アミノ酸～45アミノ酸
、約20アミノ酸～40アミノ酸、約20アミノ酸～35アミノ酸、約20アミノ酸～30アミノ酸、
約20アミノ酸～25アミノ酸、約25アミノ酸～50アミノ酸、約25アミノ酸～45アミノ酸、約
25アミノ酸～40アミノ酸、約25アミノ酸～35アミノ酸、約25アミノ酸～30アミノ酸、約30
アミノ酸～50アミノ酸、約30アミノ酸～45アミノ酸、約30アミノ酸～40アミノ酸、約30ア
ミノ酸～35アミノ酸、約35アミノ酸～50アミノ酸、約35アミノ酸～45アミノ酸、約35アミ
ノ酸～40アミノ酸、約40アミノ酸～50アミノ酸、約40アミノ酸～45アミノ酸、または約45
アミノ酸～約50アミノ酸が挿入されている、野生型全長オトフェリンタンパク質の配列を
含むことができる。いくつかの例では、挿入されるアミノ酸は、野生型全長タンパク質の
配列中に連続配列として挿入され得る。いくつかの例では、アミノ酸は、野生型全長タン
パク質の配列中に連続配列として挿入されない。当技術分野において認識され得るように
、アミノ酸は、野生型全長タンパク質の配列の、種の間で十分に保存されていない部分に
挿入され得る。
ミノ酸、1アミノ酸～45アミノ酸、1アミノ酸～40アミノ酸、1アミノ酸～35アミノ酸、1ア
ミノ酸～30アミノ酸、1アミノ酸～25アミノ酸、1アミノ酸～20アミノ酸、1アミノ酸～15
アミノ酸、1アミノ酸～10アミノ酸、1アミノ酸～9アミノ酸、1アミノ酸～8アミノ酸、1ア
ミノ酸～7アミノ酸、1アミノ酸～6アミノ酸、1アミノ酸～5アミノ酸、1アミノ酸～4アミ
ノ酸、1アミノ酸～3アミノ酸、約2アミノ酸～50アミノ酸、約2アミノ酸～45アミノ酸、約
2アミノ酸～40アミノ酸、約2アミノ酸～35アミノ酸、約2アミノ酸～30アミノ酸、約2アミ
ノ酸～25アミノ酸、約2アミノ酸～20アミノ酸、約2アミノ酸～15アミノ酸、約2アミノ酸
～10アミノ酸、約2アミノ酸～9アミノ酸、約2アミノ酸～8アミノ酸、約2アミノ酸～7アミ
ノ酸、約2アミノ酸～6アミノ酸、約2アミノ酸～5アミノ酸、約2アミノ酸～4アミノ酸、約
3アミノ酸～50アミノ酸、約3アミノ酸～45アミノ酸、約3アミノ酸～40アミノ酸、約3アミ
ノ酸～35アミノ酸、約3アミノ酸～30アミノ酸、約3アミノ酸～25アミノ酸、約3アミノ酸
～20アミノ酸、約3アミノ酸～15アミノ酸、約3アミノ酸～10アミノ酸、約3アミノ酸～9ア
ミノ酸、約3アミノ酸～8アミノ酸、約3アミノ酸～7アミノ酸、約3アミノ酸～6アミノ酸、
約3アミノ酸～5アミノ酸、約4アミノ酸～50アミノ酸、約4アミノ酸～45アミノ酸、約4ア
ミノ酸～40アミノ酸、約4アミノ酸～35アミノ酸、約4アミノ酸～30アミノ酸、約4アミノ
酸～25アミノ酸、約4アミノ酸～20アミノ酸、約4アミノ酸～15アミノ酸、約4アミノ酸～1
0アミノ酸、約4アミノ酸～9アミノ酸、約4アミノ酸～8アミノ酸、約4アミノ酸～7アミノ
酸、約4アミノ酸～6アミノ酸、約5アミノ酸～50アミノ酸、約5アミノ酸～45アミノ酸、約
5アミノ酸～40アミノ酸、約5アミノ酸～35アミノ酸、約5アミノ酸～30アミノ酸、約5アミ
ノ酸～25アミノ酸、約5アミノ酸～20アミノ酸、約5アミノ酸～15アミノ酸、約5アミノ酸
～10アミノ酸、約5アミノ酸～9アミノ酸、約5アミノ酸～8アミノ酸、約5アミノ酸～7アミ
ノ酸、約6アミノ酸～50アミノ酸、約6アミノ酸～45アミノ酸、約6アミノ酸～40アミノ酸
、約6アミノ酸～35アミノ酸、約6アミノ酸～30アミノ酸、約6アミノ酸～25アミノ酸、約6
アミノ酸～20アミノ酸、約6アミノ酸～15アミノ酸、約6アミノ酸～10アミノ酸、約6アミ
ノ酸～9アミノ酸、約6アミノ酸～8アミノ酸、約7アミノ酸～50アミノ酸、約7アミノ酸～4
5アミノ酸、約7アミノ酸～40アミノ酸、約7アミノ酸～35アミノ酸、約7アミノ酸～30アミ
ノ酸、約7アミノ酸～25アミノ酸、約7アミノ酸～20アミノ酸、約7アミノ酸～15アミノ酸
、約7アミノ酸～10アミノ酸、約7アミノ酸～9アミノ酸、約8アミノ酸～50アミノ酸、約8
アミノ酸～45アミノ酸、約8アミノ酸～40アミノ酸、約8アミノ酸～35アミノ酸、約8アミ
ノ酸～30アミノ酸、約8アミノ酸～25アミノ酸、約8アミノ酸～20アミノ酸、約8アミノ酸
～15アミノ酸、約8アミノ酸～10アミノ酸、約10アミノ酸～50アミノ酸、約10アミノ酸～4
5アミノ酸、約10アミノ酸～40アミノ酸、約10アミノ酸～35アミノ酸、約10アミノ酸～30
アミノ酸、約10アミノ酸～25アミノ酸、約10アミノ酸～20アミノ酸、約10アミノ酸～15ア
ミノ酸、約15アミノ酸～50アミノ酸、約15アミノ酸～45アミノ酸、約15アミノ酸～40アミ
ノ酸、約15アミノ酸～35アミノ酸、約15アミノ酸～30アミノ酸、約15アミノ酸～25アミノ
酸、約15アミノ酸～20アミノ酸、約20アミノ酸～50アミノ酸、約20アミノ酸～45アミノ酸
、約20アミノ酸～40アミノ酸、約20アミノ酸～35アミノ酸、約20アミノ酸～30アミノ酸、
約20アミノ酸～25アミノ酸、約25アミノ酸～50アミノ酸、約25アミノ酸～45アミノ酸、約
25アミノ酸～40アミノ酸、約25アミノ酸～35アミノ酸、約25アミノ酸～30アミノ酸、約30
アミノ酸～50アミノ酸、約30アミノ酸～45アミノ酸、約30アミノ酸～40アミノ酸、約30ア
ミノ酸～35アミノ酸、約35アミノ酸～50アミノ酸、約35アミノ酸～45アミノ酸、約35アミ
ノ酸～40アミノ酸、約40アミノ酸～50アミノ酸、約40アミノ酸～45アミノ酸、または約45
アミノ酸～約50アミノ酸が挿入されている、野生型全長オトフェリンタンパク質の配列を
含むことができる。いくつかの例では、挿入されるアミノ酸は、野生型全長タンパク質の
配列中に連続配列として挿入され得る。いくつかの例では、アミノ酸は、野生型全長タン
パク質の配列中に連続配列として挿入されない。当技術分野において認識され得るように
、アミノ酸は、野生型全長タンパク質の配列の、種の間で十分に保存されていない部分に
挿入され得る。
【0141】
範囲：本開示を通して、本発明のさまざまな局面は範囲形式で示され得る。範囲形式で
の記載は、単に便宜および簡潔のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性がない限定と
して解釈されるべきではないことが、理解されるべきである。したがって、範囲の記載は
、可能な部分範囲のすべておよびその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると考え
られるべきである。例えば、1から6までのような範囲の記載は、1～3、1～4、1～5、2～4
、2～6、3～6などのような部分範囲、およびその範囲内の個々の数、例えば、1、2、2.7
、3、4、5、5.3、および6を具体的に開示していると考えられるべきである。別の例とし
て、95～99％同一性のような範囲は、95％、96％、97％、98％、または99％同一性を有す
る何かを含み、かつ96～99％、96～98％、96～97％、97～99％、97～98％、および98～99
％同一性のような部分範囲を含む。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。
の記載は、単に便宜および簡潔のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性がない限定と
して解釈されるべきではないことが、理解されるべきである。したがって、範囲の記載は
、可能な部分範囲のすべておよびその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると考え
られるべきである。例えば、1から6までのような範囲の記載は、1～3、1～4、1～5、2～4
、2～6、3～6などのような部分範囲、およびその範囲内の個々の数、例えば、1、2、2.7
、3、4、5、5.3、および6を具体的に開示していると考えられるべきである。別の例とし
て、95～99％同一性のような範囲は、95％、96％、97％、98％、または99％同一性を有す
る何かを含み、かつ96～99％、96～98％、96～97％、97～99％、97～98％、および98～99
％同一性のような部分範囲を含む。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。
【0142】
特に定義されない限り、本明細書において用いられるすべての技術用語および科学用語
は、本発明が属する技術分野において当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味
を有する。方法および材料が、本発明における使用のために本明細書に記載されている；
当技術分野において公知の他の適している方法および材料もまた、用いられ得る。材料、
方法、および実施例は、例証となるだけであり、限定するようには意図されない。本明細
書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、
および他の参照文献は、その全体が参照により組み入れられる。矛盾する場合は、本明細
書が、定義を含めて支配することになる。
は、本発明が属する技術分野において当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味
を有する。方法および材料が、本発明における使用のために本明細書に記載されている；
当技術分野において公知の他の適している方法および材料もまた、用いられ得る。材料、
方法、および実施例は、例証となるだけであり、限定するようには意図されない。本明細
書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、
および他の参照文献は、その全体が参照により組み入れられる。矛盾する場合は、本明細
書が、定義を含めて支配することになる。
【発明を実施するための形態】
【0143】
詳細な説明
OTOFにおける変異は、劣性遺伝性の非症候性言語習得前聴力障害であるDFNB9をもたら
す。OTOFによってコードされるタンパク質であるオトフェリンの欠乏は、聴覚内有毛細胞
（IHC）からの迅速なエキソサイトーシスを消失させる。最初の聴覚シナプスでの神経伝
達の不全のために、いかなる音響信号も脳に伝達されず、このことが重度の難聴を説明し
ている。
OTOFにおける変異は、劣性遺伝性の非症候性言語習得前聴力障害であるDFNB9をもたら
す。OTOFによってコードされるタンパク質であるオトフェリンの欠乏は、聴覚内有毛細胞
（IHC）からの迅速なエキソサイトーシスを消失させる。最初の聴覚シナプスでの神経伝
達の不全のために、いかなる音響信号も脳に伝達されず、このことが重度の難聴を説明し
ている。
【0144】
本願発明の方法が、聴覚内有毛細胞における全長オトフェリンの発現をもたらすこと；
および、オトフェリンノックアウトマウスにおいて、クリック刺激の場合のABR閾値が30
dB～70 dBであり、純音の場合のABR閾値が50dB～90 dBである聴力の回復を成功させるこ
とが発見された。この発見を考慮して、本明細書において、欠陥オトフェリン遺伝子を有
すると特定された対象（例えば、ヒト）における非症候性感音難聴を治療するための組成
物および方法が提供される。
および、オトフェリンノックアウトマウスにおいて、クリック刺激の場合のABR閾値が30
dB～70 dBであり、純音の場合のABR閾値が50dB～90 dBである聴力の回復を成功させるこ
とが発見された。この発見を考慮して、本明細書において、欠陥オトフェリン遺伝子を有
すると特定された対象（例えば、ヒト）における非症候性感音難聴を治療するための組成
物および方法が提供される。
【0145】
本明細書において、少なくとも2つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、該少
なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコ
ードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも30アミノ酸
残基であり、任意で、コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が、コードされる部分
のうちの異なるもののアミノ酸配列と部分的に重複してもよく、少なくとも2つの異なる
ベクターのうちのいずれの単一のベクターも、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全
長オトフェリンタンパク質）をコードしておらず；コード配列のうちの少なくとも1つは
、オトフェリンゲノムDNAの2つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ
該2つの隣接するエクソン間のイントロン配列を欠いており；かつ染色体DNAを含む哺乳動
物細胞に導入されると、少なくとも2つの異なるベクターは、相互におよび細胞の染色体D
NAとの相同組換えを受け、それによって、染色体DNAに挿入された活性オトフェリンタン
パク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコードする組換え核酸が形成される、
前記組成物が提供される。本明細書に記載のいずれかの組成物を含むキットも提供される
。本明細書において、治療的有効量の本明細書に記載のいずれかの組成物を哺乳動物の蝸
牛内に導入する工程を含む方法も提供される。
なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコ
ードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも30アミノ酸
残基であり、任意で、コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が、コードされる部分
のうちの異なるもののアミノ酸配列と部分的に重複してもよく、少なくとも2つの異なる
ベクターのうちのいずれの単一のベクターも、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全
長オトフェリンタンパク質）をコードしておらず；コード配列のうちの少なくとも1つは
、オトフェリンゲノムDNAの2つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ
該2つの隣接するエクソン間のイントロン配列を欠いており；かつ染色体DNAを含む哺乳動
物細胞に導入されると、少なくとも2つの異なるベクターは、相互におよび細胞の染色体D
NAとの相同組換えを受け、それによって、染色体DNAに挿入された活性オトフェリンタン
パク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコードする組換え核酸が形成される、
前記組成物が提供される。本明細書に記載のいずれかの組成物を含むキットも提供される
。本明細書において、治療的有効量の本明細書に記載のいずれかの組成物を哺乳動物の蝸
牛内に導入する工程を含む方法も提供される。
【0146】
本明細書において、本明細書に記載されているいずれかの組成物を哺乳動物細胞に導入
する工程を含む、哺乳動物細胞において活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オト
フェリンタンパク質）の発現を増大させる方法も提供される。本明細書において、治療的
有効量の本明細書に記載のいずれかの組成物を哺乳動物の蝸牛に導入する工程を含む、哺
乳動物の蝸牛の内有毛細胞において活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェ
リンタンパク質）の発現を増大させる方法も提供される。本明細書において、治療的有効
量の本明細書に記載のいずれかの組成物を対象の蝸牛内に投与する工程を含む、欠陥オト
フェリン遺伝子を有すると特定された対象において非症候性感音難聴を治療する方法も提
供される。
する工程を含む、哺乳動物細胞において活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オト
フェリンタンパク質）の発現を増大させる方法も提供される。本明細書において、治療的
有効量の本明細書に記載のいずれかの組成物を哺乳動物の蝸牛に導入する工程を含む、哺
乳動物の蝸牛の内有毛細胞において活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェ
リンタンパク質）の発現を増大させる方法も提供される。本明細書において、治療的有効
量の本明細書に記載のいずれかの組成物を対象の蝸牛内に投与する工程を含む、欠陥オト
フェリン遺伝子を有すると特定された対象において非症候性感音難聴を治療する方法も提
供される。
【0147】
本発明の組成物、キット、および方法のさらなる非限定的な局面が本明細書に記載され
ており、限定されることなく任意の組み合わせで用いることができる。
ており、限定されることなく任意の組み合わせで用いることができる。
【0148】
オトフェリン
現在までに、ヒトOTOF遺伝子において、重度の言語習得前難聴DFNB9を引き起こす数百
もの変異が特定されている。このような変異は、さまざまな集団において常染色体劣性遺
伝性の非症候性難聴を持って生まれる人々の2～8％において難聴の原因となる（Rodrigue
z-Ballesteroset al. (2008) Hum. Mutat. 29 823-831; Choi et al. (2009) Clinical
Genetics 75237-243; Duman et al. (2011) Genet Test Mol Biomarkers 15 29-33; Var
ga et al.(2006) J Med Genet 43 576-581; Iwasa et al. (2013) BMC Med. Genet. 14
95）。例えば、オトフェリンの保存されているC2Cドメインにおける位置490および515で
のエクソン15における2つの置換はDFNB9を引き起こす（Mirqhomizadehet al. (2002) Ne
urobiol. Dis.10(2): 157-164）。Migliosiらは、言語習得前非症候性難聴を有するスペ
イン人の患者においてOTOFにおける新たな変異Q829Xを発見した（Migliosi et al. (2002
) J. Med.Genet. 39(7): 502-506）。
現在までに、ヒトOTOF遺伝子において、重度の言語習得前難聴DFNB9を引き起こす数百
もの変異が特定されている。このような変異は、さまざまな集団において常染色体劣性遺
伝性の非症候性難聴を持って生まれる人々の2～8％において難聴の原因となる（Rodrigue
z-Ballesteroset al. (2008) Hum. Mutat. 29 823-831; Choi et al. (2009) Clinical
Genetics 75237-243; Duman et al. (2011) Genet Test Mol Biomarkers 15 29-33; Var
ga et al.(2006) J Med Genet 43 576-581; Iwasa et al. (2013) BMC Med. Genet. 14
95）。例えば、オトフェリンの保存されているC2Cドメインにおける位置490および515で
のエクソン15における2つの置換はDFNB9を引き起こす（Mirqhomizadehet al. (2002) Ne
urobiol. Dis.10(2): 157-164）。Migliosiらは、言語習得前非症候性難聴を有するスペ
イン人の患者においてOTOFにおける新たな変異Q829Xを発見した（Migliosi et al. (2002
) J. Med.Genet. 39(7): 502-506）。
【0149】
難聴を有する対象において検出されたオトフェリン遺伝子におけるさらなる例示的変異
、およびオトフェリンをコードする核酸を配列決定する方法は、例えば、Rodriguez-Ball
esteros et al.(2003) Hum Mutat. 22: 451-456; Wang et al. (2010) BMC Med Genet.
11:79;Yildirim-Baylan et al. (2014) Int. J. Pediatr. Otorhinolaryngol 78: 950-9
53; Choi et al.(2009) Clin. Genet. 75(3): 237-243;およびMarlin et al. (2010) Bi
ochem BiophysRes Commun 394: 737-742に記載されている。
、およびオトフェリンをコードする核酸を配列決定する方法は、例えば、Rodriguez-Ball
esteros et al.(2003) Hum Mutat. 22: 451-456; Wang et al. (2010) BMC Med Genet.
11:79;Yildirim-Baylan et al. (2014) Int. J. Pediatr. Otorhinolaryngol 78: 950-9
53; Choi et al.(2009) Clin. Genet. 75(3): 237-243;およびMarlin et al. (2010) Bi
ochem BiophysRes Commun 394: 737-742に記載されている。
【0150】
DFNB9患者からの耳音響放射は、少なくとも生後10年間は正常であり、内耳の形態学的
完全性および外有毛細胞の適切な機能を示す。シナプス伝達の欠如およびその後のシナプ
スの喪失を除いて、内耳の形態および生理機能は、ヒトにおいて少なくとも生後10年間は
、DFNB9において保持されたままである。
完全性および外有毛細胞の適切な機能を示す。シナプス伝達の欠如およびその後のシナプ
スの喪失を除いて、内耳の形態および生理機能は、ヒトにおいて少なくとも生後10年間は
、DFNB9において保持されたままである。
【0151】
マウスモデルでの試験によって、シナプスは構造的に正常であり、IHCは生後1週間以内
はマウスにおいて正常なシナプス数を保持することが明らかになった。P6からP15の間に
、シナプスの約半分が失われる（Roux et al. (2006) Cell 127 277-289）。動物モデル
は、小胞融合後の細胞膜容量および聴神経における活性の変化を記録することによって、
シナプス伝達に対するオトフェリンの変異の作用を研究することを可能にした。オトフェ
リンノックアウト（Otof-/-）マウスでは、電位開口型Ca2+チャネルによる脱分極誘導性C
a2+流入により、IHCにおいてエキソサイトーシスはほとんど誘発されなかった（Rouxet
al. (2006) Cell127 277-289）。C2Fドメインにランダムな点変異を有する深刻な聴力障
害パチャンガ（pachanga）（OtofPga/Pga）マウスでは、IHCの短い（＜10ms）脱分極が
野生型マウスのものと同様の大きさの小胞融合を誘発したが、持続的な刺激は、即時放出
可能なプールへの小胞の補充における著しい欠乏を明らかにした（Pangrsic et al. (201
0) Nat.Neurosci. 13 869-876）。聴覚閾値の上昇は軽度だが音声理解の重篤な低下およ
び温度依存性難聴（temperature-dependentdeafening）を有するヒト患者においてp.Ile
515Thr変異が見出され（Vargaet al. (2006) J Med Genet 43 576-581）、これは、マウ
スモデルにおいて試験したときに中間表現型を明らかにした（Strenzke et al. (2016) E
MBO J.35:2519-2535）。このOtofI515T/I515Tマウスは、I波振幅の低下を伴うABRによっ
て評価したときに聴覚閾値の中程度の上昇を示したが、行動試験および単一の聴神経単位
の記録では正常な可聴閾値を示した。RRPのエキソサイトーシスはこの場合でもインタク
トだが、持続性エキソサイトーシスは、OtofPga/Pgaほど重篤ではないが、低下する。室
温での野生型マウスでは、持続刺激の間、各活性部位で1秒あたり750個の小胞が融合でき
るが、この比率は、OtofI515T/I515Tマウスでは350個の小胞/秒/活性部位に低下し、Otof
Pga/Pga IHCでは200個の小胞/秒/活性部位に低下する（Pangrsicet al. (2010) Nat. Ne
urosci. 13869-876; Strenzke et al. (2016) EMBO J. 35 2519-2535）。これはIHCの細
胞膜でのオトフェリンタンパク質レベルの低下と相関し、このことは、オトフェリンの量
がエキソサイトーシスおよび聴力に対応することを示す（Strenzke et al. (2016) EMBO
J. 35 2519-2535）。
はマウスにおいて正常なシナプス数を保持することが明らかになった。P6からP15の間に
、シナプスの約半分が失われる（Roux et al. (2006) Cell 127 277-289）。動物モデル
は、小胞融合後の細胞膜容量および聴神経における活性の変化を記録することによって、
シナプス伝達に対するオトフェリンの変異の作用を研究することを可能にした。オトフェ
リンノックアウト（Otof-/-）マウスでは、電位開口型Ca2+チャネルによる脱分極誘導性C
a2+流入により、IHCにおいてエキソサイトーシスはほとんど誘発されなかった（Rouxet
al. (2006) Cell127 277-289）。C2Fドメインにランダムな点変異を有する深刻な聴力障
害パチャンガ（pachanga）（OtofPga/Pga）マウスでは、IHCの短い（＜10ms）脱分極が
野生型マウスのものと同様の大きさの小胞融合を誘発したが、持続的な刺激は、即時放出
可能なプールへの小胞の補充における著しい欠乏を明らかにした（Pangrsic et al. (201
0) Nat.Neurosci. 13 869-876）。聴覚閾値の上昇は軽度だが音声理解の重篤な低下およ
び温度依存性難聴（temperature-dependentdeafening）を有するヒト患者においてp.Ile
515Thr変異が見出され（Vargaet al. (2006) J Med Genet 43 576-581）、これは、マウ
スモデルにおいて試験したときに中間表現型を明らかにした（Strenzke et al. (2016) E
MBO J.35:2519-2535）。このOtofI515T/I515Tマウスは、I波振幅の低下を伴うABRによっ
て評価したときに聴覚閾値の中程度の上昇を示したが、行動試験および単一の聴神経単位
の記録では正常な可聴閾値を示した。RRPのエキソサイトーシスはこの場合でもインタク
トだが、持続性エキソサイトーシスは、OtofPga/Pgaほど重篤ではないが、低下する。室
温での野生型マウスでは、持続刺激の間、各活性部位で1秒あたり750個の小胞が融合でき
るが、この比率は、OtofI515T/I515Tマウスでは350個の小胞/秒/活性部位に低下し、Otof
Pga/Pga IHCでは200個の小胞/秒/活性部位に低下する（Pangrsicet al. (2010) Nat. Ne
urosci. 13869-876; Strenzke et al. (2016) EMBO J. 35 2519-2535）。これはIHCの細
胞膜でのオトフェリンタンパク質レベルの低下と相関し、このことは、オトフェリンの量
がエキソサイトーシスおよび聴力に対応することを示す（Strenzke et al. (2016) EMBO
J. 35 2519-2535）。
【0152】
遺伝子における変異を検出する方法は当技術分野において周知である。そのような技術
の非限定的な例には、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）、PCR、シークエン
シング、サザンブロッティング、およびノーザンブロッティングが含まれる。
の非限定的な例には、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）、PCR、シークエン
シング、サザンブロッティング、およびノーザンブロッティングが含まれる。
【0153】
OTOF遺伝子は、蝸牛有毛細胞におけるシナプス小胞のエキソサイトーシスに関与するタ
ンパク質であるオトフェリンをコードする（例えば、Johnson and Chapman (2010) J. Ce
ll Biol.191(1):187-198;およびHeidrych et al. (2008) Hum. Mol. Genet. 17:3814-38
21を参照されたい）。
ンパク質であるオトフェリンをコードする（例えば、Johnson and Chapman (2010) J. Ce
ll Biol.191(1):187-198;およびHeidrych et al. (2008) Hum. Mol. Genet. 17:3814-38
21を参照されたい）。
【0154】
ヒトOTOF遺伝子は、染色体染色体2p23.3上に位置する。それは、約132キロベース（kb
）を包含する48個のエクソンを含む（NCBIアクセッション番号NG009937.1）。脳において
発現するオトフェリンの長鎖型（long-form）をコードするmRNAは48個のエクソンを含む
（Yasunagaet al., Am. J. Hum. Genet. 67:591-600, 2000）。OTOF遺伝子における48個
のエクソンのそれぞれを増幅するために用いることができるフォワードプライマーおよび
リバースプライマーは、Yasunaga et al., Am. J. Hum. Genet. 67:591-600, 2000の表2
に記載されている。いくつかの例では、全長OTOFタンパク質は全長野生型OTOFタンパク質
である。ヒトOTOF遺伝子から発現する全長野生型OTOFタンパク質の長さは、1997残基であ
る。
）を包含する48個のエクソンを含む（NCBIアクセッション番号NG009937.1）。脳において
発現するオトフェリンの長鎖型（long-form）をコードするmRNAは48個のエクソンを含む
（Yasunagaet al., Am. J. Hum. Genet. 67:591-600, 2000）。OTOF遺伝子における48個
のエクソンのそれぞれを増幅するために用いることができるフォワードプライマーおよび
リバースプライマーは、Yasunaga et al., Am. J. Hum. Genet. 67:591-600, 2000の表2
に記載されている。いくつかの例では、全長OTOFタンパク質は全長野生型OTOFタンパク質
である。ヒトOTOF遺伝子から発現する全長野生型OTOFタンパク質の長さは、1997残基であ
る。
【0155】
例示的なヒト野生型オトフェリンタンパク質は、SEQ ID NO：1～5のうちのいずれか1つ
の配列であるか、または該配列を含む。ヒトオトフェリンタンパク質のアイソフォームe
（SEQ IDNO：5）は、オトフェリン遺伝子のエクソン48を含むがエクソン47を含まないmR
NAによってコードされる（Yasunagaet al., Am. J. Hum. Genet. 67:591-600, 2000）。
いくつかの態様において、活性オトフェリンタンパク質は、SEQ ID NO：5の配列を有する
が、Strenzkeet al., EMBO J. 35(23):2499-2615, 2016において特定されたRXRモチーフ
を含む20アミノ酸を欠損している。野生型オトフェリンタンパク質をコードする核酸の非
限定的な例は、SEQID NO：7～11のいずれか1つであるか、またはSEQ ID NO：7～11のい
ずれか1つを含む。当技術分野において理解されるように、SEQID NO：7～11におけるコ
ドンの少なくとも一部または全ては、非ヒト哺乳動物またはヒトにおける最適な発現を可
能にするためにコドン最適化できる。ヒトオトフェリンタンパク質のオルソログは当技術
分野において公知である。
の配列であるか、または該配列を含む。ヒトオトフェリンタンパク質のアイソフォームe
（SEQ IDNO：5）は、オトフェリン遺伝子のエクソン48を含むがエクソン47を含まないmR
NAによってコードされる（Yasunagaet al., Am. J. Hum. Genet. 67:591-600, 2000）。
いくつかの態様において、活性オトフェリンタンパク質は、SEQ ID NO：5の配列を有する
が、Strenzkeet al., EMBO J. 35(23):2499-2615, 2016において特定されたRXRモチーフ
を含む20アミノ酸を欠損している。野生型オトフェリンタンパク質をコードする核酸の非
限定的な例は、SEQID NO：7～11のいずれか1つであるか、またはSEQ ID NO：7～11のい
ずれか1つを含む。当技術分野において理解されるように、SEQID NO：7～11におけるコ
ドンの少なくとも一部または全ては、非ヒト哺乳動物またはヒトにおける最適な発現を可
能にするためにコドン最適化できる。ヒトオトフェリンタンパク質のオルソログは当技術
分野において公知である。
【0156】
ヒトオトフェリンタンパク質 cDNA配列：
ヒト標準的（canonical）（長鎖型）アイソフォーム配列（オトフェリンタンパク質）（S
EQ ID NO：1）（オトフェリンアイソフォームaとも呼ばれる）（NCBIアクセッション番号
AAD26117.1）
ヒトアイソフォーム2（短鎖型1）（オトフェリンタンパク質）（SEQID NO：2）（オトフ
ェリンアイソフォームdとも呼ばれる）（NCBIアクセッション番号NP_919304.1）
ヒトアイソフォーム3（短鎖型2）（オトフェリンタンパク質）（SEQID NO：3）（オトフ
ェリンアイソフォームcとも呼ばれる）（NCBIアクセッション番号NP_919303.1）
ヒトアイソフォーム4（短鎖型3）（オトフェリンタンパク質）（SEQID NO：4）（オトフ
ェリンアイソフォームbとも呼ばれる）（NCBIアクセッション番号NP_004793.2）
ヒトアイソフォーム5（短鎖型4）（オトフェリンタンパク質）（SEQID NO：5）（オトフ
ェリンアイソフォームeとも呼ばれる）（NCBIアクセッション番号NP_001274418.1）
完全cds（オトフェリンcDNA）（www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF107403.1）（SEQID N
O：6）（SEQ ID NO：1のタンパク質をコードする）
ヒトオトフェリン転写産物バリアント1
(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_194248.2）（SEQID NO：7）（SEQ ID NO：1のタン
パク質をコードする）
ヒトオトフェリン転写産物バリアント2
(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_004802.3）（SEQID NO：8）（SEQ ID NO：4のタン
パク質をコードする）
ヒトオトフェリン転写産物バリアント3
(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_194322.2）（SEQID NO：9）（SEQ ID NO：3のタン
パク質をコードする）
ヒトオトフェリン転写産物バリアント4
(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_194323.2）（SEQID NO：10）（SEQ ID NO：2のタン
パク質をコードする）
ヒトオトフェリン転写産物バリアント5
(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001287489.1）（SEQID NO：11）（SEQ ID NO：5の
タンパク質をコードする）
ヒト標準的（canonical）（長鎖型）アイソフォーム配列（オトフェリンタンパク質）（S
EQ ID NO：1）（オトフェリンアイソフォームaとも呼ばれる）（NCBIアクセッション番号
AAD26117.1）
ヒトアイソフォーム2（短鎖型1）（オトフェリンタンパク質）（SEQID NO：2）（オトフ
ェリンアイソフォームdとも呼ばれる）（NCBIアクセッション番号NP_919304.1）
ヒトアイソフォーム3（短鎖型2）（オトフェリンタンパク質）（SEQID NO：3）（オトフ
ェリンアイソフォームcとも呼ばれる）（NCBIアクセッション番号NP_919303.1）
ヒトアイソフォーム4（短鎖型3）（オトフェリンタンパク質）（SEQID NO：4）（オトフ
ェリンアイソフォームbとも呼ばれる）（NCBIアクセッション番号NP_004793.2）
ヒトアイソフォーム5（短鎖型4）（オトフェリンタンパク質）（SEQID NO：5）（オトフ
ェリンアイソフォームeとも呼ばれる）（NCBIアクセッション番号NP_001274418.1）
完全cds（オトフェリンcDNA）（www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF107403.1）（SEQID N
O：6）（SEQ ID NO：1のタンパク質をコードする）
ヒトオトフェリン転写産物バリアント1
(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_194248.2）（SEQID NO：7）（SEQ ID NO：1のタン
パク質をコードする）
ヒトオトフェリン転写産物バリアント2
(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_004802.3）（SEQID NO：8）（SEQ ID NO：4のタン
パク質をコードする）
ヒトオトフェリン転写産物バリアント3
(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_194322.2）（SEQID NO：9）（SEQ ID NO：3のタン
パク質をコードする）
ヒトオトフェリン転写産物バリアント4
(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_194323.2）（SEQID NO：10）（SEQ ID NO：2のタン
パク質をコードする）
ヒトオトフェリン転写産物バリアント5
(www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001287489.1）（SEQID NO：11）（SEQ ID NO：5の
タンパク質をコードする）
【0157】
ヒト野生型オトフェリンゲノムDNA配列の非限定的な例はSEQ ID NO：12である。SEQ ID
NO：12におけるエクソンは以下である：ヌクレオチド位置5001～5206（エクソン1）、ヌ
クレオチド位置25925～25983（エクソン2）、ヌクレオチド位置35779～35867（エクソン3
）、ヌクレオチド位置44590～44689（エクソン4）、ヌクレオチド位置47100～47281（エ
クソン5）、ヌクレオチド位置59854～59927（エクソン6）、ヌクレオチド位置61273～613
99（エクソン7）、ヌクレオチド位置61891～61945（エクソン8）、ヌクレオチド位置6862
6～68757(エクソン9）、ヌクレオチド位置73959～74021（エクソン10）、ヌクレオチド位
置74404～74488（エクソン11）、ヌクレオチド位置79066～79225（エクソン12）、ヌクレ
オチド位置80051～80237（エクソン13）、ヌクレオチド位置81107～81293（エクソン14）
、ヌクレオチド位置82690～82913（エクソン15）、ヌクレオチド位置83388～83496（エク
ソン16）、ヌクレオチド位置84046～84226（エクソン17）、ヌクレオチド位置84315～844
35（エクソン18）、ヌクレオチド位置85950～86050（エクソン19）、ヌクレオチド位置86
193～86283（エクソン20）、ヌクレオチド位置86411～86527（エクソン21）、ヌクレオチ
ド位置86656～86808（エクソン22）、ヌクレオチド位置87382～87571（エクソン23）、ヌ
クレオチド位置87661～87785（エクソン24）、ヌクレオチド位置88206～88340（エクソン
25）、ヌクレオチド位置89025～89186（エクソン26）、ヌクレオチド位置89589～89708（
エクソン27）、ヌクレオチド位置90132～90293（エクソン28）、ヌクレオチド位置90405
～90567（エクソン29）、ヌクレオチド位置91050～91180（エクソン30）、ヌクレオチド
位置92549～92578（エクソン31）、ヌクレオチド位置92978～93106（エクソン32）、ヌク
レオチド位置95225～95291（エクソン33）、ヌクレオチド位置96198～96334（エクソン34
）、ヌクレオチド位置96466～96600（エクソン35）、ヌクレオチド位置96848～96985（エ
クソン36）、ヌクレオチド位置97623～97750（エクソン37）、ヌクレオチド位置97857～9
8027（エクソン38）、ヌクレオチド位置98670～98830（エクソン39）、ヌクレオチド位置
99593～99735 (エクソン40）、ヌクレオチド位置100128～100216（エクソン41）、ヌクレ
オチド位置101518～101616（エクソン42）、ヌクレオチド位置101762～102003（エクソン
43）、ヌクレオチド位置102669～102847（エクソン44）、ヌクレオチド位置102952～1030
52（エクソン45）、ヌクレオチド位置103494～103691（エクソン46）、ヌクレオチド位置
105479～106496（エクソン47）、およびエクソン48（
で始まる配列；Yasunagaet al., Am. J. Hum. Genet. 67:591-600, 2000におけるこのエ
クソンの記載も参照されたい）。
NO：12におけるエクソンは以下である：ヌクレオチド位置5001～5206（エクソン1）、ヌ
クレオチド位置25925～25983（エクソン2）、ヌクレオチド位置35779～35867（エクソン3
）、ヌクレオチド位置44590～44689（エクソン4）、ヌクレオチド位置47100～47281（エ
クソン5）、ヌクレオチド位置59854～59927（エクソン6）、ヌクレオチド位置61273～613
99（エクソン7）、ヌクレオチド位置61891～61945（エクソン8）、ヌクレオチド位置6862
6～68757(エクソン9）、ヌクレオチド位置73959～74021（エクソン10）、ヌクレオチド位
置74404～74488（エクソン11）、ヌクレオチド位置79066～79225（エクソン12）、ヌクレ
オチド位置80051～80237（エクソン13）、ヌクレオチド位置81107～81293（エクソン14）
、ヌクレオチド位置82690～82913（エクソン15）、ヌクレオチド位置83388～83496（エク
ソン16）、ヌクレオチド位置84046～84226（エクソン17）、ヌクレオチド位置84315～844
35（エクソン18）、ヌクレオチド位置85950～86050（エクソン19）、ヌクレオチド位置86
193～86283（エクソン20）、ヌクレオチド位置86411～86527（エクソン21）、ヌクレオチ
ド位置86656～86808（エクソン22）、ヌクレオチド位置87382～87571（エクソン23）、ヌ
クレオチド位置87661～87785（エクソン24）、ヌクレオチド位置88206～88340（エクソン
25）、ヌクレオチド位置89025～89186（エクソン26）、ヌクレオチド位置89589～89708（
エクソン27）、ヌクレオチド位置90132～90293（エクソン28）、ヌクレオチド位置90405
～90567（エクソン29）、ヌクレオチド位置91050～91180（エクソン30）、ヌクレオチド
位置92549～92578（エクソン31）、ヌクレオチド位置92978～93106（エクソン32）、ヌク
レオチド位置95225～95291（エクソン33）、ヌクレオチド位置96198～96334（エクソン34
）、ヌクレオチド位置96466～96600（エクソン35）、ヌクレオチド位置96848～96985（エ
クソン36）、ヌクレオチド位置97623～97750（エクソン37）、ヌクレオチド位置97857～9
8027（エクソン38）、ヌクレオチド位置98670～98830（エクソン39）、ヌクレオチド位置
99593～99735 (エクソン40）、ヌクレオチド位置100128～100216（エクソン41）、ヌクレ
オチド位置101518～101616（エクソン42）、ヌクレオチド位置101762～102003（エクソン
43）、ヌクレオチド位置102669～102847（エクソン44）、ヌクレオチド位置102952～1030
52（エクソン45）、ヌクレオチド位置103494～103691（エクソン46）、ヌクレオチド位置
105479～106496（エクソン47）、およびエクソン48（
で始まる配列；Yasunagaet al., Am. J. Hum. Genet. 67:591-600, 2000におけるこのエ
クソンの記載も参照されたい）。
【0158】
イントロンは、SEQID NO：12における連続する各エクソンの対の間、すなわち、ヌク
レオチド位置100～5001（イントロン1）、ヌクレオチド5207～25924（イントロン2）、ヌ
クレオチド位置25984～35778（イントロン3）、ヌクレオチド位置35868～44589（イント
ロン4）、ヌクレオチド位置44690～47099（イントロン5）、ヌクレオチド位置47282～598
53(イントロン6）、ヌクレオチド位置59928～61272（イントロン7）、ヌクレオチド位置6
1400～61890（イントロン8）、ヌクレオチド位置61946～68625（イントロン9）、ヌクレ
オチド位置68758～73958（イントロン10）、ヌクレオチド位置74022～74403（イントロン
11）、ヌクレオチド位置74489～79065（イントロン12）、ヌクレオチド位置79226～80050
（イントロン13）、ヌクレオチド位置80238～81106（イントロン14）、ヌクレオチド位置
81294～82689（イントロン15）、ヌクレオチド位置82914～83387（イントロン16）、ヌク
レオチド位置83497～84045（イントロン17）、ヌクレオチド位置84227～84314（イントロ
ン18）、ヌクレオチド位置84436～85949（イントロン19）、ヌクレオチド位置86051～861
92（イントロン20）、ヌクレオチド位置86284～86410（イントロン21）、ヌクレオチド位
置86528～86655（イントロン22）、ヌクレオチド位置86809～87381（イントロン23）、ヌ
クレオチド位置87572～87660（イントロン24）、ヌクレオチド位置87786～88205（イント
ロン25）、ヌクレオチド位置88341～89024（イントロン26）、ヌクレオチド位置89187～8
9588（イントロン27）、ヌクレオチド位置89709～90131（イントロン28）、ヌクレオチド
位置90294～90404（イントロン29）、ヌクレオチド位置90568～91049（イントロン30）、
ヌクレオチド位置91181～92548（イントロン31）、ヌクレオチド位置92579～92977（イン
トロン32）、ヌクレオチド位置93107～95224（イントロン33）、ヌクレオチド位置95292
～96197（イントロン34）、ヌクレオチド位置96335～96465（イントロン35）、ヌクレオ
チド位置96601～96847（イントロン36）、ヌクレオチド位置96986～97622（イントロン37
）、ヌクレオチド位置97751～97856（イントロン38）、ヌクレオチド位置98028～98669（
イントロン39）、ヌクレオチド位置98831～99592（イントロン40）、ヌクレオチド位置99
736～100127（イントロン41）、ヌクレオチド位置100217～101517（イントロン42）、ヌ
クレオチド位置101617～101761（イントロン43）、ヌクレオチド位置102004～102668（イ
ントロン44）、ヌクレオチド位置102848～102951（イントロン45）、ヌクレオチド位置10
3053～103494（イントロン46）、ヌクレオチド位置103692～105478（イントロン47）、お
よびヌクレオチド位置106497～108496（イントロン48）に位置する。
レオチド位置100～5001（イントロン1）、ヌクレオチド5207～25924（イントロン2）、ヌ
クレオチド位置25984～35778（イントロン3）、ヌクレオチド位置35868～44589（イント
ロン4）、ヌクレオチド位置44690～47099（イントロン5）、ヌクレオチド位置47282～598
53(イントロン6）、ヌクレオチド位置59928～61272（イントロン7）、ヌクレオチド位置6
1400～61890（イントロン8）、ヌクレオチド位置61946～68625（イントロン9）、ヌクレ
オチド位置68758～73958（イントロン10）、ヌクレオチド位置74022～74403（イントロン
11）、ヌクレオチド位置74489～79065（イントロン12）、ヌクレオチド位置79226～80050
（イントロン13）、ヌクレオチド位置80238～81106（イントロン14）、ヌクレオチド位置
81294～82689（イントロン15）、ヌクレオチド位置82914～83387（イントロン16）、ヌク
レオチド位置83497～84045（イントロン17）、ヌクレオチド位置84227～84314（イントロ
ン18）、ヌクレオチド位置84436～85949（イントロン19）、ヌクレオチド位置86051～861
92（イントロン20）、ヌクレオチド位置86284～86410（イントロン21）、ヌクレオチド位
置86528～86655（イントロン22）、ヌクレオチド位置86809～87381（イントロン23）、ヌ
クレオチド位置87572～87660（イントロン24）、ヌクレオチド位置87786～88205（イント
ロン25）、ヌクレオチド位置88341～89024（イントロン26）、ヌクレオチド位置89187～8
9588（イントロン27）、ヌクレオチド位置89709～90131（イントロン28）、ヌクレオチド
位置90294～90404（イントロン29）、ヌクレオチド位置90568～91049（イントロン30）、
ヌクレオチド位置91181～92548（イントロン31）、ヌクレオチド位置92579～92977（イン
トロン32）、ヌクレオチド位置93107～95224（イントロン33）、ヌクレオチド位置95292
～96197（イントロン34）、ヌクレオチド位置96335～96465（イントロン35）、ヌクレオ
チド位置96601～96847（イントロン36）、ヌクレオチド位置96986～97622（イントロン37
）、ヌクレオチド位置97751～97856（イントロン38）、ヌクレオチド位置98028～98669（
イントロン39）、ヌクレオチド位置98831～99592（イントロン40）、ヌクレオチド位置99
736～100127（イントロン41）、ヌクレオチド位置100217～101517（イントロン42）、ヌ
クレオチド位置101617～101761（イントロン43）、ヌクレオチド位置102004～102668（イ
ントロン44）、ヌクレオチド位置102848～102951（イントロン45）、ヌクレオチド位置10
3053～103494（イントロン46）、ヌクレオチド位置103692～105478（イントロン47）、お
よびヌクレオチド位置106497～108496（イントロン48）に位置する。
【0159】
ヒトオトフェリン遺伝子配列（ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/224465243）（SEQ ID NO：12
）
マウスオトフェリンタンパク質（SEQ ID NO：13）（NCBIアクセッション番号NP_00130069
6.1）
マウスオトフェリンcDNA（SEQID NO：14）（NCBIアクセッション番号NM_001313767.1）
マウスオトフェリン遺伝子配列（www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/83762）（SEQ ID NO：15）
アクセッション:NC_000071; 領域：相補配列(30367066..30462730）GPC_000000778; NCB
I参照配列:NC_000071.6
ゼブラフィッシュオトフェリンA遺伝子配列（www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/557476）（SEQ
ID NO：16）アクセッションNC_007131;領域： 31173357..31310109 GPC_000001574; NC
BI参照配列:NC_007131.7
アカゲザルオトフェリン遺伝子配列（www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/696717）（SEQ ID NO
：17）アクセッション：NC_027905; 領域：相補配列(26723411..26826586） GPC_000002
105; NCBI参照配列:NC_027905.1
イヌオトフェリン遺伝子配列（www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/607961）（SEQ ID NO：18）
アクセッション：NC 006599; 領域：相補配列(20518502..20619461） GPC_000000676; N
CBI参照配列:NC_006599.3
チンパンジーオトフェリン遺伝子配列（www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/459083）（SEQ ID N
O：19）アクセッション：NC 006469; 領域：相補配列(27006052..27107747） GPC_00000
2338; NCBI参照配列:NC_006469.4
ラットオトフェリンタンパク質（SEQ ID NO：20）
ゼブラフィッシュオトフェリンタンパク質（SEQ ID NO：21）
ウシオトフェリンタンパク質（SEQ ID NO：22）
ヒヒオトフェリンタンパク質（SEQ ID NO：23）
）
マウスオトフェリンタンパク質（SEQ ID NO：13）（NCBIアクセッション番号NP_00130069
6.1）
マウスオトフェリンcDNA（SEQID NO：14）（NCBIアクセッション番号NM_001313767.1）
マウスオトフェリン遺伝子配列（www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/83762）（SEQ ID NO：15）
アクセッション:NC_000071; 領域：相補配列(30367066..30462730）GPC_000000778; NCB
I参照配列:NC_000071.6
ゼブラフィッシュオトフェリンA遺伝子配列（www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/557476）（SEQ
ID NO：16）アクセッションNC_007131;領域： 31173357..31310109 GPC_000001574; NC
BI参照配列:NC_007131.7
アカゲザルオトフェリン遺伝子配列（www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/696717）（SEQ ID NO
：17）アクセッション：NC_027905; 領域：相補配列(26723411..26826586） GPC_000002
105; NCBI参照配列:NC_027905.1
イヌオトフェリン遺伝子配列（www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/607961）（SEQ ID NO：18）
アクセッション：NC 006599; 領域：相補配列(20518502..20619461） GPC_000000676; N
CBI参照配列:NC_006599.3
チンパンジーオトフェリン遺伝子配列（www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/459083）（SEQ ID N
O：19）アクセッション：NC 006469; 領域：相補配列(27006052..27107747） GPC_00000
2338; NCBI参照配列:NC_006469.4
ラットオトフェリンタンパク質（SEQ ID NO：20）
ゼブラフィッシュオトフェリンタンパク質（SEQ ID NO：21）
ウシオトフェリンタンパク質（SEQ ID NO：22）
ヒヒオトフェリンタンパク質（SEQ ID NO：23）
【0160】
ベクター
本明細書において、聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAなどの核酸療法を用いる
、非症候性難聴などの疾患の治療のための組成物およびそのための使用の方法が提供され
る。好ましくは、聴覚系ポリペプチドの核酸は、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウ
イルスベクター、レンチウイルスベクター、 およびレトロウイルスベクターなどのウイ
ルスベクター中に存在する。
本明細書において、聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAなどの核酸療法を用いる
、非症候性難聴などの疾患の治療のための組成物およびそのための使用の方法が提供され
る。好ましくは、聴覚系ポリペプチドの核酸は、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウ
イルスベクター、レンチウイルスベクター、 およびレトロウイルスベクターなどのウイ
ルスベクター中に存在する。
【0161】
所望のAAVカプシド中に組換えベクターをパッケージングして本発明のrAAVを生成する
ための前述の方法は、限定することを意味するものではなく、他の適した方法が当業者に
明らかであろう。
ための前述の方法は、限定することを意味するものではなく、他の適した方法が当業者に
明らかであろう。
【0162】
発現制御配列には、適切な転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列およびエン
ハンサー配列；スプライシングシグナルおよびポリアデニル化（poly A）シグナルなどの
効率的なRNAプロセシングシグナル；細胞質mRNAを安定化する配列、翻訳効率を増強する
配列（すなわち、Kozakコンセンサス配列）、タンパク質安定性を増強する配列；ならび
に、所望の場合、コードされた産物の分泌を増強する配列が含まれる。ネイティブな、構
成的な、誘導性のおよび/または組織特異的なプロモーターを含む、多数の発現制御配列
が当技術分野において公知であり、利用されてもよい。
ハンサー配列；スプライシングシグナルおよびポリアデニル化（poly A）シグナルなどの
効率的なRNAプロセシングシグナル；細胞質mRNAを安定化する配列、翻訳効率を増強する
配列（すなわち、Kozakコンセンサス配列）、タンパク質安定性を増強する配列；ならび
に、所望の場合、コードされた産物の分泌を増強する配列が含まれる。ネイティブな、構
成的な、誘導性のおよび/または組織特異的なプロモーターを含む、多数の発現制御配列
が当技術分野において公知であり、利用されてもよい。
【0163】
本明細書において用いられる核酸配列（例えば、コード配列）および調節配列は、核酸
配列の発現または転写が調節配列の影響下または制御下に置かれるように、それらが機能
的に連結されている場合、「機能的に」連結されていると言われる。核酸配列が機能タン
パク質に翻訳されることが望まれる場合、2つのDNA配列は、5'調節配列におけるプロモー
ターの誘導がコード配列の転写をもたらす場合、および2つのDNA配列間の連結の性質が、
（1）フレームシフト変異の導入をもたらさない、（2）コード配列の転写を指示するプロ
モーター領域の能力を妨げない、または（3）タンパク質に翻訳される対応するRNA転写産
物の能力を妨げない場合に、機能的に連結されていると言われる。よって、プロモーター
領域が、結果として生じる転写産物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳される
ように、そのDNA配列の転写をもたらす能力を有する場合に、プロモーター領域は核酸配
列に機能的に連結されていることになる。同様に、2つ以上のコード領域は、共通プロモ
ーターからのそれらの転写が、インフレームで翻訳された2つ以上のタンパク質の発現を
もたらすように連結されているときに、機能的に連結されている。いくつかの態様におい
て、機能的に連結されたコード配列は融合タンパク質をもたらす。いくつかの態様におい
て、機能的に連結されたコード配列は機能性RNA（たとえば、shRNA、miRNA、miRNAインヒ
ビター）をもたらす。
配列の発現または転写が調節配列の影響下または制御下に置かれるように、それらが機能
的に連結されている場合、「機能的に」連結されていると言われる。核酸配列が機能タン
パク質に翻訳されることが望まれる場合、2つのDNA配列は、5'調節配列におけるプロモー
ターの誘導がコード配列の転写をもたらす場合、および2つのDNA配列間の連結の性質が、
（1）フレームシフト変異の導入をもたらさない、（2）コード配列の転写を指示するプロ
モーター領域の能力を妨げない、または（3）タンパク質に翻訳される対応するRNA転写産
物の能力を妨げない場合に、機能的に連結されていると言われる。よって、プロモーター
領域が、結果として生じる転写産物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳される
ように、そのDNA配列の転写をもたらす能力を有する場合に、プロモーター領域は核酸配
列に機能的に連結されていることになる。同様に、2つ以上のコード領域は、共通プロモ
ーターからのそれらの転写が、インフレームで翻訳された2つ以上のタンパク質の発現を
もたらすように連結されているときに、機能的に連結されている。いくつかの態様におい
て、機能的に連結されたコード配列は融合タンパク質をもたらす。いくつかの態様におい
て、機能的に連結されたコード配列は機能性RNA（たとえば、shRNA、miRNA、miRNAインヒ
ビター）をもたらす。
【0164】
タンパク質をコードする核酸の場合、ポリアデニル化配列は概して、導入遺伝子配列の
後かつ3' AAVITR配列の前に挿入される。本発明で有用なrAAV構築物はまた、望ましくは
プロモーター/エンハンサー配列と導入遺伝子との間に位置する、イントロンを含んでも
よい。想定される1つのイントロン配列はSV40に由来し、SV40Tイントロン配列という。
用いられる可能性がある別のベクター要素は、配列内リボソーム進入部位（IRES）である
。IRES配列は、単一の遺伝子転写産物から2つ以上のポリペプチドを生成させるために用
いられる。IRES配列は、2つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質を生成するために使
用される。これらのおよび他の共通ベクター要素の選択は従来行われており、多くのその
ような配列が利用可能である［例えば、Sambrook et al. "Molecular Cloning. A Labora
toryManual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)、およびその
中で引用されている参考文献、例えば、第3.18 3.26および16.17 16.27頁ならびにAusube
l et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1
989を参照されたい］。いくつかの態様において、口蹄疫ウイルス2A配列がポリタンパク
質に含まれ；これは、ポリタンパク質の切断を媒介することが示されている小さなペプチ
ド（およそ18アミノ酸長）である（Ryan,M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattio
n, N M et al.,J Virology, November 1996; p. 8124-8127; Furler, S et al., Gene T
herapy, 2001; 8:864-873; およびHalpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 45
3-459）。2A配列の切断活性は、プラスミドおよび遺伝子療法ベクター（AAVおよびレトロ
ウイルス）を含む人工的な系において以前に実証されている（Ryan, M D et al., EMBO,
1994; 4:928-933; Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127;
Furler, S etal., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873;およびHalpin, C et al., The Pla
nt Journal,1999; 4: 453-459; de Felipe, P et al., Gene Therapy, 1999; 6: 198-20
8; de Felipe, Pet al., Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931; およびKlump, H
et al., GeneTherapy, 2001; 8: 811-817）。
後かつ3' AAVITR配列の前に挿入される。本発明で有用なrAAV構築物はまた、望ましくは
プロモーター/エンハンサー配列と導入遺伝子との間に位置する、イントロンを含んでも
よい。想定される1つのイントロン配列はSV40に由来し、SV40Tイントロン配列という。
用いられる可能性がある別のベクター要素は、配列内リボソーム進入部位（IRES）である
。IRES配列は、単一の遺伝子転写産物から2つ以上のポリペプチドを生成させるために用
いられる。IRES配列は、2つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質を生成するために使
用される。これらのおよび他の共通ベクター要素の選択は従来行われており、多くのその
ような配列が利用可能である［例えば、Sambrook et al. "Molecular Cloning. A Labora
toryManual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)、およびその
中で引用されている参考文献、例えば、第3.18 3.26および16.17 16.27頁ならびにAusube
l et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1
989を参照されたい］。いくつかの態様において、口蹄疫ウイルス2A配列がポリタンパク
質に含まれ；これは、ポリタンパク質の切断を媒介することが示されている小さなペプチ
ド（およそ18アミノ酸長）である（Ryan,M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattio
n, N M et al.,J Virology, November 1996; p. 8124-8127; Furler, S et al., Gene T
herapy, 2001; 8:864-873; およびHalpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 45
3-459）。2A配列の切断活性は、プラスミドおよび遺伝子療法ベクター（AAVおよびレトロ
ウイルス）を含む人工的な系において以前に実証されている（Ryan, M D et al., EMBO,
1994; 4:928-933; Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127;
Furler, S etal., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873;およびHalpin, C et al., The Pla
nt Journal,1999; 4: 453-459; de Felipe, P et al., Gene Therapy, 1999; 6: 198-20
8; de Felipe, Pet al., Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931; およびKlump, H
et al., GeneTherapy, 2001; 8: 811-817）。
【0165】
宿主細胞における遺伝子発現に必要とされる調節配列の厳密な性質は、種、組織、また
は細胞型間で異なっている可能性があるが、一般に、必要に応じて、TATAボックス、キャ
ッピング配列、CAAT配列、およびエンハンサー要素など、それぞれ転写および翻訳の開始
に関与する5'非転写配列および5'非翻訳配列が含まれるものとする。特に、そのような5'
非転写調節配列は、機能的に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含
むプロモーター領域を含む。調節配列はまた、所望により、エンハンサー配列または上流
活性化配列を含んでもよい。本発明のベクターは任意で、5'リーダー配列またはシグナル
配列を含んでもよい。適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および裁量の範
囲内である。
は細胞型間で異なっている可能性があるが、一般に、必要に応じて、TATAボックス、キャ
ッピング配列、CAAT配列、およびエンハンサー要素など、それぞれ転写および翻訳の開始
に関与する5'非転写配列および5'非翻訳配列が含まれるものとする。特に、そのような5'
非転写調節配列は、機能的に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含
むプロモーター領域を含む。調節配列はまた、所望により、エンハンサー配列または上流
活性化配列を含んでもよい。本発明のベクターは任意で、5'リーダー配列またはシグナル
配列を含んでもよい。適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および裁量の範
囲内である。
【0166】
構成的プロモーターの例には、これらに限定されないが、レトロウイルスRous肉腫ウイ
ルス（RSV）LTRプロモーター（任意でRSVエンハンサーを有する）、サイトメガロウイル
ス（CMV）プロモーター（任意でCMVエンハンサーを有する）［例えば、Boshartet al. (
1985) Cell,41:521-530を参照されたい］、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プ
ロモーター、βアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（PGK）プロモータ
ー、およびEF1αプロモーター［Invitrogen］が含まれる。
ルス（RSV）LTRプロモーター（任意でRSVエンハンサーを有する）、サイトメガロウイル
ス（CMV）プロモーター（任意でCMVエンハンサーを有する）［例えば、Boshartet al. (
1985) Cell,41:521-530を参照されたい］、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プ
ロモーター、βアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（PGK）プロモータ
ー、およびEF1αプロモーター［Invitrogen］が含まれる。
【0167】
誘導性プロモーターは遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給される化合物、温度
などの環境因子、もしくは特定の生理的状態の存在、例えば、急性期、細胞の特定の分化
状態の存在により、または細胞複製時にのみ調節することができる。誘導性プロモーター
および誘導可能な系は、これらに限定されないが、Invitrogen、ClontechおよびAriadを
含む、種々の商業的供給元から入手可能である。多くの他の系が記載されており、当業者
によって容易に選択され得る。外因的に供給されるプロモーターによって調節される誘導
性プロモーターの例には、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（MT）プロモーター、デキサ
メタゾン（Dex）誘導性マウス乳癌ウイルス（MMTV）プロモーター、T7ポリメラーゼプロ
モーター系（WO98/10088）；エクジソン昆虫プロモーター（No et al. (1996) Proc. Na
tl. Acad. Sci.USA, 93:3346-3351）、テトラサイクリン抑制性の系（Gossen et al. Pr
oc. Natl. Acad.Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)）、テトラサイクリン誘導性の系（Gos
sen et al.Science, 268:1766-1769 (1995)、Harvey et al. Curr. Opin. Chem. Biol.,
2:512-518(1998)も参照されたい）、RU486誘導性の系（Wang et al. Nat. Biotech., 1
5:239-243(1997)およびWang et al. Gene Ther., 4:432-441 (1997)）、およびラパマイ
シン誘導性の系（Magariet al. J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)）が含まれる
。この文脈において有用である可能性があるさらに他の型の誘導性プロモーターは、特定
の生理的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態により、または細胞複製時に
のみ調節されるものである。
などの環境因子、もしくは特定の生理的状態の存在、例えば、急性期、細胞の特定の分化
状態の存在により、または細胞複製時にのみ調節することができる。誘導性プロモーター
および誘導可能な系は、これらに限定されないが、Invitrogen、ClontechおよびAriadを
含む、種々の商業的供給元から入手可能である。多くの他の系が記載されており、当業者
によって容易に選択され得る。外因的に供給されるプロモーターによって調節される誘導
性プロモーターの例には、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（MT）プロモーター、デキサ
メタゾン（Dex）誘導性マウス乳癌ウイルス（MMTV）プロモーター、T7ポリメラーゼプロ
モーター系（WO98/10088）；エクジソン昆虫プロモーター（No et al. (1996) Proc. Na
tl. Acad. Sci.USA, 93:3346-3351）、テトラサイクリン抑制性の系（Gossen et al. Pr
oc. Natl. Acad.Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)）、テトラサイクリン誘導性の系（Gos
sen et al.Science, 268:1766-1769 (1995)、Harvey et al. Curr. Opin. Chem. Biol.,
2:512-518(1998)も参照されたい）、RU486誘導性の系（Wang et al. Nat. Biotech., 1
5:239-243(1997)およびWang et al. Gene Ther., 4:432-441 (1997)）、およびラパマイ
シン誘導性の系（Magariet al. J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)）が含まれる
。この文脈において有用である可能性があるさらに他の型の誘導性プロモーターは、特定
の生理的状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態により、または細胞複製時に
のみ調節されるものである。
【0168】
別の態様において、導入遺伝子のネイティブなプロモーターが用いられる。ネイティブ
なプロモーターは、導入遺伝子の発現がネイティブな発現を模倣すべきであることが望ま
しい場合に好ましい可能性がある。ネイティブなプロモーターは、導入遺伝子の発現が時
間的にもしくは発達的に、または組織特異的な形で、または特定の転写刺激に応答して調
節されなければならない場合に用いてもよい。さらなる態様において、エンハンサー要素
、ポリアデニル化部位またはKozakコンセンサス配列など、他のネイティブな発現制御要
素が、ネイティブな発現を模倣するために用いられてもよい。
なプロモーターは、導入遺伝子の発現がネイティブな発現を模倣すべきであることが望ま
しい場合に好ましい可能性がある。ネイティブなプロモーターは、導入遺伝子の発現が時
間的にもしくは発達的に、または組織特異的な形で、または特定の転写刺激に応答して調
節されなければならない場合に用いてもよい。さらなる態様において、エンハンサー要素
、ポリアデニル化部位またはKozakコンセンサス配列など、他のネイティブな発現制御要
素が、ネイティブな発現を模倣するために用いられてもよい。
【0169】
いくつかの態様において、調節配列は、組織特異的遺伝子発現能力を与える。いくつか
の場合では、組織特異的調節配列は、組織特異的な形で転写を誘導する組織特異的転写因
子に結合する。そのような組織特異的調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー等
）は当技術分野において周知である。例示的な組織特異的調節配列には、これらに限定さ
れないが以下の組織特異的プロモーターが含まれる：肝臓特異的チロキシン結合グロブリ
ン（TBG）プロモーター、インスリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、ソマトス
タチンプロモーター、膵臓ポリペプチド（PPY）プロモーター、シナプシン-1（Syn）プロ
モーター、クレアチンキナーゼ（MCK）プロモーター、哺乳類デスミン（DES）プロモータ
ー、α-ミオシン重鎖（a-MHC）プロモーター、または心筋トロポニンT（cTnT）プロモー
ター。他の例示的プロモーターには、βアクチンプロモーター、B型肝炎ウイルスコアプ
ロモーター、Sandiget al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996)；αフェトプロテイン（AFP
）プロモーター、Arbuthnotet al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)、骨オステオ
カルシンプロモーター（Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)）；骨シア
ロタンパク質プロモーター（Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)）、
CD2プロモーター（Hansalet al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998)）；免疫グロブリン
重鎖プロモーター；T細胞受容体α鎖プロモーター；神経特異的エノラーゼ（NSE）プロモ
ーターなどの神経性プロモーター（Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-1
5 (1993)）、神経フィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Piccioliet al., Proc. Natl.
Acad.Sci. USA, 88:5611-5 (1991)）、および神経特異的vgf遺伝子プロモーター（Picc
ioli et al.,Neuron, 15:373-84 (1995)）が含まれ、特に、これらは当業者に明らかで
あろう。
の場合では、組織特異的調節配列は、組織特異的な形で転写を誘導する組織特異的転写因
子に結合する。そのような組織特異的調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー等
）は当技術分野において周知である。例示的な組織特異的調節配列には、これらに限定さ
れないが以下の組織特異的プロモーターが含まれる：肝臓特異的チロキシン結合グロブリ
ン（TBG）プロモーター、インスリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、ソマトス
タチンプロモーター、膵臓ポリペプチド（PPY）プロモーター、シナプシン-1（Syn）プロ
モーター、クレアチンキナーゼ（MCK）プロモーター、哺乳類デスミン（DES）プロモータ
ー、α-ミオシン重鎖（a-MHC）プロモーター、または心筋トロポニンT（cTnT）プロモー
ター。他の例示的プロモーターには、βアクチンプロモーター、B型肝炎ウイルスコアプ
ロモーター、Sandiget al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996)；αフェトプロテイン（AFP
）プロモーター、Arbuthnotet al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)、骨オステオ
カルシンプロモーター（Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)）；骨シア
ロタンパク質プロモーター（Chen et al., J. Bone Miner. Res., 11:654-64 (1996)）、
CD2プロモーター（Hansalet al., J. Immunol., 161:1063-8 (1998)）；免疫グロブリン
重鎖プロモーター；T細胞受容体α鎖プロモーター；神経特異的エノラーゼ（NSE）プロモ
ーターなどの神経性プロモーター（Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-1
5 (1993)）、神経フィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Piccioliet al., Proc. Natl.
Acad.Sci. USA, 88:5611-5 (1991)）、および神経特異的vgf遺伝子プロモーター（Picc
ioli et al.,Neuron, 15:373-84 (1995)）が含まれ、特に、これらは当業者に明らかで
あろう。
【0170】
いくつかの態様において、1つまたは複数のmiRNAに対する1つまたは複数の結合部位が
、rAAVベクターの導入遺伝子に組み込まれ、導入遺伝子を内部に有する対象の1つまたは
複数の組織における導入遺伝子の発現を阻害する。当業者は、結合部位が組織特異的に導
入遺伝子の発現を制御するために選択されうることを理解するであろう。例えば、肝臓特
異的miR-122に対する結合部位は、肝臓においてその導入遺伝子の発現を阻害するために
導入遺伝子内に組み込まれてもよい。mRNAにおける標的部位は、5' UTR、3' UTR、または
コード領域中に存在してもよい。典型的には、標的部位はmRNAの3' UTR中に存在する。さ
らに、導入遺伝子は、複数のmiRNAが同じまたは複数の部位を認識することによってmRNA
を調節するように設計されてもよい。複数のmiRNA結合部位の存在は、複数のRISCの協同
的作用をもたらし、高い効率での発現の阻害を提供する可能性がある。標的部位配列は合
計で5～100、10～60、またはそれを上回るヌクレオチドを含み得る。標的部位配列は、標
的遺伝子結合部位の配列の少なくとも5ヌクレオチドを含み得る。
、rAAVベクターの導入遺伝子に組み込まれ、導入遺伝子を内部に有する対象の1つまたは
複数の組織における導入遺伝子の発現を阻害する。当業者は、結合部位が組織特異的に導
入遺伝子の発現を制御するために選択されうることを理解するであろう。例えば、肝臓特
異的miR-122に対する結合部位は、肝臓においてその導入遺伝子の発現を阻害するために
導入遺伝子内に組み込まれてもよい。mRNAにおける標的部位は、5' UTR、3' UTR、または
コード領域中に存在してもよい。典型的には、標的部位はmRNAの3' UTR中に存在する。さ
らに、導入遺伝子は、複数のmiRNAが同じまたは複数の部位を認識することによってmRNA
を調節するように設計されてもよい。複数のmiRNA結合部位の存在は、複数のRISCの協同
的作用をもたらし、高い効率での発現の阻害を提供する可能性がある。標的部位配列は合
計で5～100、10～60、またはそれを上回るヌクレオチドを含み得る。標的部位配列は、標
的遺伝子結合部位の配列の少なくとも5ヌクレオチドを含み得る。
【0171】
聴覚系ポリペプチドおよび聴覚系ポリペプチド導入遺伝子コード配列
rAAVベクターの聴覚系ポリペプチド導入遺伝子配列の組成は、得られるベクターを作製
する用途によって決まる。よって、本発明は、哺乳類対象における難聴に関連する疾患状
態の治療または予防に有用である、1つまたは複数の聴覚系ポリペプチド、ペプチド、ま
たはタンパク質をコードするrAAVベクターの送達を包含する。例示的な治療用タンパク質
には、オトフェリン；Cav1.3；バスーン（bassoon）、ピッコロ（piccolo）、リブアイ（
ribeye）、およびハーモニン（harmonin）から選択される足場タンパク質；Vglut3；シナ
プトタグミン；小胞テザリング/ドッキングタンパク質；小胞プライミングタンパク質；
小胞融合タンパク質；GluA2/3；またはGluA4からなる群より選択される1つまたは複数の
ポリペプチドが含まれる。
rAAVベクターの聴覚系ポリペプチド導入遺伝子配列の組成は、得られるベクターを作製
する用途によって決まる。よって、本発明は、哺乳類対象における難聴に関連する疾患状
態の治療または予防に有用である、1つまたは複数の聴覚系ポリペプチド、ペプチド、ま
たはタンパク質をコードするrAAVベクターの送達を包含する。例示的な治療用タンパク質
には、オトフェリン；Cav1.3；バスーン（bassoon）、ピッコロ（piccolo）、リブアイ（
ribeye）、およびハーモニン（harmonin）から選択される足場タンパク質；Vglut3；シナ
プトタグミン；小胞テザリング/ドッキングタンパク質；小胞プライミングタンパク質；
小胞融合タンパク質；GluA2/3；またはGluA4からなる群より選択される1つまたは複数の
ポリペプチドが含まれる。
【0172】
AAV組成物には、ポリペプチドレポータータンパク質が任意で含まれる。導入遺伝子に
おいて提供されうるレポーター配列には、これらに限定されないが、β-ラクタマーゼ、
β-ガラクトシダーゼ（LacZ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光
タンパク質（GFP）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ルシフ
ェラーゼ、および当技術分野において周知の他のものをコードするDNA配列が含まれる。
それらの発現を駆動する調節エレメントと会合したとき、レポーター配列は、酵素的、X
線撮影的、比色的、蛍光もしくは他の分光的アッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ、な
らびに酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、放射免疫測定法（RIA）および免疫組織化学的
検査を含む免疫学的アッセイを含む、従来の手段によって検出可能なシグナルを提供する
。例えば、マーカー配列がLacZ遺伝子である場合、該シグナルを保有するベクターの存在
は、β-ガラクトシダーゼ活性についてのアッセイによって検出される。導入遺伝子が緑
色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼである場合、シグナルを保有するベクターは、ル
ミノメーターで色または光の生成により視覚的に測定されうる。そのようなレポーターは
、例えば、rAAVの組織特異的標的化能力および組織特異的プロモーター調節活性を検証す
るのに有用である可能性がある。
おいて提供されうるレポーター配列には、これらに限定されないが、β-ラクタマーゼ、
β-ガラクトシダーゼ（LacZ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光
タンパク質（GFP）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ルシフ
ェラーゼ、および当技術分野において周知の他のものをコードするDNA配列が含まれる。
それらの発現を駆動する調節エレメントと会合したとき、レポーター配列は、酵素的、X
線撮影的、比色的、蛍光もしくは他の分光的アッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ、な
らびに酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、放射免疫測定法（RIA）および免疫組織化学的
検査を含む免疫学的アッセイを含む、従来の手段によって検出可能なシグナルを提供する
。例えば、マーカー配列がLacZ遺伝子である場合、該シグナルを保有するベクターの存在
は、β-ガラクトシダーゼ活性についてのアッセイによって検出される。導入遺伝子が緑
色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼである場合、シグナルを保有するベクターは、ル
ミノメーターで色または光の生成により視覚的に測定されうる。そのようなレポーターは
、例えば、rAAVの組織特異的標的化能力および組織特異的プロモーター調節活性を検証す
るのに有用である可能性がある。
【0173】
別の例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作出するために使用することを目的と
するタンパク質または機能性RNAをコードする。適切な導入遺伝子コード配列は、当業者
に明らかである。
するタンパク質または機能性RNAをコードする。適切な導入遺伝子コード配列は、当業者
に明らかである。
【0174】
rAAVベクターは、聴覚系ポリペプチド遺伝子、または聴覚系ポリペプチドの機能的経路
における別の遺伝子の発現の低下、発現の欠如、または機能障害に関連する疾患を治療す
るために対象に移入されるべき、聴覚系ポリペプチドをコードする遺伝子または遺伝子の
一部を含んでもよい。
における別の遺伝子の発現の低下、発現の欠如、または機能障害に関連する疾患を治療す
るために対象に移入されるべき、聴覚系ポリペプチドをコードする遺伝子または遺伝子の
一部を含んでもよい。
【0175】
第1の局面において、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において聴覚系ポ
リペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力を有する複数のアデノ随伴ウイルス（AAV
）ベクターを含む、治療用組成物が提供される。好ましくは、複数のAAVベクターは、治
療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において全長聴覚系ポリペプチドのメッセン
ジャーRNAを構成する能力を有する。複数のAAVベクターには、第1のAAVベクターおよび第
2のAAVベクターが含まれ、第1および第2のAAVベクターは独立して、約6kb未満のパッケ
ージング能力を含む。聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAは、例えば、本明細書に
おいて提供されるような、オトフェリンおよびそのオルソログまたはホモログからなる群
より選択される聴覚系ポリペプチドをコードする。AAVベクターは、CBA、CMV、もしくはC
B7プロモーター、または1つもしくは複数の蝸牛特異的プロモーターから選択される少な
くとも1つのプロモーター配列を含む。
リペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力を有する複数のアデノ随伴ウイルス（AAV
）ベクターを含む、治療用組成物が提供される。好ましくは、複数のAAVベクターは、治
療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において全長聴覚系ポリペプチドのメッセン
ジャーRNAを構成する能力を有する。複数のAAVベクターには、第1のAAVベクターおよび第
2のAAVベクターが含まれ、第1および第2のAAVベクターは独立して、約6kb未満のパッケ
ージング能力を含む。聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAは、例えば、本明細書に
おいて提供されるような、オトフェリンおよびそのオルソログまたはホモログからなる群
より選択される聴覚系ポリペプチドをコードする。AAVベクターは、CBA、CMV、もしくはC
B7プロモーター、または1つもしくは複数の蝸牛特異的プロモーターから選択される少な
くとも1つのプロモーター配列を含む。
【0176】
本明細書において提供される組成物は、少なくとも2つ（例えば、2つ、3つ、4つ、5つ
、または6つ）の核酸ベクターを含み、当該少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれは
、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部
分のそれぞれの長さは、少なくとも30アミノ酸（例えば、約30アミノ酸～約1950アミノ酸
、約30アミノ酸～約1900アミノ酸、約30アミノ酸～約1850アミノ酸、約30アミノ酸～約18
00アミノ酸、約30アミノ酸～約1750アミノ酸、約30アミノ酸～約1700アミノ酸、約30アミ
ノ酸～約1650アミノ酸、約30アミノ酸～約1600アミノ酸、約30アミノ酸～約1550アミノ酸
、約30アミノ酸～約1500アミノ酸、約30アミノ酸～約1450アミノ酸、約30アミノ酸～約14
00アミノ酸、約30アミノ酸～約1350アミノ酸、約30アミノ酸～約1300アミノ酸、約30アミ
ノ酸～約1250アミノ酸、約30アミノ酸～約1200アミノ酸、約30アミノ酸～約1150アミノ酸
、約30アミノ酸～約1100アミノ酸、約30アミノ酸～約1050アミノ酸、約30アミノ酸～約10
00アミノ酸、約30アミノ酸～約950アミノ酸、約30アミノ酸～約900アミノ酸、約30アミノ
酸～約850アミノ酸、約30アミノ酸～約800アミノ酸、約30アミノ酸～約750アミノ酸、約3
0アミノ酸～約700アミノ酸、約30アミノ酸～約650アミノ酸、約30アミノ酸～約600アミノ
酸、約30アミノ酸～約550アミノ酸、約30アミノ酸～約500アミノ酸、約30アミノ酸～約45
0アミノ酸、約30アミノ酸～約400アミノ酸、約30アミノ酸～約350アミノ酸、約30アミノ
酸～約300アミノ酸、約30アミノ酸～約250アミノ酸、約30アミノ酸～約200アミノ酸、約3
0アミノ酸～約150アミノ酸、約30アミノ酸～約100アミノ酸、約30アミノ酸～約50アミノ
酸、約50アミノ酸～約1950アミノ酸、約50アミノ酸～約1900アミノ酸、約50アミノ酸～約
1850アミノ酸、約50アミノ酸～約1800アミノ酸、約50アミノ酸～約1750アミノ酸、約50ア
ミノ酸～約1700アミノ酸、約50アミノ酸～約1650アミノ酸、約50アミノ酸～約1600アミノ
酸、約50アミノ酸～約1550アミノ酸、約50アミノ酸～約1500アミノ酸、約50アミノ酸～約
1450アミノ酸、約50アミノ酸～約1400アミノ酸、約50アミノ酸～約1350アミノ酸、約50ア
ミノ酸～約1300アミノ酸、約50アミノ酸～約1250アミノ酸、約50アミノ酸～約1200アミノ
酸、約50アミノ酸～約1150アミノ酸、約50アミノ酸～約1100アミノ酸、約50アミノ酸～約
1050アミノ酸、約50アミノ酸～約1000アミノ酸、約50アミノ酸～約950アミノ酸、約50ア
ミノ酸～約900アミノ酸、約50アミノ酸～約850アミノ酸、約50アミノ酸～約800アミノ酸
、約50アミノ酸～約750アミノ酸、約50アミノ酸～約700アミノ酸、約50アミノ酸～約650
アミノ酸、約50アミノ酸～約600アミノ酸、約50アミノ酸～約550アミノ酸、約50アミノ酸
～約500アミノ酸、約50アミノ酸～約450アミノ酸、約50アミノ酸～約400アミノ酸、約50
アミノ酸～約350アミノ酸、約50アミノ酸～約300アミノ酸、約50アミノ酸～約250アミノ
酸、約50アミノ酸～約200アミノ酸、約50アミノ酸～約150アミノ酸、約50アミノ酸～約10
0アミノ酸、約100アミノ酸～約1950アミノ酸、約100アミノ酸～約1900アミノ酸、約100ア
ミノ酸～約1850アミノ酸、約100アミノ酸～約1800アミノ酸、約100アミノ酸～約1750アミ
ノ酸、約100アミノ酸～約1700アミノ酸、約100アミノ酸～約1650アミノ酸、約100アミノ
酸～約1600アミノ酸、約100アミノ酸～約1550アミノ酸、約100アミノ酸～約1500アミノ酸
、約100アミノ酸～約1450アミノ酸、約100アミノ酸～約1400アミノ酸、約100アミノ酸～
約1350アミノ酸、約100アミノ酸～約1300アミノ酸、約100アミノ酸～約1250アミノ酸、約
100アミノ酸～約1200アミノ酸、約100アミノ酸～約1150アミノ酸、約100アミノ酸～約110
0アミノ酸、約100アミノ酸～約1050アミノ酸、約100アミノ酸～約1000アミノ酸、約100ア
ミノ酸～約950アミノ酸、約100アミノ酸～約900アミノ酸、約100アミノ酸～約850アミノ
酸、約100アミノ酸～約800アミノ酸、約100アミノ酸～約750アミノ酸、約100アミノ酸～
約700アミノ酸、約100アミノ酸～約650アミノ酸、約100アミノ酸～約600アミノ酸、約100
アミノ酸～約550アミノ酸、約100アミノ酸～約500アミノ酸、約100アミノ酸～約450アミ
ノ酸、約100アミノ酸～約400アミノ酸、約100アミノ酸～約350アミノ酸、約100アミノ酸
～約300アミノ酸、約100アミノ酸～約250アミノ酸、約100アミノ酸～約200アミノ酸、約1
00アミノ酸～約150アミノ酸、約150アミノ酸～約1950アミノ酸、約150アミノ酸～約1900
アミノ酸、約150アミノ酸～約1850アミノ酸、約150アミノ酸～約1800アミノ酸、約150ア
ミノ酸～約1750アミノ酸、約150アミノ酸～約1700アミノ酸、約150アミノ酸～約1650アミ
ノ酸、約150アミノ酸～約1600アミノ酸、約150アミノ酸～約1550アミノ酸、約150アミノ
酸～約1500アミノ酸、約150アミノ酸～約1450アミノ酸、約150アミノ酸～約1400アミノ酸
、約150アミノ酸～約1350アミノ酸、約150アミノ酸～約1300アミノ酸、約150アミノ酸～
約1250アミノ酸、約150アミノ酸～約1200アミノ酸、約150アミノ酸～約1150アミノ酸、約
150アミノ酸～約1100アミノ酸、約150アミノ酸～約1050アミノ酸、約150アミノ酸～約100
0アミノ酸、約150アミノ酸～約950アミノ酸、約150アミノ酸～約900アミノ酸、約150アミ
ノ酸～約850アミノ酸、約150アミノ酸～約800アミノ酸、約150アミノ酸～約750アミノ酸
、約150アミノ酸～約700アミノ酸、約150アミノ酸～約650アミノ酸、約150アミノ酸～約6
00アミノ酸、約150アミノ酸～約550アミノ酸、約150アミノ酸～約500アミノ酸、約150ア
ミノ酸～約450アミノ酸、約150アミノ酸～約400アミノ酸、約150アミノ酸～約350アミノ
酸、約150アミノ酸～約300アミノ酸、約150アミノ酸～約250アミノ酸、約150アミノ酸～
約200アミノ酸、約200アミノ酸～約1950アミノ酸、約200アミノ酸～約1900アミノ酸、約2
00アミノ酸～約1850アミノ酸、約200アミノ酸～約1800アミノ酸、約200アミノ酸～約1750
アミノ酸、約200アミノ酸～約1700アミノ酸、約200アミノ酸～約1650アミノ酸、約200ア
ミノ酸～約1600アミノ酸、約200アミノ酸～約1550アミノ酸、約200アミノ酸～約1500アミ
ノ酸、約200アミノ酸～約1450アミノ酸、約200アミノ酸～約1400アミノ酸、約200アミノ
酸～約1350アミノ酸、約200アミノ酸～約1300アミノ酸、約200アミノ酸～約1250アミノ酸
、約200アミノ酸～約1200アミノ酸、約200アミノ酸～約1150アミノ酸、約200アミノ酸～
約1100アミノ酸、約200アミノ酸～約1050アミノ酸、約200アミノ酸～約1000アミノ酸、約
200アミノ酸～約950アミノ酸、約200アミノ酸～約900アミノ酸、約200アミノ酸～約850ア
ミノ酸、約200アミノ酸～約800アミノ酸、約200アミノ酸～約750アミノ酸、約200アミノ
酸～約700アミノ酸、約200アミノ酸～約650アミノ酸、約200アミノ酸～約600アミノ酸、
約200アミノ酸～約550アミノ酸、約200アミノ酸～約500アミノ酸、約200アミノ酸～約450
アミノ酸、約200アミノ酸～約400アミノ酸、約200アミノ酸～約350アミノ酸、約200アミ
ノ酸～約300アミノ酸、約200アミノ酸～約250アミノ酸、約250アミノ酸～約1950アミノ酸
、約250アミノ酸～約1900アミノ酸、約250アミノ酸～約1850アミノ酸、約250アミノ酸～
約1800アミノ酸、約250アミノ酸～約1750アミノ酸、約250アミノ酸～約1700アミノ酸、約
250アミノ酸～約1650アミノ酸、約250アミノ酸～約1600アミノ酸、約250アミノ酸～約155
0アミノ酸、約250アミノ酸～約1500アミノ酸、約250アミノ酸～約1450アミノ酸、約250ア
ミノ酸～約1400アミノ酸、約250アミノ酸～約1350アミノ酸、約250アミノ酸～約1300アミ
ノ酸、約250アミノ酸～約1250アミノ酸、約250アミノ酸～約1200アミノ酸、約250アミノ
酸～約1150アミノ酸、約250アミノ酸～約1100アミノ酸、約250アミノ酸～約1050アミノ酸
、約250アミノ酸～約1000アミノ酸、約250アミノ酸～約950アミノ酸、約250アミノ酸～約
900アミノ酸、約250アミノ酸～約850アミノ酸、約250アミノ酸～約800アミノ酸、約250ア
ミノ酸～約750アミノ酸、約250アミノ酸～約700アミノ酸、約250アミノ酸～約650アミノ
酸、約250アミノ酸～約600アミノ酸、約250アミノ酸～約550アミノ酸、約250アミノ酸～
約500アミノ酸、約250アミノ酸～約450アミノ酸、約250アミノ酸～約400アミノ酸、約250
アミノ酸～約350アミノ酸、約250アミノ酸～約300アミノ酸、約300アミノ酸～約1950アミ
ノ酸、約300アミノ酸～約1900アミノ酸、約300アミノ酸～約1850アミノ酸、約300アミノ
酸～約1800アミノ酸、約300アミノ酸～約1750アミノ酸、約300アミノ酸～約1700アミノ酸
、約300アミノ酸～約1650アミノ酸、約300アミノ酸～約1600アミノ酸、約300アミノ酸～
約1550アミノ酸、約300アミノ酸～約1500アミノ酸、約300アミノ酸～約1450アミノ酸、約
300アミノ酸～約1400アミノ酸、約300アミノ酸～約1350アミノ酸、約300アミノ酸～約130
0アミノ酸、約300アミノ酸～約1250アミノ酸、約300アミノ酸～約1200アミノ酸、約300ア
ミノ酸～約1150アミノ酸、約300アミノ酸～約1100アミノ酸、約300アミノ酸～約1050アミ
ノ酸、約300アミノ酸～約1000アミノ酸、約300アミノ酸～約950アミノ酸、約300アミノ酸
～約900アミノ酸、約300アミノ酸～約850アミノ酸、約300アミノ酸～約800アミノ酸、約3
00アミノ酸～約750アミノ酸、約300アミノ酸～約700アミノ酸、約300アミノ酸～約650ア
ミノ酸、約300アミノ酸～約600アミノ酸、約300アミノ酸～約550アミノ酸、約300アミノ
酸～約500アミノ酸、約300アミノ酸～約450アミノ酸、約300アミノ酸～約400アミノ酸、
約300アミノ酸～約350アミノ酸、約350アミノ酸～約1950アミノ酸、約350アミノ酸～約19
00アミノ酸、約350アミノ酸～約1850アミノ酸、約350アミノ酸～約1800アミノ酸、約350
アミノ酸～約1750アミノ酸、約350アミノ酸～約1700アミノ酸、約350アミノ酸～約1650ア
ミノ酸、約350アミノ酸～約1600アミノ酸、約350アミノ酸～約1550アミノ酸、約350アミ
ノ酸～約1500アミノ酸、約350アミノ酸～約1450アミノ酸、約350アミノ酸～約1400アミノ
酸、約350アミノ酸～約1350アミノ酸、約350アミノ酸～約1300アミノ酸、約350アミノ酸
～約1250アミノ酸、約350アミノ酸～約1200アミノ酸、約350アミノ酸～約1150アミノ酸、
約350アミノ酸～約1100アミノ酸、約350アミノ酸～約1050アミノ酸、約350アミノ酸～約1
000アミノ酸、約350アミノ酸～約950アミノ酸、約350アミノ酸～約900アミノ酸、約350ア
ミノ酸～約850アミノ酸、約350アミノ酸～約800アミノ酸、約350アミノ酸～約750アミノ
酸、約350アミノ酸～約700アミノ酸、約350アミノ酸～約650アミノ酸、約350アミノ酸～
約600アミノ酸、約350アミノ酸～約550アミノ酸、約350アミノ酸～約500アミノ酸、約350
アミノ酸～約450アミノ酸、約350アミノ酸～約400アミノ酸、約400アミノ酸～約1950アミ
ノ酸、約400アミノ酸～約1900アミノ酸、約400アミノ酸～約1850アミノ酸、約400アミノ
酸～約1800アミノ酸、約400アミノ酸～約1750アミノ酸、約400アミノ酸～約1700アミノ酸
、約400アミノ酸～約1650アミノ酸、約400アミノ酸～約1600アミノ酸、約400アミノ酸～
約1550アミノ酸、約400アミノ酸～約1500アミノ酸、約400アミノ酸～約1450アミノ酸、約
400アミノ酸～約1400アミノ酸、約400アミノ酸～約1350アミノ酸、約400アミノ酸～約130
0アミノ酸、約400アミノ酸～約1250アミノ酸、約400アミノ酸～約1200アミノ酸、約400ア
ミノ酸～約1150アミノ酸、約400アミノ酸～約1100アミノ酸、約400アミノ酸～約1050アミ
ノ酸、約400アミノ酸～約1000アミノ酸、約400アミノ酸～約950アミノ酸、約400アミノ酸
～約900アミノ酸、約400アミノ酸～約850アミノ酸、約400アミノ酸～約800アミノ酸、約4
00アミノ酸～約750アミノ酸、約400アミノ酸～約700アミノ酸、約400アミノ酸～約650ア
ミノ酸、約400アミノ酸～約600アミノ酸、約400アミノ酸～約550アミノ酸、約400アミノ
酸～約500アミノ酸、約400アミノ酸～約450アミノ酸、約450アミノ酸～約1950アミノ酸、
約450アミノ酸～約1900アミノ酸、約450アミノ酸～約1850アミノ酸、約450アミノ酸～約1
800アミノ酸、約450アミノ酸～約1750アミノ酸、約450アミノ酸～約1700アミノ酸、約450
アミノ酸～約1650アミノ酸、約450アミノ酸～約1600アミノ酸、約450アミノ酸～約1550ア
ミノ酸、約450アミノ酸～約1500アミノ酸、約450アミノ酸～約1450アミノ酸、約450アミ
ノ酸～約1400アミノ酸、約450アミノ酸～約1350アミノ
酸、約450アミノ酸～約1300アミノ酸、約450アミノ酸～約1250アミノ酸、約450アミノ酸
～約1200アミノ酸、約450アミノ酸～約1150アミノ酸、約450アミノ酸～約1100アミノ酸、
約450アミノ酸～約1050アミノ酸、約450アミノ酸～約1000アミノ酸、約450アミノ酸～約9
50アミノ酸、約450アミノ酸～約900アミノ酸、約450アミノ酸～約850アミノ酸、約450ア
ミノ酸～約800アミノ酸、約450アミノ酸～約750アミノ酸、約450アミノ酸～約700アミノ
酸、約450アミノ酸～約650アミノ酸、約450アミノ酸～約600アミノ酸、約450アミノ酸～
約550アミノ酸、約450アミノ酸～約500アミノ酸、約500アミノ酸～約1950アミノ酸、約50
0アミノ酸～約1900アミノ酸、約500アミノ酸～約1850アミノ酸、約500アミノ酸～約1800
アミノ酸、約500アミノ酸～約1750アミノ酸、約500アミノ酸～約1700アミノ酸、約500ア
ミノ酸～約1650アミノ酸、約500アミノ酸～約1600アミノ酸、約500アミノ酸～約1550アミ
ノ酸、約500アミノ酸～約1500アミノ酸、約500アミノ酸～約1450アミノ酸、約500アミノ
酸～約1400アミノ酸、約500アミノ酸～約1350アミノ酸、約500アミノ酸～約1300アミノ酸
、約500アミノ酸～約1250アミノ酸、約500アミノ酸～約1200アミノ酸、約500アミノ酸～
約1150アミノ酸、約500アミノ酸～約1100アミノ酸、約500アミノ酸～約1050アミノ酸、約
500アミノ酸～約1000アミノ酸、約500アミノ酸～約950アミノ酸、約500アミノ酸～約900
アミノ酸、約500アミノ酸～約850アミノ酸、約500アミノ酸～約800アミノ酸、約500アミ
ノ酸～約750アミノ酸、約500アミノ酸～約700アミノ酸、約500アミノ酸～約650アミノ酸
、約500アミノ酸～約600アミノ酸、約500アミノ酸～約550アミノ酸、約550アミノ酸～約1
950アミノ酸、約550アミノ酸～約1900アミノ酸、約550アミノ酸～約1850アミノ酸、約550
アミノ酸～約1800アミノ酸、約550アミノ酸～約1750アミノ酸、約550アミノ酸～約1700ア
ミノ酸、約550アミノ酸～約1650アミノ酸、約550アミノ酸～約1600アミノ酸、約550アミ
ノ酸～約1550アミノ酸、約550アミノ酸～約1500アミノ酸、約550アミノ酸～約1450アミノ
酸、約550アミノ酸～約1400アミノ酸、約550アミノ酸～約1350アミノ酸、約550アミノ酸
～約1300アミノ酸、約550アミノ酸～約1250アミノ酸、約550アミノ酸～約1200アミノ酸、
約550アミノ酸～約1150アミノ酸、約550アミノ酸～約1100アミノ酸、約550アミノ酸～約1
050アミノ酸、約550アミノ酸～約1000アミノ酸、約550アミノ酸～約950アミノ酸、約550
アミノ酸～約900アミノ酸、約550アミノ酸～約850アミノ酸、約550アミノ酸～約800アミ
ノ酸、約550アミノ酸～約750アミノ酸、約550アミノ酸～約700アミノ酸、約550アミノ酸
～約650アミノ酸、約550アミノ酸～約600アミノ酸、約600アミノ酸～約1950アミノ酸、約
600アミノ酸～約1900アミノ酸、約600アミノ酸～約1850アミノ酸、約600アミノ酸～約180
0アミノ酸、約600アミノ酸～約1750アミノ酸、約600アミノ酸～約1700アミノ酸、約600ア
ミノ酸～約1650アミノ酸、約600アミノ酸～約1600アミノ酸、約600アミノ酸～約1550アミ
ノ酸、約600アミノ酸～約1500アミノ酸、約600アミノ酸～約1450アミノ酸、約600アミノ
酸～約1400アミノ酸、約600アミノ酸～約1350アミノ酸、約600アミノ酸～約1300アミノ酸
、約600アミノ酸～約1250アミノ酸、約600アミノ酸～約1200アミノ酸、約600アミノ酸～
約1150アミノ酸、約600アミノ酸～約1100アミノ酸、約600アミノ酸～約1050アミノ酸、約
600アミノ酸～約1000アミノ酸、約600アミノ酸～約950アミノ酸、約600アミノ酸～約900
アミノ酸、約600アミノ酸～約850アミノ酸、約600アミノ酸～約800アミノ酸、約600アミ
ノ酸～約750アミノ酸、約600アミノ酸～約700アミノ酸、約600アミノ酸～約650アミノ酸
、約650アミノ酸～約1950アミノ酸、約650アミノ酸～約1900アミノ酸、約650アミノ酸～
約1850アミノ酸、約650アミノ酸～約1800アミノ酸、約650アミノ酸～約1750アミノ酸、約
650アミノ酸～約1700アミノ酸、約650アミノ酸～約1650アミノ酸、約650アミノ酸～約160
0アミノ酸、約650アミノ酸～約1550アミノ酸、約650アミノ酸～約1500アミノ酸、約650ア
ミノ酸～約1450アミノ酸、約650アミノ酸～約1400アミノ酸、約650アミノ酸～約1350アミ
ノ酸、約650アミノ酸～約1300アミノ酸、約650アミノ酸～約1250アミノ酸、約650アミノ
酸～約1200アミノ酸、約650アミノ酸～約1150アミノ酸、約650アミノ酸～約1100アミノ酸
、約650アミノ酸～約1050アミノ酸、約650アミノ酸～約1000アミノ酸、約650アミノ酸～
約950アミノ酸、約650アミノ酸～約900アミノ酸、約650アミノ酸～約850アミノ酸、約650
アミノ酸～約800アミノ酸、約650アミノ酸～約750アミノ酸、約650アミノ酸～約700アミ
ノ酸、約700アミノ酸～約1950アミノ酸、約700アミノ酸～約1900アミノ酸、約700アミノ
酸～約1850アミノ酸、約700アミノ酸～約1800アミノ酸、約700アミノ酸～約1750アミノ酸
、約700アミノ酸～約1700アミノ酸、約700アミノ酸～約1650アミノ酸、約700アミノ酸～
約1600アミノ酸、約700アミノ酸～約1550アミノ酸、約700アミノ酸～約1500アミノ酸、約
700アミノ酸～約1450アミノ酸、約700アミノ酸～約1400アミノ酸、約700アミノ酸～約135
0アミノ酸、約700アミノ酸～約1300アミノ酸、約700アミノ酸～約1250アミノ酸、約700ア
ミノ酸～約1200アミノ酸、約700アミノ酸～約1150アミノ酸、約700アミノ酸～約1100アミ
ノ酸、約700アミノ酸～約1050アミノ酸、約700アミノ酸～約1000アミノ酸、約700アミノ
酸～約950アミノ酸、約700アミノ酸～約900アミノ酸、約700アミノ酸～約850アミノ酸、
約700アミノ酸～約800アミノ酸、約700アミノ酸～約750アミノ酸、約750アミノ酸～約195
0アミノ酸、約750アミノ酸～約1900アミノ酸、約750アミノ酸～約1850アミノ酸、約750ア
ミノ酸～約1800アミノ酸、約750アミノ酸～約1750アミノ酸、約750アミノ酸～約1700アミ
ノ酸、約750アミノ酸～約1650アミノ酸、約750アミノ酸～約1600アミノ酸、約750アミノ
酸～約1550アミノ酸、約750アミノ酸～約1500アミノ酸、約750アミノ酸～約1450アミノ酸
、約750アミノ酸～約1400アミノ酸、約750アミノ酸～約1350アミノ酸、約750アミノ酸～
約1250アミノ酸、約750アミノ酸～約1200アミノ酸、約750アミノ酸～約1150アミノ酸、約
750アミノ酸～約1100アミノ酸、約750アミノ酸～約1050アミノ酸、約750アミノ酸～約100
0アミノ酸、約750アミノ酸～約950アミノ酸、約750アミノ酸～約900アミノ酸、約750アミ
ノ酸～約850アミノ酸、約750アミノ酸～約800アミノ酸、約800アミノ酸～約1950アミノ酸
、約800アミノ酸～約1900アミノ酸、約800アミノ酸～約1850アミノ酸、約800アミノ酸～
約1800アミノ酸、約800アミノ酸～約1750アミノ酸、約800アミノ酸～約1700アミノ酸、約
800アミノ酸～約1650アミノ酸、約800アミノ酸～約1600アミノ酸、約800アミノ酸～約155
0アミノ酸、約800アミノ酸～約1500アミノ酸、約800アミノ酸～約1450アミノ酸、約800ア
ミノ酸～約1400アミノ酸、約800アミノ酸～約1350アミノ酸、約800アミノ酸～約1300アミ
ノ酸、約800アミノ酸～約1250アミノ酸、約800アミノ酸～約1200アミノ酸、約800アミノ
酸～約1150アミノ酸、約800アミノ酸～約1100アミノ酸、約800アミノ酸～約1050アミノ酸
、約800アミノ酸～約1000アミノ酸、約800アミノ酸～約950アミノ酸、約800アミノ酸～約
900アミノ酸、約800アミノ酸～約850アミノ酸、約850アミノ酸～約1950アミノ酸、約850
アミノ酸～約1900アミノ酸、約850アミノ酸～約1850アミノ酸、約850アミノ酸～約1800ア
ミノ酸、約850アミノ酸～約1750アミノ酸、約850アミノ酸～約1700アミノ酸、約850アミ
ノ酸～約1650アミノ酸、約850アミノ酸～約1600アミノ酸、約850アミノ酸～約1550アミノ
酸、約850アミノ酸～約1500アミノ酸、約850アミノ酸～約1450アミノ酸、約850アミノ酸
～約1400アミノ酸、約850アミノ酸～約1350アミノ酸、約850アミノ酸～約1300アミノ酸、
約850アミノ酸～約1250アミノ酸、約850アミノ酸～約1200アミノ酸、約850アミノ酸～約1
150アミノ酸、約850アミノ酸～約1100アミノ酸、約850アミノ酸～約1050アミノ酸、約850
アミノ酸～約1000アミノ酸、約850アミノ酸～約950アミノ酸、約850アミノ酸～約900アミ
ノ酸、約900アミノ酸～約1950アミノ酸、約900アミノ酸～約1900アミノ酸、約900アミノ
酸～約1850アミノ酸、約900アミノ酸～約1800アミノ酸、約900アミノ酸～約1750アミノ酸
、約900アミノ酸～約1700アミノ酸、約900アミノ酸～約1650アミノ酸、約900アミノ酸～
約1600アミノ酸、約900アミノ酸～約1550アミノ酸、約900アミノ酸～約1500アミノ酸、約
900アミノ酸～約1450アミノ酸、約900アミノ酸～約1400アミノ酸、約900アミノ酸～約135
0アミノ酸、約900アミノ酸～約1300アミノ酸、約900アミノ酸～約1250アミノ酸、約900ア
ミノ酸～約1200アミノ酸、約900アミノ酸～約1150アミノ酸、約900アミノ酸～約1100アミ
ノ酸、約900アミノ酸～約1050アミノ酸、約900アミノ酸～約1000アミノ酸、約900アミノ
酸～約950アミノ酸、約950アミノ酸～約1950アミノ酸、約950アミノ酸～約1900アミノ酸
、約950アミノ酸～約1850アミノ酸、約950アミノ酸～約1800アミノ酸、約950アミノ酸～
約1750アミノ酸、約950アミノ酸～約1700アミノ酸、約950アミノ酸～約1650アミノ酸、約
950アミノ酸～約1600アミノ酸、約950アミノ酸～約1550アミノ酸、約950アミノ酸～約150
0アミノ酸、約950アミノ酸～約1450アミノ酸、約950アミノ酸～約1400アミノ酸、約950ア
ミノ酸～約1350アミノ酸、約950アミノ酸～約1300アミノ酸、約950アミノ酸～約1250アミ
ノ酸、約950アミノ酸～約1200アミノ酸、約950アミノ酸～約1150アミノ酸、約950アミノ
酸～約1100アミノ酸、約950アミノ酸～約1050アミノ酸、約950アミノ酸～約1000アミノ酸
、約1000アミノ酸～約1950アミノ酸、約1000アミノ酸～約1900アミノ酸、約1000アミノ酸
～約1850アミノ酸、約1000アミノ酸～約1800アミノ酸、約1000アミノ酸～約1750アミノ酸
、約1000アミノ酸～約1700アミノ酸、約1000アミノ酸～約1650アミノ酸、約1000アミノ酸
～約1600アミノ酸、約1000アミノ酸～約1550アミノ酸、約1000アミノ酸～約1500アミノ酸
、約1000アミノ酸～約1450アミノ酸、約1000アミノ酸～約1400アミノ酸、約1000アミノ酸
～約1350アミノ酸、約1000アミノ酸～約1300アミノ酸、約1000アミノ酸～約1250アミノ酸
、約1000アミノ酸～約1200アミノ酸、約1000アミノ酸～約1150アミノ酸、約1000アミノ酸
～約1100アミノ酸、約1000アミノ酸～約1050アミノ酸、約1050アミノ酸～約1950アミノ酸
、約1050アミノ酸～約1900アミノ酸、約1050アミノ酸～約1850アミノ酸、約1050アミノ酸
～約1800アミノ酸、約1050アミノ酸～約1750アミノ酸、約1050アミノ酸～約1700アミノ酸
、約1050アミノ酸～約1650アミノ酸、約1050アミノ酸～約1600アミノ酸、約1050アミノ酸
～約1550アミノ酸、約1050アミノ酸～約1500アミノ酸、約1050アミノ酸～約1450アミノ酸
、約1050アミノ酸～約1400アミノ酸、約1050アミノ酸～約1350アミノ酸、約1050アミノ酸
～約1300アミノ酸、約1050アミノ酸～約1250アミノ酸、約1050アミノ酸～約1200アミノ酸
、約1050アミノ酸～約1150アミノ酸、約1050アミノ酸～約1100アミノ酸、約1100アミノ酸
～約1950アミノ酸、約1100アミノ酸～約1900アミノ酸、約1100アミノ酸～約1850アミノ酸
、約1100アミノ酸～約1800アミノ酸、約1100アミノ酸～約1750アミノ酸、約1100アミノ酸
～約1700アミノ酸、約1100アミノ酸～約1650アミノ酸、約1100アミノ酸～約1600アミノ酸
、約1100アミノ酸～約1550アミノ酸、約1100アミノ酸～約1500アミノ酸、約1100アミノ酸
～約1450アミノ酸、約1100アミノ酸～約1400アミノ酸、約1100アミノ酸～約1350アミノ酸
、約1100アミノ酸～約1300アミノ酸、約1100アミノ酸～約1250アミノ酸、約1100アミノ酸
～約1200アミノ酸、約1100アミノ酸～約1150アミノ酸、約1150アミノ酸～約1950アミノ酸
、約1150アミノ酸～約1900アミノ酸、約1150アミノ酸～約1850アミノ酸、約1150アミノ酸
～約1800アミノ酸、約1150アミノ酸～約1750アミノ酸、約1150アミノ酸～約1700アミノ酸
、約1150アミノ酸～約1650アミノ酸、約1150アミノ酸～約1600アミノ酸、約1150アミノ酸
～約1550アミノ酸、約1150アミノ酸～約1500アミノ酸、約1150アミノ酸～約1450アミノ酸
、約1150アミノ酸～約1400アミノ酸、約1150アミノ酸～約1350アミノ酸、約1150アミノ酸
～約1300アミノ酸、約1150アミノ酸～約1250アミ
ノ酸、約1150アミノ酸～約1200アミノ酸、約1200アミノ酸～約1950アミノ酸、約1200アミ
ノ酸～約1900アミノ酸、約1200アミノ酸～約1850アミノ酸、約1200アミノ酸～約1800アミ
ノ酸、約1200アミノ酸～約1750アミノ酸、約1200アミノ酸～約1700アミノ酸、約1200アミ
ノ酸～約1650アミノ酸、約1200アミノ酸～約1600アミノ酸、約1200アミノ酸～約1550アミ
ノ酸、約1200アミノ酸～約1500アミノ酸、約1200アミノ酸～約1450アミノ酸、約1200アミ
ノ酸～約1400アミノ酸、約1200アミノ酸～約1350アミノ酸、約1200アミノ酸～約1300アミ
ノ酸、約1200アミノ酸～約1250アミノ酸、約1250アミノ酸～約1950アミノ酸、約1250アミ
ノ酸～約1900アミノ酸、約1250アミノ酸～約1850アミノ酸、約1250アミノ酸～約1800アミ
ノ酸、約1250アミノ酸～約1750アミノ酸、約1250アミノ酸～約1700アミノ酸、約1250アミ
ノ酸～約1650アミノ酸、約1250アミノ酸～約1600アミノ酸、約1250アミノ酸～約1550アミ
ノ酸、約1250アミノ酸～約1500アミノ酸、約1250アミノ酸～約1450アミノ酸、約1250アミ
ノ酸～約1400アミノ酸、約1250アミノ酸～約1350アミノ酸、約1250アミノ酸～約1300アミ
ノ酸、約1300アミノ酸～約1950アミノ酸、約1300アミノ酸～約1900アミノ酸、約1300アミ
ノ酸～約1850アミノ酸、約1300アミノ酸～約1800アミノ酸、約1300アミノ酸～約1750アミ
ノ酸、約1300アミノ酸～約1700アミノ酸、約1300アミノ酸～約1650アミノ酸、約1300アミ
ノ酸～約1600アミノ酸、約1300アミノ酸～約1550アミノ酸、約1300アミノ酸～約1500アミ
ノ酸、約1300アミノ酸～約1450アミノ酸、約1300アミノ酸～約1400アミノ酸、約1300アミ
ノ酸～約1350アミノ酸、約1350アミノ酸～約1950アミノ酸、約1350アミノ酸～約1900アミ
ノ酸、約1350アミノ酸～約1850アミノ酸、約1350アミノ酸～約1800アミノ酸、約1350アミ
ノ酸～約1750アミノ酸、約1350アミノ酸～約1700アミノ酸、約1350アミノ酸～約1650アミ
ノ酸、約1350アミノ酸～約1600アミノ酸、約1350アミノ酸～約1550アミノ酸、約1350アミ
ノ酸～約1500アミノ酸、約1350アミノ酸～約1450アミノ酸、約1350アミノ酸～約1400アミ
ノ酸、約1400アミノ酸～約1950アミノ酸、約1400アミノ酸～約1900アミノ酸、約1400アミ
ノ酸～約1850アミノ酸、約1400アミノ酸～約1800アミノ酸、約1400アミノ酸～約1750アミ
ノ酸、約1400アミノ酸～約1700アミノ酸、約1400アミノ酸～約1650アミノ酸、約1400アミ
ノ酸～約1600アミノ酸、約1400アミノ酸～約1550アミノ酸、約1400アミノ酸～約1500アミ
ノ酸、約1400アミノ酸～約1450アミノ酸、約1450アミノ酸～約1950アミノ酸、約1450アミ
ノ酸～約1900アミノ酸、約1450アミノ酸～約1850アミノ酸、約1450アミノ酸～約1800アミ
ノ酸、約1450アミノ酸～約1750アミノ酸、約1450アミノ酸～約1700アミノ酸、約1450アミ
ノ酸～約1650アミノ酸、約1450アミノ酸～約1600アミノ酸、約1450アミノ酸～約1550アミ
ノ酸、約1450アミノ酸～約1500アミノ酸、約1600アミノ酸～約1950アミノ酸、約1600アミ
ノ酸～約1900アミノ酸、約1600アミノ酸～約1850アミノ酸、約1600アミノ酸～約1800アミ
ノ酸、約1600アミノ酸～約1750アミノ酸、約1600アミノ酸～約1700アミノ酸、約1600アミ
ノ酸～約1650アミノ酸、約1500アミノ酸～約1950アミノ酸、約1500アミノ酸～約1900アミ
ノ酸、約1500アミノ酸～約1850アミノ酸、約1500アミノ酸～約1800アミノ酸、約1500アミ
ノ酸～約1750アミノ酸、約1500アミノ酸～約1700アミノ酸、約1500アミノ酸～約1650アミ
ノ酸、約1500アミノ酸～約1600アミノ酸、約1500アミノ酸～約1550アミノ酸、約1550アミ
ノ酸～約1950アミノ酸、約1550アミノ酸～約1900アミノ酸、約1550アミノ酸～約1850アミ
ノ酸、約1550アミノ酸～約1800アミノ酸、約1550アミノ酸～約1750アミノ酸、約1550アミ
ノ酸～約1700アミノ酸、約1550アミノ酸～約1650アミノ酸、約1550アミノ酸～約1600アミ
ノ酸、約1600アミノ酸～約1950アミノ酸、約1600アミノ酸～約1900アミノ酸、約1600アミ
ノ酸～約1850アミノ酸、約1600アミノ酸～約1800アミノ酸、約1600アミノ酸～約1750アミ
ノ酸、約1600アミノ酸～約1700アミノ酸、約1600アミノ酸～約1650アミノ酸、約1650アミ
ノ酸～約1950アミノ酸、約1650アミノ酸～約1900アミノ酸、約1650アミノ酸～約1850アミ
ノ酸、約1650アミノ酸～約1800アミノ酸、約1650アミノ酸～約1750アミノ酸、約1650アミ
ノ酸～約1700アミノ酸、約1700アミノ酸～約1950アミノ酸、約1700アミノ酸～約1900アミ
ノ酸、約1700アミノ酸～約1850アミノ酸、約1700アミノ酸～約1800アミノ酸、約1700アミ
ノ酸～約1750アミノ酸、約1750アミノ酸～約1950アミノ酸、約1750アミノ酸～約1900アミ
ノ酸、約1750アミノ酸～約1850アミノ酸、約1750アミノ酸～約1800アミノ酸、約1800アミ
ノ酸～約1950アミノ酸、約1800アミノ酸～約1900アミノ酸、約1800アミノ酸～約1850アミ
ノ酸、約1850アミノ酸～約1950アミノ酸、約1850アミノ酸～約1900アミノ酸、約1900アミ
ノ酸～約1950アミノ酸）であり、コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列は、任意で
、当該コードされる部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と部分的に重複してもよく；
当該少なくとも2つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、活性オトフェ
リンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質（例えば、全長野生型オトフェリ
ンタンパク質））をコードしておらず；かつ当該少なくとも2つの異なるベクターは、染
色体DNAを含む哺乳動物細胞に導入されると、相互におよび細胞の染色体DNAとの相同組換
えを受け、それによって、染色体DNAに挿入された、活性オトフェリンタンパク質（例え
ば、全長オトフェリンタンパク質）をコードする組換え核酸が形成される。いくつかの態
様において、核酸ベクターのうち1つは、オトフェリンタンパク質の一部分をコードする
コード配列を含むことができ、当該コードされる部分の長さは、例えば、約900アミノ酸
～約1950アミノ酸、約900アミノ酸～約1900アミノ酸、約900アミノ酸～約1850アミノ酸、
約900アミノ酸～約1800アミノ酸、約900アミノ酸～約1750アミノ酸、約900アミノ酸～約1
700アミノ酸、約900アミノ酸～約1650アミノ酸、約900アミノ酸～約1600アミノ酸、約900
アミノ酸～約1550アミノ酸、約900アミノ酸～約1500アミノ酸、約900アミノ酸～約1450ア
ミノ酸、約900アミノ酸～約1400アミノ酸、約900アミノ酸～約1350アミノ酸、約900アミ
ノ酸～約1300アミノ酸、約900アミノ酸～約1250アミノ酸、約900アミノ酸～約1200アミノ
酸、約900アミノ酸～約1150アミノ酸、約900アミノ酸～約1100アミノ酸、約900アミノ酸
～約1050アミノ酸、約900アミノ酸～約1000アミノ酸、約900アミノ酸～約950アミノ酸、
約950アミノ酸～約1950アミノ酸、約950アミノ酸～約1900アミノ酸、約950アミノ酸～約1
850アミノ酸、約950アミノ酸～約1800アミノ酸、約950アミノ酸～約1750アミノ酸、約950
アミノ酸～約1700アミノ酸、約950アミノ酸～約1650アミノ酸、約950アミノ酸～約1600ア
ミノ酸、約950アミノ酸～約1550アミノ酸、約950アミノ酸～約1500アミノ酸、約950アミ
ノ酸～約1450アミノ酸、約950アミノ酸～約1400アミノ酸、約950アミノ酸～約1350アミノ
酸、約950アミノ酸～約1300アミノ酸、約950アミノ酸～約1250アミノ酸、約950アミノ酸
～約1200アミノ酸、約950アミノ酸～約1150アミノ酸、約950アミノ酸～約1100アミノ酸、
約950アミノ酸～約1050アミノ酸、約950アミノ酸～約1000アミノ酸、約1000アミノ酸～約
1950アミノ酸、約1000アミノ酸～約1900アミノ酸、約1000アミノ酸～約1850アミノ酸、約
1000アミノ酸～約1800アミノ酸、約1000アミノ酸～約1750アミノ酸、約1000アミノ酸～約
1700アミノ酸、約1000アミノ酸～約1650アミノ酸、約1000アミノ酸～約1600アミノ酸、約
1000アミノ酸～約1550アミノ酸、約1000アミノ酸～約1500アミノ酸、約1000アミノ酸～約
1450アミノ酸、約1000アミノ酸～約1400アミノ酸、約1000アミノ酸～約1350アミノ酸、約
1000アミノ酸～約1300アミノ酸、約1000アミノ酸～約1250アミノ酸、約1000アミノ酸～約
1200アミノ酸、約1000アミノ酸～約1150アミノ酸、約1000アミノ酸～約1100アミノ酸、約
1000アミノ酸～約1050アミノ酸、約1050アミノ酸～約1950アミノ酸、約1050アミノ酸～約
1900アミノ酸、約1050アミノ酸～約1850アミノ酸、約1050アミノ酸～約1800アミノ酸、約
1050アミノ酸～約1750アミノ酸、約1050アミノ酸～約1700アミノ酸、約1050アミノ酸～約
1650アミノ酸、約1050アミノ酸～約1600アミノ酸、約1050アミノ酸～約1550アミノ酸、約
1050アミノ酸～約1500アミノ酸、約1050アミノ酸～約1450アミノ酸、約1050アミノ酸～約
1400アミノ酸、約1050アミノ酸～約1350アミノ酸、約1050アミノ酸～約1300アミノ酸、約
1050アミノ酸～約1250アミノ酸、約1050アミノ酸～約1200アミノ酸、約1050アミノ酸～約
1150アミノ酸、約1050アミノ酸～約1100アミノ酸、約1100アミノ酸～約1950アミノ酸、約
1100アミノ酸～約1900アミノ酸、約1100アミノ酸～約1850アミノ酸、約1100アミノ酸～約
1800アミノ酸、約1100アミノ酸～約1750アミノ酸、約1100アミノ酸～約1700アミノ酸、約
1100アミノ酸～約1650アミノ酸、約1100アミノ酸～約1600アミノ酸、約1100アミノ酸～約
1550アミノ酸、約1100アミノ酸～約1500アミノ酸、約1100アミノ酸～約1450アミノ酸、約
1100アミノ酸～約1400アミノ酸、約1100アミノ酸～約1350アミノ酸、約1100アミノ酸～約
1300アミノ酸、約1100アミノ酸～約1250アミノ酸、約1100アミノ酸～約1200アミノ酸、約
1100アミノ酸～約1150アミノ酸、約1150アミノ酸～約1950アミノ酸、約1150アミノ酸～約
1900アミノ酸、約1150アミノ酸～約1850アミノ酸、約1150アミノ酸～約1800アミノ酸、約
1150アミノ酸～約1750アミノ酸、約1150アミノ酸～約1700アミノ酸、約1150アミノ酸～約
1650アミノ酸、約1150アミノ酸～約1600アミノ酸、約1150アミノ酸～約1550アミノ酸、約
1150アミノ酸～約1500アミノ酸、約1150アミノ酸～約1450アミノ酸、約1150アミノ酸～約
1400アミノ酸、約1150アミノ酸～約1350アミノ酸、約1150アミノ酸～約1300アミノ酸、約
1150アミノ酸～約1250アミノ酸、約1150アミノ酸～約1200アミノ酸、約1200アミノ酸～約
1950アミノ酸、約1200アミノ酸～約1900アミノ酸、約1200アミノ酸～約1850アミノ酸、約
1200アミノ酸～約1800アミノ酸、約1200アミノ酸～約1750アミノ酸、約1200アミノ酸～約
1700アミノ酸、約1200アミノ酸～約1650アミノ酸、約1200アミノ酸～約1600アミノ酸、約
1200アミノ酸～約1550アミノ酸、約1200アミノ酸～約1500アミノ酸、約1200アミノ酸～約
1450アミノ酸、約1200アミノ酸～約1400アミノ酸、約1200アミノ酸～約1350アミノ酸、約
1200アミノ酸～約1300アミノ酸、約1200アミノ酸～約1250アミノ酸、約1250アミノ酸～約
1950アミノ酸、約1250アミノ酸～約1900アミノ酸、約1250アミノ酸～約1850アミノ酸、約
1250アミノ酸～約1800アミノ酸、約1250アミノ酸～約1750アミノ酸、約1250アミノ酸～約
1700アミノ酸、約1250アミノ酸～約1650アミノ酸、約1250アミノ酸～約1600アミノ酸、約
1250アミノ酸～約1550アミノ酸、約1250アミノ酸～約1500アミノ酸、約1250アミノ酸～約
1450アミノ酸、約1250アミノ酸～約1400アミノ酸、約1250アミノ酸～約1350アミノ酸、約
1250アミノ酸～約1300アミノ酸、約1300アミノ酸～約1950アミノ酸、約1300アミノ酸～約
1900アミノ酸、約1300アミノ酸～約1850アミノ酸、約1300アミノ酸～約1800アミノ酸、約
1300アミノ酸～約1750アミノ酸、約1300アミノ酸～約1700アミノ酸、約1300アミノ酸～約
1650アミノ酸、約1300アミノ酸～約1600アミノ酸、約1300アミノ酸～約1550アミノ酸、約
1300アミノ酸～約1500アミノ酸、約1300アミノ酸～約1450アミノ酸、約1300アミノ酸～約
1400アミノ酸、約1300アミノ酸～約1350アミノ酸、約1350アミノ酸～約1950アミノ酸、約
1350アミノ酸～約1900アミノ酸、約1350アミノ酸～約1850アミノ酸、約1350アミノ酸～約
1800アミノ酸、約1350アミノ酸～約1750アミノ酸、約1350アミノ酸～約1700アミノ酸、約
1350アミノ酸～約1650アミノ酸、約1350アミノ酸～約1600アミノ酸、約1350アミノ酸～約
1550アミノ酸、約1350アミノ酸～約1500アミノ酸、約1350アミノ酸～約1450アミノ酸、約
1350アミノ酸～約1400アミノ酸、約1400アミノ酸～約1950アミノ酸、約1400アミノ酸～約
1900アミノ酸、約1400アミノ酸～約1850アミノ酸、約1400アミノ酸～約1800アミノ酸、約
1400アミノ酸
～約1750アミノ酸、約1400アミノ酸～約1700アミノ酸、約1400アミノ酸～約1650アミノ酸
、約1400アミノ酸～約1600アミノ酸、約1400アミノ酸～約1550アミノ酸、約1400アミノ酸
～約1500アミノ酸、約1400アミノ酸～約1450アミノ酸、約1450アミノ酸～約1950アミノ酸
、約1450アミノ酸～約1900アミノ酸、約1450アミノ酸～約1850アミノ酸、約1450アミノ酸
～約1800アミノ酸、約1450アミノ酸～約1750アミノ酸、約1450アミノ酸～約1700アミノ酸
、約1450アミノ酸～約1650アミノ酸、約1450アミノ酸～約1600アミノ酸、約1450アミノ酸
～約1550アミノ酸、約1450アミノ酸～約1500アミノ酸、約1500アミノ酸～約1950アミノ酸
、約1500アミノ酸～約1900アミノ酸、約1500アミノ酸～約1850アミノ酸、約1500アミノ酸
～約1800アミノ酸、約1500アミノ酸～約1750アミノ酸、約1500アミノ酸～約1700アミノ酸
、約1500アミノ酸～約1650アミノ酸、約1500アミノ酸～約1600アミノ酸、約1500アミノ酸
～約1550アミノ酸、約1550アミノ酸～約1950アミノ酸、約1550アミノ酸～約1900アミノ酸
、約1550アミノ酸～約1850アミノ酸、約1550アミノ酸～約1800アミノ酸、約1550アミノ酸
～約1750アミノ酸、約1550アミノ酸～約1700アミノ酸、約1550アミノ酸～約1650アミノ酸
、約1550アミノ酸～約1600アミノ酸、約1600アミノ酸～約1950アミノ酸、約1600アミノ酸
～約1900アミノ酸、約1600アミノ酸～約1850アミノ酸、約1600アミノ酸～約1800アミノ酸
、約1600アミノ酸～約1750アミノ酸、約1600アミノ酸～約1700アミノ酸、約1600アミノ酸
～約1650アミノ酸、約1650アミノ酸～約1950アミノ酸、約1650アミノ酸～約1900アミノ酸
、約1650アミノ酸～約1850アミノ酸、約1650アミノ酸～約1800アミノ酸、約1650アミノ酸
～約1750アミノ酸、約1650アミノ酸～約1700アミノ酸、約1700アミノ酸～約1950アミノ酸
、約1700アミノ酸～約1900アミノ酸、約1700アミノ酸～約1850アミノ酸、約1700アミノ酸
～約1800アミノ酸、約1700アミノ酸～約1750アミノ酸、約1750アミノ酸～約1950アミノ酸
、約1750アミノ酸～約1900アミノ酸、約1750アミノ酸～約1850アミノ酸、約1750アミノ酸
～約1800アミノ酸、約1800アミノ酸～約1950アミノ酸、約1800アミノ酸～約1900アミノ酸
、約1800アミノ酸～約1850アミノ酸、約1850アミノ酸～約1950アミノ酸、約1850アミノ酸
～約1900アミノ酸、または約1900アミノ酸～約1950アミノ酸である。
、または6つ）の核酸ベクターを含み、当該少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれは
、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部
分のそれぞれの長さは、少なくとも30アミノ酸（例えば、約30アミノ酸～約1950アミノ酸
、約30アミノ酸～約1900アミノ酸、約30アミノ酸～約1850アミノ酸、約30アミノ酸～約18
00アミノ酸、約30アミノ酸～約1750アミノ酸、約30アミノ酸～約1700アミノ酸、約30アミ
ノ酸～約1650アミノ酸、約30アミノ酸～約1600アミノ酸、約30アミノ酸～約1550アミノ酸
、約30アミノ酸～約1500アミノ酸、約30アミノ酸～約1450アミノ酸、約30アミノ酸～約14
00アミノ酸、約30アミノ酸～約1350アミノ酸、約30アミノ酸～約1300アミノ酸、約30アミ
ノ酸～約1250アミノ酸、約30アミノ酸～約1200アミノ酸、約30アミノ酸～約1150アミノ酸
、約30アミノ酸～約1100アミノ酸、約30アミノ酸～約1050アミノ酸、約30アミノ酸～約10
00アミノ酸、約30アミノ酸～約950アミノ酸、約30アミノ酸～約900アミノ酸、約30アミノ
酸～約850アミノ酸、約30アミノ酸～約800アミノ酸、約30アミノ酸～約750アミノ酸、約3
0アミノ酸～約700アミノ酸、約30アミノ酸～約650アミノ酸、約30アミノ酸～約600アミノ
酸、約30アミノ酸～約550アミノ酸、約30アミノ酸～約500アミノ酸、約30アミノ酸～約45
0アミノ酸、約30アミノ酸～約400アミノ酸、約30アミノ酸～約350アミノ酸、約30アミノ
酸～約300アミノ酸、約30アミノ酸～約250アミノ酸、約30アミノ酸～約200アミノ酸、約3
0アミノ酸～約150アミノ酸、約30アミノ酸～約100アミノ酸、約30アミノ酸～約50アミノ
酸、約50アミノ酸～約1950アミノ酸、約50アミノ酸～約1900アミノ酸、約50アミノ酸～約
1850アミノ酸、約50アミノ酸～約1800アミノ酸、約50アミノ酸～約1750アミノ酸、約50ア
ミノ酸～約1700アミノ酸、約50アミノ酸～約1650アミノ酸、約50アミノ酸～約1600アミノ
酸、約50アミノ酸～約1550アミノ酸、約50アミノ酸～約1500アミノ酸、約50アミノ酸～約
1450アミノ酸、約50アミノ酸～約1400アミノ酸、約50アミノ酸～約1350アミノ酸、約50ア
ミノ酸～約1300アミノ酸、約50アミノ酸～約1250アミノ酸、約50アミノ酸～約1200アミノ
酸、約50アミノ酸～約1150アミノ酸、約50アミノ酸～約1100アミノ酸、約50アミノ酸～約
1050アミノ酸、約50アミノ酸～約1000アミノ酸、約50アミノ酸～約950アミノ酸、約50ア
ミノ酸～約900アミノ酸、約50アミノ酸～約850アミノ酸、約50アミノ酸～約800アミノ酸
、約50アミノ酸～約750アミノ酸、約50アミノ酸～約700アミノ酸、約50アミノ酸～約650
アミノ酸、約50アミノ酸～約600アミノ酸、約50アミノ酸～約550アミノ酸、約50アミノ酸
～約500アミノ酸、約50アミノ酸～約450アミノ酸、約50アミノ酸～約400アミノ酸、約50
アミノ酸～約350アミノ酸、約50アミノ酸～約300アミノ酸、約50アミノ酸～約250アミノ
酸、約50アミノ酸～約200アミノ酸、約50アミノ酸～約150アミノ酸、約50アミノ酸～約10
0アミノ酸、約100アミノ酸～約1950アミノ酸、約100アミノ酸～約1900アミノ酸、約100ア
ミノ酸～約1850アミノ酸、約100アミノ酸～約1800アミノ酸、約100アミノ酸～約1750アミ
ノ酸、約100アミノ酸～約1700アミノ酸、約100アミノ酸～約1650アミノ酸、約100アミノ
酸～約1600アミノ酸、約100アミノ酸～約1550アミノ酸、約100アミノ酸～約1500アミノ酸
、約100アミノ酸～約1450アミノ酸、約100アミノ酸～約1400アミノ酸、約100アミノ酸～
約1350アミノ酸、約100アミノ酸～約1300アミノ酸、約100アミノ酸～約1250アミノ酸、約
100アミノ酸～約1200アミノ酸、約100アミノ酸～約1150アミノ酸、約100アミノ酸～約110
0アミノ酸、約100アミノ酸～約1050アミノ酸、約100アミノ酸～約1000アミノ酸、約100ア
ミノ酸～約950アミノ酸、約100アミノ酸～約900アミノ酸、約100アミノ酸～約850アミノ
酸、約100アミノ酸～約800アミノ酸、約100アミノ酸～約750アミノ酸、約100アミノ酸～
約700アミノ酸、約100アミノ酸～約650アミノ酸、約100アミノ酸～約600アミノ酸、約100
アミノ酸～約550アミノ酸、約100アミノ酸～約500アミノ酸、約100アミノ酸～約450アミ
ノ酸、約100アミノ酸～約400アミノ酸、約100アミノ酸～約350アミノ酸、約100アミノ酸
～約300アミノ酸、約100アミノ酸～約250アミノ酸、約100アミノ酸～約200アミノ酸、約1
00アミノ酸～約150アミノ酸、約150アミノ酸～約1950アミノ酸、約150アミノ酸～約1900
アミノ酸、約150アミノ酸～約1850アミノ酸、約150アミノ酸～約1800アミノ酸、約150ア
ミノ酸～約1750アミノ酸、約150アミノ酸～約1700アミノ酸、約150アミノ酸～約1650アミ
ノ酸、約150アミノ酸～約1600アミノ酸、約150アミノ酸～約1550アミノ酸、約150アミノ
酸～約1500アミノ酸、約150アミノ酸～約1450アミノ酸、約150アミノ酸～約1400アミノ酸
、約150アミノ酸～約1350アミノ酸、約150アミノ酸～約1300アミノ酸、約150アミノ酸～
約1250アミノ酸、約150アミノ酸～約1200アミノ酸、約150アミノ酸～約1150アミノ酸、約
150アミノ酸～約1100アミノ酸、約150アミノ酸～約1050アミノ酸、約150アミノ酸～約100
0アミノ酸、約150アミノ酸～約950アミノ酸、約150アミノ酸～約900アミノ酸、約150アミ
ノ酸～約850アミノ酸、約150アミノ酸～約800アミノ酸、約150アミノ酸～約750アミノ酸
、約150アミノ酸～約700アミノ酸、約150アミノ酸～約650アミノ酸、約150アミノ酸～約6
00アミノ酸、約150アミノ酸～約550アミノ酸、約150アミノ酸～約500アミノ酸、約150ア
ミノ酸～約450アミノ酸、約150アミノ酸～約400アミノ酸、約150アミノ酸～約350アミノ
酸、約150アミノ酸～約300アミノ酸、約150アミノ酸～約250アミノ酸、約150アミノ酸～
約200アミノ酸、約200アミノ酸～約1950アミノ酸、約200アミノ酸～約1900アミノ酸、約2
00アミノ酸～約1850アミノ酸、約200アミノ酸～約1800アミノ酸、約200アミノ酸～約1750
アミノ酸、約200アミノ酸～約1700アミノ酸、約200アミノ酸～約1650アミノ酸、約200ア
ミノ酸～約1600アミノ酸、約200アミノ酸～約1550アミノ酸、約200アミノ酸～約1500アミ
ノ酸、約200アミノ酸～約1450アミノ酸、約200アミノ酸～約1400アミノ酸、約200アミノ
酸～約1350アミノ酸、約200アミノ酸～約1300アミノ酸、約200アミノ酸～約1250アミノ酸
、約200アミノ酸～約1200アミノ酸、約200アミノ酸～約1150アミノ酸、約200アミノ酸～
約1100アミノ酸、約200アミノ酸～約1050アミノ酸、約200アミノ酸～約1000アミノ酸、約
200アミノ酸～約950アミノ酸、約200アミノ酸～約900アミノ酸、約200アミノ酸～約850ア
ミノ酸、約200アミノ酸～約800アミノ酸、約200アミノ酸～約750アミノ酸、約200アミノ
酸～約700アミノ酸、約200アミノ酸～約650アミノ酸、約200アミノ酸～約600アミノ酸、
約200アミノ酸～約550アミノ酸、約200アミノ酸～約500アミノ酸、約200アミノ酸～約450
アミノ酸、約200アミノ酸～約400アミノ酸、約200アミノ酸～約350アミノ酸、約200アミ
ノ酸～約300アミノ酸、約200アミノ酸～約250アミノ酸、約250アミノ酸～約1950アミノ酸
、約250アミノ酸～約1900アミノ酸、約250アミノ酸～約1850アミノ酸、約250アミノ酸～
約1800アミノ酸、約250アミノ酸～約1750アミノ酸、約250アミノ酸～約1700アミノ酸、約
250アミノ酸～約1650アミノ酸、約250アミノ酸～約1600アミノ酸、約250アミノ酸～約155
0アミノ酸、約250アミノ酸～約1500アミノ酸、約250アミノ酸～約1450アミノ酸、約250ア
ミノ酸～約1400アミノ酸、約250アミノ酸～約1350アミノ酸、約250アミノ酸～約1300アミ
ノ酸、約250アミノ酸～約1250アミノ酸、約250アミノ酸～約1200アミノ酸、約250アミノ
酸～約1150アミノ酸、約250アミノ酸～約1100アミノ酸、約250アミノ酸～約1050アミノ酸
、約250アミノ酸～約1000アミノ酸、約250アミノ酸～約950アミノ酸、約250アミノ酸～約
900アミノ酸、約250アミノ酸～約850アミノ酸、約250アミノ酸～約800アミノ酸、約250ア
ミノ酸～約750アミノ酸、約250アミノ酸～約700アミノ酸、約250アミノ酸～約650アミノ
酸、約250アミノ酸～約600アミノ酸、約250アミノ酸～約550アミノ酸、約250アミノ酸～
約500アミノ酸、約250アミノ酸～約450アミノ酸、約250アミノ酸～約400アミノ酸、約250
アミノ酸～約350アミノ酸、約250アミノ酸～約300アミノ酸、約300アミノ酸～約1950アミ
ノ酸、約300アミノ酸～約1900アミノ酸、約300アミノ酸～約1850アミノ酸、約300アミノ
酸～約1800アミノ酸、約300アミノ酸～約1750アミノ酸、約300アミノ酸～約1700アミノ酸
、約300アミノ酸～約1650アミノ酸、約300アミノ酸～約1600アミノ酸、約300アミノ酸～
約1550アミノ酸、約300アミノ酸～約1500アミノ酸、約300アミノ酸～約1450アミノ酸、約
300アミノ酸～約1400アミノ酸、約300アミノ酸～約1350アミノ酸、約300アミノ酸～約130
0アミノ酸、約300アミノ酸～約1250アミノ酸、約300アミノ酸～約1200アミノ酸、約300ア
ミノ酸～約1150アミノ酸、約300アミノ酸～約1100アミノ酸、約300アミノ酸～約1050アミ
ノ酸、約300アミノ酸～約1000アミノ酸、約300アミノ酸～約950アミノ酸、約300アミノ酸
～約900アミノ酸、約300アミノ酸～約850アミノ酸、約300アミノ酸～約800アミノ酸、約3
00アミノ酸～約750アミノ酸、約300アミノ酸～約700アミノ酸、約300アミノ酸～約650ア
ミノ酸、約300アミノ酸～約600アミノ酸、約300アミノ酸～約550アミノ酸、約300アミノ
酸～約500アミノ酸、約300アミノ酸～約450アミノ酸、約300アミノ酸～約400アミノ酸、
約300アミノ酸～約350アミノ酸、約350アミノ酸～約1950アミノ酸、約350アミノ酸～約19
00アミノ酸、約350アミノ酸～約1850アミノ酸、約350アミノ酸～約1800アミノ酸、約350
アミノ酸～約1750アミノ酸、約350アミノ酸～約1700アミノ酸、約350アミノ酸～約1650ア
ミノ酸、約350アミノ酸～約1600アミノ酸、約350アミノ酸～約1550アミノ酸、約350アミ
ノ酸～約1500アミノ酸、約350アミノ酸～約1450アミノ酸、約350アミノ酸～約1400アミノ
酸、約350アミノ酸～約1350アミノ酸、約350アミノ酸～約1300アミノ酸、約350アミノ酸
～約1250アミノ酸、約350アミノ酸～約1200アミノ酸、約350アミノ酸～約1150アミノ酸、
約350アミノ酸～約1100アミノ酸、約350アミノ酸～約1050アミノ酸、約350アミノ酸～約1
000アミノ酸、約350アミノ酸～約950アミノ酸、約350アミノ酸～約900アミノ酸、約350ア
ミノ酸～約850アミノ酸、約350アミノ酸～約800アミノ酸、約350アミノ酸～約750アミノ
酸、約350アミノ酸～約700アミノ酸、約350アミノ酸～約650アミノ酸、約350アミノ酸～
約600アミノ酸、約350アミノ酸～約550アミノ酸、約350アミノ酸～約500アミノ酸、約350
アミノ酸～約450アミノ酸、約350アミノ酸～約400アミノ酸、約400アミノ酸～約1950アミ
ノ酸、約400アミノ酸～約1900アミノ酸、約400アミノ酸～約1850アミノ酸、約400アミノ
酸～約1800アミノ酸、約400アミノ酸～約1750アミノ酸、約400アミノ酸～約1700アミノ酸
、約400アミノ酸～約1650アミノ酸、約400アミノ酸～約1600アミノ酸、約400アミノ酸～
約1550アミノ酸、約400アミノ酸～約1500アミノ酸、約400アミノ酸～約1450アミノ酸、約
400アミノ酸～約1400アミノ酸、約400アミノ酸～約1350アミノ酸、約400アミノ酸～約130
0アミノ酸、約400アミノ酸～約1250アミノ酸、約400アミノ酸～約1200アミノ酸、約400ア
ミノ酸～約1150アミノ酸、約400アミノ酸～約1100アミノ酸、約400アミノ酸～約1050アミ
ノ酸、約400アミノ酸～約1000アミノ酸、約400アミノ酸～約950アミノ酸、約400アミノ酸
～約900アミノ酸、約400アミノ酸～約850アミノ酸、約400アミノ酸～約800アミノ酸、約4
00アミノ酸～約750アミノ酸、約400アミノ酸～約700アミノ酸、約400アミノ酸～約650ア
ミノ酸、約400アミノ酸～約600アミノ酸、約400アミノ酸～約550アミノ酸、約400アミノ
酸～約500アミノ酸、約400アミノ酸～約450アミノ酸、約450アミノ酸～約1950アミノ酸、
約450アミノ酸～約1900アミノ酸、約450アミノ酸～約1850アミノ酸、約450アミノ酸～約1
800アミノ酸、約450アミノ酸～約1750アミノ酸、約450アミノ酸～約1700アミノ酸、約450
アミノ酸～約1650アミノ酸、約450アミノ酸～約1600アミノ酸、約450アミノ酸～約1550ア
ミノ酸、約450アミノ酸～約1500アミノ酸、約450アミノ酸～約1450アミノ酸、約450アミ
ノ酸～約1400アミノ酸、約450アミノ酸～約1350アミノ
酸、約450アミノ酸～約1300アミノ酸、約450アミノ酸～約1250アミノ酸、約450アミノ酸
～約1200アミノ酸、約450アミノ酸～約1150アミノ酸、約450アミノ酸～約1100アミノ酸、
約450アミノ酸～約1050アミノ酸、約450アミノ酸～約1000アミノ酸、約450アミノ酸～約9
50アミノ酸、約450アミノ酸～約900アミノ酸、約450アミノ酸～約850アミノ酸、約450ア
ミノ酸～約800アミノ酸、約450アミノ酸～約750アミノ酸、約450アミノ酸～約700アミノ
酸、約450アミノ酸～約650アミノ酸、約450アミノ酸～約600アミノ酸、約450アミノ酸～
約550アミノ酸、約450アミノ酸～約500アミノ酸、約500アミノ酸～約1950アミノ酸、約50
0アミノ酸～約1900アミノ酸、約500アミノ酸～約1850アミノ酸、約500アミノ酸～約1800
アミノ酸、約500アミノ酸～約1750アミノ酸、約500アミノ酸～約1700アミノ酸、約500ア
ミノ酸～約1650アミノ酸、約500アミノ酸～約1600アミノ酸、約500アミノ酸～約1550アミ
ノ酸、約500アミノ酸～約1500アミノ酸、約500アミノ酸～約1450アミノ酸、約500アミノ
酸～約1400アミノ酸、約500アミノ酸～約1350アミノ酸、約500アミノ酸～約1300アミノ酸
、約500アミノ酸～約1250アミノ酸、約500アミノ酸～約1200アミノ酸、約500アミノ酸～
約1150アミノ酸、約500アミノ酸～約1100アミノ酸、約500アミノ酸～約1050アミノ酸、約
500アミノ酸～約1000アミノ酸、約500アミノ酸～約950アミノ酸、約500アミノ酸～約900
アミノ酸、約500アミノ酸～約850アミノ酸、約500アミノ酸～約800アミノ酸、約500アミ
ノ酸～約750アミノ酸、約500アミノ酸～約700アミノ酸、約500アミノ酸～約650アミノ酸
、約500アミノ酸～約600アミノ酸、約500アミノ酸～約550アミノ酸、約550アミノ酸～約1
950アミノ酸、約550アミノ酸～約1900アミノ酸、約550アミノ酸～約1850アミノ酸、約550
アミノ酸～約1800アミノ酸、約550アミノ酸～約1750アミノ酸、約550アミノ酸～約1700ア
ミノ酸、約550アミノ酸～約1650アミノ酸、約550アミノ酸～約1600アミノ酸、約550アミ
ノ酸～約1550アミノ酸、約550アミノ酸～約1500アミノ酸、約550アミノ酸～約1450アミノ
酸、約550アミノ酸～約1400アミノ酸、約550アミノ酸～約1350アミノ酸、約550アミノ酸
～約1300アミノ酸、約550アミノ酸～約1250アミノ酸、約550アミノ酸～約1200アミノ酸、
約550アミノ酸～約1150アミノ酸、約550アミノ酸～約1100アミノ酸、約550アミノ酸～約1
050アミノ酸、約550アミノ酸～約1000アミノ酸、約550アミノ酸～約950アミノ酸、約550
アミノ酸～約900アミノ酸、約550アミノ酸～約850アミノ酸、約550アミノ酸～約800アミ
ノ酸、約550アミノ酸～約750アミノ酸、約550アミノ酸～約700アミノ酸、約550アミノ酸
～約650アミノ酸、約550アミノ酸～約600アミノ酸、約600アミノ酸～約1950アミノ酸、約
600アミノ酸～約1900アミノ酸、約600アミノ酸～約1850アミノ酸、約600アミノ酸～約180
0アミノ酸、約600アミノ酸～約1750アミノ酸、約600アミノ酸～約1700アミノ酸、約600ア
ミノ酸～約1650アミノ酸、約600アミノ酸～約1600アミノ酸、約600アミノ酸～約1550アミ
ノ酸、約600アミノ酸～約1500アミノ酸、約600アミノ酸～約1450アミノ酸、約600アミノ
酸～約1400アミノ酸、約600アミノ酸～約1350アミノ酸、約600アミノ酸～約1300アミノ酸
、約600アミノ酸～約1250アミノ酸、約600アミノ酸～約1200アミノ酸、約600アミノ酸～
約1150アミノ酸、約600アミノ酸～約1100アミノ酸、約600アミノ酸～約1050アミノ酸、約
600アミノ酸～約1000アミノ酸、約600アミノ酸～約950アミノ酸、約600アミノ酸～約900
アミノ酸、約600アミノ酸～約850アミノ酸、約600アミノ酸～約800アミノ酸、約600アミ
ノ酸～約750アミノ酸、約600アミノ酸～約700アミノ酸、約600アミノ酸～約650アミノ酸
、約650アミノ酸～約1950アミノ酸、約650アミノ酸～約1900アミノ酸、約650アミノ酸～
約1850アミノ酸、約650アミノ酸～約1800アミノ酸、約650アミノ酸～約1750アミノ酸、約
650アミノ酸～約1700アミノ酸、約650アミノ酸～約1650アミノ酸、約650アミノ酸～約160
0アミノ酸、約650アミノ酸～約1550アミノ酸、約650アミノ酸～約1500アミノ酸、約650ア
ミノ酸～約1450アミノ酸、約650アミノ酸～約1400アミノ酸、約650アミノ酸～約1350アミ
ノ酸、約650アミノ酸～約1300アミノ酸、約650アミノ酸～約1250アミノ酸、約650アミノ
酸～約1200アミノ酸、約650アミノ酸～約1150アミノ酸、約650アミノ酸～約1100アミノ酸
、約650アミノ酸～約1050アミノ酸、約650アミノ酸～約1000アミノ酸、約650アミノ酸～
約950アミノ酸、約650アミノ酸～約900アミノ酸、約650アミノ酸～約850アミノ酸、約650
アミノ酸～約800アミノ酸、約650アミノ酸～約750アミノ酸、約650アミノ酸～約700アミ
ノ酸、約700アミノ酸～約1950アミノ酸、約700アミノ酸～約1900アミノ酸、約700アミノ
酸～約1850アミノ酸、約700アミノ酸～約1800アミノ酸、約700アミノ酸～約1750アミノ酸
、約700アミノ酸～約1700アミノ酸、約700アミノ酸～約1650アミノ酸、約700アミノ酸～
約1600アミノ酸、約700アミノ酸～約1550アミノ酸、約700アミノ酸～約1500アミノ酸、約
700アミノ酸～約1450アミノ酸、約700アミノ酸～約1400アミノ酸、約700アミノ酸～約135
0アミノ酸、約700アミノ酸～約1300アミノ酸、約700アミノ酸～約1250アミノ酸、約700ア
ミノ酸～約1200アミノ酸、約700アミノ酸～約1150アミノ酸、約700アミノ酸～約1100アミ
ノ酸、約700アミノ酸～約1050アミノ酸、約700アミノ酸～約1000アミノ酸、約700アミノ
酸～約950アミノ酸、約700アミノ酸～約900アミノ酸、約700アミノ酸～約850アミノ酸、
約700アミノ酸～約800アミノ酸、約700アミノ酸～約750アミノ酸、約750アミノ酸～約195
0アミノ酸、約750アミノ酸～約1900アミノ酸、約750アミノ酸～約1850アミノ酸、約750ア
ミノ酸～約1800アミノ酸、約750アミノ酸～約1750アミノ酸、約750アミノ酸～約1700アミ
ノ酸、約750アミノ酸～約1650アミノ酸、約750アミノ酸～約1600アミノ酸、約750アミノ
酸～約1550アミノ酸、約750アミノ酸～約1500アミノ酸、約750アミノ酸～約1450アミノ酸
、約750アミノ酸～約1400アミノ酸、約750アミノ酸～約1350アミノ酸、約750アミノ酸～
約1250アミノ酸、約750アミノ酸～約1200アミノ酸、約750アミノ酸～約1150アミノ酸、約
750アミノ酸～約1100アミノ酸、約750アミノ酸～約1050アミノ酸、約750アミノ酸～約100
0アミノ酸、約750アミノ酸～約950アミノ酸、約750アミノ酸～約900アミノ酸、約750アミ
ノ酸～約850アミノ酸、約750アミノ酸～約800アミノ酸、約800アミノ酸～約1950アミノ酸
、約800アミノ酸～約1900アミノ酸、約800アミノ酸～約1850アミノ酸、約800アミノ酸～
約1800アミノ酸、約800アミノ酸～約1750アミノ酸、約800アミノ酸～約1700アミノ酸、約
800アミノ酸～約1650アミノ酸、約800アミノ酸～約1600アミノ酸、約800アミノ酸～約155
0アミノ酸、約800アミノ酸～約1500アミノ酸、約800アミノ酸～約1450アミノ酸、約800ア
ミノ酸～約1400アミノ酸、約800アミノ酸～約1350アミノ酸、約800アミノ酸～約1300アミ
ノ酸、約800アミノ酸～約1250アミノ酸、約800アミノ酸～約1200アミノ酸、約800アミノ
酸～約1150アミノ酸、約800アミノ酸～約1100アミノ酸、約800アミノ酸～約1050アミノ酸
、約800アミノ酸～約1000アミノ酸、約800アミノ酸～約950アミノ酸、約800アミノ酸～約
900アミノ酸、約800アミノ酸～約850アミノ酸、約850アミノ酸～約1950アミノ酸、約850
アミノ酸～約1900アミノ酸、約850アミノ酸～約1850アミノ酸、約850アミノ酸～約1800ア
ミノ酸、約850アミノ酸～約1750アミノ酸、約850アミノ酸～約1700アミノ酸、約850アミ
ノ酸～約1650アミノ酸、約850アミノ酸～約1600アミノ酸、約850アミノ酸～約1550アミノ
酸、約850アミノ酸～約1500アミノ酸、約850アミノ酸～約1450アミノ酸、約850アミノ酸
～約1400アミノ酸、約850アミノ酸～約1350アミノ酸、約850アミノ酸～約1300アミノ酸、
約850アミノ酸～約1250アミノ酸、約850アミノ酸～約1200アミノ酸、約850アミノ酸～約1
150アミノ酸、約850アミノ酸～約1100アミノ酸、約850アミノ酸～約1050アミノ酸、約850
アミノ酸～約1000アミノ酸、約850アミノ酸～約950アミノ酸、約850アミノ酸～約900アミ
ノ酸、約900アミノ酸～約1950アミノ酸、約900アミノ酸～約1900アミノ酸、約900アミノ
酸～約1850アミノ酸、約900アミノ酸～約1800アミノ酸、約900アミノ酸～約1750アミノ酸
、約900アミノ酸～約1700アミノ酸、約900アミノ酸～約1650アミノ酸、約900アミノ酸～
約1600アミノ酸、約900アミノ酸～約1550アミノ酸、約900アミノ酸～約1500アミノ酸、約
900アミノ酸～約1450アミノ酸、約900アミノ酸～約1400アミノ酸、約900アミノ酸～約135
0アミノ酸、約900アミノ酸～約1300アミノ酸、約900アミノ酸～約1250アミノ酸、約900ア
ミノ酸～約1200アミノ酸、約900アミノ酸～約1150アミノ酸、約900アミノ酸～約1100アミ
ノ酸、約900アミノ酸～約1050アミノ酸、約900アミノ酸～約1000アミノ酸、約900アミノ
酸～約950アミノ酸、約950アミノ酸～約1950アミノ酸、約950アミノ酸～約1900アミノ酸
、約950アミノ酸～約1850アミノ酸、約950アミノ酸～約1800アミノ酸、約950アミノ酸～
約1750アミノ酸、約950アミノ酸～約1700アミノ酸、約950アミノ酸～約1650アミノ酸、約
950アミノ酸～約1600アミノ酸、約950アミノ酸～約1550アミノ酸、約950アミノ酸～約150
0アミノ酸、約950アミノ酸～約1450アミノ酸、約950アミノ酸～約1400アミノ酸、約950ア
ミノ酸～約1350アミノ酸、約950アミノ酸～約1300アミノ酸、約950アミノ酸～約1250アミ
ノ酸、約950アミノ酸～約1200アミノ酸、約950アミノ酸～約1150アミノ酸、約950アミノ
酸～約1100アミノ酸、約950アミノ酸～約1050アミノ酸、約950アミノ酸～約1000アミノ酸
、約1000アミノ酸～約1950アミノ酸、約1000アミノ酸～約1900アミノ酸、約1000アミノ酸
～約1850アミノ酸、約1000アミノ酸～約1800アミノ酸、約1000アミノ酸～約1750アミノ酸
、約1000アミノ酸～約1700アミノ酸、約1000アミノ酸～約1650アミノ酸、約1000アミノ酸
～約1600アミノ酸、約1000アミノ酸～約1550アミノ酸、約1000アミノ酸～約1500アミノ酸
、約1000アミノ酸～約1450アミノ酸、約1000アミノ酸～約1400アミノ酸、約1000アミノ酸
～約1350アミノ酸、約1000アミノ酸～約1300アミノ酸、約1000アミノ酸～約1250アミノ酸
、約1000アミノ酸～約1200アミノ酸、約1000アミノ酸～約1150アミノ酸、約1000アミノ酸
～約1100アミノ酸、約1000アミノ酸～約1050アミノ酸、約1050アミノ酸～約1950アミノ酸
、約1050アミノ酸～約1900アミノ酸、約1050アミノ酸～約1850アミノ酸、約1050アミノ酸
～約1800アミノ酸、約1050アミノ酸～約1750アミノ酸、約1050アミノ酸～約1700アミノ酸
、約1050アミノ酸～約1650アミノ酸、約1050アミノ酸～約1600アミノ酸、約1050アミノ酸
～約1550アミノ酸、約1050アミノ酸～約1500アミノ酸、約1050アミノ酸～約1450アミノ酸
、約1050アミノ酸～約1400アミノ酸、約1050アミノ酸～約1350アミノ酸、約1050アミノ酸
～約1300アミノ酸、約1050アミノ酸～約1250アミノ酸、約1050アミノ酸～約1200アミノ酸
、約1050アミノ酸～約1150アミノ酸、約1050アミノ酸～約1100アミノ酸、約1100アミノ酸
～約1950アミノ酸、約1100アミノ酸～約1900アミノ酸、約1100アミノ酸～約1850アミノ酸
、約1100アミノ酸～約1800アミノ酸、約1100アミノ酸～約1750アミノ酸、約1100アミノ酸
～約1700アミノ酸、約1100アミノ酸～約1650アミノ酸、約1100アミノ酸～約1600アミノ酸
、約1100アミノ酸～約1550アミノ酸、約1100アミノ酸～約1500アミノ酸、約1100アミノ酸
～約1450アミノ酸、約1100アミノ酸～約1400アミノ酸、約1100アミノ酸～約1350アミノ酸
、約1100アミノ酸～約1300アミノ酸、約1100アミノ酸～約1250アミノ酸、約1100アミノ酸
～約1200アミノ酸、約1100アミノ酸～約1150アミノ酸、約1150アミノ酸～約1950アミノ酸
、約1150アミノ酸～約1900アミノ酸、約1150アミノ酸～約1850アミノ酸、約1150アミノ酸
～約1800アミノ酸、約1150アミノ酸～約1750アミノ酸、約1150アミノ酸～約1700アミノ酸
、約1150アミノ酸～約1650アミノ酸、約1150アミノ酸～約1600アミノ酸、約1150アミノ酸
～約1550アミノ酸、約1150アミノ酸～約1500アミノ酸、約1150アミノ酸～約1450アミノ酸
、約1150アミノ酸～約1400アミノ酸、約1150アミノ酸～約1350アミノ酸、約1150アミノ酸
～約1300アミノ酸、約1150アミノ酸～約1250アミ
ノ酸、約1150アミノ酸～約1200アミノ酸、約1200アミノ酸～約1950アミノ酸、約1200アミ
ノ酸～約1900アミノ酸、約1200アミノ酸～約1850アミノ酸、約1200アミノ酸～約1800アミ
ノ酸、約1200アミノ酸～約1750アミノ酸、約1200アミノ酸～約1700アミノ酸、約1200アミ
ノ酸～約1650アミノ酸、約1200アミノ酸～約1600アミノ酸、約1200アミノ酸～約1550アミ
ノ酸、約1200アミノ酸～約1500アミノ酸、約1200アミノ酸～約1450アミノ酸、約1200アミ
ノ酸～約1400アミノ酸、約1200アミノ酸～約1350アミノ酸、約1200アミノ酸～約1300アミ
ノ酸、約1200アミノ酸～約1250アミノ酸、約1250アミノ酸～約1950アミノ酸、約1250アミ
ノ酸～約1900アミノ酸、約1250アミノ酸～約1850アミノ酸、約1250アミノ酸～約1800アミ
ノ酸、約1250アミノ酸～約1750アミノ酸、約1250アミノ酸～約1700アミノ酸、約1250アミ
ノ酸～約1650アミノ酸、約1250アミノ酸～約1600アミノ酸、約1250アミノ酸～約1550アミ
ノ酸、約1250アミノ酸～約1500アミノ酸、約1250アミノ酸～約1450アミノ酸、約1250アミ
ノ酸～約1400アミノ酸、約1250アミノ酸～約1350アミノ酸、約1250アミノ酸～約1300アミ
ノ酸、約1300アミノ酸～約1950アミノ酸、約1300アミノ酸～約1900アミノ酸、約1300アミ
ノ酸～約1850アミノ酸、約1300アミノ酸～約1800アミノ酸、約1300アミノ酸～約1750アミ
ノ酸、約1300アミノ酸～約1700アミノ酸、約1300アミノ酸～約1650アミノ酸、約1300アミ
ノ酸～約1600アミノ酸、約1300アミノ酸～約1550アミノ酸、約1300アミノ酸～約1500アミ
ノ酸、約1300アミノ酸～約1450アミノ酸、約1300アミノ酸～約1400アミノ酸、約1300アミ
ノ酸～約1350アミノ酸、約1350アミノ酸～約1950アミノ酸、約1350アミノ酸～約1900アミ
ノ酸、約1350アミノ酸～約1850アミノ酸、約1350アミノ酸～約1800アミノ酸、約1350アミ
ノ酸～約1750アミノ酸、約1350アミノ酸～約1700アミノ酸、約1350アミノ酸～約1650アミ
ノ酸、約1350アミノ酸～約1600アミノ酸、約1350アミノ酸～約1550アミノ酸、約1350アミ
ノ酸～約1500アミノ酸、約1350アミノ酸～約1450アミノ酸、約1350アミノ酸～約1400アミ
ノ酸、約1400アミノ酸～約1950アミノ酸、約1400アミノ酸～約1900アミノ酸、約1400アミ
ノ酸～約1850アミノ酸、約1400アミノ酸～約1800アミノ酸、約1400アミノ酸～約1750アミ
ノ酸、約1400アミノ酸～約1700アミノ酸、約1400アミノ酸～約1650アミノ酸、約1400アミ
ノ酸～約1600アミノ酸、約1400アミノ酸～約1550アミノ酸、約1400アミノ酸～約1500アミ
ノ酸、約1400アミノ酸～約1450アミノ酸、約1450アミノ酸～約1950アミノ酸、約1450アミ
ノ酸～約1900アミノ酸、約1450アミノ酸～約1850アミノ酸、約1450アミノ酸～約1800アミ
ノ酸、約1450アミノ酸～約1750アミノ酸、約1450アミノ酸～約1700アミノ酸、約1450アミ
ノ酸～約1650アミノ酸、約1450アミノ酸～約1600アミノ酸、約1450アミノ酸～約1550アミ
ノ酸、約1450アミノ酸～約1500アミノ酸、約1600アミノ酸～約1950アミノ酸、約1600アミ
ノ酸～約1900アミノ酸、約1600アミノ酸～約1850アミノ酸、約1600アミノ酸～約1800アミ
ノ酸、約1600アミノ酸～約1750アミノ酸、約1600アミノ酸～約1700アミノ酸、約1600アミ
ノ酸～約1650アミノ酸、約1500アミノ酸～約1950アミノ酸、約1500アミノ酸～約1900アミ
ノ酸、約1500アミノ酸～約1850アミノ酸、約1500アミノ酸～約1800アミノ酸、約1500アミ
ノ酸～約1750アミノ酸、約1500アミノ酸～約1700アミノ酸、約1500アミノ酸～約1650アミ
ノ酸、約1500アミノ酸～約1600アミノ酸、約1500アミノ酸～約1550アミノ酸、約1550アミ
ノ酸～約1950アミノ酸、約1550アミノ酸～約1900アミノ酸、約1550アミノ酸～約1850アミ
ノ酸、約1550アミノ酸～約1800アミノ酸、約1550アミノ酸～約1750アミノ酸、約1550アミ
ノ酸～約1700アミノ酸、約1550アミノ酸～約1650アミノ酸、約1550アミノ酸～約1600アミ
ノ酸、約1600アミノ酸～約1950アミノ酸、約1600アミノ酸～約1900アミノ酸、約1600アミ
ノ酸～約1850アミノ酸、約1600アミノ酸～約1800アミノ酸、約1600アミノ酸～約1750アミ
ノ酸、約1600アミノ酸～約1700アミノ酸、約1600アミノ酸～約1650アミノ酸、約1650アミ
ノ酸～約1950アミノ酸、約1650アミノ酸～約1900アミノ酸、約1650アミノ酸～約1850アミ
ノ酸、約1650アミノ酸～約1800アミノ酸、約1650アミノ酸～約1750アミノ酸、約1650アミ
ノ酸～約1700アミノ酸、約1700アミノ酸～約1950アミノ酸、約1700アミノ酸～約1900アミ
ノ酸、約1700アミノ酸～約1850アミノ酸、約1700アミノ酸～約1800アミノ酸、約1700アミ
ノ酸～約1750アミノ酸、約1750アミノ酸～約1950アミノ酸、約1750アミノ酸～約1900アミ
ノ酸、約1750アミノ酸～約1850アミノ酸、約1750アミノ酸～約1800アミノ酸、約1800アミ
ノ酸～約1950アミノ酸、約1800アミノ酸～約1900アミノ酸、約1800アミノ酸～約1850アミ
ノ酸、約1850アミノ酸～約1950アミノ酸、約1850アミノ酸～約1900アミノ酸、約1900アミ
ノ酸～約1950アミノ酸）であり、コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列は、任意で
、当該コードされる部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と部分的に重複してもよく；
当該少なくとも2つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、活性オトフェ
リンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質（例えば、全長野生型オトフェリ
ンタンパク質））をコードしておらず；かつ当該少なくとも2つの異なるベクターは、染
色体DNAを含む哺乳動物細胞に導入されると、相互におよび細胞の染色体DNAとの相同組換
えを受け、それによって、染色体DNAに挿入された、活性オトフェリンタンパク質（例え
ば、全長オトフェリンタンパク質）をコードする組換え核酸が形成される。いくつかの態
様において、核酸ベクターのうち1つは、オトフェリンタンパク質の一部分をコードする
コード配列を含むことができ、当該コードされる部分の長さは、例えば、約900アミノ酸
～約1950アミノ酸、約900アミノ酸～約1900アミノ酸、約900アミノ酸～約1850アミノ酸、
約900アミノ酸～約1800アミノ酸、約900アミノ酸～約1750アミノ酸、約900アミノ酸～約1
700アミノ酸、約900アミノ酸～約1650アミノ酸、約900アミノ酸～約1600アミノ酸、約900
アミノ酸～約1550アミノ酸、約900アミノ酸～約1500アミノ酸、約900アミノ酸～約1450ア
ミノ酸、約900アミノ酸～約1400アミノ酸、約900アミノ酸～約1350アミノ酸、約900アミ
ノ酸～約1300アミノ酸、約900アミノ酸～約1250アミノ酸、約900アミノ酸～約1200アミノ
酸、約900アミノ酸～約1150アミノ酸、約900アミノ酸～約1100アミノ酸、約900アミノ酸
～約1050アミノ酸、約900アミノ酸～約1000アミノ酸、約900アミノ酸～約950アミノ酸、
約950アミノ酸～約1950アミノ酸、約950アミノ酸～約1900アミノ酸、約950アミノ酸～約1
850アミノ酸、約950アミノ酸～約1800アミノ酸、約950アミノ酸～約1750アミノ酸、約950
アミノ酸～約1700アミノ酸、約950アミノ酸～約1650アミノ酸、約950アミノ酸～約1600ア
ミノ酸、約950アミノ酸～約1550アミノ酸、約950アミノ酸～約1500アミノ酸、約950アミ
ノ酸～約1450アミノ酸、約950アミノ酸～約1400アミノ酸、約950アミノ酸～約1350アミノ
酸、約950アミノ酸～約1300アミノ酸、約950アミノ酸～約1250アミノ酸、約950アミノ酸
～約1200アミノ酸、約950アミノ酸～約1150アミノ酸、約950アミノ酸～約1100アミノ酸、
約950アミノ酸～約1050アミノ酸、約950アミノ酸～約1000アミノ酸、約1000アミノ酸～約
1950アミノ酸、約1000アミノ酸～約1900アミノ酸、約1000アミノ酸～約1850アミノ酸、約
1000アミノ酸～約1800アミノ酸、約1000アミノ酸～約1750アミノ酸、約1000アミノ酸～約
1700アミノ酸、約1000アミノ酸～約1650アミノ酸、約1000アミノ酸～約1600アミノ酸、約
1000アミノ酸～約1550アミノ酸、約1000アミノ酸～約1500アミノ酸、約1000アミノ酸～約
1450アミノ酸、約1000アミノ酸～約1400アミノ酸、約1000アミノ酸～約1350アミノ酸、約
1000アミノ酸～約1300アミノ酸、約1000アミノ酸～約1250アミノ酸、約1000アミノ酸～約
1200アミノ酸、約1000アミノ酸～約1150アミノ酸、約1000アミノ酸～約1100アミノ酸、約
1000アミノ酸～約1050アミノ酸、約1050アミノ酸～約1950アミノ酸、約1050アミノ酸～約
1900アミノ酸、約1050アミノ酸～約1850アミノ酸、約1050アミノ酸～約1800アミノ酸、約
1050アミノ酸～約1750アミノ酸、約1050アミノ酸～約1700アミノ酸、約1050アミノ酸～約
1650アミノ酸、約1050アミノ酸～約1600アミノ酸、約1050アミノ酸～約1550アミノ酸、約
1050アミノ酸～約1500アミノ酸、約1050アミノ酸～約1450アミノ酸、約1050アミノ酸～約
1400アミノ酸、約1050アミノ酸～約1350アミノ酸、約1050アミノ酸～約1300アミノ酸、約
1050アミノ酸～約1250アミノ酸、約1050アミノ酸～約1200アミノ酸、約1050アミノ酸～約
1150アミノ酸、約1050アミノ酸～約1100アミノ酸、約1100アミノ酸～約1950アミノ酸、約
1100アミノ酸～約1900アミノ酸、約1100アミノ酸～約1850アミノ酸、約1100アミノ酸～約
1800アミノ酸、約1100アミノ酸～約1750アミノ酸、約1100アミノ酸～約1700アミノ酸、約
1100アミノ酸～約1650アミノ酸、約1100アミノ酸～約1600アミノ酸、約1100アミノ酸～約
1550アミノ酸、約1100アミノ酸～約1500アミノ酸、約1100アミノ酸～約1450アミノ酸、約
1100アミノ酸～約1400アミノ酸、約1100アミノ酸～約1350アミノ酸、約1100アミノ酸～約
1300アミノ酸、約1100アミノ酸～約1250アミノ酸、約1100アミノ酸～約1200アミノ酸、約
1100アミノ酸～約1150アミノ酸、約1150アミノ酸～約1950アミノ酸、約1150アミノ酸～約
1900アミノ酸、約1150アミノ酸～約1850アミノ酸、約1150アミノ酸～約1800アミノ酸、約
1150アミノ酸～約1750アミノ酸、約1150アミノ酸～約1700アミノ酸、約1150アミノ酸～約
1650アミノ酸、約1150アミノ酸～約1600アミノ酸、約1150アミノ酸～約1550アミノ酸、約
1150アミノ酸～約1500アミノ酸、約1150アミノ酸～約1450アミノ酸、約1150アミノ酸～約
1400アミノ酸、約1150アミノ酸～約1350アミノ酸、約1150アミノ酸～約1300アミノ酸、約
1150アミノ酸～約1250アミノ酸、約1150アミノ酸～約1200アミノ酸、約1200アミノ酸～約
1950アミノ酸、約1200アミノ酸～約1900アミノ酸、約1200アミノ酸～約1850アミノ酸、約
1200アミノ酸～約1800アミノ酸、約1200アミノ酸～約1750アミノ酸、約1200アミノ酸～約
1700アミノ酸、約1200アミノ酸～約1650アミノ酸、約1200アミノ酸～約1600アミノ酸、約
1200アミノ酸～約1550アミノ酸、約1200アミノ酸～約1500アミノ酸、約1200アミノ酸～約
1450アミノ酸、約1200アミノ酸～約1400アミノ酸、約1200アミノ酸～約1350アミノ酸、約
1200アミノ酸～約1300アミノ酸、約1200アミノ酸～約1250アミノ酸、約1250アミノ酸～約
1950アミノ酸、約1250アミノ酸～約1900アミノ酸、約1250アミノ酸～約1850アミノ酸、約
1250アミノ酸～約1800アミノ酸、約1250アミノ酸～約1750アミノ酸、約1250アミノ酸～約
1700アミノ酸、約1250アミノ酸～約1650アミノ酸、約1250アミノ酸～約1600アミノ酸、約
1250アミノ酸～約1550アミノ酸、約1250アミノ酸～約1500アミノ酸、約1250アミノ酸～約
1450アミノ酸、約1250アミノ酸～約1400アミノ酸、約1250アミノ酸～約1350アミノ酸、約
1250アミノ酸～約1300アミノ酸、約1300アミノ酸～約1950アミノ酸、約1300アミノ酸～約
1900アミノ酸、約1300アミノ酸～約1850アミノ酸、約1300アミノ酸～約1800アミノ酸、約
1300アミノ酸～約1750アミノ酸、約1300アミノ酸～約1700アミノ酸、約1300アミノ酸～約
1650アミノ酸、約1300アミノ酸～約1600アミノ酸、約1300アミノ酸～約1550アミノ酸、約
1300アミノ酸～約1500アミノ酸、約1300アミノ酸～約1450アミノ酸、約1300アミノ酸～約
1400アミノ酸、約1300アミノ酸～約1350アミノ酸、約1350アミノ酸～約1950アミノ酸、約
1350アミノ酸～約1900アミノ酸、約1350アミノ酸～約1850アミノ酸、約1350アミノ酸～約
1800アミノ酸、約1350アミノ酸～約1750アミノ酸、約1350アミノ酸～約1700アミノ酸、約
1350アミノ酸～約1650アミノ酸、約1350アミノ酸～約1600アミノ酸、約1350アミノ酸～約
1550アミノ酸、約1350アミノ酸～約1500アミノ酸、約1350アミノ酸～約1450アミノ酸、約
1350アミノ酸～約1400アミノ酸、約1400アミノ酸～約1950アミノ酸、約1400アミノ酸～約
1900アミノ酸、約1400アミノ酸～約1850アミノ酸、約1400アミノ酸～約1800アミノ酸、約
1400アミノ酸
～約1750アミノ酸、約1400アミノ酸～約1700アミノ酸、約1400アミノ酸～約1650アミノ酸
、約1400アミノ酸～約1600アミノ酸、約1400アミノ酸～約1550アミノ酸、約1400アミノ酸
～約1500アミノ酸、約1400アミノ酸～約1450アミノ酸、約1450アミノ酸～約1950アミノ酸
、約1450アミノ酸～約1900アミノ酸、約1450アミノ酸～約1850アミノ酸、約1450アミノ酸
～約1800アミノ酸、約1450アミノ酸～約1750アミノ酸、約1450アミノ酸～約1700アミノ酸
、約1450アミノ酸～約1650アミノ酸、約1450アミノ酸～約1600アミノ酸、約1450アミノ酸
～約1550アミノ酸、約1450アミノ酸～約1500アミノ酸、約1500アミノ酸～約1950アミノ酸
、約1500アミノ酸～約1900アミノ酸、約1500アミノ酸～約1850アミノ酸、約1500アミノ酸
～約1800アミノ酸、約1500アミノ酸～約1750アミノ酸、約1500アミノ酸～約1700アミノ酸
、約1500アミノ酸～約1650アミノ酸、約1500アミノ酸～約1600アミノ酸、約1500アミノ酸
～約1550アミノ酸、約1550アミノ酸～約1950アミノ酸、約1550アミノ酸～約1900アミノ酸
、約1550アミノ酸～約1850アミノ酸、約1550アミノ酸～約1800アミノ酸、約1550アミノ酸
～約1750アミノ酸、約1550アミノ酸～約1700アミノ酸、約1550アミノ酸～約1650アミノ酸
、約1550アミノ酸～約1600アミノ酸、約1600アミノ酸～約1950アミノ酸、約1600アミノ酸
～約1900アミノ酸、約1600アミノ酸～約1850アミノ酸、約1600アミノ酸～約1800アミノ酸
、約1600アミノ酸～約1750アミノ酸、約1600アミノ酸～約1700アミノ酸、約1600アミノ酸
～約1650アミノ酸、約1650アミノ酸～約1950アミノ酸、約1650アミノ酸～約1900アミノ酸
、約1650アミノ酸～約1850アミノ酸、約1650アミノ酸～約1800アミノ酸、約1650アミノ酸
～約1750アミノ酸、約1650アミノ酸～約1700アミノ酸、約1700アミノ酸～約1950アミノ酸
、約1700アミノ酸～約1900アミノ酸、約1700アミノ酸～約1850アミノ酸、約1700アミノ酸
～約1800アミノ酸、約1700アミノ酸～約1750アミノ酸、約1750アミノ酸～約1950アミノ酸
、約1750アミノ酸～約1900アミノ酸、約1750アミノ酸～約1850アミノ酸、約1750アミノ酸
～約1800アミノ酸、約1800アミノ酸～約1950アミノ酸、約1800アミノ酸～約1900アミノ酸
、約1800アミノ酸～約1850アミノ酸、約1850アミノ酸～約1950アミノ酸、約1850アミノ酸
～約1900アミノ酸、または約1900アミノ酸～約1950アミノ酸である。
【0177】
これらの組成物のいくつかの態様において、コード配列のうちの少なくとも1つは、オ
トフェリンゲノムDNAの2つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ該2
つの隣接するエクソン間に天然には生じるイントロン配列を欠いている。
トフェリンゲノムDNAの2つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ該2
つの隣接するエクソン間に天然には生じるイントロン配列を欠いている。
【0178】
いくつかの態様において、コードされる部分のいずれのアミノ酸配列も、コードされる
部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と一部ですら重複していない。いくつかの態様に
おいて、コードされる部分のうちの1つまたは複数のアミノ酸配列は、コードされる部分
のうちの異なるもののアミノ酸配列と部分的に重複する。いくつかの態様において、コー
ドされる部分のそれぞれのアミノ酸配列は、コードされる部分のうちの異なるもののアミ
ノ酸配列と部分的に重複する。
部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と一部ですら重複していない。いくつかの態様に
おいて、コードされる部分のうちの1つまたは複数のアミノ酸配列は、コードされる部分
のうちの異なるもののアミノ酸配列と部分的に重複する。いくつかの態様において、コー
ドされる部分のそれぞれのアミノ酸配列は、コードされる部分のうちの異なるもののアミ
ノ酸配列と部分的に重複する。
【0179】
いくつかの態様において、重複するアミノ酸配列の長さは、約30アミノ酸残基～約1000
アミノ酸（例えば、またはこの範囲における本明細書に記載されている部分範囲のうちの
いずれか）である。
アミノ酸（例えば、またはこの範囲における本明細書に記載されている部分範囲のうちの
いずれか）である。
【0180】
いくつかの例では、ベクターは、2つの異なるベクターを含み、それらはそれぞれ、エ
クソンだけでなく、イントロンの異なるセグメントも含み、当該イントロンはオトフェリ
ンゲノムDNAに存在するイントロン（例えば、本明細書に記載されているSEQID NO：12に
おける例示的イントロンのうちのいずれか）のヌクレオチド配列を含み、2つの異なるセ
グメントの配列は、少なくとも100ヌクレオチド（例えば、約100ヌクレオチド～約5,000
ヌクレオチド、約100ヌクレオチド～約4,500ヌクレオチド、約100ヌクレオチド～約4,000
ヌクレオチド、約100ヌクレオチド～約3,500ヌクレオチド、約100ヌクレオチド～約3,000
ヌクレオチド、約100ヌクレオチド～約2,500ヌクレオチド、約100ヌクレオチド～約2,000
ヌクレオチド、約100ヌクレオチド～約1,500ヌクレオチド、約100ヌクレオチド～約1,000
ヌクレオチド、約100ヌクレオチド～約800ヌクレオチド、約100ヌクレオチド～約600ヌク
レオチド、約100ヌクレオチド～約400ヌクレオチド、約100ヌクレオチド～約200ヌクレオ
チド、約200ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約200ヌクレオチド～約4,500ヌクレオ
チド、約200ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約200ヌクレオチド～約3,500ヌクレオ
チド、約200ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約200ヌクレオチド～約2,500ヌクレオ
チド、約200ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド、約200ヌクレオチド～約1,500ヌクレオ
チド、約200ヌクレオチド～約1,000ヌクレオチド、約200ヌクレオチド～約800ヌクレオチ
ド、約200ヌクレオチド～約600ヌクレオチド、約200ヌクレオチド～約400ヌクレオチド、
約400ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約400ヌクレオチド～約4,500ヌクレオチド、
約400ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約400ヌクレオチド～約3,500ヌクレオチド、
約400ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約400ヌクレオチド～約2,500ヌクレオチド、
約400ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド、約400ヌクレオチド～約1,500ヌクレオチド、
約400ヌクレオチド～約1,000ヌクレオチド、約400ヌクレオチド～約800ヌクレオチド、約
400ヌクレオチド～約600ヌクレオチド、約600ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約60
0ヌクレオチド～約4,500ヌクレオチド、約600ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約60
0ヌクレオチド～約3,500ヌクレオチド、約600ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約60
0ヌクレオチド～約2,500ヌクレオチド、約600ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド、約60
0ヌクレオチド～約1,500ヌクレオチド、約600ヌクレオチド～約1,000ヌクレオチド、約60
0ヌクレオチド～約800ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約800
ヌクレオチド～約4,500ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約800
ヌクレオチド～約3,500ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約800
ヌクレオチド～約2,500ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド、約800
ヌクレオチド～約1,500ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約1,000ヌクレオチド、約1,0
00ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約4,500ヌクレオチド、
約1,000ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約3,500ヌクレオチ
ド、約1,000ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約2,500ヌクレ
オチド、約1,000ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約1,500ヌ
クレオチド、約1,500ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約1,500ヌクレオチド～約4,5
00ヌクレオチド、約1,500ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約1,500ヌクレオチド～
約3,500ヌクレオチド、約1,500ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約1,500ヌクレオチ
ド～約2,500ヌクレオチド、約1,500ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド、約2,000ヌクレ
オチド～約5,000ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約4,500ヌクレオチド、約2,000ヌ
クレオチド～約4,000ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約3,500ヌクレオチド、約2,0
00ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約2,500ヌクレオチド、
約2,500ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約2,500ヌクレオチド～約4,500ヌクレオチ
ド、約2,500ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約2,500ヌクレオチド～約3,500ヌクレ
オチド、約2,500ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約5,000ヌ
クレオチド、約3,000ヌクレオチド～約4,500ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約4,0
00ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約3,500ヌクレオチド、約3,500ヌクレオチド～
約5,000ヌクレオチド、約3,500ヌクレオチド～約4,500ヌクレオチド、約3,500ヌクレオチ
ド～約4,000ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約4,000ヌクレ
オチド～約4,500ヌクレオチド、約4,500ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド）の長さだ
け重複する。
クソンだけでなく、イントロンの異なるセグメントも含み、当該イントロンはオトフェリ
ンゲノムDNAに存在するイントロン（例えば、本明細書に記載されているSEQID NO：12に
おける例示的イントロンのうちのいずれか）のヌクレオチド配列を含み、2つの異なるセ
グメントの配列は、少なくとも100ヌクレオチド（例えば、約100ヌクレオチド～約5,000
ヌクレオチド、約100ヌクレオチド～約4,500ヌクレオチド、約100ヌクレオチド～約4,000
ヌクレオチド、約100ヌクレオチド～約3,500ヌクレオチド、約100ヌクレオチド～約3,000
ヌクレオチド、約100ヌクレオチド～約2,500ヌクレオチド、約100ヌクレオチド～約2,000
ヌクレオチド、約100ヌクレオチド～約1,500ヌクレオチド、約100ヌクレオチド～約1,000
ヌクレオチド、約100ヌクレオチド～約800ヌクレオチド、約100ヌクレオチド～約600ヌク
レオチド、約100ヌクレオチド～約400ヌクレオチド、約100ヌクレオチド～約200ヌクレオ
チド、約200ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約200ヌクレオチド～約4,500ヌクレオ
チド、約200ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約200ヌクレオチド～約3,500ヌクレオ
チド、約200ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約200ヌクレオチド～約2,500ヌクレオ
チド、約200ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド、約200ヌクレオチド～約1,500ヌクレオ
チド、約200ヌクレオチド～約1,000ヌクレオチド、約200ヌクレオチド～約800ヌクレオチ
ド、約200ヌクレオチド～約600ヌクレオチド、約200ヌクレオチド～約400ヌクレオチド、
約400ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約400ヌクレオチド～約4,500ヌクレオチド、
約400ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約400ヌクレオチド～約3,500ヌクレオチド、
約400ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約400ヌクレオチド～約2,500ヌクレオチド、
約400ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド、約400ヌクレオチド～約1,500ヌクレオチド、
約400ヌクレオチド～約1,000ヌクレオチド、約400ヌクレオチド～約800ヌクレオチド、約
400ヌクレオチド～約600ヌクレオチド、約600ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約60
0ヌクレオチド～約4,500ヌクレオチド、約600ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約60
0ヌクレオチド～約3,500ヌクレオチド、約600ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約60
0ヌクレオチド～約2,500ヌクレオチド、約600ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド、約60
0ヌクレオチド～約1,500ヌクレオチド、約600ヌクレオチド～約1,000ヌクレオチド、約60
0ヌクレオチド～約800ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約800
ヌクレオチド～約4,500ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約800
ヌクレオチド～約3,500ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約800
ヌクレオチド～約2,500ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド、約800
ヌクレオチド～約1,500ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約1,000ヌクレオチド、約1,0
00ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約4,500ヌクレオチド、
約1,000ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約3,500ヌクレオチ
ド、約1,000ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約2,500ヌクレ
オチド、約1,000ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約1,500ヌ
クレオチド、約1,500ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約1,500ヌクレオチド～約4,5
00ヌクレオチド、約1,500ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約1,500ヌクレオチド～
約3,500ヌクレオチド、約1,500ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約1,500ヌクレオチ
ド～約2,500ヌクレオチド、約1,500ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド、約2,000ヌクレ
オチド～約5,000ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約4,500ヌクレオチド、約2,000ヌ
クレオチド～約4,000ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約3,500ヌクレオチド、約2,0
00ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約2,500ヌクレオチド、
約2,500ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約2,500ヌクレオチド～約4,500ヌクレオチ
ド、約2,500ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約2,500ヌクレオチド～約3,500ヌクレ
オチド、約2,500ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約5,000ヌ
クレオチド、約3,000ヌクレオチド～約4,500ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約4,0
00ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約3,500ヌクレオチド、約3,500ヌクレオチド～
約5,000ヌクレオチド、約3,500ヌクレオチド～約4,500ヌクレオチド、約3,500ヌクレオチ
ド～約4,000ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約4,000ヌクレ
オチド～約4,500ヌクレオチド、約4,500ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド）の長さだ
け重複する。
【0181】
任意の2つの異なるベクターにおいて重複するヌクレオチド配列は、オトフェリン遺伝
子の1つまたは複数のエクソン（例えば、本明細書に記載されているSEQID NO：12におけ
る例示的なエクソンのうちのいずれか1つまたは複数）のうちの一部または全てを含むこ
とができる。
子の1つまたは複数のエクソン（例えば、本明細書に記載されているSEQID NO：12におけ
る例示的なエクソンのうちのいずれか1つまたは複数）のうちの一部または全てを含むこ
とができる。
【0182】
いくつかの態様において、組成物中の異なるベクターの数は、2つ、3つ、4つ、または5
つである。組成物中の異なるベクターの数が2つである組成物では、2つの異なるベクター
のうち第1のベクターは、オトフェリンタンパク質のN末端部分をコードするコード配列を
含み得る。いくつかの例では、オトフェリン遺伝子のN末端部分の長さは、約30アミノ酸
～約1950アミノ酸（または上記のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）である。いくつ
かの例では、第1のベクターは、プロモーター（例えば、本明細書に記載のまたは当技術
分野において公知のプロモーターのうちのいずれか）およびKozak配列（例えば、本明細
書に記載のまたは当技術分野において公知の例示的Kozak配列のうちのいずれか）のうち
の一方または両方をさらに含む。いくつかの例では、第1のベクターは、誘導性プロモー
ター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであるプロモーターを含む。
いくつかの例では、2つの異なるベクターのうち第2のベクターは、オトフェリンタンパク
質のC末端部分をコードするコード配列を含む。いくつかの例では、オトフェリンタンパ
ク質のC末端部分の長さは、30アミノ酸～約1950アミノ酸（または上記のこの範囲の部分
範囲のうちのいずれか）である。いくつかの例では、第2のベクターは、ポリ(A）シグナ
ル配列をさらに含む。
つである。組成物中の異なるベクターの数が2つである組成物では、2つの異なるベクター
のうち第1のベクターは、オトフェリンタンパク質のN末端部分をコードするコード配列を
含み得る。いくつかの例では、オトフェリン遺伝子のN末端部分の長さは、約30アミノ酸
～約1950アミノ酸（または上記のこの範囲の部分範囲のうちのいずれか）である。いくつ
かの例では、第1のベクターは、プロモーター（例えば、本明細書に記載のまたは当技術
分野において公知のプロモーターのうちのいずれか）およびKozak配列（例えば、本明細
書に記載のまたは当技術分野において公知の例示的Kozak配列のうちのいずれか）のうち
の一方または両方をさらに含む。いくつかの例では、第1のベクターは、誘導性プロモー
ター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであるプロモーターを含む。
いくつかの例では、2つの異なるベクターのうち第2のベクターは、オトフェリンタンパク
質のC末端部分をコードするコード配列を含む。いくつかの例では、オトフェリンタンパ
ク質のC末端部分の長さは、30アミノ酸～約1950アミノ酸（または上記のこの範囲の部分
範囲のうちのいずれか）である。いくつかの例では、第2のベクターは、ポリ(A）シグナ
ル配列をさらに含む。
【0183】
組成物中の異なるベクターの数が2つであるいくつかの例では、2つのベクターのうち1
つによってコードされるN末端部分は、野生型オトフェリンタンパク質（例えば、SEQ ID
NO：5）のアミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,950位、アミノ酸位置約1,940位、アミノ酸
位置約1,930位、アミノ酸位置約1,920位、アミノ酸位置約1,910位、アミノ酸位置約1,900
位、アミノ酸位置約1,900位、アミノ酸位置約1,890位、アミノ酸位置約1,880位、アミノ
酸位置約1,870位、アミノ酸位置約1,860位、アミノ酸位置約1,850位、アミノ酸位置約1,8
40位、アミノ酸位置約1,830位、アミノ酸位置約1,820位、アミノ酸位置約1,810位、アミ
ノ酸位置約1,800位、アミノ酸位置約1,790位、アミノ酸位置約1,780位、アミノ酸位置約1
,770位、アミノ酸位置約1,760位、アミノ酸位置約1,750位、アミノ酸位置約1,740位、ア
ミノ酸位置約1,730位、アミノ酸位置約1,720位、アミノ酸位置約1,710位、アミノ酸位置
約1,700位、約アミノ酸位、アミノ酸位置約1,690位、アミノ酸位置約1,680位、アミノ酸
位置約1,670位、アミノ酸位置約1,660位、アミノ酸位置約1,650位、アミノ酸位置約1,640
位、アミノ酸位置約1,630位、アミノ酸位置約1,620位、アミノ酸位置約1,610位、アミノ
酸位置約1,600位、アミノ酸位置約1,590位、アミノ酸位置約1,580位、アミノ酸位置約1,5
70位、アミノ酸位置約1,560位、アミノ酸位置約1,550位、アミノ酸位置約1,540位、アミ
ノ酸位置約1,530位、アミノ酸位置約1,520位、アミノ酸位置約1,510位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,500位、アミノ酸位置約1,490位、アミノ酸位置約1,480位、アミノ酸
位置約1,470位、アミノ酸位置約1,460位、アミノ酸位置約1,450位、アミノ酸位置約1,440
位、アミノ酸位置約1,430位、アミノ酸位置約1,420位、アミノ酸位置約1,410位、アミノ
酸位置約1,400位、アミノ酸位置約1,390位、アミノ酸位置約1,380位、アミノ酸位置約1,3
70位、アミノ酸位置約1,360位、アミノ酸位置約1,350位、アミノ酸位置約1,340位、アミ
ノ酸位置約1,330位、アミノ酸位置約1,320位、アミノ酸位置約1,310位、アミノ酸位置約1
,300位、アミノ酸位置約1,290位、アミノ酸位置約1,280位、アミノ酸位置約1,270位、ア
ミノ酸位置約1,260位、アミノ酸位置約1,250位、アミノ酸位置約1,240位、アミノ酸位置
約1,230位、アミノ酸位置約1,220位、アミノ酸位置約1,210位、アミノ酸位置約1,200位、
アミノ酸位置約1,190位、アミノ酸位置約1,180位、アミノ酸位置約1,170位、アミノ酸位
置約1,160位、アミノ酸位置約1,150位、アミノ酸位置約1,140位、アミノ酸位置約1,130位
、アミノ酸位置約1,120位、アミノ酸位置約1,110位、アミノ酸位置約1,100位、アミノ酸
位置約1,090位、アミノ酸位置約1,080位、アミノ酸位置約1,070位、アミノ酸位置約1,060
位、アミノ酸位置約1,050位、アミノ酸位置約1,040位、アミノ酸位置約1,030位、アミノ
酸位置約1,020位、アミノ酸位置約1,010位、アミノ酸位置約1,000位、アミノ酸位置約990
位、アミノ酸位置約980位、アミノ酸位置約970位、アミノ酸位置約960位、アミノ酸位置
約950位、アミノ酸位置約940位、アミノ酸位置約930位、アミノ酸位置約920位、アミノ酸
位置約910位、アミノ酸位置約900位、アミノ酸位置約890位、アミノ酸位置約880位、アミ
ノ酸位置約870位、アミノ酸位置約860位、アミノ酸位置約850位、アミノ酸位置約840位、
アミノ酸位置約830位、アミノ酸位置約820位、アミノ酸位置約810位、アミノ酸位置約800
位、アミノ酸位置約790位、アミノ酸位置約780位、アミノ酸位置約770位、アミノ酸位置
約760位、アミノ酸位置約750位、アミノ酸位置約740位、アミノ酸位置約730位、アミノ酸
位置約720位、アミノ酸位置約710位、アミノ酸位置約700位、アミノ酸位置約690位、アミ
ノ酸位置約680位、アミノ酸位置約670位、アミノ酸位置約660位、アミノ酸位置約650位、
アミノ酸位置約640位、アミノ酸位置約630位、アミノ酸位置約620位、アミノ酸位置約610
位、アミノ酸位置約600位、アミノ酸位置約590位、アミノ酸位置約580位、アミノ酸位置
約570位、アミノ酸位置約560位、アミノ酸位置約550位、アミノ酸位置約540位、アミノ酸
位置約530位、アミノ酸位置約520位、アミノ酸位置約510位、アミノ酸位置約500位、アミ
ノ酸位置約490位、アミノ酸位置約480位、アミノ酸位置約470位、アミノ酸位置約460位、
アミノ酸位置約450位、アミノ酸位置約440位、アミノ酸位置約430位、アミノ酸位置約420
位、アミノ酸位置約410位、アミノ酸位置約400位、アミノ酸位置約390位、アミノ酸位置
約380位、アミノ酸位置約370位、アミノ酸位置約360位、アミノ酸位置約350位、アミノ酸
位置約340位、アミノ酸位置約330位、アミノ酸位置約320位、アミノ酸位置約310位、アミ
ノ酸位置約300位、アミノ酸位置約290位、アミノ酸位置約280位、アミノ酸位置約270位、
アミノ酸位置約260位、アミノ酸位置約250位、アミノ酸位置約240位、アミノ酸位置約230
位、アミノ酸位置約220位、アミノ酸位置約210位、アミノ酸位置約200位、アミノ酸位置
約190位、アミノ酸位置約180位、アミノ酸位置約170位、アミノ酸位置約160位、アミノ酸
位置約150位、アミノ酸位置約140位、アミノ酸位置約130位、アミノ酸位置約120位、アミ
ノ酸位置約110位、アミノ酸位置約100位、アミノ酸位置約90位、アミノ酸位置約80位、ア
ミノ酸位置約70位、アミノ酸位置約60位、アミノ酸位置約50位、またはアミノ酸位置約40
位を含む部分を含みうる。
つによってコードされるN末端部分は、野生型オトフェリンタンパク質（例えば、SEQ ID
NO：5）のアミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,950位、アミノ酸位置約1,940位、アミノ酸
位置約1,930位、アミノ酸位置約1,920位、アミノ酸位置約1,910位、アミノ酸位置約1,900
位、アミノ酸位置約1,900位、アミノ酸位置約1,890位、アミノ酸位置約1,880位、アミノ
酸位置約1,870位、アミノ酸位置約1,860位、アミノ酸位置約1,850位、アミノ酸位置約1,8
40位、アミノ酸位置約1,830位、アミノ酸位置約1,820位、アミノ酸位置約1,810位、アミ
ノ酸位置約1,800位、アミノ酸位置約1,790位、アミノ酸位置約1,780位、アミノ酸位置約1
,770位、アミノ酸位置約1,760位、アミノ酸位置約1,750位、アミノ酸位置約1,740位、ア
ミノ酸位置約1,730位、アミノ酸位置約1,720位、アミノ酸位置約1,710位、アミノ酸位置
約1,700位、約アミノ酸位、アミノ酸位置約1,690位、アミノ酸位置約1,680位、アミノ酸
位置約1,670位、アミノ酸位置約1,660位、アミノ酸位置約1,650位、アミノ酸位置約1,640
位、アミノ酸位置約1,630位、アミノ酸位置約1,620位、アミノ酸位置約1,610位、アミノ
酸位置約1,600位、アミノ酸位置約1,590位、アミノ酸位置約1,580位、アミノ酸位置約1,5
70位、アミノ酸位置約1,560位、アミノ酸位置約1,550位、アミノ酸位置約1,540位、アミ
ノ酸位置約1,530位、アミノ酸位置約1,520位、アミノ酸位置約1,510位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,500位、アミノ酸位置約1,490位、アミノ酸位置約1,480位、アミノ酸
位置約1,470位、アミノ酸位置約1,460位、アミノ酸位置約1,450位、アミノ酸位置約1,440
位、アミノ酸位置約1,430位、アミノ酸位置約1,420位、アミノ酸位置約1,410位、アミノ
酸位置約1,400位、アミノ酸位置約1,390位、アミノ酸位置約1,380位、アミノ酸位置約1,3
70位、アミノ酸位置約1,360位、アミノ酸位置約1,350位、アミノ酸位置約1,340位、アミ
ノ酸位置約1,330位、アミノ酸位置約1,320位、アミノ酸位置約1,310位、アミノ酸位置約1
,300位、アミノ酸位置約1,290位、アミノ酸位置約1,280位、アミノ酸位置約1,270位、ア
ミノ酸位置約1,260位、アミノ酸位置約1,250位、アミノ酸位置約1,240位、アミノ酸位置
約1,230位、アミノ酸位置約1,220位、アミノ酸位置約1,210位、アミノ酸位置約1,200位、
アミノ酸位置約1,190位、アミノ酸位置約1,180位、アミノ酸位置約1,170位、アミノ酸位
置約1,160位、アミノ酸位置約1,150位、アミノ酸位置約1,140位、アミノ酸位置約1,130位
、アミノ酸位置約1,120位、アミノ酸位置約1,110位、アミノ酸位置約1,100位、アミノ酸
位置約1,090位、アミノ酸位置約1,080位、アミノ酸位置約1,070位、アミノ酸位置約1,060
位、アミノ酸位置約1,050位、アミノ酸位置約1,040位、アミノ酸位置約1,030位、アミノ
酸位置約1,020位、アミノ酸位置約1,010位、アミノ酸位置約1,000位、アミノ酸位置約990
位、アミノ酸位置約980位、アミノ酸位置約970位、アミノ酸位置約960位、アミノ酸位置
約950位、アミノ酸位置約940位、アミノ酸位置約930位、アミノ酸位置約920位、アミノ酸
位置約910位、アミノ酸位置約900位、アミノ酸位置約890位、アミノ酸位置約880位、アミ
ノ酸位置約870位、アミノ酸位置約860位、アミノ酸位置約850位、アミノ酸位置約840位、
アミノ酸位置約830位、アミノ酸位置約820位、アミノ酸位置約810位、アミノ酸位置約800
位、アミノ酸位置約790位、アミノ酸位置約780位、アミノ酸位置約770位、アミノ酸位置
約760位、アミノ酸位置約750位、アミノ酸位置約740位、アミノ酸位置約730位、アミノ酸
位置約720位、アミノ酸位置約710位、アミノ酸位置約700位、アミノ酸位置約690位、アミ
ノ酸位置約680位、アミノ酸位置約670位、アミノ酸位置約660位、アミノ酸位置約650位、
アミノ酸位置約640位、アミノ酸位置約630位、アミノ酸位置約620位、アミノ酸位置約610
位、アミノ酸位置約600位、アミノ酸位置約590位、アミノ酸位置約580位、アミノ酸位置
約570位、アミノ酸位置約560位、アミノ酸位置約550位、アミノ酸位置約540位、アミノ酸
位置約530位、アミノ酸位置約520位、アミノ酸位置約510位、アミノ酸位置約500位、アミ
ノ酸位置約490位、アミノ酸位置約480位、アミノ酸位置約470位、アミノ酸位置約460位、
アミノ酸位置約450位、アミノ酸位置約440位、アミノ酸位置約430位、アミノ酸位置約420
位、アミノ酸位置約410位、アミノ酸位置約400位、アミノ酸位置約390位、アミノ酸位置
約380位、アミノ酸位置約370位、アミノ酸位置約360位、アミノ酸位置約350位、アミノ酸
位置約340位、アミノ酸位置約330位、アミノ酸位置約320位、アミノ酸位置約310位、アミ
ノ酸位置約300位、アミノ酸位置約290位、アミノ酸位置約280位、アミノ酸位置約270位、
アミノ酸位置約260位、アミノ酸位置約250位、アミノ酸位置約240位、アミノ酸位置約230
位、アミノ酸位置約220位、アミノ酸位置約210位、アミノ酸位置約200位、アミノ酸位置
約190位、アミノ酸位置約180位、アミノ酸位置約170位、アミノ酸位置約160位、アミノ酸
位置約150位、アミノ酸位置約140位、アミノ酸位置約130位、アミノ酸位置約120位、アミ
ノ酸位置約110位、アミノ酸位置約100位、アミノ酸位置約90位、アミノ酸位置約80位、ア
ミノ酸位置約70位、アミノ酸位置約60位、アミノ酸位置約50位、またはアミノ酸位置約40
位を含む部分を含みうる。
【0184】
組成物中の異なるベクターの数が2つであるいくつかの例では、前駆体オトフェリンタ
ンパク質のN末端部分は、野生型オトフェリンタンパク質（例えば、SEQID NO：5）のア
ミノ酸位置1位～アミノ酸位置310位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約320位、アミノ酸
位置1位～アミノ酸位置約330位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約340位、アミノ酸位置
1位～アミノ酸位置約350位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約360位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約370位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約380位、アミノ酸位置1位～ア
ミノ酸位置約390位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約400位、アミノ酸位置1位～アミノ
酸位置約410位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約420位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位
置約430位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約440位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約
450位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約460位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約470
位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約480位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約490位、
アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約500位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約510位、アミ
ノ酸位置1位～アミノ酸位置約520位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約530位、アミノ酸
位置1位～アミノ酸位置約540位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約550位、アミノ酸位置
1位～アミノ酸位置約560位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約570位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約580位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約590位、アミノ酸位置1位～ア
ミノ酸位置約600位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約610位、アミノ酸位置1位～アミノ
酸位置約620位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約630位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位
置約640位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約650位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約
660位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約670位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約680
位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約690位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約700位、
アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約710位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約720位、アミ
ノ酸位置1位～アミノ酸位置約730位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約740位、アミノ酸
位置1位～アミノ酸位置約750位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約760位、アミノ酸位置
1位～アミノ酸位置約770位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約780位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約790位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約800位、アミノ酸位置1位～ア
ミノ酸位置約810位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約820位、アミノ酸位置1位～アミノ
酸位置約830位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約840位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位
置約850位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約860位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約
870位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約880位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約890
位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約900位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約910位、
アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約920位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約930位、アミ
ノ酸位置1位～アミノ酸位置約940位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約950位、アミノ酸
位置1位～アミノ酸位置約960位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約970位、アミノ酸位置
1位～アミノ酸位置約980位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約990位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,000位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,010位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,020位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,030位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,040位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,050位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,060位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,070位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,080位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,090位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,100位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,110位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,120位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,130位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,140位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,150位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,160位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,170位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,180位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,190位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,200位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,210位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,220位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,230位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,240位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,250位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,260位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,270位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,280位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,290位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,300位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,310位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,320位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,330位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,340位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,350位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,360位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,370位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,380位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,390位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,400位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,410位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,420位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,430位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,440位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,450位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,460位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,470位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,480位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,490位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,500位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,510位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,520位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,530位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,540位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,550位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,560位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,570位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,580位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,590位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,600位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,610位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,620位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,630位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,640位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,650位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,660位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,670位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,680位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,690位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,700位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,710位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,720位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,730位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,740位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,750位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,760位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,770位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,780位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,790位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,800位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,810位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,820位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,830位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,840位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,850位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,860位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,870位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,880位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,890位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,900位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,910位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,920位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,930位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,940位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,950位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,960位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,970位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,980位を含む部分を含みうる。
ンパク質のN末端部分は、野生型オトフェリンタンパク質（例えば、SEQID NO：5）のア
ミノ酸位置1位～アミノ酸位置310位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約320位、アミノ酸
位置1位～アミノ酸位置約330位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約340位、アミノ酸位置
1位～アミノ酸位置約350位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約360位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約370位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約380位、アミノ酸位置1位～ア
ミノ酸位置約390位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約400位、アミノ酸位置1位～アミノ
酸位置約410位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約420位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位
置約430位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約440位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約
450位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約460位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約470
位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約480位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約490位、
アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約500位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約510位、アミ
ノ酸位置1位～アミノ酸位置約520位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約530位、アミノ酸
位置1位～アミノ酸位置約540位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約550位、アミノ酸位置
1位～アミノ酸位置約560位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約570位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約580位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約590位、アミノ酸位置1位～ア
ミノ酸位置約600位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約610位、アミノ酸位置1位～アミノ
酸位置約620位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約630位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位
置約640位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約650位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約
660位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約670位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約680
位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約690位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約700位、
アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約710位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約720位、アミ
ノ酸位置1位～アミノ酸位置約730位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約740位、アミノ酸
位置1位～アミノ酸位置約750位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約760位、アミノ酸位置
1位～アミノ酸位置約770位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約780位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約790位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約800位、アミノ酸位置1位～ア
ミノ酸位置約810位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約820位、アミノ酸位置1位～アミノ
酸位置約830位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約840位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位
置約850位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約860位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約
870位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約880位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約890
位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約900位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約910位、
アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約920位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約930位、アミ
ノ酸位置1位～アミノ酸位置約940位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約950位、アミノ酸
位置1位～アミノ酸位置約960位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約970位、アミノ酸位置
1位～アミノ酸位置約980位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約990位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,000位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,010位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,020位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,030位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,040位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,050位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,060位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,070位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,080位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,090位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,100位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,110位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,120位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,130位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,140位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,150位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,160位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,170位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,180位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,190位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,200位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,210位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,220位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,230位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,240位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,250位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,260位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,270位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,280位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,290位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,300位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,310位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,320位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,330位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,340位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,350位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,360位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,370位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,380位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,390位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,400位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,410位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,420位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,430位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,440位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,450位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,460位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,470位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,480位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,490位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,500位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,510位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,520位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,530位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,540位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,550位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,560位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,570位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,580位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,590位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,600位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,610位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,620位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,630位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,640位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,650位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,660位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,670位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,680位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,690位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,700位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,710位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,720位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,730位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,740位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,750位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,760位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,770位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,780位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,790位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,800位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,810位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,820位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,830位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,840位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,850位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,860位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,870位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,880位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,890位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,900位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,910位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,920位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,930位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,940位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,950位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,960位、アミノ酸位置1位～アミノ酸位置約1,970位、アミノ酸位置1位
～アミノ酸位置約1,980位を含む部分を含みうる。
【0185】
本明細書において用いられる「ベクター」という用語は、適切な制御要素と関連すると
複製する能力を有する、および細胞間で遺伝子配列を移動させることができる、プラスミ
ド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオン等
の任意の遺伝要素を含む。よって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、なら
びにウイルスベクターを含む。いくつかの態様において、有用なベクターは、転写される
べき核酸セグメントがプロモーターの転写制御下に配置されているベクターであることが
企図される。
複製する能力を有する、および細胞間で遺伝子配列を移動させることができる、プラスミ
ド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオン等
の任意の遺伝要素を含む。よって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、なら
びにウイルスベクターを含む。いくつかの態様において、有用なベクターは、転写される
べき核酸セグメントがプロモーターの転写制御下に配置されているベクターであることが
企図される。
【0186】
いくつかの例では、ベクターは、人工染色体（例えば、ヒト人工染色体（HAC）、酵母
人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、またはP1由来人工染色体（PAC））、また
はウイルスベクター（例えば、 任意のアデノウイルスベクター（例えば、pSVまたはpCMV
ベクター）、本明細書に記載されているような任意のレトロウイルスベクター、および任
意のGateway(登録商標)ベクター）であり得る。ベクターは、例えば、発現に十分なシス
作用性エレメントを含む可能性があり；発現のための他の要素は、宿主哺乳動物細胞によ
ってまたはインビトロ発現系において供給され得る。
人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、またはP1由来人工染色体（PAC））、また
はウイルスベクター（例えば、 任意のアデノウイルスベクター（例えば、pSVまたはpCMV
ベクター）、本明細書に記載されているような任意のレトロウイルスベクター、および任
意のGateway(登録商標)ベクター）であり得る。ベクターは、例えば、発現に十分なシス
作用性エレメントを含む可能性があり；発現のための他の要素は、宿主哺乳動物細胞によ
ってまたはインビトロ発現系において供給され得る。
【0187】
「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列（例えば、遺伝子）の特定の転写を開始す
るのに必要とされる、細胞の合成装置または導入された合成装置によって認識されるDNA
配列を指す。「機能的に位置づけられた」、「制御下で」または「転写制御下で」という
記載は、プロモーターが、遺伝子のRNAポリメラーゼ開始および発現を制御するために核
酸との関連で正しい位置および方向付けにあることを意味する。「発現ベクターまたは構
築物」という用語は、核酸コード配列の一部または全部を転写することができる核酸を含
有する任意の種類の遺伝子構築物を意味する。いくつかの態様において、発現は、例えば
、転写遺伝子から生物学的に活性なポリペプチド産物または抑制性RNA（例えば、shRNA、
miRNA、miRNAインヒビター）を作製するための、核酸の転写を含む。
るのに必要とされる、細胞の合成装置または導入された合成装置によって認識されるDNA
配列を指す。「機能的に位置づけられた」、「制御下で」または「転写制御下で」という
記載は、プロモーターが、遺伝子のRNAポリメラーゼ開始および発現を制御するために核
酸との関連で正しい位置および方向付けにあることを意味する。「発現ベクターまたは構
築物」という用語は、核酸コード配列の一部または全部を転写することができる核酸を含
有する任意の種類の遺伝子構築物を意味する。いくつかの態様において、発現は、例えば
、転写遺伝子から生物学的に活性なポリペプチド産物または抑制性RNA（例えば、shRNA、
miRNA、miRNAインヒビター）を作製するための、核酸の転写を含む。
【0188】
ベクターには、組換えポリペプチドを組み込む、コスミド、プラスミド（例えば、ネイ
キッドなまたはリポソーム中に含有される）、およびウイルス（例えば、レンチウイルス
、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含む当技術分野にお
いて公知の全てのものが含まれる。当業者は、本明細書に記載されている核酸のいずれか
を作製するのに適したベクターおよび哺乳動物細胞を選択することができる。いくつかの
態様において、ベクターはプラスミド（すなわち、細胞の内部で自律的に複製することが
できる環状DNA分子）である。いくつかの態様において、ベクターはコスミド（例えば、p
WEシリーズおよびsCosシリーズ（Wahlet al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2
160-2164, Evanset al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5030-5034）であり得
る。
キッドなまたはリポソーム中に含有される）、およびウイルス（例えば、レンチウイルス
、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含む当技術分野にお
いて公知の全てのものが含まれる。当業者は、本明細書に記載されている核酸のいずれか
を作製するのに適したベクターおよび哺乳動物細胞を選択することができる。いくつかの
態様において、ベクターはプラスミド（すなわち、細胞の内部で自律的に複製することが
できる環状DNA分子）である。いくつかの態様において、ベクターはコスミド（例えば、p
WEシリーズおよびsCosシリーズ（Wahlet al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2
160-2164, Evanset al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5030-5034）であり得
る。
【0189】
「トランスファーベクター」という用語は、単離された核酸を含み、かつ細胞の内部に
該単離された核酸を送達するのに用いることができる組成物を指す。多数のベクターが当
技術分野において公知であり、それらには、これらに限定されないが、直鎖状ポリヌクレ
オチド、イオン性もしくは両親媒性の化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、
およびウイルスが含まれる。よって、「トランスファーベクター」という用語は、自律的
複製性のプラスミドまたはウイルスを含む。この用語は、例えば、ポリリジン化合物およ
びリポソームなどの、細胞内への核酸の移入を促進する非プラスミド性および非ウイルス
性の化合物をさらに含むようにも解釈されるべきである。ウイルス性トランスファーベク
ターの例には、これらに限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス
ベクター、レトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターなどが含まれる。
該単離された核酸を送達するのに用いることができる組成物を指す。多数のベクターが当
技術分野において公知であり、それらには、これらに限定されないが、直鎖状ポリヌクレ
オチド、イオン性もしくは両親媒性の化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、
およびウイルスが含まれる。よって、「トランスファーベクター」という用語は、自律的
複製性のプラスミドまたはウイルスを含む。この用語は、例えば、ポリリジン化合物およ
びリポソームなどの、細胞内への核酸の移入を促進する非プラスミド性および非ウイルス
性の化合物をさらに含むようにも解釈されるべきである。ウイルス性トランスファーベク
ターの例には、これらに限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス
ベクター、レトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターなどが含まれる。
【0190】
「発現ベクター」という用語は、発現させるべきヌクレオチド配列に機能的に連結され
た発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含む、ベクターを指す。発現ベクターは
、発現に十分なシス作用性エレメントを含み；発現のための他の要素は、宿主細胞によっ
てまたはインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターは、組換えポリヌクレオ
チドを組み込む、コスミド、プラスミド（例えば、ネイキッドなまたはリポソーム中に含
有される）、およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイル
ス、およびアデノ随伴ウイルス）を含む、当技術分野において公知の全てのものが含まれ
る。
た発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含む、ベクターを指す。発現ベクターは
、発現に十分なシス作用性エレメントを含み；発現のための他の要素は、宿主細胞によっ
てまたはインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターは、組換えポリヌクレオ
チドを組み込む、コスミド、プラスミド（例えば、ネイキッドなまたはリポソーム中に含
有される）、およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイル
ス、およびアデノ随伴ウイルス）を含む、当技術分野において公知の全てのものが含まれ
る。
【0191】
いくつかの態様において、ベクターは人工染色体である。人工染色体は、大きなDNA挿
入断片を運ぶためにベクターとして用いることができる遺伝子改変した染色体である。い
くつかの態様において、人工染色体はヒト人工染色体（HAC）である（例えば、Kouprina
et al., ExpertOpin. Drug Deliv 11(4): 517-535, 2014; Basu et al., Pediatr. Clin
. North Am. 53:843-853, 2006; Ren et al., Stem. Cell Rev. 2(1):43-50, 2006; Kaz
uki et al.,Mol. Ther. 19(9):1591-1601, 2011; Kazuki et al., Gen. Ther. 18: 384-
393, 2011; およびKatohet al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 321:280-290, 2004
を参照されたい）。
入断片を運ぶためにベクターとして用いることができる遺伝子改変した染色体である。い
くつかの態様において、人工染色体はヒト人工染色体（HAC）である（例えば、Kouprina
et al., ExpertOpin. Drug Deliv 11(4): 517-535, 2014; Basu et al., Pediatr. Clin
. North Am. 53:843-853, 2006; Ren et al., Stem. Cell Rev. 2(1):43-50, 2006; Kaz
uki et al.,Mol. Ther. 19(9):1591-1601, 2011; Kazuki et al., Gen. Ther. 18: 384-
393, 2011; およびKatohet al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 321:280-290, 2004
を参照されたい）。
【0192】
いくつかの態様において、ベクターは酵母人工染色体（YAC）である（例えば、Murray
et al., Nature305: 189-193, 1983; Ikeno et al. (1998) Nat. Biotech. 16:431-439,
1998を参照されたい）。いくつかの態様において、ベクターは細菌人工染色体(BAC）（
例えば、pBeloBAC11、pECBAC1、およびpBAC108L）である。いくつかの態様において、ベ
クターはP1由来人工染色体（PAC）である。人工染色体の例が、当技術分野において公知
である。
et al., Nature305: 189-193, 1983; Ikeno et al. (1998) Nat. Biotech. 16:431-439,
1998を参照されたい）。いくつかの態様において、ベクターは細菌人工染色体(BAC）（
例えば、pBeloBAC11、pECBAC1、およびpBAC108L）である。いくつかの態様において、ベ
クターはP1由来人工染色体（PAC）である。人工染色体の例が、当技術分野において公知
である。
【0193】
いくつかの態様において、ベクターはウイルスベクターである（例えば、アデノ随伴ウ
イルス、アデノウイルス、レンチウイルス、およびレトロウイルス）。ウイルスベクター
の非限定的な例は本明細書に記載されている。
イルス、アデノウイルス、レンチウイルス、およびレトロウイルス）。ウイルスベクター
の非限定的な例は本明細書に記載されている。
【0194】
組換えAAVベクター
本発明の「組換えAAVベクター」または「rAAV」は典型的には、最小で、導入遺伝子ま
たはその部分および調節配列、ならびに任意で5'および3'AAV末端逆位配列（ITR）で構成
される。この組換えAAVベクターは、カプシドタンパク質内にパッケージングされ、選択
標的細胞に送達される。いくつかの態様において、導入遺伝子は、関心対象のポリペプチ
ド、タンパク質、機能性RNA分子（例えば、miRNA、miRNAインヒビター）、または他の遺
伝子産物をコードする、ベクター配列にとって異種の核酸配列である。核酸コード配列は
、標的組織の細胞における導入遺伝子の転写、翻訳、および/または発現を可能にする形
で、制御成分に機能的に連結される。
本発明の「組換えAAVベクター」または「rAAV」は典型的には、最小で、導入遺伝子ま
たはその部分および調節配列、ならびに任意で5'および3'AAV末端逆位配列（ITR）で構成
される。この組換えAAVベクターは、カプシドタンパク質内にパッケージングされ、選択
標的細胞に送達される。いくつかの態様において、導入遺伝子は、関心対象のポリペプチ
ド、タンパク質、機能性RNA分子（例えば、miRNA、miRNAインヒビター）、または他の遺
伝子産物をコードする、ベクター配列にとって異種の核酸配列である。核酸コード配列は
、標的組織の細胞における導入遺伝子の転写、翻訳、および/または発現を可能にする形
で、制御成分に機能的に連結される。
【0195】
いくつかの態様において、ベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（AAV）である（例
えば、Asokanet al., Mol. Ther. 20: 699-7080, 2012を参照されたい）。「組換えAAV
ベクター」または「rAAV」は典型的には、最小で、導入遺伝子またはその部分および調節
配列、ならびに任意で5'および3'AAV末端逆位配列（ITR）で構成される。そのような組換
えAAVベクターは、カプシド内にパッケージングされ、選択標的細胞（例えば、内有毛細
胞）に送達される。
えば、Asokanet al., Mol. Ther. 20: 699-7080, 2012を参照されたい）。「組換えAAV
ベクター」または「rAAV」は典型的には、最小で、導入遺伝子またはその部分および調節
配列、ならびに任意で5'および3'AAV末端逆位配列（ITR）で構成される。そのような組換
えAAVベクターは、カプシド内にパッケージングされ、選択標的細胞（例えば、内有毛細
胞）に送達される。
【0196】
ベクターのAAV配列は典型的には、シス作用性5'および3'末端逆位配列を含む（例えば
、B. J.Carter, in "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press,pp. 1
55 168 (1990)を参照されたい）。ITR配列は約145nt長である。好ましくは、実質的には
ITRをコードする全配列が分子中に用いられるが、これらの配列のある程度の若干の改変
は許容される。これらのITR配列を改変する能力は当技術分野における技能の範囲内であ
る（例えば、Sambrooket al. "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Co
ld SpringHarbor Laboratory, New York (1989); およびK. Fisher et al., J Virol.,
70:520 532(1996)などの教科書を参照されたい）。本発明で利用されるそのような分子
の例は、選択された導入遺伝子配列と関連する調節エレメントが5'および3' AAV ITR配列
によって隣接している、導入遺伝子を含有する「シス作用性」プラスミドである。AAV IT
R配列は、今回特定した哺乳類AAV型を含む、任意の公知のAAVから得られうる。
、B. J.Carter, in "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press,pp. 1
55 168 (1990)を参照されたい）。ITR配列は約145nt長である。好ましくは、実質的には
ITRをコードする全配列が分子中に用いられるが、これらの配列のある程度の若干の改変
は許容される。これらのITR配列を改変する能力は当技術分野における技能の範囲内であ
る（例えば、Sambrooket al. "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Co
ld SpringHarbor Laboratory, New York (1989); およびK. Fisher et al., J Virol.,
70:520 532(1996)などの教科書を参照されたい）。本発明で利用されるそのような分子
の例は、選択された導入遺伝子配列と関連する調節エレメントが5'および3' AAV ITR配列
によって隣接している、導入遺伝子を含有する「シス作用性」プラスミドである。AAV IT
R配列は、今回特定した哺乳類AAV型を含む、任意の公知のAAVから得られうる。
【0197】
組換えAAVベクターについて上記で特定した主要な要素に加えて、ベクターは、本発明
によって生成されたプラスミドベクターでトランスフェクトしたまたはウイルスに感染し
た細胞におけるその転写、翻訳、および/または発現を可能にする形で導入遺伝子に機能
的に連結されている従来の制御要素も含む。本明細書で用いられる「機能的に連結されて
いる」配列は、関心対象の遺伝子と連続している発現制御配列と、トランスでまたは離れ
て作用して関心対象の遺伝子を制御する発現制御配列との両方を含む。
によって生成されたプラスミドベクターでトランスフェクトしたまたはウイルスに感染し
た細胞におけるその転写、翻訳、および/または発現を可能にする形で導入遺伝子に機能
的に連結されている従来の制御要素も含む。本明細書で用いられる「機能的に連結されて
いる」配列は、関心対象の遺伝子と連続している発現制御配列と、トランスでまたは離れ
て作用して関心対象の遺伝子を制御する発現制御配列との両方を含む。
【0198】
本明細書に記載されているようなAAVベクターは、本明細書に記載されている調節要素
のうちのいずれか（例えば、プロモーター、ポリA配列、およびIRESのうちの1つまたは複
数）を含んでもよい。
のうちのいずれか（例えば、プロモーター、ポリA配列、およびIRESのうちの1つまたは複
数）を含んでもよい。
【0199】
組換えAVベクターおよびレンチウイルスベクター
1つまたは複数のアデノウイルス（AV）ベクターを含む治療用組成物も提供され、ここ
で、1つまたは複数のAVベクターは、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞にお
いて聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力を有する。好ましくは、該1
つまたは複数のAVベクターは、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において全
長聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力を有する。
1つまたは複数のアデノウイルス（AV）ベクターを含む治療用組成物も提供され、ここ
で、1つまたは複数のAVベクターは、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞にお
いて聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力を有する。好ましくは、該1
つまたは複数のAVベクターは、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において全
長聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成する能力を有する。
【0200】
いくつかの態様において、ベクターはアデノウイルスである（例えば、Dmitriev et al
. (1998) J.Virol. 72: 9706-9713; およびPoulin et al., J. Virol 8: 10074-10086,
2010を参照されたい）。いくつかの態様において、ベクターはレトロウイルスである（例
えば、Maieret al. (2010) Future Microbiol 5: 1507-23を参照されたい）。
. (1998) J.Virol. 72: 9706-9713; およびPoulin et al., J. Virol 8: 10074-10086,
2010を参照されたい）。いくつかの態様において、ベクターはレトロウイルスである（例
えば、Maieret al. (2010) Future Microbiol 5: 1507-23を参照されたい）。
【0201】
いくつかの態様において、ベクターはレンチウイルスである（例えば、Matrai et al.
(2010) MolTher. 18: 477-490; Banasik et al. (2010) Gene Ther. 17:150-7; およびW
anisch et al.(2009) Mol. Ther. 17: 1316-32を参照されたい）。レンチウイルスベク
ターは、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指し、特に、Milo
ne et al., Mol.Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)で提供されるような自己不活性型レン
チウイルスベクターを含む。診療所で用いられ得る非限定的なレンチウイルスベクターに
は、OxfordBioMedicaのLENTIVECTOR(登録商標)遺伝子送達技術、およびLentigenのLENTI
MAX(商標)ベクター系などが含まれる。他の種類のレンチウイルスベクターもまた利用可
能であり、かつ当業者に公知である。
(2010) MolTher. 18: 477-490; Banasik et al. (2010) Gene Ther. 17:150-7; およびW
anisch et al.(2009) Mol. Ther. 17: 1316-32を参照されたい）。レンチウイルスベク
ターは、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指し、特に、Milo
ne et al., Mol.Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)で提供されるような自己不活性型レン
チウイルスベクターを含む。診療所で用いられ得る非限定的なレンチウイルスベクターに
は、OxfordBioMedicaのLENTIVECTOR(登録商標)遺伝子送達技術、およびLentigenのLENTI
MAX(商標)ベクター系などが含まれる。他の種類のレンチウイルスベクターもまた利用可
能であり、かつ当業者に公知である。
【0202】
「レンチウイルス」という用語は、レトロウイルス（Retroviridae）科の属を指す。レ
ンチウイルスは、非分裂細胞に感染できるという点でレトロウイルスの中でも独特であり
；レンチウイルスは宿主細胞のDNA内に十分な量の遺伝情報を送達することができ、よっ
て遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の1つである。HIV、SIV、およびFIVは全て、レ
ンチウイルスの例である。
ンチウイルスは、非分裂細胞に感染できるという点でレトロウイルスの中でも独特であり
；レンチウイルスは宿主細胞のDNA内に十分な量の遺伝情報を送達することができ、よっ
て遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の1つである。HIV、SIV、およびFIVは全て、レ
ンチウイルスの例である。
【0203】
「レンチウイルスベクター」という用語は、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に
由来するベクターを指し、特に、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)
において提供される自己不活性型レンチウイルスベクターを含む。診療所で用いられる可
能性があるレンチウイルスベクターの他の例には、これらに限定されないが、例えば、Ox
ford BioMedicaのLENTIVECTOR(登録商標)遺伝子送達技術、およびLentigenのLENTIMAX(商
標)ベクター系などが含まれる。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であ
り、当業者に公知であろう。
由来するベクターを指し、特に、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)
において提供される自己不活性型レンチウイルスベクターを含む。診療所で用いられる可
能性があるレンチウイルスベクターの他の例には、これらに限定されないが、例えば、Ox
ford BioMedicaのLENTIVECTOR(登録商標)遺伝子送達技術、およびLentigenのLENTIMAX(商
標)ベクター系などが含まれる。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であ
り、当業者に公知であろう。
【0204】
例えば、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において聴覚系ポリペプチドの
メッセンジャーRNAを構成する能力を有する1つまたは複数のレンチウイルスベクターを含
む治療用組成物が提供される。1つの態様において、1つまたは複数のレンチウイルスベク
ターは、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において全長聴覚系ポリペプチド
のメッセンジャーRNAを構成する能力を有する。
メッセンジャーRNAを構成する能力を有する1つまたは複数のレンチウイルスベクターを含
む治療用組成物が提供される。1つの態様において、1つまたは複数のレンチウイルスベク
ターは、治療用組成物が投与されるヒト対象の標的細胞において全長聴覚系ポリペプチド
のメッセンジャーRNAを構成する能力を有する。
【0205】
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、ベクタ
ーは、図11に図示されるpAAV-AK-SA-3'mOTOF-EWB（SEQID NO：39）である。pAAV-AK-SA-
3'mOTOF-EWBベクターは7625bp長であり、かつヌクレオチド位置2～78にAK配列、ヌクレ
オチド位置79～129にスプライシングアクセプター（SA）部位、ヌクレオチド位置130～35
40に3' mOTOF、ヌクレオチド位置490～891にC2D、ヌクレオチド位置1996～2516にC2E、ヌ
クレオチド位置2749～3234にC2F、ヌクレオチド位置3595～4188にWPRE、ヌクレオチド位
置5537～6537にアンピシリン（AMP）耐性遺伝子、ヌクレオチド位置4212～4422にウシ成
長ホルモンポリAテール（bGHpA）、ヌクレオチド位置4674～5133にファージ由来f1(+）
複製起点（ORI）、ヌクレオチド位置6787～7012に複製起点（ORI）を有する。
ーは、図11に図示されるpAAV-AK-SA-3'mOTOF-EWB（SEQID NO：39）である。pAAV-AK-SA-
3'mOTOF-EWBベクターは7625bp長であり、かつヌクレオチド位置2～78にAK配列、ヌクレ
オチド位置79～129にスプライシングアクセプター（SA）部位、ヌクレオチド位置130～35
40に3' mOTOF、ヌクレオチド位置490～891にC2D、ヌクレオチド位置1996～2516にC2E、ヌ
クレオチド位置2749～3234にC2F、ヌクレオチド位置3595～4188にWPRE、ヌクレオチド位
置5537～6537にアンピシリン（AMP）耐性遺伝子、ヌクレオチド位置4212～4422にウシ成
長ホルモンポリAテール（bGHpA）、ヌクレオチド位置4674～5133にファージ由来f1(+）
複製起点（ORI）、ヌクレオチド位置6787～7012に複製起点（ORI）を有する。
【0206】
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、ベクタ
ーは図12に図示されるpAAV-SA-3'mOTOF-EWB（SEQID NO：40）である。pAAV-SA-3'mOTOF-
EWBベクターは7548 bp長であり、かつヌクレオチド位置2～52にスプライシングアクセプ
ター（SA）部位、ヌクレオチド位置53～3463に3'mOTOF、ヌクレオチド位置413～814にC2
D、ヌクレオチド位置1919～2439にC2E、ヌクレオチド位置2672～3157にC2F、ヌクレオチ
ド位置3518～4111にWPRE、ヌクレオチド位置5460～6460にアンピシリン（AMP）耐性遺伝
子、ヌクレオチド位置4135～4345にウシ成長ホルモンポリAテール（bGH pA）、およびヌ
クレオチド位置4597～5056にファージ由来f1(+）複製起点（ORI）を有する。
ーは図12に図示されるpAAV-SA-3'mOTOF-EWB（SEQID NO：40）である。pAAV-SA-3'mOTOF-
EWBベクターは7548 bp長であり、かつヌクレオチド位置2～52にスプライシングアクセプ
ター（SA）部位、ヌクレオチド位置53～3463に3'mOTOF、ヌクレオチド位置413～814にC2
D、ヌクレオチド位置1919～2439にC2E、ヌクレオチド位置2672～3157にC2F、ヌクレオチ
ド位置3518～4111にWPRE、ヌクレオチド位置5460～6460にアンピシリン（AMP）耐性遺伝
子、ヌクレオチド位置4135～4345にウシ成長ホルモンポリAテール（bGH pA）、およびヌ
クレオチド位置4597～5056にファージ由来f1(+）複製起点（ORI）を有する。
【0207】
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、ベクタ
ーは、図13に記載されているpAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD（SEQID NO：41）である。p
AAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SDベクターは7346bp長であり、かつヌクレオチド位置662～6
67にKozak配列(*）、ヌクレオチド位置668～1384に高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP）配
列、ヌクレオチド位置1391～1456にP2A、ヌクレオチド位置1463～1468にKozak配列、ヌク
レオチド位置1469～3988に5'mOTOF配列、ヌクレオチド位置1469～1831にC2A、ヌクレオ
チド位置2231～2599にC2B、ヌクレオチド位置2720～3091にC2C、ヌクレオチド位置3872～
3988にヒトOTOFエクソン21、ヌクレオチド位置3989～4070にスプライシングドナー（SD）
部位、ヌクレオチド位置5186～6186にAMP耐性遺伝子、ヌクレオチド位置4323～4782にf1(
+）ORI、ヌクレオチド位置6436～6661にORI、およびヌクレオチド位置7277～272にヒトサ
イトメガロウイルス（hCMV）エンハンサーを有する。
ーは、図13に記載されているpAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD（SEQID NO：41）である。p
AAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SDベクターは7346bp長であり、かつヌクレオチド位置662～6
67にKozak配列(*）、ヌクレオチド位置668～1384に高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP）配
列、ヌクレオチド位置1391～1456にP2A、ヌクレオチド位置1463～1468にKozak配列、ヌク
レオチド位置1469～3988に5'mOTOF配列、ヌクレオチド位置1469～1831にC2A、ヌクレオ
チド位置2231～2599にC2B、ヌクレオチド位置2720～3091にC2C、ヌクレオチド位置3872～
3988にヒトOTOFエクソン21、ヌクレオチド位置3989～4070にスプライシングドナー（SD）
部位、ヌクレオチド位置5186～6186にAMP耐性遺伝子、ヌクレオチド位置4323～4782にf1(
+）ORI、ヌクレオチド位置6436～6661にORI、およびヌクレオチド位置7277～272にヒトサ
イトメガロウイルス（hCMV）エンハンサーを有する。
【0208】
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかのいくつかの態様において、ベクタ
ーは、図14に図示されるpAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD-AK（SEQID NO：42）である。pA
AV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD-AKは7423bp長であり、かつヌクレオチド位置662～667にKo
zak配列(*）、ヌクレオチド位置668～1384に高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP）配列、ヌ
クレオチド位置1391～1456にP2A、ヌクレオチド位置1463～1468にKozak配列、ヌクレオチ
ド位置1469～3988に5'mOTOF配列、ヌクレオチド位置1469～1831にC2A、ヌクレオチド位
置2231～2599にC2B、ヌクレオチド位置2720～3091にC2C、ヌクレオチド位置3872～3988に
ヒトOTOFエクソン21、ヌクレオチド位置3989～4070にスプライシングドナー（SD）部位、
ヌクレオチド位置4071～4147にAK配列、ヌクレオチド位置5263～6263にAMP耐性遺伝子、
ヌクレオチド位置4400～4859にf1(+）ORI、ヌクレオチド位置6513～6738にORI、およびヌ
クレオチド位置7354～272にヒトサイトメガロウイルス（hCMV）エンハンサーを有する。
ーは、図14に図示されるpAAV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD-AK（SEQID NO：42）である。pA
AV-HBA-eGFP-P2A-5'mOTOF-SD-AKは7423bp長であり、かつヌクレオチド位置662～667にKo
zak配列(*）、ヌクレオチド位置668～1384に高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP）配列、ヌ
クレオチド位置1391～1456にP2A、ヌクレオチド位置1463～1468にKozak配列、ヌクレオチ
ド位置1469～3988に5'mOTOF配列、ヌクレオチド位置1469～1831にC2A、ヌクレオチド位
置2231～2599にC2B、ヌクレオチド位置2720～3091にC2C、ヌクレオチド位置3872～3988に
ヒトOTOFエクソン21、ヌクレオチド位置3989～4070にスプライシングドナー（SD）部位、
ヌクレオチド位置4071～4147にAK配列、ヌクレオチド位置5263～6263にAMP耐性遺伝子、
ヌクレオチド位置4400～4859にf1(+）ORI、ヌクレオチド位置6513～6738にORI、およびヌ
クレオチド位置7354～272にヒトサイトメガロウイルス（hCMV）エンハンサーを有する。
【0209】
本明細書において提供されるベクターはさまざまなサイズのベクターでありうる。本明
細書に記載されている組成物、キット、および方法のうちのいずれかで使用されるベクタ
ーの選択は、ベクターのサイズに左右される可能性がある。
細書に記載されている組成物、キット、および方法のうちのいずれかで使用されるベクタ
ーの選択は、ベクターのサイズに左右される可能性がある。
【0210】
いくつかの態様において、ベクターはプラスミドであり、かつ最長約1 kb、最長約2 kb
、最長約3 kb、最長約4kb、最長約5 kb、最長約6 kb、最長約7 kb、最長約8kb、最長約9
kb、最長約10kb、最長約11 kb、最長約12 kb、最長約13 kb、最長約14 kb、または最長
約15 kbの全長を含み得る。いくつかの態様において、ベクターはプラスミドであり、か
つ約1 kb～約2kb、約1 kb～約3 kb、約1 kb～約4 kb、約1 kb～約5 kb、約1 kb～約6 kb
、約1 kb～約7kb、約1 kb～約8 kb、約1 kb～約9 kb、約1 kb～約10 kb、約1 kb～約11
kb、約1 kb～約12 kb、約1kb～約13 kb、約1 kb～約14 kb、または約1 kb～約15 kbの範
囲の全長を含み得る。
、最長約3 kb、最長約4kb、最長約5 kb、最長約6 kb、最長約7 kb、最長約8kb、最長約9
kb、最長約10kb、最長約11 kb、最長約12 kb、最長約13 kb、最長約14 kb、または最長
約15 kbの全長を含み得る。いくつかの態様において、ベクターはプラスミドであり、か
つ約1 kb～約2kb、約1 kb～約3 kb、約1 kb～約4 kb、約1 kb～約5 kb、約1 kb～約6 kb
、約1 kb～約7kb、約1 kb～約8 kb、約1 kb～約9 kb、約1 kb～約10 kb、約1 kb～約11
kb、約1 kb～約12 kb、約1kb～約13 kb、約1 kb～約14 kb、または約1 kb～約15 kbの範
囲の全長を含み得る。
【0211】
いくつかの態様において、ベクターはトランスポゾン（例えば、PiggyBacトランスポゾ
ン）であり、かつ200kb超を含み得る。いくつかの例では、ベクターは、約1 kb～約10 k
b、約1 kb～約20 kb、約1kb～約30 kb、約1 kb～約40 kb、約1 kb～約50 kb、約1 kb～
約60 kb、約1kb～約70 kb、約1 kb～約80 kb、約1 kb～約90 kb、約10 kb～約20 kb、約
10 kb～約30 kb、約10kb～約40 kb、約10 kb～約50 kb、約10 kb～約60 kb、約10 kb～
約70 kb、約10kb～約90 kb、約10 kb～約100 kb、約20 kb～約30 kb、約20 kb～約40 kb
、約20 kb～約50kb、約20 kb～約60 kb、約20 kb～約70 kb、約20 kb～約80 kb、約20 k
b～約90 kb、約20 kb～約100kb、約30 kb～約40 kb、約30 kb～約50 kb、約30 kb～約60
kb、約30 kb～約70kb、約30 kb～約80 kb、約30 kb～約90 kb、約30 kb～約100 kb、約
40 kb～約50 kb、約40kb～約60 kb、約40 kb～約70 kb、約40 kb～約80 kb、約40 kb～
約90 kb、約40kb～約100 kb、約50 kb～約60 kb、約50 kb～約70 kb、約50 kb～約80 kb
、約50 kb～約90kb、約50 kb～約100 kb、約60 kb～約70 kb、約60 kb～約80 kb、約60
kb～約90 kb、約60kb～約100 kb、約70 kb～約80 kb、約70 kb～約90 kb、約70 kb～約1
00 kb、約80 kb～約90kb、約80 kb～約100 kb、約90 kb～約100 kb、約1 kb～約100 kb
、約100 kb～約200kb、約100 kb～約300 kb、約100 kb～約400 kb、または約100 kb～約
500 kbの範囲の全長を有するトランスポゾンである。
ン）であり、かつ200kb超を含み得る。いくつかの例では、ベクターは、約1 kb～約10 k
b、約1 kb～約20 kb、約1kb～約30 kb、約1 kb～約40 kb、約1 kb～約50 kb、約1 kb～
約60 kb、約1kb～約70 kb、約1 kb～約80 kb、約1 kb～約90 kb、約10 kb～約20 kb、約
10 kb～約30 kb、約10kb～約40 kb、約10 kb～約50 kb、約10 kb～約60 kb、約10 kb～
約70 kb、約10kb～約90 kb、約10 kb～約100 kb、約20 kb～約30 kb、約20 kb～約40 kb
、約20 kb～約50kb、約20 kb～約60 kb、約20 kb～約70 kb、約20 kb～約80 kb、約20 k
b～約90 kb、約20 kb～約100kb、約30 kb～約40 kb、約30 kb～約50 kb、約30 kb～約60
kb、約30 kb～約70kb、約30 kb～約80 kb、約30 kb～約90 kb、約30 kb～約100 kb、約
40 kb～約50 kb、約40kb～約60 kb、約40 kb～約70 kb、約40 kb～約80 kb、約40 kb～
約90 kb、約40kb～約100 kb、約50 kb～約60 kb、約50 kb～約70 kb、約50 kb～約80 kb
、約50 kb～約90kb、約50 kb～約100 kb、約60 kb～約70 kb、約60 kb～約80 kb、約60
kb～約90 kb、約60kb～約100 kb、約70 kb～約80 kb、約70 kb～約90 kb、約70 kb～約1
00 kb、約80 kb～約90kb、約80 kb～約100 kb、約90 kb～約100 kb、約1 kb～約100 kb
、約100 kb～約200kb、約100 kb～約300 kb、約100 kb～約400 kb、または約100 kb～約
500 kbの範囲の全長を有するトランスポゾンである。
【0212】
いくつかの態様において、ベクターはコスミドであり、かつ最長55 kbの全長を有し得
る。いくつかの例では、ベクターはコスミドであり、かつ約1 kb～約10 kb、約1 kb～約2
0 kb、約1 kb～約30kb、約1 kb～約40 kb、約1 kb～約50 kb、約1 kb～約55 kb、約10 k
b～約20 kb、約10 kb～約30kb、約10 kb～約40 kb、約10 kb～約50 kb、約10 kb～約55
kb、約15 kb～約55kb、約15 kb～約50 kb、約15 kb～約40 kb、約15 kb～約30 kb、約15
kb～約20 kb、約20kb～約55 kb、約20 kb～約50 kb、約20 kb～約40 kb、約20 kb～約3
0 kb、約25 kb～約55kb、約25 kb～約50 kb、約25 kb～約40 kb、約25 kb～約30 kb、約
30 kb～約55 kb、約30kb～約50 kb、約30 kb～約40 kb、約35 kb～約55 kb、約40 kb～
約55 kb、約40kb～約50 kb、または約45 kb～約55 kbの総ヌクレオチド数を有する。
る。いくつかの例では、ベクターはコスミドであり、かつ約1 kb～約10 kb、約1 kb～約2
0 kb、約1 kb～約30kb、約1 kb～約40 kb、約1 kb～約50 kb、約1 kb～約55 kb、約10 k
b～約20 kb、約10 kb～約30kb、約10 kb～約40 kb、約10 kb～約50 kb、約10 kb～約55
kb、約15 kb～約55kb、約15 kb～約50 kb、約15 kb～約40 kb、約15 kb～約30 kb、約15
kb～約20 kb、約20kb～約55 kb、約20 kb～約50 kb、約20 kb～約40 kb、約20 kb～約3
0 kb、約25 kb～約55kb、約25 kb～約50 kb、約25 kb～約40 kb、約25 kb～約30 kb、約
30 kb～約55 kb、約30kb～約50 kb、約30 kb～約40 kb、約35 kb～約55 kb、約40 kb～
約55 kb、約40kb～約50 kb、または約45 kb～約55 kbの総ヌクレオチド数を有する。
【0213】
いくつかの態様において、ベクターは人工染色体であり、かつ約100 kb～約2000 kbの
総ヌクレオチド数を有し得る。いくつかの態様において、人工染色体はヒト人工染色体（
HAC）であり、かつ約1 kb～約10kb、1 kb～約20 kb、約1 kb～約30 kb、約1 kb～約40 k
b、約1 kb～約50 kb、約1kb～約60 kb、約10 kb～約20 kb、約10 kb～約30 kb、約10 kb
～約40 kb、約10kb～約50 kb、約10 kb～約60 kb、約20 kb～約30 kb、約20 kb～約40 k
b、約20 kb～約50 kb、約20kb～約60 kb、約30 kb～約40 kb、約30 kb～約50 kb、約30
kb～約60 kb、約40kb～約50 kb、約40 kb～約60 kb、または約50 kb～約60 kbの範囲の
総ヌクレオチド数を有し得る。
総ヌクレオチド数を有し得る。いくつかの態様において、人工染色体はヒト人工染色体（
HAC）であり、かつ約1 kb～約10kb、1 kb～約20 kb、約1 kb～約30 kb、約1 kb～約40 k
b、約1 kb～約50 kb、約1kb～約60 kb、約10 kb～約20 kb、約10 kb～約30 kb、約10 kb
～約40 kb、約10kb～約50 kb、約10 kb～約60 kb、約20 kb～約30 kb、約20 kb～約40 k
b、約20 kb～約50 kb、約20kb～約60 kb、約30 kb～約40 kb、約30 kb～約50 kb、約30
kb～約60 kb、約40kb～約50 kb、約40 kb～約60 kb、または約50 kb～約60 kbの範囲の
総ヌクレオチド数を有し得る。
【0214】
いくつかの態様において、人工染色体は酵母人工染色体（YAC）であり、かつ最大1000
kbの総ヌクレオチド数を有し得る。いくつかの態様において、人工染色体は、約100kb～
約1,000 kb、約100kb～約900 kb、約100 kb～約800 kb、約100 kb～約700 kb、約100 kb
～約600 kb、約100kb～約500 kb、約100 kb～約400 kb、約100 kb～約300 kb、約100 kb
～約200 kb、約200kb～約1,000 kb、約200 kb～約900 kb、約200 kb～約800 kb、約200
kb～約700 kb、約200kb～約600 kb、約200 kb～約500 kb、約200 kb～約400 kb、約200
kb～約300 kb、約300kb～約1,000 kb、約300 kb～約900 kb、約300 kb～約800 kb、約30
0 kb～約700 kb、約300kb～約600 kb、約300 kb～約500 kb、約300 kb～約400 kb、約40
0 kb～約1,000 kb、約400kb～約900 kb、約400 kb～約800 kb、約400 kb～約700 kb、約
400 kb～約600 kb、約400kb～約500 kb、約500 kb～約1,000 kb、約500 kb～約900 kb、
約500 kb～約800kb、約500 kb～約700 kb、約500 kb～約600 kb、約600 kb～約1,000 kb
、約600 kb～約900kb、約600 kb～約800 kb、約600 kb～約700 kb、約700 kb～約1,000
kb、約700 kb～約900kb、約700 kb～約800 kb、約800 kb～約1,000 kb、約800 kb～約90
0 kb、または約900 kb～約1,000kbの範囲の総ヌクレオチド数を有するYACである。
kbの総ヌクレオチド数を有し得る。いくつかの態様において、人工染色体は、約100kb～
約1,000 kb、約100kb～約900 kb、約100 kb～約800 kb、約100 kb～約700 kb、約100 kb
～約600 kb、約100kb～約500 kb、約100 kb～約400 kb、約100 kb～約300 kb、約100 kb
～約200 kb、約200kb～約1,000 kb、約200 kb～約900 kb、約200 kb～約800 kb、約200
kb～約700 kb、約200kb～約600 kb、約200 kb～約500 kb、約200 kb～約400 kb、約200
kb～約300 kb、約300kb～約1,000 kb、約300 kb～約900 kb、約300 kb～約800 kb、約30
0 kb～約700 kb、約300kb～約600 kb、約300 kb～約500 kb、約300 kb～約400 kb、約40
0 kb～約1,000 kb、約400kb～約900 kb、約400 kb～約800 kb、約400 kb～約700 kb、約
400 kb～約600 kb、約400kb～約500 kb、約500 kb～約1,000 kb、約500 kb～約900 kb、
約500 kb～約800kb、約500 kb～約700 kb、約500 kb～約600 kb、約600 kb～約1,000 kb
、約600 kb～約900kb、約600 kb～約800 kb、約600 kb～約700 kb、約700 kb～約1,000
kb、約700 kb～約900kb、約700 kb～約800 kb、約800 kb～約1,000 kb、約800 kb～約90
0 kb、または約900 kb～約1,000kbの範囲の総ヌクレオチド数を有するYACである。
【0215】
いくつかの態様において、人工染色体は細菌人工染色体（BAC）であり、かつ最大750 k
bの総ヌクレオチド数を有し得る。いくつかの態様において、人工染色体はBACであり、か
つ約100 kb～約750kb、約100 kb～約700 kb、約100 kb～約600 kb、約100 kb～約500 kb
、約100 kb～約400kb、約100 kb～約300 kb、約100 kb～約200 kb、約150 kb～約750 kb
、約150 kb～約700kb、約150 kb～約600 kb、約150 kb～約500 kb、約150 kb～約400 kb
、約150 kb～約300kb、約150 kb～約200 kb、約200 kb～約750 kb、約200 kb～約700 kb
、約200 kb～約600kb、約200 kb～約500 kb、約200 kb～約400 kb、約200 kb～約300 kb
、約250 kb～約750kb、約250 kb～約700 kb、約250 kb～約600 kb、約250 kb～約500 kb
、約250 kb～約400kb、約250 kb～約300 kb、約300 kb～約750 kb、約300 kb～約700 kb
、約300 kb～約600kb、約300 kb～約500 kb、約300 kb～約400 kb、約350 kb～約750 kb
、約350 kb～約700kb、約350 kb～約600 kb、約350 kb～約500 kb、約350 kb～約400 kb
、約400 kb～約750kb、約400 kb～約700 kb、約450 kb～約600 kb、約450 kb～約500 kb
、約500 kb～約750kb、約500 kb～約700 kb、約500 kb～約600 kb、約550 kb～約750 kb
、約550 kb～約700kb、約550 kb～約600 kb、約600 kb～約750 kb、約600 kb～約700 kb
、または約650kb～約750 kbの範囲の総ヌクレオチド数を有し得る。
bの総ヌクレオチド数を有し得る。いくつかの態様において、人工染色体はBACであり、か
つ約100 kb～約750kb、約100 kb～約700 kb、約100 kb～約600 kb、約100 kb～約500 kb
、約100 kb～約400kb、約100 kb～約300 kb、約100 kb～約200 kb、約150 kb～約750 kb
、約150 kb～約700kb、約150 kb～約600 kb、約150 kb～約500 kb、約150 kb～約400 kb
、約150 kb～約300kb、約150 kb～約200 kb、約200 kb～約750 kb、約200 kb～約700 kb
、約200 kb～約600kb、約200 kb～約500 kb、約200 kb～約400 kb、約200 kb～約300 kb
、約250 kb～約750kb、約250 kb～約700 kb、約250 kb～約600 kb、約250 kb～約500 kb
、約250 kb～約400kb、約250 kb～約300 kb、約300 kb～約750 kb、約300 kb～約700 kb
、約300 kb～約600kb、約300 kb～約500 kb、約300 kb～約400 kb、約350 kb～約750 kb
、約350 kb～約700kb、約350 kb～約600 kb、約350 kb～約500 kb、約350 kb～約400 kb
、約400 kb～約750kb、約400 kb～約700 kb、約450 kb～約600 kb、約450 kb～約500 kb
、約500 kb～約750kb、約500 kb～約700 kb、約500 kb～約600 kb、約550 kb～約750 kb
、約550 kb～約700kb、約550 kb～約600 kb、約600 kb～約750 kb、約600 kb～約700 kb
、または約650kb～約750 kbの範囲の総ヌクレオチド数を有し得る。
【0216】
いくつかの態様において、人工染色体はP1由来人工染色体（PAC）であり、かつ最大300
kbの総ヌクレオチド数を有し得る。いくつかの態様において、P1由来人工染色体は、約1
00 kb～約300 kb、約100kb～約200 kb、または約200 kb～約300 kbの範囲の総ヌクレオ
チド数を有し得る。
kbの総ヌクレオチド数を有し得る。いくつかの態様において、P1由来人工染色体は、約1
00 kb～約300 kb、約100kb～約200 kb、または約200 kb～約300 kbの範囲の総ヌクレオ
チド数を有し得る。
【0217】
いくつかの態様において、ベクターはウイルスベクターであり、かつ最大10 kbの総ヌ
クレオチド数を有し得る。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、約1 kb～約2
kb、1 kb～約3 kb、約1kb～約4 kb、約1 kb～約5 kb、約1 kb～約6 kb、約1 kb～約7 kb
、約1 kb～約8kb、約1 kb～約9 kb、約1 kb～約10 kb、約2 kb～約3 kb、約2 kb～約4 k
b、約2 kb～約5 kb、約2kb～約6 kb、約2 kb～約7 kb、約2 kb～約8 kb、約2 kb～約9 k
b、約2 kb～約10 kb、約3kb～約4 kb、約3 kb～約5 kb、約3 kb～約6 kb、約3 kb～約7
kb、約3 kb～約8 kb、約3kb～約9 kb、約3 kb～約10 kb、約4 kb～約5 kb、約4 kb～約6
kb、約4 kb～約7kb、約4 kb～約8 kb、約4 kb～約9 kb、約4 kb～約10 kb、約5 kb～約
6 kb、約5 kb～約7kb、約5 kb～約8 kb、約5 kb～約9 kb、約5 kb～約10 kb、約6 kb～
約7 kb、約6kb～約8 kb、約6 kb～約9 kb、約6 kb～約10 kb、約7 kb～約8 kb、約7 kb
～約9 kb、約7kb～約10 kb、約8 kb～約9 kb、約8 kb～約10 kb、または約9 kb～約10 k
bの範囲の総ヌクレオチド数を有し得る。
クレオチド数を有し得る。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、約1 kb～約2
kb、1 kb～約3 kb、約1kb～約4 kb、約1 kb～約5 kb、約1 kb～約6 kb、約1 kb～約7 kb
、約1 kb～約8kb、約1 kb～約9 kb、約1 kb～約10 kb、約2 kb～約3 kb、約2 kb～約4 k
b、約2 kb～約5 kb、約2kb～約6 kb、約2 kb～約7 kb、約2 kb～約8 kb、約2 kb～約9 k
b、約2 kb～約10 kb、約3kb～約4 kb、約3 kb～約5 kb、約3 kb～約6 kb、約3 kb～約7
kb、約3 kb～約8 kb、約3kb～約9 kb、約3 kb～約10 kb、約4 kb～約5 kb、約4 kb～約6
kb、約4 kb～約7kb、約4 kb～約8 kb、約4 kb～約9 kb、約4 kb～約10 kb、約5 kb～約
6 kb、約5 kb～約7kb、約5 kb～約8 kb、約5 kb～約9 kb、約5 kb～約10 kb、約6 kb～
約7 kb、約6kb～約8 kb、約6 kb～約9 kb、約6 kb～約10 kb、約7 kb～約8 kb、約7 kb
～約9 kb、約7kb～約10 kb、約8 kb～約9 kb、約8 kb～約10 kb、または約9 kb～約10 k
bの範囲の総ヌクレオチド数を有し得る。
【0218】
いくつかの態様において、ベクターはレンチウイルスであり、かつ最大8 kbの総ヌクレ
オチド数を有し得る。いくつかの例では、レンチウイルスは、約1 kb～約2 kb、約1 kb～
約3 kb、約1kb～約4 kb、約1 kb～約5 kb、約1 kb～約6 kb、約1 kb～約7 kb、約1 kb～
約8 kb、約2kb～約3 kb、約2 kb～約4 kb、約2 kb～約5 kb、約2 kb～約6 kb、約2 kb～
約7 kb、約2kb～約8 kb、約3 kb～約4 kb、約3 kb～約5 kb、約3 kb～約6 kb、約3 kb～
約7 kb、約3kb～約8 kb、約4 kb～約5 kb、約4 kb～約6 kb、約4 kb～約7 kb、約4 kb～
約8 kb、約5kb～約6 kb、約5 kb～約7 kb、約5 kb～約8 kb、約6 kb～約8kb、約6 kb～
約7 kb、または約7kb～約8 kbの総ヌクレオチド数を有し得る。
オチド数を有し得る。いくつかの例では、レンチウイルスは、約1 kb～約2 kb、約1 kb～
約3 kb、約1kb～約4 kb、約1 kb～約5 kb、約1 kb～約6 kb、約1 kb～約7 kb、約1 kb～
約8 kb、約2kb～約3 kb、約2 kb～約4 kb、約2 kb～約5 kb、約2 kb～約6 kb、約2 kb～
約7 kb、約2kb～約8 kb、約3 kb～約4 kb、約3 kb～約5 kb、約3 kb～約6 kb、約3 kb～
約7 kb、約3kb～約8 kb、約4 kb～約5 kb、約4 kb～約6 kb、約4 kb～約7 kb、約4 kb～
約8 kb、約5kb～約6 kb、約5 kb～約7 kb、約5 kb～約8 kb、約6 kb～約8kb、約6 kb～
約7 kb、または約7kb～約8 kbの総ヌクレオチド数を有し得る。
【0219】
いくつかの態様において、ベクターはアデノウイルスであり、かつ最大で8 kbの総ヌク
レオチド数を有し得る。いくつかの態様において、アデノウイルスは、約1 kb～約2 kb、
約1 kb～約3kb、約1 kb～約4 kb、約1 kb～約5 kb、約1 kb～約6 kb、約1 kb～約7 kb、
約1 kb～約8kb、約2 kb～約3 kb、約2 kb～約4 kb、約2 kb～約5 kb、約2 kb～約6 kb、
約2 kb～約7kb、約2 kb～約8 kb、約3 kb～約4 kb、約3 kb～約5 kb、約3 kb～約6 kb、
約3 kb～約7kb、約3 kb～約8 kb、約4 kb～約5 kb、約4 kb～約6 kb、約4 kb～約7 kb、
約4 kb～約8kb、約5 kb～約6 kb、約5 kb～約7 kb、約5 kb～約8 kb、約6 kb～約7 kb、
約6 kb～約8kb、または約7 kb～約8 kbの範囲の総ヌクレオチド数を有し得る。
レオチド数を有し得る。いくつかの態様において、アデノウイルスは、約1 kb～約2 kb、
約1 kb～約3kb、約1 kb～約4 kb、約1 kb～約5 kb、約1 kb～約6 kb、約1 kb～約7 kb、
約1 kb～約8kb、約2 kb～約3 kb、約2 kb～約4 kb、約2 kb～約5 kb、約2 kb～約6 kb、
約2 kb～約7kb、約2 kb～約8 kb、約3 kb～約4 kb、約3 kb～約5 kb、約3 kb～約6 kb、
約3 kb～約7kb、約3 kb～約8 kb、約4 kb～約5 kb、約4 kb～約6 kb、約4 kb～約7 kb、
約4 kb～約8kb、約5 kb～約6 kb、約5 kb～約7 kb、約5 kb～約8 kb、約6 kb～約7 kb、
約6 kb～約8kb、または約7 kb～約8 kbの範囲の総ヌクレオチド数を有し得る。
【0220】
いくつかの態様において、ベクターはアデノ随伴ウイルス（AAVベクター）であり、か
つ最大5 kbの総ヌクレオチド数を有し得る。いくつかの態様において、AAVベクターは、
約1 kb～約2kb、約1 kb～約3 kb、約1 kb～約4 kb、約1 kb～約5 kb、約2 kb～約3 kb、
約2 kb～約4kb、約2 kb～約5kb、約3 kb～約4 kb、約3 kb～約5 kb、または約4 kb～約5
kbの範囲の総ヌクレオチド数を含み得る。
つ最大5 kbの総ヌクレオチド数を有し得る。いくつかの態様において、AAVベクターは、
約1 kb～約2kb、約1 kb～約3 kb、約1 kb～約4 kb、約1 kb～約5 kb、約2 kb～約3 kb、
約2 kb～約4kb、約2 kb～約5kb、約3 kb～約4 kb、約3 kb～約5 kb、または約4 kb～約5
kbの範囲の総ヌクレオチド数を含み得る。
【0221】
いくつかの態様において、ベクターはGateway(登録商標)ベクターであり、かつ最大5 k
bの総ヌクレオチド数を含み得る。いくつかの態様において、各Gateway(登録商標)ベクタ
ーは、約1 kb～約2kb、約1 kb～約3 kb、約1 kb～約4 kb、約1 kb～約5 kb、約2 kb～約
3 kb、約2 kb～約4kb、約2 kb～約5 kb、約3 kb～約4 kb、約3 kb～約5 kb、または約4
kb～約5 kbの範囲の総ヌクレオチド数を含む。
bの総ヌクレオチド数を含み得る。いくつかの態様において、各Gateway(登録商標)ベクタ
ーは、約1 kb～約2kb、約1 kb～約3 kb、約1 kb～約4 kb、約1 kb～約5 kb、約2 kb～約
3 kb、約2 kb～約4kb、約2 kb～約5 kb、約3 kb～約4 kb、約3 kb～約5 kb、または約4
kb～約5 kbの範囲の総ヌクレオチド数を含む。
【0222】
本明細書において提供される組成物、キット、および方法のうちのいずれかのいくつか
の態様において、少なくとも2つの異なるベクターは実質的に同じ種類のベクターである
ことができ、かつサイズは異なってもよい。いくつかの態様において、少なくとも2つの
異なるベクターは異なる種類のベクターであることができ、かつ実質的に同じサイズであ
ってもよく、異なるサイズを有してもよい。
の態様において、少なくとも2つの異なるベクターは実質的に同じ種類のベクターである
ことができ、かつサイズは異なってもよい。いくつかの態様において、少なくとも2つの
異なるベクターは異なる種類のベクターであることができ、かつ実質的に同じサイズであ
ってもよく、異なるサイズを有してもよい。
【0223】
いくつかの態様において、少なくとも2つのベクターのうちのいずれかは、約500ヌクレ
オチド～約10,000ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約500ヌク
レオチド～約9,000ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約500ヌク
レオチド～約8,000ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約500ヌク
レオチド～約7,600ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約500ヌク
レオチド～約7,200ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約500ヌク
レオチド～約6,800ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約500ヌク
レオチド～約6,400ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約500ヌク
レオチド～約6,000ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約500ヌク
レオチド～約5,600ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチド、約500ヌク
レオチド～約5,200ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約500ヌク
レオチド～約4,800ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約4,400ヌ
クレオチド、約500ヌクレオチド～約4,200ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約4,000ヌ
クレオチド、約500ヌクレオチド～約3,800ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約3,600ヌ
クレオチド、約500ヌクレオチド～約3,400ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約3,200ヌ
クレオチド、約500ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約2,800ヌ
クレオチド、約500ヌクレオチド～約2,600ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約2,400ヌ
クレオチド、約500ヌクレオチド～約2,200ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約2,000ヌ
クレオチド、約500ヌクレオチド～約1,800ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約1,600ヌ
クレオチド、約500ヌクレオチド～約1,400ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約1,200ヌ
クレオチド、約500ヌクレオチド～約1,000ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約800ヌク
レオチド、約800ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約9,500ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約8,500ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約7,800ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約7,400ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約7,000ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約6,600ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約6,200ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約5,800ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約5,400ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約5,000ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約4,600ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約4,200ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約3,800ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約3,600ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約3,400ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約3,200ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約3,000ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約2,800ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約2,600ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約2,400ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約2,200ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約1,800ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約1,600ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約1,400ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約1,200ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約1,000ヌ
クレオチド、約1,000ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約9,
000ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～
約8,000ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチ
ド～約7,600ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約1,000ヌクレ
オチド～約7,200ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約1,000ヌ
クレオチド～約6,800ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約1,0
00ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、
約1,000ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチ
ド、約1,000ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約5,400ヌクレ
オチド、約1,000ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約5,000ヌ
クレオチド、約1,000ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約4,6
00ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～
約4,200ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチ
ド～約3,800ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約3,600ヌクレオチド、約1,000ヌクレ
オチド～約3,400ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約3,200ヌクレオチド、約1,000ヌ
クレオチド～約3,000ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約2,600ヌクレオチド、約1,0
00ヌクレオチド～約2,400ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約2,200ヌクレオチド、
約1,000ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約1,800ヌクレオチ
ド、約1,000ヌクレオチド～約1,600ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約1,400ヌクレ
オチド、約1,000ヌクレオチド～約1,200ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約10,000
ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約9
,000ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド
～約8,000ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約1,200ヌクレオ
チド～約7,600ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約1,200ヌク
レオチド～約7,200ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約1,200
ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約1
,200ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド
、約1,200ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約5,800ヌクレオ
チド、約1,200ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約5,400ヌク
レオチド、約1,200ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約4,800
ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約4,600ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約4
,400ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約4,200ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド
～約4,000ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約3,800ヌクレオチド、約1,200ヌクレオ
チド～約3,600ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約3,400ヌクレオチド、約1,200ヌク
レオチド～約3,200ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約1,200
ヌクレオチド～約2,800ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約2,600ヌクレオチド、約1
,200ヌクレオチド～約2,400ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約2,200ヌクレオチド
、約1,200ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約1,800ヌクレオ
チド、約1,200ヌクレオチド～約1,600ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約1,400ヌク
レオチド、約1,400ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約9,50
0ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約
8,500ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド
～約7,800ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約1,400ヌクレオ
チド～約7,400ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約1,400ヌク
レオチド～約7,000ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約1,400
ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約1
,400ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド
、約1,400ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約5,600ヌクレオ
チド、約1,400ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約5,200ヌク
レオチド、約1,400ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約4,800
ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約4,600ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約4
,400ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約4,200ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド
～約4,000ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約3,800ヌクレオチド、約1,400ヌクレオ
チド～約3,600ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約3,400ヌクレオチド、約1,400ヌク
レオチド～約3,200ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約1,400
ヌクレオチド～約2,600ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約2,400ヌクレオチド、約1
,400ヌクレオチド～約2,200ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド
、約1,400ヌクレオチド～約1,800ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約1,600ヌクレオ
チド、約1,600ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約9,500ヌ
クレオチド、約1,600ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約8,5
00ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～
約7,800ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチ
ド～約7,400ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約1,600ヌクレ
オチド～約7,000ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約1,600ヌ
クレオチド～約6,400ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約1,6
00ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、
約1,600ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチ
ド、約1,600ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約5,000ヌクレ
オチド、約1,600ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約4,600ヌ
クレオチド、約1,600ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約4,2
00ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～
約3,800ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約3,600ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチ
ド～約3,400ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約3,200ヌクレオチド、約1,600ヌクレ
オチド～約3,000ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約2,800ヌクレオチド、約1,600ヌ
クレオチド～約2,600ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約2,400ヌクレオチド、約1,6
00ヌクレオチド～約2,200ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド、
約1,600ヌクレオチド～約1,800ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約10,000ヌクレオ
チド、約1,800ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約9,000ヌク
レオチド、約1,800ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約8,000
ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約7
,600ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド
～約7,200ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約1,800ヌクレオ
チド～約6,800ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約1,800ヌク
レオチド～約6,400ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約1,800
ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約1
,800ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチド
、約1,800ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約5,000ヌクレオ
チド、約1,800ヌクレオチ
ド～約4,800ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約4,600ヌクレオチド、約1,800ヌクレ
オチド～約4,400ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約4,200ヌクレオチド、約1,800ヌ
クレオチド～約4,000ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約3,800ヌクレオチド、約1,8
00ヌクレオチド～約3,600ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約3,400ヌクレオチド、
約1,800ヌクレオチド～約3,200ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチ
ド、約1,800ヌクレオチド～約2,800ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約2,600ヌクレ
オチド、約1,800ヌクレオチド～約2,400ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約2,200ヌ
クレオチド、約1,800ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約10,
000ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～
約9,000ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチ
ド～約8,000ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約2,000ヌクレ
オチド～約7,600ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約2,000ヌ
クレオチド～約7,200ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約2,0
00ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、
約2,000ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチ
ド、約2,000ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約5,800ヌクレ
オチド、約2,000ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約5,400ヌ
クレオチド、約2,000ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約5,0
00ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～
約4,600ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチ
ド～約4,200ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約2,000ヌクレ
オチド～約3,800ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約3,600ヌクレオチド、約2,000ヌ
クレオチド～約3,400ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約3,200ヌクレオチド、約2,0
00ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約2,800ヌクレオチド、
約2,000ヌクレオチド～約2,600ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約2,400ヌクレオチ
ド、約2,000ヌクレオチド～約2,200ヌクレオチド、約2,200ヌクレオチド～約10,000ヌク
レオチド、約9,500ヌクレオチド、約9,000ヌクレオチド、約8,500ヌクレオチド、約8,000
ヌクレオチド、約7,800ヌクレオチド、約7,600ヌクレオチド、約7,400ヌクレオチド、約7
,200ヌクレオチド、約7,000ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド
、約6,400ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド、約5,800ヌクレオ
チド、約5,600ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド、約5,000ヌク
レオチド、約4,800ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド、約4,200
ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド、約3
,400ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド
、約2,600ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約10,000ヌクレ
オチド、約2,400ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約9,000ヌ
クレオチド、約2,400ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約8,0
00ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～
約7,600ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチ
ド～約7,200ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約2,400ヌクレ
オチド～約6,800ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約2,400ヌ
クレオチド～約6,400ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約2,4
00ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、
約2,400ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチ
ド、約2,400ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約5,000ヌクレ
オチド、約2,400ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約4,600ヌ
クレオチド、約2,400ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約4,2
00ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～
約3,800ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約3,600ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチ
ド～約3,400ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約3,200ヌクレオチド、約2,400ヌクレ
オチド～約3,000ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約2,800ヌクレオチド、約2,400ヌ
クレオチド～約2,600ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約2,
600ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、
約2,600ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチ
ド、約2,600ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約7,600ヌクレ
オチド、約2,600ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約7,200ヌ
クレオチド、約2,600ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約6,8
00ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～
約6,400ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチ
ド～約6,000ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約2,600ヌクレ
オチド～約5,600ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチド、約2,600ヌ
クレオチド～約5,200ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約2,6
00ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約4,600ヌクレオチド、
約2,600ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約4,200ヌクレオチ
ド、約2,600ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約3,800ヌクレ
オチド、約2,600ヌクレオチド～約3,600ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約3,400ヌ
クレオチド、約2,600ヌクレオチド～約3,200ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約3,0
00ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約2,800ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～
約10,000ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約2,800ヌクレオ
チド～約9,000ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約2,800ヌク
レオチド～約8,000ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約2,800
ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約2
,800ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド
、約2,800ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約6,600ヌクレオ
チド、約2,800ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約6,200ヌク
レオチド、約2,800ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約5,800
ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約5
,400ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド
～約5,000ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約2,800ヌクレオ
チド～約4,600ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約2,800ヌク
レオチド～約4,200ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約2,800
ヌクレオチド～約3,800ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約3,600ヌクレオチド、約2
,800ヌクレオチド～約3,400ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約3,200ヌクレオチド
、約2,800ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約10,000ヌクレ
オチド、約3,000ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約9,000ヌ
クレオチド、約3,000ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約8,0
00ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～
約7,600ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチ
ド～約7,200ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約3,000ヌクレ
オチド～約6,800ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約3,000ヌ
クレオチド～約6,400ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約3,0
00ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、
約3,000ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチ
ド、約3,000ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約5,000ヌクレ
オチド、約3,000ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約4,600ヌ
クレオチド、約3,000ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約4,2
00ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～
約3,800ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約3,600ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチ
ド～約3,400ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約3,200ヌクレオチド、約3,200ヌクレ
オチド～約10,000ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約3,200
ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約3
,200ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド
、約3,200ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約7,400ヌクレオ
チド、約3,200ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約7,000ヌク
レオチド、約3,200ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約6,600
ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約6
,200ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド
～約5,800ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約3,200ヌクレオ
チド～約5,400ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約3,200ヌク
レオチド～約5,000ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約3,200
ヌクレオチド～約4,600ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約3
,200ヌクレオチド～約4,200ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド
、約3,200ヌクレオチド～約3,800ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約3,600ヌクレオ
チド、約3,200ヌクレオチド～約3,400ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約10,000ヌ
クレオチド、約3,400ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約9,0
00ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～
約8,000ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチ
ド～約7,600ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約3,400ヌクレ
オチド～約7,200ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約3,400ヌ
クレオチド～約6,800ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約3,4
00ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、
約3,400ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチ
ド、約3,400ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約5,400ヌクレ
オチド、約3,400ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約5,000ヌ
クレオチド、約3,400ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約4,6
00ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～
約4,200ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチ
ド～約3,800ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約3,600ヌクレオチド、約3,600ヌクレ
オチド～約10,000ヌクレオチド、約
3,600ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド
、約3,600ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約8,000ヌクレオ
チド、約3,600ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約7,600ヌク
レオチド、約3,600ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約7,200
ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約6
,800ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド
～約6,400ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約3,600ヌクレオ
チド～約6,000ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約3,600ヌク
レオチド～約5,600ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチド、約3,600
ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約3
,600ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約4,600ヌクレオチド
、約3,600ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約4,200ヌクレオ
チド、約3,600ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約3,800ヌク
レオチド、約3,800ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約9,50
0ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約
8,500ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド
～約7,800ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約3,800ヌクレオ
チド～約7,400ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約3,800ヌク
レオチド～約7,000ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約3,800
ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約3
,800ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド
、約3,800ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約5,600ヌクレオ
チド、約3,800ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約5,200ヌク
レオチド、約3,800ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約4,800
ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約4,600ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約4
,200ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド
～約10,000ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約4,000ヌクレ
オチド～約9,000ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約4,000ヌ
クレオチド～約8,000ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約4,0
00ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、
約4,000ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチ
ド、約4,000ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約6,600ヌクレ
オチド、約4,000ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約6,200ヌ
クレオチド、約4,000ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約5,8
00ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～
約5,400ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチ
ド～約5,000ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約4,000ヌクレ
オチド～約4,600ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約4,000ヌ
クレオチド～約4,200ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約4,
200ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、
約4,200ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチ
ド、約4,200ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約7,600ヌクレ
オチド、約4,200ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約7,200ヌ
クレオチド、約4,200ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約6,8
00ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～
約6,400ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチ
ド～約6,000ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約4,200ヌクレ
オチド～約5,600ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチド、約4,200ヌ
クレオチド～約5,200ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約4,2
00ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約4,600ヌクレオチド、
約4,200ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約10,000ヌクレオ
チド、約4,400ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約9,000ヌク
レオチド、約4,400ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約8,000
ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約7
,600ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド
～約7,200ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約4,400ヌクレオ
チド～約6,800ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約4,400ヌク
レオチド～約6,400ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約4,400
ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約4
,400ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチド
、約4,400ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約5,000ヌクレオ
チド、約4,400ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約4,600ヌク
レオチド、約4,600ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約9,50
0ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約
8,500ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド
～約7,800ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約4,600ヌクレオ
チド～約7,400ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約4,600ヌク
レオチド～約7,000ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約4,600
ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約4
,600ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド
、約4,600ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約5,600ヌクレオ
チド、約4,600ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約5,200ヌク
レオチド、約4,600ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約4,800
ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約
9,500ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド
～約8,500ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約4,800ヌクレオ
チド～約7,800ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約4,800ヌク
レオチド～約7,400ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約4,800
ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約4
,800ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド
、約4,800ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約6,000ヌクレオ
チド、約4,800ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約5,600ヌク
レオチド、約4,800ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約5,200
ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド～約1
0,000ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド
～約9,000ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約5,000ヌクレオ
チド～約8,000ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約5,000ヌク
レオチド～約7,600ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約5,000
ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約5
,000ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド
、約5,000ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド～約6,200ヌクレオ
チド、約5,000ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド～約5,800ヌク
レオチド、約5,000ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド～約5,400
ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド～約1
0,000ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド
～約9,000ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約5,200ヌクレオ
チド～約8,000ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約5,200ヌク
レオチド～約7,600ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約5,200
ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約5
,200ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド
、約5,200ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド～約6,200ヌクレオ
チド、約5,200ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド～約5,800ヌク
レオチド、約5,200ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド～約5,400
ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド～約
9,500ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド
～約8,500ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約5,400ヌクレオ
チド～約7,800ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約5,400ヌク
レオチド～約7,400ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約5,400
ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約5
,400ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド
、約5,400ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド～約6,000ヌクレオ
チド、約5,400ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド～約5,600ヌク
レオチド、約5,600ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド～約9,50
0ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド～約
8,500ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド
～約7,800ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約5,600ヌクレオ
チド～約7,400ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約5,600ヌク
レオチド～約7,000ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約5,600
ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約5
,600ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド
、約5,600ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド～約10,000ヌクレ
オチド、約5,800ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド～約9,000ヌ
クレオチド、約5,800ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド～約8,0
00ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド～
約7,600ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチ
ド～約7,200ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約5,800ヌクレ
オチド～約6,800ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約5,800ヌ
クレオチド～約6,400ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約5,8
00ヌクレオチド～約6,0
00ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド～
約9,500ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチ
ド～約8,500ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約6,000ヌクレ
オチド～約7,800ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約6,000ヌ
クレオチド～約7,400ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約6,0
00ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、
約6,000ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチ
ド、約6,000ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド～約10,000ヌク
レオチド、約6,200ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド～約8,500
ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド～約7
,800ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド
～約7,400ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約6,200ヌクレオ
チド～約7,000ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約6,200ヌク
レオチド～約6,600ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約6,400
ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約
6,400ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド
、約6,400ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド～約7,800ヌクレオ
チド、約6,400ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド～約7,400ヌク
レオチド、約6,400ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド～約7,000
ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド～約6
,600ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド
～約9,500ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約6,600ヌクレオ
チド～約8,500ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約6,600ヌク
レオチド～約7,800ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約6,600
ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約6
,600ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド
、約6,800ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチド～約9,500ヌクレ
オチド、約6,800ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチド～約8,500ヌ
クレオチド、約6,800ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチド～約7,8
00ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチド～
約7,400ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチ
ド～約7,000ヌクレオチド、約7,000ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約7,000ヌク
レオチド～約9,500ヌクレオチド、約7,000ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約7,000
ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約7,000ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約7
,000ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約7,000ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド
、約7,000ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約7,000ヌクレオチド～約7,200ヌクレオ
チド、約7,200ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約7,200ヌクレオチド～約9,500ヌ
クレオチド、約7,200ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約7,200ヌクレオチド～約8,5
00ヌクレオチド、約7,200ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約7,200ヌクレオチド～
約7,800ヌクレオチド、約7,200ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約7,200ヌクレオチ
ド～約7,400ヌクレオチド、約7,400ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約7,400ヌク
レオチド～約9,500ヌクレオチド、約7,400ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約7,400
ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約7,400ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約7
,400ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約7,400ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド
、約7,600ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約7,600ヌクレオチド～約9,500ヌクレ
オチド、約7,600ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約7,600ヌクレオチド～約8,500ヌ
クレオチド、約7,600ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約7,600ヌクレオチド～約7,8
00ヌクレオチド、約7,800ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約7,800ヌクレオチド～
約9,500ヌクレオチド、約7,800ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約7,800ヌクレオチ
ド～約8,500ヌクレオチド、約7,800ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約8,000ヌクレ
オチド～約10,000ヌクレオチド、約8,000ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約8,000
ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約8,000ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約8
,500ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約8,500ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド
、約8,500ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約9,000ヌクレオチド～約10,000ヌクレ
オチド、約9,000ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド,または約9,500ヌクレオチド～約10
,000ヌクレオチドの範囲（両端の数字を含む）の総ヌクレオチド数を有し得る。
オチド～約10,000ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約500ヌク
レオチド～約9,000ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約500ヌク
レオチド～約8,000ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約500ヌク
レオチド～約7,600ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約500ヌク
レオチド～約7,200ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約500ヌク
レオチド～約6,800ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約500ヌク
レオチド～約6,400ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約500ヌク
レオチド～約6,000ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約500ヌク
レオチド～約5,600ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチド、約500ヌク
レオチド～約5,200ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約500ヌク
レオチド～約4,800ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約4,400ヌ
クレオチド、約500ヌクレオチド～約4,200ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約4,000ヌ
クレオチド、約500ヌクレオチド～約3,800ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約3,600ヌ
クレオチド、約500ヌクレオチド～約3,400ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約3,200ヌ
クレオチド、約500ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約2,800ヌ
クレオチド、約500ヌクレオチド～約2,600ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約2,400ヌ
クレオチド、約500ヌクレオチド～約2,200ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約2,000ヌ
クレオチド、約500ヌクレオチド～約1,800ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約1,600ヌ
クレオチド、約500ヌクレオチド～約1,400ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約1,200ヌ
クレオチド、約500ヌクレオチド～約1,000ヌクレオチド、約500ヌクレオチド～約800ヌク
レオチド、約800ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約9,500ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約8,500ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約7,800ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約7,400ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約7,000ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約6,600ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約6,200ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約5,800ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約5,400ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約5,000ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約4,600ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約4,200ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約3,800ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約3,600ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約3,400ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約3,200ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約3,000ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約2,800ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約2,600ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約2,400ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約2,200ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約1,800ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約1,600ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約1,400ヌ
クレオチド、約800ヌクレオチド～約1,200ヌクレオチド、約800ヌクレオチド～約1,000ヌ
クレオチド、約1,000ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約9,
000ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～
約8,000ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチ
ド～約7,600ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約1,000ヌクレ
オチド～約7,200ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約1,000ヌ
クレオチド～約6,800ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約1,0
00ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、
約1,000ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチ
ド、約1,000ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約5,400ヌクレ
オチド、約1,000ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約5,000ヌ
クレオチド、約1,000ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約4,6
00ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～
約4,200ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチ
ド～約3,800ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約3,600ヌクレオチド、約1,000ヌクレ
オチド～約3,400ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約3,200ヌクレオチド、約1,000ヌ
クレオチド～約3,000ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約2,600ヌクレオチド、約1,0
00ヌクレオチド～約2,400ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約2,200ヌクレオチド、
約1,000ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約1,800ヌクレオチ
ド、約1,000ヌクレオチド～約1,600ヌクレオチド、約1,000ヌクレオチド～約1,400ヌクレ
オチド、約1,000ヌクレオチド～約1,200ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約10,000
ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約9
,000ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド
～約8,000ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約1,200ヌクレオ
チド～約7,600ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約1,200ヌク
レオチド～約7,200ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約1,200
ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約1
,200ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド
、約1,200ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約5,800ヌクレオ
チド、約1,200ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約5,400ヌク
レオチド、約1,200ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約4,800
ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約4,600ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約4
,400ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約4,200ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド
～約4,000ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約3,800ヌクレオチド、約1,200ヌクレオ
チド～約3,600ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約3,400ヌクレオチド、約1,200ヌク
レオチド～約3,200ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約1,200
ヌクレオチド～約2,800ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約2,600ヌクレオチド、約1
,200ヌクレオチド～約2,400ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約2,200ヌクレオチド
、約1,200ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約1,800ヌクレオ
チド、約1,200ヌクレオチド～約1,600ヌクレオチド、約1,200ヌクレオチド～約1,400ヌク
レオチド、約1,400ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約9,50
0ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約
8,500ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド
～約7,800ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約1,400ヌクレオ
チド～約7,400ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約1,400ヌク
レオチド～約7,000ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約1,400
ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約1
,400ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド
、約1,400ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約5,600ヌクレオ
チド、約1,400ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約5,200ヌク
レオチド、約1,400ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約4,800
ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約4,600ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約4
,400ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約4,200ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド
～約4,000ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約3,800ヌクレオチド、約1,400ヌクレオ
チド～約3,600ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約3,400ヌクレオチド、約1,400ヌク
レオチド～約3,200ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約1,400
ヌクレオチド～約2,600ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約2,400ヌクレオチド、約1
,400ヌクレオチド～約2,200ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド
、約1,400ヌクレオチド～約1,800ヌクレオチド、約1,400ヌクレオチド～約1,600ヌクレオ
チド、約1,600ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約9,500ヌ
クレオチド、約1,600ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約8,5
00ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～
約7,800ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチ
ド～約7,400ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約1,600ヌクレ
オチド～約7,000ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約1,600ヌ
クレオチド～約6,400ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約1,6
00ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、
約1,600ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチ
ド、約1,600ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約5,000ヌクレ
オチド、約1,600ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約4,600ヌ
クレオチド、約1,600ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約4,2
00ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～
約3,800ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約3,600ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチ
ド～約3,400ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約3,200ヌクレオチド、約1,600ヌクレ
オチド～約3,000ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約2,800ヌクレオチド、約1,600ヌ
クレオチド～約2,600ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約2,400ヌクレオチド、約1,6
00ヌクレオチド～約2,200ヌクレオチド、約1,600ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド、
約1,600ヌクレオチド～約1,800ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約10,000ヌクレオ
チド、約1,800ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約9,000ヌク
レオチド、約1,800ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約8,000
ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約7
,600ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド
～約7,200ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約1,800ヌクレオ
チド～約6,800ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約1,800ヌク
レオチド～約6,400ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約1,800
ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約1
,800ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチド
、約1,800ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約5,000ヌクレオ
チド、約1,800ヌクレオチ
ド～約4,800ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約4,600ヌクレオチド、約1,800ヌクレ
オチド～約4,400ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約4,200ヌクレオチド、約1,800ヌ
クレオチド～約4,000ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約3,800ヌクレオチド、約1,8
00ヌクレオチド～約3,600ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約3,400ヌクレオチド、
約1,800ヌクレオチド～約3,200ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチ
ド、約1,800ヌクレオチド～約2,800ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約2,600ヌクレ
オチド、約1,800ヌクレオチド～約2,400ヌクレオチド、約1,800ヌクレオチド～約2,200ヌ
クレオチド、約1,800ヌクレオチド～約2,000ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約10,
000ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～
約9,000ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチ
ド～約8,000ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約2,000ヌクレ
オチド～約7,600ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約2,000ヌ
クレオチド～約7,200ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約2,0
00ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、
約2,000ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチ
ド、約2,000ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約5,800ヌクレ
オチド、約2,000ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約5,400ヌ
クレオチド、約2,000ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約5,0
00ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～
約4,600ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチ
ド～約4,200ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約2,000ヌクレ
オチド～約3,800ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約3,600ヌクレオチド、約2,000ヌ
クレオチド～約3,400ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約3,200ヌクレオチド、約2,0
00ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約2,800ヌクレオチド、
約2,000ヌクレオチド～約2,600ヌクレオチド、約2,000ヌクレオチド～約2,400ヌクレオチ
ド、約2,000ヌクレオチド～約2,200ヌクレオチド、約2,200ヌクレオチド～約10,000ヌク
レオチド、約9,500ヌクレオチド、約9,000ヌクレオチド、約8,500ヌクレオチド、約8,000
ヌクレオチド、約7,800ヌクレオチド、約7,600ヌクレオチド、約7,400ヌクレオチド、約7
,200ヌクレオチド、約7,000ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド
、約6,400ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド、約5,800ヌクレオ
チド、約5,600ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド、約5,000ヌク
レオチド、約4,800ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド、約4,200
ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド、約3
,400ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド
、約2,600ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約10,000ヌクレ
オチド、約2,400ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約9,000ヌ
クレオチド、約2,400ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約8,0
00ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～
約7,600ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチ
ド～約7,200ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約2,400ヌクレ
オチド～約6,800ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約2,400ヌ
クレオチド～約6,400ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約2,4
00ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、
約2,400ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチ
ド、約2,400ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約5,000ヌクレ
オチド、約2,400ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約4,600ヌ
クレオチド、約2,400ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約4,2
00ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～
約3,800ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約3,600ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチ
ド～約3,400ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約3,200ヌクレオチド、約2,400ヌクレ
オチド～約3,000ヌクレオチド、約2,400ヌクレオチド～約2,800ヌクレオチド、約2,400ヌ
クレオチド～約2,600ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約2,
600ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、
約2,600ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチ
ド、約2,600ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約7,600ヌクレ
オチド、約2,600ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約7,200ヌ
クレオチド、約2,600ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約6,8
00ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～
約6,400ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチ
ド～約6,000ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約2,600ヌクレ
オチド～約5,600ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチド、約2,600ヌ
クレオチド～約5,200ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約2,6
00ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約4,600ヌクレオチド、
約2,600ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約4,200ヌクレオチ
ド、約2,600ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約3,800ヌクレ
オチド、約2,600ヌクレオチド～約3,600ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約3,400ヌ
クレオチド、約2,600ヌクレオチド～約3,200ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約3,0
00ヌクレオチド、約2,600ヌクレオチド～約2,800ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～
約10,000ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約2,800ヌクレオ
チド～約9,000ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約2,800ヌク
レオチド～約8,000ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約2,800
ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約2
,800ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド
、約2,800ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約6,600ヌクレオ
チド、約2,800ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約6,200ヌク
レオチド、約2,800ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約5,800
ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約5
,400ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド
～約5,000ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約2,800ヌクレオ
チド～約4,600ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約2,800ヌク
レオチド～約4,200ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約2,800
ヌクレオチド～約3,800ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約3,600ヌクレオチド、約2
,800ヌクレオチド～約3,400ヌクレオチド、約2,800ヌクレオチド～約3,200ヌクレオチド
、約2,800ヌクレオチド～約3,000ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約10,000ヌクレ
オチド、約3,000ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約9,000ヌ
クレオチド、約3,000ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約8,0
00ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～
約7,600ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチ
ド～約7,200ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約3,000ヌクレ
オチド～約6,800ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約3,000ヌ
クレオチド～約6,400ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約3,0
00ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、
約3,000ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチ
ド、約3,000ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約5,000ヌクレ
オチド、約3,000ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約4,600ヌ
クレオチド、約3,000ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約4,2
00ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～
約3,800ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約3,600ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチ
ド～約3,400ヌクレオチド、約3,000ヌクレオチド～約3,200ヌクレオチド、約3,200ヌクレ
オチド～約10,000ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約3,200
ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約3
,200ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド
、約3,200ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約7,400ヌクレオ
チド、約3,200ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約7,000ヌク
レオチド、約3,200ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約6,600
ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約6
,200ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド
～約5,800ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約3,200ヌクレオ
チド～約5,400ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約3,200ヌク
レオチド～約5,000ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約3,200
ヌクレオチド～約4,600ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約3
,200ヌクレオチド～約4,200ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド
、約3,200ヌクレオチド～約3,800ヌクレオチド、約3,200ヌクレオチド～約3,600ヌクレオ
チド、約3,200ヌクレオチド～約3,400ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約10,000ヌ
クレオチド、約3,400ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約9,0
00ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～
約8,000ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチ
ド～約7,600ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約3,400ヌクレ
オチド～約7,200ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約3,400ヌ
クレオチド～約6,800ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約3,4
00ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、
約3,400ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチ
ド、約3,400ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約5,400ヌクレ
オチド、約3,400ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約5,000ヌ
クレオチド、約3,400ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約4,6
00ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～
約4,200ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチ
ド～約3,800ヌクレオチド、約3,400ヌクレオチド～約3,600ヌクレオチド、約3,600ヌクレ
オチド～約10,000ヌクレオチド、約
3,600ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド
、約3,600ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約8,000ヌクレオ
チド、約3,600ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約7,600ヌク
レオチド、約3,600ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約7,200
ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約6
,800ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド
～約6,400ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約3,600ヌクレオ
チド～約6,000ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約3,600ヌク
レオチド～約5,600ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチド、約3,600
ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約3
,600ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約4,600ヌクレオチド
、約3,600ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約4,200ヌクレオ
チド、約3,600ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約3,600ヌクレオチド～約3,800ヌク
レオチド、約3,800ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約9,50
0ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約
8,500ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド
～約7,800ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約3,800ヌクレオ
チド～約7,400ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約3,800ヌク
レオチド～約7,000ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約3,800
ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約3
,800ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド
、約3,800ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約5,600ヌクレオ
チド、約3,800ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約5,200ヌク
レオチド、約3,800ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約4,800
ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約4,600ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約4
,200ヌクレオチド、約3,800ヌクレオチド～約4,000ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド
～約10,000ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約4,000ヌクレ
オチド～約9,000ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約4,000ヌ
クレオチド～約8,000ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約4,0
00ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、
約4,000ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチ
ド、約4,000ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約6,600ヌクレ
オチド、約4,000ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約6,200ヌ
クレオチド、約4,000ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約5,8
00ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～
約5,400ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチ
ド～約5,000ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約4,000ヌクレ
オチド～約4,600ヌクレオチド、約4,000ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約4,000ヌ
クレオチド～約4,200ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約4,
200ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、
約4,200ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチ
ド、約4,200ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約7,600ヌクレ
オチド、約4,200ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約7,200ヌ
クレオチド、約4,200ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約6,8
00ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～
約6,400ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチ
ド～約6,000ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約4,200ヌクレ
オチド～約5,600ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチド、約4,200ヌ
クレオチド～約5,200ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約4,2
00ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約4,200ヌクレオチド～約4,600ヌクレオチド、
約4,200ヌクレオチド～約4,400ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約10,000ヌクレオ
チド、約4,400ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約9,000ヌク
レオチド、約4,400ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約8,000
ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約7
,600ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド
～約7,200ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約4,400ヌクレオ
チド～約6,800ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約4,400ヌク
レオチド～約6,400ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約4,400
ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約4
,400ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチド
、約4,400ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約5,000ヌクレオ
チド、約4,400ヌクレオチド～約4,800ヌクレオチド、約4,400ヌクレオチド～約4,600ヌク
レオチド、約4,600ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約9,50
0ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約
8,500ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド
～約7,800ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約4,600ヌクレオ
チド～約7,400ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約4,600ヌク
レオチド～約7,000ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約4,600
ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約4
,600ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド
、約4,600ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約5,600ヌクレオ
チド、約4,600ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約5,200ヌク
レオチド、約4,600ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約4,600ヌクレオチド～約4,800
ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約
9,500ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド
～約8,500ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約4,800ヌクレオ
チド～約7,800ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約4,800ヌク
レオチド～約7,400ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約4,800
ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約4
,800ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド
、約4,800ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約6,000ヌクレオ
チド、約4,800ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約5,600ヌク
レオチド、約4,800ヌクレオチド～約5,400ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約5,200
ヌクレオチド、約4,800ヌクレオチド～約5,000ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド～約1
0,000ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド
～約9,000ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約5,000ヌクレオ
チド～約8,000ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約5,000ヌク
レオチド～約7,600ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約5,000
ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約5
,000ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド
、約5,000ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド～約6,200ヌクレオ
チド、約5,000ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド～約5,800ヌク
レオチド、約5,000ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド～約5,400
ヌクレオチド、約5,000ヌクレオチド～約5,200ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド～約1
0,000ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド
～約9,000ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約5,200ヌクレオ
チド～約8,000ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約5,200ヌク
レオチド～約7,600ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約5,200
ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約5
,200ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド
、約5,200ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド～約6,200ヌクレオ
チド、約5,200ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド～約5,800ヌク
レオチド、約5,200ヌクレオチド～約5,600ヌクレオチド、約5,200ヌクレオチド～約5,400
ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド～約
9,500ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド
～約8,500ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約5,400ヌクレオ
チド～約7,800ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約5,400ヌク
レオチド～約7,400ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約5,400
ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約5
,400ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド
、約5,400ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド～約6,000ヌクレオ
チド、約5,400ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約5,400ヌクレオチド～約5,600ヌク
レオチド、約5,600ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド～約9,50
0ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド～約
8,500ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド
～約7,800ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約5,600ヌクレオ
チド～約7,400ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約5,600ヌク
レオチド～約7,000ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約5,600
ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約5
,600ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約5,600ヌクレオチド～約6,000ヌクレオチド
、約5,600ヌクレオチド～約5,800ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド～約10,000ヌクレ
オチド、約5,800ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド～約9,000ヌ
クレオチド、約5,800ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド～約8,0
00ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド～
約7,600ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチ
ド～約7,200ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約5,800ヌクレ
オチド～約6,800ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約5,800ヌ
クレオチド～約6,400ヌクレオチド、約5,800ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約5,8
00ヌクレオチド～約6,0
00ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド～
約9,500ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチ
ド～約8,500ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約6,000ヌクレ
オチド～約7,800ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約6,000ヌ
クレオチド～約7,400ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約6,0
00ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、
約6,000ヌクレオチド～約6,600ヌクレオチド、約6,000ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチ
ド、約6,000ヌクレオチド～約6,200ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド～約10,000ヌク
レオチド、約6,200ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド～約8,500
ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド～約7
,800ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド
～約7,400ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約6,200ヌクレオ
チド～約7,000ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約6,200ヌク
レオチド～約6,600ヌクレオチド、約6,200ヌクレオチド～約6,400ヌクレオチド、約6,400
ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約
6,400ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド
、約6,400ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド～約7,800ヌクレオ
チド、約6,400ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド～約7,400ヌク
レオチド、約6,400ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド～約7,000
ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド、約6,400ヌクレオチド～約6
,600ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド
～約9,500ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約6,600ヌクレオ
チド～約8,500ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約6,600ヌク
レオチド～約7,800ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約6,600
ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約6
,600ヌクレオチド～約7,000ヌクレオチド、約6,600ヌクレオチド～約6,800ヌクレオチド
、約6,800ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチド～約9,500ヌクレ
オチド、約6,800ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチド～約8,500ヌ
クレオチド、約6,800ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチド～約7,8
00ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチド～
約7,400ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチド～約7,200ヌクレオチド、約6,800ヌクレオチ
ド～約7,000ヌクレオチド、約7,000ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約7,000ヌク
レオチド～約9,500ヌクレオチド、約7,000ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約7,000
ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約7,000ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約7
,000ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約7,000ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド
、約7,000ヌクレオチド～約7,400ヌクレオチド、約7,000ヌクレオチド～約7,200ヌクレオ
チド、約7,200ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約7,200ヌクレオチド～約9,500ヌ
クレオチド、約7,200ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約7,200ヌクレオチド～約8,5
00ヌクレオチド、約7,200ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約7,200ヌクレオチド～
約7,800ヌクレオチド、約7,200ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド、約7,200ヌクレオチ
ド～約7,400ヌクレオチド、約7,400ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約7,400ヌク
レオチド～約9,500ヌクレオチド、約7,400ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約7,400
ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約7,400ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約7
,400ヌクレオチド～約7,800ヌクレオチド、約7,400ヌクレオチド～約7,600ヌクレオチド
、約7,600ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約7,600ヌクレオチド～約9,500ヌクレ
オチド、約7,600ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約7,600ヌクレオチド～約8,500ヌ
クレオチド、約7,600ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約7,600ヌクレオチド～約7,8
00ヌクレオチド、約7,800ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約7,800ヌクレオチド～
約9,500ヌクレオチド、約7,800ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約7,800ヌクレオチ
ド～約8,500ヌクレオチド、約7,800ヌクレオチド～約8,000ヌクレオチド、約8,000ヌクレ
オチド～約10,000ヌクレオチド、約8,000ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド、約8,000
ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約8,000ヌクレオチド～約8,500ヌクレオチド、約8
,500ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチド、約8,500ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド
、約8,500ヌクレオチド～約9,000ヌクレオチド、約9,000ヌクレオチド～約10,000ヌクレ
オチド、約9,000ヌクレオチド～約9,500ヌクレオチド,または約9,500ヌクレオチド～約10
,000ヌクレオチドの範囲（両端の数字を含む）の総ヌクレオチド数を有し得る。
【0224】
本明細書において開示されるベクターのうちのいずれかを哺乳動物細胞（例えば、蝸牛
内有毛細胞）内に導入するために、当技術分野において公知の種々の異なる方法を用いる
ことができる。核酸を哺乳動物細胞内に導入するための方法の非限定的な例には、リポフ
ェクション、トランスフェクション（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、
高分岐型有機化合物を用いるトランスフェクション、カチオン性ポリマーを用いるトラン
スフェクション、デンドリマーによるトランスフェクション、光学トランスフェクション
、粒子によるトランスフェクション（例えば、ナノ粒子トランスフェクション）、または
リポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）を用いるトランスフェクション）、マイク
ロインジェクション、エレクトロポレーション、細胞スクイージング（cell squeezing）
、ソノポレーション、原形質融合、インペールフェクション（impalefection）、流体力
学的送達、遺伝子銃、マグネトフェクション、ウイルス性トランスフェクション、および
ヌクレオフェクションが含まれる。
内有毛細胞）内に導入するために、当技術分野において公知の種々の異なる方法を用いる
ことができる。核酸を哺乳動物細胞内に導入するための方法の非限定的な例には、リポフ
ェクション、トランスフェクション（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、
高分岐型有機化合物を用いるトランスフェクション、カチオン性ポリマーを用いるトラン
スフェクション、デンドリマーによるトランスフェクション、光学トランスフェクション
、粒子によるトランスフェクション（例えば、ナノ粒子トランスフェクション）、または
リポソーム（例えば、カチオン性リポソーム）を用いるトランスフェクション）、マイク
ロインジェクション、エレクトロポレーション、細胞スクイージング（cell squeezing）
、ソノポレーション、原形質融合、インペールフェクション（impalefection）、流体力
学的送達、遺伝子銃、マグネトフェクション、ウイルス性トランスフェクション、および
ヌクレオフェクションが含まれる。
【0225】
当業者は、本明細書に記載されているベクターのうちのいずれかは、例えば、リポフェ
クションなどによって哺乳動物細胞内に導入できること、および内在性遺伝子座（例えば
、オトフェリン遺伝子座）内に安定的に組み込むことができることを理解している。いく
つかの態様において、本明細書において提供されるベクターは、内在性欠陥オトフェリン
遺伝子座内に安定的に組み込まれ、それによって、欠陥オトフェリン遺伝子が、機能する
（例えば、野生型）オトフェリンタンパク質をコードする核酸と置き換えられる。
クションなどによって哺乳動物細胞内に導入できること、および内在性遺伝子座（例えば
、オトフェリン遺伝子座）内に安定的に組み込むことができることを理解している。いく
つかの態様において、本明細書において提供されるベクターは、内在性欠陥オトフェリン
遺伝子座内に安定的に組み込まれ、それによって、欠陥オトフェリン遺伝子が、機能する
（例えば、野生型）オトフェリンタンパク質をコードする核酸と置き換えられる。
【0226】
内在性遺伝子内に変異および/または欠失を導入するのに用いることができるさまざま
な分子生物学的技術もまた、当技術分野において公知である。そのような技術の非限定的
な例には、部位特異的変異誘発、CRISPR（例えば、CRISPR/Cas9誘導性ノックイン変異お
よびCRISPR/Cas9誘導性ノックアウト変異）、およびTALENが含まれる。これらの方法は、
標的細胞の染色体中に存在する欠陥内在性遺伝子の配列を修正するために用いることがで
きる。
な分子生物学的技術もまた、当技術分野において公知である。そのような技術の非限定的
な例には、部位特異的変異誘発、CRISPR（例えば、CRISPR/Cas9誘導性ノックイン変異お
よびCRISPR/Cas9誘導性ノックアウト変異）、およびTALENが含まれる。これらの方法は、
標的細胞の染色体中に存在する欠陥内在性遺伝子の配列を修正するために用いることがで
きる。
【0227】
本明細書に記載されているベクターのうちのいずれかは、制御配列、例えば、転写開始
配列、転写終結配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、RNAスプライシング配列、
ポリアデニル化（ポリA）配列、およびKozakコンセンサス配列の群より選択される制御配
列をさらに含むことができる。これらの制御配列の非限定的な例が本明細書に記載されて
いる。いくつかの態様において、プロモーターは、ネイティブなプロモーター、構成的プ
ロモーター、誘導性プロモーター、および/または組織特異的プロモーターであり得る。
配列、転写終結配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、RNAスプライシング配列、
ポリアデニル化（ポリA）配列、およびKozakコンセンサス配列の群より選択される制御配
列をさらに含むことができる。これらの制御配列の非限定的な例が本明細書に記載されて
いる。いくつかの態様において、プロモーターは、ネイティブなプロモーター、構成的プ
ロモーター、誘導性プロモーター、および/または組織特異的プロモーターであり得る。
【0228】
プロモーター
プロモーターの非限定的な例が本明細書に記載されている。プロモーターのさらなる例
は当技術分野において公知である。
プロモーターの非限定的な例が本明細書に記載されている。プロモーターのさらなる例
は当技術分野において公知である。
【0229】
いくつかの態様において、オトフェリンタンパク質（例えば、ヒトオトフェリンタンパ
ク質）のN末端部分をコードするベクターは、プロモーターおよび/またはエンハンサーを
含むことができる。オトフェリンタンパク質のN末端部分をコードするベクターは、本明
細書に記載されているかまたは当技術分野において公知であるプロモーターおよび/また
はエンハンサーのうちのいずれかを含むことができる。
ク質）のN末端部分をコードするベクターは、プロモーターおよび/またはエンハンサーを
含むことができる。オトフェリンタンパク質のN末端部分をコードするベクターは、本明
細書に記載されているかまたは当技術分野において公知であるプロモーターおよび/また
はエンハンサーのうちのいずれかを含むことができる。
【0230】
いくつかの態様において、プロモーターは、誘導性プロモーター、構成的プロモーター
、哺乳動物細胞プロモーター、ウイルスプロモーター、キメラプロモーター、操作された
プロモーター、組織特異的プロモーター、または当技術分野において公知の任意の他の種
類のプロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、哺乳類RNAポリメ
ラーゼIIプロモーターなどのRNAポリメラーゼIIプロモーターである。いくつかの態様に
おいて、プロモーターは、これらに限定されないが、H1プロモーター、ヒトU6プロモータ
ー、マウスU6プロモーター、またはブタU6プロモーターを含む、RNAポリメラーゼIIIプロ
モーターである。プロモーターは概して、有毛細胞など蝸牛細胞における転写を促進する
ことができるプロモーターである。いくつかの例では、プロモーターは、蝸牛特異的プロ
モーターまたは蝸牛指向型プロモーターである。
、哺乳動物細胞プロモーター、ウイルスプロモーター、キメラプロモーター、操作された
プロモーター、組織特異的プロモーター、または当技術分野において公知の任意の他の種
類のプロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、哺乳類RNAポリメ
ラーゼIIプロモーターなどのRNAポリメラーゼIIプロモーターである。いくつかの態様に
おいて、プロモーターは、これらに限定されないが、H1プロモーター、ヒトU6プロモータ
ー、マウスU6プロモーター、またはブタU6プロモーターを含む、RNAポリメラーゼIIIプロ
モーターである。プロモーターは概して、有毛細胞など蝸牛細胞における転写を促進する
ことができるプロモーターである。いくつかの例では、プロモーターは、蝸牛特異的プロ
モーターまたは蝸牛指向型プロモーターである。
【0231】
本明細書において用いることができる種々のプロモーターが、当技術分野において公知
である。本明細書において用いることができるプロモーターの非限定的な例には、ヒトEF
1a、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）（米国特許第5,168,062号）、ヒトユビキチンC（U
BC）、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ1、ポリオーマアデノウイルス、サルウイルス4
0（SV40）、βグロビン、βアクチン、αフェトプロテイン、γグロビン、βインターフ
ェロン、γグルタミルトランスフェラーゼ、マウス乳癌ウイルス（MMTV）、Rous肉腫ウイ
ルス、ラットインスリン、グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素、メタロチオネインII
（MTII）、アミラーゼ、カテプシン、MIムスカリン受容体、レトロウイルスLTR（例えば
、ヒトT細胞白血病ウイルスHTLV）、AAVITR、インターロイキン2、コラゲナーゼ、血小
板由来増殖因子、アデノウイルス5 E2、ストロメライシン、マウスMX遺伝子、グルコース
制御タンパク質（GRP78およびGRP94）、α-2-マクログロブリン、ビメンチン、MHCクラス
I遺伝子Η-2κb、HSP70、プロリフェリン、腫瘍壊死因子、甲状腺刺激ホルモンα遺伝子
、免疫グロブリン軽鎖、T細胞受容体、HLA DQαおよびDQβ、インターロイキン2受容体、
MHCクラスII、MHCクラスIIHLA-DRα、筋クレアチンキナーゼ、プレアルブミン（トラン
スサイレチン）、エラスターゼI、アルブミン遺伝子、c-fos、c-HA-ras、神経細胞接着分
子（NCAM）、H2B（TH2B）ヒストン、ラット成長ホルモン、ヒト血清アミロイド（SAA）、
トロポニンI（TNI）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ヒト免疫不全ウイルス、および
テナガザル白血病ウイルス（GALV）のプロモーターが含まれる。プロモーターのさらなる
例が当技術分野において公知である。例えば、Lodish, Molecular Cell Biology, Freema
n and Company,New York 2007を参照されたい。いくつかの態様において、プロモーター
はCMV前初期プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターはCAGプロモー
ターまたはCAG/CBAプロモーターである。
である。本明細書において用いることができるプロモーターの非限定的な例には、ヒトEF
1a、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）（米国特許第5,168,062号）、ヒトユビキチンC（U
BC）、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ1、ポリオーマアデノウイルス、サルウイルス4
0（SV40）、βグロビン、βアクチン、αフェトプロテイン、γグロビン、βインターフ
ェロン、γグルタミルトランスフェラーゼ、マウス乳癌ウイルス（MMTV）、Rous肉腫ウイ
ルス、ラットインスリン、グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素、メタロチオネインII
（MTII）、アミラーゼ、カテプシン、MIムスカリン受容体、レトロウイルスLTR（例えば
、ヒトT細胞白血病ウイルスHTLV）、AAVITR、インターロイキン2、コラゲナーゼ、血小
板由来増殖因子、アデノウイルス5 E2、ストロメライシン、マウスMX遺伝子、グルコース
制御タンパク質（GRP78およびGRP94）、α-2-マクログロブリン、ビメンチン、MHCクラス
I遺伝子Η-2κb、HSP70、プロリフェリン、腫瘍壊死因子、甲状腺刺激ホルモンα遺伝子
、免疫グロブリン軽鎖、T細胞受容体、HLA DQαおよびDQβ、インターロイキン2受容体、
MHCクラスII、MHCクラスIIHLA-DRα、筋クレアチンキナーゼ、プレアルブミン（トラン
スサイレチン）、エラスターゼI、アルブミン遺伝子、c-fos、c-HA-ras、神経細胞接着分
子（NCAM）、H2B（TH2B）ヒストン、ラット成長ホルモン、ヒト血清アミロイド（SAA）、
トロポニンI（TNI）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ヒト免疫不全ウイルス、および
テナガザル白血病ウイルス（GALV）のプロモーターが含まれる。プロモーターのさらなる
例が当技術分野において公知である。例えば、Lodish, Molecular Cell Biology, Freema
n and Company,New York 2007を参照されたい。いくつかの態様において、プロモーター
はCMV前初期プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターはCAGプロモー
ターまたはCAG/CBAプロモーターである。
【0232】
「機能的に連結されている」または「転写制御」という用語は、異種核酸配列の発現を
もたらす調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結を指す。例えば、第1の核酸配列が
第2の核酸配列との機能的関連性をもって配置されているとき、第1の核酸配列は第2の核
酸配列と機能的に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現
に影響を与える場合、プロモーターはコード配列に機能的に連結されている。機能的に連
結されたDNA配列は、相互に連続している可能性があり、例えば、2つのタンパク質コード
領域を連結する必要がある場合、同じ読み枠中にある。
もたらす調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結を指す。例えば、第1の核酸配列が
第2の核酸配列との機能的関連性をもって配置されているとき、第1の核酸配列は第2の核
酸配列と機能的に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現
に影響を与える場合、プロモーターはコード配列に機能的に連結されている。機能的に連
結されたDNA配列は、相互に連続している可能性があり、例えば、2つのタンパク質コード
領域を連結する必要がある場合、同じ読み枠中にある。
【0233】
「構成的」プロモーターという用語は、タンパク質（例えば、オトフェリンタンパク質
）をコードする核酸と機能的に連結されると、ほとんどまたは全ての生理的条件下で哺乳
動物細胞においてRNAを核酸から転写させる、ヌクレオチド配列を指す。
）をコードする核酸と機能的に連結されると、ほとんどまたは全ての生理的条件下で哺乳
動物細胞においてRNAを核酸から転写させる、ヌクレオチド配列を指す。
【0234】
「構成的」プロモーターという用語は、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレ
オチドと機能的に連結されると、細胞のほとんどまたは全ての生理的条件下で細胞におい
て遺伝子産物を生成させる、ヌクレオチド配列を指す。
オチドと機能的に連結されると、細胞のほとんどまたは全ての生理的条件下で細胞におい
て遺伝子産物を生成させる、ヌクレオチド配列を指す。
【0235】
構成的プロモーターの例には、これらに限定されないが、レトロウイルスRous肉腫ウイ
ルス（RSV）LTRプロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター（例えば、Bo
shart et al.Cell 41:521-530, 1985を参照されたい）、SV40プロモーター、ジヒドロ葉
酸還元酵素プロモーター、βアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（PGK
）プロモーター、およびEF1αプロモーター（Invitrogen）が含まれる。
ルス（RSV）LTRプロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター（例えば、Bo
shart et al.Cell 41:521-530, 1985を参照されたい）、SV40プロモーター、ジヒドロ葉
酸還元酵素プロモーター、βアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（PGK
）プロモーター、およびEF1αプロモーター（Invitrogen）が含まれる。
【0236】
「誘導性」プロモーターという用語は、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレ
オチドと機能的に連結されると、プロモーターに対応する誘導因子が細胞内に存在する場
合にのみ、細胞内で遺伝子産物を実質的に生成させる、ヌクレオチド配列を指す。
オチドと機能的に連結されると、プロモーターに対応する誘導因子が細胞内に存在する場
合にのみ、細胞内で遺伝子産物を実質的に生成させる、ヌクレオチド配列を指す。
【0237】
誘導性プロモーターは遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給される化合物、温度
などの環境因子、もしくは特定の生理的状態、例えば、急性期、細胞の特定の分化状態の
存在によって、または細胞複製時にのみ調節することができる。誘導性プロモーターおよ
び誘導可能な系は、これらに限定されないが、Invitrogen、Clontech、およびAriadを含
む、種々の商業的供給元から入手可能である。誘導性プロモーターのさらなる例は当技術
分野において公知である。
などの環境因子、もしくは特定の生理的状態、例えば、急性期、細胞の特定の分化状態の
存在によって、または細胞複製時にのみ調節することができる。誘導性プロモーターおよ
び誘導可能な系は、これらに限定されないが、Invitrogen、Clontech、およびAriadを含
む、種々の商業的供給元から入手可能である。誘導性プロモーターのさらなる例は当技術
分野において公知である。
【0238】
外因的に供給される化合物によって調節される誘導性プロモーターの例には、亜鉛誘導
性ヒツジメタロチオニン（MT）プロモーター、デキサメタゾン（Dex）誘導性マウス乳癌
ウイルス（MMTV）プロモーター、T7ポリメラーゼプロモーター系（WO 98/10088）；エク
ジソン昆虫プロモーター（No et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:3346-3351, 19
96）、テトラサイクリン抑制系（Gossenet al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:554
7-5551, 1992）、テトラサイクリン誘導系（Gossenet al. Science 268:1766-1769, 199
5、さらにHarvey etal. Curr. Opin. Chem. Biol. 2:512-518, 1998も参照されたい）、
RU486誘導系（Wanget al. Nat. Biotech. 15:239-243, 1997)およびWang et al. Gene
Ther.4:432-441, 1997）、およびラパマイシン誘導系（Magari et al. J. Clin. Invest
.100:2865-2872, 1997）が含まれる。
性ヒツジメタロチオニン（MT）プロモーター、デキサメタゾン（Dex）誘導性マウス乳癌
ウイルス（MMTV）プロモーター、T7ポリメラーゼプロモーター系（WO 98/10088）；エク
ジソン昆虫プロモーター（No et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:3346-3351, 19
96）、テトラサイクリン抑制系（Gossenet al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:554
7-5551, 1992）、テトラサイクリン誘導系（Gossenet al. Science 268:1766-1769, 199
5、さらにHarvey etal. Curr. Opin. Chem. Biol. 2:512-518, 1998も参照されたい）、
RU486誘導系（Wanget al. Nat. Biotech. 15:239-243, 1997)およびWang et al. Gene
Ther.4:432-441, 1997）、およびラパマイシン誘導系（Magari et al. J. Clin. Invest
.100:2865-2872, 1997）が含まれる。
【0239】
「組織特異的」プロモーターという用語は、ある特定の特異的な細胞型および/または
組織のみで活性があるプロモーターを指す（例えば、特定の遺伝子の転写は、組織特異的
プロモーターに結合する転写調節タンパク質を発現する細胞内でのみ起こる）。
組織のみで活性があるプロモーターを指す（例えば、特定の遺伝子の転写は、組織特異的
プロモーターに結合する転写調節タンパク質を発現する細胞内でのみ起こる）。
【0240】
「組織特異的」プロモーターという用語は、遺伝子をコードするまたは遺伝子によって
特定されるポリヌクレオチドと機能的に連結されると、細胞がプロモーターに対応する組
織型の細胞である場合にのみ、細胞において遺伝子産物を実質的に生成させる、ヌクレオ
チド配列を指す。
特定されるポリヌクレオチドと機能的に連結されると、細胞がプロモーターに対応する組
織型の細胞である場合にのみ、細胞において遺伝子産物を実質的に生成させる、ヌクレオ
チド配列を指す。
【0241】
「調節配列」という用語は、調節配列に機能的に連結された遺伝子産物の発現を調節す
る核酸配列を指す。いくつかの例では、この配列は、遺伝子産物の発現を調節する、エン
ハンサー配列および他の調節エレメントであってもよい。
る核酸配列を指す。いくつかの例では、この配列は、遺伝子産物の発現を調節する、エン
ハンサー配列および他の調節エレメントであってもよい。
【0242】
いくつかの態様において、調節配列は、組織特異的遺伝子発現能を与える。いくつかの
場合では、組織特異的調節配列は、組織特異的に転写を誘導する組織特異的転写因子に結
合する。
場合では、組織特異的調節配列は、組織特異的に転写を誘導する組織特異的転写因子に結
合する。
【0243】
いくつかの態様において、組織特異的プロモーターは蝸牛特異的プロモーターである。
いくつかの態様において、組織特異的プロモーターは蝸牛有毛細胞特異的プロモーターで
ある。蝸牛有毛細胞特異的プロモーターの非限定的な例には、これらに限定されないが、
ATOH1プロモーター、POU4F3プロモーター、LHX3プロモーター、MY07Aプロモーター、MY06
プロモーター、α9ACHRプロモーター、およびα10ACHRプロモーターが含まれる。
いくつかの態様において、組織特異的プロモーターは蝸牛有毛細胞特異的プロモーターで
ある。蝸牛有毛細胞特異的プロモーターの非限定的な例には、これらに限定されないが、
ATOH1プロモーター、POU4F3プロモーター、LHX3プロモーター、MY07Aプロモーター、MY06
プロモーター、α9ACHRプロモーター、およびα10ACHRプロモーターが含まれる。
【0244】
エンハンサーおよび5’キャップ
いくつかの例では、ベクターは、プロモーター配列および/またはエンハンサー配列を
含み得る。「エンハンサー」という用語は、関心対象のタンパク質（例えば、オトフェリ
ンタンパク質）をコードする核酸の転写レベルを増大させることができるヌクレオチド配
列を指す。エンハンサー配列（50～1500塩基対長）は概して、転写関連タンパク質（例え
ば、転写因子）に追加の結合部位を提供することによって、転写レベルを増大させる。い
くつかの態様において、エンハンサー配列はイントロン配列内に認められる。プロモータ
ー配列とは異なり、エンハンサー配列は、（例えば、プロモーターと比較して）転写開始
点からはるかに遠く離れて作用することができる。エンハンサーの非限定的な例には、RS
Vエンハンサー、CMVエンハンサー、およびSV40エンハンサーが含まれる。
いくつかの例では、ベクターは、プロモーター配列および/またはエンハンサー配列を
含み得る。「エンハンサー」という用語は、関心対象のタンパク質（例えば、オトフェリ
ンタンパク質）をコードする核酸の転写レベルを増大させることができるヌクレオチド配
列を指す。エンハンサー配列（50～1500塩基対長）は概して、転写関連タンパク質（例え
ば、転写因子）に追加の結合部位を提供することによって、転写レベルを増大させる。い
くつかの態様において、エンハンサー配列はイントロン配列内に認められる。プロモータ
ー配列とは異なり、エンハンサー配列は、（例えば、プロモーターと比較して）転写開始
点からはるかに遠く離れて作用することができる。エンハンサーの非限定的な例には、RS
Vエンハンサー、CMVエンハンサー、およびSV40エンハンサーが含まれる。
【0245】
本明細書で用いられる5’キャップ（RNAキャップ、RNA 7-メチルグアノシンキャップ、
またはRNA m7Gキャップとも呼ばれる）は、転写開始直後に真核生物メッセンジャーRNAの
「フロント」または5'端に付加される改変グアニンヌクレオチドである。5’キャップは
、第1の転写ヌクレオチドに連結される末端基からなる。その存在は、リボソームによる
認識およびRNaseからの保護に重要である。キャップ付加は転写と共役し、それぞれがも
う一方に影響するように転写と共役して起こる。転写の開始直後に、合成中のmRNAの5'末
端は、RNAポリメラーゼに付随するキャップ合成複合体に囲まれる。この酵素複合体は、m
RNAキャッピングに必要とされる化学反応を触媒する。合成は複数段階の生化学反応とし
て進行する。このキャッピング部分は、その安定性または転写効率などのmRNAの機能を調
節するように改変することができる。
またはRNA m7Gキャップとも呼ばれる）は、転写開始直後に真核生物メッセンジャーRNAの
「フロント」または5'端に付加される改変グアニンヌクレオチドである。5’キャップは
、第1の転写ヌクレオチドに連結される末端基からなる。その存在は、リボソームによる
認識およびRNaseからの保護に重要である。キャップ付加は転写と共役し、それぞれがも
う一方に影響するように転写と共役して起こる。転写の開始直後に、合成中のmRNAの5'末
端は、RNAポリメラーゼに付随するキャップ合成複合体に囲まれる。この酵素複合体は、m
RNAキャッピングに必要とされる化学反応を触媒する。合成は複数段階の生化学反応とし
て進行する。このキャッピング部分は、その安定性または転写効率などのmRNAの機能を調
節するように改変することができる。
【0246】
ポリ(A)配列
いくつかの態様において、本明細書において提供されるベクターのうちのいずれかはポ
リ(A）配列を含み得る。ほとんどの真核生物新生mRNAは、その3'末端に、一次転写産物の
切断および共役したポリアデニル化反応を含む複合プロセスにおいて付加される、ポリ(A
)テールを持つ（例えば、Proudfootet al., Cell 108:501-512, 2002を参照されたい）
。ポリ(A)テールは、mRNA安定性および移動性を付与する（MolecularBiology of the Ce
ll, ThirdEdition by B. Alberts et al., Garland Publishing, 1994）。いくつかの態
様において、ポリ(A）配列は、オトフェリンタンパク質のC末端をコードする核酸配列の3
'側に位置づけられる。
いくつかの態様において、本明細書において提供されるベクターのうちのいずれかはポ
リ(A）配列を含み得る。ほとんどの真核生物新生mRNAは、その3'末端に、一次転写産物の
切断および共役したポリアデニル化反応を含む複合プロセスにおいて付加される、ポリ(A
)テールを持つ（例えば、Proudfootet al., Cell 108:501-512, 2002を参照されたい）
。ポリ(A)テールは、mRNA安定性および移動性を付与する（MolecularBiology of the Ce
ll, ThirdEdition by B. Alberts et al., Garland Publishing, 1994）。いくつかの態
様において、ポリ(A）配列は、オトフェリンタンパク質のC末端をコードする核酸配列の3
'側に位置づけられる。
【0247】
本明細書で用いられる「ポリアデニル化」は、ポリアデニル化部分またその改変バリア
ントとメッセンジャーRNA分子との共有結合による連結を指す。真核生物では、ほとんど
のメッセンジャーRNA（mRNA）分子は3'末端でポリアデニル化される。3'ポリ(A)テール
は、酵素ポリアデニル酸ポリメラーゼの作用によりプレmRNAに付加された、アデニンヌク
レオチドの長い配列（多くの場合、数百万）である。高等真核生物では、ポリ(A)テール
は、特定の配列であるポリアデニル化シグナルを含有する転写産物に付加される。ポリ(A
)テールおよびそれに結合したタンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からmRNAを
保護するのを助ける。ポリアデニル化はまた、転写の終結、核からのmRNAの輸送、および
翻訳にも重要である。ポリアデニル化は、DNAのRNAへの転写直後に核内で生じるだけでな
く、さらに、その後に細胞質でも生じ得る。転写が終結した後、mRNA鎖は、RNAポリメラ
ーゼに付随するエンドヌクレアーゼ複合体の作用により切断される。切断部位は通常、切
断部位の近くにある塩基配列AAUAAAの存在を特徴とする。mRNAが切断された後、アデノシ
ン残基が、切断部位のフリーな3'末端に付加される。
ントとメッセンジャーRNA分子との共有結合による連結を指す。真核生物では、ほとんど
のメッセンジャーRNA（mRNA）分子は3'末端でポリアデニル化される。3'ポリ(A)テール
は、酵素ポリアデニル酸ポリメラーゼの作用によりプレmRNAに付加された、アデニンヌク
レオチドの長い配列（多くの場合、数百万）である。高等真核生物では、ポリ(A)テール
は、特定の配列であるポリアデニル化シグナルを含有する転写産物に付加される。ポリ(A
)テールおよびそれに結合したタンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からmRNAを
保護するのを助ける。ポリアデニル化はまた、転写の終結、核からのmRNAの輸送、および
翻訳にも重要である。ポリアデニル化は、DNAのRNAへの転写直後に核内で生じるだけでな
く、さらに、その後に細胞質でも生じ得る。転写が終結した後、mRNA鎖は、RNAポリメラ
ーゼに付随するエンドヌクレアーゼ複合体の作用により切断される。切断部位は通常、切
断部位の近くにある塩基配列AAUAAAの存在を特徴とする。mRNAが切断された後、アデノシ
ン残基が、切断部位のフリーな3'末端に付加される。
【0248】
本明細書で用いられる「ポリ(A)シグナル配列」は、エンドヌクレアーゼによるmRNAの
切断、および切断されたmRNAの3'末端への一続きのアデノシンの付加を誘発する配列であ
る。
切断、および切断されたmRNAの3'末端への一続きのアデノシンの付加を誘発する配列であ
る。
【0249】
本明細書で用いられる「ポリ(A)」は、ポリアデニル化によってmRNAに付着させた一続
きのアデノシンである。一過性発現のための構築物の好ましい態様において、ポリAは、5
0～5000、好ましくは64超、より好ましくは100超、最も好ましくは300超または400超であ
る。ポリ(A)配列は、局在性、安定性、または翻訳の効率などのmRNAの機能性を調節する
ために化学的にまたは酵素的に改変され得る。
きのアデノシンである。一過性発現のための構築物の好ましい態様において、ポリAは、5
0～5000、好ましくは64超、より好ましくは100超、最も好ましくは300超または400超であ
る。ポリ(A)配列は、局在性、安定性、または翻訳の効率などのmRNAの機能性を調節する
ために化学的にまたは酵素的に改変され得る。
【0250】
用いることができる複数のポリ(A)シグナル配列が存在しており、これらには、ウシ成
長ホルモン（bgh）（Woychiket al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81(13):3944-394
8, 1984; U.S.Patent No. 5,122,458）、マウス-βグロビン、マウス-αグロビン（Orki
n et al., EMBOJ. 4(2):453-456, 1985; Thein et al., Blood 71(2):313-319, 1988）
ヒトコラーゲン、ポリオーマウイルス（Batt et al., Mol. Cell Biol. 15(9):4783-4790
, 1995）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（HSVTK）、IgG重鎖遺伝子ポ
リアデニル化シグナル（US 2006/0040354）、ヒト成長ホルモン（hGH）（Szymanski et a
l., Mol.Therapy 15(7):1340-1347, 2007）、SV40後期および初期ポリ(A)シグナル配列
などSV40 ポリ(A)シグナル配列からなる群（Scheket al., Mol. Cell Biol. 12(12):538
6-5393, 1992）に由来する配列が含まれる。
長ホルモン（bgh）（Woychiket al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81(13):3944-394
8, 1984; U.S.Patent No. 5,122,458）、マウス-βグロビン、マウス-αグロビン（Orki
n et al., EMBOJ. 4(2):453-456, 1985; Thein et al., Blood 71(2):313-319, 1988）
ヒトコラーゲン、ポリオーマウイルス（Batt et al., Mol. Cell Biol. 15(9):4783-4790
, 1995）、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（HSVTK）、IgG重鎖遺伝子ポ
リアデニル化シグナル（US 2006/0040354）、ヒト成長ホルモン（hGH）（Szymanski et a
l., Mol.Therapy 15(7):1340-1347, 2007）、SV40後期および初期ポリ(A)シグナル配列
などSV40 ポリ(A)シグナル配列からなる群（Scheket al., Mol. Cell Biol. 12(12):538
6-5393, 1992）に由来する配列が含まれる。
【0251】
ポリ(A)シグナル配列は、配列AATAAAを含み得る。AATAAA配列は、
を含む、ポリアデニル化をシグナル伝達する能力を有する、AATAAAと相同性を有する他の
ヘキサヌクレオチド配列と置換されてもよい（例えば、WO 06/12414を参照されたい）。
を含む、ポリアデニル化をシグナル伝達する能力を有する、AATAAAと相同性を有する他の
ヘキサヌクレオチド配列と置換されてもよい（例えば、WO 06/12414を参照されたい）。
【0252】
いくつかの態様において、ポリ(A)シグナル配列は、合成ポリアデニル化部位であり得
る（例えば、Levittel al, Genes Dev. 3(7):1019-1025, 1989に基づく、PromegaのpCl-
neo発現ベクターを参照されたい）。いくつかの態様において、ポリ(A）シグナル配列は
、可溶性ニューロピリン1（sNRP）のポリアデニル化シグナル
である（例えば、WO05/073384を参照されたい）。ポリ(A)シグナル配列のさらなる例は
当技術分野において公知である。
る（例えば、Levittel al, Genes Dev. 3(7):1019-1025, 1989に基づく、PromegaのpCl-
neo発現ベクターを参照されたい）。いくつかの態様において、ポリ(A）シグナル配列は
、可溶性ニューロピリン1（sNRP）のポリアデニル化シグナル
である（例えば、WO05/073384を参照されたい）。ポリ(A)シグナル配列のさらなる例は
当技術分野において公知である。
【0253】
配列内リボソーム進入部位（IRES）
いくつかの態様において、オトフェリンタンパク質のC末端をコードするベクターは、
ポリヌクレオチド配列内リボソーム進入部位（IRES）を含み得る。IRES配列は、単一の遺
伝子転写産物から2つ以上のポリペプチドを生成するために用いられる。IRESは、IRESが
位置する位置の直ぐ下流のmRNAの任意の位置から翻訳が生じるように、複雑な二次構造を
形成する（例えば、Pelletierand Sonenberg, Mol. Cell. Biol. 8(3):1103-1112, 1988
を参照されたい）。
いくつかの態様において、オトフェリンタンパク質のC末端をコードするベクターは、
ポリヌクレオチド配列内リボソーム進入部位（IRES）を含み得る。IRES配列は、単一の遺
伝子転写産物から2つ以上のポリペプチドを生成するために用いられる。IRESは、IRESが
位置する位置の直ぐ下流のmRNAの任意の位置から翻訳が生じるように、複雑な二次構造を
形成する（例えば、Pelletierand Sonenberg, Mol. Cell. Biol. 8(3):1103-1112, 1988
を参照されたい）。
【0254】
当業者に公知の複数のIRES配列が存在し、これらには、例えば、口蹄疫ウイルス（FMDV
）、脳心筋炎ウイルス（EMCV）、ヒトライノウイルス（HRV）、コオロギ麻痺ウイルス,ヒ
ト免疫不全ウイルス（HIV）、A型肝炎ウイルス（HAV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、およ
びポリオウイルス（PV）由来の配列が含まれる。例えば、Alberts,Molecular Biology o
f the Cell, GarlandScience, 2002; and Hellen et al., Genes Dev. 15(13):1593-612
, 2001を参照されたい。
）、脳心筋炎ウイルス（EMCV）、ヒトライノウイルス（HRV）、コオロギ麻痺ウイルス,ヒ
ト免疫不全ウイルス（HIV）、A型肝炎ウイルス（HAV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、およ
びポリオウイルス（PV）由来の配列が含まれる。例えば、Alberts,Molecular Biology o
f the Cell, GarlandScience, 2002; and Hellen et al., Genes Dev. 15(13):1593-612
, 2001を参照されたい。
【0255】
いくつかの態様において、オトフェリンタンパク質のC末端をコードするベクター内に
組み込まれるIRES配列は、口蹄疫ウイルス（FMDV）である。口蹄疫ウイルス2A配列は、ポ
リタンパク質の切断を媒介することが示されている小さなペプチド（およそ18アミノ酸長
）である（Ryan,M D et al., EMBO 4:928-933, 1994; Mattion et al., J. Virology 70
:8124-8127,1996; Furler et al., Gene Therapy 8:864-873, 2001; およびHalpin et a
l., PlantJournal 4:453-459, 1999）。2A配列の切断活性は、プラスミドおよび遺伝子
治療ベクター（AAVおよびレトロウイルス）を含む人工システムにおいて以前に実証され
ている（Ryanet al., EMBO 4:928-933, 1994; Mattion et al., J. Virology 70:8124-8
127, 1996;Furler et al., Gene Therapy 8:864-873, 2001;およびHalpin et al., Plan
t Journal4:453-459, 1999; de Felipe et al., Gene Therapy 6:198-208, 1999; de Fe
lipe et al.,Human Gene Therapy 11:1921-1931, 2000; およびKlump et al., Gene The
rapy 8:811-817,2001）。
組み込まれるIRES配列は、口蹄疫ウイルス（FMDV）である。口蹄疫ウイルス2A配列は、ポ
リタンパク質の切断を媒介することが示されている小さなペプチド（およそ18アミノ酸長
）である（Ryan,M D et al., EMBO 4:928-933, 1994; Mattion et al., J. Virology 70
:8124-8127,1996; Furler et al., Gene Therapy 8:864-873, 2001; およびHalpin et a
l., PlantJournal 4:453-459, 1999）。2A配列の切断活性は、プラスミドおよび遺伝子
治療ベクター（AAVおよびレトロウイルス）を含む人工システムにおいて以前に実証され
ている（Ryanet al., EMBO 4:928-933, 1994; Mattion et al., J. Virology 70:8124-8
127, 1996;Furler et al., Gene Therapy 8:864-873, 2001;およびHalpin et al., Plan
t Journal4:453-459, 1999; de Felipe et al., Gene Therapy 6:198-208, 1999; de Fe
lipe et al.,Human Gene Therapy 11:1921-1931, 2000; およびKlump et al., Gene The
rapy 8:811-817,2001）。
【0256】
レポーター配列
本明細書において提供されるベクターのうちのいずれかは任意で、レポータータンパク
質をコードする配列（「レポーター配列」）を含み得る。レポーター配列の非限定的な例
は本明細書に記載されている。レポーター配列のさらなる例は当技術分野において公知で
ある。いくつかの態様において、レポーター配列は、本明細書に記載されているベクター
のうちのいずれかの組織特異的標的化能力および組織特異的プロモーター調節活性を検証
するために用いることができる。
本明細書において提供されるベクターのうちのいずれかは任意で、レポータータンパク
質をコードする配列（「レポーター配列」）を含み得る。レポーター配列の非限定的な例
は本明細書に記載されている。レポーター配列のさらなる例は当技術分野において公知で
ある。いくつかの態様において、レポーター配列は、本明細書に記載されているベクター
のうちのいずれかの組織特異的標的化能力および組織特異的プロモーター調節活性を検証
するために用いることができる。
【0257】
フランキング領域非翻訳領域（UTR）
いくつかの態様において、本明細書に記載されているベクターのうちのいずれか（例え
ば、少なくとも2つの異なるベクターのうちのいずれか）は、非翻訳領域を含み得る。い
くつかの態様において、ベクターは5' UTRまたは3' UTRを含み得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載されているベクターのうちのいずれか（例え
ば、少なくとも2つの異なるベクターのうちのいずれか）は、非翻訳領域を含み得る。い
くつかの態様において、ベクターは5' UTRまたは3' UTRを含み得る。
【0258】
遺伝子の非翻訳領域（UTR）は、転写されるが、翻訳されない。5' UTRは転写開始点で
始まり、開始コドンまで続くが、開始コドンを含まない。3' UTRは停止コドンの直後から
始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子の安定性および翻訳に関してUTRが果たす
調節的役割についての証拠が増えてきている。UTRの調節的特徴は、本明細書に記載され
ているようなベクター、組成物、キット、または方法のうちのいずれかに取り入れられ、
オトフェリンタンパク質の安定性を高めることができる。
始まり、開始コドンまで続くが、開始コドンを含まない。3' UTRは停止コドンの直後から
始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子の安定性および翻訳に関してUTRが果たす
調節的役割についての証拠が増えてきている。UTRの調節的特徴は、本明細書に記載され
ているようなベクター、組成物、キット、または方法のうちのいずれかに取り入れられ、
オトフェリンタンパク質の安定性を高めることができる。
【0259】
天然の5'UTRは、転写開始で役割を果たす配列を含む。それらは、それによってリボソ
ームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般に知られている、Ko
zak配列のような特性を保有する。Kozak配列はコンセンサス配列
を有し、式中、Rは、開始コドン（AUG）の3塩基上流にあるプリン（AまたはG）であり、
開始コドンの後にさらなる「G」が続く。5' UTRはまた、例えば、伸長因子結合に関与す
る二次構造を形成することも公知である。
ームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般に知られている、Ko
zak配列のような特性を保有する。Kozak配列はコンセンサス配列
を有し、式中、Rは、開始コドン（AUG）の3塩基上流にあるプリン（AまたはG）であり、
開始コドンの後にさらなる「G」が続く。5' UTRはまた、例えば、伸長因子結合に関与す
る二次構造を形成することも公知である。
【0260】
例えば、いくつかの態様において、5' UTRは、本明細書に記載されているベクターのう
ちのいずれかに含まれる。5' UTRの非限定的な例は、以下の遺伝子：アルブミン、血清ア
ミロイドA、アポリポタンパク質A/B/E、トランスフェリン、αフェトプロテイン、エリ
スロポエチン、および第VIII因子に由来するものを含み、mRNAなどの核酸分子の発現を増
強するために用いることができる。
ちのいずれかに含まれる。5' UTRの非限定的な例は、以下の遺伝子：アルブミン、血清ア
ミロイドA、アポリポタンパク質A/B/E、トランスフェリン、αフェトプロテイン、エリ
スロポエチン、および第VIII因子に由来するものを含み、mRNAなどの核酸分子の発現を増
強するために用いることができる。
【0261】
いくつかの態様において、蝸牛における細胞によって転写されるmRNA由来の5' UTRが、
本明細書に記載されているベクター、組成物、キット、および方法のうちのいずれかに含
まれ得る。
本明細書に記載されているベクター、組成物、キット、および方法のうちのいずれかに含
まれ得る。
【0262】
3' UTRは、その中に一続きのアデノシンおよびウリジンが組み込まれていることが知ら
れている。これらのAUリッチ特性は、高い回転率を有する遺伝子において特に見られる。
その配列特徴および機能特性に基づき、AUリッチ領域（ARE）は3つのクラスに分けること
ができる（Chenet al., Mol. Cell. Biol. 15:5777-5788, 1995; Chen et al., Mol. Ce
ll Biol.15:2010-2018, 1995）：クラスI AREは、Uリッチ領域内にAUUUAモチーフの複数
の分散したコピーを含有する。例えば、c-Myc mRNAおよびMyoD mRNAはクラスI AREを含有
する。クラスIIAREは、2つ以上の重複する
ノナマーを持つ。GM-CSFmRNAおよびTNFα mRNAは、クラスII AREを含有する例である。
クラスIIIAREはあまりよく定義されていない。そのUリッチ領域はAUUUAモチーフを含有
しない。当該クラスの2つのよく研究されている例は、c-Jun mRNAおよびミオゲニンmRNA
である。
れている。これらのAUリッチ特性は、高い回転率を有する遺伝子において特に見られる。
その配列特徴および機能特性に基づき、AUリッチ領域（ARE）は3つのクラスに分けること
ができる（Chenet al., Mol. Cell. Biol. 15:5777-5788, 1995; Chen et al., Mol. Ce
ll Biol.15:2010-2018, 1995）：クラスI AREは、Uリッチ領域内にAUUUAモチーフの複数
の分散したコピーを含有する。例えば、c-Myc mRNAおよびMyoD mRNAはクラスI AREを含有
する。クラスIIAREは、2つ以上の重複する
ノナマーを持つ。GM-CSFmRNAおよびTNFα mRNAは、クラスII AREを含有する例である。
クラスIIIAREはあまりよく定義されていない。そのUリッチ領域はAUUUAモチーフを含有
しない。当該クラスの2つのよく研究されている例は、c-Jun mRNAおよびミオゲニンmRNA
である。
【0263】
AREに結合するタンパク質の大部分はメッセンジャーを不安定にすることが公知である
のに対して、ELAVファミリーのメンバー、とりわけHuRは、mRNAの安定性を向上させると
記録されている。HuRは3つのクラス全てのAREに結合する。HuR特異的結合部位を核酸分子
の3' UTR内に設計することによってHuR結合がもたらされ、それによりインビボでメッセ
ージの安定化がもたらされるであろう。
のに対して、ELAVファミリーのメンバー、とりわけHuRは、mRNAの安定性を向上させると
記録されている。HuRは3つのクラス全てのAREに結合する。HuR特異的結合部位を核酸分子
の3' UTR内に設計することによってHuR結合がもたらされ、それによりインビボでメッセ
ージの安定化がもたらされるであろう。
【0264】
いくつかの態様において、3' UTR AREの導入、除去、または改変は、オトフェリンタン
パク質をコードするmRNAの安定性を調節するために用いることができる。他の態様におい
て、細胞内安定性を向上させることによりオトフェリンタンパク質の翻訳および生成を増
大させるために、AREを除去するかまたは変異させることができる。
パク質をコードするmRNAの安定性を調節するために用いることができる。他の態様におい
て、細胞内安定性を向上させることによりオトフェリンタンパク質の翻訳および生成を増
大させるために、AREを除去するかまたは変異させることができる。
【0265】
他の態様において、非UTR配列が5' UTRまたは3' UTR内に組み込まれ得る。いくつかの
態様において、本明細書において提供されるベクター、組成物、キット、および方法のう
ちのいずれかにおけるポリヌクレオチドのフランキング領域内に、イントロンまたはイン
トロン配列の一部分が組み込まれ得る。イントロン配列の組み込みは、タンパク質産生な
らびにmRNAレベルを増大させ得る。
態様において、本明細書において提供されるベクター、組成物、キット、および方法のう
ちのいずれかにおけるポリヌクレオチドのフランキング領域内に、イントロンまたはイン
トロン配列の一部分が組み込まれ得る。イントロン配列の組み込みは、タンパク質産生な
らびにmRNAレベルを増大させ得る。
【0266】
哺乳動物細胞
本明細書において、本明細書に記載されている核酸、ベクター（例えば、本明細書に記
載されている少なくとも2つの異なるベクター）、または組成物のうちのいずれかを含む
細胞（例えば、哺乳動物細胞）も提供される。当業者は、本明細書に記載されている核酸
およびベクターを任意の哺乳動物細胞内に導入できることを理解するであろう。ベクター
およびベクターを哺乳動物細胞内に導入するための方法の非限定的な例は本明細書に記載
されている。
本明細書において、本明細書に記載されている核酸、ベクター（例えば、本明細書に記
載されている少なくとも2つの異なるベクター）、または組成物のうちのいずれかを含む
細胞（例えば、哺乳動物細胞）も提供される。当業者は、本明細書に記載されている核酸
およびベクターを任意の哺乳動物細胞内に導入できることを理解するであろう。ベクター
およびベクターを哺乳動物細胞内に導入するための方法の非限定的な例は本明細書に記載
されている。
【0267】
いくつかの態様において、細胞は、ヒト細胞、マウス細胞、ブタ細胞、ウサギ細胞、イ
ヌ細胞、ネコ細胞、ラット細胞、ヒツジ細胞、ネコ細胞、ウマ細胞、または非ヒト霊長類
細胞である。いくつかの態様において、細胞は、蝸牛の特殊化した細胞である。いくつか
の態様において、細胞は、蝸牛内有毛細胞または蝸牛外有毛細胞である。いくつかの態様
において、細胞は蝸牛内有毛細胞である。いくつかの態様において、細胞は蝸牛内有毛細
胞である。
ヌ細胞、ネコ細胞、ラット細胞、ヒツジ細胞、ネコ細胞、ウマ細胞、または非ヒト霊長類
細胞である。いくつかの態様において、細胞は、蝸牛の特殊化した細胞である。いくつか
の態様において、細胞は、蝸牛内有毛細胞または蝸牛外有毛細胞である。いくつかの態様
において、細胞は蝸牛内有毛細胞である。いくつかの態様において、細胞は蝸牛内有毛細
胞である。
【0268】
いくつかの態様において、哺乳動物細胞はインビトロにある。いくつかの態様において
、哺乳動物細胞は哺乳動物中に存在する。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、対
象から得られかつエクスビボで培養された自己細胞である。
、哺乳動物細胞は哺乳動物中に存在する。いくつかの態様において、哺乳動物細胞は、対
象から得られかつエクスビボで培養された自己細胞である。
【0269】
方法
本明細書において、治療的有効量の本明細書に記載されている組成物のうちのいずれか
を哺乳動物（例えば、ヒト）の蝸牛に導入する方法も提供される。さらに、治療的有効量
の本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを哺乳動物の蝸牛に導入する工程を
含む、哺乳動物（例えば、ヒト）の蝸牛の内有毛細胞において活性オトフェリンタンパク
質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）の発現を増大させる方法も提供される。さら
に、治療的有効量の本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを対象の蝸牛内に
投与する工程を含む、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると特定された対象（例えば、ヒト
）において非症候性感音難聴を治療する方法も提供される。いくつかの例では、本明細書
に記載されている方法は、対象の蝸牛に神経栄養因子を投与する工程をさらに含み得る（
例えば、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかと実質的に同時に、対象に投
与される）。いくつかの例では、本明細書に記載されている方法は、対象に蝸牛インプラ
ントを投与する工程をさらに含み得る（例えば、本明細書に記載されている組成物のうち
のいずれかと実質的に同時に、対象に投与される）。
本明細書において、治療的有効量の本明細書に記載されている組成物のうちのいずれか
を哺乳動物（例えば、ヒト）の蝸牛に導入する方法も提供される。さらに、治療的有効量
の本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを哺乳動物の蝸牛に導入する工程を
含む、哺乳動物（例えば、ヒト）の蝸牛の内有毛細胞において活性オトフェリンタンパク
質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）の発現を増大させる方法も提供される。さら
に、治療的有効量の本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを対象の蝸牛内に
投与する工程を含む、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると特定された対象（例えば、ヒト
）において非症候性感音難聴を治療する方法も提供される。いくつかの例では、本明細書
に記載されている方法は、対象の蝸牛に神経栄養因子を投与する工程をさらに含み得る（
例えば、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかと実質的に同時に、対象に投
与される）。いくつかの例では、本明細書に記載されている方法は、対象に蝸牛インプラ
ントを投与する工程をさらに含み得る（例えば、本明細書に記載されている組成物のうち
のいずれかと実質的に同時に、対象に投与される）。
【0270】
これらの方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、哺乳動物は、欠陥オトフェ
リン遺伝子（例えば、該遺伝子によってコードされるオトフェリンタンパク質の発現およ
び/または活性の低下をもたらす変異を有するオトフェリン遺伝子）を有すると予め特定
されている。これらの方法のうちのいずれかのいくつかの態様は、導入する工程または投
与する工程の前に、対象が欠陥オトフェリン遺伝子を有することを決定する工程をさらに
含む。これらの方法のうちのいずれかのいくつかの態様は、対象においてオトフェリン遺
伝子における変異を検出する工程をさらに含み得る。該方法のうちのいずれかのいくつか
の態様は、対象を非症候性感音難聴を有すると特定または診断する工程をさらに含み得る
。
リン遺伝子（例えば、該遺伝子によってコードされるオトフェリンタンパク質の発現およ
び/または活性の低下をもたらす変異を有するオトフェリン遺伝子）を有すると予め特定
されている。これらの方法のうちのいずれかのいくつかの態様は、導入する工程または投
与する工程の前に、対象が欠陥オトフェリン遺伝子を有することを決定する工程をさらに
含む。これらの方法のうちのいずれかのいくつかの態様は、対象においてオトフェリン遺
伝子における変異を検出する工程をさらに含み得る。該方法のうちのいずれかのいくつか
の態様は、対象を非症候性感音難聴を有すると特定または診断する工程をさらに含み得る
。
【0271】
これらの方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、本明細書に記載されている
組成物のうちのいずれかの2回以上の用量が、哺乳動物または対象の蝸牛に導入または投
与される。これらの方法のうちのいずれかのいくつかの態様は、組成物の第1の用量を哺
乳動物または対象の蝸牛に導入または投与する工程、第1の用量の導入または投与後に哺
乳動物または対象の聴力機能を評価する工程、および正常範囲内の聴力機能を有さないと
認められた（例えば、当技術分野において公知の聴力についての任意の検査を用いて決定
された）哺乳動物または対象の蝸牛に組成物の追加用量を投与する工程を含み得る。
組成物のうちのいずれかの2回以上の用量が、哺乳動物または対象の蝸牛に導入または投
与される。これらの方法のうちのいずれかのいくつかの態様は、組成物の第1の用量を哺
乳動物または対象の蝸牛に導入または投与する工程、第1の用量の導入または投与後に哺
乳動物または対象の聴力機能を評価する工程、および正常範囲内の聴力機能を有さないと
認められた（例えば、当技術分野において公知の聴力についての任意の検査を用いて決定
された）哺乳動物または対象の蝸牛に組成物の追加用量を投与する工程を含み得る。
【0272】
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、組成物は
、蝸牛内投与用に製剤化され得る。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのい
くつかの態様において、本明細書に記載されている組成物は、蝸牛内投与または局所投与
により投与され得る。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様
において、組成物は、医療デバイス（例えば、本明細書に記載されている例示的な医療デ
バイスのうちのいずれか）を使用して投与される。
、蝸牛内投与用に製剤化され得る。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのい
くつかの態様において、本明細書に記載されている組成物は、蝸牛内投与または局所投与
により投与され得る。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様
において、組成物は、医療デバイス（例えば、本明細書に記載されている例示的な医療デ
バイスのうちのいずれか）を使用して投与される。
【0273】
いくつかの態様において、蝸牛内投与は、本明細書に記載されている方法または当技術
分野において公知の方法のいずれかを用いて実施され得る。例えば、組成物は、以下の外
科的手法を用いて蝸牛に投与または導入され得る：初めに0度、2.5-mm硬性内視鏡による
視覚化を用いて、外耳道をきれいにし、円刃刀を用いておよそ5-mmの外耳道鼓膜弁の輪郭
を鋭く線引きする。次いで、外耳道鼓膜弁を持ち上げ、後方の中耳に進入する。鼓索神経
を特定および分割し、鋭匙を用いて上鼓室側壁の（scutal）骨を取り除き、正円窓膜を露
出させる。投与または導入される組成物の先端への分布を強化するために、手術用レーザ
ーを用いて、卵円窓に小さな2-mmの開窓術を行い、正円窓膜を越えて組成物を注入する時
に外リンパ置換を可能にしてもよい。次いで、マイクロインフュージョンデバイスを準備
し、手術野に至らしめる。デバイスを正円窓に向かって進め、先端を正円窓の骨突出部内
に設置し、マイクロニードルによる膜の穿通を可能にする。組成物の測定された着実な注
入を可能にするように、足踏みペダルを連動させる。次いで、デバイスを引き抜き、正円
窓およびアブミ骨底板をゲルフォームパッチで塞ぐ。
分野において公知の方法のいずれかを用いて実施され得る。例えば、組成物は、以下の外
科的手法を用いて蝸牛に投与または導入され得る：初めに0度、2.5-mm硬性内視鏡による
視覚化を用いて、外耳道をきれいにし、円刃刀を用いておよそ5-mmの外耳道鼓膜弁の輪郭
を鋭く線引きする。次いで、外耳道鼓膜弁を持ち上げ、後方の中耳に進入する。鼓索神経
を特定および分割し、鋭匙を用いて上鼓室側壁の（scutal）骨を取り除き、正円窓膜を露
出させる。投与または導入される組成物の先端への分布を強化するために、手術用レーザ
ーを用いて、卵円窓に小さな2-mmの開窓術を行い、正円窓膜を越えて組成物を注入する時
に外リンパ置換を可能にしてもよい。次いで、マイクロインフュージョンデバイスを準備
し、手術野に至らしめる。デバイスを正円窓に向かって進め、先端を正円窓の骨突出部内
に設置し、マイクロニードルによる膜の穿通を可能にする。組成物の測定された着実な注
入を可能にするように、足踏みペダルを連動させる。次いで、デバイスを引き抜き、正円
窓およびアブミ骨底板をゲルフォームパッチで塞ぐ。
【0274】
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、対象また
は哺乳動物は、齧歯類、非ヒト霊長類、またはヒトである。本明細書に記載されている方
法のうちのいずれかのいくつかの態様において、対象または哺乳動物は、成体、10歳代、
若齡、小児、幼児、乳幼児、または新生児もしくは新生仔である。本明細書に記載されて
いる方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、対象または哺乳動物の年齢は、1
～5、1～10、1～20、1～30、1～40、1～50、1～60、1～70、1～80、1～90、1～100、1～1
10、2～5、2～10、10～20、20～30、30～40、40～50、50～60、60～70、70～80、80～90
、90～100、100～110、10～30、10～40、10～50、10～60、10～70、10～80、10～90、10
～100、10～110、20～40、20～50、20～60、20～70、20～80、20～90、20～100、20～110
、30～50、30～60、30～70、30～80、30～90、30～100、40～60、40～70、40～80、40～9
0、40～100、50～70、50～80、50～90、50～100、60～80、60～90、60～100、70～90、70
～100、70～110、80～100、80～110、または90～110歳である。本明細書に記載されてい
る方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、対象または哺乳動物の月齢は、1、2
、3、4、5、6、7、8、9、10、または11ヶ月である。
は哺乳動物は、齧歯類、非ヒト霊長類、またはヒトである。本明細書に記載されている方
法のうちのいずれかのいくつかの態様において、対象または哺乳動物は、成体、10歳代、
若齡、小児、幼児、乳幼児、または新生児もしくは新生仔である。本明細書に記載されて
いる方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、対象または哺乳動物の年齢は、1
～5、1～10、1～20、1～30、1～40、1～50、1～60、1～70、1～80、1～90、1～100、1～1
10、2～5、2～10、10～20、20～30、30～40、40～50、50～60、60～70、70～80、80～90
、90～100、100～110、10～30、10～40、10～50、10～60、10～70、10～80、10～90、10
～100、10～110、20～40、20～50、20～60、20～70、20～80、20～90、20～100、20～110
、30～50、30～60、30～70、30～80、30～90、30～100、40～60、40～70、40～80、40～9
0、40～100、50～70、50～80、50～90、50～100、60～80、60～90、60～100、70～90、70
～100、70～110、80～100、80～110、または90～110歳である。本明細書に記載されてい
る方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、対象または哺乳動物の月齢は、1、2
、3、4、5、6、7、8、9、10、または11ヶ月である。
【0275】
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、対象また
は哺乳動物は、非症候性感音難聴を有するかまたはそれを発症するリスクがある。本明細
書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、対象または哺乳動
物は、オトフェリン遺伝子に変異を有すると以前に特定されている。本明細書に記載され
ている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、対象または哺乳動物は、本明細
書に記載されているかまたは非症候性感音難聴と関連することが当技術分野において公知
である、オトフェリン遺伝子における変異のうちのいずれかを有する。
は哺乳動物は、非症候性感音難聴を有するかまたはそれを発症するリスクがある。本明細
書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、対象または哺乳動
物は、オトフェリン遺伝子に変異を有すると以前に特定されている。本明細書に記載され
ている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、対象または哺乳動物は、本明細
書に記載されているかまたは非症候性感音難聴と関連することが当技術分野において公知
である、オトフェリン遺伝子における変異のうちのいずれかを有する。
【0276】
本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつかの態様において、対象また
は哺乳動物は、（例えば、遺伝子検査を介して）オトフェリン遺伝子における変異のキャ
リアであると特定されている。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつ
かの態様において、対象またはヒトは、オトフェリン遺伝子における変異を有すると特定
されており、かつ非症候性感音難聴と診断されている。本明細書に記載されている方法の
うちのいずれかのいくつかの態様において、対象またはヒトは、非症候性感音難聴を有す
ると特定されている。
は哺乳動物は、（例えば、遺伝子検査を介して）オトフェリン遺伝子における変異のキャ
リアであると特定されている。本明細書に記載されている方法のうちのいずれかのいくつ
かの態様において、対象またはヒトは、オトフェリン遺伝子における変異を有すると特定
されており、かつ非症候性感音難聴と診断されている。本明細書に記載されている方法の
うちのいずれかのいくつかの態様において、対象またはヒトは、非症候性感音難聴を有す
ると特定されている。
【0277】
いくつかの態様において、非症候性感音難聴の治療の成功は、当技術分野において公知
の通常の聴力機能検査のうちのいずれかを用いて対象において判定することができる。聴
力機能検査の非限定的な例は、さまざまな種類の聴力アッセイ（例えば、純音検査、語音
検査、中耳の検査、聴性脳幹反応、および耳音響放射）である。
の通常の聴力機能検査のうちのいずれかを用いて対象において判定することができる。聴
力機能検査の非限定的な例は、さまざまな種類の聴力アッセイ（例えば、純音検査、語音
検査、中耳の検査、聴性脳幹反応、および耳音響放射）である。
【0278】
本明細書において、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを哺乳動物細胞
に導入する工程を含む、哺乳動物細胞おいて活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長
オトフェリンタンパク質）の発現を増大させる方法も提供される。これらの方法のいくつ
かの態様において、哺乳動物細胞は蝸牛内有毛細胞である。これらの方法のいくつかの態
様において、哺乳動物細胞はヒト細胞（例えば、ヒト蝸牛内有毛細胞）である。これらの
方法のいくつかの態様において、哺乳動物細胞はインビトロにある。これらの方法のいく
つかの態様において、哺乳動物細胞は哺乳動物中にある。これらの方法のいくつかの態様
において、哺乳動物細胞は、元は哺乳動物から得られ、エクスビボで培養される。いくつ
かの態様において、哺乳動物細胞は、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に判定され
ている。
に導入する工程を含む、哺乳動物細胞おいて活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長
オトフェリンタンパク質）の発現を増大させる方法も提供される。これらの方法のいくつ
かの態様において、哺乳動物細胞は蝸牛内有毛細胞である。これらの方法のいくつかの態
様において、哺乳動物細胞はヒト細胞（例えば、ヒト蝸牛内有毛細胞）である。これらの
方法のいくつかの態様において、哺乳動物細胞はインビトロにある。これらの方法のいく
つかの態様において、哺乳動物細胞は哺乳動物中にある。これらの方法のいくつかの態様
において、哺乳動物細胞は、元は哺乳動物から得られ、エクスビボで培養される。いくつ
かの態様において、哺乳動物細胞は、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に判定され
ている。
【0279】
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを哺乳動物細胞に導入するための方
法は、当技術分野において公知である（例えば、リポフェクションを介して、またはウイ
ルスベクター、例えば、本明細書に記載されているウイルスベクターのうちのいずれかの
使用を通じて）。
法は、当技術分野において公知である（例えば、リポフェクションを介して、またはウイ
ルスベクター、例えば、本明細書に記載されているウイルスベクターのうちのいずれかの
使用を通じて）。
【0280】
本明細書に記載されているような活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェ
リンタンパク質）の発現は、例えば、対照と比較して、またはベクターを導入する前の活
性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）の発現のレベルと比
較して、増大する。
リンタンパク質）の発現は、例えば、対照と比較して、またはベクターを導入する前の活
性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）の発現のレベルと比
較して、増大する。
【0281】
オトフェリンの発現および/または活性を検出する方法は、当技術分野において公知で
ある。いくつかの態様において、オトフェリンタンパク質の発現のレベルは、直接的に検
出され得る（例えば、オトフェリンタンパク質を検出するまたはオトフェリンmRNAを検出
する）。オトフェリンの発現および/または活性を直接的に検出するのに用いることがで
きる技術の非限定的な例には、リアルタイムPCR、ウエスタンブロッティング、免疫沈降
、免疫組織化学的検査、または免疫蛍光法が含まれる。いくつかの態様において、オトフ
ェリンタンパク質の発現は、間接的に（例えば、聴力機能検査を通じて）検出することが
できる。
ある。いくつかの態様において、オトフェリンタンパク質の発現のレベルは、直接的に検
出され得る（例えば、オトフェリンタンパク質を検出するまたはオトフェリンmRNAを検出
する）。オトフェリンの発現および/または活性を直接的に検出するのに用いることがで
きる技術の非限定的な例には、リアルタイムPCR、ウエスタンブロッティング、免疫沈降
、免疫組織化学的検査、または免疫蛍光法が含まれる。いくつかの態様において、オトフ
ェリンタンパク質の発現は、間接的に（例えば、聴力機能検査を通じて）検出することが
できる。
【0282】
薬学的組成物およびキット
本発明の薬学的組成物は、本明細書に記載されているような核酸、例えば、1つまたは
複数のAAVベクターを、1つまたは複数の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈
剤、または賦形剤との組み合わせで含んでもよい。そのような組成物は、中性緩衝化食塩
水およびリン酸緩衝化食塩水などの緩衝剤；グルコース、マンノース、スクロース、また
はデキストランなどの糖質；マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンな
どのアミノ酸；抗酸化剤；EDTAまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例
えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含んでもよい。本発明の組成物は、1つの
局面において、蝸牛内投与用に製剤化されている。本発明の組成物は、1つの局面におい
て、静脈内投与用に製剤化されている。
本発明の薬学的組成物は、本明細書に記載されているような核酸、例えば、1つまたは
複数のAAVベクターを、1つまたは複数の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈
剤、または賦形剤との組み合わせで含んでもよい。そのような組成物は、中性緩衝化食塩
水およびリン酸緩衝化食塩水などの緩衝剤；グルコース、マンノース、スクロース、また
はデキストランなどの糖質；マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンな
どのアミノ酸；抗酸化剤；EDTAまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例
えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含んでもよい。本発明の組成物は、1つの
局面において、蝸牛内投与用に製剤化されている。本発明の組成物は、1つの局面におい
て、静脈内投与用に製剤化されている。
【0283】
好ましくは、治療用組成物は蝸牛内投与用に製剤化されている。任意で、治療用組成物
は、脂質ナノ粒子を含むように製剤化されている。任意で、治療用組成物は、ポリマーナ
ノ粒子を含むように製剤化されている。任意で、治療用組成物は、小環状DNAを含むよう
に製剤化されている。任意で、治療用組成物は、CELiD DNAを含むように製剤化されてい
る。任意で、治療用組成物は、合成外リンパ液を含むように製剤化されている。例示的な
合成外リンパ液は、約6～約9のpHで、20～200 mM NaCl；1～5 mM KCl；0.1～10 mM CaCl2
；1～10 mMグルコース；および2～50mM HEPESを含む。
は、脂質ナノ粒子を含むように製剤化されている。任意で、治療用組成物は、ポリマーナ
ノ粒子を含むように製剤化されている。任意で、治療用組成物は、小環状DNAを含むよう
に製剤化されている。任意で、治療用組成物は、CELiD DNAを含むように製剤化されてい
る。任意で、治療用組成物は、合成外リンパ液を含むように製剤化されている。例示的な
合成外リンパ液は、約6～約9のpHで、20～200 mM NaCl；1～5 mM KCl；0.1～10 mM CaCl2
；1～10 mMグルコース；および2～50mM HEPESを含む。
【0284】
いくつかの態様において、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかは、哺乳
動物細胞内への核酸または本明細書に記載されているベクターのうちのいずれかの侵入を
促進する1つまたは複数の剤（例えば、リポソームまたはカチオン性脂質）をさらに含み
得る。いくつかの態様において、本明細書に記載されているベクターのうちのいずれかは
、天然ポリマーおよび/または合成ポリマーを用いて製剤化され得る。本明細書に記載さ
れている組成物のうちのいずれかにおいて含まれ得るポリマーの非限定的な例には、これ
らに限定されないが、DYNAMIC POLYCONJUGATE(登録商標)（Arrowhead Research Corp., P
asadena, Calif）、Mirus Bio（Madison, Wis.）およびRoche Madison（Madison, Wis.
）の製剤、PhaseRXポリマー製剤、例えば、これらに限定されないが、SMARTTPOLYMER TE
CHNOLOGY(登録商標)（PhaseRX,Seattle, Wash ）等、DMRI/DOPE、ポロクサマー、Vical
（SanDiego, Calif）のVAXFECTIN(登録商標)アジュバント、キトサン、Calando Pharmac
euticals（Pasadena,Calif）のシクロデキストリン、デンドリマーおよびポリ(乳酸-co-
グリコール酸)（PLGA）ポリマー、RONDEL(商標)（RNAi/オリゴヌクレオチドナノ粒子送達
）ポリマー（ArrowheadResearch Corporation, Pasadena, Calif）、ならびにpH応答性
コブロック（co-block）ポリマー、例えば、これらに限定されないが、PhaseRX（Seattle
, Wash.）により製造されるコブロックポリマー等が含まれ得る。これらのポリマーの多
くは、インビボでオリゴヌクレオチドを哺乳動物細胞内に送達するのに有効であることが
実証されている（例えば、deFougerolles, Human Gene Ther. 19:125-132, 2008; Rozema
et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:12982-12887, 2007; Rozema et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 104:12982-12887, 2007; Hu-Lieskovan et al., Cancer Re
s.65:8984-8982, 2005; Heidel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:5715-572
1, 2007を参照されたい）。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかは、例え
ば、薬学的組成物であり得る。
動物細胞内への核酸または本明細書に記載されているベクターのうちのいずれかの侵入を
促進する1つまたは複数の剤（例えば、リポソームまたはカチオン性脂質）をさらに含み
得る。いくつかの態様において、本明細書に記載されているベクターのうちのいずれかは
、天然ポリマーおよび/または合成ポリマーを用いて製剤化され得る。本明細書に記載さ
れている組成物のうちのいずれかにおいて含まれ得るポリマーの非限定的な例には、これ
らに限定されないが、DYNAMIC POLYCONJUGATE(登録商標)（Arrowhead Research Corp., P
asadena, Calif）、Mirus Bio（Madison, Wis.）およびRoche Madison（Madison, Wis.
）の製剤、PhaseRXポリマー製剤、例えば、これらに限定されないが、SMARTTPOLYMER TE
CHNOLOGY(登録商標)（PhaseRX,Seattle, Wash ）等、DMRI/DOPE、ポロクサマー、Vical
（SanDiego, Calif）のVAXFECTIN(登録商標)アジュバント、キトサン、Calando Pharmac
euticals（Pasadena,Calif）のシクロデキストリン、デンドリマーおよびポリ(乳酸-co-
グリコール酸)（PLGA）ポリマー、RONDEL(商標)（RNAi/オリゴヌクレオチドナノ粒子送達
）ポリマー（ArrowheadResearch Corporation, Pasadena, Calif）、ならびにpH応答性
コブロック（co-block）ポリマー、例えば、これらに限定されないが、PhaseRX（Seattle
, Wash.）により製造されるコブロックポリマー等が含まれ得る。これらのポリマーの多
くは、インビボでオリゴヌクレオチドを哺乳動物細胞内に送達するのに有効であることが
実証されている（例えば、deFougerolles, Human Gene Ther. 19:125-132, 2008; Rozema
et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:12982-12887, 2007; Rozema et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 104:12982-12887, 2007; Hu-Lieskovan et al., Cancer Re
s.65:8984-8982, 2005; Heidel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:5715-572
1, 2007を参照されたい）。本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかは、例え
ば、薬学的組成物であり得る。
【0285】
いくつかの態様において、組成物には、薬学的に許容される担体（例えば、リン酸緩衝
化食塩水、食塩水、または静菌水）が含まれる。製剤後、溶液は、投薬剤形に適合する形
で、かつ治療的に有効な量で投与される。製剤は、注射可能な溶液、注射可能なゲル、お
よび薬物放出カプセル等の種々の剤形で容易に投与される。
化食塩水、食塩水、または静菌水）が含まれる。製剤後、溶液は、投薬剤形に適合する形
で、かつ治療的に有効な量で投与される。製剤は、注射可能な溶液、注射可能なゲル、お
よび薬物放出カプセル等の種々の剤形で容易に投与される。
【0286】
本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」という用語には、薬学的な投
与に適合している溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤、および抗真菌剤等が含まれる
。補足的な活性化合物もまた、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかに組み
込まれ得る。
与に適合している溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤、および抗真菌剤等が含まれる
。補足的な活性化合物もまた、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかに組み
込まれ得る。
【0287】
いくつかの態様において、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかの1回の
用量は、少なくとも1ng、少なくとも2 ng、少なくとも4 ng、約6 ng、約8 ng、少なくと
も10 ng、少なくとも20ng、少なくとも30 ng、少なくとも40 ng、少なくとも50 ng、少
なくとも60 ng、少なくとも70ng、少なくとも80 ng、少なくとも90 ng、少なくとも100
ng、少なくとも200 ng、少なくとも300ng、少なくとも400 ng、少なくとも500 ng、少な
くとも1 μg、少なくとも2μg、少なくとも4 μg、少なくとも6 μg、少なくとも8 μg
、少なくとも10 μg、少なくとも12μg、少なくとも14 μg、少なくとも16 μg、少なく
とも18 μg、少なくとも20μg、少なくとも22 μg、少なくとも24 μg、少なくとも26
μg、少なくとも28μg、少なくとも30 μg、少なくとも32 μg、少なくとも34 μg、少
なくとも36 μg、少なくとも38μg、少なくとも40 μg、少なくとも42 μg、少なくとも
44 μg、少なくとも46 μg、少なくとも48μg、少なくとも50 μg、少なくとも52 μg、
少なくとも54 μg、少なくとも56μg、少なくとも58 μg、少なくとも60 μg、少なくと
も62 μg、少なくとも64μg、少なくとも66 μg、少なくとも68 μg、少なくとも70 μg
、少なくとも72 μg、少なくとも74μg、少なくとも76 μg、少なくとも78 μg、少なく
とも80 μg、少なくとも82μg、少なくとも84 μg、少なくとも86 μg、少なくとも88
μg、少なくとも90μg、少なくとも92 μg、少なくとも94 μg、少なくとも96 μg、少
なくとも98 μg、少なくとも100μg、少なくとも102 μg、少なくとも104 μg、少なく
とも106 μg、少なくとも108μg、少なくとも110 μg、少なくとも112 μg、少なくとも
114 μg、少なくとも116μg、少なくとも118 μg、少なくとも120 μg、少なくとも122
μg、少なくとも124μg、少なくとも126 μg、少なくとも128 μg、少なくとも130 μg
、少なくとも132μg、少なくとも134 μg、少なくとも136 μg、少なくとも138 μg、少
なくとも140 μg、少なくとも142μg、少なくとも144 μg、少なくとも146 μg、少なく
とも148 μg、少なくとも150μg、少なくとも152 μg、少なくとも154 μg、少なくとも
156 μg、少なくとも158μg、少なくとも160 μg、少なくとも162 μg、少なくとも164
μg、少なくとも166μg、少なくとも168 μg、少なくとも170 μg、少なくとも172 μg
、少なくとも174μg、少なくとも176 μg、少なくとも178 μg、少なくとも180 μg、少
なくとも182 μg、少なくとも184μg、少なくとも186 μg、少なくとも188 μg、少なく
とも190 μg、少なくとも192μg、少なくとも194 μg、少なくとも196 μg、少なくとも
198 μg、または少なくとも200μgの少なくとも2つの異なるベクターの合計量を、例え
ば緩衝液中に含み得る。
用量は、少なくとも1ng、少なくとも2 ng、少なくとも4 ng、約6 ng、約8 ng、少なくと
も10 ng、少なくとも20ng、少なくとも30 ng、少なくとも40 ng、少なくとも50 ng、少
なくとも60 ng、少なくとも70ng、少なくとも80 ng、少なくとも90 ng、少なくとも100
ng、少なくとも200 ng、少なくとも300ng、少なくとも400 ng、少なくとも500 ng、少な
くとも1 μg、少なくとも2μg、少なくとも4 μg、少なくとも6 μg、少なくとも8 μg
、少なくとも10 μg、少なくとも12μg、少なくとも14 μg、少なくとも16 μg、少なく
とも18 μg、少なくとも20μg、少なくとも22 μg、少なくとも24 μg、少なくとも26
μg、少なくとも28μg、少なくとも30 μg、少なくとも32 μg、少なくとも34 μg、少
なくとも36 μg、少なくとも38μg、少なくとも40 μg、少なくとも42 μg、少なくとも
44 μg、少なくとも46 μg、少なくとも48μg、少なくとも50 μg、少なくとも52 μg、
少なくとも54 μg、少なくとも56μg、少なくとも58 μg、少なくとも60 μg、少なくと
も62 μg、少なくとも64μg、少なくとも66 μg、少なくとも68 μg、少なくとも70 μg
、少なくとも72 μg、少なくとも74μg、少なくとも76 μg、少なくとも78 μg、少なく
とも80 μg、少なくとも82μg、少なくとも84 μg、少なくとも86 μg、少なくとも88
μg、少なくとも90μg、少なくとも92 μg、少なくとも94 μg、少なくとも96 μg、少
なくとも98 μg、少なくとも100μg、少なくとも102 μg、少なくとも104 μg、少なく
とも106 μg、少なくとも108μg、少なくとも110 μg、少なくとも112 μg、少なくとも
114 μg、少なくとも116μg、少なくとも118 μg、少なくとも120 μg、少なくとも122
μg、少なくとも124μg、少なくとも126 μg、少なくとも128 μg、少なくとも130 μg
、少なくとも132μg、少なくとも134 μg、少なくとも136 μg、少なくとも138 μg、少
なくとも140 μg、少なくとも142μg、少なくとも144 μg、少なくとも146 μg、少なく
とも148 μg、少なくとも150μg、少なくとも152 μg、少なくとも154 μg、少なくとも
156 μg、少なくとも158μg、少なくとも160 μg、少なくとも162 μg、少なくとも164
μg、少なくとも166μg、少なくとも168 μg、少なくとも170 μg、少なくとも172 μg
、少なくとも174μg、少なくとも176 μg、少なくとも178 μg、少なくとも180 μg、少
なくとも182 μg、少なくとも184μg、少なくとも186 μg、少なくとも188 μg、少なく
とも190 μg、少なくとも192μg、少なくとも194 μg、少なくとも196 μg、少なくとも
198 μg、または少なくとも200μgの少なくとも2つの異なるベクターの合計量を、例え
ば緩衝液中に含み得る。
【0288】
本明細書において提供される組成物は、例えば、その目的とする投与経路に適合するよ
うに製剤化され得る。目的とする投与経路の非限定的な例は、局所投与（例えば、蝸牛内
投与）である。
うに製剤化され得る。目的とする投与経路の非限定的な例は、局所投与（例えば、蝸牛内
投与）である。
【0289】
いくつかの態様において、治療用組成物は、脂質ナノ粒子を含むように製剤化されてい
る。いくつかの態様において、治療用組成物は、ポリマーナノ粒子を含むように製剤化さ
れている。いくつかの態様において、治療用組成物は、小環状DNAを含むように製剤化さ
れている。いくつかの態様において、治療用組成物は、CELiD DNAを含むように製剤化さ
れている。いくつかの態様において、治療用組成物は、合成外リンパ液を含むように製剤
化されている。例示的な合成外リンパ液は、20～200 mM NaCl；1～5 mM KCl；0.1～10 mM
CaCl2；1～10mMグルコース； 2～50 mM HEPESを含み、約6～約9のpHを有する。
る。いくつかの態様において、治療用組成物は、ポリマーナノ粒子を含むように製剤化さ
れている。いくつかの態様において、治療用組成物は、小環状DNAを含むように製剤化さ
れている。いくつかの態様において、治療用組成物は、CELiD DNAを含むように製剤化さ
れている。いくつかの態様において、治療用組成物は、合成外リンパ液を含むように製剤
化されている。例示的な合成外リンパ液は、20～200 mM NaCl；1～5 mM KCl；0.1～10 mM
CaCl2；1～10mMグルコース； 2～50 mM HEPESを含み、約6～約9のpHを有する。
【0290】
本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを含むキットも提供される。いくつ
かの態様において、キットは、固体組成物（例えば、本明細書に記載されている少なくと
も2つの異なるベクターを含む凍結乾燥した組成物）、および凍結乾燥した組成物を可溶
化するための液体を含み得る。いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載され
ている組成物のうちのいずれかを含む充填済みシリンジを含み得る。
かの態様において、キットは、固体組成物（例えば、本明細書に記載されている少なくと
も2つの異なるベクターを含む凍結乾燥した組成物）、および凍結乾燥した組成物を可溶
化するための液体を含み得る。いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載され
ている組成物のうちのいずれかを含む充填済みシリンジを含み得る。
【0291】
いくつかの態様において、キットは、（例えば、水性組成物（例えば、水性薬学的組成
物）として製剤化された）本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを含むバイ
アルを含む。
物）として製剤化された）本明細書に記載されている組成物のうちのいずれかを含むバイ
アルを含む。
【0292】
いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載されている方法のうちのいずれか
を実施するための説明書を含み得る。
を実施するための説明書を含み得る。
【0293】
投与経路
注射用途に適した薬学的形態には、滅菌水溶液または分散物、および滅菌注射液または
分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。分散物は、グリセロール、液体ポリエチレン
グリコール、およびそれらの混合物、ならびに油で調製されてもよい。保存および使用の
一般的な条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。多
くの場合では、該剤形は、無菌であり、かつ注射容易性（easy syringability）が存在す
る程度に流体である。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌お
よび真菌などの微生物の混入活動に対して保護されなければならない。担体は、例えば、
水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液
体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、および/または植物油を含む、
溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの
使用によって、分散物の場合は必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使
用によって、維持され得る。微生物の活動の防止は、さまざまな抗細菌剤および抗真菌剤
、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、およびチメロサール等
によってもたらされ得る。多くの場合では、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを
含むことが好ましい。注射可能な組成物の長時間吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、
モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物における使用によってもたらされ
得る。
注射用途に適した薬学的形態には、滅菌水溶液または分散物、および滅菌注射液または
分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。分散物は、グリセロール、液体ポリエチレン
グリコール、およびそれらの混合物、ならびに油で調製されてもよい。保存および使用の
一般的な条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。多
くの場合では、該剤形は、無菌であり、かつ注射容易性（easy syringability）が存在す
る程度に流体である。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌お
よび真菌などの微生物の混入活動に対して保護されなければならない。担体は、例えば、
水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液
体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、および/または植物油を含む、
溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの
使用によって、分散物の場合は必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使
用によって、維持され得る。微生物の活動の防止は、さまざまな抗細菌剤および抗真菌剤
、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、およびチメロサール等
によってもたらされ得る。多くの場合では、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを
含むことが好ましい。注射可能な組成物の長時間吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、
モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物における使用によってもたらされ
得る。
【0294】
注射可能な水溶液の投与では、例えば、該溶液は適切に緩衝化されうる、必要に応じて
、液体希釈剤は初めに十分な食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水
溶液は特に、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内への投与に適している。これに関連して
、利用することができる滅菌水性媒体は当業者に公知である。例えば、1回の投与量は、1
mlの等張NaCl溶液で溶解され、そして、1000mlの皮下注入用流体（hypodermoclysis fl
uid）に加えられるかまたは注入の予定部位に注射され得る（例えば、“Remington'sPha
rmaceuticalSciences” 15th Edition, pages 1035-1038および1570-1580を参照された
い）。投与量のいくらかの変動は、宿主の状態に依存して必然的に生じるであろう。投与
に責任を持つ人物は、あらゆる場合において、個別の宿主に適切な用量を決定するであろ
う。
、液体希釈剤は初めに十分な食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水
溶液は特に、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内への投与に適している。これに関連して
、利用することができる滅菌水性媒体は当業者に公知である。例えば、1回の投与量は、1
mlの等張NaCl溶液で溶解され、そして、1000mlの皮下注入用流体（hypodermoclysis fl
uid）に加えられるかまたは注入の予定部位に注射され得る（例えば、“Remington'sPha
rmaceuticalSciences” 15th Edition, pages 1035-1038および1570-1580を参照された
い）。投与量のいくらかの変動は、宿主の状態に依存して必然的に生じるであろう。投与
に責任を持つ人物は、あらゆる場合において、個別の宿主に適切な用量を決定するであろ
う。
【0295】
注射可能な滅菌溶液は、本明細書において列挙されたさまざまな他の成分を伴う適切な
溶媒中に活性rAAVを必要とされる量で取り込み、必要な場合、その後にろ過滅菌すること
によって調製される。一般に、分散物は、基本の分散媒および上記に列挙したものから必
要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルに、種々の滅菌した活性成分を取り込むことによ
って調製される。注射可能な滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法
は、事前に滅菌濾過されたその溶液から活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末を
得る真空乾燥技法および凍結乾燥技法である。
溶媒中に活性rAAVを必要とされる量で取り込み、必要な場合、その後にろ過滅菌すること
によって調製される。一般に、分散物は、基本の分散媒および上記に列挙したものから必
要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルに、種々の滅菌した活性成分を取り込むことによ
って調製される。注射可能な滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法
は、事前に滅菌濾過されたその溶液から活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末を
得る真空乾燥技法および凍結乾燥技法である。
【0296】
本明細書において開示されるrAAV組成物は、天然形態または塩形態で製剤化されてもよ
い。薬学的に許容される塩は、（タンパク質の遊離アミノ基によって形成される）酸付加
塩を含み、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、お
よびマンデル酸等のような有機酸によって形成される。遊離カルボキシル基と形成される
塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カ
ルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチ
ルアミン、ヒスチジン、およびプロカインのような有機塩基にも由来しうる。製剤化し次
第、溶液は、投薬剤形に適合する形で、かつ治療的に有効な量で投与される。製剤は、注
射可能な溶液、および薬物放出カプセル等の種々の投薬形態で容易に投与される。
い。薬学的に許容される塩は、（タンパク質の遊離アミノ基によって形成される）酸付加
塩を含み、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、お
よびマンデル酸等のような有機酸によって形成される。遊離カルボキシル基と形成される
塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カ
ルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチ
ルアミン、ヒスチジン、およびプロカインのような有機塩基にも由来しうる。製剤化し次
第、溶液は、投薬剤形に適合する形で、かつ治療的に有効な量で投与される。製剤は、注
射可能な溶液、および薬物放出カプセル等の種々の投薬形態で容易に投与される。
【0297】
本明細書において用いられる「担体」には、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、ビヒク
ル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤
、担体溶液、懸濁物、ならびにコロイド等が含まれる。薬学的に活性な物質でのそのよう
な媒体および剤の使用は当技術分野において周知である。補足的な活性成分もまた、組成
物に取り入れることができる。「薬学的に許容される」という記載は、宿主に投与したと
きにアレルギー反応または類似の有害反応を生じない分子実態および組成物を指す。
ル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤
、担体溶液、懸濁物、ならびにコロイド等が含まれる。薬学的に活性な物質でのそのよう
な媒体および剤の使用は当技術分野において周知である。補足的な活性成分もまた、組成
物に取り入れることができる。「薬学的に許容される」という記載は、宿主に投与したと
きにアレルギー反応または類似の有害反応を生じない分子実態および組成物を指す。
【0298】
リポソーム、ナノカプセル、微小粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、およびベシクル等
の送達ビヒクルは、適した宿主細胞への本発明の組成物の導入に用いられ得る。具体的に
は、rAAVベクター送達導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフェア、
またはナノ粒子等のいずれかの中に封入される送達用に製剤化され得る。
の送達ビヒクルは、適した宿主細胞への本発明の組成物の導入に用いられ得る。具体的に
は、rAAVベクター送達導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフェア、
またはナノ粒子等のいずれかの中に封入される送達用に製剤化され得る。
【0299】
そのような製剤は、本明細書に開示される核酸またはrAAV構築物の薬学的に許容される
製剤の導入にとって好ましい可能性がある。リポソームの形成および使用は概して、当業
者に公知である。近年、血清安定性および循環半減時間が向上したリポソームが開発され
た（米国特許第5,741,516号）。さらに、可能性のある薬物担体として、リポソームおよ
びリポソーム様調製物のさまざまな方法が記載されている（米国特許第5,567,434号；同
第5,552,157号；同第5,565,213号；同第5,738,868号および同第5,795,587号）。
製剤の導入にとって好ましい可能性がある。リポソームの形成および使用は概して、当業
者に公知である。近年、血清安定性および循環半減時間が向上したリポソームが開発され
た（米国特許第5,741,516号）。さらに、可能性のある薬物担体として、リポソームおよ
びリポソーム様調製物のさまざまな方法が記載されている（米国特許第5,567,434号；同
第5,552,157号；同第5,565,213号；同第5,738,868号および同第5,795,587号）。
【0300】
リポソームは、他の手法によるトランスフェクションに通常は抵抗性を有するいくつか
の細胞型で成功裏に用いられている。加えて、リポソームは、ウイルスに基づく送達系で
は典型的な、DNAの長さの制約を受けない。リポソームは、遺伝子、薬物、放射線治療剤
、ウイルス、転写因子、およびアロステリックエフェクターを種々の培養細胞株および動
物に導入するのに効率的に用いられている。加えて、リポソーム媒介性薬物送達の有効性
を試験する複数の臨床試験が成功裏に完了している。
の細胞型で成功裏に用いられている。加えて、リポソームは、ウイルスに基づく送達系で
は典型的な、DNAの長さの制約を受けない。リポソームは、遺伝子、薬物、放射線治療剤
、ウイルス、転写因子、およびアロステリックエフェクターを種々の培養細胞株および動
物に導入するのに効率的に用いられている。加えて、リポソーム媒介性薬物送達の有効性
を試験する複数の臨床試験が成功裏に完了している。
【0301】
リポソームは、水性媒体中に分散され、多重層同円心状二重層ベシクル（多重層ベシク
ル（MLV）とも呼ばれる）を自発的に形成する、リン脂質から形成される。MLVは概して、
25 nmから4 μmの直径を有する。MLVの超音波処理は、コア中に水溶液を含有する、200～
500 Åの範囲の直径を有する小さな単層ベシクル（SUV）の形成をもたらす。
ル（MLV）とも呼ばれる）を自発的に形成する、リン脂質から形成される。MLVは概して、
25 nmから4 μmの直径を有する。MLVの超音波処理は、コア中に水溶液を含有する、200～
500 Åの範囲の直径を有する小さな単層ベシクル（SUV）の形成をもたらす。
【0302】
あるいは、rAAVのナノカプセル製剤を用いてもよい。ナノカプセルは一般に、安定的か
つ再現可能な方法で物質を封入することができる。細胞内でのポリマー過負荷による副作
用を回避するために、（およそ0.1 μmのサイズの）そのような超微細な粒子は、インビ
ボで分解されるポリマーを用いて設計すべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリ
アルキル-シアノアクリラートナノ粒子の使用が企図される。
つ再現可能な方法で物質を封入することができる。細胞内でのポリマー過負荷による副作
用を回避するために、（およそ0.1 μmのサイズの）そのような超微細な粒子は、インビ
ボで分解されるポリマーを用いて設計すべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリ
アルキル-シアノアクリラートナノ粒子の使用が企図される。
【0303】
上記の送達の方法に加えて、以下の技術もまた、宿主にrAAV組成物を送達する代替の方
法として企図される。ソノフォレーシス（すなわち、超音波）は、循環系内へのおよび循
環系を通過する薬物浸透の速度および有効性を増強するためのデバイスとして米国特許第
5,656,016号において用いられかつ記載されている。企図される他の薬物送達代替法は、
骨内注入（米国特許第5,779,708号）、マイクロチップデバイス（米国特許第5,797,898号
）、眼用製剤（Bourlaiset al., 1998）、経皮マトリクス（米国特許第5,770,219号およ
び同第5,783,208号）、およびフィードバック制御送達（米国特許第5,697,899号）である
。
法として企図される。ソノフォレーシス（すなわち、超音波）は、循環系内へのおよび循
環系を通過する薬物浸透の速度および有効性を増強するためのデバイスとして米国特許第
5,656,016号において用いられかつ記載されている。企図される他の薬物送達代替法は、
骨内注入（米国特許第5,779,708号）、マイクロチップデバイス（米国特許第5,797,898号
）、眼用製剤（Bourlaiset al., 1998）、経皮マトリクス（米国特許第5,770,219号およ
び同第5,783,208号）、およびフィードバック制御送達（米国特許第5,697,899号）である
。
【0304】
対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注入、経口摂取、輸注、体内移植、または移植
を含む、任意の通常の方法で実行され得る。本明細書に記載されている組成物は、患者に
、動脈、皮下、皮内、結節内、骨髄内、筋肉内を経由して、静脈内（i.v.）注射によって
、または腹腔内で投与され得る。1つの局面において、本発明の核酸組成物は、皮内また
は皮下注射によって患者に投与される。1つの局面において、本発明の核組成物は、i.v.
注射によって投与される。
を含む、任意の通常の方法で実行され得る。本明細書に記載されている組成物は、患者に
、動脈、皮下、皮内、結節内、骨髄内、筋肉内を経由して、静脈内（i.v.）注射によって
、または腹腔内で投与され得る。1つの局面において、本発明の核酸組成物は、皮内また
は皮下注射によって患者に投与される。1つの局面において、本発明の核組成物は、i.v.
注射によって投与される。
【0305】
デバイスおよび外科的方法
本明細書において、難聴および他の聴力に関連する疾患、障害および状態を治療するた
めの治療用送達システムが提供される。1つの局面において、i）その必要があるヒト対象
の内耳の正円窓膜に1つまたは複数の切開部を作出する能力を有する医療用デバイス、お
よびii）内耳の標的細胞において全長聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成す
る能力を有する1つまたは複数のアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを含む治療組成物の
有効用量を含む、治療用送達システムが提供される。
本明細書において、難聴および他の聴力に関連する疾患、障害および状態を治療するた
めの治療用送達システムが提供される。1つの局面において、i）その必要があるヒト対象
の内耳の正円窓膜に1つまたは複数の切開部を作出する能力を有する医療用デバイス、お
よびii）内耳の標的細胞において全長聴覚系ポリペプチドのメッセンジャーRNAを構成す
る能力を有する1つまたは複数のアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを含む治療組成物の
有効用量を含む、治療用送達システムが提供される。
【0306】
有効用量の請求項1記載の治療用組成物をその必要があるヒト対象に蝸牛内投与する工
程を含む、外科的方法を実施するための手段であって、治療用組成物は、a）正円窓膜に1
つまたは複数の切開部を作出するための手段およびb）有効用量の治療用組成物を含む、
医療用デバイスを用いることによって投与することができる。
程を含む、外科的方法を実施するための手段であって、治療用組成物は、a）正円窓膜に1
つまたは複数の切開部を作出するための手段およびb）有効用量の治療用組成物を含む、
医療用デバイスを用いることによって投与することができる。
【0307】
本明細書において、難聴の治療のための外科的方法が提供される。1つの局面において
、方法は、ヒト対象の蝸牛に第1の切開点で第1の切開部を導入する工程；および本明細書
において提供されるような有効用量の治療用組成物（例えば、本明細書に記載されている
組成物のうちのいずれか）を蝸牛内投与する工程を含む。1つの態様において、治療用組
成物（例えば、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれか）は、第1の切開点で
対象に投与される。1つの態様において、治療用組成物は、第1の切開部内にまたはそれを
通って対象に投与される。1つの態様において、治療用組成物は、蝸牛卵円窓膜内にまた
はそれを通って対象に投与される。1つの態様において、治療用組成物は、蝸牛正円窓膜
内にまたはそれを通って対象に投与される。1つの態様において、治療用組成物は、正円
窓膜に複数の切開部を作出する能力を有する医療用デバイスを用いて投与される。1つの
態様において、医療用デバイスは、複数のマイクロニードルを含む。1つの態様において
、医療用デバイスは、概ね円形の第1の面を含む複数のマイクロニードルを含み、ここで
、各マイクロニードルは、少なくとも約10ミクロンの直径を有する。1つの態様において
、医療用デバイスは、治療用組成物を保持する能力を有する基部およびリザーバーを含む
。1つの態様において、医療用デバイスは、治療用組成物を移入する能力を有する内腔を1
つ1つが含む、複数の中空マイクロニードルを含む。1つの態様において、医療用デバイス
は、少なくとも不完全真空を発生させるための手段を含む。
、方法は、ヒト対象の蝸牛に第1の切開点で第1の切開部を導入する工程；および本明細書
において提供されるような有効用量の治療用組成物（例えば、本明細書に記載されている
組成物のうちのいずれか）を蝸牛内投与する工程を含む。1つの態様において、治療用組
成物（例えば、本明細書に記載されている組成物のうちのいずれか）は、第1の切開点で
対象に投与される。1つの態様において、治療用組成物は、第1の切開部内にまたはそれを
通って対象に投与される。1つの態様において、治療用組成物は、蝸牛卵円窓膜内にまた
はそれを通って対象に投与される。1つの態様において、治療用組成物は、蝸牛正円窓膜
内にまたはそれを通って対象に投与される。1つの態様において、治療用組成物は、正円
窓膜に複数の切開部を作出する能力を有する医療用デバイスを用いて投与される。1つの
態様において、医療用デバイスは、複数のマイクロニードルを含む。1つの態様において
、医療用デバイスは、概ね円形の第1の面を含む複数のマイクロニードルを含み、ここで
、各マイクロニードルは、少なくとも約10ミクロンの直径を有する。1つの態様において
、医療用デバイスは、治療用組成物を保持する能力を有する基部およびリザーバーを含む
。1つの態様において、医療用デバイスは、治療用組成物を移入する能力を有する内腔を1
つ1つが含む、複数の中空マイクロニードルを含む。1つの態様において、医療用デバイス
は、少なくとも不完全真空を発生させるための手段を含む。
【0308】
本発明は、以下の実験的実施例への参照によってさらに詳細に記載される。これらの実
施例は例示のみを目的として提供するものであり、特に指示がない限り、限定することを
意図しない。よって、本発明は、以下の実施例に限定されるとして何ら解釈されるべきで
はなく、むしろ、本明細書において提供される教示の結果として明らかになる任意のおよ
び全ての変形形態を包含すると解釈されるべきである。
施例は例示のみを目的として提供するものであり、特に指示がない限り、限定することを
意図しない。よって、本発明は、以下の実施例に限定されるとして何ら解釈されるべきで
はなく、むしろ、本明細書において提供される教示の結果として明らかになる任意のおよ
び全ての変形形態を包含すると解釈されるべきである。
【0309】
本明細書の実施例欄に記載のアッセイならびに当技術分野において公知であるアッセイ
を含む、他のアッセイもまた、本発明の聴覚系ポリペプチド核酸および核酸構築物を評価
するために用いることができる。
を含む、他のアッセイもまた、本発明の聴覚系ポリペプチド核酸および核酸構築物を評価
するために用いることができる。
【0310】
さらなる説明がなくとも、当業者は、前述の説明および以下の例示的な実施例を用いて
、本発明の発明の化合物を作製および利用するならびに特許請求の範囲に記載の方法を実
施することができると考えられる。以下の実施例は、本発明のさまざまな局面を明示する
ものであり、決して開示の残りを限定するものとして解釈されるべきではない。
、本発明の発明の化合物を作製および利用するならびに特許請求の範囲に記載の方法を実
施することができると考えられる。以下の実施例は、本発明のさまざまな局面を明示する
ものであり、決して開示の残りを限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例0311】
実施例1：ヒトオトフェリン遺伝子、ホモログ、オルソログの特徴付け
オトフェリン遺伝子および対応するmRNAが以下に提供される。
オトフェリン遺伝子および対応するmRNAが以下に提供される。
【0312】
実施例2：ウイルスベクターの構築
Xiao etal. J Virol 1999, 73(5):3994-4003によって用いられているようなアデノウ
イルスフリーの方法を用いるトランスフェクションによって、組換えAAVを作製する。AAV
ITRを有するシスプラスミド（cisplasmid）、AAV Repおよびキャップ遺伝子を有するト
ランスプラスミド（transplasmid）、ならびにアデノウイルスゲノム由来の必須領域を
有するヘルパープラスミドを、1：1：2の比率で293細胞にコトランスフェクトする。ここ
で用いられるAAVベクターは、以下に記載の構築物を用いる複数のデュアルベクター戦略
下で、ヒトオトフェリンまたはマウスオトフェリンを発現する。Pryadkina et al. Meth
Clin Devel2015, 2:15009によって概説されているように、AAV血清型1、2、3、4、5、6
、7、8、9、rh8、rh1O、rh39、rh43、およびAnc80を、3セットのオトフェリン構築物を封
入するようにそれぞれ調製し、（i）コンカテマー形成-トランススプライシング戦略、（
ii）ハイブリッドイントロン相同組換え-トランススプライシング戦略、および（iii）エ
クソン相同組換え戦略を試験する。
Xiao etal. J Virol 1999, 73(5):3994-4003によって用いられているようなアデノウ
イルスフリーの方法を用いるトランスフェクションによって、組換えAAVを作製する。AAV
ITRを有するシスプラスミド（cisplasmid）、AAV Repおよびキャップ遺伝子を有するト
ランスプラスミド（transplasmid）、ならびにアデノウイルスゲノム由来の必須領域を
有するヘルパープラスミドを、1：1：2の比率で293細胞にコトランスフェクトする。ここ
で用いられるAAVベクターは、以下に記載の構築物を用いる複数のデュアルベクター戦略
下で、ヒトオトフェリンまたはマウスオトフェリンを発現する。Pryadkina et al. Meth
Clin Devel2015, 2:15009によって概説されているように、AAV血清型1、2、3、4、5、6
、7、8、9、rh8、rh1O、rh39、rh43、およびAnc80を、3セットのオトフェリン構築物を封
入するようにそれぞれ調製し、（i）コンカテマー形成-トランススプライシング戦略、（
ii）ハイブリッドイントロン相同組換え-トランススプライシング戦略、および（iii）エ
クソン相同組換え戦略を試験する。
【0313】
実施例3：OTOF構成成分のクローニング
Yasunagaet al. Am J Genet 2000, 67:591-600に記載されているように、ヒトの胎児
全身、成体の脳、心臓、腎臓、およびマウス胎仔心臓のポリ(A）＋mRNAからOligo-dTライ
ブラリーおよびランダムプライムcDNAライブラリーを構築する。これらのライブラリーに
対して、リンカープライマーおよびオトフェリンcDNA配列から選択される一連のプライマ
ーを用いてRACE-PCR試験を実施する。PCR産物をpGEM-TEasyベクター内に直接クローニン
グし、配列決定する。ヒトcDNA長鎖型（7 kb）を単離するために、リバースプライマー
をオトフェリンの最初に報告された（Yasunaga et al., 1999）短鎖型のaa63～70をコー
ドする配列から設計する（GenBank 107403）。
Yasunagaet al. Am J Genet 2000, 67:591-600に記載されているように、ヒトの胎児
全身、成体の脳、心臓、腎臓、およびマウス胎仔心臓のポリ(A）＋mRNAからOligo-dTライ
ブラリーおよびランダムプライムcDNAライブラリーを構築する。これらのライブラリーに
対して、リンカープライマーおよびオトフェリンcDNA配列から選択される一連のプライマ
ーを用いてRACE-PCR試験を実施する。PCR産物をpGEM-TEasyベクター内に直接クローニン
グし、配列決定する。ヒトcDNA長鎖型（7 kb）を単離するために、リバースプライマー
をオトフェリンの最初に報告された（Yasunaga et al., 1999）短鎖型のaa63～70をコー
ドする配列から設計する（GenBank 107403）。
【0314】
Strenzkeet al., EMBO J. 35(23):2519-2535, 2016に記載されている方法を用いて、
マウス蝸牛から総RNAを抽出する。GeneAmpRNA PCRキットにしたがって、さまざまなマウ
スおよびヒトRNA供給源においてRT-PCR試験を実施する。一方は
に由来し、もう一方は
に由来する、2対のプライマー対を用いて、脳および蝸牛に由来するマウスcDNAを再構成
する。ヒト脳cDNA長鎖型の5'部分全体を再構成するために、
由来のプライマーを用いる。
マウス蝸牛から総RNAを抽出する。GeneAmpRNA PCRキットにしたがって、さまざまなマウ
スおよびヒトRNA供給源においてRT-PCR試験を実施する。一方は
に由来し、もう一方は
に由来する、2対のプライマー対を用いて、脳および蝸牛に由来するマウスcDNAを再構成
する。ヒト脳cDNA長鎖型の5'部分全体を再構成するために、
由来のプライマーを用いる。
【0315】
コンカテマー形成-トランススプライシング戦略では、5'カセットが、合成有毛細胞指
向性プロモーター、キメライントロン（βグロビン）、コンセンサスKozak配列、オトフ
ェリンのエクソン1～26、およびオトフェリンのイントロン26の半分（エクソン1～26に対
応するオトフェリンcDNAの3,836bpまたは3,494 bpにイントロン26の最初の342 bpを加え
たものを表す）を含み、かつ3'カセットが、イントロン26の後半部分（342 bp）、オトフ
ェリンのエクソン27～48（3,843bp）、およびポリアデニル化シグナル配列を含むように
、2つのカセットが構成される。いくつかの例では、有毛細胞指向性プロモーターは、聴
覚内有毛細胞におけるオトフェリンタンパク質の発現を必要としない。イントロン相同組
換え-スプライシング戦略では、両プラスミドにおいて半分のイントロン26に代えてオト
フェリンの全長イントロン26が加えられるように、上記のコンカテマー形成-スプライシ
ング戦略のカセットを改変する。
向性プロモーター、キメライントロン（βグロビン）、コンセンサスKozak配列、オトフ
ェリンのエクソン1～26、およびオトフェリンのイントロン26の半分（エクソン1～26に対
応するオトフェリンcDNAの3,836bpまたは3,494 bpにイントロン26の最初の342 bpを加え
たものを表す）を含み、かつ3'カセットが、イントロン26の後半部分（342 bp）、オトフ
ェリンのエクソン27～48（3,843bp）、およびポリアデニル化シグナル配列を含むように
、2つのカセットが構成される。いくつかの例では、有毛細胞指向性プロモーターは、聴
覚内有毛細胞におけるオトフェリンタンパク質の発現を必要としない。イントロン相同組
換え-スプライシング戦略では、両プラスミドにおいて半分のイントロン26に代えてオト
フェリンの全長イントロン26が加えられるように、上記のコンカテマー形成-スプライシ
ング戦略のカセットを改変する。
【0316】
エクソン相同組換え戦略では、5'カセットが、有毛細胞指向性プロモーター、キメライ
ントロン、コンセンサスKozak配列、およびエクソン1～28（オトフェリンcDNAの最初の3,
776 bp）を含み、かつ3'カセットが、エクソン23～48（オトフェリンcDNAの最後の4,446
bp）およびポリアデニル化シグナル配列を含むように、2つのカセットが構成される。2つ
のカセット間で相同な領域は885 bpである。
ントロン、コンセンサスKozak配列、およびエクソン1～28（オトフェリンcDNAの最初の3,
776 bp）を含み、かつ3'カセットが、エクソン23～48（オトフェリンcDNAの最後の4,446
bp）およびポリアデニル化シグナル配列を含むように、2つのカセットが構成される。2つ
のカセット間で相同な領域は885 bpである。
【0317】
実施例4：ウイルス粒子の作製および精製
Pryadkinaet al. Mol Ther 2015, 2:15009によって記載されているように、組換えAAV
-1を、トリプルトランスフェクション（tripletransfection）プロトコールを用いて生
成させ、2回の連続塩化セシウム（CsCl）密度勾配によって精製する。2回目の遠心分離の
最後に、CsCl密度勾配チューブから11個の500μl画分を回収し、1×PBSでの透析によっ
て精製する。画分をドットブロットによって分析し、rAAVゲノムを含有する画分を決定す
る。各調製物のウイルスゲノム数（vg）を、AAVベクターゲノムのITR領域に対応するプラ
イマーおよびプローブを用いる定量的リアルタイムPCRに基づくタイトレーション法によ
って決定する（Bartoliet al. Gene Ther 2006, 13:20-28）。
Pryadkinaet al. Mol Ther 2015, 2:15009によって記載されているように、組換えAAV
-1を、トリプルトランスフェクション（tripletransfection）プロトコールを用いて生
成させ、2回の連続塩化セシウム（CsCl）密度勾配によって精製する。2回目の遠心分離の
最後に、CsCl密度勾配チューブから11個の500μl画分を回収し、1×PBSでの透析によっ
て精製する。画分をドットブロットによって分析し、rAAVゲノムを含有する画分を決定す
る。各調製物のウイルスゲノム数（vg）を、AAVベクターゲノムのITR領域に対応するプラ
イマーおよびプローブを用いる定量的リアルタイムPCRに基づくタイトレーション法によ
って決定する（Bartoliet al. Gene Ther 2006, 13:20-28）。
【0318】
実施例5：ウイルス粒子の製剤
1e14vg/mLの力価で作製したAAVを、3.2e13、1.0e13、3.2e12、1.0e12 vg/mLの希釈で
人工外リンパで調製する。人工外リンパを、以下の試薬：NaCl、120 mM； KCl、3.5 mM；
CaCl2、1.5mM；グルコース、5.5 mM；およびHEPES、20 mMを組み合わせることによって
調製する。人工外リンパをNaOHで滴定し、そのpHを7.5に調整する（130 mMの総Na+濃度）
（Chen etal. J Controlled Rel 2005, 110:1-19）。
1e14vg/mLの力価で作製したAAVを、3.2e13、1.0e13、3.2e12、1.0e12 vg/mLの希釈で
人工外リンパで調製する。人工外リンパを、以下の試薬：NaCl、120 mM； KCl、3.5 mM；
CaCl2、1.5mM；グルコース、5.5 mM；およびHEPES、20 mMを組み合わせることによって
調製する。人工外リンパをNaOHで滴定し、そのpHを7.5に調整する（130 mMの総Na+濃度）
（Chen etal. J Controlled Rel 2005, 110:1-19）。
【0319】
実施例6：OTOFmRNAおよびタンパク質生成のインビトロでの実証（抗OTOF抗体）
AAV-OTOFベクターがインビトロで哺乳動物細胞をに成功裏に形質導入される能力を有す
ることを確認するために、ヒト網膜上皮細胞および新生仔マウス蝸牛外植片を、3.2e13、
1.0e13、3.2e12、1.0e12ウイルスゲノム含有粒子（vg/mL）の力価でのAAV-OTOFと一緒に
インキュベートし、以前に記載されている（Duncker et al., 2013 J Neurosci 33(22):9
508-9519）ようにオトフェリンDNA、mRNAおよびタンパク質のレベルについてアッセイす
る。マウスオトフェリンに対する抗体をAbcamから入手し、Engel et al., 2006 Neurosci
143:837-849に記載されているように用いる。
AAV-OTOFベクターがインビトロで哺乳動物細胞をに成功裏に形質導入される能力を有す
ることを確認するために、ヒト網膜上皮細胞および新生仔マウス蝸牛外植片を、3.2e13、
1.0e13、3.2e12、1.0e12ウイルスゲノム含有粒子（vg/mL）の力価でのAAV-OTOFと一緒に
インキュベートし、以前に記載されている（Duncker et al., 2013 J Neurosci 33(22):9
508-9519）ようにオトフェリンDNA、mRNAおよびタンパク質のレベルについてアッセイす
る。マウスオトフェリンに対する抗体をAbcamから入手し、Engel et al., 2006 Neurosci
143:837-849に記載されているように用いる。
【0320】
実施例7：デバイスの説明
RWMの安定かつ安全な穿通のために設計された特殊化したマイクロカテーテルを用いて
、AAV-OTOF製剤を蝸牛に送達する。マイクロカテーテルは、送達手法を実施する外科医が
外耳道を介して中耳腔に進入させかつマイクロカテーテルの末端をRWMと接触させること
ができるような形状をしている。マイクロカテーテルの遠位端は、10～1,000ミクロンの
直径を有する少なくとも1つのマイクロニードルで構成され、該マイクロニードルは、AAV
-OTOFをおよそ1 μL/分の速度で鼓室階の蝸牛外リンパに入れるのに十分だが外科的修復
なしで治癒する、穿孔をRWM中に生じる。マイクロニードルの近位にあるマイクロカテー
テルの残りの部分には、およそ1e13 vg/mLの力価でAAV-OTOF/人工外リンパ製剤を充填す
る。マイクロカテーテルの近位端は、およそ1 μL/分の正確で少量の注入を可能にするマ
イクロマニピュレーターに接続される。
RWMの安定かつ安全な穿通のために設計された特殊化したマイクロカテーテルを用いて
、AAV-OTOF製剤を蝸牛に送達する。マイクロカテーテルは、送達手法を実施する外科医が
外耳道を介して中耳腔に進入させかつマイクロカテーテルの末端をRWMと接触させること
ができるような形状をしている。マイクロカテーテルの遠位端は、10～1,000ミクロンの
直径を有する少なくとも1つのマイクロニードルで構成され、該マイクロニードルは、AAV
-OTOFをおよそ1 μL/分の速度で鼓室階の蝸牛外リンパに入れるのに十分だが外科的修復
なしで治癒する、穿孔をRWM中に生じる。マイクロニードルの近位にあるマイクロカテー
テルの残りの部分には、およそ1e13 vg/mLの力価でAAV-OTOF/人工外リンパ製剤を充填す
る。マイクロカテーテルの近位端は、およそ1 μL/分の正確で少量の注入を可能にするマ
イクロマニピュレーターに接続される。
【0321】
実施例8：動物モデル1：老化マウス
AAV-OTOFの蝸牛送達によるオトフェリンレスキューを、3種類のOTOFノックアウトマウ
スモデル（Longo-Guesset al. Hearing Res 2007, 234(1-2):21-28; Roux et al. Cell
2006,127:277-289; およびReisinger et al., J. Neurosci. 31(13):4886-4895, 2011に
記載されているようなマウスモデル）において評価する。蝸牛発達段階を基準とした生後
の処置ウインドウ（treatmentwindow）を評価するために、レスキュー試験を新生仔マウ
ス（P1）、幼若マウス（P6またはP12）、および成体（P42）マウスにおいて試験する。
AAV-OTOFの蝸牛送達によるオトフェリンレスキューを、3種類のOTOFノックアウトマウ
スモデル（Longo-Guesset al. Hearing Res 2007, 234(1-2):21-28; Roux et al. Cell
2006,127:277-289; およびReisinger et al., J. Neurosci. 31(13):4886-4895, 2011に
記載されているようなマウスモデル）において評価する。蝸牛発達段階を基準とした生後
の処置ウインドウ（treatmentwindow）を評価するために、レスキュー試験を新生仔マウ
ス（P1）、幼若マウス（P6またはP12）、および成体（P42）マウスにおいて試験する。
【0322】
幼若マウスおよび成体マウス（n＝32）においてベースライン聴性脳幹反応（ABR）およ
び歪成分耳音響放射（DPOAE）を両側で測定し、処置前の内有毛細胞（IHC）および外有毛
細胞（OHC）の機能を評価する。全動物が、オトフェリン機能障害の特徴的な聴力プロフ
ァイルを示すこと－すなわち、試験した可聴周波数でABRは異常だがDPOAEは正常であるこ
とが予測され、機能障害性IHCシグナル伝達および正常なOHC機能を示す（Yasunaga et al
. 2000, Am JHum Genet 67:591-600）。
び歪成分耳音響放射（DPOAE）を両側で測定し、処置前の内有毛細胞（IHC）および外有毛
細胞（OHC）の機能を評価する。全動物が、オトフェリン機能障害の特徴的な聴力プロフ
ァイルを示すこと－すなわち、試験した可聴周波数でABRは異常だがDPOAEは正常であるこ
とが予測され、機能障害性IHCシグナル伝達および正常なOHC機能を示す（Yasunaga et al
. 2000, Am JHum Genet 67:591-600）。
【0323】
ベースラインABRおよびDPOAE測定の後、1.0e13、3.2e12、および1.0e12vg/mLの力価の
AAV1-OTOF を、下記のように幼若および成体マウス（n＝32）の左側鼓室階に0.3μL注入
する。等力価だが0.2μLの容量で、新生仔マウス（n＝16）の左側鼓室階に注入する（下
記の外科的手技）。各動物の右耳を未処置対照として残す。外科的手技の1、5および10日
後に、幼若および成体動物においてABRおよびDPOAEの測定を再び両側で行う。手技後4週
（n＝24）および12週（n＝24）で、さらなる両側ABRおよびDPOAE測定を新生仔群、幼若群
および成体群（合計n＝48）における全動物から得て、続いて、動物を屠殺し、その蝸牛
を取り出す。
AAV1-OTOF を、下記のように幼若および成体マウス（n＝32）の左側鼓室階に0.3μL注入
する。等力価だが0.2μLの容量で、新生仔マウス（n＝16）の左側鼓室階に注入する（下
記の外科的手技）。各動物の右耳を未処置対照として残す。外科的手技の1、5および10日
後に、幼若および成体動物においてABRおよびDPOAEの測定を再び両側で行う。手技後4週
（n＝24）および12週（n＝24）で、さらなる両側ABRおよびDPOAE測定を新生仔群、幼若群
および成体群（合計n＝48）における全動物から得て、続いて、動物を屠殺し、その蝸牛
を取り出す。
【0324】
屠殺した動物のうちの半分（処置後4週群および12週群のそれぞれからn＝4）で、免疫
染色を実施して、有毛細胞構造の特定を行い、蝸牛感覚上皮沿いのOTOFタンパク質発現を
評価する。有毛細胞（Myo7a）、支持細胞（Sox2）、およびオトフェリンのマーカーに対
する抗体を以前に記載されている（Duncker et al. 2013, J Neurosci 33(22):9508-9519
）ように用いる。コルチ器の基底回転、中回転、および頂回転で、有毛細胞およびOTOFを
発現するそれらの有毛細胞の総数を200 μm領域内で計数した；コルチ器の全長を等しい
長さの3つの断片に分割し、基底領域、中領域、および頂領域を指定した。
染色を実施して、有毛細胞構造の特定を行い、蝸牛感覚上皮沿いのOTOFタンパク質発現を
評価する。有毛細胞（Myo7a）、支持細胞（Sox2）、およびオトフェリンのマーカーに対
する抗体を以前に記載されている（Duncker et al. 2013, J Neurosci 33(22):9508-9519
）ように用いる。コルチ器の基底回転、中回転、および頂回転で、有毛細胞およびOTOFを
発現するそれらの有毛細胞の総数を200 μm領域内で計数した；コルチ器の全長を等しい
長さの3つの断片に分割し、基底領域、中領域、および頂領域を指定した。
【0325】
屠殺した動物の残りの半分（処置後4週群および12週群のそれぞれの残りの4匹の動物）
において、上記と同じ基底領域、中領域、および頂領域から蝸牛組織試料を収集し、以前
に記載されている（Dunckeret al. 2013, J Neurosci 33(22):9508-9519, Heidrych et
al. 2008, HumMol Genet 17:3814-3821, Heidrych et al., 2009, Hum Mol Genet 18:27
79-2790）ようにオトフェリンmRNA転写産物についてアッセイした。
において、上記と同じ基底領域、中領域、および頂領域から蝸牛組織試料を収集し、以前
に記載されている（Dunckeret al. 2013, J Neurosci 33(22):9508-9519, Heidrych et
al. 2008, HumMol Genet 17:3814-3821, Heidrych et al., 2009, Hum Mol Genet 18:27
79-2790）ようにオトフェリンmRNA転写産物についてアッセイした。
【0326】
実施例9：動物モデル1A：老化マウスにおける外科的方法
人工外リンパで調製したAAV-OTOFを、Shu et al. 2016（Shu Yilai, Tao Yong, Wang Z
hengmin, TangYong, Li Huawei, Dai Pu, Gao Guanping, and Chen Zheng-Yi. Human Ge
ne Therapy.June 2016, ahead of print. doi:10.1089/hum.2016.053）によって記載さ
れているようにマウスにおいて鼓室階に投与する。6週齢雄マウスにキシラジン（20 mg/k
g）およびケタミン（100mg/kg）の腹腔内注入を用いて麻酔をかける。体温を、電気温熱
パッドを用いて37℃に維持する。切開部を右側耳後部領域から作製し、鼓室胞を露出させ
る。鼓室胞を外科用縫合針で穿孔し、小さな孔を広げ、蝸牛へのアクセスをもたらす。鼓
室階の蝸牛側壁の骨を、膜性側壁をインタクトなままになるように、歯科用ドリルで薄く
する。ガラス製マイクロピペットと連結したNanoliter Microinjection Systemを用いて
、2 nL/秒の速度で、合計およそ300nLの人工外リンパ中のAAV-OTOFを鼓室階に送達する
。ガラス製マイクロピペットを注入後5分間留置する。内耳開窓術および注入後、鼓室胞
の開口部を歯科用セメントで封着し、筋および皮膚を縫合する。マウスを麻酔から目覚め
させ、痛みを0.15mg/kg塩酸ブプレノルフィンで3日間制御する。
人工外リンパで調製したAAV-OTOFを、Shu et al. 2016（Shu Yilai, Tao Yong, Wang Z
hengmin, TangYong, Li Huawei, Dai Pu, Gao Guanping, and Chen Zheng-Yi. Human Ge
ne Therapy.June 2016, ahead of print. doi:10.1089/hum.2016.053）によって記載さ
れているようにマウスにおいて鼓室階に投与する。6週齢雄マウスにキシラジン（20 mg/k
g）およびケタミン（100mg/kg）の腹腔内注入を用いて麻酔をかける。体温を、電気温熱
パッドを用いて37℃に維持する。切開部を右側耳後部領域から作製し、鼓室胞を露出させ
る。鼓室胞を外科用縫合針で穿孔し、小さな孔を広げ、蝸牛へのアクセスをもたらす。鼓
室階の蝸牛側壁の骨を、膜性側壁をインタクトなままになるように、歯科用ドリルで薄く
する。ガラス製マイクロピペットと連結したNanoliter Microinjection Systemを用いて
、2 nL/秒の速度で、合計およそ300nLの人工外リンパ中のAAV-OTOFを鼓室階に送達する
。ガラス製マイクロピペットを注入後5分間留置する。内耳開窓術および注入後、鼓室胞
の開口部を歯科用セメントで封着し、筋および皮膚を縫合する。マウスを麻酔から目覚め
させ、痛みを0.15mg/kg塩酸ブプレノルフィンで3日間制御する。
【0327】
実施例10：動物モデル2：モルモットにおける往復マイクロポンプ
外科的手法
Tandonet al. Lab Chip 2015（DOI: 10.1039/c5lc01396h）によって記載されているよ
うに、人工外リンパで調製したAAV-OTOFをモルモットに投与し、往復マイクロポンプによ
る蝸牛内送達後の分布および毒性を評価する。各々がおよそ350 gの体重の雄モルモット
（n＝16）をペントバルビタールナトリウム（ネンブタール；25mg kg-1、腹腔内注射）
、フェンタニル（0.2mg kg-1、筋肉内注射）、およびハロペリドール（10 mg kg-1、筋
肉内注射）の組み合わせで麻酔する。リドカインはエピネフリンと一緒に、局所麻酔とし
て切開部にて皮下に与える。背側からのアプローチを用いて、鼓室胞において5 mm直径の
円孔を作製し、正円窓膜よりおよそ0.5 mm遠位で内耳開窓を作出する。（下記の）マイク
ロポンプのカニューレを内耳開窓内に挿入し、蝸牛内に先端3 mmを通し、一般的なシアノ
アクリル酸接着剤で鼓室胞に接着させる。複合活動電位（CAP）測定のために、ペルフル
オロアルコキシアルカンで絶縁した銀線電極（203 μm被覆なしの直径）を正円窓小窩の
近くに挿入し、鼓室胞に接着させる。
外科的手法
Tandonet al. Lab Chip 2015（DOI: 10.1039/c5lc01396h）によって記載されているよ
うに、人工外リンパで調製したAAV-OTOFをモルモットに投与し、往復マイクロポンプによ
る蝸牛内送達後の分布および毒性を評価する。各々がおよそ350 gの体重の雄モルモット
（n＝16）をペントバルビタールナトリウム（ネンブタール；25mg kg-1、腹腔内注射）
、フェンタニル（0.2mg kg-1、筋肉内注射）、およびハロペリドール（10 mg kg-1、筋
肉内注射）の組み合わせで麻酔する。リドカインはエピネフリンと一緒に、局所麻酔とし
て切開部にて皮下に与える。背側からのアプローチを用いて、鼓室胞において5 mm直径の
円孔を作製し、正円窓膜よりおよそ0.5 mm遠位で内耳開窓を作出する。（下記の）マイク
ロポンプのカニューレを内耳開窓内に挿入し、蝸牛内に先端3 mmを通し、一般的なシアノ
アクリル酸接着剤で鼓室胞に接着させる。複合活動電位（CAP）測定のために、ペルフル
オロアルコキシアルカンで絶縁した銀線電極（203 μm被覆なしの直径）を正円窓小窩の
近くに挿入し、鼓室胞に接着させる。
【0328】
歪成分耳音響放射（DPOAE）およびCAPの測定のための手法を、Tandon et al. Biomed M
icrodevices2015, 17:3-21に以前に記載されているように実施する。手術の結果として
生じるいかなる損傷もモニタリングするために、特徴周波数：32、24、16、12、8、5.6、
4、および2.78 kHzで内耳開窓術の前およびその後にDPOAEを測定した。
icrodevices2015, 17:3-21に以前に記載されているように実施する。手術の結果として
生じるいかなる損傷もモニタリングするために、特徴周波数：32、24、16、12、8、5.6、
4、および2.78 kHzで内耳開窓術の前およびその後にDPOAEを測定した。
【0329】
マイクロポンプの説明
1e14vg/mLの最大力価でのAAV-OTOFを、Tandon et al. Lab Chip 2015（DOI: 10.1039/
c5lc01396h）に記載されているようにマイクロポンプを用いてモルモットに投与する。マ
イクロポンプシステムは、4つの選択可能なポートを備える。これらのポートは、（i）人
工外リンパ液貯蔵のために用いられる大きな流体キャパシター；（ii）蝸牛に接続される
出口；（iii）統合されたAAV-OTOFリザーバーからの出口；（iv）統合されたAAV-OTOFリ
ザーバーへの入口に連結される。各ポートは中心ポンプチャンバーに流体的に連結され、
各々は個別に弁によって対処される。AAV-OTOF送達を往復運動させるための一連の事象は
以下の通りである：（i）内部AAV-OTOFリフレッシュループを動作させ、AAV-OTOFをAAV-O
TOFリザーバーからメイン注入-吸引ラインに移入する；（ii）AAV-OTOFを蝸牛内に注入し
、一部の人工外リンパを人工外リンパ貯蔵キャパシターから排出する；（iii）初めの2工
程は、追加の投与毎に複数回繰り返す可能性がある；（iv）AAV-OTOFをしばらくの間拡散
させた後、工程（i）～（iii）で注入した容量と同じ量の外リンパを蝸牛から取り除き、
人工外リンパ貯蔵キャパシターを再び満たす。このプロセスは、正味ゼロの流体容量が蝸
牛に加えられる薬物の正味送達をもたらす。
1e14vg/mLの最大力価でのAAV-OTOFを、Tandon et al. Lab Chip 2015（DOI: 10.1039/
c5lc01396h）に記載されているようにマイクロポンプを用いてモルモットに投与する。マ
イクロポンプシステムは、4つの選択可能なポートを備える。これらのポートは、（i）人
工外リンパ液貯蔵のために用いられる大きな流体キャパシター；（ii）蝸牛に接続される
出口；（iii）統合されたAAV-OTOFリザーバーからの出口；（iv）統合されたAAV-OTOFリ
ザーバーへの入口に連結される。各ポートは中心ポンプチャンバーに流体的に連結され、
各々は個別に弁によって対処される。AAV-OTOF送達を往復運動させるための一連の事象は
以下の通りである：（i）内部AAV-OTOFリフレッシュループを動作させ、AAV-OTOFをAAV-O
TOFリザーバーからメイン注入-吸引ラインに移入する；（ii）AAV-OTOFを蝸牛内に注入し
、一部の人工外リンパを人工外リンパ貯蔵キャパシターから排出する；（iii）初めの2工
程は、追加の投与毎に複数回繰り返す可能性がある；（iv）AAV-OTOFをしばらくの間拡散
させた後、工程（i）～（iii）で注入した容量と同じ量の外リンパを蝸牛から取り除き、
人工外リンパ貯蔵キャパシターを再び満たす。このプロセスは、正味ゼロの流体容量が蝸
牛に加えられる薬物の正味送達をもたらす。
【0330】
マイクロポンプにおける流体キャパシターは、シーリングが薄く（25.4 μm）可撓性を
有するポリイミド膜である円柱状のチャンバーである。ポンプチャンバーは3.5 mmの直径
を有し、流体貯蔵キャパシターは14 mmの直径を有し、残りのキャパシターは全て4 mmの
直径を有する。弁のそれぞれにて流れを遮断するように、同じ膜を偏らせる。弁チャンバ
ーは3.1 mmの直径を有する。薬物リザーバーを含む蛇行チャネルは、238μLの総体積で
幅762 μmおよび長さ410mmの矩断面を有する。ポンプ中の他のマイクロチャネルは全て
、400 μmの幅および254μmの高さを有する。
有するポリイミド膜である円柱状のチャンバーである。ポンプチャンバーは3.5 mmの直径
を有し、流体貯蔵キャパシターは14 mmの直径を有し、残りのキャパシターは全て4 mmの
直径を有する。弁のそれぞれにて流れを遮断するように、同じ膜を偏らせる。弁チャンバ
ーは3.1 mmの直径を有する。薬物リザーバーを含む蛇行チャネルは、238μLの総体積で
幅762 μmおよび長さ410mmの矩断面を有する。ポンプ中の他のマイクロチャネルは全て
、400 μmの幅および254μmの高さを有する。
【0331】
モルモットにおける急性薬物送達
マイクロポンプに、AAV-OTOFおよび人工外リンパを充填し、カニューレを24 kHzおよび
32 kHzの特徴周波数感応性を有する位置の間の蝸牛の領域において作製された内耳開窓内
に挿入し、かつ先端3mmを通し、12～16 kHz領域にて終了する。AAV-OTOF/人工外リンパ
注入の開始前に、ベースラインDPOAEおよびCAP聴力検査を実施する。次いで、ポンプを起
動し、およそ1 μLの人工外リンパを、合計でおよそ10μLの人工外リンパが蝸牛に送達
されるまで5分毎に注入する。20分の待ち時間後、およそ10μLの外リンパを蝸牛から取
り除く。次いで、AAV-OTOF送達を、合計でおよそ10μLの流体が送達されるまで5分毎に
およそ1 μLの速度で開始する。
マイクロポンプに、AAV-OTOFおよび人工外リンパを充填し、カニューレを24 kHzおよび
32 kHzの特徴周波数感応性を有する位置の間の蝸牛の領域において作製された内耳開窓内
に挿入し、かつ先端3mmを通し、12～16 kHz領域にて終了する。AAV-OTOF/人工外リンパ
注入の開始前に、ベースラインDPOAEおよびCAP聴力検査を実施する。次いで、ポンプを起
動し、およそ1 μLの人工外リンパを、合計でおよそ10μLの人工外リンパが蝸牛に送達
されるまで5分毎に注入する。20分の待ち時間後、およそ10μLの外リンパを蝸牛から取
り除く。次いで、AAV-OTOF送達を、合計でおよそ10μLの流体が送達されるまで5分毎に
およそ1 μLの速度で開始する。
【0332】
処置後1週、1ヶ月、3ヶ月、および6ヶ月で動物を屠殺し（1群あたりn＝4）、その蝸牛
を摘出する。コルチ器沿いのAAV形質導入およびOTOF発現の程度を、抗OTOF抗体による免
疫染色を介して評価する。有毛細胞（Myo7a）および支持細胞（Sox2）のマーカーに対す
る抗体を用いて、IHC、OHC、支持細胞、および不動毛の形態を定量化する。アネキシンV
染色を用いて、蝸牛感覚上皮沿いの細胞におけるアポトーシスの証拠を評価する。
を摘出する。コルチ器沿いのAAV形質導入およびOTOF発現の程度を、抗OTOF抗体による免
疫染色を介して評価する。有毛細胞（Myo7a）および支持細胞（Sox2）のマーカーに対す
る抗体を用いて、IHC、OHC、支持細胞、および不動毛の形態を定量化する。アネキシンV
染色を用いて、蝸牛感覚上皮沿いの細胞におけるアポトーシスの証拠を評価する。
【0333】
実施例11：動物モデル3：ヒツジでの大型動物毒性試験
人工外リンパで調製したAAV-OTOFを幼若ヒツジに投与し、トランス-RWM注入を介する蝸
牛への送達後の分布および毒性を評価する。ベースライン聴性脳幹反応（ABR）および歪
成分耳音響放射（DPOAE）を3ヶ月齢の雌ヒツジ（n＝40）において両側で測定し、処理前
の内有毛細胞（IHC）および外有毛細胞（OHC）の機能を評価する。ベースラインABRおよ
びDPOAE測定後、1.0e14、3.2e13、1.0e13、および3.2e12vg/mlの力価のAAV1-OTOFをヒツ
ジの左側鼓室階に20μL注入する（1群あたりn＝10）。各動物の右耳を未処置の対照とし
て残す。外科的手技の1、5および10日後に、ABRおよびDPOAE測定を再び両側で行う。手技
後6ヶ月で、さらなる両側ABRおよびDPOAE測定を全動物から得て、続いて、動物を屠殺し
、その蝸牛を取り出す。
人工外リンパで調製したAAV-OTOFを幼若ヒツジに投与し、トランス-RWM注入を介する蝸
牛への送達後の分布および毒性を評価する。ベースライン聴性脳幹反応（ABR）および歪
成分耳音響放射（DPOAE）を3ヶ月齢の雌ヒツジ（n＝40）において両側で測定し、処理前
の内有毛細胞（IHC）および外有毛細胞（OHC）の機能を評価する。ベースラインABRおよ
びDPOAE測定後、1.0e14、3.2e13、1.0e13、および3.2e12vg/mlの力価のAAV1-OTOFをヒツ
ジの左側鼓室階に20μL注入する（1群あたりn＝10）。各動物の右耳を未処置の対照とし
て残す。外科的手技の1、5および10日後に、ABRおよびDPOAE測定を再び両側で行う。手技
後6ヶ月で、さらなる両側ABRおよびDPOAE測定を全動物から得て、続いて、動物を屠殺し
、その蝸牛を取り出す。
【0334】
屠殺した動物のうちの半分（用量コホートのそれぞれからn＝5）で、免疫染色を実施し
て、有毛細胞構造を特定し、蝸牛感覚上皮沿いのOTOFタンパク質発現を評価する。有毛細
胞（Myo7a）、支持細胞（Sox2）、およびオトフェリンのマーカーに対する抗体を以前に
記載されているように（Duncker et al. 2013, J Neurosci 33(22):9508-9519）用いる。
コルチ器の基底回転、中回転、および頂回転で、有毛細胞およびOTOFを発現するそれらの
有毛細胞の総数を200μm領域内で計数する。
て、有毛細胞構造を特定し、蝸牛感覚上皮沿いのOTOFタンパク質発現を評価する。有毛細
胞（Myo7a）、支持細胞（Sox2）、およびオトフェリンのマーカーに対する抗体を以前に
記載されているように（Duncker et al. 2013, J Neurosci 33(22):9508-9519）用いる。
コルチ器の基底回転、中回転、および頂回転で、有毛細胞およびOTOFを発現するそれらの
有毛細胞の総数を200μm領域内で計数する。
【0335】
屠殺した動物の残りの半分（各用量コホートから残りの5匹の動物）において、上記と
同じ基底領域、中領域、および頂領域から蝸牛組織試料を収集し、以前に記載されている
（Dunckeret al. 2013, J Neurosci 33(22):9508-9519, Heidrych et al. 2008, Hum Mo
l Genet17:3814-3821, Heidrych et al., 2009, Hum Mol Genet 18:2779-2790）ように
オトフェリンmRNA転写産物についてアッセイする。
同じ基底領域、中領域、および頂領域から蝸牛組織試料を収集し、以前に記載されている
（Dunckeret al. 2013, J Neurosci 33(22):9508-9519, Heidrych et al. 2008, Hum Mo
l Genet17:3814-3821, Heidrych et al., 2009, Hum Mol Genet 18:2779-2790）ように
オトフェリンmRNA転写産物についてアッセイする。
【0336】
実施例12：動物モデル3A：CRISPRで作製したトランスジェニック大型動物モデル（ヒツジ
）
Cas9およびsgRNAを共発現するプラスミドの作製
pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9プラスミド（Addgeneプラスミド#42230）をBsbIで
消化し、AntarticPhosphataseを用いて脱リン酸化し、直線化ベクターをゲル精製する。
OTOFに対するCas9およびsgRNAを発現するバイシストロン性ベクター（pX330-cas9-OTOF）
を作製するために、オトフェリンエクソン1を標的とするオリゴの対をアニールし、リン
酸化し、直線化ベクターにライゲーションする（Cong et al. 2013 Science 339(6121):8
19-23）。
）
Cas9およびsgRNAを共発現するプラスミドの作製
pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9プラスミド（Addgeneプラスミド#42230）をBsbIで
消化し、AntarticPhosphataseを用いて脱リン酸化し、直線化ベクターをゲル精製する。
OTOFに対するCas9およびsgRNAを発現するバイシストロン性ベクター（pX330-cas9-OTOF）
を作製するために、オトフェリンエクソン1を標的とするオリゴの対をアニールし、リン
酸化し、直線化ベクターにライゲーションする（Cong et al. 2013 Science 339(6121):8
19-23）。
【0337】
細胞でのゲノム編集アッセイ
A15アストログリアヒツジ細胞株（Viletteet al., 2000 In Vitro Cell Dev Biol Ani
m 36(1):45-9）を10％胎仔ウシ血清、2mMグルタミン、1％ピルビン酸ナトリウムおよび1
％ペニシリン/ストレプトマイシンでのDMEM中で維持する。細胞を24ウェルプレート中で
、リポフェクタミンLTX試薬を用いて、オトフェリンに対するCas9およびsgRNAを共発現す
る2 μgのpX330-cas9-OTOFでトランスフェクトする。3日後、トランスフェクトした細胞
からのゲノムDNAを抽出し、A260/A280比およびA260/A230比を測定してサンプル純度を説
明するNanoDrop2000分光光度計を用いて定量化する。
A15アストログリアヒツジ細胞株（Viletteet al., 2000 In Vitro Cell Dev Biol Ani
m 36(1):45-9）を10％胎仔ウシ血清、2mMグルタミン、1％ピルビン酸ナトリウムおよび1
％ペニシリン/ストレプトマイシンでのDMEM中で維持する。細胞を24ウェルプレート中で
、リポフェクタミンLTX試薬を用いて、オトフェリンに対するCas9およびsgRNAを共発現す
る2 μgのpX330-cas9-OTOFでトランスフェクトする。3日後、トランスフェクトした細胞
からのゲノムDNAを抽出し、A260/A280比およびA260/A230比を測定してサンプル純度を説
明するNanoDrop2000分光光度計を用いて定量化する。
【0338】
OTOFエクソン1の標的遺伝子座でのsgRNA配列の遺伝子変異活性を、T7EIミスマッチ検出
アッセイを用いて定量化する。関心対象のDNA配列を、特異的プライマーを用いて高忠実
度（high-fidelity）ポリメラーゼ（HerculaseII融合ポリメラーゼ）でPCR増幅する。次
いで、結果として生じるPCR産物を変性させ、ゆっくりと再アニールさせて（95℃、2分；
95℃ から85℃へ、－2℃/秒；85℃から25℃へ、－1℃/秒）、ホモ二本鎖/ヘテロ二本鎖混
合物を生成させる。次いで、これを、5 UのT7EI制限酵素によって37℃にて30分間消化す
る。消化産物を2％アガロースゲル電気泳動によって分離する。ImageJソフトウエアを用
いて以前に記載されている（Menoret et al. 2011 Advanced protocols for Animal Tran
sgenesis. AnISTT Manual. Heidelberg: Springer. p117-36）ように、切断産物の未切
断産物に対する比率を用いて、NHEJ頻度を計算する。NHEJ頻度は、％遺伝子改変＝100×(
1-(1-切断率)^(1/2)として計算される。
アッセイを用いて定量化する。関心対象のDNA配列を、特異的プライマーを用いて高忠実
度（high-fidelity）ポリメラーゼ（HerculaseII融合ポリメラーゼ）でPCR増幅する。次
いで、結果として生じるPCR産物を変性させ、ゆっくりと再アニールさせて（95℃、2分；
95℃ から85℃へ、－2℃/秒；85℃から25℃へ、－1℃/秒）、ホモ二本鎖/ヘテロ二本鎖混
合物を生成させる。次いで、これを、5 UのT7EI制限酵素によって37℃にて30分間消化す
る。消化産物を2％アガロースゲル電気泳動によって分離する。ImageJソフトウエアを用
いて以前に記載されている（Menoret et al. 2011 Advanced protocols for Animal Tran
sgenesis. AnISTT Manual. Heidelberg: Springer. p117-36）ように、切断産物の未切
断産物に対する比率を用いて、NHEJ頻度を計算する。NHEJ頻度は、％遺伝子改変＝100×(
1-(1-切断率)^(1/2)として計算される。
【0339】
sgRNAおよびCas9mRNAの生成
以前に記載されている（Bellec et al. 2015, Current Gene Ther）ように、pX330-cas
9-OTOFプラスミドのPCR増幅によって、T7プロモーターをsgRNA鋳型に付加する。NucleoSp
in Gel and PCRClean-upを用いて、PCR産物を精製する。該PCR産物は、MEGAshortscript
T7キットを用いて製造者マニュアルにしたがって、インビトロ転写の鋳型として用いら
れる。転写の完了後、DNase I処理を実施する。
以前に記載されている（Bellec et al. 2015, Current Gene Ther）ように、pX330-cas
9-OTOFプラスミドのPCR増幅によって、T7プロモーターをsgRNA鋳型に付加する。NucleoSp
in Gel and PCRClean-upを用いて、PCR産物を精製する。該PCR産物は、MEGAshortscript
T7キットを用いて製造者マニュアルにしたがって、インビトロ転写の鋳型として用いら
れる。転写の完了後、DNase I処理を実施する。
【0340】
Cas9mRNAを、PmeI消化Cas9発現JDS246プラスミド（Addgeneプラスミド # 43861）およ
びmMESSAGEmMACHINE T7 ULTRA Transcriptionキットを用いて製造者マニュアルにしたが
って転写する。転写の完了後、ポリ(A)テーリング反応およびDNase I処理を実施する。Ca
s9 mRNAおよびsgRNAのどちらもMEGAclearキットを用いて精製され、溶出バッファーで溶
出される。
びmMESSAGEmMACHINE T7 ULTRA Transcriptionキットを用いて製造者マニュアルにしたが
って転写する。転写の完了後、ポリ(A)テーリング反応およびDNase I処理を実施する。Ca
s9 mRNAおよびsgRNAのどちらもMEGAclearキットを用いて精製され、溶出バッファーで溶
出される。
【0341】
胚のインビトロでの生成
以前に記載されている（Crispo et al. 2014 Transgenic Res, 24(1):31-41）ような日
常的な手法によるインビトロでの受精によって、胚を生成した。簡単に説明すると、屠殺
場からの卵巣を研究室に運び、卵丘卵母細胞複合体（COC）を回復培地中で吸引する。選
択したCOCを、5％C02の加湿空気雰囲気中で39℃にて24時間、成熟培地中に置く。次いで
、拡大させたCOCを、スイムアップ法で優勢な遊走によって選別された、1×106用量の凍
結融解精液を含む100μl液滴で受精させる。受精は、加湿雰囲気を伴う5％ C02中で39℃
にて22時間行われる。
以前に記載されている（Crispo et al. 2014 Transgenic Res, 24(1):31-41）ような日
常的な手法によるインビトロでの受精によって、胚を生成した。簡単に説明すると、屠殺
場からの卵巣を研究室に運び、卵丘卵母細胞複合体（COC）を回復培地中で吸引する。選
択したCOCを、5％C02の加湿空気雰囲気中で39℃にて24時間、成熟培地中に置く。次いで
、拡大させたCOCを、スイムアップ法で優勢な遊走によって選別された、1×106用量の凍
結融解精液を含む100μl液滴で受精させる。受精は、加湿雰囲気を伴う5％ C02中で39℃
にて22時間行われる。
【0342】
受精卵へのマイクロインジェクション
受精直後に、572の推定受精卵を3つの実験群に無作為に割り当て、マイクロインジェク
ションする（CRISPR群、n＝200；およびバッファー群、n＝200）、あるいはそうしない（
対照群、n＝200）。CRISPR群のマイクロインジェクションは、注入バッファー（10mM Tr
is pH 7.5、0.1mM EDTA）で希釈した5 ng/μlのsgRNAおよび20 ng/μlのCas9 mRNAによ
り細胞質内で実施され、バッファー群は同じ手法だがバッファー単独で注入される。最後
に、注入された胚および注入されていない胚を、5％ C02、5％ 02および90％ N2の加湿大
気中で39℃にて、ミネラルオイル下の培養培地中に移す。2日目の卵割比率（卵割した受
精卵/総卵母細胞）および6日目の発生比率（桑実胚および胚盤胞/総卵母細胞）を全実験
群について記録する。6日目の後、20のCRISPR群の胚からのDNAをSanger配列決定によって
分析し、OTOF遺伝子レベルでの変異を決定する。
受精直後に、572の推定受精卵を3つの実験群に無作為に割り当て、マイクロインジェク
ションする（CRISPR群、n＝200；およびバッファー群、n＝200）、あるいはそうしない（
対照群、n＝200）。CRISPR群のマイクロインジェクションは、注入バッファー（10mM Tr
is pH 7.5、0.1mM EDTA）で希釈した5 ng/μlのsgRNAおよび20 ng/μlのCas9 mRNAによ
り細胞質内で実施され、バッファー群は同じ手法だがバッファー単独で注入される。最後
に、注入された胚および注入されていない胚を、5％ C02、5％ 02および90％ N2の加湿大
気中で39℃にて、ミネラルオイル下の培養培地中に移す。2日目の卵割比率（卵割した受
精卵/総卵母細胞）および6日目の発生比率（桑実胚および胚盤胞/総卵母細胞）を全実験
群について記録する。6日目の後、20のCRISPR群の胚からのDNAをSanger配列決定によって
分析し、OTOF遺伝子レベルでの変異を決定する。
【0343】
系のインビボでの効率を決定するために、CRISPR/Cas9受精卵マイクロインジェクショ
ンによって生成した53の胚盤胞を、29匹の雌レシピエントに移植する。極めて良好または
良好に分類される（すなわち、Stringfellow et al. 2010, Manual of the Internationa
l EmbryoTransfer Societyにおいて定義されるグレード1）初期胚盤胞、胚盤胞、および
拡張胚盤胞のみが、受精後6日目に移植される。胚移植は、黄体と同側の子宮角の頭側に
胚を配置する、腹腔鏡手術に補助される最小の侵襲手術によって実施される。Menchaca e
t al. 2004, ReprodFertil Dev. 16(4):403-413に記載されているように、以前に記載の
排卵を制御する標準的なプロトコールを用いて、レシピエント雌ヒツジを発情周期の6日
目になるよう予め同調させる。
ンによって生成した53の胚盤胞を、29匹の雌レシピエントに移植する。極めて良好または
良好に分類される（すなわち、Stringfellow et al. 2010, Manual of the Internationa
l EmbryoTransfer Societyにおいて定義されるグレード1）初期胚盤胞、胚盤胞、および
拡張胚盤胞のみが、受精後6日目に移植される。胚移植は、黄体と同側の子宮角の頭側に
胚を配置する、腹腔鏡手術に補助される最小の侵襲手術によって実施される。Menchaca e
t al. 2004, ReprodFertil Dev. 16(4):403-413に記載されているように、以前に記載の
排卵を制御する標準的なプロトコールを用いて、レシピエント雌ヒツジを発情周期の6日
目になるよう予め同調させる。
【0344】
胎仔および子ヒツジのモニタリング
妊娠診断および胎仔発達を、5および3.5 MHzプローブを装備したBモード超音波検査を
用いることによって、30日目および105日目にそれぞれ実施する。実験の0日目を胚受精の
瞬間として定義する。妊娠の105日目の胎仔の発達を調べるために複数のパラメーター：
胸郭径、大横径、後頭鼻骨長、および心拍数を測定する。出産時に、妊娠期間、性別、直
腸温、心拍数および呼吸数、体重、胸郭周囲長、大横径、頭殿長、後頭骨鼻（occipitona
sal）長、体高、股関節部の高さ、股関節部の幅、および胸部の幅を記録した。誕生時、
ならびに15、30および60日後に、体重および形態計測の変量を決定する。
妊娠診断および胎仔発達を、5および3.5 MHzプローブを装備したBモード超音波検査を
用いることによって、30日目および105日目にそれぞれ実施する。実験の0日目を胚受精の
瞬間として定義する。妊娠の105日目の胎仔の発達を調べるために複数のパラメーター：
胸郭径、大横径、後頭鼻骨長、および心拍数を測定する。出産時に、妊娠期間、性別、直
腸温、心拍数および呼吸数、体重、胸郭周囲長、大横径、頭殿長、後頭骨鼻（occipitona
sal）長、体高、股関節部の高さ、股関節部の幅、および胸部の幅を記録した。誕生時、
ならびに15、30および60日後に、体重および形態計測の変量を決定する。
【0345】
トランスジェニック動物の確認および遺伝子型判定
KOファウンダーおよびオフターゲット部位を特定および特徴付けるために、生後7日目
に子ヒツジの皮膚および四肢筋から試料を採取し、T7EIアッセイ、ウエスタンブロット検
査および組織学的試験を実施する。総DNAを全ての動物の皮膚生検および一部の動物の筋
から単離する。試料をキャピラリー電気泳動を用いて分析する。OTOFエクソン1の遺伝子
型判定を、PCRアンプリコンの直接的配列決定によって、および個々のアンプリコン配列
を有する単離された細菌クローンのさらなる配列決定により筋生検において行った。
KOファウンダーおよびオフターゲット部位を特定および特徴付けるために、生後7日目
に子ヒツジの皮膚および四肢筋から試料を採取し、T7EIアッセイ、ウエスタンブロット検
査および組織学的試験を実施する。総DNAを全ての動物の皮膚生検および一部の動物の筋
から単離する。試料をキャピラリー電気泳動を用いて分析する。OTOFエクソン1の遺伝子
型判定を、PCRアンプリコンの直接的配列決定によって、および個々のアンプリコン配列
を有する単離された細菌クローンのさらなる配列決定により筋生検において行った。
【0346】
オトフェリン発現の分析
ウエスタンブロッティングを実施し、筋繊維におけるミオスタチンの存在を決定する。
当量の総タンパク質を12％（v/v）ゲル電気泳動で動作させ、PVDF膜に電気泳動的に転写
する。モノクローナルマウス抗オトフェリン抗体をウエスタンブロッティングで用いる。
洗浄した膜を1：50000希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ（HPR）に連結した二次抗体と
一緒にインキュベートする。ウエスタンブロット化学発光を用いてHPR活性を検出する。
ウエスタンブロッティングを実施し、筋繊維におけるミオスタチンの存在を決定する。
当量の総タンパク質を12％（v/v）ゲル電気泳動で動作させ、PVDF膜に電気泳動的に転写
する。モノクローナルマウス抗オトフェリン抗体をウエスタンブロッティングで用いる。
洗浄した膜を1：50000希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ（HPR）に連結した二次抗体と
一緒にインキュベートする。ウエスタンブロット化学発光を用いてHPR活性を検出する。
【0347】
トランスジェニックヒツジモデルにおけるAAV-OTOFレスキュー治療
人工外リンパで調製したAAV-OTOFをOTOFノックアウトトランスジェニックヒツジに投与
し、トランス-RWM注入を介する蝸牛への送達後に正常な聴力機能を回復させる能力を評価
する。ベースライン聴性脳幹反応（ABR）および歪成分耳音響放射（DPOAE）を、3ヶ月齢
の雌ヒツジ（n＝30）において両側で測定し、処置前の内有毛細胞（IHC）および外有毛細
胞（OHC）の機能を評価する。ベースラインABRおよびDPOAE測定後、1.0e14,3.2e13およ
び1.0e13vg/mLの力価のAAV1-OTOFをヒツジの左側鼓室階に20 μL注入する（1群あたりn
＝10）。各動物の右耳を未処置対照として残す。ABRおよびDPOAEの測定を外科的手技の1
、5および10日後に再び両側で行う。手技後6ヶ月で、さらなる両側ABRおよびDPOAE測定を
全動物から得て、続いて、動物を屠殺し、その蝸牛を取り出す。
人工外リンパで調製したAAV-OTOFをOTOFノックアウトトランスジェニックヒツジに投与
し、トランス-RWM注入を介する蝸牛への送達後に正常な聴力機能を回復させる能力を評価
する。ベースライン聴性脳幹反応（ABR）および歪成分耳音響放射（DPOAE）を、3ヶ月齢
の雌ヒツジ（n＝30）において両側で測定し、処置前の内有毛細胞（IHC）および外有毛細
胞（OHC）の機能を評価する。ベースラインABRおよびDPOAE測定後、1.0e14,3.2e13およ
び1.0e13vg/mLの力価のAAV1-OTOFをヒツジの左側鼓室階に20 μL注入する（1群あたりn
＝10）。各動物の右耳を未処置対照として残す。ABRおよびDPOAEの測定を外科的手技の1
、5および10日後に再び両側で行う。手技後6ヶ月で、さらなる両側ABRおよびDPOAE測定を
全動物から得て、続いて、動物を屠殺し、その蝸牛を取り出す。
【0348】
屠殺した動物のうちの半分（用量コホートのそれぞれからn＝5）で、免疫染色を実施し
て、有毛細胞構造を特定し、蝸牛感覚上皮沿いのOTOFタンパク質発現を評価する。有毛細
胞（Myo7a）、支持細胞（Sox2）、およびオトフェリンのマーカーに対する抗体を以前に
記載されているように（Duncker et al. 2013, J Neurosci 33(22):9508-9519）用いる。
コルチ器の基底回転、中回転、および頂回転で、有毛細胞およびOTOFを発現するそれらの
有毛細胞の総数を200μm領域内で計数する。
て、有毛細胞構造を特定し、蝸牛感覚上皮沿いのOTOFタンパク質発現を評価する。有毛細
胞（Myo7a）、支持細胞（Sox2）、およびオトフェリンのマーカーに対する抗体を以前に
記載されているように（Duncker et al. 2013, J Neurosci 33(22):9508-9519）用いる。
コルチ器の基底回転、中回転、および頂回転で、有毛細胞およびOTOFを発現するそれらの
有毛細胞の総数を200μm領域内で計数する。
【0349】
屠殺した動物の残りの半分（各用量コホートから残りの5匹の動物）において、上記と
同じ基底領域、中領域、および頂領域から蝸牛組織試料を収集し、以前に記載されている
（Dunckeret al. 2013, J Neurosci 33(22):9508-9519, Heidrych et al. 2008, Hum Mo
l Genet17:3814-3821, Heidrych et al., 2009, Hum Mol Genet 18:2779-2790）ように
オトフェリンmRNA転写産物についてアッセイする。
同じ基底領域、中領域、および頂領域から蝸牛組織試料を収集し、以前に記載されている
（Dunckeret al. 2013, J Neurosci 33(22):9508-9519, Heidrych et al. 2008, Hum Mo
l Genet17:3814-3821, Heidrych et al., 2009, Hum Mol Genet 18:2779-2790）ように
オトフェリンmRNA転写産物についてアッセイする。
【0350】
実施例13：ヒト臨床例（小児処置）
患者を全身麻酔下に置く。外科医は、外耳道から鼓膜にアプローチし、鼓膜と接触する
外耳道の下縁に小さな切開部を作製し、鼓膜を弁のように挙上して、中耳空間を露出させ
る。手術用レーザーを用いて、アブミ骨底に小さな開口部（およそ2 mm）を作製する。次
いで、外科医は、1e13vg/mLの力価で人工外リンパで調製したAAV-OTOFの溶液を充填した
マイクロカテーテルで正円窓膜に侵入する。マイクロカテーテルを、およそ1 μL/分の速
度でおよそ20 μLのAAV-OTOF溶液を注入するマイクロマニピュレーターに連結する。AAV-
OTOF注入の最後に、外科医はマイクロカテーテルを引き抜き、アブミ骨底およびRWMにお
ける孔をゲルフォームパッチで修復する。手技は、鼓膜弁を元に戻し完了する。
患者を全身麻酔下に置く。外科医は、外耳道から鼓膜にアプローチし、鼓膜と接触する
外耳道の下縁に小さな切開部を作製し、鼓膜を弁のように挙上して、中耳空間を露出させ
る。手術用レーザーを用いて、アブミ骨底に小さな開口部（およそ2 mm）を作製する。次
いで、外科医は、1e13vg/mLの力価で人工外リンパで調製したAAV-OTOFの溶液を充填した
マイクロカテーテルで正円窓膜に侵入する。マイクロカテーテルを、およそ1 μL/分の速
度でおよそ20 μLのAAV-OTOF溶液を注入するマイクロマニピュレーターに連結する。AAV-
OTOF注入の最後に、外科医はマイクロカテーテルを引き抜き、アブミ骨底およびRWMにお
ける孔をゲルフォームパッチで修復する。手技は、鼓膜弁を元に戻し完了する。
【0351】
実施例14：OTOF変異を検出する母体血の非侵襲性出生前検査
母体血試料（20～40mL）をセルフリーDNA採血管に収集する。2,000 gで20分間、続い
て3,220 gで30分間遠心し、第1の遠心の後に上清を移す、二重遠心プロトコールを介して
、少なくとも7mLの血漿を各試料から単離する。cfDNAを、QIAGEN QIAmp Circulating Nu
clei Acidキットを用いて7～20mLの血漿から単離し、45 μL TEバッファーで溶出する。
純粋な母体ゲノムDNAを、第1の遠心分離後に得られるバフィーコートから単離する。
母体血試料（20～40mL）をセルフリーDNA採血管に収集する。2,000 gで20分間、続い
て3,220 gで30分間遠心し、第1の遠心の後に上清を移す、二重遠心プロトコールを介して
、少なくとも7mLの血漿を各試料から単離する。cfDNAを、QIAGEN QIAmp Circulating Nu
clei Acidキットを用いて7～20mLの血漿から単離し、45 μL TEバッファーで溶出する。
純粋な母体ゲノムDNAを、第1の遠心分離後に得られるバフィーコートから単離する。
【0352】
以前に記載されている（Stiller et al. 2009 Genome Res 19(10):1843-1848）ように
アッセイの熱力学的モデリングを組み合わせて、増幅アプローチによるプローブ-プロー
ブ相互作用の可能性を最小限にするプローブを選択することによって、11,000のアッセイ
の多重化を達成することができる。母体cfDNA試料および母体ゲノムDNA試料を、11,000の
標的特異的アッセイを用いて15サイクルで前増幅し、アリコートを、ネステッドプライマ
ーを用いる15サイクルの第2のPCR反応に移す。12サイクルの第3ラウンドのPCRでバーコー
ド化タグを付加することによって、試料を配列決定用に調製する。標的には、オトフェリ
ン機能喪失をもたらすことが公知の2番染色体における100個の変異に対応するSNPを含む
（Zhang etal. 2016 Clin Genetics Jan 27）。次いで、Illumina HiSeqシーケンサーを
用いて、アンプリコンを配列決定する。ゲノム配列アライメントを市販のソフトウエアを
用いて実施する。
アッセイの熱力学的モデリングを組み合わせて、増幅アプローチによるプローブ-プロー
ブ相互作用の可能性を最小限にするプローブを選択することによって、11,000のアッセイ
の多重化を達成することができる。母体cfDNA試料および母体ゲノムDNA試料を、11,000の
標的特異的アッセイを用いて15サイクルで前増幅し、アリコートを、ネステッドプライマ
ーを用いる15サイクルの第2のPCR反応に移す。12サイクルの第3ラウンドのPCRでバーコー
ド化タグを付加することによって、試料を配列決定用に調製する。標的には、オトフェリ
ン機能喪失をもたらすことが公知の2番染色体における100個の変異に対応するSNPを含む
（Zhang etal. 2016 Clin Genetics Jan 27）。次いで、Illumina HiSeqシーケンサーを
用いて、アンプリコンを配列決定する。ゲノム配列アライメントを市販のソフトウエアを
用いて実施する。
【0353】
実施例15：代替の例（mRNA、単一のウイルスベクター、非ウイルスベクター）
単一のウイルスベクター調製
N末端ドメインを欠くマウスオトフェリンは、オトフェリンノックアウトゼブラフィッ
シュにおいてノックダウン表現型をレスキューすることができる（Chatterjee et al. Mo
l Cell Biol2015, 35(6):1043-1054）。一方で、哺乳動物では、C2BドメインおよびC2C
ドメインにおけるミスセンス変異は、難聴に関係しており（Longo-Guess et al., 2007 H
ear Res,234:21-28; Mirghomizadeh et al., 2002 Neurobiol Dis 10:157-164）、これ
らのドメインが高等種ではオトフェリンの正常な聴力に関連した機能に必須であることを
示唆する。哺乳類オトフェリンのC2AドメインはCa2+に結合しないのに対して、全ての他
のC2ドメインは、酸性脂質の非存在下で中程度の（20～50μM）または低い（400～700
μM）親和性でCa2+に結合する。C2DドメインおよびC2Eドメインは、Ca2+依存的にCa2+な
らびにホスファチジルセリン（PS）に結合する。C2A、C2DおよびC2Eドメインを欠く切断
型のオトフェリンをコードするcDNAを作製する。このcDNAはAAVベクター中にパッケージ
ングするのに適している。
単一のウイルスベクター調製
N末端ドメインを欠くマウスオトフェリンは、オトフェリンノックアウトゼブラフィッ
シュにおいてノックダウン表現型をレスキューすることができる（Chatterjee et al. Mo
l Cell Biol2015, 35(6):1043-1054）。一方で、哺乳動物では、C2BドメインおよびC2C
ドメインにおけるミスセンス変異は、難聴に関係しており（Longo-Guess et al., 2007 H
ear Res,234:21-28; Mirghomizadeh et al., 2002 Neurobiol Dis 10:157-164）、これ
らのドメインが高等種ではオトフェリンの正常な聴力に関連した機能に必須であることを
示唆する。哺乳類オトフェリンのC2AドメインはCa2+に結合しないのに対して、全ての他
のC2ドメインは、酸性脂質の非存在下で中程度の（20～50μM）または低い（400～700
μM）親和性でCa2+に結合する。C2DドメインおよびC2Eドメインは、Ca2+依存的にCa2+な
らびにホスファチジルセリン（PS）に結合する。C2A、C2DおよびC2Eドメインを欠く切断
型のオトフェリンをコードするcDNAを作製する。このcDNAはAAVベクター中にパッケージ
ングするのに適している。
【0354】
Padmanarayanaet al. 2014 Biochem 53:5023-5033によって記載されているように、切
断型オトフェリン構築物（OTOFΔC2ADE）は、全長OTOF遺伝子をコードする元の野生型オ
トフェリンプラスミドに由来し、該プラスミドからクローニングされる。C2ドメインのコ
ード領域の欠失を、ドメインに及ぶオリゴヌクレオチドを用いるPCR突然変異誘発、およ
び二重変異原性プライマーアプローチを利用するQuikChange部位特異的変異誘発キットに
よって実施する。簡単に説明すると、PCRを以下のように実施する：95℃で3分間；95℃で
15秒間、65℃で1分間、および68℃で12分間を18サイクル；および68℃で7分間。PCR産物
をDpnIで消化し、DSC-Bベクターにクローニングし、DH5αまたはXL1O-Gold細菌細胞内で
形質転換する。プラスミド DNAをミニプレップ（mini preparation）によって単離し、続
いて配列決定する。
断型オトフェリン構築物（OTOFΔC2ADE）は、全長OTOF遺伝子をコードする元の野生型オ
トフェリンプラスミドに由来し、該プラスミドからクローニングされる。C2ドメインのコ
ード領域の欠失を、ドメインに及ぶオリゴヌクレオチドを用いるPCR突然変異誘発、およ
び二重変異原性プライマーアプローチを利用するQuikChange部位特異的変異誘発キットに
よって実施する。簡単に説明すると、PCRを以下のように実施する：95℃で3分間；95℃で
15秒間、65℃で1分間、および68℃で12分間を18サイクル；および68℃で7分間。PCR産物
をDpnIで消化し、DSC-Bベクターにクローニングし、DH5αまたはXL1O-Gold細菌細胞内で
形質転換する。プラスミド DNAをミニプレップ（mini preparation）によって単離し、続
いて配列決定する。
【0355】
CBAプロモーター、キメライントロン（βグロビン）、コンセンサスKozak配列、OTOFΔ
C2ADE cDNA、およびポリアデニル化シグナル配列を含有するプラスミドをAAV構築物に用
いる。組換えAAVを、Xiaoet al. J Virol 1999, 73(5):3994-4003によって用いられるよ
うなアデノウイルスフリーの方法によるトランスフェクションによって作製する。AAV IT
Rを有するシスプラスミド、AAVRepおよびキャップ遺伝子を有するトランスプラスミド、
ならびにアデノウイルスゲノム由来の必須領域を有するヘルパープラスミドを、1：1：2
の比率で293細胞にコトランスフェクトする。AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、rh
8、rh1O、rh39、rh43、およびAnc80をそれぞれ調製し、OTOFΔC2ADEcDNA構築物を封入す
る。
C2ADE cDNA、およびポリアデニル化シグナル配列を含有するプラスミドをAAV構築物に用
いる。組換えAAVを、Xiaoet al. J Virol 1999, 73(5):3994-4003によって用いられるよ
うなアデノウイルスフリーの方法によるトランスフェクションによって作製する。AAV IT
Rを有するシスプラスミド、AAVRepおよびキャップ遺伝子を有するトランスプラスミド、
ならびにアデノウイルスゲノム由来の必須領域を有するヘルパープラスミドを、1：1：2
の比率で293細胞にコトランスフェクトする。AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、rh
8、rh1O、rh39、rh43、およびAnc80をそれぞれ調製し、OTOFΔC2ADEcDNA構築物を封入す
る。
【0356】
CELiD調製
Li etal. 2013, PLoS ONE 8(8):e69879に記載されているように、オトフェリン遺伝子
を非ウイルス遺伝子導入用に調製する。最初に、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodopte
ra frugiperda）Sf9細胞を無血清培地中で懸濁物に成長させる。ブラストサイジン-Sデア
ミナーゼ（bs）遺伝子を、以下のプライマー対
を用いて、pIB/V5-His/CATからPCR増幅する。865bp PCR産物をHindIIIで消化し、HindII
Iで消化したpFBGR内にライゲーションする。CellfectinTransfection Reagentを用いて
、Sf9細胞にpFBGR-bsdをトランスフェクトする。トランスフェクション後3日目に、ブラ
ストサイジン-SHCl（50 μg/mL）の増殖培地への添加によって、抗生物質耐性細胞を選
択する。選択培地で2週間後、ブラストサイジン耐性（bsdr）クローンを、単一細胞希釈
または直接コロニートランスファー技術によって得る。bsdrクローンを、10％ FBSおよび
ブラストサイジン-SHCl（10 μg/mL）を補充した昆虫細胞培養培地中でさらに2～3継代
拡大させ、次いで、10μg/mLブラストサイジン-S HClを含む無血清培地に戻す。さらに1
2継代後、ブラストサイジン-SHClを培地から取り除き、細胞株を分析のために拡大させ
る。機能的スクリーニングでは、クローンSf9/ITR-OTOF細胞株は、AAV2型Rep78およびRep
52タンパク質を発現する組換えバキュロウイルス、Bac-Repに感染し（MOI＝5）、誘導性O
TOF発現について分析される。最高レベルのOTOF発現を有するクローンSf9/ITR-OTOF細胞
をCELiD-OTOFDNA調製のために拡大させる。
Li etal. 2013, PLoS ONE 8(8):e69879に記載されているように、オトフェリン遺伝子
を非ウイルス遺伝子導入用に調製する。最初に、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodopte
ra frugiperda）Sf9細胞を無血清培地中で懸濁物に成長させる。ブラストサイジン-Sデア
ミナーゼ（bs）遺伝子を、以下のプライマー対
を用いて、pIB/V5-His/CATからPCR増幅する。865bp PCR産物をHindIIIで消化し、HindII
Iで消化したpFBGR内にライゲーションする。CellfectinTransfection Reagentを用いて
、Sf9細胞にpFBGR-bsdをトランスフェクトする。トランスフェクション後3日目に、ブラ
ストサイジン-SHCl（50 μg/mL）の増殖培地への添加によって、抗生物質耐性細胞を選
択する。選択培地で2週間後、ブラストサイジン耐性（bsdr）クローンを、単一細胞希釈
または直接コロニートランスファー技術によって得る。bsdrクローンを、10％ FBSおよび
ブラストサイジン-SHCl（10 μg/mL）を補充した昆虫細胞培養培地中でさらに2～3継代
拡大させ、次いで、10μg/mLブラストサイジン-S HClを含む無血清培地に戻す。さらに1
2継代後、ブラストサイジン-SHClを培地から取り除き、細胞株を分析のために拡大させ
る。機能的スクリーニングでは、クローンSf9/ITR-OTOF細胞株は、AAV2型Rep78およびRep
52タンパク質を発現する組換えバキュロウイルス、Bac-Repに感染し（MOI＝5）、誘導性O
TOF発現について分析される。最高レベルのOTOF発現を有するクローンSf9/ITR-OTOF細胞
をCELiD-OTOFDNA調製のために拡大させる。
【0357】
クローンSf9/ITR-OTOF細胞を2e6細胞/mLで播種し、Bac-Repを感染させた（MOI＝1～3）
。細胞径が18～20μmに増大し（未感染細胞の細胞径は14～15 μm）、細胞がウイルス感
染の後期段階にあることを示すまで、細胞生存率および細胞径を毎日モニタリングする。
市販のプラスミド単離キットを用いて、Bac-Rep感染Sf9/ITR-GFP細胞から染色体外DNAを
抽出する。アガロースゲル電気泳動および染色体外DNAのエチジウムブロミド染色によっ
て、CELiD産生をモニタリングする。2つの別個のバキュロウイルス発現ベクター（BEV）
：Bac-Rep およびBac-OTOFなどのITR隣接導入遺伝子を有する第2のBEVによる同時感染に
よって、CELiDDNAを親Sf9細胞内に産生させる。平均細胞径が4～5 μmに増大しかつ生存
率が80～90％に低下したら、感染したSf9細胞を回収する。市販のプラスミド精製キット
を用いて、CELiDDNAを単離する。
。細胞径が18～20μmに増大し（未感染細胞の細胞径は14～15 μm）、細胞がウイルス感
染の後期段階にあることを示すまで、細胞生存率および細胞径を毎日モニタリングする。
市販のプラスミド単離キットを用いて、Bac-Rep感染Sf9/ITR-GFP細胞から染色体外DNAを
抽出する。アガロースゲル電気泳動および染色体外DNAのエチジウムブロミド染色によっ
て、CELiD産生をモニタリングする。2つの別個のバキュロウイルス発現ベクター（BEV）
：Bac-Rep およびBac-OTOFなどのITR隣接導入遺伝子を有する第2のBEVによる同時感染に
よって、CELiDDNAを親Sf9細胞内に産生させる。平均細胞径が4～5 μmに増大しかつ生存
率が80～90％に低下したら、感染したSf9細胞を回収する。市販のプラスミド精製キット
を用いて、CELiDDNAを単離する。
【0358】
クローンSf9/ITR-OTOF細胞にさまざまな量のBac-Repストックを接種する。細胞を定期
的に収集し、市販のDNA単離キットを用いて染色体外DNAを回収する。CELiDDNA量の定量
的決定のために、抽出したDNAを、アガロースゲル電気泳動によってまたはOTOF特異的プ
ライマー対によるPCRによって調べる。ウエスタンブロッティングでは、細胞タンパク質
はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画され、ニトロセルロース膜に転写さ
れる。膜を、0.05％Tween-20を加えたリン酸緩衝化食塩水（PBST）中の5％脱脂粉乳（w:
v）で構成されるブロッキングバッファー（BB）中で環境温度にて環状攪拌しながら1時間
インキュベートする。PBST中の3％脱脂粉乳で構成される洗浄バッファー（WB）で膜を洗
浄した後、膜を適切な一次抗体溶液（BBで希釈）と一緒に連続的に環状攪拌しながら環境
温度（1時間）または4℃（一晩）のいずれかでインキュベートする。以下の一次抗体およ
び希釈比率を用いる：抗AAV Repマウスモノクローナル抗体（mAb）；2.抗バキュロウイル
スエンベロープ糖タンパク質gp64マウスmAb；抗OTOFマウスmAb。インキュベーション後、
一次抗体溶液を取り除き、膜をWBで洗浄する（3×5分）。コンジュゲートしていないmAb
を二次抗体溶液（ヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲート）と
一緒に1時間インキュベートし、次いで、上記のようにWBで洗浄する。HRP活性を高感度化
学発光（ECL）によって検出する。
的に収集し、市販のDNA単離キットを用いて染色体外DNAを回収する。CELiDDNA量の定量
的決定のために、抽出したDNAを、アガロースゲル電気泳動によってまたはOTOF特異的プ
ライマー対によるPCRによって調べる。ウエスタンブロッティングでは、細胞タンパク質
はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画され、ニトロセルロース膜に転写さ
れる。膜を、0.05％Tween-20を加えたリン酸緩衝化食塩水（PBST）中の5％脱脂粉乳（w:
v）で構成されるブロッキングバッファー（BB）中で環境温度にて環状攪拌しながら1時間
インキュベートする。PBST中の3％脱脂粉乳で構成される洗浄バッファー（WB）で膜を洗
浄した後、膜を適切な一次抗体溶液（BBで希釈）と一緒に連続的に環状攪拌しながら環境
温度（1時間）または4℃（一晩）のいずれかでインキュベートする。以下の一次抗体およ
び希釈比率を用いる：抗AAV Repマウスモノクローナル抗体（mAb）；2.抗バキュロウイル
スエンベロープ糖タンパク質gp64マウスmAb；抗OTOFマウスmAb。インキュベーション後、
一次抗体溶液を取り除き、膜をWBで洗浄する（3×5分）。コンジュゲートしていないmAb
を二次抗体溶液（ヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲート）と
一緒に1時間インキュベートし、次いで、上記のようにWBで洗浄する。HRP活性を高感度化
学発光（ECL）によって検出する。
【0359】
脂質ナノ粒子
オトフェリンcDNAまたはmRNAを、以前に記載されている（O’Donnelland McGinity 19
97 Adv DrugDelivery Rev 28(1):25-42）二重エマルジョン溶媒蒸発法によるポリ(乳酸-
co-グリコール酸)ナノ粒子、および脂質ナノ粒子（Pezzoliet al. 2013 Methods Mol Bi
ol 1025:269-279）中に封入する。簡単に説明すると、カチオン性脂質としてPrecirolAT
O-5およびステアリルアミンを用いて、マイクロエマルジョンから固体脂質ナノ粒子を作
製することができる。500 mgのPrecirol ATO-5をその融点を10℃上回る温度に加熱し、ポ
ロクサマーおよびステアリルアミンの熱水溶液を異なる割合（1/1.25；1/1.87；1/3.12；
1/4.37および1/5）で10mL添加する。試料を14,000 rpmで30分間攪拌する。熱マイクロエ
マルジョンを1：5のエマルジョン：水比率で冷水（2～5℃）中に分散させることによって
、ナノ粒子を作製する。ナノ粒子を回収するために、結果として生じる懸濁物を20℃の温
度で3,000 rpmにて20分間で3回遠心分離し、遠心分離後に沈殿物を再構成する。1：2（SL
N:マンニトール）の比率で凍結保護剤（5％マンニトール）の水溶液を加えることによっ
て、カチオン性固体脂質ナノ粒子を凍結乾燥する。凍結温度を凍結乾燥器において－40℃
に設定し、試料をこの温度で2時間維持する。次いで、凍結乾燥温度を48時間、0.2～0.4
mBaの圧力で25℃に設定する。OTOFcDNAプラスミドの溶液を2 μg/μLの濃度に調製する
。次いで、プラスミドDNA溶液の25 μLアリコートを異なる容量のカチオン性SLN懸濁物に
加え、攪拌によって15：1～1：1（SLN：OTOF）の比率を得る。
オトフェリンcDNAまたはmRNAを、以前に記載されている（O’Donnelland McGinity 19
97 Adv DrugDelivery Rev 28(1):25-42）二重エマルジョン溶媒蒸発法によるポリ(乳酸-
co-グリコール酸)ナノ粒子、および脂質ナノ粒子（Pezzoliet al. 2013 Methods Mol Bi
ol 1025:269-279）中に封入する。簡単に説明すると、カチオン性脂質としてPrecirolAT
O-5およびステアリルアミンを用いて、マイクロエマルジョンから固体脂質ナノ粒子を作
製することができる。500 mgのPrecirol ATO-5をその融点を10℃上回る温度に加熱し、ポ
ロクサマーおよびステアリルアミンの熱水溶液を異なる割合（1/1.25；1/1.87；1/3.12；
1/4.37および1/5）で10mL添加する。試料を14,000 rpmで30分間攪拌する。熱マイクロエ
マルジョンを1：5のエマルジョン：水比率で冷水（2～5℃）中に分散させることによって
、ナノ粒子を作製する。ナノ粒子を回収するために、結果として生じる懸濁物を20℃の温
度で3,000 rpmにて20分間で3回遠心分離し、遠心分離後に沈殿物を再構成する。1：2（SL
N:マンニトール）の比率で凍結保護剤（5％マンニトール）の水溶液を加えることによっ
て、カチオン性固体脂質ナノ粒子を凍結乾燥する。凍結温度を凍結乾燥器において－40℃
に設定し、試料をこの温度で2時間維持する。次いで、凍結乾燥温度を48時間、0.2～0.4
mBaの圧力で25℃に設定する。OTOFcDNAプラスミドの溶液を2 μg/μLの濃度に調製する
。次いで、プラスミドDNA溶液の25 μLアリコートを異なる容量のカチオン性SLN懸濁物に
加え、攪拌によって15：1～1：1（SLN：OTOF）の比率を得る。
【0360】
改変RNA
ポリヌクレオチド、本発明による使用のための一次構築物mRNA（または改変mRNA、また
は「mmRNA」）は、これらに限定されないが、化学合成、一般にインビトロ転写（IVT）と
呼ばれる酵素的合成、またはより長い前駆体の酵素的もしくは化学的切断等を含む、任意
の利用可能な技術によって調製され得る。RNAを合成する方法は当技術分野において公知
である（例えば、Gait,M. J. (ed.) Oligonucleotide synthesis: a practical approac
h, Oxford[Oxfordshire], Washington, D.C.: IRL Press, 1984;およびHerdewijn, P. (
ed.)Oligonucleotide synthesis: methods and applications, Methods in Molecular B
iology, v. 288(Clifton, N.J.) Totowa, N.J.: Humana Press, 2005を参照されたい；
これらの両方が参照により本明細書に組み入れられる）。
ポリヌクレオチド、本発明による使用のための一次構築物mRNA（または改変mRNA、また
は「mmRNA」）は、これらに限定されないが、化学合成、一般にインビトロ転写（IVT）と
呼ばれる酵素的合成、またはより長い前駆体の酵素的もしくは化学的切断等を含む、任意
の利用可能な技術によって調製され得る。RNAを合成する方法は当技術分野において公知
である（例えば、Gait,M. J. (ed.) Oligonucleotide synthesis: a practical approac
h, Oxford[Oxfordshire], Washington, D.C.: IRL Press, 1984;およびHerdewijn, P. (
ed.)Oligonucleotide synthesis: methods and applications, Methods in Molecular B
iology, v. 288(Clifton, N.J.) Totowa, N.J.: Humana Press, 2005を参照されたい；
これらの両方が参照により本明細書に組み入れられる）。
【0361】
本発明の一次構築物の設計および合成のプロセスには概して、遺伝子構築、mRNA生成（
改変ありまたはなしで）、および精製の工程が含まれる。酵素的合成方法では、関心対象
のポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチド配列が、ベクターへの組み込み用に最
初に選択され、増幅されcDNA鋳型を生成する。任意で、標的ポリヌクレオチド配列および
/または任意のフランキング配列はコドン最適化されてもよい。次いで、cDNA鋳型を用い
て、インビトロ転写（IVT）を通じてmRNAを生成する。生成後、mRNAは精製プロセスおよ
びクリーンアッププロセスを受けてもよい。これらの工程は下記により詳細に提供される
。
改変ありまたはなしで）、および精製の工程が含まれる。酵素的合成方法では、関心対象
のポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチド配列が、ベクターへの組み込み用に最
初に選択され、増幅されcDNA鋳型を生成する。任意で、標的ポリヌクレオチド配列および
/または任意のフランキング配列はコドン最適化されてもよい。次いで、cDNA鋳型を用い
て、インビトロ転写（IVT）を通じてmRNAを生成する。生成後、mRNAは精製プロセスおよ
びクリーンアッププロセスを受けてもよい。これらの工程は下記により詳細に提供される
。
【0362】
遺伝子構築
遺伝子構築の工程は、これらに限定されないが、遺伝子合成、ベクター増幅、プラスミ
ド精製、プラスミドの直線化およびクリーンアップ、ならびにcDNA鋳型の合成およびクリ
ーンアップが含まれ得る。
遺伝子構築の工程は、これらに限定されないが、遺伝子合成、ベクター増幅、プラスミ
ド精製、プラスミドの直線化およびクリーンアップ、ならびにcDNA鋳型の合成およびクリ
ーンアップが含まれ得る。
【0363】
遺伝子合成
関心対象または標的のポリペプチドが生成のために選択されたら、一次構築物が設計さ
れる。一次構築物内では、関心対象のポリペプチドをコードする連鎖するヌクレオシドの
第1の領域は、選択された核酸（DNAまたはRNA）転写産物のオープンリーディングフレー
ム（ORF）を用いて構築されてもよい。ORFは、野生型ORF、そのアイソフォーム、バリア
ント、または断片を含んでもよい。本明細書で用いられる「オープンリーディングフレー
ム」または「ORF」は、関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列（DNAまたはRNA）
を指すことを意味する。ORFは多くの場合、開始コドン、ATGで始まり、ナンセンスまたは
停止コドンまたはシグナルで終了する。さらに、第1の領域のヌクレオチド配列はコドン
最適化されてもよい。コドン最適化法は当技術分野において公知であり、いくつかの目的
の1つまたは複数を達成する試みにおいて有用であり得る。これらの目的には、適切なフ
ォールディングを確実にするために標的生物および宿主生物においてコドン頻度を適合さ
せること、mRNA安定性を向上させるまたは二次構造を低減させるためにGC含量を偏らせる
こと、遺伝子の構築または発現を損なう可能性があるタンデムリピートコドンまたは塩基
の一続き（baserun）を最小化すること、転写および翻訳の制御領域をカスタマイズする
こと、タンパク質輸送配列を挿入もしくは除去すること、コードされるタンパク質に翻訳
後修飾部位（例えば、糖付加部位）を除去/付加すること、タンパク質ドメインを付加、
除去もしくはシャッフルすること、制限部位を挿入もしくは欠失させること、リボソーム
結合部位およびmRNA分解部位を修飾すること、タンパク質のさまざまなドメインが適切に
フォールディングされるように翻訳速度を調整すること、またはmRNA内の問題ある二次構
造を低下または除去することが含まれる。コドン最適化ツール、アルゴリズムおよびサー
ビスは、当技術分野において公知である。非限定的な例には、GeneArt（Life Technologi
es）およびDNA2.0（MenloPark Calif.）からのサービスならびに/または独自の方法が含
まれる。1つの態様において、ORF配列は最適化アルゴリズムを用いて最適化される。各ア
ミノ酸のコドン選択肢は当技術分野において公知である。
関心対象または標的のポリペプチドが生成のために選択されたら、一次構築物が設計さ
れる。一次構築物内では、関心対象のポリペプチドをコードする連鎖するヌクレオシドの
第1の領域は、選択された核酸（DNAまたはRNA）転写産物のオープンリーディングフレー
ム（ORF）を用いて構築されてもよい。ORFは、野生型ORF、そのアイソフォーム、バリア
ント、または断片を含んでもよい。本明細書で用いられる「オープンリーディングフレー
ム」または「ORF」は、関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列（DNAまたはRNA）
を指すことを意味する。ORFは多くの場合、開始コドン、ATGで始まり、ナンセンスまたは
停止コドンまたはシグナルで終了する。さらに、第1の領域のヌクレオチド配列はコドン
最適化されてもよい。コドン最適化法は当技術分野において公知であり、いくつかの目的
の1つまたは複数を達成する試みにおいて有用であり得る。これらの目的には、適切なフ
ォールディングを確実にするために標的生物および宿主生物においてコドン頻度を適合さ
せること、mRNA安定性を向上させるまたは二次構造を低減させるためにGC含量を偏らせる
こと、遺伝子の構築または発現を損なう可能性があるタンデムリピートコドンまたは塩基
の一続き（baserun）を最小化すること、転写および翻訳の制御領域をカスタマイズする
こと、タンパク質輸送配列を挿入もしくは除去すること、コードされるタンパク質に翻訳
後修飾部位（例えば、糖付加部位）を除去/付加すること、タンパク質ドメインを付加、
除去もしくはシャッフルすること、制限部位を挿入もしくは欠失させること、リボソーム
結合部位およびmRNA分解部位を修飾すること、タンパク質のさまざまなドメインが適切に
フォールディングされるように翻訳速度を調整すること、またはmRNA内の問題ある二次構
造を低下または除去することが含まれる。コドン最適化ツール、アルゴリズムおよびサー
ビスは、当技術分野において公知である。非限定的な例には、GeneArt（Life Technologi
es）およびDNA2.0（MenloPark Calif.）からのサービスならびに/または独自の方法が含
まれる。1つの態様において、ORF配列は最適化アルゴリズムを用いて最適化される。各ア
ミノ酸のコドン選択肢は当技術分野において公知である。
【0364】
停止コドン
1つの態様において、本発明の一次構築物は、3'非翻訳領域（UTR）の前に少なくとも2
つの停止コドンを含んでもよい。停止コドンは、TGA、TAAおよびTAGから選択され得る。1
つの態様において、本発明の一次構築物は、停止コドンTGAおよび1つのさらなる停止コド
ンを含む。さらなる態様において、さらなる停止コドンはTAAであり得る。別の態様にお
いて、本発明の一次構築物は3つの停止コドンを含む。
1つの態様において、本発明の一次構築物は、3'非翻訳領域（UTR）の前に少なくとも2
つの停止コドンを含んでもよい。停止コドンは、TGA、TAAおよびTAGから選択され得る。1
つの態様において、本発明の一次構築物は、停止コドンTGAおよび1つのさらなる停止コド
ンを含む。さらなる態様において、さらなる停止コドンはTAAであり得る。別の態様にお
いて、本発明の一次構築物は3つの停止コドンを含む。
【0365】
ベクター増幅
次いで、一次構築物を含有するベクターが増幅され、これらに限定されないが、Invitr
ogen PURELINK(商標)HiPureMaxiprepキット（Carlsbad, Calif）を用いるマキシプレッ
プなど当技術分野において公知の方法を用いて、プラスミドが単離および精製される。
次いで、一次構築物を含有するベクターが増幅され、これらに限定されないが、Invitr
ogen PURELINK(商標)HiPureMaxiprepキット（Carlsbad, Calif）を用いるマキシプレッ
プなど当技術分野において公知の方法を用いて、プラスミドが単離および精製される。
【0366】
プラスミド直線化
次いで、プラスミドが、これらに限定されないが、制限酵素およびバッファーの使用な
ど当技術分野において公知の方法を用いて直線化され得る。直線化反応は、例えば、Invi
trogenのPURELINK(登録商標)PCRMicroキット（Carlsbad, Calif）、ならびにこれらに限
定されないが、強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC（RP-HPLC）、およ
び疎水性相互作用HPLC（HIC-HPLC）などのHPLCに基づく精製方法、ならびにInvitrogenの
標準PURELINK(商標)PCRキット（Carlsbad,Calif）を含む方法を用いて精製され得る。精
製方法は、実施される直線化反応のサイズに応じて改変され得る。次いで、直線化プラス
ミドを用いて、インビトロ転写（IVT）反応のためのcDNAを作製する。
次いで、プラスミドが、これらに限定されないが、制限酵素およびバッファーの使用な
ど当技術分野において公知の方法を用いて直線化され得る。直線化反応は、例えば、Invi
trogenのPURELINK(登録商標)PCRMicroキット（Carlsbad, Calif）、ならびにこれらに限
定されないが、強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC（RP-HPLC）、およ
び疎水性相互作用HPLC（HIC-HPLC）などのHPLCに基づく精製方法、ならびにInvitrogenの
標準PURELINK(商標)PCRキット（Carlsbad,Calif）を含む方法を用いて精製され得る。精
製方法は、実施される直線化反応のサイズに応じて改変され得る。次いで、直線化プラス
ミドを用いて、インビトロ転写（IVT）反応のためのcDNAを作製する。
【0367】
cDNA鋳型合成
cDNA鋳型は、直線化プラスミドがポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を受けることによって
合成されてもよい。任意の増幅のためのプライマー-プローブ設計は当業者の技術の範囲
内である。プローブは、標的分子に対する塩基対形成忠実度および塩基対形成強度を増大
させる化学的に修飾された塩基も含んでもよい。そのような修飾には、5-メチル-シチジ
ン、2,6-ジ-アミノ-プリン、2'-フルオロ、ホスホロチオアート、またはロックド核酸が
含まれてもよい。
cDNA鋳型は、直線化プラスミドがポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を受けることによって
合成されてもよい。任意の増幅のためのプライマー-プローブ設計は当業者の技術の範囲
内である。プローブは、標的分子に対する塩基対形成忠実度および塩基対形成強度を増大
させる化学的に修飾された塩基も含んでもよい。そのような修飾には、5-メチル-シチジ
ン、2,6-ジ-アミノ-プリン、2'-フルオロ、ホスホロチオアート、またはロックド核酸が
含まれてもよい。
【0368】
mRNA生成
mRNAまたはmmRNA生成のプロセスには、これらに限定されないが、インビトロでの転写
、cDNA鋳型除去およびRNAクリーンアップ、ならびにmRNAのキャッピングおよび/またはテ
ーリング反応が含まれ得る。
mRNAまたはmmRNA生成のプロセスには、これらに限定されないが、インビトロでの転写
、cDNA鋳型除去およびRNAクリーンアップ、ならびにmRNAのキャッピングおよび/またはテ
ーリング反応が含まれ得る。
【0369】
インビトロ転写
上記で生成したcDNAは、インビトロ転写（IVT）系を用いて転写され得る。系は典型的
には、転写バッファー、ヌクレオチド三リン酸（NTP）、RNaseインヒビター、およびポリ
メラーゼを含む。NTPは、インハウスで製造してもよく、供給者から選択されてもよく、
または本明細書に記載されているように合成されてもよい。NTPは、これらに限定されな
いが、天然のおよび非天然の（修飾した）NTPを含む、本明細書に記載されているNTPから
選択されてもよい。ポリメラーゼは、これらに限定されないが、T7 RNAポリメラーゼ、T3
RNAポリメラーゼ、および変異ポリメラーゼ、例えば、これらに限定されないが、修飾さ
れた核酸を取り込むことができるポリメラーゼなどから選択されてもよい。
上記で生成したcDNAは、インビトロ転写（IVT）系を用いて転写され得る。系は典型的
には、転写バッファー、ヌクレオチド三リン酸（NTP）、RNaseインヒビター、およびポリ
メラーゼを含む。NTPは、インハウスで製造してもよく、供給者から選択されてもよく、
または本明細書に記載されているように合成されてもよい。NTPは、これらに限定されな
いが、天然のおよび非天然の（修飾した）NTPを含む、本明細書に記載されているNTPから
選択されてもよい。ポリメラーゼは、これらに限定されないが、T7 RNAポリメラーゼ、T3
RNAポリメラーゼ、および変異ポリメラーゼ、例えば、これらに限定されないが、修飾さ
れた核酸を取り込むことができるポリメラーゼなどから選択されてもよい。
【0370】
5’キャッピング
mRNAの5’キャップ構造は、核外移行に関与し、mRNA安定性を向上させる。それは、mRN
Aキャップ結合タンパク質（CBP）に結合し、CBPのポリ(A）結合タンパク質と会合し成熟
環状mRNA種を形成することによって細胞内でのmRNA安定性および翻訳能力を担う。キャッ
プはさらに、mRNAスプライシング時に5'近位イントロンの除去を助ける。内在性mRNA分子
は、5'端キャッピングされ、mRNA分子の末端グアノシンキャップ残基と5'末端転写センス
ヌクレオチドとの間の5'-ppp-5'-三リン酸塩結合を生じ得る。次いで、この5'-グアニル
酸キャップはメチル化され、N7-メチル-グアニル酸残基を生じ得る。mRNAの5'端の末端お
よび/または末端前（anteterminal）の転写ヌクレオチドのリボース糖もまた任意で、2'-
0-メチル化されてもよい。グアニル酸キャップ構造の加水分解および切断による5'-キャ
ップ除去は、mRNA分子などの核酸分子を分解の標的にし得る。本発明のポリヌクレオチド
、一次構築物、およびmmRNAへの修飾は、キャップ除去を妨げ、よってmRNA半減期を増大
させる、非加水分解性のキャップ構造を生じ得る。キャップ構造の加水分解は、5'-ppp-5
'ホスホロジエステル結合の切断を必要とすることから、修飾ヌクレオチドは、キャップ
形成反応時に用いてもよい。例えば、New England Biolabs（Ipswich, Mass.）のVaccini
aキャッピング酵素は、製造者の説明書にしたがってα-チオ-グアノシンヌクレオチドと
一緒に用いて、5'-ppp-5’キャップにおいてホスホロチオアート結合をもたらし得る。さ
らなる修飾グアノシンヌクレオチド、α-メチルホスホン酸ヌクレオチドおよびセレノリ
ン酸ヌクレオチドなどが用いられ得る。さらなる修飾には、これらに限定されないが、糖
環の2'-ヒドロキシル基に対する（上述のような）mRNAの5'端の末端および/または5'末端
前のヌクレオチドのリボース糖の2'-0-メチル化が含まれる。複数の異なる5'-キャップ構
造を用いて、mRNA分子などの核酸分子の5'-キャップを作製することができる。
mRNAの5’キャップ構造は、核外移行に関与し、mRNA安定性を向上させる。それは、mRN
Aキャップ結合タンパク質（CBP）に結合し、CBPのポリ(A）結合タンパク質と会合し成熟
環状mRNA種を形成することによって細胞内でのmRNA安定性および翻訳能力を担う。キャッ
プはさらに、mRNAスプライシング時に5'近位イントロンの除去を助ける。内在性mRNA分子
は、5'端キャッピングされ、mRNA分子の末端グアノシンキャップ残基と5'末端転写センス
ヌクレオチドとの間の5'-ppp-5'-三リン酸塩結合を生じ得る。次いで、この5'-グアニル
酸キャップはメチル化され、N7-メチル-グアニル酸残基を生じ得る。mRNAの5'端の末端お
よび/または末端前（anteterminal）の転写ヌクレオチドのリボース糖もまた任意で、2'-
0-メチル化されてもよい。グアニル酸キャップ構造の加水分解および切断による5'-キャ
ップ除去は、mRNA分子などの核酸分子を分解の標的にし得る。本発明のポリヌクレオチド
、一次構築物、およびmmRNAへの修飾は、キャップ除去を妨げ、よってmRNA半減期を増大
させる、非加水分解性のキャップ構造を生じ得る。キャップ構造の加水分解は、5'-ppp-5
'ホスホロジエステル結合の切断を必要とすることから、修飾ヌクレオチドは、キャップ
形成反応時に用いてもよい。例えば、New England Biolabs（Ipswich, Mass.）のVaccini
aキャッピング酵素は、製造者の説明書にしたがってα-チオ-グアノシンヌクレオチドと
一緒に用いて、5'-ppp-5’キャップにおいてホスホロチオアート結合をもたらし得る。さ
らなる修飾グアノシンヌクレオチド、α-メチルホスホン酸ヌクレオチドおよびセレノリ
ン酸ヌクレオチドなどが用いられ得る。さらなる修飾には、これらに限定されないが、糖
環の2'-ヒドロキシル基に対する（上述のような）mRNAの5'端の末端および/または5'末端
前のヌクレオチドのリボース糖の2'-0-メチル化が含まれる。複数の異なる5'-キャップ構
造を用いて、mRNA分子などの核酸分子の5'-キャップを作製することができる。
【0371】
フランキング領域非翻訳領域（UTR）
遺伝子の非翻訳領域（UTR）は転写されるが、翻訳されない。5'UTRは転写開始点で始ま
り、開始コドンまで続くが、開始コドンを含まないのに対して、3' UTRは停止コドンの直
後から始まり、転写終結シグナルまで続く。UTRは、本発明のポリヌクレオチド、一次構
築物および/またはmRNA内に組み込まれ、分子の安定性を増強することができる。UTRはま
た、望ましくない器官部位に誤って導かれる場合に転写産物の制御された下方調節を確実
にするように組み入れられる。
遺伝子の非翻訳領域（UTR）は転写されるが、翻訳されない。5'UTRは転写開始点で始ま
り、開始コドンまで続くが、開始コドンを含まないのに対して、3' UTRは停止コドンの直
後から始まり、転写終結シグナルまで続く。UTRは、本発明のポリヌクレオチド、一次構
築物および/またはmRNA内に組み込まれ、分子の安定性を増強することができる。UTRはま
た、望ましくない器官部位に誤って導かれる場合に転写産物の制御された下方調節を確実
にするように組み入れられる。
【0372】
5' UTRおよび翻訳開始
特定の標的器官にて豊富に発現する遺伝子において典型的に認められる特徴を操作する
ことによって、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAの安定性およびタン
パク質生成を増強することができる。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部を
、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAのフランキング領域内に組み込ん
でもよい。
特定の標的器官にて豊富に発現する遺伝子において典型的に認められる特徴を操作する
ことによって、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAの安定性およびタン
パク質生成を増強することができる。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部を
、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAのフランキング領域内に組み込ん
でもよい。
【0373】
AUリッチ領域
AUリッチ領域（ARE）は3つのクラスに分けることができる（Chenet al., Mol. Cell.
Biol.15:5777-5788, 1995; Chen et al., Mol. Cell Biol. 15:2010-2018, 1995）：ク
ラスI AREは、Uリッチ領域内にAUUUAモチーフの複数の分散したコピーを含有する。C-Myc
およびMyoDはクラスIAREを含有する。クラスII AREは、2つ以上の重複するUUAUUUA(U/A
）(U/A）（SEQID NO：38 ）ノナマーを持つ。このタイプのAREを含有する分子には、GM-
CSFおよびTNF-αが含まれる。クラスIIIAREはあまりよく定義されていない。これらのU
リッチ領域はAUUUAモチーフを含有しない。c-Junおよびミオゲニンは、このクラスの2つ
のよく研究されている例である。AREに結合するタンパク質の大部分は、メッセンジャー
を不安定化することが公知であるのに対して、ELAVファミリーのメンバー、とりわけHuR
は、mRNAの安定性を向上させると記録されている。HuRは、3つのクラス全てのAREに結合
する。HuR特異的結合部位を核酸分子の3'UTR内に設計することによってHuR結合がもたら
され、よって、インビボでメッセージの安定化がもたらされるであろう。3' UTR AUリッ
チ領域（ARE）の導入、除去、または改変は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物ま
たはmmRNAの安定性を調節するために用いることができる。特定のポリヌクレオチド、一
次構築物またはmmRNAを設計するとき、AREの1つまたは複数のコピーを導入し、本発明の
ポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAの安定性を低下させ、それによって結果とし
て生じるタンパク質の翻訳を削減し、その生成を減少させることができる。同様に、結果
として生じるタンパク質の細胞内安定性を向上させ、それにより、その翻訳および生成を
増大させるために、AREを特定してい除去または変異することができる。トランスフェク
ション試験は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAを用いて、関連する
細胞株において実施することができ、タンパク質生成は翻訳後のさまざまな時点でアッセ
イすることができる。例えば、細胞は、さまざまなARE操作分子によって、かつ関連する
タンパク質に対するELISAキットを用いかつトランスフェクション後6時間、12時間、24時
間、48時間、および7日に生成したタンパク質をアッセイすることによって、トランスフ
ェクトすることができる。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmRNAは、天然
ポリマーおよび/または合成ポリマーを用いて製剤化できる。送達のために用いられ得る
ポリマーの非限定的な例には、これらに限定されないが、MIRUS(登録商標) Bio（Madison
, Wis.）およびRocheMadison（Madison, Wis.）のDYNAMIC POLYCONJUGATE(登録商標)（A
rrowheadResearch Corp., Pasadena, Calif.）製剤、PHASERX(商標)ポリマー製剤、例え
ば、これらに限定されないが、SMARTT POLYMER TECHNOLOGY(商標)（PHASERX.RTM., Seatt
le, Wash ）、DMRI/DOPE、ポロクサマー、Vical（SanDiego, Calif）のVAXFECTIN(登録
商標)アジュバント、キトサン、CalandoPharmaceuticals（Pasadena, Calif）のシクロ
デキストリン、デンドリマーおよびポリ(乳酸-co-グリコール酸)（PLGA）ポリマーRONDEL
(商標)（RNAi/オリゴヌクレオチドナノ粒子送達）ポリマー（ArrowheadResearch Corpor
ation,Pasadena, Calif.）、ならびにpH応答性コブロックポリマー、例えば、これらに
限定されないが、PHASERX(登録商標)（Seattle,Wash.）が含まれる。これらのポリマー
アプローチの多くは、オリゴヌクレオチドを細胞の細胞質内にインビボで送達するのに有
効であることが実証されている（deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132におい
て概説される：その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。核酸、この場合では
低分子干渉RNA（siRNA）のロバストなインビボ送達を生じさせる2つのポリマーアプロー
チは、ダイナミックポリコンジュゲート（dynamic poly conjugate）およびシクロデキス
トリンに基づくナノ粒子である。これらの送達アプローチの第1のアプローチは、ダイナ
ミックポリコンジュゲートを用いるものであり、siRNAを効率的に送達することおよび肝
細胞における内在性標的mRNAを発現停止させることがマウスにおいてインビボで示されて
いる（Rozemaet al., Proc Natl Acad Sci USA. 2007 104:12982-12887；その全体が参
照により本明細書に組み入れられる）。この特定のアプローチは、多成分ポリマー系であ
り、その重要な特徴には、核酸、この場合ではsiRNAがジスルフィド結合を介して共有結
合的に共役される膜活性化ポリマーが含まれ、ここで、（電荷マスキングのための）PEG
基および（肝細胞標的化のための）N-アセチルガラクトサミン基の両方ともpH応答性結合
を介して連結される（Rozema et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2007 104:12982-12887
；その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。肝細胞に結合しエンドソーム内に
侵入する際に、ポリマー複合体は、低pH環境下でその正電荷を露出するポリマーによって
分解され、ポリマーからのsiRNAのエンドソーム脱出および細胞質放出をもたらす。N-ア
セチルガラクトサミン基のマンノース基との置換によって、標的をアシアロ糖タンパク質
受容体発現肝細胞から類洞内皮細胞およびKupffer細胞に変更できることが示された。別
のポリマーアプローチは、トランスフェリン標的化シクロデキストリン含有ポリカチオン
ナノ粒子を使用することを伴う。これらのナノ粒子は、トランスフェリン受容体発現Ewin
g肉腫腫瘍細胞におけるEWS-FLI1遺伝子産物の標的化サイレンシングが実証されており（H
u-Lieskovan etal., Cancer Res. 2005 65: 8984-8982；その全体が参照により本明細書
に組み入れられる）、これらのナノ粒子中に製剤化されたsiRNAは、非ヒト霊長類におい
て十分な耐性を有した（Heidel et al., Proc Natl Acad Sci USA 2007 104:5715-21；そ
の全体が参照により本明細書に組み入れられる）。これらの送達戦略のどちらも、標的化
送達メカニズムおよびエンドソーム脱出メカニズムの両方を用いる合理的なアプローチを
組み入れる。
AUリッチ領域（ARE）は3つのクラスに分けることができる（Chenet al., Mol. Cell.
Biol.15:5777-5788, 1995; Chen et al., Mol. Cell Biol. 15:2010-2018, 1995）：ク
ラスI AREは、Uリッチ領域内にAUUUAモチーフの複数の分散したコピーを含有する。C-Myc
およびMyoDはクラスIAREを含有する。クラスII AREは、2つ以上の重複するUUAUUUA(U/A
）(U/A）（SEQID NO：38 ）ノナマーを持つ。このタイプのAREを含有する分子には、GM-
CSFおよびTNF-αが含まれる。クラスIIIAREはあまりよく定義されていない。これらのU
リッチ領域はAUUUAモチーフを含有しない。c-Junおよびミオゲニンは、このクラスの2つ
のよく研究されている例である。AREに結合するタンパク質の大部分は、メッセンジャー
を不安定化することが公知であるのに対して、ELAVファミリーのメンバー、とりわけHuR
は、mRNAの安定性を向上させると記録されている。HuRは、3つのクラス全てのAREに結合
する。HuR特異的結合部位を核酸分子の3'UTR内に設計することによってHuR結合がもたら
され、よって、インビボでメッセージの安定化がもたらされるであろう。3' UTR AUリッ
チ領域（ARE）の導入、除去、または改変は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物ま
たはmmRNAの安定性を調節するために用いることができる。特定のポリヌクレオチド、一
次構築物またはmmRNAを設計するとき、AREの1つまたは複数のコピーを導入し、本発明の
ポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAの安定性を低下させ、それによって結果とし
て生じるタンパク質の翻訳を削減し、その生成を減少させることができる。同様に、結果
として生じるタンパク質の細胞内安定性を向上させ、それにより、その翻訳および生成を
増大させるために、AREを特定してい除去または変異することができる。トランスフェク
ション試験は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物またはmmRNAを用いて、関連する
細胞株において実施することができ、タンパク質生成は翻訳後のさまざまな時点でアッセ
イすることができる。例えば、細胞は、さまざまなARE操作分子によって、かつ関連する
タンパク質に対するELISAキットを用いかつトランスフェクション後6時間、12時間、24時
間、48時間、および7日に生成したタンパク質をアッセイすることによって、トランスフ
ェクトすることができる。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmRNAは、天然
ポリマーおよび/または合成ポリマーを用いて製剤化できる。送達のために用いられ得る
ポリマーの非限定的な例には、これらに限定されないが、MIRUS(登録商標) Bio（Madison
, Wis.）およびRocheMadison（Madison, Wis.）のDYNAMIC POLYCONJUGATE(登録商標)（A
rrowheadResearch Corp., Pasadena, Calif.）製剤、PHASERX(商標)ポリマー製剤、例え
ば、これらに限定されないが、SMARTT POLYMER TECHNOLOGY(商標)（PHASERX.RTM., Seatt
le, Wash ）、DMRI/DOPE、ポロクサマー、Vical（SanDiego, Calif）のVAXFECTIN(登録
商標)アジュバント、キトサン、CalandoPharmaceuticals（Pasadena, Calif）のシクロ
デキストリン、デンドリマーおよびポリ(乳酸-co-グリコール酸)（PLGA）ポリマーRONDEL
(商標)（RNAi/オリゴヌクレオチドナノ粒子送達）ポリマー（ArrowheadResearch Corpor
ation,Pasadena, Calif.）、ならびにpH応答性コブロックポリマー、例えば、これらに
限定されないが、PHASERX(登録商標)（Seattle,Wash.）が含まれる。これらのポリマー
アプローチの多くは、オリゴヌクレオチドを細胞の細胞質内にインビボで送達するのに有
効であることが実証されている（deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132におい
て概説される：その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。核酸、この場合では
低分子干渉RNA（siRNA）のロバストなインビボ送達を生じさせる2つのポリマーアプロー
チは、ダイナミックポリコンジュゲート（dynamic poly conjugate）およびシクロデキス
トリンに基づくナノ粒子である。これらの送達アプローチの第1のアプローチは、ダイナ
ミックポリコンジュゲートを用いるものであり、siRNAを効率的に送達することおよび肝
細胞における内在性標的mRNAを発現停止させることがマウスにおいてインビボで示されて
いる（Rozemaet al., Proc Natl Acad Sci USA. 2007 104:12982-12887；その全体が参
照により本明細書に組み入れられる）。この特定のアプローチは、多成分ポリマー系であ
り、その重要な特徴には、核酸、この場合ではsiRNAがジスルフィド結合を介して共有結
合的に共役される膜活性化ポリマーが含まれ、ここで、（電荷マスキングのための）PEG
基および（肝細胞標的化のための）N-アセチルガラクトサミン基の両方ともpH応答性結合
を介して連結される（Rozema et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2007 104:12982-12887
；その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。肝細胞に結合しエンドソーム内に
侵入する際に、ポリマー複合体は、低pH環境下でその正電荷を露出するポリマーによって
分解され、ポリマーからのsiRNAのエンドソーム脱出および細胞質放出をもたらす。N-ア
セチルガラクトサミン基のマンノース基との置換によって、標的をアシアロ糖タンパク質
受容体発現肝細胞から類洞内皮細胞およびKupffer細胞に変更できることが示された。別
のポリマーアプローチは、トランスフェリン標的化シクロデキストリン含有ポリカチオン
ナノ粒子を使用することを伴う。これらのナノ粒子は、トランスフェリン受容体発現Ewin
g肉腫腫瘍細胞におけるEWS-FLI1遺伝子産物の標的化サイレンシングが実証されており（H
u-Lieskovan etal., Cancer Res. 2005 65: 8984-8982；その全体が参照により本明細書
に組み入れられる）、これらのナノ粒子中に製剤化されたsiRNAは、非ヒト霊長類におい
て十分な耐性を有した（Heidel et al., Proc Natl Acad Sci USA 2007 104:5715-21；そ
の全体が参照により本明細書に組み入れられる）。これらの送達戦略のどちらも、標的化
送達メカニズムおよびエンドソーム脱出メカニズムの両方を用いる合理的なアプローチを
組み入れる。
【0374】
実施例16－トランススプライシングアプローチによるOtof-/-マウスにおける聴力の回復
アプローチ
明細書に記載の方法を用いて試験を実施し、2つの異なるベクターの組み合わせを用い
てOtof-/-マウスにおいて聴力が回復しうるかどうかを決定した。
アプローチ
明細書に記載の方法を用いて試験を実施し、2つの異なるベクターの組み合わせを用い
てOtof-/-マウスにおいて聴力が回復しうるかどうかを決定した。
【0375】
材料および方法
クローニング
蝸牛cDNAからサブクローニングしたマウスオトフェリンcDNA転写産物バリアント4（KX
060996；参照配列NM_001313767と同一であるコーディングDNA配列（CDS））（Strenzke
et al. (2016)EMBO J. 35 2519-2535）を、制限酵素による消化およびライゲーションを
含む標準的なクローニング戦略を用いてAAV産生のために骨格内にサブクローニングした
。両方のベクターとも、血清型2のITRを含有する。CMVエンハンサーおよびヒトβアクチ
ンプロモーターを、eGFPcDNAおよびP2Aシグナルを含有する5'ベクター内にサブクローニ
ングした（図1）。オトフェリンCDSをエクソン21-エクソン22接合部でほぼ同じサイズの2
つの部分に分割した。5'ベクターは、オトフェリンのN末端部分（アミノ酸位置1～844位
）をコードし、3'ベクターは、アミノ酸位置845～1977位のコード配列およびウッドチャ
ック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）およびポリアデニル化シグナルを含有す
る。
クローニング
蝸牛cDNAからサブクローニングしたマウスオトフェリンcDNA転写産物バリアント4（KX
060996；参照配列NM_001313767と同一であるコーディングDNA配列（CDS））（Strenzke
et al. (2016)EMBO J. 35 2519-2535）を、制限酵素による消化およびライゲーションを
含む標準的なクローニング戦略を用いてAAV産生のために骨格内にサブクローニングした
。両方のベクターとも、血清型2のITRを含有する。CMVエンハンサーおよびヒトβアクチ
ンプロモーターを、eGFPcDNAおよびP2Aシグナルを含有する5'ベクター内にサブクローニ
ングした（図1）。オトフェリンCDSをエクソン21-エクソン22接合部でほぼ同じサイズの2
つの部分に分割した。5'ベクターは、オトフェリンのN末端部分（アミノ酸位置1～844位
）をコードし、3'ベクターは、アミノ酸位置845～1977位のコード配列およびウッドチャ
ック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）およびポリアデニル化シグナルを含有す
る。
【0376】
トランススプライシングアプローチでは、5'ベクターにおいて、スプライスドナー部位
（Trapaniet al. (2014) EMBO Mol. Med. 6(2):194-211, 2014）がコード配列に続く。3
'ベクターでは、スプライスアクセプター部位をオトフェリンのコード配列の直前にサブ
クローニングした。コード配列内では、制限酵素による消化用のさらなる部位を生じさせ
る、サイレント変異を導入した。
（Trapaniet al. (2014) EMBO Mol. Med. 6(2):194-211, 2014）がコード配列に続く。3
'ベクターでは、スプライスアクセプター部位をオトフェリンのコード配列の直前にサブ
クローニングした。コード配列内では、制限酵素による消化用のさらなる部位を生じさせ
る、サイレント変異を導入した。
【0377】
ハイブリッドアプローチでは、相同組換え用のF1ファージ組換え誘導領域を、5'ベクタ
ー中のスプライスドナー部位の直後かつ3 'ベクターのスプライスアクセプター部位の前
にサブクローニングした（図2）。プラスミド同一性をSanger配列決定によって検証した
。
ー中のスプライスドナー部位の直後かつ3 'ベクターのスプライスアクセプター部位の前
にサブクローニングした（図2）。プラスミド同一性をSanger配列決定によって検証した
。
【0378】
ウイルスの産生および精製
多層式セルファクトリーで増殖させたHEK293細胞の一過性トランスフェクションによっ
て、デュアルAAVベクターを産生させた。血清型6カプシドタンパク質をコードするウイル
ス産生のために、細胞にヘルパープラスミドを同時形質導入した。イオジキサノール密度
勾配超遠心分離、続いて、FPLCアフィニティークロマトグラフィーによる第2の精製およ
び濃縮工程によって、細胞可溶化液の精製を実施した（Asai et al. (2015) Nat. Neuros
ci. 181584-1593; Tereshchenko et al. (2014) Neurobiol. Dis. 65 35-42）。トラン
ススプライシングアプローチでは、5'ベクターは、約2.8×108形質導入単位/μLの濃度を
達成した。3 'ベクターは、約1.4×108形質導入単位/μLに到達した。ハイブリッドアプ
ローチでは、両方のウイルスが同じ溶液中で同時に精製され、わずかに高いウイルス力価
に到達した。
多層式セルファクトリーで増殖させたHEK293細胞の一過性トランスフェクションによっ
て、デュアルAAVベクターを産生させた。血清型6カプシドタンパク質をコードするウイル
ス産生のために、細胞にヘルパープラスミドを同時形質導入した。イオジキサノール密度
勾配超遠心分離、続いて、FPLCアフィニティークロマトグラフィーによる第2の精製およ
び濃縮工程によって、細胞可溶化液の精製を実施した（Asai et al. (2015) Nat. Neuros
ci. 181584-1593; Tereshchenko et al. (2014) Neurobiol. Dis. 65 35-42）。トラン
ススプライシングアプローチでは、5'ベクターは、約2.8×108形質導入単位/μLの濃度を
達成した。3 'ベクターは、約1.4×108形質導入単位/μLに到達した。ハイブリッドアプ
ローチでは、両方のウイルスが同じ溶液中で同時に精製され、わずかに高いウイルス力価
に到達した。
【0379】
マウス系統
記載されているように（Reisinger et al. (2011) J. Neurosci. 31 4886-4895）オト
フェリンノックアウト（Otof-/-）マウスを作製し、C57/Bl6N系統またはCD1系統のいずれ
かと少なくとも5世代戻し交配した。ウイルス注入では、Otof-/-CD1雌およびOtof-/-C57/
Bl6N雄からのF1子孫を用いた。野生型対照では、Otof+/-C57/Bl6N繁殖からのOtof+/+マウ
スをCD1野生型マウス（CharlesRiver）と交配させた。
記載されているように（Reisinger et al. (2011) J. Neurosci. 31 4886-4895）オト
フェリンノックアウト（Otof-/-）マウスを作製し、C57/Bl6N系統またはCD1系統のいずれ
かと少なくとも5世代戻し交配した。ウイルス注入では、Otof-/-CD1雌およびOtof-/-C57/
Bl6N雄からのF1子孫を用いた。野生型対照では、Otof+/-C57/Bl6N繁殖からのOtof+/+マウ
スをCD1野生型マウス（CharlesRiver）と交配させた。
【0380】
ウイルス注入
生後6～7日のマウス（P6～7）を2.5％～5％イソフルランを用いて麻酔した。左側鼓室
胞の後ろの皮膚を開口し、正円窓小窩を露出させた。ガラス製キャピラリー中のウイルス
溶液を、圧力源としてPLI-100A BASIC PICOLITERマイクロインジェクター（Harvard Appa
ratus GmbH,Germany）を用いて正円窓膜を通って注入し、それによって内耳当たり約0.2
～0.5 μLの溶液を注入した（Junget al. (2015) EMBO J. 34 2686-2702）。皮膚を閉じ
、仔を母が育てた。
生後6～7日のマウス（P6～7）を2.5％～5％イソフルランを用いて麻酔した。左側鼓室
胞の後ろの皮膚を開口し、正円窓小窩を露出させた。ガラス製キャピラリー中のウイルス
溶液を、圧力源としてPLI-100A BASIC PICOLITERマイクロインジェクター（Harvard Appa
ratus GmbH,Germany）を用いて正円窓膜を通って注入し、それによって内耳当たり約0.2
～0.5 μLの溶液を注入した（Junget al. (2015) EMBO J. 34 2686-2702）。皮膚を閉じ
、仔を母が育てた。
【0381】
免疫組織化学的検査
免疫染色を以前に記載されているように実施した（Strenzke et al. (2016) EMBO J. 3
5 2519-2535）。側頭骨を断頭後単離し、蝸牛の骨性ラセン板（bonyshelf）の一部を開
口し、正円窓を穿孔した。側頭骨をPBS中の4％ホルムアルデヒドで4℃にて45分間固定す
る。P20を超えるマウスの蝸牛を、Morse溶液中で5分間または0.12M EDTA溶液中で2日間
のいずれかで脱灰した。17％正常なヤギ血清、0.3％ Triton X-100、0.45 mM NaCl、およ
び20 mMリン酸緩衝液、pH7.4でブロッキングを行った。頂回転および基底回転を切除す
る前に、抗体をブロッキング液で希釈し、側頭骨中に位置するコルチ器に適用した。以下
の抗体を用いた：ヤギIgG1抗Ctbp2マウス抗オトフェリン（RRID:AB_881807, Abcam, Camb
ridge, UK, 1：300）、ウサギ抗オトフェリン（SynapticSystems, Gottingen, Germany,
1：100）、ヤギ抗カルビンディンD28k、ならびにAlexaFluor(登録商標)405、AlexaFluor
(登録商標)488-、AlexaFluor(登録商標)568-、AlexaFluor(登録商標)594-、およびAlexaF
luor647-標識二次抗体（Invitrogen,1：200）。63×グリセロール液浸対物レンズを有す
るレーザー走査型共焦点顕微鏡（Leica TCS SP5, Leica Microsystems CMS GmbH, Mannhe
im, Germany）を用いて、0.6μmのステップサイズで2D画像のスタックとして、共焦点顕
微鏡画像を取得した（NA＝1.456）。14～16日齢の内有毛細胞（IHC）におけるシナプスの
数を、ImageJソフトウエアにプラグインした細胞計数器を用いて、Ctbp2スポットの数と
して計数した。膜結合型オトフェリンの分画レベルを決定するための画像分析はStrenzke
et al.(2016a) EMBO J. 35 2519-2535に記載されている。
免疫染色を以前に記載されているように実施した（Strenzke et al. (2016) EMBO J. 3
5 2519-2535）。側頭骨を断頭後単離し、蝸牛の骨性ラセン板（bonyshelf）の一部を開
口し、正円窓を穿孔した。側頭骨をPBS中の4％ホルムアルデヒドで4℃にて45分間固定す
る。P20を超えるマウスの蝸牛を、Morse溶液中で5分間または0.12M EDTA溶液中で2日間
のいずれかで脱灰した。17％正常なヤギ血清、0.3％ Triton X-100、0.45 mM NaCl、およ
び20 mMリン酸緩衝液、pH7.4でブロッキングを行った。頂回転および基底回転を切除す
る前に、抗体をブロッキング液で希釈し、側頭骨中に位置するコルチ器に適用した。以下
の抗体を用いた：ヤギIgG1抗Ctbp2マウス抗オトフェリン（RRID:AB_881807, Abcam, Camb
ridge, UK, 1：300）、ウサギ抗オトフェリン（SynapticSystems, Gottingen, Germany,
1：100）、ヤギ抗カルビンディンD28k、ならびにAlexaFluor(登録商標)405、AlexaFluor
(登録商標)488-、AlexaFluor(登録商標)568-、AlexaFluor(登録商標)594-、およびAlexaF
luor647-標識二次抗体（Invitrogen,1：200）。63×グリセロール液浸対物レンズを有す
るレーザー走査型共焦点顕微鏡（Leica TCS SP5, Leica Microsystems CMS GmbH, Mannhe
im, Germany）を用いて、0.6μmのステップサイズで2D画像のスタックとして、共焦点顕
微鏡画像を取得した（NA＝1.456）。14～16日齢の内有毛細胞（IHC）におけるシナプスの
数を、ImageJソフトウエアにプラグインした細胞計数器を用いて、Ctbp2スポットの数と
して計数した。膜結合型オトフェリンの分画レベルを決定するための画像分析はStrenzke
et al.(2016a) EMBO J. 35 2519-2535に記載されている。
【0382】
電気生理
IHCからのCa2+電流および細胞膜容量を、記載のように（(Moser& Beutner (2000) Pro
c Natl Acad SciU S A 97 883-888)、穿孔パッチ配置での新鮮に解剖したコルチ器の頂
回転由来のIHCのパッチクランプによって室温（20～25℃）にて測定した。ピペット溶液
は、130 mMCs-グルコン酸、10 mMテトラエチルアンモニウム-クロリド（TEA-Cl）、10 m
M 4-アミノピリジン（Merck,Darmstadt, Germany）、1 mM MgCl2、10 mM Cs-HEPES（pH
7.17、容量オスモル濃度およそ290mOsm）、300 μg/mLアンホテリシンB（Calbiochem, L
a Jolla, CA）を含有した。細胞外溶液は、110mM NaCl、35 mM TEA-Cl、2.8 mM KCl、2
mM CaCl2、1mM MgCl2、10 mM Na-HEPES、1 mM CsCl、11.1 mM D-グルコース（pH 7.2、
容量オスモル濃度およそ300 mOsm）を含有した。他に記載のない限り、全ての化学物質は
Sigma-Aldrich（Taufkirchen,Germany）から入手した。Pulseソフトウエアによって制御
されるEPC-9増幅器（HEKAElectronics, Lambrecht, Germany）をそれぞれ20 kHzおよび5
kHzで用いて、電流をサンプリングおよび選別した。電位を液間電位差で補正した(-14m
V）。以前に記載されている（Beutner& Moser (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97 88
3-888）ように、ピークCa2+電流電位までの持続期間が異なる脱分極を用いて、30～60秒
の刺激時間間隔で、ΔCmを測定した。全ての電流をP/6プロトコールを用いて漏出補正し
た。100 ms脱分化時のΔCmから20ms脱分化でのΔCmを引いて、小胞当たり45 aFで割るこ
とによって小胞補充速度を計算し（(Neef et al. (2007) The Journal of Neuroscience
27 12933-12944)、小胞の数を得た。細胞毎のアクティブゾーンの数を免疫組織化学的検
査によって決定した（形質導入したOtof-/- IHCでは10のシナプス、Otof+/+ IHCでは14の
シナプス）。
IHCからのCa2+電流および細胞膜容量を、記載のように（(Moser& Beutner (2000) Pro
c Natl Acad SciU S A 97 883-888)、穿孔パッチ配置での新鮮に解剖したコルチ器の頂
回転由来のIHCのパッチクランプによって室温（20～25℃）にて測定した。ピペット溶液
は、130 mMCs-グルコン酸、10 mMテトラエチルアンモニウム-クロリド（TEA-Cl）、10 m
M 4-アミノピリジン（Merck,Darmstadt, Germany）、1 mM MgCl2、10 mM Cs-HEPES（pH
7.17、容量オスモル濃度およそ290mOsm）、300 μg/mLアンホテリシンB（Calbiochem, L
a Jolla, CA）を含有した。細胞外溶液は、110mM NaCl、35 mM TEA-Cl、2.8 mM KCl、2
mM CaCl2、1mM MgCl2、10 mM Na-HEPES、1 mM CsCl、11.1 mM D-グルコース（pH 7.2、
容量オスモル濃度およそ300 mOsm）を含有した。他に記載のない限り、全ての化学物質は
Sigma-Aldrich（Taufkirchen,Germany）から入手した。Pulseソフトウエアによって制御
されるEPC-9増幅器（HEKAElectronics, Lambrecht, Germany）をそれぞれ20 kHzおよび5
kHzで用いて、電流をサンプリングおよび選別した。電位を液間電位差で補正した(-14m
V）。以前に記載されている（Beutner& Moser (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97 88
3-888）ように、ピークCa2+電流電位までの持続期間が異なる脱分極を用いて、30～60秒
の刺激時間間隔で、ΔCmを測定した。全ての電流をP/6プロトコールを用いて漏出補正し
た。100 ms脱分化時のΔCmから20ms脱分化でのΔCmを引いて、小胞当たり45 aFで割るこ
とによって小胞補充速度を計算し（(Neef et al. (2007) The Journal of Neuroscience
27 12933-12944)、小胞の数を得た。細胞毎のアクティブゾーンの数を免疫組織化学的検
査によって決定した（形質導入したOtof-/- IHCでは10のシナプス、Otof+/+ IHCでは14の
シナプス）。
【0383】
ABR記録
聴性脳幹反応を記載（(Jing et al. (2013) J Neurosci 33 4456-4467)のように記録し
た。
聴性脳幹反応を記載（(Jing et al. (2013) J Neurosci 33 4456-4467)のように記録し
た。
【0384】
RNA単離、逆転写、PCRおよび配列決定
総RNAを急性的に解剖したコルチ器からInvitrogen(商標)TRIzol(商標) Plus RNA Puri
ficationキット（ThermoFisher Scientific, 12183555）によって製造者の説明書にした
がって単離し、SuperScript(登録商標)IV First-Strand Synthesis System（ThermoFish
er Scientific,18091050）を用いるcDNA合成の鋳型として、オリゴ(dT)20およびRandom
Hexamerプライマーと一緒に用いた。cDNAをさらに、以下のプライマー：
を用い、DreamTaq(登録商標)ポリメラーゼ（ThermoFisher Scientific, EP0702）を用い
るPCR増幅反応に用いた。
総RNAを急性的に解剖したコルチ器からInvitrogen(商標)TRIzol(商標) Plus RNA Puri
ficationキット（ThermoFisher Scientific, 12183555）によって製造者の説明書にした
がって単離し、SuperScript(登録商標)IV First-Strand Synthesis System（ThermoFish
er Scientific,18091050）を用いるcDNA合成の鋳型として、オリゴ(dT)20およびRandom
Hexamerプライマーと一緒に用いた。cDNAをさらに、以下のプライマー：
を用い、DreamTaq(登録商標)ポリメラーゼ（ThermoFisher Scientific, EP0702）を用い
るPCR増幅反応に用いた。
【0385】
全てのバンドを切り出し、TOPO(登録商標)TA(登録商標) Cloningキット（Thermo Fishe
r Scientific,450641）を用いてpCR2.1(商標)-TOPO(登録商標)ベクター内にクローニン
グし、OneShot(商標)TOP10 Electrocomp(商標)E. coli細胞（Thermo Fisher Scientific
, C404050）内にショットした。全てのクローンを正確な挿入についてスクリーニングし
、Sanger配列決定によって検証する。
r Scientific,450641）を用いてpCR2.1(商標)-TOPO(登録商標)ベクター内にクローニン
グし、OneShot(商標)TOP10 Electrocomp(商標)E. coli細胞（Thermo Fisher Scientific
, C404050）内にショットした。全てのクローンを正確な挿入についてスクリーニングし
、Sanger配列決定によって検証する。
【0386】
結果
トランススプライシングアプローチを試験するために、それぞれがオトフェリンCDSの
半分を含む、デュアルAAVベクターを作製した。第1のベクターでは、ヒトβアクチンプロ
モーターおよびCMVエンハンサーを用いて、P2A配列によって分離されるeGFPおよび5'オト
フェリン断片の発現を駆動した（図1）。第2のベクターは、3'オトフェリンCDS要素およ
びmRNA安定化要素を含有した。AAVベクターは、末端逆位配列（ITR）の非相同末端結合に
よって標的細胞の核内でヘッドトゥテール（head-to-tail）型の多量体化を受け、それに
よって、2つのベクターゲノムの会合を促進する。5'ベクター中のスプライスドナー部位
および3'ベクター中のスプライスアクセプター部位は、正確な全長オトフェリンmRNAのプ
ロセシングを押し進めるために含まれる（図1）。
トランススプライシングアプローチを試験するために、それぞれがオトフェリンCDSの
半分を含む、デュアルAAVベクターを作製した。第1のベクターでは、ヒトβアクチンプロ
モーターおよびCMVエンハンサーを用いて、P2A配列によって分離されるeGFPおよび5'オト
フェリン断片の発現を駆動した（図1）。第2のベクターは、3'オトフェリンCDS要素およ
びmRNA安定化要素を含有した。AAVベクターは、末端逆位配列（ITR）の非相同末端結合に
よって標的細胞の核内でヘッドトゥテール（head-to-tail）型の多量体化を受け、それに
よって、2つのベクターゲノムの会合を促進する。5'ベクター中のスプライスドナー部位
および3'ベクター中のスプライスアクセプター部位は、正確な全長オトフェリンmRNAのプ
ロセシングを押し進めるために含まれる（図1）。
【0387】
生後6～7日のオトフェリンノックアウトOtof-/-動物（P6-7）に、左耳の正円窓膜を通
って両方のAAV（約1.4～2.8×108形質導入単位/μL）を同時注入した（図3）。注入を行
わなかったOtof-/-同腹仔および野生型動物は、その一部にeGFPコードAAVを注入し、対照
とした。P23-28で、聴性脳幹記録（ABR）を用いて聴力を試験し、免疫組織化学的検査を
用いて内有毛細胞（IHC）伝達速度およびオトフェリン発現レベルを試験した。図3に示す
ように、形質導入しなかったOtof-/-マウスでは、ABR記録は、IHCの脱分化を原因とする
顕著な加重電位（SP）を誘発したが、これらのシグナルは、脳幹に伝達されず、フラット
な線形に終わった。デュアルAAV形質導入後、マウスは典型的なABR波形を示し、聴覚情報
が脳幹へ処理されたことを示した。
って両方のAAV（約1.4～2.8×108形質導入単位/μL）を同時注入した（図3）。注入を行
わなかったOtof-/-同腹仔および野生型動物は、その一部にeGFPコードAAVを注入し、対照
とした。P23-28で、聴性脳幹記録（ABR）を用いて聴力を試験し、免疫組織化学的検査を
用いて内有毛細胞（IHC）伝達速度およびオトフェリン発現レベルを試験した。図3に示す
ように、形質導入しなかったOtof-/-マウスでは、ABR記録は、IHCの脱分化を原因とする
顕著な加重電位（SP）を誘発したが、これらのシグナルは、脳幹に伝達されず、フラット
な線形に終わった。デュアルAAV形質導入後、マウスは典型的なABR波形を示し、聴覚情報
が脳幹へ処理されたことを示した。
【0388】
クリック刺激に対する反応では、成功裏に形質導入した耳における閾値は54±3 dB（範
囲：30～70dB）であった。対照実験では、形質導入を行っていないOtof-/-同腹仔動物は
、加重電位以外は100dB音刺激ですらABR波形を示さなかった。純音刺激は、大部分の形
質導入した耳でABR反応を誘発したが、形質導入を行っていないOtof-/-同腹仔対照ではそ
うではなかった（図3～6）。純音ABRは、低周波数（6kHz）、中周波数（12kHz）、および
高周波数（24kHz）で検出可能であった。Otof+/+対照は、39±1dB（範囲：30～40dB）の
閾値で正常なABR波形を示した（図4および5）。図4に示すように、形質導入したOtof-/-
マウスにおけるABR波形の振幅は、高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP）を有するデュアルA
AVを形質導入した野生型Otofwt/wtマウスより小さい。
囲：30～70dB）であった。対照実験では、形質導入を行っていないOtof-/-同腹仔動物は
、加重電位以外は100dB音刺激ですらABR波形を示さなかった。純音刺激は、大部分の形
質導入した耳でABR反応を誘発したが、形質導入を行っていないOtof-/-同腹仔対照ではそ
うではなかった（図3～6）。純音ABRは、低周波数（6kHz）、中周波数（12kHz）、および
高周波数（24kHz）で検出可能であった。Otof+/+対照は、39±1dB（範囲：30～40dB）の
閾値で正常なABR波形を示した（図4および5）。図4に示すように、形質導入したOtof-/-
マウスにおけるABR波形の振幅は、高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP）を有するデュアルA
AVを形質導入した野生型Otofwt/wtマウスより小さい。
【0389】
正しい配向での全長オトフェリンmRNAの正確なコンカテマー化および再構築を試験する
ために、形質導入したおよび形質導入していないP14 Otof-/-コルチ器からmRNAを抽出し
た。cDNAへの逆転写後、オトフェリンmRNA由来の3つのフラグメントを増幅した：1つは5'
ウイルスによってコードされ、1つは3'ウイルスによってコードされ、1つのフラグメント
は2つのベクターの会合部位を包含する。PCRアンプリコンのSanger配列決定によって、ウ
イルスにより形質導入されたオトフェリンのサイレント変異を含有する正確なオトフェリ
ン転写産物が明らかにされ、デュアルAAV形質導入したオトフェリンmRNAの正確な構築が
示された。
ために、形質導入したおよび形質導入していないP14 Otof-/-コルチ器からmRNAを抽出し
た。cDNAへの逆転写後、オトフェリンmRNA由来の3つのフラグメントを増幅した：1つは5'
ウイルスによってコードされ、1つは3'ウイルスによってコードされ、1つのフラグメント
は2つのベクターの会合部位を包含する。PCRアンプリコンのSanger配列決定によって、ウ
イルスにより形質導入されたオトフェリンのサイレント変異を含有する正確なオトフェリ
ン転写産物が明らかにされ、デュアルAAV形質導入したオトフェリンmRNAの正確な構築が
示された。
【0390】
内有毛細胞（IHC）の形質導入比率およびオトフェリン発現レベルを試験するために、
コルチ器をP18-28で解剖し、一方がオトフェリンのN末端部分に結合し、もう一方がオト
フェリンのちょうどC末端部分に結合する、2つの抗オトフェリン抗体を用いる免疫組織化
学的検査によって分析した（図6および図7）。図7に示すように、カルビンディンを内有
毛細胞および外有毛細胞のマーカーとして用いた。eGFPを発現する細胞は、少なくとも5'
ウイルスのウイルス形質導入を示した。オトフェリンのN末端側半分における抗オトフェ
リン抗体染色（Abcam）は、オトフェリンのN末端部分の発現を示した。C末端抗オトフェ
リン抗体染色（SynapticSystems）は、オトフェリンのC末端部分の発現を示した。まと
めると、図7における3つのパネルは全て、全長オトフェリンがIHCにおいて発現したこと
を実証した。12～51％（平均で32±4％,s.e.m.）のIHCが、基底回転における比率（24±
6％、範囲：0～51％）より高いIHC形質導入率（低周波数領域、35±5％形質導入率；範囲
：19～52％）での全長オトフェリン発現を蝸牛の先端において示した。全IHCのうち約10
％がN末端オトフェリンシグナルを示したが、C末端オトフェリン発現を示さず、5'ベクタ
ーのみの形質導入を推定的に示した。Otof-/-対照同腹仔ではいかなるシグナルも観察さ
れなかった。注目すべきことに、N末端オトフェリンシグナルおよびC末端オトフェリンシ
グナルの両方はIHCでのみ認められたのに対して、eGFP蛍光は、外有毛細胞（OHC）ならび
にオトフェリンを同時に発現しなかった他の細胞型でも追加的に認められた。したがって
、AAVはコルチ器にある複数の細胞型において形質導入されたにもかかわらず、オトフェ
リンの発現はIHCに限定された。オトフェリン発現レベルを定量化するために、免疫染色
したIHCの共焦点スタックでのN末端抗オトフェリン抗体を用いる免疫蛍光を測定した（St
renzke et al.(2016) EMBO J. 35 2519-2535のように)。デュアルAAV形質導入Otof-/-IH
Cでは、オトフェリンレベルは、野生型対照の約30％であることが認められた。
コルチ器をP18-28で解剖し、一方がオトフェリンのN末端部分に結合し、もう一方がオト
フェリンのちょうどC末端部分に結合する、2つの抗オトフェリン抗体を用いる免疫組織化
学的検査によって分析した（図6および図7）。図7に示すように、カルビンディンを内有
毛細胞および外有毛細胞のマーカーとして用いた。eGFPを発現する細胞は、少なくとも5'
ウイルスのウイルス形質導入を示した。オトフェリンのN末端側半分における抗オトフェ
リン抗体染色（Abcam）は、オトフェリンのN末端部分の発現を示した。C末端抗オトフェ
リン抗体染色（SynapticSystems）は、オトフェリンのC末端部分の発現を示した。まと
めると、図7における3つのパネルは全て、全長オトフェリンがIHCにおいて発現したこと
を実証した。12～51％（平均で32±4％,s.e.m.）のIHCが、基底回転における比率（24±
6％、範囲：0～51％）より高いIHC形質導入率（低周波数領域、35±5％形質導入率；範囲
：19～52％）での全長オトフェリン発現を蝸牛の先端において示した。全IHCのうち約10
％がN末端オトフェリンシグナルを示したが、C末端オトフェリン発現を示さず、5'ベクタ
ーのみの形質導入を推定的に示した。Otof-/-対照同腹仔ではいかなるシグナルも観察さ
れなかった。注目すべきことに、N末端オトフェリンシグナルおよびC末端オトフェリンシ
グナルの両方はIHCでのみ認められたのに対して、eGFP蛍光は、外有毛細胞（OHC）ならび
にオトフェリンを同時に発現しなかった他の細胞型でも追加的に認められた。したがって
、AAVはコルチ器にある複数の細胞型において形質導入されたにもかかわらず、オトフェ
リンの発現はIHCに限定された。オトフェリン発現レベルを定量化するために、免疫染色
したIHCの共焦点スタックでのN末端抗オトフェリン抗体を用いる免疫蛍光を測定した（St
renzke et al.(2016) EMBO J. 35 2519-2535のように)。デュアルAAV形質導入Otof-/-IH
Cでは、オトフェリンレベルは、野生型対照の約30％であることが認められた。
【0391】
Otof-/-マウスにおけるシナプスは、生後第2週間で部分的に失われることから、これら
のIHCにおけるオトフェリンの発現がシナプス数に影響を与えるかどうかを決定する実験
を行った。シナプスリボンを免疫標識した；9±0.3シナプスが、26日齢の形質導入してい
ないOtof-/-IHCにおいて認められた（n＝42細胞、N＝3動物）。デュアルAAV形質導入Otof
-/-では、10±0.2シナプスがeGFP蛍光によって特定された（n＝59細胞；N＝3動物）。こ
れに対して、野生型IHCは、IHC当たり13～16シナプスを呈した（Strenzkeet al. (2016)
EMBO J.35 2519-2535）。したがって、P6でのデュアルAAV注入後のオトフェリンの発現
は、P26Otof-/-IHCからのシナプスの喪失を部分的に防いだ。
のIHCにおけるオトフェリンの発現がシナプス数に影響を与えるかどうかを決定する実験
を行った。シナプスリボンを免疫標識した；9±0.3シナプスが、26日齢の形質導入してい
ないOtof-/-IHCにおいて認められた（n＝42細胞、N＝3動物）。デュアルAAV形質導入Otof
-/-では、10±0.2シナプスがeGFP蛍光によって特定された（n＝59細胞；N＝3動物）。こ
れに対して、野生型IHCは、IHC当たり13～16シナプスを呈した（Strenzkeet al. (2016)
EMBO J.35 2519-2535）。したがって、P6でのデュアルAAV注入後のオトフェリンの発現
は、P26Otof-/-IHCからのシナプスの喪失を部分的に防いだ。
【0392】
【0393】
これらのデータは、本願特許請求の範囲に記載されている方法が、オトフェリン遺伝子
における不活性化変異を有する哺乳動物における聴力を回復できることを示す。
における不活性化変異を有する哺乳動物における聴力を回復できることを示す。
【0394】
実施例17－Otof-/-マウスのIHCにおけるオトフェリンのトランススプライシングデュアル
AAV媒介性発現により回復した短い脱分極刺激に対する反応におけるエキソサイトーシス
の回復
本願特許請求の範囲に記載されている方法がOtof-/-マウスにおける内聴覚有毛細胞に
よるシナプス小胞の融合を回復させるかどうかを決定する試験を実施した。
AAV媒介性発現により回復した短い脱分極刺激に対する反応におけるエキソサイトーシス
の回復
本願特許請求の範囲に記載されている方法がOtof-/-マウスにおける内聴覚有毛細胞に
よるシナプス小胞の融合を回復させるかどうかを決定する試験を実施した。
【0395】
シナプス小胞の融合は細胞の細胞膜表面を増大させることから、この融合は、細胞膜容
量（ΔCm）の増加として測定することができる。小胞の即時放出可能プールのエキソサイ
トーシスおよび持続的エキソサイトーシスを定量化するために、細胞膜容量の変化（ΔCm
）を、穿孔パッチクランプ配置で測定した（図8～10）。エキソサイトーシスを、指示さ
れた期間IHCを-14mVに脱分極させた後の膜容量の変化として記録した。
量（ΔCm）の増加として測定することができる。小胞の即時放出可能プールのエキソサイ
トーシスおよび持続的エキソサイトーシスを定量化するために、細胞膜容量の変化（ΔCm
）を、穿孔パッチクランプ配置で測定した（図8～10）。エキソサイトーシスを、指示さ
れた期間IHCを-14mVに脱分極させた後の膜容量の変化として記録した。
【0396】
マウスの急性的に外植したコルチ器からのIHCを生後14～18日目（P14-P18）に、最大Ca
2+電流が誘発される電位、典型的には、-14 mVに脱分極させた。ウイルス形質導入を有す
るおよび有さないOtof-/-IHCからのCa2+電流およびΔCmを記録した、ウイルス形質導入
したIHCは試験時のそのeGFP蛍光によって特定された。未処置のOtof-/-IHCのおよび形質
導入したOtof-/-IHCにおけるシナプス数と一致して、Ca2+電流は、Otof+/+の年齢および
背景を適合させた対照のものと大きさが同等であることが認められた（図8および10）。
図8に示すように、Ca2+電流は、形質導入していないOtof-/-IHC、デュアルAAVを形質導
入したIHC、または背景を適合させた対照動物からの野生型IHCとの間で振幅またはゲート
特性では異なっていなかった。5または10 msの脱分極パルスに対する反応では、形質導入
したOtof-/-IHCにおけるエキソサイトーシスは、Otof+/+ IHCと同様の大きさであること
が認められた一方で、形質導入されていないOtof-/- IHCでは、Cmの変化はほとんど検出
されなかった（図9）。実際、最大で20msの短い脱分極刺激では、エキソサイトーシスは
、Otof-/-マウスのデュアルAAV形質転換したIHCにおいて野生型と同様であり、インタク
トな小胞の即時放出可能プールが示された。持続的脱分極の間、即時放出可能プールの小
胞は補充する必要があある；オトフェリンは、このプロセスに必要とされることが公知で
ある（Pangrsicet al. (2010) Nat. Neurosci. 13 869-876; Strenzke et al. (2016) E
MBO J. 352519-2535）。より長い脱分極刺激では、エキソサイトーシスは、軽度の聴力
不全を有するOtofI515T/I515Tマウスの範囲内であった（Strenzke et al. (2016) EMBO
J. 35 2519-2535）。図9に示すように、50～100ms脱分極では、形質導入したOtof-/- IH
Cにおけるエキソサイトーシスは、Otof+/+IHCの約60％であることが認められた一方で、
形質導入していないOtof-/-IHCは、以前に記載されている（Roux et al. (2006) Cell 1
27 277-289）ように、いかなる小胞融合も示さなかった。小胞補充の速度は、個々の形質
転換した細胞において計算された。Otof+/+ IHCでの750小胞/秒/アクティブゾーン（(Str
enzke et al.(2016) EMBO J. 35 2519-2535)と比較して、およそ380小胞/秒/アクティブ
ゾーンが、エキソサイトーシスを受けることが認められた。したがって、形質導入したOt
of-/-IHCでは、RRPへの小胞補充の速度は一部回復され、野生型対照のものと軽度の聴力
不全を有するOtofI515T/I515Tマウスとの間であった（Strenzke et al. (2016) EMBO J.
352519-2535）。図10に示すように、脱分極段階でのCa2+積分値は、形質導入したOtof-
/- IHC、形質導入していないOtof-/- IHC、および野生型対照細胞において、ほぼ同等のC
a2+の電荷がIHC内に侵入したことを示す。
2+電流が誘発される電位、典型的には、-14 mVに脱分極させた。ウイルス形質導入を有す
るおよび有さないOtof-/-IHCからのCa2+電流およびΔCmを記録した、ウイルス形質導入
したIHCは試験時のそのeGFP蛍光によって特定された。未処置のOtof-/-IHCのおよび形質
導入したOtof-/-IHCにおけるシナプス数と一致して、Ca2+電流は、Otof+/+の年齢および
背景を適合させた対照のものと大きさが同等であることが認められた（図8および10）。
図8に示すように、Ca2+電流は、形質導入していないOtof-/-IHC、デュアルAAVを形質導
入したIHC、または背景を適合させた対照動物からの野生型IHCとの間で振幅またはゲート
特性では異なっていなかった。5または10 msの脱分極パルスに対する反応では、形質導入
したOtof-/-IHCにおけるエキソサイトーシスは、Otof+/+ IHCと同様の大きさであること
が認められた一方で、形質導入されていないOtof-/- IHCでは、Cmの変化はほとんど検出
されなかった（図9）。実際、最大で20msの短い脱分極刺激では、エキソサイトーシスは
、Otof-/-マウスのデュアルAAV形質転換したIHCにおいて野生型と同様であり、インタク
トな小胞の即時放出可能プールが示された。持続的脱分極の間、即時放出可能プールの小
胞は補充する必要があある；オトフェリンは、このプロセスに必要とされることが公知で
ある（Pangrsicet al. (2010) Nat. Neurosci. 13 869-876; Strenzke et al. (2016) E
MBO J. 352519-2535）。より長い脱分極刺激では、エキソサイトーシスは、軽度の聴力
不全を有するOtofI515T/I515Tマウスの範囲内であった（Strenzke et al. (2016) EMBO
J. 35 2519-2535）。図9に示すように、50～100ms脱分極では、形質導入したOtof-/- IH
Cにおけるエキソサイトーシスは、Otof+/+IHCの約60％であることが認められた一方で、
形質導入していないOtof-/-IHCは、以前に記載されている（Roux et al. (2006) Cell 1
27 277-289）ように、いかなる小胞融合も示さなかった。小胞補充の速度は、個々の形質
転換した細胞において計算された。Otof+/+ IHCでの750小胞/秒/アクティブゾーン（(Str
enzke et al.(2016) EMBO J. 35 2519-2535)と比較して、およそ380小胞/秒/アクティブ
ゾーンが、エキソサイトーシスを受けることが認められた。したがって、形質導入したOt
of-/-IHCでは、RRPへの小胞補充の速度は一部回復され、野生型対照のものと軽度の聴力
不全を有するOtofI515T/I515Tマウスとの間であった（Strenzke et al. (2016) EMBO J.
352519-2535）。図10に示すように、脱分極段階でのCa2+積分値は、形質導入したOtof-
/- IHC、形質導入していないOtof-/- IHC、および野生型対照細胞において、ほぼ同等のC
a2+の電荷がIHC内に侵入したことを示す。
【0397】
AAV血清型6を選択したところ、該血清型は、最大で51％のIHC形質導入率をもたらした
。人工血清型Anc80L65は、最近示されている（(Landeggeret al. (2017) Nat. Biotechn
ol. 35 280-284)ように、特により成熟した耳に適用したときに、IHC形質導入率をさらに
上昇させ得る（Suzukiet al. (2017) Scientific Reports 7 45524）。
。人工血清型Anc80L65は、最近示されている（(Landeggeret al. (2017) Nat. Biotechn
ol. 35 280-284)ように、特により成熟した耳に適用したときに、IHC形質導入率をさらに
上昇させ得る（Suzukiet al. (2017) Scientific Reports 7 45524）。
【0398】
要約すると、これらのデータは、本明細書に記載されている方法を用いて、9匹の注入
されたOtof-/-動物において、聴力が回復したことを示す。これらのデータはまた、聴力
閾値がより多くのオトフェリンを発現するIHCでより良くなることも示す。
されたOtof-/-動物において、聴力が回復したことを示す。これらのデータはまた、聴力
閾値がより多くのオトフェリンを発現するIHCでより良くなることも示す。
【0399】
実施例18：アデノ随伴ウイルス（AAV）トランススプライシング戦略
少なくとも2つの異なる核酸ベクター（例えば、AAVベクター）を用いて、分子間コンカ
テマー形成およびトランススプライシング後に細胞内で活性オトフェリン遺伝子（例えば
、全長オトフェリン遺伝子）を再構成することができる。例えば、その全体が本明細書に
組み入れられる、Yanet al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:12; 6716-6721, 2000
を参照されたい。
少なくとも2つの異なる核酸ベクター（例えば、AAVベクター）を用いて、分子間コンカ
テマー形成およびトランススプライシング後に細胞内で活性オトフェリン遺伝子（例えば
、全長オトフェリン遺伝子）を再構成することができる。例えば、その全体が本明細書に
組み入れられる、Yanet al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:12; 6716-6721, 2000
を参照されたい。
【0400】
いくつかの例では、2つの異なる核酸ベクターが用いられる。第1の核酸ベクターは、プ
ロモーター（例えば、本明細書に記載されているプロモーターのうちのいずれか）、プロ
モーターの3'側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のN末端部分（例えば、本明細
書に記載されているオトフェリンタンパク質の一部分のサイズのうちのいずれかおよび/
または本明細書に記載されているオトフェリンタンパク質のN末端部分のうちのいずれか
）をコードする第1のコード配列、および第1のコード配列の3'末端に位置づけられたスプ
ライシングドナーシグナル配列を含み得る。第2の核酸ベクターは、スプライシングアク
セプターシグナル配列、スプライシングアクセプターシグナル配列の3'末端に位置づけら
れたオトフェリンタンパク質のC末端部分（すなわち、N末端部分に含まれないオトフェリ
ンタンパク質の全体部分）（例えば、本明細書に記載されているオトフェリンタンパク質
の一部分のサイズのうちのいずれかおよび/または本明細書に記載されているオトフェリ
ンタンパク質のC末端部分のうちのいずれか）をコードする第2のコード配列、および第2
のコード配列の3'末端にあるポリアデニル化配列（例えば、本明細書に記載されているポ
リアデニル化配列のうちのいずれか）を含み得る。いくつかの態様において、コードされ
る部分のそれぞれの長さは、少なくとも30アミノ酸残基（例えば、少なくとも50アミノ酸
、少なくとも75アミノ酸、または少なくとも100アミノ酸）であり、コードされる部分の
それぞれのアミノ酸配列は、他のコードされる部分の配列と重複せず、2つの異なるベク
ターのうちいずれの単一のベクターも、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オト
フェリンタンパク質）をコードしない。2つのベクターの2つのコード配列が哺乳動物細胞
（例えば、本明細書に記載されている哺乳動物細胞のうちのいずれか）において発現する
と、スプライシングドナーシグナル配列とスプライシングアクセプターシグナル配列との
間でスプライシングが生じ、それによって、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長
オトフェリンタンパク質）をコードする組換えmRNAが形成される。
ロモーター（例えば、本明細書に記載されているプロモーターのうちのいずれか）、プロ
モーターの3'側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のN末端部分（例えば、本明細
書に記載されているオトフェリンタンパク質の一部分のサイズのうちのいずれかおよび/
または本明細書に記載されているオトフェリンタンパク質のN末端部分のうちのいずれか
）をコードする第1のコード配列、および第1のコード配列の3'末端に位置づけられたスプ
ライシングドナーシグナル配列を含み得る。第2の核酸ベクターは、スプライシングアク
セプターシグナル配列、スプライシングアクセプターシグナル配列の3'末端に位置づけら
れたオトフェリンタンパク質のC末端部分（すなわち、N末端部分に含まれないオトフェリ
ンタンパク質の全体部分）（例えば、本明細書に記載されているオトフェリンタンパク質
の一部分のサイズのうちのいずれかおよび/または本明細書に記載されているオトフェリ
ンタンパク質のC末端部分のうちのいずれか）をコードする第2のコード配列、および第2
のコード配列の3'末端にあるポリアデニル化配列（例えば、本明細書に記載されているポ
リアデニル化配列のうちのいずれか）を含み得る。いくつかの態様において、コードされ
る部分のそれぞれの長さは、少なくとも30アミノ酸残基（例えば、少なくとも50アミノ酸
、少なくとも75アミノ酸、または少なくとも100アミノ酸）であり、コードされる部分の
それぞれのアミノ酸配列は、他のコードされる部分の配列と重複せず、2つの異なるベク
ターのうちいずれの単一のベクターも、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オト
フェリンタンパク質）をコードしない。2つのベクターの2つのコード配列が哺乳動物細胞
（例えば、本明細書に記載されている哺乳動物細胞のうちのいずれか）において発現する
と、スプライシングドナーシグナル配列とスプライシングアクセプターシグナル配列との
間でスプライシングが生じ、それによって、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長
オトフェリンタンパク質）をコードする組換えmRNAが形成される。
【0401】
別の例では、3つの異なる核酸ベクターを用いることができる。第1の核酸ベクターは、
プロモーター配列の部分（例えば、本明細書に記載されているプロモーター配列のうちの
いずれか）、プロモーターの3'側に位置づけられたオトフェリンタンパク質（例えば、本
明細書に記載されているオトフェリンコード配列のうちのいずれか）の第1の部分をコー
ドするオトフェリン遺伝子の第1のコード配列、および第1のコード配列の3'末端に位置づ
けられた第1のスプライシングドナーシグナル配列を含み得る。第2の核酸ベクターは、第
1のスプライシングアクセプターシグナル配列、第1のスプライシングアクセプターシグナ
ル配列の3'末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質の第2の部分をコードするオト
フェリン遺伝子の第2のコード配列、および第2のコード配列の3'末端に位置づけられた第
2のスプライシングドナーシグナル配列（例えば、本明細書に記載されているスプライシ
ングドナーシグナルのうちのいずれか）を含み得る。第2の核酸ベクターの特徴は、自己
スプライシングが生じ得ない（すなわち、第2の核酸ベクターの第2のスプライシングドナ
ーシグナル配列と第1のスプライシングアクセプターシグナル配列との間ではスプライシ
ングは生じない）ことである。いくつかの態様において、第1の核酸ベクターのスプライ
シングドナーシグナル配列と第2の核酸ベクターの第2のスプライシングドナーシグナルと
は同じである（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知のスプライシン
グドナーシグナルのうちのいずれか）。いくつかの態様において、第1の核酸ベクターの
第1のスプライシングドナーシグナル配列と第2の核酸ベクターの第2のスプライシングド
ナーシグナル配列とは異なっている（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野におい
て公知のスプライシングドナーシグナル配列のうちのいずれか）。第3の核酸ベクターは
、第2のスプライシングアクセプターシグナル配列、第2のスプライシングアクセプターシ
グナル配列の3'末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質の第3の部分をコードする
オトフェリン遺伝子の第3のコード配列、および第3のコード配列の3'末端に位置づけられ
たポリアデニル化配列（例えば、本明細書に記載されているポリアデニル化配列のうちの
いずれか）を含む。3つの核酸ベクターが用いられるそのような方法では、第1のスプライ
シングドナー配列および第1のスプライシングアクセプター配列は一緒に会合され、第2の
スプライシングドナー配列および第2のスプライシングアクセプター配列は一緒に会合さ
れ（再結合され）、かつ第1のコード配列、第2のコード配列、および第3のコード配列に
よってそれぞれコードされるオトフェリンタンパク質の部分は重複せず、かつ哺乳動物細
胞（例えば、本明細書に記載されている哺乳動物細胞のうちのいずれか）内に導入される
と、第1のスプライシングドナー配列と第1のスプライシングアクセプター配列との間、お
よび第2のスプライシングドナー配列と第2のスプライシングアクセプター配列との間でス
プライシングが生じ、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク
質）をコードするスプライシングされた核酸が形成される。上記で提供した戦略に基づき
、当業者は、4つ、5つ、または6つの異なる核酸ベクターを用いる戦略を開発する方法を
理解するはずである。
プロモーター配列の部分（例えば、本明細書に記載されているプロモーター配列のうちの
いずれか）、プロモーターの3'側に位置づけられたオトフェリンタンパク質（例えば、本
明細書に記載されているオトフェリンコード配列のうちのいずれか）の第1の部分をコー
ドするオトフェリン遺伝子の第1のコード配列、および第1のコード配列の3'末端に位置づ
けられた第1のスプライシングドナーシグナル配列を含み得る。第2の核酸ベクターは、第
1のスプライシングアクセプターシグナル配列、第1のスプライシングアクセプターシグナ
ル配列の3'末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質の第2の部分をコードするオト
フェリン遺伝子の第2のコード配列、および第2のコード配列の3'末端に位置づけられた第
2のスプライシングドナーシグナル配列（例えば、本明細書に記載されているスプライシ
ングドナーシグナルのうちのいずれか）を含み得る。第2の核酸ベクターの特徴は、自己
スプライシングが生じ得ない（すなわち、第2の核酸ベクターの第2のスプライシングドナ
ーシグナル配列と第1のスプライシングアクセプターシグナル配列との間ではスプライシ
ングは生じない）ことである。いくつかの態様において、第1の核酸ベクターのスプライ
シングドナーシグナル配列と第2の核酸ベクターの第2のスプライシングドナーシグナルと
は同じである（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知のスプライシン
グドナーシグナルのうちのいずれか）。いくつかの態様において、第1の核酸ベクターの
第1のスプライシングドナーシグナル配列と第2の核酸ベクターの第2のスプライシングド
ナーシグナル配列とは異なっている（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野におい
て公知のスプライシングドナーシグナル配列のうちのいずれか）。第3の核酸ベクターは
、第2のスプライシングアクセプターシグナル配列、第2のスプライシングアクセプターシ
グナル配列の3'末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質の第3の部分をコードする
オトフェリン遺伝子の第3のコード配列、および第3のコード配列の3'末端に位置づけられ
たポリアデニル化配列（例えば、本明細書に記載されているポリアデニル化配列のうちの
いずれか）を含む。3つの核酸ベクターが用いられるそのような方法では、第1のスプライ
シングドナー配列および第1のスプライシングアクセプター配列は一緒に会合され、第2の
スプライシングドナー配列および第2のスプライシングアクセプター配列は一緒に会合さ
れ（再結合され）、かつ第1のコード配列、第2のコード配列、および第3のコード配列に
よってそれぞれコードされるオトフェリンタンパク質の部分は重複せず、かつ哺乳動物細
胞（例えば、本明細書に記載されている哺乳動物細胞のうちのいずれか）内に導入される
と、第1のスプライシングドナー配列と第1のスプライシングアクセプター配列との間、お
よび第2のスプライシングドナー配列と第2のスプライシングアクセプター配列との間でス
プライシングが生じ、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク
質）をコードするスプライシングされた核酸が形成される。上記で提供した戦略に基づき
、当業者は、4つ、5つ、または6つの異なる核酸ベクターを用いる戦略を開発する方法を
理解するはずである。
【0402】
これらの方法の例のうちのいずれかにおいて、コードされる部分のそれぞれのアミノ酸
配列は、他のコードされる部分のうちのいずれかの配列と重複せず、かついずれの単一の
ベクターも、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコ
ードしない。
配列は、他のコードされる部分のうちのいずれかの配列と重複せず、かついずれの単一の
ベクターも、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコ
ードしない。
【0403】
少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれは、オトフェリンタンパク質の異なる部分
をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれは、少なくとも30アミノ酸
（例えば、約30アミノ酸～約1600アミノ酸、またはこの範囲における本明細書に記載の他
の部分範囲のうちのいずれか）であり得る。
をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれは、少なくとも30アミノ酸
（例えば、約30アミノ酸～約1600アミノ酸、またはこの範囲における本明細書に記載の他
の部分範囲のうちのいずれか）であり得る。
【0404】
いくつかの態様において、コード配列のそれぞれは、SEQ ID NO：12の少なくとも1つの
エクソンおよび少なくとも1つのイントロン（例えば、少なくとも2つのエクソンおよび少
なくとも1つのイントロン、少なくとも2つのエクソンおよび少なくとも2つのイントロン
、少なくとも3つエクソンおよび少なくとも1つのイントロン、少なくとも3つエクソンお
よび少なくとも2つのイントロン、または少なくとも3つエクソンおよび少なくとも3つイ
ントロン）を含み得る。いくつかの態様において、少なくとも2つの異なるベクターのそ
れぞれは、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コード
される部分のそれぞれは、コードされる部分のそれぞれが重複しないように、SEQ ID NO
：5のアミノ酸配列の最大で80％（例えば、SEQID NO：5の最大で10％、最大で20％、最
大で30％、最大で40％、最大で50％、最大で60％、または最大で70％）をコードし得る。
いくつかの態様において、少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれは、オトフェリン
タンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれは
、コードされる部分のそれぞれが重複しないように、SEQ ID NO：5のアミノ酸配列の最大
で80％（例えば、SEQID NO：5の最大で10％、最大で20％、最大で30％、最大で40％、最
大で50％、最大で60％、または最大で70％）をコードする。
エクソンおよび少なくとも1つのイントロン（例えば、少なくとも2つのエクソンおよび少
なくとも1つのイントロン、少なくとも2つのエクソンおよび少なくとも2つのイントロン
、少なくとも3つエクソンおよび少なくとも1つのイントロン、少なくとも3つエクソンお
よび少なくとも2つのイントロン、または少なくとも3つエクソンおよび少なくとも3つイ
ントロン）を含み得る。いくつかの態様において、少なくとも2つの異なるベクターのそ
れぞれは、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コード
される部分のそれぞれは、コードされる部分のそれぞれが重複しないように、SEQ ID NO
：5のアミノ酸配列の最大で80％（例えば、SEQID NO：5の最大で10％、最大で20％、最
大で30％、最大で40％、最大で50％、最大で60％、または最大で70％）をコードし得る。
いくつかの態様において、少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれは、オトフェリン
タンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれは
、コードされる部分のそれぞれが重複しないように、SEQ ID NO：5のアミノ酸配列の最大
で80％（例えば、SEQID NO：5の最大で10％、最大で20％、最大で30％、最大で40％、最
大で50％、最大で60％、または最大で70％）をコードする。
【0405】
少なくとも2つの核酸ベクターのそれぞれは、ヘッドトゥテール組換えを可能にする末
端逆位配列（ITR）をさらに含み得る。ITRはその後、スプライシングによって除去される
。例えば、ITRは、その全体が本明細書に組み入れられる、Yanet al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A.97(12):6716-6721, 2000に記載されているように、パリンドローム性二
重D ITRであり得る。例えば、ITRは、Goshet al., Mol. Ther. 16:124-130, 2008, and
Gosh et al.,Human Gene Ther. 22: 77-83, 2011に記載されているようにAAV血清型-2 I
TRであり得る。スプライシングアクセプターおよび/またはドナーシグナル配列の非限定
的な例は、当技術分野において公知である。例えば、Reich et al., Human Gene Ther. 1
4(1):37-44,2003, and Lai et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23(11):1435-1439, 2005,
2005を参照されたい。スプライシングドナーおよびアクセプターシグナル配列は、遺伝
子（例えば、オトフェリン遺伝子）の任意の内在性イントロンスプライシングシグナルで
あり得る。
端逆位配列（ITR）をさらに含み得る。ITRはその後、スプライシングによって除去される
。例えば、ITRは、その全体が本明細書に組み入れられる、Yanet al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A.97(12):6716-6721, 2000に記載されているように、パリンドローム性二
重D ITRであり得る。例えば、ITRは、Goshet al., Mol. Ther. 16:124-130, 2008, and
Gosh et al.,Human Gene Ther. 22: 77-83, 2011に記載されているようにAAV血清型-2 I
TRであり得る。スプライシングアクセプターおよび/またはドナーシグナル配列の非限定
的な例は、当技術分野において公知である。例えば、Reich et al., Human Gene Ther. 1
4(1):37-44,2003, and Lai et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23(11):1435-1439, 2005,
2005を参照されたい。スプライシングドナーおよびアクセプターシグナル配列は、遺伝
子（例えば、オトフェリン遺伝子）の任意の内在性イントロンスプライシングシグナルで
あり得る。
【0406】
例えば、スプライシングドナーシグナル配列は、
であってもよく、かつスプライシングアクセプターシグナルは、
であってもよい（例えば、Trapani et al., EMBO Mol. Med. 6(2):194-211, 2014を参照
されたい）。
であってもよく、かつスプライシングアクセプターシグナルは、
であってもよい（例えば、Trapani et al., EMBO Mol. Med. 6(2):194-211, 2014を参照
されたい）。
【0407】
スプライシングおよびスプライシング効率を評価する方法は当技術分野において公知で
ある（例えば、Laiet al., Nat. Biotechnol. 23(11): 1435-1439, 2005を参照されたい
）。
ある（例えば、Laiet al., Nat. Biotechnol. 23(11): 1435-1439, 2005を参照されたい
）。
【0408】
実施例19：アルカリホスファターゼ（AP）高度に組換え誘導性の外因的遺伝子領域を用い
るハイブリッドベクタートランススプライシング戦略
少なくとも2つ（例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ）の異なる核酸ベクター（例
えば、AAVベクター）はまた、分子間コンカテマー形成、マーカー遺伝子媒介性組換え、
およびトランススプライシング後に細胞内で活性オトフェリン遺伝子（例えば、全長オト
フェリン遺伝子）を再構成するために、本明細書に記載されている方法のうちのいずれか
において用いることができる。この戦略は、相同組換えおよび/またはトランススプライ
シングを含む、ハイブリッド戦略である。例えば、その全体が本明細書に各々組み入れら
れる、Gosh etal., Mol. Ther. 16: 124-130, 2008; Gosh et al., Human Gene Ther. 2
2: 77-83, 2011;およびDuanet al., Mol. Ther. 4: 383-391, 2001を参照されたい。本
明細書で用いられる検出可能なマーカー遺伝子は、コード配列非依存的組換えを可能にす
る高度に組換え誘導性のDNA配列であり得る。検出可能なマーカー遺伝子の非限定的な例
は、アルカリホスファターゼ（AP）遺伝子である。例えば、検出可能なマーカー遺伝子は
、872 bpの長さのヒト胎盤AP相補的DNAの中央の1/3であり得る（例えば、Goshet al., 2
008を参照されたい）。少なくとも2つの異なる核酸ベクターは、検出可能なマーカー遺伝
子（例えば、本明細書に記載されている検出可能なマーカー遺伝子のいずれか）を含む。
ハイブリッドベクターは、実施例18に記載されているようなトランススプライシングベク
ターに基づき構築されることから、活性オトフェリン遺伝子（例えば、全長オトフェリン
遺伝子）は、ITR媒介組換えおよびトランススプライシングまたは検出可能なマーカー遺
伝子媒介（例えば、AP遺伝子媒介）組換えおよびトランススプライシングのいずれかを用
いて再構成され得る。トランススプライシング後、活性オトフェリン遺伝子（例えば、全
長オトフェリン遺伝子）は、哺乳動物細胞（例えば、本明細書に記載されているいずれか
の哺乳動物細胞）のゲノムDNAにおいて再構成される。
るハイブリッドベクタートランススプライシング戦略
少なくとも2つ（例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ）の異なる核酸ベクター（例
えば、AAVベクター）はまた、分子間コンカテマー形成、マーカー遺伝子媒介性組換え、
およびトランススプライシング後に細胞内で活性オトフェリン遺伝子（例えば、全長オト
フェリン遺伝子）を再構成するために、本明細書に記載されている方法のうちのいずれか
において用いることができる。この戦略は、相同組換えおよび/またはトランススプライ
シングを含む、ハイブリッド戦略である。例えば、その全体が本明細書に各々組み入れら
れる、Gosh etal., Mol. Ther. 16: 124-130, 2008; Gosh et al., Human Gene Ther. 2
2: 77-83, 2011;およびDuanet al., Mol. Ther. 4: 383-391, 2001を参照されたい。本
明細書で用いられる検出可能なマーカー遺伝子は、コード配列非依存的組換えを可能にす
る高度に組換え誘導性のDNA配列であり得る。検出可能なマーカー遺伝子の非限定的な例
は、アルカリホスファターゼ（AP）遺伝子である。例えば、検出可能なマーカー遺伝子は
、872 bpの長さのヒト胎盤AP相補的DNAの中央の1/3であり得る（例えば、Goshet al., 2
008を参照されたい）。少なくとも2つの異なる核酸ベクターは、検出可能なマーカー遺伝
子（例えば、本明細書に記載されている検出可能なマーカー遺伝子のいずれか）を含む。
ハイブリッドベクターは、実施例18に記載されているようなトランススプライシングベク
ターに基づき構築されることから、活性オトフェリン遺伝子（例えば、全長オトフェリン
遺伝子）は、ITR媒介組換えおよびトランススプライシングまたは検出可能なマーカー遺
伝子媒介（例えば、AP遺伝子媒介）組換えおよびトランススプライシングのいずれかを用
いて再構成され得る。トランススプライシング後、活性オトフェリン遺伝子（例えば、全
長オトフェリン遺伝子）は、哺乳動物細胞（例えば、本明細書に記載されているいずれか
の哺乳動物細胞）のゲノムDNAにおいて再構成される。
【0409】
1つの例では、2つの異なる核酸ベクターが用いられる。第1の核酸ベクターは、プロモ
ーター（例えば、本明細書に記載されているプロモーターのうちのいずれか）、プロモー
ターの3'側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のN末端部分（例えば、本明細書に
記載されているオトフェリンタンパク質の一部分のサイズのうちのいずれかおよび/また
は本明細書に記載されているオトフェリンタンパク質のN末端部分のうちのいずれか）を
コードする第1のコード配列、第1のコード配列の3'末端に位置づけられたスプライシング
ドナーシグナル配列、およびスプライシングドナーシグナル配列の3'側に位置づけられた
第1の検出可能なマーカー遺伝子を含み得る。第2の核酸ベクターは、第2の検出可能なマ
ーカー遺伝子、第2の検出可能なマーカー遺伝子の3'側に位置づけられたスプライシング
アクセプターシグナル配列、スプライシングアクセプターシグナル配列の3'末端に位置づ
けられたオトフェリンタンパク質のC末端部分（例えば、本明細書に記載されているオト
フェリンタンパク質の一部分のサイズのうちのいずれかおよび/または本明細書に記載さ
れているオトフェリンタンパク質のC末端部分のうちのいずれか）をコードする第2のコー
ド配列、および第2のコード配列の3'末端にあるポリアデニル化配列（例えば、本明細書
に記載されているポリアデニル化配列のうちのいずれか）を含み得る。いくつかの態様に
おいて、コードされる部分のそれぞれの長さは、少なくとも30アミノ酸残基（例えば、少
なくとも50アミノ酸、少なくとも75アミノ酸、または少なくとも100アミノ酸）であり、
コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列は重複しておらず、かつ2つの異なるベクタ
ーのうちのいずれの単一のベクターも、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オト
フェリンタンパク質）をコードしない。哺乳動物細胞（例えば、本明細書に記載されてい
る哺乳動物細胞のうちのいずれか）に導入されると、スプライシングドナーシグナル配列
とスプライシングアクセプターシグナル配列との間でスプライシングが生じ、それによっ
て、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコードする
RNA酸が形成される。
ーター（例えば、本明細書に記載されているプロモーターのうちのいずれか）、プロモー
ターの3'側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のN末端部分（例えば、本明細書に
記載されているオトフェリンタンパク質の一部分のサイズのうちのいずれかおよび/また
は本明細書に記載されているオトフェリンタンパク質のN末端部分のうちのいずれか）を
コードする第1のコード配列、第1のコード配列の3'末端に位置づけられたスプライシング
ドナーシグナル配列、およびスプライシングドナーシグナル配列の3'側に位置づけられた
第1の検出可能なマーカー遺伝子を含み得る。第2の核酸ベクターは、第2の検出可能なマ
ーカー遺伝子、第2の検出可能なマーカー遺伝子の3'側に位置づけられたスプライシング
アクセプターシグナル配列、スプライシングアクセプターシグナル配列の3'末端に位置づ
けられたオトフェリンタンパク質のC末端部分（例えば、本明細書に記載されているオト
フェリンタンパク質の一部分のサイズのうちのいずれかおよび/または本明細書に記載さ
れているオトフェリンタンパク質のC末端部分のうちのいずれか）をコードする第2のコー
ド配列、および第2のコード配列の3'末端にあるポリアデニル化配列（例えば、本明細書
に記載されているポリアデニル化配列のうちのいずれか）を含み得る。いくつかの態様に
おいて、コードされる部分のそれぞれの長さは、少なくとも30アミノ酸残基（例えば、少
なくとも50アミノ酸、少なくとも75アミノ酸、または少なくとも100アミノ酸）であり、
コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列は重複しておらず、かつ2つの異なるベクタ
ーのうちのいずれの単一のベクターも、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オト
フェリンタンパク質）をコードしない。哺乳動物細胞（例えば、本明細書に記載されてい
る哺乳動物細胞のうちのいずれか）に導入されると、スプライシングドナーシグナル配列
とスプライシングアクセプターシグナル配列との間でスプライシングが生じ、それによっ
て、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコードする
RNA酸が形成される。
【0410】
別の例では、3つの異なる核酸ベクターを用いることができる。第1の核酸ベクターは、
プロモーター配列（例えば、本明細書に記載されているプロモーター配列のうちのいずれ
か）の一部分、プロモーターの3'側に位置づけられたオトフェリンタンパク質の第1の部
分をコードするオトフェリン遺伝子の第1のコード配列（例えば、本明細書に記載されて
いるオトフェリンコード配列のうちのいずれか）、第1のコード配列の3'末端に位置づけ
られた第1のスプライシングドナーシグナル配列、および第1の検出可能なマーカー遺伝子
を含み得る。第2の核酸ベクターは、第2の検出可能なマーカー遺伝子、第2の検出可能な
マーカー遺伝子の3'側に位置づけられた第1のスプライシングアクセプターシグナル配列
、第1のスプライシングアクセプターシグナル配列の3'末端に位置づけられたオトフェリ
ンタンパク質の第2の部分をコードするオトフェリン遺伝子の第2のコード配列、第2のコ
ード配列の3'末端に位置づけられた第2のスプライシングドナーシグナル配列（例えば、
本明細書に記載されているスプライシングドナーシグナルのうちのいずれか）、および第
3の検出可能なマーカー遺伝子を含み得る。第2の核酸ベクターの特徴は、自己スプライシ
ングが生じ得ないことである（すなわち、第2の核酸ベクターの第2のスプライシングドナ
ーシグナル配列と第1のスプライシングアクセプターシグナル配列との間では、スプライ
シングは生じない）。いくつかの態様において、第1の核酸ベクターのスプライシングド
ナーシグナル配列と第2の核酸ベクターの第2のスプライシングドナーシグナルとは同じで
ある（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知のスプライシングドナー
シグナルのうちのいずれか）。いくつかの態様において、第1の核酸ベクターの第1のスプ
ライシングドナーシグナル配列と第2の核酸ベクターの第2のスプライシングドナーシグナ
ル配列は異なっている（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知のスプ
ライシングドナーシグナル配列のうちのいずれか）。第3の核酸ベクターは、第4の検出可
能なマーカー遺伝子、第4の検出可能なマーカー遺伝子の3'側に位置づけられた第2のスプ
ライシングアクセプターシグナル配列、第2のスプライシングアクセプターシグナル配列
の3'末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質の第3の部分をコードするオトフェリ
ン遺伝子の第3のコード配列、および第3のコード配列の3'末端に位置づけられたポリアデ
ニル化配列（例えば、本明細書に記載されているポリアデニル化配列のうちのいずれか）
を含み得る。3つの核酸ベクターが用いられるそのような方法では、第1のスプライシング
ドナー配列および第1のスプライシングアクセプター配列は一緒に会合され（再結合され
）、かつ第2のスプライシングドナー配列および第2のスプライシングアクセプター配列は
一緒に会合され（再結合され）、かつ第1のコード配列、第2のコード配列、および第3の
コード配列によってコードされるオトフェリンタンパク質の部分は重複しておらず、かつ
哺乳動物細胞（例えば、本明細書に記載されている哺乳動物細胞のうちのいずれか）内に
導入されると、第1のスプライシングドナー配列と第1のスプライシングアクセプター配列
との間、および第2のスプライシングドナー配列と第2のスプライシングアクセプター配列
との間でスプライシングが生じ、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリ
ンタンパク質）をコードする組換え核酸が形成される。当技術分野において理解されるよ
うに、3つの核酸ベクターが用いられる場合、少なくとも2つの異なる核酸ベクターのうち
2つは、検出可能なマーカー遺伝子（例えば、APマーカー遺伝子）を含む可能性があり、
少なくとも2つの異なる核酸ベクターのうち1つは、検出可能なマーカー遺伝子を含む核酸
ベクターにおけるスプライシングドナーシグナル配列に相補的であるスプライシングアク
セプターシグナル配列を含み得る。例えば、いくつかの態様において、第1の核酸ベクタ
ーおよび第2の核酸ベクターは検出可能なマーカー遺伝子（例えば、APマーカー遺伝子）
を含む可能性があり、かつ第3の核酸ベクターは、第2の核酸ベクターにおけるスプライシ
ングドナーシグナル配列に相補的であるスプライシングアクセプターシグナル配列を含み
、かつ第3の核酸ベクターは検出可能なマーカー遺伝子（例えば、APマーカー遺伝子）を
含まない。他の例では、第2の核酸ベクターおよび第3の核酸ベクターは検出可能なマーカ
ー遺伝子（例えば、APマーカー遺伝子）を含む可能性があり、かつ第1の核酸ベクターは
、第2の核酸ベクターにおけるスプライシングアクセプターシグナル配列に相補的である
スプライシングドナーシグナル配列を含み、かつ第1の核酸ベクターは検出可能なマーカ
ー遺伝子（例えば、APマーカー遺伝子）を含まない。
プロモーター配列（例えば、本明細書に記載されているプロモーター配列のうちのいずれ
か）の一部分、プロモーターの3'側に位置づけられたオトフェリンタンパク質の第1の部
分をコードするオトフェリン遺伝子の第1のコード配列（例えば、本明細書に記載されて
いるオトフェリンコード配列のうちのいずれか）、第1のコード配列の3'末端に位置づけ
られた第1のスプライシングドナーシグナル配列、および第1の検出可能なマーカー遺伝子
を含み得る。第2の核酸ベクターは、第2の検出可能なマーカー遺伝子、第2の検出可能な
マーカー遺伝子の3'側に位置づけられた第1のスプライシングアクセプターシグナル配列
、第1のスプライシングアクセプターシグナル配列の3'末端に位置づけられたオトフェリ
ンタンパク質の第2の部分をコードするオトフェリン遺伝子の第2のコード配列、第2のコ
ード配列の3'末端に位置づけられた第2のスプライシングドナーシグナル配列（例えば、
本明細書に記載されているスプライシングドナーシグナルのうちのいずれか）、および第
3の検出可能なマーカー遺伝子を含み得る。第2の核酸ベクターの特徴は、自己スプライシ
ングが生じ得ないことである（すなわち、第2の核酸ベクターの第2のスプライシングドナ
ーシグナル配列と第1のスプライシングアクセプターシグナル配列との間では、スプライ
シングは生じない）。いくつかの態様において、第1の核酸ベクターのスプライシングド
ナーシグナル配列と第2の核酸ベクターの第2のスプライシングドナーシグナルとは同じで
ある（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知のスプライシングドナー
シグナルのうちのいずれか）。いくつかの態様において、第1の核酸ベクターの第1のスプ
ライシングドナーシグナル配列と第2の核酸ベクターの第2のスプライシングドナーシグナ
ル配列は異なっている（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知のスプ
ライシングドナーシグナル配列のうちのいずれか）。第3の核酸ベクターは、第4の検出可
能なマーカー遺伝子、第4の検出可能なマーカー遺伝子の3'側に位置づけられた第2のスプ
ライシングアクセプターシグナル配列、第2のスプライシングアクセプターシグナル配列
の3'末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質の第3の部分をコードするオトフェリ
ン遺伝子の第3のコード配列、および第3のコード配列の3'末端に位置づけられたポリアデ
ニル化配列（例えば、本明細書に記載されているポリアデニル化配列のうちのいずれか）
を含み得る。3つの核酸ベクターが用いられるそのような方法では、第1のスプライシング
ドナー配列および第1のスプライシングアクセプター配列は一緒に会合され（再結合され
）、かつ第2のスプライシングドナー配列および第2のスプライシングアクセプター配列は
一緒に会合され（再結合され）、かつ第1のコード配列、第2のコード配列、および第3の
コード配列によってコードされるオトフェリンタンパク質の部分は重複しておらず、かつ
哺乳動物細胞（例えば、本明細書に記載されている哺乳動物細胞のうちのいずれか）内に
導入されると、第1のスプライシングドナー配列と第1のスプライシングアクセプター配列
との間、および第2のスプライシングドナー配列と第2のスプライシングアクセプター配列
との間でスプライシングが生じ、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリ
ンタンパク質）をコードする組換え核酸が形成される。当技術分野において理解されるよ
うに、3つの核酸ベクターが用いられる場合、少なくとも2つの異なる核酸ベクターのうち
2つは、検出可能なマーカー遺伝子（例えば、APマーカー遺伝子）を含む可能性があり、
少なくとも2つの異なる核酸ベクターのうち1つは、検出可能なマーカー遺伝子を含む核酸
ベクターにおけるスプライシングドナーシグナル配列に相補的であるスプライシングアク
セプターシグナル配列を含み得る。例えば、いくつかの態様において、第1の核酸ベクタ
ーおよび第2の核酸ベクターは検出可能なマーカー遺伝子（例えば、APマーカー遺伝子）
を含む可能性があり、かつ第3の核酸ベクターは、第2の核酸ベクターにおけるスプライシ
ングドナーシグナル配列に相補的であるスプライシングアクセプターシグナル配列を含み
、かつ第3の核酸ベクターは検出可能なマーカー遺伝子（例えば、APマーカー遺伝子）を
含まない。他の例では、第2の核酸ベクターおよび第3の核酸ベクターは検出可能なマーカ
ー遺伝子（例えば、APマーカー遺伝子）を含む可能性があり、かつ第1の核酸ベクターは
、第2の核酸ベクターにおけるスプライシングアクセプターシグナル配列に相補的である
スプライシングドナーシグナル配列を含み、かつ第1の核酸ベクターは検出可能なマーカ
ー遺伝子（例えば、APマーカー遺伝子）を含まない。
【0411】
上記で提供した戦略に基づき、当業者は、4、5、または6つのベクターを用いる戦略を
開発する方法を理解する方法を理解するはずである。
開発する方法を理解する方法を理解するはずである。
【0412】
少なくとも2つの核酸ベクター（例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ）において提
供されるコード配列は重複しない。少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれは、オト
フェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含んでもよく、コードされる
部分のそれぞれは、例えば、少なくとも30アミノ酸（例えば、約30アミノ酸～約1600アミ
ノ酸、またはこの範囲における本明細書に記載の他の部分範囲のうちのいずれか）である
。
供されるコード配列は重複しない。少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれは、オト
フェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含んでもよく、コードされる
部分のそれぞれは、例えば、少なくとも30アミノ酸（例えば、約30アミノ酸～約1600アミ
ノ酸、またはこの範囲における本明細書に記載の他の部分範囲のうちのいずれか）である
。
【0413】
いくつかの態様において、少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれは、オトフェリ
ンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれ
は、SEQ IDNO：12の少なくとも1つのエクソンおよび少なくとも1つのイントロン（例え
ば、少なくとも2つのエクソンおよび少なくとも1つのイントロン、少なくとも2つのエク
ソンおよび少なくとも2つのイントロン、少なくとも3つのエクソンおよび少なくとも1つ
のイントロン、少なくとも3つのエクソンおよび少なくとも2つのイントロン、または少な
くとも3つのエクソンおよび少なくとも3つのイントロン）をコードする。いくつかの態様
において、少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれは、オトフェリンタンパク質の異
なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれは、コードされる
部分のそれぞれが重複しないように、SEQ ID NO：5の最大で80％（例えば、SEQ ID NO：5
の最大で10％、最大で20％、最大で30％、最大で40％、最大で50％、最大で60％、最大で
70％）をコードする。いくつかの態様において、少なくとも2つの異なるベクターのそれ
ぞれは、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードさ
れる部分のそれぞれは、コードされる部分のそれぞれが重複しないように、SEQ ID NO：5
の最大で80％（例えば、SEQID NO：5の最大で10％、最大で20％、最大で30％、最大で40
％、最大で50％、最大で60％、または最大で70％）をコードする。
ンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれ
は、SEQ IDNO：12の少なくとも1つのエクソンおよび少なくとも1つのイントロン（例え
ば、少なくとも2つのエクソンおよび少なくとも1つのイントロン、少なくとも2つのエク
ソンおよび少なくとも2つのイントロン、少なくとも3つのエクソンおよび少なくとも1つ
のイントロン、少なくとも3つのエクソンおよび少なくとも2つのイントロン、または少な
くとも3つのエクソンおよび少なくとも3つのイントロン）をコードする。いくつかの態様
において、少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれは、オトフェリンタンパク質の異
なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれは、コードされる
部分のそれぞれが重複しないように、SEQ ID NO：5の最大で80％（例えば、SEQ ID NO：5
の最大で10％、最大で20％、最大で30％、最大で40％、最大で50％、最大で60％、最大で
70％）をコードする。いくつかの態様において、少なくとも2つの異なるベクターのそれ
ぞれは、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードさ
れる部分のそれぞれは、コードされる部分のそれぞれが重複しないように、SEQ ID NO：5
の最大で80％（例えば、SEQID NO：5の最大で10％、最大で20％、最大で30％、最大で40
％、最大で50％、最大で60％、または最大で70％）をコードする。
【0414】
実施例18に記載されているように、少なくとも2つの核酸ベクターのそれぞれは、ヘッ
ドトゥテール組換えを可能にする末端逆位配列（ITR）をさらに含んでもよい。ITRはその
後、スプライシングによって除去される。ITRならびにスプライシングアクセプターおよ
び/またはドナーシグナル配列の例は、当技術分野において公知であり、実施例18に記載
されている。
ドトゥテール組換えを可能にする末端逆位配列（ITR）をさらに含んでもよい。ITRはその
後、スプライシングによって除去される。ITRならびにスプライシングアクセプターおよ
び/またはドナーシグナル配列の例は、当技術分野において公知であり、実施例18に記載
されている。
【0415】
実施例20：F1ファージの高度に組換え誘導性の外因的遺伝子領域（AK）を用いるハイブリ
ッドベクタートランススプライシング戦略
少なくとも2つ（例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ）の異なる核酸ベクター（例
えば、AAVベクター）は、分子間コンカテマー形成、マーカー遺伝子媒介組換え、および
トランススプライシング後に細胞内で活性オトフェリン遺伝子（例えば、全長オトフェリ
ン遺伝子）を再構成するために、本明細書に記載されている方法のうちのいずれかにおい
て用いることもできる。例えば、図2に示されるベクターを参照されたい。この戦略は、
相同組換えおよび/またはトランススプライシングを含むことからハイブリッド戦略であ
る。例えば、その全体が本明細書に組み入れられる、Trapani et al., EMBO Mol. Med. 6
(2):194-211,2014を参照されたい。本明細書において用いられるF1ファージの組換え誘
導性領域（AK）は、コード配列非依存性組換えを可能にするために用いられる。F1ファー
ジの組換え誘導性領域は、Trapani et al. (2014) EMBO Mol. Med. 6(2):194-211, 2014
に記載されているようなF1ファージゲノム由来の77 bpの組換え誘導性領域であってもよ
い。少なくとも2つの異なる核酸ベクターは、F1ファージの組換え誘導性領域を含有する
。ハイブリッドベクターは、実施例18に記載されているようにトランススプライシングベ
クターに基づいて構築されることから、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長ステ
レオシリンタンパク質）をコードする核酸は、ITR媒介組換えおよびトランススプライシ
ングまたはF1ファージの組換え誘導性領域誘導性組換えおよびトランススプライシングの
いずれかを用いて作製され得る。トランススプライシング後、活性オトフェリンタンパク
質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコードする核酸は、哺乳動物細胞（例えば
、本明細書に記載されている哺乳動物細胞のうちのいずれか）において作製される。
ッドベクタートランススプライシング戦略
少なくとも2つ（例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ）の異なる核酸ベクター（例
えば、AAVベクター）は、分子間コンカテマー形成、マーカー遺伝子媒介組換え、および
トランススプライシング後に細胞内で活性オトフェリン遺伝子（例えば、全長オトフェリ
ン遺伝子）を再構成するために、本明細書に記載されている方法のうちのいずれかにおい
て用いることもできる。例えば、図2に示されるベクターを参照されたい。この戦略は、
相同組換えおよび/またはトランススプライシングを含むことからハイブリッド戦略であ
る。例えば、その全体が本明細書に組み入れられる、Trapani et al., EMBO Mol. Med. 6
(2):194-211,2014を参照されたい。本明細書において用いられるF1ファージの組換え誘
導性領域（AK）は、コード配列非依存性組換えを可能にするために用いられる。F1ファー
ジの組換え誘導性領域は、Trapani et al. (2014) EMBO Mol. Med. 6(2):194-211, 2014
に記載されているようなF1ファージゲノム由来の77 bpの組換え誘導性領域であってもよ
い。少なくとも2つの異なる核酸ベクターは、F1ファージの組換え誘導性領域を含有する
。ハイブリッドベクターは、実施例18に記載されているようにトランススプライシングベ
クターに基づいて構築されることから、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長ステ
レオシリンタンパク質）をコードする核酸は、ITR媒介組換えおよびトランススプライシ
ングまたはF1ファージの組換え誘導性領域誘導性組換えおよびトランススプライシングの
いずれかを用いて作製され得る。トランススプライシング後、活性オトフェリンタンパク
質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコードする核酸は、哺乳動物細胞（例えば
、本明細書に記載されている哺乳動物細胞のうちのいずれか）において作製される。
【0416】
1つの例では、2つの異なる核酸ベクターが用いられる。第1の核酸ベクターは、プロモ
ーター（例えば、本明細書に記載されているプロモーターのうちのいずれか）、プロモー
ターの3'側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のN末端部分（例えば、本明細書に
記載されているオトフェリンタンパク質の部分のサイズのうちのいずれかおよび/または
本明細書に記載されているオトフェリンタンパク質のN末端部分のうちのいずれか）をコ
ードする第1のコード配列、第1のコード配列の3'末端に位置づけられたスプライシングド
ナーシグナル配列、およびスプライシングドナーシグナル配列の3'側に位置づけられたF1
ファージの組換え誘導性領域を含み得る。第2の核酸ベクターは、F1ファージの組換え誘
導性領域、F1ファージの組換え誘導性領域の3'側に位置づけられたスプライシングアクセ
プターシグナル配列、スプライシングアクセプターシグナル配列の3'末端に位置づけられ
たオトフェリンタンパク質のC末端部分（例えば、本明細書に記載されているオトフェリ
ンタンパク質の一部分のサイズのうちのいずれかおよび/または本明細書に記載されてい
るオトフェリンタンパク質のC末端部分のうちのいずれか）をコードする第2のコード配列
、および第2のコード配列の3'末端にあるポリアデニル化配列（例えば、本明細書に記載
されているポリアデニル化配列のうちのいずれか）を含み得る。いくつかの態様において
、コードされる部分のそれぞれの長さは、少なくとも30アミノ酸残基（例えば、少なくと
も50アミノ酸、少なくとも75アミノ酸、または少なくとも100アミノ酸）であり、コード
される部分のそれぞれのアミノ酸配列は重複しておらず、かつ2つの異なるベクターのう
ちのいずれの単一のベクターも、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリ
ンタンパク質）をコードしない。ベクターが哺乳動物細胞（例えば、本明細書に記載され
ている哺乳動物細胞のうちのいずれか）に導入されると、スプライシングドナーシグナル
配列とスプライシングアクセプターシグナル配列との間でスプライシングが生じ、それに
よって、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコード
する組換え核酸が形成される。
ーター（例えば、本明細書に記載されているプロモーターのうちのいずれか）、プロモー
ターの3'側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のN末端部分（例えば、本明細書に
記載されているオトフェリンタンパク質の部分のサイズのうちのいずれかおよび/または
本明細書に記載されているオトフェリンタンパク質のN末端部分のうちのいずれか）をコ
ードする第1のコード配列、第1のコード配列の3'末端に位置づけられたスプライシングド
ナーシグナル配列、およびスプライシングドナーシグナル配列の3'側に位置づけられたF1
ファージの組換え誘導性領域を含み得る。第2の核酸ベクターは、F1ファージの組換え誘
導性領域、F1ファージの組換え誘導性領域の3'側に位置づけられたスプライシングアクセ
プターシグナル配列、スプライシングアクセプターシグナル配列の3'末端に位置づけられ
たオトフェリンタンパク質のC末端部分（例えば、本明細書に記載されているオトフェリ
ンタンパク質の一部分のサイズのうちのいずれかおよび/または本明細書に記載されてい
るオトフェリンタンパク質のC末端部分のうちのいずれか）をコードする第2のコード配列
、および第2のコード配列の3'末端にあるポリアデニル化配列（例えば、本明細書に記載
されているポリアデニル化配列のうちのいずれか）を含み得る。いくつかの態様において
、コードされる部分のそれぞれの長さは、少なくとも30アミノ酸残基（例えば、少なくと
も50アミノ酸、少なくとも75アミノ酸、または少なくとも100アミノ酸）であり、コード
される部分のそれぞれのアミノ酸配列は重複しておらず、かつ2つの異なるベクターのう
ちのいずれの単一のベクターも、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリ
ンタンパク質）をコードしない。ベクターが哺乳動物細胞（例えば、本明細書に記載され
ている哺乳動物細胞のうちのいずれか）に導入されると、スプライシングドナーシグナル
配列とスプライシングアクセプターシグナル配列との間でスプライシングが生じ、それに
よって、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）をコード
する組換え核酸が形成される。
【0417】
別の例では、3つの異なる核酸ベクターが用いられる。第1の核酸ベクターは、プロモー
ター配列（例えば、本明細書に記載されているプロモーター配列のうちのいずれか）の一
部分、プロモーターの5'側に位置づけられたオトフェリンタンパク質（例えば、本明細書
に記載されているオトフェリンコード配列のうちのいずれか）の第1の部分をコードする
オトフェリン遺伝子の第1のコード配列、第1のコード配列の3'末端に位置づけられた第1
のスプライシングドナーシグナル配列、およびF1ファージの組換え誘導性領域を含み得る
。第2の核酸ベクターは、F1ファージの組換え誘導性領域、F1ファージの組換え誘導性領
域の3'側に位置づけられた第1のスプライシングアクセプターシグナル配列、第1のスプラ
イシングアクセプターシグナル配列の3'末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質の
第2の部分をコードするオトフェリン遺伝子の第2のコード配列、第2のコード配列の3'末
端に位置づけられた第2のスプライシングドナーシグナル配列（例えば、本明細書に記載
されているスプライシングドナーシグナルのうちのいずれか）、およびF1ファージの組換
え誘導性領域を含み得る。第2の核酸ベクターの特徴は、自己スプライシングが生じ得な
いことである（すなわちは、第2の核酸ベクターの第2のスプライシングドナーシグナル配
列と第1のスプライシングアクセプターシグナル配列との間では、スプライシング生じな
い）。いくつかの態様において、第1の核酸ベクターのスプライシングドナーシグナル配
列と第2の核酸ベクターの第2のスプライシングドナーシグナルとは同じである（例えば、
本明細書に記載のまたは当技術分野において公知のスプライシングドナーシグナルのうち
のいずれか）。いくつかの態様において、第1の核酸ベクターの第1のスプライシングドナ
ーシグナル配列と第2の核酸ベクターの第2のスプライシングドナーシグナル配列とは異な
っている（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知のスプライシングド
ナーシグナル配列のうちのいずれか）。第3の核酸ベクターは、F1ファージの組換え誘導
性領域、F1ファージの組換え誘導性領域の3'側に位置づけられた第2のスプライシングア
クセプターシグナル配列、第2のスプライシングアクセプターシグナル配列の3'末端に位
置づけられたオトフェリンタンパク質の第3の部分をコードするオトフェリン遺伝子の第3
のコード配列、および第3のコード配列の3'末端に位置づけられたポリアデニル化配列（
例えば、本明細書に記載されているポリアデニル化配列のうちのいずれか）を含み得る。
3つの核酸ベクターを用いるそのような方法では、第1のスプライシングドナー配列および
第1のスプライシングアクセプター配列は一緒に会合され（再結合され）、かつ第2のスプ
ライシングドナー配列および第2のスプライシングアクセプター配列は一緒に会合され（
再結合され）、かつ第1のコード配列、第2のコード配列、および第3のコード配列によっ
てコードされるオトフェリンタンパク質の部分は重複しておらず、かつ哺乳動物細胞（例
えば、本明細書に記載されている哺乳動物細胞のうちのいずれか）に導入されると、第1
のスプライシングドナー配列と第1のスプライシングアクセプター配列との間、および第2
のスプライシングドナー配列と第2のスプライシングアクセプター配列との間で、スプラ
イシングが生じ、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）
をコードする組換え核酸が形成される。当技術分野において理解されるように、3つの核
酸ベクターを用いる場合、異なる核酸ベクターのうち2つはF1ファージの組換え誘導性領
域を含む可能性があり、かつ異なる核酸ベクターのうち1つは、F1ファージの組換え誘導
性領域を含む核酸ベクターにおけるスプライシングドナーシグナル配列に相補的であるス
プライシングアクセプターシグナル配列を含んでもよい。例えば、いくつかの態様におい
て、第1の核酸ベクターおよび第2の核酸ベクターはF1ファージの組換え誘導性領域を含む
可能性があり、かつ第3の核酸ベクターは、第2の核酸ベクターにおけるスプライシングド
ナーシグナル配列に相補的であるスプライシングアクセプターシグナルを含み、かつ第3
の核酸ベクターは、F1ファージの組換え誘導性領域（例えば、APマーカー遺伝子）を含ま
ない。他の例では、第2の核酸ベクターおよび第3の核酸ベクターは、F1ファージの組換え
誘導性領域を含む可能性があり、かつ第1の核酸ベクターは、第2の核酸ベクターにおける
スプライシングアクセプターシグナル配列に相補的であるスプライシングドナーシグナル
配列を含み、かつ第1の核酸ベクターはF1ファージの組換え誘導性領域を含まない。上記
で提供される戦略に基づき、当業者は、4、5、または6つのベクターを用いる戦略を開発
する方法を理解するはずである。
ター配列（例えば、本明細書に記載されているプロモーター配列のうちのいずれか）の一
部分、プロモーターの5'側に位置づけられたオトフェリンタンパク質（例えば、本明細書
に記載されているオトフェリンコード配列のうちのいずれか）の第1の部分をコードする
オトフェリン遺伝子の第1のコード配列、第1のコード配列の3'末端に位置づけられた第1
のスプライシングドナーシグナル配列、およびF1ファージの組換え誘導性領域を含み得る
。第2の核酸ベクターは、F1ファージの組換え誘導性領域、F1ファージの組換え誘導性領
域の3'側に位置づけられた第1のスプライシングアクセプターシグナル配列、第1のスプラ
イシングアクセプターシグナル配列の3'末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質の
第2の部分をコードするオトフェリン遺伝子の第2のコード配列、第2のコード配列の3'末
端に位置づけられた第2のスプライシングドナーシグナル配列（例えば、本明細書に記載
されているスプライシングドナーシグナルのうちのいずれか）、およびF1ファージの組換
え誘導性領域を含み得る。第2の核酸ベクターの特徴は、自己スプライシングが生じ得な
いことである（すなわちは、第2の核酸ベクターの第2のスプライシングドナーシグナル配
列と第1のスプライシングアクセプターシグナル配列との間では、スプライシング生じな
い）。いくつかの態様において、第1の核酸ベクターのスプライシングドナーシグナル配
列と第2の核酸ベクターの第2のスプライシングドナーシグナルとは同じである（例えば、
本明細書に記載のまたは当技術分野において公知のスプライシングドナーシグナルのうち
のいずれか）。いくつかの態様において、第1の核酸ベクターの第1のスプライシングドナ
ーシグナル配列と第2の核酸ベクターの第2のスプライシングドナーシグナル配列とは異な
っている（例えば、本明細書に記載のまたは当技術分野において公知のスプライシングド
ナーシグナル配列のうちのいずれか）。第3の核酸ベクターは、F1ファージの組換え誘導
性領域、F1ファージの組換え誘導性領域の3'側に位置づけられた第2のスプライシングア
クセプターシグナル配列、第2のスプライシングアクセプターシグナル配列の3'末端に位
置づけられたオトフェリンタンパク質の第3の部分をコードするオトフェリン遺伝子の第3
のコード配列、および第3のコード配列の3'末端に位置づけられたポリアデニル化配列（
例えば、本明細書に記載されているポリアデニル化配列のうちのいずれか）を含み得る。
3つの核酸ベクターを用いるそのような方法では、第1のスプライシングドナー配列および
第1のスプライシングアクセプター配列は一緒に会合され（再結合され）、かつ第2のスプ
ライシングドナー配列および第2のスプライシングアクセプター配列は一緒に会合され（
再結合され）、かつ第1のコード配列、第2のコード配列、および第3のコード配列によっ
てコードされるオトフェリンタンパク質の部分は重複しておらず、かつ哺乳動物細胞（例
えば、本明細書に記載されている哺乳動物細胞のうちのいずれか）に導入されると、第1
のスプライシングドナー配列と第1のスプライシングアクセプター配列との間、および第2
のスプライシングドナー配列と第2のスプライシングアクセプター配列との間で、スプラ
イシングが生じ、活性オトフェリンタンパク質（例えば、全長オトフェリンタンパク質）
をコードする組換え核酸が形成される。当技術分野において理解されるように、3つの核
酸ベクターを用いる場合、異なる核酸ベクターのうち2つはF1ファージの組換え誘導性領
域を含む可能性があり、かつ異なる核酸ベクターのうち1つは、F1ファージの組換え誘導
性領域を含む核酸ベクターにおけるスプライシングドナーシグナル配列に相補的であるス
プライシングアクセプターシグナル配列を含んでもよい。例えば、いくつかの態様におい
て、第1の核酸ベクターおよび第2の核酸ベクターはF1ファージの組換え誘導性領域を含む
可能性があり、かつ第3の核酸ベクターは、第2の核酸ベクターにおけるスプライシングド
ナーシグナル配列に相補的であるスプライシングアクセプターシグナルを含み、かつ第3
の核酸ベクターは、F1ファージの組換え誘導性領域（例えば、APマーカー遺伝子）を含ま
ない。他の例では、第2の核酸ベクターおよび第3の核酸ベクターは、F1ファージの組換え
誘導性領域を含む可能性があり、かつ第1の核酸ベクターは、第2の核酸ベクターにおける
スプライシングアクセプターシグナル配列に相補的であるスプライシングドナーシグナル
配列を含み、かつ第1の核酸ベクターはF1ファージの組換え誘導性領域を含まない。上記
で提供される戦略に基づき、当業者は、4、5、または6つのベクターを用いる戦略を開発
する方法を理解するはずである。
【0418】
少なくとも2つの核酸ベクター（例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つ）のそれぞれ
において提供されるコード配列は、重複しない。少なくとも2つの異なるベクターのそれ
ぞれは、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードさ
れる部分のそれぞれは、少なくとも30アミノ酸（例えば、約30アミノ酸～約1600アミノ酸
、またはこの範囲における本明細書に記載の部分範囲のうちのいずれか）である。
において提供されるコード配列は、重複しない。少なくとも2つの異なるベクターのそれ
ぞれは、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードさ
れる部分のそれぞれは、少なくとも30アミノ酸（例えば、約30アミノ酸～約1600アミノ酸
、またはこの範囲における本明細書に記載の部分範囲のうちのいずれか）である。
【0419】
いくつかの態様において、少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれは、オトフェリ
ンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれ
は、SEQ IDNO：12の少なくとも1つのエクソンおよび少なくとも1つのイントロン（例え
ば、少なくとも2つのエクソンおよび少なくとも1つのイントロン、少なくとも2つのエク
ソンおよび少なくとも2つのイントロン、少なくとも3つエクソン少なくとも1つのイント
ロン、少なくとも3つエクソンおよび少なくとも2つのイントロン、または少なくとも3つ
エクソンおよび少なくとも3つイントロン）をコードする。いくつかの態様において、少
なくとも2つの異なるベクターのそれぞれは、オトフェリンタンパク質の異なる部得分を
コードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれは、コードされる部分のそれ
ぞれが重複しないように、SEQ ID NO：5の最大で80％（例えば、 SEQ ID NO：5の最大で1
0％、最大で20％、最大で30％、最大で40％、最大で50％、最大で60％、または最大で70
％）をコードする。いくつかの態様において、少なくとも2つの異なるベクターのそれぞ
れは、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされ
る部分のそれぞれは、コードされる部分のそれぞれが重複しないように、SEQ ID NO：5の
最大で80％（例えば、SEQID NO：5の最大で10％、最大で20％、最大で30％、最大で40％
、最大で50％、最大で60％、または最大で70％）をコードする。
ンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれ
は、SEQ IDNO：12の少なくとも1つのエクソンおよび少なくとも1つのイントロン（例え
ば、少なくとも2つのエクソンおよび少なくとも1つのイントロン、少なくとも2つのエク
ソンおよび少なくとも2つのイントロン、少なくとも3つエクソン少なくとも1つのイント
ロン、少なくとも3つエクソンおよび少なくとも2つのイントロン、または少なくとも3つ
エクソンおよび少なくとも3つイントロン）をコードする。いくつかの態様において、少
なくとも2つの異なるベクターのそれぞれは、オトフェリンタンパク質の異なる部得分を
コードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれは、コードされる部分のそれ
ぞれが重複しないように、SEQ ID NO：5の最大で80％（例えば、 SEQ ID NO：5の最大で1
0％、最大で20％、最大で30％、最大で40％、最大で50％、最大で60％、または最大で70
％）をコードする。いくつかの態様において、少なくとも2つの異なるベクターのそれぞ
れは、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされ
る部分のそれぞれは、コードされる部分のそれぞれが重複しないように、SEQ ID NO：5の
最大で80％（例えば、SEQID NO：5の最大で10％、最大で20％、最大で30％、最大で40％
、最大で50％、最大で60％、または最大で70％）をコードする。
【0420】
実施例18に記載されているように、少なくとも2つの核酸ベクターのそれぞれは、ヘッ
ドトゥテール組換えを可能にする末端逆位配列（ITR）をさらに含んでもよい。ITRはその
後、スプライシングによって除去される。ITRならびにスプライシングアクセプターおよ
び/またはドナーシグナルの例は、当技術分野において公知であり、かつ実施例18に記載
されている。
ドトゥテール組換えを可能にする末端逆位配列（ITR）をさらに含んでもよい。ITRはその
後、スプライシングによって除去される。ITRならびにスプライシングアクセプターおよ
び/またはドナーシグナルの例は、当技術分野において公知であり、かつ実施例18に記載
されている。
【0421】
これらの方法が用いられ、5匹の動物において聴力を回復させている。図15および16に
おけるデータは、図2に示したベクターを投与したOtof-/-マウスが、Otof-/-マウスのIHC
におけるオトフェリン機能を回復することを示す。
おけるデータは、図2に示したベクターを投与したOtof-/-マウスが、Otof-/-マウスのIHC
におけるオトフェリン機能を回復することを示す。
【0422】
他の態様
使用されている文章は限定ではなく説明の文章であり、そのより広い局面において本発
明の真の範囲および精神から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲の範囲内で変更を
行ってもよいことが理解されるはずである。
使用されている文章は限定ではなく説明の文章であり、そのより広い局面において本発
明の真の範囲および精神から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲の範囲内で変更を
行ってもよいことが理解されるはずである。
【0423】
本発明は、複数の記載の態様に関してかなり詳しくかつある程度の具体性をもって記載
されているが、いかなるそのような事項もしくは態様またはいかなる特定の態様に限定す
べきであることを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲に関して、従来技術を踏
まえそのような特許請求の可能な限り最も広い解釈を提供し、そのために、本発明の目的
とする範囲を効率的に包含するように解釈されるべきである。
されているが、いかなるそのような事項もしくは態様またはいかなる特定の態様に限定す
べきであることを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲に関して、従来技術を踏
まえそのような特許請求の可能な限り最も広い解釈を提供し、そのために、本発明の目的
とする範囲を効率的に包含するように解釈されるべきである。
【0424】
発明をその詳細な説明と共に記載しているが、前述の説明は例示を目的とするものであ
り、発明の範囲を限定するものではなく、それは添付の特許請求の範囲の範囲によって定
義されることが理解されるべきである。他の局面、利点、および変更は、添付の特許請求
の範囲の範囲内である。
り、発明の範囲を限定するものではなく、それは添付の特許請求の範囲の範囲によって定
義されることが理解されるべきである。他の局面、利点、および変更は、添付の特許請求
の範囲の範囲内である。
【0425】
本明細書において記述される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、
その全体が参照により組み入れられる。矛盾が生じる場合、定義を含む本明細書が優先さ
れる。加えて、段落の見出し、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定すること
を意図しない。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
少なくとも2つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、
該少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも30アミノ酸残基であり、該コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が、任意で、該コードされる部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と部分的に重複してもよく；
該少なくとも2つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず；
該コード配列のうちの少なくとも１つが、オトフェリンゲノムDNAの2つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ該2つの隣接するエクソンの間のイントロン配
列を欠いており；かつ
該少なくとも2つの異なるベクターが、哺乳動物細胞内に導入されたときに相互にコンカテマー化または相同組換えを受け、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換え核酸が形成される、
前記組成物。
(項目２)
前記少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、プラスミド、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、またはウイルスベクターである、項目1に記載の組成物。
(項目３)
前記少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、ヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、またはP1由来人工染色体（PAC）である、項目1に記載の組成物。
(項目４)
前記少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターから選択されるウイルスベクターである、項目1に記載の組成物。
(項目５)
前記少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、AAVベクターである、項目1に記載
の組成物。
(項目６)
前記コードされる部分のうちの1つのアミノ酸配列が、該コードされる部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と重複する、項目1～5のいずれか一項に記載の組成物。
(項目７)
前記コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が、異なるコードされる部分のアミノ酸配列と部分的に重複する、項目6に記載の組成物。
(項目８)
前記重複するアミノ酸配列の長さが、約30アミノ酸残基～約1000アミノ酸残基である、項目7に記載の組成物。
(項目９)
前記ベクターが2つの異なるベクターを含み、該異なるベクターのそれぞれが、イントロンの異なるセグメントを含み、該イントロンが、オトフェリンゲノムDNA中に存在するイントロンのヌクレオチド配列を含み、かつ該2つの異なるセグメントの配列が、少なくとも100ヌクレオチド重複する、項目1～5のいずれか一項に記載の組成物。
(項目１０)
前記2つの異なるセグメントの配列が、約100ヌクレオチド～約800ヌクレオチド重複す
る、項目9に記載の組成物。
(項目１１)
前記少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれのヌクレオチド配列の長さが、約500ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチドである、項目1～10のいずれか一項に記載の組成物。
(項目１２)
前記少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれのヌクレオチド配列の長さが、500ヌクレオチド～5,000ヌクレオチドである、項目11に記載の組成物。
(項目１３)
前記組成物中の異なるベクターの数が2つである、項目1～12のいずれか一項に記載の組成物。
(項目１４)
前記2つの異なるベクターのうちの第1のベクターが、前記オトフェリンタンパク質のN
末端部分をコードするコード配列を含む、項目13に記載の組成物。
(項目１５)
前記オトフェリンタンパク質の前記N末端部分の長さが、30アミノ酸～1600アミノ酸で
ある、項目14に記載の組成物。
(項目１６)
前記オトフェリンタンパク質の前記N末端部分の長さが、200アミノ酸～1500アミノ酸である、項目15に記載の組成物。
(項目１７)
前記第1のベクターが、プロモーターおよびKozak配列のうちの一方または両方をさらに含む、項目14～16のいずれか一項に記載の組成物。
(項目１８)
前記第1のベクターが、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであるプロモーターを含む、項目17に記載の組成物。
(項目１９)
前記2つの異なるベクターのうちの第2のベクターが、前記オトフェリンタンパク質のC
末端部分をコードするコード配列を含む、項目14～18のいずれか一項に記載の組成物。
(項目２０)
前記オトフェリンタンパク質の前記C末端部分の長さが、30アミノ酸～1600アミノ酸で
ある、項目19に記載の組成物。
(項目２１)
前記オトフェリンタンパク質の前記C末端部分の長さが、200アミノ酸～1500アミノ酸である、項目20に記載の組成物。
(項目２２)
前記第2のベクターがポリ(dA)配列をさらに含む、項目19～21のいずれか一項に記載の
組成物。
(項目２３)
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、項目1～22のいずれか一項に記載の組成物。
(項目２４)
項目1～23のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット。
(項目２５)
前記組成物を含む充填済みシリンジをさらに含む、項目24に記載のキット。
(項目２６)
治療的有効量の項目1～23のいずれか一項に記載の組成物を哺乳動物の蝸牛内に導入する工程を含む、方法。
(項目２７)
前記哺乳動物がヒトである、項目26に記載の方法。
(項目２８)
前記哺乳動物が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている、項目26または27に記載の方法。
(項目２９)
項目1～23のいずれか一項に記載の組成物を哺乳動物細胞内に導入する工程を含む、哺乳動物細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法。
(項目３０)
前記哺乳動物細胞が内有毛細胞である、項目29に記載の方法。
(項目３１)
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、項目29または30に記載の方法。
(項目３２)
前記哺乳動物細胞が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に判定されている、項目29～31のいずれか一項に記載の方法。
(項目３３)
治療的有効量の項目1～23のいずれか一項に記載の組成物を哺乳動物の蝸牛内に導入する工程を含む、哺乳動物の蝸牛の内有毛細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法。
(項目３４)
前記哺乳動物が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている、項目33に記載の方法。
(項目３５)
前記哺乳動物がヒトである、項目33または34に記載の方法。
(項目３６)
治療的有効量の項目1～23のいずれか一項に記載の組成物を対象の蝸牛内に投与する工程を含む、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると特定された対象において非症候性感音難聴を治療する方法。
(項目３７)
前記対象がヒトである、項目36に記載の方法。
(項目３８)
前記投与する工程の前に、前記対象が欠陥オトフェリン遺伝子を有することを判定する工程をさらに含む、項目36または37に記載の方法。
(項目３９)
2つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、
該2つの異なる核酸ベクターのうちの第1の核酸ベクターが、プロモーター、該プロモーターの3'側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のN末端部分をコードする第1のコード配列、および該第1のコード配列の3'末端に位置づけられたスプライシングドナーシグ
ナル配列を含み；かつ
該2つの異なる核酸ベクターのうちの第2の核酸ベクターが、スプライシングアクセプターシグナル配列、該スプライシングアクセプターシグナル配列の3'末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質のC末端部分をコードする第2のコード配列、および該第2のコー
ド配列の3'末端のポリアデニル化配列を含み；
コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも30アミノ酸残基であり、該コードされる部分のアミノ酸配列が重複せず、該2つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベク
ターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず、かつ、該コード配列が哺乳動物細胞において転写されてRNA転写産物が生成されると、一方の転写産物上のスプライシングドナーシグナル配列ともう一方の転写産物上のスプライシングアクセプターシグナル配列との間でスプライシングが起こり、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換えRNA分子が形成される、
前記組成物。
(項目４０)
前記ベクターのうちの少なくとも1つのベクターのコード配列が、オトフェリンゲノムDNAの2つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ該2つの隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いている、項目39に記載の組成物。
(項目４１)
プロモーター、該プロモーターの3'側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のN末端部分をコードする第1のコード配列、該第1のコード配列の3'末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列、および該スプライシングドナーシグナル配列の3'側に位置づけられた第1の検出可能なマーカー遺伝子を含む、第1の核酸ベクター；ならびに
第2の検出可能なマーカー遺伝子、該第2の検出可能なマーカー遺伝子の3'側に位置づけられたスプライシングアクセプターシグナル配列、該スプライシングアクセプターシグナル配列の3'末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質のC末端部分をコードする第2のコード配列、および該第2のコード配列の3'末端に位置づけられたポリアデニル化配列を
含む、該第1の核酸ベクターとは異なる第2の核酸ベクター
を含む組成物であって；
コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも30アミノ酸残基であり、該コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が相互に重複せず、2つの異なる該ベクターのうちのい
ずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず、かつ、該コード配列が哺乳動物細胞において転写されてRNA転写産物が生成されると、一方の転写産物上のスプライシングドナーシグナルともう一方の転写産物上のスプライシングアクセプターシグナルとの間でスプライシングが起こり、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換えRNA分子が形成される、
前記組成物。
(項目４２)
前記ベクターのうちの少なくとも1つのベクターのコード配列が、オトフェリンゲノムDNAの2つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ該2つの隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いている、項目41に記載の組成物。
(項目４３)
前記第1または第2の検出可能なマーカー遺伝子がアルカリホスファターゼをコードする、項目41に記載の組成物。
(項目４４)
前記第1および第2の検出可能なマーカー遺伝子が同じである、項目41または43に記載の組成物。
(項目４５)
プロモーター、該プロモーターの3'側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のN末端部分をコードする第1のコード配列、該第1のコード配列の3'末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列、および該スプライシングドナーシグナル配列の3'側に位置づけられたF1ファージの組換え誘導性（recombinogenic）領域を含む、第1の核酸ベク
ター；ならびに
第2のF1ファージの組換え誘導性領域、該第2のF1ファージの組換え誘導性領域の3'側に位置づけられたスプライシングアクセプターシグナル配列、該スプライシングアクセプターシグナル配列の3'末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質のC末端部分をコード
する第2のコード配列、および該第2のコード配列の3'末端に位置づけられたポリアデニル化配列を含む、該第1の核酸ベクターとは異なる第2の核酸ベクター
を含む組成物であって；
コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも30アミノ酸残基であり、該コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が相互に重複せず、該2つの異なるベクターのうちのい
ずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず、かつ、該コード配列が哺乳動物細胞において転写されてRNA転写産物が生成されると、一方の転写産物上のスプライシングドナーシグナルともう一方の転写産物上のスプライシングアクセプターシグナルとの間でスプライシングが起こり、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換えRNA分子が形成される、
前記組成物。
(項目４６)
前記ベクターのうちの少なくとも1つのベクターのコード配列が、オトフェリンゲノムDNAの2つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ該2つの隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いている、項目45に記載の組成物。
(項目４７)
項目39～46のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット。
(項目４８)
前記組成物がシリンジに充填済みである、項目47に記載のキット。
(項目４９)
治療的有効量の項目39～46のいずれか一項に記載の組成物を哺乳動物の蝸牛内に導入する工程を含む、方法。
(項目５０)
前記哺乳動物がヒトである、項目49に記載の方法。
(項目５１)
前記哺乳動物が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている、項目49または50に記載の方法。
(項目５２)
項目39～46のいずれか一項に記載の組成物を哺乳動物細胞内に導入する工程を含む、哺乳動物細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法。
(項目５３)
前記哺乳動物細胞が蝸牛内有毛細胞である、項目52に記載の方法。
(項目５４)
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、項目52または53に記載の方法。
(項目５５)
前記哺乳動物細胞が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に判定されている、項目52～54のいずれか一項に記載の方法。
(項目５６)
治療的有効量の項目39～46のいずれか一項に記載の組成物を蝸牛内に導入する工程を含む、哺乳動物の蝸牛の内有毛細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法。
(項目５７)
前記哺乳動物が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている、項目56に記載の方法。
(項目５８)
前記哺乳動物がヒトである、項目56または57に記載の方法。
(項目５９)
治療的有効量の項目39～46のいずれか一項に記載の組成物を対象の蝸牛内に投与する工程を含む、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると特定された対象において非症候性感音難聴を治療する方法。
(項目６０)
前記対象がヒトである、項目59に記載の方法。
(項目６１)
前記投与する工程の前に、前記対象が欠陥オトフェリン遺伝子を有することを判定する工程をさらに含む、項目59または60に記載の方法。
(項目６２)
前記2つのベクターのうちの第1のベクターがSEQ ID NO: 39を含み、かつ該2つのベクターのうちの第2のベクターがSEQID NO: 40を含む、項目13に記載の組成物。
(項目６３)
前記2つのベクターのうちの第1のベクターがSEQ ID NO: 41を含み、かつ該2つのベクターのうちの第2のベクターがSEQID NO: 42を含む、項目13に記載の組成物。
その全体が参照により組み入れられる。矛盾が生じる場合、定義を含む本明細書が優先さ
れる。加えて、段落の見出し、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定すること
を意図しない。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
少なくとも2つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、
該少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、オトフェリンタンパク質の異なる部分をコードするコード配列を含み、コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも30アミノ酸残基であり、該コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が、任意で、該コードされる部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と部分的に重複してもよく；
該少なくとも2つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず；
該コード配列のうちの少なくとも１つが、オトフェリンゲノムDNAの2つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ該2つの隣接するエクソンの間のイントロン配
列を欠いており；かつ
該少なくとも2つの異なるベクターが、哺乳動物細胞内に導入されたときに相互にコンカテマー化または相同組換えを受け、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換え核酸が形成される、
前記組成物。
(項目２)
前記少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、プラスミド、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、またはウイルスベクターである、項目1に記載の組成物。
(項目３)
前記少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、ヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、またはP1由来人工染色体（PAC）である、項目1に記載の組成物。
(項目４)
前記少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターから選択されるウイルスベクターである、項目1に記載の組成物。
(項目５)
前記少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれが、AAVベクターである、項目1に記載
の組成物。
(項目６)
前記コードされる部分のうちの1つのアミノ酸配列が、該コードされる部分のうちの異なるもののアミノ酸配列と重複する、項目1～5のいずれか一項に記載の組成物。
(項目７)
前記コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が、異なるコードされる部分のアミノ酸配列と部分的に重複する、項目6に記載の組成物。
(項目８)
前記重複するアミノ酸配列の長さが、約30アミノ酸残基～約1000アミノ酸残基である、項目7に記載の組成物。
(項目９)
前記ベクターが2つの異なるベクターを含み、該異なるベクターのそれぞれが、イントロンの異なるセグメントを含み、該イントロンが、オトフェリンゲノムDNA中に存在するイントロンのヌクレオチド配列を含み、かつ該2つの異なるセグメントの配列が、少なくとも100ヌクレオチド重複する、項目1～5のいずれか一項に記載の組成物。
(項目１０)
前記2つの異なるセグメントの配列が、約100ヌクレオチド～約800ヌクレオチド重複す
る、項目9に記載の組成物。
(項目１１)
前記少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれのヌクレオチド配列の長さが、約500ヌクレオチド～約10,000ヌクレオチドである、項目1～10のいずれか一項に記載の組成物。
(項目１２)
前記少なくとも2つの異なるベクターのそれぞれのヌクレオチド配列の長さが、500ヌクレオチド～5,000ヌクレオチドである、項目11に記載の組成物。
(項目１３)
前記組成物中の異なるベクターの数が2つである、項目1～12のいずれか一項に記載の組成物。
(項目１４)
前記2つの異なるベクターのうちの第1のベクターが、前記オトフェリンタンパク質のN
末端部分をコードするコード配列を含む、項目13に記載の組成物。
(項目１５)
前記オトフェリンタンパク質の前記N末端部分の長さが、30アミノ酸～1600アミノ酸で
ある、項目14に記載の組成物。
(項目１６)
前記オトフェリンタンパク質の前記N末端部分の長さが、200アミノ酸～1500アミノ酸である、項目15に記載の組成物。
(項目１７)
前記第1のベクターが、プロモーターおよびKozak配列のうちの一方または両方をさらに含む、項目14～16のいずれか一項に記載の組成物。
(項目１８)
前記第1のベクターが、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターであるプロモーターを含む、項目17に記載の組成物。
(項目１９)
前記2つの異なるベクターのうちの第2のベクターが、前記オトフェリンタンパク質のC
末端部分をコードするコード配列を含む、項目14～18のいずれか一項に記載の組成物。
(項目２０)
前記オトフェリンタンパク質の前記C末端部分の長さが、30アミノ酸～1600アミノ酸で
ある、項目19に記載の組成物。
(項目２１)
前記オトフェリンタンパク質の前記C末端部分の長さが、200アミノ酸～1500アミノ酸である、項目20に記載の組成物。
(項目２２)
前記第2のベクターがポリ(dA)配列をさらに含む、項目19～21のいずれか一項に記載の
組成物。
(項目２３)
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、項目1～22のいずれか一項に記載の組成物。
(項目２４)
項目1～23のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット。
(項目２５)
前記組成物を含む充填済みシリンジをさらに含む、項目24に記載のキット。
(項目２６)
治療的有効量の項目1～23のいずれか一項に記載の組成物を哺乳動物の蝸牛内に導入する工程を含む、方法。
(項目２７)
前記哺乳動物がヒトである、項目26に記載の方法。
(項目２８)
前記哺乳動物が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている、項目26または27に記載の方法。
(項目２９)
項目1～23のいずれか一項に記載の組成物を哺乳動物細胞内に導入する工程を含む、哺乳動物細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法。
(項目３０)
前記哺乳動物細胞が内有毛細胞である、項目29に記載の方法。
(項目３１)
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、項目29または30に記載の方法。
(項目３２)
前記哺乳動物細胞が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に判定されている、項目29～31のいずれか一項に記載の方法。
(項目３３)
治療的有効量の項目1～23のいずれか一項に記載の組成物を哺乳動物の蝸牛内に導入する工程を含む、哺乳動物の蝸牛の内有毛細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法。
(項目３４)
前記哺乳動物が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている、項目33に記載の方法。
(項目３５)
前記哺乳動物がヒトである、項目33または34に記載の方法。
(項目３６)
治療的有効量の項目1～23のいずれか一項に記載の組成物を対象の蝸牛内に投与する工程を含む、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると特定された対象において非症候性感音難聴を治療する方法。
(項目３７)
前記対象がヒトである、項目36に記載の方法。
(項目３８)
前記投与する工程の前に、前記対象が欠陥オトフェリン遺伝子を有することを判定する工程をさらに含む、項目36または37に記載の方法。
(項目３９)
2つの異なる核酸ベクターを含む組成物であって、
該2つの異なる核酸ベクターのうちの第1の核酸ベクターが、プロモーター、該プロモーターの3'側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のN末端部分をコードする第1のコード配列、および該第1のコード配列の3'末端に位置づけられたスプライシングドナーシグ
ナル配列を含み；かつ
該2つの異なる核酸ベクターのうちの第2の核酸ベクターが、スプライシングアクセプターシグナル配列、該スプライシングアクセプターシグナル配列の3'末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質のC末端部分をコードする第2のコード配列、および該第2のコー
ド配列の3'末端のポリアデニル化配列を含み；
コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも30アミノ酸残基であり、該コードされる部分のアミノ酸配列が重複せず、該2つの異なるベクターのうちのいずれの単一のベク
ターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず、かつ、該コード配列が哺乳動物細胞において転写されてRNA転写産物が生成されると、一方の転写産物上のスプライシングドナーシグナル配列ともう一方の転写産物上のスプライシングアクセプターシグナル配列との間でスプライシングが起こり、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換えRNA分子が形成される、
前記組成物。
(項目４０)
前記ベクターのうちの少なくとも1つのベクターのコード配列が、オトフェリンゲノムDNAの2つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ該2つの隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いている、項目39に記載の組成物。
(項目４１)
プロモーター、該プロモーターの3'側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のN末端部分をコードする第1のコード配列、該第1のコード配列の3'末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列、および該スプライシングドナーシグナル配列の3'側に位置づけられた第1の検出可能なマーカー遺伝子を含む、第1の核酸ベクター；ならびに
第2の検出可能なマーカー遺伝子、該第2の検出可能なマーカー遺伝子の3'側に位置づけられたスプライシングアクセプターシグナル配列、該スプライシングアクセプターシグナル配列の3'末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質のC末端部分をコードする第2のコード配列、および該第2のコード配列の3'末端に位置づけられたポリアデニル化配列を
含む、該第1の核酸ベクターとは異なる第2の核酸ベクター
を含む組成物であって；
コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも30アミノ酸残基であり、該コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が相互に重複せず、2つの異なる該ベクターのうちのい
ずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず、かつ、該コード配列が哺乳動物細胞において転写されてRNA転写産物が生成されると、一方の転写産物上のスプライシングドナーシグナルともう一方の転写産物上のスプライシングアクセプターシグナルとの間でスプライシングが起こり、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換えRNA分子が形成される、
前記組成物。
(項目４２)
前記ベクターのうちの少なくとも1つのベクターのコード配列が、オトフェリンゲノムDNAの2つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ該2つの隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いている、項目41に記載の組成物。
(項目４３)
前記第1または第2の検出可能なマーカー遺伝子がアルカリホスファターゼをコードする、項目41に記載の組成物。
(項目４４)
前記第1および第2の検出可能なマーカー遺伝子が同じである、項目41または43に記載の組成物。
(項目４５)
プロモーター、該プロモーターの3'側に位置づけられたオトフェリンタンパク質のN末端部分をコードする第1のコード配列、該第1のコード配列の3'末端に位置づけられたスプライシングドナーシグナル配列、および該スプライシングドナーシグナル配列の3'側に位置づけられたF1ファージの組換え誘導性（recombinogenic）領域を含む、第1の核酸ベク
ター；ならびに
第2のF1ファージの組換え誘導性領域、該第2のF1ファージの組換え誘導性領域の3'側に位置づけられたスプライシングアクセプターシグナル配列、該スプライシングアクセプターシグナル配列の3'末端に位置づけられたオトフェリンタンパク質のC末端部分をコード
する第2のコード配列、および該第2のコード配列の3'末端に位置づけられたポリアデニル化配列を含む、該第1の核酸ベクターとは異なる第2の核酸ベクター
を含む組成物であって；
コードされる部分のそれぞれの長さが少なくとも30アミノ酸残基であり、該コードされる部分のそれぞれのアミノ酸配列が相互に重複せず、該2つの異なるベクターのうちのい
ずれの単一のベクターも、全長オトフェリンタンパク質をコードしておらず、かつ、該コード配列が哺乳動物細胞において転写されてRNA転写産物が生成されると、一方の転写産物上のスプライシングドナーシグナルともう一方の転写産物上のスプライシングアクセプターシグナルとの間でスプライシングが起こり、それによって、全長オトフェリンタンパク質をコードする組換えRNA分子が形成される、
前記組成物。
(項目４６)
前記ベクターのうちの少なくとも1つのベクターのコード配列が、オトフェリンゲノムDNAの2つの隣接するエクソンに及ぶヌクレオチド配列を含み、かつ該2つの隣接するエクソンの間のイントロン配列を欠いている、項目45に記載の組成物。
(項目４７)
項目39～46のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット。
(項目４８)
前記組成物がシリンジに充填済みである、項目47に記載のキット。
(項目４９)
治療的有効量の項目39～46のいずれか一項に記載の組成物を哺乳動物の蝸牛内に導入する工程を含む、方法。
(項目５０)
前記哺乳動物がヒトである、項目49に記載の方法。
(項目５１)
前記哺乳動物が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている、項目49または50に記載の方法。
(項目５２)
項目39～46のいずれか一項に記載の組成物を哺乳動物細胞内に導入する工程を含む、哺乳動物細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法。
(項目５３)
前記哺乳動物細胞が蝸牛内有毛細胞である、項目52に記載の方法。
(項目５４)
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、項目52または53に記載の方法。
(項目５５)
前記哺乳動物細胞が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に判定されている、項目52～54のいずれか一項に記載の方法。
(項目５６)
治療的有効量の項目39～46のいずれか一項に記載の組成物を蝸牛内に導入する工程を含む、哺乳動物の蝸牛の内有毛細胞において全長オトフェリンタンパク質の発現を増大させる方法。
(項目５７)
前記哺乳動物が、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると以前に特定されている、項目56に記載の方法。
(項目５８)
前記哺乳動物がヒトである、項目56または57に記載の方法。
(項目５９)
治療的有効量の項目39～46のいずれか一項に記載の組成物を対象の蝸牛内に投与する工程を含む、欠陥オトフェリン遺伝子を有すると特定された対象において非症候性感音難聴を治療する方法。
(項目６０)
前記対象がヒトである、項目59に記載の方法。
(項目６１)
前記投与する工程の前に、前記対象が欠陥オトフェリン遺伝子を有することを判定する工程をさらに含む、項目59または60に記載の方法。
(項目６２)
前記2つのベクターのうちの第1のベクターがSEQ ID NO: 39を含み、かつ該2つのベクターのうちの第2のベクターがSEQID NO: 40を含む、項目13に記載の組成物。
(項目６３)
前記2つのベクターのうちの第1のベクターがSEQ ID NO: 41を含み、かつ該2つのベクターのうちの第2のベクターがSEQID NO: 42を含む、項目13に記載の組成物。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】
【外国語明細書】