特開 2022-188912 マイクロ流体デバイス、マイクロ流体デバイスの製造方法、及びマイクロ流体デバイスの使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022188912

(43)【公開日】2022-12-22

(54)【発明の名称】マイクロ流体デバイス、マイクロ流体デバイスの製造方法、及びマイクロ流体デバイスの使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20221215BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20221215BHJP

   C12N 5/0793 20100101ALN20221215BHJP

【ＦＩ】

C12M3/00 A

C12Q1/04

C12N5/0793

【審査請求】未請求

【請求項の数】10

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021097200

(22)【出願日】2021-06-10

(71)【出願人】

【識別番号】597124316

【氏名又は名称】学校法人東北工業大学

(71)【出願人】

【識別番号】000102212

【氏名又は名称】ウシオ電機株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 郁郎

(72)【発明者】

【氏名】山中 誠

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA01

4B029BB11

4B029CC02

4B029GA08

4B029GB04

4B029GB09

4B063QA18

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QR90

4B063QS39

4B065AA90X

4B065AC20

4B065CA46

(57)【要約】

【課題】細胞体と細胞体から延びる突起状の細胞構成部位とを効率よく分離して培養することができるマイクロ流体デバイス、マイクロ流体デバイスの製造方法、及びマイクロ流体デバイスの使用方法を提供する。
【解決手段】細胞体と前記細胞体から延びる突起状の細胞構成部位とを分離した状態で培養可能なマイクロ流体デバイスであって、細胞体を培養可能な第一培養空間と、第一培養空間から延設されて細胞構成部位を培養可能な第二培養空間と、を備え、第二培養空間は、延設方向に見たとき、扁平な形状であって細胞体から延びる細胞構成部位の培養が可能な幅を持つと共に、細胞体が侵入しない高さを有する。
【選択図】図４

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞体と前記細胞体から延びる突起状の細胞構成部位とを分離した状態で培養可能なマイクロ流体デバイスであって、
前記細胞体を培養可能な第一培養空間と、前記第一培養空間から延設されて前記細胞構成部位を培養可能な第二培養空間と、を備え、
前記第二培養空間は、延設方向に見たとき、扁平な形状であって前記細胞体から延びる前記細胞構成部位の培養が可能な幅を持つと共に、前記細胞体が侵入しない高さを有することを特徴とするマイクロ流路デバイス。

【請求項2】

前記第二培養空間は、扁平な形状であって前記細胞体から延びる前記細胞構成部位の直径の７倍以上の幅を有することを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流路デバイス。

【請求項3】

前記第二培養空間は、幅が高さの１０倍以上の大きさであることを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流路デバイス。

【請求項4】

前記第二培養空間の高さは、５μｍ以上８０μｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項5】

前記第一培養空間及び／又は前記第二培養空間は外部から観察可能に構成されていることを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項6】

前記マイクロ流体デバイスは、熱可塑性樹脂により構成されていることを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項7】

前記熱可塑性樹脂は、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）であることを特徴とする請求項６に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項8】

前記細胞体は、神経細胞であり、前記細胞構成部位は、前記神経細胞から延びる神経突起であることを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項9】

請求項１に記載のマイクロ流体デバイスを製造する方法であって、
第一基板に、前記第一基板の第一主面から第二主面に向かって延びる貫通孔と、前記第二主面に設けられて前記貫通孔に連通する凹部と、を形成する工程と、
第二基板を前記第一基板の前記第二主面に当接させて前記貫通孔及び前記凹部を覆う工程と、
前記第一基板と前記第二基板を光接合により接合する工程と、を有することを特徴とするマイクロ流体デバイスの製造方法。

【請求項10】

請求項１に記載のマイクロ流体デバイスの使用方法であって、
前記細胞体を前記第一培養空間で培養し、前記細胞体から延びる前記細胞構成部位を前記第二培養空間で培養するステップと、
前記第二培養空間内に薬剤を投与して、前記細胞構成部位に対する前記薬剤の薬効及び／又は毒性を評価するステップと、を有することを特徴とするマイクロ流体デバイスの使用方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、マイクロ流体デバイス、マイクロ流体デバイスの製造方法、及びマイクロ流体デバイスの使用方法に関する。

【背景技術】

【0002】

神経毒性を評価する従来の方法として、実験動物を利用する方法では反射運動を見る観察試験がある。また、培養細胞を用いた培養試験ではマルチ電極アレイを用いた電気生理計測法がある。

【0003】

しかし、実験動物を利用する方法では、動物は人体との種差があるため、人体向けの検証には信頼性が低い。また、細胞電気生理の方法では、計測と分析に非常に高度な専門知識を要する。また、測定器が高価であり多数の試験に対応できないという問題がある。

【0004】

さらに、神経毒性を評価する方法として、マイクロ流体デバイスを用いて神経細胞から神経突起を形成させて薬剤刺激とその応答を観察する方法が知られている（例えば、下記特許文献１及び２）。特許文献１では、細胞体から延びた神経突起（軸索ともいう）を培養可能なチャネルを有するマイクロ流体デバイスが開示されている。特許文献２では、細胞体から延びた神経突起を培養可能な流路を有するマイクロ流体デバイスが開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特許第６４３０６８０号公報

【特許文献2】特許第５９０４７８９号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかしながら、特許文献１のチャネルは、幅１００～１５０μｍ及び高さ１００～２００μｍであり、幅と高さが神経突起の太さに比べて大きく、且つ幅と高さの大きさが近いため、神経突起が集合して束状構造を形成する。神経突起の束状構造を生成させる流路構造では、神経突起の個別の成長を観察して分析することができない。

【0007】

特許文献２の流路は、内径が１０μｍであり、神経突起は非常に微小な流路を通過する必要があるため、神経突起が成長しにくく、試験の効率が低下する。また、神経突起を覆って保護するミエリンを構成する細胞が流路を通過できないため、神経突起の成長や機能が不完全となる。結果、生体を再現した薬剤試験とならない。

【0008】

本発明は、上記の課題に鑑み、細胞体と細胞体から延びる突起状の細胞構成部位とを効率よく分離して培養することができるマイクロ流体デバイス、マイクロ流体デバイスの製造方法、及びマイクロ流体デバイスの使用方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明に係るマイクロ流体デバイスは、細胞体と前記細胞体から延びる突起状の細胞構成部位とを分離した状態で培養可能なマイクロ流体デバイスであって、
前記細胞体を培養可能な第一培養空間と、前記第一培養空間から延設されて前記細胞構成部位を培養可能な第二培養空間と、を備え、前記第二培養空間は、延設方向に見たとき、扁平な形状であって前記細胞体から延びる前記細胞構成部位の培養が可能な幅を持つと共に、前記細胞体が侵入しない高さを有するように構成されているものである。
また、前記第二培養空間は、扁平な形状であって前記細胞体から延びる前記細胞構成部位の直径の７倍以上の幅を有するように構成されているものである。
更には、前記第二培養空間は、幅が高さの１０倍以上の大きさとなるように構成されているものである。

【0010】

この構成によれば、第一培養空間は、細胞体を培養することができ、第二培養空間は、細胞体から延びる細胞構成部位を培養することができる。このとき、第二培養空間は、扁平な形状であって前記細胞体から延びる前記細胞構成部位の直径の７倍以上の幅を有する。更には、幅が高さの１０倍以上となるように扁平な断面形状に構成されている。このため、複数の神経突起が束状構造をとらず、それぞれの神経突起が幅方向に並ぶように培養される。その結果、本発明のマイクロ流体デバイスによれば、細胞体と細胞体から延びる突起状の細胞構成部位とを効率よく分離して培養することができる。

【0011】

本発明に係るマイクロ流体デバイスにおいて、前記第二培養空間の高さは、５μｍ以上８０μｍ以下である、という構成でもよい。この構成によれば、細胞構成部位を第二培養空間にて適切に培養することができる。

【0012】

本発明に係るマイクロ流体デバイスにおいて、前記第一培養空間及び／又は前記第二培養空間は外部から観察可能に構成されている、という構成でもよい。この構成によれば、培養から観察評価までの一連の操作を一つのマイクロ流体デバイス内で実施することができる。

【0013】

本発明に係るマイクロ流体デバイスは、熱可塑性樹脂により構成されている、という構成でもよい。この構成によれば、射出成形により容易にマイクロ流体デバイスを成形することができる。

【0014】

本発明に係るマイクロ流体デバイスにおいて、前記熱可塑性樹脂は、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）である、という構成でもよい。ＣＯＰは、低薬剤吸着性を有するため、薬剤吸着が少なく正確な薬剤評価を行うことができる。また、ＣＯＰは、高透明性を有するため、外部から細胞を観察しやすい。

【0015】

本発明に係るマイクロ流体デバイスの製造方法は、
第一基板に、前記第一基板の第一主面から第二主面に向かって延びる貫通孔と、前記第二主面に設けられて前記貫通孔に連通する凹部と、を形成する工程と、
第二基板を前記第一基板の前記第二主面に当接させて前記貫通孔及び前記凹部を覆う工程と、
前記第一基板と前記第二基板を光接合により接合する工程と、を有するものである。

【0016】

この構成によれば、第一基板と第二基板とが接合されることにより、貫通孔が第一培養空間として機能し、凹部が第二培養空間として機能する。また、第一基板と第二基板を光接合により接合することで、薬剤の評価に悪影響を与えたり、細胞を傷害したりする溶出物が発生しないマイクロ流体デバイスとすることができる。

【0017】

本発明に係るマイクロ流体デバイスの使用方法は、
前記細胞体を前記第一培養空間で培養し、前記細胞体から延びる前記細胞構成部位を前記第二培養空間で培養するステップと、
前記第二培養空間内に薬剤を投与して、前記細胞構成部位に対する前記薬剤の薬効及び／又は毒性を評価するステップと、を有するものである。

【0018】

本発明のマイクロ流体デバイスの使用方法によれば、細胞体と細胞体から延びる突起状の細胞構成部位とを効率よく分離して培養することができるため、生体環境に近い状態を再現した薬剤評価を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】本実施形態に係るマイクロ流体デバイスを製造する前の状態における斜視図

【図2】マイクロ流体デバイスの平面図

【図3】図２に示すマイクロ流体デバイスのIII－III線断面図

【図4】マイクロ流体デバイスで神経細胞を培養した様子を模式的に示す平面図

【図5】図４に示すマイクロ流体デバイス１のＶ－Ｖ線断面図

【図6A】別実施形態に係るマイクロ流体デバイスの平面図

【図6B】別実施形態に係るマイクロ流体デバイスの断面図

【図7A】別実施形態に係るマイクロ流体デバイスの平面図

【図7B】別実施形態に係るマイクロ流体デバイスの断面図

【図8A】別実施形態に係るマイクロ流体デバイスの平面図

【図8B】別実施形態に係るマイクロ流体デバイスの断面図

【図9A】別実施形態に係るマイクロ流体デバイスの平面図

【図9B】別実施形態に係るマイクロ流体デバイスの断面図

【発明を実施するための形態】

【0020】

［マイクロ流体デバイスの構造］
本発明に係るマイクロ流体デバイスにつき、図面を参照しながら説明する。なお、本明細書に開示された各図面は、あくまで模式的に図示されたものである。すなわち、図面上の寸法比と実際の寸法比とは必ずしも一致しておらず、また、各図面間においても寸法比は必ずしも一致していない。

【0021】

図１は、本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１を製造する前の状態における斜視図である。マイクロ流体デバイス１は、第一基板１０と第二基板２０とを有し、これらが接合されることで製造される。図１は、第一基板１０に第二基板２０を接合する直前の、両基板を示した斜視図に対応する。

【0022】

マイクロ流体デバイス１は、第二基板２０の一つの主面２０ａ上に、第一基板１０の一つの主面１０ｂ（本発明の第二主面に相当する）が部分的に接触するように積層し、接合されて形成される。主面とは、基板１０，２０を構成する面のうち他の面よりもはるかに面積の大きい面を指す。基板１０，２０にはそれぞれ二つの主面があり、この二つの主面は互いに対向配置される。第二基板２０に部分的に接触する第一基板１０の主面１０ｂは凹部（後述する）を有する。第一基板１０のもう一つの主面１０ａ（本発明の第一主面に相当する）は、第二基板２０とは反対側に位置し、ポート１１，１２（後述する）を有する。

【0023】

以下の説明では、第一基板１０と第二基板２０とが接合された状態において、第一基板１０の主面１０ａ，１０ｂ及び第二基板２０の主面２０ａ，２０ｂに平行な面をＸＹ平面とし、このＸＹ平面に直交する方向をＺ方向とする、ＸＹＺ座標系が適宜参照される。

【0024】

また、本明細書において、方向を表現する際に、正負の向きを区別する場合には、「＋Ｘ方向」、「－Ｘ方向」のように、正負の符号を付して記載される。また、正負の向きを区別せずに方向を表現する場合には、単に「Ｘ方向」と記載される。すなわち、本明細書において、単に「Ｘ方向」と記載されている場合には、「＋Ｘ方向」と「－Ｘ方向」の双方が含まれる。Ｙ方向及びＺ方向についても同様である。なお、マイクロ流体デバイス１は、通常、Ｚ方向を上下方向として使用され、－Ｚ方向が上方向に相当する。

【0025】

図２は、マイクロ流体デバイス１の平面図である。図３は、第二基板２０上に第一基板１０が接合されたマイクロ流体デバイス１の断面模式図を示し、当該断面模式図は、図２に示すマイクロ流体デバイス１のIII－III線断面図である。図３の断面模式図は、図の理解を容易にするために、両基板の外形線のうち断面上に表れる線のみを示している。後述する図５についても同様である。

【0026】

第一基板１０及び第二基板２０は、それぞれ同一形状の主面を有する矩形基板である。第一基板１０及び第二基板２０の主面の縦と横は、例えば１０ｍｍと２０ｍｍである。また、第一基板１０の厚みは第二基板２０の厚みよりも大きい。第一基板１０の厚みは、例えば、０．２～１０ｍｍであり、本実施形態では３ｍｍである。また、第二基板２０の厚みは、例えば０．１～２ｍｍであり、本実施形態では１ｍｍである。

【0027】

第一基板１０には、図１に示すように、第一主面１０ａから第二主面１０ｂへ向かって延びる貫通孔１１ａ及び貫通孔１２ａが形成されている。貫通孔１１ａ及び貫通孔１２ａは、Ｘ方向に並べて配置されている。第一主面１０ａにおける貫通孔１１ａの開口部がポート１１であり、第一主面１０ａにおける貫通孔１２ａの開口部がポート１２である。

【0028】

ポート１１，１２は、液体をマイクロ流体デバイス１に注入する目的と、液体をマイクロ流体デバイス１から排出する目的と、の少なくとも一方の目的を有する。例えば、ポート１１が液体注入口として使用され、ポート１２が液体排出口として使用されてもよい。

【0029】

貫通孔１１ａは、第一基板１０と第二基板２０とが接合されることにより、第一培養空間３１として機能する。ただし、本実施形態では貫通孔１１ａが第一培養空間３１として機能する例を示すが、貫通孔１２ａが第一培養空間３１として機能するようにしてもよい。また、貫通孔１１ａと貫通孔１２ａの両方がそれぞれ第一培養空間３１として機能するようにしてもよい。

【0030】

本実施形態の貫通孔１１ａ及び貫通孔１２ａは、何れもＺ方向に延びる円孔である。貫通孔１１ａ及び貫通孔１２ａの直径ｄ（図２参照）は、例えば０．０５～５ｍｍであり、本実施形態では２ｍｍである。また、貫通孔１１ａと貫通孔１２ａの間の距離Ｌ（図２参照）は、例えば１～１００ｍｍであり、本実施形態では７ｍｍである。

【0031】

第一基板１０の第二主面１０ｂは、図１に示すように、凹部１３ａを備える。凹部１３ａは、第二主面１０ｂのＹ方向中央部にＸ方向へ延びるように形成されている。凹部１３ａの延設方向（Ｘ方向）に垂直な断面（ＹＺ平面に平行な断面）は扁平な矩形状である。

【0032】

凹部１３ａは、貫通孔１１ａ及び貫通孔１２ａに連通する。凹部１３ａは、第一基板１０と第二基板２０とが接合されることにより、両基板１０，２０に挟まれた中空状の第二培養空間３２として機能する。

【0033】

凹部１３ａは、一定の幅及び深さでＸ方向に延びるスリット状である。凹部１３ａは、幅が深さの１０倍以上の大きさとなっている。すなわち、第二培養空間３２は、延設方向に見たとき、幅Ｗ（図２参照）が高さＨ（図３参照）の１０倍以上の大きさとなるように構成されている。第二培養空間３２は、幅Ｗが高さＨの好ましくは１０倍以上、より好ましくは２０倍以上の大きさとなるように構成される。また、幅Ｗは高さＨの１００倍以下の大きさとするのが好ましい。なお、シリコーンゴムで形成された従来のマイクロ流体デバイスにおいては、幅が高さの１０倍以上となる扁平な流路は、重力等の影響で高さを維持することが困難であった。

【0034】

以上のように、本実施形態のマイクロ流体デバイス１は、第一培養空間３１と第一培養空間３１から延設された第二培養空間３２と、を備え、第二培養空間３２は、延設方向に見たとき、幅Ｗが高さＨの１０倍以上の大きさとなるように構成されている。第一培養空間３１は、細胞体を培養することができ、第二培養空間３２は、細胞体から延びる突起状の細胞構成部位を培養することができる。その結果、マイクロ流体デバイス１は、細胞体と細胞構成部位とを分離した状態で培養することができる。

【0035】

図４及び図５は、マイクロ流体デバイス１で神経細胞を培養した様子を模式的に示す平面図及び断面図である。図５は、図４に示すマイクロ流体デバイス１のＶ－Ｖ線断面図である。

【0036】

神経細胞Ｃ１（細胞体の一例）は、第一培養空間３１にて培養され、一方、神経細胞Ｃ１から延びる突起状の神経突起Ｃ２（細胞構成部位の一例）は、第二培養空間３２で培養されている。このとき、第二培養空間３２は、図４、図５に示すように神経細胞Ｃ１が第二培養空間３２に入り込むことが無く、神経突起Ｃ２が培養可能な扁平な形状と成っている。
また、神経細胞Ｃ１は髄鞘の有無，直径，伝導速度などにより分類されるが、髄鞘を有するＡタイプでは、それぞれ直径がＡα（１３～２２μｍ）、Ａβ（８～１３μｍ）、Ａγ（４～８μｍ）、Ａδ（１～４μｍ）である。また、髄鞘を有する場合でも自立神経はＢタイプと呼ばれ、その直径は１～３μｍである。更には、髄鞘を有さないＣタイプ（Ｃ線維）では、直径は０．２～１．０μｍである。
更には、第二培養空間３２は、幅Ｗが高さＨの１０倍以上となるように扁平な断面形状に構成されているため、図４に示すように、複数の神経突起Ｃ２が束状構造をとらず、それぞれの神経突起Ｃ２が幅方向（Ｙ方向）に並ぶように培養される。

【0037】

神経突起Ｃ２が軸索のみで構成される場合（ミエリンがない場合）、神経突起Ｃ２の直径は０．２～１．５μｍであり、神経突起Ｃ２がミエリンで覆われた軸索で構成される場合、神経突起Ｃ２の直径は１～２２μｍである。この神経突起Ｃ２が、その直径の７倍以上の幅を第二培養空間３２に持たせることで第二培養空間３２の側壁に接触することなく神経突起Ｃ２を複数に分割しながら成長させることができる。神経突起Ｃ２の直径に対して第二培養空間３２の幅が７倍以下であれば、神経突起Ｃ２の培養時に隣接する神経突起Ｃ２自身や第二培養空間３２の側壁に接触し、成長が抑制されてしまう。

【0038】

第二培養空間３２において、幅Ｗは、５０μｍ以上８０００μｍ以下が好ましく、５００μｍ以上１０００μｍ以下がより好ましい。幅Ｗが５０μｍより狭いと、十分な観察範囲を得ることが難しくなる。一方、幅Ｗが８０００μｍよりも広いと、分離可能な流路高さと流路幅を共に満たすことができない。本実施形態では、幅Ｗは８００μｍである。

【0039】

第二培養空間３２において、高さＨは、５μｍ以上８０μｍ以下が好ましく、２０μｍ以上８０μｍ以下がより好ましい。高さＨが５μｍより低いと、神経突起Ｃ２が侵入しにくく、また、神経突起Ｃ２が侵入しても成長が阻害される。一方、高さＨが８０μｍより高いと、神経細胞Ｃ１も第二培養空間３２に侵入してしまい、神経細胞Ｃ１と神経突起Ｃ２を分離することができない。本実施形態では、高さＨは４０μｍである。

【0040】

ミエリン（髄鞘）を持たない神経突起（無髄神経）を培養する場合やその他の細胞を用いる場合、高さＨは、無髄神経の直径より大きい５μｍ以上が好ましい。また、ミエリン（髄鞘）を持つ神経突起（有髄神経）を培養する場合、高さＨは、有髄神経の太さの２０μｍ以上が好ましい。

【0041】

個々の細胞に分離して、分散した細胞を播種する場合、浮遊した細胞が第二培養空間３２に流れ込むのを防ぐ必要がある。単一細胞に分散した時の細胞の大きさは、細胞種にもよるが、直径１０～３０μｍの大きさとなるため、高さＨは２０μｍ以下が好ましい。また、細胞凝集塊の状態で細胞を播種する場合、高さＨは、細胞凝集塊より小さい高さ８０μｍ以下が好ましい。

【0042】

［マイクロ流体デバイスの製造方法］
次に、マイクロ流体デバイス１の製造方法について詳細に説明する。

【0043】

（基板の準備工程）
マイクロ流体デバイス１を構成する第一基板１０と第二基板２０とを準備する。

【0044】

基板１０，２０を構成する材料は、透明な熱可塑性樹脂である。熱可塑性樹脂の例としては、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）が挙げられる。基板１０，２０を構成する熱可塑性樹脂としては、医療用グレードのＣＯＰが特に好ましい。ＣＯＰは、高透明性、低自家蛍光、低薬剤吸着性の熱可塑性樹脂である。

【0045】

本実施形態における基板１０，２０の形状について説明する。第一基板１０及び第二基板２０は、それぞれ同一形状の主面を有する矩形基板を使用している。また、第一基板１０の厚みは第二基板２０の厚みよりも大きい。しかしながら、第一基板１０及び第二基板２０の主面は、同一形状でなくてもよい。例えば、第一基板１０の主面の縦と横の寸法が、第二基板２０の主面の縦と横の寸法より大きくてもよく、第二基板２０の主面の縦と横の寸法が、第一基板１０の主面の縦と横の寸法より大きくてもよい。また、第一基板１０の厚みは第二基板２０の厚みと同じでもよく、第一基板１０の厚みは第二基板２０の厚みよりも小さくてもよい。

【0046】

本実施形態における第二基板２０の二つの主面２０ａ，２０ｂは共に平坦である。第一基板１０の第一主面１０ａは、ポート１１，１２を有する。ポート１１，１２は、第一基板１０に形成された貫通孔１１ａ，１２ａの開口部である。また、第一基板１０の第二主面１０ｂは、第二基板２０と接合された後に中空状の第二培養空間３２を形成するための凹部１３ａを有する。

【0047】

第一基板１０に貫通孔１１ａ，１２ａ及び凹部１３ａを設けるには、例えば、射出成形、フォトリソグラフィ工程とエッチング工程との組合せ、鋳造、切削加工等の手段があるが、基板を構成する材料に応じて最適な手段を選択するとよい。一例として、第一基板１０を、上述したような熱可塑性樹脂で構成することで、射出成形により容易に貫通孔１１ａ，１２ａ及び凹部１３ａを形成することができる。

【0048】

（基板の接合工程）
作製された第一基板１０の主面１０ｂと第二基板２０の主面２０ａとを接合する。以下に示す接合方法は、基板上に接着剤となる薄膜の形成が不要となる方法であり、以下の手順で実行される。

【0049】

まず、両基板の接合面（１０ｂ，２０ａ）に対して、表面を活性化する処理を行う。表面活性化処理の方法としては、紫外線を照射する方法が利用できる。

【0050】

紫外線を照射する方法には、例えば、波長１７２ｎｍの光を照射するキセノンエキシマランプなどの紫外線光源から、第一基板１０の主面１０ｂ、及び第二基板２０の主面２０ａに対して、波長２００ｎｍ以下の真空紫外線（ＶＵＶ）を照射することで実行される。紫外線光源の他の例としては、１８５ｎｍに輝線を有する低圧水銀ランプ、波長１２０～２００ｎｍの範囲に輝線を有する重水素ランプを好適に用いることができる。真空紫外線の照度は、例えば１０～５００ｍＷ／ｃｍ^２であり、照射時間は樹脂に応じて適宜設定されるが、例えば５～６秒間である。

【0051】

次に、表面活性化処理が施された両基板の接合面（１０ｂ，２０ａ）を接触させるように第一基板１０と第二基板２０とを重ね合わせ、プレス機を使用して両基板を押圧し接合する接合工程を行う。接合工程は、表面活性化状態を維持するために、紫外線照射工程が完了してから所定時間内、例えば１０分以内に行うとよい。

【0052】

この接合工程は、接合を強固にするために、必要に応じて加熱された環境において行われる。接合工程において、加熱温度や押圧力等の接合条件は、第一基板１０の構成材料及び第二基板２０の構成材料に応じて設定される。具体的な条件を挙げると、押圧する際の温度は、例えば４０～１３０℃であり、接合するための押圧力は、例えば、０．１～１０ＭＰａである。

【0053】

第一基板１０と第二基板２０とが接合された基板（以下、「接合基板」と呼ぶ場合がある。）を所定時間加圧した後、必要に応じてさらに所定時間加熱してもよい。接合基板を加圧した後に加熱することにより、加圧後の積層基板における接合界面に、十分な接合状態が得られている部分と、十分な接合状態が得られていない部分とが混在している場合であっても、加熱により、十分な接合状態が得られていない部分において、その接合状態を、所期の状態とすることができる。

【0054】

接合基板の加圧状態を所定時間にわたって維持し、その後、その加圧状態を解除し、接合基板の温度を所定温度まで上昇させ、その温度を、所期の接合状態が得られるまで維持するようにしてもよい。ここに、所定温度とは、接合基板に変形が生じることのない温度である。例えば、加熱温度が例えば４０～１３０℃であり、加熱時間が例えば６０～６００秒間である。

【0055】

その後、冷却工程を経て、第二基板２０の主面２０ａ上に第一基板１０が接合されたマイクロ流体デバイス１が作製される。

【0056】

［マイクロ流体デバイスの使用方法］
次に、マイクロ流体デバイス１の使用方法について説明する。具体的には、マイクロ流体デバイス１を用いて薬剤の評価を行う方法である。

【0057】

初めに、ポート１１から第一培養空間３１に神経細胞Ｃ１を播種する。第一培養空間３１及び第二培養空間３２は、適切な培地で満たされる。神経細胞Ｃ１が第一培養空間３１にて数日間培養されることで、神経細胞Ｃ１から神経突起Ｃ２が伸長し、第二培養空間３２へ侵入していく。これにより、神経細胞Ｃ１と神経突起Ｃ２とを分離した状態で培養するこができる。第二培養空間３２にて培養された神経突起Ｃ２は、外部から観察することができる。神経突起Ｃ２は、例えば、第二基板２０の主面２０ｂ側から蛍光顕微鏡等を使って観察される。神経突起Ｃ２を外部から適切に観察可能とするため、第一基板１０及び第二基板２０を透明な熱可塑性樹脂で形成し、かつ第一基板１０及び第二基板２０の主面を平坦とするのが好ましい。

【0058】

次いで、第二培養空間３２内に薬剤を投与して、神経突起Ｃ２に対する薬剤の薬効及び／又は毒性を評価する。以上のように、本発明のマイクロ流体デバイス１によれば、培養から薬剤試験、観察評価までの一連の操作を一つのデバイス内で実施することができる。

【0059】

なお、薬剤を投与するタイミングとして、神経突起Ｃ２が第二培養空間３２内で十分に伸長した後に第二培養空間３２内に薬剤を投与し、薬効及び／又は毒性を評価する方法と、第二培養空間３２（第一培養空間３１も）の培地に予め薬剤を投与した状態で神経突起Ｃ２を培養させ、薬効及び／又は毒性を評価する方法とがある。

【0060】

以上、本発明の実施形態について図面に基づいて説明したが、具体的な構成は、これらの実施形態に限定されるものでないと考えられるべきである。本発明の範囲は、上記した実施形態の説明だけではなく特許請求の範囲によって示され、さらに特許請求の範囲と均等の意味及び範囲内でのすべての変更が含まれる。

【0061】

上記の各実施形態で採用している構造を他の任意の実施形態に採用することは可能である。各部の具体的な構成は、上記した実施形態のみに限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で種々変形が可能である。

【0062】

（１）マイクロ流体デバイス１は、培地を貯留するリザーバをさらに備えていてもよい。図６Ａ及び図６Ｂは、マイクロ流体デバイス１がリザーバ３３を備える例を示す平面図及び断面図である。リザーバ３３は、第一培養空間３１に連接されている。リザーバ３３及び第一培養空間３１と、第二培養空間３２との容積比率は、例えば２０００：１である。

【0063】

なお、図６Ａ及び図６Ｂでは、リザーバ３３は第一培養空間３１と別の構成として示しているが、一体の構成としてもよい。すなわち、第一培養空間３１をリザーバ３３の一部として構成してもよい。

【0064】

（２）図７Ａ及び図７Ｂは、第二培養空間３２の構成が上記の実施形態と異なる別例を示す。この例では、第二培養空間３２は、一部が外部に露出している。

【0065】

（３）図８Ａ及び図８Ｂは、第二培養空間３２の構成が上記の実施形態と異なるさらなる別例を示す。この例では、第二培養空間３２は、第二基板２０に形成された凹部により構成されている。また、第二培養空間３２は、一部が外部に露出している。

【0066】

（４）図９Ａ及び図９Ｂは、第二培養空間３２に連通する薬液導入ポート１４を設けた例を示す。薬液導入ポート１４から第二培養空間３２に薬剤を投与することができる。

【0067】

（５）上記の実施形態では、細胞体として神経細胞の例を示したが、これに限定されない。細胞体としては、リンパ組織内にいる免疫機構を構成する抗原提示細胞である濾胞樹状細胞（follicular dendritic cell）、皮膚等に存在してメラニンを生成する細胞であるメラノサイト（melanocyte）が挙げられる。

【符号の説明】

【0068】

１ ：マイクロ流体デバイス
１０ ：第一基板
１０ａ ：第一主面
１０ｂ ：第二主面
１１ ：ポート
１１ａ ：貫通孔
１２ ：ポート
１２ａ ：貫通孔
１３ａ ：凹部
１４ ：薬液導入ポート
２０ ：第二基板
２０ａ ：主面
２０ｂ ：主面
３１ ：第一培養空間
３２ ：第二培養空間
３３ ：リザーバ
Ｃ１ ：神経細胞
Ｃ２ ：神経突起
Ｗ ：第二培養空間の幅
Ｈ ：第二培養空間の高さ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】