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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022189249
(43)【公開日】2022-12-22
(54)【発明の名称】Ｔ細胞増殖促進ペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 14/00 20060101AFI20221215BHJP
C40B 40/10 20060101ALI20221215BHJP
【ＦＩ】
C07K14/00
C40B40/10 ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021097735
(22)【出願日】2021-06-11
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）２０１９年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、創薬基盤推進研究事業、「重症ＧＶＨＤ治療に向けたＣＤ２５中和抗体代替ペプチド製剤の開発」、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】304021417
【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学
(71)【出願人】
【識別番号】304027279
【氏名又は名称】国立大学法人 新潟大学
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(74)【代理人】
【識別番号】100090251
【氏名又は名称】森田 憲一
(72)【発明者】
【氏名】門之園 哲哉
(72)【発明者】
【氏名】近藤 科江
(72)【発明者】
【氏名】牛木 隆志
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA18
4H045CA40
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】 （修正有）
【課題】安価なＴ細胞の増殖因子を提供する。
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列において、Ｎ末端にＰ、ＲＰ、若しくはＥＲＰを含むか、及び／又は、Ｃ末端にＴ、ＴＧ、ＴＧＱ、ＴＧＱＫ、若しくはＴＧＱＫＰを含むペプチドによる。
【選択図】なし
【解決手段】特定のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列において、Ｎ末端にＰ、ＲＰ、若しくはＥＲＰを含むか、及び／又は、Ｃ末端にＴ、ＴＧ、ＴＧＱ、ＴＧＱＫ、若しくはＴＧＱＫＰを含むペプチドによる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１で表されるアミノ酸配列における１５～１７番の位置に任意のアミノ酸を含むペプチド、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列における１３番及び２０番の位置に任意のアミノ酸を含むペプチド。
【請求項2】
配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端にＰ、ＲＰ、若しくはＥＲＰを含むか、及び／又はＣ末端にＴ、ＴＧ、ＴＧＱ、ＴＧＱＫ、若しくはＴＧＱＫＰを含む請求項１に記載のペプチド。
【請求項3】
請求項１又は２に記載のペプチドを含むペプチドライブラリー。
【請求項4】
配列番号３～６２で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項5】
配列番号３～６２で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列において、Ｎ末端にＰ、ＲＰ、若しくはＥＲＰを含むか、及び／又はＣ末端にＴ、ＴＧ、ＴＧＱ、ＴＧＱＫ、若しくはＴＧＱＫＰを含む請求項４に記載のペプチド。
【請求項6】
前記アミノ酸配列が、配列番号５、６、又は３３で表されるアミノ酸配列である請求項４又は５に記載のペプチド。
【請求項7】
Ｔ細胞増殖用である、請求項４～６のいずれか一項に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｔ細胞増殖促進ペプチドに関する。
【背景技術】
【0002】
近年、患者のＴ細胞を利用したがん治療法の開発が進んでいる。例えば、Ｂ細胞性急性リンパ芽球性白血病、又はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の治療薬キムリアが認可されている。キムリアは、患者から採取した健常Ｔ細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させたＣＡＲ－Ｔ細胞とよばれる遺伝子組換え細胞を用い、患者に投与することによって抗原発現がん細胞を選択的に攻撃し、消滅させることができる。このＣＡＲ－Ｔ細胞療法においては、ＣＡＲ遺伝子をＴ細胞に導入したのちに、細胞を増殖させる必要がある。
【0003】
Ｔ細胞及びＣＡＲ－Ｔ細胞を試験管内で増殖させるためには、培養液にＣＤ３結合抗体、ＣＤ２８結合抗体、サイトカインＩＬ－２などを添加する必要があった（非特許文献１）。これらのタンパク質はいずれもアミノ酸長が１１４以上あるため、化学合成で安価に合成できず、高額な組換えタンパク質が利用されていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】「モリキュラー・セラピー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）」２０２０年、（米国）第２８巻、ｐ２３７９－２３９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
Ｔ細胞及びＣＡＲ－Ｔ細胞の試験管内での増殖において、安価なＴ細胞の増殖因子があれば、ＣＡＲ－Ｔ細胞の製造コストを下げることが可能である。また、基礎研究においてもＴ細胞を用いる実験のコストを下げることが可能になる。
従って、本発明の目的は、安価なＴ細胞の増殖因子を提供することである。
従って、本発明の目的は、安価なＴ細胞の増殖因子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者は、安価なＴ細胞の増殖因子について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、３０アミノ酸程度の、短い特定のペプチドが強力なＴ細胞の増殖活性を有することを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列における１５～１７番の位置に任意のアミノ酸を含むペプチド、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列における１３番及び２０番の位置に任意のアミノ酸を含むペプチド、
［２］配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端にＰ、ＲＰ、若しくはＥＲＰを含むか、及び／又はＣ末端にＴ、ＴＧ、ＴＧＱ、ＴＧＱＫ、若しくはＴＧＱＫＰを含む［１］に記載のペプチド、
［３］［１］又は［２］に記載のペプチドを含むペプチドライブラリー、
［４］配列番号３～６２で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、
［５］配列番号３～６２で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列において、Ｎ末端にＰ、ＲＰ、若しくはＥＲＰを含むか、及び／又はＣ末端にＴ、ＴＧ、ＴＧＱ、ＴＧＱＫ、若しくはＴＧＱＫＰを含む［４］に記載のペプチド、
［６］前記アミノ酸配列が、配列番号５、６、又は３３で表されるアミノ酸配列である［４］又は［５］に記載のペプチド、及び
［７］Ｔ細胞増殖用である、［４］～［６］のいずれかに記載のペプチド、
に関する。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列における１５～１７番の位置に任意のアミノ酸を含むペプチド、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列における１３番及び２０番の位置に任意のアミノ酸を含むペプチド、
［２］配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端にＰ、ＲＰ、若しくはＥＲＰを含むか、及び／又はＣ末端にＴ、ＴＧ、ＴＧＱ、ＴＧＱＫ、若しくはＴＧＱＫＰを含む［１］に記載のペプチド、
［３］［１］又は［２］に記載のペプチドを含むペプチドライブラリー、
［４］配列番号３～６２で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、
［５］配列番号３～６２で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列において、Ｎ末端にＰ、ＲＰ、若しくはＥＲＰを含むか、及び／又はＣ末端にＴ、ＴＧ、ＴＧＱ、ＴＧＱＫ、若しくはＴＧＱＫＰを含む［４］に記載のペプチド、
［６］前記アミノ酸配列が、配列番号５、６、又は３３で表されるアミノ酸配列である［４］又は［５］に記載のペプチド、及び
［７］Ｔ細胞増殖用である、［４］～［６］のいずれかに記載のペプチド、
に関する。
【発明の効果】
【0007】
本発明のペプチドによれば、Ｔ細胞の増殖を効率的に促進することができる。本発明のペプチドは、３０アミノ酸程度のアミノ酸鎖長であり、化学合成可能であるため安価に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】ペプチドライブラリー１のＣＤ２５との結合で濃縮されたペプチドのアミノ酸配列である。
【図2】ペプチドライブラリー２のＣＤ２５との結合で濃縮されたペプチドのアミノ酸配列である。
【図3】本発明のペプチド１～３の添加によりヒト末梢血単核細胞の増殖が促進されたことをＭＴＴアッセイで測定したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0009】
［１］ペプチドライブラリー
本発明のペプチドライブラリーは、配列番号１で表されるアミノ酸配列における１５～１７番の位置に任意のアミノ酸を含むペプチド、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列における１３番及び２０番の位置に任意のアミノ酸を含むペプチドを含む。前記ペプチドは、配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端にＰ、ＲＰ、若しくはＥＲＰを含むか、及び／又はＣ末端にＴ、ＴＧ、ＴＧＱ、ＴＧＱＫ、若しくはＴＧＱＫＰを含んでもよい。
本発明のペプチドライブラリーは、配列番号１で表されるアミノ酸配列における１５～１７番の位置に任意のアミノ酸を含むペプチド、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列における１３番及び２０番の位置に任意のアミノ酸を含むペプチドを含む。前記ペプチドは、配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端にＰ、ＲＰ、若しくはＥＲＰを含むか、及び／又はＣ末端にＴ、ＴＧ、ＴＧＱ、ＴＧＱＫ、若しくはＴＧＱＫＰを含んでもよい。
【0010】
本発明のペプチドライブラリーに用いるペプチド（以下、ライブラリーペプチドと称することがある）は、足場タンパク質にＣＤ２５に対するモノクローナル抗体のＣＤＲ－Ｈ３の部分配列を組み込んだペプチドである。ＣＤ２５は、ＩＬ－２受容体を構成する３つのサブユニットのうちの１つであり、αサブユニットと称される。本発明者らは、ＩＬ－２受容体の３つのサブユニットからαサブユニット（ＣＤ２５）を選択し、そしてＣＤ２５に対するモノクローナル抗体の６つの相補性決定領域（complementarity determining region）であるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３からＣＤＲ－Ｈ３を選択し、ＣＤＲ－Ｈ３の部分配列を足場タンパク質に組み込んだものである。
【0011】
前記足場タンパク質としては、特願２０２０－２０６６７１号に記載の
ＹＡＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＣＸ５Ｘ６Ｘ７ＦＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＲＨＩＲＩＨ（配列番号６３）を含む足場タンパク質を用いた。この足場タンパク質にＣＤＲ－Ｈ３の部分タンパク質を組み込んだ。作製したライブラリーペプチドは、
（１）ＹＡＣＰＶＥＳＣＧＧＶＦＤＹＸＸＸＬＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号１）、及び
（２）ＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＸＧＧＧＶＬＴＸＨＩＲＩＨ（配列番号２）、を含むペプチドのライブラリーである。
用いたＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列は、「ＧＧＧＶＦＤＹ（配列番号６４）」である。前記ライブラリーペプチド（１）は、前記足場タンパク質の「Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＦＸ８Ｘ９」の領域に、ＣＤＲ－Ｈ３の部分ペプチドである「ＧＧＶＦＤＹ（配列番号６５）」を組み込んだペプチドである。そして、足場タンパク質の「Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２」の領域に任意のアミノ酸を含むペプチドである。
一方、前記ライブラリーペプチド（２）は、前記足場タンパク質の足場タンパク質の「Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２」の領域に、ＣＤＲ－Ｈ３の部分ペプチドである「ＧＧＧＶ（配列番号６６）」を組み込んだペプチドである。そして、足場タンパク質の「Ｘ８」及び「Ｒ」の位置に任意のアミノ酸を含むペプチドである。
ＹＡＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＣＸ５Ｘ６Ｘ７ＦＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４ＲＨＩＲＩＨ（配列番号６３）を含む足場タンパク質を用いた。この足場タンパク質にＣＤＲ－Ｈ３の部分タンパク質を組み込んだ。作製したライブラリーペプチドは、
（１）ＹＡＣＰＶＥＳＣＧＧＶＦＤＹＸＸＸＬＴＲＨＩＲＩＨ（配列番号１）、及び
（２）ＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＸＧＧＧＶＬＴＸＨＩＲＩＨ（配列番号２）、を含むペプチドのライブラリーである。
用いたＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列は、「ＧＧＧＶＦＤＹ（配列番号６４）」である。前記ライブラリーペプチド（１）は、前記足場タンパク質の「Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＦＸ８Ｘ９」の領域に、ＣＤＲ－Ｈ３の部分ペプチドである「ＧＧＶＦＤＹ（配列番号６５）」を組み込んだペプチドである。そして、足場タンパク質の「Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２」の領域に任意のアミノ酸を含むペプチドである。
一方、前記ライブラリーペプチド（２）は、前記足場タンパク質の足場タンパク質の「Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２」の領域に、ＣＤＲ－Ｈ３の部分ペプチドである「ＧＧＧＶ（配列番号６６）」を組み込んだペプチドである。そして、足場タンパク質の「Ｘ８」及び「Ｒ」の位置に任意のアミノ酸を含むペプチドである。
【0012】
本発明のライブラリーペプチドは、前記ライブラリーペプチド（１）又はライブラリーペプチド（２）のＮ末端にＰ、ＲＰ、若しくはＥＲＰを含むか、及び／又はＣ末端にＴ、ＴＧ、ＴＧＱ、ＴＧＱＫ、若しくはＴＧＱＫＰを含んでもよい。従って、Ｎ末端はアミノ酸が付加されない態様を含めて４種の末端があり、Ｃ末端もアミノ酸が付加されない態様を含めて６種類の末端がある。従って、ライブラリーペプチド（１）又はライブラリーペプチド（２）のＮ末端及びＣ末端の組み合わせの態様は、２４種類の組み合わせの態様がある。これらのいずれの態様においても、本発明のライブラリーのペプチドとして用いることができる。具体的には、前記２５アミノ酸長のライブラリーペプチド（１）又はライブラリーペプチド（２）は、安定してＣＤＲ－Ｈ３の部分ペプチドを提示することが可能である。更に、Ｎ末及び／又はＣ末に前記のアミノ酸が付加された態様の２６～３３アミノ酸長の２４種類のライブラリーペプチドも安定してＣＤＲ－Ｈ３の部分ペプチドを提示することが可能である。
例えば、ライブラリーペプチド（１）又はライブラリーペプチド（２）のＮ末端に「ＥＲＰ」が付加され、そしてＣ末端に「ＴＧＱＫＰ」が付加されたライブラリーペプチドは、それぞれ３３アミノ酸長の
（３）ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＧＧＶＦＤＹＸＸＸＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号６７）、及び
（４）ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＸＧＧＧＶＬＴＸＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号６８）、である。
例えば、ライブラリーペプチド（１）又はライブラリーペプチド（２）のＮ末端に「ＥＲＰ」が付加され、そしてＣ末端に「ＴＧＱＫＰ」が付加されたライブラリーペプチドは、それぞれ３３アミノ酸長の
（３）ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＧＧＶＦＤＹＸＸＸＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号６７）、及び
（４）ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＸＧＧＧＶＬＴＸＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号６８）、である。
【0013】
前記２５アミノ酸長のライブラリーペプチド（１）又はライブラリーペプチド（２）は安定してＣＤＲ－Ｈ３の部分ペプチド及び「Ｘ」の任意のアミノ酸を提示することができる。この２５アミノ酸長のライブラリーペプチド（１）又はライブラリーペプチド（２）が安定であるため、これらのライブラリーペプチド（１）又はライブラリーペプチド（２）を含む、２６～３３アミノ酸長のライブラリーペプチドも、安定してＣＤＲ－Ｈ３の部分ペプチド及び「Ｘ」の任意のアミノ酸を提示することができる。更に、前記３３アミノ酸長のライブラリーペプチド（３）及びライブラリーペプチド（４）のＮ末端及び／又はＣ末端に１又は複数のアミノ酸が付加されたライブラリーペプチドも、本発明のライブラリーペプチドとして、有効に用いることができる。付加されるアミノ酸の数は、特に限定されるものではないが、好ましくは１～１５個（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５）、より好ましくは１～１０個、更に好ましくは１～５個、更により好ましくは１～３個である。付加されるアミノ酸も特に限定されるものではないが、後述の「Ｘ」の任意のアミノ酸が挙げられる。
【0014】
前記ライブラリーペプチドに含まれる「Ｘ」の任意のアミノ酸は、特に限定されるものではないが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、又はヒスチジンの生体内のタンパク質を構成する２０種のα－アミノ酸が挙げられる。生体内のタンパク質を構成するα－アミノ酸は基本的にＬ型であるが、前記「Ｘ」のアミノ酸は、Ｄ型アミノ酸を含んでもよい。
【0015】
また、限定されるものではないが、前記「Ｘ」の任意のアミノ酸としては、前記２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を用いることができる。すなわち、スクリーニングの目的に応じて、組み込むアミノ酸を選択することができる。具体的なアミノ酸としては、２，３－ジアミノプロピオン酸、α－アミノイソ酪酸、ε－アミノヘキサン酸、δ－アミノ吉草酸、Ｎ－メチルグリシンまたはサルコシン、オルニチン、シトルリン、ｔ－ブチルアラニン、ｔ－ブチルグリシン、Ｎ－メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ナフチルアラニン、２－クロロフェニルアラニン、３－クロロフェニルアラニン、４－クロロフェニルアラニン、２－フルオロフェニルアラニン、３－フルオロフェニルアラニン、４－フルオロフェニルアラニン、２－ブロモフェニルアラニン、３－ブロモフェニルアラニン、４－ブロモフェニルアラニン、２－メチルフェニルアラニン、３－メチルフェニルアラニン、４－メチルフェニルアラニン、２－ニトロフェニルアラニン、３－ニトロフェニルアラニン、４－ニトロフェニルアラニン、２－シアノフェニルアラニン、３－シアノフェニルアラニン、４－シアノフェニルアラニン、２－トリフルオロメチルフェニルアラニン、３－トリフルオロメチルフェニルアラニン、４－トリフルオロメチルフェニルアラニン、４－アミノフェニルアラニン、４－ヨードフェニルアラニン、４－アミノメチルフェニルアラニン、２，４－ジクロロフェニルアラニン、３，４－ジクロロフェニルアラニン、２，４－ジフルオロフェニルアラニン、３，４－ジフルオロフェニルアラニン、ピリド－２－イルアラニン、ピリド－３－イルアラニン、ピリド－４－イルアラニン、ナフト－１－イルアラニン、ナフト－２－イルアラニン、チアゾリルアラニン、ベンゾチエニルアラニン、チエニルアラニン、フリルアラニン、ホモフェニルアラニン、ホモチロシン、ホモトリプトファン、ペンタフルオロフェニルアラニン、スチリルアラニン、アウトリルアラニン、３，３－ジフェニルアラニン、３－アミノ－５－フェニルペンタン酸、ペニシラミン、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－３－カルボン酸、β－２－チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、Ｎ（ｗ）－ニトロアルギニン、ホモリジン、ホスホノメチルフェニルアラニン、ホスホセリン、ホスホトレオニン、ホモアスパラギン酸、ホモグルタミン酸、１－アミノシクロペンタ－（２または３）－エン－４カルボン酸；ピペコリン酸、アゼチジン－３－カルボン酸、１－アミノシクロペンタン－３－カルボン酸；アリルグリシン、プロパルギルグリシン、ホモアラニン、ノルバリン、ホモロイシン、ホモバリン、ホモイソロイシン、ホモアルギニン、Ｎ－アセチルリジン、２，４－ジアミノ酪酸、２，３－ジアミノ酪酸、Ｎ－メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、ヒドロキシプロリン、およびホモプロリンが挙げられる。前記アミノ酸は、好ましくはαアミノ酸である。αアミノ酸が、その構造から、本発明のライブラリーペプチドの構造を安定させることができるからである。しかしながら、βアミノ酸が数個（例えば４個以下、３個以下、２個以下、又は１個）含まれていても、本発明の足場ペプチドの構造は安定である。
【0016】
本発明のライブラリーペプチドを用いることによって、Ｔ細胞のＩＬ－２受容体への優れた結合能を示すペプチドをスクリーニングすることができる。すなわち、本発明のライブラリーペプチドは、ＣＤＲ－Ｈ３の部分ペプチドを含んでいるため、ＩＬ－２受容体のαサブユニット（ＣＤ２５）にある程度の親和性を有すると考えられるが、スクリーニングにより、結合に最適なアミノ酸「Ｘ」を選択できるため、Ｔ細胞のＩＬ－２受容体への優れた結合能を有するペプチドを選択できると考えられる。
【0017】
本発明のペプチドライブラリーは、本発明のライブラリーペプチドを用いることを除いては、本分野の公知のライブラリーに関する技術を用いることができる。ペプチドライブラリーを構築するために、ライブラリーペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用することができる。
ポリヌクレオチドは、本発明のライブラリーペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、ライブラリーペプチドポリヌクレオチドと称することがある）である。ライブラリーペプチドポリヌクレオチドは、リンカーポリペプチドをコードするヌクレオチドを含んでもよい。
ライブラリーに組込む遺伝子は、公知の方法で調整することができる。例えば、「Ｘ」の任意のアミノ酸をコードするＮＮＫコドン（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれかの塩基、ＫはＧもしくはＴのいずれかの塩基）を任意のアミノ酸をコードするコドンと部位特異的に置換する。置換には当該領域を含むオリゴＤＮＡを化学合成し、制限酵素を利用して組込む、あるいはＰＣＲを用いてベクター全長を複製する方法が用いられる。
ポリヌクレオチドは、本発明のライブラリーペプチドをコードするポリヌクレオチド（以下、ライブラリーペプチドポリヌクレオチドと称することがある）である。ライブラリーペプチドポリヌクレオチドは、リンカーポリペプチドをコードするヌクレオチドを含んでもよい。
ライブラリーに組込む遺伝子は、公知の方法で調整することができる。例えば、「Ｘ」の任意のアミノ酸をコードするＮＮＫコドン（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれかの塩基、ＫはＧもしくはＴのいずれかの塩基）を任意のアミノ酸をコードするコドンと部位特異的に置換する。置換には当該領域を含むオリゴＤＮＡを化学合成し、制限酵素を利用して組込む、あるいはＰＣＲを用いてベクター全長を複製する方法が用いられる。
【0018】
前記ポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、ベクターに組み込むことによって、容易に増幅させることができる。また、ライブラリーペプチドとして、容易に発現させることができる。
前記ポリヌクレオチドを組込むベクターとしては、宿主細胞において複製可能である限り、プラスミド、ファージ、又はウイルス等のいかなるベクターも用いることができる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＫＣ３０、ｐＣＦＭ５３６等の大腸菌プラスミド、ｐＵＢ１１０等の枯草菌プラスミド、ｐＧ－１、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等の酵母プラスミド、λｇｔ１１０、λＺＡＰＩＩ等のファージのＤＮＡ等が挙げられ、哺乳類細胞用のベクターとしては、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス等のウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体等が挙げられる。ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
前記ポリヌクレオチドを組込むベクターとしては、宿主細胞において複製可能である限り、プラスミド、ファージ、又はウイルス等のいかなるベクターも用いることができる。例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＫＣ３０、ｐＣＦＭ５３６等の大腸菌プラスミド、ｐＵＢ１１０等の枯草菌プラスミド、ｐＧ－１、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等の酵母プラスミド、λｇｔ１１０、λＺＡＰＩＩ等のファージのＤＮＡ等が挙げられ、哺乳類細胞用のベクターとしては、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス等のウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体等が挙げられる。ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
【0019】
本明細書において「宿主」とは、前記ベクターが組込まれ、ライブラリーペプチドを発現できる限りにおいて、限定されるものでない。例えば、ファージベクターの宿主としては、Ｍ１３ファージ、ｆｄファージ、又はＴ７ファージを挙げることができる。
また、細菌のベクターの宿主としては、大腸菌、ストレプトミセス、又は枯草菌を挙げることができる。更に、酵母ベクターの宿主としては、パン酵母、又はメタノール資化性酵母を挙げることができる。昆虫細胞ベクターの宿主としては、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９を挙げることができる。更に、動物細胞ベクターの宿主としては、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３、Ｃ１２７を挙げることができる。
また、細菌のベクターの宿主としては、大腸菌、ストレプトミセス、又は枯草菌を挙げることができる。更に、酵母ベクターの宿主としては、パン酵母、又はメタノール資化性酵母を挙げることができる。昆虫細胞ベクターの宿主としては、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９を挙げることができる。更に、動物細胞ベクターの宿主としては、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３、Ｃ１２７を挙げることができる。
【0020】
ファージの表面タンパク質としては、限定されるものではないが、Ｍ１３ファージのｇ３ｐ、ｇ８ｐ、又はＴ７ファージのＧ１０を挙げることができる。
細菌の表面タンパク質、例えば大腸菌の表面タンパク質としては、限定されるものではないが、ＯｍｐＡを挙げることができる。
酵母の表面タンパク質としては、限定されるものではないが、Ｆｌｏ１、αアグルチニン、又はＡＧＡ２を挙げることができる。
動物細胞の表面タンパク質としては、限定されるものではないが、human Toll-like receptor 4、ＥＧＦＲ、LDL receptor、angiotensin II receptor、又はＰＤＧＦＲを挙げることができる。
細菌の表面タンパク質、例えば大腸菌の表面タンパク質としては、限定されるものではないが、ＯｍｐＡを挙げることができる。
酵母の表面タンパク質としては、限定されるものではないが、Ｆｌｏ１、αアグルチニン、又はＡＧＡ２を挙げることができる。
動物細胞の表面タンパク質としては、限定されるものではないが、human Toll-like receptor 4、ＥＧＦＲ、LDL receptor、angiotensin II receptor、又はＰＤＧＦＲを挙げることができる。
【0021】
従って、本発明のペプチドライブラリーを用いて、目的ペプチドのアフィニティーセレクション（スクリーニング）を行う場合、容易に目的ペプチドの濃縮を行うことができる。
スクリーニング方法は、（１）ＣＤ２５及びペプチドライブラリーを接触させる工程、（２）ＣＤ２５に結合した宿主を回収する工程、を含み、好ましくは（３）前記回収した宿主を増幅する工程を更に含む。前記スクリーニング方法は、前記接触工程（１）、宿主回収工程（２）及び増幅工程（３）を繰り返し、ＣＤ２５に結合するペプチドを濃縮することが好ましい。前記接触工程（１）におけるＣＤ２５及びペプチドライブラリーの接触は、標的分子を不溶性担体（例えば、ウエル又はディッシュ）に固相化して行うことができる。
前記スクリーニング方法は、本発明のペプチドライブラリーを用いる以外は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、宿主としてファージを用いたファージライブラリーのスクリーニングは、以下のようにことができる。プレートなどに、固相化した標的分子と、ファージライブラリーとを接触させることにより反応させる。洗浄によって標的分子と結合しなかったファージを除去する。標的分子に結合したファージを回収し、大腸菌に感染させ、溶菌、そして増殖させる。溶菌後の培養上清、又は精製したファージを、更に固相化した標的分子と反応させる（パンニングさせる）ことによって、標的分子に特異的な結合分子を提示したファージを濃縮する。最終的にファージをクローン化し、提示ペプチドをシークエンスにより同定する。
得られたペプチドは、ＣＤ２５と結合することができるペプチドである。前記スクリーニング方法では、ペプチドが前記足場タンパク質に提示されているため、ペプチドの構造が安定し、ＣＤ２５に特異性の高いペプチドをスクリーニングすることができる。
スクリーニング方法は、（１）ＣＤ２５及びペプチドライブラリーを接触させる工程、（２）ＣＤ２５に結合した宿主を回収する工程、を含み、好ましくは（３）前記回収した宿主を増幅する工程を更に含む。前記スクリーニング方法は、前記接触工程（１）、宿主回収工程（２）及び増幅工程（３）を繰り返し、ＣＤ２５に結合するペプチドを濃縮することが好ましい。前記接触工程（１）におけるＣＤ２５及びペプチドライブラリーの接触は、標的分子を不溶性担体（例えば、ウエル又はディッシュ）に固相化して行うことができる。
前記スクリーニング方法は、本発明のペプチドライブラリーを用いる以外は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、宿主としてファージを用いたファージライブラリーのスクリーニングは、以下のようにことができる。プレートなどに、固相化した標的分子と、ファージライブラリーとを接触させることにより反応させる。洗浄によって標的分子と結合しなかったファージを除去する。標的分子に結合したファージを回収し、大腸菌に感染させ、溶菌、そして増殖させる。溶菌後の培養上清、又は精製したファージを、更に固相化した標的分子と反応させる（パンニングさせる）ことによって、標的分子に特異的な結合分子を提示したファージを濃縮する。最終的にファージをクローン化し、提示ペプチドをシークエンスにより同定する。
得られたペプチドは、ＣＤ２５と結合することができるペプチドである。前記スクリーニング方法では、ペプチドが前記足場タンパク質に提示されているため、ペプチドの構造が安定し、ＣＤ２５に特異性の高いペプチドをスクリーニングすることができる。
【0022】
［２］Ｔ細胞増殖用ペプチド
本発明のペプチドは、配列番号３～６２で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド（以下、Ｔ細胞増殖ペプチドと称することがある）であり、ＣＤ２５に高い親和性を示し、Ｔ細胞の増殖作用を有する。配列番号３～６２で表されるアミノ酸配列のＴ細胞増殖配列を表１及び２に示す。
本発明のペプチドは、配列番号３～６２で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド（以下、Ｔ細胞増殖ペプチドと称することがある）であり、ＣＤ２５に高い親和性を示し、Ｔ細胞の増殖作用を有する。配列番号３～６２で表されるアミノ酸配列のＴ細胞増殖配列を表１及び２に示す。
【0023】
【表1】
【0024】
【表2】
【0025】
本発明のＴ細胞増殖ペプチドは、配列番号３～６２で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端にＰ、ＲＰ、若しくはＥＲＰを含むか、及び／又はＣ末端にＴ、ＴＧ、ＴＧＱ、ＴＧＱＫ、若しくはＴＧＱＫＰを含んでもよい。従って、Ｎ末端はアミノ酸が付加されない態様を含めて４種の末端があり、Ｃ末端もアミノ酸が付加されない態様を含めて６種類の末端がある。従って、Ｔ細胞増殖ペプチドのＮ末端及びＣ末端の組み合わせの態様は、２４種類の組み合わせの態様がある。これらのいずれの態様においても、本発明のＴ細胞増殖ペプチドとして用いることができる。具体的には、前記２５アミノ酸長のＴ細胞増殖ペプチドは、安定してＣＤ２５に高い親和性を示し、Ｔ細胞の増殖作用を示す。更に、Ｎ末及び／又はＣ末に前記のアミノ酸が付加された態様の２６～３３アミノ酸長の２４種類のライブラリーペプチドも安定してＣＤ２５に高い親和性を示し、Ｔ細胞の増殖作用を示す。
【0026】
例えば、Ｔ細胞増殖ペプチドのＮ末端に「ＥＲＰ」が付加され、そしてＣ末端に「ＴＧＱＫＰ」が付加されたＴ細胞増殖ペプチドとして、それぞれ３３アミノ酸長の
ペプチド１：ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＧＧＶＦＤＹＨＩＧＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号６９）、
ペプチド２：ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＧＧＶＦＤＹＫＶＱＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号７０）、又は
ペプチド３：ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＴＧＧＧＶＬＴＡＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号７１）、が挙げられる。
ペプチド１：ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＧＧＶＦＤＹＨＩＧＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号６９）、
ペプチド２：ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＧＧＶＦＤＹＫＶＱＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号７０）、又は
ペプチド３：ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＴＧＧＧＶＬＴＡＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号７１）、が挙げられる。
【0027】
前記２５アミノ酸長のＴ細胞増殖ペプチドは安定して安定してＣＤ２５に高い親和性を示し、Ｔ細胞の増殖作用を示す。この２５アミノ酸長のＴ細胞増殖ペプチドが安定であるため、これらのＴ細胞増殖ペプチドを含む、２６～３３アミノ酸長のＴ細胞増殖ペプチドも、安定してＣＤ２５に高い親和性を示し、Ｔ細胞の増殖作用を示す。更に、前記３３アミノ酸長のＴ細胞増殖ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に１又は複数のアミノ酸が付加されたライブラリーペプチドも、本発明のライブラリーペプチドとして、有効に用いることができる。付加されるアミノ酸の数は、特に限定されるものではないが、好ましくは１～１５個（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５）、より好ましくは１～１０個、更に好ましくは１～５個、更により好ましくは１～３個である。
【0028】
本発明のＴ細胞増殖ペプチドの平衡解離定数（ＫＤ）は、特に限定されるものではないが、例えば０．００１～１００００ＫＤ（ｎＭ）であり、ある態様では、０．０１～１００ＫＤ（ｎＭ）であり、ある態様では１～１００ＫＤ（ｎＭ）であり、ある態様では１０～８０ＫＤ（ｎＭ）であり、ある態様では２０～６０ＫＤ（ｎＭ）である。平衡解離定数が前記範囲であることによって、ＣＤ２５に効率的に結合し、Ｔ細胞を増殖させることができる。
【0029】
《作用》
本発明のＴ細胞増殖ペプチドは、分子サイズが小さく、かつ分子内ジスルフィド結合を持たないため、容易に化学合成で調製できる。
本発明のＴ細胞増殖ペプチドは、分子サイズが小さく、かつ分子内ジスルフィド結合を持たないため、容易に化学合成で調製できる。
【実施例0030】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【0031】
《実施例１》
本実施例では、足場ペプチドにＣＤ２５に対するモノクローナル抗体のＣＤＲ－Ｈ３の部分ペプチドを組み込んだ下記の２種類のアミノ酸配列を有するペプチドライブラリーを構築した。
ペプチドライブラリー１：
ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＧＧＶＦＤＹＸＸＸＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号６７）
ペプチドライブラリー２：
ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＸＧＧＧＶＬＴＸＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号６８）
ペプチドライブラリー１は、足場ペプチド（ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ：配列番号７２）の１２～２０番のアミノ酸「ＤＲＲＦＳＲＳＤＥ」を「ＧＧＶＦＤＹＸＸＸ」に置き換えた。ペプチドライブラリー２は、１６～２３番のアミノ酸「ＳＲＳＤＥＬＴＲ」を「ＸＧＧＧＶＬＴＸ」に置き換えた。前記足場ペプチドをコードする核酸を含むベクターを鋳型に、それぞれ「ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＧＧＶＦＤＹＸＸＸＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ」又は「ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＸＧＧＧＶＬＴＸＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ」をコードするヌクレオチドをＰＣＲで合成した。Ｘのアミノ酸は、２０個の任意のアミノ酸をコードするＮＮＫコドン（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれかの塩基、ＫはＧもしくはＴのいずれかの塩基）となるように、ヌクレオチド（プライマー）を合成し、反応に用いた。
得られたヌクレオチドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで切り出し、レンチウイルスベクターに組み込み、ペプチドライブラリー１及び２を得た。
本実施例では、足場ペプチドにＣＤ２５に対するモノクローナル抗体のＣＤＲ－Ｈ３の部分ペプチドを組み込んだ下記の２種類のアミノ酸配列を有するペプチドライブラリーを構築した。
ペプチドライブラリー１：
ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＧＧＶＦＤＹＸＸＸＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号６７）
ペプチドライブラリー２：
ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＸＧＧＧＶＬＴＸＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号６８）
ペプチドライブラリー１は、足場ペプチド（ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ：配列番号７２）の１２～２０番のアミノ酸「ＤＲＲＦＳＲＳＤＥ」を「ＧＧＶＦＤＹＸＸＸ」に置き換えた。ペプチドライブラリー２は、１６～２３番のアミノ酸「ＳＲＳＤＥＬＴＲ」を「ＸＧＧＧＶＬＴＸ」に置き換えた。前記足場ペプチドをコードする核酸を含むベクターを鋳型に、それぞれ「ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＧＧＶＦＤＹＸＸＸＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ」又は「ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＸＧＧＧＶＬＴＸＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ」をコードするヌクレオチドをＰＣＲで合成した。Ｘのアミノ酸は、２０個の任意のアミノ酸をコードするＮＮＫコドン（ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれかの塩基、ＫはＧもしくはＴのいずれかの塩基）となるように、ヌクレオチド（プライマー）を合成し、反応に用いた。
得られたヌクレオチドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで切り出し、レンチウイルスベクターに組み込み、ペプチドライブラリー１及び２を得た。
【0032】
《実施例２》
本実施例では、実施例１で構築したペプチドライブラリー１及び２を用いて、ＣＤ２５との結合によりスクリーニング（濃縮）を行った。
まず、ＣＤ２５を恒常発現するＫ５６２細胞株を樹立し、さらに、実施例１で得られたライブラリーペプチドを細胞膜上に共発現させた。この中から、ＣＤ２５とペプチドが結合している細胞群を回収してゲノムを抽出し、ライブラリーペプチドをコードする遺伝子配列を次世代シーケンサーで解析した。
ペプチドライブラリー１の上位３０のペプチド配列を図１に、ペプチドライブラリー２の上位３０のペプチド配列を図２に示す。これらのペプチドは、ＣＤ２５との結合によって、濃縮されたペプチドであり、優れたＣＤ２５との親和性を示す。
本実施例では、実施例１で構築したペプチドライブラリー１及び２を用いて、ＣＤ２５との結合によりスクリーニング（濃縮）を行った。
まず、ＣＤ２５を恒常発現するＫ５６２細胞株を樹立し、さらに、実施例１で得られたライブラリーペプチドを細胞膜上に共発現させた。この中から、ＣＤ２５とペプチドが結合している細胞群を回収してゲノムを抽出し、ライブラリーペプチドをコードする遺伝子配列を次世代シーケンサーで解析した。
ペプチドライブラリー１の上位３０のペプチド配列を図１に、ペプチドライブラリー２の上位３０のペプチド配列を図２に示す。これらのペプチドは、ＣＤ２５との結合によって、濃縮されたペプチドであり、優れたＣＤ２５との親和性を示す。
【0033】
《実施例３》
本実施例では、実施例２で得られたペプチドを化学合成し、ＣＤ２５との結合との結合力をバイオレイヤー干渉法により測定した。下記のペプチド１～３を化学合成した。
ペプチド１：ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＧＧＶＦＤＹＨＩＧＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号６９）
ペプチド２：ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＧＧＶＦＤＹＫＶＱＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号７０）
ペプチド３：ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＴＧＧＧＶＬＴＡＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号７１）
ペプチドのＮ末端にビオチンを修飾し、１００ｎＭとなるように緩衝液（０．１％ ＢＳＡ、０．００２％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＴＢＳ緩衝液、ｐＨ＝７．４）で調製し、ストレプトアビジンバイオセンサーの表面に３００ 秒間ロードした。バイオセンサーを３０秒間洗浄、および６０秒間平衡化した後、バイオセンサーに固定したペプチドへのＣＤ２５－Ｆｃの結合を３００秒間測定した。続いて、バイオセンサーを緩衝液に浸し、ＣＤ２５－Ｆｃの解離を３００秒間測定した。得られた結合曲線を解析し、平衡解離定数ＫＤを求めた。
表３に示すように、ペプチド１～３は優れた平衡解離定数を示した。
本実施例では、実施例２で得られたペプチドを化学合成し、ＣＤ２５との結合との結合力をバイオレイヤー干渉法により測定した。下記のペプチド１～３を化学合成した。
ペプチド１：ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＧＧＶＦＤＹＨＩＧＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号６９）
ペプチド２：ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＧＧＶＦＤＹＫＶＱＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号７０）
ペプチド３：ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＴＧＧＧＶＬＴＡＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号７１）
ペプチドのＮ末端にビオチンを修飾し、１００ｎＭとなるように緩衝液（０．１％ ＢＳＡ、０．００２％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＴＢＳ緩衝液、ｐＨ＝７．４）で調製し、ストレプトアビジンバイオセンサーの表面に３００ 秒間ロードした。バイオセンサーを３０秒間洗浄、および６０秒間平衡化した後、バイオセンサーに固定したペプチドへのＣＤ２５－Ｆｃの結合を３００秒間測定した。続いて、バイオセンサーを緩衝液に浸し、ＣＤ２５－Ｆｃの解離を３００秒間測定した。得られた結合曲線を解析し、平衡解離定数ＫＤを求めた。
表３に示すように、ペプチド１～３は優れた平衡解離定数を示した。
【0034】
【表3】
【0035】
《実施例４》
本実施例では、前記ペプチド１～３を用いて、ヒトＴ細胞に対する増殖作用を検討した。
ボランティアより採血した血液から、Lymphoprepを用いて抹消単核球を分離した。５ｘ１０５個のヒト末梢血単核細胞を培養し、培養液に前記プチド１～３（１０μｇ／ｍＬ）を添加した。陽性コントロールとしてＩＬ－２（２００Ｕ／ｍＬ）を、そして陰性コントロールとして足場ペプチド（１０μｇ／ｍＬ：下記にアミノ酸配列を示す）を添加した。
足場ペプチド：ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号７２）
７日間培養後に細胞数をＭＴＴアッセイにより測定した（ｎ＝３）。図３に示すように、ペプチド１、２、３を添加した場合に、有意に細胞数が増加した。この細胞増殖効果は、ＩＬ－２よりも強かった。
本実施例では、前記ペプチド１～３を用いて、ヒトＴ細胞に対する増殖作用を検討した。
ボランティアより採血した血液から、Lymphoprepを用いて抹消単核球を分離した。５ｘ１０５個のヒト末梢血単核細胞を培養し、培養液に前記プチド１～３（１０μｇ／ｍＬ）を添加した。陽性コントロールとしてＩＬ－２（２００Ｕ／ｍＬ）を、そして陰性コントロールとして足場ペプチド（１０μｇ／ｍＬ：下記にアミノ酸配列を示す）を添加した。
足場ペプチド：ＥＲＰＹＡＣＰＶＥＳＣＤＲＲＦＳＲＳＤＥＬＴＲＨＩＲＩＨＴＧＱＫＰ（配列番号７２）
７日間培養後に細胞数をＭＴＴアッセイにより測定した（ｎ＝３）。図３に示すように、ペプチド１、２、３を添加した場合に、有意に細胞数が増加した。この細胞増殖効果は、ＩＬ－２よりも強かった。
【産業上の利用可能性】
【0036】
本発明のＴ細胞増殖ペプチドはＴ細胞の増殖作用を有し、例えばＣＡＲ－Ｔ細胞療法におけるＴ細胞の増殖に用いることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】