(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022189889
(43)【公開日】2022-12-22
(54)【発明の名称】疼痛関連障害を処置するための物質及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20221215BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20221215BHJP
A61P 25/04 20060101ALI20221215BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20221215BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20221215BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20221215BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20221215BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20221215BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N15/11 Z ZNA
A61P25/04
A61P29/00
A61K48/00
A61K35/545
A61K35/28
A61K35/76
【審査請求】有
【請求項の数】29
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022167518
(22)【出願日】2022-10-19
(62)【分割の表示】P 2019500283の分割
【原出願日】2017-07-06
(31)【優先権主張番号】62/358,769
(32)【優先日】2016-07-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/461,876
(32)【優先日】2017-02-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】598032106
【氏名又は名称】バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＶＥＲＴＥＸ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100150810
【弁理士】
【氏名又は名称】武居 良太郎
(74)【代理人】
【識別番号】100134784
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 和美
(72)【発明者】
【氏名】アンテ スベン ランドバーグ
(72)【発明者】
【氏名】サマース クルカーニー
(72)【発明者】
【氏名】ローレンス クレイン
(72)【発明者】
【氏名】ハリ クマー パッドマナブハン
(57)【要約】
【課題】ＳＣＮ１０Ａ関連適応症に関する安全で有効な処置を開発すること。
【解決手段】ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏに関わらずＳＣＮ１０Ａと関連する１つまたは複数の状態を有する患者を処置するための物質及び方法を提供する。加えて、本出願は、ゲノム編集によって細胞内でＳＣＮ１０Ａ遺伝子の発現を編集及び／またはモジュレートするための物質及び方法を提供する。
【選択図】図１
【解決手段】ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏに関わらずＳＣＮ１０Ａと関連する１つまたは複数の状態を有する患者を処置するための物質及び方法を提供する。加えて、本出願は、ゲノム編集によって細胞内でＳＣＮ１０Ａ遺伝子の発現を編集及び／またはモジュレートするための物質及び方法を提供する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゲノム編集によって細胞内で電位依存性ナトリウムチャネルＸ型アルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）遺伝子を編集するための方法であって、前記細胞に１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、前記ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ制御エレメント内またはその近傍で１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を行い、前記ＳＣＮ１０Ａ遺伝子内またはその近傍に少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的挿入、欠失または変異をもたらし、それによって、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子産物の発現または機能を低減または除去することを含む前記方法。
【請求項2】
ＳＣＮ１０Ａ関連状態または障害を有する患者を処置するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、
（ａ）患者特異的誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を電位依存性ナトリウムチャネルＸ型アルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）遺伝子または前記ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の制御エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍で編集すること；
（ｂ）前記編集されたｉＰＳＣを末梢神経系のニューロンに分化させること；及び
（ｃ）前記末梢神経系のニューロンを前記患者に投与すること
を含む前記方法。
（ａ）患者特異的誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を電位依存性ナトリウムチャネルＸ型アルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）遺伝子または前記ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の制御エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍で編集すること；
（ｂ）前記編集されたｉＰＳＣを末梢神経系のニューロンに分化させること；及び
（ｃ）前記末梢神経系のニューロンを前記患者に投与すること
を含む前記方法。
【請求項3】
前記編集ステップが、前記ｉＰＳＣに１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、前記ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ制御エレメント内またはその近傍で１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を行い、前記ＳＣＮ１０Ａ遺伝子内またはその近傍に少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的挿入、欠失または変異をもたらし、それによって、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子産物の発現または機能を低減または除去することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
ＳＣＮ１０Ａ関連状態または障害を有する患者を処置するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、
（ａ）間葉系幹細胞を電位依存性ナトリウムチャネルＸ型アルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）遺伝子または前記ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の制御エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍で編集すること；
（ｂ）前記編集された間葉系幹細胞を末梢神経系のニューロンに分化させること；及び
（ｃ）前記末梢神経系のニューロンを前記患者に投与すること
を含む前記方法。
（ａ）間葉系幹細胞を電位依存性ナトリウムチャネルＸ型アルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）遺伝子または前記ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の制御エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍で編集すること；
（ｂ）前記編集された間葉系幹細胞を末梢神経系のニューロンに分化させること；及び
（ｃ）前記末梢神経系のニューロンを前記患者に投与すること
を含む前記方法。
【請求項5】
前記編集ステップが、前記間葉系幹細胞に１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、前記ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ制御エレメント内またはその近傍で１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を行い、前記ＳＣＮ１０Ａ遺伝子内またはその近傍に少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的挿入、欠失または変異をもたらし、それによって、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子産物の発現または機能を低減または除去することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
ＳＣＮ１０Ａ関連障害を有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法であって、前記患者の細胞内で前記電位依存性ナトリウムチャネルＸ型アルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）遺伝子を編集することを含む前記方法。
【請求項7】
前記編集ステップが、前記細胞に１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、前記ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ制御エレメント内またはその近傍で１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を行い、前記ＳＣＮ１０Ａ遺伝子内またはその近傍に少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的挿入、欠失または変異をもたらし、それによって、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子産物の発現または機能を低減または除去することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記細胞が末梢神経系のニューロンである、請求項６～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記１種または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを、直接的な神経節内もしくは髄腔内注射、または髄腔内送達を介して前記末梢神経系のニューロンに送達する、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
細胞内でＳＣＮ１０Ａ遺伝子の連続ゲノム配列を変化させる方法であって、前記細胞を、１種または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼと接触させて、１種または複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を行うことを含む前記方法。
【請求項11】
前記連続ゲノム配列の変化が前記ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の１つまたは複数のエキソンで生じる、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記１種または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、配列番号１～６２０の配列のいずれか、及び配列番号１～６２０において開示されている配列のいずれかに対して少なくとも９０％相同性を有するバリアントから選択される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記１種または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが１つまたは複数のタンパク質またはポリペプチドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１種または複数のポリヌクレオチドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
前記１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、前記１つまたは複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）が、１つまたは複数の化学修飾ＲＮＡである、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記１つまたは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）が、前記コード領域で化学修飾されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記１つもしくは複数のポリヌクレオチドまたは１つもしくは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）がコドン最適化されている、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記細胞に、１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡを導入することをさらに含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、前記ＳＣＮ１０Ａ遺伝子内またはその近傍のＤＮＡ配列に対して相補的であるスペーサー配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが化学修飾されている、請求項１９～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡが、前記１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼと事前複合体化されている、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記事前複合体化が、前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１種もしくは複数のｓｇＲＮＡと前記１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼとの共有結合を伴う、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼがリポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化されている、請求項１２～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡも含むリポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化されている、請求項１９～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
前記１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼがＡＡＶベクター粒子内でコードされる、請求項１０、または１９～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡがＡＡＶベクター粒子内でコードされる、請求項１９～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
前記１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたは１つもしくは複数のｓｇＲＮＡもコードするＡＡＶベクター粒子内でコードされる、請求項１９～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
前記ＡＡＶベクター粒子が、配列番号４７３４～５３０２及び表２に開示されているもののうちのいずれかからなる群から選択される、請求項２６～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
配列番号５３０５～７６０１２のいずれかに対応するＲＮＡ配列である少なくとも１つのスペーサー配列を含む、一分子ガイドＲＮＡ。
【請求項31】
前記一分子ガイドＲＮＡがスペーサーエクステンション領域をさらに含む、請求項３０に記載の一分子ガイドＲＮＡ。
【請求項32】
前記一分子ガイドＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション領域をさらに含む、請求項３０に記載の一分子ガイドＲＮＡ。
【請求項33】
前記一分子ガイドＲＮＡが化学修飾されている、請求項３０～３２に記載の一分子ガイドＲＮＡ。
【請求項34】
ＤＮＡエンドヌクレアーゼと事前複合体化している、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の一分子ガイドＲＮＡ。
【請求項35】
前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである、請求項３４に記載の一分子ガイドＲＮＡ。
【請求項36】
Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ ３ Ｃａｓ９、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９、Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１及びＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６ Ｃｐｆ１、ならびに前記エンドヌクレアーゼに対して少なくとも９０％相同性を有するバリアントからなる群から選択される、請求項３５に記載の一分子ガイドＲＮＡ。
【請求項37】
前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが１つまたは複数の核移行シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項３６に記載の一分子ガイドＲＮＡ。
【請求項38】
少なくとも１つのＮＬＳが、前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼのアミノ末端に、またはその５０アミノ酸以内にあり、及び／または少なくとも１つのＮＬＳが、前記Ｃａｓ９またはＣｐｆ１のカルボキシ末端に、またはその５０アミノ酸以内にある、請求項３７に記載の一分子ガイドＲＮＡ。
【請求項39】
請求項３０～３３のいずれか１項に記載の一分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、遺伝子編集の分野に、具体的には、電位依存性ナトリウムチャネルＸ型アルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）遺伝子の変化に関する。
【0002】
関連出願
本出願は、２０１６年７月６日出願の米国特許仮出願第６２／３５８，７６９号、及び２０１７年２月２２日出願の米国特許仮出願第６２／４６１，８７６号の利益を請求するものであり、これらは両方とも、参照によってその全体が本明細書に援用される。
本出願は、２０１６年７月６日出願の米国特許仮出願第６２／３５８，７６９号、及び２０１７年２月２２日出願の米国特許仮出願第６２／４６１，８７６号の利益を請求するものであり、これらは両方とも、参照によってその全体が本明細書に援用される。
【0003】
配列表の参照による援用
本出願は、コンピューター読み取り可能な形式の配列表［ファイル名：１７０１５３ＰＣＴ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ（ＳＣＮ１０Ａ）＿（Ｐａｒｔ １）：１８，３７５，９１０バイト－ＡＳＣＩＩテキストファイル；２０１７年６月２８日作成、及び１７０１５３ＰＣＴ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ（ＳＣＮ１０Ａ）＿（Ｐａｒｔ ２）：１５，０４８，６０８バイト－ＡＳＣＩＩテキストファイル；２０１７年６月２８日作成］を含み、これらは、その全体が参照によって本明細書に援用され、かつ本開示の一部を形成する。
本出願は、コンピューター読み取り可能な形式の配列表［ファイル名：１７０１５３ＰＣＴ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ（ＳＣＮ１０Ａ）＿（Ｐａｒｔ １）：１８，３７５，９１０バイト－ＡＳＣＩＩテキストファイル；２０１７年６月２８日作成、及び１７０１５３ＰＣＴ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ（ＳＣＮ１０Ａ）＿（Ｐａｒｔ ２）：１５，０４８，６０８バイト－ＡＳＣＩＩテキストファイル；２０１７年６月２８日作成］を含み、これらは、その全体が参照によって本明細書に援用され、かつ本開示の一部を形成する。
【背景技術】
【0004】
ゲノム操作は、生体の遺伝情報（ゲノム）を標的特異的修飾するためのストラテジー及び技法を指す。ゲノム操作は、特にヒトの健康分野における広範な適用可能性により、研究が非常に活発な分野である。例えば、ゲノム操作を、有害な変異を保有する遺伝子を変化させる（例えば、修正する、またはノックアウトする）ために、または遺伝子の機能を探求するために使用することができる。生細胞に導入遺伝子を挿入するために開発された初期の技術は、ゲノムへの新たな配列のランダムな挿入性によって制限されることが多かった。ゲノムへのランダム挿入は、隣接遺伝子の正常な制御の破壊をもたらし、深刻で望ましくない作用につながることがある。さらに、２つの異なる細胞で同じ場所に配列が挿入される保証がないので、ランダム挿入技術は、再現性をほとんど示さない。最近のゲノム操作ストラテジー、例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）及びＭｅｇａＴＡＬでは、ＤＮＡの特異的な領域を修飾することができ、それによって、初期技術と比較すると、修正または挿入の精度が上昇する。これらの新しいプラットフォームは、かなり高い程度の再現性を示すが、それらにはまだ限界がある。
【0005】
遺伝性障害に対処しようとしている全世界の研究者及び医療従事者の努力にも関わらず、かつゲノム操作アプローチの将来性にも関わらず、ＳＣＮ１０Ａ関連適応症に関する安全で有効な処置を開発する重大な必要性がいまだ存在する。
【0006】
ゲノムの恒久的変化をもたらし、わずか１回の処置でＳＣＮ１０Ａ関連障害または状態に対処することができるゲノム操作ツールを使用することによって、結果として生じる治療法は、ある種のＳＣＮ１０Ａ関連適応症及び／または疾患を完全に治癒させ得る。
【発明の概要】
【0007】
ゲノム編集によって電位依存性ナトリウムチャネルＸ型アルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ遺伝子の制御エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍に少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の挿入、欠失または変異を導入し、電位依存性ナトリウムチャネルＸ型アルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）遺伝子産物を減少させる、または除去することによって、ゲノムの恒久的変化をもたらすための細胞ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ方法を本明細書において提供し、この方法を、疼痛を処置するために使用することができる。そのような方法を行うための成分及び組成物、ならびにベクターも提供する。
【0008】
細胞に１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ制御エレメント内またはその近傍で１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を行い、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子内またはその近傍に少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的挿入、欠失または変異をもたらし、それによって、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子産物の発現または機能を低減または除去することを含む、ゲノム編集により細胞内で電位依存性ナトリウムチャネルＸ型アルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）遺伝子を編集するための方法を本明細書において提供する。
【0009】
患者特異的誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を電位依存性ナトリウムチャネルＸ型アルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ遺伝子の制御エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍で編集すること；編集されたｉＰＳＣを末梢神経系のニューロンに分化させること；及び末梢神経系のニューロンを患者に投与することを含む、ＳＣＮ１０Ａ関連状態または障害を有する患者を処置するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法も本明細書において提供する。
【0010】
一部の態様では、編集ステップは、ｉＰＳＣに１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ制御エレメント内またはその近傍で１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を行い、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子内またはその近傍に少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的挿入、欠失または変異をもたらし、それによって、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子産物の発現または機能を低減または除去することを含む。
【0011】
間葉系幹細胞を電位依存性ナトリウムチャネルＸ型アルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ遺伝子の制御エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍で編集すること；編集された間葉系幹細胞を末梢神経系のニューロンに分化させること；及び末梢神経系のニューロンを患者に投与することを含む、ＳＣＮ１０Ａ関連状態または障害を有する患者を処置するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法も本明細書において提供する。
【0012】
一部の態様では、編集ステップは、間葉系幹細胞に１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ制御エレメント内またはその近傍で１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を行い、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子内またはその近傍に少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的挿入、欠失または変異をもたらし、それによって、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子産物の発現または機能を低減または除去することを含む。
【0013】
患者の細胞内で電位依存性ナトリウムチャネルＸ型アルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）遺伝子を編集することを含む、ＳＣＮ１０Ａ関連障害を有する患者を処置するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法も本明細書において提供する。
【0014】
一部の態様では、編集ステップは、細胞に１つまたは複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入して、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ制御エレメント内またはその近傍で１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を行い、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子内またはその近傍に少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的挿入、欠失または変異をもたらし、それによって、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子産物の発現または機能を低減または除去することを含む。
【0015】
一部の態様では、細胞は、末梢神経系のニューロンである。一部の態様では、１種または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを、直接的な神経節内もしくは髄腔内注射、または髄腔内送達を介して末梢神経系のニューロンに送達する。
【0016】
細胞を１種または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼと接触させて、１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を行うことを含む、細胞内でＳＣＮ１０Ａ遺伝子の連続ゲノム配列を変化させる方法も本明細書において提供する。一部の態様では、連続ゲノム配列の変化は、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の１つまたは複数のエキソンで生じる。
【0017】
一部の態様では、１種または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、配列番号１～６２０の配列のいずれか、及び配列番号１～６２０で開示されているもののうちのいずれかに対して少なくとも９０％相同性を有するバリアントから選択される。
【0018】
一部の態様では、１種または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、１種または複数のタンパク質またはポリペプチドである。一部の態様では、１種または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、１種または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１種または複数のポリヌクレオチドである。一部の態様では、１種または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、１種または複数のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１種または複数のリボ核酸（ＲＮＡ）である。一部の態様では、１種または複数のリボ核酸（ＲＮＡ）は、１種または複数の化学修飾ＲＮＡである。一部の態様では、１種または複数のリボ核酸（ＲＮＡ）は、コード領域で化学修飾されている。一部の態様では、１種もしくは複数のポリヌクレオチドまたは１種もしくは複数のリボ核酸（ＲＮＡ）は、コドン最適化されている。
【0019】
一部の態様では、方法はさらに、細胞に１種もしくは複数のｇＲＮＡまたは１種もしくは複数のｓｇＲＮＡを導入することを含む。一部の態様では、１種もしくは複数のｇＲＮＡまたは１種もしくは複数のｓｇＲＮＡは、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子内またはその近傍のＤＮＡ配列に対して相補的であるスペーサー配列を含む。一部の態様では、１種もしくは複数のｇＲＮＡまたは１種もしくは複数のｓｇＲＮＡは、化学修飾されている。一部の態様では、１種もしくは複数のｇＲＮＡまたは１種もしくは複数のｓｇＲＮＡは、１種または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼと事前複合体化されている。一部の態様では、事前複合体化は、１種または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼへの１種もしくは複数のｇＲＮＡまたは１種もしくは複数のｓｇＲＮＡの共有結合を伴う。
【0020】
一部の態様では、１種または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼをリポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化する。一部の態様では、１種または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを、１種もしくは複数のｇＲＮＡまたは１種もしくは複数のｓｇＲＮＡも含むリポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化する。
【0021】
一部の態様では、１種または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、ＡＡＶベクター粒子内でコードされる。一部の態様では、１種もしくは複数のｇＲＮＡまたは１種もしくは複数のｓｇＲＮＡは、ＡＡＶベクター粒子内でコードされる。一部の態様では、１種または複数のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼは、１種もしくは複数のｇＲＮＡまたは１種もしくは複数のｓｇＲＮＡもコードするＡＡＶベクター粒子内でコードされる。一部の態様では、ＡＡＶベクター粒子は、配列番号４７３４～５３０２及び表２に開示されているもののいずれかからなる群から選択される。
【0022】
配列番号５３０５～７６０１２のいずれかに対応するＲＮＡ配列である少なくとも１つのスペーサー配列を含む一分子ガイドＲＮＡも本明細書において提供する。一部の態様では、一分子ガイドＲＮＡはさらに、スペーサーエクステンション領域を含む。一部の態様では、一分子ガイドＲＮＡはさらに、ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション領域を含む。一部の態様では、一分子ガイドＲＮＡは、化学修飾されている。
【0023】
一部の態様では、一分子ガイドＲＮＡは、部位特異的ポリペプチドと事前複合体化されている。一部の態様では、部位特異的ポリペプチドは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。一部の態様では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣＰｆ１エンドヌクレアーゼである。一部の態様では、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ ３ Ｃａｓ９、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９、Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１及びＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６ Ｃｐｆ１、ならびにこれらのエンドヌクレアーゼに対して少なくとも９０％相同性を有するバリアントからなる群から選択される。一部の態様では、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼは、１つまたは複数の核移行シグナル（ＮＬＳ）を含む。一部の態様では、少なくとも１つのＮＬＳは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼのアミノ末端もしくはその５０アミノ酸以内にあり、及び／または少なくとも１つのＮＬＳは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼのカルボキシ末端もしくはその５０アミノ酸以内にある。
【0024】
本明細書に記載の一分子ガイドポリヌクレオチドをコードするＲＮＡも本明細書において提供する。
【0025】
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムをコードするＲＮＡも本明細書において提供する。
【0026】
本明細書に記載の一分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡも本明細書において提供する。
【0027】
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムをコードするＤＮＡも本明細書において提供する。
【0028】
一分子ガイドＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムをコードするＤＮＡを含むベクターも本明細書において提供する。一部の態様では、ベクターはプラスミドである。一部の態様では、ベクターは、配列番号４７３４～５３０２または表２に列挙されているものから選択されるＡＡＶベクター粒子である。
【0029】
添付の図面を参照することによって、本明細書において開示する、及び記載する物質及び方法の様々な態様をより良好に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】Ａ～Ｂは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを示している。Ａは、ｇＲＮＡを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの図である。Ｂは、ｓｇＲＮＡを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの別の図である。
【図2A】ｉｎ－ｖｉｔｒｏ転写された（ＩＶＴ）ｇＲＮＡスクリーニングを介して選択されたＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡの９０．４～９８．６％の範囲の切断効率を示している。
【図2B】ｉｎ－ｖｉｔｒｏ転写された（ＩＶＴ）ｇＲＮＡスクリーニングを介して選択されたＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡの８４．６～９０．３％の範囲の切断効率を示している。
【図2C】ｉｎ－ｖｉｔｒｏ転写された（ＩＶＴ）ｇＲＮＡスクリーニングを介して選択されたＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡの７８．７～８４．３％の範囲の切断効率を示している。
【図2D】ｉｎ－ｖｉｔｒｏ転写された（ＩＶＴ）ｇＲＮＡスクリーニングを介して選択されたＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡの７１．４～７７．６％の範囲の切断効率を示している。
【図2E】ｉｎ－ｖｉｔｒｏ転写された（ＩＶＴ）ｇＲＮＡスクリーニングを介して選択されたＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡの６２～７１．４％の範囲の切断効率を示している。
【図2F】ｉｎ－ｖｉｔｒｏ転写された（ＩＶＴ）ｇＲＮＡスクリーニングを介して選択されたＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡの４４～５９．９％の範囲の切断効率を示している。
【図2G】ｉｎ－ｖｉｔｒｏ転写された（ＩＶＴ）ｇＲＮＡスクリーニングを介して選択されたＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡの１５．４～４３．７％の範囲の切断効率を示している。
【図2H】ｉｎ－ｖｉｔｒｏ転写された（ＩＶＴ）ｇＲＮＡスクリーニングを介して選択されたＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡの１．６～１４．７％の範囲の切断効率を示している。
【図3A】ＳＣＮ１０Ａ遺伝子をターゲティングする、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内でのＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡの８１．１～９８．６％の範囲の切断効率を示している。
【図3B】ＳＣＮ１０Ａ遺伝子をターゲティングする、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内でのＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡの６２．１～８１．１％の範囲の切断効率を示している。
【図3C】ＳＣＮ１０Ａ遺伝子をターゲティングする、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内でのＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡの１．６～６２％の範囲の切断効率を示している。
【発明を実施するための形態】
【0031】
配列表の簡単な説明
配列番号１～６２０は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼオルソログ配列である。
配列番号１～６２０は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼオルソログ配列である。
【0032】
配列番号６２１～６３１は、配列を含まない。
【0033】
配列番号６３２～４７１５は、ミクロＲＮＡ配列である。
【0034】
配列番号４７１６～４７３３は、配列を含まない。
【0035】
配列番号４７３４～５３０２は、ＡＡＶ血清型配列である。
【0036】
配列番号５３０３は、ＳＣＮ１０Ａヌクレオチド配列である。
【0037】
配列番号５３０４は、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の上流及び／または下流にある１～５キロ塩基対を含む遺伝子配列である。
【0038】
配列番号５３０５～５７０２は、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼで、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ遺伝子の制御エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍でターゲティングするための２０ｂｐスペーサー配列である。
【0039】
配列番号５７０３～６７７１は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼで、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ遺伝子の制御エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍でターゲティングするための２０ｂｐスペーサー配列である。
【0040】
配列番号６７７２～９９８３は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼで、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ遺伝子の制御エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍でターゲティングするための２０ｂｐスペーサー配列である。
【0041】
配列番号９９８４～１２７５３は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼで、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ遺伝子の制御エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍でターゲティングするための２０ｂｐスペーサー配列である。
【0042】
配列番号１２７５４～４０５３０は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼで、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ遺伝子の制御エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍でターゲティングするための２０ｂｐスペーサー配列である。
【0043】
配列番号４０５３１～７６０１２は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、ａ Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、及びＦｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ Ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼで、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ遺伝子の制御エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍でターゲティングするための２０ｂｐスペーサー配列である。
【0044】
配列番号７６０１３～７６０４２は、配列を含まない。
【0045】
配列番号７６０４３は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのためのサンプルのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。
【0046】
配列番号７６０４４～７６０４６は、サンプルのｓｇＲＮＡ配列を示している。
【0047】
詳細な説明
Ｉ．序論
ゲノム編集
本開示は、生体の遺伝情報（ゲノム）を標的特異的変化させるためのストラテジー及び技法を提供する。本明細書で使用する場合、「変化」または「遺伝情報の変化」という用語は、細胞のゲノムの任意の変化を指す。遺伝性障害を処置する文脈では、変化には、これに限定されないが、挿入、欠失及び修正が含まれ得る。本明細書で使用する場合、「挿入」という用語は、ＤＮＡ配列での１個または複数のヌクレオチドの付加を指す。挿入は、いくつかのヌクレオチドの小さな挿入から、大きなセグメント、例えばｃＤＮＡまたは遺伝子の挿入までの範囲であり得る。「欠失」という用語は、ＤＮＡ配列における１つもしくは複数のヌクレオチドの喪失もしくは除去または遺伝子の機能の喪失もしくは除去を指す。場合によっては、欠失には、例えば、いくつかのヌクレオチド、エキソン、イントロン、遺伝子セグメント、または遺伝子の全配列の喪失が含まれ得る。場合によっては、遺伝子の欠失は、遺伝子の機能もしくは発現またはその遺伝子産物の除去または低減を指す。これは、遺伝子内またはその近傍の配列の欠失からだけでなく、遺伝子の発現を破壊する他の事象（例えば挿入、ナンセンス変異）からも生じ得る。「修正」という用語は、本明細書で使用する場合、挿入、欠失または置換によるかに関わらず、細胞内のゲノムの１つまたは複数のヌクレオチドの変化を指す。そのような修正は、構造または機能においてに関わらず、修正されたゲノム部位に、より好ましい遺伝子型または表現型結果をもたらし得る。「修正」の非限定的例の１つは、構造または機能を遺伝子またはその遺伝子産物（複数可）に回復する、野生型配列に対する変異または欠損配列の修正を含む。変異の性質に応じて、修正は、本明細書で開示する様々なストラテジーによって達成され得る。非限定的一例では、ミスセンス変異は、変異を含む領域をその野生型カウンターパートに置き換えることによって修正し得る。別の例として、遺伝子における重複変異（例えば、リピート伸長）は、余分な配列を除去することによって修正し得る。
Ｉ．序論
ゲノム編集
本開示は、生体の遺伝情報（ゲノム）を標的特異的変化させるためのストラテジー及び技法を提供する。本明細書で使用する場合、「変化」または「遺伝情報の変化」という用語は、細胞のゲノムの任意の変化を指す。遺伝性障害を処置する文脈では、変化には、これに限定されないが、挿入、欠失及び修正が含まれ得る。本明細書で使用する場合、「挿入」という用語は、ＤＮＡ配列での１個または複数のヌクレオチドの付加を指す。挿入は、いくつかのヌクレオチドの小さな挿入から、大きなセグメント、例えばｃＤＮＡまたは遺伝子の挿入までの範囲であり得る。「欠失」という用語は、ＤＮＡ配列における１つもしくは複数のヌクレオチドの喪失もしくは除去または遺伝子の機能の喪失もしくは除去を指す。場合によっては、欠失には、例えば、いくつかのヌクレオチド、エキソン、イントロン、遺伝子セグメント、または遺伝子の全配列の喪失が含まれ得る。場合によっては、遺伝子の欠失は、遺伝子の機能もしくは発現またはその遺伝子産物の除去または低減を指す。これは、遺伝子内またはその近傍の配列の欠失からだけでなく、遺伝子の発現を破壊する他の事象（例えば挿入、ナンセンス変異）からも生じ得る。「修正」という用語は、本明細書で使用する場合、挿入、欠失または置換によるかに関わらず、細胞内のゲノムの１つまたは複数のヌクレオチドの変化を指す。そのような修正は、構造または機能においてに関わらず、修正されたゲノム部位に、より好ましい遺伝子型または表現型結果をもたらし得る。「修正」の非限定的例の１つは、構造または機能を遺伝子またはその遺伝子産物（複数可）に回復する、野生型配列に対する変異または欠損配列の修正を含む。変異の性質に応じて、修正は、本明細書で開示する様々なストラテジーによって達成され得る。非限定的一例では、ミスセンス変異は、変異を含む領域をその野生型カウンターパートに置き換えることによって修正し得る。別の例として、遺伝子における重複変異（例えば、リピート伸長）は、余分な配列を除去することによって修正し得る。
【0048】
一部の態様では、変化には、遺伝子ノックイン、ノックアウトまたはノックダウンも含まれ得る。本明細書で使用する場合、「ノックイン」という用語は、ＤＮＡ配列、またはその断片をゲノムに付加することを指す。ノックインされたそのようなＤＮＡ配列は、遺伝子全体または複数の遺伝子を含んでよく、遺伝子または上述の任意の部分もしくは断片と関連する制御配列を含んでよい。例えば、野生型タンパク質をコードするｃＤＮＡを、変異遺伝子を保持する細胞のゲノムへ挿入してもよい。ノックインストラテジーは、全体で、または部分で、欠損遺伝子を置き換える必要はない。場合によっては、ノックインストラテジーはさらに、既存の配列を用意した配列で置き換えること、例えば、変異対立遺伝子を野生型コピーで置き換えることを伴ってよい。他方で、「ノックアウト」という用語は、遺伝子または遺伝子の発現の除去を指す。例えば、リーディングフレームの破壊をもたらすヌクレオチド配列を欠失させる、またはそれを付加することによって、遺伝子をノックアウトすることができる。別の例として、遺伝子の一部を関連配列で置き換えることによって、遺伝子をノックアウトしてもよい。最後に、「ノックダウン」という用語は、本明細書で使用する場合、遺伝子の発現またはその遺伝子産物（複数可）の低減を指す。遺伝子ノックダウンの結果として、タンパク質の活性または機能は減弱し得るか、またはタンパク質レベルは低下する、または除去され得る。
【0049】
ゲノム編集は一般に、ゲノムのヌクレオチド配列を好ましくは正確な、または事前決定された手法で修飾するプロセスを指す。本明細書に記載のゲノム編集の方法の例には、ゲノム内の正確な標的位置でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を切断し、それによって、ゲノム内の特定の位置で一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断を作製するために、部位特異的ヌクレアーゼを使用する方法が含まれる。そのような切断は、Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２１（２），１２１－３１（２０１５）において概説されているとおり、天然内因性細胞プロセス、例えば、相同性配向型修復（ＨＤＲ）及び非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復されてよいか、または通常、それらによって修復される。これら２つの主なＤＮＡ修復プロセスは、別の経路のファミリーから構成される。ＮＨＥＪは、二本鎖切断から生じているＤＮＡ末端を直接結合させ、時に、遺伝子発現を破壊または増強し得るヌクレオチド配列の喪失また付加を伴う。ＨＤＲは、切断点に規定のＤＮＡ配列を挿入するためのテンプレートとして、相同配列、またはドナー配列を利用する。相同配列は、内在性ゲノム、例えば、姉妹染色分体にあり得る。別法では、ドナーは、ヌクレアーゼ切断遺伝子座と高い相同性の領域を有するが、切断標的遺伝子座に組み込まれ得る追加の配列または欠失を含む配列変化も含み得る外在性核酸、例えば、プラスミド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、二重鎖オリゴヌクレオチドまたはウイルスであり得る。第３の修復機構は、「代替ＮＨＥＪ」とも称されるマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）であり得、この場合、遺伝子結果は、小さな欠失及び挿入が切断部位で生じ得るＮＨＥＪと同様である。ＭＭＥＪは、より好ましいＤＮＡ末端結合修復結果を促進するために、ＤＮＡ切断部位に隣接するいくつかの塩基対の相同配列を利用することができ、最近の報告が、このプロセスの分子機構をさらに明瞭にしている；例えば、Ｃｈｏ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ ５１８，１７４－７６（２０１５）；Ｋｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｄｖ．Ｏｎｌｉｎｅ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｓｍｂ．２９６１（２０１５）；Ｍａｔｅｏｓ－Ｇｏｍｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５１８，２５４－５７（２０１５）；Ｃｅｃｃａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２８，２５８－６２（２０１５）を参照されたい。一部の例では、ＤＮＡ切断の部位で起こり得るマイクロホモロジーの分析に基づき、有望な修復結果を予測することが可能であり得る。
【0050】
これらのゲノム編集機構のそれぞれを、所望のゲノム変化を作製するために使用することができる。ゲノム編集プロセスのステップは、標的遺伝子座で、意図されている変異の部位近傍として１つまたは２つのＤＮＡ切断（後者は二本鎖切断として、または２つの一本鎖切断として）を作製するためであり得る。これを、本明細書に記載及び例示するとおり、部位特異的ポリペプチドの使用によって達成することができる。
【0051】
ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼシステム
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート；Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）ゲノム遺伝子座は、多くの原核生物（例えば、細菌及び古細菌）のゲノムにおいて見出され得る。原核生物では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、外来侵入物、例えば、ウイルス及びファージに対して原核生物を防御するために役立つ免疫系の１タイプとして機能する産物をコードする。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座機能には３つの段階がある：ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座への新たな配列の組込み、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の発現、及び外来侵入物核酸のサイレンシング。５種のＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｕ型、及びＶ型）が同定されている。
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート；Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）ゲノム遺伝子座は、多くの原核生物（例えば、細菌及び古細菌）のゲノムにおいて見出され得る。原核生物では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、外来侵入物、例えば、ウイルス及びファージに対して原核生物を防御するために役立つ免疫系の１タイプとして機能する産物をコードする。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座機能には３つの段階がある：ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座への新たな配列の組込み、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の発現、及び外来侵入物核酸のサイレンシング。５種のＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｕ型、及びＶ型）が同定されている。
【0052】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、「リピート」と呼ばれるいくつかの短い繰り返し配列を含む。発現すると、リピートは、二次構造（例えば、ヘアピン）を形成し得る、及び／または非構造化一本鎖配列を含み得る。リピートは通常、クラスターで生じ、種の間で高頻度に分岐し得る。リピートは、「スペーサー」と呼ばれる固有の介在配列で規則的に空間を空けられていて、それによってリピート－スペーサー－リピート遺伝子座の構造が生じている。スペーサーは、既知の外来侵入物配列と同一であるか、または高い相同性を有する。スペーサー－リピート単位は、ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードし、これは、スペーサー－リピート単位の成熟形態にプロセシングされる。ｃｒＲＮＡは、標的核酸をターゲティングすることに関与する「シード」またはスペーサー配列を含む（原核生物において天然に存在する形態では、スペーサー配列は外来侵入物核酸をターゲティングする）。スペーサー配列は、ｃｒＲＮＡの５’または３’末端に位置する。
【0053】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座はまた、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。Ｃａｓ遺伝子は、原核生物において生合成及びｃｒＲＮＡ機能の干渉段階に関与するエンドヌクレアーゼをコードする。一部のＣａｓ遺伝子は、相同性の二次的構造及び／または三次的構造を含む。
【0054】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム
天然におけるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムでのｃｒＲＮＡ生合成は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とする。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの非限定的例は、図１のＡ及びＢに示されている。ｔｒａｃｒＲＮＡは、内在性ＲＮアーゼＩＩＩによって修飾され得、次いで、ハイブリダイズして、プレｃｒＲＮＡアレイでｃｒＲＮＡリピートになる。内在性ＲＮアーゼＩＩＩは、プレｃｒＲＮＡを切断するために動員され得る。切断されたｃｒＲＮＡは、エキソリボヌクレアーゼトリミングに供されて、成熟型ｃｒＲＮＡ（例えば、５’トリミング）を生じ得る。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとハイブリダイズされたまま残存し得、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡは、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）と会合する。ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体のｃｒＲＮＡは、複合体を標的核酸にガイドし得る（標的核酸へｃｒＲＮＡがハイブリダイズし得る）。標的核酸に対するｃｒＲＮＡのハイブリダイゼーションは、標的核酸切断に関してＣａｓ９を活性化し得る。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおける標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ；ＰＡＭ）と呼ばれる。天然では、ＰＡＭは、標的核酸への部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）の結合を容易にするために必須である。ＩＩ型システム（ＮｍｅｎｉまたはＣＡＳＳ４とも呼ばれる）はさらに、ＩＩ－Ａ（ＣＡＳＳ４）型及びＩＩ－Ｂ（ＣＡＳＳ４ａ）型に細分される。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６－８２１（２０１２）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが、ＲＮＡプログラム可能ゲノム編集に有用であることを示しており、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１３／１７６７７２は、部位特異的遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムの多数の例及び用途を提供している。
天然におけるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムでのｃｒＲＮＡ生合成は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とする。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムの非限定的例は、図１のＡ及びＢに示されている。ｔｒａｃｒＲＮＡは、内在性ＲＮアーゼＩＩＩによって修飾され得、次いで、ハイブリダイズして、プレｃｒＲＮＡアレイでｃｒＲＮＡリピートになる。内在性ＲＮアーゼＩＩＩは、プレｃｒＲＮＡを切断するために動員され得る。切断されたｃｒＲＮＡは、エキソリボヌクレアーゼトリミングに供されて、成熟型ｃｒＲＮＡ（例えば、５’トリミング）を生じ得る。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとハイブリダイズされたまま残存し得、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡは、部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）と会合する。ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ９複合体のｃｒＲＮＡは、複合体を標的核酸にガイドし得る（標的核酸へｃｒＲＮＡがハイブリダイズし得る）。標的核酸に対するｃｒＲＮＡのハイブリダイゼーションは、標的核酸切断に関してＣａｓ９を活性化し得る。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおける標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ；ＰＡＭ）と呼ばれる。天然では、ＰＡＭは、標的核酸への部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）の結合を容易にするために必須である。ＩＩ型システム（ＮｍｅｎｉまたはＣＡＳＳ４とも呼ばれる）はさらに、ＩＩ－Ａ（ＣＡＳＳ４）型及びＩＩ－Ｂ（ＣＡＳＳ４ａ）型に細分される。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６－８２１（２０１２）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが、ＲＮＡプログラム可能ゲノム編集に有用であることを示しており、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１３／１７６７７２は、部位特異的遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムの多数の例及び用途を提供している。
【0055】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステム
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＩＩ型システムとはいくつかの重要な相違を有する。例えば、Ｃｐｆ１は、ＩＩ型システムとは対照的に、ｔｒａｃｒＲＮＡをもたない単一のＲＮＡガイドされるエンドヌクレアーゼである。実際に、Ｃｐｆ１関連ＣＲＩＳＰＲアレイは、追加のトランス活性化ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせずに、成熟ｃｒＲＮＡへとプロセシングされ得る。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲアレイは、４２～４４ヌクレオチド長の短い成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされ得、各成熟ｃｒＲＮＡは、１９ヌクレオチドのダイレクトリピートから始まり、２３～２５ヌクレオチドのスペーサー配列が続く。対照的に、ＩＩ型システムの成熟ｃｒＲＮＡは、２０～２４ヌクレオチドのスペーサー配列から始まり、約２２ヌクレオチドのダイレクトリピートが続き得る。また、Ｃｐｆ１はＴリッチプロトスペーサー隣接モチーフを利用し得て、Ｃｐｆ１－ｃｒＲＮＡ複合体が、短いＴリッチＰＡＭが先行する標的ＤＮＡを効率的に切断するようになっているが、これは、ＩＩ型システムでは標的ＤＮＡの後であるＧリッチＰＡＭとは対照的である。したがって、Ｖ型システムが、ＰＡＭから離れたポイントで切断する一方で、ＩＩ型システムは、ＰＡＭに隣接するポイントで切断する。加えて、ＩＩ型システムとは対照的に、Ｃｐｆ１は、スタッガード（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）ＤＮＡ二本鎖切断を介して、４または５ヌクレオチドの５’オーバーハングを伴ってＤＮＡを切断する。ＩＩ型システムは、ブラント二本鎖切断を介して切断する。ＩＩ型システムと同様に、Ｃｐｆ１は、予測されたＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含有するが、第２のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを欠いていて、これは、ＩＩ型システムとは対照的である。
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＩＩ型システムとはいくつかの重要な相違を有する。例えば、Ｃｐｆ１は、ＩＩ型システムとは対照的に、ｔｒａｃｒＲＮＡをもたない単一のＲＮＡガイドされるエンドヌクレアーゼである。実際に、Ｃｐｆ１関連ＣＲＩＳＰＲアレイは、追加のトランス活性化ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせずに、成熟ｃｒＲＮＡへとプロセシングされ得る。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲアレイは、４２～４４ヌクレオチド長の短い成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされ得、各成熟ｃｒＲＮＡは、１９ヌクレオチドのダイレクトリピートから始まり、２３～２５ヌクレオチドのスペーサー配列が続く。対照的に、ＩＩ型システムの成熟ｃｒＲＮＡは、２０～２４ヌクレオチドのスペーサー配列から始まり、約２２ヌクレオチドのダイレクトリピートが続き得る。また、Ｃｐｆ１はＴリッチプロトスペーサー隣接モチーフを利用し得て、Ｃｐｆ１－ｃｒＲＮＡ複合体が、短いＴリッチＰＡＭが先行する標的ＤＮＡを効率的に切断するようになっているが、これは、ＩＩ型システムでは標的ＤＮＡの後であるＧリッチＰＡＭとは対照的である。したがって、Ｖ型システムが、ＰＡＭから離れたポイントで切断する一方で、ＩＩ型システムは、ＰＡＭに隣接するポイントで切断する。加えて、ＩＩ型システムとは対照的に、Ｃｐｆ１は、スタッガード（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）ＤＮＡ二本鎖切断を介して、４または５ヌクレオチドの５’オーバーハングを伴ってＤＮＡを切断する。ＩＩ型システムは、ブラント二本鎖切断を介して切断する。ＩＩ型システムと同様に、Ｃｐｆ１は、予測されたＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含有するが、第２のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを欠いていて、これは、ＩＩ型システムとは対照的である。
【0056】
Ｃａｓ遺伝子／ポリペプチド及びプロトスペーサー隣接モチーフ
例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドは、Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４２：２５７７－２５９０（２０１４）で公開されているとおりのＣａｓ９ポリペプチドを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子命名システムは、Ｃａｓ遺伝子が発見されて以来広範に書き換えを受けてきた。Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．も、様々な種からのＣａｓ９ポリペプチドでのＰＡＭ配列を提供している（上記表１も参照されたい）。
例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドは、Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４２：２５７７－２５９０（２０１４）で公開されているとおりのＣａｓ９ポリペプチドを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子命名システムは、Ｃａｓ遺伝子が発見されて以来広範に書き換えを受けてきた。Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．も、様々な種からのＣａｓ９ポリペプチドでのＰＡＭ配列を提供している（上記表１も参照されたい）。
【0057】
ＩＩ．本開示の組成物及び方法
ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ遺伝子の制御エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の欠失または変異によって、ゲノムに恒久的変化をもたらすためにゲノム操作ツールを使用するための細胞ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ方法を本明細書において提供する。そのような方法は、エンドヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）ヌクレアーゼを使用して、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ遺伝子の制御エレメントをコードする他のＤＮＡ配列のゲノム遺伝子座内またはその近傍で恒久的に編集する。この方法で、本開示で記載する例は、（患者の寿命にわたって有望な治療を送達するのではなく）わずか１回の処置でＳＣＮ１０Ａ遺伝子の発現を減少させる、または除去するために役立ち得る。
ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ遺伝子の制御エレメントをコードする他のＤＮＡ配列の欠失または変異によって、ゲノムに恒久的変化をもたらすためにゲノム操作ツールを使用するための細胞ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ方法を本明細書において提供する。そのような方法は、エンドヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）ヌクレアーゼを使用して、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ遺伝子の制御エレメントをコードする他のＤＮＡ配列のゲノム遺伝子座内またはその近傍で恒久的に編集する。この方法で、本開示で記載する例は、（患者の寿命にわたって有望な治療を送達するのではなく）わずか１回の処置でＳＣＮ１０Ａ遺伝子の発現を減少させる、または除去するために役立ち得る。
【0058】
部位特異的ポリペプチド（エンドヌクレアーゼ、酵素）
部位特異的ポリペプチドは、ＤＮＡを切断するためにゲノム編集で使用されるヌクレアーゼである。部位特異的ポリペプチドを、１種もしくは複数のポリペプチド、またはそのポリペプチドをコードする１種もしくは複数のｍＲＮＡのいずれかとして細胞または患者に投与することができる。配列番号１～６２０に列挙されている、または本明細書で開示する酵素またはオルソログのいずれかを、本明細書に記載の方法で利用し得る。一分子ガイドＲＮＡは、部位特異的ポリペプチドと事前複合体化することができる。部位特異的ポリペプチドは、本明細書で開示するＤＮＡエンドヌクレアーゼのいずれかであり得る。
部位特異的ポリペプチドは、ＤＮＡを切断するためにゲノム編集で使用されるヌクレアーゼである。部位特異的ポリペプチドを、１種もしくは複数のポリペプチド、またはそのポリペプチドをコードする１種もしくは複数のｍＲＮＡのいずれかとして細胞または患者に投与することができる。配列番号１～６２０に列挙されている、または本明細書で開示する酵素またはオルソログのいずれかを、本明細書に記載の方法で利用し得る。一分子ガイドＲＮＡは、部位特異的ポリペプチドと事前複合体化することができる。部位特異的ポリペプチドは、本明細書で開示するＤＮＡエンドヌクレアーゼのいずれかであり得る。
【0059】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの文脈では、部位特異的ポリペプチドは、ガイドＲＮＡに結合し得て、これが次いで、標的ＤＮＡ内の部位を指定し、そこにポリペプチドが配向される。本明細書で開示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムでは、部位特異的ポリペプチドは、エンドヌクレアーゼ、例えば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼであり得る。
【0060】
部位特異的ポリペプチドは、複数の核酸切断（すなわち、ヌクレアーゼ）ドメインを含み得る。２つ以上の核酸切断ドメインをリンカーによって一緒に連結させることができる。例えば、リンカーは、柔軟なリンカーを含み得る。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０またはそれ以上のアミノ酸長を含み得る。
【0061】
天然に存在する野生型Ｃａｓ９酵素は、２つのヌクレアーゼドメイン、ＨＮＨヌクレアーゼドメイン及びＲｕｖＣドメインを含む。本明細書では、「Ｃａｓ９」という用語は、天然に存在するＣａｓ９及び組換えＣａｓ９の両方を指す。本明細書で企図されているＣａｓ９酵素は、ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン、及び／またはＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含み得る。
【0062】
ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、ＭｃｒＡ様フォールドを含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、２つの逆平行βストランド及びαへリックスを含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、金属結合部位（例えば、二価カチオン結合部位）を含む。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ドメインは、標的核酸の１つのストランド（例えば、ｃｒＲＮＡ標的ストランドの相補的ストランド）を切断することができる。
【0063】
ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ドメインは、ＲＮアーゼＨまたはＲＮアーゼＨ様フォールドを含む。ＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨドメインは、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方に対する作用を含む、多様なセットの核酸ベースの機能に関与する。ＲＮアーゼＨドメインは、多数のαへリックスに囲まれた５つのβストランドを含む。ＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨまたはＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨ様ドメインは、金属結合部位（例えば、二価カチオン結合部位）を含む。ＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨまたはＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨ様ドメインは、標的核酸の１つのストランド（例えば、二本鎖標的ＤＮＡの非相補的ストランド）を切断することができる。
【0064】
部位特異的ポリペプチドは、核酸、例えば、ゲノムＤＮＡに二本鎖切断または一本鎖切断を導入することができる。二本鎖切断は、細胞の内在性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同性依存的修復（ＨＤＲ）またはＮＨＥＪまたは代替の非相同性末端結合（Ａ－ＮＨＥＪ）またはマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ））を刺激することができる。ＮＨＥＪは、相同性テンプレートを必要とせずに、切断された標的核酸を修復し得る。これは時に、標的核酸に切断部位で小さな欠失または挿入（インデル）をもたらし得、かつ遺伝子発現の破壊または変化をもたらし得る。相同性修復テンプレート、またはドナーが利用可能である場合に、ＨＤＲは生じ得る。相同性ドナーテンプレートは、標的核酸切断部位に隣接する配列に対して相同である配列を含み得る。姉妹染色分体が、細胞によって修復テンプレートとして使用され得る。しかしながら、ゲノム編集の目的のために、修復テンプレートを、外因性核酸、例えばプラスミド、二重鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチドまたはウイルス核酸として供給することができる。外因性ドナーテンプレートを用いると、追加の、または変化した核酸配列も標的遺伝子座に組み込まれるように、追加の核酸配列（導入遺伝子など）または修飾（１つまたは多数の塩基変化または欠失など）を相同性の隣接領域の間に導入することができる。ＭＭＥＪは、ＮＨＥＪと同様である遺伝結果をもたらし得、その際、小さな欠失及び挿入が切断部位で生じ得る。好ましい末端結合ＤＮＡ修復結果を推進するために、ＭＭＥＪは、切断部位に隣接するいくつかの塩基対の相同配列を利用することができる。一部の例では、ヌクレアーゼ標的領域で起こり得るマイクロホモロジーの分析に基づき、見込まれる修復結果を予測することが可能であり得る。
【0065】
したがって、場合によっては、外因性ポリヌクレオチド配列を標的核酸切断部位に挿入するために、相同性組換えを使用することができる。外因性ポリヌクレオチド配列は、本明細書では「ドナーポリヌクレオチド」（またはドナーもしくはドナー配列）と呼ばれる。ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部を標的核酸切断部位に挿入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチド配列、すなわち、標的核酸切断部位で天然に生じない配列であり得る。
【0066】
ＮＨＥＪ及び／またはＨＤＲによる標的ＤＮＡの修飾は、例えば、変異、欠失、変化、組込み、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子タギング、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、転座及び／または遺伝子変異をもたらし得る。ゲノムＤＮＡを欠失する、及び非天然核酸をゲノムＤＮＡに組み込むプロセスは、ゲノム編集の例である。
【0067】
部位特異的ポリペプチドは、野生型の例示的部位特異的ポリペプチド［例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、ＵＳ２０１４／００６８７９７号、配列番号８またはＳａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３９（２１）：９２７５－９２８２（２０１１）］、及び様々な他の部位特異的ポリペプチドに対して少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、１０の連続アミノ酸にわたって野生型部位特異的ポリペプチド（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、前出）に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％同一性を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、１０の連続アミノ酸にわたって野生型部位特異的ポリペプチド（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、前出）に対して多くとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％同一性を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン内の１０の連続アミノ酸にわたって野生型部位特異的ポリペプチド（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、前出）に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％同一性を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメイン内の１０の連続アミノ酸にわたって野生型部位特異的ポリペプチド（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、前出）に対して多くとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％同一性を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内の１０の連続アミノ酸にわたって野生型部位特異的ポリペプチド（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、前出）に対して少なくとも：７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％同一性を含み得る。部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメイン内の１０の連続アミノ酸にわたって野生型部位特異的ポリペプチド（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、前出）に対して多くとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、または１００％同一性を含み得る。
【0068】
部位特異的ポリペプチドは、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチドの修飾形態を含み得る。野生型の例示的な部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、部位特異的ポリペプチドの核酸切断活性を低下させる変異を含み得る。野生型の例示的な部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、野生型の例示的な部位特異的ポリペプチド（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、前出）の核酸切断活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を有し得る。部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、実質的な核酸切断活性を有し得ない。部位特異的ポリペプチドが実質的な核酸切断活性を有さない修飾形態である場合、本発明では「酵素的に不活性な」と称される。
【0069】
部位特異的ポリペプチドの修飾形態は、（例えば、二本鎖標的核酸の糖－リン酸骨格の一方だけを切ることによって）標的核酸で一本鎖切断（ＳＳＢ）を誘導し得るような変異を含み得る。一部の態様では、変異は、野生型部位特異的ポリペプチド（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、前出）の複数の核酸切断ドメインのうちの１つまたは複数の核酸切断活性の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満をもたらし得る。一部の態様では、変異は、複数の核酸切断ドメインのうちの１つまたは複数で生じて、標的核酸の相補ストランドを切断する能力は維持しつつ、しかし、標的核酸の非相補ストランドを切断するその能力は低下させ得る。変異は、複数の核酸切断ドメインのうちの１種または複数で生じて、標的核酸の非相補ストランドを切断する能力は維持しつつ、しかし、標的核酸の相補ストランドを切断するその能力は低下させ得る。例えば、野生型の例示的Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチドの残基、例えばＡｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４及びＡｓｎ８５６を変異させて、複数の核酸切断ドメイン（例えば、ヌクレアーゼドメイン）のうちの１つまたは複数を不活化させる。変異させる残基は、（例えば、配列及び／または構造的アラインメントによって決定されるとおり）野生型の例示的なＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ポリペプチド内の残基Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４及びＡｓｎ８５６に対応し得る。変異の非限定的例には、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４ＡまたはＮ８５６Ａが含まれる。当業者は、アラニン置換以外の変異が適し得ることが分かるであろう。
【0070】
一部の態様では、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠いている部位特異的ポリペプチドを生成するために、Ｄ１０Ａ変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つまたは複数と組み合わせることができる。ＤＮＡ切断活性を実質的に欠いている部位特異的ポリペプチドを生成するために、Ｈ８４０Ａ変異を、Ｄ１０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つまたは複数と組み合わせることができる。ＤＮＡ切断活性を実質的に欠いている部位特異的ポリペプチドを生成するために、Ｎ８５４Ａ変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８５６Ａ変異のうちの１つまたは複数と組み合わせることができる。ＤＮＡ切断活性を実質的に欠いている部位特異的ポリペプチドを生成するために、Ｎ８５６Ａ変異をＨ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＤ１０Ａ変異のうちの１つまたは複数と組み合わせることができる。１つの実質的に不活性なヌクレアーゼドメインを含む部位特異的ポリペプチドは、「ニッカーゼ」と呼ばれる。
【0071】
ＲＮＡガイドされるエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９のニッカーゼバリアントを、ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム編集の特異性を上昇させるために使用することができる。野生型Ｃａｓ９は典型的には、標的配列（内在性ゲノム遺伝子座など）内の規定の約２０ヌクレオチド配列とハイブリダイズするように設計された単一ガイドＲＮＡによってガイドされる。しかしながら、いくつかのミスマッチが、ガイドＲＮＡと標的遺伝子座との間で許容され得、これは、標的部位内の必要な相同性の長さを例えば１３ｎｔの相同性の小ささまで効果的に低減し、それによって、オフターゲット切断としても知られている、標的ゲノム内の他の場所でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体による結合及び二本鎖核酸切断の可能性を上昇させる。Ｃａｓ９のニッカーゼバリアントはそれぞれ１本のストランドしか切断しないので、二本鎖切断をもたらすためには、一対のニッカーゼが近接して、かつ標的核酸の逆ストランド上で結合し、それによって、二本鎖切断の同等物である一対のニックを作製することが必要である。これは、２つの別々のガイドＲＮＡ（各ニッカーゼに１つ）が近接して、かつ標的核酸の逆ストランド上で結合する必要がある。この要求は本質的に、二本鎖切断を起こすために必要な相同性の最小長さを二倍にし、それによって、ゲノム内の他の箇所で二本鎖切断事象が起こる可能性を低下させるが、その際、２つのガイドＲＮＡ部位（それらが存在する場合に）が、二本鎖切断の形成を可能にするように相互に十分に近接する可能性は低い。当技術分野で記載されているとおり、ニッカーゼはまた、ＮＨＥＪに対してＨＤＲを促進するために使用することができる。ＨＤＲは、所望の変化を効果的に媒介する特異的なドナー配列の使用によってゲノム内の標的部位に選択された変化を導入するために使用することができる。
【0072】
企図される変異には、置換、付加、及び欠失、またはその任意の組み合わせが含まれ得る。変異は、変異アミノ酸をアラニンに変換する。変異は、変異アミノ酸を別のアミノ酸（例えば、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、またはアルギニン）に変換する。変異は、変異アミノ酸を非天然アミノ酸（例えば、セレノメチオニン）に変換する。変異は、変異アミノ酸をアミノ酸模倣体（例えば、ホスホ模倣体）に変換する。変異は、保存的変異であり得る。例えば、変異は、変異アミノ酸をサイズ、形状、電荷、極性、配置が類似するアミノ酸、及び／または変異アミノ酸の回転異性体に変換する（例えば、システイン／セリン変異、リシン／アスパラギン変異、ヒスチジン／フェニルアラニン変異）。変異は、リーディングフレームのシフト及び／または未成熟終止コドンの作成をもたらし得る。変異は、１つまたは複数の遺伝子の発現に影響を及ぼす遺伝子または遺伝子座の制御領域を変化させ得る。
【0073】
部位特異的ポリペプチド（例えば、バリアント、変異、酵素的に不活性な、及び／または条件的に酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチド）は、核酸をターゲティングし得る。部位特異的ポリペプチド（例えば、バリアント、変異、酵素的に不活性な、及び／または条件的に酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ）は、ＤＮＡをターゲティングし得る。部位特異的ポリペプチド（例えば、バリアント、変異、酵素的に不活性な、及び／または条件的に酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ）は、ＲＮＡをターゲティングし得る。
【0074】
部位特異的ポリペプチドは、１つまたは複数の非天然配列を含み得る（例えば、部位特異的ポリペプチドは融合タンパク質である）。
【0075】
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、核酸結合ドメイン、及び２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を含み得る。
【0076】
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％アミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、及び２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を含み得る。
【0077】
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、及び２つの核酸切断ドメインを含み得、その際、核酸切断ドメインの一方または両方は、細菌（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９からのヌクレアーゼドメインに対して少なくとも５０％アミノ酸同一性を含む。
【0078】
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）、及び非天然配列（例えば、核移行シグナル）または非天然配列に部位特異的ポリペプチドを連結するリンカーを含み得る。
【0079】
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を含み得、その際、部位特異的ポリペプチドは、核酸切断ドメインの一方または両方において、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％低下させる変異を含む。
【0080】
部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９に対して少なくとも１５％のアミノ酸同一性を含むアミノ酸配列、及び２つの核酸切断ドメイン（すなわち、ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を含み得、その際、ヌクレアーゼドメインの一方は、アスパラギン酸１０の変異を含み、及び／またはヌクレアーゼドメインの一方は、ヒスチジン８４０の変異を含み得、及び変異は、ヌクレアーゼドメイン（複数可）の切断活性を少なくとも５０％低下させる。
【0081】
１種または複数の部位特異的ポリペプチド、例えばＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ゲノム内の特異的な遺伝子座で１つの二本鎖切断を一緒になって行う２つのニッカーゼ、またはゲノム内の特異的な遺伝子座で２つの二本鎖切断を一緒になって行うか、それをもたらす４つのニッカーゼを含み得る。別法では、１つの部位特異的ポリペプチド、例えばＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ゲノム内の特異的な遺伝子座で１つの二本鎖切断を行い得るか、それをもたらし得る。
【0082】
他の菌株に由来するＣａｓ９オルソログの非限定的例には、これに限定されないが、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ ＭＢＩＣ１１０１７；Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ ＤＳＭ ５５０１；Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ；Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ ＡＴＣＣ ２３２７０；Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ＬＡＡ１；Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ＤＳＭ ４４６；Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ ＤＳＭ １８０；Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ ＫＣ４；Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ２９４１３；Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ ＣＳ－３２８；Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ ｓｔｒ．Ｐａｒａｃａ；Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．ＰＣＣ ８００５；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ ＤＳＭ １２４４２；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ ＭＬＳ１０；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ １＿１＿４７；Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ ＤＳＭ ６７２５；Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ ａｕｄａｘｖｉａｔｏｒ ＭＰ１０４Ｃ；Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ＿１０８；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｈａｇｅ ｃ－ｓｔ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ａ３ ｓｔｒ．Ｌｏｃｈ Ｍａｒｅｅ；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ Ｂａ４ ｓｔｒ．６５７；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＱＣＤ－６３ｑ４２；Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ ＷＨ ８５０１；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＡＴＣＣ ５１１４２；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＣＣＹ０１１０；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＰＣＣ ７４２４；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．ＰＣＣ ７８２２；Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ ２５５－１５；Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ ＡＴＣＣ ２９３２８；Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ ＤＳＭ ４４９６３；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ＰＢ２００３／０４４－Ｔ３－４；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ ＡＴＣＣ １１７４１；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ；Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．ＰＣＣ ８１０６；Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＥＬＢ１７；Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ Ｚ－７３０３；Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ｐｈａｇｅ Ｍａ－ＬＭＭ０１；Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＮＩＥＳ－８４３；Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ ＡＴＣＣ ２３１３４；Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ ＰＣＣ ７４２０；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ；Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ Ｎｃ４；Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ ＤＳＭ ４３１１１；Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ ＣＣＹ９４１４；Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．ＰＣＣ ７１２０；Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．ＰＣＣ ６５０６；Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ＿ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ＿ＳＩ；Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ ＳＪ９５；Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ ＣＪ２；Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＪＳ６６６；Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ ＴＡＣ１２５；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ ＡＴＣＣ ２５４８６；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ ＡＴＣＣ ２５４８６；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭ ４０７３６；Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ ＤＳＭ ４３０２１；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ ７３３５；及びＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ ＴＣＦ５２Ｂで同定されたＣａｓタンパク質が含まれる（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．，２０１３；１０（５）：７２６－７３７）。
【0083】
Ｃａｓ９オルソログに加えて、他のＣａｓ９バリアント、例えば、不活性なｄＣａｓ９及び異なる機能を有するエフェクタードメインの融合タンパク質は、遺伝的修飾のためのプラットフォームとして役立ち得る。上述の酵素のいずれも、本開示において有用であり得る。
【0084】
本開示で利用してもよいエンドヌクレアーゼのさらなる例を配列番号１～６２０に示す。これらのタンパク質は、使用前に修飾されてもよいか、または核酸配列、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはｍＲＮＡにおいて、またはベクター構築物、例えば、本明細書において教示するプラスミドまたはＡＡＶベクター内でコードされてもよい。さらに、それらは、コドン最適化されていてもよい。
【0085】
配列番号１～６２０は、エンドヌクレアーゼ配列の非排他的リストを開示している。
【0086】
ゲノムターゲティング核酸
本開示は、関連ポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチド）の活性を標的核酸内の特異的標的配列へと指示し得るゲノムターゲティング核酸を提供する。ゲノムターゲティング核酸はＲＮＡであり得る。ゲノムターゲティングＲＮＡは、本明細書では「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と称される。ガイドＲＮＡは、目的の標的核酸配列、及びＣＲＩＳＰＲリピート配列とハイブリダイズする少なくとも１つのスペーサー配列を含み得る。ＩＩ型システムでは、ｇＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡを含む。ＩＩ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ＣＲＩＳＰＲリピート配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、相互にハイブリダイズして二重鎖を形成する。Ｖ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ｃｒＲＮＡは二重鎖を形成する。両方のシステムで、ガイドＲＮＡ及び部位特異的ポリペプチドが複合体を形成するように、二重鎖は部位特異的ポリペプチドに結合し得る。ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドとのその会合により、標的特異性を複合体に与え得る。したがって、ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を指示し得る。
本開示は、関連ポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチド）の活性を標的核酸内の特異的標的配列へと指示し得るゲノムターゲティング核酸を提供する。ゲノムターゲティング核酸はＲＮＡであり得る。ゲノムターゲティングＲＮＡは、本明細書では「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」と称される。ガイドＲＮＡは、目的の標的核酸配列、及びＣＲＩＳＰＲリピート配列とハイブリダイズする少なくとも１つのスペーサー配列を含み得る。ＩＩ型システムでは、ｇＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡを含む。ＩＩ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ＣＲＩＳＰＲリピート配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、相互にハイブリダイズして二重鎖を形成する。Ｖ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ｃｒＲＮＡは二重鎖を形成する。両方のシステムで、ガイドＲＮＡ及び部位特異的ポリペプチドが複合体を形成するように、二重鎖は部位特異的ポリペプチドに結合し得る。ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドとのその会合により、標的特異性を複合体に与え得る。したがって、ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を指示し得る。
【0087】
例示的なガイドＲＮＡには、配列表の配列番号５３０５～７６０１２におけるスペーサー配列が含まれる。通常の技能の当業者には理解されるとおり、各ガイドＲＮＡを、そのゲノム標的配列に相補的なスペーサー配列を含むように設計することができる。例えば、配列表の配列番号５３０５～７６０１２におけるスペーサー配列のそれぞれを、単一のＲＮＡキメラまたはｃｒＲＮＡ（対応するｔｒａｃｒＲＮＡと共に）に入れることができる。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ,３３７,８１６－８２１（２０１２）及びＤｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．,Ｎａｔｕｒｅ,４７１,６０２－６０７（２０１１）を参照されたい。
【0088】
ゲノムターゲティング核酸は、二重分子ガイドＲＮＡであり得る。ゲノムターゲティング核酸は、一分子ガイドＲＮＡであり得る。
【0089】
二重分子ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの二本のストランドを含み得る。第１のストランドは、５’から３’方向で、任意選択のスペーサーエクステンション配列、スペーサー配列及びミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列を含む。第２のストランドは、最少ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列に相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列を含み得る。
【0090】
ＩＩ型システムにおける一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’方向で、任意選択のスペーサーエクステンション配列、スペーサー配列、ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列、一分子ガイドリンカー、ミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列を含み得る。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡエクステンションは、追加の機能性（例えば、安定性）をガイドＲＮＡに与えるエレメントを含み得る。一分子ガイドリンカーは、ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート及びミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列を連結して、ヘアピン構造を形成し得る。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡエクステンションは、１つまたは複数のヘアピンを含み得る。
【0091】
ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチド未満のスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０ヌクレオチド超のスペーサー配列を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に、１７～３０ヌクレオチドを含む様々な長さのスペーサー配列を含み得る（表１を参照されたい）。
【0092】
ｓｇＲＮＡは、表１の配列番号７６０４５においてのように、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端にウラシルを含まなくてよい。ｓｇＲＮＡは、表１の配列番号７６０４６においてのように、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１つまたは複数のウラシルを含んでよい。例えば、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１つのウラシル（Ｕ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に２つのウラシル（ＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に３つのウラシル（ＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に４つのウラシル（ＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に５つのウラシル（ＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に６つのウラシル（ＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に７つのウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に８つのウラシル（ＵＵＵＵＵＵＵＵ）を含み得る。
【0093】
ｓｇＲＮＡは、修飾されていなくてよいか、または修飾されていてよい。例えば、修飾ｓｇＲＮＡは、１つまたは複数の２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートヌクレオチドを含み得る。
【表1】
【0094】
Ｖ型システムにおける一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’方向で、ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列及びスペーサー配列を含み得る。
【0095】
実例としては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムにおいて使用されるガイドＲＮＡ、または他のより小さなＲＮＡは、下記で例示するとおり、かつ当技術分野で記載されているとおり、化学的手段によって容易に合成することができる。化学合成手順は絶えず拡大しているが、ポリヌクレオチド長さが約１００ヌクレオチドを超えてかなり増大するにつれて、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、これによりＰＡＧＥなどのゲルの使用が回避される）などの手順によるそのようなＲＮＡの精製は、より困難になる傾向がある。比較的大きな長さのＲＮＡを生成するために使用されるアプローチの１つは、２つ以上の分子を生成して、それらを一緒にライゲートさせることである。かなり長いＲＮＡ、例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするものは、酵素によってより容易に生成される。当技術分野で記載されているとおり、ＲＮＡの化学合成及び／または酵素的生成の間に、またはその後に、様々な種類のＲＮＡ修飾、例えば、安定性を上昇させる、自然免疫応答の可能性または程度を低下させる、及び／または他の特性を増強する修飾を導入することができる。
【0096】
スペーサーエクステンション配列
ゲノムターゲティング核酸の一部の例では、スペーサーエクステンション配列は、活性を修飾し得る、安定性をもたらし得る、及び／またはゲノムターゲティング核酸を修飾するための位置をもたらし得る。スペーサーエクステンション配列は、オンターゲットまたはオフターゲット活性または特異性を修飾し得る。一部の例では、スペーサーエクステンション配列を付与することができる。スペーサーエクステンション配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、もしくは７０００超またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有し得る。スペーサーエクステンション配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００未満またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有し得る。スペーサーエクステンション配列は、１０未満のヌクレオチド長さであり得る。スペーサーエクステンション配列は、１０から３０の間のヌクレオチド長さであり得る。スペーサーエクステンション配列は、３０から７０の間のヌクレオチド長さであり得る。
ゲノムターゲティング核酸の一部の例では、スペーサーエクステンション配列は、活性を修飾し得る、安定性をもたらし得る、及び／またはゲノムターゲティング核酸を修飾するための位置をもたらし得る。スペーサーエクステンション配列は、オンターゲットまたはオフターゲット活性または特異性を修飾し得る。一部の例では、スペーサーエクステンション配列を付与することができる。スペーサーエクステンション配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、もしくは７０００超またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有し得る。スペーサーエクステンション配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００未満またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有し得る。スペーサーエクステンション配列は、１０未満のヌクレオチド長さであり得る。スペーサーエクステンション配列は、１０から３０の間のヌクレオチド長さであり得る。スペーサーエクステンション配列は、３０から７０の間のヌクレオチド長さであり得る。
【0097】
スペーサーエクステンション配列は、別の部分（例えば、安定性制御配列、エンドリボヌクレアーゼ結合配列、リボザイム）を含み得る。その部分は、核酸ターゲティング核酸の安定性を低下または上昇させ得る。その部分は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）であり得る。その部分は、真核細胞において機能し得る。その部分は、原核細胞において機能し得る。その部分は、真核及び原核細胞の両方で機能し得る。適切な部分の非限定的例には：５’キャップ（例えば、７－メチルグアニレートキャップ（ｍ７Ｇ））、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及びタンパク質複合体による制御された安定性及び／または制御されたアクセシビリティを可能にするために）、ｄｓＲＮＡ二本鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）へと配向する配列、追跡を可能にする修飾または配列（例えば、蛍光分子との直接的なコンジュゲーション、蛍光検出を促進する部分とのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）、及び／またはタンパク質のための結合部位を提供する修飾または配列（例えば、転写活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）が含まれる。
【0098】
スペーサー配列
スペーサー配列は、目的の標的核酸内の配列とハイブリダイズする。ゲノムターゲティング核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して、配列特異的に標的核酸と相互作用し得る。スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の配列に依存して変化し得る。
スペーサー配列は、目的の標的核酸内の配列とハイブリダイズする。ゲノムターゲティング核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して、配列特異的に標的核酸と相互作用し得る。スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の配列に依存して変化し得る。
【0099】
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、スペーサー配列を、システムで使用されるＣａｓ９酵素のＰＡＭの５’側に位置する標的核酸とハイブリダイズするように設計することができる。スペーサーは、標的配列に完全にマッチしてもよいか、またはミスマッチを有してもよい。各Ｃａｓ９酵素は、標的ＤＮＡにおいて認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓは、標的核酸において、配列５’－ＮＲＧ－３’を含むＰＡＭを認識し、その際、Ｒは、ＡまたはＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列がターゲティングする標的核酸配列のすぐ３’側である。
【0100】
標的核酸配列は、２０のヌクレオチドを含み得る。標的核酸は、２０未満のヌクレオチドを含み得る。標的核酸は、２０超のヌクレオチドを含み得る。標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０またはそれ以上のヌクレオチドを含み得る。標的核酸は、多くとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０またはそれ以上のヌクレオチドを含み得る。標的核酸配列は、ＰＡＭの第１のヌクレオチドのすぐ５’側に２０の塩基を含み得る。例えば、５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＲＧ－３’（配列番号７６０４３）を含む配列では、標的核酸は、任意のヌクレオチドであるＮに対応する配列を含み得、下線を付されたＮＲＧ配列が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＰＡＭである。この標的核酸配列は多くの場合に、ＰＡＭストランドと称され、相補核酸配列は多くの場合に、非ＰＡＭストランドと称される。当業者は、スペーサー配列が標的核酸の非ＰＡＭストランドとハイブリダイズすることが分かるであろう（図１のＡ及びＢ）。
【0101】
標的核酸とハイブリダイズするスペーサー配列は、少なくとも約６ヌクレオチド（ｎｔ）の長さを有し得る。スペーサー配列は、少なくとも約６ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔまたは少なくとも約４０ｎｔ、約６ｎｔ～約８０ｎｔ、約６ｎｔ～約５０ｎｔ、約６ｎｔ～約４５ｎｔ、約６ｎｔ～約４０ｎｔ、約６ｎｔ～約３５ｎｔ、約６ｎｔ～約３０ｎｔ、約６ｎｔ～約２５ｎｔ、約６ｎｔ～約２０ｎｔ、約６ｎｔ～約１９ｎｔ、約１０ｎｔ～約５０ｎｔ、約１０ｎｔ～約４５ｎｔ、約１０ｎｔ～約４０ｎｔ、約１０ｎｔ～約３５ｎｔ、約１０ｎｔ～約３０ｎｔ、約１０ｎｔ～約２５ｎｔ、約１０ｎｔ～約２０ｎｔ、約１０ｎｔ～約１９ｎｔ、約１９ｎｔ～約２５ｎｔ、約１９ｎｔ～約３０ｎｔ、約１９ｎｔ～約３５ｎｔ、約１９ｎｔ～約４０ｎｔ、約１９ｎｔ～約４５ｎｔ、約１９ｎｔ～約５０ｎｔ、約１９ｎｔ～約６０ｎｔ、約２０ｎｔ～約２５ｎｔ、約２０ｎｔ～約３０ｎｔ、約２０ｎｔ～約３５ｎｔ、約２０ｎｔ～約４０ｎｔ、約２０ｎｔ～約４５ｎｔ、約２０ｎｔ～約５０ｎｔ、または約２０ｎｔ～約６０ｎｔであり得る。一部の例では、スペーサー配列は、２０ヌクレオチドを含み得る。一部の例では、スペーサーは、１９ヌクレオチドを含み得る。一部の例では、スペーサーは１８ヌクレオチドを含み得る。一部の例では、スペーサーは、２２ヌクレオチドを含み得る。
【0102】
一部の例では、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％である。一部の例では、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、多くとも約３０％、多くとも約４０％、多くとも約５０％、多くとも約６０％、多くとも約６５％、多くとも約７０％、多くとも約７５％、多くとも約８０％、多くとも約８５％、多くとも約９０％、多くとも約９５％、多くとも約９７％、多くとも約９８％、多くとも約９９％、または１００％である。一部の例では、スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、標的核酸の相補性ストランドの標的配列の６つの連続する最も５’側のヌクレオチドにわたって１００％である。スペーサー配列と標的核酸との間の相補性パーセントは、約２０の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であり得る。スペーサー配列及び標的核酸の長さは、１～６ヌクレオチド異なってよく、これは、１つのバルジまたは複数のバルジと考えてよい。
【0103】
スペーサー配列を、コンピュータープログラムを使用して設計または選択することができる。コンピュータープログラムは、変数、例えば、予測融解温度、二次構造形成、予測アニーリング温度、配列同一性、ゲノムコンテキスト、クロマチンアクセシビリティ、％ＧＣ、（例えば、同一であるか、または相似しているが、ミスマッチ、挿入もしくは欠失の結果として１つまたは複数のスポットにおいて異なる配列の）ゲノム出現の頻度、メチル化状態、ＳＮＰの存在などを使用することができる。
【0104】
ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列
一部の態様では、ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列は、基準ＣＲＩＳＰＲリピート配列（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のｃｒＲＮＡ）に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％配列同一性を有する配列である。
一部の態様では、ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列は、基準ＣＲＩＳＰＲリピート配列（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のｃｒＲＮＡ）に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％配列同一性を有する配列である。
【0105】
一部の態様では、ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列は、細胞内でミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列とハイブリダイズし得るヌクレオチドを含む。ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列及びミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、二重鎖、すなわち塩基対合二本鎖構造を形成し得る。ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列及びミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列は一緒に、部位特異的ポリペプチドに結合し得る。ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は、ミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列とハイブリダイズし得る。ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は、ミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％相補性を含み得る。一部の態様では、ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は、ミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して多くとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％相補性を含む。
【0106】
ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列は、約７ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドまでの長さを有し得る。例えば、ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列の長さは、約７ヌクレオチド（ｎｔ）～約５０ｎｔ、約７ｎｔ～約４０ｎｔ、約７ｎｔ～約３０ｎｔ、約７ｎｔ～約２５ｎｔ、約７ｎｔ～約２０ｎｔ、約７ｎｔ～約１５ｎｔ、約８ｎｔ～約４０ｎｔ、約８ｎｔ～約３０ｎｔ、約８ｎｔ～約２５ｎｔ、約８ｎｔ～約２０ｎｔ、約８ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ～約２５ｎｔである。一部の態様では、ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列は、約９ヌクレオチド長さである。一部の態様では、ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列は、約１２ヌクレオチド長さである。
【0107】
ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列は、少なくとも６、７、または８つの連続ヌクレオチドの区間にわたって基準ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｃｒＲＮＡ）に対して少なくとも約６０％同一であり得る。例えば、ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列は、少なくとも６、７、または８つの連続ヌクレオチドの区間にわたって基準ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列に対して少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一または１００％同一であり得る。
【0108】
ミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列
ミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、基準ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％配列同一性を有する配列であり得る。
ミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、基準ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％配列同一性を有する配列であり得る。
【0109】
ミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、細胞内でミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列とハイブリダイズするヌクレオチドを含み得る。ミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列及びミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列は、二重鎖、すなわち塩基対合二本鎖構造を形成する。ミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列及びミニマムＣＲＩＳＰＲリピートは一緒に、部位特異的ポリペプチドに結合し得る。ミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも一部は、ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列とハイブリダイズし得る。ミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート配列に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％相補性であり得る。
【0110】
ミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドまでの長さを有し得る。例えば、ミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド（ｎｔ）～約５０ｎｔ、約７ｎｔ～約４０ｎｔ、約７ｎｔ～約３０ｎｔ、約７ｎｔ～約２５ｎｔ、約７ｎｔ～約２０ｎｔ、約７ｎｔ～約１５ｎｔ、約８ｎｔ～約４０ｎｔ、約８ｎｔ～約３０ｎｔ、約８ｎｔ～約２５ｎｔ、約８ｎｔ～約２０ｎｔ、約８ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ～約２５ｎｔ長さであり得る。ミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約９ヌクレオチド長さであり得る。ミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約１２ヌクレオチドであり得る。ミニマムｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（前出）に記載のｔｒａｃｒＲＮＡ ｎｔ２３～４８からなり得る。
【0111】
ミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８つの連続ヌクレオチドの区間にわたって基準ミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列に対して少なくとも約６０％同一であり得る。例えば、ミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８つの連続ヌクレオチドの区間にわたって基準ミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対して少なくとも約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一または１００％同一であり得る。
【0112】
ミニマムＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びミニマムｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は、二重へリックスを含み得る。ミニマムＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びミニマムｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０またはそれ以上のヌクレオチドを含み得る。ミニマムＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びミニマムｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は、多くとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０またはそれ以上のヌクレオチドを含み得る。
【0113】
二重鎖は、ミスマッチを含み得る（すなわち、二重鎖の２つのストランドは１００％相補的ではない）。二重鎖は、少なくとも約１、２、３、４、もしくは５またはミスマッチを含み得る。二重鎖は、多くとも約１、２、３、４、もしくは５またはミスマッチを含み得る。二重鎖は、２つ以下のミスマッチを含み得る。
【0114】
バルジ
場合によっては、ミニマムＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びミニマムｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖に、「バルジ」が存在し得る。バルジは、二重鎖内のヌクレオチドの非対合領域である。バルジは、部位特異的ポリペプチドへの二重鎖の結合に寄与し得る。バルジは、二重鎖の片側に、非対合５’－ＸＸＸＹ－３’（ここで、Ｘは、任意のプリンであり、Ｙは、逆ストランド上のヌクレオチドとゆらぎ対を形成し得るヌクレオチドを含む）、及び二重鎖の他の側に、非対合ヌクレオチド領域を含み得る。二重鎖の２つの側にある非対合ヌクレオチドの数は、異なり得る。
場合によっては、ミニマムＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びミニマムｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖に、「バルジ」が存在し得る。バルジは、二重鎖内のヌクレオチドの非対合領域である。バルジは、部位特異的ポリペプチドへの二重鎖の結合に寄与し得る。バルジは、二重鎖の片側に、非対合５’－ＸＸＸＹ－３’（ここで、Ｘは、任意のプリンであり、Ｙは、逆ストランド上のヌクレオチドとゆらぎ対を形成し得るヌクレオチドを含む）、及び二重鎖の他の側に、非対合ヌクレオチド領域を含み得る。二重鎖の２つの側にある非対合ヌクレオチドの数は、異なり得る。
【0115】
一例では、バルジは、バルジのミニマムＣＲＩＳＰＲリピートストランド上に非対合プリン（例えば、アデニン）を含み得る。一部の例では、バルジは、バルジのミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列ストランドの非対合５’－ＡＡＧＹ－３’を含み得、ここで、Ｙは、ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート鎖上のヌクレオチドとゆらぎ対合を形成し得るヌクレオチドを含む。
【0116】
二重鎖のミニマムＣＲＩＳＰＲリピート側にあるバルジは、少なくとも１、２、３、４、もしくは５またはそれ以上の非対合ヌクレオチドを含み得る。二重鎖のミニマムＣＲＩＳＰＲリピート側にあるバルジは、多くとも１、２、３、４、もしくは５またはそれ以上の非対合ヌクレオチドを含み得る。二重鎖のミニマムＣＲＩＳＰＲリピート側にあるバルジは、１つの非対合ヌクレオチドを含み得る。
【0117】
二重鎖のミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列側にあるバルジは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０またはそれ以上の非対合ヌクレオチドを含み得る。二重鎖のミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列側にあるバルジは、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０またはそれ以上の非対合ヌクレオチドを含み得る。二重鎖の第２の側にあるバルジ（例えば、二重鎖のミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列側）は、４つの非対合ヌクレオチドを含み得る。
【0118】
バルジは、少なくとも１つのゆらぎ対合を含み得る。一部の例では、バルジは、多くとも１つのゆらぎ対合を含み得る。バルジは、少なくとも１つのプリンヌクレオチドを含み得る。バルジは、少なくとも３つのプリンヌクレオチドを含み得る。バルジ配列は、少なくとも５つのプリンヌクレオチドを含み得る。バルジ配列は、少なくとも１つのグアニンヌクレオチドを含み得る。一部の例では、バルジ配列は、少なくとも１つのアデニンヌクレオチドを含み得る。
【0119】
ヘアピン
様々な例で、１つまたは複数のヘアピンが、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内のミニマムｔｒａｃｒＲＮＡの３’側に位置し得る。
様々な例で、１つまたは複数のヘアピンが、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内のミニマムｔｒａｃｒＲＮＡの３’側に位置し得る。
【0120】
ヘアピンは、ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート及びミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列二重鎖内の最後の対合ヌクレオチドから３’側の少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、もしくは２０またはそれ以上のヌクレオチドで始まり得る。ヘアピンは、ミニマムＣＲＩＳＰＲリピート及びミニマムｔｒａｃｒＲＮＡ配列二重鎖内の最後の対合ヌクレオチドから３’側の多くとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０またはそれ以上のヌクレオチドで始まり得る。
【0121】
ヘアピンは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、もしくは２０またはそれ以上の連続ヌクレオチドを含み得る。ヘアピンは、多くとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、もしくはそれ以上の連続ヌクレオチドを含み得る。
【0122】
ヘアピンは、ＣＣジヌクレオチド（すなわち、２つの連続シトシンヌクレオチド）を含み得る。
【0123】
ヘアピンは、二重鎖ヌクレオチド（例えば、一緒にハイブリダイズしているヘアピン内のヌクレオチド）を含み得る。例えば、ヘアピンは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のヘアピン二重鎖内のＧＧジヌクレオチドとハイブリダイズしているＣＣジヌクレオチドを含み得る。
【0124】
ヘアピンの１つまたは複数は、部位特異的ポリペプチドのガイドＲＮＡ－相互作用領域と相互作用し得る。
【0125】
一部の例では、２つ以上のヘアピンが存在し、他の例では、３つ以上のヘアピンが存在する。
【0126】
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、基準ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のｔｒａｃｒＲＮＡ）に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％配列同一性を有する配列を含み得る。
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、基準ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のｔｒａｃｒＲＮＡ）に対して少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％配列同一性を有する配列を含み得る。
【0127】
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド（ｎｔ）～約５０ｎｔ、約６ｎｔ～約４０ｎｔ、約６ｎｔ～約３０ｎｔ、約６ｎｔ～約２５ｎｔ、約６ｎｔ～約２０ｎｔ、約６ｎｔ～約１５ｎｔ、約８ｎｔ～約４０ｎｔ、約８ｎｔ～約３０ｎｔ、約８ｎｔ～約２５ｎｔ、約８ｎｔ～約２０ｎｔ、約８ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ～約２５ｎｔの長さを有し得る。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約１４ヌクレオチドの長さを有し得る。
【0128】
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８つの連続ヌクレオチドの区間にわたって基準３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に対して少なくとも約６０％同一であり得る。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、または８の連続ヌクレオチドの区間にわたって基準３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えばＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）に対して少なくとも約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、または１００％同一であり得る。
【0129】
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、１つより多い二重鎖領域（例えば、ヘアピン、ハイブリダイズした領域）を含み得る。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つの二重鎖領域を含み得る。
【0130】
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ステムループ構造を含み得る。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ内のステムループ構造は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５もしくは２０またはそれ以上のヌクレオチドを含み得る。３’ｔｒａｃｒＲＮＡ内のステムループ構造は、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０またはそれ以上のヌクレオチドを含み得る。ステムループ構造は、機能性部分を含み得る。例えば、ステムループ構造は、アプタマー、リボザイム、タンパク質－相互作用ヘアピン、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、またはエキソンを含み得る。ステムループ構造は、少なくとも約１、２、３、４、もしくは５またはそれ以上の機能性部分を含み得る。ステムループ構造は、多くとも約１、２、３、４、もしくは５またはそれ以上の機能性部分を含み得る。
【0131】
３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列内のヘアピンは、Ｐ－ドメインを含み得る。一部の例では、Ｐ－ドメインは、ヘアピン内の二本鎖領域を含み得る。
【0132】
ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列
ｔｒａｃｒＲＮＡが一分子ガイドまたは二重分子ガイドの状況にあるかに関わらず、ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列を付与してよい。ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列は、約１ヌクレオチド～約４００ヌクレオチドの長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、または４００ヌクレオチド超の長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列は、約２０～約５０００またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列は、１０００ヌクレオチド超の長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００未満またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列は、１０００ヌクレオチド未満の長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列は、１０ヌクレオチド未満の長さを含み得る。ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列は、１０～３０ヌクレオチドの長さであり得る。ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列は、３０～７０ヌクレオチドの長さであり得る。
ｔｒａｃｒＲＮＡが一分子ガイドまたは二重分子ガイドの状況にあるかに関わらず、ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列を付与してよい。ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列は、約１ヌクレオチド～約４００ヌクレオチドの長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、または４００ヌクレオチド超の長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列は、約２０～約５０００またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列は、１０００ヌクレオチド超の長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００未満またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列は、１０００ヌクレオチド未満の長さを有し得る。ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列は、１０ヌクレオチド未満の長さを含み得る。ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列は、１０～３０ヌクレオチドの長さであり得る。ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列は、３０～７０ヌクレオチドの長さであり得る。
【0133】
ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列は、機能性部分（例えば、安定性制御配列、リボザイム、エンドリボヌクレアーゼ結合配列）を含み得る。機能性部分は、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終結配列）を含み得る。機能性部分は、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）～約１００ヌクレオチド、約１０ｎｔ～約２０ｎｔ、約２０ｎｔ～約３０ｎｔ、約３０ｎｔ～約４０ｎｔ、約４０ｎｔ～約５０ｎｔ、約５０ｎｔ～約６０ｎｔ、約６０ｎｔ～約７０ｎｔ、約７０ｎｔ～約８０ｎｔ、約８０ｎｔ～約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ～約１００ｎｔ、約１５ｎｔ～約８０ｎｔ、約１５ｎｔ～約５０ｎｔ、約１５ｎｔ～約４０ｎｔ、約１５ｎｔ～約３０ｎｔ、または約１５ｎｔ～約２５ｎｔの全長を有し得る。機能性部分は、真核細胞において機能し得る。機能性部分は、原核細胞において機能し得る。機能性部分は、真核及び原核細胞の両方で機能し得る。
【0134】
適切なｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション機能性部分の非限定的例には、３’ポリ－アデニル化テイル、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及びタンパク質複合体による制御された安定性及び／または制御されたアクセシビリティを可能にするために）、ｄｓＲＮＡ二本鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）へと配向する配列、追跡を可能にする修飾または配列（例えば、蛍光分子との直接的なコンジュゲーション、蛍光検出を促進する部分とのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）、及び／またはタンパク質のための結合部位を提供する修飾または配列（例えば、転写活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）が含まれる。ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列は、プライマー結合部位または分子インデックス（例えば、バーコード配列）を含み得る。ｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション配列は、１つまたは複数の親和性タグを含み得る。
【0135】
一分子ガイドリンカー配列
一分子ガイド核酸のリンカー配列は、約３ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（前出）では、例えば、単純な４ヌクレオチド「テトラループ」（－ＧＡＡＡ－）が使用された（Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７（６０９６）：８１６－８２１（２０１２））。リンカーの実例は、約３ヌクレオチド（ｎｔ）～約９０ｎｔ、約３ｎｔ～約８０ｎｔ、約３ｎｔ～約７０ｎｔ、約３ｎｔ～約６０ｎｔ、約３ｎｔ～約５０ｎｔ、約３ｎｔ～約４０ｎｔ、約３ｎｔ～約３０ｎｔ、約３ｎｔ～約２０ｎｔ、約３ｎｔ～約１０ｎｔの長さを有する。例えば、リンカーは、約３ｎｔ～約５ｎｔ、約５ｎｔ～約１０ｎｔ、約１０ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約２０ｎｔ、約２０ｎｔ～約２５ｎｔ、約２５ｎｔ～約３０ｎｔ、約３０ｎｔ～約３５ｎｔ、約３５ｎｔ～約４０ｎｔ、約４０ｎｔ～約５０ｎｔ、約５０ｎｔ～約６０ｎｔ、約６０ｎｔ～約７０ｎｔ、約７０ｎｔ～約８０ｎｔ、約８０ｎｔ～約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ～約１００ｎｔの長さを有し得る。一分子ガイド核酸のリンカーは、４から４０の間のヌクレオチドであり得る。リンカーは、少なくとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、もしくは７０００またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。リンカーは、多くとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、もしくは７０００またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。
一分子ガイド核酸のリンカー配列は、約３ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（前出）では、例えば、単純な４ヌクレオチド「テトラループ」（－ＧＡＡＡ－）が使用された（Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７（６０９６）：８１６－８２１（２０１２））。リンカーの実例は、約３ヌクレオチド（ｎｔ）～約９０ｎｔ、約３ｎｔ～約８０ｎｔ、約３ｎｔ～約７０ｎｔ、約３ｎｔ～約６０ｎｔ、約３ｎｔ～約５０ｎｔ、約３ｎｔ～約４０ｎｔ、約３ｎｔ～約３０ｎｔ、約３ｎｔ～約２０ｎｔ、約３ｎｔ～約１０ｎｔの長さを有する。例えば、リンカーは、約３ｎｔ～約５ｎｔ、約５ｎｔ～約１０ｎｔ、約１０ｎｔ～約１５ｎｔ、約１５ｎｔ～約２０ｎｔ、約２０ｎｔ～約２５ｎｔ、約２５ｎｔ～約３０ｎｔ、約３０ｎｔ～約３５ｎｔ、約３５ｎｔ～約４０ｎｔ、約４０ｎｔ～約５０ｎｔ、約５０ｎｔ～約６０ｎｔ、約６０ｎｔ～約７０ｎｔ、約７０ｎｔ～約８０ｎｔ、約８０ｎｔ～約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ～約１００ｎｔの長さを有し得る。一分子ガイド核酸のリンカーは、４から４０の間のヌクレオチドであり得る。リンカーは、少なくとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、もしくは７０００またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。リンカーは、多くとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、もしくは７０００またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。
【0136】
リンカーは、様々な配列のいずれも含むことができるが、一部の例では、リンカーは、ガイドの他の機能性領域を妨害し得る分子内結合をもたらすかもしれない、ガイドＲＮＡの他の部分と相同性の広範な領域を有する配列を含まない。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（前出）では、単純な４ヌクレオチド配列－ＧＡＡＡ－が使用されたが（Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７（６０９６）：８１６－８２１（２０１２））、より長い配列を含む多数の他の配列を同様に使用することができる。
【0137】
リンカー配列は、機能性部分を含み得る。例えば、リンカー配列は、アプタマー、リボザイム、タンパク質－相互作用ヘアピン、タンパク質結合部位、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、またはエキソンを含む１つまたは複数のフィーチャーを含み得る。リンカー配列は、少なくとも約１、２、３、４、もしくは５またはそれ以上の機能性部分を含み得る。一部の例では、リンカー配列は、多くとも約１、２、３、４、もしくは５またはそれ以上の機能性部分を含み得る。
【0138】
核酸修飾（化学及び構造修飾）
一部の態様では、本明細書においてさらに記載するとおり、かつ当技術分野で公知のとおり、細胞に導入されるポリヌクレオチドは、例えば、活性、安定性または特異性を増強するために、送達を変化させるために、宿主細胞における自然免疫応答を低下させるために、または他の増強のために個別に、または組み合わせて使用することができる１つまたは複数の修飾を含み得る。
一部の態様では、本明細書においてさらに記載するとおり、かつ当技術分野で公知のとおり、細胞に導入されるポリヌクレオチドは、例えば、活性、安定性または特異性を増強するために、送達を変化させるために、宿主細胞における自然免疫応答を低下させるために、または他の増強のために個別に、または組み合わせて使用することができる１つまたは複数の修飾を含み得る。
【0139】
ある種の例では、修飾ポリヌクレオチドを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用することができ、その場合、以下に記載及び例示するとおり、細胞に導入されるガイドＲＮＡ（一分子ガイドまたは二重分子ガイドのいずれか）及び／またはＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを修飾することができる。そのような修飾ポリヌクレオチドを、任意の１つまたは複数のゲノム遺伝子座を編集するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムにおいて使用することができる。
【0140】
そのような使用の非限定的説明を目的としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを使用すると、ガイドＲＮＡの修飾を、一分子ガイドまたは二重分子であってよいガイドＲＮＡと、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼとを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ゲノム編集複合体の形成または安定性を増強するために使用することができる。ガイドＲＮＡの修飾をまた、または別法で、ゲノム編集複合体とゲノム内の標的配列との相互作用の開始、安定性または反応速度を増強するために使用することができ、これを、例えばオンターゲット活性を増強するために使用することができる。ガイドＲＮＡの修飾をまた、または別法で、特異性、例えば、他の（オフターゲット）部位での作用と比較して、オンターゲット部位でのゲノム編集の相対速度を増強するために使用することができる。
【0141】
修飾をまた、または別法で、ガイドＲＮＡの安定性を、例えば、細胞内に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）による分解に対するその抵抗性を上昇させ、それによって細胞におけるその半減期を増加させることによって上昇させるために使用することができる。ガイドＲＮＡ半減期を増加させる修飾は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼを生成するために翻訳されることを必要とするＲＮＡを介して、編集されるべき細胞に導入される態様で特に有用であり得るが、それというのも、エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡと同時に導入されるガイドＲＮＡの半減期の増加を、ガイドＲＮＡ及びコードされたＣａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが細胞内に同時に存在する時間を増加させるために使用することができるためである。
【0142】
修飾をまた、または別法で、細胞に導入されたＲＮＡが自然免疫応答を誘発する可能性または程度を低下させるために使用することができる。以下に、及び当技術分野で記載されているとおりの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の文脈で十分に特徴付けられているそのような応答は、ＲＮＡの半減期の減少及び／またはサイトカインまたは免疫応答と関連する他の因子の誘発と関連する傾向がある。
【0143】
限定ではないが、ＲＮＡの安定性を増強する修飾（細胞内に存在するＲＮアーゼによるその分解を増加させることなどによって）、生じる産物（すなわち、エンドヌクレアーゼ）の翻訳を増強する修飾、及び／または細胞に導入されたＲＮＡが自然免疫応答を誘発する可能性または程度を低下させる修飾を含む、１つまたは複数の種類の修飾を、細胞に導入されるエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡに行うこともできる。
【0144】
上述などの修飾の組み合わせも同様に使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１の場合では、例えば、１つまたは複数の種類の修飾をガイドＲＮＡ（上記で例示したものを含む）に行うことができる、及び／または１つまたは複数の種類の修飾をＣａｓエンドヌクレアーゼ（上記で例示したものを含む）をコードするＲＮＡに行うことができる。
【0145】
実例としては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムで使用されるガイドＲＮＡ、または他のより小さなＲＮＡを、化学的手段によって容易に合成することができ、下記で例示されているとおり、及び当技術分野で記載されているとおり、いくつかの修飾を容易に組み込むことができる。化学合成手順は絶えず拡大しているが、ポリヌクレオチド長さが約１００ヌクレオチドを超えてかなり増大するにつれて、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、これによりＰＡＧＥなどのゲルの使用が回避される）などの手順によるそのようなＲＮＡの精製は、より困難になる傾向がある。比較的大きな長さの化学修飾ＲＮＡを生成するために使用され得るアプローチの１つは、２つ以上の分子を生成して、それらを一緒にライゲートさせることである。かなり長いＲＮＡ、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするものは、酵素によってより容易に生成される。より少ない種類の修飾を酵素生成ＲＮＡで使用することができるが、例えば、さらに以下で記載するとおり、及び当技術分野で記載するとおり、安定性を増強する、自然免疫応答の可能性または程度を低下させる、及び／または他の特性を増強するために使用することができる修飾がなお存在し；新たな種類の修飾が定期的に開発されている。
【0146】
様々な種類の修飾、特に、しばしば比較的小さな化学合成ＲＮＡと共に使用されるものの実例としては、修飾は、糖の２’位で修飾された１つまたは複数のヌクレオチド、一部の態様では、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル、または２’－フルオロ－修飾ヌクレオチドを含み得る。一部の例では、ＲＮＡ修飾には、ピリミジンのリボースでの２’－フルオロ、２’－アミノもしくは２’－Ｏ－メチル修飾、非塩基残基、またはＲＮＡの３’末端にある反転塩基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｂａｓｅ）が含まれる。そのような修飾は、オリゴヌクレオチドにルーチン的に組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対して２’－デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いＴｍ（すなわち、より高い標的結合親和性）を有することが示されている。
【0147】
いくつかのヌクレオチド及びヌクレオシド修飾は、組み込まれるオリゴヌクレオチドを天然オリゴヌクレオチドよりもヌクレアーゼ消化に対してより抵抗性にすることが示されている；これらの修飾オリゴは、非修飾オリゴヌクレオチドよりも長時間にわたって無傷で残存する。修飾オリゴヌクレオチドの具体例には、修飾骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間（ｉｎｔｅｒｓｕｇａｒ）結合または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式糖間結合を含むものが含まれる。一部のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子骨格、特にＣＨ２－ＮＨ－Ｏ－ＣＨ２、ＣＨ、－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格としても公知）、ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２、ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２及びＯ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２骨格（ここで、天然のホスホジエステル骨格は、Ｏ－Ｐ－Ｏ－ＣＨとして表される）；アミド骨格［Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．,Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．、２８：３６６－３７４（１９９５）を参照されたい］；モルホリノ骨格構造（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ及びＷｅｌｌｅｒ、米国特許第５，０３４，５０６号を参照されたい）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（ここで、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格はポリアミド骨格で置き換えられ、ヌクレオチドは、ポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合している。Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．,Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１,２５４,１４９７を参照されたい）を有するものである。リン含有結合には、これに限定されないが、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホラミデート及びアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び正常な３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’結合類似体、ならびにヌクレオシド単位の隣接対が３’－５’から５’－３’に、または２’－５’から５’－２’に結合している逆転極性（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｐｏｌａｒｉｔｙ）を有するものが含まれる；米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；及び同第５，６２５，０５０号を参照されたい。
【0148】
モルホリノベースのオリゴマー化合物は、Ｂｒａａｓｃｈ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（１４）：４５０３－４５１０（２００２）；Ｇｅｎｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ３０，Ｉｓｓｕｅ ３，（２００１）；Ｈｅａｓｍａｎ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２４３：２０９－２１４（２００２）；Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２６：２１６－２２０（２０００）；Ｌａｃｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：９５９１－９５９６（２０００）；及び１９９１年７月２３日発行の米国特許第５，０３４，５０６号に記載されている。
【0149】
シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣体は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８５９５－８６０２（２０００）に記載されている。
【0150】
リン原子をそこに含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合を有するもの（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２構成部分を有する他のものを含む；米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；及び同第５，６７７，４３９号を参照されたい。
【0151】
１つまたは複数の置換糖部分、例えば、２’位の次のいずれか：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３ＯＣＨ３、ＯＣＨ３Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、またはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ここで、ｎは、１～約１０である）；Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリールまたはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基；または同様の特性を有するオリゴヌクレオチド及び他の置換基の薬力学的特性を改善するための基も含まれ得る。一部の態様では、修飾には、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）としても公知）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ，ＨｅＩｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６）が含まれる。他の修飾には、２’－メトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ３）、２’－プロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）及び２’－フルオロ（２’－Ｆ）が含まれる。同様の修飾をまた、オリゴヌクレオチドの他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位で行ってもよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖模倣体を有してもよい。
【0152】
一部の例では、糖及びヌクレオシド間結合の両方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が、新規の基で置き換えられ得る。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイズのために維持され得る。そのようなオリゴマー化合物の１つである、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖－骨格は、アミド含有骨格、例えば、アミノエチルグリシン骨格と置き換えられ得る。ヌクレオ塩基は維持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合し得る。ＰＮＡ化合物の調製を教示している代表的な米国特許には、これに限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；及び同第５，７１９，２６２号が含まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７－１５００（１９９１）において見出すことができる。
【0153】
ガイドＲＮＡはまた、加えて、または別法で、ヌクレオ塩基（多くの場合に当技術分野では単純に「塩基」と称される）修飾または置換を含み得る。本明細書で使用する場合、「非修飾」または「天然」ヌクレオ塩基には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾ヌクレオ塩基には、天然核酸でまれに、または一過性にのみ見出されるヌクレオ塩基、例えば、ヒポキサンチン、６－メチルアデニン、５－Ｍｅピリミジン、特に５－メチルシトシン（５－メチル－２’デオキシシトシンとも称され、多くの場合に当技術分野では５－Ｍｅ－Ｃと称される）、５－ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ及びゲントビオシルＨＭＣ、さらには合成ヌクレオ塩基、例えば、２－アミノアデニン、２－（メチルアミノ）アデニン、２－（イミダゾリルアルキル）アデニン、２－（アミノアルキルアミノ）アデニンまたは他のヘテロ置換アルキルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミン、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、８－アザグアニン、７－デアザグアニン、Ｎ６（６－アミノヘキシル）アデニン、及び２，６－ジアミノプリンが含まれる。Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７５－７７（１９８０）；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：４５１３（１９９７）。当技術分野で公知の「ユニバーサル」塩基、例えばイノシンも含まれ得る。５－Ｍｅ－Ｃ置換は核酸二重鎖の安定性を０．６～１．２℃上昇させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，ｉｎ Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８）、塩基置換の態様である。
【0154】
修飾ヌクレオ塩基は、他の合成及び天然ヌクレオ塩基、例えば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６－メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（シュード－ウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル及び他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン、ならびに３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンを含み得る。
【0155】
さらに、ヌクレオ塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、「Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、ｐａｇｅｓ ８５８－８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｌｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ’，１９９１，３０，ｐａｇｅ ６１３によって開示されているもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，ｉｎ Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’，ｐａｇｅｓ ２８９－ ３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅａ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されているものを含み得る。これらのヌクレオ塩基のいくつかは、本開示のオリゴマー化合物の結合親和性を上昇させるために特に有用である。これらには、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンならびにＮ－２、Ｎ－６及び０－６置換プリンが含まれ、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシンを含む。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６～１．２℃まで上昇させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，ｉｎ Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８）、より詳しくは２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせる場合も、塩基置換の態様である。修飾ヌクレオ塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号、さらには、同第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６８１，９４１号；同第５，７５０，６９２号；同第５，７６３，５８８号；同第５，８３０，６５３号；同第６，００５，０９６号；及び米国特許出願公開第２００３／０１５８４０３号に記載されている。
【0156】
したがって、「修飾」という用語は、ガイドＲＮＡ、エンドヌクレアーゼ、またはガイドＲＮＡ及びエンドヌクレアーゼの両方に組み込まれる非天然糖、リン酸、または塩基に関する。所与のオリゴヌクレオチド内のすべての位置が均一に修飾されている必要はなく、実際には、上記の修飾のうちの１つより多くを、単一のオリゴヌクレオチドに、またはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにも組み込むことができる。
【0157】
ガイドＲＮＡ及び／またはエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（またはＤＮＡ）は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを増強する１つまたは複数の部分またはコンジュゲートに化学結合していてよい。そのような部分は、これに限定されないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分［［Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：６５５３－６５５６（１９８９）］；コール酸［Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，４：１０５３－１０６０（１９９４）］；チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール［Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：３０６－３０９（１９９２）及びＭａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，３：２７６５－２７７０（１９９３）］；チオコレステロール［Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：５３３－５３８（１９９２）］；脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基［Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２５９：３２７－３３０（１９９０）及びＳｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７５：４９－５４（１９９３）］；リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート［Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１－３６５４（１９９５）及びＳｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：３７７７－３７８３（１９９０）］；ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖［Ｍａｎｃｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４：９６９－９７３（１９９５）］；アダマンタン酢酸［Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１－３６５４（１９９５）］；パルミチル部分［（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２６４：２２９－２３７（１９９５）］；またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニル－ｔオキシコレステロール部分［Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７７：９２３－９３７（１９９６）］を含む。また、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号；同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号；同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号及び同第５，６８８，９４１号を参照されたい。
【0158】
糖及び他の部分を、タンパク質及びヌクレオチドを含む複合体、例えば、カチオン性ポリソーム及びリポソームを特定の部位に配向するために使用することができる。例えば、肝細胞配向送達を、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を介して媒介することができ；例えば、Ｈｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．２１（１０）：１０２５－３０（２０１４）を参照されたい。この場合に使用される生体分子及び／またはその複合体を目的の特定の標的細胞に配向するために、当技術分野で公知である、及び定期的に開発される他のシステムを使用することができる。
【0159】
これらのターゲティング部分またはコンジュゲートは、官能基、例えば、第一級または第二級ヒドロキシル基に共有結合しているコンジュゲート基を含み得る。本開示のコンジュゲート基には、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する基、及びオリゴマーの薬物動態特性を増強する基が含まれる。典型的なコンジュゲート基には、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び色素が含まれる。薬力学的特性を増強する基には、本開示の文脈では、取り込みを改善する、分解に対する抵抗性を増強する、及び／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が含まれる。薬物動態特性を増強する基には、本開示の文脈では、本開示の化合物の取り込み、分布、代謝または排出を改善する基が含まれる。代表的なコンジュゲート基は、１９９２年１０月２３日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６（ＷＯ１９９３００７８８３として公開）、及び米国特許第６，２８７，８６０号に開示されている。コンジュゲート部分には、これに限定されないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル－５－トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールもしくはトリエチルアンモニウムｌ，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分が含まれる。例えば、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７、５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号；同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３、５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号及び同第５，６８８，９４１号を参照されたい。
【0160】
化学合成に対する適性が低く、典型的には酵素合成によって生成される比較的長いポリヌクレオチドはまた、様々な手段によって修飾することができる。そのような修飾には、例えば、ある種のヌクレオチド類似体の導入、分子の５’または３’末端での特定の配列または他の部分の組込み、及び他の修飾が含まれ得る。実例としては、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡは、約４ｋｂ長さであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって合成することができる。例えば、その翻訳または安定性を増加させるために（細胞での分解に対するその抵抗性を増大させることなどによって）、または多くの場合に外因性ＲＮＡ、特に、Ｃａｓ９をコードするものなどの比較的長いＲＮＡの導入後に細胞内で観察される自然免疫応答を誘発するＲＮＡの傾向を低下させるために、ｍＲＮＡに対する修飾を適用することができる。
【0161】
多数のそのような修飾、例えばポリＡテイル、５’キャップ類似体（例えば、アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）またはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ））、修飾された５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、修飾塩基の使用（シュード－ＵＴＰ、２－チオ－ＵＴＰ、５－メチルシチジン－５’－トリホスフェート（５－メチル－ＣＴＰ）またはＮ６－メチル－ＡＴＰなど）、または５’末端リン酸を除去するためのホスファターゼでの処理が当技術分野で記載されている。これらの及び他の修飾は当技術分野で公知であり、ＲＮＡの新たな修飾が定期的に開発されている。
【0162】
修飾ＲＮＡの多数の商業的供給者が存在し、例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＡｘｏＬａｂｓ、Ｂｉｏ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ及びその他多数が含まれる。ＴｒｉＬｉｎｋによって記載されているとおり、例えば、５－メチル－ＣＴＰを、望ましい特徴、例えば、ヌクレアーゼ安定性の増大、翻訳の増大または自然免疫受容体とｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡの相互作用の減少を付与するために使用することができる。以下で言及するＫｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．及びＷａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．による刊行物において説明されているとおり、５－メチルシチジン－５’－三リン酸（５－メチル－ＣＴＰ）、Ｎ６－メチル－ＡＴＰ、さらにはシュード－ＵＴＰ及び２－チオ－ＵＴＰも、翻訳を増強しながら、培養及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて自然免疫刺激を減少させることが示されている。
【0163】
ｉｎ ｖｉｖｏで送達された化学修飾ｍＲＮＡを、治療効果の改善を達成するために使用することができることが示されている；例えば、Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９，１５４－１５７（２０１１）を参照されたい。例えば、ＲＮＡ分子の安定性を増大させるために、及び／または免疫原性を低下させるために、そのような修飾を使用することができる。化学修飾、例えば、シュード－Ｕ、Ｎ６－メチル－Ａ、２－チオ－Ｕ及び５－メチル－Ｃを使用する場合、ウリジン及びシチジン残基のちょうど１／４をそれぞれ２－チオ－Ｕ及び５－メチル－Ｃで置換すると、マウスにおいてｍＲＮＡのｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）媒介認識の有意な減少が生じることが見出された。自然免疫系の活性化を低下させることによって、これらの修飾を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＲＮＡの安定性及び寿命を効果的に増大させることができる；例えば、Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（前出）を参照されたい。
【0164】
自然免疫抗ウイルス応答をバイパスするように設計された修飾が組み込まれている合成メッセンジャーＲＮＡの反復投与が分化ヒト細胞を多能性にリプログラミングし得ることも示されている。例えば、Ｗａｒｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，７（５）：６１８－３０（２０１０）を参照されたい。一次リプログラミングタンパク質（ｐｒｉｍａｒｙ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）として作用するそのような修飾ｍＲＮＡは、多数のヒト細胞型をリプログラミングする効率的な手段であり得る。そのような細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と称され、５－メチル－ＣＴＰ、シュード－ＵＴＰ及びアンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）が組み込まれた酵素合成ＲＮＡを、細胞の抗ウイルス応答を効果的に回避するために使用することができることが見出された；例えば、Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（前出）を参照されたい。
【0165】
当技術分野に記載のポリヌクレオチドの他の修飾には、例えばポリＡテイルの使用、５’キャップ類似体（例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ））の付加、５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の修飾、または５’末端リン酸を除去するためのホスファターゼでの処理が含まれ、新たなアプローチが定期的に開発されている。
【0166】
本明細書で使用するための修飾ＲＮＡの生成に適用可能ないくつかの組成物及び技法は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含むＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の修飾と関連して開発されている。ｓｉＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで特定の攻撃を提示し、それというのも、ｍＲＮＡ干渉を介しての遺伝子サイレンシングに対するそれらの作用は一般に一過性であり、これを繰り返し投与することが必要であり得るためである。加えて、ｓｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、哺乳類細胞は、多くの場合にウイルス感染の副産物であるｄｓＲＮＡを検出及び中和するために展開されてきた免疫応答を有する。したがって、哺乳類酵素、例えば、ＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ－応答キナーゼ；ｄｓＲＮＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｋｉｎａｓｅ）、及び潜在的に、細胞応答をｄｓＲＮＡに媒介し得る潜在的にレチノイン酸誘導遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）、さらにそのような分子に応じてサイトカインの誘導を開始させ得るＴｏｌｌ様受容体（例えばＴＬＲ３、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８）が存在する；例えば、Ａｎｇａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ）６（４）：４４０－４６８（２０１３）；Ｋａｎａｓｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０（３）：５１３－５２４（２０１２）；Ｂｕｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．６（９）：１１３０－４６（２０１１）；Ｊｕｄｇｅ ａｎｄ ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９（２）：１１１－２４（２００８）による概説；及びそこで引用されている参照文献を参照されたい。
【0167】
本明細書に記載のとおり、ＲＮＡ安定性を増強するために、自然免疫応答を減少させるために、及び／またはヒト細胞へのポリヌクレオチドの導入に関して有用であり得る他の利点を達成するために、多数の様々な修飾が開発され、適用されている；例えば、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ＫＡ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２：７７－９６（２０１１）；Ｇａｇｌｉｏｎｅ ａｎｄ Ｍｅｓｓｅｒｅ，Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１０（７）：５７８－９５（２０１０）；Ｃｈｅｒｎｏｌｏｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，１２（２）：１５８－６７（２０１０）；Ｄｅｌｅａｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍ Ｃｈａｐｔｅｒ １６：Ｕｎｉｔ １６．３（２００９）；Ｂｅｈｌｋｅ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８（４）：３０５－１９（２００８）；Ｆｕｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ ２２（３）：２０５－２１０（２０１２）；Ｂｒｅｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ ３：１５４（２０１２）による概説を参照されたい。
【0168】
上記のとおり、多数の修飾ＲＮＡの商業的供給者が存在し、そのうちの多くは、ｓｉＲＮＡの有効性を改善するように設計された修飾を専門としている。様々なアプローチが、文献で報告された様々な所見に基づき提示されている。例えば、Ｋｏｌｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １１：１２５－１４０（２０１２）によって報告されているとおり、Ｄｈａｒｍａｃｏｎは、ｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ抵抗性を改善するために硫黄（ホスホロチオエート、ＰＳ）での非架橋酸素の置き換えが広範に使用されていることを述べている。リボースの２’位の修飾は、二重鎖安定性（Ｔｍ）を増大させながらヌクレオチド間リン酸結合のヌクレアーゼ抵抗性を改善することが報告されており、これはまた、免疫活性化からの防御を提供することも示されている。Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３－１７８（２００４）によって報告されているとおり、中等度のＰＳ骨格修飾と小さな十分に許容される２’－置換（２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－ヒドロ）との組み合わせは、ｉｎ ｖｉｖｏで適用するために高度に安定なｓｉＲＮＡと関連しており；Ｖｏｌｋｏｖ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９：１９１－２０２（２００９）によって報告されているとおり、２’－Ｏ－メチル修飾は、安定性の改善において有効であると報告されている。自然免疫応答の誘導を減少させることに関しては、特異的な配列を２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－ヒドロで修飾することが、一般にサイレンシング活性を保存しながらＴＬＲ７／ＴＬＲ８相互作用を減少させると報告されている；例えば、Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３：４９４－５０５（２００６）；及びＣｅｋａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６５：９０－１０８（２００７）を参照されたい。追加の修飾、例えば２－チオウラシル、シュードウラシル、５－メチルシトシン、５－メチルウラシル、及びＮ６－メチルアデノシンも、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ８によって媒介される免疫作用を最小化することが示されている；例えば、Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３：１６５－１７５（２００５）を参照されたい。
【0169】
当技術分野で公知で、市販もされているとおり、本明細書での使用のために、それらの送達及び／または細胞による取り込みを増強し得るいくつかのコンジュゲートを、ポリヌクレオチド、例えばＲＮＡに適用することができ、例えば、コレステロール、トコフェロール及び葉酸、脂質、ペプチド、ポリマー、リンカー及びアプタマーが含まれる；例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．４：７９１－８０９（２０１３）による概説、及びそこで引用されている参照文献を参照されたい。
【0170】
コドン最適化
目的の標的ＤＮＡを含有する細胞内での発現のために当技術分野で標準的な方法に従って、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをコドン最適化することができる。例えば、意図されている標的核酸がヒト細胞内にあれば、Ｃａｓ９をコードするヒトコドン最適化ポリヌクレオチドが、Ｃａｓ９ポリペプチドを生成するために使用されるように企図される。
目的の標的ＤＮＡを含有する細胞内での発現のために当技術分野で標準的な方法に従って、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをコドン最適化することができる。例えば、意図されている標的核酸がヒト細胞内にあれば、Ｃａｓ９をコードするヒトコドン最適化ポリヌクレオチドが、Ｃａｓ９ポリペプチドを生成するために使用されるように企図される。
【0171】
ゲノムターゲティング核酸及び部位特異的ポリペプチドの複合体
ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチド（例えば、核酸ガイドされるヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９）と相互作用し、それによって、複合体を形成する。ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドを標的核酸に配向させる。
ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチド（例えば、核酸ガイドされるヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９）と相互作用し、それによって、複合体を形成する。ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドを標的核酸に配向させる。
【0172】
リボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）
部位特異的ポリペプチド及びゲノムターゲティング核酸をそれぞれ、細胞または患者に別々に投与することができる。他方で、部位特異的ポリペプチドを、ｔｒａｃｒＲＮＡと一緒に１つもしくは複数のガイドＲＮＡ、または１つもしくは複数のｃｒＲＮＡと事前複合体化することができる。次いで、事前複合体化物質を細胞または患者に投与することができる。そのような事前複合体化物質は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として公知である。ＲＮＰ中の部位特異的ポリペプチドは、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり得る。部位特異的ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方で１つまたは複数の核移行シグナル（ＮＬＳ）と隣接し得る。例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、２つのＮＬＳと隣接し得て、１つのＮＬＳはＮ末端に位置し、第２のＮＬＳはＣ末端に位置する。ＮＬＳは、当技術分野で公知の任意のＮＬＳ、例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳであり得る。ＲＮＰにおけるゲノムターゲティング核酸と部位特異的ポリペプチドとの重量比は、１：１であり得る。例えば、ＲＮＰにおけるｓｇＲＮＡとＣａｓ９エンドヌクレアーゼとの重量比は、１：１であり得る。
部位特異的ポリペプチド及びゲノムターゲティング核酸をそれぞれ、細胞または患者に別々に投与することができる。他方で、部位特異的ポリペプチドを、ｔｒａｃｒＲＮＡと一緒に１つもしくは複数のガイドＲＮＡ、または１つもしくは複数のｃｒＲＮＡと事前複合体化することができる。次いで、事前複合体化物質を細胞または患者に投与することができる。そのような事前複合体化物質は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として公知である。ＲＮＰ中の部位特異的ポリペプチドは、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり得る。部位特異的ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端及びＣ末端の両方で１つまたは複数の核移行シグナル（ＮＬＳ）と隣接し得る。例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、２つのＮＬＳと隣接し得て、１つのＮＬＳはＮ末端に位置し、第２のＮＬＳはＣ末端に位置する。ＮＬＳは、当技術分野で公知の任意のＮＬＳ、例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳであり得る。ＲＮＰにおけるゲノムターゲティング核酸と部位特異的ポリペプチドとの重量比は、１：１であり得る。例えば、ＲＮＰにおけるｓｇＲＮＡとＣａｓ９エンドヌクレアーゼとの重量比は、１：１であり得る。
【0173】
システム成分をコードする核酸
本開示は、本開示のゲノムターゲティング核酸をコードするヌクレオチド配列、本開示の部位特異的ポリペプチド、及び／または本開示の方法の態様を実施するために必要な任意の核酸またはタンパク質分子を含む核酸を提供する。
本開示は、本開示のゲノムターゲティング核酸をコードするヌクレオチド配列、本開示の部位特異的ポリペプチド、及び／または本開示の方法の態様を実施するために必要な任意の核酸またはタンパク質分子を含む核酸を提供する。
【0174】
本開示のゲノムターゲティング核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、及び／または本開示の方法の態様を実施するために必要な任意の核酸またはタンパク質分子をコードする核酸はベクター（例えば、組換え発現ベクター）を含み得る。
【0175】
「ベクター」という用語は、結合している別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの１種は「プラスミド」であり、これは追加の核酸セグメントをライゲートすることができる円形二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、この場合、追加の核酸セグメントをウイルスゲノムにライゲートすることができる。ある種のベクターは、導入された宿主細胞中での自律複製が可能である（例えば、細菌複製開始点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）を宿主細胞へ導入して宿主細胞のゲノムに組み込むと、それによってそれらは、宿主ゲノムと共に複製される。
【0176】
一部の例では、ベクターは、作動可能に連結された核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」、またはより簡単に「発現ベクター」と称され、同等の機能を果たす。
【0177】
「作動可能に連結された」という用語は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にするように制御配列（複数可）に連結していることを意味する。「制御配列」という用語は、例えば、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図されている。そのような制御配列は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。制御配列には、宿主細胞の多くの種類においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、及び特定の宿主細胞においてだけヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的制御配列）が含まれる。発現ベクターの設計は、標的細胞の選択、所望の発現レベルなどの因子に依存し得ることは、当業者には分かるであろう。
【0178】
企図される発現ベクターには、これに限定されないが、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス）をベースとするウイルスベクター、及びレトロウイルス、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳癌ウイルスに由来するベクターならびに他の組換えベクターが含まれる。真核標的細胞で企図される他のベクターには、これに限定されないが、ベクターｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。宿主細胞と適合し得る限り、他のベクターを使用することができる。
【0179】
一部の例では、ベクターは、１つまたは複数の転写及び／または翻訳制御エレメントを含み得る。利用する宿主／ベクターシステムに応じて、構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含むいくつかの適切な転写及び翻訳制御要素のいずれかを、発現ベクターにおいて使用することができる。ベクターは、ウイルス配列またはＣＲＩＳＰＲ機構の成分または他のエレメントのいずれかを不活化する自己不活化型ベクターであり得る。
【0180】
適切な真核プロモーター（すなわち、真核細胞で機能性のプロモーター）の非限定的例には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期に由来するもの、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の長末端反復（ＬＴＲ）、ヒト伸長因子－１プロモーター（ＥＦ１）、ハイブリッド構築物（ニワトリβアクチンプロモーター（ＣＡＧ）に融合したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーを含む）、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１遺伝子座プロモーター（ＰＧＫ）及びマウスメタロチオネイン－Ｉが含まれる。
【0181】
Ｃａｓエンドヌクレアーゼと関連して使用されるガイドＲＮＡを含む小さなＲＮＡを発現するために、例えばＵ６及びＨ１を含むＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどの様々なプロモーターが有利であり得る。そのようなプロモーターの使用の記載及びそれを増強するためのパラメーターは、当分野で公知であり、追加の情報及びアプローチは定期的に記載されている；例えば、Ｍａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ － Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３，ｅ１６１（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１４．１２を参照されたい。
【0182】
発現ベクターはまた、翻訳開始及び転写終結のためのリボソーム結合部位を含有し得る。発現ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含み得る。発現ベクターはまた、部位特異的ポリペプチドに融合している非天然タグ（例えば、ヒスチジンタグ、血球凝集素タグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列を含み得、したがって、融合タンパク質が生じている。
【0183】
プロモーターは、誘導プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリン制御プロモーター、ステロイド制御プロモーター、金属制御プロモーター、エストロゲン受容体制御プロモーターなど）であり得る。プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター）であり得る。場合によっては、プロモーターは、空間限定（ｓｐａｔｉａｌｌｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）及び／または一過性限定（ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）プロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）であり得る。
【0184】
本開示のゲノムターゲティング核酸及び／または部位特異的ポリペプチドをコードする核酸を、細胞に送達するために送達ビヒクル内に、またはその表面にパッケージングすることができる。企図される送達ビヒクルには、これに限定されないが、ナノ球体、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、及びミセルが含まれる。当技術分野で記載されているとおり、そのようなビヒクルと所望の細胞型または位置との優先的相互作用を増強するために、様々なターゲティング部分を使用することができる。
【0185】
細胞への本開示の複合体、ポリペプチド、及び核酸の導入は、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔法、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、粒子ガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロ注射、ナノ粒子媒介核酸送達などによって行うことができる。
【0186】
治療アプローチ
本明細書で提供されるのは、疼痛を有する患者を治療するための方法である。そのような方法の１つの態様は、ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞ベースの治療である。例えば、患者の末梢神経の生検が行われる。神経組織は、患者の皮膚または脚から分離され得る。次いで、末梢神経系の細胞（例えば、神経内のシュワン細胞または神経節内のサテライトグリア細胞などのニューロンまたはグリア細胞）は、生検材料から単離される。次いで、末梢神経系の細胞（例えば、神経内のシュワン細胞または神経節内のサテライトグリア細胞などのニューロンまたはグリア細胞）の染色体ＤＮＡは、本明細書に記載の材料及び方法を用いて編集され得る。最後に、末梢神経系の編集細胞（例えば、神経内のシュワン細胞または神経節内のサテライトグリア細胞などのニューロンまたはグリア細胞）は、患者に移植される。任意の起源または細胞の種類は、前駆細胞として使用され得る。
本明細書で提供されるのは、疼痛を有する患者を治療するための方法である。そのような方法の１つの態様は、ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞ベースの治療である。例えば、患者の末梢神経の生検が行われる。神経組織は、患者の皮膚または脚から分離され得る。次いで、末梢神経系の細胞（例えば、神経内のシュワン細胞または神経節内のサテライトグリア細胞などのニューロンまたはグリア細胞）は、生検材料から単離される。次いで、末梢神経系の細胞（例えば、神経内のシュワン細胞または神経節内のサテライトグリア細胞などのニューロンまたはグリア細胞）の染色体ＤＮＡは、本明細書に記載の材料及び方法を用いて編集され得る。最後に、末梢神経系の編集細胞（例えば、神経内のシュワン細胞または神経節内のサテライトグリア細胞などのニューロンまたはグリア細胞）は、患者に移植される。任意の起源または細胞の種類は、前駆細胞として使用され得る。
【0187】
そのような方法の別の態様は、ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞ベースの治療である。例えば、患者特異的な人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が作製され得る。次いで、これらのｉＰＳＣ細胞の染色体ＤＮＡは、本明細書に記載の材料及び方法を用いて編集され得る。次に、ゲノム編集されたｉＰＳＣは、末梢神経系の細胞（例えば、神経内のシュワン細胞または神経節内のサテライトグリア細胞などのニューロンまたはグリア細胞）に分化され得る。最後に、末梢神経系の分化した細胞（例えば、神経内のシュワン細胞または神経節内のサテライトグリア細胞などのニューロンまたはグリア細胞）は、患者に移植される。
【0188】
そのような方法のさらに別の態様は、ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞ベースの治療である。例えば、間葉系幹細胞は、患者から単離され得、患者の骨髄または末梢血から単離され得る。次に、これらの間葉系幹細胞の染色体ＤＮＡは、本明細書に記載の材料及び方法を用いて編集され得る。次に、ゲノム編集された間葉系幹細胞は、末梢神経系の細胞（例えば、神経内のシュワン細胞または神経節内のサテライトグリア細胞などのニューロンまたはグリア細胞）に分化され得る。最後に、末梢神経系の分化した細胞（例えば、神経内のシュワン細胞または神経節内のサテライトグリア細胞などのニューロンまたはグリア細胞）は、患者に移植される。
【0189】
ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞療法のアプローチの１つの利点は、投与前に治療薬の包括的な分析を行うことができることである。ヌクレアーゼベースの治療薬は、ある程度のオフターゲットの効果をもたらす可能性がある。ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子編集を行うことにより、移植前に編集された細胞集団を特徴付けることが可能になる。本開示は、もしあれば、オフターゲットの効果が、患者に対する最小のリスクと関連するゲノム位置にあり得ることを確実にするために、編集された細胞の全ゲノムを配列決定することを含む。さらに、クローン集団を含む特定の細胞の集団は、移植前に単離され得る。
【0190】
ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞療法の別の利点は、他の初代細胞の供給源と比較した、ｉＰＳＣにおける遺伝子改変に関する。ｉＰＳＣは豊富で、細胞ベースの治療に必要とされる多数の細胞を得ることを容易にする。さらに、ｉＰＳＣは、クローンの単離を行うのに理想的な細胞型である。これにより、生存率の低下を招くことなく、正確なゲノム修飾をスクリーニングすることができる。対照的に、グリア細胞のような他の初代細胞は、数継代の間だけ生存可能であり、クローン的に拡大することが困難である。したがって、疼痛の治療のためのｉＰＳＣの操作は、はるかに容易であり得、所望の遺伝子改変をするために必要とされる時間量を短縮し得る。
【0191】
方法はまた、ｉｎ ｖｉｖｏベースの治療を含み得る。患者の細胞の染色体ＤＮＡは、本明細書に記載の材料及び方法を用いて編集される。いくつかの態様において、ｉｎ ｖｉｖｏベースの治療における標的細胞は、末梢神経系のニューロンである。
【0192】
特定の細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏでの処置及び療法のための魅力的な標的を提示するが、送達における有効性の増加は、そのような細胞への直接的なｉｎ ｖｉｖｏの送達を可能にし得る。理想的には、ターゲティング及び編集は、関連する細胞に指向される。他の細胞における切断は、特定の細胞及び／または発生段階においてのみ活性なプロモーターの使用によっても防止され得る。追加のプロモーターは、誘導性であり、したがって、ヌクレアーゼがプラスミドとして送達される場合は、一時的に制御され得る。送達されたＲＮＡ及びタンパク質が細胞内に留まる時間量もまた、半減期を変えるために、処置または添加されたドメインを用いて調整され得る。ｉｎ ｖｉｖｏでの処置は、多くの処置工程を排除するが、より低い送達速度は、より高い編集速度を必要とし得る。ｉｎ ｖｉｖｏでの治療は、ｅｘ ｖｉｖｏでの治療、ならびに既存の脳回路へのニューロン及びグリア細胞の生着及び生着後の、適切な統合からの問題及び損失を排除し得る。
【0193】
ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子治療の利点は、治療薬の製造及び投与が容易なことであり得る。同じ治療アプローチ及び治療は、例えば、同じまたは類似の遺伝子型または対立遺伝子を共有する多数の患者など、複数の患者を治療するために使用される可能性を有する。対照的に、ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞療法は、典型的には、患者の自身の細胞を使用することを必要とし、それは単離され、操作され、そして同じ患者に戻される。
【0194】
ゲノム編集により細胞内のＳＣＮ１０Ａ遺伝子を編集するための細胞方法も本明細書に提供される。例えば、細胞は、患者または動物から単離され得る。次いで、本明細書に記載の材料及び方法を用いて、細胞の染色体ＤＮＡが編集され得る。
【0195】
本明細書で提供される方法は、細胞方法、またはｅｘ ｖｉｖｏでの方法もしくはｉｎ ｖｉｖｏでの方法のいずれであるかにかかわらず、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列の内またはその近傍に、１つ以上の挿入、欠失または突然変異を導入することにより、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の発現を低減（ノックダウン）または排除（ノックアウト）することを含み得る。
【0196】
例えば、ノックダウンまたはノックアウトの戦略は、不正確なＮＨＥＪ修復経路に起因して生じる、ランダムな挿入または欠失（インデル）を導入することによって、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子内のリーディングフレームを破壊することを含み得る。これは、１つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡ）を用いて、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子内の１つの一本鎖切断もしくは二本鎖切断、または２つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ及び２つ以上のｓｇＲＮＡを用いて、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子内の２つ以上の一本鎖切断もしくは二本鎖切断を誘導することによって達成され得る。このアプローチは、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子に対して、sｇＲＮＡの開発及び最適化を必要とし得る。
【0197】
あるいは、ノックダウンまたはノックアウトの戦略はまた、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列の内またはその近傍に、１つ以上のセグメントの欠失も含み得る。この欠失の戦略は、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子内またはその近傍の２つの異なる部位に結合することができる、少なくとも一対のｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはsｇＲＮＡ）、及び１つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを必要とする。２つのｇＲＮＡで構成されたＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、所望の位置で２つの二本鎖切断を誘導する。切断後、前記２つの末端は、平滑であるかオーバーハングを有するかにかかわらず、ＮＨＥＪによって連結され得、介在セグメントの欠失をもたらす。ＮＨＥＪの修復経路は、前記接合箇所において、挿入、欠失または突然変異を引き起こす可能性がある。
【0198】
上記のゲノム編集の戦略に加えて、別の戦略は、調節配列内で編集することによって、ＳＣＮ１０Ａの発現、機能または活性を調節することを含む。
【0199】
上記の編集オプションに加えて、Ｃａｓ９または同様のタンパク質は、編集のために同定され得る同じ標的部位、またはエフェクタードメインの範囲内のさらなる標的部位に、エフェクタードメインを標的化するために使用され得る。様々なクロマチン修飾酵素、メチラーゼまたはデメチラーゼは、標的遺伝子の発現を変えるために使用され得る。１つの可能性は、突然変異が望ましくない活性をもたらす場合に、ＳＣＮ１０Ａタンパク質の発現を減少させることである。これらの種類のエピジェネティックの制御は、特に、それらが起こり得るオフターゲットの効果が限られているので、いくつかの利点を有する。
【0200】
多くの種類のゲノム標的部位は、コード配列及びスプライシング配列に加えて存在し得る。
【0201】
転写及び翻訳の調節は、細胞タンパク質またはヌクレオチドと相互作用する多数の異なるクラスの部位を意味する。転写因子または他のタンパク質のＤＮＡ結合部位は、その部位の役割を研究するために、突然変異または欠失の標的となることが多いが、それらは、また、遺伝子発現を変化させるためにターゲティングされ得る。部位は、非相同性末端結合ＮＨＥＪまたは相同性配向型修復（ＨＤＲ）による直接的なゲノム編集によって付加され得る。ゲノム配列決定、ＲＮＡの発現、及び転写因子結合のゲノムワイドな研究の使用の増加は、前記部位が発生または一時的な遺伝子調節につながる方法を同定するために、我々の能力を高めた。これらの制御システムは、直接的なものでも、複数のエンハンサーからの活性の統合を必要とし得る広範囲の協調的な制御を伴うものでもよい。転写因子は、通常６～１２ｂｐ長の縮重ＤＮＡ配列に結合する。個々の部位によって提供される低レベルの特異性は、複雑な相互作用及び規則が結合及び機能的な結果に関与していることを示唆している。縮重の少ない結合部位は、より単純な調節手段を提供し得る。人工転写因子は、ゲノム中のより少ない類似した配列を有し、オフターゲットの切断のために低い可能性を有する、より長い配列を特定するように設計され得る。これらのタイプの結合部位のいずれも、遺伝子調節または発現における変化を可能にするために、突然変異、欠失、または創製さえされ得る（Ｃａｎｖｅｒ，Ｍ.Ｃ.ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１５））。
【0202】
これらの特徴を有する遺伝子制御領域の他のクラスは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位である。ｍｉＲＮＡは、転写後の遺伝子調節において重要な役割を果たすノンコーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、すべての哺乳動物のタンパク質をコードする遺伝子の３０％の発現を調節し得る。二本鎖ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）による特異的かつ強力な遺伝子サイレンシング、さらに追加の小さな非コードＲＮＡが発見された（Ｃａｎｖｅｒ，Ｍ．Ｃ.ｅｔ ａｌ.,Ｎａｔｕｒｅ（２０１５））。遺伝子サイレンシングに重要な最大クラスの非コードＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである。哺乳動物では、ｍｉＲＮＡは、最初に長いＲＮＡ転写産物として転写され、別々の転写単位、タンパク質イントロンの一部、または他の転写産物であり得る。長い転写産物は、不完全に塩基対を形成したヘアピン構造を含む一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる。これらのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、Ｄｒｏｓｈａを含む、核内のタンパク質複合体であるマイクロプロセッサによって、１つ以上のより短い前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）に切断され得る。
【0203】
ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、長さ約７０ヌクレオチドの短いステムループであり、成熟した１９～２５ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊二本鎖に運ばれる２－ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。より低い塩基対を形成する安定性を有するｍｉＲＮＡ鎖（ガイド鎖）は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）にロードされ得る。パッセンジャー鎖（＊印）は、機能され得るが、通常は分解される。成熟ｍｉＲＮＡは、主に、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内に見出される標的ｍＲＮＡにおいて、部分的に相補的な配列モチーフにＲＩＳＣをつなぎ、転写後の遺伝子サイレンシングを誘導する（Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．Ｃｅｌｌ １３６，２１５－２３３（２００９）；Ｓａｊ，Ａ.＆Ｌａｉ,Ｅ.Ｃ.Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ２１,５０４－５１０（２０１１））。
【0204】
ｍｉＲＮＡは、発生、分化、細胞周期、及び成長制御において、そして哺乳動物及び他の多細胞生物における実質的にすべての生物学的経路において、重要であり得る。ｍｉＲＮＡはまた、細胞周期の制御、アポトーシス、及び幹細胞の分化、造血、低酸素、筋肉発生、神経発生、インスリン分泌、コレステロール代謝、老化、ウイルス複製、及び免疫応答にも関与し得る。
【0205】
単一のｍｉＲＮＡは、数百の異なるｍＲＮＡ転写物をターゲティングし得るが、個々のｍｉＲＮＡ転写物は、多くの異なるｍｉＲＮＡによってターゲティングされ得る。最新リリースのｍｉＲＢａｓｅ（v.２１）には、２８６４５を超えるマイクロＲＮＡがアノテーションされている。いくつかのｍｉＲＮＡは、複数の遺伝子座によってコードされ得、そのうちのいくつかは、タンデムに同時転写されたクラスターから発現され得る。前記特徴により、複数の経路及びフィードバック制御を備えた複雑な制御ネットワークが可能になる。ｍｉＲＮＡは、これらのフィードバック及び調節回路の不可欠な部分であり得、そしてタンパク質産生を制限内に維持することによって遺伝子発現を調節するのを助け得る（Ｈｅｒｒａｎｚ,Ｈ.＆Ｃｏｈｅｎ,Ｓ.Ｍ.Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２４,１３３９－１３４４（２０１０）；Ｐｏｓａｄａｓ,Ｄ.Ｍ.＆ Ｃａｒｔｈｅｗ,Ｒ.Ｗ.Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ２７,１－６（２０１４））。
【0206】
ｍｉＲＮＡはまた、異常なｍｉＲＮＡ発現に関連する多数のヒトの疾患において重要であり得る。この関連付けは、前記ｍｉＲＮＡの制御経路の重要性を強調している。最近のｍｉＲＮＡ欠失の研究は、ｍｉＲＮＡを免疫応答の調節と関連付けている（Ｓｔｅｒｎ－Ｇｉｎｏｓｓａｒ,Ｎ.ｅｔ ａｌ.,Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１７,３７６－３８１（２００７））。
【0207】
ｍｉＲＮＡはまた、癌と強い関連があり、異なる種類の癌において役割を果し得る。ｍｉＲＮＡは、多くの腫瘍でダウンレギュレーションされることが分かっている。ｍｉＲＮＡは、細胞周期制御やＤＮＡ損傷応答などの主要な癌関連経路の調節に重要となり得、したがって、診断に使用され得、臨床的にターゲティングされ得る。マイクロＲＮＡは、すべてのマイクロＲＮＡを枯渇させる実験が腫瘍血管形成を抑制するように、血管形成のバランスを微妙に制御し得る（Ｃｈｅｎ,Ｓ.ｅｔ ａｌ.,Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２８,１０５４－１０６７（２０１４））。
【0208】
タンパク質をコードする遺伝子について示されているように、ｍｉＲＮＡ遺伝子はまた、癌に伴って起こるエピジェネティックな変化を受ける可能性がある。多くのｍｉＲＮＡ遺伝子座は、ＤＮＡメチル化による制御についてそれらの機会を増大させるＣｐＧアイランドと関連付けさせ得る（Ｗｅｂｅｒ,Ｂ.,Ｓｔｒｅｓｅｍａｎｎ,Ｃ.,Ｂｒｕｅｃｋｎｅｒ,Ｂ.＆ Ｌｙｋｏ,Ｆ.Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ６,１００１－１００５（２００７））。大部分の研究は、エピジェネティックにサイレンスしたｍｉＲＮＡを明らかにするために、クロマチン再構成薬を用いた治療を使用してきた。
【0209】
ＲＮＡサイレンシングにおけるそれらの役割に加えて、ｍｉＲＮＡも翻訳を活性化し得る（Ｐｏｓａｄａｓ,Ｄ.Ｍ.＆ Ｃａｒｔｈｅｗ,Ｒ.Ｗ.Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ２７,１－６（２０１４））。ｍｉＲＮＡ部位をノックアウトすると、標的遺伝子の発現が減少し得るが、これらの部位を導入すると発現が増加し得る。
【0210】
個々のｍｉＲＮＡは、結合特異性について重要であり得るシード配列（マイクロＲＮＡの２～８塩基）を変異させることによって、最も効果的にノックアウトされ得る。この領域での切断、それに続くＮＨＥＪによる誤修復は、標的部位への結合を遮断することによって、ｍｉＲＮＡ機能を効果的に無効にし得る。ｍｉＲＮＡは、パリンドローム配列に隣接する特別なループ領域の特異的な標的化によっても阻害され得る。触媒的に不活性なＣａｓ９も、ｓｈＲＮＡ発現を阻害するために使用され得る（Ｚｈａｏ,Ｙ.ｅｔ ａｌ.,Ｓｃｉ Ｒｅｐ ４,３９４３（２０１４））。ｍｉＲＮＡをターゲティングすることに加えて、前記結合部位はまた、ｍｉＲＮＡによるサイレンシングを防ぐためにターゲティングされ、突然変異させられ得る。
【0211】
本開示によれば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）またはそれらの結合部位のいずれも本発明の組成物に組み込まれ得る。
【0212】
組成物は、限定されるものではないが、配列番号６３２～４７１５に記載のマイクロＲＮＡのいずれかの配列を含む領域、配列番号６３２～４７１５に記載のマイクロＲＮＡの逆相補体、または配列番号６３２～４７１５に記載のマイクロＲＮＡのいずれかのマイクロＲＮＡアンチシード領域などの領域を有し得る。
【0213】
本開示の組成物は、１つ以上のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列、またはマイクロＲＮＡシードを含み得る。そのような配列は、米国特許出願公開第２００５／０２６１２１８号及び米国特許出願公開第２００５／００５９００５号に教示されているものなどの、任意の既知のマイクロＲＮＡに対応し得る。非限定的な例として、ヒトゲノムにおける既知のマイクロＲＮＡ、それらの配列及びそれらの結合部位の配列は、配列番号６３２～４７１５に列挙されている。
【0214】
マイクロＲＮＡ配列は、「シード」配列、すなわち、成熟マイクロＲＮＡの２～８位の領域内の配列を含み、この配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列に対して完全なワトソン－クリックの相補性を有する。マイクロＲＮＡシードは、成熟マイクロＲＮＡの２～８位または２～７位を含み得る。いくつかの態様において、マイクロＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡの２～８ヌクレオチド）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補的部位は、１位のマイクロＲＮＡとは反対側のアデニン（Ａ）に隣接される。いくつかの態様において、マイクロＲＮＡシードは、６ヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡの２～７ヌクレオチド）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補的部位は、１位のマイクロＲＮＡとは反対側のアデニン（Ａ）に隣接される。例えば、Ｇｒｉｍｓｏｎ Ａ,Ｆａｒｈ ＫＫ,Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＷＫ,Ｇａｒｒｅｔｔ－Ｅｎｇｅｌｅ Ｐ,Ｌｉｍ ＬＰ,Ｂａｒｔｅｌ ＤＰ；Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ.２００７ Ｊｕｌ ６；２７（１）：９１－１０５を参照されたい。マイクロＲＮＡシードの塩基は、標的配列と完全に相補的である。
【0215】
マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ標的領域、ならびにそれらの発現パターン及び生物学における役割の同定が報告されている（Ｂｏｎａｕｅｒ ｅｔ ａｌ.,Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２０１０ １１：９４３－９４９；Ａｎａｎｄ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１ １８：１７１－１７６；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ａｎｄ Ｒａｏ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２０１２ ２６：４０４－４１３（２０１１ Ｄｅｃ ２０.ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ.２０１１．３５６）；Ｂａｒｔｅｌ Ｃｅｌｌ ２００９ １３６：２１５－２３３；Ｌａｎｄｇｒａｆ ｅｔ ａｌ,Ｃｅｌｌ,２００７ １２９：１４０１－１４１４；Ｇｅｎｔｎｅｒ ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ,Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ.２０１２ ８０：３９３－４０３）。
【0216】
例えば、前記組成物が肝臓に送達されることを意図されずにそれで終わる場合、次いで、肝臓に豊富に存在するマイクロＲＮＡであるｍｉＲ－１２２は、ｍｉＲ－１２２の１つまたは複数の標的部位がその標的配列をコードするポリヌクレオチド中に操作される場合に、送達される配列の発現を阻害し得る。異なるマイクロＲＮＡについての１つまたは複数の結合部位の導入は、寿命、安定性、及びタンパク質翻訳をさらに減少させるように操作され得、それ故にさらなる耐久性の層を提供する。
【0217】
本明細書で使用されるとき、用語「マイクロＲＮＡ部位」は、マイクロＲＮＡ標的部位もしくはマイクロＲＮＡ認識部位、またはマイクロＲＮＡが結合または会合する任意のヌクレオチド配列のことをいう。「結合」は、伝統的なワトソン－クリックのハイブリダイゼーション法則に従ってもよいし、またはマイクロＲＮＡとマイクロＲＮＡ部位またはその近傍の標的配列との任意の安定な会合を反映してもよいことを理解されたい。
【0218】
逆に、本開示の組成物の目的のために、マイクロＲＮＡ結合部位は、特定の組織におけるタンパク質発現を増加させるために、それらが天然に存在する配列から設計され得る（すなわち、そこから除去され得る）。
【0219】
具体的には、マイクロＲＮＡは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞及びマクロファージ）、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞などの免疫細胞（造血細胞ともいう）において、差次的に発現されることが知られている。免疫細胞特異的なマイクロＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染に対する免疫応答、炎症、ならびに遺伝子治療及び組織／臓器移植後の望ましくない免疫応答に関与している。免疫細胞特異的なマイクロＲＮＡはまた、造血細胞（免疫細胞）の発生、増殖、分化及びアポトーシスの多くの局面を調節する。例えば、ｍｉＲ－１４２及びｍｉＲ－１４６は、免疫細胞において排他的に発現され、特に、骨髄性樹状細胞において豊富に発現される。本開示のポリペプチドの３’－ＵＴＲへのｍｉＲ－１４２結合部位の導入は、ｍｉＲ－１４２媒介ｍＲＮＡ分解を介して抗原提示細胞における遺伝子発現を選択的に抑制し得、専門ＡＰＣ（例えば、樹状細胞）における抗原提示を制限し、それにより、遺伝子送達後の抗原媒介性免疫応答を妨げる（Ａｎｎｏｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ.,ｂｌｏｏｄ,２００９,１１４,５１５２-５１６１を参照されたい。）。
【0220】
１つの例において、免疫細胞、特に、抗原提示細胞において発現されることが知られているマイクロＲＮＡ結合部位は、マイクロＲＮＡ媒介性のＲＮＡ分解を介して、ＡＰＣにおけるポリヌクレオチドの発現を抑制するために、ポリヌクレオチドに操作され、抗原媒介性免疫応答を抑制し得、一方、ポリヌクレオチドの発現は、免疫細胞特異的マイクロＲＮＡが発現されない非免疫細胞において維持される。
【0221】
様々な癌細胞／組織及び他の疾患におけるマイクロＲＮＡの差次的発現を概説するために、多くのマイクロＲＮＡ発現の研究が行われており、当該分野において記載されている。いくつかのマイクロＲＮＡは、特定の癌細胞において異常に過剰発現され、他のものは低発現される。例えば、マイクロＲＮＡは、癌細胞において差次的に発現される（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＵＳ２０１３／００５９０１５、ＵＳ２０１３／００４２３３３、ＷＯ２０１１／１５７２９４）；癌幹細胞（ＵＳ２０１２／００５３２２４）；膵臓癌及び疾患（ＵＳ２００９／０１３１３４８、ＵＳ２０１１／０１７１６４６、ＵＳ２０１０／０２８６２３２、ＵＳ８３８９２１０）；喘息及び炎症（ＵＳ８４１５０９６）；前立腺癌（ＵＳ２０１３／００５３２６４）；肝細胞癌（ＷＯ２０１２／１５１２１２、ＵＳ２０１２／０３２９６７２、ＷＯ２００８／０５４８２８、ＵＳ８２５２５３８）；肺癌細胞（ＷＯ２０１１／０７６１４３、ＷＯ２０１３／０３３６４０、ＷＯ２００９／０７０６５３、ＵＳ２０１０／０３２３３５７）；皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＷＯ２０１３／０１１３７８）；結腸直腸癌細胞（ＷＯ２０１１／０２８１７５６、ＷＯ２０１１／０７６１４２）；癌陽性リンパ節（ＷＯ２００９／１００４３０、ＵＳ２００９／０２６３８０３）；鼻咽頭癌（ＥＰ２１１２２３５）；慢性閉塞性肺疾患（ＵＳ２０１２／０２６４６２６、ＵＳ２０１３／００５３２６３）、甲状腺癌（ＷＯ２０１３／０６６６７８）；卵巣癌細胞（ＵＳ２０１２／０３０９６４５、ＷＯ２０１１／０９５６２３）；乳癌細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＷＯ２００７／０８１７４０、ＵＳ２０１２／０２１４６９９）、白血病及びリンパ腫（ＷＯ２００８／０７３９１５、ＵＳ２００９／００９２９７４、ＵＳ２０１２／０３６０８１、ＵＳ２０１２／０２８３３１０、ＷＯ２０１０／０１８５６３）。
【0222】
マイクロＲＮＡ配列、ならびに標的組織及び／または細胞の非限定的な例は、配列番号６３２～４７１５に開示されている。
【0223】
ゲノム工学戦略
いくつかの態様において、本開示の方法は、一方または両方の対立遺伝子を編集することを含み得る。対立遺伝子（複数可）を改変するための遺伝子編集は、標的遺伝子または遺伝子産物を恒久的に改変するという利点を有する。
いくつかの態様において、本開示の方法は、一方または両方の対立遺伝子を編集することを含み得る。対立遺伝子（複数可）を改変するための遺伝子編集は、標的遺伝子または遺伝子産物を恒久的に改変するという利点を有する。
【0224】
本開示のｅｘ ｖｉｖｏでの方法の工程は、ゲノム工学を用いて、患者から単離された末梢神経系の細胞（例えば、神経内のシュワン細胞または神経節内のサテライトグリア細胞などのニューロンまたはグリア細胞）を編集することを含み得る。あるいは、本開示のｅｘ ｖｉｖｏでの方法の工程は、患者特異的なｉＰＳＣまたは間葉系幹細胞を編集することを含み得る。同様に、本開示のｉｎ ｖｉｖｏでの方法の工程は、ゲノム工学を用いて、疼痛を患う患者の細胞を編集することを含む。同様に、本開示の細胞方法における工程は、ゲノム工学によって、ヒト細胞におけるＳＣＮ１０Ａ遺伝子を編集することを含み得る。
【0225】
任意のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼが本開示の方法において使用され得、各ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、それ自体の関連するＰＡＭを有し、これは、疾患特異的であってもなくてもよい。
【0226】
例えば、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の発現は、不正確なＮＨＥＪ修復経路に起因して生じるランダムな挿入または欠失（インデル）を導入することによって、破壊または排除され得る。標的領域は、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子のコード配列（すなわち、エキソン）であってもよい。遺伝子のコード配列へのヌクレオチドの挿入または欠失は、通常の３文字コドンパターンが乱される「フレームシフト」を引き起こす可能性がある。このようにして、遺伝子発現、ひいてはタンパク質産生は、減少または排除され得る。このアプローチはまた、配列の変化がＳＣＮ１０Ａ遺伝子の発現を妨害し得るＳＣＮ１０Ａ遺伝子の任意のイントロン、イントロン：エキソン接合部、または調節ＤＮＡエレメントをターゲティングするためにも使用され得る。
【0227】
別の例として、ＮＨＥＪはまた、直接的に、またはいくつかの位置をターゲティングする１つのｇＲＮＡまたはいくつかのｇＲＮＡによる切断を通して、スプライスドナーまたはアクセプター部位を変更することによってのいずれかで、遺伝子のセグメントを欠失させるために使用され得る。これは、小さなランダムインデルが標的遺伝子をノックアウトするのに非効率的である場合に役立ち得る。この種の欠失には、一対のｇＲＮＡが使用されてきた。
【0228】
ドナーが存在しない場合、ＤＮＡ切断からの末端または異なる切断からの末端は、ＤＮＡ末端が接合部でほとんどまたは全く塩基対合なしに接合される、いくつかの非相同修復経路を用いて連結され得る。正規のＮＨＥＪに加えて、ａｌｔ－ＮＨＥＪなどの同様の修復メカニズムがある。２つの切れ目がある場合は、間にあるセグメントは、削除または反転され得る。ＮＨＥＪの修復経路は、前記ジョイントで挿入、欠失または突然変異を引き起こす可能性がある。
【0229】
ＮＨＥＪはまた、相同性非依存的な標的の組込みをもたらし得る。例えば、ドナーのプラスミド上のヌクレアーゼ標的部位の包含は、ドナー及び染色体の両方のｉｎ ｖｉｖｏでのヌクレアーゼ切断後の、導入遺伝子の染色体二本鎖切断への組込みを促進し得る（Ｃｒｉｓｔｅａ.,Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ.２０１３ Ｍａｒ；１１０（３）：８７１－８０）。ＮＨＥＪは、ヌクレアーゼ切断後に、１５ｋｂの誘導性遺伝子発現カセットをヒト細胞株の規定の遺伝子座に挿入するために使用された。（例えば、Ｍａｒｅｓｃａ,Ｍ.,Ｌｉｎ,Ｖ.Ｇ.,Ｇｕｏ,Ｎ.＆Ｙａｎｇ,Ｙ.,Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２３,５３９－５４６（２０１３）；Ｃｒｉｓｔｅａ ｅｔ ａｌ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２０１３；Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ.Ｎａｔｕｒｅ,５４０,１４４－１４９（２０１６）を参照されたい。）。組み込まれた配列は、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子のリーディングフレームを破壊するか、または前記遺伝子の構造を変え得る。
【0230】
さらなる代替として、相同性配向型修復（ＨＤＲ）もまた、遺伝子をノックアウトするかまたは遺伝子機能を改変するために使用され得る。例えば、ＨＤＲノックアウトの戦略は、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子に非機能的または無関係な配列を挿入することによって、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の構造または機能を破壊することを含み得る。これは、細胞的なＤＳＢ応答を相同性配向型修復に指向するために、外因的に導入されたドナーのＤＮＡ鋳型（ドナーのＤＮＡ鋳型は、短い一本鎖オリゴヌクレオチド、短い二本鎖オリゴヌクレオチド、長い一本鎖または二本鎖ＤＮＡ分子であり得る。）の存在下で、１つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ及び２つ以上のｇＲＮＡを有する目的の遺伝子において、１つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ（例えば、ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡ）、または２つ以上の一本鎖切断もしくは二本鎖切断を用いて、目的の遺伝子において、一本鎖切断または二本鎖切断を誘導することによって達成され得る。このアプローチは、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子についてｇＲＮＡ及びドナーのＤＮＡ分子の開発及び最適化を必要とし得る。
【0231】
相同性配向型修復（ＨＤＲ）は、本質的に、ＤＳＢ修復中に供給された相同ＤＮＡ配列を鋳型として使用する、エラーのないメカニズムである。ＨＤＲの速度は、突然変異と切断部位との間の距離の関数であるので、重複または最も近い標的部位を選択することが重要である。鋳型は、相同領域に隣接する追加の配列を含み得、またはゲノム配列とは異なる配列を含み得、したがって配列編集が可能になる。
【0232】
最も一般的な形態のＨＤＲは、相同組換えである。一本鎖アニーリング及び代替ＨＤＲを含むＨＤＲについて、さらなる経路がある。ゲノム工学のツールにより、研究者は、細胞相同組換え経路を操作して、ゲノムに部位特異的修飾を作り出すことができる。細胞は、トランスで提供される合成ドナー分子を用いて、二本鎖切断を修復し得ることが見出された。したがって、特定の突然変異の近くに二本鎖切断を導入し、適切なドナーを提供することによって、標的化された変化がゲノムにおいてなされ得る。特異的な切断は、同種のドナーのみを受けた１０６個の細胞において、ＨＤＲの速度を１の速度よりも１，０００倍以上増加させる。特定のヌクレオチドにおける相同性配向型修復（ＨＤＲ）の速度は、切断部位までの距離の関数であるので、重複または最も近い標的部位を選択することが重要である。インサイチューでの編集は、残りのゲノムを混乱させないままにするので、遺伝子編集は、遺伝子付加よりも有利である。
【0233】
ＨＤＲによる編集のために供給されるドナーは著しく変化するが、ゲノムＤＮＡへのアニーリングを可能にするために、小さいまたは大きい隣接相同性アームを有する意図された配列を含み得る。導入された遺伝的変化に隣接する相同性領域は、３０ｂｐ以下、またはプロモーター、ｃＤＮＡなどを含み得るマルチキロベースのカセットと同じ大きさであり得る。一本鎖及び二本鎖オリゴヌクレオチドのドナーの両方が使用されてきた。より長いｓｓＤＮＡもまた生成されそして使用され得るが、これらのオリゴヌクレオチドは、１００ｎｔ未満から数ｋｂを超えるまでのサイズの範囲である。ＰＣＲアンプリコン、プラスミド、及びミニサークルを含む二本鎖のドナーが使用され得る。一般に、ＡＡＶベクターは、ドナーの鋳型の送達の非常に有効な手段であり得るが、個々のドナーに対するパッケージングの限界は、＜５ｋｂである。ドナーの活発な転写は、３倍ＨＤＲを増加させ、プロモーターの包含が変換を増加させるかもしれないことを示している。逆に、ドナーのＣｐＧのメチル化は、遺伝子発現及びＨＤＲを減少させた。
【0234】
Ｃａｓ９のような野生型エンドヌクレアーゼに加えて、一方または他方のヌクレアーゼドメインが不活性化されて、１つのＤＮＡ鎖のみが切断されるニッカーゼ変異体が存在する。ＨＤＲは、個々のＣａｓニッカーゼから、または標的領域に隣接する一対のニッカーゼを用いて指示され得る。ドナーは、一本鎖、ニックの入った、またはｄｓＤＮＡであり得る。
【0235】
ドナーのＤＮＡは、ヌクレアーゼと共に、または種々の異なる方法により、例えば、トランスフェクション、ナノ粒子、マイクロインジェクション、もしくはウイルス形質導入により独立して供給され得る。ＨＤＲに対するドナーの利用可能性を高めるために、一連のテザリングの選択肢が提案されている。例には、ドナーをヌクレアーゼに結合すること、近くに結合するＤＮＡ結合タンパク質に結合すること、またはＤＮＡ末端結合もしくは修復に関与するタンパク質に結合することが含まれる。
【0236】
修復経路の選択は、細胞周期に影響を与えるものなどの多くの培養条件によって、またはＤＮＡ修復及び関連タンパク質の標的化によって導かれ得る。例えば、ＨＤＲを増加させるために、ＫＵ７０、ＫＵ８０またはＤＮＡリガーゼＩＶなどの重要なＮＨＥＪ分子が抑制され得る。
【0237】
ＮＨＥＪまたはＨＤＲによるゲノム編集に加えて、ＮＨＥＪ経路及びＨＤＲの両方を使用する部位特異的な遺伝子挿入が行われてきた。組み合わせアプローチは、おそらくイントロン／エキソンの境界を含む特定の状況において、適用可能であり得る。ＮＨＥＪは、イントロンでのライゲーションに効果的であることが証明され得るが、エラーのないＨＤＲは、コード領域でより適し得る。
【0238】
ＳＣＮ１０Ａ遺伝子は、表３に示すように、多数のエキソンを含む。リーディングフレームを破壊し、最終的に異常なＳＣＮ１０Ａタンパク質活性を排除する１つ以上のインデルを作製するために、これらのエキソンまたは近くのイントロンのうちの任意の１つ以上がターゲティングされ得る。
【0239】
いくつかの態様において、本方法は、不要な配列に隣接する位置で遺伝子を２回切断することによって欠失を生じるｇＲＮＡ対を提供し得る。この配列は、１つ以上のエキソン、イントロン、イントロン：エキソン接合部、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の調節エレメントをコードする他のＤＮＡ配列、またはそれらの組み合わせを含み得る。切断は、それぞれがゲノム内にＤＳＢを作る一対のＤＮＡエンドヌクレアーゼによって、または一緒になって、ゲノム内にＤＳＢを作る複数のニッカーゼによって達成され得る。
【0240】
あるいは、本方法は、コード配列またはスプライシング配列内に、１つの二本鎖切断を作製するための１つのｇＲＮＡを提供し得る。二本鎖切断は、単一のＤＮＡエンドヌクレアーゼ、または一緒にゲノム中にＤＳＢを作る複数のニッカーゼによって作製され得る。
【0241】
スプライシングドナー及びアクセプターは、一般に、隣接するイントロンの１００塩基対以内にある。いくつかの例では、方法は、対象となる各エキソン／イントロン接合部に対して、約＋／－１００～３１００ｂｐを切断するｇＲＮＡを提供し得る。
【0242】
任意のゲノム編集戦略について、遺伝子編集は、配列決定またはＰＣＲ解析によって確認され得る。
【0243】
標的配列の選択
特定の参照遺伝子座に対する５’境界及び／または３’境界の位置のシフトは、本明細書でさらに説明及び図示されるように、編集のために選択されたエンドヌクレアーゼシステムに部分的に依存する、遺伝子編集の特定の適用を容易にするかまたは高めるために使用され得る。
特定の参照遺伝子座に対する５’境界及び／または３’境界の位置のシフトは、本明細書でさらに説明及び図示されるように、編集のために選択されたエンドヌクレアーゼシステムに部分的に依存する、遺伝子編集の特定の適用を容易にするかまたは高めるために使用され得る。
【0244】
このような標的配列選択の非限定的な第一の例において、多くのエンドヌクレアーゼシステムは、ＣＲＩＳＰＲ ＴｙｐｅＩＩまたはＴｙｐｅ Ｖエンドヌクレアーゼの場合において、ＤＮＡ切断部位に隣接する特定の位置におけるＰＡＭ配列モチーフの必要性などの切断のために、潜在的な標的部位の初期選択を導き得る規則または基準を有する。
【0245】
標的配列の選択または最適化の別の非限定的な例において、標的配列及び遺伝子編集のエンドヌクレアーゼの特定の組み合わせについて、オフターゲット活性の頻度（すなわち、選択された標的配列以外の部位で生じるＤＳＢの頻度）は、オンターゲット活性の頻度と比較して評価され得る。場合によっては、所望の遺伝子座で正しく編集された細胞は、他の細胞と比較して、選択的な利点を有することがある。選択的な利点の例示的であるが非限定的な例としては、複製速度の向上、持続性、特定の条件に対する耐性、患者への導入後のｉｎ ｖｉｖｏでの生着の成功率または持続性の向上などの属性の獲得、及びそのような細胞の維持または増加した数もしくは生存率に関連する他の属性が挙げられる。他の場合では、所望の遺伝子座で正しく編集された細胞は、正しく編集された細胞を同定、分類、または選択するために用いられる１つ以上のスクリーニング方法によって、積極的に選択され得る。選択的な利点及び指向的選択方法の両方とも、変化に関連した表現型が利用され得る。場合によっては、意図された細胞集団を選択または精製するために使用される、新しい表現型を作製する第２の改変を作製するために、細胞は、２回以上編集され得る。そのような第２の修飾は、選択可能またはスクリーニング可能なマーカーの発現を可能にする、第２のｇＲＮＡを付加することによって作製され得る。場合によっては、ｃＤＮＡ及び選択マーカーを含むＤＮＡ断片を用いて、細胞は、所望の遺伝子座で正しく編集され得る。
【0246】
任意の選択的な利点が適用可能であるか、または任意の有向選択が特定の場合に適用されるべきかにかかわらず、標的の配列選択はまた、適用の有効性を高めるため及び／または所望の標的以外の部位で、望ましくない改変の可能性を減少させるために、オフターゲットの周波数の考慮によって導かれ得る。本明細書及び当該技術分野でさらに説明され例示されるように、オフターゲット活性の発生は、標的部位と様々なオフターゲット部位との間の類似性及び非類似性、ならびに使用される特定のエンドヌクレアーゼを含む多数の要因によって影響され得る。オフターゲット活性の予測を支援するバイオインフォマティクスのツールが利用可能であり、そして多くの場合、そのようなツールは、オフターゲット活性の可能性が最も高い部位を同定するためにも使用され得、次いで、これを実験設定で評価して、オフターゲット活性対オンターゲット活性の相対頻度を評価することができ、それにより、より高い相対的オンターゲット活性を有する配列の選択が可能になる。そのような技術の例示的な例は、本明細書に提供されており、他のものは当該技術分野において公知である。
【0247】
標的配列の選択の別の態様は、相同組換えの事象に関する。相同性領域を共有する配列は、介在配列の欠失をもたらす相同組換え事象の焦点として役立ち得る。そのような組換えの事象は、染色体及び他のＤＮＡ配列の通常の複製の過程の間に、また、ＤＮＡ配列が合成されるその他の時間、例えば、二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復の場合のように、通常の細胞複製サイクルの間に定期的に起こるが、種々の事象（紫外線や他のＤＮＡ破壊の誘発物質など）の発生、または特定の薬剤の存在（様々な化学的誘発物質など）によって増強され得る。多くのそのような誘発物質は、ＤＳＢをゲノム中に無差別に発生させ、また、ＤＳＢは、正常細胞において定期的に誘導されそして修復され得る。修復中に、元の配列は、完全な忠実度で再構築され得るが、場合によっては、小さな挿入または欠失（「インデル」という。）がＤＳＢ部位に導入される。
【0248】
また、ＤＳＢは、本明細書に記載のエンドヌクレアーゼシステムの場合のように、特定の位置で特異的に誘導され得、これは選択された染色体位置に指向性または優先的な遺伝子改変事象を引き起こすために使用され得る。相同配列がＤＮＡ修復（ならびに複製）の状況において組換えを受ける傾向は、多くの状況において利用され得て、それは、「ドナー」のポリヌクレオチドの使用により提供される目的の配列を所望の染色体位置に挿入するために、相同性配向型修復が使用されるＣＲＩＳＰＲのような遺伝子編集システムの一つの応用の基礎である。
【0249】
わずか１０塩基対以下を含み得る「ミクロ相同性」の小領域であり得る、特定の配列間の相同性領域もまた、所望の欠失をもたらすために使用され得る。例えば、単一のＤＳＢは、近くの配列とミクロ相同性を示す部位に導入され得る。そのようなＤＳＢの通常の修復過程において、高い頻度で起こる結果は、組換えがＤＳＢ及び付随する細胞修復過程によって促進される結果として、介在配列の欠失である。
【0250】
しかしながら、いくつかの状況において、相同性領域内の標的配列の選択はまた、遺伝子融合を含むはるかに大きな欠失（欠失がコード領域にある場合）を生じさせる可能性があり、これは、特定の状況を考えると望まれる場合と望まない場合とがある。
【0251】
本明細書に提供される実施例はさらに、ＳＣＮ１０Ａタンパク質活性の低下または排除をもたらす挿入、欠失または突然変異を誘導するように設計された、ＤＳＢの作製のための様々な標的領域の選択、ならびにオンターゲットの事象に対してオフターゲットの事象を最小限に抑えるように設計されているそのような領域内の特定の標的配列の選択を例示する。
【0252】
ヒト細胞
本明細書に記載及び例示されるように、ＳＣＮ１０Ａに関連する疼痛または任意の障害を改善するために、遺伝子編集の主な標的はヒト細胞である。例えば、ｅｘ ｖｉｖｏでの方法において、ヒト細胞は、体細胞であり得、それは記載の技術を用いて改変された後、分化した細胞、例えば、末梢神経系のニューロンまたは前駆細胞を生じ得る。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの方法において、ヒト細胞は、末梢神経系のニューロン、または他の罹患器官由来の細胞であり得る。
本明細書に記載及び例示されるように、ＳＣＮ１０Ａに関連する疼痛または任意の障害を改善するために、遺伝子編集の主な標的はヒト細胞である。例えば、ｅｘ ｖｉｖｏでの方法において、ヒト細胞は、体細胞であり得、それは記載の技術を用いて改変された後、分化した細胞、例えば、末梢神経系のニューロンまたは前駆細胞を生じ得る。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの方法において、ヒト細胞は、末梢神経系のニューロン、または他の罹患器官由来の細胞であり得る。
【0253】
必要としている患者に由来し、したがって既に完全に一致している自己細胞において遺伝子編集を行うことによって、前記患者に安全に再導入され得る細胞を生成すること、及び前記患者の疾患に関連する１つ以上の臨床状態を改善するのに有効であろう細胞集団を効果的に生じさせることが可能である。
【0254】
幹細胞は、増殖することができ、そしてより多くの前駆細胞を生じさせることができ、これらは、次に、分化したまたは分化可能な娘細胞を生じさせ得る多数の母細胞を生成する能力を有する。娘細胞自体を増殖させ、続いて、１つ以上の成熟細胞型に分化する子孫を産生させる一方で、親の発生能を有する１つ以上の細胞を保持することもできる。次いで、用語「幹細胞」は、特定の状況下で、より特殊化されたまたは分化した表現型へと分化する能力または可能性を有し、ある状況下で、実質的に分化することなく増殖する能力を保持する細胞のことをいう。１つの態様において、用語前駆細胞または幹細胞は、その子孫（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）（子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ））が、例えば、胚細胞及び組織の漸進的多様化において生じるように、例えば、完全に個々の特徴を獲得することによる分化によって、多くの場合異なる方向に特化する一般化した母細胞のことをいう。細胞分化は、典型的には多くの細胞分裂を通して起こる複雑な過程である。分化細胞は、それ自体が多能性細胞に由来するなど、多能性細胞に由来し得る。これらの多分化能性細胞のそれぞれは幹細胞と見なされ得るが、それぞれが生じ得る細胞型の範囲はかなり異なり得る。いくつかの分化細胞はまた、より大きな発生可能性の細胞を生じさせる能力を有する。そのような能力は、天然のものでもよく、または様々な因子による治療の際に人工的に誘発されてもよい。多くの生物学的な事例において、幹細胞はまた、それらが１つ以上の異なる細胞型の子孫を産生し得るので「多能性」であり得るが、これは「幹細胞性」に必要とされない。
【0255】
自己複製は、幹細胞の別の重要な態様であり得る。理論的には、自己複製は、２つの主要なメカニズムのいずれかによって発生し得る。幹細胞は、一方の娘は幹状態を保持し、他方の娘はいくつかの異なる他の特定の機能及び表現型を発現することを伴い、非対称的に分裂し得る。あるいは、集団内のいくつかの幹細胞は、対称的に２つの幹に分裂し得、したがって、集団内のいくつかの幹細胞を全体として維持しながら、集団内の他の細胞は、分化した子孫のみを生じさせる。一般に、「前駆細胞」は、より原始的な（すなわち、完全に分化した細胞よりも、発生経路または進行に沿ったより早い段階にある。）細胞表現型を有する。多くの場合、前駆細胞はまた、有意なまたは非常に高い増殖能を有する。前駆細胞は、発生経路及び前記細胞が発生し分化する環境に応じて、複数の異なる分化細胞型または単一の分化細胞型を生じさせ得る。
【0256】
細胞の個体発生の状況において、形容詞「分化した」または「分化している」は、相対的な用語である。「分化細胞」は、それが比較されている細胞よりも発生経路に沿ってさらに進行した細胞である。したがって、幹細胞は、系統を限定した前駆細胞（神経前駆細胞など）に分化することができ、前記経路のさらに下流の他の種類の前駆細胞（神経前駆細胞など）に分化し、次いで、特定の組織型において特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持してもしなくてもよい、神経細胞のような最終段階の分化した細胞へ分化し得る。
【0257】
人工多能性幹細胞
本明細書に記載の遺伝子操作されたヒト細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。ｉＰＳＣを用いることの利点は、前記細胞が、前駆細胞が投与されるのと同じ対象に由来し得ることである。すなわち、体細胞は、対象から得られ、人工多能性幹細胞に再プログラム化され、次いで、前記対象に投与されるべき前駆細胞（例えば、自己細胞）に再分化され得る。前駆体は、本質的に自家供給源に由来するので、生着拒絶またはアレルギー反応の危険性は、他の対象または対象群由来の細胞の使用と比較して、減少させ得る。さらに、ｉＰＳＣの使用は、胚供給源から得られた細胞の必要性を否定する。したがって、１つの態様において、開示された方法で使用される幹細胞は、胚性幹細胞ではない。
本明細書に記載の遺伝子操作されたヒト細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり得る。ｉＰＳＣを用いることの利点は、前記細胞が、前駆細胞が投与されるのと同じ対象に由来し得ることである。すなわち、体細胞は、対象から得られ、人工多能性幹細胞に再プログラム化され、次いで、前記対象に投与されるべき前駆細胞（例えば、自己細胞）に再分化され得る。前駆体は、本質的に自家供給源に由来するので、生着拒絶またはアレルギー反応の危険性は、他の対象または対象群由来の細胞の使用と比較して、減少させ得る。さらに、ｉＰＳＣの使用は、胚供給源から得られた細胞の必要性を否定する。したがって、１つの態様において、開示された方法で使用される幹細胞は、胚性幹細胞ではない。
【0258】
分化は、一般に生理学的状況下では不可逆的であるが、体細胞をｉＰＳＣに再プログラム化するためのいくつかの方法が最近開発された。例示的な方法は、当業者に知られており、以下に簡単に説明されている。
【0259】
用語「再プログラミング」は、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態を変化させるかまたは逆転させる過程のことをいう。別の言い方をすれば、再プログラミングとは、細胞の分化をより未分化の、またはより原始的なタイプの細胞に逆行させる過程のことをいう。多くの初代細胞培養細胞を培養すると、完全に分化した特徴がある程度失われる可能性があることに注意されたい。したがって、分化細胞という用語に含まれるそのような細胞を単に培養することは、これらの細胞を分化していない細胞（例えば、未分化細胞）または多能性細胞にしない。分化細胞の多能性への移行は、培養において分化した特徴の部分的な喪失をもたらす刺激を超える再プログラミングの刺激を必要とする。再プログラム化された細胞はまた、一般に培養中の限られた数の分裂に対してのみ能力を有する、初代細胞の親と比較して、増殖能力を失うことなく継代を延長する能力の特徴を有する。
【0260】
再プログラム化された細胞は、再プログラミングの前に部分的にまたは最終的に分化させ得る。再プログラミングは、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態の多能性状態または多分化性状態への完全な復帰を包含し得る。再プログラミングは、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態の未分化細胞（例えば、胚様細胞）への完全または部分的な復帰状態を包含し得る。再プログラミングは、細胞による特定の遺伝子の発現をもたらし得、その発現はさらに再プログラミングに寄与する。本明細書に記載の特定の例では、分化細胞（例えば、体細胞）の再プログラミングは、分化細胞を未分化状態とすることができる（例えば、未分化細胞である。）。得られた細胞は、「再プログラム化された細胞」または「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣまたはｉＰＳ細胞）」という。
【0261】
再プログラミングは、細胞分化の間に起こる核酸修飾（例えば、メチル化）、クロマチン凝縮、エピジェネティックな変化、ゲノムインプリンティングなどの遺伝的パターンの少なくともいくつかの変化、例えば反転を含み得る。再プログラミングは、既に多能性である細胞の既存の未分化状態を単に維持すること、または既に多分化能細胞である細胞（例えば、筋原性幹細胞）の既存の完全に分化していない状態を維持することとは異なる。いくつかの例において、本明細書に記載の組成物及び方法もそのような目的に有用であり得るが、再プログラミングは、既に多能性または多分化能である細胞の自己複製または増殖の促進とも異なる。
【0262】
体細胞から多能性幹細胞を生成するために使用され得る多くの方法が当該技術分野において公知である。体細胞を多能性表現型に再プログラム化する任意のそのような方法は、本明細書に記載の方法における使用に適切である。
【0263】
定義された組み合わせの転写因子を用いて、多能性細胞を生成するための再プログラミング方法論が記載されている。マウス体細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ－Ｍｙｃの直接の形質導入によって、発生能が拡大したＥＳ細胞様細胞に変換され得る。例えばＴａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ １２６（４）：６６３－７６（２００６）を参照されたい。ｉＰＳＣは、多能性関連の転写回路及び多くのエピジェネティックランドスケープを修復するので、ＥＳ細胞に似ている。さらに、マウスｉＰＳＣは、多能性についてのすべての標準的アッセイ、具体的には、３つの胚葉の細胞型へのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化、奇形腫形成、キメラへの寄与、生殖系列伝達［例えば、Ｍａｈｅｒａｌｉ ａｎｄ Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ,Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ.３（６）：５９5－６０５（２００８）を参照されたい。］、及び四倍体相補性を満たす。
【0264】
ヒトｉＰＳＣは、同様の形質導入方法を用いて得ることができ、転写因子トリオ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、及びＮＡＮＯＧは、多能性を支配する転写因子のコアセットとして確立されている。例えば、Ｂｕｄｎｉａｔｚｋｙ ａｎｄ Ｇｅｐｓｔｅｉｎ,Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ.３（４）：４４８－５７（２０１４）；Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ.,Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ ３：１－６ ｓｃｔｍ.２０１４－０１２１（２０１４）；Ｆｏｃｏｓｉ ｅｔ ａｌ.,Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ４：ｅ２１１（２０１４）；及びそこに引用されている参考文献を参照されたい。ｉＰＳＣの産生は、歴史的にはウイルスベクターを用いて、幹細胞関連遺伝子をコードする核酸配列を成体の体細胞に導入することによって達成され得る。
【0265】
ｉＰＳＣは、成体幹細胞または体性幹細胞と同様に、最終分化した体細胞からも生成または誘導され得る。すなわち、非多能性前駆細胞は、再プログラミングによって、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）または多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）にすることができる。そのような場合、最終分化細胞を再プログラム化するのに必要な数の再プログラム化因子を含める必要はないかもしれない。さらに、再プログラミングは、例えば、タンパク質自体を導入することによって、または再プログラミング因子をコードする核酸を導入することによって、または翻訳時に再プログラミング因子を産生するメッセンジャーＲＮＡを導入することによって、再プログラミング因子の非ウイルス導入によって誘導され得る（例えば、Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ.,Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，７（５）：６１８－３０（２０１０）を参照されたい。）。再プログラミングは、例えば、Ｏｃｔ－４（Ｏｃｔ-３／４またはＰｏｕｆ５１としても知られている。）、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１８、ＮＡＮＯＧ、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、ＮＲ５Ａ２、ｃ－Ｍｙｃ、1－Ｍｙｃ、ｎ－Ｍｙｃ、Ｒｅｍ２、Ｔｅｒｔ、及びＬＩＮ２８を含む幹細胞関連遺伝子をコードする核酸の組み合わせを導入することによって達成され得る。本明細書に記載の方法及び組成物を用いた再プログラミングは、体細胞へのＯｃｔ－３／４、Ｓｏｘファミリーのメンバー、Ｋｌｆファミリーのメンバー、及びＭｙｃファミリーのメンバーのうちの１つ以上の導入をさらに含み得る。本明細書に記載の方法及び組成物は、再プログラミングについてＯｃｔ－４、Ｓｏｘ２、ＮＡＮＯＧ、ｃ－Ｍｙｃ及びＫｌｆ４のそれぞれの１つ以上を導入することをさらに含み得る。上記のように、再プログラミングに用いられる正確な方法は、本明細書に記載の方法及び組成物にとって必ずしも重要ではない。しかしながら、再プログラム化された細胞から分化した細胞が、例えばヒトの治療において用いられることになっている場合、１つの態様において、再プログラミングは、ゲノムを変える方法によって影響をもたらさせない。したがって、そのような例では、再プログラミングは、例えば、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターを用いずに達成させ得る。
【0266】
開始細胞の集団に由来する再プログラミングの効率（すなわち、再プログラム化された細胞の数）は、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ.,Ｃｅｌｌ－Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２：５２５－５２８（２００８）；Ｈｕａｎｇｆｕ ｅｔ ａｌ.,Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６（７）：７９５－７９７（２００８） ａｎｄ Ｍａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ.,Ｃｅｌｌ－Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ３：１３２－１３５（２００８）によって示されるように、様々な薬剤（例えば、小分子）の添加によって増強され得る。したがって、人工多能性幹細胞産生の効率または速度を増強する薬剤または薬剤の組み合わせは、患者特異的または疾患特異的なｉＰＳＣの産生に使用され得る。再プログラミング効率を高める薬剤のいくつかの非限定的な例には、可溶性Ｗｎｔ、Ｗｎｔ馴化培地、ＢＩＸ－０１２９４（Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ）、ＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、バルプロ酸、５’－アザシチジン、デキサメタゾン、スベロイルアニリド、ヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、ビタミンＣ、及びトリコスタチン（ＴＳＡ）などが挙げられる。
【0267】
再プログラミング促進剤の他の非限定的な例としては、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ（例えば、ＭＫ０６８３、ボリノスタット）及び他のヒドロキサム酸）、ＢＭＬ－２１０、デプデシン（例えば、（－）－デプデシン）、ＨＣ毒素、ヌルスクリプト（４－（１，３－ジオキソ－１Ｈ、３Ｈ－ベンゾ［デ］イソキノリン－２－イル）－Ｎ－ヒドロキシブタンアミド）、フェニルブチレート（例えば、フェニルブチレートナトリウム）及びバルプロ酸（（ＶＰＡ）及び他の短鎖）脂肪酸）、スクリプタイド、スラミンナトリウム、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ＡＰＨＡ化合物８、アピシジン、酪酸ナトリウム、ピバロイルオキシメチルブチレート（Ｐｉｖａｎｅｘ、ＡＮ－９）、トラポキシンＢ、クラミドシン、デプシペプチド（ＦＲ９０１２２８またはＦＫ２２８としても知られる。）、ベンズアミド（例えば、ＣＩ－９９４（例えば、Ｎ－アセチルジナリン）及びＭＳ－２７－２７５）、ＭＧＣＤ０１０３、ＮＶＰ－ＬＡＱ－８２４、ＣＢＨＡ（ｍ－カルボキシシンナミン酸ビスヒドロキサム酸）、ＪＮＪ１６２４１１９９、ツバシン、Ａ－１６１９０６、プロキサミド、オキサムフラチン、３－Ｃｌ－ＵＣＨＡ（例えば、６－（３－クロロフェニルウレイド）カプロン酸ヒドロキサム酸）、ＡＯＥ（２－アミノ－８－オキソ－９，１０－エポキシデカン酸）、ＣＨＡＰ３１、及びＣＨＡＰ５０が挙げられる。他の再プログラミング促進剤としては、例えば、ＨＤＡＣのドミナントネガティブ形態（例えば、触媒的に不活性な形態）、ＨＤＡＣのｓｉＲＮＡ阻害剤、及びＨＤＡＣに特異的に結合する抗体が挙げられる。そのような阻害剤は、例えば、ＢＩＯＭＯＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｆｕｋａｓａｗａ、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｔｉｔａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＭｅｔｈｙｌＧｅｎｅ、及びＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である。
【0268】
本明細書に記載の方法で使用するための多能性幹細胞の誘導を確認するために、単離されたクローンは、幹細胞マーカーの発現について試験され得る。体細胞由来の細胞におけるそのような発現は、その細胞を人工多能性幹細胞として同定する。幹細胞マーカーは、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ９、Ｎａｎｏｇ、Ｆｂｘｌ５、Ｅｃａｔ１、ＥＳｇｌ、Ｅｒａｓ、Ｇｄｆ３、Ｆｇｆ４、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｄａｘ１、Ｚｐｆ２９６、Ｓｌｃ２ａ３、Ｒｅｘ１、Ｕｔｆｌ、及びＮａｔｌを含む非限定的な群から選択され得る。１つの例において、例えば、Ｏｃｔ４またはＮａｎｏｇを発現する細胞は、多能性として同定される。そのようなマーカーの発現を検出するための方法には、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ及びコードされたポリペプチドの存在を検出する免疫学的方法、例えば、ウエスタンブロット法またはフローサイトメトリー解析が含まれ得る。検出は、ＲＴ－ＰＣＲだけでなく、タンパク質マーカーの検出も含み得る。細胞内マーカーは、ＲＴ－ＰＣＲ、または免疫細胞化学などのタンパク質検出方法によって最もよく同定され得るが、細胞表面マーカーは、例えば、免疫細胞化学によって容易に同定される。
【0269】
単離された細胞の多能性幹細胞の特徴は、ｉＰＳＣが３つの胚葉のそれぞれの細胞に分化する能力を評価する試験によって確認され得る。１つの例として、ヌードマウスにおける奇形腫形成は、単離されたクローンの多能性を評価するために使用され得る。前記細胞は、ヌードマウスに導入され得、組織学及び／または免疫組織化学は、前記細胞から生じる腫瘍に対して行われ得る。例えば、３つすべての胚葉由来の細胞を含む腫瘍の増殖は、前記細胞が多能性幹細胞であることをさらに示す。
【0270】
末梢神経系の細胞
いくつかの態様において、本明細書に記載の遺伝子操作されたヒト細胞は、脳及び脊髄の外側のニューロン及び神経である。情報を処理するニューロン、及び神経系への機械的及び代謝的支持を提供するグリア細胞は、末梢神経系の細胞の２つの主要なクラスである。ニューロンの非限定的な例には、感覚ニューロン（皮膚、筋肉、及び臓器などの領域内の感覚受容体からインパルスを収集し、それらのインパルスを神経を通してＣＮＳに伝達する。）及び運動ニューロン（前記ＣＮＳから発信メッセージを収集し、どのような行動をとる必要があるのかを指示しながら、適切な身体器官にそれらを送達する。）が含まれる。グリア細胞の非限定的な例には、神経内のシュワン細胞または神経節内のサテライト細胞が含まれる。
いくつかの態様において、本明細書に記載の遺伝子操作されたヒト細胞は、脳及び脊髄の外側のニューロン及び神経である。情報を処理するニューロン、及び神経系への機械的及び代謝的支持を提供するグリア細胞は、末梢神経系の細胞の２つの主要なクラスである。ニューロンの非限定的な例には、感覚ニューロン（皮膚、筋肉、及び臓器などの領域内の感覚受容体からインパルスを収集し、それらのインパルスを神経を通してＣＮＳに伝達する。）及び運動ニューロン（前記ＣＮＳから発信メッセージを収集し、どのような行動をとる必要があるのかを指示しながら、適切な身体器官にそれらを送達する。）が含まれる。グリア細胞の非限定的な例には、神経内のシュワン細胞または神経節内のサテライト細胞が含まれる。
【0271】
患者特異的ｉＰＳＣの作製
本開示のｅｘ ｖｉｖｏでの方法の１つの工程は、患者特異的ｉＰＳ細胞、患者特異的ｉＰＳ細胞（複数可）、または患者特異的ｉＰＳ細胞株を作製することを含み得る。Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ ２００６；Ｔａｋａｈａｓｈｉ,Ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ.２００７に記載されているように、患者特異的ｉＰＳ細胞を作製するための当該分野において確立された多くの方法がある。例えば、前記作製工程は、ａ）皮膚細胞または線維芽細胞などの体細胞を患者から単離すること、及びｂ）多能性幹細胞になるように細胞を誘導するために、１組の多能性関連遺伝子を体細胞に導入すること、を含み得る。多能性関連遺伝子のセットは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１８、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ｃ－ＭＹＣ、ｎ－ＭＹＣ、ＲＥＭ２、ＴＥＲＴ、及びＬＩＮ２８からなる群から選択される１つ以上の遺伝子であり得る。
本開示のｅｘ ｖｉｖｏでの方法の１つの工程は、患者特異的ｉＰＳ細胞、患者特異的ｉＰＳ細胞（複数可）、または患者特異的ｉＰＳ細胞株を作製することを含み得る。Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ ２００６；Ｔａｋａｈａｓｈｉ,Ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ.２００７に記載されているように、患者特異的ｉＰＳ細胞を作製するための当該分野において確立された多くの方法がある。例えば、前記作製工程は、ａ）皮膚細胞または線維芽細胞などの体細胞を患者から単離すること、及びｂ）多能性幹細胞になるように細胞を誘導するために、１組の多能性関連遺伝子を体細胞に導入すること、を含み得る。多能性関連遺伝子のセットは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１８、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ｃ－ＭＹＣ、ｎ－ＭＹＣ、ＲＥＭ２、ＴＥＲＴ、及びＬＩＮ２８からなる群から選択される１つ以上の遺伝子であり得る。
【0272】
患者の組織の生検または吸引の実施
生検または吸引は、身体から採取された組織または体液のサンプルである。生検や吸引には様々な種類がある。それらのほとんどすべては、少量の組織を除去するために、鋭利な道具を用いることを含む。生検が皮膚または他の敏感な部分にある場合は、麻痺薬を最初に適用し得る。生検または吸引は、当該分野で公知の方法のいずれかに従って行われ得る。例えば、骨髄吸引液において、大きな針は、骨盤骨に入れて、骨髄を集めるために用いられる。例えば、末梢神経系のニューロンを単離するための皮膚または脚からの神経生検の場合には、神経部分は切除され、最小限の機械的損傷を与えている。神経を圧迫したり伸ばしたりすることは避けられ、脂肪や結合組織の過剰な除去は試みられない。
生検または吸引は、身体から採取された組織または体液のサンプルである。生検や吸引には様々な種類がある。それらのほとんどすべては、少量の組織を除去するために、鋭利な道具を用いることを含む。生検が皮膚または他の敏感な部分にある場合は、麻痺薬を最初に適用し得る。生検または吸引は、当該分野で公知の方法のいずれかに従って行われ得る。例えば、骨髄吸引液において、大きな針は、骨盤骨に入れて、骨髄を集めるために用いられる。例えば、末梢神経系のニューロンを単離するための皮膚または脚からの神経生検の場合には、神経部分は切除され、最小限の機械的損傷を与えている。神経を圧迫したり伸ばしたりすることは避けられ、脂肪や結合組織の過剰な除去は試みられない。
【0273】
末梢神経系のニューロンの単離
末梢神経系のニューロンは、当該技術分野における任意の既知の方法に従って単離され得る。例えば、神経セグメントは、無菌条件下で、最小の機械的損傷を与えて切除される。神経を圧迫したり伸ばしたりすることは、厳密に避けられ、脂肪や結合組織の過剰な除去は、試みられない。神経線維は、機械的損傷に対して非常に敏感であるため、近位神経切断が最初に行われる。単離後、最も外側の結合組織層である上尿膜が除去され、酵素消化のために集められる。すべての束が個々の繊維に分離されるまで、前記繊維は、細い鉗子の助けを用いて裂かれる。次いで、上尿膜及び裂かれた繊維は、ディスパーゼＩＩ及びＩ型コラゲナーゼを用いて、一晩酵素消化に供される。消化された生成物は、濾過され、遠心分離により集められる。得られた細胞懸濁液は、接着剤ＰＬＬ／ラミニン基質上にプレーティングされる。接着細胞は、解析のために培養される（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ－Ｎａｔｕｒｅ，２０１６，６：３１７８１）。
末梢神経系のニューロンは、当該技術分野における任意の既知の方法に従って単離され得る。例えば、神経セグメントは、無菌条件下で、最小の機械的損傷を与えて切除される。神経を圧迫したり伸ばしたりすることは、厳密に避けられ、脂肪や結合組織の過剰な除去は、試みられない。神経線維は、機械的損傷に対して非常に敏感であるため、近位神経切断が最初に行われる。単離後、最も外側の結合組織層である上尿膜が除去され、酵素消化のために集められる。すべての束が個々の繊維に分離されるまで、前記繊維は、細い鉗子の助けを用いて裂かれる。次いで、上尿膜及び裂かれた繊維は、ディスパーゼＩＩ及びＩ型コラゲナーゼを用いて、一晩酵素消化に供される。消化された生成物は、濾過され、遠心分離により集められる。得られた細胞懸濁液は、接着剤ＰＬＬ／ラミニン基質上にプレーティングされる。接着細胞は、解析のために培養される（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ－Ｎａｔｕｒｅ，２０１６，６：３１７８１）。
【0274】
間葉系幹細胞の単離
間葉系幹細胞は、患者の骨髄または末梢血からなど、当該技術分野において公知の任意の方法に従って単離され得る。例えば、骨髄吸引液は、ヘパリンと共に注射器に集められ得る。細胞は、洗浄され、Ｐｅｒｃｏｌｌで遠心され得る。前記細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（低グルコース）中で培養され得る（Ｐｉｔｔｉｎｇｅｒ ＭＦ，Ｍａｃｋａｙ ＡＭ，Ｂｅｃｋ ＳＣ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９；２８４：１４３－１４７）。
間葉系幹細胞は、患者の骨髄または末梢血からなど、当該技術分野において公知の任意の方法に従って単離され得る。例えば、骨髄吸引液は、ヘパリンと共に注射器に集められ得る。細胞は、洗浄され、Ｐｅｒｃｏｌｌで遠心され得る。前記細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（低グルコース）中で培養され得る（Ｐｉｔｔｉｎｇｅｒ ＭＦ，Ｍａｃｋａｙ ＡＭ，Ｂｅｃｋ ＳＣ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９；２８４：１４３－１４７）。
【0275】
遺伝子改変細胞
用語「遺伝子改変細胞」は、ゲノム編集によって（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを用いて）導入された、少なくとも１つの遺伝子改変を含む細胞のことをいう。本明細書中のいくつかのｅｘ ｖｉｖｏの例において、遺伝子改変細胞は、遺伝子改変前駆細胞であり得る。本明細書中のいくつかのｉｎ ｖｉｖｏでの例において、遺伝子改変細胞は、末梢神経系の遺伝子改変ニューロンであり得る。外因性ゲノムターゲティング核酸及び／またはゲノムターゲティング核酸をコードする外因性核酸を含む遺伝子改変細胞は、本明細書で企図される。
用語「遺伝子改変細胞」は、ゲノム編集によって（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを用いて）導入された、少なくとも１つの遺伝子改変を含む細胞のことをいう。本明細書中のいくつかのｅｘ ｖｉｖｏの例において、遺伝子改変細胞は、遺伝子改変前駆細胞であり得る。本明細書中のいくつかのｉｎ ｖｉｖｏでの例において、遺伝子改変細胞は、末梢神経系の遺伝子改変ニューロンであり得る。外因性ゲノムターゲティング核酸及び／またはゲノムターゲティング核酸をコードする外因性核酸を含む遺伝子改変細胞は、本明細書で企図される。
【0276】
用語「対照を処理した集団」は、ゲノム編集をしたコンポーネントの追加を除いて、同じ培地、ウイルス誘導、核酸配列、温度、集密度、フラスコサイズ、ｐＨなどで処理された細胞集団を表す。当該技術分野で公知の任意の方法が使用され、例えば、ＳＣＮ１０Ａタンパク質のウエスタンブロット解析またはＳＣＮ１０Ａ ｍＲＮＡを定量するためのリアルタイムＰＣＲで、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の転写、またはタンパク質の発現もしくは活性を測定し得る。
【0277】
用語「単離された細胞」は、それが最初に見出された生物から取り出された細胞、またはそのような細胞の子孫のことをいう。場合により、前記細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば、規定の条件下でまたは他の細胞の存在下で培養され得る。場合によっては、前記細胞は、後に第２の生物に導入されるか、またはそれが単離された生物（またはそれが由来する細胞）に再導入され得る。
【0278】
単離された細胞集団に関して、用語「単離された集団」は、混合されたまたは不均一な細胞集団から取り出され分離された細胞の集団のことをいう。いくつかの場合において、単離された集団は、細胞が単離された、または濃縮された異種の集団と比較して、実質的に純粋な細胞の集団であり得る。場合によっては、単離された集団は、ヒト前駆細胞及びヒト前駆細胞が由来する細胞を含む不均一な細胞集団と比較して、ヒト前駆細胞の単離された集団（例えば、実質的に純粋なヒト前駆細胞の集団）であり得る。
【0279】
特定の細胞集団に関して、用語「実質的に増強された」は、特定の種類の細胞の発生が既存のまたは参照レベルと比較して、例えば、疼痛を改善するためのそのような細胞の所望のレベルに応じて、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも４００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも２００００倍、少なくとも１０００００倍、またはそれ以上の倍数で増加している細胞の集団のことをいう。
【0280】
特定の細胞集団に関して、用語「実質的に濃縮された」は、全細胞集団を構成する細胞に対して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％以上である細胞の集団のことをいう。
【0281】
特定の細胞集団に関して、用語「実質的に純粋な」は、全細胞集団を構成する細胞に関して、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％純粋である細胞の集団のことをいう。すなわち、前駆細胞の集団に関して、用語「実質的に純粋な」または「本質的に精製された」は、本明細書中の用語により定義されるような前駆細胞ではない、約２０％未満、約１５％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、または１％未満の細胞を含む細胞の集団のことをいう。
【0282】
ゲノム編集ｉＰＳＣの末梢神経系細胞への分化
本開示のｅｘ ｖｉｖｏでの方法の別の工程は、ゲノム編集されたｉＰＳＣを末梢神経系の細胞（例えば、神経内のシュワン細胞または神経節内のサテライトグリア細胞などのニューロンまたはグリア細胞）に分化させることを含み得る。分化する工程は、当該技術分野において公知の任意の方法に従って実施され得る。例えば、ｉＰＳＣの神経分化は、脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、及びジブチリルサイクリックＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）の組み合わせを用いて誘導される。次いで、ｉＰＳＣ由来の神経細胞は、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ニューレグリン１β、及びｄｂｃＡＭＰを用いて、シュワン細胞にさらに分化させる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ.，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１１；３２（２２）：５０２３－５０３２）。
本開示のｅｘ ｖｉｖｏでの方法の別の工程は、ゲノム編集されたｉＰＳＣを末梢神経系の細胞（例えば、神経内のシュワン細胞または神経節内のサテライトグリア細胞などのニューロンまたはグリア細胞）に分化させることを含み得る。分化する工程は、当該技術分野において公知の任意の方法に従って実施され得る。例えば、ｉＰＳＣの神経分化は、脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、及びジブチリルサイクリックＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）の組み合わせを用いて誘導される。次いで、ｉＰＳＣ由来の神経細胞は、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ニューレグリン１β、及びｄｂｃＡＭＰを用いて、シュワン細胞にさらに分化させる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ.，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１１；３２（２２）：５０２３－５０３２）。
【0283】
ゲノム編集された間葉系幹細胞の末梢神経系細胞への分化
本開示のｅｘ ｖｉｖｏでの方法の別の工程は、ゲノム編集された間葉系幹細胞を末梢神経系の細胞（例えば、神経節のシュワン細胞または神経節のサテライトグリア細胞などのニューロンまたはグリア細胞）に分化させることを含み得る。分化する工程は、当該技術分野において公知の任意の方法に従って実施され得る。例えば、ＭＳＣは、塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒト組換え血小板由来増殖因子、フォルスコリン、及びグリア増殖因子－２を含む様々な因子及びホルモンで治療される（Ｌａｄａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２２８（２０１１）２４２－２５２）。
本開示のｅｘ ｖｉｖｏでの方法の別の工程は、ゲノム編集された間葉系幹細胞を末梢神経系の細胞（例えば、神経節のシュワン細胞または神経節のサテライトグリア細胞などのニューロンまたはグリア細胞）に分化させることを含み得る。分化する工程は、当該技術分野において公知の任意の方法に従って実施され得る。例えば、ＭＳＣは、塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒト組換え血小板由来増殖因子、フォルスコリン、及びグリア増殖因子－２を含む様々な因子及びホルモンで治療される（Ｌａｄａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２２８（２０１１）２４２－２５２）。
【0284】
患者への細胞移植
本開示のｅｘ ｖｉｖｏでの方法の別の工程は、末梢神経系のゲノム編集されたニューロンを患者に移植することを含み得る。この移植工程は、当該技術分野において公知の任意の移植方法を用いて達成され得る。例えば、遺伝子改変細胞は、前記患者の血液に直接注入されるか、他の方法で前記患者に投与され得る。
本開示のｅｘ ｖｉｖｏでの方法の別の工程は、末梢神経系のゲノム編集されたニューロンを患者に移植することを含み得る。この移植工程は、当該技術分野において公知の任意の移植方法を用いて達成され得る。例えば、遺伝子改変細胞は、前記患者の血液に直接注入されるか、他の方法で前記患者に投与され得る。
【0285】
ＩＩＩ．製剤及び送達
薬学的に許容される担体
本明細書で企図される対象に前駆細胞を投与するｅｘ ｖｉｖｏ方法は、前駆細胞を含む治療用組成物の使用を伴う。
薬学的に許容される担体
本明細書で企図される対象に前駆細胞を投与するｅｘ ｖｉｖｏ方法は、前駆細胞を含む治療用組成物の使用を伴う。
【0286】
治療用組成物は、生理学的に許容される担体を、その中に活性成分として溶解または分散している細胞組成物、及び任意選択で本明細書に記載のとおりの少なくとも１種の追加の生理活性薬剤と一緒に含有し得る。場合によっては、治療用組成物は、治療目的で哺乳類またはヒト患者に投与した場合に、そのように望まない場合を除いて実質的に免疫原性ではない。
【0287】
一般に、本明細書に記載の前駆細胞を、薬学的に許容される担体と共に懸濁液として投与することができる。当業者は、細胞組成物において使用される薬学的に許容される担体が、対象に送達される細胞の生存を実質的に妨害する量で緩衝剤、化合物、凍結保存剤、防腐剤、または他の薬剤を含まないことが分かるであろう。細胞を含む製剤は、例えば、維持されるべき細胞膜の完全性を可能にする浸透圧緩衝剤、及び任意選択で、細胞の生存を維持する、または投与の際の生着を増強する栄養素を含み得る。そのような製剤及び懸濁液は当業者に公知である、及び／またはルーチン的な実験を使用して、本明細書に記載のとおりの前駆細胞と共に使用するために適合させることができる。
【0288】
乳化手順が細胞の生存に不利な影響を及ぼさないことを条件として、細胞組成物を乳化することができるか、リポソーム組成物として提供することもできる。細胞及び任意の他の活性成分を、薬学的に許容され、活性成分と適合性であり、かつ本明細書に記載の治療法で使用するために適した量の添加剤と混合することができる。
【0289】
細胞組成物に含まれる追加の薬剤には、その中の成分の薬学的に許容される塩が含まれ得る。薬学的に許容される塩には、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基と形成される）が含まれる。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導され得る。
【0290】
生理学的に許容される担体は当技術分野で周知である。例示的な液体担体は、活性成分及び水の他に物質を含有しない、または生理学的ｐＨ値でリン酸ナトリウムなどの緩衝剤を含有する滅菌水溶液、生理食塩水またはその両方、例えば、リン酸緩衝生理食塩水である。またさらに、水性担体は、１種より多い緩衝塩、さらには塩化ナトリウム及びカリウムなどの塩、デキストロース、ポリエチレングリコール及び他の溶質を含有し得る。液体組成物はまた、水に加えて、及び水を除いて、液相を含有し得る。そのような追加の液相の例は、グリセリン、植物油、例えば綿実油、及び水－油乳剤である。特定の障害または状態の処置で有効な細胞組成物で使用される活性化合物の量は、障害または状態の性質に依存し得、標準的な臨床的技法によって決定され得る。
【0291】
ガイドＲＮＡ製剤
本開示のガイドＲＮＡを、特定の投与様式及び剤形に応じて、薬学的に許容される添加剤、例えば担体、溶媒、安定剤、アジュバント、希釈剤などで製剤化することができる。ガイドＲＮＡ組成物は、生理学的に適合性なｐＨ、ならびに製剤及び投与経路に応じて約３のｐＨから約１１までのｐＨ、約ｐＨ３～約ｐＨ７の範囲を達成するように製剤化することができる。場合によっては、ｐＨを約ｐＨ５．０～約ｐＨ８の範囲に調節することができる。場合によっては、組成物は、少なくとも１種の本明細書に記載の化合物の治療有効量を１種または複数の薬学的に許容される添加剤と共に含み得る。任意選択で、組成物は、本明細書に記載の化合物の組み合わせを含むことができるか、または細菌成長の処置もしくは予防に有用な第２の活性成分（例えば、限定ではないが抗細菌薬または抗菌薬）を含むことができるか、または本開示の試薬の組み合わせを含むことができる。
本開示のガイドＲＮＡを、特定の投与様式及び剤形に応じて、薬学的に許容される添加剤、例えば担体、溶媒、安定剤、アジュバント、希釈剤などで製剤化することができる。ガイドＲＮＡ組成物は、生理学的に適合性なｐＨ、ならびに製剤及び投与経路に応じて約３のｐＨから約１１までのｐＨ、約ｐＨ３～約ｐＨ７の範囲を達成するように製剤化することができる。場合によっては、ｐＨを約ｐＨ５．０～約ｐＨ８の範囲に調節することができる。場合によっては、組成物は、少なくとも１種の本明細書に記載の化合物の治療有効量を１種または複数の薬学的に許容される添加剤と共に含み得る。任意選択で、組成物は、本明細書に記載の化合物の組み合わせを含むことができるか、または細菌成長の処置もしくは予防に有用な第２の活性成分（例えば、限定ではないが抗細菌薬または抗菌薬）を含むことができるか、または本開示の試薬の組み合わせを含むことができる。
【0292】
適切な添加剤には、例えば、大きな、ゆっくり代謝される高分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び不活性なウイルス粒子を含む担体分子が含まれる。他の例示的な添加剤には、抗酸化剤（例えば、限定ではないがアスコルビン酸）、キレート化剤（例えば、限定ではないが、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例えば、限定ではないが、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、及びヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（例えば及び限定ではないが、油、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノール）、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などが含まれ得る。
【0293】
送達
ガイドＲＮＡポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）及び／またはエンドヌクレアーゼポリヌクレオチド（複数可）（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を当技術分野で公知のウイルスまたは非ウイルス送達ビヒクルによって送達することができる。別法では、エンドヌクレアーゼポリペプチド（複数可）を、当技術分野で公知のウイルスまたは非ウイルス送達ビヒクル、例えば電気穿孔法または脂質ナノ粒子によって送達することができる。さらなる代替の態様では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼを、１種または複数のポリペプチドとして、単独で、あるいはｔｒａｃｒＲＮＡと一緒に１つもしくは複数のガイドＲＮＡ、または１つもしくは複数のｃｒＲＮＡと事前複合体化して送達することができる。
ガイドＲＮＡポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）及び／またはエンドヌクレアーゼポリヌクレオチド（複数可）（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を当技術分野で公知のウイルスまたは非ウイルス送達ビヒクルによって送達することができる。別法では、エンドヌクレアーゼポリペプチド（複数可）を、当技術分野で公知のウイルスまたは非ウイルス送達ビヒクル、例えば電気穿孔法または脂質ナノ粒子によって送達することができる。さらなる代替の態様では、ＤＮＡエンドヌクレアーゼを、１種または複数のポリペプチドとして、単独で、あるいはｔｒａｃｒＲＮＡと一緒に１つもしくは複数のガイドＲＮＡ、または１つもしくは複数のｃｒＲＮＡと事前複合体化して送達することができる。
【0294】
ポリヌクレオチドを、これに限定されないが、ナノ粒子、リポソーム、リボ核タンパク質、正電荷をもつペプチド、小分子ＲＮＡコンジュゲート、アプタマー－ＲＮＡキメラ、及びＲＮＡ融合タンパク質複合体を含む非ウイルス送達ビヒクルによって送達することができる。一部の例示的な非ウイルス送達ビヒクルが、Ｐｅｅｒ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８：１１２７－１１３３（２０１１）（これは他のポリヌクレオチドの送達にも有用であるｓｉＲＮＡのための非ウイルス送達ビヒクルに焦点を当てている）に記載されている。
【0295】
本開示のポリヌクレオチドでは、製剤を、例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０に教示されているもののいずれかから選択してよい。
【0296】
ポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、及びエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によって細胞または患者に送達してよい。
【0297】
ＬＮＰは、１０００ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、または２５ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子を指す。別法では、ナノ粒子は、１～１０００ｎｍ、１～５００ｎｍ、１～２５０ｎｍ、２５～２００ｎｍ、２５～１００ｎｍ、３５～７５ｎｍ、または２５～６０ｎｍのサイズの範囲であってよい。
【0298】
ＬＮＰを陽イオン性、陰イオン性、または中性脂質から作製してよい。中性脂質、例えば膜融合性リン脂質ＤＯＰＥまたは膜成分コレステロールが、トランスフェクション活性及びナノ粒子安定性を増強する「ヘルパー」脂質としてＬＮＰに含まれてよい。陽イオン性脂質の限界には、不十分な安定性及び急速なクリアランスによる低い有効性、さらには炎症または抗炎症反応の発生が含まれる。
【0299】
ＬＮＰはまた、疎水性脂質、親水性脂質、または疎水性及び親水性脂質の両方から構成されてよい。
【0300】
当技術分野で公知の任意の脂質または脂質の組み合わせを、ＬＮＰを生成するために使用することができる。ＬＮＰを生成するために使用される脂質の例は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ－コレステロール、ＤＯＴＡＰ－コレステロール、ＧＡＰ－ＤＭＯＲＩＥ－ＤＰｙＰＥ、及びＧＬ６７Ａ－ＤＯＰＥ－ＤＭＰＥ－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。陽イオン性脂質の例は、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１、及び７Ｃ１である。天然脂質の例は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭである。ＰＥＧ修飾脂質の例は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４、及びＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０である。
【0301】
脂質を任意の数値のモル比で組み合わせて、ＬＮＰを生成することができる。加えて、ポリヌクレオチド（複数可）を幅広いモル比で脂質（複数可）と組み合わせて、ＬＮＰを生成することができる。
【0302】
既に述べたとおり、部位特異的ポリペプチド及びゲノムターゲティング核酸をそれぞれ別々に細胞または患者に投与することができる。他方で、部位特異的ポリペプチドを、ｔｒａｃｒＲＮＡと一緒に１つもしくは複数のガイドＲＮＡ、または１つもしくは複数のｃｒＲＮＡと事前複合体化することができる。次いで、事前複合体化物質を細胞または患者に投与することができる。そのような事前複合体化物質は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として公知である。
【0303】
ＲＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡと特異的な相互作用を生じ得る。この特性は多くの生物学的プロセスで利用されるが、核酸リッチな細胞環境では無差別に相互作用するリスクもある。この問題の解決策の１つは、ＲＮＡがエンドヌクレアーゼと事前複合体化されているリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）の形成である。ＲＮＰの別の利点は、ＲＮＡを分解から保護することである。
【0304】
ＲＮＰにおけるエンドヌクレアーゼは修飾されていてよいか、または非修飾であってよい。同様に、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡも修飾されていてよいか、または非修飾であってよい。多数の修飾が当技術分野で公知であり、使用することができる。
【0305】
エンドヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡを一般に１：１のモル比で組み合わせることができる。別法では、エンドヌクレアーゼ、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを一般に１：１：１のモル比で組み合わせることができる。しかしながら、幅広いモル比を使用して、ＲＮＰを生成することができる。
【0306】
ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを送達のために使用することができる。送達されるポリヌクレオチド、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能を含むパッケージングされたＡＡＶゲノムを細胞に供給するｒＡＡＶ粒子を生成するための技法は、当技術分野で標準的である。ｒＡＡＶの生成は典型的には、次の成分が単細胞（本明細書ではパッケージング細胞と示される）内に存在することを必要とする：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別の（すなわち、その中にはない）ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及びヘルパーウイルス機能。ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスを誘導し得る任意のＡＡＶ血清型からのものであってよく、かつこれに限定されないが、本明細書に記載のＡＡＶ血清型を含む、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型からのものであってよい。偽型ｒＡＡＶの生成が例えば、国際特許出願公開ＷＯ０１／８３６９２に開示されている。
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを送達のために使用することができる。送達されるポリヌクレオチド、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能を含むパッケージングされたＡＡＶゲノムを細胞に供給するｒＡＡＶ粒子を生成するための技法は、当技術分野で標準的である。ｒＡＡＶの生成は典型的には、次の成分が単細胞（本明細書ではパッケージング細胞と示される）内に存在することを必要とする：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別の（すなわち、その中にはない）ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及びヘルパーウイルス機能。ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスを誘導し得る任意のＡＡＶ血清型からのものであってよく、かつこれに限定されないが、本明細書に記載のＡＡＶ血清型を含む、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型からのものであってよい。偽型ｒＡＡＶの生成が例えば、国際特許出願公開ＷＯ０１／８３６９２に開示されている。
【0307】
ＡＡＶ血清型
本開示の組成物、例えば、エンドヌクレアーゼ、ドナー配列、またはＲＮＡガイド分子をコードするポリヌクレオチドをパッケージングする本開示のＡＡＶ粒子は、任意の天然または組換えＡＡＶ血清型を含むか、またはそれから誘導されていてよい。本開示によれば、ＡＡＶ粒子は、これに限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ１－７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１－８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ２－１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ２－３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２－４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２－５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ－２－ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ－１０１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３－１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ３－９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２－１０、ＡＡＶ４２－１１、ＡＡＶ４２－１２、ＡＡＶ４２－１３、ＡＡＶ４２－１５、ＡＡＶ４２－１ｂ、ＡＡＶ４２－２、ＡＡＶ４２－３ａ、ＡＡＶ４２－３ｂ、ＡＡＶ４２－４、ＡＡＶ４２－５ａ、ＡＡＶ４２－５ｂ、ＡＡＶ４２－６ｂ、ＡＡＶ４２－８、ＡＡＶ４２－ａａ、ＡＡＶ４３－１、ＡＡＶ４３－１２、ＡＡＶ４３－２０、ＡＡＶ４３－２１、ＡＡＶ４３－２３、ＡＡＶ４３－２５、ＡＡＶ４３－５、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ４－８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４－８／ｒｈ．６４、ＡＡＶ４－９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５－２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ５－３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ－８ｂ、ＡＡＶ－８ｈ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶ－ｂ、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ８、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶ－ｈ、ＡＡＶＨ－１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶＨ－５／ｈｕ．３、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．ｔ１９、ＡＡＶＬＧ－１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ－４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ－ＬＫ０１、ＡＡＶ－ＬＫ０２、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０４、ＡＡＶ－ＬＫ０５、ＡＡＶ－ＬＫ０６、ＡＡＶ－ＬＫ０７、ＡＡＶ－ＬＫ０８、ＡＡＶ－ＬＫ０９、ＡＡＶ－ＬＫ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１１、ＡＡＶ－ＬＫ１２、ＡＡＶ－ＬＫ１３、ＡＡＶ－ＬＫ１４、ＡＡＶ－ＬＫ１５、ＡＡＶ－ＬＫ１７、ＡＡＶ－ＬＫ１８、ＡＡＶ－ＬＫ１９、ＡＡＶＮ７２１－８／ｒｈ．４３、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ８、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ変異体、ＢＡＡＶ、ＢＮＰ６１ＡＡＶ、ＢＮＰ６２ＡＡＶ、ＢＮＰ６３ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、Ｊａｐａｎｅｓｅ ＡＡＶ１０、真型（ｔｒｕｅ ｔｙｐｅ）ＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１６、ＡＡＡＶ、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－１、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－２、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－３、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－７、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－２、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－６、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－８、ＡＡＶ ＳＭ１００－１０、ＡＡＶ ＳＭ１００－３、ＡＡＶ ＳＭ１０－１、ＡＡＶ ＳＭ１０－２、及び／またはＡＡＶ ＳＭ１０－８を含む血清型、及びそのバリアントのいずれかから選択される血清型を利用し得るか、またはそれに基づき得る。
本開示の組成物、例えば、エンドヌクレアーゼ、ドナー配列、またはＲＮＡガイド分子をコードするポリヌクレオチドをパッケージングする本開示のＡＡＶ粒子は、任意の天然または組換えＡＡＶ血清型を含むか、またはそれから誘導されていてよい。本開示によれば、ＡＡＶ粒子は、これに限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ１－７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１－８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ２－１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ２－３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２－４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２－５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ－２－ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ－１０１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３－１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ３－３、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ３－９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２－１０、ＡＡＶ４２－１１、ＡＡＶ４２－１２、ＡＡＶ４２－１３、ＡＡＶ４２－１５、ＡＡＶ４２－１ｂ、ＡＡＶ４２－２、ＡＡＶ４２－３ａ、ＡＡＶ４２－３ｂ、ＡＡＶ４２－４、ＡＡＶ４２－５ａ、ＡＡＶ４２－５ｂ、ＡＡＶ４２－６ｂ、ＡＡＶ４２－８、ＡＡＶ４２－ａａ、ＡＡＶ４３－１、ＡＡＶ４３－１２、ＡＡＶ４３－２０、ＡＡＶ４３－２１、ＡＡＶ４３－２３、ＡＡＶ４３－２５、ＡＡＶ４３－５、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ４－８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４－８／ｒｈ．６４、ＡＡＶ４－９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５－２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ５－３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ－８ｂ、ＡＡＶ－８ｈ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶ－ｂ、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ８、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶ－ｈ、ＡＡＶＨ－１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶＨ－５／ｈｕ．３、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．ｔ１９、ＡＡＶＬＧ－１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ－４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＬＧ－９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ－ＬＫ０１、ＡＡＶ－ＬＫ０２、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＬＫ０４、ＡＡＶ－ＬＫ０５、ＡＡＶ－ＬＫ０６、ＡＡＶ－ＬＫ０７、ＡＡＶ－ＬＫ０８、ＡＡＶ－ＬＫ０９、ＡＡＶ－ＬＫ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１１、ＡＡＶ－ＬＫ１２、ＡＡＶ－ＬＫ１３、ＡＡＶ－ＬＫ１４、ＡＡＶ－ＬＫ１５、ＡＡＶ－ＬＫ１７、ＡＡＶ－ＬＫ１８、ＡＡＶ－ＬＫ１９、ＡＡＶＮ７２１－８／ｒｈ．４３、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ－ＰＡＥＣ８、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ変異体、ＢＡＡＶ、ＢＮＰ６１ＡＡＶ、ＢＮＰ６２ＡＡＶ、ＢＮＰ６３ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、Ｊａｐａｎｅｓｅ ＡＡＶ１０、真型（ｔｒｕｅ ｔｙｐｅ）ＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ ＡＡＶ１０、ＡＡＶ－ＬＫ１６、ＡＡＡＶ、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－１、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－２、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－３、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１００－７、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－２、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－６、ＡＡＶ Ｓｈｕｆｆｌｅ１０－８、ＡＡＶ ＳＭ１００－１０、ＡＡＶ ＳＭ１００－３、ＡＡＶ ＳＭ１０－１、ＡＡＶ ＳＭ１０－２、及び／またはＡＡＶ ＳＭ１０－８を含む血清型、及びそのバリアントのいずれかから選択される血清型を利用し得るか、またはそれに基づき得る。
【0308】
一部の態様では、Ｎ Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １９（６）：１０７０－１０７８（２０１１））によって記載されたとおり、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ９配列の変異、例えば、これに限定されないが、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４であってよいか、それを有してよい。
【0309】
一部の態様では、ＡＡＶ血清型は、米国特許第６１５６３０３号に記載されているとおりの配列、例えば、これに限定されないが、ＡＡＶ３Ｂ（米国特許第６１５６３０３号の配列番号１及び１０）、ＡＡＶ６（米国特許第６１５６３０３号の配列番号２、７及び１１）、ＡＡＶ２（米国特許第６１５６３０３号の配列番号３及び８）、ＡＡＶ３Ａ（米国特許第６１５６３０３号の配列番号４及び９）、またはその誘導体であってよいか、それを有してよい。
【0310】
一部の態様では、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８２（１２）：５８８７－５９１１（２００８））によって記載されたとおり、血清型は、ＡＡＶＤＪまたはそのバリアント、例えばＡＡＶＤＪ８（またはＡＡＶ－ＤＪ８）であってよい。ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）を除去するために、ＡＡＶＤＪ８のアミノ酸配列は、２つ以上の変異を含んでよい。非限定的例として、米国特許第７，５８８，７７２号に配列番号１として記載されているＡＡＶ－ＤＪ配列：（１）アミノ酸５８７のアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がグルタミン（Ｑ；Ｇｌｎ）に変化しているＲ５８７Ｑ及び（２）アミノ酸５９０のアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がトレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）に変化しているＲ５９０Ｔ。別の非限定的例として、３つの変異を含んでよい：（１）アミノ酸４０６のリシン（Ｋ；Ｌｙｓ）がアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）に変化しているＫ４０６Ｒ、（２）アミノ酸５８７のアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がグルタミン（Ｑ；Ｇｌｎ）に変化しているＲ５８７Ｑ、及び（３）アミノ酸５９０のアルギニン（Ｒ；Ａｒｇ）がトレオニン（Ｔ；Ｔｈｒ）に変化しているＲ５９０Ｔ。
【0311】
一部の例では、ＡＡＶ血清型は、国際公開ＷＯ２０１５１２１５０１に記載されているとおりの配列、例えば、これに限定されないが、真型ＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）（ＷＯ２０１５１２１５０１の配列番号２）、「ＵＰｅｎｎ ＡＡＶ１０」（ＷＯ２０１５１２１５０１の配列番号８）、「Ｊａｐａｎｅｓｅ ＡＡＶ１０」（ＷＯ２０１５１２１５０１の配列番号９）、またはそのバリアントであってよいか、それを有してよい。
【0312】
本開示によれば、ＡＡＶカプシド血清型の選択または使用は、様々な種からであってよい。一例では、ＡＡＶは、トリＡＡＶ（ＡＡＡＶ）であってよい。ＡＡＡＶ血清型は、米国特許第９２３８８００号に記載のとおりの配列、例えば、これに限定されないが、ＡＡＡＶ（米国特許第９２３８８００号の配列番号１、２、４、６、８、１０、１２、及び１４）、またはそのバリアントであってよいか、それを有してよい。
【0313】
一例では、ＡＡＶはウシＡＡＶ（ＢＡＡＶ）であってよい。ＢＡＡＶ血清型は、米国特許第９，１９３，７６９号に記載のとおりの配列、例えば、これに限定されないが、ＢＡＡＶ（米国特許第９，１９３，７６９号の配列番号１及び６）、またはそのバリアントであってよいか、それを有してよい。ＢＡＡＶ血清型は、米国特許第７４２７３９６号に記載のとおりの配列、例えば、これに限定されないが、ＢＡＡＶ（米国特許第７４２７３９６号の配列番号５及び６）、またはそのバリアントであってよいか、それを有してよい。
【0314】
一例では、ＡＡＶはヤギＡＡＶであってよい。ヤギＡＡＶ血清型は、米国特許第７４２７３９６号に記載のとおりの配列、例えば、これに限定されないが、ヤギＡＡＶ（米国特許第７４２７３９６号の配列番号３）、またはそのバリアントであってよいか、それを有してよい。
【0315】
他の例では、ＡＡＶを、２つ以上の親血清型に由来するハイブリッドＡＡＶとして操作してよい。一例では、ＡＡＶは、ＡＡＶ２及びＡＡＶ９に由来する配列を含むＡＡＶ２Ｇ９であってよい。ＡＡＶ２Ｇ９ＡＡＶ血清型は、米国特許出願公開第２０１６００１７００５号に記載のとおりの配列であってよいか、それを有してよい。
【0316】
一例では、ＡＡＶは、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １９（６）：１０７０－１０７８（２０１１）によって記載されたとおり、アミノ酸３９０～６２７（ＶＰ１ナンバリング）に変異を有するＡＡＶ９カプシドライブラリーによって生成された血清型であってよい。血清型及び対応するヌクレオチド及びアミノ酸置換は、これに限定されないが、ＡＡＶ９．１（Ｇ１５９４Ｃ；Ｄ５３２Ｈ）、ＡＡＶ６．２（Ｔ１４１８Ａ及びＴ１４３６Ｘ；Ｖ４７３Ｄ及びＩ４７９Ｋ）、ＡＡＶ９．３（Ｔ１２３８Ａ；Ｆ４１３Ｙ）、ＡＡＶ９．４（Ｔ１２５０Ｃ及びＡ１６１７Ｔ；Ｆ４１７Ｓ）、ＡＡＶ９．５（Ａ１２３５Ｇ、Ａ１３１４Ｔ、Ａ１６４２Ｇ、Ｃ１７６０Ｔ；Ｑ４１２Ｒ、Ｔ５４８Ａ、Ａ５８７Ｖ）、ＡＡＶ９．６（Ｔ１２３１Ａ；Ｆ４１１Ｉ）、ＡＡＶ９．９（Ｇ１２０３Ａ、Ｇ１７８５Ｔ；Ｗ５９５Ｃ）、ＡＡＶ９．１０（Ａ１５００Ｇ、Ｔ１６７６Ｃ；Ｍ５５９Ｔ）、ＡＡＶ９．１１（Ａ１４２５Ｔ、Ａ１７０２Ｃ、Ａ１７６９Ｔ；Ｔ５６８Ｐ、Ｑ５９０Ｌ）、ＡＡＶ９．１３（Ａ１３６９Ｃ、Ａ１７２０Ｔ；Ｎ４５７Ｈ、Ｔ５７４Ｓ）、ＡＡＶ９．１４（Ｔ１３４０Ａ、Ｔ１３６２Ｃ、Ｔ１５６０Ｃ、Ｇ１７１３Ａ；Ｌ４４７Ｈ）、ＡＡＶ９．１６（Ａ１７７５Ｔ；Ｑ５９２Ｌ）、ＡＡＶ９．２４（Ｔ１５０７Ｃ、Ｔ１５２１Ｇ；Ｗ５０３Ｒ）、ＡＡＶ９．２６（Ａ１３３７Ｇ、Ａ１７６９Ｃ；Ｙ４４６Ｃ、Ｑ５９０Ｐ）、ＡＡＶ９．３３（Ａ１６６７Ｃ；Ｄ５５６Ａ）、ＡＡＶ９．３４（Ａ１５３４Ｇ、Ｃ１７９４Ｔ；Ｎ５１２Ｄ）、ＡＡＶ９．３５（Ａ１２８９Ｔ、Ｔ１４５０Ａ、Ｃ１４９４Ｔ、Ａ１５１５Ｔ、Ｃ１７９４Ａ、Ｇ１８１６Ａ；Ｑ４３０Ｌ、Ｙ４８４Ｎ、Ｎ９８Ｋ、Ｖ６０６Ｉ）、ＡＡＶ９．４０（Ａ１６９４Ｔ、Ｅ５６５Ｖ）、ＡＡＶ９．４１（Ａ１３４８Ｔ、Ｔ１３６２Ｃ；Ｔ４５０Ｓ）、ＡＡＶ９．４４（Ａ１６８４Ｃ、Ａ１７０１Ｔ、Ａ１７３７Ｇ；Ｎ５６２Ｈ、Ｋ５６７Ｎ）、ＡＡＶ９．４５（Ａ１４９２Ｔ、Ｃ１８０４Ｔ；Ｎ４９８Ｙ、Ｌ６０２Ｆ）、ＡＡＶ９．４６（Ｇ１４４１Ｃ、Ｔ１５２５Ｃ、Ｔ１５４９Ｇ；Ｇ４８１Ｒ、Ｗ５０９Ｒ、Ｌ５１７Ｖ）、９．４７（Ｇ１２４１Ａ、Ｇ１３５８Ａ、Ａ１６６９Ｇ、Ｃ１７４５Ｔ；Ｓ４１４Ｎ、Ｇ４５３Ｄ、Ｋ５５７Ｅ、Ｔ５８２Ｉ）、ＡＡＶ９．４８（Ｃ１４４５Ｔ、Ａ１７３６Ｔ；Ｐ４８２Ｌ、Ｑ５７９Ｌ）、ＡＡＶ９．５０（Ａ１６３８Ｔ、Ｃ１６８３Ｔ、Ｔ１８０５Ａ；Ｑ５４６Ｈ、Ｌ６０２Ｈ）、ＡＡＶ９．５３（Ｇ１３０１Ａ、Ａ１４０５Ｃ、Ｃ１６６４Ｔ、Ｇ１８１１Ｔ；Ｒ１３４Ｑ、Ｓ４６９Ｒ、Ａ５５５Ｖ、Ｇ６０４Ｖ）、ＡＡＶ９．５４（Ｃ１５３１Ａ、Ｔ１６０９Ａ；Ｌ５１１Ｉ、Ｌ５３７Ｍ）、ＡＡＶ９．５５（Ｔ１６０５Ａ；Ｆ５３５Ｌ）、ＡＡＶ９．５８（Ｃ１４７５Ｔ、Ｃ１５７９Ａ；Ｔ４９２Ｉ、Ｈ５２７Ｎ）、ＡＡＶ．５９（Ｔ１３３６Ｃ；Ｙ４４６Ｈ）、ＡＡＶ９．６１（Ａ１４９３Ｔ；Ｎ４９８Ｉ）、ＡＡＶ９．６４（Ｃ１５３１Ａ、Ａ１６１７Ｔ；Ｌ５１１Ｉ）、ＡＡＶ９．６５（Ｃ１３３５Ｔ、Ｔ１５３０Ｃ、Ｃ１５６８Ａ；Ａ５２３Ｄ）、ＡＡＶ９．６８（Ｃ１５１０Ａ；Ｐ５０４Ｔ）、ＡＡＶ９．８０（Ｇ１４４１Ａ，；Ｇ４８１Ｒ）、ＡＡＶ９．８３（Ｃ１４０２Ａ、Ａ１５００Ｔ；Ｐ４６８Ｔ、Ｅ５００Ｄ）、ＡＡＶ９．８７（Ｔ１４６４Ｃ、Ｔ１４６８Ｃ；Ｓ４９０Ｐ）、ＡＡＶ９．９０（Ａ１１９６Ｔ；Ｙ３９９Ｆ）、ＡＡＶ９．９１（Ｔ１３１６Ｇ、Ａ１５８３Ｔ、Ｃ１７８２Ｇ、Ｔ１８０６Ｃ；Ｌ４３９Ｒ、Ｋ５２８Ｉ）、ＡＡＶ９．９３（Ａ１２７３Ｇ、Ａ１４２１Ｇ、Ａ１６３８Ｃ、Ｃ１７１２Ｔ、Ｇ１７３２Ａ、Ａ１７４４Ｔ、Ａ１８３２Ｔ；Ｓ４２５Ｇ、Ｑ４７４Ｒ、Ｑ５４６Ｈ、Ｐ５７１Ｌ、Ｇ５７８Ｒ、Ｔ５８２Ｓ、Ｄ６１１Ｖ）、ＡＡＶ９．９４（Ａ１６７５Ｔ；Ｍ５５９Ｌ）及びＡＡＶ９．９５（Ｔ１６０５Ａ；Ｆ５３５Ｌ）であってよい。
【0317】
一例では、ＡＡＶは、少なくとも１つのＡＡＶカプシドＣＤ８＋Ｔ－細胞エピトープを含む血清型であってよい。非限定的例として、血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２またはＡＡＶ８であってよい。
【0318】
一例では、ＡＡＶは、Ｄｅｖｅｒｍａｎ．２０１６．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．３４（２）：２０４－２０９に記載されているとおり、バリアント、例えばＰＨＰ．ＡまたはＰＨＰ．Ｂであってよい。
【0319】
一例では、ＡＡＶは、配列番号４７３４～５３０２及び表２において見出されるもののうちのいずれかから選択される血清型であってよい。
【0320】
一例では、ＡＡＶは、配列番号４７３４～５３０２及び表２に記載されているとおりの配列、断片またはバリアントによってコードされてよい。
【0321】
ｒＡＡＶ生成の一般原則は、例えばＣａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９；及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）において概説されている。様々なアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）；及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）；米国特許第５，１７３，４１４号；ＷＯ９５／１３３６５及び対応する米国特許第５，６５８．７７６号；ＷＯ９５／１３３９２；ＷＯ９６／１７９４７；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００；ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）；ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）；ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）；ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）；ＷＯ９９／１１７６４；Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２；米国特許第５，７８６，２１１号；米国特許第５，８７１，９８２号；及び米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。
【0322】
ＡＡＶベクター血清型を標的細胞型に適合させることができる。例えば、次の例示的な細胞型をとりわけ、示されているＡＡＶ血清型によって形質導入することができる。
【0323】
【表2】
【0324】
アデノ随伴ウイルスベクターに加えて、他のウイルスベクターを使用することができる。そのようなウイルスベクターには、これに限定されないが、レンチウイルス、アルファウイルス、エンテロウイルス、ペスチウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン－バールウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、及び単純ヘルペスウイルスが含まれる。
【0325】
一部の態様では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の１つまたは２つの部位をターゲティングするｓｇＲＮＡ、及びドナーＤＮＡを脂質ナノ粒子にそれぞれ別々に製剤化することができるか、または１つの脂質ナノ粒子に共製剤化する。
【0326】
一部の態様では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子に製剤化することができる一方で、ｓｇＲＮＡ及びドナーＤＮＡは、ＡＡＶベクターにおいて送達することができる。
【0327】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＤＮＡプラスミドとして、ｍＲＮＡとして、またはタンパク質として送達するために、オプションを利用することができる。ガイドＲＮＡを、同じＤＮＡから発現させることができるか、またはＲＮＡとして送達することもできる。ＲＮＡを化学修飾して、半減期を変化させる、もしくは改善する、または免疫応答の可能性もしくは程度を低下させることができる。エンドヌクレアーゼタンパク質を、送達前にｇＲＮＡと複合体化することができる。ウイルスベクターは効率的な送達を可能にし；Ｃａｓ９の分割バージョン及びＣａｓ９のより小さなオルソログをＡＡＶにパッケージングすることができ、ＨＤＲのためのドナーも同様にできる。これらの成分のそれぞれを送達することができる様々な非ウイルス送達方法も存在し、または非ウイルス及びウイルス方法を合わせて使用することができる。例えば、ナノ粒子を、タンパク質及びガイドＲＮＡを送達するために使用することができる一方で、ＡＡＶを、ドナーＤＮＡを送達するために使用することができる。
【0328】
本明細書に記載のｉｎ ｖｉｖｏベースの治療の一部の態様では、エンドヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ及び／またはドナーＤＮＡをコードするウイルスベクター（複数可）を、直接神経節内もしくは髄腔内注射、または髄腔内送達を介して末梢神経系のニューロン、例えば、一次感覚及び運動ニューロンに送達してよい（Ｈｏｙｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１５ Ｊｕｌ １５；８：３２）。
【0329】
ＩＶ．投薬及び投与
「投与すること」、「導入すること」及び「移植すること」という用語は、所望の作用（複数可）が生じるように所望の部位、例えば、損傷または修復の部位で、導入された細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって、細胞、例えば、前駆細胞を対象に配置する文脈で互換的に使用される。細胞、例えば前駆細胞、またはそれらの分化後代を、対象内の所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって、移植細胞または細胞の成分の少なくとも一部を生かしたままで投与することができる。対象への投与後の細胞の生存期間は、短くて数時間、例えば２４時間、数日まで、長くて数年まで、またはさらには患者の寿命、すなわち、長期生着であり得る。例えば、本明細書に記載の一部の態様では、前駆細胞の有効量を全身投与経路、例えば腹腔内または静脈内経路を介して投与する。
「投与すること」、「導入すること」及び「移植すること」という用語は、所望の作用（複数可）が生じるように所望の部位、例えば、損傷または修復の部位で、導入された細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって、細胞、例えば、前駆細胞を対象に配置する文脈で互換的に使用される。細胞、例えば前駆細胞、またはそれらの分化後代を、対象内の所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって、移植細胞または細胞の成分の少なくとも一部を生かしたままで投与することができる。対象への投与後の細胞の生存期間は、短くて数時間、例えば２４時間、数日まで、長くて数年まで、またはさらには患者の寿命、すなわち、長期生着であり得る。例えば、本明細書に記載の一部の態様では、前駆細胞の有効量を全身投与経路、例えば腹腔内または静脈内経路を介して投与する。
【0330】
「個体」、「対象」、「宿主」及び「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、診断、処置または治療が望ましい任意の対象を指す。一部の態様では、対象は哺乳類である。一部の態様では、対象はヒトである。
【0331】
予防的に与える場合、疼痛のいずれかの症状の前に、本明細書に記載の前駆細胞を対象に投与することができる。したがって、前駆細胞集団の予防投与は、疼痛を予防するために役立つ。
【0332】
本明細書に記載の方法によって投与される前駆細胞集団は、１つまたは複数のドナーから得られた同種前駆細胞を含み得る。そのような前駆細胞は、任意の細胞または組織起源のもの、例えば、肝臓、筋肉、心臓などのものであってよい。「同種」は、同じ種の１つまたは複数の異なるドナーから得られた、１つまたは複数の遺伝子座にある遺伝子が同一ではない１つの前駆細胞または前駆細胞を含む生体試料を指す。例えば、対象に投与される肝臓前駆細胞集団は、１つもしくは複数の無関係ドナー対象から、または１つもしくは複数の非同一兄弟から誘導することができる。場合によっては、同系前駆細胞集団を、例えば、遺伝的に同一の動物から、または一卵性双生児から得られたものなどを使用することができる。前駆細胞は自己細胞であり得；すなわち、前駆細胞を対象から採取または単離し、その同じ対象に投与する、すなわち、ドナー及びレシピエントが同じである。
【0333】
「有効量」という用語は、疼痛の少なくとも１つまたは複数の徴候または症状を予防または軽減するために必要な前駆細胞またはそれらの後代の集団の量を指し、所望の作用を得るために、例えば、疼痛を有する対象を処置するために十分な組成物の量に関連する。したがって「治療有効量」という用語は、典型的な対象、例えば、疼痛を有するか、またはそのリスクを有する対象に投与した場合に特定の作用を促進するために十分な前駆細胞または前駆細胞を含む組成物の量を指す。有効量には、疾患の症状の発生を予防する、もしくは遅延させる、疾患の症状の経過を変化させる（例えば、これに限定されないが、疾患の症状の進行を減速させる）、または疾患の症状を逆転させるために十分な量も含まれるであろう。任意の所与の症例では、当業者が適切な「有効量」をルーチン的な実験を使用して決定することができることは理解される。
【0334】
本明細書に記載の様々な態様で使用するために、前駆細胞の有効量は、少なくとも１０２の前駆細胞、少なくとも５×１０２の前駆細胞、少なくとも１０３の前駆細胞、少なくとも５×１０３の前駆細胞、少なくとも１０４の前駆細胞、少なくとも５×１０４の前駆細胞、少なくとも１０５の前駆細胞、少なくとも２×１０５の前駆細胞、少なくとも３×１０５の前駆細胞、少なくとも４×１０５の前駆細胞、少なくとも５×１０５の前駆細胞、少なくとも６×１０５の前駆細胞、少なくとも７×１０５の前駆細胞、少なくとも８×１０５の前駆細胞、少なくとも９×１０５の前駆細胞、少なくとも１×１０６の前駆細胞、少なくとも２×１０６の前駆細胞、少なくとも３×１０６の前駆細胞、少なくとも４×１０６の前駆細胞、少なくとも５×１０６の前駆細胞、少なくとも６×１０６の前駆細胞、少なくとも７×１０６の前駆細胞、少なくとも８×１０６の前駆細胞、少なくとも９×１０６の前駆細胞、またはその倍数を含む。前駆細胞を１つまたは複数のドナーから得ることができるか、または自己供給源から得ることができる。本明細書に記載の一部の例では、前駆細胞を、それを必要とする対象に投与する前に、培養で増やすことができる。
【0335】
疼痛を有する患者の細胞で発現されるＳＣＮ１０Ａのレベルのわずかで漸増的な低下は、疾患の１つまたは複数の症状の寛解に、長期生存の増大に、及び／または他の処置と関連する副作用の低減に有利であり得る。ヒト患者へのそのような細胞の投与に際して、ＳＣＮ１０Ａのレベルを低下させている前駆細胞の存在が有利となる。場合によっては、対象の有効な処置は、処置対象において、全ＳＣＮ１０Ａに対してＳＣＮ１０Ａの少なくとも約３％、５％または７％の減少をもたらす。一部の例では、ＳＣＮ１０Ａの減少は、全ＳＣＮ１０Ａの少なくとも約１０％である。一部の例では、ＳＣＮ１０Ａの減少は、全ＳＣＮ１０Ａの少なくとも約２０％～３０％である。同様に、一部の状況では、規格化細胞（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｅｌｌ）が罹患細胞に対して選択的利点を有するであろうので、ＳＣＮ１０Ａのレベルを有意に低下させている細胞のさらに比較的限定された分集団の導入が様々な患者において有利であり得る。しかしながら、ＳＣＮ１０Ａの減少レベルで中程度のレベルの前駆細胞も、患者の疼痛の１つまたは複数の態様を寛解させるために有利であり得る。一部の例では、そのような細胞を投与される患者における神経前駆細胞のうちの約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％またはそれ以上がＳＣＮ１０Ａのレベルを低下させる。
【0336】
「投与された」は、所望の部位での細胞組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による対象への前駆細胞組成物の送達を指す。細胞組成物を、対象において有効な処置をもたらす任意の適切な経路によって投与することができ、すなわち、投与は、対象において所望の位置への送達をもたらし、その際、送達される組成物の少なくとも一部、すなわち少なくとも１×１０４の細胞が、ある期間にわたって所望の部位に送達される。
【0337】
方法の一態様では、医薬組成物を、これに限定されないが、腸内（小腸に）、胃腸内、硬膜外（硬膜に）、経口（口腔によって）、経皮、硬膜上、脳内（大脳に）、脳室内（脳室に）、皮膚上（皮膚に塗布）、皮内（皮膚自体に）、皮下（皮膚下に）、経鼻投与（鼻を通じて）、静脈内（静脈に）、静脈内ボーラス、静脈内点滴、動脈内（動脈に）、筋肉内（筋肉に）、心臓内（心臓に）、骨内注入（骨髄に）、髄腔内（脊柱管に）、腹腔内（腹膜への注入または注射）、膀胱内注入、硝子体中（目を通じて）、空洞内注射（病的空洞に）、腔内（陰茎の基部（ｂａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｎｉｓ）に）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身分布のための無傷の皮膚を通じて拡散）、経粘膜（粘膜を通じて拡散）、経膣、吹送（経鼻吸引（ｓｎｏｒｔｉｎｇ））、舌下、唇下、浣腸、点眼（結膜上に）、点耳、耳（耳道内、またはそれによって）、頬側（頬側に対して）、結膜、皮膚、歯科的（歯に）、電気浸透、頸管内、静脈洞内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質性、腹腔内、羊膜内、関節内、胆管内、気管支内、滑液包内、軟骨内（軟骨の内部に）、馬尾内（馬尾の内部に）、槽内（小脳延髄大槽（ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｍｅｄｕｌａｒｉｓ）の内部に）、角膜内（角膜の内部に）、歯冠内（ｄｅｎｔａｌ ｉｎｔｒａｃｏｒｎａｌ）、冠内（冠動脈の内部に）、陰核海綿体内（陰茎の海綿体の膨張性空間の内部に）、椎間板内（椎間板の内部に）、管内（腺管の内部に）、十二指腸内（十二指腸の内部に）、硬膜内（硬膜の内部に、またはその下に）、表皮内（表皮に対して）、食道内（食道に対して）、胃内（胃の内部に）、歯肉内（歯肉の内部に）、回腸内（小腸遠位部の内部に）、病変内（局所病変の内部に、またはそれに直接導入される）、管腔内（管腔の内部に）、リンパ内（リンパの内部に）、髄内（骨髄腔の内部に）、髄膜内（髄膜の内部に）、眼内（眼の内部に）、卵巣内（卵巣の内部に）、心膜内（心膜の内部に）、胸膜内（胸膜の内部に）、前立腺内（前立腺の内部に）、肺内（肺またはその気管支の内部に）、洞内（鼻洞または眼窩周囲洞の内部に）、髄腔内（脊柱の内部に）、滑液包内（関節の滑膜腔の内部に）、腱内（腱の内部に）、精巣内（精巣の内部に）、くも膜下腔内（任意の脳脊髄軸レベルの脳脊髄液の内部に）、胸腔内（胸部の内部に）、管内（臓器細管の内部に）、腫瘍内（腫瘍の内部に）、鼓室内（中耳（ａｕｒｕｓ ｍｅｄｉａ）の内部に）、血管内（１つまたは複数の血管の内部に）、脳室内（脳室の内部に）、イオントフォレーシス（電流を用いて、ここでは可溶性塩のイオンが体の組織中に移動する）、潅注（開放創または体腔を浴洗し、またはフラッシュするため）、喉頭（喉頭上に直接）、経鼻胃（鼻から胃の中に）、密封包帯療法（局所経路投与、次いで包帯で被覆して範囲を閉塞する）、眼（外眼部に対して）、口腔咽頭（口及び咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（局所作用または全身作用のため経口的または経鼻的に吸入することによって気道の内部に）、球後（橋の後方または眼球の後方）、心筋内（心筋層の内部に）、軟部組織、クモ膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤（胎盤を通じて、またはそれにわたって）、経皮気管内（気管壁を通じて）、経鼓室（鼓室にわたって、またはそれを通じて）、尿管（尿管に対して）、尿道（尿道に対して）、腟内、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆管潅流、心潅流、フォトフェレーシス及び脊髄などの経路を介して投与してよい。
【0338】
投与様式には、注射、注入、点滴、及び／または経口摂取が含まれる。「注射」には、限定ではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、心室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経皮気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏ ｓｐｉｎａｌ）、及び胸骨内注射及び注入が含まれる。一部の例では、経路は静脈内である。細胞の送達では、注射または注入による投与を行うことができる。
【0339】
細胞を全身投与することができる。「全身投与」、「全身投与される」、「末梢投与」及び「末梢投与される」という語句は、標的部位、組織、または器官に直接以外で、代わりに、対象の循環系に入る、したがって、代謝及び他の同様のプロセスを受けるような前駆細胞の集団の投与を指す。
【0340】
疼痛を処置するための組成物を含む処置の有効性は、熟達した臨床医であれば決定することができる。しかしながら、ＳＣＮ１０Ａの徴候または症状のいずれか、もしくはすべて、しかし一例としては、そのレベルが有利に変化する（例えば、少なくとも１０％低下する）、または疾患の他の臨床的に認められる症状もしくはマーカーが改善もしくは寛解されれば、処置は「有効な処置」とみなされる。有効性をまた、入院または医療介入の必要によって評価されるような個体の悪化がない（例えば、疾患の進行が停止するか、または少なくとも減速する）ことによって測定することができる。これらの指標を測定する方法は、当業者に知られている、及び／または本明細書に記載されている。処置には、個体または動物（一部の非限定的例には、ヒト、または哺乳類が含まれる）における疾患の任意の処置が含まれ、（１）疾患を阻害すること、例えば、症状の進行を停止もしくは減速させること；または（２）疾患を軽減すること、例えば、症状の退縮をもたらすこと；及び（３）症状の発生を予防すること、またはその可能性を低下させることが含まれる。
【0341】
本開示による処置は、個体におけるＳＣＮ１０Ａタンパク質の量を低減する、または変化させることによって、疼痛と関連する１つまたは複数の症状を寛解させることができる。
【0342】
Ｖ．電位依存性ナトリウムチャネルタイプＸアルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）遺伝子の特徴及び特性
ＳＣＮ１０Ａは、先天性無痛覚、喘息、運動失調症、心房細動、乳房の悪性新生物、肥大型心筋症、心血管疾患、小脳疾患、消化不良、実験的自己免疫性脳脊髄炎、原発性肢端紅痛症、心ブロック、遺伝性感覚性ニューロパチー５型、痛覚過敏、急性骨髄性白血病、多発性硬化症、神経痛、神経芽細胞腫、疼痛、帯状疱疹後神経痛、タバコ使用障害、三叉神経痛、心室細動、滑液嚢胞、坐骨神経ニューロパチー、慢性疼痛、細動、血液腫瘍、心電図：Ｐ－Ｒ間隔、ニューロパチー、乳癌、中枢神経芽細胞腫、水痘帯状疱疹、ブルガダ症候群（障害）、粘液様嚢胞、チャネル病、圧迫性ニューロパチー、発作性激痛症、高度房室ブロック、小径線維ニューロパチー、及び家族性エピソード性疼痛症候群２等であるがこれらに限定されない疾患ならびに障害と関連している。本明細書に記載の方法のいずれかを使用したＳＣＮ１０Ａ遺伝子の編集を用いて、本明細書に記載の疾患及び障害の症状を治療、予防、及び／または軽減することがある。
ＳＣＮ１０Ａは、先天性無痛覚、喘息、運動失調症、心房細動、乳房の悪性新生物、肥大型心筋症、心血管疾患、小脳疾患、消化不良、実験的自己免疫性脳脊髄炎、原発性肢端紅痛症、心ブロック、遺伝性感覚性ニューロパチー５型、痛覚過敏、急性骨髄性白血病、多発性硬化症、神経痛、神経芽細胞腫、疼痛、帯状疱疹後神経痛、タバコ使用障害、三叉神経痛、心室細動、滑液嚢胞、坐骨神経ニューロパチー、慢性疼痛、細動、血液腫瘍、心電図：Ｐ－Ｒ間隔、ニューロパチー、乳癌、中枢神経芽細胞腫、水痘帯状疱疹、ブルガダ症候群（障害）、粘液様嚢胞、チャネル病、圧迫性ニューロパチー、発作性激痛症、高度房室ブロック、小径線維ニューロパチー、及び家族性エピソード性疼痛症候群２等であるがこれらに限定されない疾患ならびに障害と関連している。本明細書に記載の方法のいずれかを使用したＳＣＮ１０Ａ遺伝子の編集を用いて、本明細書に記載の疾患及び障害の症状を治療、予防、及び／または軽減することがある。
【0343】
遺伝子ＳＣＮ１０Ａは、ＮａＶ１．８と命名された電位依存性ナトリウムチャネルのアルファサブユニットをコードする。ＮａＶ１．８は、主に後根神経節の感覚ニューロンで発現され、神経因性疼痛の機序において重要な役割を果たす。ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の突然変異は、家族性エピソード性疼痛症候群２型の患者に見出されている。家族性エピソード性疼痛症候群２型は、稀な常染色体優性の神経障害であり、成人発症の足領域における発作性の疼痛を特徴とする。これらの症状の発現は、一般に高温、低温、化学物質、及びある特定の表面によって誘発される。患者はまた、接触過敏及び疼痛刺激に対する反応の亢進が生じている場合もある。現在、この疾患に利用できる治療法はない。暖かさが疼痛の症状の発現を和らげることが証明されている。ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の突然変異もまた、小径線維ニューロパチーの症状の約５パーセントに関与する。小径線維ニューロパチーは、激痛発作及び無痛症を特徴とする状態である。これらの疼痛発作は、通常、しびれ、刺すようなもしくは焼けるような、またはヒリヒリするもしくはかゆみのような皮膚の感覚異常として説明される。現在、小径線維末梢性ニューロパチーに対する治療法はない。治療の選択肢としては、静注免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）及び血漿交換が挙げられる。
【0344】
１つの例では、該遺伝子は、電位依存性ナトリウムチャネルタイプＸアルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）であり、これはまた、ナトリウム電位依存性チャネルアルファサブユニット１０、ナトリウムチャネル電位依存性タイプＸアルファポリペプチド、電位依存性ナトリウムチャネルサブユニットアルファＮａｖ１．８、ナトリウムチャネルタンパク質タイプＸサブユニットアルファ、末梢神経ナトリウムチャネル３、ＨＰＮ３、ＰＮ３、Ｎａｖ１．８、ＦＥＰＳ２、及びＳＮＳとも呼ばれる場合がある。ＳＣＮ１０Ａは、細胞遺伝学的位置３ｐ２２．２にあり、ゲノム座標は、リザーブ鎖（ｒｅｓｅｒｖｅ ｓｔｒａｎｄ）の３番染色体上の位置３８，６９６，８０２～３８，７９４，０１０である。ＳＣＮ１０Ａのヌクレオチド配列は、配列番号５３０３として示される。ＡＣ１１６０３８．１は、リバース鎖（ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｔｒａｎｄ）上のＳＣＮ１０Ａの上流の遺伝子であり、ＳＣＮ５Ａは、リバース鎖（ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｔｒａｎｄ）上のＳＣＮ１０Ａの下流の遺伝子である。ＳＣＮ１０Ａは、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤが６３３６、ＵｎｉｐｒｏｔのＩＤがＱ９Ｙ５Ｙ９、及びＥｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤがＥＮＳＧ０００００１８５３１３である。ＳＣＮ１０Ａは、６３８０のＳＮＰ、２６のイントロン、及び２７のエクソンを有する。Ｅｎｓｅｍｂｌのエクソン識別子ならびにイントロン及びエクソンの開始／終止部位を表３に示す。
【表3-1】
【表3-2】
【0345】
表４は、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースに基づくＳＣＮ１０Ａ遺伝子のすべての転写産物に関する情報を提供する。表４に提供するのは、Ｅｎｓｅｍｂｌの転写産物のＩＤ及び当該転写産物に関する対応するＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ、Ｅｎｓｅｍｂｌの翻訳ＩＤ及び当該タンパク質に関する対応するＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ、Ｅｎｓｅｍｂｌによって分類される転写産物配列のバイオタイプ、ならびに表３の情報に基づく転写産物のエクソン及びイントロンである。
【表4】
【0346】
ＳＣＮ１０Ａは、６３８０のＳＮＰを有し、このＳＣＮ１０Ａ遺伝子に関するＮＣＢＩのｒｓ番号及び／またはＵｎｉｐｒｏｔのＶＡＲ番号は、ｒｓ７６３０９８９、ｒｓ６７９５９７０、ｒｓ１２６３２９４２、ｒｓ６５９９２４１、ｒｓ３５３３２７０５、ＶＡＲ＿０６４７４８、ｒｓ１３８４０４７８３、ＶＡＲ＿０７０８７９、ＶＡＲ＿０７０８８０、ＶＡＲ＿０７０８８１、ＶＡＲ＿０７０８８２、ｒｓ１４２２１７２６９、ｒｓ１５１０９０７２９、ｒｓ４０７６７３７、ｒｓ４４２６６２３、ｒｓ４６２２８４７、ｒｓ５８４８４８６、ｒｓ４６７６５９６、ｒｓ４６７６５９７、ｒｓ４６７６５９８、ｒｓ６４２２１４３、ｒｓ６７６７９４８、ｒｓ６７７６０３４、ｒｓ６７６３６２８、ｒｓ６７８３１１０、ｒｓ６７７７７７５、ｒｓ６７６４４９３、ｒｓ６７９４９１４、ｒｓ６７８４３０３、ｒｓ６７９５８８０、ｒｓ６７９９０３８、ｒｓ６７８１７４０、ｒｓ６８０３１８９、ｒｓ６５９９２４３、ｒｓ６５９９２４４、ｒｓ６５９９２４５、ｒｓ６５９９２４６、ｒｓ６５９９２４７、ｒｓ６５９９２４８、ｒｓ６５９９２４９、ｒｓ６５９９２５２、ｒｓ６５９９２５３、ｒｓ６５９９２５６、ｒｓ６５９９２６０、ｒｓ６５９９２６１、ｒｓ６８００５４１、ｒｓ６７９０３９６、ｒｓ６７９７７６３、ｒｓ６７９８０８７、ｒｓ６７７５１９７、ｒｓ６７９０６２７、ｒｓ６７９８０１５、ｒｓ７４３０３２３、ｒｓ７４３０４３８、ｒｓ６５９９２５９、ｒｓ７４３０４５１、ｒｓ６８０２２９４、ｒｓ６７９１１７１、ｒｓ６７９３２２６、ｒｓ６５９９２５７、ｒｓ６５９９２５５、ｒｓ７４３０７２６、ｒｓ６５９９２５４、ｒｓ６５９９２５１、ｒｓ６５９９２５０、ｒｓ７４３１１４４、ｒｓ７３７３５９５、ｒｓ７３７４０３０、ｒｓ６５９９２４２、ｒｓ７３７４８０４、ｒｓ７３７５０３４、ｒｓ７３７５０３６、ｒｓ６５９９２４０、ｒｓ６５９９２３９、ｒｓ６７９６４５９、ｒｓ６７９６３３６、ｒｓ７４２８１６７、ｒｓ６７９９２５７、ｒｓ７４２８５３８、ｒｓ６７８０１０３、ｒｓ７４３２７８７、ｒｓ７４３２８０４、ｒｓ６７６３８７６、ｒｓ７４２９９４６、ｒｓ７４３３３０６、ｒｓ６７７１１５７、ｒｓ７４３３４３０、ｒｓ６７６７６９９、ｒｓ７６２８８７３、ｒｓ６７６３２８２、ｒｓ６７６７２８７、ｒｓ６７６７２８６、ｒｓ７６１７５４７、ｒｓ４６７６５９５、ｒｓ４６７６５９４、ｒｓ７６５０３８４、ｒｓ７６３５２２１、ｒｓ４６７６４７９、ｒｓ４６２９２７４、ｒｓ４４２６６２２、ｒｓ７６１０４８９、ｒｓ９８２５７６２、ｒｓ４４２０８０５、ｒｓ４４２０８０４、ｒｓ７６５１１０６、ｒｓ７６４１８４４、ｒｓ４４１７８０８、ｒｓ９８２７９４１、ｒｓ４４１４７７８、ｒｓ４３９０８６１、ｒｓ９３１１１９８、ｒｓ９８２８２６８、ｒｓ９８４７６６２、ｒｓ９８１１４９８、ｒｓ９８３６５３１、ｒｓ４３６９９７４、ｒｓ７６４４１２７、ｒｓ３９２３６９７、ｒｓ７６４４３３２、ｒｓ９８３６８５９、ｒｓ３９２３６９６、ｒｓ９６３７５３６、ｒｓ９８４４２６５、ｒｓ４０７２０９０、ｒｓ９８４４５７７、ｒｓ４０７２０８９、ｒｓ９８６１４５６、ｒｓ９８６２４４１、ｒｓ９８７５６１０、ｒｓ９８４６７７４、ｒｓ９８８４０５２、ｒｓ６８０１９５７、ｒｓ９８５１４７１、ｒｓ９９９０１３７、ｒｓ７４３０２８３、ｒｓ１１１２９８００、ｒｓ１１１２９８０１、ｒｓ１１１２９８０２、ｒｓ１１１２９８０３、ｒｓ７４３０４３９、ｒｓ１１１２９８０５、ｒｓ１１１２９８０６、ｒｓ７４３０４７７、ｒｓ７６１１４５６、ｒｓ１０２１２３３８、ｒｓ９８７８６０４、ｒｓ７４３０８６１、ｒｓ１０２１２５３５、ｒｓ７３７２６７２、ｒｓ７３７３３７３、ｒｓ６８０５１８７、ｒｓ１１７１０４６２、ｒｓ７３７４５９９、ｒｓ９８７９４７２、ｒｓ７４２６９５１、ｒｓ７４３１７０３、ｒｓ１１７１１８６０、ｒｓ１１７１１９３６、ｒｓ１１７１１９４１、ｒｓ９８７４４３６、ｒｓ６８０９２６４、ｒｓ１１７１２３５４、ｒｓ７４２８２３２、ｒｓ１１９２７８５６、ｒｓ７４３２７２７、ｒｓ１２４８７０９０、ｒｓ１２４９４０６５、ｒｓ７６１５１４０、ｒｓ１１７０７３３１、ｒｓ１２６３１９１８、ｒｓ１１９２８９０５、ｒｓ７４３３３５２、ｒｓ１１７０７９６１、ｒｓ１２４８７５５１、ｒｓ１１９２９６４５、ｒｓ１２４９５２０５、ｒｓ７４３３７２３、ｒｓ７４３３９５８、ｒｓ７６３９１０４、ｒｓ９８１５４５８、ｒｓ１２０５４２４５、ｒｓ１１７２１２８５、ｒｓ９８１５８９１、ｒｓ１１９２２０８２、ｒｓ７６１７９１９、ｒｓ１２６３４００１、ｒｓ７６３５３２５、ｒｓ１１７１６４９３、ｒｓ１２４８９２２１、ｒｓ１１９１５５６７、ｒｓ１２４９６７５０、ｒｓ１１７０９８２８、ｒｓ７６１８６２０、ｒｓ１１７１０１６１、ｒｓ１２４９７１７３、ｒｓ１２４９７８６８、ｒｓ１２４９７９１８、ｒｓ９８１６８１７、ｒｓ９８０９７９８、ｒｓ１２６３５８５９、ｒｓ１２６３５８６９、ｒｓ１２４９０４７８、ｒｓ７６４１７０２、ｒｓ９８１８０８７、ｒｓ１２６３６１５３、ｒｓ１１９２５００７、ｒｓ１２４９１５９３、ｒｓ１３３１５３８３、ｒｓ１１９１７８３５、ｒｓ９３１１１９６、ｒｓ９３１１１９７、ｒｓ９８２８７３７、ｒｓ９８２８９１２、ｒｓ９８２００４２、ｒｓ９８４８９７６、ｒｓ９８３０６８７、ｒｓ１３０７１３１１、ｒｓ２８５３５３９５、ｒｓ９８７６５６４、ｒｓ１１１２９７９９、ｒｓ１３０８７４４０、ｒｓ３５１６４５６７、ｒｓ１１１２９８０４、ｒｓ３４７５８５６８、ｒｓ３４２９２０４４、ｒｓ３４２９２３７７、ｒｓ１１１２９８０７、ｒｓ３４３１４５８３、ｒｓ１１１２９８０８、ｒｓ９８７２４８２、ｒｓ１０４２８１３２、ｒｓ３４８０４７５６、ｒｓ２８７０６１４９、ｒｓ１０４２８１６８、ｒｓ３５３９５５９１、ｒｓ３５３９６９１６、ｒｓ１１７１０４６１、ｒｓ３５３０１５３４、ｒｓ３４３９２３６０、ｒｓ９８６６５４０、ｒｓ３４３９７５１４、ｒｓ２８４４８３４９、ｒｓ１０６３７３３３、ｒｓ１１７１１０６２、ｒｓ９８７４６３３、ｒｓ３５４６３８２０、ｒｓ３５４６４５４７、ｒｓ１１７０５７３０、ｒｓ３４４５５８６１、ｒｓ１１７１９２４１、ｒｓ３５４８６８８０、ｒｓ１１３４４１１３、ｒｓ３４４７８０９４、ｒｓ３５４９６５４３、ｒｓ３４９１９０６７、ｒｓ１１７１４３９４、ｒｓ１１９２８９１７、ｒｓ１１３９６３９２、ｒｓ３４９２９２９６、ｒｓ５６６５４６８０、ｒｓ３４９３０８９３、ｒｓ５６６６１４７２、ｒｓ１１７１５５１３、ｒｓ３４５１５４３９、ｒｓ３４５１６１７９、ｒｓ５６７０４７６５、ｒｓ３４０７４７１５、ｒｓ１１７０８５８７、ｒｓ１２６３３２１４、ｒｓ３５９９３９３７、ｒｓ５６８２４３１８、ｒｓ１１９２１９１７、ｒｓ３４９８７０１４、ｒｓ１１９２２４１５、ｒｓ３４１０５５４３、ｒｓ５９４６８０１６、ｒｓ３４１５２４０７、ｒｓ１１７１６４６７、ｒｓ１１７１０００６、ｒｓ１２１７２９６２、ｒｓ３５６５２１０４、ｒｓ３５０４８３１１、ｒｓ１２１７２９６６、ｒｓ５７１２２７０６、ｒｓ３６０８５８２２、ｒｓ３５０５２２３８、ｒｓ１１９２４８４６、ｒｓ１２６３６１２３、ｒｓ３４６６７１４７、ｒｓ５８４１０５５１、ｒｓ１１９２６１５８、ｒｓ１２６３０７９５、ｒｓ５９６４０９４２、ｒｓ５７２０３６２４、ｒｓ１２６３８５３６、ｒｓ１２６３８５７２、ｒｓ３５７１０８３９、ｒｓ６０８４７４７６、ｒｓ３４７００４３１、ｒｓ１３０８５８０８、ｒｓ５６１２８８３７、ｒｓ６２２４２３９８、ｒｓ６２２４２３９９、ｒｓ１３３１９５０４、ｒｓ２８５２３３２３、ｒｓ６２２４２４３２、ｒｓ３４２６０３５９、ｒｓ２８５７０３４４、ｒｓ６２２４２４３５、ｒｓ３４７５６５８１、ｒｓ６２２４２４３８、ｒｓ６２２４２４４３、ｒｓ６２２４２４４４、ｒｓ３５２１２２７６、ｒｓ６２２４２４４６、ｒｓ６２２４２４４７、ｒｓ６２２４２４４８、ｒｓ６２２４２４５０、ｒｓ６２２４２４５３、ｒｓ５７３２６３９９、ｒｓ５９７３３６６８、ｒｓ３４７７７８０３、ｒｓ５７３４６２７５、ｒｓ１３３２５６２８、ｒｓ３４７８６３２６、ｒｓ３５３８９７５１、ｒｓ６０９６９３０９、ｒｓ６２２４４０６５、ｒｓ６２２４４０７０、ｒｓ６２２４４０７１、ｒｓ６２２４４０７２、ｒｓ６２２４４０７３、ｒｓ６２２４４０７４、ｒｓ６２２４４０７５、ｒｓ６２２４４０７６、ｒｓ３４８４６２５５、ｒｓ２８４３５４５８、ｒｓ６２２４４０７９、ｒｓ３４４２２５０５、ｒｓ３４８９０２４９、ｒｓ５５７９１３６６、ｒｓ３５４６６１０４、ｒｓ１３０９５４７７、ｒｓ３５９０４８２９、ｒｓ６２２４４１０７、ｒｓ６２２４４１０８、ｒｓ５５８４９７１３、ｒｓ６２２４４１１０、ｒｓ６２２４４１１１、ｒｓ５６４０６４４０、ｒｓ１３０９６８９３、ｒｓ３５５２３５４６、ｒｓ６１０１４９２５、ｒｓ５９８５６１０１、ｒｓ５９８５８９６５、ｒｓ１３０９８８２７、ｒｓ５９９１４１７８、ｒｓ３５９９３３３０、ｒｓ５８７９２３４９、ｒｓ５８８０２０１６、ｒｓ３５９９８２４９、ｒｓ５８８８３３９２、ｒｓ５８９１５８９５、ｒｓ３５８４７００６、ｒｓ５８１４１２７９、ｒｓ３６０５７８６２、ｒｓ５６０４０６３０、ｒｓ６０２１８４０１、ｒｓ５５７４２６０９、ｒｓ３４１７７３９３、ｒｓ５６０５１５６０、ｒｓ７１６３５８７６、ｒｓ６０２４０６５６、ｒｓ３４２０４６２１、ｒｓ３４２０５２５２、ｒｓ５５７７９９５７、ｒｓ６０７７３０８４、ｒｓ７１０８５３３５、ｒｓ７１０８５３３６、ｒｓ５９６３９７８５、ｒｓ６０３４９８０８、ｒｓ３５０９４３６０、ｒｓ３５０９５２６４、ｒｓ６０８７４２６５、ｒｓ５８０２５６３１、ｒｓ６２２４２４２９、ｒｓ６２２４２４３０、ｒｓ７１３２３６７３、ｒｓ７１３２３６７４、ｒｓ７１３２３６７５、ｒｓ７１３２３６７６、ｒｓ６２２４２４３３、ｒｓ７２８６４３７０、ｒｓ７２８６４３７７、ｒｓ６２２４２４３４、ｒｓ７２８６４３９２、ｒｓ７２８６６２３５、ｒｓ７２８６６２５３、ｒｓ６２２４２４３６、ｒｓ７２８６６２６０、ｒｓ７２８６６２６５、ｒｓ７２８６６２６６、ｒｓ７２８６６２６７、ｒｓ６２２４２４４５、ｒｓ７２８６６２７８、ｒｓ３５７３４４６３、ｒｓ６２２４３８６０、ｒｓ７３８２５８６３、ｒｓ６２２４３８６１、ｒｓ６２２４３８６２、ｒｓ７３８２５８６６、ｒｓ７３８２５８６７、ｒｓ７３８２５８７８、ｒｓ７３８２５８８０、ｒｓ６２２４４０７７、ｒｓ７２８６７８０８、ｒｓ７２８６９６１８、ｒｓ７２８６７８５５、ｒｓ７３８２５８６４、ｒｓ７３８２５８６５、ｒｓ７３８２５８８３、ｒｓ６２２４４０７８、ｒｓ７３８２６３２３、ｒｓ７３８２６３２４、ｒｓ６２２４４０８０、ｒｓ６２２４４０８１、ｒｓ７３８２６３５７、ｒｓ７３８２６３５８、ｒｓ６２２４４１０３、ｒｓ７４８４８７８４、ｒｓ６６６８９３３９、ｒｓ７４３４１０７３、ｒｓ６２２４４１０４、ｒｓ６２２４４１０５、ｒｓ７５８５９６１１、ｒｓ６２２４４１０６、ｒｓ７４９２８８８４、ｒｓ６２２４４１０９、ｒｓ６２２４４１１２、ｒｓ５９７９０６７１、ｒｓ７４４４５５１６、ｒｓ５８６８４９４６、ｒｓ５６２０６２１３、ｒｓ５８７６００１２、ｒｓ３５８１８４４０、ｒｓ６０１１８５３７、ｒｓ６８００１８６３、ｒｓ７７０１９１３３、ｒｓ５７８０３３９６、ｒｓ５５７４９３３１、ｒｓ７１６３５８７４、ｒｓ６１３４９１１９、ｒｓ６０２７８０９０、ｒｓ７１０８５３３４、ｒｓ５７９０５５２２、ｒｓ７３０６４５２９、ｒｓ６１４８７２３８、ｒｓ７３０６４５３６、ｒｓ５７９８９９６２、ｒｓ７３０６４５４８、ｒｓ７３０６４５５７、ｒｓ７３０６４５５９、ｒｓ６１５３３３７５、ｒｓ７７０４９３３７、ｒｓ７１３０１３００、ｒｓ６０５５４５４１、ｒｓ７４５４８８２３、ｒｓ７４５５１９２３、ｒｓ７４７９２９２４、ｒｓ７７０８４２６５、ｒｓ７６０１７４９８、ｒｓ７５４９７５１６、ｒｓ７２８６４３８０、ｒｓ７２８６６２５９、ｒｓ７２
８６６２７０、ｒｓ７２８６９６２０、ｒｓ７３８２５８８７、ｒｓ７５５０８２８７、ｒｓ７６５３５９３０、ｒｓ７４５８７２９３、ｒｓ７３８２６３０５、ｒｓ７３８２６３０６、ｒｓ７３８２６３１０、ｒｓ７５０８８９３７、ｒｓ７３８２６３２１、ｒｓ７７１３６８１３、ｒｓ７３８２６３２７、ｒｓ７５５６２９４６、ｒｓ７７５３９００９、ｒｓ７３８２６３３４、ｒｓ７５１６１４２７、ｒｓ７３８２６３５９、ｒｓ７６０９６３１２、ｒｓ７４３４８０９１、ｒｓ７６１０４７１１、ｒｓ７４６７５９３８、ｒｓ７５６１５８１２、ｒｓ７８０９５０８３、ｒｓ７４３６３９８７、ｒｓ７７２１６８０６、ｒｓ７５８６４７２５、ｒｓ７４４１９０４２、ｒｓ７４４２３８４９、ｒｓ７５２２３０９１、ｒｓ７９２１７９８１、ｒｓ７５８８８４７６、ｒｓ７６９８４９９３、ｒｓ７５６６０６３７、ｒｓ７７２６１７４４、ｒｓ７９２２８３１０、ｒｓ７６９８７４１２、ｒｓ７６４２４９５０、ｒｓ７６１８７３２５、ｒｓ７６７２４２７２、ｒｓ７６７２４６０１、ｒｓ７５９２７６７１、ｒｓ７７２９７３４５、ｒｓ７６７２８６１２、ｒｓ７７３０４５３８、ｒｓ７３０６０４４１、ｒｓ７３０６０４５９、ｒｓ７３０６２５７５、ｒｓ７５２８４８７３、ｒｓ７９２６７８９８、ｒｓ７９２６９９４５、ｒｓ７３０６２５７８、ｒｓ７５３１０９６４、ｒｓ７８７６８８５８、ｒｓ７３０６２５９７、ｒｓ７６４６２４５５、ｒｓ７６７８６７７６、ｒｓ７９７７３５２２、ｒｓ１１１６８２６４７、ｒｓ７４４９８９９１、ｒｓ７９７９３３６２、ｒｓ７５０１２４２７、ｒｓ７３０６４５１０、ｒｓ７６２９０６９４、ｒｓ７３０６４５３４、ｒｓ７８８２４５２１、ｒｓ７３０６４５４０、ｒｓ７６８４６４７７、ｒｓ７６８４９０６７、ｒｓ７８８３７６２２、ｒｓ７６８５３３１７、ｒｓ７６８５３７６３、ｒｓ７３０６４５６４、ｒｓ７５９９０４５７、ｒｓ７９８３９２３２、ｒｓ１１１７４９７７６、ｒｓ７５９９１７７７、ｒｓ７５０６２４０５、ｒｓ７７７８７３５８、ｒｓ７８３２６８００、ｒｓ７６５２３２９２、ｒｓ７６３５４９９１、ｒｓ７８８８１９８５、ｒｓ７５４９８３２７、ｒｓ７７８０４５２６、ｒｓ１１３２９５３９８、ｒｓ１１３２９８１８７、ｒｓ１１３２９８８５０、ｒｓ１１１７７１５１０、ｒｓ７５０７０６８２、ｒｓ１１４９４９８３１、ｒｓ７６５３４０５２、ｒｓ７８９１１２２７、ｒｓ７５０７４３４１、ｒｓ７８９１６４４３、ｒｓ７６５４２２０２、ｒｓ７５０８５３９３、ｒｓ７４５９８０４３、ｒｓ７７４９９９６８、ｒｓ７９８６８３４８、ｒｓ７５１０８２４０、ｒｓ７７８３３５４２、ｒｓ７５５５９８４０、ｒｓ７９４１４３４８、ｒｓ１１４９６３２１６、ｒｓ７８３７６０９６、ｒｓ７６６００４５２、ｒｓ７５１６５２２４、ｒｓ７６１０４１８６、ｒｓ７９４３２３２０、ｒｓ７４６８７６８４、ｒｓ１３８７９２４２９、ｒｓ７９９１９３７４、ｒｓ７６６５６２０５、ｒｓ７６６６６１６２、ｒｓ７４７１７８８５、ｒｓ１３８８０８７９１、ｒｓ１３８８０９５２３、ｒｓ１１６５９２９０３、ｒｓ７７６１４７４７、ｒｓ７８１３６６０３、ｒｓ７８４３０２１９、ｒｓ７７２７９１４９、ｒｓ１１３４４２３１７、ｒｓ１３８８３２８６８、ｒｓ７７６３９３３９、ｒｓ７６２０２４７９、ｒｓ７５２７３３４８、ｒｓ１１５０５３６０４、ｒｓ１１５０７０８２０、ｒｓ１１５０７９５８３、ｒｓ７５２７６２７３、ｒｓ１３８８８７０７０、ｒｓ７７６６６７７１、ｒｓ１１３５１０２４４、ｒｓ１３８９０６５１８、ｒｓ１１３５１７９００、ｒｓ７８７６４００４、ｒｓ７９０６５８１７、ｒｓ１１５１４５２９８、ｒｓ１１３５４６８９５、ｒｓ７６７８４９５７、ｒｓ７６２５０２７６、ｒｓ７９７８８２１３、ｒｓ１１５１７４５６７、ｒｓ７８２６８１５６、ｒｓ７５７８８９５１、ｒｓ８００５９４８６、ｒｓ１１１７０６０９２、ｒｓ１３８９８２１６８、ｒｓ７８５３３４８５、ｒｓ１１６７４７４８３、ｒｓ１１６７５７６３５、ｒｓ７７４００９９２、ｒｓ７７４２９６０９、ｒｓ７８５５５４０８、ｒｓ７７４３０４７０、ｒｓ１１６７７５１６５、ｒｓ７８５７２０３７、ｒｓ１１１７４９８８７、ｒｓ７８０３０６６２、ｒｓ１１５２７８９１６、ｒｓ７７４４７１５６、ｒｓ１１２０９６８６７、ｒｓ７７７９２３８２、ｒｓ１１１７６３４６０、ｒｓ１３９０７３５９０、ｒｓ１３９０７７５５２、ｒｓ１１３６４１２５８、ｒｓ１１５３０４８６２、ｒｓ７９６３７５８８、ｒｓ１１３３０７２４５、ｒｓ７８０７２２１６、ｒｓ１１５３２２６７２、ｒｓ１３９１２７３１９、ｒｓ７９６５７０５０、ｒｓ１１６８３９９０２、ｒｓ１１２１６７９２１、ｒｓ７８９１１１７２、ｒｓ１３９１４５７７１、ｒｓ７７４９４１１７、ｒｓ７７４９８６０２、ｒｓ１４０５８４６８０、ｒｓ７７８３２５４８、ｒｓ１４０５８６６４６、ｒｓ１４０５８６８３７、ｒｓ１１２２０８９４６、ｒｓ１４２２８５０２９、ｒｓ１３９１８３３１２、ｒｓ７８９２５９８６、ｒｓ１４２２９１７１０、ｒｓ１１５３９８６０９、ｒｓ７９６９６３３４、ｒｓ７９６９９９４８、ｒｓ１１１７８８６４５、ｒｓ７８３７５０７０、ｒｓ１１６９７８５１０、ｒｓ１３９２０２６８２、ｒｓ１４０６０９９９０、ｒｓ１３９２０９０９５、ｒｓ１１３７０２８５４、ｒｓ１４２２９０９０２、ｒｓ１４０６１２０２９、ｒｓ１１１７９１００３、ｒｓ１４４０１１６７６、ｒｓ１３９２３４０５１、ｒｓ１１３３４９０４８、ｒｓ１１７０５４２１４、ｒｓ１１５４６１４０１、ｒｓ１１５４６３８３０、ｒｓ１１３３５０２９２、ｒｓ１１７１２７９２１、ｒｓ１４４０３７６８７、ｒｓ１３８７８６１２７、ｒｓ１１７１７２０９６、ｒｓ８０２２６１７８、ｒｓ１４５６４１３１７、ｒｓ１１１８１８３６９、ｒｓ７８４０８０１０、ｒｓ１４５６４６７６６、ｒｓ８０２３１４７５、ｒｓ７８９７２２９１、ｒｓ１４５６５３２７０、ｒｓ１４０７０５０１２、ｒｓ１４４０６００４７、ｒｓ７８４２５１８０、ｒｓ７８４２５５５２、ｒｓ７９９５２０９６、ｒｓ１４２３７９５２９、ｒｓ１１５０４１７５２、ｒｓ１１７２９０５６９、ｒｓ１１３８２２１８２、ｒｓ１３８８３９５３９、ｒｓ１１６６２８１４９、ｒｓ１１７３２６０６２、ｒｓ１３９３３２１０１、ｒｓ８０２５５３３０、ｒｓ８０００２３５７、ｒｓ８０００６５１９、ｒｓ１１１９２９４４６、ｒｓ１４０７４７５６１、ｒｓ１１３８４６３２６、ｒｓ１３９３４２３８９、ｒｓ１３８９５３９２１、ｒｓ７８５１７４４１、ｒｓ１１７４１０７９４、ｒｓ１３９３５５４４９、ｒｓ１４５７１２１２４、ｒｓ１４４１０６４６４、ｒｓ１１５５４０６２２、ｒｓ１４０７８００００、ｒｓ７８５２１８２４、ｒｓ１１２４１２２８１、ｒｓ１４５７５６６４８、ｒｓ１４０７９７１８７、ｒｓ１４４１４１５０５、ｒｓ１１３９０５０５２、ｒｓ１１３９０６８７６、ｒｓ１４５７６３７９６、ｒｓ１１１９８７０８９、ｒｓ１４２４５２４０８、ｒｓ１１５５７８０３２、ｒｓ１４２４５６５４４、ｒｓ１１２４３８９０２、ｒｓ１１５１７６８４５、ｒｓ１１６７４０４６３、ｒｓ１１５２１０９８０、ｒｓ１１２４４８５９８、ｒｓ１３９０１５５１５、ｒｓ１１３９３９５１１、ｒｓ１３９０２６５７４、ｒｓ１１５２５３４４０、ｒｓ８０３２５３１７、ｒｓ１１５２７９５９０、ｒｓ１１２０９８６３８、ｒｓ１１３６３６２８８、ｒｓ８０１２８０３６、ｒｓ７９１７１４２３、ｒｓ１４０５６６２５２、ｒｓ１１３９９０９１７、ｒｓ１４５８４７８２０、ｒｓ１４０８７０６７１、ｒｓ１４２５２０９０４、ｒｓ１４２５３１４７８、ｒｓ１４２５３７３９２、ｒｓ１３９１６４３１１、ｒｓ８０３５３４５３、ｒｓ１４０６２０３６６、ｒｓ１４４２５８３２２、ｒｓ１１７９７１９４１、ｒｓ１４４２７０１３６、ｒｓ１１３７２１３５６、ｒｓ１４４２８０５７６、ｒｓ１４５９００４１１、ｒｓ１１２２４１７６３、ｒｓ１４５９０９１７２、ｒｓ１３９２２１２１９、ｒｓ１４２５７７８５８、ｒｓ８０１８９３３７、ｒｓ１３９４９７７８１、ｒｓ１４４３０４１６４、ｒｓ１４０９２４１７９、ｒｓ１１３７４３６２６、ｒｓ１４２６０７９７３、ｒｓ１４２６０９８６８、ｒｓ１４５６２３３６９、ｒｓ１４５６３８８５３、ｒｓ１４５６４４４３９、ｒｓ１４０６９４３０３、ｒｓ１１３７９５９３２、ｒｓ１４４０６０１０５、ｒｓ１４５９６６２４５、ｒｓ１４４３４３６２７、ｒｓ１４４３５０９５０、ｒｓ１３９３０３１１９、ｒｓ１３７８５８８２３、ｒｓ１１３８１５４２２、ｒｓ１４０７１８３０１、ｒｓ１４２６５３８４６、ｒｓ１４０９６７０５３、ｒｓ１１４１２１７８３、ｒｓ１１３８２３５０３、ｒｓ１４６００２７１０、ｒｓ１３９３１８１１８、ｒｓ１４６０１２９９７、ｒｓ１４５６９４２２２、ｒｓ１４４３９７３０５、ｒｓ１４０７４４１９０、ｒｓ１４５６９５７８８、ｒｓ１１２３７４１６４、ｒｓ１４６０３０３３５、ｒｓ１３７９０６７４０、ｒｓ１３７９０７６１９、ｒｓ１３９５９０５６１、ｒｓ１３９３４７６６１、ｒｓ１１５７５８５６３、ｒｓ１３９６０３８６３、ｒｓ１１５７７６８６２、ｒｓ１４２７３１９７３、ｒｓ１１４１９１１１７、ｒｓ１４０７８８０９６、ｒｓ１１３９１３３９５、ｒｓ１３７９３８１９７、ｒｓ１３９６２１７９６、ｒｓ１４０８１６９８９、ｒｓ１１４２０２７２８、ｒｓ１１２４４２６７７、ｒｓ１４１０３０３９８、ｒｓ１４５７９１５４１、ｒｓ１３９６３８４４６、ｒｓ１４０８２５８８９、ｒｓ１４２７７３６９６、ｒｓ１４１０４４１２６、ｒｓ１１５８２３２６８、ｒｓ１１２４５１１５９、ｒｓ１３９６５５０８５、ｒｓ１１５８２４５４０、ｒｓ１３７９７２５９３、ｒｓ１３９４３６４９６、ｒｓ８０３３０１０６、ｒｓ１１５８３７２４９、ｒｓ１１７７８１１９４、ｒｓ１４２８０４９０３、ｒｓ１４４２２０３２２、ｒｓ１１７８０４０１６、ｒｓ１３９４５３９９９、ｒｓ１１７８２６０９０、ｒｓ１３８０１３１９９、ｒｓ１４６１３６０００、ｒｓ８０３５３３５８、ｒｓ１４２５４０５９８、ｒｓ１１８０３１７４０、ｒｓ１１８０４８８９０、ｒｓ１１５８８７８１１、ｒｓ１１４０５８４００、ｒｓ１１１３３５０９０、ｒｓ１１４２６８２８８、ｒｓ１４６１４７５１７、ｒｓ１１２７７６９２２、ｒｓ１４１１２０３０３、ｒｓ１４２８８４４９９、ｒｓ１４５９１６３０３、ｒｓ１１２７９５６１２、ｒｓ１３９７７８４６５、ｒｓ１３８０６３６９９、ｒｓ１１５９３８７１２、ｒｓ１１２８０７１８５、ｒｓ１４６１５１６７０、ｒｓ１１５９４５８６７、ｒｓ１４１１５８８６７、ｒｓ１１２８１４２３９、ｒｓ１１８１４２５４６、ｒｓ１１２５５７７６５、ｒｓ１１２８２１６６４、ｒｓ１４２６１９３２８、ｒｓ１４６２１７３９１、ｒｓ１４４６３２７６９、ｒｓ１１８１７６５５６、ｒｓ１１１３９３１４４、ｒｓ１４１２０２７５３、ｒｓ１１４３４８７７７、ｒｓ１１４０８８４４４、ｒｓ１４２９５４４４０、ｒｓ１４２６２１１０６、ｒｓ１４２６２９０１６、ｒｓ１４２６４４４７２、ｒｓ１１４１０７８４６、ｒｓ１３９８７４１３４、ｒｓ１３７８５９８９８、ｒｓ１１６０１８８０８、ｒｓ１３９８８５９３５、ｒｓ１４６２５４８７４、ｒｓ１４４３７９６９３、ｒｓ１３９９１１３４６、ｒｓ１３９９１４４９８、ｒｓ１１４１３０６３８、ｒｓ１１４１３８８０５、ｒｓ１１２６０４４９６、ｒｓ１４２６９８７６４、ｒｓ１４６０２８８２９、ｒｓ１４１２７８７２９、ｒｓ１４１２８１２５０、ｒｓ１４１２８３９６２、ｒｓ１１５７５７４５７、ｒｓ１３８１６４４８７、ｒｓ１４１２９６６０２、ｒｓ１１１２８０９４７、ｒｓ１１６０７６９５８、ｒｓ１１４１９１９０１、ｒｓ１１６０８３１８２、ｒｓ１１２６６６７８１、ｒｓ１４１３１３６５８、ｒｓ１３９６２８７６４、ｒｓ１４４４８２５７２、ｒｓ１３９９８８５７７、ｒｓ１３９６４３１２５、ｒｓ１１５８２３８５８、ｒｓ１４４５０８１７７、ｒｓ１４１３６８５４８、ｒｓ１１２７１１６３６、ｒｓ１４６３３６
５６７、ｒｓ１４４７６３７９６、ｒｓ１３８２６２９２７、ｒｓ１４６３４７２６７、ｒｓ１１２７１８３７１、ｒｓ１１２９９２５８１、ｒｓ１１６１６０７８４、ｒｓ１４３１０１８８５、ｒｓ１４３１０５４３２、ｒｓ１３８２８６２５４、ｒｓ１３７９９１７６４、ｒｓ１４２８１３３４０、ｒｓ１３９６８７１８９、ｒｓ１４１０７２６６０、ｒｓ１３８２９８９９４、ｒｓ１３８２９９０５４、ｒｓ１１４２６６９７２、ｒｓ１１１５３５７５９、ｒｓ１４４５４６２４６、ｒｓ１１５８８０７５０、ｒｓ１１２７７４６９９、ｒｓ１４６３８６４４１、ｒｓ１３８３２９９０７、ｒｓ１４６３８８２８７、ｒｓ１３８３３２３５９、ｒｓ１１１５５８７６６、ｒｓ１４３１３８３８４、ｒｓ１４４５８３３５６、ｒｓ１４６４１０３２０、ｒｓ１３９７９３１６７、ｒｓ１１１５６０６３６、ｒｓ１４１４９３５２４、ｒｓ１４４８３１５５２、ｒｓ１１５９５４３３５、ｒｓ１１５９６１８９４、ｒｓ１４４６１８０１２、ｒｓ１１４３４６３２３、ｒｓ１４１２０７０４８、ｒｓ１３９８６１０６１、ｒｓ１３９８６８７０４、ｒｓ１１１６０８３５１、ｒｓ１３８４１３４３８、ｒｓ１３９８６９０２８、ｒｓ１３９８７１０１０、ｒｓ１４４８７２０８７、ｒｓ１４４６６３１３５、ｒｓ１４４６８２１６６、ｒｓ１４６２６６３９７、ｒｓ１３８４４１６３４、ｒｓ１３８１４０３８５、ｒｓ１４６５０４４５４、ｒｓ１３８４４６４３２、ｒｓ１１４６７５１９９、ｒｓ１１６２８３３３２、ｒｓ１４１２６５５５６、ｒｓ１４６２６９６９８、ｒｓ１４６５３６９８５、ｒｓ１３８１４７５５９、ｒｓ１４４７０１２８６、ｒｓ１３８４７９２０８、ｒｓ１１４４０６３７９、ｒｓ１４３０２４２１２、ｒｓ１４３２６４６１３、ｒｓ１４４９４４３６９、ｒｓ１４３０３１３０１、ｒｓ１４０２２６２３９、ｒｓ１１４７３０２７３、ｒｓ１４４９５３８６６、ｒｓ１４０２３１８３５、ｒｓ１４３２７７２７６、ｒｓ１４３０３３８０５、ｒｓ１４４９６２９８７、ｒｓ１４４９６５４０７、ｒｓ１１３２２８７２４、ｒｓ１１２９４７７５２、ｒｓ１４３０６１０６７、ｒｓ１３８５２２９５６、ｒｓ１１２９６２２８９、ｒｓ１４３０６７５８７、ｒｓ１３８２４４８３７、ｒｓ１３８５３２６５６、ｒｓ１４３０９２５６８、ｒｓ１１３００４３５３、ｒｓ１４４９９３６４２、ｒｓ１４１６２２５９９、ｒｓ１３８２９０８９３、ｒｓ１４４７８８２６８、ｒｓ１４０２８８１０３、ｒｓ１４５０３２０３７、ｒｓ１４８９１２８０１、ｒｓ１３８５８４６１４、ｒｓ１１６３７１６１２、ｒｓ１１４５２７３１６、ｒｓ１１１５３５６５１、ｒｓ１４０２９２３６１、ｒｓ１１６１８６２７５、ｒｓ１４７３４４３０５、ｒｓ１４００８３４８６、ｒｓ１１６３７８５３６、ｒｓ１４７３４５３６６、ｒｓ１４６６６２１４８、ｒｓ１４６６６５５０２、ｒｓ１１４５４３５２７、ｒｓ１４３１５００６４、ｒｓ１４０１２９２９１、ｒｓ１４０１２３９７７、ｒｓ１４７３６０５１８、ｒｓ１４７３７６２１５、ｒｓ１４８９６３９４２、ｒｓ１４０３０４４３３、ｒｓ１１１５８２４７０、ｒｓ１１４５９６１０６、ｒｓ１４６７０４３４９、ｒｓ１１１５８８３１８、ｒｓ１４６４３８７０５、ｒｓ１４８９７５１２４、ｒｓ１４１５１４８４８、ｒｓ１４０１５８３８７、ｒｓ１４６４７４０６２、ｒｓ１４３４１８２７９、ｒｓ１４３４２３７９６、ｒｓ１３８４１６００３、ｒｓ１４３１８５２７０、ｒｓ１４５１０６４７３、ｒｓ１４１７０３０６４、ｒｓ１４３４３８５５７、ｒｓ１４６４７９１０８、ｒｓ１４７４４５２５９、ｒｓ１１１６２０８８６、ｒｓ１４３２０８５０５、ｒｓ１４０２０３４４５、ｒｓ１４４９１９５３４、ｒｓ１４１５７５７１２、ｒｓ１４３４９１１６０、ｒｓ１３８４７７２０３、ｒｓ１４９０５２２４１、ｒｓ１４１７３８８８２、ｒｓ１４３４９６６６３、ｒｓ１４６５４２５４９、ｒｓ１３８７０２８６４、ｒｓ１３８４８９６３９、ｒｓ１４０２２６１３１、ｒｓ１４７４８２５２０、ｒｓ１１６３１７２７７、ｒｓ１４５１８２２８７、ｒｓ１４３５２３４０３、ｒｓ１４６５８２６９６、ｒｓ１４０４５３３７８、ｒｓ１１６５２９７４３、ｒｓ１４１７６３３７７、ｒｓ１４０２３９１１３、ｒｓ１４１７６７８４９、ｒｓ１４９１０２６３２、ｒｓ１４９１０３８０５、ｒｓ１４６５９３３７１、ｒｓ１４６５９６５９９、ｒｓ１３８７３９４１８、ｒｓ１３８７３９９８４、ｒｓ１４９１２３５１４、ｒｓ１４７２８９７２５、ｒｓ１４５２３８７２９、ｒｓ１４３３０３６８８、ｒｓ１４０４９０２２３、ｒｓ１４５２４３２７０、ｒｓ１４５２４５０８６、ｒｓ１３８５４０３４０、ｒｓ１４０２７３２９７、ｒｓ１３８７５１０９７、ｒｓ１１６３５３９２９、ｒｓ１４７５４９８７３、ｒｓ１４１８０１０２２、ｒｓ１４５０３４５１５、ｒｓ１４１８０８５９１、ｒｓ１３８７６０７８２、ｒｓ１４０２９２３５８、ｒｓ１４１６４８６４１、ｒｓ１１６３７８５２１、ｒｓ１３８７６９９１０、ｒｓ１４７３５４９４１、ｒｓ１４９１６７４３６、ｒｓ１４５０５１４５３、ｒｓ１４３３９９６８１、ｒｓ１４６６８９５７６、ｒｓ１８３５６５６７１、ｒｓ１８３５６１９１２、ｒｓ１５０６８６４８７、ｒｓ１８３５７３４０２、ｒｓ１８３５７７３４５、ｒｓ１８３５８０６０４、ｒｓ１８３５８１１５５、ｒｓ１４８９６５６７５、ｒｓ１８３５６９８３６、ｒｓ１４１８６９７３３、ｒｓ１４５２９８３８６、ｒｓ１４６９０１４９５、ｒｓ１４６６９９７７５、ｒｓ１４０３３０６８５、ｒｓ１４９２２９５３２、ｒｓ１４３６６８８８９、ｒｓ１４３４１１４７０、ｒｓ１４７６２２４３１、ｒｓ１４５３１３５７８、ｒｓ１８３６１５３９６、ｒｓ１４５０９２１７２、ｒｓ１５０７２９９９１、ｒｓ１４８９７９４３８、ｒｓ１４６７１１４７６、ｒｓ１４３６８７２２４、ｒｓ１４１９０６３０９、ｒｓ１１６４３７２８４、ｒｓ１４７６３６９２２、ｒｓ１４７６４０８１１、ｒｓ１４３４２７５７４、ｒｓ１４３４５１１１８、ｒｓ１４３７０８０３３、ｒｓ１４９０２７４１１、ｒｓ１８１８６５２９３、ｒｓ１４３７０９６４３、ｒｓ１４５３４００２７、ｒｓ１４１７２３９３５、ｒｓ１８５５２２６２２、ｒｓ１８５５２２８１０、ｒｓ１８１８６９４６５、ｒｓ１８５５２５１４２、ｒｓ１４１９３０２４３、ｒｓ１８１８７１００３、ｒｓ１８５５２６８２３、ｒｓ１４７６６０３４４、ｒｓ１４６７６９２１０、ｒｓ１４３４７８７４４、ｒｓ１４６７７５０４８、ｒｓ１８５５３９１９５、ｒｓ１４０４１３９７２、ｒｓ１４７４６８２５２、ｒｓ１４７４７７９３８、ｒｓ１４６９５５４３４、ｒｓ１４１９５３２４６、ｒｓ１４０４３４２２７、ｒｓ１４０４３６４９７、ｒｓ１４３７４４７９６、ｒｓ１４５３６４４１２、ｒｓ１３８７１８０９１、ｒｓ１４９３０１３５９、ｒｓ１４６９６５００５、ｒｓ１５０８１７１６２、ｒｓ１４６９８５５７８、ｒｓ１８５５９３６９４、ｒｓ１８５６０２７１８、ｒｓ１４６８１１７７１、ｒｓ１４０４７３６４３、ｒｓ１４６９９９８０７、ｒｓ１３８７３８４７１、ｒｓ１４６８３２７５２、ｒｓ１４７７４８９３６、ｒｓ１４３８１６７９０、ｒｓ１８３７６８９３０、ｒｓ１３８７４６９６５、ｒｓ１８３７８８９４２、ｒｓ１４９３９９８４８、ｒｓ１８３７９１４２７、ｒｓ１５０９２３７５３、ｒｓ１８３７９９７３０、ｒｓ１４３５７５６４３、ｒｓ１８３８０５９３９、ｒｓ１４２０９３９２３、ｒｓ１８３８１８０１８、ｒｓ１４９１３６１０９、ｒｓ１８３８２２５６４、ｒｓ１８３８３１１９５、ｒｓ１８５７１１９７３、ｒｓ１５０６３６８３１、ｒｓ１４１８０６７７４、ｒｓ１４７８０３０２８、ｒｓ１４５４８１７８８、ｒｓ１５０９７２１４７、ｒｓ１４１８１０２６６、ｒｓ１４９１５５３５２、ｒｓ１４７０８００１１、ｒｓ１８５７４５９８５、ｒｓ１４３６０１３１６、ｒｓ１４７０８９４５５、ｒｓ１４１８２８５７７、ｒｓ１４３６１０２９７、ｒｓ１８５７５４７１０、ｒｓ１４２１６３０９２、ｒｓ１８５７５６１０８、ｒｓ１５０６７１２５１、ｒｓ１４１８６１２００、ｒｓ１４２１７３７３５、ｒｓ１５１０２５１７５、ｒｓ１４７８３５０３４、ｒｓ１４２１７７７９１、ｒｓ１４７８３６３８０、ｒｓ１８５７７９７２９、ｒｓ１４７８４４６０７、ｒｓ１８３５８４０４６、ｒｓ１４９４９６１６３、ｒｓ１４１８７８２１２、ｒｓ１８３９２１１７４、ｒｓ１８５７９６３６０、ｒｓ１５０７１１８６７、ｒｓ１４５３１１０９８、ｒｓ１４７６２７０８３、ｒｓ１４９５０４１０３、ｒｓ１８１８５０２３０、ｒｓ１４７１３０８９１、ｒｓ１８２０６５３０４、ｒｓ１４７１５０４３８、ｒｓ１４７１５０８３１、ｒｓ１４１９０２９８６、ｒｓ１４３６８８９２１、ｒｓ１４５３３４３１０、ｒｓ１４９２６３１４９、ｒｓ１５１１０２８８１、ｒｓ１４５３３７１１０、ｒｓ１４５５５５９７４、ｒｓ１４２２３５２５６、ｒｓ１４５３４０６８５、ｒｓ１８５５３４９３９、ｒｓ１５０７７３４３７、ｒｓ１８２０９９７８０、ｒｓ１４３７２７５１５、ｒｓ１５１１２２２５３、ｒｓ１４９５４３３８８、ｒｓ１４５５６８４３５、ｒｓ１８２１１４２０２、ｒｓ１４２２５４８６５、ｒｓ１８２１１６１３３、ｒｓ１４５５８５３９９、ｒｓ１４９２８４３４０、ｒｓ１５０７８１６５５、ｒｓ１４５５８９２４１、ｒｓ１５１１５３６３９、ｒｓ１８１８８３３９０、ｒｓ１８５８９２８０５、ｒｓ１８１８８６５４０、ｒｓ１８１８８７８４８、ｒｓ１４２２７６６８９、ｒｓ１５０７９４６１１、ｒｓ１５１１６４０５７、ｒｓ１４３７８５３６１、ｒｓ１４７７２６２３３、ｒｓ１８２１５０３９９、ｒｓ１５０８６９５３９、ｒｓ１８９０８７２４６、ｒｓ１４７２４５５５８、ｒｓ１４７２４６７２５、ｒｓ１８５９１３９９８、ｒｓ１４７２４８２０２、ｒｓ１８２１５９３１０、ｒｓ１８７２９４９８８、ｒｓ１８５６２２５２２、ｒｓ１４３８３６１３７、ｒｓ１８２１６４１６２、ｒｓ１８９０９５７５４、ｒｓ１８３８０２５５８、ｒｓ１８２１７２５５８、ｒｓ１８２１７２６２３、ｒｓ１８５９２５２０１、ｒｓ１４９４２３４２０、ｒｓ１９０７５１３１４、ｒｓ１４９４３８２３５、ｒｓ１８４０６７６２３、ｒｓ１８２１８２８５８、ｒｓ１８７３２１８８５、ｒｓ１４２１２４２１６、ｒｓ１４２１３０６６２、ｒｓ１４７９６１６９２、ｒｓ１８７３４４１８８、ｒｓ１８７３４５４２９、ｒｓ１８７３４７９４４、ｒｓ１５０９７７１４９、ｒｓ１５１２３６２２５、ｒｓ１４２１５３５８０、ｒｓ１４５４９８５８２、ｒｓ１４９６１８７２５、ｒｓ１４７０９３５４１、ｒｓ１４７９８９５５３、ｒｓ１８５７６３０９４、ｒｓ１４９６２８１６２、ｒｓ１９２５４３７０９、ｒｓ１４３９２００５３、ｒｓ１４９４９１６０８、ｒｓ１９０８１９０６２、ｒｓ１８６００１９６７、ｒｓ１４３９３７１２３、ｒｓ１４７１２７６９５、ｒｓ１４３９４４２５１、ｒｓ１８６０１８４４７、ｒｓ１９０８３８００７、ｒｓ１４２２０３３９８、ｒｓ１４２２０３４３９、ｒｓ１５１３０３３４６、ｒｓ１４８０４４３８２、ｒｓ１８２０７０９４０、ｒｓ１４８０４６２８６、ｒｓ１８６０３７２２１、ｒｓ１９０８５６７６８、ｒｓ１８９１６６５５４、ｒｓ１４９６７３０４９、ｒｓ１４９６８２０８９、ｒｓ１８２０８４８００、ｒｓ１５１１００７３８、ｒｓ１４９６８５９５３、ｒｓ１４３９７５０３０、ｒｓ１８６０８３５３５、ｒｓ１８６０８８９３２、ｒｓ１８６０９７２９１、ｒｓ１４５５６０５９０、ｒｓ１４２２４１２１０、ｒｓ１８９２０８６１４、ｒｓ１４８１１８０１４、ｒｓ１８０６９３５２８、ｒｓ１８９２１１４０９、ｒｓ１４２２４１８４２、ｒｓ１８９２２０３３７、ｒｓ１４２２４３７４７、ｒｓ１４９７３４０１７、ｒｓ１８４０１５３１０、ｒｓ１８２３６９８１１、ｒｓ１４９５５８９６５、ｒｓ１８９２３２４００、ｒｓ１４８１３８９６８、ｒｓ１８０７１５５８３、ｒｓ１８４０２１５９５、ｒｓ１８２１３６８６７、ｒｓ１８４０２４６７７、ｒｓ１４９
５６７３７５、ｒｓ１４７２３５７６２、ｒｓ１８９２４４８９３、ｒｓ１８４２５３０７４、ｒｓ１８０７２２７４６、ｒｓ１８９２４７０１１、ｒｓ１８４２５３９２３、ｒｓ１４７２３８４９４、ｒｓ１４２２８３４１５、ｒｓ１９２６８０７４５、ｒｓ１９２６８４２３４、ｒｓ１８０７４３２３３、ｒｓ１８２４１１８７９、ｒｓ１４７２４８５６６、ｒｓ１４８１８１３４８、ｒｓ１８２４１８２８６、ｒｓ１８２４２１３１９、ｒｓ１５１１８２５４２、ｒｓ１８０７５８５９０、ｒｓ１８７５６６６３７、ｒｓ１８７５６８４２９、ｒｓ１８２４３５２８２、ｒｓ１８９０９７６８６、ｒｓ１８７５７７２３２、ｒｓ１４７９４２４０５、ｒｓ１８２１８０３２５、ｒｓ１８９３２１１３８、ｒｓ１８７５９３４０１、ｒｓ１４７９５２３３１、ｒｓ１８４０７４６８１、ｒｓ１９２７６１４４９、ｒｓ１９０７８１７４９、ｒｓ１８７３５５５０９、ｒｓ１４８２５５０９３、ｒｓ１４８２５６７０７、ｒｓ１４７９７９５４５、ｒｓ１９２５３２３１８、ｒｓ１４９８８３８９９、ｒｓ１９１０７４４８９、ｒｓ１８７３６４１０５、ｒｓ１９０８０９３３５、ｒｓ１９１０８３６５８、ｒｓ１９０８１００５２、ｒｓ１９２８１９００９、ｒｓ１８６３０１５８３、ｒｓ１９２８２７０４５、ｒｓ１９１１１００８４、ｒｓ１４９９３１０８１、ｒｓ１８２５４９５４５、ｒｓ１４８３３０４３３、ｒｓ１８２５５５１５８、ｒｓ１４９６４２９５７、ｒｓ１８２５６２１１４、ｒｓ１９０８３２２８２、ｒｓ１４９９５４５０９、ｒｓ１８６３３４８６１、ｒｓ１５１２９１５２３、ｒｓ１８６３５１７２５、ｒｓ１９２５６９２６１、ｒｓ１８６３５３０７７、ｒｓ１４８３６４８３２、ｒｓ１８６３５５１３６、ｒｓ１４８０４１３７１、ｒｓ１８６０３１４１３、ｒｓ１８６３６０２１９、ｒｓ１８９４６０９８５、ｒｓ１８９４６３１６３、ｒｓ１８４１８３３３８、ｒｓ１５１３３０７８４、ｒｓ１８９１８２３６５、ｒｓ１８６０７９２６７、ｒｓ１８６０９９０２８、ｒｓ１８４２１８９５９、ｒｓ１８９２１６６００、ｒｓ１４８１２９６８８、ｒｓ１８０７０６７８３、ｒｓ１８４２３６７７４、ｒｓ１９２９０１９１４、ｒｓ１８７７６５６２６、ｒｓ１８４４９５３３１、ｒｓ１８９４８７１１７、ｒｓ１５００１８７７０、ｒｓ１８９４９４０７５、ｒｓ１８０７１７１７３、ｒｓ１８９５０４２６９、ｒｓ１９２６７０７１７、ｒｓ１４８４２９４３８、ｒｓ１８７５１１６４０、ｒｓ１８４２４９８９８、ｒｓ１９１２３４４８５、ｒｓ１８２３８７０８０、ｒｓ１８７８０８１３７、ｒｓ１８２６７３３６７、ｒｓ１８４５４５２９７、ｒｓ１４８４５０２７４、ｒｓ１９１２４６４０７、ｒｓ１８６１３８２１６、ｒｓ１９１２５０４３２、ｒｓ１８２３９０５５７、ｒｓ１８７８４１４２０、ｒｓ１８６４７３０８５、ｒｓ１８７８５５５４１、ｒｓ１５０１１１７２２、ｒｓ１５０１１２７３５、ｒｓ１９２７０４６９４、ｒｓ１８０７５５３５６、ｒｓ１８６１９４２６８、ｒｓ１９２７４１７９３、ｒｓ１５０１２７５６７、ｒｓ１８０９９３３５３、ｒｓ１４９８２５６５９、ｒｓ１４８５０４９５５、ｒｓ１８７６０３９６６、ｒｓ１８４３４４１３７、ｒｓ１９１０４１５１５、ｒｓ１８１０１２７６０、ｒｓ１９１０５０４３３、ｒｓ１９１０５６９１１、ｒｓ１４８５２７７４３、ｒｓ１８１０２８９４５、ｒｓ１８２７８２２２３、ｒｓ１９３０６８８９２、ｒｓ１４９８７９１８３、ｒｓ１４９８９２２１８、ｒｓ１８４３９３７９８、ｒｓ１９２８１４８９６、ｒｓ１４８３３９４６２、ｒｓ１８９６５１１５１、ｒｓ１９１１４１５５２、ｒｓ１９１３６７６８６、ｒｓ１９１３６８３１９、ｒｓ１９１３７０５０７、ｒｓ１９３０９２７１０、ｒｓ１９１３７１９０７、ｒｓ１９１３７８９８１、ｒｓ１８７７２２５８６、ｒｓ１８９６７６９４５、ｒｓ１９１３９７１３９、ｒｓ１８９４５３２７１、ｒｓ１９１３９９２４７、ｒｓ１９１１５７４７１、ｒｓ１４８５７７０１１、ｒｓ１８４４６０５７５、ｒｓ１８７９９２９３２、ｒｓ１４８５８６８４９、ｒｓ１８４７０７５１１、ｒｓ１８６３６４６２５、ｒｓ１５０２４７７７５、ｒｓ１８９４６８１４７、ｒｓ１８８００８７７４、ｒｓ１８４７１８２９５、ｒｓ１８４４７２２７０、ｒｓ１５０２６０６９３、ｒｓ１８９７２３２５７、ｒｓ１８８０２２６０４、ｒｓ１５０２７０６５２、ｒｓ１８７７４１９４２、ｒｓ１８８０２６８４５、ｒｓ１８９７３６１６５、ｒｓ１９３１７１１５４、ｒｓ１８４４７４２８９、ｒｓ１９３１７６７０７、ｒｓ１８６６５９２１３、ｒｓ１４８６１９５９８、ｒｓ１８９４７１６９６、ｒｓ１８６６６５４０７、ｒｓ１８９７５８９１７、ｒｓ１８４４８００３１、ｒｓ１８９４７５５３７、ｒｓ１４８３９２７８０、ｒｓ１５０００６６６６、ｒｓ１８７７８０６８６、ｒｓ１８４５２１５２０、ｒｓ１５００４１８１３、ｒｓ１８６６９９１５８、ｒｓ１９３２３０３８７、ｒｓ１９３２３５４２５、ｒｓ１９２９４１２１０、ｒｓ１９２９４６２７６、ｒｓ１８４５５０５９４、ｒｓ１８２６９０１００、ｒｓ１８２７２６７２９、ｒｓ１８２７３１４０７、ｒｓ１８８１０４５０２、ｒｓ１４８６６３０９８、ｒｓ１８８１２２５０３、ｒｓ１８３００１４６３、ｒｓ１９３０１３３２６、ｒｓ１５０１２３１１０、ｒｓ１８１２６３２０１、ｒｓ１４８５０４７４０、ｒｓ１９３０２８７１５、ｒｓ１８１２６５８５６、ｒｓ１８３０１１７３５、ｒｓ１８４８３５７１２、ｒｓ１９３０３５８６４、ｒｓ１８１０１０８３１、ｒｓ１８４８３７６７４、ｒｓ１８１０１４３５８、ｒｓ１８１２７５３００、ｒｓ１８３０２２９９３、ｒｓ１８１２７８０７８、ｒｓ１８１２８０５７４、ｒｓ１８３０３０７４３、ｒｓ１４８６９１４９４、ｒｓ１４８５２５９７４、ｒｓ１５０３８５２７７、ｒｓ１８６７７９９６８、ｒｓ１５０３９２９２３、ｒｓ１９１５９０１１７、ｒｓ１８９８８５１７２、ｒｓ１８１０３５４８３、ｒｓ１８８１７５４３６、ｒｓ１８８１７７０８９、ｒｓ１８２７８７９５７、ｒｓ１５０４０４８０２、ｒｓ１４８５３７６５３、ｒｓ１８２７９０８８５、ｒｓ１９９５０３４３９、ｒｓ１８８１９０８４２、ｒｓ１８２７９６８９３、ｒｓ１８９９０２２９２、ｒｓ１８１０４８５６１、ｒｓ１９９５１８０７８、ｒｓ１９１３８９１０７、ｒｓ１８４６８７６０８、ｒｓ１８４６９２７３０、ｒｓ１９１６３０３９２、ｒｓ１８９９２９３８８、ｒｓ１５０４２７７８８、ｒｓ１９３１３６８５７、ｒｓ１８７９９８８５０、ｒｓ１９９５３５８６３、ｒｓ１９９５３７６８５、ｒｓ１８８００２６７８、ｒｓ１８４７２０２８１、ｒｓ１９９５４２６８５、ｒｓ１５０４４２００７、ｒｓ１９１６５１３０８、ｒｓ１８４９３７３８３、ｒｓ１４８７４８２４８、ｒｓ１９１６６１５０４、ｒｓ１８４７３３４１０、ｒｓ１８４９４６８９６、ｒｓ１８４９５５１４３、ｒｓ１８４９６１４２３、ｒｓ１８９９８１８１１、ｒｓ１９１６２４００１、ｒｓ１８８２８１４５７、ｒｓ１９１６２５６３２、ｒｓ１４８７３４３２７、ｒｓ１９１６３９３１６、ｒｓ１８４９２５２４９、ｒｓ１８９７４１２８３、ｒｓ１８９７５３２６６、ｒｓ１４８７８５００１、ｒｓ１９０００３２９４、ｒｓ１４８６２６８４５、ｒｓ１５０３０１００２、ｒｓ１８６６７４１６３、ｒｓ１９９６１８６３３、ｒｓ１８１１９１５７７、ｒｓ１８３２０４４５３、ｒｓ１９００３２５６５、ｒｓ１８１４７０２２９、ｒｓ１４８６３９６３４、ｒｓ１８８０６８４９０、ｒｓ１８１４７８３８４、ｒｓ１８６６９４２０７、ｒｓ１５０３３３３３７、ｒｓ１９３２４４４３３、ｒｓ１５０５２２４１９、ｒｓ１８１４９０７６１、ｒｓ１８８１０２８４８、ｒｓ１４８６５７８５６、ｒｓ１５０５３２１３２、ｒｓ１５０３４２２０９、ｒｓ１８８３５８９６１、ｒｓ１８２９８１０６４、ｒｓ１８８３６７９３６、ｒｓ１８６９４０６６６、ｒｓ１８１５１４５８７、ｒｓ１８１５２４６６５、ｒｓ１８６７４０５８９、ｒｓ１８３００６０８０、ｒｓ１８５０８９４４０、ｒｓ１８８１３４２５０、ｒｓ１８４８３１２２０、ｒｓ１８８４００１０９、ｒｓ１８３２８３７４４、ｒｓ１８６７５３０７９、ｒｓ１９９７００３１８、ｒｓ１９９７０３２０３、ｒｓ１８３０１５２２８、ｒｓ１８３２９０４２７、ｒｓ１８３２９０８１７、ｒｓ１４８９０５１１０、ｒｓ１８８４１３４１０、ｒｓ１８３０１９８９１、ｒｓ１８８４１８４５６、ｒｓ１９９７１５８５５、ｒｓ１９０１２６４０８、ｒｓ１８６９８１３３２、ｒｓ１５０５８４１７０、ｒｓ１５０３８３７００、ｒｓ１８６９８８３１９、ｒｓ１９９７３４７１０、ｒｓ１８１３０７１１８、ｒｓ１９１６００９２０、ｒｓ１９１６１０６４２、ｒｓ１４８７１５８５２、ｒｓ１９１８６９２６３、ｒｓ１８９９０１９３１、ｒｓ１９９５１７４４８、ｒｓ１８９９１６８０７、ｒｓ１８９９８５９２０、ｒｓ１５０４７６７１３、ｒｓ１９０１７８５４２、ｒｓ１９９５４１４８２、ｒｓ１９９５５６２８９、ｒｓ１８５１８４７８２、ｒｓ１９１８９４４５７、ｒｓ１５０４８０７７３、ｒｓ２０２０４０６５９、ｒｓ１４８７７８６１２、ｒｓ１９１９２５７５２、ｒｓ１４８７８０２２０、ｒｓ１８６８８５７１６、ｒｓ１９０１７６４７２、ｒｓ１９９５９３８９８、ｒｓ１８１６６５８８３、ｒｓ１８３４０６４６４、ｒｓ２０２０６３６３２、ｒｓ１８３４１２３８０、ｒｓ１９０２４０９７１、ｒｓ１９００１４３９５、ｒｓ１５０５０１０６５、ｒｓ１８３４１７２２５、ｒｓ１８１４６０６１１、ｒｓ１９１９５８８５４、ｒｓ１８１４６２４６１、ｒｓ１９０２７２５３３、ｒｓ１８５２８１３１９、ｒｓ２０２０９４２０６、ｒｓ１９９８６５４４６、ｒｓ１８５２８７０２４、ｒｓ１８８５８２０９１、ｒｓ１８５２９９０５０、ｒｓ１８５０２４４３８、ｒｓ１８１４７５６３８、ｒｓ１８８３３８９６４、ｒｓ１８１４８３９２３、ｒｓ１９９６４１７３６、ｒｓ１９９６４５９０４、ｒｓ１８６９２９３１４、ｒｓ１９０３０８４９２、ｒｓ２０２１１７０１２、ｒｓ１９９８９２１９０、ｒｓ１４８８５１８９０、ｒｓ１８８３６５９０２、ｒｓ１４８８７５３６５、ｒｓ１８５０８６９３８、ｒｓ１８７１３７４７５、ｒｓ１８６９６６０７６、ｒｓ１８８３９９８１６、ｒｓ１８８６３０６３０、ｒｓ１８７１４７７５５、ｒｓ２０２１３１９７６、ｒｓ１８７１５４２７８、ｒｓ２０２１３４３３０、ｒｓ１５０５６５３１０、ｒｓ１８７１６４６５４、ｒｓ２０２１４３５１６、ｒｓ１９９７０４４４３、ｒｓ１８８６５６０４１、ｒｓ１８３２９５０５２、ｒｓ１８３５３９８５８、ｒｓ３６９３９０６６８、ｒｓ１８７１９３７５９、ｒｓ３６９３９９４２４、ｒｓ１９９７２７９９９、ｒｓ１８６９９３３０３、ｒｓ２０２１７４４７２、ｒｓ１９９９７３７７７、ｒｓ１９０１４７３４７、ｒｓ１９２０９５９６５、ｒｓ１８８４４４６４２、ｒｓ１９０１５８１４３、ｒｓ１９０１６２１６８、ｒｓ３７１４４６７３３、ｒｓ１９９７５８８４５、ｒｓ３７１４５２２０５、ｒｓ２０２１８９２５８、ｒｓ２００５８４４１６、ｒｓ１９１８７８９３６、ｒｓ３７１４６３２７７、ｒｓ３７３４９２７０３、ｒｓ１８３３４４８９８、ｒｓ２０２１９７７７６、ｒｓ２０２０２９２０１、ｒｓ２０２１９９９６６、ｒｓ３７３５０４８６３、ｒｓ３７５５７２９１７、ｒｓ１９２１４６７８２、ｒｓ１９９７８７７７５、ｒｓ３６９４７１２１２、ｒｓ２００６０１５９１、ｒｓ２０２０２５１９７、ｒｓ１９２１６２５７７、ｒｓ３７５５８８１５４、ｒｓ２０００４６４４８、ｒｓ１９１９２０９６６、ｒｓ３７５５９８８２０、ｒｓ１８１６６０５０７、ｒｓ３６９４９７１３１、ｒｓ１８１６６３２４５、ｒｓ２０００６３３８３、ｒｓ３７１５３１１２７、ｒｓ１９９８１２５９８、ｒｓ２００５９７４０１、ｒｓ１８１６６５４９５、ｒｓ１８８８２６３１１、ｒｓ１９２２１９９３６、ｒｓ１８８８３２６２７、ｒｓ２００１０８７８５、ｒｓ２００６４５４５２、ｒｓ１８８５４１５８９、ｒｓ
１８１６８２８６５、ｒｓ３７５６５５７１１、ｒｓ１８１６８８７１１、ｒｓ３６９５６２７２５、ｒｓ１９０２６５４３７、ｒｓ１９０２９３５０１、ｒｓ１９０２９８２８８、ｒｓ１８７１１１８９４、ｒｓ１８５３０９００２、ｒｓ１９０３０１９２２、ｒｓ１９９８８２６０３、ｒｓ２６７５９９８０３、ｒｓ２６７５９９８０４、ｒｓ１８７１１８００４、ｒｓ２６７５９９８０６、ｒｓ１９０３１５８１６、ｒｓ１９０３１７２９１、ｒｓ３６９５７０７１６、ｒｓ２００１３８８４０、ｒｓ１８８８５６２３３、ｒｓ１９０４９８９８１、ｒｓ１８８８６０５６７、ｒｓ１８８６１６３１９、ｒｓ２００５３９６８３、ｒｓ１８７１４０１０６、ｒｓ１８８６２２６４９、ｒｓ１９９９２７２９７、ｒｓ３６７５５５２２２、ｒｓ３７１６０６５８１、ｒｓ１９９９３１９２０、ｒｓ３６７５６６０２５、ｒｓ２００１６３３７８、ｒｓ１８８６６０３３１、ｒｓ３６９３９９６４１、ｒｓ３６７５７１６５１、ｒｓ３６７５７１８０７、ｒｓ３７１６１３６３６、ｒｓ３６９６０８０８６、ｒｓ３７１４２３８７２、ｒｓ１８８８８４８７０、ｒｓ２０２１７６２７９、ｒｓ２００５７７７５１、ｒｓ３７５７１１５７１、ｒｓ３６９４１７５６８、ｒｓ３６９４２３６０９、ｒｓ２００５８３４０５、ｒｓ２０２１９２８１８、ｒｓ２００７３７１４４、ｒｓ１８８９１２７２３、ｒｓ３６９４４９９２０、ｒｓ３６９６４２６９６、ｒｓ１８８９１４０４８、ｒｓ１９２１３４０６５、ｒｓ２００６１０２２８、ｒｓ１９２１６６２６３、ｒｓ３６９６５８５４９、ｒｓ２００７６１２１２、ｒｓ３６９６５６３５８、ｒｓ３７５７６５８８６、ｒｓ３６７６６１４１３、ｒｓ３７５７６６７２７、ｒｓ３６９４９５１５２、ｒｓ１９０５３５９６２、ｒｓ３７１５２７９０３、ｒｓ２００２４９０１６、ｒｓ１９０５４０９４１、ｒｓ３７５７９９３３２、ｒｓ１９０５４６５２８、ｒｓ２００７９８６１７、ｒｓ３６９５０９２９２、ｒｓ３７３７０９２７５、ｒｓ１８８８０６０６０、ｒｓ１９０５３１２７６、ｒｓ２０００８７０６６、ｒｓ１８８８３６６０６、ｒｓ２００１１１９２８、ｒｓ３７３５８９４９１、ｒｓ２６７５９９７９６、ｒｓ１９２３８５８２７、ｒｓ３６７７５１２６０、ｒｓ３７３７４５８８９、ｒｓ２６７５９９７９７、ｒｓ２６７５９９７９８、ｒｓ２６７５９９７９９、ｒｓ２６７５９９８００、ｒｓ２００３０４１１７、ｒｓ２６７５９９８０１、ｒｓ３６７７６９２０１、ｒｓ２６７５９９８０２、ｒｓ３７５８８６０８２、ｒｓ２００３２４５３９、ｒｓ３７３７８１３９６、ｒｓ２００３３２１７８、ｒｓ２６７５９９８０５、ｒｓ２００８７０３８９、ｒｓ３７５９０４８５９、ｒｓ２６７５９９８０７、ｒｓ２６７５９９８０８、ｒｓ１９２４１４９９６、ｒｓ３７５９１３６５９、ｒｓ３７３８０１６４５、ｒｓ３７５９２４３８７、ｒｓ３７３８０９６１２、ｒｓ１９２２６５１４２、ｒｓ３６７５４８４８０、ｒｓ３７５９３５７０９、ｒｓ３７１６００９９６、ｒｓ２００９０１４５９、ｒｓ３７１６０２５７０、ｒｓ３６９７７４７３２、ｒｓ３７５９４０６８０、ｒｓ１９２２６８８９４、ｒｓ３７３８２８２９０、ｒｓ３７１８０８９１０、ｒｓ３７１６０９０９１、ｒｓ３７３８５１２８２、ｒｓ３６９６０２２３７、ｒｓ３７１８３４３４０、ｒｓ３７１８３４３９６、ｒｓ２００６９９６４９、ｒｓ２００１７４６４４、ｒｓ２００７１３７２４、ｒｓ２００７１４５１９、ｒｓ１９２４６７２３２、ｒｓ１８９０７９８２７、ｒｓ３７３６４２７３０、ｒｓ３７３９１０１２２、ｒｓ３６９８２７７８５、ｒｓ３６９６２９２５３、ｒｓ３６７６１２７９２、ｒｓ３７１９０４８５２、ｒｓ２００４４３０６８、ｒｓ３６７６１８９１４、ｒｓ１９２４８７３０２、ｒｓ３６７９５５１７３、ｒｓ２００４４８１１０、ｒｓ３７５７３５１０１、ｒｓ３６７９６０２８５、ｒｓ１９２４９３０５２、ｒｓ１８８９１８９３８、ｒｓ１８８９２３５０１、ｒｓ２００２３７５２４、ｒｓ３７１９２４４６５、ｒｓ２００９９３９４９、ｒｓ１９２４９５９８０、ｒｓ３７７６０６７７７、ｒｓ３７６０６７３４２、ｒｓ３６９６６８５８０、ｒｓ３７６０７７４３６、ｒｓ３７６０７７９８４、ｒｓ３７１９４５４３２、ｒｓ２００２６７３３３、ｒｓ３７７６１８８６５、ｒｓ３７３７１４４０９、ｒｓ１９０５５５１０９、ｒｓ２０１０２４７７９、ｒｓ２０１０２５２５３、ｒｓ３６８００４８３５、ｒｓ３６７７２５０４３、ｒｓ５２８３３５１６１、ｒｓ２００８１５６４９、ｒｓ２００８２３２４７、ｒｓ３６７７４３５１９、ｒｓ１９０５６４１６７、ｒｓ３７１９９５１７１、ｒｓ３７４０２９３２４、ｒｓ３７５８５８０８１、ｒｓ２０１０５３５１２、ｒｓ２０１０５４８２４、ｒｓ５２８３７０５３５、ｒｓ３７２００９７５８、ｒｓ３７３７５０９８５、ｒｓ３６９９２３２９１、ｒｓ３６７７６０５６８、ｒｓ１９０５６８６５２、ｒｓ３７６１４８４３２、ｒｓ５３２０９２８８４、ｒｓ５３２０９５６７９、ｒｓ３７５８７４４７５、ｒｓ３７２０２５３２３、ｒｓ１９２３９６５９６、ｒｓ３７３７８４８８９、ｒｓ２０１０６８９５９、ｒｓ３７３７９５３６８、ｒｓ３７４０６０３６６、ｒｓ２００８７９５９７、ｒｓ２００８８９９５２、ｒｓ３６９９４５０３６、ｒｓ３７４０６６１０６、ｒｓ５３０３１１９１１、ｒｓ３７５９２６５７７、ｒｓ２００３６１６３２、ｒｓ３７５９４０２０１、ｒｓ３７７７１６８４７、ｒｓ３７１８０３８１６、ｒｓ２０１０９１４３２、ｒｓ２００９１８２９６、ｒｓ１８９０５７３５１、ｒｓ３７６１９３４３９、ｒｓ３７４０９３５４０、ｒｓ３６９９７８６９５、ｒｓ３７３８７６７１４、ｒｓ３６９９８４２２７、ｒｓ３７１８６３４０９、ｒｓ３７３８９３５４９、ｒｓ３７７７５７２０５、ｒｓ３７３８９５５０７、ｒｓ１９２４７５０６４、ｒｓ３６７９４３４６４、ｒｓ３７６２２６６７７、ｒｓ１９２４８２３７３、ｒｓ３７１９０９８１７、ｒｓ３８６３９６３９３、ｒｓ５３２１７７４３３、ｒｓ１９２４８８６０９、ｒｓ３７６２５１２９１、ｒｓ３７３９４７１１１、ｒｓ３６８１５９９５５、ｒｓ３７６０５７０５０、ｒｓ３７６０５７４７３、ｒｓ１９２５０４７６６、ｒｓ５３２１９６３１３、ｒｓ５３０３９８２０９、ｒｓ３７６２６６８２６、ｒｓ５３２１９９８６９、ｒｓ３７６０８０２３６、ｒｓ３７６０９０７２２、ｒｓ３７６０９９０７０、ｒｓ３７２１３７１３２、ｒｓ２０１０２６３１７、ｒｓ３７２１３８０９７、ｒｓ３７７６４９１１３、ｒｓ３７２１４２８９２、ｒｓ３７２１４６９６９、ｒｓ２０１０４１６３５、ｒｓ５２８５０６０５８、ｒｓ３６８１８６９６４、ｒｓ３７１９８７０２８、ｒｓ５３０４２３８３６、ｒｓ３６８１９１７３３、ｒｓ３６９９０６０３１、ｒｓ３７００８４１４６、ｒｓ３７４０３３７６６、ｒｓ５２８３７１５４４、ｒｓ３７６１４６２８９、ｒｓ３８６６６０２８６、ｒｓ３６８２０７０３６、ｒｓ５３２０９０８３５、ｒｓ３７６１５３８１３、ｒｓ３６９９３５９２４、ｒｓ５３０３０１５７９、ｒｓ５２８５４００７５、ｒｓ３７２１９１３４２、ｒｓ３６８０６５４３９、ｒｓ３７６１６３２６８、ｒｓ５２８３９３００７、ｒｓ３７７７０８８５３、ｒｓ５２８５４９９３４、ｒｓ３７７７０８９５５、ｒｓ３７０１３１３２０、ｒｓ３７６３４３６９５、ｒｓ３７４２４２８０３、ｒｓ３７６３４６９７０、ｒｓ３７７７１４３６７、ｒｓ５３２２７４２５７、ｒｓ３６９９５９７２１、ｒｓ３６９９７０１８１、ｒｓ３７６３５５４０８、ｒｓ３７７７３１３４８、ｒｓ５３０５０１５９３、ｒｓ５３０５０３２９９、ｒｓ３６８２７１８６１、ｒｓ５２８４２６０８５、ｒｓ２０１１０６８７９、ｒｓ５３２１４９３２２、ｒｓ３７２２５６７７１、ｒｓ３７６２２０５６１、ｒｓ３７２０９００４７、ｒｓ３７２２６８３３９、ｒｓ３７０２００８４７、ｒｓ３７０２０２９５５、ｒｓ３６８３１２６７８、ｒｓ３７０２０８２２３、ｒｓ３７７７６６９０５、ｒｓ３７０００９９２０、ｒｓ５３２３３９３９５、ｒｓ３６８３２６１７６、ｒｓ５２８６３７７９４、ｒｓ３７６４３２７６０、ｒｓ２０１１２６９１１、ｒｓ３６８３３５１７０、ｒｓ３７６４３７９９９、ｒｓ５３２３５３１６７、ｒｓ３６８１４８２３９、ｒｓ３６８３３８２６５、ｒｓ３６８１５４１９１、ｒｓ３７６４３９８６３、ｒｓ３７４３４１４７４、ｒｓ５３０３９２６１２、ｒｓ３７２３１６３９６、ｒｓ２０１１４８３１５、ｒｓ２０１１４９５３０、ｒｓ３７２１３１８０１、ｒｓ３７４３６３０８２、ｒｓ５３０５８５９０４、ｒｓ５３２３８９１６１、ｒｓ３７６４８０６４９、ｒｓ５３０４０１９５４、ｒｓ３７０２７９５２１、ｒｓ３７２１３４８３０、ｒｓ３６８３９４５４４、ｒｓ５３０４０４４９８、ｒｓ２０１１５８７５３、ｒｓ３７６５０５１２２、ｒｓ２０１３３０３７０、ｒｓ３６８４０８１６２、ｒｓ３７０３１１３１０、ｒｓ２０１３４２０３６、ｒｓ２０１３４２３３２、ｒｓ５３２４２６０３４、ｒｓ５３２４３１７１６、ｒｓ３６８１８３７７４、ｒｓ３７０３２１５４７、ｒｓ５３０４２２７２４、ｒｓ３７０３２４０９９、ｒｓ３７６５２８８３１、ｒｓ３７０３３２１３０、ｒｓ５３２４４２５２２、ｒｓ２０１１７０８２１、ｒｓ５３０６６３４５５、ｒｓ５２８７３８４０３、ｒｓ２０１１７４５５８、ｒｓ３７４４４７２６１、ｒｓ３７６５４７２６２、ｒｓ５３２２２９１４１、ｒｓ５２８７４５３６０、ｒｓ３７６３０６１６１、ｒｓ５２８７４９７４１、ｒｓ３７４４５８６８４、ｒｓ３７０３６２４４１、ｒｓ３６８２１２７６６、ｒｓ３７００９６９２３、ｒｓ２０１３９７４６９、ｒｓ３７６５９０４１３、ｒｓ５３０４５０１７４、ｒｓ５３２４９２９３７、ｒｓ５３２４９７８８３、ｒｓ２０１４１２３９４、ｒｓ５３２２４６９９９、ｒｓ５２８７９３８３３、ｒｓ５３０７１８２３３、ｒｓ２０１４１７９３３、ｒｓ２０１１９１５１０、ｒｓ３７６６１５３３０、ｒｓ２０１４２７３６６、ｒｓ３６８５３００２４、ｒｓ３７２４９７５６０、ｒｓ５３０７３５８２８、ｒｓ３７２１９９２８１、ｒｓ３６８２３２９４９、ｒｓ３７２２０３１３８、ｒｓ５２８８２０７７４、ｒｓ５３０４６７２９４、ｒｓ２０１４４３０６３、ｒｓ５２８５６３２８５、ｒｓ３６８５４８６４３、ｒｓ３７６６４０１５７、ｒｓ５２８８３４５９９、ｒｓ３７２５２７０２６、ｒｓ５３０７６０７５０、ｒｓ３６８２５００７１、ｒｓ３７４５６６３６２、ｒｓ３７０４６５５８５、ｒｓ３７０４６７１４０、ｒｓ３７２５３９２６３、ｒｓ３７２５４０９５０、ｒｓ３６８５８２７２５、ｒｓ２０１４７４８５４、ｒｓ３７４２５２８５１、ｒｓ５３０４９３６８５、ｒｓ２０１２３４１０１、ｒｓ３７６６８０１４１、ｒｓ３７６６８６０１１、ｒｓ５２８５８８７６８、ｒｓ３７６６８８０３５、ｒｓ３７２２５０２５１、ｒｓ３７０５０５２３７、ｒｓ５３０７９８８７９、ｒｓ３６８６１３９２３、ｒｓ５３２３１０１８３、ｒｓ３６８２８７６９７、ｒｓ３７４３１９１４３、ｒｓ３７４３１９７２６、ｒｓ３７２５９３４１２、ｒｓ２０１５１１２７１、ｒｓ３６８３３４６３８、ｒｓ２０１２７９９９７、ｒｓ２０１２８０４２６、ｒｓ５３０５６９１４６、ｒｓ３７４３５２１０７、ｒｓ３７４３５５６３８、ｒｓ３７２６０６０９８、ｒｓ３７４３５７４７４、ｒｓ３６８６５２４５９、ｒｓ３７０５４５４３４、ｒｓ３６８６５５７４１、ｒｓ３９７９８９２６６、ｒｓ５３０８３８７６０、ｒｓ３７０５５３４８８、ｒｓ３７６７４３８５１、ｒｓ３９７７２５６６７、ｒｓ５２８９２５４４５、ｒｓ５３２６３０４６５、ｒｓ３７２６２５８８６、ｒｓ３７４６５８８４７、ｒｓ３７４３８１７０４、ｒｓ３７２３６８０６２、ｒｓ５３２６５３０１５、ｒｓ３７２３６８９１４、ｒｓ５３２６５９４１４、ｒｓ５３０８７９７２９、ｒｓ５２８７１８８８５、ｒｓ３７４４２２９８６、ｒｓ２０１５７４１５５、ｒｓ２０１５７５３１７、ｒｓ３７０６１０７３６、ｒｓ３７６５４２１６１
、ｒｓ３７６８１００３２、ｒｓ３７４４４４８６４、ｒｓ３９７７８１６３８、ｒｓ３７０３５４２２９、ｒｓ３７２７０２３０２、ｒｓ３６８４６８０７２、ｒｓ３７６８２５１７５、ｒｓ５３２６８２９８７、ｒｓ３９８０９１４２３、ｒｓ３７６８３０３６９、ｒｓ３７６８３０９５９、ｒｓ３７０３７３２１５、ｒｓ３７２７１４１３１、ｒｓ５３０９２４７３７、ｒｓ３７２７１６５８３、ｒｓ３７６８３７８１０、ｒｓ３７２４６２５５５、ｒｓ２０１４１５２００、ｒｓ３９７８２３９３３、ｒｓ３６８７６８４０７、ｒｓ５２９０１８３１４、ｒｓ５３２６９６４４７、ｒｓ５３０７３７０８２、ｒｓ３７２７３１１０４、ｒｓ３７０４３５３４０、ｒｓ３６８７７６８８２、ｒｓ５３０９４６６０８、ｒｓ５３０７３８３５５、ｒｓ３６８７８３４２１、ｒｓ３６８７８４３３０、ｒｓ３７６８６４８８５、ｒｓ５３２７０８２７７、ｒｓ５２７２４５６６６、ｒｓ３６８７９３９７０、ｒｓ５３０９６９１９５、ｒｓ３６８８０７５５１、ｒｓ５３０７４０１５２、ｒｓ３６８５４８４５０、ｒｓ２０１６４５０１８、ｒｓ３７４８１１１１５、ｒｓ３７４８１３２４１、ｒｓ３７４８１３９４２、ｒｓ２０１４６１１６１、ｒｓ３７０４８３００３、ｒｓ３７０７２２９６５、ｒｓ５３２５７１００６、ｒｓ５２７２９０９３４、ｒｓ５３２７４１３５８、ｒｓ３６８８３３８０２、ｒｓ３７４８３２０９２、ｒｓ３７４８３４７６８、ｒｓ５２９０９２９２７、ｒｓ３７０７４７６２８、ｒｓ５２７３０８４２４、ｒｓ５２９０９６７５２、ｒｓ５３２５７７６７０、ｒｓ３９７９４０２６３、ｒｓ３７０７５７１３０、ｒｓ３７０７７９２５８、ｒｓ３６８８８２０６４、ｒｓ５３２７７４２１３、ｒｓ２０１６９８３２３、ｒｓ５３１０５１９６０、ｒｓ５２７３４３８３８、ｒｓ５３２５８７９８１、ｒｓ５２８８８０５５４、ｒｓ５３０８０５３２５、ｒｓ２０１７０６５６０、ｒｓ３７６７１００１３、ｒｓ２０１７１５０７５、ｒｓ３７０５２８１２０、ｒｓ３６８６３７６２５、ｒｓ３７６７１９８３２、ｒｓ５３０８２１１６０、ｒｓ５３１０８７６８３、ｒｓ３６８６４１１３１、ｒｓ３６８６４１３５６、ｒｓ５２７３８６５５５、ｒｓ５２７３８６６４９、ｒｓ５２８９０５８３８、ｒｓ３７０５４２８８０、ｒｓ３７４９４３５３８、ｒｓ３７０５５４８８４、ｒｓ３６８６８０８７１、ｒｓ３７０５７６１４２、ｒｓ３７２９０７４５４、ｒｓ３７０８８０７９６、ｒｓ５３２８３７８８１、ｒｓ２０１７５３９５５、ｒｓ３６８９７２１３７、ｒｓ３７６７８０２４９、ｒｓ５２７４２６９７５、ｒｓ５２７４２９４０６、ｒｓ３７０６０３０４６、ｒｓ３６８９８８１６２、ｒｓ５３２８５２８８３、ｒｓ３７２６７４２７９、ｒｓ３６８９９４６６３、ｒｓ３７４７１２００４、ｒｓ５２９２３２９２４、ｒｓ３７０９１２２５０、ｒｓ５３２６７７１２０、ｒｓ２０１７８９９７０、ｒｓ３７０９１６２３８、ｒｓ３７０９１７７３４、ｒｓ３７６８１５７５３、ｒｓ３６９００８２８２、ｒｓ５３１１４９１８３、ｒｓ３７５０１２７９３、ｒｓ５３１１５３５０１、ｒｓ５２９２４９８８７、ｒｓ２０１５８８８１１、ｒｓ５２８９９２１３１、ｒｓ２０１８１５５６９、ｒｓ３７６８３３２９５、ｒｓ５３２８８９５３９、ｒｓ５２９０１０４７３、ｒｓ５３２８９１５３３、ｒｓ３７６８４００１１、ｒｓ２０１８２７２１７、ｒｓ３９８１０５７８４、ｒｓ５２７４９６３２４、ｒｓ３７４７５７２５１、ｒｓ５３１１８７７０６、ｒｓ５３２９０３４０１、ｒｓ５３０９４１６８９、ｒｓ３６８７８１６９７、ｒｓ３７５０９２７９９、ｒｓ５３０９７７１２３、ｒｓ３６９１０７３５７、ｒｓ２０１８７１４９３、ｒｓ３７３０６２０３２、ｒｓ３６９１１８１３８、ｒｓ３７５１１０５８４、ｒｓ５３０９８０３０４、ｒｓ５３２９４３９４０、ｒｓ５２９０７７２１２、ｒｓ２０１６５９６８５、ｒｓ２０１６６０９８３、ｒｓ３７３０８３７３２、ｒｓ３７３０８５０９９、ｒｓ３６９１３７５１５、ｒｓ３７５１３０６５２、ｒｓ３７３０９０９７６、ｒｓ３７３０９０９７８、ｒｓ５２７５６７９３４、ｒｓ５２７５７７６６６、ｒｓ３６９１７５４４９、ｒｓ３６９１７７５９９、ｒｓ５２９３６４２４３、ｒｓ３７２８０４０２１、ｒｓ３７７２４３６１０、ｒｓ５２７６１２５４２、ｒｓ３６９１９８４０６、ｒｓ５３１２８７６９５、ｒｓ５３１２８８０３０、ｒｓ２０１６８０３１５、ｒｓ５３２７８０３３８、ｒｓ２０１７０３４６０、ｒｓ５２９１３６７７１、ｒｓ３７５２０６７８３、ｒｓ３７０８０５１４７、ｒｓ２０１９５５９９０、ｒｓ５２９４０６００７、ｒｓ３７３１７８２８０、ｒｓ３７３１８０５２３、ｒｓ３７７０００６３６、ｒｓ３７５２２６６３７、ｒｓ５３２７９３７１５、ｒｓ５３２７９５０９５、ｒｓ３７０８２３１３３、ｒｓ３７１１５５７５３、ｒｓ３７１１６１８６６、ｒｓ５３１０９１８８７、ｒｓ５２９４３０７３８、ｒｓ３７７０２３９６２、ｒｓ３７３２０９４５０、ｒｓ５３２８２１１５６、ｒｓ２０１７４８４２４、ｒｓ５２９１８６４７９、ｒｓ２０１９８５５３６、ｒｓ５２７４０１８９７、ｒｓ５３２８３９６８２、ｒｓ３７７０６４３０３、ｒｓ５２９４４９７３３、ｒｓ５３１３５２３２４、ｒｓ５２７４２９７５０、ｒｓ３６８９９２８４３、ｒｓ３６８９９７７５７、ｒｓ３７１２０７４５８、ｒｓ３７３２４６８２１、ｒｓ５３１１４１７４６、ｒｓ５２９２４２８４６、ｒｓ５２９２５１８７６、ｒｓ３７７３４００９２、ｒｓ３７７１２１４６９、ｒｓ５２７７２６７８４、ｒｓ５３１３７８０８７、ｒｓ５３１３７８１４８、ｒｓ３７７３５１５４２、ｒｓ３７７１３６１３５、ｒｓ５２７５２９９９４、ｒｓ５２７７４１１４６、ｒｓ３７１２５６７０６、ｒｓ３７１２５８４３８、ｒｓ３７１２６１２３５、ｒｓ３７１２６２６０３、ｒｓ５２９５０１３５６、ｒｓ５３３０８５６８７、ｒｓ５３１３９８９９４、ｒｓ３７１１９０２６１、ｒｓ５２９５０８８２６、ｒｓ３７３２８９５０８、ｒｓ３７３２８９７７０、ｒｓ３７１２７６６３６、ｒｓ３７３２９４３２５、ｒｓ５３１１７４００２、ｒｓ５３３１０１１７３、ｒｓ３７３３１２４６４、ｒｓ５２７７７９１７０、ｒｓ５２９５３６２８６、ｒｓ３７１３１９８３７、ｒｓ３７１３２４９２１、ｒｓ３７０９６０６８６、ｒｓ３７０９６５０１１、ｒｓ３７１３３１０１１、ｒｓ３７３３４０３６３、ｒｓ５３７５６１６３９、ｒｓ３７１３３７２２８、ｒｓ３７１３３９７３９、ｒｓ３７１３４１９５６、ｒｓ５３３１２３４０８、ｒｓ３７３３４７７８７、ｒｓ３７１３４４６５８、ｒｓ３７５３８３２１８、ｒｓ５３３９９６１３０、ｒｓ３７３３５１８０２、ｒｓ５２９２８７７０１、ｒｓ５３１１９３５９８、ｒｓ５２７８１４５０４、ｒｓ５３７５８５７１６、ｒｓ５２９２９７９３３、ｒｓ３７７１９１０１６、ｒｓ３７５１１９７１０、ｒｓ３７７１９７８９２、ｒｓ５３３１３６５２５、ｒｓ３７３３７０６１６、ｒｓ５２７５５６００６、ｒｓ５３４０２５３４０、ｒｓ５３４０３４２８５、ｒｓ５３１４７６６３３、ｒｓ３７３１２８３５３、ｒｓ３７７４６７２５９、ｒｓ５２７８３８０４５、ｒｓ３７１３７８５１２、ｒｓ５３３１５２２４２、ｒｓ３７３３９１８２０、ｒｓ３７５４２５９６５、ｒｓ３７３１５３８４５、ｒｓ３７３４１１３２０、ｒｓ３７５４４４７４８、ｒｓ５３７６４０５１６、ｒｓ３７５４４５２６６、ｒｓ５３７６４０８８３、ｒｓ３７７４９２３２７、ｒｓ３７３１６０６１７、ｒｓ５３７６４４４２４、ｒｓ５２７８６９８１４、ｒｓ５３３００５６７５、ｒｓ５２９６０８１４７、ｒｓ３７５２０６２７６、ｒｓ３７７２６８５０２、ｒｓ３７５４６０５４４、ｒｓ５２７８８９２２５、ｒｓ５２９４１５４２３、ｒｓ３７３１８６０４５、ｒｓ５２７８９６９０５、ｒｓ５３４１１２６７２、ｒｓ５２７８９８４５０、ｒｓ５３１５３４１３４、ｒｓ３７７２８５７７５、ｒｓ５２７６５９３０６、ｒｓ５２７６６７１８２、ｒｓ５４１０８７１５２、ｒｓ３７５４９３６５３、ｒｓ３７５４９５５８９、ｒｓ３７３２０７９０３、ｒｓ３７３４７０６５１、ｒｓ５４１１０４４３７、ｒｓ５３３０３５２８３、ｒｓ５３４１４５２０７、ｒｓ３７３２１６８１１、ｒｓ３７１１７４９１５、ｒｓ５３７７１９３９６、ｒｓ５２７９２５９４６、ｒｓ３７１１８２５７９、ｒｓ３７３４８４４３５、ｒｓ５３３２２２３１８、ｒｓ５３３２２４７２１、ｒｓ５２７６８９４１９、ｒｓ３７５２７４１２２、ｒｓ５３４１７０９５８、ｒｓ３７５５３３６９１、ｒｓ５２７９４５３７３、ｒｓ５３４１８０９２４、ｒｓ５３４１８２９８４、ｒｓ３７３２３９９７２、ｒｓ３７３２９９５５３、ｒｓ５２７７０６４０１、ｒｓ５２９４６５８５７、ｒｓ５４４７２３７６０、ｒｓ３７３２５３４３０、ｒｓ３７１２２１４０８、ｒｓ５２７９７５５１８、ｒｓ３７７３４２１８５、ｒｓ５３３２６７４４０、ｒｓ５４８６３０４４１、ｒｓ５２７９８１７２７、ｒｓ５４１１８６５４７、ｒｓ３６９３４１３９１、ｒｓ５３１６１５９４１、ｒｓ５３３９８０４７２、ｒｓ５５２３６３３７３、ｒｓ５３７８１７４３３、ｒｓ５４１２１０１６９、ｒｓ５３３２９３７２２、ｒｓ５３４２４８５８９、ｒｓ５２９７４１１５４、ｒｓ５３７８２６９２６、ｒｓ５２９４８６２７７、ｒｓ３７３３３７８４９、ｒｓ５３３０８９１９２、ｒｓ５２９５６２８４０、ｒｓ５４８６０５９２６、ｒｓ５４８６９３６１５、ｒｓ５４８６９５３６７、ｒｓ５３４２７００５２、ｒｓ５３３３３５３５６、ｒｓ５４８７１０２７３、ｒｓ５２８０３６６０７、ｒｓ５３１５８０６４０、ｒｓ５４１２６９７０１、ｒｓ３７５５６１９６９、ｒｓ５２９７８００６４、ｒｓ３７５３９３２２９、ｒｓ５２８０４３７１６、ｒｓ５２７８１６１３９、ｒｓ５３１６６８０８７、ｒｓ５２８０４８５８７、ｒｓ５３３３６２３６１、ｒｓ５３７８７３４０４、ｒｓ５２８０５４７４５、ｒｓ５３３３７１４５９、ｒｓ３７５３９７６３９、ｒｓ５３７５８９５２０、ｒｓ３７５４０１５３１、ｒｓ５３７５９６００５、ｒｓ５４８７５８０３１、ｒｓ５５２４７４７２８、ｒｓ５５２４７５２３６、ｒｓ５４８７６６５３８、ｒｓ５３４３２０１０４、ｒｓ５２９８３１４０６、ｒｓ５３３１４９３６２、ｒｓ５２７８４５６９６、ｒｓ３７５４４６３３５、ｒｓ５４８７７６１５４、ｒｓ５３１７０９５１３、ｒｓ５４１３３６５８７、ｒｓ５３４３３６３７４、ｒｓ５２９８４５６２３、ｒｓ５３７６４７７６４、ｒｓ５３１７１９７２５、ｒｓ５３１７２６５９４、ｒｓ５２９８５６６２７、ｒｓ５２９８６１０７７、ｒｓ５２９６１０２４４、ｒｓ５３７９３５９２９、ｒｓ５４４９００２５３、ｒｓ５２９８７９１４３、ｒｓ３７５４５８５９４、ｒｓ５４１０６４９０９、ｒｓ３７７５１８７０８、ｒｓ５４１０７７２９２、ｒｓ５３７６９３１７３、ｒｓ５４８８３９９９５、ｒｓ５４８８４０７１５、ｒｓ５３１７６５６１８、ｒｓ５５２５６１２２６、ｒｓ５５２５６４８０６、ｒｓ５３１５３７４５５、ｒｓ３７３４６６５５１、ｒｓ５３４３９５２５８、ｒｓ５３７７１５９２２、ｒｓ３７３４８０６９８、ｒｓ５３１７９９４２４、ｒｓ５２８１４８３０７、ｒｓ５３７７１８１９２、ｒｓ５３７９８８５５３、ｒｓ５３３４９５３４１、ｒｓ５３３２２１８０３、ｒｓ５４１４３８３３９、ｒｓ５３１８１７０９０、ｒｓ５３１８２７２６３、ｒｓ５４８９０３２３１、ｒｓ５４８９０３９４１、ｒｓ５３３２２９７８６、ｒｓ５５２６２５２２７、ｒｓ５４４９８６２３４、ｒｓ５３４１６３８３８、ｒｓ５４１４７０３８５、ｒｓ５４８９２８１３１、ｒｓ５４１２６６３６４、ｒｓ５２９９７８４５３、ｒｓ５４８６０６０３８、ｒｓ５４５００５７５５、ｒｓ５４１４９５９９６、ｒｓ５５２６７６１１６、ｒｓ５３７７８４０９８、ｒｓ５５２３３１２７２、ｒｓ５３３５６９４６７、ｒｓ５３８０５３６５５、ｒｓ５４４７３１４０３、ｒｓ５４５０４１２０２、ｒｓ５４８６３５８３６、ｒｓ５３４４８３５１５、ｒｓ５３４４８３
９７９、ｒｓ５３１６１６５３３、ｒｓ５５２６９７７４０、ｒｓ５５２６９７９７２、ｒｓ５３１６３７３２７、ｒｓ５５２７０１０１９、ｒｓ５２８２０７９５９、ｒｓ５４８９９７２２７、ｒｓ５３４２５５４７３、ｒｓ５４１５２８２７５、ｒｓ５３１９１９８６４、ｒｓ５４１２４６６６１、ｒｓ５４９０１２５８４、ｒｓ５４４７８６６０９、ｒｓ５４９０２８１０７、ｒｓ５３４５１２７５４、ｒｓ５３１９５０５３９、ｒｓ５２８２３５６６２、ｒｓ５３１９６１８２０、ｒｓ５２８０２５２６３、ｒｓ５５２６５２３６７、ｒｓ５３８１０９５２３、ｒｓ５５２４３２７６７、ｒｓ５２８０４０７９９、ｒｓ５５２７８３６２２、ｒｓ５５２７８６９２４、ｒｓ５３３３５２９７４、ｒｓ５３７８７８５８４、ｒｓ５４９０９３６２７、ｒｓ５２８２７４９０９、ｒｓ５４１５９５４６８、ｒｓ５２８２９２０８９、ｒｓ５４９１１７８１０、ｒｓ５３４３０２５５９、ｒｓ５３４５７６９０７、ｒｓ５２８０６５４５４、ｒｓ５４９１２２６３８、ｒｓ５２８３０１０９７、ｒｓ５３２０２５６１１、ｒｓ５４４８４５３９１、ｒｓ５３２０３１６８３、ｒｓ５３４５８６１９１、ｒｓ５４４８５５５３２、ｒｓ５４５１７５０１８、ｒｓ５４５１７６６３０、ｒｓ５３３７１９３１０、ｒｓ５４９１４５７５１、ｒｓ５３０１６７６０８、ｒｓ５２９８３３６３３、ｒｓ５５２８６４５３４、ｒｓ５５６５５５９３９、ｒｓ５４１３２５２７２、ｒｓ５３０１７９５０１、ｒｓ５４５２００４３７、ｒｓ５３８１８４７１４、ｒｓ５３３７４５８５１、ｒｓ５３３４１４９９８、ｒｓ５４１６６４６２６、ｒｓ５６０６３１７４５、ｒｓ５４１６８１００８、ｒｓ５６０６５１１７９、ｒｓ５４１６８６２５２、ｒｓ５５２９２６０６０、ｒｓ５５６５９９６３５、ｒｓ５５６６０３０９４、ｒｓ５４９１９１１０７、ｒｓ５３４６５１６０１、ｒｓ５３３７８８７３０、ｒｓ５６４６４２８８５、ｒｓ５５２９４６０００、ｒｓ５３８２２４１２１、ｒｓ５３３７９９４３９、ｒｓ５３７９３２８７４、ｒｓ５３１７４９８２５、ｒｓ５６０６８６６２１、ｒｓ５４１７１０９７４、ｒｓ５６０６８９７０３、ｒｓ５４５２８６１９５、ｒｓ５６０７０１２１６、ｒｓ５６４６７５５０４、ｒｓ５３３４４７１３４、ｒｓ５３３４５３５７３、ｒｓ５４９２１８９３３、ｒｓ５５２９９４５４５、ｒｓ５２９８９０６３９、ｒｓ５５２５５１１０９、ｒｓ５４４９２９８７５、ｒｓ５４１７４７８８４、ｒｓ５５３０１８５０２、ｒｓ５３４３９１３６４、ｒｓ５６０７６２０２８、ｒｓ５４８８６６３８９、ｒｓ５５３０３３９８８、ｒｓ５６０７７２９９６、ｒｓ５５２５８６８４６、ｒｓ５４８８８３２４２、ｒｓ５４８８９０２３８、ｒｓ５５２６２３４７７、ｒｓ５２８１６６７８１、ｒｓ５４１４７５９０４、ｒｓ５３８２８９２５４、ｒｓ５３４７２５２７５、ｒｓ５６０７９９９０４、ｒｓ５３０００７８０４、ｒｓ５５６７０８４９０、ｒｓ５５３０７９９８２、ｒｓ５３８３０５４６２、ｒｓ５６８９２９４２９、ｒｓ５３８０４５３４１、ｒｓ５４１８０６０５４、ｒｓ５３８１０９６７８、ｒｓ５４１８１３６１１、ｒｓ５３３５７６３６１、ｒｓ５６０８４７０２７、ｒｓ５６８９５３１０５、ｒｓ５４８９８３９９５、ｒｓ５３３５８３４６５、ｒｓ５３８０６４４２６、ｒｓ５３００３８８１９、ｒｓ５６８９６２６３４、ｒｓ５５２７２０５２１、ｒｓ５３８３３２０２９、ｒｓ５６４８６４０７４、ｒｓ５４９０１５８７８、ｒｓ５４５１００８８３、ｒｓ５３８３５９１５２、ｒｓ５４１８５８０７０、ｒｓ５３４５２９５２４、ｒｓ５４９３２４７１６、ｒｓ５６４９０１３７３、ｒｓ５６４９０４４７９、ｒｓ５６４８１２１６２、ｒｓ５５３１８８５４１、ｒｓ５３８１１６３３３、ｒｓ５５２７９５９４４、ｒｓ５５６７９８１５１、ｒｓ５４１８０４５５３、ｒｓ５４５５１１５５４、ｒｓ５６０８３８７０２、ｒｓ５４５５１３０３７、ｒｓ５４９０８７０４４、ｒｓ５３８１５２８０９、ｒｓ５３３６９７５０６、ｒｓ５６０９６９７６２、ｒｓ５４５１６８３０８、ｒｓ５５２８４８２２８、ｒｓ５６４９５７４８６、ｒｓ５３８４１３８０８、ｒｓ５４９１５１０４０、ｒｓ５６４９５９０２３、ｒｓ５４９３５８９４８、ｒｓ５４９３５９３７６、ｒｓ５４５１９４３０４、ｒｓ５３８４１９１７７、ｒｓ５４１８９９９３５、ｒｓ５３２０８０７３７、ｒｓ５３３８００２６１、ｒｓ５３４６６１３１４、ｒｓ５６４６８３７１６、ｒｓ５６４６８４０９２、ｒｓ５６１００４３３３、ｒｓ５５２９９８６０７、ｒｓ５４９２２９１５７、ｒｓ５３４８７０３２４、ｒｓ５４１９２３７２３、ｒｓ５５３２９１７５１、ｒｓ５３８４７４４６３、ｒｓ５６９１０４５５６、ｒｓ５６９１１１７２８、ｒｓ５６４７１２４７０、ｒｓ５６９１１３８７０、ｒｓ５４１９４５９８０、ｒｓ５４５３３８１７６、ｒｓ５３８４９８６９３、ｒｓ５３３８６２６９２、ｒｓ５６０７７８８０２、ｒｓ５３３８７６５７５、ｒｓ５３４９２５２５５、ｒｓ５４５６３４４００、ｒｓ５６５０８１８４２、ｒｓ５４１９６７１４１、ｒｓ５３８２８０４８２、ｒｓ５５３０４７０６１、ｒｓ５３８５４７１２８、ｒｓ５５３３８３１７５、ｒｓ５６０７８６１３４、ｒｓ５４１９８３０８２、ｒｓ５６９１６８７４４、ｒｓ５６９１７３１８７、ｒｓ５３４７２０２１０、ｒｓ５４９２６４０２５、ｒｓ５５３１９８９７０、ｒｓ５４５６８４８４６、ｒｓ５６９１８７７６８、ｒｓ５６９０３３８６６、ｒｓ５６５１５４０３７、ｒｓ５５６９５９３４３、ｒｓ５４９３４１９０６、ｒｓ５６５１５９７８０、ｒｓ５６５１６００４１、ｒｓ５６１１７９３３９、ｒｓ５４９３４３９４０、ｒｓ５５６９６８０７９、ｒｓ５３５００５３４６、ｒｓ５５３１０９９３１、ｒｓ５５３１１０１５２、ｒｓ５４９４７３０９２、ｒｓ５４１８１９３８２、ｒｓ５５６９８６２９７、ｒｓ５５３１１２６５４、ｒｓ５４５４３３１２０、ｒｓ５６９２１７６４７、ｒｓ５４５４６３７１３、ｒｓ５４２０２８７１３、ｒｓ５５７０１１３５０、ｒｓ５４９４９２１７８、ｒｓ５３８３５６３８９、ｒｓ５６９０２０００６、ｒｓ５５３１８８２２８、ｒｓ５６０９６４６０１、ｒｓ５５７０３１２７３、ｒｓ５６５１５１６３２、ｒｓ５４５６９５７９６、ｒｓ５４５５１３８３０、ｒｓ５６４９４１５４０、ｒｓ５５３５０５７７７、ｒｓ５６４９４３６３２、ｒｓ５４５５３０６２５、ｒｓ５３５０７３２２１、ｒｓ５５３２４１２０９、ｒｓ５３４８２９４４３、ｒｓ５６９２６１４０８、ｒｓ５４２０７７４１８、ｒｓ５３８４２４８３３、ｒｓ５４９３６３７３９、ｒｓ５５３５２２６５５、ｒｓ５５３２５６３１５、ｒｓ５６５２５２６９３、ｒｓ５６１００２３２２、ｒｓ５４５７９２０７８、ｒｓ５４５７９３３５５、ｒｓ５５３５４１０８７、ｒｓ５５７０８９１８７、ｒｓ５３８４３２１４８、ｒｓ５５３２６０４５４、ｒｓ５５３２７４０８２、ｒｓ５４１９４３６７５、ｒｓ５６５０４３６６４、ｒｓ５４２１１４４０８、ｒｓ５４５８１８９４８、ｒｓ５５７１１６９８３、ｒｓ５３５１３５０２１、ｒｓ５４５８３４６６９、ｒｓ５６１３０３２００、ｒｓ５６１０７６９９６、ｒｓ５５３３４５０３１、ｒｓ５４２１５０７７４、ｒｓ５５７１４９５７６、ｒｓ５４９４１７３４８、ｒｓ５６１１１４３３２、ｒｓ５５３３８１４０４、ｒｓ５３４９５５９２０、ｒｓ５４２１６２０４６、ｒｓ５４９５７６５６２、ｒｓ５４９４５８１４１、ｒｓ５６１３２３１３８、ｒｓ５６１１６６３６１、ｒｓ５６１１６８２４６、ｒｓ５５７０３４９５４、ｒｓ５５７１７８０９２、ｒｓ５３８７７９７０５、ｒｓ５５３６２９９７９、ｒｓ５６５３６０６５６、ｒｓ５６９３３７６５４、ｒｓ５６１２２２９２９、ｒｓ５３５１９３９８６、ｒｓ５６９３４３６１５、ｒｓ５５３６４１５４７、ｒｓ５６９１９６６０２、ｒｓ５６９１９９５２９、ｒｓ５５７０３７２９５、ｒｓ５５３４３８８０３、ｒｓ５５３４４５３８３、ｒｓ５５３６５９１２０、ｒｓ５６５３８９２７５、ｒｓ５５３４５０２７９、ｒｓ５５７２１４９４６、ｒｓ５４２２１１０６５、ｒｓ５５３６７１２７４、ｒｓ５５７２２０２９２、ｒｓ５３５２２８６３０、ｒｓ５３５０１９９００、ｒｓ５３８６２１１４９、ｒｓ５５７０１５３２２、ｒｓ５３８８２６２２１、ｒｓ５４９４９６４９８、ｒｓ５４５９２９７８２、ｒｓ５６５４１８８９７、ｒｓ５４２０４１２９４、ｒｓ５３８８３７６２０、ｒｓ５４９５０５５６０、ｒｓ５６１３８８６１５、ｒｓ５５３５０８３９５、ｒｓ５６５４３３９７３、ｒｓ５４２０６３８９４、ｒｓ５４２０４２７８７、ｒｓ５５３５１３５３５、ｒｓ５４２２４３９９１、ｒｓ５３８８４９１５６、ｒｓ５４２０７１１２９、ｒｓ５６９２６４９０３、ｒｓ５６５４５０９０７、ｒｓ５５３７２２１４５、ｒｓ５６１２４９７９５、ｒｓ５５７０７２４８６、ｒｓ５５３５３３９０７、ｒｓ５６５４５７４２９、ｒｓ５６５４５８７１４、ｒｓ５３５２７６２１７、ｒｓ５４９６９７７６２、ｒｓ５４９６９９３７６、ｒｓ５４２２６９１３５、ｒｓ５５７２９６０１１、ｒｓ５６１４２６５８５、ｒｓ５３５１０６７２８、ｒｓ５３８８９０１２１、ｒｓ５４２１８２００４、ｒｓ５５７３１７２８７、ｒｓ５３８９０２１４８、ｒｓ５３５３１２７６１、ｒｓ５５７０９５３８６、ｒｓ５５７３２７０４５、ｒｓ５６５２７８７０６、ｒｓ５４２１０８９９４、ｒｓ５３５３２６８３２、ｒｓ５６５５１８８４０、ｒｓ５４９７５１６０１、ｒｓ５３５１１５７６６、ｒｓ５３５３４４５８８、ｒｓ５６９３１６７３５、ｒｓ５４９７６７４４２、ｒｓ５６５５３６８７９、ｒｓ５６１４６９４１１、ｒｓ５５７３６３８４０、ｒｓ５６９４４９０１７、ｒｓ５４９７７６３８３、ｒｓ５６５５４８６８２、ｒｓ５６５５５１０４０、ｒｓ５５３８２３７９２、ｒｓ５５７３８３９３９、ｒｓ５３８７５０２５７、ｒｓ５４９７９５９３６、ｒｓ５５３５９９４６６、ｒｓ５４９７９７１８５、ｒｓ５５３５９９５６０、ｒｓ５３５１６２３１３、ｒｓ５４６０７９８５４、ｒｓ５４９８１６２０９、ｒｓ５５７１５７２５９、ｒｓ５５７１６０５０２、ｒｓ５３８９８６７２２、ｒｓ５５３６１８５７６、ｒｓ５３５１８３４８８、ｒｓ５５７４４０１６０、ｒｓ５３８７７５８９２、ｒｓ５３５２００８８３、ｒｓ５４６００４３０１、ｒｓ５６９３４７３５５、ｒｓ５６５３８５７２９、ｒｓ５４９６２１１８６、ｒｓ５５７２０９１８８、ｒｓ５５７４７２４４６、ｒｓ５４２４３８６８１、ｒｓ５４５９０７４５６、ｒｓ５３９０４１４３５、ｒｓ５５３９１３５８０、ｒｓ５５７２２６７１７、ｒｓ５５７２２９００７、ｒｓ５５７２３１８７２、ｒｓ５４２２２６０６３、ｒｓ５４２４５６８９０、ｒｓ５３５２４２６５４、ｒｓ５５３９２８７００、ｒｓ５４９８９４３４３、ｒｓ５５７５０４７７２、ｒｓ５４９６５８１１５、ｒｓ５４２２３７４１３、ｒｓ５５７５１１９９４、ｒｓ５４９９０８９１１、ｒｓ５３５２５３６８６、ｒｓ５４６１７５３６３、ｒｓ５３５４８４８２１、ｒｓ５４９９１９４６７、ｒｓ５４５９４４２８０、ｒｓ５６５７０４８１７、ｒｓ５４２２４３９３６、ｒｓ５６１３９９０３２、ｒｓ５６１４０５０９２、ｒｓ５５７５４７７３１、ｒｓ５４９６８５８６２、ｒｓ５４２５０９３９５、ｒｓ５４６２１４６５２、ｒｓ５６５４５３９３４、ｒｓ５４６２１５６６３、ｒｓ５６１４０８０６３、ｒｓ５４５９９１０２２、ｒｓ５５７３１４０７５、ｒｓ５５３９８２９４１、ｒｓ５３９１２４４１８、ｒｓ５６１６０６６７０、ｒｓ５５７５７４９８４、ｒｓ５３８９１４３８８、ｒｓ５３５４２７１３０、ｒｓ５４９９８１８６４、ｒｓ５６５６２５３８３、ｒｓ５４６１２４６９０、ｒｓ５４６１３０２０４、ｒｓ５６５７６６５５５、ｒｓ５３９０３４７３５、ｒｓ５３９０４０７７３、ｒｓ５５３９１３８２５、ｒｓ５５７６０２３３５、ｒｓ５４２５５４７４５、ｒｓ５４２５５８５２４、ｒｓ５５３９１４６５７、ｒｓ５５４０１７３６６、ｒｓ５５００１１０４９、ｒｓ５６５
７９０２１９、ｒｓ５５３７８４６４３、ｒｓ５３９１７３８３３、ｒｓ５６１６４５６５１、ｒｓ５３９１７９２０９、ｒｓ５３９１８３１１８、ｒｓ５５７３５２３７６、ｒｓ５６１６５５６５４、ｒｓ５５００４７１７５、ｒｓ５６１６６５１２２、ｒｓ５６５５３３５０５、ｒｓ５６５５６７４３１、ｒｓ５４６３１１８９０、ｒｓ５３９２１５０１４、ｒｓ５４６０６６７８２、ｒｓ５５７３９６７０５、ｒｓ５６９４６５８５６、ｒｓ５６９４７１２７２、ｒｓ５６５８４３３４８、ｒｓ５４９８２３５０２、ｒｓ５６５６０１７４３、ｒｓ５４２６３２０１３、ｒｓ５４２６３２８６５、ｒｓ５３９２２９１５４、ｒｓ５３８９９８６３１、ｒｓ５６５８５５３３８、ｒｓ５６１５２１５８０、ｒｓ５４９８５００９１、ｒｓ５４２６４３１７６、ｒｓ５３９２４９６３０、ｒｓ５５４０９７９２１、ｒｓ５６９７１６５８６、ｒｓ５６５６６０４１４、ｒｓ５３５５５０３３２、ｒｓ５４９８７９０６５、ｒｓ５５０１２２０３９、ｒｓ５４６１５６１２６、ｒｓ５３９２６７５７２、ｒｓ５４９９０２０３５、ｒｓ５５０１３１７４０、ｒｓ５６１７２６０３６、ｒｓ５５７７３４５１７、ｒｓ５３５４７８５０４、ｒｓ５６５９１６６４５、ｒｓ５６９７５１０８７、ｒｓ５３９２９５４９１、ｒｓ５３９２９９０２９、ｒｓ５６１７５６８９６、ｒｓ５５７７６１１４２、ｒｓ５５７５１３７２８、ｒｓ５３５４９６３４７、ｒｓ５６５９４０６７０、ｒｓ５６９５４３９４１、ｒｓ５４２７１９０４９、ｒｓ５４２４９６７５９、ｒｓ５４９９４２０２４、ｒｓ５５４１６９４７８、ｒｓ５５７５５０８２０、ｒｓ５６１８０６４１５、ｒｓ５３９１１８９２２、ｒｓ５６９８１５８３５、ｒｓ５４６２１６５４５、ｒｓ５３９３５２７７７、ｒｓ５４６２１８３８４、ｒｓ５４６２１９３５３、ｒｓ５６１８２５０６６、ｒｓ５６９８３２６９９、ｒｓ５５７５７８６１０、ｒｓ５３５７６６５９３、ｒｓ５３５７６７７６６、ｒｓ５６１８３８３５６、ｒｓ５３９３８２４３２、ｒｓ５６１６１４３５７、ｒｓ５６１８６０６１９、ｒｓ５３９３８６６４９、ｒｓ５３９３８６８５２、ｒｓ５４９９８７８７５、ｒｓ５６５７６７０７３、ｒｓ５６６０３６７６２、ｒｓ５４６４７８７７４、ｒｓ５４２８０１８３１、ｒｓ５６５８９０６４８、ｒｓ５６９８７７９７８、ｒｓ５６１６２０６７２、ｒｓ５６１６２７１３９、ｒｓ５５４０１２１２６、ｒｓ５３５５６６３０１、ｒｓ５３９４０６２２２、ｒｓ５６５７９３００９、ｒｓ５４６４９１４９２、ｒｓ５５４２４４３４９、ｒｓ５３５６７１３８４、ｒｓ５４２５８８８２０、ｒｓ５５０２９２００８、ｒｓ５５００５６６３０、ｒｓ５５０２９４２２６、ｒｓ５５４０６２９７７、ｒｓ５５４２５２７８７、ｒｓ５４２８３２８０９、ｒｓ５６９９０４２０３、ｒｓ５６９６６９９９６、ｒｓ５４６３１６７０４、ｒｓ５３９４３６１７９、ｒｓ５５００７０３１０、ｒｓ５６６０８８９３７、ｒｓ５６９６７４９８５、ｒｓ５３９４５２６８９、ｒｓ５５０３３５２０１、ｒｓ５６５８４４４８６、ｒｓ５５４２８４１４１、ｒｓ５４２８７５７３５、ｒｓ５５７９５５５２９、ｒｓ５４６５４０１３３、ｒｓ５５７９６０５８２、ｒｓ５６９６７８８０８、ｒｓ５４２８９６４１０、ｒｓ５６９９７８７１７、ｒｓ５３９４８７６１４、ｒｓ５３５９０１５８６、ｒｓ５３９４８９５３９、ｒｓ５３９４８９８７６、ｒｓ５４２６３７６４７、ｒｓ５５０３８６０６８、ｒｓ５４２９１４５０１、ｒｓ５３５６４４９３２、ｒｓ５４６５６８３０９、ｒｓ５４６３３６２２９、ｒｓ５３９２６０１５２、ｒｓ５３５９１３１９２、ｒｓ５６５８９３１２８、ｒｓ５４２６７２４４０、ｒｓ５６６０４４８２２、ｒｓ５３５９２５０７０、ｒｓ５６１９６９２２０、ｒｓ５４６５８９８９３、ｒｓ５６６０４６９５０、ｒｓ５５０２６０３４５、ｒｓ５４２８０６１８９、ｒｓ５３９５３１７９６、ｒｓ５４６４８４９３９、ｒｓ５３５８０８１９６、ｒｓ５６９８８８５７６、ｒｓ５６５９０８３５９、ｒｓ５５７７６２３４２、ｒｓ５５８０４８８５２、ｒｓ５６５９３５０３６、ｒｓ５７００５８０９７、ｒｓ５５４３７２５３５、ｒｓ５５８０８１４７１、ｒｓ５４２７１３１５１、ｒｓ５３９５７５４８１、ｒｓ５５４１５４４７２、ｒｓ５６６２３２４１６、ｒｓ５６９７９８０３５、ｒｓ５６５９６７５５８、ｒｓ５４２７４８３５０、ｒｓ５６６２４７０８１、ｒｓ５５７８１９１３０、ｒｓ５５７８２３９８４、ｒｓ５５７８２４２４４、ｒｓ５６５９９８７７０、ｒｓ５６６０２３３３４、ｒｓ５５０５１８６９７、ｒｓ５３９３８７２４７、ｒｓ５５７８９１０７０、ｒｓ５３５９３２７７９、ｒｓ５５８１４３８７４、ｒｓ５３５８１７８３７、ｒｓ５６１９５９９１０、ｒｓ５５０５３８０２４、ｒｓ５６１９６０３５７、ｒｓ５３９４１５４６４、ｒｓ５４２８３００２８、ｒｓ５６２０９１７１７、ｒｓ５７０１３７６３４、ｒｓ５６２０９５２８９、ｒｓ５７０１４５３８６、ｒｓ５３９４２８６９５、ｒｓ５３９４３４７６９、ｒｓ５７０１６１８８９、ｒｓ５６６３０３５２１、ｒｓ５６６３０６５６３、ｒｓ５５０３１７３００、ｒｓ５６６０９８８２２、ｒｓ５６９９４１１１５、ｒｓ５４６７１３４３９、ｒｓ５６２１５３３８６、ｒｓ５５４２９８２８７、ｒｓ５５４３１４２８８、ｒｓ５５７９９４７３８、ｒｓ５６１９４８４５３、ｒｓ５６６３３９１５３、ｒｓ５５７９９９０９７、ｒｓ５４６５７６４０７、ｒｓ５６６１９０３２８、ｒｓ５４３０４７５４９、ｒｓ５５０６３９４６８、ｒｓ５４２９５０４５９、ｒｓ５５８０３７９１８、ｒｓ５３５９３７５７３、ｒｓ５７００３３０００、ｒｓ５７００３７６８８、ｒｓ５３９６１３６１６、ｒｓ５７０１３３５１３、ｒｓ５６２２２７９７８、ｒｓ５６２０８３９５２、ｒｓ５５０６８４７９５、ｒｓ５６６３８９３７１、ｒｓ５５８３０３５６７、ｒｓ５５８３０３９４４、ｒｓ５５４４１９１５０、ｒｓ５７００４０９９６、ｒｓ５５０６９７７４５、ｒｓ５５０４５３０９６、ｒｓ５５８０８２５５７、ｒｓ５３６１３４６６９、ｒｓ５６２０２９４２８、ｒｓ５７０３０５９６７、ｒｓ５３９７３７７１３、ｒｓ５３５９８１７５９、ｒｓ５５０７２０１２６、ｒｓ５７００９３１５４、ｒｓ５５０５００３８５、ｒｓ５３５９８８７７５、ｒｓ５７０１００７９１、ｒｓ５５０７４２７８０、ｒｓ５６２３１２３１０、ｒｓ５５８３６５２７７、ｒｓ５６６４３６３９７、ｒｓ５４３２５９２５４、ｒｓ５６２３２３９０１、ｒｓ５３６１６９３２８、ｒｓ５５８１２０１０８、ｒｓ５６２０６４８２６、ｒｓ５４６８３３８８７、ｒｓ５５０５１５５２７、ｒｓ５３６１８７１０８、ｒｓ５３５９９８３２３、ｒｓ５５０７９１０３５、ｒｓ５６２０９１５４９、ｒｓ５６２０８３９５０、ｒｓ５３９６２７１９２、ｒｓ５５４４３６８０８、ｒｓ５４３３００９０３、ｒｓ５６２１４５２８５、ｒｓ５４３１０４４５０、ｒｓ５３９６５４０９３、ｒｓ５３９８０７１６８、ｒｓ５６２１６１１７０、ｒｓ５４６７２０４３１、ｒｓ５６６４８１８８１、ｒｓ５３９６７２７４９、ｒｓ５５８４３５７０１、ｒｓ５７０２１８６１７、ｒｓ５６２１８３６６１、ｒｓ５６２１９６５５９、ｒｓ５４３１３３１１３、ｒｓ５４６７４５００５、ｒｓ５４３１３２８３９、ｒｓ５５０８４３２９０、ｒｓ５５０８４５８９５、ｒｓ５６２４１７７７６、ｒｓ５３９８３８４３２、ｒｓ５５８４７５７３１、ｒｓ５４３３６８２８２、ｒｓ５４３３７４００５、ｒｓ５６２３９５１２１、ｒｓ５５８２５５９５７、ｒｓ５４３３８１０４２、ｒｓ５３６２４８３２６、ｒｓ５３９６９３８６７、ｒｓ５３９８７５５３９、ｒｓ５６６５３５０３８、ｒｓ５５４７０１６５９、ｒｓ５７０４９５２１２、ｒｓ５６２２２０４２５、ｒｓ５７０２６２４０９、ｒｓ５６６３７２７８１、ｒｓ５３９７０４９１９、ｒｓ５４３１７９４９３、ｒｓ５３９８９１８９２、ｒｓ５５８５４４０３６、ｒｓ５５８３０５３２５、ｒｓ５５８３１６４５４、ｒｓ５６２２６３００６、ｒｓ５５４７３３８０６、ｒｓ５７０２９７７７５、ｒｓ５５０７０５８１７、ｒｓ５６６５６２４０４、ｒｓ５５８５６３８６８、ｒｓ５４３４４６１５８、ｒｓ５６２５１６９０８、ｒｓ５７０５４５４５２、ｒｓ５４３２１９３８４、ｒｓ５５４７７２８７４、ｒｓ５５４５３００１９、ｒｓ５５４７７４６６９、ｒｓ５５４５３１０１８、ｒｓ５６２２８６７６１、ｒｓ５４３４６９９２４、ｒｓ５４６９５４３８７、ｒｓ５７０３２０６０２、ｒｓ５３６１６９９２７、ｒｓ５５８３８４９４６、ｒｓ５４６９６５９１８、ｒｓ５３９９４２２３２、ｒｓ５３９９４４６５９、ｒｓ５６６６０４７１５、ｒｓ５７０５９００１８、ｒｓ５４６９７２１１３、ｒｓ５３６３１４６０８、ｒｓ５７０５９１３６６、ｒｓ５６２５７７１９６、ｒｓ５６６４５９３９４、ｒｓ５５８６３２２３３、ｒｓ５４６９７８５０４、ｒｓ５６２５８４１４０、ｒｓ５５０７８８９０９、ｒｓ５５８６３９３４６、ｒｓ５４３２９６３５８、ｒｓ５３６１９１３８９、ｒｓ５４３５２０４７９、ｒｓ５７０３８７３６０、ｒｓ５５４８４１２０６、ｒｓ５６６６２６９３１、ｒｓ５６６６２８７１１、ｒｓ５４３２９７５３６、ｒｓ５５８６６２０３３、ｒｓ５３９８０１５７９、ｒｓ５５４８５９１６７、ｒｓ５５４５９７２７３、ｒｓ５５４５９８０８８、ｒｓ５５４８６７５２１、ｒｓ５７０６４４８５４、ｒｓ５５８６７９００７、ｒｓ５４３５５９７９７、ｒｓ５５１０７３１４７、ｒｓ５３６３６０１７１、ｒｓ５５４８９６２４５、ｒｓ５７０６６２９６４、ｒｓ５４３５７４８３２、ｒｓ５６６４７６０９７、ｒｓ５４３３１４４７１、ｒｓ５３６３７３５１７、ｒｓ５４７０４０７０３、ｒｓ５７０４０９４１９、ｒｓ５６６６６７６０７、ｒｓ５５０８２５８４５、ｒｓ５５０８２９１１５、ｒｓ５６６４９４４９２、ｒｓ５４３５９０１３３、ｒｓ５４６８６６７８０、ｒｓ５６２６８３１５１、ｒｓ５５４６７４００５、ｒｓ５４０００９２３０、ｒｓ５６６６７６８４５、ｒｓ５５１１２０００６、ｒｓ５７０６９７８０７、ｒｓ５７０４７０２３２、ｒｓ５６２４６０４１８、ｒｓ５６６５１２３７６、ｒｓ５４３６０４５２０、ｒｓ５５４９５３１５１、ｒｓ５５０９０２７５９、ｒｓ５６２７２９４４４、ｒｓ５５４７１０７５３、ｒｓ５５８５３１５５３、ｒｓ５６６５４５２２９、ｒｓ５５４７１３８３９、ｒｓ５５０９２０５４２、ｒｓ５６６５５３７２５、ｒｓ５４３６４６５５１、ｒｓ５４００４６７７７、ｒｓ５４３６５１４９１、ｒｓ５５０９２５１９０、ｒｓ５５０９２７９７９、ｒｓ５５０９３２３１０、ｒｓ５６２５３４２０２、ｒｓ５６２５３９９９６、ｒｓ５６２５４３１３６、ｒｓ５５５０１６６６０、ｒｓ５５５０１７８１７、ｒｓ５４３４６９６０７、ｒｓ５６２７７７２９８、ｒｓ５５８８２６０８４、ｒｓ５７０５６６９４８、ｒｓ５５４７９０５９９、ｒｓ５５５０４０７９０、ｒｓ５４６９６２９５０、ｒｓ５４６９７４４４７、ｒｓ５４７１７４３２４、ｒｓ５５８６３８１５５、ｒｓ５５８６４０４６７、ｒｓ５７０６０８６７２、ｒｓ５７０６１１１７６、ｒｓ５５４８５２８０５、ｒｓ５６６７７３１４５、ｒｓ５３６５１５４８０、ｒｓ５５８８５７８００、ｒｓ５６２６１５６７２、ｒｓ５６６７８０１１５、ｒｓ５３６５１８５６０、ｒｓ５５８６６７７０７、ｒｓ５５１０５４４７４、ｒｓ５６２６５９８４２、ｒｓ５５８８７０１７１、ｒｓ５５８８７９８２９、ｒｓ５６２６６２７４６、ｒｓ５７０８５０００４、ｒｓ５３６３７８９３７、ｒｓ５５４９１７９７０、ｒｓ５６６８１９６４０、ｒｓ５６６８１９７４７、ｒｓ５７０６８２０２７、ｒｓ５７０６８２３２５、ｒｓ５３６５５６４６６、ｒｓ５４７２４２４６２、ｒｓ５５１１０６８２６、ｒｓ５４０１２７０６６、ｒｓ５５４９２７３６０、ｒｓ５４３７７１５４０、ｒｓ５６６８３９４９０、ｒｓ５４００１７２１０、ｒｓ５５５１４４４１２、ｒｓ５７０８７８６２０、ｒｓ５６２９００４９９、ｒｓ５４７０９１３７０、ｒｓ
５６６８５１２５８、ｒｓ５４０１４５１０１、ｒｓ５４７０７２５０１、ｒｓ５４７２７７８１４、ｒｓ５６２９１６３６５、ｒｓ５４０１５１１９６、ｒｓ５５１３４６３０９、ｒｓ５４７２９０８３１、ｒｓ５５１３５２４０１、ｒｓ５５１３５２５０７、ｒｓ５５５１８４８９７、ｒｓ５４７２９８１５０、ｒｓ５４７０７８９６２、ｒｓ５４３７９３９９６、ｒｓ５５５１８９４１３、ｒｓ５５８９０３３５１、ｒｓ５５８９３０７３７、ｒｓ５６２７３９８５１、ｒｓ５４７３１２６８５、ｒｓ５６６７０９１４５、ｒｓ５５５２１０６８１、ｒｓ５５８７８６７５０、ｒｓ５６６９１３５３９、ｒｓ５６２９７２６４６、ｒｓ５５８７９１００９、ｒｓ５５１４０５８１４、ｒｓ５５８７９１２６４、ｒｓ５３６４４６３４７、ｒｓ５４７３５０７４２、ｒｓ５６６７１７６５６、ｒｓ５４３８６８４０１、ｒｓ５５８９６５８８７、ｒｓ５６６９４５４８６、ｒｓ５５５２５７９７１、ｒｓ５５５００７２７６、ｒｓ５６３０２７２９５、ｒｓ５３６６８６００９、ｒｓ５３６６９０４６８、ｒｓ５６６７２２６０１、ｒｓ５４３６５９５９１、ｒｓ５５１４６９８９９、ｒｓ５４７１３９３７０、ｒｓ５４７１３９７７８、ｒｓ５５１２００１６８、ｒｓ５７０７７５６１２、ｒｓ５３６４７４５０８、ｒｓ５４３６９０２３２、ｒｓ５５１４８７８０９、ｒｓ５５５０５０９３９、ｒｓ５６７０２６４５０、ｒｓ５４３９２９１５８、ｒｓ５３６４９９９１９、ｒｓ５３６７３９５６８、ｒｓ５４３７０１７９１、ｒｓ５６２８１６９２４、ｒｓ５５１５２３３７２、ｒｓ５４００８８５４８、ｒｓ５４７１８６９４６、ｒｓ５５１２５２９６８、ｒｓ５６７０５５４２０、ｒｓ５７１０８７２９２、ｒｓ５６３１１０４８４、ｒｓ５６３１１７９９６、ｒｓ５７１０９９３３５、ｒｓ５６７０７６５１０、ｒｓ５７１１０７８３７、ｒｓ５５１２５８４０７、ｒｓ５５９０５１２４２、ｒｓ５３６７８９０９２、ｒｓ５６７１０１１５２、ｒｓ５５１５７７５２２、ｒｓ５５５０９８７６０、ｒｓ５５９０６３３２１、ｒｓ５５５４２７５５６、ｒｓ５６３１６５０５６、ｒｓ５６２８５２２６２、ｒｓ５６７１２５７８３、ｒｓ５４７２３１４３６、ｒｓ５６３１７２０４７、ｒｓ５３６５４６８４８、ｒｓ５５８８８３３００、ｒｓ５４０３５７３７１、ｒｓ５４３９９８５１０、ｒｓ５７０８５３８０８、ｒｓ５６６８２３１２８、ｒｓ５５１６２５７９６、ｒｓ５４０３７５０４９、ｒｓ５４０３８１６９６、ｒｓ５４０３８４８２３、ｒｓ５５１６３８８４９、ｒｓ５４７２４５４３９、ｒｓ５５５４８９７３０、ｒｓ５７０８７１６２１、ｒｓ５３６８４９６２８、ｒｓ５７１２０２８３６、ｒｓ５６２９４４６０２、ｒｓ５４０１３４０２５、ｒｓ５４０４０１５７８、ｒｓ５４０４０８５２６、ｒｓ５３６６１６４２２、ｒｓ５４７５９７４６４、ｒｓ５５１６６５２８５、ｒｓ５３６８７２３６３、ｒｓ５５５５２３９３２、ｒｓ５５５５２６１６９、ｒｓ５６７２０８１５７、ｒｓ５４７３０３２１７、ｒｓ５４０４３５２１３、ｒｓ５４０４４０７１８、ｒｓ５６３２８１９３５、ｒｓ５５５５６６４８４、ｒｓ５７１２７７８９６、ｒｓ５５８９３７６３６、ｒｓ５４３８３４０８５、ｒｓ５３６６３３８４８、ｒｓ５３６６４９７５５、ｒｓ５６７２６９４２９、ｒｓ５４４１０３２１３、ｒｓ５５５５９２４５９、ｒｓ５４７３３９６０６、ｒｓ５５１４０７７２５、ｒｓ５６７２７９２５２、ｒｓ５５５２４９３０３、ｒｓ５７０９８０９５７、ｒｓ５５５２９４５６３、ｒｓ５４７３９５０１１、ｒｓ５４７４０３２５３、ｒｓ５６３３５６８６１、ｒｓ５５５６４１１５６、ｒｓ５３６９７９５４５、ｒｓ５５５６４６８９６、ｒｓ５５１７３８２８４、ｒｓ５５５６４９７２２、ｒｓ５７１０２３６７８、ｒｓ５５１７４１７０１、ｒｓ５７１３５３３３３、ｒｓ５５５６５６６６８、ｒｓ５４３９０６０３０、ｒｓ５４０２４７９１５、ｒｓ５６３０６３０２３、ｒｓ５３６７１９６７５、ｒｓ５４７７３９７２４、ｒｓ５４７４３４７６５、ｒｓ５６３３９８９０７、ｒｓ５７１３７４５４４、ｒｓ５６３０８８２７０、ｒｓ５５１５１２２５６、ｒｓ５５５６９７６３３、ｒｓ５５５３５５３８６、ｒｓ５６７０５０９２２、ｒｓ５４０２８９９８６、ｒｓ５６３４２７８５０、ｒｓ５４７７８９５７２、ｒｓ５４０２９２３１９、ｒｓ５７１４１６９７２、ｒｓ５４０５９３９６７、ｒｓ５６３４４４５９５、ｒｓ５７１４２２７６６、ｒｓ５７１４３３２０９、ｒｓ５６７０８６１８１、ｒｓ５６７１０９８８５、ｒｓ５５５４３６９３７、ｒｓ５３６８１２８６１、ｒｓ５４７８２７９７２、ｒｓ５３６８１３８３６、ｒｓ５４０３５７２１２、ｒｓ５５１６１３７１３、ｒｓ５５５４５３５１５、ｒｓ５３７０９１２６３、ｒｓ５３６８４６４０４、ｒｓ５６７１６９３６８、ｒｓ５３６８５６８７６、ｒｓ５７１４８２３３７、ｒｓ５５１８１６８２７、ｒｓ５３６８５９８４７、ｒｓ５６３５１４６２４、ｒｓ５５１６６４０２５、ｒｓ５５５５３８８７１、ｒｓ５３７１１９６９８、ｒｓ５４４０９０５１６、ｒｓ５６３３００５９９、ｒｓ５３７１２１５０１、ｒｓ５４０６７３８５７、ｒｓ５５５８２７２５６、ｒｓ５３６９２９９７０、ｒｓ５７１５０８０８９、ｒｓ５７１５０８６６８、ｒｓ５３６９３５４８３、ｒｓ５５５５９２９４５、ｒｓ５４７６７９３４６、ｒｓ５５５８３６８６６、ｒｓ５５９１６６０１４、ｒｓ５７１３２３００７、ｒｓ５５１７２４３２６、ｒｓ５５５６３５７０２、ｒｓ５６７５０６５０２、ｒｓ５６７５０７７２４、ｒｓ５３６９７１３９９、ｒｓ５６３５６６９７０、ｒｓ５７１３５２５８３、ｒｓ５６３５６８３４７、ｒｓ５５１８４４２４２、ｒｓ５５９３４０４９７、ｒｓ５５１８４６２７８、ｒｓ５５１８４６７４３、ｒｓ５５９３４１８４１、ｒｓ５４７９３１２８６、ｒｓ５４４１５１１５０、ｒｓ５６３５７７７４５、ｒｓ５６３３８２７１３、ｒｓ５４７７３７３０３、ｒｓ５３６９９６８４６、ｒｓ５５９３６３１０６、ｒｓ５７１３６４１５２、ｒｓ５７１５５８４１０、ｒｓ５６３５９５２８０、ｒｓ５７１５６７９２８、ｒｓ５６７３５０４６５、ｒｓ５４０５６３２９３、ｒｓ５５５８９９４１６、ｒｓ５５５９０２０２３、ｒｓ５４０７５３２６４、ｒｓ５４７９７０４３１、ｒｓ５６７３６３２４８、ｒｓ５６３４１５２９５、ｒｓ５４７９８３９５１、ｒｓ５４４１７３３４０、ｒｓ５３７０４３７５２、ｒｓ５３７２１４４０６、ｒｓ５４７８１２２４６、ｒｓ５５１８７９４８０、ｒｓ５４７９９３８６８、ｒｓ５４８０００１０７、ｒｓ５７１４３５８０８、ｒｓ５６７４２０３５３、ｒｓ５５９４２４０９２、ｒｓ５４７８２３４８６、ｒｓ５６３４８３７１６、ｒｓ５４０６２９４４１、ｒｓ５４０６２９５１５、ｒｓ５５５９７６７７０、ｒｓ５５５７７７４４９、ｒｓ５５１８０９５８９、ｒｓ５６７４４６７１６、ｒｓ５６７６４１８１５、ｒｓ５６７６４６５２８、ｒｓ５７１６６０２７９、ｒｓ５５９２６１００６、ｒｓ５４４３４９３５６、ｒｓ５４８０６５８５０、ｒｓ５４０８４０３４６、ｒｓ５５９２７６３３１、ｒｓ５５９２７８４８３、ｒｓ５５１９２８４４０、ｒｓ５６７６８９３５７、ｒｓ５５１９２９３１０、ｒｓ５５９２７９８１０、ｒｓ５７１５０４２４２、ｒｓ５３７３１８８２７、ｒｓ５４７８９５４７３、ｒｓ５５１９４０２９２、ｒｓ５５９５３２８７５、ｒｓ５４７８７８５４０、ｒｓ５５６０６５１５７、ｒｓ５３７３４５５３２、ｒｓ５４４３８８７６２、ｒｓ５４４３９３１３０、ｒｓ５４０８９５２４１、ｒｓ５４０８６６５１９、ｒｓ５４４２５７３１１、ｒｓ５５９５５６８３７、ｒｓ５５９３０９４５３、ｒｓ５４７８９９９１３、ｒｓ５７１７５３７２６、ｒｓ５６３７４６３８７、ｒｓ５６７７６１５６８、ｒｓ５６３７５７４５７、ｒｓ５３７３７９６５４、ｒｓ５６７４９８４７１、ｒｓ５４４４２７６７１、ｒｓ５４４２６２３５３、ｒｓ５５６１２１６６９、ｒｓ５４０６９０６４７、ｒｓ５５６１２７２９７、ｒｓ５５９５９８６９８、ｒｓ５５９６０６５４１、ｒｓ５３７４０５４８９、ｒｓ５５９３２１２７９、ｒｓ５４０７０６１６９、ｒｓ５５１９８７８３４、ｒｓ５５９３３７０１０、ｒｓ５５９３４７６２６、ｒｓ５４４４６５９６５、ｒｓ５７１５５０１７９、ｒｓ５６３８０６８４２、ｒｓ５４８２３０１３７、ｒｓ５４０９８６５３８、ｒｓ５４４４８７５２８、ｒｓ５４０７２８０１５、ｒｓ５７１８５０２２３、ｒｓ５５６１９７８８１、ｒｓ５５５８８４１３２、ｒｓ５４７９４９４１４、ｒｓ５４１００１７０９、ｒｓ５６７８６３７０１、ｒｓ５５９３７２７９６、ｒｓ５５９６８０９５９、ｒｓ５５２０１９６４４、ｒｓ５６７８６９２０３、ｒｓ５６７８７０４５４、ｒｓ５４７９６１０９９、ｒｓ５４１０１６８５５、ｒｓ５６７８７９１２５、ｒｓ５４１０２１３３９、ｒｓ５７１５８６５２２、ｒｓ５４４５２２４７６、ｒｓ５４０７６７３２３、ｒｓ５５５９２１１３５、ｒｓ５３７４８２３８６、ｒｓ５７１５９４２２０、ｒｓ５４８２８５６４３、ｒｓ５４７９８９８６６、ｒｓ５５６２５３８８５、ｒｓ５６３８７１３６４、ｒｓ５７７０３３７１０、ｒｓ５６７５９９０３８、ｒｓ５４４３２１８８０、ｒｓ５７１６２０１３８、ｒｓ５７２８８４６８８、ｒｓ５３７２４３２７１、ｒｓ５４０８０８５８１、ｒｓ５７１６３７８５３、ｒｓ５４８０３６８１５、ｒｓ５５９４５１８５４、ｒｓ５６７９３６０７１、ｒｓ５７２８９５４７４、ｒｓ５７７０５４７２７、ｒｓ５７１６５０３８３、ｒｓ５５９７６７０９７、ｒｓ５４８３３６２１５、ｒｓ５６３８９６０２８、ｒｓ５５６３０５０５３、ｒｓ５７７０６８４８０、ｒｓ５５５９９５５３４、ｒｓ５５６３０９００１、ｒｓ５７７０７０７４２、ｒｓ５４８３４４３７２、ｒｓ５４０８４４５９５、ｒｓ５６７９５９６６９、ｒｓ５６７９６１７５４、ｒｓ５７１６８８００１、ｒｓ５３７３１３７８５、ｒｓ５４８０９５６１７、ｒｓ５５９７９１４３２、ｒｓ５５１９４６１９４、ｒｓ５７１９８８５４２、ｒｓ５７７１０５０７６、ｒｓ５７７１０６９９７、ｒｓ５７１９９５７７０、ｒｓ５６７７３０９２５、ｒｓ５５９８１４８３７、ｒｓ５４８３９０００３、ｒｓ５６３９３４６１５、ｒｓ５４８３９６９３２、ｒｓ５４４６４００７４、ｒｓ５５６０７９２３６、ｒｓ５５９５６０２３１、ｒｓ５７１７５０９６５、ｒｓ５７７１２８６０１、ｒｓ５４４４２６２４３、ｒｓ５６８０１１１２０、ｒｓ５６８０１３２０９、ｒｓ５４０９２８６７８、ｒｓ５７２０３４１０２、ｒｓ５５２１３１４９６、ｒｓ５５６１２２５０２、ｒｓ５６８０２２１９５、ｒｓ５５６１４５２９４、ｒｓ５３７４１２５８３、ｒｓ５６３７９４５２１、ｒｓ５４８２０６３６６、ｒｓ５７２０５２３３７、ｒｓ５６８０４１８０７、ｒｓ５７１８３１０５２、ｒｓ５６８０４９１８９、ｒｓ５６８０５８４２８、ｒｓ５７３０３０６２４、ｒｓ５４４４８９１０８、ｒｓ５５２１７０２５９、ｒｓ５４８２４７４８９、ｒｓ５６３８２８７０７、ｒｓ５６８０７８１１４、ｒｓ５５６２１２４４０、ｒｓ５７２０８８８９４、ｒｓ５５２０２１８１５、ｒｓ５４８２７４３６２、ｒｓ５４４５２３５４８、ｒｓ５６３９９０４１３、ｒｓ５５６２３５４６４、ｒｓ５４４５２９８８３、ｒｓ５７１９０３５５１、ｒｓ５４８３０９１３０、ｒｓ５７３０７７５０２、ｒｓ５７２１０６６６４、ｒｓ５６８１１０４３５、ｒｓ５５９９５５６８６、ｒｓ５６７９２４５２５、ｒｓ５７２１１２４４２、ｒｓ５６７９２６４２４、ｒｓ５７７０４５３５４、ｒｓ５５２２３４７９０、ｒｓ５７３１１３４０１、ｒｓ５５２０５８０６８、ｒｓ５６８１４８８１１、ｒｓ５７３１２１３６７、ｒｓ５４８５５０２５３、ｒｓ５５９９９８６３８、ｒｓ５５６２８７１４５、ｒｓ５７１９３８００５、ｒｓ５４８５５８８７２、ｒｓ５７２８９０６８４、ｒｓ５７７２９０９５５、ｒｓ５７７２９２２６１、ｒｓ５７２１５０７１４、ｒｓ５５９７６５２１６、ｒｓ５７２１５５６７２、ｒｓ５７２１５８４７１
、ｒｓ５４４５８６９４８、ｒｓ５７２９１３９５９、ｒｓ５７３１６０６０１、ｒｓ７４７７１２９８５、ｒｓ５６００４３６３２、ｒｓ５７３１６７２００、ｒｓ５６３９０７５０２、ｒｓ５７１９７３０１５、ｒｓ５５６５２６０２４、ｒｓ５５６３２７３５３、ｒｓ５６７９７５９４９、ｒｓ７６０１９８８４０、ｒｓ７６０２１０４１９、ｒｓ５７３２０５８６２、ｒｓ５６００８８４１９、ｒｓ５４４６２３１０２、ｒｓ７５５８４５９７４、ｒｓ７６０２２２８６１、ｒｓ７４７７７０５６４、ｒｓ５４４６４０９５４、ｒｓ５６０１０６８７９、ｒｓ５６８２６６５９３、ｒｓ７５５８６３１１４、ｒｓ５７３２３５１９４、ｒｓ５６８２７４８７６、ｒｓ５４４６４０９６６、ｒｓ５６４１０１４６２、ｒｓ５６０１０３７１７、ｒｓ７４７７９３５５１、ｒｓ７６０２４８０３６、ｒｓ７５１６６３２９４、ｒｓ７５１６６４３４５、ｒｓ５７７３６２４６７、ｒｓ５７７３６９９５０、ｒｓ５７３２４８７６４、ｒｓ５６０１２５２６５、ｒｓ５６０１３９００２、ｒｓ７４７８０３００１、ｒｓ７５５８８７９０４、ｒｓ５６４１１０４３２、ｒｓ５５６３６７８２６、ｒｓ５６３９４２８８７、ｒｓ５７２９８５３３５、ｒｓ７６０２６９０２８、ｒｓ７６０２７０８３９、ｒｓ５７３２６９７２６、ｒｓ５７３２７４９８９、ｒｓ７５５９１１７２８、ｒｓ５６８３１８９５３、ｒｓ５６８０２１７５７、ｒｓ５５２１３５６７９、ｒｓ７５１７０７４０８、ｒｓ５４８４２６８４６、ｒｓ５４８４３４４１８、ｒｓ５６４１３９３４２、ｒｓ５７２０５１５９１、ｒｓ５５２１５３２５９、ｒｓ５７２０７２２７４、ｒｓ７５１７１５９５９、ｒｓ５７７１８８０６２、ｒｓ５６４１４６９８０、ｒｓ７４７８４８５５９、ｒｓ５６８３４１５３６、ｒｓ５５９９０８０８１、ｒｓ５５２１８８１２４、ｒｓ７５５９３９０２１、ｒｓ５７７２０６７６４、ｒｓ７６０３１７５２１、ｒｓ７５５９４８７３６、ｒｓ７５１７４３００６、ｒｓ５４８４７６３８６、ｒｓ７４７８７２８２７、ｒｓ５６８３６９１９７、ｒｓ７５５９６０８１５、ｒｓ７５１７５４５５３、ｒｓ５６０２２３９７４、ｒｓ５４８４７９６８５、ｒｓ７５５９７４１６８、ｒｓ５５６４３５０３７、ｒｓ５５２１９６５９６、ｒｓ７４７８９６１２６、ｒｓ５６０２４４１６８、ｒｓ７４７６５２０３１、ｒｓ５７７２２４２３５、ｒｓ５６０２５８６４６、ｒｓ５６４２２２５７１、ｒｓ７４７９１９９２０、ｒｓ７４７９２０６９８、ｒｓ７５１７９９８６５、ｒｓ５６４２３２８０３、ｒｓ５５９９６１８１４、ｒｓ５７３０９４１７４、ｒｓ５６８１３２９７２、ｒｓ５５６４７７５６５、ｒｓ５７３１２５２１２、ｒｓ７６０３９２１１１、ｒｓ７５１８１１６５７、ｒｓ７４７９３５７６７、ｒｓ５６４０３４７１３、ｒｓ７４７６８７６３２、ｒｓ５７３４０３７７６、ｒｓ５６８４４０７２１、ｒｓ５７３４０７０１１、ｒｓ５６８４４３１７５、ｒｓ７５６０３０６０８、ｒｓ７５６０３３４１５、ｒｓ７６０４０８４１４、ｒｓ５６８１８１８６２、ｒｓ５７７３０６８３５、ｒｓ７５６０４１９１０、ｒｓ７５６０４６０５２、ｒｓ７６０４２２０７７、ｒｓ７５１８４３７３８、ｒｓ５５６５１０８０１、ｒｓ５６００５１４３５、ｒｓ５６４２８６０２１、ｒｓ５７２３７８２０８、ｒｓ７４７９８４５９４、ｒｓ７４７７２２１３４、ｒｓ５６００６９３５２、ｒｓ７６０１９７６０４、ｒｓ５６０３４２８７８、ｒｓ７４７７５８５４４、ｒｓ７５５８８０９１２、ｒｓ５６４３１５５５６、ｒｓ７４７８０２８４２、ｒｓ５６４３１９６７４、ｒｓ７４８００１６４９、ｒｓ７５６０９７７０５、ｒｓ７５６１０１８８３、ｒｓ７４７８０６３５０、ｒｓ５６４３２７１２６、ｒｓ７５１８９５１７２、ｒｓ５６０３６７８４３、ｒｓ５７３２６３０３４、ｒｓ７６０２６８０５２、ｒｓ５６８５２６６５５、ｒｓ７４８０２３５９０、ｒｓ７５５９１９５３７、ｒｓ５７２２６０３６４、ｒｓ５７７５５５４４５、ｒｓ５７３２９４７２２、ｒｓ５６０３９４９２１、ｒｓ５７３５１０４４６、ｒｓ７５６１３３８７６、ｒｓ７４７８３９３１２、ｒｓ７６０５１１５２１、ｒｓ５６４３７０７７５、ｒｓ５６４３７６２４８、ｒｓ５６４３７６３６４、ｒｓ５６４１３９６８２、ｒｓ５６８５６３５５６、ｒｓ７５６１５２３８５、ｒｓ７４７８４０１７２、ｒｓ７４８０６６２６０、ｒｓ７５５９２７８５０、ｒｓ５６８５７２６７９、ｒｓ７５６１６４０９２、ｒｓ７６０５３４８９０、ｒｓ５７３３００６４７、ｒｓ７５５９３４９４５、ｒｓ５７７５９２２６２、ｒｓ５６４４０６７７０、ｒｓ５７２４５７５４７、ｒｓ７６０５５２０７６、ｒｓ５６８５９１０８３、ｒｓ７５６１８８５３８、ｒｓ５７３３０８９２６、ｒｓ７６０５６２９９８、ｒｓ７６０５６３１２１、ｒｓ７６０５７０１１８、ｒｓ７４８１１１９９９、ｒｓ５６０１９８８０５、ｒｓ７６０５７９６８５、ｒｓ７５６２１６３８８、ｒｓ７４７８７２２２５、ｒｓ５６４１８９０２１、ｒｓ５６０２３３３２４、ｒｓ７５２００８９９４、ｒｓ７６０３５４０８９、ｒｓ７５１７７８１１６、ｒｓ５７３３６１９０８、ｒｓ５６４２３３５９７、ｒｓ７６０３８５２９７、ｒｓ７５６２３５２５６、ｒｓ５７３６１４１８９、ｒｓ５６４４６７００６、ｒｓ５６０２７５７７２、ｒｓ７５６０１７９６９、ｒｓ７５１８１０６５６、ｒｓ７５６２５３７３５、ｒｓ７５２０３９２２６、ｒｓ７６０３９６４６０、ｒｓ７４８１６１６４７、ｒｓ５７３６３９３３８、ｒｓ７５２０４９７１４、ｒｓ５６４２４６７４１、ｒｓ７５６２８３４６２、ｒｓ７５６０３６７６８、ｒｓ７５２０７５００１、ｒｓ７５１８３１４９６、ｒｓ５６８４６７０２３、ｒｓ５６０５５２８６９、ｒｓ５６４２８３４８６、ｒｓ５７３４５４３６８、ｒｓ７５１８６８８４９、ｒｓ５７３４５６１８５、ｒｓ７５６０８３９６０、ｒｓ５７３６８０１６７、ｒｓ７６０６６４３１９、ｒｓ７５１８７５４０６、ｒｓ７５２０９０２８９、ｒｓ５７２３９６３３２、ｒｓ５６８７１００９８、ｒｓ５７３６９１５８８、ｒｓ７５６３１４６９１、ｒｓ５６８７１４２９４、ｒｓ５６０５７３４７７、ｒｓ５７３６９９３８３、ｒｓ７５６３２３２０６、ｒｓ７６０４７１８９９、ｒｓ７６０４７９５０１、ｒｓ７５１８９８７６４、ｒｓ５６８５３４４３５、ｒｓ７５２１１６１０３、ｒｓ７４８０３４７７３、ｒｓ７６０５０４７４５、ｒｓ５６０６００４６３、ｒｓ７６０７０８４８１、ｒｓ７６０７１４８１９、ｒｓ５７３５１４３８６、ｒｓ５７２５５７４１４、ｒｓ５７２５５７９５８、ｒｓ７４８２５４８６８、ｒｓ５６４３７７２７５、ｒｓ５６８７６２６０４、ｒｓ５６８７６３１９４、ｒｓ５６４５８９０２３、ｒｓ７４８０６１０１６、ｒｓ７５６１６２２４５、ｒｓ７５６１６６５７７、ｒｓ５６８７７１００６、ｒｓ５７２４４６６１８、ｒｓ７５１９７９７２９、ｒｓ７６４６０１９１２、ｒｓ７６４６０５５１７、ｒｓ７６０７４１４６５、ｒｓ７４８１１４０５９、ｒｓ５６８６２００７７、ｒｓ７５６３８３６９０、ｒｓ７５６３８４８７１、ｒｓ７５６３９１４００、ｒｓ５６８７８８８８１、ｒｓ７５６２１７８８８、ｒｓ７６０５８８７９８、ｒｓ５７３６０２７５０、ｒｓ７５２１８０１３８、ｒｓ５６４６２３７７８、ｒｓ７６４６２７８２１、ｒｓ７４８２９９５０３、ｒｓ７６４６２９９１０、ｒｓ７４８１３０６５１、ｒｓ５７３７８４８６１、ｒｓ７５６４０８３９３、ｒｓ７６０５９５８６４、ｒｓ７５６２３２７２４、ｒｓ７６０７７３４１２、ｒｓ５６４４６３９１５、ｒｓ５７２４９６２６０、ｒｓ５６８６５３５９８、ｒｓ７５６２５１５５９、ｒｓ７６０７７９０２２、ｒｓ７６０７８１５３９、ｒｓ５７３６３５９８２、ｒｓ５７３６５２５４９、ｒｓ７６４６５４４６４、ｒｓ７６４６５４９８７、ｒｓ７５２０６８７５３、ｒｓ７６９３０５４５３、ｒｓ５６８６９２９１８、ｒｓ５７２６１９９９１、ｒｓ５７３８３２７０４、ｒｓ５７７６６５１６０、ｒｓ５７７７６１３７０、ｒｓ７５６４６６４１２、ｒｓ５７７６６５６０９、ｒｓ７６４６９０７４７、ｒｓ７６９３２９２６４、ｒｓ５７３８５２８８８、ｒｓ５７３６７５２８６、ｒｓ７４８１９６０３７、ｒｓ７４８３６７８７５、ｒｓ７５６３００６６２、ｒｓ７４８１９７７４９、ｒｓ７６９３５９３９１、ｒｓ７４８２０３４３２、ｒｓ７６０８６３００９、ｒｓ７５２０９１１９８、ｒｓ７４８２２３１８７、ｒｓ７７３８９８３６８、ｒｓ７７３８９９８３４、ｒｓ７６０８８７５１２、ｒｓ７６９３９７９４３、ｒｓ５７２５４５２６３、ｒｓ７４８２３００１２、ｒｓ５６０５９１０９６、ｒｓ７６０７０２０９５、ｒｓ７５６５４７２２１、ｒｓ７６９４０３６０５、ｒｓ５７３９１６６１１、ｒｓ７６９４０５３７３、ｒｓ５７７６９１８２１、ｒｓ７６０８９９１３５、ｒｓ７６０７１４９１６、ｒｓ７６４７７８７１０、ｒｓ５６８７５９５５５、ｒｓ５６０６２６８０９、ｒｓ５７７７０８４２４、ｒｓ７６０９１３８９３、ｒｓ７６０７３１０２２、ｒｓ７６９４２８０８７、ｒｓ７５２１５１３０７、ｒｓ５７３９４２９４０、ｒｓ７５６５８２０５９、ｒｓ７６０９２６０９２、ｒｓ７４８４５６９１３、ｒｓ７７３９５７５６２、ｒｓ７５６３７４８０６、ｒｓ７５２３５５３３５、ｒｓ７５２１６４９４０、ｒｓ７７３９６１８５３、ｒｓ７６４８１６９２７、ｒｓ７６９４５３５７７、ｒｓ７４８２８０５７７、ｒｓ７５２１７６０１４、ｒｓ７４８４７２９７９、ｒｓ７４８２９２６９３、ｒｓ７７３９７３８４９、ｒｓ７５６３９６６７８、ｒｓ７４８４７７１２３、ｒｓ７６４８３１５２２、ｒｓ７７３９８６２９６、ｒｓ７６９４７５８９７、ｒｓ７７３９８９４９４、ｒｓ７４８４８８８７４、ｒｓ７６０９６２５２９、ｒｓ５７３９８９２６０、ｒｓ７６４６３００００、ｒｓ５７７７３１３５８、ｒｓ７６４８６００９１、ｒｓ７６０９７８５３０、ｒｓ７６４８６４８４４、ｒｓ７７４０１０５９９、ｒｓ７６０９８２３１８、ｒｓ７５６６４６３８７、ｒｓ７５２１８９４８３、ｒｓ７５２４１０６４０、ｒｓ７７４０２１５０６、ｒｓ７６４６４２３１７、ｒｓ７５６６６０４７１、ｒｓ７５２４１８４５０、ｒｓ７５６６６５１６１、ｒｓ７６０７７５１２８、ｒｓ７５２４２５８９０、ｒｓ５７３７９５４０７、ｒｓ７６９２７４４９５、ｒｓ７４８５３６４４５、ｒｓ７７４０４２５４０、ｒｓ７７４０４８０８５、ｒｓ７４８５４５５５５、ｒｓ７６４９０４９０６、ｒｓ７６９２８０９７２、ｒｓ７６４６５２２８７、ｒｓ７５６４４０４２５、ｒｓ７６０８１１１０２、ｒｓ７５２４４７２５３、ｒｓ７５２２３５４５６、ｒｓ７６１０３２０８８、ｒｓ７６９５５５２３９、ｒｓ５７２７９６３７５、ｒｓ５７４０５８３２２、ｒｓ７７４０６８８０７、ｒｓ７５６７０５５９１、ｒｓ７４８３４９７７８、ｒｓ７６９３３６３７３、ｒｓ７６９３３８１４３、ｒｓ５７２８０６７０３、ｒｓ５７７７７４０２２、ｒｓ７６４９３９２５６、ｒｓ７５６７２０３７４、ｒｓ７６４９４５４３７、ｒｓ７４８５８２０８５、ｒｓ７６４９４５９８２、ｒｓ７５２４７６２５１、ｒｓ７６０８４１３５３、ｒｓ７５６５１３８９３、ｒｓ７６４９５０８７６、ｒｓ７５２２８７８３９、ｒｓ７５６７２９３０６、ｒｓ７５２２９７７８７、ｒｓ５７２６６９９３７、ｒｓ７４８５９８４１６、ｒｓ７７４１０６００５、ｒｓ７６９３９９９５２、ｒｓ７６４９６５５０７、ｒｓ７５２３１１３１６、ｒｓ７５２４９７０１６、ｒｓ７５６７４６８７６、ｒｓ７７３９１１２６６、ｒｓ７５６７５１０９４、ｒｓ５７７９７５７９８、ｒｓ７６９４０６２６６、ｒｓ５７４１１３２１６、ｒｓ７５６７６０４８６、ｒｓ７７３９２３４４７、ｒｓ７６４９８８７１９、ｒｓ７７４１３４０６０、ｒｓ５７７８１７７６１、ｒｓ５７４１２３６０８、ｒｓ５７７８１９８５０、ｒｓ７５６７７４３７６、ｒｓ７４８４４１１５７、ｒｓ７６９４２７９６３、ｒｓ７６９６３５９４８、ｒｓ５７７８２８６５６、ｒｓ７７３９６０１６１、ｒｓ５７２７０３
３９２、ｒｓ７７４１６１４７５、ｒｓ７７４１６６３６３、ｒｓ７６９６５５３０３、ｒｓ５７３９６４９３１、ｒｓ７５２３６０９３８、ｒｓ７５６８０１７６６、ｒｓ７６５０３０１１２、ｒｓ７５６６０７２３８、ｒｓ７７３９７５６６０、ｒｓ７６９６６３３２３、ｒｓ７６９４８５８０８、ｒｓ７６５０３８５８２、ｒｓ７６９４８９９３０、ｒｓ７５２４０４５５７、ｒｓ７６０９９３３２７、ｒｓ５７７８９１６１５、ｒｓ７５２５７０５１９、ｒｓ７５６６６９２７７、ｒｓ７６９５２６８３３、ｒｓ７５２５７７８７２、ｒｓ７５６６８６２２１、ｒｓ７５２５７９２７０、ｒｓ７６５０５５７５０、ｒｓ７７４０５３６３９、ｒｓ７７４０５６４６３、ｒｓ７６９５４７３７４、ｒｓ７６５０６０４５１、ｒｓ７５６８３４３３６、ｒｓ７６９６９７３５０、ｒｓ７４８６８８０７４、ｒｓ７６９５５２３３０、ｒｓ７６１１７６５３８、ｒｓ７４８５６９２７７、ｒｓ７６４９３１３７６、ｒｓ７５２６０２１０２、ｒｓ７４８５７０６０４、ｒｓ５７７９３８２３３、ｒｓ７６５０７９５３７、ｒｓ５７２８２１８２８、ｒｓ７６９７１４７２５、ｒｓ７６９７１５２６３、ｒｓ７４８７０２４５５、ｒｓ７７８９４６７０２、ｒｓ７６１１９４０６６、ｒｓ７６９５８４０９３、ｒｓ７６９７２８３８３、ｒｓ７６９５８４７３９、ｒｓ５７４２２６２５８、ｒｓ７５６７３３８９５、ｒｓ７５２６２３５３７、ｒｓ５７２８３１８３５、ｒｓ７６９７３７８３９、ｒｓ７４８７２４５８３、ｒｓ７６９７５１８２１、ｒｓ７６４９６３６４６、ｒｓ５７４２５１２６８、ｒｓ７５６７４４３７２、ｒｓ５７４２５２８６１、ｒｓ７７８９８５９２５、ｒｓ５７２８４３３０９、ｒｓ５７２８４７８５８、ｒｓ７６５１３００６５、ｒｓ７７８９９５８４８、ｒｓ７４８６２０８８５、ｒｓ７７４１３５１５６、ｒｓ７６１１０２７０８、ｒｓ７４８６３４６３９、ｒｓ７７８８５８３９６、ｒｓ７６９６４０３６１、ｒｓ７４８６３８８３８、ｒｓ７５６９２４７２９、ｒｓ７６９７８９９９１、ｒｓ７７４１６００５８、ｒｓ７６５０２５３７８、ｒｓ７７８８８００７５、ｒｓ７４８７７４３７５、ｒｓ７６５０３０７４９、ｒｓ７５２５６０４３５、ｒｓ７４８７７９７３０、ｒｓ７６１２７２１１７、ｒｓ５７４１６８１０８、ｒｓ７６１２７５４７４、ｒｓ７７４３３１０２９、ｒｓ７４８６６５１８５、ｒｓ７５２５６９１８９、ｒｓ７６１２８５６７８、ｒｓ７７４３３６５９３、ｒｓ７７４３３７２４８、ｒｓ７７４１８６１５９、ｒｓ７６９８２５００５、ｒｓ７７４１８６３１２、ｒｓ７６５０４６３４０、ｒｓ７６５１９７０３７、ｒｓ７４８８０４６９７、ｒｓ７７４１９２７３９、ｒｓ７７４３４７８３４、ｒｓ７５２７１９１９４、ｒｓ７６５０５３３７６、ｒｓ７７４３５３２４３、ｒｓ７６９６８６９３６、ｒｓ７５２５８４４６９、ｒｓ７６９６８９１６５、ｒｓ７６１１７５７３５、ｒｓ７４８８２１４４６、ｒｓ７７４２１６４０８、ｒｓ７７９０８５５６６、ｒｓ７５６９９２６７４、ｒｓ７５２６００３２５、ｒｓ７７９０９１２５７、ｒｓ７５６８４８６００、ｒｓ７７４２２３７２６、ｒｓ７６９８６４５１６、ｒｓ７５７００２６２０、ｒｓ５７８０７２５２０、ｒｓ７５２６１８４９２、ｒｓ７７８９５５４０８、ｒｓ７４８７１５７６０、ｒｓ７５６８７６８６２、ｒｓ５７８２２５０５０、ｒｓ７６１３４１１９０、ｒｓ７７４３９１５６２、ｒｓ７５７０１４６９２、ｒｓ７６１２２２５２２、ｒｓ７７９１１５３４６、ｒｓ５７４３７１００１、ｒｓ７６１３４９５９３、ｒｓ７４８８５４０１７、ｒｓ７７４４０５５１９、ｒｓ７７４４１４６０９、ｒｓ７６９７５６２８２、ｒｓ７６９９００２７９、ｒｓ７６５２６９４１９、ｒｓ５７８２４８３２５、ｒｓ７５７０３９０２０、ｒｓ７７９１４２１５２、ｒｓ７６５２７３８１０、ｒｓ７６１３６８４６２、ｒｓ７５２６４７５４６、ｒｓ７５２６４８２５４、ｒｓ７４８７４７２２２、ｒｓ５７８１２９０６４、ｒｓ７６１３７６０７１、ｒｓ７５２７９３６４３、ｒｓ７７９１５５９５４、ｒｓ７５６９１２５７０、ｒｓ７６１２４２８５３、ｒｓ５７８１３３９６０、ｒｓ７７９００８５８８、ｒｓ７６５１４７９２８、ｒｓ７６５１５７９２４、ｒｓ７６１３８７８９６、ｒｓ７６５２９８８６３、ｒｓ５７４２８９１８４、ｒｓ７４８９０００４２、ｒｓ７４８９００３５９、ｒｓ７４８９０３６４７、ｒｓ７６５１６１１７９、ｒｓ７７９１８２２８５、ｒｓ７７４４５７８９３、ｒｓ７７９１８４６２３、ｒｓ７７４４６２２４３、ｒｓ７６９９４７４５５、ｒｓ７６１２６８１８５、ｒｓ７７４３１５９３３、ｒｓ７６９８０７４６７、ｒｓ７５７０８２６１３、ｒｓ７７９１９８４３２、ｒｓ５７４３１３１２２、ｒｓ５７４３１３７３４、ｒｓ７７４４７４１４１、ｒｓ７５６９６２５９２、ｒｓ７６９９６２６９５、ｒｓ７６５３３６６２６、ｒｓ５７８１７９９９５、ｒｓ７５２７１１４１１、ｒｓ５７４４５８９１３、ｒｓ７６９９７６７２８、ｒｓ７７４４９１７３３、ｒｓ７６９９７７８９７、ｒｓ７７４４９２６３４、ｒｓ７７４４９３５３４、ｒｓ７７９２２２３８４、ｒｓ７７４４９５１６４、ｒｓ７５２７１５１１０、ｒｓ７６１４４３９５６、ｒｓ７６５３５３１１０、ｒｓ７６１４４８０８３、ｒｓ７４５３０７８００、ｒｓ７５６９７７７７１、ｒｓ７６１３０９５２５、ｒｓ７７９０７７３２９、ｒｓ５７８１９６４３６、ｒｓ７７４５１９４４１、ｒｓ７７０００４９７０、ｒｓ７６１３１５６８７、ｒｓ７６１３１６７７０、ｒｓ５７４４９５５３０、ｒｓ７７４５２９５２７、ｒｓ７６１３２１０５０、ｒｓ７７４５３０２５２、ｒｓ７６５３８６９８６、ｒｓ７４８９７３６２６、ｒｓ７４８９７３６２７、ｒｓ７５７１３３４６３、ｒｓ７４８８２８２２５、ｒｓ７６５２３０６９５、ｒｓ７７９２６６０９９、ｒｓ７５２７４８７９３、ｒｓ７５７１３６６７５、ｒｓ７７４３８３８７６、ｒｓ５７４５０８３９２、ｒｓ７７９２７２５６９、ｒｓ７７４３８４８７４、ｒｓ７６９８７１２８２、ｒｓ７７００２９０２９、ｒｓ７７４５４７２９８、ｒｓ７６９８７４１３３、ｒｓ７６５２４７０６５、ｒｓ７７４５５０８７４、ｒｓ５７４３８９９３７、ｒｓ７７９２８３２３６、ｒｓ７７９１４７２５０、ｒｓ７５７１５５４０４、ｒｓ５７８２５７３８８、ｒｓ７６１５０２５４４、ｒｓ７５７０５０８４５、ｒｓ７７００４７２４７、ｒｓ７６５４１９０８３、ｒｓ７６１５０５２７３、ｒｓ７７４５６７２１７、ｒｓ７４９０１１１９６、ｒｓ７４９０１５８７６、ｒｓ７５２７９３１０９、ｒｓ７４８８８３５６０、ｒｓ５７４５５２０１４、ｒｓ７５７１７６１３６、ｒｓ７４５３６９３８５、ｒｓ７４８８８５７６８、ｒｓ７７００７０４１９、ｒｓ７６１５３０５０７、ｒｓ７６５４５１７９３、ｒｓ７５７０５８１１７、ｒｓ７５７０５８３７３、ｒｓ７６１５３６６３３、ｒｓ７６５２９５４６４、ｒｓ７７４４４２２１８、ｒｓ７４５３９０１２２、ｒｓ７５７０６７３４０、ｒｓ７６５３１１７０３、ｒｓ７６５３２２３９８、ｒｓ７６１４１５７１１、ｒｓ７７９１９５２２７、ｒｓ７７９２００５９５、ｒｓ７７９３４５８４６、ｒｓ７５２８２５５４１、ｒｓ７６９９６０５８７、ｒｓ７６５４７５４２７、ｒｓ７６９９６７１１６、ｒｓ７４８９２７６０５、ｒｓ７７９２２５７６５、ｒｓ５７４５８６３９８、ｒｓ７５２９４１０１１、ｒｓ７７０１２２７２０、ｒｓ５７４５９６７９５、ｒｓ５７４５９７４４５、ｒｓ７６１４５５１０３、ｒｓ７５７１１８２２９、ｒｓ７７９３８２９０５、ｒｓ７７９３８３１１２、ｒｓ７４５４２９３３８、ｒｓ７４５３１２５９５、ｒｓ７６１４６２９４０、ｒｓ５７４４９１６７３、ｒｓ７６１５９７１９４、ｒｓ７６１５９９４９４、ｒｓ７５７２４３３３３、ｒｓ７７９４１０３７０、ｒｓ７７９４１２８４３、ｒｓ７６１４６６８８０、ｒｓ７５２９７５２４０、ｒｓ７６５５３９３１５、ｒｓ７４５４５７４０４、ｒｓ７６５５４０３６２、ｒｓ７７４６８６２１０、ｒｓ７６５５４６３８６、ｒｓ７７０１７９１８３、ｒｓ７６１６１６０８１、ｒｓ７４８９７１０９３、ｒｓ７６５３８９９４８、ｒｓ７４９１２６７７９、ｒｓ７５７２６９２５１、ｒｓ７７０１９７２１７、ｒｓ７７００２０４１８、ｒｓ７７４５３６５７８、ｒｓ７４９１３４１０８、ｒｓ７７０２１０５４５、ｒｓ７７００２３１９８、ｒｓ７７４５４５３１４、ｒｓ７４９１３８８０１、ｒｓ７７９２７４５４７、ｒｓ５７４６７７２６８、ｒｓ７７００３０７４５、ｒｓ７６５５８６１７６、ｒｓ７５３０１２９５８、ｒｓ７６１６５５９３９、ｒｓ７５３０１７５５０、ｒｓ７５７２９４７７２、ｒｓ５７４５１５８３７、ｒｓ７４５５０６４０８、ｒｓ７４５３４３１８１、ｒｓ７５７３０２６５７、ｒｓ７５３０２７９８８、ｒｓ７５７１５５２３２、ｒｓ７７０２５１２０３、ｒｓ７４９０００６８９、ｒｓ７７４７６０３７８、ｒｓ７６５６２３５０５、ｒｓ７４５５３２９７２、ｒｓ７７００４６５７３、ｒｓ７７００６０３７５、ｒｓ７６１６９８３１７、ｒｓ７４９０２０５５１、ｒｓ７６１７００７５９、ｒｓ７４５５４２４９５、ｒｓ７４９１９３６６３、ｒｓ７７９３１６４９５、ｒｓ７７０２７６９７６、ｒｓ７４５５４５４８３、ｒｓ７７４７８３３０９、ｒｓ７５２９１２８７４、ｒｓ７５７３３８５３８、ｒｓ７５２９１４３０３、ｒｓ７４５５５０５８７、ｒｓ７４５５５２４１３、ｒｓ７４５５５５７０４、ｒｓ７５２９１８９０８、ｒｓ７７００８８７１５、ｒｓ７４９０４４３６１、ｒｓ７４９０４５５４３、ｒｓ７７９５３８７１８、ｒｓ７７４８０３６１０、ｒｓ７５７３５５６３１、ｒｓ７４９０４５８０２、ｒｓ７６１７３００８５、ｒｓ７４９０４６６７０、ｒｓ７６５６７０４１４、ｒｓ７５３０８６８２０、ｒｓ７７００９７５９５、ｒｓ７４５５７８４８５、ｒｓ７７４８２０１３７、ｒｓ７６１７４２２２８、ｒｓ７５７３７１５５５、ｒｓ７７４６１１５９１、ｒｓ７６１７４３８６５、ｒｓ７４５５８２７４３、ｒｓ７７０３２０９９４、ｒｓ７６５６８４７２４、ｒｓ７７０１０１３１２、ｒｓ７７９３４９６０３、ｒｓ７６１７５１８９１、ｒｓ７７４８３０３２４、ｒｓ７６１７５２２７５、ｒｓ７７９５７５３８４、ｒｓ５７４７５２９１１、ｒｓ７５７３８２０９４、ｒｓ７６５４７７３７７、ｒｓ７５２９３３９４９、ｒｓ７４９２５０６２２、ｒｓ７４５５９９００５、ｒｓ７５３１０５６３９、ｒｓ７６１５５９６８８、ｒｓ７７９５９０７３５、ｒｓ７４５４２０３４６、ｒｓ７７０１３５２６５、ｒｓ７７０１４１２８５、ｒｓ７７０３６０８８９、ｒｓ７６１５９２３０２、ｒｓ７６５７２４１８６、ｒｓ７５３１２１９７３、ｒｓ７４９０９５８７５、ｒｓ７５２９７３９８１、ｒｓ７５７４１０９６０、ｒｓ７４９１１７７６５、ｒｓ７４５４７２３６７、ｒｓ７６１７８７２８８、ｒｓ７６５７３１４０５、ｒｓ７７９６１６１８０、ｒｓ７６５７３６６５２、ｒｓ５７４６６３６１３、ｒｓ７７０２００３３６、ｒｓ５７４７８５６０３、ｒｓ７７０２１０５７７、ｒｓ７４５４９１８３５、ｒｓ７４５６３３２１９、ｒｓ７５３００４４３１、ｒｓ７７４７２６４９８、ｒｓ７７９４７１２８０、ｒｓ７６５７４６１６５、ｒｓ７７９４７７８７７、ｒｓ７６１６７８８２２、ｒｓ７７０３８９８８１、ｒｓ７６５７４９７３５、ｒｓ７７４７５８７８１、ｒｓ７７４８９２３６４、ｒｓ７６１６９１６１４、ｒｓ７４９３０８９８０、ｒｓ７７４８９５４４９、ｒｓ５７４７１０９７４、ｒｓ７４９３１４０６７、ｒｓ７６５６３４３１２、ｒｓ７４５６５９０１９、ｒｓ７７９５１９０６３、ｒｓ５７４８０８６２５、ｒｓ７６５７７２５７５、ｒｓ７７９５２４５５０、ｒｓ７７９５２７２６４、ｒｓ７７０２８８３４３、ｒｓ７６５６５２４１４、ｒｓ７６１８３５４０６、ｒｓ７７０４２９４２５、ｒｓ７７０４２９４９８、ｒｓ７４９２０７７０３、ｒｓ７５７３４７５６５、ｒｓ７７４８０６６０１、ｒｓ７７９５５１０６７、ｒｓ７４５６８１０４２、ｒｓ７７９
６８８６３４、ｒｓ７７９６９２７３５、ｒｓ７７０４５０８６４、ｒｓ７７０４５３６２８、ｒｓ７７９５６００８０、ｒｓ７６５６８２１４１、ｒｓ５７４８４０７６２、ｒｓ７７９５６９９６８、ｒｓ７５７４８７９１３、ｒｓ７７９５７００７３、ｒｓ７４５７００３７４、ｒｓ７６５６９７３８４、ｒｓ７５７４９６０１５、ｒｓ７７４８３５９５１、ｒｓ７５７３８９５９０、ｒｓ７６５８２６５９２、ｒｓ７５３２０４１２５、ｒｓ７４５６０８３５６、ｒｓ７６１８８３４４５、ｒｓ７７４８５３００６、ｒｓ７７４８５５９３９、ｒｓ７７９６０５４０５、ｒｓ７７９７３３１１６、ｒｓ７４９３９１７８６、ｒｓ７７４９８３９７４、ｒｓ７７４８６１６８０、ｒｓ７５３２２１６５６、ｒｓ７６５８５３８０４、ｒｓ７７４９８８９３３、ｒｓ７７０５０４３９１、ｒｓ５７４７７６７３６、ｒｓ７６１７８６１３８、ｒｓ７６５８７１９２７、ｒｓ７４９４１３５６７、ｒｓ７６１７８７１５１、ｒｓ７７９７７１０４４、ｒｓ７４９４１７１２３、ｒｓ７４９４２０３３１、ｒｓ７５７５４９０９０、ｒｓ５７４８９２９６５、ｒｓ７４５６３０６２０、ｒｓ７７４８７６７０２、ｒｓ７５３１３７５３５、ｒｓ７４９２９２４０２、ｒｓ７７０３８４９５１、ｒｓ７５３１４２３０５、ｒｓ７５７４２４８６６、ｒｓ７７０５５９２０４、ｒｓ７４９２９６７４１、ｒｓ７５７５８２８２７、ｒｓ７７０３８９０４１、ｒｓ５７４９２１７５１、ｒｓ７７５０５５９５０、ｒｓ７７９８２３９００、ｒｓ７４５７９７７５６、ｒｓ７６１９７６２９５、ｒｓ７７９８３０８２３、ｒｓ７７９６３６７１７、ｒｓ７６５９３６４７２、ｒｓ５７４９３２８８３、ｒｓ７７４８９３５６８、ｒｓ７７０５９６７９９、ｒｓ７７９６４６８３９、ｒｓ７６５９４７４０１、ｒｓ７４５６５８１４９、ｒｓ７４９３２１８５６、ｒｓ７６５９５３９５１、ｒｓ７６５９５８２０６、ｒｓ７６５９５８３８３、ｒｓ７７０４１６２２４、ｒｓ７４９４９２９０５、ｒｓ７６５７７５４３３、ｒｓ７７０６１４０３１、ｒｓ７７５０９４９５４、ｒｓ７４５８３５５７１、ｒｓ７７９８７２９６９、ｒｓ７６５７７６３６６、ｒｓ７４９３２８６５９、ｒｓ７７５１０６５４６、ｒｓ７６１８４００１１、ｒｓ７７９６７６５４６、ｒｓ７４９３４２２１５、ｒｓ７４５８５０１７５、ｒｓ７７０６３５３２３、ｒｓ７４９５１３９７７、ｒｓ５７４９６７０４０、ｒｓ７５７４７０３０９、ｒｓ７４９５１５０１８、ｒｓ７５３３２１７１１、ｒｓ７５７６４７４１１、ｒｓ７５７４８６０１０、ｒｓ５７４９７２５６６、ｒｓ７７５１１９８００、ｒｓ７６５８１２７３２、ｒｓ５７４８４２１２０、ｒｓ７７９９０１６７８、ｒｓ７４５６９８３９２、ｒｓ７５７６５５００１、ｒｓ７７９９０５６４８、ｒｓ７７０６５３０７４、ｒｓ７６２０４３６４４、ｒｓ７６１８７１７７１、ｒｓ７４５８６８３１５、ｒｓ７７９７１５３３４、ｒｓ７４５７０８００８、ｒｓ７７９９１３２３１、ｒｓ７５３２０５３２３、ｒｓ７６２０５２７６１、ｒｓ７７９７２３８４４、ｒｓ５７４９８７０２０、ｒｓ７６６０１７８５１、ｒｓ７５３２０５９３４、ｒｓ７７９９２４１４９、ｒｓ７７０６６９９１２、ｒｓ７６６０２１１３３、ｒｓ７４５８８１００８、ｒｓ７５７６７２４６０、ｒｓ７７９９３１４７７、ｒｓ７５７６７５２４４、ｒｓ７４５８９１５０４、ｒｓ７４５７２０５８０、ｒｓ７４９３９４３５０、ｒｓ７７０５０６８８３、ｒｓ７６１９１６６１３、ｒｓ７５３２３８９８８、ｒｓ７６６０４４５６４、ｒｓ７４５７６２６８７、ｒｓ７４９５４９４４３、ｒｓ７７０５４０６５０、ｒｓ７６６０４７９２８、ｒｓ７７０５４３８９６、ｒｓ７６６０５０２２２、ｒｓ７７９９５８９０７、ｒｓ７５３３６７５９４、ｒｓ７５３３６７７５０、ｒｓ７７０５４６９４５、ｒｓ７７５０３１８８５、ｒｓ７４９４３６１３６、ｒｓ７７５１８１８７２、ｒｓ７５７５７２４９８、ｒｓ７５３２６６３２６、ｒｓ７７０７１０５２８、ｒｓ７７９８２０７６０、ｒｓ７７５０６４１１０、ｒｓ７６２１０１７９７、ｒｓ７６５９３７４６２、ｒｓ７７５１８８３３４、ｒｓ７４５９２１３６４、ｒｓ７６２１０５４４２、ｒｓ７７９８４４４６１、ｒｓ７５７７１３８２１、ｒｓ７７９９８１５９３、ｒｓ７６２１１２５２８、ｒｓ７７５１９８４３５、ｒｓ７６６０７８６６２、ｒｓ７５７７２１８６０、ｒｓ７６２１１９０３８、ｒｓ７５３２９２２４１、ｒｓ７４５９３９８２０、ｒｓ７６１９９６８７３、ｒｓ５７５０３１９２２、ｒｓ７５３２９７７０１、ｒｓ７５３３００３３９、ｒｓ７８００１１８５１、ｒｓ７６２０１７４２５、ｒｓ７８００１８５２７、ｒｓ７４９５０７０４３、ｒｓ７８００１９７６９、ｒｓ７６５９８３７８８、ｒｓ７７５２３３８９７、ｒｓ７４９５９８１４０、ｒｓ７６６１１７１４４、ｒｓ７６５９８４３３２、ｒｓ７５７６４１６７５、ｒｓ７７０６３６８８７、ｒｓ７５３４０７０３４、ｒｓ７７０７６７５９０、ｒｓ７５７７６２９７３、ｒｓ７５７６４７８３５、ｒｓ７４５９７４７３５、ｒｓ７６２１７３２１３、ｒｓ７７５２１２９１６、ｒｓ７６２１７３６８３、ｒｓ７６６１４３５４２、ｒｓ７６６１４３７５２、ｒｓ７５７６４９９００、ｒｓ７６６１４５４０６、ｒｓ７５３４２７５５７、ｒｓ７７０７９５００８、ｒｓ７６５９９７８４５、ｒｓ７４５９９３３７４、ｒｓ７６６００１５７３、ｒｓ７４９５２４０２９、ｒｓ７７５２７３３７９、ｒｓ７７９９１１０８１、ｒｓ７４５９９９５２２、ｒｓ７５３４３４２５１、ｒｓ７７９９１１８５８、ｒｓ７４６００６３２５、ｒｓ７６６１６６４５５、ｒｓ７６６１６８０５３、ｒｓ７５７８０３５７７、ｒｓ７４５８７５３５４、ｒｓ７４９６３３０８１、ｒｓ７７０８１４６５４、ｒｓ７５７８０５１４５、ｒｓ７６６０１５３０２、ｒｓ７５３４４５５５７、ｒｓ７４９６３８８１４、ｒｓ７６６０１９７４３、ｒｓ７７５２９８７７１、ｒｓ７６６１８８５７１、ｒｓ７６６０３７５２２、ｒｓ７７９９４５１６０、ｒｓ７７９９４９９５２、ｒｓ７６６０４４３０１、ｒｓ７４５９００９３２、ｒｓ７４９６５５２７９、ｒｓ５７５０９５６６１、ｒｓ７６２０８３３７１、ｒｓ７６２０８５７９２、ｒｓ７４６０４６３８１、ｒｓ５７５１００１２４、ｒｓ７５７８４６９４７、ｒｓ７４６０５４７０３、ｒｓ７４９６７３３４５、ｒｓ７６２０８６３７６、ｒｓ７６６０５７７３１、ｒｓ７７０７０５１２４、ｒｓ７５７８６９０９１、ｒｓ７７５１８１１６４、ｒｓ７５７７０４３６７、ｒｓ７４９６９５３４９、ｒｓ７４６０８１４２５、ｒｓ７６２０９９４４７、ｒｓ７７５１８５５８５、ｒｓ７４９７０２４１９、ｒｓ７７５１８６９８５、ｒｓ７４９５６２５７０、ｒｓ７８０１７２９６４、ｒｓ７４５９２２０４２、ｒｓ７４９７０７３８５、ｒｓ７６６２６３２９３、ｒｓ７４６０９６９７４、ｒｓ７５３３８４２０２、ｒｓ７７０７９１５９０、ｒｓ７４９７１４０１１、ｒｓ７７０９１８２８４、ｒｓ７７５４０１７０５、ｒｓ７４６１０７１７２、ｒｓ７８０００３２５８、ｒｓ７６６２８０８７２、ｒｓ７５３５１９４５３、ｒｓ７８０００８１４２、ｒｓ７４５９５４１６１、ｒｓ７６２３１５４６３、ｒｓ７５７７５２５０２、ｒｓ７７０９３９５００、ｒｓ７４９５９７１５５、ｒｓ７５７９２９９８２、ｒｓ７４６１２８５７６、ｒｓ７６２１５２１０２、ｒｓ７７０９４７３９９、ｒｓ７４５９６４１４９、ｒｓ７４９７４３９５８、ｒｓ７６２３３５４８９、ｒｓ７７０７６６６００、ｒｓ７７５２４５１５０、ｒｓ７６２３３８６７２、ｒｓ７８０２２８８９８、ｒｓ７４９６１４２７１、ｒｓ７５３５５２４８６、ｒｓ７７５４４９７９３、ｒｓ７６６３１９３５９、ｒｓ７６６３２３５６３、ｒｓ７８０２４５３７１、ｒｓ７４６１５４６８２、ｒｓ７６２１８１３３４、ｒｓ７７５４７２２２２、ｒｓ７６６２８０７０１、ｒｓ７７５４７５１８２、ｒｓ７５７９７７５５５、ｒｓ７５７９７８９７５、ｒｓ７７０９３１１５１、ｒｓ７８０２６７２９６、ｒｓ７７０９９７７６４、ｒｓ７５７９１６０３６、ｒｓ７８０２０５９４５、ｒｓ５７５１５７６５７、ｒｓ７５７９９２３９４、ｒｓ７７１００５４１８、ｒｓ７４６１８０１３５、ｒｓ７６２１８３０６７、ｒｓ７６６３６２７８０、ｒｓ７７１００９０３８、ｒｓ７８００６１６３６、ｒｓ７７１００９３０７、ｒｓ７６２３８７１２６、ｒｓ７６６３６７７２７、ｒｓ７６６３６８５８１、ｒｓ７５７７９２１７３、ｒｓ７８００７３３４９、ｒｓ７６６１６８３３１、ｒｓ７８００８２７９６、ｒｓ７７５２９７４９２、ｒｓ７７５３０８１１０、ｒｓ７５７８２６４３８、ｒｓ７８０３１５７０９、ｒｓ７５８０３５４９８、ｒｓ７６２４２２６６９、ｒｓ７７０８３９５７４、ｒｓ７４９６５２４８１、ｒｓ７６２４２５４６９、ｒｓ７４６２１８６６０、ｒｓ７８０３２６７３２、ｒｓ７７５５５２６４４、ｒｓ７４６０３１３６２、ｒｓ７７１０５７６１８、ｒｓ７６２４３７１２４、ｒｓ７７０８５０５６７、ｒｓ７７５５６３２６５、ｒｓ７４９８３５０９０、ｒｓ７５７８３８７９９、ｒｓ７５３４７４３９８、ｒｓ７６２４５０４２２、ｒｓ７６２４５１４０３、ｒｓ７５８０６８９５０、ｒｓ７５３６６２９２８、ｒｓ７７０８７１０８６、ｒｓ７７１０７９５０１、ｒｓ７７０８７５５７４、ｒｓ７５３６７３６０９、ｒｓ７６２４６６６６６、ｒｓ７６６４４９３４７、ｒｓ７６２４７３６６４、ｒｓ７７５３６３２６９、ｒｓ７４６２６９６６４、ｒｓ７４６２７０７８２、ｒｓ７４６０７６８３４、ｒｓ７７１１０１０１７、ｒｓ７４６２７３１３７、ｒｓ７５８１００５０７、ｒｓ７５３６９６１３９、ｒｓ７８０１６４９８６、ｒｓ７８０３８７５４８、ｒｓ７７５６１７３０５、ｒｓ７８０３９０４８７、ｒｓ７５８１０５４４４、ｒｓ７５７８８４３７１、ｒｓ７６２４９３１２３、ｒｓ７６６４７５２８８、ｒｓ７４６０９２２９９、ｒｓ７４６２８１７０６、ｒｓ７７５３８３４８６、ｒｓ７５７８９３１４１、ｒｓ７５８１１５８０２、ｒｓ７４９７１３５４１、ｒｓ７５３７１４２５８、ｒｓ７６６４８８０１０、ｒｓ７５３７１９２２３、ｒｓ７４９７１３６７７、ｒｓ７５３７２０４１４、ｒｓ７６６４９２８６８、ｒｓ７７１１２５８５４、ｒｓ７６２５１１００１、ｒｓ７８０２３１７８４、ｒｓ７５８１２７０７３、ｒｓ７７１１２７７０２、ｒｓ７４９７６６２０９、ｒｓ７４６１６９４６４、ｒｓ５７５２７４７７５、ｒｓ７６２３７６２３０、ｒｓ７７５４９１７２０、ｒｓ７５３７３１７４０、ｒｓ７７５６５７５６４、ｒｓ７７５４２８０７３、ｒｓ７７５６５８９６４、ｒｓ７４９７４２９７０、ｒｓ７６２３３５６０２、ｒｓ７６２５４１５０４、ｒｓ７７１１５０７９７、ｒｓ７４６３２２０１１、ｒｓ７５８１５７００３、ｒｓ７４９７４９３７７、ｒｓ７６２３６２２７０、ｒｓ７７１１５７６１０、ｒｓ７５８１６２２１１、ｒｓ７６２５１７８６８、ｒｓ７６６３５７１２２、ｒｓ７４９７８８８０７、ｒｓ７４９９１１２４８、ｒｓ７７１１２８４４５、ｒｓ５７５２７４４８４、ｒｓ７４６３３３５６５、ｒｓ７５３５９６６８６、ｒｓ７７５７０４４６１、ｒｓ７７１１７３８５６、ｒｓ７４６３４１９１７、ｒｓ７４６１８６６４３、ｒｓ７８０４７５５６０、ｒｓ７４６１９３８０４、ｒｓ７７５５１６６６３、ｒｓ７５３７８０９３８、ｒｓ７７１０２９５１０、ｒｓ７６６５６０９９１、ｒｓ７７１１８９１３８、ｒｓ７５８１９７１４０、ｒｓ７８０３０２５９９、ｒｓ７７５７２８６９３、ｒｓ７４６３６１３２９、ｒｓ７７５５２７２１２、ｒｓ７６２４１５８１２、ｒｓ７５３８０３８３４、ｒｓ７６２６００３８６、ｒｓ７４６３７４３３０、ｒｓ７５３６３１６５１、ｒｓ７８０３２０９４８、ｒｓ７８０５１８２１２、ｒｓ５７５２２１９１０、ｒｓ７４６２３２０１２、ｒｓ７５８２２４７１８、ｒｓ７７５５６８８８３、ｒｓ７６６４２８６０１、ｒｓ７４６３８４５４９、ｒｓ７５８２３０６１８、ｒｓ７６２６１６４２３、ｒｓ７５３８２６０６６、ｒｓ
７６６６０３３９５、ｒｓ７８０５３４２０７、ｒｓ７６２６２１６１０、ｒｓ７７５５８０３４１、ｒｓ７５３８３２７１７、ｒｓ７４９９５８８３１、ｒｓ７６６４４３９０８、ｒｓ７５８０９０５５５、ｒｓ７４９９６０６５７、ｒｓ７６６６２７０３６、ｒｓ７４９９６３６１３、ｒｓ７７５７８８５２６、ｒｓ７４６４０８５６０、ｒｓ７６２６４４１３５、ｒｓ７７５６０９１１７、ｒｓ５７５４００８３８、ｒｓ７６６４６８６５３、ｒｓ７８０５６９３７０、ｒｓ７５８２６９２０６、ｒｓ７５３８７８５７２、ｒｓ７４６４４１９５６、ｒｓ７６６６６７３５８、ｒｓ７８０６０１２７５、ｒｓ７４９９９００２１、ｒｓ７８０６０２８５７、ｒｓ７６６６７０８５３、ｒｓ５７５４３７０８１、ｒｓ７６６６７４５２８、ｒｓ７６６６８２６４６、ｒｓ７８０６１７２８８、ｒｓ７４９８６８８１７、ｒｓ７４６２８１２３９、ｒｓ７７５６２４５０２、ｒｓ７５３９１２１９４、ｒｓ７６６６９６７８０、ｒｓ７５８１１０７０３、ｒｓ７４６４７１９５２、ｒｓ７４９８７５２８０、ｒｓ７６２５０８５１１、ｒｓ７５８１２６１１４、ｒｓ７５８３３３６５３、ｒｓ７５３７３５００５、ｒｓ７７１１４５７４３、ｒｓ７５３７５９５９０、ｒｓ７５３７３０８５９、ｒｓ７８０６４９３３８、ｒｓ７６６７２３９９６、ｒｓ５７５３１１４９１、ｒｓ７４６４９０５９９、ｒｓ７７５６７２４３３、ｒｓ７６２５４６４８８、ｒｓ７５００２６３８２、ｒｓ７６６７３４４２５、ｒｓ７６６５３１７３０、ｒｓ７７１１５８３３９、ｒｓ５７５４７６９１５、ｒｓ７７１３３５５００、ｒｓ７６６７４７９３４、ｒｓ７５３９２３０６１、ｒｓ７６６７５３３１８、ｒｓ７７１３６１６０６、ｒｓ７８０６９２３８８、ｒｓ７７１３３９２８９、ｒｓ７７５９３０３９９、ｒｓ７５００４７９１３、ｒｓ７６２５５４４２１、ｒｓ７８０６４１８８６、ｒｓ７４６５３１６５０、ｒｓ７８０６６３０６５、ｒｓ７８０７０９７５１、ｒｓ７５８３５９０４６、ｒｓ７５８４０１５７７、ｒｓ５７５４９８３４８、ｒｓ５７５５３８４９８、ｒｓ７８０７１７０１３、ｒｓ７７１１６５８６９、ｒｓ７５８１７７９６４、ｒｓ７５８３６２１１８、ｒｓ７６２５６８０１３、ｒｓ７５３９９５２７０、ｒｓ５７５５４６１７２、ｒｓ７５４０００３８４、ｒｓ７７５９６７０１１、ｒｓ７８０４７５８１１、ｒｓ７５００７３６１８、ｒｓ７５８１８４０７６、ｒｓ７６６５６０３７３、ｒｓ７７１４０４１３９、ｒｓ７８０７４００６６、ｒｓ７５８４２４０９２、ｒｓ７７５７２３７９９、ｒｓ７７５９８０４８３、ｒｓ７６６５７４３０１、ｒｓ７４６３６５４７４、ｒｓ７７５９８２０６０、ｒｓ７８０７４３２６１、ｒｓ７７５７４８７７８、ｒｓ７７５９８６５４８、ｒｓ７７５９８６９０５、ｒｓ５７５３６２５５５、ｒｓ５７５３６３８０２、ｒｓ７６２６１０１５９、ｒｓ７７１２１５１８０、ｒｓ７５４０２５０４６、ｒｓ７７１４２３４０３、ｒｓ７７１２１５７８１、ｒｓ７６２８１９９５０、ｒｓ７８０５３５１８４、ｒｓ７７１４３４２７２、ｒｓ７４６４０３２９６、ｒｓ７５３８４１４８３、ｒｓ７４９９６７２０６、ｒｓ７５３８５５８２９、ｒｓ５７５５９８０８１、ｒｓ７６６８３１８５０、ｒｓ７５０００２４７２、ｒｓ７８０７８４０６１、ｒｓ７５０００２８７９、ｒｓ７５８４６６９８５、ｒｓ７７１３０２７６６、ｒｓ７５０１０７４０７、ｒｓ７４６４６９７６６、ｒｓ７５８４７３５０４、ｒｓ７７１３１９７９３、ｒｓ７５００１４５２９、ｒｓ７５８３３３２２２、ｒｓ７７５８７５０９７、ｒｓ７８０７９７５３４、ｒｓ７４６５０７８３６、ｒｓ７７５９２９３８１、ｒｓ７４６６０６５８０、ｒｓ７４６６０８２６２、ｒｓ７６６８５４４５９、ｒｓ７７６０３９６０６、ｒｓ７８０８０４４２１、ｒｓ７６２８５５６９４、ｒｓ７７１４７３５９０、ｒｓ７６６７５１１９９、ｒｓ７５４０８８４１６、ｒｓ５７５５２１９７８、ｒｓ７５８４９９２７２、ｒｓ７５３９７６０５３、ｒｓ７６６７７０３３４、ｒｓ７６６８７２７０９、ｒｓ７５３９９０７１７、ｒｓ７５０１４８４３１、ｒｓ７７１３８５４９０、ｒｓ７５４１１３２４８、ｒｓ７４６６５３３８９、ｒｓ７５８４０２４６９、ｒｓ７５３９９２４７５、ｒｓ５７５５３９３０６、ｒｓ７６２７８３４８１、ｒｓ７６２７９５７０８、ｒｓ７５４０１０１４４、ｒｓ７６２７９８１３４、ｒｓ７７５９７９８３９、ｒｓ７４６５５９８２１、ｒｓ７５４０１６８７５、ｒｓ７６６８０４３６５、ｒｓ７６２８０８７４８、ｒｓ７７１５２４２２８、ｒｓ７５０１７８１１９、ｒｓ７５８４３３９０８、ｒｓ７８０７５１９４３、ｒｓ７５８４３４８６６、ｒｓ７７１４２３８８０、ｒｓ７５８５５４４５１、ｒｓ５７５６９８４３６、ｒｓ７５０１８８４８５、ｒｓ７７６１３４８４３、ｒｓ７６２９２０５４２、ｒｓ７５８４４９１９６、ｒｓ７７１４３４４４９、ｒｓ７４６６９０６３９、ｒｓ７７６０１２３１６、ｒｓ７７１４３５９１９、ｒｓ７７６０１３７８２、ｒｓ７５８４５９２７７、ｒｓ７８０７８４３３３、ｒｓ５７５７１９６６７、ｒｓ７５４１７１７９４、ｒｓ７５０２１３８４７、ｒｓ７６６９５２４５３、ｒｓ７５８５９０６８６、ｒｓ７６６８３７７２０、ｒｓ７８０９２４５４７、ｒｓ７５４１８７４０９、ｒｓ７５８４７０６１８、ｒｓ７６２８４３５８３、ｒｓ７６２９４５４８３、ｒｓ７６６９６６８８９、ｒｓ７５４０６５１３７、ｒｓ７６６８４６９６９、ｒｓ７６６９７５７７３、ｒｓ７７１５８３８５９、ｒｓ７６６８４７０９２、ｒｓ７５８６２１１５９、ｒｓ７５４２１０５４１、ｒｓ５７５７６３００４、ｒｓ７４６７４５６７３、ｒｓ７６２８４７８５０、ｒｓ７７６０４６１８２、ｒｓ５７５７６９２８０、ｒｓ７７１４７６９１４、ｒｓ５７５７７０４０８、ｒｓ７６６８６７８０６、ｒｓ７５０１３０００１、ｒｓ７５８５０３５１９、ｒｓ７８０９７７９５７、ｒｓ７５０２７３２５６、ｒｓ７５４２３４０００、ｒｓ７６２９８７２４８、ｒｓ７４６７６６６０６、ｒｓ７８０８２８７７２、ｒｓ７５４１１３０３４、ｒｓ７５０２７８２９１、ｒｓ７８０９９０９７１、ｒｓ７６７０１９８０３、ｒｓ７６２９９４１１３、ｒｓ７６２９９５３４６、ｒｓ７５８５３２４０１、ｒｓ７７１６０３１３３、ｒｓ７６７０２６３５３、ｒｓ７５０２８６６９７、ｒｓ７５８６６２５５０、ｒｓ７７６２４７７７１、ｒｓ７８０９６６７６５、ｒｓ７５４１２３４２２、ｒｓ７５４２５４８５４、ｒｓ５７５６７４７１３、ｒｓ７５４２６０４５３、ｒｓ７８１０１５５３４、ｒｓ７７６２６５４７０、ｒｓ７７６１０１５７５、ｒｓ７４６７９９２８８、ｒｓ７８１０２７７６７、ｒｓ７７６２７５７４７、ｒｓ７８０８５９１５１、ｒｓ７５０１６６６８２、ｒｓ７７６２７８４０１、ｒｓ７５４２７７２９１、ｒｓ７４６６６１４８７、ｒｓ７６３０２３６３４、ｒｓ７８０８６１５３５、ｒｓ５７５８２８６４７、ｒｓ７５８６９８３６６、ｒｓ７７１５１５３３９、ｒｓ７７１６７１６４７、ｒｓ７４６８１７５３４、ｒｓ７５４１３０７４８、ｒｓ７５８７０６１９２、ｒｓ７７６２９６９７０、ｒｓ７８１０５８６６０、ｒｓ７６２９０５０００、ｒｓ７６７０８７９２１、ｒｓ７８１０７３９５７、ｒｓ７５０１７６７１９、ｒｓ７６６９１３７５８、ｒｓ７６３０５７２８４、ｒｓ７６２９０７７５０、ｒｓ７４６８４０１８１、ｒｓ７５４１３８０９９、ｒｓ７７６１２３０７８、ｒｓ７５０１９６８１１、ｒｓ７８１０９０８８７、ｒｓ７５０１９６９３８、ｒｓ７７６３３２７４４、ｒｓ７８１０９４４０８、ｒｓ７７６３３５６９１、ｒｓ７７６３３９９６９、ｒｓ７５４１５９９３７、ｒｓ７５４１６３４５９、ｒｓ７５０３７４４５８、ｒｓ７７１５５５９３５、ｒｓ７４６７０１８４４、ｒｓ７６３０８４１００、ｒｓ７５４１７０６４４、ｒｓ７８１１１８０７４、ｒｓ７７１７４４９３８、ｒｓ７５０３９２３８９、ｒｓ７６２９４２１３３、ｒｓ７６２９４４７１９、ｒｓ７５８７７１３２８、ｒｓ５７５７３８４７９、ｒｓ７５８６０８４６４、ｒｓ７４６７２７９５８、ｒｓ７８０９４５２５８、ｒｓ７７１５９９０１３、ｒｓ７５０４００６２７、ｒｓ７７６２０９３８１、ｒｓ７７６３８４８１６、ｒｓ７８０９７４８６７、ｒｓ７７１７６６５３３、ｒｓ７７６３８９２９１、ｒｓ７５８６３８９２５、ｒｓ７５０２８８３３４、ｒｓ７５８７９１８８７、ｒｓ７８０９８７７４８、ｒｓ５７５９２９３８３、ｒｓ７７１６２０５０１、ｒｓ７４６８７９５７５、ｒｓ７６７１６１４２０、ｒｓ７５０２８３７３３、ｒｓ７６７０２５０１５、ｒｓ７５４３９２８０３、ｒｓ７７１７７１８８１、ｒｓ７６３１１１０７２、ｒｓ７６７１６８３８４、ｒｓ７５０２８９９０２、ｒｓ７７１７７１２９３、ｒｓ７７６３９５３７７、ｒｓ７７６４０８４３６、ｒｓ７６３００４１８７、ｒｓ７８１１６７８４２、ｒｓ７４６７９５８８５、ｒｓ７６７１７７５９６、ｒｓ７６７１７９５６５、ｒｓ７６３１３０８０３、ｒｓ７６７１８２６２７、ｒｓ７４６８０３５５１、ｒｓ７５４４１４２８８、ｒｓ７８１０３０５１６、ｒｓ７５４２７７３０４、ｒｓ７５８６９３６４９、ｒｓ７５４４２３７２８、ｒｓ７５０４５２２０３、ｒｓ５７５８３３６８２、ｒｓ７６３１４８６７６、ｒｓ７５４２９２０６７、ｒｓ７５０３４０２５２、ｒｓ７７６４４２３４５、ｒｓ７５４４３７１３６、ｒｓ７７６３２１４７１、ｒｓ７８１２０６０１１、ｒｓ７５８８４３２５７、ｒｓ７８１２０７６８０、ｒｓ７７６４４９５８８、ｒｓ７５８８４８１６６、ｒｓ７７６４５４８８１、ｒｓ７７１７０３８４２、ｒｓ７５８８５９８５２、ｒｓ７７１８４４２９１、ｒｓ５７５９９６６２６、ｒｓ７７６３２８４３４、ｒｓ７６３１７２６６５、ｒｓ７８１０８６４５５、ｒｓ７７６３３１０３４、ｒｓ７８１０８９００９、ｒｓ７６７２３４５４１、ｒｓ７７１７１５３２７、ｒｓ７６７２３６６０６、ｒｓ７５８８７７８３２、ｒｓ７６７１１０６８２、ｒｓ５７５８８１８８２、ｒｓ７７１８６７１７８、ｒｓ７５０５０６８３７、ｒｓ７７６３４１５６７、ｒｓ７７６３４３６９１、ｒｓ７５４３５１６０７、ｒｓ７４６９４７８５７、ｒｓ７８１２６６３５１、ｒｓ７５０５１８４１０、ｒｓ７８１２７３１８６、ｒｓ５７６０３９１３９、ｒｓ７５４３６１６７１、ｒｓ７５８８９９４０５、ｒｓ５７５９０３７２３、ｒｓ７６７２６７５３１、ｒｓ７６７２７０８７８、ｒｓ７６７２７４５７１、ｒｓ７８１２８９１２７、ｒｓ５７６０５５０８７、ｒｓ７６３２２１５３４、ｒｓ７７１９０３２５１、ｒｓ７７６５２９３２２、ｒｓ７５０３９５４５１、ｒｓ７７１９０９１１４、ｒｓ７４６９７０７３０、ｒｓ７６７２９３６６４、ｒｓ７５４３６５０８７、ｒｓ７５０５５４３１８、ｒｓ７６７２９６０１８、ｒｓ７５８７７４４６２、ｒｓ７８１１３１０２１、ｒｓ７８１３１５１６１、ｒｓ７５８７７５９１５、ｒｓ７５０４０４５７０、ｒｓ７６３２４１３６８、ｒｓ７７１９２８７０８、ｒｓ７５８９３６６２９、ｒｓ７７６５５２７３９、ｒｓ７８１３２９３４５、ｒｓ７７１９４２０１１、ｒｓ７５４３８０３５８、ｒｓ７５０４２０７２６、ｒｓ７７１９４６３７９、ｒｓ７５４５６３１３０、ｒｓ７７６５７１９０４、ｒｓ５７６１０２０１１、ｒｓ７５８７９８１７１、ｒｓ７８１３５４２２３、ｒｓ７５８７９９５８９、ｒｓ７４６８８３８７７、ｒｓ７４７００９２２７、ｒｓ７６３１１８４１３、ｒｓ７５８８０３２５０、ｒｓ７７６４０５６９０、ｒｓ７５８８０６７５６、ｒｓ７７６５９３９８２、ｒｓ７７１９６０２２３、ｒｓ７８１３５４２７３、ｒｓ５７６１０８７８６、ｒｓ７５８８１１１２８、ｒｓ７６３１３４０３０、ｒｓ７８１３９２０９３、ｒｓ７７２０００１４８、ｒｓ７５４６１０３７６、ｒｓ７５４６１２０２９、ｒｓ７５４４１８１６１、ｒｓ７７６４２９６０６、ｒｓ７６７１９２８９７、ｒｓ７６３３１８５４１、ｒｓ７６３１４８０２９、ｒｓ７５８８３６４３７、ｒｓ７６７３９１５４５、ｒｓ７５４４３２３６１
、ｒｓ５７６１５４９９０、ｒｓ７５８８４２１１３、ｒｓ７４７０４４３８２、ｒｓ７７６４５８９６０、ｒｓ７８１２３１５９１、ｒｓ７５４６３２３３３、ｒｓ７４７０５１６３４、ｒｓ７６３１７４９８５、ｒｓ７７２０３０２７３、ｒｓ７７６６４９５１２、ｒｓ７５０６５５７２８、ｒｓ７８１４２７４９２、ｒｓ７７６６５４８５６、ｒｓ７５０４９２９４５、ｒｓ７４６９３２２９６、ｒｓ７８１４３７７５７、ｒｓ７５９０３１７４２、ｒｓ７６３１８２９１６、ｒｓ７７２０４６８７８、ｒｓ７５０６７４６９３、ｒｓ５７６０１８６６８、ｒｓ７５０６７６１８７、ｒｓ７５９０４２２３１、ｒｓ７５９０４６４６０、ｒｓ７７６６８０３９６、ｒｓ７５０５０５６８０、ｒｓ５７６０２１４７６、ｒｓ７７６６９２７７０、ｒｓ７７２０７２６９６、ｒｓ７６７２４５８５６、ｒｓ５７６０３１２７７、ｒｓ７５９０６０９３４、ｒｓ７７６６９６９９７、ｒｓ７５８８９８７２１、ｒｓ７８１２８０４８２、ｒｓ７５８９１６７３９、ｒｓ７４６９７５９８１、ｒｓ７７２０８２７５７、ｒｓ７５４６８９６２２、ｒｓ７６３３９３３９０、ｒｓ７６７２９８０２５、ｒｓ７７１９２２３２０、ｒｓ７５４５３６０９１、ｒｓ７６３２４０１３２、ｒｓ７８１３３４３１８、ｒｓ７５８９４８３１３、ｒｓ７５４７１１３７０、ｒｓ７５０５９９８８９、ｒｓ７８１３６０９２６、ｒｓ７４７１０８６０６、ｒｓ７７６７４４３３９、ｒｓ７４７１１４４２０、ｒｓ７８１５２２３３３、ｒｓ７６７４９８３２１、ｒｓ７５４７２８５００、ｒｓ７８１５２７３１０、ｒｓ７５４５７６６１３、ｒｓ５７６１１８６６６、ｒｓ７６３２９１３０７、ｒｓ７８１３７９１２３、ｒｓ５７６１３３５２０、ｒｓ７５０７６０３９３、ｒｓ７６３３０３２６９、ｒｓ７６７５２２２５４、ｒｓ７６３４５５８１８、ｒｓ７５９１２９７４５、ｒｓ７８１５５３６２２、ｒｓ７５０７７１８１１、ｒｓ７５９１３６５３４、ｒｓ７７１９９７０６７、ｒｓ７５４６１２６２７、ｒｓ７５０７８２７４９、ｒｓ７５０６３７６０３、ｒｓ７５０６３７９１６、ｒｓ７５９１５０９７１、ｒｓ７７６８０４１１１、ｒｓ７６３４８４３８９、ｒｓ７７２０１２８４１、ｒｓ７５０６４０７１８、ｒｓ７６７５６３３４４、ｒｓ７５９０１２４１３、ｒｓ７４７１６４４７１、ｒｓ７５４６２３４３８、ｒｓ７６３３２８０９９、ｒｓ７６３３３２６４２、ｒｓ７７６６４８９１１、ｒｓ７６７４１１１７６、ｒｓ７５０８１０９６３、ｒｓ７６３５０４８９８、ｒｓ７５０６６２２６７、ｒｓ７４７１７４４５４、ｒｓ５７６１７５４１３、ｒｓ７４７１７８６９７、ｒｓ７５０８２２７４６、ｒｓ７７２０５２６６７、ｒｓ７４７０７２２９９、ｒｓ７５０６９１８１１、ｒｓ７８１６１９３１７、ｒｓ７８１４７０４１３、ｒｓ７６７６０２２８６、ｒｓ７７２０７４４３１、ｒｓ５７６３４３３９２、ｒｓ７４７０８４５１０、ｒｓ７７６６９９２７０、ｒｓ７７６７０５３１８、ｒｓ７６３３９０６５４、ｒｓ７５０８４９３８４、ｒｓ５７６２１０６９０、ｒｓ７６３５４２７４５、ｒｓ５７６２２１０１９、ｒｓ７４７１０２５７８、ｒｓ７５０８５９７９６、ｒｓ７７２２４１３９６、ｒｓ７６７６３５２８４、ｒｓ７５９０８４９３０、ｒｓ７７２１０４７１５、ｒｓ７７２２４９６１４、ｒｓ７７２１０４７１９、ｒｓ７６３４１５１２７、ｒｓ７５９２２７６２１、ｒｓ７７２１２１０４２、ｒｓ７７６８９７１１５、ｒｓ７６３４３６３３９、ｒｓ７７６７６２７２７、ｒｓ７７２２５９９４５、ｒｓ７４７１２９８７０、ｒｓ７５０７５９１７４、ｒｓ５７６２６５６０８、ｒｓ７６７５１９３４４、ｒｓ７４７２３０７１８、ｒｓ７８１５６５７２７、ｒｓ７６３４７０４５６、ｒｓ７７６９２４２９５、ｒｓ７８１７０１９２１、ｒｓ７６７５４７４７６、ｒｓ７７２１７０４３５、ｒｓ７７６８０８８４９、ｒｓ５７６３０３３４８、ｒｓ７７２１８２４４３、ｒｓ７６３６１１２７６、ｒｓ７５０８０３６７４、ｒｓ７４７２５４６１７、ｒｓ７５９１６４９８８、ｒｓ７５０９２５３９４、ｒｓ７７２１８７８７９、ｒｓ７６７７１６０４２、ｒｓ７５９２８６２７７、ｒｓ７７２３１６６２０、ｒｓ７６７７２００３４、ｒｓ７４７２６５７１３、ｒｓ５７６４４１４８６、ｒｓ５７６４４２５９３、ｒｓ５７６３１７１６８、ｒｓ７６７５７９９２９、ｒｓ５７６４４７７８９、ｒｓ７８１７４２５４５、ｒｓ７８１６０２９２９、ｒｓ７７６８３８０４５、ｒｓ７５０９４４５１５、ｒｓ７５４９３９５５７、ｒｓ７５０８２３８５２、ｒｓ７５９１８４４１４、ｒｓ７７２３３７９２５、ｒｓ７８１７５５９３５、ｒｓ７５４９４４６２４、ｒｓ７４７１８２０７６、ｒｓ７７２３４２０３４、ｒｓ７５４９４８７２３、ｒｓ７７６９９４０８７、ｒｓ７７２３４７２７６、ｒｓ７８１７６４５６８、ｒｓ７７６９９６７３２、ｒｓ７５０８３０３１８、ｒｓ７７２２１８３３０、ｒｓ７５４９５９７６２、ｒｓ７６７６０９５５０、ｒｓ７５９１９８３３８、ｒｓ７６３６７４０６７、ｒｓ７４７２９６８７２、ｒｓ７６３６７４６５５、ｒｓ７７６８６１０３２、ｒｓ７７７０１３０８０、ｒｓ７４７１９４９１７、ｒｓ７７２２３２６３９、ｒｓ７６７７６７７１５、ｒｓ７５０８５３１８６、ｒｓ７４７２０４７０４、ｒｓ５７６４９３６３２、ｒｓ７５９３４２２２４、ｒｓ７６３６９２４９２、ｒｓ７４７２０８８９９、ｒｓ７５４９８８３９９、ｒｓ７５９３４８９２０、ｒｓ５７６５０３６５０、ｒｓ７６３５５９９９７、ｒｓ７７２２５０８７９、ｒｓ７７２３９７０１８、ｒｓ５７６３７２７２２、ｒｓ７６３７０９９６１、ｒｓ７７２２５８３７０、ｒｓ７６７６５７０９６、ｒｓ７５１００７０５６、ｒｓ７６７６５７７６２、ｒｓ７４７３２１２１９、ｒｓ７５９２３６４０２、ｒｓ７６３７２１３３５、ｒｓ７５９３７３６６３、ｒｓ７６７８１３９１５、ｒｓ７６７８１５２４１、ｒｓ７６７８０５５３６、ｒｓ７７２４０６６５３、ｒｓ７８１６８１４５６、ｒｓ７７６９１２２３８、ｒｓ７５９３８３９４３、ｒｓ７５１０２６７５７、ｒｓ７６７６７０９８９、ｒｓ７８１６８８３１２、ｒｓ７５１０２８６６１、ｒｓ７５９３８６１２１、ｒｓ７７２４３０９０７、ｒｓ７７２２８２１６８、ｒｓ７６７８３６５１２、ｒｓ７８１７０５８０９、ｒｓ７４７２４５８１７、ｒｓ７５０９１３７５６、ｒｓ５７６５６０３７５、ｒｓ７４７３４８７２９、ｒｓ７６７６９９３８６、ｒｓ７４７２５０２２１、ｒｓ７５４９０１５８７、ｒｓ７５５０５７０１９、ｒｓ７７７１１２６９８、ｒｓ７８１７２０６１５、ｒｓ７５９４２２２５０、ｒｓ７５９４２２５１６、ｒｓ７８１７３０４２１、ｒｓ７７２３２１９１８、ｒｓ７６３７８００３３、ｒｓ７６３６３５８９６、ｒｓ７５１０７６０１３、ｒｓ７４７３６８４９９、ｒｓ７７２３２８４２６、ｒｓ７５４９３２５８６、ｒｓ７５５０８６１４７、ｒｓ７７６９８３３４２、ｒｓ５７６５９６２７１、ｒｓ７５９４５６８３０、ｒｓ７７２３３６８０８、ｒｓ７７７１５９２６６、ｒｓ７７２４９８７９３、ｒｓ７５５１００２２６、ｒｓ５７６６０９４１１、ｒｓ７６７９０６４２７、ｒｓ７５９３０８８０４、ｒｓ７６３８１４６６３、ｒｓ７６３８１７５０９、ｒｓ７５５１１０００１、ｒｓ７５０９６０４７７、ｒｓ７６３８２１１４２、ｒｓ７５９４７２９９４、ｒｓ７５９３１９０８０、ｒｓ７５４９６０５９２、ｒｓ７７７００５７０７、ｒｓ７６３６７４６７５、ｒｓ５７６６２６２７５、ｒｓ７７２５２０９７２、ｒｓ７６７９２５４９７、ｒｓ７５４９６９８６１、ｒｓ７４７２９８９３５、ｒｓ７７７１９０５７９、ｒｓ７５９３３２５１３、ｒｓ７７７１９１６０１、ｒｓ７６３８３５７６４、ｒｓ７７７２０００６６、ｒｓ７７７２０４２７４、ｒｓ７６３８５０４７９、ｒｓ５７６６４６５４９、ｒｓ７６３６８１９７９、ｒｓ７６７９５７８９１、ｒｓ７６７９６０１１５、ｒｓ７７７０３３７５０、ｒｓ７４７３０９５３６、ｒｓ７６７７９３８２７、ｒｓ７７２５６３６９９、ｒｓ７６７７９８６１９、ｒｓ７７２４０１８９０、ｒｓ７７７０５３７９３、ｒｓ７７７２４０１０４、ｒｓ７７２５７１３４４、ｒｓ７４７４２９２１２、ｒｓ５７６６７７８６２、ｒｓ７７２４１４９８８、ｒｓ７５１１６６６４０、ｒｓ７５９３７８０６１、ｒｓ７５９５３３２８４、ｒｓ７５１０２３１５５、ｒｓ７７７２５４１０６、ｒｓ７６７９８７７８７、ｒｓ７７７０７５０２０、ｒｓ７５５０２６６４１、ｒｓ７６７８２６８１１、ｒｓ７５１１６７０６８、ｒｓ７７７２６４９３３、ｒｓ７５５１９１６５８、ｒｓ７７７０８４０１０、ｒｓ７５５１９２２４３、ｒｓ７７２４３６４８１、ｒｓ７７２４３７４３０、ｒｓ７５９４０３３８９、ｒｓ７４７３５０８７５、ｒｓ７５１１９１７６０、ｒｓ７６８０１０５２４、ｒｓ７７７１１０１１１、ｒｓ７６３７６４３３０、ｒｓ７５５０５９０２２、ｒｓ７７７１２１４８５、ｒｓ７７２６１３５９９、ｒｓ７５５０６７１２６、ｒｓ５７６７１９６８５、ｒｓ５７６７２２５０３、ｒｓ７７７２９９５９３、ｒｓ７５９５７８０１９、ｒｓ７７７３０３３１１、ｒｓ７５９５７９８９２、ｒｓ７５５０７５０１６、ｒｓ５７６５８７７６２、ｒｓ７５９４４５３６４、ｒｓ７７２４８４９６０、ｒｓ７９６０８９４７０、ｒｓ７５１２２４９０９、ｒｓ７５９４５８２９６、ｒｓ７７２６３７９３８、ｒｓ７５９５９６１４３、ｒｓ７５１１０１４５５、ｒｓ７５５２４４４２４、ｒｓ７５５２４４５４５、ｒｓ７６３８１９４１５、ｒｓ７５９４７３９８５、ｒｓ７６３９６３９７２、ｒｓ７５１２４３１８０、ｒｓ７７７３３６７９１、ｒｓ７７７３３６８３５、ｒｓ７６３９６９５１４、ｒｓ７５９４７４２５３、ｒｓ７６７９１９２０６、ｒｓ７５５２５４９５５、ｒｓ７７２５１５７４０、ｒｓ７５９６１１３１０、ｒｓ７７２５２４４２７、ｒｓ５７６７６０７５６、ｒｓ５７６６３０９６０、ｒｓ５７６６３２３１６、ｒｓ７５１２５２１９９、ｒｓ７７７３４７８４４、ｒｓ７７７３５３４０２、ｒｓ７４７４８６３２８、ｒｓ７７２５５２３４４、ｒｓ７５５２７９７６７、ｒｓ７６３８６８３２７、ｒｓ７７２５５７９５７、ｒｓ７７２５６２５６６、ｒｓ７６４００７８８４、ｒｓ７５１２８１５１２、ｒｓ７５５２９６８４２、ｒｓ７６３８７８６３９、ｒｓ７９６１９２０２０、ｒｓ７７７２３７４３８、ｒｓ７５１１６２３４５、ｒｓ７５９５２８８０１、ｒｓ７５５１９２２２２、ｒｓ７５９６７２９５４、ｒｓ７５９６８２８２８、ｒｓ７６４０５５８７４、ｒｓ７９６２２７００８、ｒｓ７６４０６１７９９、ｒｓ７５５３３９４９４、ｒｓ７６７９８４４０４、ｒｓ７５１３２４９３２、ｒｓ７７７２５８１７９、ｒｓ７５１３２６５７５、ｒｓ７５５１８５３０９、ｒｓ５７６８４０３５３、ｒｓ７６７９９４３６０、ｒｓ７７２５９０８１１、ｒｓ７５１３３０４４３、ｒｓ７５５３４５８２０、ｒｓ５７６８４５４７０、ｒｓ７７２７５７３２３、ｒｓ７７７４３０５５６、ｒｓ７６８１６８０２２、ｒｓ７５９６９３３３７、ｒｓ７５１３２７６０８、ｒｓ７７７２６９６１２、ｒｓ７５５３６３７８６、ｒｓ７９６２７７０６３、ｒｓ７９６２７８２４５、ｒｓ７６４０９５９００、ｒｓ７７２７７９１２６、ｒｓ７９６２９４８９４、ｒｓ７６３９１１１５６、ｒｓ５７６８７５９１０、ｒｓ７６８００６９２７、ｒｓ７５９７３５６１７、ｒｓ７７７２７５９４８、ｒｓ７６８２０５６１７、ｒｓ７５９７４４８２０、ｒｓ７６８２０７１６３、ｒｓ７６３９１６８０１、ｒｓ７６３９１９９５１、ｒｓ７５１１９６８１２、ｒｓ７５９５６２８４５、ｒｓ７７７２９１１９１、ｒｓ７９６０７６３７２、ｒｓ７６４１３３０３３、ｒｓ７５１２１８３６２、ｒｓ７７７５０７７３０、ｒｓ７５９５８１９５０、ｒｓ７７２８２１６２４、ｒｓ７５１２２０３７１、ｒｓ７５５４１９３４９、ｒｓ５７６９１４５３６、ｒｓ７５１４０４０９１、ｒｓ７５１４０４３７７、ｒｓ７６４１５４５５４、ｒｓ７５５４２６２９４、ｒｓ７５１４１０３３７、ｒｓ７６８２４４
５８３、ｒｓ７５５２３４７６９、ｒｓ７５５４３５１４９、ｒｓ７６８２５３８０９、ｒｓ７７２６４５４８２、ｒｓ７５１２３７５６５、ｒｓ７７２８５０１７９、ｒｓ７４７４７４９９８、ｒｓ７５９７９９１６６、ｒｓ７７７３３７４５８、ｒｓ７４７４７８０５９、ｒｓ７７７５５１９７２、ｒｓ７５５４４８９６７、ｒｓ７９６１２１８１２、ｒｓ７７７５５６６２２、ｒｓ７５１４３８３２２、ｒｓ７７２８６５４４３、ｒｓ７５９８１０６５７、ｒｓ７５９８１１９３２、ｒｓ７７２６６３６４０、ｒｓ７７２８６９１１０、ｒｓ７７７３４５３０１、ｒｓ７９６４０５２１７、ｒｓ５７６９５８６１５、ｒｓ７７２８７８００６、ｒｓ７５１２５２１６７、ｒｓ７７７３５９６８８、ｒｓ７６８０９３２７８、ｒｓ７５１２７１３７２、ｒｓ７７７３６８８０５、ｒｓ７５９６５５９０３、ｒｓ７５９８３１９２６、ｒｓ７４７５０８９３２、ｒｓ５７６９６９６０１、ｒｓ７７２８９１４９６、ｒｓ７７７５９１３４７、ｒｓ７５１４６４２６８、ｒｓ７７７５９９７９０、ｒｓ７５５３１１８００、ｒｓ７７７６０４７８９、ｒｓ７６８３１４０８２、ｒｓ７６８１２８２７７、ｒｓ７７７６０６８２４、ｒｓ７４７６１３０２４、ｒｓ７６４２３３０８３、ｒｓ７６４０３８８６１、ｒｓ７５１４８４１０６、ｒｓ５７６９９６７６６、ｒｓ７５５３４４３７３、ｒｓ７５５３４５２６０、ｒｓ５７６９９９０４０、ｒｓ７７２９１７９９９、ｒｓ７５５５１０１６３、ｒｓ７７２９２６２１４、ｒｓ７５５５１５２７１、ｒｓ７７７６３３５９２、ｒｓ７７７６３４５７２、ｒｓ７９６４７８９０１、ｒｓ７６８１６７７６８、ｒｓ７５１３４０１４２、ｒｓ７６４２６０６７１、ｒｓ７７７６４２０８９、ｒｓ７６８３４７４９６、ｒｓ７５１５１４１２５、ｒｓ７５９８８０５５０、ｒｓ７６４０８１４５３、ｒｓ７７７６６１３１９、ｒｓ７７７６６７０８４、ｒｓ７５１３４４４５４、ｒｓ７７７６７０４８４、ｒｓ５７６９９６９４４、ｒｓ７７７６３８３６８、ｒｓ７５５５５３７１７、ｒｓ５７７０１８７６５、ｒｓ７７７４７４４１２、ｒｓ７９６２９８０３７、ｒｓ７６４２９８５３８、ｒｓ７９６５４４２５３、ｒｓ７７７６９１４６３、ｒｓ７７７４８３３２４、ｒｓ７７７６９８３８１、ｒｓ７７２７９８０４８、ｒｓ７５１５５８５９３、ｒｓ７５５３９２８３２、ｒｓ７６４３１６５８１、ｒｓ７５９９３０９４５、ｒｓ７５９７５１８４３、ｒｓ７５１３８３２５２、ｒｓ７５９９３４７３４、ｒｓ７６４３２７４６５、ｒｓ７５１３８４１５１、ｒｓ７５１５７４３９２、ｒｓ７９６３２９０３０、ｒｓ７７２８１０６６１、ｒｓ７５１３９４３１０、ｒｓ７７７５１６５５２、ｒｓ７９６３６８１９４、ｒｓ７６４１６８７６８、ｒｓ７６４３４９８０５、ｒｓ７５１５９３８２４、ｒｓ７５５６０９４３０、ｒｓ７６４１７０８１２、ｒｓ７９６６２０５０６、ｒｓ７７７５４６６７１、ｒｓ７５９９８９５８９、ｒｓ７５５６４５３５１、ｒｓ７７２８５４９３３、ｒｓ７９６３８３６２０、ｒｓ７７７７８７０１５、ｒｓ７９６６６１１９２、ｒｓ７６４４０１４９２、ｒｓ７６８４９５５３８、ｒｓ７５９８０４０９１、ｒｓ７６８５００１４２、ｒｓ７６４１９１８８３、ｒｓ７６８５０２２９２、ｒｓ７６８５０２７９１、ｒｓ７６８２７８２１８、ｒｓ７９６４１２０９３、ｒｓ７７２８８１４２１、ｒｓ７５５４６９５０１、ｒｓ７７７５７９３０９、ｒｓ７６４２０８４６７、ｒｓ７５５４７４４１６、ｒｓ７６４２１２３５４、ｒｓ７５９８４２２３８、ｒｓ５７６９８７２６７、ｒｓ７７７６１１６８５、ｒｓ７６８５３１７４１、ｒｓ７６８５４１７８７、ｒｓ７９６７４４４３８、ｒｓ７６４２３９３０５、ｒｓ７５５５３０２５５、ｒｓ７６８５５６７２１、ｒｓ７６８３６８０７３、ｒｓ７５９９００８３９、ｒｓ７７３１５５２５９、ｒｓ７９６５２９１６９、ｒｓ７７３１５９９６８、ｒｓ７６００７３０９７、ｒｓ７９６５３３４６０、ｒｓ７７２９７４７９５、ｒｓ７６８５６６９４４、ｒｓ７６４２９８０９８、ｒｓ７５５５７０７１７、ｒｓ７５９９２１７５３、ｒｓ７５１５５８７５１、ｒｓ７７７８９６１９０、ｒｓ７７７９０４９３２、ｒｓ７９６５７６４３８、ｒｓ７７７９０５７４４、ｒｓ７６４３２５０２８、ｒｓ７６０１０６７６０、ｒｓ７６０１１４６７０、ｒｓ７７３００８８０９、ｒｓ７９６８３５５１７、ｒｓ７６４３３０７２５、ｒｓ７５５５９１７６９、ｒｓ７５１５７７５８２、ｒｓ７９６８４５８０６、ｒｓ７６４５４３２１９、ｒｓ７７３２２４１３９、ｒｓ７７７９５０３８３、ｒｓ７７７７３１６９９、ｒｓ７５９９５３８１３、ｒｓ７６４５５０９９７、ｒｓ７６０１４１９６９、ｒｓ７５９９５５８０３、ｒｓ７７７７４０４８０、ｒｓ７７７７７４０５２、ｒｓ７７３０７０４７１、ｒｓ７６８４７６９２９、ｒｓ７６８４９６７６６、ｒｓ７６４４１４０４３、ｒｓ７７７８１５７８７、ｒｓ７９６６９４０８１、ｒｓ７９６６９４１０１、ｒｓ７６００２６５６３、ｒｓ７９６７００１８０、ｒｓ７７３２８１９３９、ｒｓ７５５６８８６０８、ｒｓ７６４４３７５３５、ｒｓ７６８５２１７４２、ｒｓ７７７８３５８１１、ｒｓ７６８５２６５５４、ｒｓ７７３２９０９０１、ｒｓ７６４４４８４８２、ｒｓ７６４４７０７４６、ｒｓ７７３１４９６３４、ｒｓ７７３２９６２１０、ｒｓ７６４４７６０３４、ｒｓ７５５７２８９２３、ｒｓ７６８５６３０６２、ｒｓ７７８０５２４３３、ｒｓ７７３３１９９４５、ｒｓ７７３３２４３１９、ｒｓ７７８０４２６２０、ｒｓ７６８７３３９９４、ｒｓ７７８０４４２０５、ｒｓ７９６９９７００４、ｒｓ７７７８８１７４１、ｒｓ７９６７７０４３６、ｒｓ７７３３６３２７９、ｒｓ７６００７７７２６、ｒｓ７６８５７１０８０、ｒｓ７５５７４３１６１、ｒｓ７５５７４６２６４、ｒｓ７７８１３１３８３、ｒｓ７６８７８５６４４、ｒｓ７９６８００１０４、ｒｓ７５５７６４０８２、ｒｓ７７３３９９４７８、ｒｓ７７８１４８７２７、ｒｓ７７３４０４０８２、ｒｓ７７３４０７４１５、ｒｓ７９６８３１６３１、ｒｓ７７３４０９６６１、ｒｓ７７８１５６８７８、ｒｓ７７８１６９４７０、ｒｓ７７３４３４６３５、ｒｓ７６８６１４３４１、ｒｓ７６０１２４７９６、ｒｓ７６８６２０３３９、ｒｓ７６８６３００６１、ｒｓ７９６８６１８４２、ｒｓ７６８８９６２１６、ｒｓ７６８６３５３７７、ｒｓ７６４５５５７８０、ｒｓ７７７９６３３９８、ｒｓ７６８９２５７４１、ｒｓ７９６８７２４９１、ｒｓ７７３２４３１５０、ｒｓ７７３５４８３５５、ｒｓ７６８９５００８６、ｒｓ７７７９７７２１６、ｒｓ７７３５７９５６６、ｒｓ７７３５８４４０４、ｒｓ７７８３４０３９８、ｒｓ７６８９７９２６３、ｒｓ７７７９８０９７１、ｒｓ７７８３４２０５９、ｒｓ７６０１６５２９５、ｒｓ７９６９０６１１５、ｒｓ７７８３５３３１７、ｒｓ７９６９１１６０８、ｒｓ７７３６０５１５０、ｒｓ７７３６０７６６９、ｒｓ７７３６１２３５８、ｒｓ７７８３７０１７２、ｒｓ７７３２６７２７２、ｒｓ７７８０１０２６３、ｒｓ７９６９３４８３０、ｒｓ７７３６３０００２、ｒｓ７７８３８９２６９、ｒｓ７７３６３８１１８、ｒｓ７７８３９９１３０、ｒｓ７７８０１８３６４、ｒｓ７６０１９３５２４、ｒｓ７６９０５０５２４、ｒｓ７６９０５１７６６、ｒｓ７７３６６０５１５、ｒｓ７７３６６２４５５、ｒｓ７７３２８９４３０、ｒｓ７７８０２０８４７、ｒｓ７９６９５０４２３、ｒｓ７７８０２６５２５、ｒｓ７９６９５２２３６、ｒｓ７６８７０７９２７、ｒｓ７９７０２１８６４、ｒｓ７７３６９４１８１、ｒｓ７９７０２１８８５、ｒｓ７７８０９５１５４、ｒｓ７７８１０１４４４、ｒｓ７７８１１２５６６、ｒｓ７７８１１６３６０、ｒｓ７７８５１１１８０、ｒｓ７７８５２０１８０、ｒｓ７７８１３１２３５、ｒｓ７６９１５３５７２、ｒｓ７６８７８４５７１、ｒｓ７７８１３５９４２、ｒｓ７７８５４４７１６、ｒｓ７７３３９４２３４、ｒｓ７７８５７０８４２、ｒｓ７６９１０３５３６、ｒｓ７７３８０８３４０、ｒｓ７７８５８３９２５、ｒｓ７６８８０５８６３、ｒｓ７７８２０４７３８、ｒｓ７７３８２５９９３、ｒｓ７７８６１９７７６、ｒｓ７７８２０６６４８、ｒｓ７７３４８４１１４、ｒｓ７６９２５３９９６、ｒｓ７７８２３３７３７、ｒｓ７７３４９５５２３、ｒｓ７７８７１９１１４、ｒｓ７６８９０８８７８、ｒｓ７７８７５４３０１、ｒｓ７７８２６４４１９、ｒｓ７７３５２４２４０、ｒｓ７７８７７２０５９、ｒｓ７７８７９８６３１、ｒｓ７６８９２６５０９、ｒｓ７６８９２９１４３、ｒｓ７７８８１０６２３、ｒｓ７７８８１４０７５、ｒｓ７７８８４２２９９、ｒｓ７６８９６５１６５、ｒｓ７７８３４０８６８、ｒｓ７６８９８１９２１、ｒｓ７７８３５１６７２、ｒｓ７７８３６０４５３、ｒｓ７６９０１３６５１、ｒｓ７７３６２３５３７、ｒｓ７６９０２３４８９、ｒｓ７７３６４５９７４、ｒｓ７７８４１６３５７、ｒｓ７７３６６７４１７、ｒｓ７７３６６７７７４、ｒｓ７７３６７６０１８、ｒｓ７６９０７１２９０、ｒｓ７６９０７１３６１、ｒｓ７６９０７６００３、ｒｓ７７８４４９２８５、ｒｓ７７８４９８２５４、ｒｓ７７３８１２６９５、ｒｓ７６９１０８１７１、ｒｓ７６９１２８７６３、ｒｓ７７８５１１０１４、ｒｓ７７３７５７９００、ｒｓ７７８５３２２２６、ｒｓ７６９１５７１４５、ｒｓ７６９１８７０３９、ｒｓ７６９２００２５７、ｒｓ７７８６０１００５、ｒｓ７７８６２０１３５、ｒｓ７６９２４５６３１、ｒｓ７７３８７７０６９、ｒｓ７７８７０４１２２、ｒｓ７７８７２０４８２、ｒｓ７７８７５６７４１、ｒｓ７７８７６００３８、ｒｓ７７８８０６８４１、及びｒｓ７７８８１０４２５である。
８６６２７０、ｒｓ７２８６９６２０、ｒｓ７３８２５８８７、ｒｓ７５５０８２８７、ｒｓ７６５３５９３０、ｒｓ７４５８７２９３、ｒｓ７３８２６３０５、ｒｓ７３８２６３０６、ｒｓ７３８２６３１０、ｒｓ７５０８８９３７、ｒｓ７３８２６３２１、ｒｓ７７１３６８１３、ｒｓ７３８２６３２７、ｒｓ７５５６２９４６、ｒｓ７７５３９００９、ｒｓ７３８２６３３４、ｒｓ７５１６１４２７、ｒｓ７３８２６３５９、ｒｓ７６０９６３１２、ｒｓ７４３４８０９１、ｒｓ７６１０４７１１、ｒｓ７４６７５９３８、ｒｓ７５６１５８１２、ｒｓ７８０９５０８３、ｒｓ７４３６３９８７、ｒｓ７７２１６８０６、ｒｓ７５８６４７２５、ｒｓ７４４１９０４２、ｒｓ７４４２３８４９、ｒｓ７５２２３０９１、ｒｓ７９２１７９８１、ｒｓ７５８８８４７６、ｒｓ７６９８４９９３、ｒｓ７５６６０６３７、ｒｓ７７２６１７４４、ｒｓ７９２２８３１０、ｒｓ７６９８７４１２、ｒｓ７６４２４９５０、ｒｓ７６１８７３２５、ｒｓ７６７２４２７２、ｒｓ７６７２４６０１、ｒｓ７５９２７６７１、ｒｓ７７２９７３４５、ｒｓ７６７２８６１２、ｒｓ７７３０４５３８、ｒｓ７３０６０４４１、ｒｓ７３０６０４５９、ｒｓ７３０６２５７５、ｒｓ７５２８４８７３、ｒｓ７９２６７８９８、ｒｓ７９２６９９４５、ｒｓ７３０６２５７８、ｒｓ７５３１０９６４、ｒｓ７８７６８８５８、ｒｓ７３０６２５９７、ｒｓ７６４６２４５５、ｒｓ７６７８６７７６、ｒｓ７９７７３５２２、ｒｓ１１１６８２６４７、ｒｓ７４４９８９９１、ｒｓ７９７９３３６２、ｒｓ７５０１２４２７、ｒｓ７３０６４５１０、ｒｓ７６２９０６９４、ｒｓ７３０６４５３４、ｒｓ７８８２４５２１、ｒｓ７３０６４５４０、ｒｓ７６８４６４７７、ｒｓ７６８４９０６７、ｒｓ７８８３７６２２、ｒｓ７６８５３３１７、ｒｓ７６８５３７６３、ｒｓ７３０６４５６４、ｒｓ７５９９０４５７、ｒｓ７９８３９２３２、ｒｓ１１１７４９７７６、ｒｓ７５９９１７７７、ｒｓ７５０６２４０５、ｒｓ７７７８７３５８、ｒｓ７８３２６８００、ｒｓ７６５２３２９２、ｒｓ７６３５４９９１、ｒｓ７８８８１９８５、ｒｓ７５４９８３２７、ｒｓ７７８０４５２６、ｒｓ１１３２９５３９８、ｒｓ１１３２９８１８７、ｒｓ１１３２９８８５０、ｒｓ１１１７７１５１０、ｒｓ７５０７０６８２、ｒｓ１１４９４９８３１、ｒｓ７６５３４０５２、ｒｓ７８９１１２２７、ｒｓ７５０７４３４１、ｒｓ７８９１６４４３、ｒｓ７６５４２２０２、ｒｓ７５０８５３９３、ｒｓ７４５９８０４３、ｒｓ７７４９９９６８、ｒｓ７９８６８３４８、ｒｓ７５１０８２４０、ｒｓ７７８３３５４２、ｒｓ７５５５９８４０、ｒｓ７９４１４３４８、ｒｓ１１４９６３２１６、ｒｓ７８３７６０９６、ｒｓ７６６００４５２、ｒｓ７５１６５２２４、ｒｓ７６１０４１８６、ｒｓ７９４３２３２０、ｒｓ７４６８７６８４、ｒｓ１３８７９２４２９、ｒｓ７９９１９３７４、ｒｓ７６６５６２０５、ｒｓ７６６６６１６２、ｒｓ７４７１７８８５、ｒｓ１３８８０８７９１、ｒｓ１３８８０９５２３、ｒｓ１１６５９２９０３、ｒｓ７７６１４７４７、ｒｓ７８１３６６０３、ｒｓ７８４３０２１９、ｒｓ７７２７９１４９、ｒｓ１１３４４２３１７、ｒｓ１３８８３２８６８、ｒｓ７７６３９３３９、ｒｓ７６２０２４７９、ｒｓ７５２７３３４８、ｒｓ１１５０５３６０４、ｒｓ１１５０７０８２０、ｒｓ１１５０７９５８３、ｒｓ７５２７６２７３、ｒｓ１３８８８７０７０、ｒｓ７７６６６７７１、ｒｓ１１３５１０２４４、ｒｓ１３８９０６５１８、ｒｓ１１３５１７９００、ｒｓ７８７６４００４、ｒｓ７９０６５８１７、ｒｓ１１５１４５２９８、ｒｓ１１３５４６８９５、ｒｓ７６７８４９５７、ｒｓ７６２５０２７６、ｒｓ７９７８８２１３、ｒｓ１１５１７４５６７、ｒｓ７８２６８１５６、ｒｓ７５７８８９５１、ｒｓ８００５９４８６、ｒｓ１１１７０６０９２、ｒｓ１３８９８２１６８、ｒｓ７８５３３４８５、ｒｓ１１６７４７４８３、ｒｓ１１６７５７６３５、ｒｓ７７４００９９２、ｒｓ７７４２９６０９、ｒｓ７８５５５４０８、ｒｓ７７４３０４７０、ｒｓ１１６７７５１６５、ｒｓ７８５７２０３７、ｒｓ１１１７４９８８７、ｒｓ７８０３０６６２、ｒｓ１１５２７８９１６、ｒｓ７７４４７１５６、ｒｓ１１２０９６８６７、ｒｓ７７７９２３８２、ｒｓ１１１７６３４６０、ｒｓ１３９０７３５９０、ｒｓ１３９０７７５５２、ｒｓ１１３６４１２５８、ｒｓ１１５３０４８６２、ｒｓ７９６３７５８８、ｒｓ１１３３０７２４５、ｒｓ７８０７２２１６、ｒｓ１１５３２２６７２、ｒｓ１３９１２７３１９、ｒｓ７９６５７０５０、ｒｓ１１６８３９９０２、ｒｓ１１２１６７９２１、ｒｓ７８９１１１７２、ｒｓ１３９１４５７７１、ｒｓ７７４９４１１７、ｒｓ７７４９８６０２、ｒｓ１４０５８４６８０、ｒｓ７７８３２５４８、ｒｓ１４０５８６６４６、ｒｓ１４０５８６８３７、ｒｓ１１２２０８９４６、ｒｓ１４２２８５０２９、ｒｓ１３９１８３３１２、ｒｓ７８９２５９８６、ｒｓ１４２２９１７１０、ｒｓ１１５３９８６０９、ｒｓ７９６９６３３４、ｒｓ７９６９９９４８、ｒｓ１１１７８８６４５、ｒｓ７８３７５０７０、ｒｓ１１６９７８５１０、ｒｓ１３９２０２６８２、ｒｓ１４０６０９９９０、ｒｓ１３９２０９０９５、ｒｓ１１３７０２８５４、ｒｓ１４２２９０９０２、ｒｓ１４０６１２０２９、ｒｓ１１１７９１００３、ｒｓ１４４０１１６７６、ｒｓ１３９２３４０５１、ｒｓ１１３３４９０４８、ｒｓ１１７０５４２１４、ｒｓ１１５４６１４０１、ｒｓ１１５４６３８３０、ｒｓ１１３３５０２９２、ｒｓ１１７１２７９２１、ｒｓ１４４０３７６８７、ｒｓ１３８７８６１２７、ｒｓ１１７１７２０９６、ｒｓ８０２２６１７８、ｒｓ１４５６４１３１７、ｒｓ１１１８１８３６９、ｒｓ７８４０８０１０、ｒｓ１４５６４６７６６、ｒｓ８０２３１４７５、ｒｓ７８９７２２９１、ｒｓ１４５６５３２７０、ｒｓ１４０７０５０１２、ｒｓ１４４０６００４７、ｒｓ７８４２５１８０、ｒｓ７８４２５５５２、ｒｓ７９９５２０９６、ｒｓ１４２３７９５２９、ｒｓ１１５０４１７５２、ｒｓ１１７２９０５６９、ｒｓ１１３８２２１８２、ｒｓ１３８８３９５３９、ｒｓ１１６６２８１４９、ｒｓ１１７３２６０６２、ｒｓ１３９３３２１０１、ｒｓ８０２５５３３０、ｒｓ８０００２３５７、ｒｓ８０００６５１９、ｒｓ１１１９２９４４６、ｒｓ１４０７４７５６１、ｒｓ１１３８４６３２６、ｒｓ１３９３４２３８９、ｒｓ１３８９５３９２１、ｒｓ７８５１７４４１、ｒｓ１１７４１０７９４、ｒｓ１３９３５５４４９、ｒｓ１４５７１２１２４、ｒｓ１４４１０６４６４、ｒｓ１１５５４０６２２、ｒｓ１４０７８００００、ｒｓ７８５２１８２４、ｒｓ１１２４１２２８１、ｒｓ１４５７５６６４８、ｒｓ１４０７９７１８７、ｒｓ１４４１４１５０５、ｒｓ１１３９０５０５２、ｒｓ１１３９０６８７６、ｒｓ１４５７６３７９６、ｒｓ１１１９８７０８９、ｒｓ１４２４５２４０８、ｒｓ１１５５７８０３２、ｒｓ１４２４５６５４４、ｒｓ１１２４３８９０２、ｒｓ１１５１７６８４５、ｒｓ１１６７４０４６３、ｒｓ１１５２１０９８０、ｒｓ１１２４４８５９８、ｒｓ１３９０１５５１５、ｒｓ１１３９３９５１１、ｒｓ１３９０２６５７４、ｒｓ１１５２５３４４０、ｒｓ８０３２５３１７、ｒｓ１１５２７９５９０、ｒｓ１１２０９８６３８、ｒｓ１１３６３６２８８、ｒｓ８０１２８０３６、ｒｓ７９１７１４２３、ｒｓ１４０５６６２５２、ｒｓ１１３９９０９１７、ｒｓ１４５８４７８２０、ｒｓ１４０８７０６７１、ｒｓ１４２５２０９０４、ｒｓ１４２５３１４７８、ｒｓ１４２５３７３９２、ｒｓ１３９１６４３１１、ｒｓ８０３５３４５３、ｒｓ１４０６２０３６６、ｒｓ１４４２５８３２２、ｒｓ１１７９７１９４１、ｒｓ１４４２７０１３６、ｒｓ１１３７２１３５６、ｒｓ１４４２８０５７６、ｒｓ１４５９００４１１、ｒｓ１１２２４１７６３、ｒｓ１４５９０９１７２、ｒｓ１３９２２１２１９、ｒｓ１４２５７７８５８、ｒｓ８０１８９３３７、ｒｓ１３９４９７７８１、ｒｓ１４４３０４１６４、ｒｓ１４０９２４１７９、ｒｓ１１３７４３６２６、ｒｓ１４２６０７９７３、ｒｓ１４２６０９８６８、ｒｓ１４５６２３３６９、ｒｓ１４５６３８８５３、ｒｓ１４５６４４４３９、ｒｓ１４０６９４３０３、ｒｓ１１３７９５９３２、ｒｓ１４４０６０１０５、ｒｓ１４５９６６２４５、ｒｓ１４４３４３６２７、ｒｓ１４４３５０９５０、ｒｓ１３９３０３１１９、ｒｓ１３７８５８８２３、ｒｓ１１３８１５４２２、ｒｓ１４０７１８３０１、ｒｓ１４２６５３８４６、ｒｓ１４０９６７０５３、ｒｓ１１４１２１７８３、ｒｓ１１３８２３５０３、ｒｓ１４６００２７１０、ｒｓ１３９３１８１１８、ｒｓ１４６０１２９９７、ｒｓ１４５６９４２２２、ｒｓ１４４３９７３０５、ｒｓ１４０７４４１９０、ｒｓ１４５６９５７８８、ｒｓ１１２３７４１６４、ｒｓ１４６０３０３３５、ｒｓ１３７９０６７４０、ｒｓ１３７９０７６１９、ｒｓ１３９５９０５６１、ｒｓ１３９３４７６６１、ｒｓ１１５７５８５６３、ｒｓ１３９６０３８６３、ｒｓ１１５７７６８６２、ｒｓ１４２７３１９７３、ｒｓ１１４１９１１１７、ｒｓ１４０７８８０９６、ｒｓ１１３９１３３９５、ｒｓ１３７９３８１９７、ｒｓ１３９６２１７９６、ｒｓ１４０８１６９８９、ｒｓ１１４２０２７２８、ｒｓ１１２４４２６７７、ｒｓ１４１０３０３９８、ｒｓ１４５７９１５４１、ｒｓ１３９６３８４４６、ｒｓ１４０８２５８８９、ｒｓ１４２７７３６９６、ｒｓ１４１０４４１２６、ｒｓ１１５８２３２６８、ｒｓ１１２４５１１５９、ｒｓ１３９６５５０８５、ｒｓ１１５８２４５４０、ｒｓ１３７９７２５９３、ｒｓ１３９４３６４９６、ｒｓ８０３３０１０６、ｒｓ１１５８３７２４９、ｒｓ１１７７８１１９４、ｒｓ１４２８０４９０３、ｒｓ１４４２２０３２２、ｒｓ１１７８０４０１６、ｒｓ１３９４５３９９９、ｒｓ１１７８２６０９０、ｒｓ１３８０１３１９９、ｒｓ１４６１３６０００、ｒｓ８０３５３３５８、ｒｓ１４２５４０５９８、ｒｓ１１８０３１７４０、ｒｓ１１８０４８８９０、ｒｓ１１５８８７８１１、ｒｓ１１４０５８４００、ｒｓ１１１３３５０９０、ｒｓ１１４２６８２８８、ｒｓ１４６１４７５１７、ｒｓ１１２７７６９２２、ｒｓ１４１１２０３０３、ｒｓ１４２８８４４９９、ｒｓ１４５９１６３０３、ｒｓ１１２７９５６１２、ｒｓ１３９７７８４６５、ｒｓ１３８０６３６９９、ｒｓ１１５９３８７１２、ｒｓ１１２８０７１８５、ｒｓ１４６１５１６７０、ｒｓ１１５９４５８６７、ｒｓ１４１１５８８６７、ｒｓ１１２８１４２３９、ｒｓ１１８１４２５４６、ｒｓ１１２５５７７６５、ｒｓ１１２８２１６６４、ｒｓ１４２６１９３２８、ｒｓ１４６２１７３９１、ｒｓ１４４６３２７６９、ｒｓ１１８１７６５５６、ｒｓ１１１３９３１４４、ｒｓ１４１２０２７５３、ｒｓ１１４３４８７７７、ｒｓ１１４０８８４４４、ｒｓ１４２９５４４４０、ｒｓ１４２６２１１０６、ｒｓ１４２６２９０１６、ｒｓ１４２６４４４７２、ｒｓ１１４１０７８４６、ｒｓ１３９８７４１３４、ｒｓ１３７８５９８９８、ｒｓ１１６０１８８０８、ｒｓ１３９８８５９３５、ｒｓ１４６２５４８７４、ｒｓ１４４３７９６９３、ｒｓ１３９９１１３４６、ｒｓ１３９９１４４９８、ｒｓ１１４１３０６３８、ｒｓ１１４１３８８０５、ｒｓ１１２６０４４９６、ｒｓ１４２６９８７６４、ｒｓ１４６０２８８２９、ｒｓ１４１２７８７２９、ｒｓ１４１２８１２５０、ｒｓ１４１２８３９６２、ｒｓ１１５７５７４５７、ｒｓ１３８１６４４８７、ｒｓ１４１２９６６０２、ｒｓ１１１２８０９４７、ｒｓ１１６０７６９５８、ｒｓ１１４１９１９０１、ｒｓ１１６０８３１８２、ｒｓ１１２６６６７８１、ｒｓ１４１３１３６５８、ｒｓ１３９６２８７６４、ｒｓ１４４４８２５７２、ｒｓ１３９９８８５７７、ｒｓ１３９６４３１２５、ｒｓ１１５８２３８５８、ｒｓ１４４５０８１７７、ｒｓ１４１３６８５４８、ｒｓ１１２７１１６３６、ｒｓ１４６３３６
５６７、ｒｓ１４４７６３７９６、ｒｓ１３８２６２９２７、ｒｓ１４６３４７２６７、ｒｓ１１２７１８３７１、ｒｓ１１２９９２５８１、ｒｓ１１６１６０７８４、ｒｓ１４３１０１８８５、ｒｓ１４３１０５４３２、ｒｓ１３８２８６２５４、ｒｓ１３７９９１７６４、ｒｓ１４２８１３３４０、ｒｓ１３９６８７１８９、ｒｓ１４１０７２６６０、ｒｓ１３８２９８９９４、ｒｓ１３８２９９０５４、ｒｓ１１４２６６９７２、ｒｓ１１１５３５７５９、ｒｓ１４４５４６２４６、ｒｓ１１５８８０７５０、ｒｓ１１２７７４６９９、ｒｓ１４６３８６４４１、ｒｓ１３８３２９９０７、ｒｓ１４６３８８２８７、ｒｓ１３８３３２３５９、ｒｓ１１１５５８７６６、ｒｓ１４３１３８３８４、ｒｓ１４４５８３３５６、ｒｓ１４６４１０３２０、ｒｓ１３９７９３１６７、ｒｓ１１１５６０６３６、ｒｓ１４１４９３５２４、ｒｓ１４４８３１５５２、ｒｓ１１５９５４３３５、ｒｓ１１５９６１８９４、ｒｓ１４４６１８０１２、ｒｓ１１４３４６３２３、ｒｓ１４１２０７０４８、ｒｓ１３９８６１０６１、ｒｓ１３９８６８７０４、ｒｓ１１１６０８３５１、ｒｓ１３８４１３４３８、ｒｓ１３９８６９０２８、ｒｓ１３９８７１０１０、ｒｓ１４４８７２０８７、ｒｓ１４４６６３１３５、ｒｓ１４４６８２１６６、ｒｓ１４６２６６３９７、ｒｓ１３８４４１６３４、ｒｓ１３８１４０３８５、ｒｓ１４６５０４４５４、ｒｓ１３８４４６４３２、ｒｓ１１４６７５１９９、ｒｓ１１６２８３３３２、ｒｓ１４１２６５５５６、ｒｓ１４６２６９６９８、ｒｓ１４６５３６９８５、ｒｓ１３８１４７５５９、ｒｓ１４４７０１２８６、ｒｓ１３８４７９２０８、ｒｓ１１４４０６３７９、ｒｓ１４３０２４２１２、ｒｓ１４３２６４６１３、ｒｓ１４４９４４３６９、ｒｓ１４３０３１３０１、ｒｓ１４０２２６２３９、ｒｓ１１４７３０２７３、ｒｓ１４４９５３８６６、ｒｓ１４０２３１８３５、ｒｓ１４３２７７２７６、ｒｓ１４３０３３８０５、ｒｓ１４４９６２９８７、ｒｓ１４４９６５４０７、ｒｓ１１３２２８７２４、ｒｓ１１２９４７７５２、ｒｓ１４３０６１０６７、ｒｓ１３８５２２９５６、ｒｓ１１２９６２２８９、ｒｓ１４３０６７５８７、ｒｓ１３８２４４８３７、ｒｓ１３８５３２６５６、ｒｓ１４３０９２５６８、ｒｓ１１３００４３５３、ｒｓ１４４９９３６４２、ｒｓ１４１６２２５９９、ｒｓ１３８２９０８９３、ｒｓ１４４７８８２６８、ｒｓ１４０２８８１０３、ｒｓ１４５０３２０３７、ｒｓ１４８９１２８０１、ｒｓ１３８５８４６１４、ｒｓ１１６３７１６１２、ｒｓ１１４５２７３１６、ｒｓ１１１５３５６５１、ｒｓ１４０２９２３６１、ｒｓ１１６１８６２７５、ｒｓ１４７３４４３０５、ｒｓ１４００８３４８６、ｒｓ１１６３７８５３６、ｒｓ１４７３４５３６６、ｒｓ１４６６６２１４８、ｒｓ１４６６６５５０２、ｒｓ１１４５４３５２７、ｒｓ１４３１５００６４、ｒｓ１４０１２９２９１、ｒｓ１４０１２３９７７、ｒｓ１４７３６０５１８、ｒｓ１４７３７６２１５、ｒｓ１４８９６３９４２、ｒｓ１４０３０４４３３、ｒｓ１１１５８２４７０、ｒｓ１１４５９６１０６、ｒｓ１４６７０４３４９、ｒｓ１１１５８８３１８、ｒｓ１４６４３８７０５、ｒｓ１４８９７５１２４、ｒｓ１４１５１４８４８、ｒｓ１４０１５８３８７、ｒｓ１４６４７４０６２、ｒｓ１４３４１８２７９、ｒｓ１４３４２３７９６、ｒｓ１３８４１６００３、ｒｓ１４３１８５２７０、ｒｓ１４５１０６４７３、ｒｓ１４１７０３０６４、ｒｓ１４３４３８５５７、ｒｓ１４６４７９１０８、ｒｓ１４７４４５２５９、ｒｓ１１１６２０８８６、ｒｓ１４３２０８５０５、ｒｓ１４０２０３４４５、ｒｓ１４４９１９５３４、ｒｓ１４１５７５７１２、ｒｓ１４３４９１１６０、ｒｓ１３８４７７２０３、ｒｓ１４９０５２２４１、ｒｓ１４１７３８８８２、ｒｓ１４３４９６６６３、ｒｓ１４６５４２５４９、ｒｓ１３８７０２８６４、ｒｓ１３８４８９６３９、ｒｓ１４０２２６１３１、ｒｓ１４７４８２５２０、ｒｓ１１６３１７２７７、ｒｓ１４５１８２２８７、ｒｓ１４３５２３４０３、ｒｓ１４６５８２６９６、ｒｓ１４０４５３３７８、ｒｓ１１６５２９７４３、ｒｓ１４１７６３３７７、ｒｓ１４０２３９１１３、ｒｓ１４１７６７８４９、ｒｓ１４９１０２６３２、ｒｓ１４９１０３８０５、ｒｓ１４６５９３３７１、ｒｓ１４６５９６５９９、ｒｓ１３８７３９４１８、ｒｓ１３８７３９９８４、ｒｓ１４９１２３５１４、ｒｓ１４７２８９７２５、ｒｓ１４５２３８７２９、ｒｓ１４３３０３６８８、ｒｓ１４０４９０２２３、ｒｓ１４５２４３２７０、ｒｓ１４５２４５０８６、ｒｓ１３８５４０３４０、ｒｓ１４０２７３２９７、ｒｓ１３８７５１０９７、ｒｓ１１６３５３９２９、ｒｓ１４７５４９８７３、ｒｓ１４１８０１０２２、ｒｓ１４５０３４５１５、ｒｓ１４１８０８５９１、ｒｓ１３８７６０７８２、ｒｓ１４０２９２３５８、ｒｓ１４１６４８６４１、ｒｓ１１６３７８５２１、ｒｓ１３８７６９９１０、ｒｓ１４７３５４９４１、ｒｓ１４９１６７４３６、ｒｓ１４５０５１４５３、ｒｓ１４３３９９６８１、ｒｓ１４６６８９５７６、ｒｓ１８３５６５６７１、ｒｓ１８３５６１９１２、ｒｓ１５０６８６４８７、ｒｓ１８３５７３４０２、ｒｓ１８３５７７３４５、ｒｓ１８３５８０６０４、ｒｓ１８３５８１１５５、ｒｓ１４８９６５６７５、ｒｓ１８３５６９８３６、ｒｓ１４１８６９７３３、ｒｓ１４５２９８３８６、ｒｓ１４６９０１４９５、ｒｓ１４６６９９７７５、ｒｓ１４０３３０６８５、ｒｓ１４９２２９５３２、ｒｓ１４３６６８８８９、ｒｓ１４３４１１４７０、ｒｓ１４７６２２４３１、ｒｓ１４５３１３５７８、ｒｓ１８３６１５３９６、ｒｓ１４５０９２１７２、ｒｓ１５０７２９９９１、ｒｓ１４８９７９４３８、ｒｓ１４６７１１４７６、ｒｓ１４３６８７２２４、ｒｓ１４１９０６３０９、ｒｓ１１６４３７２８４、ｒｓ１４７６３６９２２、ｒｓ１４７６４０８１１、ｒｓ１４３４２７５７４、ｒｓ１４３４５１１１８、ｒｓ１４３７０８０３３、ｒｓ１４９０２７４１１、ｒｓ１８１８６５２９３、ｒｓ１４３７０９６４３、ｒｓ１４５３４００２７、ｒｓ１４１７２３９３５、ｒｓ１８５５２２６２２、ｒｓ１８５５２２８１０、ｒｓ１８１８６９４６５、ｒｓ１８５５２５１４２、ｒｓ１４１９３０２４３、ｒｓ１８１８７１００３、ｒｓ１８５５２６８２３、ｒｓ１４７６６０３４４、ｒｓ１４６７６９２１０、ｒｓ１４３４７８７４４、ｒｓ１４６７７５０４８、ｒｓ１８５５３９１９５、ｒｓ１４０４１３９７２、ｒｓ１４７４６８２５２、ｒｓ１４７４７７９３８、ｒｓ１４６９５５４３４、ｒｓ１４１９５３２４６、ｒｓ１４０４３４２２７、ｒｓ１４０４３６４９７、ｒｓ１４３７４４７９６、ｒｓ１４５３６４４１２、ｒｓ１３８７１８０９１、ｒｓ１４９３０１３５９、ｒｓ１４６９６５００５、ｒｓ１５０８１７１６２、ｒｓ１４６９８５５７８、ｒｓ１８５５９３６９４、ｒｓ１８５６０２７１８、ｒｓ１４６８１１７７１、ｒｓ１４０４７３６４３、ｒｓ１４６９９９８０７、ｒｓ１３８７３８４７１、ｒｓ１４６８３２７５２、ｒｓ１４７７４８９３６、ｒｓ１４３８１６７９０、ｒｓ１８３７６８９３０、ｒｓ１３８７４６９６５、ｒｓ１８３７８８９４２、ｒｓ１４９３９９８４８、ｒｓ１８３７９１４２７、ｒｓ１５０９２３７５３、ｒｓ１８３７９９７３０、ｒｓ１４３５７５６４３、ｒｓ１８３８０５９３９、ｒｓ１４２０９３９２３、ｒｓ１８３８１８０１８、ｒｓ１４９１３６１０９、ｒｓ１８３８２２５６４、ｒｓ１８３８３１１９５、ｒｓ１８５７１１９７３、ｒｓ１５０６３６８３１、ｒｓ１４１８０６７７４、ｒｓ１４７８０３０２８、ｒｓ１４５４８１７８８、ｒｓ１５０９７２１４７、ｒｓ１４１８１０２６６、ｒｓ１４９１５５３５２、ｒｓ１４７０８００１１、ｒｓ１８５７４５９８５、ｒｓ１４３６０１３１６、ｒｓ１４７０８９４５５、ｒｓ１４１８２８５７７、ｒｓ１４３６１０２９７、ｒｓ１８５７５４７１０、ｒｓ１４２１６３０９２、ｒｓ１８５７５６１０８、ｒｓ１５０６７１２５１、ｒｓ１４１８６１２００、ｒｓ１４２１７３７３５、ｒｓ１５１０２５１７５、ｒｓ１４７８３５０３４、ｒｓ１４２１７７７９１、ｒｓ１４７８３６３８０、ｒｓ１８５７７９７２９、ｒｓ１４７８４４６０７、ｒｓ１８３５８４０４６、ｒｓ１４９４９６１６３、ｒｓ１４１８７８２１２、ｒｓ１８３９２１１７４、ｒｓ１８５７９６３６０、ｒｓ１５０７１１８６７、ｒｓ１４５３１１０９８、ｒｓ１４７６２７０８３、ｒｓ１４９５０４１０３、ｒｓ１８１８５０２３０、ｒｓ１４７１３０８９１、ｒｓ１８２０６５３０４、ｒｓ１４７１５０４３８、ｒｓ１４７１５０８３１、ｒｓ１４１９０２９８６、ｒｓ１４３６８８９２１、ｒｓ１４５３３４３１０、ｒｓ１４９２６３１４９、ｒｓ１５１１０２８８１、ｒｓ１４５３３７１１０、ｒｓ１４５５５５９７４、ｒｓ１４２２３５２５６、ｒｓ１４５３４０６８５、ｒｓ１８５５３４９３９、ｒｓ１５０７７３４３７、ｒｓ１８２０９９７８０、ｒｓ１４３７２７５１５、ｒｓ１５１１２２２５３、ｒｓ１４９５４３３８８、ｒｓ１４５５６８４３５、ｒｓ１８２１１４２０２、ｒｓ１４２２５４８６５、ｒｓ１８２１１６１３３、ｒｓ１４５５８５３９９、ｒｓ１４９２８４３４０、ｒｓ１５０７８１６５５、ｒｓ１４５５８９２４１、ｒｓ１５１１５３６３９、ｒｓ１８１８８３３９０、ｒｓ１８５８９２８０５、ｒｓ１８１８８６５４０、ｒｓ１８１８８７８４８、ｒｓ１４２２７６６８９、ｒｓ１５０７９４６１１、ｒｓ１５１１６４０５７、ｒｓ１４３７８５３６１、ｒｓ１４７７２６２３３、ｒｓ１８２１５０３９９、ｒｓ１５０８６９５３９、ｒｓ１８９０８７２４６、ｒｓ１４７２４５５５８、ｒｓ１４７２４６７２５、ｒｓ１８５９１３９９８、ｒｓ１４７２４８２０２、ｒｓ１８２１５９３１０、ｒｓ１８７２９４９８８、ｒｓ１８５６２２５２２、ｒｓ１４３８３６１３７、ｒｓ１８２１６４１６２、ｒｓ１８９０９５７５４、ｒｓ１８３８０２５５８、ｒｓ１８２１７２５５８、ｒｓ１８２１７２６２３、ｒｓ１８５９２５２０１、ｒｓ１４９４２３４２０、ｒｓ１９０７５１３１４、ｒｓ１４９４３８２３５、ｒｓ１８４０６７６２３、ｒｓ１８２１８２８５８、ｒｓ１８７３２１８８５、ｒｓ１４２１２４２１６、ｒｓ１４２１３０６６２、ｒｓ１４７９６１６９２、ｒｓ１８７３４４１８８、ｒｓ１８７３４５４２９、ｒｓ１８７３４７９４４、ｒｓ１５０９７７１４９、ｒｓ１５１２３６２２５、ｒｓ１４２１５３５８０、ｒｓ１４５４９８５８２、ｒｓ１４９６１８７２５、ｒｓ１４７０９３５４１、ｒｓ１４７９８９５５３、ｒｓ１８５７６３０９４、ｒｓ１４９６２８１６２、ｒｓ１９２５４３７０９、ｒｓ１４３９２００５３、ｒｓ１４９４９１６０８、ｒｓ１９０８１９０６２、ｒｓ１８６００１９６７、ｒｓ１４３９３７１２３、ｒｓ１４７１２７６９５、ｒｓ１４３９４４２５１、ｒｓ１８６０１８４４７、ｒｓ１９０８３８００７、ｒｓ１４２２０３３９８、ｒｓ１４２２０３４３９、ｒｓ１５１３０３３４６、ｒｓ１４８０４４３８２、ｒｓ１８２０７０９４０、ｒｓ１４８０４６２８６、ｒｓ１８６０３７２２１、ｒｓ１９０８５６７６８、ｒｓ１８９１６６５５４、ｒｓ１４９６７３０４９、ｒｓ１４９６８２０８９、ｒｓ１８２０８４８００、ｒｓ１５１１００７３８、ｒｓ１４９６８５９５３、ｒｓ１４３９７５０３０、ｒｓ１８６０８３５３５、ｒｓ１８６０８８９３２、ｒｓ１８６０９７２９１、ｒｓ１４５５６０５９０、ｒｓ１４２２４１２１０、ｒｓ１８９２０８６１４、ｒｓ１４８１１８０１４、ｒｓ１８０６９３５２８、ｒｓ１８９２１１４０９、ｒｓ１４２２４１８４２、ｒｓ１８９２２０３３７、ｒｓ１４２２４３７４７、ｒｓ１４９７３４０１７、ｒｓ１８４０１５３１０、ｒｓ１８２３６９８１１、ｒｓ１４９５５８９６５、ｒｓ１８９２３２４００、ｒｓ１４８１３８９６８、ｒｓ１８０７１５５８３、ｒｓ１８４０２１５９５、ｒｓ１８２１３６８６７、ｒｓ１８４０２４６７７、ｒｓ１４９
５６７３７５、ｒｓ１４７２３５７６２、ｒｓ１８９２４４８９３、ｒｓ１８４２５３０７４、ｒｓ１８０７２２７４６、ｒｓ１８９２４７０１１、ｒｓ１８４２５３９２３、ｒｓ１４７２３８４９４、ｒｓ１４２２８３４１５、ｒｓ１９２６８０７４５、ｒｓ１９２６８４２３４、ｒｓ１８０７４３２３３、ｒｓ１８２４１１８７９、ｒｓ１４７２４８５６６、ｒｓ１４８１８１３４８、ｒｓ１８２４１８２８６、ｒｓ１８２４２１３１９、ｒｓ１５１１８２５４２、ｒｓ１８０７５８５９０、ｒｓ１８７５６６６３７、ｒｓ１８７５６８４２９、ｒｓ１８２４３５２８２、ｒｓ１８９０９７６８６、ｒｓ１８７５７７２３２、ｒｓ１４７９４２４０５、ｒｓ１８２１８０３２５、ｒｓ１８９３２１１３８、ｒｓ１８７５９３４０１、ｒｓ１４７９５２３３１、ｒｓ１８４０７４６８１、ｒｓ１９２７６１４４９、ｒｓ１９０７８１７４９、ｒｓ１８７３５５５０９、ｒｓ１４８２５５０９３、ｒｓ１４８２５６７０７、ｒｓ１４７９７９５４５、ｒｓ１９２５３２３１８、ｒｓ１４９８８３８９９、ｒｓ１９１０７４４８９、ｒｓ１８７３６４１０５、ｒｓ１９０８０９３３５、ｒｓ１９１０８３６５８、ｒｓ１９０８１００５２、ｒｓ１９２８１９００９、ｒｓ１８６３０１５８３、ｒｓ１９２８２７０４５、ｒｓ１９１１１００８４、ｒｓ１４９９３１０８１、ｒｓ１８２５４９５４５、ｒｓ１４８３３０４３３、ｒｓ１８２５５５１５８、ｒｓ１４９６４２９５７、ｒｓ１８２５６２１１４、ｒｓ１９０８３２２８２、ｒｓ１４９９５４５０９、ｒｓ１８６３３４８６１、ｒｓ１５１２９１５２３、ｒｓ１８６３５１７２５、ｒｓ１９２５６９２６１、ｒｓ１８６３５３０７７、ｒｓ１４８３６４８３２、ｒｓ１８６３５５１３６、ｒｓ１４８０４１３７１、ｒｓ１８６０３１４１３、ｒｓ１８６３６０２１９、ｒｓ１８９４６０９８５、ｒｓ１８９４６３１６３、ｒｓ１８４１８３３３８、ｒｓ１５１３３０７８４、ｒｓ１８９１８２３６５、ｒｓ１８６０７９２６７、ｒｓ１８６０９９０２８、ｒｓ１８４２１８９５９、ｒｓ１８９２１６６００、ｒｓ１４８１２９６８８、ｒｓ１８０７０６７８３、ｒｓ１８４２３６７７４、ｒｓ１９２９０１９１４、ｒｓ１８７７６５６２６、ｒｓ１８４４９５３３１、ｒｓ１８９４８７１１７、ｒｓ１５００１８７７０、ｒｓ１８９４９４０７５、ｒｓ１８０７１７１７３、ｒｓ１８９５０４２６９、ｒｓ１９２６７０７１７、ｒｓ１４８４２９４３８、ｒｓ１８７５１１６４０、ｒｓ１８４２４９８９８、ｒｓ１９１２３４４８５、ｒｓ１８２３８７０８０、ｒｓ１８７８０８１３７、ｒｓ１８２６７３３６７、ｒｓ１８４５４５２９７、ｒｓ１４８４５０２７４、ｒｓ１９１２４６４０７、ｒｓ１８６１３８２１６、ｒｓ１９１２５０４３２、ｒｓ１８２３９０５５７、ｒｓ１８７８４１４２０、ｒｓ１８６４７３０８５、ｒｓ１８７８５５５４１、ｒｓ１５０１１１７２２、ｒｓ１５０１１２７３５、ｒｓ１９２７０４６９４、ｒｓ１８０７５５３５６、ｒｓ１８６１９４２６８、ｒｓ１９２７４１７９３、ｒｓ１５０１２７５６７、ｒｓ１８０９９３３５３、ｒｓ１４９８２５６５９、ｒｓ１４８５０４９５５、ｒｓ１８７６０３９６６、ｒｓ１８４３４４１３７、ｒｓ１９１０４１５１５、ｒｓ１８１０１２７６０、ｒｓ１９１０５０４３３、ｒｓ１９１０５６９１１、ｒｓ１４８５２７７４３、ｒｓ１８１０２８９４５、ｒｓ１８２７８２２２３、ｒｓ１９３０６８８９２、ｒｓ１４９８７９１８３、ｒｓ１４９８９２２１８、ｒｓ１８４３９３７９８、ｒｓ１９２８１４８９６、ｒｓ１４８３３９４６２、ｒｓ１８９６５１１５１、ｒｓ１９１１４１５５２、ｒｓ１９１３６７６８６、ｒｓ１９１３６８３１９、ｒｓ１９１３７０５０７、ｒｓ１９３０９２７１０、ｒｓ１９１３７１９０７、ｒｓ１９１３７８９８１、ｒｓ１８７７２２５８６、ｒｓ１８９６７６９４５、ｒｓ１９１３９７１３９、ｒｓ１８９４５３２７１、ｒｓ１９１３９９２４７、ｒｓ１９１１５７４７１、ｒｓ１４８５７７０１１、ｒｓ１８４４６０５７５、ｒｓ１８７９９２９３２、ｒｓ１４８５８６８４９、ｒｓ１８４７０７５１１、ｒｓ１８６３６４６２５、ｒｓ１５０２４７７７５、ｒｓ１８９４６８１４７、ｒｓ１８８００８７７４、ｒｓ１８４７１８２９５、ｒｓ１８４４７２２７０、ｒｓ１５０２６０６９３、ｒｓ１８９７２３２５７、ｒｓ１８８０２２６０４、ｒｓ１５０２７０６５２、ｒｓ１８７７４１９４２、ｒｓ１８８０２６８４５、ｒｓ１８９７３６１６５、ｒｓ１９３１７１１５４、ｒｓ１８４４７４２８９、ｒｓ１９３１７６７０７、ｒｓ１８６６５９２１３、ｒｓ１４８６１９５９８、ｒｓ１８９４７１６９６、ｒｓ１８６６６５４０７、ｒｓ１８９７５８９１７、ｒｓ１８４４８００３１、ｒｓ１８９４７５５３７、ｒｓ１４８３９２７８０、ｒｓ１５０００６６６６、ｒｓ１８７７８０６８６、ｒｓ１８４５２１５２０、ｒｓ１５００４１８１３、ｒｓ１８６６９９１５８、ｒｓ１９３２３０３８７、ｒｓ１９３２３５４２５、ｒｓ１９２９４１２１０、ｒｓ１９２９４６２７６、ｒｓ１８４５５０５９４、ｒｓ１８２６９０１００、ｒｓ１８２７２６７２９、ｒｓ１８２７３１４０７、ｒｓ１８８１０４５０２、ｒｓ１４８６６３０９８、ｒｓ１８８１２２５０３、ｒｓ１８３００１４６３、ｒｓ１９３０１３３２６、ｒｓ１５０１２３１１０、ｒｓ１８１２６３２０１、ｒｓ１４８５０４７４０、ｒｓ１９３０２８７１５、ｒｓ１８１２６５８５６、ｒｓ１８３０１１７３５、ｒｓ１８４８３５７１２、ｒｓ１９３０３５８６４、ｒｓ１８１０１０８３１、ｒｓ１８４８３７６７４、ｒｓ１８１０１４３５８、ｒｓ１８１２７５３００、ｒｓ１８３０２２９９３、ｒｓ１８１２７８０７８、ｒｓ１８１２８０５７４、ｒｓ１８３０３０７４３、ｒｓ１４８６９１４９４、ｒｓ１４８５２５９７４、ｒｓ１５０３８５２７７、ｒｓ１８６７７９９６８、ｒｓ１５０３９２９２３、ｒｓ１９１５９０１１７、ｒｓ１８９８８５１７２、ｒｓ１８１０３５４８３、ｒｓ１８８１７５４３６、ｒｓ１８８１７７０８９、ｒｓ１８２７８７９５７、ｒｓ１５０４０４８０２、ｒｓ１４８５３７６５３、ｒｓ１８２７９０８８５、ｒｓ１９９５０３４３９、ｒｓ１８８１９０８４２、ｒｓ１８２７９６８９３、ｒｓ１８９９０２２９２、ｒｓ１８１０４８５６１、ｒｓ１９９５１８０７８、ｒｓ１９１３８９１０７、ｒｓ１８４６８７６０８、ｒｓ１８４６９２７３０、ｒｓ１９１６３０３９２、ｒｓ１８９９２９３８８、ｒｓ１５０４２７７８８、ｒｓ１９３１３６８５７、ｒｓ１８７９９８８５０、ｒｓ１９９５３５８６３、ｒｓ１９９５３７６８５、ｒｓ１８８００２６７８、ｒｓ１８４７２０２８１、ｒｓ１９９５４２６８５、ｒｓ１５０４４２００７、ｒｓ１９１６５１３０８、ｒｓ１８４９３７３８３、ｒｓ１４８７４８２４８、ｒｓ１９１６６１５０４、ｒｓ１８４７３３４１０、ｒｓ１８４９４６８９６、ｒｓ１８４９５５１４３、ｒｓ１８４９６１４２３、ｒｓ１８９９８１８１１、ｒｓ１９１６２４００１、ｒｓ１８８２８１４５７、ｒｓ１９１６２５６３２、ｒｓ１４８７３４３２７、ｒｓ１９１６３９３１６、ｒｓ１８４９２５２４９、ｒｓ１８９７４１２８３、ｒｓ１８９７５３２６６、ｒｓ１４８７８５００１、ｒｓ１９０００３２９４、ｒｓ１４８６２６８４５、ｒｓ１５０３０１００２、ｒｓ１８６６７４１６３、ｒｓ１９９６１８６３３、ｒｓ１８１１９１５７７、ｒｓ１８３２０４４５３、ｒｓ１９００３２５６５、ｒｓ１８１４７０２２９、ｒｓ１４８６３９６３４、ｒｓ１８８０６８４９０、ｒｓ１８１４７８３８４、ｒｓ１８６６９４２０７、ｒｓ１５０３３３３３７、ｒｓ１９３２４４４３３、ｒｓ１５０５２２４１９、ｒｓ１８１４９０７６１、ｒｓ１８８１０２８４８、ｒｓ１４８６５７８５６、ｒｓ１５０５３２１３２、ｒｓ１５０３４２２０９、ｒｓ１８８３５８９６１、ｒｓ１８２９８１０６４、ｒｓ１８８３６７９３６、ｒｓ１８６９４０６６６、ｒｓ１８１５１４５８７、ｒｓ１８１５２４６６５、ｒｓ１８６７４０５８９、ｒｓ１８３００６０８０、ｒｓ１８５０８９４４０、ｒｓ１８８１３４２５０、ｒｓ１８４８３１２２０、ｒｓ１８８４００１０９、ｒｓ１８３２８３７４４、ｒｓ１８６７５３０７９、ｒｓ１９９７００３１８、ｒｓ１９９７０３２０３、ｒｓ１８３０１５２２８、ｒｓ１８３２９０４２７、ｒｓ１８３２９０８１７、ｒｓ１４８９０５１１０、ｒｓ１８８４１３４１０、ｒｓ１８３０１９８９１、ｒｓ１８８４１８４５６、ｒｓ１９９７１５８５５、ｒｓ１９０１２６４０８、ｒｓ１８６９８１３３２、ｒｓ１５０５８４１７０、ｒｓ１５０３８３７００、ｒｓ１８６９８８３１９、ｒｓ１９９７３４７１０、ｒｓ１８１３０７１１８、ｒｓ１９１６００９２０、ｒｓ１９１６１０６４２、ｒｓ１４８７１５８５２、ｒｓ１９１８６９２６３、ｒｓ１８９９０１９３１、ｒｓ１９９５１７４４８、ｒｓ１８９９１６８０７、ｒｓ１８９９８５９２０、ｒｓ１５０４７６７１３、ｒｓ１９０１７８５４２、ｒｓ１９９５４１４８２、ｒｓ１９９５５６２８９、ｒｓ１８５１８４７８２、ｒｓ１９１８９４４５７、ｒｓ１５０４８０７７３、ｒｓ２０２０４０６５９、ｒｓ１４８７７８６１２、ｒｓ１９１９２５７５２、ｒｓ１４８７８０２２０、ｒｓ１８６８８５７１６、ｒｓ１９０１７６４７２、ｒｓ１９９５９３８９８、ｒｓ１８１６６５８８３、ｒｓ１８３４０６４６４、ｒｓ２０２０６３６３２、ｒｓ１８３４１２３８０、ｒｓ１９０２４０９７１、ｒｓ１９００１４３９５、ｒｓ１５０５０１０６５、ｒｓ１８３４１７２２５、ｒｓ１８１４６０６１１、ｒｓ１９１９５８８５４、ｒｓ１８１４６２４６１、ｒｓ１９０２７２５３３、ｒｓ１８５２８１３１９、ｒｓ２０２０９４２０６、ｒｓ１９９８６５４４６、ｒｓ１８５２８７０２４、ｒｓ１８８５８２０９１、ｒｓ１８５２９９０５０、ｒｓ１８５０２４４３８、ｒｓ１８１４７５６３８、ｒｓ１８８３３８９６４、ｒｓ１８１４８３９２３、ｒｓ１９９６４１７３６、ｒｓ１９９６４５９０４、ｒｓ１８６９２９３１４、ｒｓ１９０３０８４９２、ｒｓ２０２１１７０１２、ｒｓ１９９８９２１９０、ｒｓ１４８８５１８９０、ｒｓ１８８３６５９０２、ｒｓ１４８８７５３６５、ｒｓ１８５０８６９３８、ｒｓ１８７１３７４７５、ｒｓ１８６９６６０７６、ｒｓ１８８３９９８１６、ｒｓ１８８６３０６３０、ｒｓ１８７１４７７５５、ｒｓ２０２１３１９７６、ｒｓ１８７１５４２７８、ｒｓ２０２１３４３３０、ｒｓ１５０５６５３１０、ｒｓ１８７１６４６５４、ｒｓ２０２１４３５１６、ｒｓ１９９７０４４４３、ｒｓ１８８６５６０４１、ｒｓ１８３２９５０５２、ｒｓ１８３５３９８５８、ｒｓ３６９３９０６６８、ｒｓ１８７１９３７５９、ｒｓ３６９３９９４２４、ｒｓ１９９７２７９９９、ｒｓ１８６９９３３０３、ｒｓ２０２１７４４７２、ｒｓ１９９９７３７７７、ｒｓ１９０１４７３４７、ｒｓ１９２０９５９６５、ｒｓ１８８４４４６４２、ｒｓ１９０１５８１４３、ｒｓ１９０１６２１６８、ｒｓ３７１４４６７３３、ｒｓ１９９７５８８４５、ｒｓ３７１４５２２０５、ｒｓ２０２１８９２５８、ｒｓ２００５８４４１６、ｒｓ１９１８７８９３６、ｒｓ３７１４６３２７７、ｒｓ３７３４９２７０３、ｒｓ１８３３４４８９８、ｒｓ２０２１９７７７６、ｒｓ２０２０２９２０１、ｒｓ２０２１９９９６６、ｒｓ３７３５０４８６３、ｒｓ３７５５７２９１７、ｒｓ１９２１４６７８２、ｒｓ１９９７８７７７５、ｒｓ３６９４７１２１２、ｒｓ２００６０１５９１、ｒｓ２０２０２５１９７、ｒｓ１９２１６２５７７、ｒｓ３７５５８８１５４、ｒｓ２０００４６４４８、ｒｓ１９１９２０９６６、ｒｓ３７５５９８８２０、ｒｓ１８１６６０５０７、ｒｓ３６９４９７１３１、ｒｓ１８１６６３２４５、ｒｓ２０００６３３８３、ｒｓ３７１５３１１２７、ｒｓ１９９８１２５９８、ｒｓ２００５９７４０１、ｒｓ１８１６６５４９５、ｒｓ１８８８２６３１１、ｒｓ１９２２１９９３６、ｒｓ１８８８３２６２７、ｒｓ２００１０８７８５、ｒｓ２００６４５４５２、ｒｓ１８８５４１５８９、ｒｓ
１８１６８２８６５、ｒｓ３７５６５５７１１、ｒｓ１８１６８８７１１、ｒｓ３６９５６２７２５、ｒｓ１９０２６５４３７、ｒｓ１９０２９３５０１、ｒｓ１９０２９８２８８、ｒｓ１８７１１１８９４、ｒｓ１８５３０９００２、ｒｓ１９０３０１９２２、ｒｓ１９９８８２６０３、ｒｓ２６７５９９８０３、ｒｓ２６７５９９８０４、ｒｓ１８７１１８００４、ｒｓ２６７５９９８０６、ｒｓ１９０３１５８１６、ｒｓ１９０３１７２９１、ｒｓ３６９５７０７１６、ｒｓ２００１３８８４０、ｒｓ１８８８５６２３３、ｒｓ１９０４９８９８１、ｒｓ１８８８６０５６７、ｒｓ１８８６１６３１９、ｒｓ２００５３９６８３、ｒｓ１８７１４０１０６、ｒｓ１８８６２２６４９、ｒｓ１９９９２７２９７、ｒｓ３６７５５５２２２、ｒｓ３７１６０６５８１、ｒｓ１９９９３１９２０、ｒｓ３６７５６６０２５、ｒｓ２００１６３３７８、ｒｓ１８８６６０３３１、ｒｓ３６９３９９６４１、ｒｓ３６７５７１６５１、ｒｓ３６７５７１８０７、ｒｓ３７１６１３６３６、ｒｓ３６９６０８０８６、ｒｓ３７１４２３８７２、ｒｓ１８８８８４８７０、ｒｓ２０２１７６２７９、ｒｓ２００５７７７５１、ｒｓ３７５７１１５７１、ｒｓ３６９４１７５６８、ｒｓ３６９４２３６０９、ｒｓ２００５８３４０５、ｒｓ２０２１９２８１８、ｒｓ２００７３７１４４、ｒｓ１８８９１２７２３、ｒｓ３６９４４９９２０、ｒｓ３６９６４２６９６、ｒｓ１８８９１４０４８、ｒｓ１９２１３４０６５、ｒｓ２００６１０２２８、ｒｓ１９２１６６２６３、ｒｓ３６９６５８５４９、ｒｓ２００７６１２１２、ｒｓ３６９６５６３５８、ｒｓ３７５７６５８８６、ｒｓ３６７６６１４１３、ｒｓ３７５７６６７２７、ｒｓ３６９４９５１５２、ｒｓ１９０５３５９６２、ｒｓ３７１５２７９０３、ｒｓ２００２４９０１６、ｒｓ１９０５４０９４１、ｒｓ３７５７９９３３２、ｒｓ１９０５４６５２８、ｒｓ２００７９８６１７、ｒｓ３６９５０９２９２、ｒｓ３７３７０９２７５、ｒｓ１８８８０６０６０、ｒｓ１９０５３１２７６、ｒｓ２０００８７０６６、ｒｓ１８８８３６６０６、ｒｓ２００１１１９２８、ｒｓ３７３５８９４９１、ｒｓ２６７５９９７９６、ｒｓ１９２３８５８２７、ｒｓ３６７７５１２６０、ｒｓ３７３７４５８８９、ｒｓ２６７５９９７９７、ｒｓ２６７５９９７９８、ｒｓ２６７５９９７９９、ｒｓ２６７５９９８００、ｒｓ２００３０４１１７、ｒｓ２６７５９９８０１、ｒｓ３６７７６９２０１、ｒｓ２６７５９９８０２、ｒｓ３７５８８６０８２、ｒｓ２００３２４５３９、ｒｓ３７３７８１３９６、ｒｓ２００３３２１７８、ｒｓ２６７５９９８０５、ｒｓ２００８７０３８９、ｒｓ３７５９０４８５９、ｒｓ２６７５９９８０７、ｒｓ２６７５９９８０８、ｒｓ１９２４１４９９６、ｒｓ３７５９１３６５９、ｒｓ３７３８０１６４５、ｒｓ３７５９２４３８７、ｒｓ３７３８０９６１２、ｒｓ１９２２６５１４２、ｒｓ３６７５４８４８０、ｒｓ３７５９３５７０９、ｒｓ３７１６００９９６、ｒｓ２００９０１４５９、ｒｓ３７１６０２５７０、ｒｓ３６９７７４７３２、ｒｓ３７５９４０６８０、ｒｓ１９２２６８８９４、ｒｓ３７３８２８２９０、ｒｓ３７１８０８９１０、ｒｓ３７１６０９０９１、ｒｓ３７３８５１２８２、ｒｓ３６９６０２２３７、ｒｓ３７１８３４３４０、ｒｓ３７１８３４３９６、ｒｓ２００６９９６４９、ｒｓ２００１７４６４４、ｒｓ２００７１３７２４、ｒｓ２００７１４５１９、ｒｓ１９２４６７２３２、ｒｓ１８９０７９８２７、ｒｓ３７３６４２７３０、ｒｓ３７３９１０１２２、ｒｓ３６９８２７７８５、ｒｓ３６９６２９２５３、ｒｓ３６７６１２７９２、ｒｓ３７１９０４８５２、ｒｓ２００４４３０６８、ｒｓ３６７６１８９１４、ｒｓ１９２４８７３０２、ｒｓ３６７９５５１７３、ｒｓ２００４４８１１０、ｒｓ３７５７３５１０１、ｒｓ３６７９６０２８５、ｒｓ１９２４９３０５２、ｒｓ１８８９１８９３８、ｒｓ１８８９２３５０１、ｒｓ２００２３７５２４、ｒｓ３７１９２４４６５、ｒｓ２００９９３９４９、ｒｓ１９２４９５９８０、ｒｓ３７７６０６７７７、ｒｓ３７６０６７３４２、ｒｓ３６９６６８５８０、ｒｓ３７６０７７４３６、ｒｓ３７６０７７９８４、ｒｓ３７１９４５４３２、ｒｓ２００２６７３３３、ｒｓ３７７６１８８６５、ｒｓ３７３７１４４０９、ｒｓ１９０５５５１０９、ｒｓ２０１０２４７７９、ｒｓ２０１０２５２５３、ｒｓ３６８００４８３５、ｒｓ３６７７２５０４３、ｒｓ５２８３３５１６１、ｒｓ２００８１５６４９、ｒｓ２００８２３２４７、ｒｓ３６７７４３５１９、ｒｓ１９０５６４１６７、ｒｓ３７１９９５１７１、ｒｓ３７４０２９３２４、ｒｓ３７５８５８０８１、ｒｓ２０１０５３５１２、ｒｓ２０１０５４８２４、ｒｓ５２８３７０５３５、ｒｓ３７２００９７５８、ｒｓ３７３７５０９８５、ｒｓ３６９９２３２９１、ｒｓ３６７７６０５６８、ｒｓ１９０５６８６５２、ｒｓ３７６１４８４３２、ｒｓ５３２０９２８８４、ｒｓ５３２０９５６７９、ｒｓ３７５８７４４７５、ｒｓ３７２０２５３２３、ｒｓ１９２３９６５９６、ｒｓ３７３７８４８８９、ｒｓ２０１０６８９５９、ｒｓ３７３７９５３６８、ｒｓ３７４０６０３６６、ｒｓ２００８７９５９７、ｒｓ２００８８９９５２、ｒｓ３６９９４５０３６、ｒｓ３７４０６６１０６、ｒｓ５３０３１１９１１、ｒｓ３７５９２６５７７、ｒｓ２００３６１６３２、ｒｓ３７５９４０２０１、ｒｓ３７７７１６８４７、ｒｓ３７１８０３８１６、ｒｓ２０１０９１４３２、ｒｓ２００９１８２９６、ｒｓ１８９０５７３５１、ｒｓ３７６１９３４３９、ｒｓ３７４０９３５４０、ｒｓ３６９９７８６９５、ｒｓ３７３８７６７１４、ｒｓ３６９９８４２２７、ｒｓ３７１８６３４０９、ｒｓ３７３８９３５４９、ｒｓ３７７７５７２０５、ｒｓ３７３８９５５０７、ｒｓ１９２４７５０６４、ｒｓ３６７９４３４６４、ｒｓ３７６２２６６７７、ｒｓ１９２４８２３７３、ｒｓ３７１９０９８１７、ｒｓ３８６３９６３９３、ｒｓ５３２１７７４３３、ｒｓ１９２４８８６０９、ｒｓ３７６２５１２９１、ｒｓ３７３９４７１１１、ｒｓ３６８１５９９５５、ｒｓ３７６０５７０５０、ｒｓ３７６０５７４７３、ｒｓ１９２５０４７６６、ｒｓ５３２１９６３１３、ｒｓ５３０３９８２０９、ｒｓ３７６２６６８２６、ｒｓ５３２１９９８６９、ｒｓ３７６０８０２３６、ｒｓ３７６０９０７２２、ｒｓ３７６０９９０７０、ｒｓ３７２１３７１３２、ｒｓ２０１０２６３１７、ｒｓ３７２１３８０９７、ｒｓ３７７６４９１１３、ｒｓ３７２１４２８９２、ｒｓ３７２１４６９６９、ｒｓ２０１０４１６３５、ｒｓ５２８５０６０５８、ｒｓ３６８１８６９６４、ｒｓ３７１９８７０２８、ｒｓ５３０４２３８３６、ｒｓ３６８１９１７３３、ｒｓ３６９９０６０３１、ｒｓ３７００８４１４６、ｒｓ３７４０３３７６６、ｒｓ５２８３７１５４４、ｒｓ３７６１４６２８９、ｒｓ３８６６６０２８６、ｒｓ３６８２０７０３６、ｒｓ５３２０９０８３５、ｒｓ３７６１５３８１３、ｒｓ３６９９３５９２４、ｒｓ５３０３０１５７９、ｒｓ５２８５４００７５、ｒｓ３７２１９１３４２、ｒｓ３６８０６５４３９、ｒｓ３７６１６３２６８、ｒｓ５２８３９３００７、ｒｓ３７７７０８８５３、ｒｓ５２８５４９９３４、ｒｓ３７７７０８９５５、ｒｓ３７０１３１３２０、ｒｓ３７６３４３６９５、ｒｓ３７４２４２８０３、ｒｓ３７６３４６９７０、ｒｓ３７７７１４３６７、ｒｓ５３２２７４２５７、ｒｓ３６９９５９７２１、ｒｓ３６９９７０１８１、ｒｓ３７６３５５４０８、ｒｓ３７７７３１３４８、ｒｓ５３０５０１５９３、ｒｓ５３０５０３２９９、ｒｓ３６８２７１８６１、ｒｓ５２８４２６０８５、ｒｓ２０１１０６８７９、ｒｓ５３２１４９３２２、ｒｓ３７２２５６７７１、ｒｓ３７６２２０５６１、ｒｓ３７２０９００４７、ｒｓ３７２２６８３３９、ｒｓ３７０２００８４７、ｒｓ３７０２０２９５５、ｒｓ３６８３１２６７８、ｒｓ３７０２０８２２３、ｒｓ３７７７６６９０５、ｒｓ３７０００９９２０、ｒｓ５３２３３９３９５、ｒｓ３６８３２６１７６、ｒｓ５２８６３７７９４、ｒｓ３７６４３２７６０、ｒｓ２０１１２６９１１、ｒｓ３６８３３５１７０、ｒｓ３７６４３７９９９、ｒｓ５３２３５３１６７、ｒｓ３６８１４８２３９、ｒｓ３６８３３８２６５、ｒｓ３６８１５４１９１、ｒｓ３７６４３９８６３、ｒｓ３７４３４１４７４、ｒｓ５３０３９２６１２、ｒｓ３７２３１６３９６、ｒｓ２０１１４８３１５、ｒｓ２０１１４９５３０、ｒｓ３７２１３１８０１、ｒｓ３７４３６３０８２、ｒｓ５３０５８５９０４、ｒｓ５３２３８９１６１、ｒｓ３７６４８０６４９、ｒｓ５３０４０１９５４、ｒｓ３７０２７９５２１、ｒｓ３７２１３４８３０、ｒｓ３６８３９４５４４、ｒｓ５３０４０４４９８、ｒｓ２０１１５８７５３、ｒｓ３７６５０５１２２、ｒｓ２０１３３０３７０、ｒｓ３６８４０８１６２、ｒｓ３７０３１１３１０、ｒｓ２０１３４２０３６、ｒｓ２０１３４２３３２、ｒｓ５３２４２６０３４、ｒｓ５３２４３１７１６、ｒｓ３６８１８３７７４、ｒｓ３７０３２１５４７、ｒｓ５３０４２２７２４、ｒｓ３７０３２４０９９、ｒｓ３７６５２８８３１、ｒｓ３７０３３２１３０、ｒｓ５３２４４２５２２、ｒｓ２０１１７０８２１、ｒｓ５３０６６３４５５、ｒｓ５２８７３８４０３、ｒｓ２０１１７４５５８、ｒｓ３７４４４７２６１、ｒｓ３７６５４７２６２、ｒｓ５３２２２９１４１、ｒｓ５２８７４５３６０、ｒｓ３７６３０６１６１、ｒｓ５２８７４９７４１、ｒｓ３７４４５８６８４、ｒｓ３７０３６２４４１、ｒｓ３６８２１２７６６、ｒｓ３７００９６９２３、ｒｓ２０１３９７４６９、ｒｓ３７６５９０４１３、ｒｓ５３０４５０１７４、ｒｓ５３２４９２９３７、ｒｓ５３２４９７８８３、ｒｓ２０１４１２３９４、ｒｓ５３２２４６９９９、ｒｓ５２８７９３８３３、ｒｓ５３０７１８２３３、ｒｓ２０１４１７９３３、ｒｓ２０１１９１５１０、ｒｓ３７６６１５３３０、ｒｓ２０１４２７３６６、ｒｓ３６８５３００２４、ｒｓ３７２４９７５６０、ｒｓ５３０７３５８２８、ｒｓ３７２１９９２８１、ｒｓ３６８２３２９４９、ｒｓ３７２２０３１３８、ｒｓ５２８８２０７７４、ｒｓ５３０４６７２９４、ｒｓ２０１４４３０６３、ｒｓ５２８５６３２８５、ｒｓ３６８５４８６４３、ｒｓ３７６６４０１５７、ｒｓ５２８８３４５９９、ｒｓ３７２５２７０２６、ｒｓ５３０７６０７５０、ｒｓ３６８２５００７１、ｒｓ３７４５６６３６２、ｒｓ３７０４６５５８５、ｒｓ３７０４６７１４０、ｒｓ３７２５３９２６３、ｒｓ３７２５４０９５０、ｒｓ３６８５８２７２５、ｒｓ２０１４７４８５４、ｒｓ３７４２５２８５１、ｒｓ５３０４９３６８５、ｒｓ２０１２３４１０１、ｒｓ３７６６８０１４１、ｒｓ３７６６８６０１１、ｒｓ５２８５８８７６８、ｒｓ３７６６８８０３５、ｒｓ３７２２５０２５１、ｒｓ３７０５０５２３７、ｒｓ５３０７９８８７９、ｒｓ３６８６１３９２３、ｒｓ５３２３１０１８３、ｒｓ３６８２８７６９７、ｒｓ３７４３１９１４３、ｒｓ３７４３１９７２６、ｒｓ３７２５９３４１２、ｒｓ２０１５１１２７１、ｒｓ３６８３３４６３８、ｒｓ２０１２７９９９７、ｒｓ２０１２８０４２６、ｒｓ５３０５６９１４６、ｒｓ３７４３５２１０７、ｒｓ３７４３５５６３８、ｒｓ３７２６０６０９８、ｒｓ３７４３５７４７４、ｒｓ３６８６５２４５９、ｒｓ３７０５４５４３４、ｒｓ３６８６５５７４１、ｒｓ３９７９８９２６６、ｒｓ５３０８３８７６０、ｒｓ３７０５５３４８８、ｒｓ３７６７４３８５１、ｒｓ３９７７２５６６７、ｒｓ５２８９２５４４５、ｒｓ５３２６３０４６５、ｒｓ３７２６２５８８６、ｒｓ３７４６５８８４７、ｒｓ３７４３８１７０４、ｒｓ３７２３６８０６２、ｒｓ５３２６５３０１５、ｒｓ３７２３６８９１４、ｒｓ５３２６５９４１４、ｒｓ５３０８７９７２９、ｒｓ５２８７１８８８５、ｒｓ３７４４２２９８６、ｒｓ２０１５７４１５５、ｒｓ２０１５７５３１７、ｒｓ３７０６１０７３６、ｒｓ３７６５４２１６１
、ｒｓ３７６８１００３２、ｒｓ３７４４４４８６４、ｒｓ３９７７８１６３８、ｒｓ３７０３５４２２９、ｒｓ３７２７０２３０２、ｒｓ３６８４６８０７２、ｒｓ３７６８２５１７５、ｒｓ５３２６８２９８７、ｒｓ３９８０９１４２３、ｒｓ３７６８３０３６９、ｒｓ３７６８３０９５９、ｒｓ３７０３７３２１５、ｒｓ３７２７１４１３１、ｒｓ５３０９２４７３７、ｒｓ３７２７１６５８３、ｒｓ３７６８３７８１０、ｒｓ３７２４６２５５５、ｒｓ２０１４１５２００、ｒｓ３９７８２３９３３、ｒｓ３６８７６８４０７、ｒｓ５２９０１８３１４、ｒｓ５３２６９６４４７、ｒｓ５３０７３７０８２、ｒｓ３７２７３１１０４、ｒｓ３７０４３５３４０、ｒｓ３６８７７６８８２、ｒｓ５３０９４６６０８、ｒｓ５３０７３８３５５、ｒｓ３６８７８３４２１、ｒｓ３６８７８４３３０、ｒｓ３７６８６４８８５、ｒｓ５３２７０８２７７、ｒｓ５２７２４５６６６、ｒｓ３６８７９３９７０、ｒｓ５３０９６９１９５、ｒｓ３６８８０７５５１、ｒｓ５３０７４０１５２、ｒｓ３６８５４８４５０、ｒｓ２０１６４５０１８、ｒｓ３７４８１１１１５、ｒｓ３７４８１３２４１、ｒｓ３７４８１３９４２、ｒｓ２０１４６１１６１、ｒｓ３７０４８３００３、ｒｓ３７０７２２９６５、ｒｓ５３２５７１００６、ｒｓ５２７２９０９３４、ｒｓ５３２７４１３５８、ｒｓ３６８８３３８０２、ｒｓ３７４８３２０９２、ｒｓ３７４８３４７６８、ｒｓ５２９０９２９２７、ｒｓ３７０７４７６２８、ｒｓ５２７３０８４２４、ｒｓ５２９０９６７５２、ｒｓ５３２５７７６７０、ｒｓ３９７９４０２６３、ｒｓ３７０７５７１３０、ｒｓ３７０７７９２５８、ｒｓ３６８８８２０６４、ｒｓ５３２７７４２１３、ｒｓ２０１６９８３２３、ｒｓ５３１０５１９６０、ｒｓ５２７３４３８３８、ｒｓ５３２５８７９８１、ｒｓ５２８８８０５５４、ｒｓ５３０８０５３２５、ｒｓ２０１７０６５６０、ｒｓ３７６７１００１３、ｒｓ２０１７１５０７５、ｒｓ３７０５２８１２０、ｒｓ３６８６３７６２５、ｒｓ３７６７１９８３２、ｒｓ５３０８２１１６０、ｒｓ５３１０８７６８３、ｒｓ３６８６４１１３１、ｒｓ３６８６４１３５６、ｒｓ５２７３８６５５５、ｒｓ５２７３８６６４９、ｒｓ５２８９０５８３８、ｒｓ３７０５４２８８０、ｒｓ３７４９４３５３８、ｒｓ３７０５５４８８４、ｒｓ３６８６８０８７１、ｒｓ３７０５７６１４２、ｒｓ３７２９０７４５４、ｒｓ３７０８８０７９６、ｒｓ５３２８３７８８１、ｒｓ２０１７５３９５５、ｒｓ３６８９７２１３７、ｒｓ３７６７８０２４９、ｒｓ５２７４２６９７５、ｒｓ５２７４２９４０６、ｒｓ３７０６０３０４６、ｒｓ３６８９８８１６２、ｒｓ５３２８５２８８３、ｒｓ３７２６７４２７９、ｒｓ３６８９９４６６３、ｒｓ３７４７１２００４、ｒｓ５２９２３２９２４、ｒｓ３７０９１２２５０、ｒｓ５３２６７７１２０、ｒｓ２０１７８９９７０、ｒｓ３７０９１６２３８、ｒｓ３７０９１７７３４、ｒｓ３７６８１５７５３、ｒｓ３６９００８２８２、ｒｓ５３１１４９１８３、ｒｓ３７５０１２７９３、ｒｓ５３１１５３５０１、ｒｓ５２９２４９８８７、ｒｓ２０１５８８８１１、ｒｓ５２８９９２１３１、ｒｓ２０１８１５５６９、ｒｓ３７６８３３２９５、ｒｓ５３２８８９５３９、ｒｓ５２９０１０４７３、ｒｓ５３２８９１５３３、ｒｓ３７６８４００１１、ｒｓ２０１８２７２１７、ｒｓ３９８１０５７８４、ｒｓ５２７４９６３２４、ｒｓ３７４７５７２５１、ｒｓ５３１１８７７０６、ｒｓ５３２９０３４０１、ｒｓ５３０９４１６８９、ｒｓ３６８７８１６９７、ｒｓ３７５０９２７９９、ｒｓ５３０９７７１２３、ｒｓ３６９１０７３５７、ｒｓ２０１８７１４９３、ｒｓ３７３０６２０３２、ｒｓ３６９１１８１３８、ｒｓ３７５１１０５８４、ｒｓ５３０９８０３０４、ｒｓ５３２９４３９４０、ｒｓ５２９０７７２１２、ｒｓ２０１６５９６８５、ｒｓ２０１６６０９８３、ｒｓ３７３０８３７３２、ｒｓ３７３０８５０９９、ｒｓ３６９１３７５１５、ｒｓ３７５１３０６５２、ｒｓ３７３０９０９７６、ｒｓ３７３０９０９７８、ｒｓ５２７５６７９３４、ｒｓ５２７５７７６６６、ｒｓ３６９１７５４４９、ｒｓ３６９１７７５９９、ｒｓ５２９３６４２４３、ｒｓ３７２８０４０２１、ｒｓ３７７２４３６１０、ｒｓ５２７６１２５４２、ｒｓ３６９１９８４０６、ｒｓ５３１２８７６９５、ｒｓ５３１２８８０３０、ｒｓ２０１６８０３１５、ｒｓ５３２７８０３３８、ｒｓ２０１７０３４６０、ｒｓ５２９１３６７７１、ｒｓ３７５２０６７８３、ｒｓ３７０８０５１４７、ｒｓ２０１９５５９９０、ｒｓ５２９４０６００７、ｒｓ３７３１７８２８０、ｒｓ３７３１８０５２３、ｒｓ３７７０００６３６、ｒｓ３７５２２６６３７、ｒｓ５３２７９３７１５、ｒｓ５３２７９５０９５、ｒｓ３７０８２３１３３、ｒｓ３７１１５５７５３、ｒｓ３７１１６１８６６、ｒｓ５３１０９１８８７、ｒｓ５２９４３０７３８、ｒｓ３７７０２３９６２、ｒｓ３７３２０９４５０、ｒｓ５３２８２１１５６、ｒｓ２０１７４８４２４、ｒｓ５２９１８６４７９、ｒｓ２０１９８５５３６、ｒｓ５２７４０１８９７、ｒｓ５３２８３９６８２、ｒｓ３７７０６４３０３、ｒｓ５２９４４９７３３、ｒｓ５３１３５２３２４、ｒｓ５２７４２９７５０、ｒｓ３６８９９２８４３、ｒｓ３６８９９７７５７、ｒｓ３７１２０７４５８、ｒｓ３７３２４６８２１、ｒｓ５３１１４１７４６、ｒｓ５２９２４２８４６、ｒｓ５２９２５１８７６、ｒｓ３７７３４００９２、ｒｓ３７７１２１４６９、ｒｓ５２７７２６７８４、ｒｓ５３１３７８０８７、ｒｓ５３１３７８１４８、ｒｓ３７７３５１５４２、ｒｓ３７７１３６１３５、ｒｓ５２７５２９９９４、ｒｓ５２７７４１１４６、ｒｓ３７１２５６７０６、ｒｓ３７１２５８４３８、ｒｓ３７１２６１２３５、ｒｓ３７１２６２６０３、ｒｓ５２９５０１３５６、ｒｓ５３３０８５６８７、ｒｓ５３１３９８９９４、ｒｓ３７１１９０２６１、ｒｓ５２９５０８８２６、ｒｓ３７３２８９５０８、ｒｓ３７３２８９７７０、ｒｓ３７１２７６６３６、ｒｓ３７３２９４３２５、ｒｓ５３１１７４００２、ｒｓ５３３１０１１７３、ｒｓ３７３３１２４６４、ｒｓ５２７７７９１７０、ｒｓ５２９５３６２８６、ｒｓ３７１３１９８３７、ｒｓ３７１３２４９２１、ｒｓ３７０９６０６８６、ｒｓ３７０９６５０１１、ｒｓ３７１３３１０１１、ｒｓ３７３３４０３６３、ｒｓ５３７５６１６３９、ｒｓ３７１３３７２２８、ｒｓ３７１３３９７３９、ｒｓ３７１３４１９５６、ｒｓ５３３１２３４０８、ｒｓ３７３３４７７８７、ｒｓ３７１３４４６５８、ｒｓ３７５３８３２１８、ｒｓ５３３９９６１３０、ｒｓ３７３３５１８０２、ｒｓ５２９２８７７０１、ｒｓ５３１１９３５９８、ｒｓ５２７８１４５０４、ｒｓ５３７５８５７１６、ｒｓ５２９２９７９３３、ｒｓ３７７１９１０１６、ｒｓ３７５１１９７１０、ｒｓ３７７１９７８９２、ｒｓ５３３１３６５２５、ｒｓ３７３３７０６１６、ｒｓ５２７５５６００６、ｒｓ５３４０２５３４０、ｒｓ５３４０３４２８５、ｒｓ５３１４７６６３３、ｒｓ３７３１２８３５３、ｒｓ３７７４６７２５９、ｒｓ５２７８３８０４５、ｒｓ３７１３７８５１２、ｒｓ５３３１５２２４２、ｒｓ３７３３９１８２０、ｒｓ３７５４２５９６５、ｒｓ３７３１５３８４５、ｒｓ３７３４１１３２０、ｒｓ３７５４４４７４８、ｒｓ５３７６４０５１６、ｒｓ３７５４４５２６６、ｒｓ５３７６４０８８３、ｒｓ３７７４９２３２７、ｒｓ３７３１６０６１７、ｒｓ５３７６４４４２４、ｒｓ５２７８６９８１４、ｒｓ５３３００５６７５、ｒｓ５２９６０８１４７、ｒｓ３７５２０６２７６、ｒｓ３７７２６８５０２、ｒｓ３７５４６０５４４、ｒｓ５２７８８９２２５、ｒｓ５２９４１５４２３、ｒｓ３７３１８６０４５、ｒｓ５２７８９６９０５、ｒｓ５３４１１２６７２、ｒｓ５２７８９８４５０、ｒｓ５３１５３４１３４、ｒｓ３７７２８５７７５、ｒｓ５２７６５９３０６、ｒｓ５２７６６７１８２、ｒｓ５４１０８７１５２、ｒｓ３７５４９３６５３、ｒｓ３７５４９５５８９、ｒｓ３７３２０７９０３、ｒｓ３７３４７０６５１、ｒｓ５４１１０４４３７、ｒｓ５３３０３５２８３、ｒｓ５３４１４５２０７、ｒｓ３７３２１６８１１、ｒｓ３７１１７４９１５、ｒｓ５３７７１９３９６、ｒｓ５２７９２５９４６、ｒｓ３７１１８２５７９、ｒｓ３７３４８４４３５、ｒｓ５３３２２２３１８、ｒｓ５３３２２４７２１、ｒｓ５２７６８９４１９、ｒｓ３７５２７４１２２、ｒｓ５３４１７０９５８、ｒｓ３７５５３３６９１、ｒｓ５２７９４５３７３、ｒｓ５３４１８０９２４、ｒｓ５３４１８２９８４、ｒｓ３７３２３９９７２、ｒｓ３７３２９９５５３、ｒｓ５２７７０６４０１、ｒｓ５２９４６５８５７、ｒｓ５４４７２３７６０、ｒｓ３７３２５３４３０、ｒｓ３７１２２１４０８、ｒｓ５２７９７５５１８、ｒｓ３７７３４２１８５、ｒｓ５３３２６７４４０、ｒｓ５４８６３０４４１、ｒｓ５２７９８１７２７、ｒｓ５４１１８６５４７、ｒｓ３６９３４１３９１、ｒｓ５３１６１５９４１、ｒｓ５３３９８０４７２、ｒｓ５５２３６３３７３、ｒｓ５３７８１７４３３、ｒｓ５４１２１０１６９、ｒｓ５３３２９３７２２、ｒｓ５３４２４８５８９、ｒｓ５２９７４１１５４、ｒｓ５３７８２６９２６、ｒｓ５２９４８６２７７、ｒｓ３７３３３７８４９、ｒｓ５３３０８９１９２、ｒｓ５２９５６２８４０、ｒｓ５４８６０５９２６、ｒｓ５４８６９３６１５、ｒｓ５４８６９５３６７、ｒｓ５３４２７００５２、ｒｓ５３３３３５３５６、ｒｓ５４８７１０２７３、ｒｓ５２８０３６６０７、ｒｓ５３１５８０６４０、ｒｓ５４１２６９７０１、ｒｓ３７５５６１９６９、ｒｓ５２９７８００６４、ｒｓ３７５３９３２２９、ｒｓ５２８０４３７１６、ｒｓ５２７８１６１３９、ｒｓ５３１６６８０８７、ｒｓ５２８０４８５８７、ｒｓ５３３３６２３６１、ｒｓ５３７８７３４０４、ｒｓ５２８０５４７４５、ｒｓ５３３３７１４５９、ｒｓ３７５３９７６３９、ｒｓ５３７５８９５２０、ｒｓ３７５４０１５３１、ｒｓ５３７５９６００５、ｒｓ５４８７５８０３１、ｒｓ５５２４７４７２８、ｒｓ５５２４７５２３６、ｒｓ５４８７６６５３８、ｒｓ５３４３２０１０４、ｒｓ５２９８３１４０６、ｒｓ５３３１４９３６２、ｒｓ５２７８４５６９６、ｒｓ３７５４４６３３５、ｒｓ５４８７７６１５４、ｒｓ５３１７０９５１３、ｒｓ５４１３３６５８７、ｒｓ５３４３３６３７４、ｒｓ５２９８４５６２３、ｒｓ５３７６４７７６４、ｒｓ５３１７１９７２５、ｒｓ５３１７２６５９４、ｒｓ５２９８５６６２７、ｒｓ５２９８６１０７７、ｒｓ５２９６１０２４４、ｒｓ５３７９３５９２９、ｒｓ５４４９００２５３、ｒｓ５２９８７９１４３、ｒｓ３７５４５８５９４、ｒｓ５４１０６４９０９、ｒｓ３７７５１８７０８、ｒｓ５４１０７７２９２、ｒｓ５３７６９３１７３、ｒｓ５４８８３９９９５、ｒｓ５４８８４０７１５、ｒｓ５３１７６５６１８、ｒｓ５５２５６１２２６、ｒｓ５５２５６４８０６、ｒｓ５３１５３７４５５、ｒｓ３７３４６６５５１、ｒｓ５３４３９５２５８、ｒｓ５３７７１５９２２、ｒｓ３７３４８０６９８、ｒｓ５３１７９９４２４、ｒｓ５２８１４８３０７、ｒｓ５３７７１８１９２、ｒｓ５３７９８８５５３、ｒｓ５３３４９５３４１、ｒｓ５３３２２１８０３、ｒｓ５４１４３８３３９、ｒｓ５３１８１７０９０、ｒｓ５３１８２７２６３、ｒｓ５４８９０３２３１、ｒｓ５４８９０３９４１、ｒｓ５３３２２９７８６、ｒｓ５５２６２５２２７、ｒｓ５４４９８６２３４、ｒｓ５３４１６３８３８、ｒｓ５４１４７０３８５、ｒｓ５４８９２８１３１、ｒｓ５４１２６６３６４、ｒｓ５２９９７８４５３、ｒｓ５４８６０６０３８、ｒｓ５４５００５７５５、ｒｓ５４１４９５９９６、ｒｓ５５２６７６１１６、ｒｓ５３７７８４０９８、ｒｓ５５２３３１２７２、ｒｓ５３３５６９４６７、ｒｓ５３８０５３６５５、ｒｓ５４４７３１４０３、ｒｓ５４５０４１２０２、ｒｓ５４８６３５８３６、ｒｓ５３４４８３５１５、ｒｓ５３４４８３
９７９、ｒｓ５３１６１６５３３、ｒｓ５５２６９７７４０、ｒｓ５５２６９７９７２、ｒｓ５３１６３７３２７、ｒｓ５５２７０１０１９、ｒｓ５２８２０７９５９、ｒｓ５４８９９７２２７、ｒｓ５３４２５５４７３、ｒｓ５４１５２８２７５、ｒｓ５３１９１９８６４、ｒｓ５４１２４６６６１、ｒｓ５４９０１２５８４、ｒｓ５４４７８６６０９、ｒｓ５４９０２８１０７、ｒｓ５３４５１２７５４、ｒｓ５３１９５０５３９、ｒｓ５２８２３５６６２、ｒｓ５３１９６１８２０、ｒｓ５２８０２５２６３、ｒｓ５５２６５２３６７、ｒｓ５３８１０９５２３、ｒｓ５５２４３２７６７、ｒｓ５２８０４０７９９、ｒｓ５５２７８３６２２、ｒｓ５５２７８６９２４、ｒｓ５３３３５２９７４、ｒｓ５３７８７８５８４、ｒｓ５４９０９３６２７、ｒｓ５２８２７４９０９、ｒｓ５４１５９５４６８、ｒｓ５２８２９２０８９、ｒｓ５４９１１７８１０、ｒｓ５３４３０２５５９、ｒｓ５３４５７６９０７、ｒｓ５２８０６５４５４、ｒｓ５４９１２２６３８、ｒｓ５２８３０１０９７、ｒｓ５３２０２５６１１、ｒｓ５４４８４５３９１、ｒｓ５３２０３１６８３、ｒｓ５３４５８６１９１、ｒｓ５４４８５５５３２、ｒｓ５４５１７５０１８、ｒｓ５４５１７６６３０、ｒｓ５３３７１９３１０、ｒｓ５４９１４５７５１、ｒｓ５３０１６７６０８、ｒｓ５２９８３３６３３、ｒｓ５５２８６４５３４、ｒｓ５５６５５５９３９、ｒｓ５４１３２５２７２、ｒｓ５３０１７９５０１、ｒｓ５４５２００４３７、ｒｓ５３８１８４７１４、ｒｓ５３３７４５８５１、ｒｓ５３３４１４９９８、ｒｓ５４１６６４６２６、ｒｓ５６０６３１７４５、ｒｓ５４１６８１００８、ｒｓ５６０６５１１７９、ｒｓ５４１６８６２５２、ｒｓ５５２９２６０６０、ｒｓ５５６５９９６３５、ｒｓ５５６６０３０９４、ｒｓ５４９１９１１０７、ｒｓ５３４６５１６０１、ｒｓ５３３７８８７３０、ｒｓ５６４６４２８８５、ｒｓ５５２９４６０００、ｒｓ５３８２２４１２１、ｒｓ５３３７９９４３９、ｒｓ５３７９３２８７４、ｒｓ５３１７４９８２５、ｒｓ５６０６８６６２１、ｒｓ５４１７１０９７４、ｒｓ５６０６８９７０３、ｒｓ５４５２８６１９５、ｒｓ５６０７０１２１６、ｒｓ５６４６７５５０４、ｒｓ５３３４４７１３４、ｒｓ５３３４５３５７３、ｒｓ５４９２１８９３３、ｒｓ５５２９９４５４５、ｒｓ５２９８９０６３９、ｒｓ５５２５５１１０９、ｒｓ５４４９２９８７５、ｒｓ５４１７４７８８４、ｒｓ５５３０１８５０２、ｒｓ５３４３９１３６４、ｒｓ５６０７６２０２８、ｒｓ５４８８６６３８９、ｒｓ５５３０３３９８８、ｒｓ５６０７７２９９６、ｒｓ５５２５８６８４６、ｒｓ５４８８８３２４２、ｒｓ５４８８９０２３８、ｒｓ５５２６２３４７７、ｒｓ５２８１６６７８１、ｒｓ５４１４７５９０４、ｒｓ５３８２８９２５４、ｒｓ５３４７２５２７５、ｒｓ５６０７９９９０４、ｒｓ５３０００７８０４、ｒｓ５５６７０８４９０、ｒｓ５５３０７９９８２、ｒｓ５３８３０５４６２、ｒｓ５６８９２９４２９、ｒｓ５３８０４５３４１、ｒｓ５４１８０６０５４、ｒｓ５３８１０９６７８、ｒｓ５４１８１３６１１、ｒｓ５３３５７６３６１、ｒｓ５６０８４７０２７、ｒｓ５６８９５３１０５、ｒｓ５４８９８３９９５、ｒｓ５３３５８３４６５、ｒｓ５３８０６４４２６、ｒｓ５３００３８８１９、ｒｓ５６８９６２６３４、ｒｓ５５２７２０５２１、ｒｓ５３８３３２０２９、ｒｓ５６４８６４０７４、ｒｓ５４９０１５８７８、ｒｓ５４５１００８８３、ｒｓ５３８３５９１５２、ｒｓ５４１８５８０７０、ｒｓ５３４５２９５２４、ｒｓ５４９３２４７１６、ｒｓ５６４９０１３７３、ｒｓ５６４９０４４７９、ｒｓ５６４８１２１６２、ｒｓ５５３１８８５４１、ｒｓ５３８１１６３３３、ｒｓ５５２７９５９４４、ｒｓ５５６７９８１５１、ｒｓ５４１８０４５５３、ｒｓ５４５５１１５５４、ｒｓ５６０８３８７０２、ｒｓ５４５５１３０３７、ｒｓ５４９０８７０４４、ｒｓ５３８１５２８０９、ｒｓ５３３６９７５０６、ｒｓ５６０９６９７６２、ｒｓ５４５１６８３０８、ｒｓ５５２８４８２２８、ｒｓ５６４９５７４８６、ｒｓ５３８４１３８０８、ｒｓ５４９１５１０４０、ｒｓ５６４９５９０２３、ｒｓ５４９３５８９４８、ｒｓ５４９３５９３７６、ｒｓ５４５１９４３０４、ｒｓ５３８４１９１７７、ｒｓ５４１８９９９３５、ｒｓ５３２０８０７３７、ｒｓ５３３８００２６１、ｒｓ５３４６６１３１４、ｒｓ５６４６８３７１６、ｒｓ５６４６８４０９２、ｒｓ５６１００４３３３、ｒｓ５５２９９８６０７、ｒｓ５４９２２９１５７、ｒｓ５３４８７０３２４、ｒｓ５４１９２３７２３、ｒｓ５５３２９１７５１、ｒｓ５３８４７４４６３、ｒｓ５６９１０４５５６、ｒｓ５６９１１１７２８、ｒｓ５６４７１２４７０、ｒｓ５６９１１３８７０、ｒｓ５４１９４５９８０、ｒｓ５４５３３８１７６、ｒｓ５３８４９８６９３、ｒｓ５３３８６２６９２、ｒｓ５６０７７８８０２、ｒｓ５３３８７６５７５、ｒｓ５３４９２５２５５、ｒｓ５４５６３４４００、ｒｓ５６５０８１８４２、ｒｓ５４１９６７１４１、ｒｓ５３８２８０４８２、ｒｓ５５３０４７０６１、ｒｓ５３８５４７１２８、ｒｓ５５３３８３１７５、ｒｓ５６０７８６１３４、ｒｓ５４１９８３０８２、ｒｓ５６９１６８７４４、ｒｓ５６９１７３１８７、ｒｓ５３４７２０２１０、ｒｓ５４９２６４０２５、ｒｓ５５３１９８９７０、ｒｓ５４５６８４８４６、ｒｓ５６９１８７７６８、ｒｓ５６９０３３８６６、ｒｓ５６５１５４０３７、ｒｓ５５６９５９３４３、ｒｓ５４９３４１９０６、ｒｓ５６５１５９７８０、ｒｓ５６５１６００４１、ｒｓ５６１１７９３３９、ｒｓ５４９３４３９４０、ｒｓ５５６９６８０７９、ｒｓ５３５００５３４６、ｒｓ５５３１０９９３１、ｒｓ５５３１１０１５２、ｒｓ５４９４７３０９２、ｒｓ５４１８１９３８２、ｒｓ５５６９８６２９７、ｒｓ５５３１１２６５４、ｒｓ５４５４３３１２０、ｒｓ５６９２１７６４７、ｒｓ５４５４６３７１３、ｒｓ５４２０２８７１３、ｒｓ５５７０１１３５０、ｒｓ５４９４９２１７８、ｒｓ５３８３５６３８９、ｒｓ５６９０２０００６、ｒｓ５５３１８８２２８、ｒｓ５６０９６４６０１、ｒｓ５５７０３１２７３、ｒｓ５６５１５１６３２、ｒｓ５４５６９５７９６、ｒｓ５４５５１３８３０、ｒｓ５６４９４１５４０、ｒｓ５５３５０５７７７、ｒｓ５６４９４３６３２、ｒｓ５４５５３０６２５、ｒｓ５３５０７３２２１、ｒｓ５５３２４１２０９、ｒｓ５３４８２９４４３、ｒｓ５６９２６１４０８、ｒｓ５４２０７７４１８、ｒｓ５３８４２４８３３、ｒｓ５４９３６３７３９、ｒｓ５５３５２２６５５、ｒｓ５５３２５６３１５、ｒｓ５６５２５２６９３、ｒｓ５６１００２３２２、ｒｓ５４５７９２０７８、ｒｓ５４５７９３３５５、ｒｓ５５３５４１０８７、ｒｓ５５７０８９１８７、ｒｓ５３８４３２１４８、ｒｓ５５３２６０４５４、ｒｓ５５３２７４０８２、ｒｓ５４１９４３６７５、ｒｓ５６５０４３６６４、ｒｓ５４２１１４４０８、ｒｓ５４５８１８９４８、ｒｓ５５７１１６９８３、ｒｓ５３５１３５０２１、ｒｓ５４５８３４６６９、ｒｓ５６１３０３２００、ｒｓ５６１０７６９９６、ｒｓ５５３３４５０３１、ｒｓ５４２１５０７７４、ｒｓ５５７１４９５７６、ｒｓ５４９４１７３４８、ｒｓ５６１１１４３３２、ｒｓ５５３３８１４０４、ｒｓ５３４９５５９２０、ｒｓ５４２１６２０４６、ｒｓ５４９５７６５６２、ｒｓ５４９４５８１４１、ｒｓ５６１３２３１３８、ｒｓ５６１１６６３６１、ｒｓ５６１１６８２４６、ｒｓ５５７０３４９５４、ｒｓ５５７１７８０９２、ｒｓ５３８７７９７０５、ｒｓ５５３６２９９７９、ｒｓ５６５３６０６５６、ｒｓ５６９３３７６５４、ｒｓ５６１２２２９２９、ｒｓ５３５１９３９８６、ｒｓ５６９３４３６１５、ｒｓ５５３６４１５４７、ｒｓ５６９１９６６０２、ｒｓ５６９１９９５２９、ｒｓ５５７０３７２９５、ｒｓ５５３４３８８０３、ｒｓ５５３４４５３８３、ｒｓ５５３６５９１２０、ｒｓ５６５３８９２７５、ｒｓ５５３４５０２７９、ｒｓ５５７２１４９４６、ｒｓ５４２２１１０６５、ｒｓ５５３６７１２７４、ｒｓ５５７２２０２９２、ｒｓ５３５２２８６３０、ｒｓ５３５０１９９００、ｒｓ５３８６２１１４９、ｒｓ５５７０１５３２２、ｒｓ５３８８２６２２１、ｒｓ５４９４９６４９８、ｒｓ５４５９２９７８２、ｒｓ５６５４１８８９７、ｒｓ５４２０４１２９４、ｒｓ５３８８３７６２０、ｒｓ５４９５０５５６０、ｒｓ５６１３８８６１５、ｒｓ５５３５０８３９５、ｒｓ５６５４３３９７３、ｒｓ５４２０６３８９４、ｒｓ５４２０４２７８７、ｒｓ５５３５１３５３５、ｒｓ５４２２４３９９１、ｒｓ５３８８４９１５６、ｒｓ５４２０７１１２９、ｒｓ５６９２６４９０３、ｒｓ５６５４５０９０７、ｒｓ５５３７２２１４５、ｒｓ５６１２４９７９５、ｒｓ５５７０７２４８６、ｒｓ５５３５３３９０７、ｒｓ５６５４５７４２９、ｒｓ５６５４５８７１４、ｒｓ５３５２７６２１７、ｒｓ５４９６９７７６２、ｒｓ５４９６９９３７６、ｒｓ５４２２６９１３５、ｒｓ５５７２９６０１１、ｒｓ５６１４２６５８５、ｒｓ５３５１０６７２８、ｒｓ５３８８９０１２１、ｒｓ５４２１８２００４、ｒｓ５５７３１７２８７、ｒｓ５３８９０２１４８、ｒｓ５３５３１２７６１、ｒｓ５５７０９５３８６、ｒｓ５５７３２７０４５、ｒｓ５６５２７８７０６、ｒｓ５４２１０８９９４、ｒｓ５３５３２６８３２、ｒｓ５６５５１８８４０、ｒｓ５４９７５１６０１、ｒｓ５３５１１５７６６、ｒｓ５３５３４４５８８、ｒｓ５６９３１６７３５、ｒｓ５４９７６７４４２、ｒｓ５６５５３６８７９、ｒｓ５６１４６９４１１、ｒｓ５５７３６３８４０、ｒｓ５６９４４９０１７、ｒｓ５４９７７６３８３、ｒｓ５６５５４８６８２、ｒｓ５６５５５１０４０、ｒｓ５５３８２３７９２、ｒｓ５５７３８３９３９、ｒｓ５３８７５０２５７、ｒｓ５４９７９５９３６、ｒｓ５５３５９９４６６、ｒｓ５４９７９７１８５、ｒｓ５５３５９９５６０、ｒｓ５３５１６２３１３、ｒｓ５４６０７９８５４、ｒｓ５４９８１６２０９、ｒｓ５５７１５７２５９、ｒｓ５５７１６０５０２、ｒｓ５３８９８６７２２、ｒｓ５５３６１８５７６、ｒｓ５３５１８３４８８、ｒｓ５５７４４０１６０、ｒｓ５３８７７５８９２、ｒｓ５３５２００８８３、ｒｓ５４６００４３０１、ｒｓ５６９３４７３５５、ｒｓ５６５３８５７２９、ｒｓ５４９６２１１８６、ｒｓ５５７２０９１８８、ｒｓ５５７４７２４４６、ｒｓ５４２４３８６８１、ｒｓ５４５９０７４５６、ｒｓ５３９０４１４３５、ｒｓ５５３９１３５８０、ｒｓ５５７２２６７１７、ｒｓ５５７２２９００７、ｒｓ５５７２３１８７２、ｒｓ５４２２２６０６３、ｒｓ５４２４５６８９０、ｒｓ５３５２４２６５４、ｒｓ５５３９２８７００、ｒｓ５４９８９４３４３、ｒｓ５５７５０４７７２、ｒｓ５４９６５８１１５、ｒｓ５４２２３７４１３、ｒｓ５５７５１１９９４、ｒｓ５４９９０８９１１、ｒｓ５３５２５３６８６、ｒｓ５４６１７５３６３、ｒｓ５３５４８４８２１、ｒｓ５４９９１９４６７、ｒｓ５４５９４４２８０、ｒｓ５６５７０４８１７、ｒｓ５４２２４３９３６、ｒｓ５６１３９９０３２、ｒｓ５６１４０５０９２、ｒｓ５５７５４７７３１、ｒｓ５４９６８５８６２、ｒｓ５４２５０９３９５、ｒｓ５４６２１４６５２、ｒｓ５６５４５３９３４、ｒｓ５４６２１５６６３、ｒｓ５６１４０８０６３、ｒｓ５４５９９１０２２、ｒｓ５５７３１４０７５、ｒｓ５５３９８２９４１、ｒｓ５３９１２４４１８、ｒｓ５６１６０６６７０、ｒｓ５５７５７４９８４、ｒｓ５３８９１４３８８、ｒｓ５３５４２７１３０、ｒｓ５４９９８１８６４、ｒｓ５６５６２５３８３、ｒｓ５４６１２４６９０、ｒｓ５４６１３０２０４、ｒｓ５６５７６６５５５、ｒｓ５３９０３４７３５、ｒｓ５３９０４０７７３、ｒｓ５５３９１３８２５、ｒｓ５５７６０２３３５、ｒｓ５４２５５４７４５、ｒｓ５４２５５８５２４、ｒｓ５５３９１４６５７、ｒｓ５５４０１７３６６、ｒｓ５５００１１０４９、ｒｓ５６５
７９０２１９、ｒｓ５５３７８４６４３、ｒｓ５３９１７３８３３、ｒｓ５６１６４５６５１、ｒｓ５３９１７９２０９、ｒｓ５３９１８３１１８、ｒｓ５５７３５２３７６、ｒｓ５６１６５５６５４、ｒｓ５５００４７１７５、ｒｓ５６１６６５１２２、ｒｓ５６５５３３５０５、ｒｓ５６５５６７４３１、ｒｓ５４６３１１８９０、ｒｓ５３９２１５０１４、ｒｓ５４６０６６７８２、ｒｓ５５７３９６７０５、ｒｓ５６９４６５８５６、ｒｓ５６９４７１２７２、ｒｓ５６５８４３３４８、ｒｓ５４９８２３５０２、ｒｓ５６５６０１７４３、ｒｓ５４２６３２０１３、ｒｓ５４２６３２８６５、ｒｓ５３９２２９１５４、ｒｓ５３８９９８６３１、ｒｓ５６５８５５３３８、ｒｓ５６１５２１５８０、ｒｓ５４９８５００９１、ｒｓ５４２６４３１７６、ｒｓ５３９２４９６３０、ｒｓ５５４０９７９２１、ｒｓ５６９７１６５８６、ｒｓ５６５６６０４１４、ｒｓ５３５５５０３３２、ｒｓ５４９８７９０６５、ｒｓ５５０１２２０３９、ｒｓ５４６１５６１２６、ｒｓ５３９２６７５７２、ｒｓ５４９９０２０３５、ｒｓ５５０１３１７４０、ｒｓ５６１７２６０３６、ｒｓ５５７７３４５１７、ｒｓ５３５４７８５０４、ｒｓ５６５９１６６４５、ｒｓ５６９７５１０８７、ｒｓ５３９２９５４９１、ｒｓ５３９２９９０２９、ｒｓ５６１７５６８９６、ｒｓ５５７７６１１４２、ｒｓ５５７５１３７２８、ｒｓ５３５４９６３４７、ｒｓ５６５９４０６７０、ｒｓ５６９５４３９４１、ｒｓ５４２７１９０４９、ｒｓ５４２４９６７５９、ｒｓ５４９９４２０２４、ｒｓ５５４１６９４７８、ｒｓ５５７５５０８２０、ｒｓ５６１８０６４１５、ｒｓ５３９１１８９２２、ｒｓ５６９８１５８３５、ｒｓ５４６２１６５４５、ｒｓ５３９３５２７７７、ｒｓ５４６２１８３８４、ｒｓ５４６２１９３５３、ｒｓ５６１８２５０６６、ｒｓ５６９８３２６９９、ｒｓ５５７５７８６１０、ｒｓ５３５７６６５９３、ｒｓ５３５７６７７６６、ｒｓ５６１８３８３５６、ｒｓ５３９３８２４３２、ｒｓ５６１６１４３５７、ｒｓ５６１８６０６１９、ｒｓ５３９３８６６４９、ｒｓ５３９３８６８５２、ｒｓ５４９９８７８７５、ｒｓ５６５７６７０７３、ｒｓ５６６０３６７６２、ｒｓ５４６４７８７７４、ｒｓ５４２８０１８３１、ｒｓ５６５８９０６４８、ｒｓ５６９８７７９７８、ｒｓ５６１６２０６７２、ｒｓ５６１６２７１３９、ｒｓ５５４０１２１２６、ｒｓ５３５５６６３０１、ｒｓ５３９４０６２２２、ｒｓ５６５７９３００９、ｒｓ５４６４９１４９２、ｒｓ５５４２４４３４９、ｒｓ５３５６７１３８４、ｒｓ５４２５８８８２０、ｒｓ５５０２９２００８、ｒｓ５５００５６６３０、ｒｓ５５０２９４２２６、ｒｓ５５４０６２９７７、ｒｓ５５４２５２７８７、ｒｓ５４２８３２８０９、ｒｓ５６９９０４２０３、ｒｓ５６９６６９９９６、ｒｓ５４６３１６７０４、ｒｓ５３９４３６１７９、ｒｓ５５００７０３１０、ｒｓ５６６０８８９３７、ｒｓ５６９６７４９８５、ｒｓ５３９４５２６８９、ｒｓ５５０３３５２０１、ｒｓ５６５８４４４８６、ｒｓ５５４２８４１４１、ｒｓ５４２８７５７３５、ｒｓ５５７９５５５２９、ｒｓ５４６５４０１３３、ｒｓ５５７９６０５８２、ｒｓ５６９６７８８０８、ｒｓ５４２８９６４１０、ｒｓ５６９９７８７１７、ｒｓ５３９４８７６１４、ｒｓ５３５９０１５８６、ｒｓ５３９４８９５３９、ｒｓ５３９４８９８７６、ｒｓ５４２６３７６４７、ｒｓ５５０３８６０６８、ｒｓ５４２９１４５０１、ｒｓ５３５６４４９３２、ｒｓ５４６５６８３０９、ｒｓ５４６３３６２２９、ｒｓ５３９２６０１５２、ｒｓ５３５９１３１９２、ｒｓ５６５８９３１２８、ｒｓ５４２６７２４４０、ｒｓ５６６０４４８２２、ｒｓ５３５９２５０７０、ｒｓ５６１９６９２２０、ｒｓ５４６５８９８９３、ｒｓ５６６０４６９５０、ｒｓ５５０２６０３４５、ｒｓ５４２８０６１８９、ｒｓ５３９５３１７９６、ｒｓ５４６４８４９３９、ｒｓ５３５８０８１９６、ｒｓ５６９８８８５７６、ｒｓ５６５９０８３５９、ｒｓ５５７７６２３４２、ｒｓ５５８０４８８５２、ｒｓ５６５９３５０３６、ｒｓ５７００５８０９７、ｒｓ５５４３７２５３５、ｒｓ５５８０８１４７１、ｒｓ５４２７１３１５１、ｒｓ５３９５７５４８１、ｒｓ５５４１５４４７２、ｒｓ５６６２３２４１６、ｒｓ５６９７９８０３５、ｒｓ５６５９６７５５８、ｒｓ５４２７４８３５０、ｒｓ５６６２４７０８１、ｒｓ５５７８１９１３０、ｒｓ５５７８２３９８４、ｒｓ５５７８２４２４４、ｒｓ５６５９９８７７０、ｒｓ５６６０２３３３４、ｒｓ５５０５１８６９７、ｒｓ５３９３８７２４７、ｒｓ５５７８９１０７０、ｒｓ５３５９３２７７９、ｒｓ５５８１４３８７４、ｒｓ５３５８１７８３７、ｒｓ５６１９５９９１０、ｒｓ５５０５３８０２４、ｒｓ５６１９６０３５７、ｒｓ５３９４１５４６４、ｒｓ５４２８３００２８、ｒｓ５６２０９１７１７、ｒｓ５７０１３７６３４、ｒｓ５６２０９５２８９、ｒｓ５７０１４５３８６、ｒｓ５３９４２８６９５、ｒｓ５３９４３４７６９、ｒｓ５７０１６１８８９、ｒｓ５６６３０３５２１、ｒｓ５６６３０６５６３、ｒｓ５５０３１７３００、ｒｓ５６６０９８８２２、ｒｓ５６９９４１１１５、ｒｓ５４６７１３４３９、ｒｓ５６２１５３３８６、ｒｓ５５４２９８２８７、ｒｓ５５４３１４２８８、ｒｓ５５７９９４７３８、ｒｓ５６１９４８４５３、ｒｓ５６６３３９１５３、ｒｓ５５７９９９０９７、ｒｓ５４６５７６４０７、ｒｓ５６６１９０３２８、ｒｓ５４３０４７５４９、ｒｓ５５０６３９４６８、ｒｓ５４２９５０４５９、ｒｓ５５８０３７９１８、ｒｓ５３５９３７５７３、ｒｓ５７００３３０００、ｒｓ５７００３７６８８、ｒｓ５３９６１３６１６、ｒｓ５７０１３３５１３、ｒｓ５６２２２７９７８、ｒｓ５６２０８３９５２、ｒｓ５５０６８４７９５、ｒｓ５６６３８９３７１、ｒｓ５５８３０３５６７、ｒｓ５５８３０３９４４、ｒｓ５５４４１９１５０、ｒｓ５７００４０９９６、ｒｓ５５０６９７７４５、ｒｓ５５０４５３０９６、ｒｓ５５８０８２５５７、ｒｓ５３６１３４６６９、ｒｓ５６２０２９４２８、ｒｓ５７０３０５９６７、ｒｓ５３９７３７７１３、ｒｓ５３５９８１７５９、ｒｓ５５０７２０１２６、ｒｓ５７００９３１５４、ｒｓ５５０５００３８５、ｒｓ５３５９８８７７５、ｒｓ５７０１００７９１、ｒｓ５５０７４２７８０、ｒｓ５６２３１２３１０、ｒｓ５５８３６５２７７、ｒｓ５６６４３６３９７、ｒｓ５４３２５９２５４、ｒｓ５６２３２３９０１、ｒｓ５３６１６９３２８、ｒｓ５５８１２０１０８、ｒｓ５６２０６４８２６、ｒｓ５４６８３３８８７、ｒｓ５５０５１５５２７、ｒｓ５３６１８７１０８、ｒｓ５３５９９８３２３、ｒｓ５５０７９１０３５、ｒｓ５６２０９１５４９、ｒｓ５６２０８３９５０、ｒｓ５３９６２７１９２、ｒｓ５５４４３６８０８、ｒｓ５４３３００９０３、ｒｓ５６２１４５２８５、ｒｓ５４３１０４４５０、ｒｓ５３９６５４０９３、ｒｓ５３９８０７１６８、ｒｓ５６２１６１１７０、ｒｓ５４６７２０４３１、ｒｓ５６６４８１８８１、ｒｓ５３９６７２７４９、ｒｓ５５８４３５７０１、ｒｓ５７０２１８６１７、ｒｓ５６２１８３６６１、ｒｓ５６２１９６５５９、ｒｓ５４３１３３１１３、ｒｓ５４６７４５００５、ｒｓ５４３１３２８３９、ｒｓ５５０８４３２９０、ｒｓ５５０８４５８９５、ｒｓ５６２４１７７７６、ｒｓ５３９８３８４３２、ｒｓ５５８４７５７３１、ｒｓ５４３３６８２８２、ｒｓ５４３３７４００５、ｒｓ５６２３９５１２１、ｒｓ５５８２５５９５７、ｒｓ５４３３８１０４２、ｒｓ５３６２４８３２６、ｒｓ５３９６９３８６７、ｒｓ５３９８７５５３９、ｒｓ５６６５３５０３８、ｒｓ５５４７０１６５９、ｒｓ５７０４９５２１２、ｒｓ５６２２２０４２５、ｒｓ５７０２６２４０９、ｒｓ５６６３７２７８１、ｒｓ５３９７０４９１９、ｒｓ５４３１７９４９３、ｒｓ５３９８９１８９２、ｒｓ５５８５４４０３６、ｒｓ５５８３０５３２５、ｒｓ５５８３１６４５４、ｒｓ５６２２６３００６、ｒｓ５５４７３３８０６、ｒｓ５７０２９７７７５、ｒｓ５５０７０５８１７、ｒｓ５６６５６２４０４、ｒｓ５５８５６３８６８、ｒｓ５４３４４６１５８、ｒｓ５６２５１６９０８、ｒｓ５７０５４５４５２、ｒｓ５４３２１９３８４、ｒｓ５５４７７２８７４、ｒｓ５５４５３００１９、ｒｓ５５４７７４６６９、ｒｓ５５４５３１０１８、ｒｓ５６２２８６７６１、ｒｓ５４３４６９９２４、ｒｓ５４６９５４３８７、ｒｓ５７０３２０６０２、ｒｓ５３６１６９９２７、ｒｓ５５８３８４９４６、ｒｓ５４６９６５９１８、ｒｓ５３９９４２２３２、ｒｓ５３９９４４６５９、ｒｓ５６６６０４７１５、ｒｓ５７０５９００１８、ｒｓ５４６９７２１１３、ｒｓ５３６３１４６０８、ｒｓ５７０５９１３６６、ｒｓ５６２５７７１９６、ｒｓ５６６４５９３９４、ｒｓ５５８６３２２３３、ｒｓ５４６９７８５０４、ｒｓ５６２５８４１４０、ｒｓ５５０７８８９０９、ｒｓ５５８６３９３４６、ｒｓ５４３２９６３５８、ｒｓ５３６１９１３８９、ｒｓ５４３５２０４７９、ｒｓ５７０３８７３６０、ｒｓ５５４８４１２０６、ｒｓ５６６６２６９３１、ｒｓ５６６６２８７１１、ｒｓ５４３２９７５３６、ｒｓ５５８６６２０３３、ｒｓ５３９８０１５７９、ｒｓ５５４８５９１６７、ｒｓ５５４５９７２７３、ｒｓ５５４５９８０８８、ｒｓ５５４８６７５２１、ｒｓ５７０６４４８５４、ｒｓ５５８６７９００７、ｒｓ５４３５５９７９７、ｒｓ５５１０７３１４７、ｒｓ５３６３６０１７１、ｒｓ５５４８９６２４５、ｒｓ５７０６６２９６４、ｒｓ５４３５７４８３２、ｒｓ５６６４７６０９７、ｒｓ５４３３１４４７１、ｒｓ５３６３７３５１７、ｒｓ５４７０４０７０３、ｒｓ５７０４０９４１９、ｒｓ５６６６６７６０７、ｒｓ５５０８２５８４５、ｒｓ５５０８２９１１５、ｒｓ５６６４９４４９２、ｒｓ５４３５９０１３３、ｒｓ５４６８６６７８０、ｒｓ５６２６８３１５１、ｒｓ５５４６７４００５、ｒｓ５４０００９２３０、ｒｓ５６６６７６８４５、ｒｓ５５１１２０００６、ｒｓ５７０６９７８０７、ｒｓ５７０４７０２３２、ｒｓ５６２４６０４１８、ｒｓ５６６５１２３７６、ｒｓ５４３６０４５２０、ｒｓ５５４９５３１５１、ｒｓ５５０９０２７５９、ｒｓ５６２７２９４４４、ｒｓ５５４７１０７５３、ｒｓ５５８５３１５５３、ｒｓ５６６５４５２２９、ｒｓ５５４７１３８３９、ｒｓ５５０９２０５４２、ｒｓ５６６５５３７２５、ｒｓ５４３６４６５５１、ｒｓ５４００４６７７７、ｒｓ５４３６５１４９１、ｒｓ５５０９２５１９０、ｒｓ５５０９２７９７９、ｒｓ５５０９３２３１０、ｒｓ５６２５３４２０２、ｒｓ５６２５３９９９６、ｒｓ５６２５４３１３６、ｒｓ５５５０１６６６０、ｒｓ５５５０１７８１７、ｒｓ５４３４６９６０７、ｒｓ５６２７７７２９８、ｒｓ５５８８２６０８４、ｒｓ５７０５６６９４８、ｒｓ５５４７９０５９９、ｒｓ５５５０４０７９０、ｒｓ５４６９６２９５０、ｒｓ５４６９７４４４７、ｒｓ５４７１７４３２４、ｒｓ５５８６３８１５５、ｒｓ５５８６４０４６７、ｒｓ５７０６０８６７２、ｒｓ５７０６１１１７６、ｒｓ５５４８５２８０５、ｒｓ５６６７７３１４５、ｒｓ５３６５１５４８０、ｒｓ５５８８５７８００、ｒｓ５６２６１５６７２、ｒｓ５６６７８０１１５、ｒｓ５３６５１８５６０、ｒｓ５５８６６７７０７、ｒｓ５５１０５４４７４、ｒｓ５６２６５９８４２、ｒｓ５５８８７０１７１、ｒｓ５５８８７９８２９、ｒｓ５６２６６２７４６、ｒｓ５７０８５０００４、ｒｓ５３６３７８９３７、ｒｓ５５４９１７９７０、ｒｓ５６６８１９６４０、ｒｓ５６６８１９７４７、ｒｓ５７０６８２０２７、ｒｓ５７０６８２３２５、ｒｓ５３６５５６４６６、ｒｓ５４７２４２４６２、ｒｓ５５１１０６８２６、ｒｓ５４０１２７０６６、ｒｓ５５４９２７３６０、ｒｓ５４３７７１５４０、ｒｓ５６６８３９４９０、ｒｓ５４００１７２１０、ｒｓ５５５１４４４１２、ｒｓ５７０８７８６２０、ｒｓ５６２９００４９９、ｒｓ５４７０９１３７０、ｒｓ
５６６８５１２５８、ｒｓ５４０１４５１０１、ｒｓ５４７０７２５０１、ｒｓ５４７２７７８１４、ｒｓ５６２９１６３６５、ｒｓ５４０１５１１９６、ｒｓ５５１３４６３０９、ｒｓ５４７２９０８３１、ｒｓ５５１３５２４０１、ｒｓ５５１３５２５０７、ｒｓ５５５１８４８９７、ｒｓ５４７２９８１５０、ｒｓ５４７０７８９６２、ｒｓ５４３７９３９９６、ｒｓ５５５１８９４１３、ｒｓ５５８９０３３５１、ｒｓ５５８９３０７３７、ｒｓ５６２７３９８５１、ｒｓ５４７３１２６８５、ｒｓ５６６７０９１４５、ｒｓ５５５２１０６８１、ｒｓ５５８７８６７５０、ｒｓ５６６９１３５３９、ｒｓ５６２９７２６４６、ｒｓ５５８７９１００９、ｒｓ５５１４０５８１４、ｒｓ５５８７９１２６４、ｒｓ５３６４４６３４７、ｒｓ５４７３５０７４２、ｒｓ５６６７１７６５６、ｒｓ５４３８６８４０１、ｒｓ５５８９６５８８７、ｒｓ５６６９４５４８６、ｒｓ５５５２５７９７１、ｒｓ５５５００７２７６、ｒｓ５６３０２７２９５、ｒｓ５３６６８６００９、ｒｓ５３６６９０４６８、ｒｓ５６６７２２６０１、ｒｓ５４３６５９５９１、ｒｓ５５１４６９８９９、ｒｓ５４７１３９３７０、ｒｓ５４７１３９７７８、ｒｓ５５１２００１６８、ｒｓ５７０７７５６１２、ｒｓ５３６４７４５０８、ｒｓ５４３６９０２３２、ｒｓ５５１４８７８０９、ｒｓ５５５０５０９３９、ｒｓ５６７０２６４５０、ｒｓ５４３９２９１５８、ｒｓ５３６４９９９１９、ｒｓ５３６７３９５６８、ｒｓ５４３７０１７９１、ｒｓ５６２８１６９２４、ｒｓ５５１５２３３７２、ｒｓ５４００８８５４８、ｒｓ５４７１８６９４６、ｒｓ５５１２５２９６８、ｒｓ５６７０５５４２０、ｒｓ５７１０８７２９２、ｒｓ５６３１１０４８４、ｒｓ５６３１１７９９６、ｒｓ５７１０９９３３５、ｒｓ５６７０７６５１０、ｒｓ５７１１０７８３７、ｒｓ５５１２５８４０７、ｒｓ５５９０５１２４２、ｒｓ５３６７８９０９２、ｒｓ５６７１０１１５２、ｒｓ５５１５７７５２２、ｒｓ５５５０９８７６０、ｒｓ５５９０６３３２１、ｒｓ５５５４２７５５６、ｒｓ５６３１６５０５６、ｒｓ５６２８５２２６２、ｒｓ５６７１２５７８３、ｒｓ５４７２３１４３６、ｒｓ５６３１７２０４７、ｒｓ５３６５４６８４８、ｒｓ５５８８８３３００、ｒｓ５４０３５７３７１、ｒｓ５４３９９８５１０、ｒｓ５７０８５３８０８、ｒｓ５６６８２３１２８、ｒｓ５５１６２５７９６、ｒｓ５４０３７５０４９、ｒｓ５４０３８１６９６、ｒｓ５４０３８４８２３、ｒｓ５５１６３８８４９、ｒｓ５４７２４５４３９、ｒｓ５５５４８９７３０、ｒｓ５７０８７１６２１、ｒｓ５３６８４９６２８、ｒｓ５７１２０２８３６、ｒｓ５６２９４４６０２、ｒｓ５４０１３４０２５、ｒｓ５４０４０１５７８、ｒｓ５４０４０８５２６、ｒｓ５３６６１６４２２、ｒｓ５４７５９７４６４、ｒｓ５５１６６５２８５、ｒｓ５３６８７２３６３、ｒｓ５５５５２３９３２、ｒｓ５５５５２６１６９、ｒｓ５６７２０８１５７、ｒｓ５４７３０３２１７、ｒｓ５４０４３５２１３、ｒｓ５４０４４０７１８、ｒｓ５６３２８１９３５、ｒｓ５５５５６６４８４、ｒｓ５７１２７７８９６、ｒｓ５５８９３７６３６、ｒｓ５４３８３４０８５、ｒｓ５３６６３３８４８、ｒｓ５３６６４９７５５、ｒｓ５６７２６９４２９、ｒｓ５４４１０３２１３、ｒｓ５５５５９２４５９、ｒｓ５４７３３９６０６、ｒｓ５５１４０７７２５、ｒｓ５６７２７９２５２、ｒｓ５５５２４９３０３、ｒｓ５７０９８０９５７、ｒｓ５５５２９４５６３、ｒｓ５４７３９５０１１、ｒｓ５４７４０３２５３、ｒｓ５６３３５６８６１、ｒｓ５５５６４１１５６、ｒｓ５３６９７９５４５、ｒｓ５５５６４６８９６、ｒｓ５５１７３８２８４、ｒｓ５５５６４９７２２、ｒｓ５７１０２３６７８、ｒｓ５５１７４１７０１、ｒｓ５７１３５３３３３、ｒｓ５５５６５６６６８、ｒｓ５４３９０６０３０、ｒｓ５４０２４７９１５、ｒｓ５６３０６３０２３、ｒｓ５３６７１９６７５、ｒｓ５４７７３９７２４、ｒｓ５４７４３４７６５、ｒｓ５６３３９８９０７、ｒｓ５７１３７４５４４、ｒｓ５６３０８８２７０、ｒｓ５５１５１２２５６、ｒｓ５５５６９７６３３、ｒｓ５５５３５５３８６、ｒｓ５６７０５０９２２、ｒｓ５４０２８９９８６、ｒｓ５６３４２７８５０、ｒｓ５４７７８９５７２、ｒｓ５４０２９２３１９、ｒｓ５７１４１６９７２、ｒｓ５４０５９３９６７、ｒｓ５６３４４４５９５、ｒｓ５７１４２２７６６、ｒｓ５７１４３３２０９、ｒｓ５６７０８６１８１、ｒｓ５６７１０９８８５、ｒｓ５５５４３６９３７、ｒｓ５３６８１２８６１、ｒｓ５４７８２７９７２、ｒｓ５３６８１３８３６、ｒｓ５４０３５７２１２、ｒｓ５５１６１３７１３、ｒｓ５５５４５３５１５、ｒｓ５３７０９１２６３、ｒｓ５３６８４６４０４、ｒｓ５６７１６９３６８、ｒｓ５３６８５６８７６、ｒｓ５７１４８２３３７、ｒｓ５５１８１６８２７、ｒｓ５３６８５９８４７、ｒｓ５６３５１４６２４、ｒｓ５５１６６４０２５、ｒｓ５５５５３８８７１、ｒｓ５３７１１９６９８、ｒｓ５４４０９０５１６、ｒｓ５６３３００５９９、ｒｓ５３７１２１５０１、ｒｓ５４０６７３８５７、ｒｓ５５５８２７２５６、ｒｓ５３６９２９９７０、ｒｓ５７１５０８０８９、ｒｓ５７１５０８６６８、ｒｓ５３６９３５４８３、ｒｓ５５５５９２９４５、ｒｓ５４７６７９３４６、ｒｓ５５５８３６８６６、ｒｓ５５９１６６０１４、ｒｓ５７１３２３００７、ｒｓ５５１７２４３２６、ｒｓ５５５６３５７０２、ｒｓ５６７５０６５０２、ｒｓ５６７５０７７２４、ｒｓ５３６９７１３９９、ｒｓ５６３５６６９７０、ｒｓ５７１３５２５８３、ｒｓ５６３５６８３４７、ｒｓ５５１８４４２４２、ｒｓ５５９３４０４９７、ｒｓ５５１８４６２７８、ｒｓ５５１８４６７４３、ｒｓ５５９３４１８４１、ｒｓ５４７９３１２８６、ｒｓ５４４１５１１５０、ｒｓ５６３５７７７４５、ｒｓ５６３３８２７１３、ｒｓ５４７７３７３０３、ｒｓ５３６９９６８４６、ｒｓ５５９３６３１０６、ｒｓ５７１３６４１５２、ｒｓ５７１５５８４１０、ｒｓ５６３５９５２８０、ｒｓ５７１５６７９２８、ｒｓ５６７３５０４６５、ｒｓ５４０５６３２９３、ｒｓ５５５８９９４１６、ｒｓ５５５９０２０２３、ｒｓ５４０７５３２６４、ｒｓ５４７９７０４３１、ｒｓ５６７３６３２４８、ｒｓ５６３４１５２９５、ｒｓ５４７９８３９５１、ｒｓ５４４１７３３４０、ｒｓ５３７０４３７５２、ｒｓ５３７２１４４０６、ｒｓ５４７８１２２４６、ｒｓ５５１８７９４８０、ｒｓ５４７９９３８６８、ｒｓ５４８０００１０７、ｒｓ５７１４３５８０８、ｒｓ５６７４２０３５３、ｒｓ５５９４２４０９２、ｒｓ５４７８２３４８６、ｒｓ５６３４８３７１６、ｒｓ５４０６２９４４１、ｒｓ５４０６２９５１５、ｒｓ５５５９７６７７０、ｒｓ５５５７７７４４９、ｒｓ５５１８０９５８９、ｒｓ５６７４４６７１６、ｒｓ５６７６４１８１５、ｒｓ５６７６４６５２８、ｒｓ５７１６６０２７９、ｒｓ５５９２６１００６、ｒｓ５４４３４９３５６、ｒｓ５４８０６５８５０、ｒｓ５４０８４０３４６、ｒｓ５５９２７６３３１、ｒｓ５５９２７８４８３、ｒｓ５５１９２８４４０、ｒｓ５６７６８９３５７、ｒｓ５５１９２９３１０、ｒｓ５５９２７９８１０、ｒｓ５７１５０４２４２、ｒｓ５３７３１８８２７、ｒｓ５４７８９５４７３、ｒｓ５５１９４０２９２、ｒｓ５５９５３２８７５、ｒｓ５４７８７８５４０、ｒｓ５５６０６５１５７、ｒｓ５３７３４５５３２、ｒｓ５４４３８８７６２、ｒｓ５４４３９３１３０、ｒｓ５４０８９５２４１、ｒｓ５４０８６６５１９、ｒｓ５４４２５７３１１、ｒｓ５５９５５６８３７、ｒｓ５５９３０９４５３、ｒｓ５４７８９９９１３、ｒｓ５７１７５３７２６、ｒｓ５６３７４６３８７、ｒｓ５６７７６１５６８、ｒｓ５６３７５７４５７、ｒｓ５３７３７９６５４、ｒｓ５６７４９８４７１、ｒｓ５４４４２７６７１、ｒｓ５４４２６２３５３、ｒｓ５５６１２１６６９、ｒｓ５４０６９０６４７、ｒｓ５５６１２７２９７、ｒｓ５５９５９８６９８、ｒｓ５５９６０６５４１、ｒｓ５３７４０５４８９、ｒｓ５５９３２１２７９、ｒｓ５４０７０６１６９、ｒｓ５５１９８７８３４、ｒｓ５５９３３７０１０、ｒｓ５５９３４７６２６、ｒｓ５４４４６５９６５、ｒｓ５７１５５０１７９、ｒｓ５６３８０６８４２、ｒｓ５４８２３０１３７、ｒｓ５４０９８６５３８、ｒｓ５４４４８７５２８、ｒｓ５４０７２８０１５、ｒｓ５７１８５０２２３、ｒｓ５５６１９７８８１、ｒｓ５５５８８４１３２、ｒｓ５４７９４９４１４、ｒｓ５４１００１７０９、ｒｓ５６７８６３７０１、ｒｓ５５９３７２７９６、ｒｓ５５９６８０９５９、ｒｓ５５２０１９６４４、ｒｓ５６７８６９２０３、ｒｓ５６７８７０４５４、ｒｓ５４７９６１０９９、ｒｓ５４１０１６８５５、ｒｓ５６７８７９１２５、ｒｓ５４１０２１３３９、ｒｓ５７１５８６５２２、ｒｓ５４４５２２４７６、ｒｓ５４０７６７３２３、ｒｓ５５５９２１１３５、ｒｓ５３７４８２３８６、ｒｓ５７１５９４２２０、ｒｓ５４８２８５６４３、ｒｓ５４７９８９８６６、ｒｓ５５６２５３８８５、ｒｓ５６３８７１３６４、ｒｓ５７７０３３７１０、ｒｓ５６７５９９０３８、ｒｓ５４４３２１８８０、ｒｓ５７１６２０１３８、ｒｓ５７２８８４６８８、ｒｓ５３７２４３２７１、ｒｓ５４０８０８５８１、ｒｓ５７１６３７８５３、ｒｓ５４８０３６８１５、ｒｓ５５９４５１８５４、ｒｓ５６７９３６０７１、ｒｓ５７２８９５４７４、ｒｓ５７７０５４７２７、ｒｓ５７１６５０３８３、ｒｓ５５９７６７０９７、ｒｓ５４８３３６２１５、ｒｓ５６３８９６０２８、ｒｓ５５６３０５０５３、ｒｓ５７７０６８４８０、ｒｓ５５５９９５５３４、ｒｓ５５６３０９００１、ｒｓ５７７０７０７４２、ｒｓ５４８３４４３７２、ｒｓ５４０８４４５９５、ｒｓ５６７９５９６６９、ｒｓ５６７９６１７５４、ｒｓ５７１６８８００１、ｒｓ５３７３１３７８５、ｒｓ５４８０９５６１７、ｒｓ５５９７９１４３２、ｒｓ５５１９４６１９４、ｒｓ５７１９８８５４２、ｒｓ５７７１０５０７６、ｒｓ５７７１０６９９７、ｒｓ５７１９９５７７０、ｒｓ５６７７３０９２５、ｒｓ５５９８１４８３７、ｒｓ５４８３９０００３、ｒｓ５６３９３４６１５、ｒｓ５４８３９６９３２、ｒｓ５４４６４００７４、ｒｓ５５６０７９２３６、ｒｓ５５９５６０２３１、ｒｓ５７１７５０９６５、ｒｓ５７７１２８６０１、ｒｓ５４４４２６２４３、ｒｓ５６８０１１１２０、ｒｓ５６８０１３２０９、ｒｓ５４０９２８６７８、ｒｓ５７２０３４１０２、ｒｓ５５２１３１４９６、ｒｓ５５６１２２５０２、ｒｓ５６８０２２１９５、ｒｓ５５６１４５２９４、ｒｓ５３７４１２５８３、ｒｓ５６３７９４５２１、ｒｓ５４８２０６３６６、ｒｓ５７２０５２３３７、ｒｓ５６８０４１８０７、ｒｓ５７１８３１０５２、ｒｓ５６８０４９１８９、ｒｓ５６８０５８４２８、ｒｓ５７３０３０６２４、ｒｓ５４４４８９１０８、ｒｓ５５２１７０２５９、ｒｓ５４８２４７４８９、ｒｓ５６３８２８７０７、ｒｓ５６８０７８１１４、ｒｓ５５６２１２４４０、ｒｓ５７２０８８８９４、ｒｓ５５２０２１８１５、ｒｓ５４８２７４３６２、ｒｓ５４４５２３５４８、ｒｓ５６３９９０４１３、ｒｓ５５６２３５４６４、ｒｓ５４４５２９８８３、ｒｓ５７１９０３５５１、ｒｓ５４８３０９１３０、ｒｓ５７３０７７５０２、ｒｓ５７２１０６６６４、ｒｓ５６８１１０４３５、ｒｓ５５９９５５６８６、ｒｓ５６７９２４５２５、ｒｓ５７２１１２４４２、ｒｓ５６７９２６４２４、ｒｓ５７７０４５３５４、ｒｓ５５２２３４７９０、ｒｓ５７３１１３４０１、ｒｓ５５２０５８０６８、ｒｓ５６８１４８８１１、ｒｓ５７３１２１３６７、ｒｓ５４８５５０２５３、ｒｓ５５９９９８６３８、ｒｓ５５６２８７１４５、ｒｓ５７１９３８００５、ｒｓ５４８５５８８７２、ｒｓ５７２８９０６８４、ｒｓ５７７２９０９５５、ｒｓ５７７２９２２６１、ｒｓ５７２１５０７１４、ｒｓ５５９７６５２１６、ｒｓ５７２１５５６７２、ｒｓ５７２１５８４７１
、ｒｓ５４４５８６９４８、ｒｓ５７２９１３９５９、ｒｓ５７３１６０６０１、ｒｓ７４７７１２９８５、ｒｓ５６００４３６３２、ｒｓ５７３１６７２００、ｒｓ５６３９０７５０２、ｒｓ５７１９７３０１５、ｒｓ５５６５２６０２４、ｒｓ５５６３２７３５３、ｒｓ５６７９７５９４９、ｒｓ７６０１９８８４０、ｒｓ７６０２１０４１９、ｒｓ５７３２０５８６２、ｒｓ５６００８８４１９、ｒｓ５４４６２３１０２、ｒｓ７５５８４５９７４、ｒｓ７６０２２２８６１、ｒｓ７４７７７０５６４、ｒｓ５４４６４０９５４、ｒｓ５６０１０６８７９、ｒｓ５６８２６６５９３、ｒｓ７５５８６３１１４、ｒｓ５７３２３５１９４、ｒｓ５６８２７４８７６、ｒｓ５４４６４０９６６、ｒｓ５６４１０１４６２、ｒｓ５６０１０３７１７、ｒｓ７４７７９３５５１、ｒｓ７６０２４８０３６、ｒｓ７５１６６３２９４、ｒｓ７５１６６４３４５、ｒｓ５７７３６２４６７、ｒｓ５７７３６９９５０、ｒｓ５７３２４８７６４、ｒｓ５６０１２５２６５、ｒｓ５６０１３９００２、ｒｓ７４７８０３００１、ｒｓ７５５８８７９０４、ｒｓ５６４１１０４３２、ｒｓ５５６３６７８２６、ｒｓ５６３９４２８８７、ｒｓ５７２９８５３３５、ｒｓ７６０２６９０２８、ｒｓ７６０２７０８３９、ｒｓ５７３２６９７２６、ｒｓ５７３２７４９８９、ｒｓ７５５９１１７２８、ｒｓ５６８３１８９５３、ｒｓ５６８０２１７５７、ｒｓ５５２１３５６７９、ｒｓ７５１７０７４０８、ｒｓ５４８４２６８４６、ｒｓ５４８４３４４１８、ｒｓ５６４１３９３４２、ｒｓ５７２０５１５９１、ｒｓ５５２１５３２５９、ｒｓ５７２０７２２７４、ｒｓ７５１７１５９５９、ｒｓ５７７１８８０６２、ｒｓ５６４１４６９８０、ｒｓ７４７８４８５５９、ｒｓ５６８３４１５３６、ｒｓ５５９９０８０８１、ｒｓ５５２１８８１２４、ｒｓ７５５９３９０２１、ｒｓ５７７２０６７６４、ｒｓ７６０３１７５２１、ｒｓ７５５９４８７３６、ｒｓ７５１７４３００６、ｒｓ５４８４７６３８６、ｒｓ７４７８７２８２７、ｒｓ５６８３６９１９７、ｒｓ７５５９６０８１５、ｒｓ７５１７５４５５３、ｒｓ５６０２２３９７４、ｒｓ５４８４７９６８５、ｒｓ７５５９７４１６８、ｒｓ５５６４３５０３７、ｒｓ５５２１９６５９６、ｒｓ７４７８９６１２６、ｒｓ５６０２４４１６８、ｒｓ７４７６５２０３１、ｒｓ５７７２２４２３５、ｒｓ５６０２５８６４６、ｒｓ５６４２２２５７１、ｒｓ７４７９１９９２０、ｒｓ７４７９２０６９８、ｒｓ７５１７９９８６５、ｒｓ５６４２３２８０３、ｒｓ５５９９６１８１４、ｒｓ５７３０９４１７４、ｒｓ５６８１３２９７２、ｒｓ５５６４７７５６５、ｒｓ５７３１２５２１２、ｒｓ７６０３９２１１１、ｒｓ７５１８１１６５７、ｒｓ７４７９３５７６７、ｒｓ５６４０３４７１３、ｒｓ７４７６８７６３２、ｒｓ５７３４０３７７６、ｒｓ５６８４４０７２１、ｒｓ５７３４０７０１１、ｒｓ５６８４４３１７５、ｒｓ７５６０３０６０８、ｒｓ７５６０３３４１５、ｒｓ７６０４０８４１４、ｒｓ５６８１８１８６２、ｒｓ５７７３０６８３５、ｒｓ７５６０４１９１０、ｒｓ７５６０４６０５２、ｒｓ７６０４２２０７７、ｒｓ７５１８４３７３８、ｒｓ５５６５１０８０１、ｒｓ５６００５１４３５、ｒｓ５６４２８６０２１、ｒｓ５７２３７８２０８、ｒｓ７４７９８４５９４、ｒｓ７４７７２２１３４、ｒｓ５６００６９３５２、ｒｓ７６０１９７６０４、ｒｓ５６０３４２８７８、ｒｓ７４７７５８５４４、ｒｓ７５５８８０９１２、ｒｓ５６４３１５５５６、ｒｓ７４７８０２８４２、ｒｓ５６４３１９６７４、ｒｓ７４８００１６４９、ｒｓ７５６０９７７０５、ｒｓ７５６１０１８８３、ｒｓ７４７８０６３５０、ｒｓ５６４３２７１２６、ｒｓ７５１８９５１７２、ｒｓ５６０３６７８４３、ｒｓ５７３２６３０３４、ｒｓ７６０２６８０５２、ｒｓ５６８５２６６５５、ｒｓ７４８０２３５９０、ｒｓ７５５９１９５３７、ｒｓ５７２２６０３６４、ｒｓ５７７５５５４４５、ｒｓ５７３２９４７２２、ｒｓ５６０３９４９２１、ｒｓ５７３５１０４４６、ｒｓ７５６１３３８７６、ｒｓ７４７８３９３１２、ｒｓ７６０５１１５２１、ｒｓ５６４３７０７７５、ｒｓ５６４３７６２４８、ｒｓ５６４３７６３６４、ｒｓ５６４１３９６８２、ｒｓ５６８５６３５５６、ｒｓ７５６１５２３８５、ｒｓ７４７８４０１７２、ｒｓ７４８０６６２６０、ｒｓ７５５９２７８５０、ｒｓ５６８５７２６７９、ｒｓ７５６１６４０９２、ｒｓ７６０５３４８９０、ｒｓ５７３３００６４７、ｒｓ７５５９３４９４５、ｒｓ５７７５９２２６２、ｒｓ５６４４０６７７０、ｒｓ５７２４５７５４７、ｒｓ７６０５５２０７６、ｒｓ５６８５９１０８３、ｒｓ７５６１８８５３８、ｒｓ５７３３０８９２６、ｒｓ７６０５６２９９８、ｒｓ７６０５６３１２１、ｒｓ７６０５７０１１８、ｒｓ７４８１１１９９９、ｒｓ５６０１９８８０５、ｒｓ７６０５７９６８５、ｒｓ７５６２１６３８８、ｒｓ７４７８７２２２５、ｒｓ５６４１８９０２１、ｒｓ５６０２３３３２４、ｒｓ７５２００８９９４、ｒｓ７６０３５４０８９、ｒｓ７５１７７８１１６、ｒｓ５７３３６１９０８、ｒｓ５６４２３３５９７、ｒｓ７６０３８５２９７、ｒｓ７５６２３５２５６、ｒｓ５７３６１４１８９、ｒｓ５６４４６７００６、ｒｓ５６０２７５７７２、ｒｓ７５６０１７９６９、ｒｓ７５１８１０６５６、ｒｓ７５６２５３７３５、ｒｓ７５２０３９２２６、ｒｓ７６０３９６４６０、ｒｓ７４８１６１６４７、ｒｓ５７３６３９３３８、ｒｓ７５２０４９７１４、ｒｓ５６４２４６７４１、ｒｓ７５６２８３４６２、ｒｓ７５６０３６７６８、ｒｓ７５２０７５００１、ｒｓ７５１８３１４９６、ｒｓ５６８４６７０２３、ｒｓ５６０５５２８６９、ｒｓ５６４２８３４８６、ｒｓ５７３４５４３６８、ｒｓ７５１８６８８４９、ｒｓ５７３４５６１８５、ｒｓ７５６０８３９６０、ｒｓ５７３６８０１６７、ｒｓ７６０６６４３１９、ｒｓ７５１８７５４０６、ｒｓ７５２０９０２８９、ｒｓ５７２３９６３３２、ｒｓ５６８７１００９８、ｒｓ５７３６９１５８８、ｒｓ７５６３１４６９１、ｒｓ５６８７１４２９４、ｒｓ５６０５７３４７７、ｒｓ５７３６９９３８３、ｒｓ７５６３２３２０６、ｒｓ７６０４７１８９９、ｒｓ７６０４７９５０１、ｒｓ７５１８９８７６４、ｒｓ５６８５３４４３５、ｒｓ７５２１１６１０３、ｒｓ７４８０３４７７３、ｒｓ７６０５０４７４５、ｒｓ５６０６００４６３、ｒｓ７６０７０８４８１、ｒｓ７６０７１４８１９、ｒｓ５７３５１４３８６、ｒｓ５７２５５７４１４、ｒｓ５７２５５７９５８、ｒｓ７４８２５４８６８、ｒｓ５６４３７７２７５、ｒｓ５６８７６２６０４、ｒｓ５６８７６３１９４、ｒｓ５６４５８９０２３、ｒｓ７４８０６１０１６、ｒｓ７５６１６２２４５、ｒｓ７５６１６６５７７、ｒｓ５６８７７１００６、ｒｓ５７２４４６６１８、ｒｓ７５１９７９７２９、ｒｓ７６４６０１９１２、ｒｓ７６４６０５５１７、ｒｓ７６０７４１４６５、ｒｓ７４８１１４０５９、ｒｓ５６８６２００７７、ｒｓ７５６３８３６９０、ｒｓ７５６３８４８７１、ｒｓ７５６３９１４００、ｒｓ５６８７８８８８１、ｒｓ７５６２１７８８８、ｒｓ７６０５８８７９８、ｒｓ５７３６０２７５０、ｒｓ７５２１８０１３８、ｒｓ５６４６２３７７８、ｒｓ７６４６２７８２１、ｒｓ７４８２９９５０３、ｒｓ７６４６２９９１０、ｒｓ７４８１３０６５１、ｒｓ５７３７８４８６１、ｒｓ７５６４０８３９３、ｒｓ７６０５９５８６４、ｒｓ７５６２３２７２４、ｒｓ７６０７７３４１２、ｒｓ５６４４６３９１５、ｒｓ５７２４９６２６０、ｒｓ５６８６５３５９８、ｒｓ７５６２５１５５９、ｒｓ７６０７７９０２２、ｒｓ７６０７８１５３９、ｒｓ５７３６３５９８２、ｒｓ５７３６５２５４９、ｒｓ７６４６５４４６４、ｒｓ７６４６５４９８７、ｒｓ７５２０６８７５３、ｒｓ７６９３０５４５３、ｒｓ５６８６９２９１８、ｒｓ５７２６１９９９１、ｒｓ５７３８３２７０４、ｒｓ５７７６６５１６０、ｒｓ５７７７６１３７０、ｒｓ７５６４６６４１２、ｒｓ５７７６６５６０９、ｒｓ７６４６９０７４７、ｒｓ７６９３２９２６４、ｒｓ５７３８５２８８８、ｒｓ５７３６７５２８６、ｒｓ７４８１９６０３７、ｒｓ７４８３６７８７５、ｒｓ７５６３００６６２、ｒｓ７４８１９７７４９、ｒｓ７６９３５９３９１、ｒｓ７４８２０３４３２、ｒｓ７６０８６３００９、ｒｓ７５２０９１１９８、ｒｓ７４８２２３１８７、ｒｓ７７３８９８３６８、ｒｓ７７３８９９８３４、ｒｓ７６０８８７５１２、ｒｓ７６９３９７９４３、ｒｓ５７２５４５２６３、ｒｓ７４８２３００１２、ｒｓ５６０５９１０９６、ｒｓ７６０７０２０９５、ｒｓ７５６５４７２２１、ｒｓ７６９４０３６０５、ｒｓ５７３９１６６１１、ｒｓ７６９４０５３７３、ｒｓ５７７６９１８２１、ｒｓ７６０８９９１３５、ｒｓ７６０７１４９１６、ｒｓ７６４７７８７１０、ｒｓ５６８７５９５５５、ｒｓ５６０６２６８０９、ｒｓ５７７７０８４２４、ｒｓ７６０９１３８９３、ｒｓ７６０７３１０２２、ｒｓ７６９４２８０８７、ｒｓ７５２１５１３０７、ｒｓ５７３９４２９４０、ｒｓ７５６５８２０５９、ｒｓ７６０９２６０９２、ｒｓ７４８４５６９１３、ｒｓ７７３９５７５６２、ｒｓ７５６３７４８０６、ｒｓ７５２３５５３３５、ｒｓ７５２１６４９４０、ｒｓ７７３９６１８５３、ｒｓ７６４８１６９２７、ｒｓ７６９４５３５７７、ｒｓ７４８２８０５７７、ｒｓ７５２１７６０１４、ｒｓ７４８４７２９７９、ｒｓ７４８２９２６９３、ｒｓ７７３９７３８４９、ｒｓ７５６３９６６７８、ｒｓ７４８４７７１２３、ｒｓ７６４８３１５２２、ｒｓ７７３９８６２９６、ｒｓ７６９４７５８９７、ｒｓ７７３９８９４９４、ｒｓ７４８４８８８７４、ｒｓ７６０９６２５２９、ｒｓ５７３９８９２６０、ｒｓ７６４６３００００、ｒｓ５７７７３１３５８、ｒｓ７６４８６００９１、ｒｓ７６０９７８５３０、ｒｓ７６４８６４８４４、ｒｓ７７４０１０５９９、ｒｓ７６０９８２３１８、ｒｓ７５６６４６３８７、ｒｓ７５２１８９４８３、ｒｓ７５２４１０６４０、ｒｓ７７４０２１５０６、ｒｓ７６４６４２３１７、ｒｓ７５６６６０４７１、ｒｓ７５２４１８４５０、ｒｓ７５６６６５１６１、ｒｓ７６０７７５１２８、ｒｓ７５２４２５８９０、ｒｓ５７３７９５４０７、ｒｓ７６９２７４４９５、ｒｓ７４８５３６４４５、ｒｓ７７４０４２５４０、ｒｓ７７４０４８０８５、ｒｓ７４８５４５５５５、ｒｓ７６４９０４９０６、ｒｓ７６９２８０９７２、ｒｓ７６４６５２２８７、ｒｓ７５６４４０４２５、ｒｓ７６０８１１１０２、ｒｓ７５２４４７２５３、ｒｓ７５２２３５４５６、ｒｓ７６１０３２０８８、ｒｓ７６９５５５２３９、ｒｓ５７２７９６３７５、ｒｓ５７４０５８３２２、ｒｓ７７４０６８８０７、ｒｓ７５６７０５５９１、ｒｓ７４８３４９７７８、ｒｓ７６９３３６３７３、ｒｓ７６９３３８１４３、ｒｓ５７２８０６７０３、ｒｓ５７７７７４０２２、ｒｓ７６４９３９２５６、ｒｓ７５６７２０３７４、ｒｓ７６４９４５４３７、ｒｓ７４８５８２０８５、ｒｓ７６４９４５９８２、ｒｓ７５２４７６２５１、ｒｓ７６０８４１３５３、ｒｓ７５６５１３８９３、ｒｓ７６４９５０８７６、ｒｓ７５２２８７８３９、ｒｓ７５６７２９３０６、ｒｓ７５２２９７７８７、ｒｓ５７２６６９９３７、ｒｓ７４８５９８４１６、ｒｓ７７４１０６００５、ｒｓ７６９３９９９５２、ｒｓ７６４９６５５０７、ｒｓ７５２３１１３１６、ｒｓ７５２４９７０１６、ｒｓ７５６７４６８７６、ｒｓ７７３９１１２６６、ｒｓ７５６７５１０９４、ｒｓ５７７９７５７９８、ｒｓ７６９４０６２６６、ｒｓ５７４１１３２１６、ｒｓ７５６７６０４８６、ｒｓ７７３９２３４４７、ｒｓ７６４９８８７１９、ｒｓ７７４１３４０６０、ｒｓ５７７８１７７６１、ｒｓ５７４１２３６０８、ｒｓ５７７８１９８５０、ｒｓ７５６７７４３７６、ｒｓ７４８４４１１５７、ｒｓ７６９４２７９６３、ｒｓ７６９６３５９４８、ｒｓ５７７８２８６５６、ｒｓ７７３９６０１６１、ｒｓ５７２７０３
３９２、ｒｓ７７４１６１４７５、ｒｓ７７４１６６３６３、ｒｓ７６９６５５３０３、ｒｓ５７３９６４９３１、ｒｓ７５２３６０９３８、ｒｓ７５６８０１７６６、ｒｓ７６５０３０１１２、ｒｓ７５６６０７２３８、ｒｓ７７３９７５６６０、ｒｓ７６９６６３３２３、ｒｓ７６９４８５８０８、ｒｓ７６５０３８５８２、ｒｓ７６９４８９９３０、ｒｓ７５２４０４５５７、ｒｓ７６０９９３３２７、ｒｓ５７７８９１６１５、ｒｓ７５２５７０５１９、ｒｓ７５６６６９２７７、ｒｓ７６９５２６８３３、ｒｓ７５２５７７８７２、ｒｓ７５６６８６２２１、ｒｓ７５２５７９２７０、ｒｓ７６５０５５７５０、ｒｓ７７４０５３６３９、ｒｓ７７４０５６４６３、ｒｓ７６９５４７３７４、ｒｓ７６５０６０４５１、ｒｓ７５６８３４３３６、ｒｓ７６９６９７３５０、ｒｓ７４８６８８０７４、ｒｓ７６９５５２３３０、ｒｓ７６１１７６５３８、ｒｓ７４８５６９２７７、ｒｓ７６４９３１３７６、ｒｓ７５２６０２１０２、ｒｓ７４８５７０６０４、ｒｓ５７７９３８２３３、ｒｓ７６５０７９５３７、ｒｓ５７２８２１８２８、ｒｓ７６９７１４７２５、ｒｓ７６９７１５２６３、ｒｓ７４８７０２４５５、ｒｓ７７８９４６７０２、ｒｓ７６１１９４０６６、ｒｓ７６９５８４０９３、ｒｓ７６９７２８３８３、ｒｓ７６９５８４７３９、ｒｓ５７４２２６２５８、ｒｓ７５６７３３８９５、ｒｓ７５２６２３５３７、ｒｓ５７２８３１８３５、ｒｓ７６９７３７８３９、ｒｓ７４８７２４５８３、ｒｓ７６９７５１８２１、ｒｓ７６４９６３６４６、ｒｓ５７４２５１２６８、ｒｓ７５６７４４３７２、ｒｓ５７４２５２８６１、ｒｓ７７８９８５９２５、ｒｓ５７２８４３３０９、ｒｓ５７２８４７８５８、ｒｓ７６５１３００６５、ｒｓ７７８９９５８４８、ｒｓ７４８６２０８８５、ｒｓ７７４１３５１５６、ｒｓ７６１１０２７０８、ｒｓ７４８６３４６３９、ｒｓ７７８８５８３９６、ｒｓ７６９６４０３６１、ｒｓ７４８６３８８３８、ｒｓ７５６９２４７２９、ｒｓ７６９７８９９９１、ｒｓ７７４１６００５８、ｒｓ７６５０２５３７８、ｒｓ７７８８８００７５、ｒｓ７４８７７４３７５、ｒｓ７６５０３０７４９、ｒｓ７５２５６０４３５、ｒｓ７４８７７９７３０、ｒｓ７６１２７２１１７、ｒｓ５７４１６８１０８、ｒｓ７６１２７５４７４、ｒｓ７７４３３１０２９、ｒｓ７４８６６５１８５、ｒｓ７５２５６９１８９、ｒｓ７６１２８５６７８、ｒｓ７７４３３６５９３、ｒｓ７７４３３７２４８、ｒｓ７７４１８６１５９、ｒｓ７６９８２５００５、ｒｓ７７４１８６３１２、ｒｓ７６５０４６３４０、ｒｓ７６５１９７０３７、ｒｓ７４８８０４６９７、ｒｓ７７４１９２７３９、ｒｓ７７４３４７８３４、ｒｓ７５２７１９１９４、ｒｓ７６５０５３３７６、ｒｓ７７４３５３２４３、ｒｓ７６９６８６９３６、ｒｓ７５２５８４４６９、ｒｓ７６９６８９１６５、ｒｓ７６１１７５７３５、ｒｓ７４８８２１４４６、ｒｓ７７４２１６４０８、ｒｓ７７９０８５５６６、ｒｓ７５６９９２６７４、ｒｓ７５２６００３２５、ｒｓ７７９０９１２５７、ｒｓ７５６８４８６００、ｒｓ７７４２２３７２６、ｒｓ７６９８６４５１６、ｒｓ７５７００２６２０、ｒｓ５７８０７２５２０、ｒｓ７５２６１８４９２、ｒｓ７７８９５５４０８、ｒｓ７４８７１５７６０、ｒｓ７５６８７６８６２、ｒｓ５７８２２５０５０、ｒｓ７６１３４１１９０、ｒｓ７７４３９１５６２、ｒｓ７５７０１４６９２、ｒｓ７６１２２２５２２、ｒｓ７７９１１５３４６、ｒｓ５７４３７１００１、ｒｓ７６１３４９５９３、ｒｓ７４８８５４０１７、ｒｓ７７４４０５５１９、ｒｓ７７４４１４６０９、ｒｓ７６９７５６２８２、ｒｓ７６９９００２７９、ｒｓ７６５２６９４１９、ｒｓ５７８２４８３２５、ｒｓ７５７０３９０２０、ｒｓ７７９１４２１５２、ｒｓ７６５２７３８１０、ｒｓ７６１３６８４６２、ｒｓ７５２６４７５４６、ｒｓ７５２６４８２５４、ｒｓ７４８７４７２２２、ｒｓ５７８１２９０６４、ｒｓ７６１３７６０７１、ｒｓ７５２７９３６４３、ｒｓ７７９１５５９５４、ｒｓ７５６９１２５７０、ｒｓ７６１２４２８５３、ｒｓ５７８１３３９６０、ｒｓ７７９００８５８８、ｒｓ７６５１４７９２８、ｒｓ７６５１５７９２４、ｒｓ７６１３８７８９６、ｒｓ７６５２９８８６３、ｒｓ５７４２８９１８４、ｒｓ７４８９０００４２、ｒｓ７４８９００３５９、ｒｓ７４８９０３６４７、ｒｓ７６５１６１１７９、ｒｓ７７９１８２２８５、ｒｓ７７４４５７８９３、ｒｓ７７９１８４６２３、ｒｓ７７４４６２２４３、ｒｓ７６９９４７４５５、ｒｓ７６１２６８１８５、ｒｓ７７４３１５９３３、ｒｓ７６９８０７４６７、ｒｓ７５７０８２６１３、ｒｓ７７９１９８４３２、ｒｓ５７４３１３１２２、ｒｓ５７４３１３７３４、ｒｓ７７４４７４１４１、ｒｓ７５６９６２５９２、ｒｓ７６９９６２６９５、ｒｓ７６５３３６６２６、ｒｓ５７８１７９９９５、ｒｓ７５２７１１４１１、ｒｓ５７４４５８９１３、ｒｓ７６９９７６７２８、ｒｓ７７４４９１７３３、ｒｓ７６９９７７８９７、ｒｓ７７４４９２６３４、ｒｓ７７４４９３５３４、ｒｓ７７９２２２３８４、ｒｓ７７４４９５１６４、ｒｓ７５２７１５１１０、ｒｓ７６１４４３９５６、ｒｓ７６５３５３１１０、ｒｓ７６１４４８０８３、ｒｓ７４５３０７８００、ｒｓ７５６９７７７７１、ｒｓ７６１３０９５２５、ｒｓ７７９０７７３２９、ｒｓ５７８１９６４３６、ｒｓ７７４５１９４４１、ｒｓ７７０００４９７０、ｒｓ７６１３１５６８７、ｒｓ７６１３１６７７０、ｒｓ５７４４９５５３０、ｒｓ７７４５２９５２７、ｒｓ７６１３２１０５０、ｒｓ７７４５３０２５２、ｒｓ７６５３８６９８６、ｒｓ７４８９７３６２６、ｒｓ７４８９７３６２７、ｒｓ７５７１３３４６３、ｒｓ７４８８２８２２５、ｒｓ７６５２３０６９５、ｒｓ７７９２６６０９９、ｒｓ７５２７４８７９３、ｒｓ７５７１３６６７５、ｒｓ７７４３８３８７６、ｒｓ５７４５０８３９２、ｒｓ７７９２７２５６９、ｒｓ７７４３８４８７４、ｒｓ７６９８７１２８２、ｒｓ７７００２９０２９、ｒｓ７７４５４７２９８、ｒｓ７６９８７４１３３、ｒｓ７６５２４７０６５、ｒｓ７７４５５０８７４、ｒｓ５７４３８９９３７、ｒｓ７７９２８３２３６、ｒｓ７７９１４７２５０、ｒｓ７５７１５５４０４、ｒｓ５７８２５７３８８、ｒｓ７６１５０２５４４、ｒｓ７５７０５０８４５、ｒｓ７７００４７２４７、ｒｓ７６５４１９０８３、ｒｓ７６１５０５２７３、ｒｓ７７４５６７２１７、ｒｓ７４９０１１１９６、ｒｓ７４９０１５８７６、ｒｓ７５２７９３１０９、ｒｓ７４８８８３５６０、ｒｓ５７４５５２０１４、ｒｓ７５７１７６１３６、ｒｓ７４５３６９３８５、ｒｓ７４８８８５７６８、ｒｓ７７００７０４１９、ｒｓ７６１５３０５０７、ｒｓ７６５４５１７９３、ｒｓ７５７０５８１１７、ｒｓ７５７０５８３７３、ｒｓ７６１５３６６３３、ｒｓ７６５２９５４６４、ｒｓ７７４４４２２１８、ｒｓ７４５３９０１２２、ｒｓ７５７０６７３４０、ｒｓ７６５３１１７０３、ｒｓ７６５３２２３９８、ｒｓ７６１４１５７１１、ｒｓ７７９１９５２２７、ｒｓ７７９２００５９５、ｒｓ７７９３４５８４６、ｒｓ７５２８２５５４１、ｒｓ７６９９６０５８７、ｒｓ７６５４７５４２７、ｒｓ７６９９６７１１６、ｒｓ７４８９２７６０５、ｒｓ７７９２２５７６５、ｒｓ５７４５８６３９８、ｒｓ７５２９４１０１１、ｒｓ７７０１２２７２０、ｒｓ５７４５９６７９５、ｒｓ５７４５９７４４５、ｒｓ７６１４５５１０３、ｒｓ７５７１１８２２９、ｒｓ７７９３８２９０５、ｒｓ７７９３８３１１２、ｒｓ７４５４２９３３８、ｒｓ７４５３１２５９５、ｒｓ７６１４６２９４０、ｒｓ５７４４９１６７３、ｒｓ７６１５９７１９４、ｒｓ７６１５９９４９４、ｒｓ７５７２４３３３３、ｒｓ７７９４１０３７０、ｒｓ７７９４１２８４３、ｒｓ７６１４６６８８０、ｒｓ７５２９７５２４０、ｒｓ７６５５３９３１５、ｒｓ７４５４５７４０４、ｒｓ７６５５４０３６２、ｒｓ７７４６８６２１０、ｒｓ７６５５４６３８６、ｒｓ７７０１７９１８３、ｒｓ７６１６１６０８１、ｒｓ７４８９７１０９３、ｒｓ７６５３８９９４８、ｒｓ７４９１２６７７９、ｒｓ７５７２６９２５１、ｒｓ７７０１９７２１７、ｒｓ７７００２０４１８、ｒｓ７７４５３６５７８、ｒｓ７４９１３４１０８、ｒｓ７７０２１０５４５、ｒｓ７７００２３１９８、ｒｓ７７４５４５３１４、ｒｓ７４９１３８８０１、ｒｓ７７９２７４５４７、ｒｓ５７４６７７２６８、ｒｓ７７００３０７４５、ｒｓ７６５５８６１７６、ｒｓ７５３０１２９５８、ｒｓ７６１６５５９３９、ｒｓ７５３０１７５５０、ｒｓ７５７２９４７７２、ｒｓ５７４５１５８３７、ｒｓ７４５５０６４０８、ｒｓ７４５３４３１８１、ｒｓ７５７３０２６５７、ｒｓ７５３０２７９８８、ｒｓ７５７１５５２３２、ｒｓ７７０２５１２０３、ｒｓ７４９０００６８９、ｒｓ７７４７６０３７８、ｒｓ７６５６２３５０５、ｒｓ７４５５３２９７２、ｒｓ７７００４６５７３、ｒｓ７７００６０３７５、ｒｓ７６１６９８３１７、ｒｓ７４９０２０５５１、ｒｓ７６１７００７５９、ｒｓ７４５５４２４９５、ｒｓ７４９１９３６６３、ｒｓ７７９３１６４９５、ｒｓ７７０２７６９７６、ｒｓ７４５５４５４８３、ｒｓ７７４７８３３０９、ｒｓ７５２９１２８７４、ｒｓ７５７３３８５３８、ｒｓ７５２９１４３０３、ｒｓ７４５５５０５８７、ｒｓ７４５５５２４１３、ｒｓ７４５５５５７０４、ｒｓ７５２９１８９０８、ｒｓ７７００８８７１５、ｒｓ７４９０４４３６１、ｒｓ７４９０４５５４３、ｒｓ７７９５３８７１８、ｒｓ７７４８０３６１０、ｒｓ７５７３５５６３１、ｒｓ７４９０４５８０２、ｒｓ７６１７３００８５、ｒｓ７４９０４６６７０、ｒｓ７６５６７０４１４、ｒｓ７５３０８６８２０、ｒｓ７７００９７５９５、ｒｓ７４５５７８４８５、ｒｓ７７４８２０１３７、ｒｓ７６１７４２２２８、ｒｓ７５７３７１５５５、ｒｓ７７４６１１５９１、ｒｓ７６１７４３８６５、ｒｓ７４５５８２７４３、ｒｓ７７０３２０９９４、ｒｓ７６５６８４７２４、ｒｓ７７０１０１３１２、ｒｓ７７９３４９６０３、ｒｓ７６１７５１８９１、ｒｓ７７４８３０３２４、ｒｓ７６１７５２２７５、ｒｓ７７９５７５３８４、ｒｓ５７４７５２９１１、ｒｓ７５７３８２０９４、ｒｓ７６５４７７３７７、ｒｓ７５２９３３９４９、ｒｓ７４９２５０６２２、ｒｓ７４５５９９００５、ｒｓ７５３１０５６３９、ｒｓ７６１５５９６８８、ｒｓ７７９５９０７３５、ｒｓ７４５４２０３４６、ｒｓ７７０１３５２６５、ｒｓ７７０１４１２８５、ｒｓ７７０３６０８８９、ｒｓ７６１５９２３０２、ｒｓ７６５７２４１８６、ｒｓ７５３１２１９７３、ｒｓ７４９０９５８７５、ｒｓ７５２９７３９８１、ｒｓ７５７４１０９６０、ｒｓ７４９１１７７６５、ｒｓ７４５４７２３６７、ｒｓ７６１７８７２８８、ｒｓ７６５７３１４０５、ｒｓ７７９６１６１８０、ｒｓ７６５７３６６５２、ｒｓ５７４６６３６１３、ｒｓ７７０２００３３６、ｒｓ５７４７８５６０３、ｒｓ７７０２１０５７７、ｒｓ７４５４９１８３５、ｒｓ７４５６３３２１９、ｒｓ７５３００４４３１、ｒｓ７７４７２６４９８、ｒｓ７７９４７１２８０、ｒｓ７６５７４６１６５、ｒｓ７７９４７７８７７、ｒｓ７６１６７８８２２、ｒｓ７７０３８９８８１、ｒｓ７６５７４９７３５、ｒｓ７７４７５８７８１、ｒｓ７７４８９２３６４、ｒｓ７６１６９１６１４、ｒｓ７４９３０８９８０、ｒｓ７７４８９５４４９、ｒｓ５７４７１０９７４、ｒｓ７４９３１４０６７、ｒｓ７６５６３４３１２、ｒｓ７４５６５９０１９、ｒｓ７７９５１９０６３、ｒｓ５７４８０８６２５、ｒｓ７６５７７２５７５、ｒｓ７７９５２４５５０、ｒｓ７７９５２７２６４、ｒｓ７７０２８８３４３、ｒｓ７６５６５２４１４、ｒｓ７６１８３５４０６、ｒｓ７７０４２９４２５、ｒｓ７７０４２９４９８、ｒｓ７４９２０７７０３、ｒｓ７５７３４７５６５、ｒｓ７７４８０６６０１、ｒｓ７７９５５１０６７、ｒｓ７４５６８１０４２、ｒｓ７７９
６８８６３４、ｒｓ７７９６９２７３５、ｒｓ７７０４５０８６４、ｒｓ７７０４５３６２８、ｒｓ７７９５６００８０、ｒｓ７６５６８２１４１、ｒｓ５７４８４０７６２、ｒｓ７７９５６９９６８、ｒｓ７５７４８７９１３、ｒｓ７７９５７００７３、ｒｓ７４５７００３７４、ｒｓ７６５６９７３８４、ｒｓ７５７４９６０１５、ｒｓ７７４８３５９５１、ｒｓ７５７３８９５９０、ｒｓ７６５８２６５９２、ｒｓ７５３２０４１２５、ｒｓ７４５６０８３５６、ｒｓ７６１８８３４４５、ｒｓ７７４８５３００６、ｒｓ７７４８５５９３９、ｒｓ７７９６０５４０５、ｒｓ７７９７３３１１６、ｒｓ７４９３９１７８６、ｒｓ７７４９８３９７４、ｒｓ７７４８６１６８０、ｒｓ７５３２２１６５６、ｒｓ７６５８５３８０４、ｒｓ７７４９８８９３３、ｒｓ７７０５０４３９１、ｒｓ５７４７７６７３６、ｒｓ７６１７８６１３８、ｒｓ７６５８７１９２７、ｒｓ７４９４１３５６７、ｒｓ７６１７８７１５１、ｒｓ７７９７７１０４４、ｒｓ７４９４１７１２３、ｒｓ７４９４２０３３１、ｒｓ７５７５４９０９０、ｒｓ５７４８９２９６５、ｒｓ７４５６３０６２０、ｒｓ７７４８７６７０２、ｒｓ７５３１３７５３５、ｒｓ７４９２９２４０２、ｒｓ７７０３８４９５１、ｒｓ７５３１４２３０５、ｒｓ７５７４２４８６６、ｒｓ７７０５５９２０４、ｒｓ７４９２９６７４１、ｒｓ７５７５８２８２７、ｒｓ７７０３８９０４１、ｒｓ５７４９２１７５１、ｒｓ７７５０５５９５０、ｒｓ７７９８２３９００、ｒｓ７４５７９７７５６、ｒｓ７６１９７６２９５、ｒｓ７７９８３０８２３、ｒｓ７７９６３６７１７、ｒｓ７６５９３６４７２、ｒｓ５７４９３２８８３、ｒｓ７７４８９３５６８、ｒｓ７７０５９６７９９、ｒｓ７７９６４６８３９、ｒｓ７６５９４７４０１、ｒｓ７４５６５８１４９、ｒｓ７４９３２１８５６、ｒｓ７６５９５３９５１、ｒｓ７６５９５８２０６、ｒｓ７６５９５８３８３、ｒｓ７７０４１６２２４、ｒｓ７４９４９２９０５、ｒｓ７６５７７５４３３、ｒｓ７７０６１４０３１、ｒｓ７７５０９４９５４、ｒｓ７４５８３５５７１、ｒｓ７７９８７２９６９、ｒｓ７６５７７６３６６、ｒｓ７４９３２８６５９、ｒｓ７７５１０６５４６、ｒｓ７６１８４００１１、ｒｓ７７９６７６５４６、ｒｓ７４９３４２２１５、ｒｓ７４５８５０１７５、ｒｓ７７０６３５３２３、ｒｓ７４９５１３９７７、ｒｓ５７４９６７０４０、ｒｓ７５７４７０３０９、ｒｓ７４９５１５０１８、ｒｓ７５３３２１７１１、ｒｓ７５７６４７４１１、ｒｓ７５７４８６０１０、ｒｓ５７４９７２５６６、ｒｓ７７５１１９８００、ｒｓ７６５８１２７３２、ｒｓ５７４８４２１２０、ｒｓ７７９９０１６７８、ｒｓ７４５６９８３９２、ｒｓ７５７６５５００１、ｒｓ７７９９０５６４８、ｒｓ７７０６５３０７４、ｒｓ７６２０４３６４４、ｒｓ７６１８７１７７１、ｒｓ７４５８６８３１５、ｒｓ７７９７１５３３４、ｒｓ７４５７０８００８、ｒｓ７７９９１３２３１、ｒｓ７５３２０５３２３、ｒｓ７６２０５２７６１、ｒｓ７７９７２３８４４、ｒｓ５７４９８７０２０、ｒｓ７６６０１７８５１、ｒｓ７５３２０５９３４、ｒｓ７７９９２４１４９、ｒｓ７７０６６９９１２、ｒｓ７６６０２１１３３、ｒｓ７４５８８１００８、ｒｓ７５７６７２４６０、ｒｓ７７９９３１４７７、ｒｓ７５７６７５２４４、ｒｓ７４５８９１５０４、ｒｓ７４５７２０５８０、ｒｓ７４９３９４３５０、ｒｓ７７０５０６８８３、ｒｓ７６１９１６６１３、ｒｓ７５３２３８９８８、ｒｓ７６６０４４５６４、ｒｓ７４５７６２６８７、ｒｓ７４９５４９４４３、ｒｓ７７０５４０６５０、ｒｓ７６６０４７９２８、ｒｓ７７０５４３８９６、ｒｓ７６６０５０２２２、ｒｓ７７９９５８９０７、ｒｓ７５３３６７５９４、ｒｓ７５３３６７７５０、ｒｓ７７０５４６９４５、ｒｓ７７５０３１８８５、ｒｓ７４９４３６１３６、ｒｓ７７５１８１８７２、ｒｓ７５７５７２４９８、ｒｓ７５３２６６３２６、ｒｓ７７０７１０５２８、ｒｓ７７９８２０７６０、ｒｓ７７５０６４１１０、ｒｓ７６２１０１７９７、ｒｓ７６５９３７４６２、ｒｓ７７５１８８３３４、ｒｓ７４５９２１３６４、ｒｓ７６２１０５４４２、ｒｓ７７９８４４４６１、ｒｓ７５７７１３８２１、ｒｓ７７９９８１５９３、ｒｓ７６２１１２５２８、ｒｓ７７５１９８４３５、ｒｓ７６６０７８６６２、ｒｓ７５７７２１８６０、ｒｓ７６２１１９０３８、ｒｓ７５３２９２２４１、ｒｓ７４５９３９８２０、ｒｓ７６１９９６８７３、ｒｓ５７５０３１９２２、ｒｓ７５３２９７７０１、ｒｓ７５３３００３３９、ｒｓ７８００１１８５１、ｒｓ７６２０１７４２５、ｒｓ７８００１８５２７、ｒｓ７４９５０７０４３、ｒｓ７８００１９７６９、ｒｓ７６５９８３７８８、ｒｓ７７５２３３８９７、ｒｓ７４９５９８１４０、ｒｓ７６６１１７１４４、ｒｓ７６５９８４３３２、ｒｓ７５７６４１６７５、ｒｓ７７０６３６８８７、ｒｓ７５３４０７０３４、ｒｓ７７０７６７５９０、ｒｓ７５７７６２９７３、ｒｓ７５７６４７８３５、ｒｓ７４５９７４７３５、ｒｓ７６２１７３２１３、ｒｓ７７５２１２９１６、ｒｓ７６２１７３６８３、ｒｓ７６６１４３５４２、ｒｓ７６６１４３７５２、ｒｓ７５７６４９９００、ｒｓ７６６１４５４０６、ｒｓ７５３４２７５５７、ｒｓ７７０７９５００８、ｒｓ７６５９９７８４５、ｒｓ７４５９９３３７４、ｒｓ７６６００１５７３、ｒｓ７４９５２４０２９、ｒｓ７７５２７３３７９、ｒｓ７７９９１１０８１、ｒｓ７４５９９９５２２、ｒｓ７５３４３４２５１、ｒｓ７７９９１１８５８、ｒｓ７４６００６３２５、ｒｓ７６６１６６４５５、ｒｓ７６６１６８０５３、ｒｓ７５７８０３５７７、ｒｓ７４５８７５３５４、ｒｓ７４９６３３０８１、ｒｓ７７０８１４６５４、ｒｓ７５７８０５１４５、ｒｓ７６６０１５３０２、ｒｓ７５３４４５５５７、ｒｓ７４９６３８８１４、ｒｓ７６６０１９７４３、ｒｓ７７５２９８７７１、ｒｓ７６６１８８５７１、ｒｓ７６６０３７５２２、ｒｓ７７９９４５１６０、ｒｓ７７９９４９９５２、ｒｓ７６６０４４３０１、ｒｓ７４５９００９３２、ｒｓ７４９６５５２７９、ｒｓ５７５０９５６６１、ｒｓ７６２０８３３７１、ｒｓ７６２０８５７９２、ｒｓ７４６０４６３８１、ｒｓ５７５１００１２４、ｒｓ７５７８４６９４７、ｒｓ７４６０５４７０３、ｒｓ７４９６７３３４５、ｒｓ７６２０８６３７６、ｒｓ７６６０５７７３１、ｒｓ７７０７０５１２４、ｒｓ７５７８６９０９１、ｒｓ７７５１８１１６４、ｒｓ７５７７０４３６７、ｒｓ７４９６９５３４９、ｒｓ７４６０８１４２５、ｒｓ７６２０９９４４７、ｒｓ７７５１８５５８５、ｒｓ７４９７０２４１９、ｒｓ７７５１８６９８５、ｒｓ７４９５６２５７０、ｒｓ７８０１７２９６４、ｒｓ７４５９２２０４２、ｒｓ７４９７０７３８５、ｒｓ７６６２６３２９３、ｒｓ７４６０９６９７４、ｒｓ７５３３８４２０２、ｒｓ７７０７９１５９０、ｒｓ７４９７１４０１１、ｒｓ７７０９１８２８４、ｒｓ７７５４０１７０５、ｒｓ７４６１０７１７２、ｒｓ７８０００３２５８、ｒｓ７６６２８０８７２、ｒｓ７５３５１９４５３、ｒｓ７８０００８１４２、ｒｓ７４５９５４１６１、ｒｓ７６２３１５４６３、ｒｓ７５７７５２５０２、ｒｓ７７０９３９５００、ｒｓ７４９５９７１５５、ｒｓ７５７９２９９８２、ｒｓ７４６１２８５７６、ｒｓ７６２１５２１０２、ｒｓ７７０９４７３９９、ｒｓ７４５９６４１４９、ｒｓ７４９７４３９５８、ｒｓ７６２３３５４８９、ｒｓ７７０７６６６００、ｒｓ７７５２４５１５０、ｒｓ７６２３３８６７２、ｒｓ７８０２２８８９８、ｒｓ７４９６１４２７１、ｒｓ７５３５５２４８６、ｒｓ７７５４４９７９３、ｒｓ７６６３１９３５９、ｒｓ７６６３２３５６３、ｒｓ７８０２４５３７１、ｒｓ７４６１５４６８２、ｒｓ７６２１８１３３４、ｒｓ７７５４７２２２２、ｒｓ７６６２８０７０１、ｒｓ７７５４７５１８２、ｒｓ７５７９７７５５５、ｒｓ７５７９７８９７５、ｒｓ７７０９３１１５１、ｒｓ７８０２６７２９６、ｒｓ７７０９９７７６４、ｒｓ７５７９１６０３６、ｒｓ７８０２０５９４５、ｒｓ５７５１５７６５７、ｒｓ７５７９９２３９４、ｒｓ７７１００５４１８、ｒｓ７４６１８０１３５、ｒｓ７６２１８３０６７、ｒｓ７６６３６２７８０、ｒｓ７７１００９０３８、ｒｓ７８００６１６３６、ｒｓ７７１００９３０７、ｒｓ７６２３８７１２６、ｒｓ７６６３６７７２７、ｒｓ７６６３６８５８１、ｒｓ７５７７９２１７３、ｒｓ７８００７３３４９、ｒｓ７６６１６８３３１、ｒｓ７８００８２７９６、ｒｓ７７５２９７４９２、ｒｓ７７５３０８１１０、ｒｓ７５７８２６４３８、ｒｓ７８０３１５７０９、ｒｓ７５８０３５４９８、ｒｓ７６２４２２６６９、ｒｓ７７０８３９５７４、ｒｓ７４９６５２４８１、ｒｓ７６２４２５４６９、ｒｓ７４６２１８６６０、ｒｓ７８０３２６７３２、ｒｓ７７５５５２６４４、ｒｓ７４６０３１３６２、ｒｓ７７１０５７６１８、ｒｓ７６２４３７１２４、ｒｓ７７０８５０５６７、ｒｓ７７５５６３２６５、ｒｓ７４９８３５０９０、ｒｓ７５７８３８７９９、ｒｓ７５３４７４３９８、ｒｓ７６２４５０４２２、ｒｓ７６２４５１４０３、ｒｓ７５８０６８９５０、ｒｓ７５３６６２９２８、ｒｓ７７０８７１０８６、ｒｓ７７１０７９５０１、ｒｓ７７０８７５５７４、ｒｓ７５３６７３６０９、ｒｓ７６２４６６６６６、ｒｓ７６６４４９３４７、ｒｓ７６２４７３６６４、ｒｓ７７５３６３２６９、ｒｓ７４６２６９６６４、ｒｓ７４６２７０７８２、ｒｓ７４６０７６８３４、ｒｓ７７１１０１０１７、ｒｓ７４６２７３１３７、ｒｓ７５８１００５０７、ｒｓ７５３６９６１３９、ｒｓ７８０１６４９８６、ｒｓ７８０３８７５４８、ｒｓ７７５６１７３０５、ｒｓ７８０３９０４８７、ｒｓ７５８１０５４４４、ｒｓ７５７８８４３７１、ｒｓ７６２４９３１２３、ｒｓ７６６４７５２８８、ｒｓ７４６０９２２９９、ｒｓ７４６２８１７０６、ｒｓ７７５３８３４８６、ｒｓ７５７８９３１４１、ｒｓ７５８１１５８０２、ｒｓ７４９７１３５４１、ｒｓ７５３７１４２５８、ｒｓ７６６４８８０１０、ｒｓ７５３７１９２２３、ｒｓ７４９７１３６７７、ｒｓ７５３７２０４１４、ｒｓ７６６４９２８６８、ｒｓ７７１１２５８５４、ｒｓ７６２５１１００１、ｒｓ７８０２３１７８４、ｒｓ７５８１２７０７３、ｒｓ７７１１２７７０２、ｒｓ７４９７６６２０９、ｒｓ７４６１６９４６４、ｒｓ５７５２７４７７５、ｒｓ７６２３７６２３０、ｒｓ７７５４９１７２０、ｒｓ７５３７３１７４０、ｒｓ７７５６５７５６４、ｒｓ７７５４２８０７３、ｒｓ７７５６５８９６４、ｒｓ７４９７４２９７０、ｒｓ７６２３３５６０２、ｒｓ７６２５４１５０４、ｒｓ７７１１５０７９７、ｒｓ７４６３２２０１１、ｒｓ７５８１５７００３、ｒｓ７４９７４９３７７、ｒｓ７６２３６２２７０、ｒｓ７７１１５７６１０、ｒｓ７５８１６２２１１、ｒｓ７６２５１７８６８、ｒｓ７６６３５７１２２、ｒｓ７４９７８８８０７、ｒｓ７４９９１１２４８、ｒｓ７７１１２８４４５、ｒｓ５７５２７４４８４、ｒｓ７４６３３３５６５、ｒｓ７５３５９６６８６、ｒｓ７７５７０４４６１、ｒｓ７７１１７３８５６、ｒｓ７４６３４１９１７、ｒｓ７４６１８６６４３、ｒｓ７８０４７５５６０、ｒｓ７４６１９３８０４、ｒｓ７７５５１６６６３、ｒｓ７５３７８０９３８、ｒｓ７７１０２９５１０、ｒｓ７６６５６０９９１、ｒｓ７７１１８９１３８、ｒｓ７５８１９７１４０、ｒｓ７８０３０２５９９、ｒｓ７７５７２８６９３、ｒｓ７４６３６１３２９、ｒｓ７７５５２７２１２、ｒｓ７６２４１５８１２、ｒｓ７５３８０３８３４、ｒｓ７６２６００３８６、ｒｓ７４６３７４３３０、ｒｓ７５３６３１６５１、ｒｓ７８０３２０９４８、ｒｓ７８０５１８２１２、ｒｓ５７５２２１９１０、ｒｓ７４６２３２０１２、ｒｓ７５８２２４７１８、ｒｓ７７５５６８８８３、ｒｓ７６６４２８６０１、ｒｓ７４６３８４５４９、ｒｓ７５８２３０６１８、ｒｓ７６２６１６４２３、ｒｓ７５３８２６０６６、ｒｓ
７６６６０３３９５、ｒｓ７８０５３４２０７、ｒｓ７６２６２１６１０、ｒｓ７７５５８０３４１、ｒｓ７５３８３２７１７、ｒｓ７４９９５８８３１、ｒｓ７６６４４３９０８、ｒｓ７５８０９０５５５、ｒｓ７４９９６０６５７、ｒｓ７６６６２７０３６、ｒｓ７４９９６３６１３、ｒｓ７７５７８８５２６、ｒｓ７４６４０８５６０、ｒｓ７６２６４４１３５、ｒｓ７７５６０９１１７、ｒｓ５７５４００８３８、ｒｓ７６６４６８６５３、ｒｓ７８０５６９３７０、ｒｓ７５８２６９２０６、ｒｓ７５３８７８５７２、ｒｓ７４６４４１９５６、ｒｓ７６６６６７３５８、ｒｓ７８０６０１２７５、ｒｓ７４９９９００２１、ｒｓ７８０６０２８５７、ｒｓ７６６６７０８５３、ｒｓ５７５４３７０８１、ｒｓ７６６６７４５２８、ｒｓ７６６６８２６４６、ｒｓ７８０６１７２８８、ｒｓ７４９８６８８１７、ｒｓ７４６２８１２３９、ｒｓ７７５６２４５０２、ｒｓ７５３９１２１９４、ｒｓ７６６６９６７８０、ｒｓ７５８１１０７０３、ｒｓ７４６４７１９５２、ｒｓ７４９８７５２８０、ｒｓ７６２５０８５１１、ｒｓ７５８１２６１１４、ｒｓ７５８３３３６５３、ｒｓ７５３７３５００５、ｒｓ７７１１４５７４３、ｒｓ７５３７５９５９０、ｒｓ７５３７３０８５９、ｒｓ７８０６４９３３８、ｒｓ７６６７２３９９６、ｒｓ５７５３１１４９１、ｒｓ７４６４９０５９９、ｒｓ７７５６７２４３３、ｒｓ７６２５４６４８８、ｒｓ７５００２６３８２、ｒｓ７６６７３４４２５、ｒｓ７６６５３１７３０、ｒｓ７７１１５８３３９、ｒｓ５７５４７６９１５、ｒｓ７７１３３５５００、ｒｓ７６６７４７９３４、ｒｓ７５３９２３０６１、ｒｓ７６６７５３３１８、ｒｓ７７１３６１６０６、ｒｓ７８０６９２３８８、ｒｓ７７１３３９２８９、ｒｓ７７５９３０３９９、ｒｓ７５００４７９１３、ｒｓ７６２５５４４２１、ｒｓ７８０６４１８８６、ｒｓ７４６５３１６５０、ｒｓ７８０６６３０６５、ｒｓ７８０７０９７５１、ｒｓ７５８３５９０４６、ｒｓ７５８４０１５７７、ｒｓ５７５４９８３４８、ｒｓ５７５５３８４９８、ｒｓ７８０７１７０１３、ｒｓ７７１１６５８６９、ｒｓ７５８１７７９６４、ｒｓ７５８３６２１１８、ｒｓ７６２５６８０１３、ｒｓ７５３９９５２７０、ｒｓ５７５５４６１７２、ｒｓ７５４０００３８４、ｒｓ７７５９６７０１１、ｒｓ７８０４７５８１１、ｒｓ７５００７３６１８、ｒｓ７５８１８４０７６、ｒｓ７６６５６０３７３、ｒｓ７７１４０４１３９、ｒｓ７８０７４００６６、ｒｓ７５８４２４０９２、ｒｓ７７５７２３７９９、ｒｓ７７５９８０４８３、ｒｓ７６６５７４３０１、ｒｓ７４６３６５４７４、ｒｓ７７５９８２０６０、ｒｓ７８０７４３２６１、ｒｓ７７５７４８７７８、ｒｓ７７５９８６５４８、ｒｓ７７５９８６９０５、ｒｓ５７５３６２５５５、ｒｓ５７５３６３８０２、ｒｓ７６２６１０１５９、ｒｓ７７１２１５１８０、ｒｓ７５４０２５０４６、ｒｓ７７１４２３４０３、ｒｓ７７１２１５７８１、ｒｓ７６２８１９９５０、ｒｓ７８０５３５１８４、ｒｓ７７１４３４２７２、ｒｓ７４６４０３２９６、ｒｓ７５３８４１４８３、ｒｓ７４９９６７２０６、ｒｓ７５３８５５８２９、ｒｓ５７５５９８０８１、ｒｓ７６６８３１８５０、ｒｓ７５０００２４７２、ｒｓ７８０７８４０６１、ｒｓ７５０００２８７９、ｒｓ７５８４６６９８５、ｒｓ７７１３０２７６６、ｒｓ７５０１０７４０７、ｒｓ７４６４６９７６６、ｒｓ７５８４７３５０４、ｒｓ７７１３１９７９３、ｒｓ７５００１４５２９、ｒｓ７５８３３３２２２、ｒｓ７７５８７５０９７、ｒｓ７８０７９７５３４、ｒｓ７４６５０７８３６、ｒｓ７７５９２９３８１、ｒｓ７４６６０６５８０、ｒｓ７４６６０８２６２、ｒｓ７６６８５４４５９、ｒｓ７７６０３９６０６、ｒｓ７８０８０４４２１、ｒｓ７６２８５５６９４、ｒｓ７７１４７３５９０、ｒｓ７６６７５１１９９、ｒｓ７５４０８８４１６、ｒｓ５７５５２１９７８、ｒｓ７５８４９９２７２、ｒｓ７５３９７６０５３、ｒｓ７６６７７０３３４、ｒｓ７６６８７２７０９、ｒｓ７５３９９０７１７、ｒｓ７５０１４８４３１、ｒｓ７７１３８５４９０、ｒｓ７５４１１３２４８、ｒｓ７４６６５３３８９、ｒｓ７５８４０２４６９、ｒｓ７５３９９２４７５、ｒｓ５７５５３９３０６、ｒｓ７６２７８３４８１、ｒｓ７６２７９５７０８、ｒｓ７５４０１０１４４、ｒｓ７６２７９８１３４、ｒｓ７７５９７９８３９、ｒｓ７４６５５９８２１、ｒｓ７５４０１６８７５、ｒｓ７６６８０４３６５、ｒｓ７６２８０８７４８、ｒｓ７７１５２４２２８、ｒｓ７５０１７８１１９、ｒｓ７５８４３３９０８、ｒｓ７８０７５１９４３、ｒｓ７５８４３４８６６、ｒｓ７７１４２３８８０、ｒｓ７５８５５４４５１、ｒｓ５７５６９８４３６、ｒｓ７５０１８８４８５、ｒｓ７７６１３４８４３、ｒｓ７６２９２０５４２、ｒｓ７５８４４９１９６、ｒｓ７７１４３４４４９、ｒｓ７４６６９０６３９、ｒｓ７７６０１２３１６、ｒｓ７７１４３５９１９、ｒｓ７７６０１３７８２、ｒｓ７５８４５９２７７、ｒｓ７８０７８４３３３、ｒｓ５７５７１９６６７、ｒｓ７５４１７１７９４、ｒｓ７５０２１３８４７、ｒｓ７６６９５２４５３、ｒｓ７５８５９０６８６、ｒｓ７６６８３７７２０、ｒｓ７８０９２４５４７、ｒｓ７５４１８７４０９、ｒｓ７５８４７０６１８、ｒｓ７６２８４３５８３、ｒｓ７６２９４５４８３、ｒｓ７６６９６６８８９、ｒｓ７５４０６５１３７、ｒｓ７６６８４６９６９、ｒｓ７６６９７５７７３、ｒｓ７７１５８３８５９、ｒｓ７６６８４７０９２、ｒｓ７５８６２１１５９、ｒｓ７５４２１０５４１、ｒｓ５７５７６３００４、ｒｓ７４６７４５６７３、ｒｓ７６２８４７８５０、ｒｓ７７６０４６１８２、ｒｓ５７５７６９２８０、ｒｓ７７１４７６９１４、ｒｓ５７５７７０４０８、ｒｓ７６６８６７８０６、ｒｓ７５０１３０００１、ｒｓ７５８５０３５１９、ｒｓ７８０９７７９５７、ｒｓ７５０２７３２５６、ｒｓ７５４２３４０００、ｒｓ７６２９８７２４８、ｒｓ７４６７６６６０６、ｒｓ７８０８２８７７２、ｒｓ７５４１１３０３４、ｒｓ７５０２７８２９１、ｒｓ７８０９９０９７１、ｒｓ７６７０１９８０３、ｒｓ７６２９９４１１３、ｒｓ７６２９９５３４６、ｒｓ７５８５３２４０１、ｒｓ７７１６０３１３３、ｒｓ７６７０２６３５３、ｒｓ７５０２８６６９７、ｒｓ７５８６６２５５０、ｒｓ７７６２４７７７１、ｒｓ７８０９６６７６５、ｒｓ７５４１２３４２２、ｒｓ７５４２５４８５４、ｒｓ５７５６７４７１３、ｒｓ７５４２６０４５３、ｒｓ７８１０１５５３４、ｒｓ７７６２６５４７０、ｒｓ７７６１０１５７５、ｒｓ７４６７９９２８８、ｒｓ７８１０２７７６７、ｒｓ７７６２７５７４７、ｒｓ７８０８５９１５１、ｒｓ７５０１６６６８２、ｒｓ７７６２７８４０１、ｒｓ７５４２７７２９１、ｒｓ７４６６６１４８７、ｒｓ７６３０２３６３４、ｒｓ７８０８６１５３５、ｒｓ５７５８２８６４７、ｒｓ７５８６９８３６６、ｒｓ７７１５１５３３９、ｒｓ７７１６７１６４７、ｒｓ７４６８１７５３４、ｒｓ７５４１３０７４８、ｒｓ７５８７０６１９２、ｒｓ７７６２９６９７０、ｒｓ７８１０５８６６０、ｒｓ７６２９０５０００、ｒｓ７６７０８７９２１、ｒｓ７８１０７３９５７、ｒｓ７５０１７６７１９、ｒｓ７６６９１３７５８、ｒｓ７６３０５７２８４、ｒｓ７６２９０７７５０、ｒｓ７４６８４０１８１、ｒｓ７５４１３８０９９、ｒｓ７７６１２３０７８、ｒｓ７５０１９６８１１、ｒｓ７８１０９０８８７、ｒｓ７５０１９６９３８、ｒｓ７７６３３２７４４、ｒｓ７８１０９４４０８、ｒｓ７７６３３５６９１、ｒｓ７７６３３９９６９、ｒｓ７５４１５９９３７、ｒｓ７５４１６３４５９、ｒｓ７５０３７４４５８、ｒｓ７７１５５５９３５、ｒｓ７４６７０１８４４、ｒｓ７６３０８４１００、ｒｓ７５４１７０６４４、ｒｓ７８１１１８０７４、ｒｓ７７１７４４９３８、ｒｓ７５０３９２３８９、ｒｓ７６２９４２１３３、ｒｓ７６２９４４７１９、ｒｓ７５８７７１３２８、ｒｓ５７５７３８４７９、ｒｓ７５８６０８４６４、ｒｓ７４６７２７９５８、ｒｓ７８０９４５２５８、ｒｓ７７１５９９０１３、ｒｓ７５０４００６２７、ｒｓ７７６２０９３８１、ｒｓ７７６３８４８１６、ｒｓ７８０９７４８６７、ｒｓ７７１７６６５３３、ｒｓ７７６３８９２９１、ｒｓ７５８６３８９２５、ｒｓ７５０２８８３３４、ｒｓ７５８７９１８８７、ｒｓ７８０９８７７４８、ｒｓ５７５９２９３８３、ｒｓ７７１６２０５０１、ｒｓ７４６８７９５７５、ｒｓ７６７１６１４２０、ｒｓ７５０２８３７３３、ｒｓ７６７０２５０１５、ｒｓ７５４３９２８０３、ｒｓ７７１７７１８８１、ｒｓ７６３１１１０７２、ｒｓ７６７１６８３８４、ｒｓ７５０２８９９０２、ｒｓ７７１７７１２９３、ｒｓ７７６３９５３７７、ｒｓ７７６４０８４３６、ｒｓ７６３００４１８７、ｒｓ７８１１６７８４２、ｒｓ７４６７９５８８５、ｒｓ７６７１７７５９６、ｒｓ７６７１７９５６５、ｒｓ７６３１３０８０３、ｒｓ７６７１８２６２７、ｒｓ７４６８０３５５１、ｒｓ７５４４１４２８８、ｒｓ７８１０３０５１６、ｒｓ７５４２７７３０４、ｒｓ７５８６９３６４９、ｒｓ７５４４２３７２８、ｒｓ７５０４５２２０３、ｒｓ５７５８３３６８２、ｒｓ７６３１４８６７６、ｒｓ７５４２９２０６７、ｒｓ７５０３４０２５２、ｒｓ７７６４４２３４５、ｒｓ７５４４３７１３６、ｒｓ７７６３２１４７１、ｒｓ７８１２０６０１１、ｒｓ７５８８４３２５７、ｒｓ７８１２０７６８０、ｒｓ７７６４４９５８８、ｒｓ７５８８４８１６６、ｒｓ７７６４５４８８１、ｒｓ７７１７０３８４２、ｒｓ７５８８５９８５２、ｒｓ７７１８４４２９１、ｒｓ５７５９９６６２６、ｒｓ７７６３２８４３４、ｒｓ７６３１７２６６５、ｒｓ７８１０８６４５５、ｒｓ７７６３３１０３４、ｒｓ７８１０８９００９、ｒｓ７６７２３４５４１、ｒｓ７７１７１５３２７、ｒｓ７６７２３６６０６、ｒｓ７５８８７７８３２、ｒｓ７６７１１０６８２、ｒｓ５７５８８１８８２、ｒｓ７７１８６７１７８、ｒｓ７５０５０６８３７、ｒｓ７７６３４１５６７、ｒｓ７７６３４３６９１、ｒｓ７５４３５１６０７、ｒｓ７４６９４７８５７、ｒｓ７８１２６６３５１、ｒｓ７５０５１８４１０、ｒｓ７８１２７３１８６、ｒｓ５７６０３９１３９、ｒｓ７５４３６１６７１、ｒｓ７５８８９９４０５、ｒｓ５７５９０３７２３、ｒｓ７６７２６７５３１、ｒｓ７６７２７０８７８、ｒｓ７６７２７４５７１、ｒｓ７８１２８９１２７、ｒｓ５７６０５５０８７、ｒｓ７６３２２１５３４、ｒｓ７７１９０３２５１、ｒｓ７７６５２９３２２、ｒｓ７５０３９５４５１、ｒｓ７７１９０９１１４、ｒｓ７４６９７０７３０、ｒｓ７６７２９３６６４、ｒｓ７５４３６５０８７、ｒｓ７５０５５４３１８、ｒｓ７６７２９６０１８、ｒｓ７５８７７４４６２、ｒｓ７８１１３１０２１、ｒｓ７８１３１５１６１、ｒｓ７５８７７５９１５、ｒｓ７５０４０４５７０、ｒｓ７６３２４１３６８、ｒｓ７７１９２８７０８、ｒｓ７５８９３６６２９、ｒｓ７７６５５２７３９、ｒｓ７８１３２９３４５、ｒｓ７７１９４２０１１、ｒｓ７５４３８０３５８、ｒｓ７５０４２０７２６、ｒｓ７７１９４６３７９、ｒｓ７５４５６３１３０、ｒｓ７７６５７１９０４、ｒｓ５７６１０２０１１、ｒｓ７５８７９８１７１、ｒｓ７８１３５４２２３、ｒｓ７５８７９９５８９、ｒｓ７４６８８３８７７、ｒｓ７４７００９２２７、ｒｓ７６３１１８４１３、ｒｓ７５８８０３２５０、ｒｓ７７６４０５６９０、ｒｓ７５８８０６７５６、ｒｓ７７６５９３９８２、ｒｓ７７１９６０２２３、ｒｓ７８１３５４２７３、ｒｓ５７６１０８７８６、ｒｓ７５８８１１１２８、ｒｓ７６３１３４０３０、ｒｓ７８１３９２０９３、ｒｓ７７２０００１４８、ｒｓ７５４６１０３７６、ｒｓ７５４６１２０２９、ｒｓ７５４４１８１６１、ｒｓ７７６４２９６０６、ｒｓ７６７１９２８９７、ｒｓ７６３３１８５４１、ｒｓ７６３１４８０２９、ｒｓ７５８８３６４３７、ｒｓ７６７３９１５４５、ｒｓ７５４４３２３６１
、ｒｓ５７６１５４９９０、ｒｓ７５８８４２１１３、ｒｓ７４７０４４３８２、ｒｓ７７６４５８９６０、ｒｓ７８１２３１５９１、ｒｓ７５４６３２３３３、ｒｓ７４７０５１６３４、ｒｓ７６３１７４９８５、ｒｓ７７２０３０２７３、ｒｓ７７６６４９５１２、ｒｓ７５０６５５７２８、ｒｓ７８１４２７４９２、ｒｓ７７６６５４８５６、ｒｓ７５０４９２９４５、ｒｓ７４６９３２２９６、ｒｓ７８１４３７７５７、ｒｓ７５９０３１７４２、ｒｓ７６３１８２９１６、ｒｓ７７２０４６８７８、ｒｓ７５０６７４６９３、ｒｓ５７６０１８６６８、ｒｓ７５０６７６１８７、ｒｓ７５９０４２２３１、ｒｓ７５９０４６４６０、ｒｓ７７６６８０３９６、ｒｓ７５０５０５６８０、ｒｓ５７６０２１４７６、ｒｓ７７６６９２７７０、ｒｓ７７２０７２６９６、ｒｓ７６７２４５８５６、ｒｓ５７６０３１２７７、ｒｓ７５９０６０９３４、ｒｓ７７６６９６９９７、ｒｓ７５８８９８７２１、ｒｓ７８１２８０４８２、ｒｓ７５８９１６７３９、ｒｓ７４６９７５９８１、ｒｓ７７２０８２７５７、ｒｓ７５４６８９６２２、ｒｓ７６３３９３３９０、ｒｓ７６７２９８０２５、ｒｓ７７１９２２３２０、ｒｓ７５４５３６０９１、ｒｓ７６３２４０１３２、ｒｓ７８１３３４３１８、ｒｓ７５８９４８３１３、ｒｓ７５４７１１３７０、ｒｓ７５０５９９８８９、ｒｓ７８１３６０９２６、ｒｓ７４７１０８６０６、ｒｓ７７６７４４３３９、ｒｓ７４７１１４４２０、ｒｓ７８１５２２３３３、ｒｓ７６７４９８３２１、ｒｓ７５４７２８５００、ｒｓ７８１５２７３１０、ｒｓ７５４５７６６１３、ｒｓ５７６１１８６６６、ｒｓ７６３２９１３０７、ｒｓ７８１３７９１２３、ｒｓ５７６１３３５２０、ｒｓ７５０７６０３９３、ｒｓ７６３３０３２６９、ｒｓ７６７５２２２５４、ｒｓ７６３４５５８１８、ｒｓ７５９１２９７４５、ｒｓ７８１５５３６２２、ｒｓ７５０７７１８１１、ｒｓ７５９１３６５３４、ｒｓ７７１９９７０６７、ｒｓ７５４６１２６２７、ｒｓ７５０７８２７４９、ｒｓ７５０６３７６０３、ｒｓ７５０６３７９１６、ｒｓ７５９１５０９７１、ｒｓ７７６８０４１１１、ｒｓ７６３４８４３８９、ｒｓ７７２０１２８４１、ｒｓ７５０６４０７１８、ｒｓ７６７５６３３４４、ｒｓ７５９０１２４１３、ｒｓ７４７１６４４７１、ｒｓ７５４６２３４３８、ｒｓ７６３３２８０９９、ｒｓ７６３３３２６４２、ｒｓ７７６６４８９１１、ｒｓ７６７４１１１７６、ｒｓ７５０８１０９６３、ｒｓ７６３５０４８９８、ｒｓ７５０６６２２６７、ｒｓ７４７１７４４５４、ｒｓ５７６１７５４１３、ｒｓ７４７１７８６９７、ｒｓ７５０８２２７４６、ｒｓ７７２０５２６６７、ｒｓ７４７０７２２９９、ｒｓ７５０６９１８１１、ｒｓ７８１６１９３１７、ｒｓ７８１４７０４１３、ｒｓ７６７６０２２８６、ｒｓ７７２０７４４３１、ｒｓ５７６３４３３９２、ｒｓ７４７０８４５１０、ｒｓ７７６６９９２７０、ｒｓ７７６７０５３１８、ｒｓ７６３３９０６５４、ｒｓ７５０８４９３８４、ｒｓ５７６２１０６９０、ｒｓ７６３５４２７４５、ｒｓ５７６２２１０１９、ｒｓ７４７１０２５７８、ｒｓ７５０８５９７９６、ｒｓ７７２２４１３９６、ｒｓ７６７６３５２８４、ｒｓ７５９０８４９３０、ｒｓ７７２１０４７１５、ｒｓ７７２２４９６１４、ｒｓ７７２１０４７１９、ｒｓ７６３４１５１２７、ｒｓ７５９２２７６２１、ｒｓ７７２１２１０４２、ｒｓ７７６８９７１１５、ｒｓ７６３４３６３３９、ｒｓ７７６７６２７２７、ｒｓ７７２２５９９４５、ｒｓ７４７１２９８７０、ｒｓ７５０７５９１７４、ｒｓ５７６２６５６０８、ｒｓ７６７５１９３４４、ｒｓ７４７２３０７１８、ｒｓ７８１５６５７２７、ｒｓ７６３４７０４５６、ｒｓ７７６９２４２９５、ｒｓ７８１７０１９２１、ｒｓ７６７５４７４７６、ｒｓ７７２１７０４３５、ｒｓ７７６８０８８４９、ｒｓ５７６３０３３４８、ｒｓ７７２１８２４４３、ｒｓ７６３６１１２７６、ｒｓ７５０８０３６７４、ｒｓ７４７２５４６１７、ｒｓ７５９１６４９８８、ｒｓ７５０９２５３９４、ｒｓ７７２１８７８７９、ｒｓ７６７７１６０４２、ｒｓ７５９２８６２７７、ｒｓ７７２３１６６２０、ｒｓ７６７７２００３４、ｒｓ７４７２６５７１３、ｒｓ５７６４４１４８６、ｒｓ５７６４４２５９３、ｒｓ５７６３１７１６８、ｒｓ７６７５７９９２９、ｒｓ５７６４４７７８９、ｒｓ７８１７４２５４５、ｒｓ７８１６０２９２９、ｒｓ７７６８３８０４５、ｒｓ７５０９４４５１５、ｒｓ７５４９３９５５７、ｒｓ７５０８２３８５２、ｒｓ７５９１８４４１４、ｒｓ７７２３３７９２５、ｒｓ７８１７５５９３５、ｒｓ７５４９４４６２４、ｒｓ７４７１８２０７６、ｒｓ７７２３４２０３４、ｒｓ７５４９４８７２３、ｒｓ７７６９９４０８７、ｒｓ７７２３４７２７６、ｒｓ７８１７６４５６８、ｒｓ７７６９９６７３２、ｒｓ７５０８３０３１８、ｒｓ７７２２１８３３０、ｒｓ７５４９５９７６２、ｒｓ７６７６０９５５０、ｒｓ７５９１９８３３８、ｒｓ７６３６７４０６７、ｒｓ７４７２９６８７２、ｒｓ７６３６７４６５５、ｒｓ７７６８６１０３２、ｒｓ７７７０１３０８０、ｒｓ７４７１９４９１７、ｒｓ７７２２３２６３９、ｒｓ７６７７６７７１５、ｒｓ７５０８５３１８６、ｒｓ７４７２０４７０４、ｒｓ５７６４９３６３２、ｒｓ７５９３４２２２４、ｒｓ７６３６９２４９２、ｒｓ７４７２０８８９９、ｒｓ７５４９８８３９９、ｒｓ７５９３４８９２０、ｒｓ５７６５０３６５０、ｒｓ７６３５５９９９７、ｒｓ７７２２５０８７９、ｒｓ７７２３９７０１８、ｒｓ５７６３７２７２２、ｒｓ７６３７０９９６１、ｒｓ７７２２５８３７０、ｒｓ７６７６５７０９６、ｒｓ７５１００７０５６、ｒｓ７６７６５７７６２、ｒｓ７４７３２１２１９、ｒｓ７５９２３６４０２、ｒｓ７６３７２１３３５、ｒｓ７５９３７３６６３、ｒｓ７６７８１３９１５、ｒｓ７６７８１５２４１、ｒｓ７６７８０５５３６、ｒｓ７７２４０６６５３、ｒｓ７８１６８１４５６、ｒｓ７７６９１２２３８、ｒｓ７５９３８３９４３、ｒｓ７５１０２６７５７、ｒｓ７６７６７０９８９、ｒｓ７８１６８８３１２、ｒｓ７５１０２８６６１、ｒｓ７５９３８６１２１、ｒｓ７７２４３０９０７、ｒｓ７７２２８２１６８、ｒｓ７６７８３６５１２、ｒｓ７８１７０５８０９、ｒｓ７４７２４５８１７、ｒｓ７５０９１３７５６、ｒｓ５７６５６０３７５、ｒｓ７４７３４８７２９、ｒｓ７６７６９９３８６、ｒｓ７４７２５０２２１、ｒｓ７５４９０１５８７、ｒｓ７５５０５７０１９、ｒｓ７７７１１２６９８、ｒｓ７８１７２０６１５、ｒｓ７５９４２２２５０、ｒｓ７５９４２２５１６、ｒｓ７８１７３０４２１、ｒｓ７７２３２１９１８、ｒｓ７６３７８００３３、ｒｓ７６３６３５８９６、ｒｓ７５１０７６０１３、ｒｓ７４７３６８４９９、ｒｓ７７２３２８４２６、ｒｓ７５４９３２５８６、ｒｓ７５５０８６１４７、ｒｓ７７６９８３３４２、ｒｓ５７６５９６２７１、ｒｓ７５９４５６８３０、ｒｓ７７２３３６８０８、ｒｓ７７７１５９２６６、ｒｓ７７２４９８７９３、ｒｓ７５５１００２２６、ｒｓ５７６６０９４１１、ｒｓ７６７９０６４２７、ｒｓ７５９３０８８０４、ｒｓ７６３８１４６６３、ｒｓ７６３８１７５０９、ｒｓ７５５１１０００１、ｒｓ７５０９６０４７７、ｒｓ７６３８２１１４２、ｒｓ７５９４７２９９４、ｒｓ７５９３１９０８０、ｒｓ７５４９６０５９２、ｒｓ７７７００５７０７、ｒｓ７６３６７４６７５、ｒｓ５７６６２６２７５、ｒｓ７７２５２０９７２、ｒｓ７６７９２５４９７、ｒｓ７５４９６９８６１、ｒｓ７４７２９８９３５、ｒｓ７７７１９０５７９、ｒｓ７５９３３２５１３、ｒｓ７７７１９１６０１、ｒｓ７６３８３５７６４、ｒｓ７７７２０００６６、ｒｓ７７７２０４２７４、ｒｓ７６３８５０４７９、ｒｓ５７６６４６５４９、ｒｓ７６３６８１９７９、ｒｓ７６７９５７８９１、ｒｓ７６７９６０１１５、ｒｓ７７７０３３７５０、ｒｓ７４７３０９５３６、ｒｓ７６７７９３８２７、ｒｓ７７２５６３６９９、ｒｓ７６７７９８６１９、ｒｓ７７２４０１８９０、ｒｓ７７７０５３７９３、ｒｓ７７７２４０１０４、ｒｓ７７２５７１３４４、ｒｓ７４７４２９２１２、ｒｓ５７６６７７８６２、ｒｓ７７２４１４９８８、ｒｓ７５１１６６６４０、ｒｓ７５９３７８０６１、ｒｓ７５９５３３２８４、ｒｓ７５１０２３１５５、ｒｓ７７７２５４１０６、ｒｓ７６７９８７７８７、ｒｓ７７７０７５０２０、ｒｓ７５５０２６６４１、ｒｓ７６７８２６８１１、ｒｓ７５１１６７０６８、ｒｓ７７７２６４９３３、ｒｓ７５５１９１６５８、ｒｓ７７７０８４０１０、ｒｓ７５５１９２２４３、ｒｓ７７２４３６４８１、ｒｓ７７２４３７４３０、ｒｓ７５９４０３３８９、ｒｓ７４７３５０８７５、ｒｓ７５１１９１７６０、ｒｓ７６８０１０５２４、ｒｓ７７７１１０１１１、ｒｓ７６３７６４３３０、ｒｓ７５５０５９０２２、ｒｓ７７７１２１４８５、ｒｓ７７２６１３５９９、ｒｓ７５５０６７１２６、ｒｓ５７６７１９６８５、ｒｓ５７６７２２５０３、ｒｓ７７７２９９５９３、ｒｓ７５９５７８０１９、ｒｓ７７７３０３３１１、ｒｓ７５９５７９８９２、ｒｓ７５５０７５０１６、ｒｓ５７６５８７７６２、ｒｓ７５９４４５３６４、ｒｓ７７２４８４９６０、ｒｓ７９６０８９４７０、ｒｓ７５１２２４９０９、ｒｓ７５９４５８２９６、ｒｓ７７２６３７９３８、ｒｓ７５９５９６１４３、ｒｓ７５１１０１４５５、ｒｓ７５５２４４４２４、ｒｓ７５５２４４５４５、ｒｓ７６３８１９４１５、ｒｓ７５９４７３９８５、ｒｓ７６３９６３９７２、ｒｓ７５１２４３１８０、ｒｓ７７７３３６７９１、ｒｓ７７７３３６８３５、ｒｓ７６３９６９５１４、ｒｓ７５９４７４２５３、ｒｓ７６７９１９２０６、ｒｓ７５５２５４９５５、ｒｓ７７２５１５７４０、ｒｓ７５９６１１３１０、ｒｓ７７２５２４４２７、ｒｓ５７６７６０７５６、ｒｓ５７６６３０９６０、ｒｓ５７６６３２３１６、ｒｓ７５１２５２１９９、ｒｓ７７７３４７８４４、ｒｓ７７７３５３４０２、ｒｓ７４７４８６３２８、ｒｓ７７２５５２３４４、ｒｓ７５５２７９７６７、ｒｓ７６３８６８３２７、ｒｓ７７２５５７９５７、ｒｓ７７２５６２５６６、ｒｓ７６４００７８８４、ｒｓ７５１２８１５１２、ｒｓ７５５２９６８４２、ｒｓ７６３８７８６３９、ｒｓ７９６１９２０２０、ｒｓ７７７２３７４３８、ｒｓ７５１１６２３４５、ｒｓ７５９５２８８０１、ｒｓ７５５１９２２２２、ｒｓ７５９６７２９５４、ｒｓ７５９６８２８２８、ｒｓ７６４０５５８７４、ｒｓ７９６２２７００８、ｒｓ７６４０６１７９９、ｒｓ７５５３３９４９４、ｒｓ７６７９８４４０４、ｒｓ７５１３２４９３２、ｒｓ７７７２５８１７９、ｒｓ７５１３２６５７５、ｒｓ７５５１８５３０９、ｒｓ５７６８４０３５３、ｒｓ７６７９９４３６０、ｒｓ７７２５９０８１１、ｒｓ７５１３３０４４３、ｒｓ７５５３４５８２０、ｒｓ５７６８４５４７０、ｒｓ７７２７５７３２３、ｒｓ７７７４３０５５６、ｒｓ７６８１６８０２２、ｒｓ７５９６９３３３７、ｒｓ７５１３２７６０８、ｒｓ７７７２６９６１２、ｒｓ７５５３６３７８６、ｒｓ７９６２７７０６３、ｒｓ７９６２７８２４５、ｒｓ７６４０９５９００、ｒｓ７７２７７９１２６、ｒｓ７９６２９４８９４、ｒｓ７６３９１１１５６、ｒｓ５７６８７５９１０、ｒｓ７６８００６９２７、ｒｓ７５９７３５６１７、ｒｓ７７７２７５９４８、ｒｓ７６８２０５６１７、ｒｓ７５９７４４８２０、ｒｓ７６８２０７１６３、ｒｓ７６３９１６８０１、ｒｓ７６３９１９９５１、ｒｓ７５１１９６８１２、ｒｓ７５９５６２８４５、ｒｓ７７７２９１１９１、ｒｓ７９６０７６３７２、ｒｓ７６４１３３０３３、ｒｓ７５１２１８３６２、ｒｓ７７７５０７７３０、ｒｓ７５９５８１９５０、ｒｓ７７２８２１６２４、ｒｓ７５１２２０３７１、ｒｓ７５５４１９３４９、ｒｓ５７６９１４５３６、ｒｓ７５１４０４０９１、ｒｓ７５１４０４３７７、ｒｓ７６４１５４５５４、ｒｓ７５５４２６２９４、ｒｓ７５１４１０３３７、ｒｓ７６８２４４
５８３、ｒｓ７５５２３４７６９、ｒｓ７５５４３５１４９、ｒｓ７６８２５３８０９、ｒｓ７７２６４５４８２、ｒｓ７５１２３７５６５、ｒｓ７７２８５０１７９、ｒｓ７４７４７４９９８、ｒｓ７５９７９９１６６、ｒｓ７７７３３７４５８、ｒｓ７４７４７８０５９、ｒｓ７７７５５１９７２、ｒｓ７５５４４８９６７、ｒｓ７９６１２１８１２、ｒｓ７７７５５６６２２、ｒｓ７５１４３８３２２、ｒｓ７７２８６５４４３、ｒｓ７５９８１０６５７、ｒｓ７５９８１１９３２、ｒｓ７７２６６３６４０、ｒｓ７７２８６９１１０、ｒｓ７７７３４５３０１、ｒｓ７９６４０５２１７、ｒｓ５７６９５８６１５、ｒｓ７７２８７８００６、ｒｓ７５１２５２１６７、ｒｓ７７７３５９６８８、ｒｓ７６８０９３２７８、ｒｓ７５１２７１３７２、ｒｓ７７７３６８８０５、ｒｓ７５９６５５９０３、ｒｓ７５９８３１９２６、ｒｓ７４７５０８９３２、ｒｓ５７６９６９６０１、ｒｓ７７２８９１４９６、ｒｓ７７７５９１３４７、ｒｓ７５１４６４２６８、ｒｓ７７７５９９７９０、ｒｓ７５５３１１８００、ｒｓ７７７６０４７８９、ｒｓ７６８３１４０８２、ｒｓ７６８１２８２７７、ｒｓ７７７６０６８２４、ｒｓ７４７６１３０２４、ｒｓ７６４２３３０８３、ｒｓ７６４０３８８６１、ｒｓ７５１４８４１０６、ｒｓ５７６９９６７６６、ｒｓ７５５３４４３７３、ｒｓ７５５３４５２６０、ｒｓ５７６９９９０４０、ｒｓ７７２９１７９９９、ｒｓ７５５５１０１６３、ｒｓ７７２９２６２１４、ｒｓ７５５５１５２７１、ｒｓ７７７６３３５９２、ｒｓ７７７６３４５７２、ｒｓ７９６４７８９０１、ｒｓ７６８１６７７６８、ｒｓ７５１３４０１４２、ｒｓ７６４２６０６７１、ｒｓ７７７６４２０８９、ｒｓ７６８３４７４９６、ｒｓ７５１５１４１２５、ｒｓ７５９８８０５５０、ｒｓ７６４０８１４５３、ｒｓ７７７６６１３１９、ｒｓ７７７６６７０８４、ｒｓ７５１３４４４５４、ｒｓ７７７６７０４８４、ｒｓ５７６９９６９４４、ｒｓ７７７６３８３６８、ｒｓ７５５５５３７１７、ｒｓ５７７０１８７６５、ｒｓ７７７４７４４１２、ｒｓ７９６２９８０３７、ｒｓ７６４２９８５３８、ｒｓ７９６５４４２５３、ｒｓ７７７６９１４６３、ｒｓ７７７４８３３２４、ｒｓ７７７６９８３８１、ｒｓ７７２７９８０４８、ｒｓ７５１５５８５９３、ｒｓ７５５３９２８３２、ｒｓ７６４３１６５８１、ｒｓ７５９９３０９４５、ｒｓ７５９７５１８４３、ｒｓ７５１３８３２５２、ｒｓ７５９９３４７３４、ｒｓ７６４３２７４６５、ｒｓ７５１３８４１５１、ｒｓ７５１５７４３９２、ｒｓ７９６３２９０３０、ｒｓ７７２８１０６６１、ｒｓ７５１３９４３１０、ｒｓ７７７５１６５５２、ｒｓ７９６３６８１９４、ｒｓ７６４１６８７６８、ｒｓ７６４３４９８０５、ｒｓ７５１５９３８２４、ｒｓ７５５６０９４３０、ｒｓ７６４１７０８１２、ｒｓ７９６６２０５０６、ｒｓ７７７５４６６７１、ｒｓ７５９９８９５８９、ｒｓ７５５６４５３５１、ｒｓ７７２８５４９３３、ｒｓ７９６３８３６２０、ｒｓ７７７７８７０１５、ｒｓ７９６６６１１９２、ｒｓ７６４４０１４９２、ｒｓ７６８４９５５３８、ｒｓ７５９８０４０９１、ｒｓ７６８５００１４２、ｒｓ７６４１９１８８３、ｒｓ７６８５０２２９２、ｒｓ７６８５０２７９１、ｒｓ７６８２７８２１８、ｒｓ７９６４１２０９３、ｒｓ７７２８８１４２１、ｒｓ７５５４６９５０１、ｒｓ７７７５７９３０９、ｒｓ７６４２０８４６７、ｒｓ７５５４７４４１６、ｒｓ７６４２１２３５４、ｒｓ７５９８４２２３８、ｒｓ５７６９８７２６７、ｒｓ７７７６１１６８５、ｒｓ７６８５３１７４１、ｒｓ７６８５４１７８７、ｒｓ７９６７４４４３８、ｒｓ７６４２３９３０５、ｒｓ７５５５３０２５５、ｒｓ７６８５５６７２１、ｒｓ７６８３６８０７３、ｒｓ７５９９００８３９、ｒｓ７７３１５５２５９、ｒｓ７９６５２９１６９、ｒｓ７７３１５９９６８、ｒｓ７６００７３０９７、ｒｓ７９６５３３４６０、ｒｓ７７２９７４７９５、ｒｓ７６８５６６９４４、ｒｓ７６４２９８０９８、ｒｓ７５５５７０７１７、ｒｓ７５９９２１７５３、ｒｓ７５１５５８７５１、ｒｓ７７７８９６１９０、ｒｓ７７７９０４９３２、ｒｓ７９６５７６４３８、ｒｓ７７７９０５７４４、ｒｓ７６４３２５０２８、ｒｓ７６０１０６７６０、ｒｓ７６０１１４６７０、ｒｓ７７３００８８０９、ｒｓ７９６８３５５１７、ｒｓ７６４３３０７２５、ｒｓ７５５５９１７６９、ｒｓ７５１５７７５８２、ｒｓ７９６８４５８０６、ｒｓ７６４５４３２１９、ｒｓ７７３２２４１３９、ｒｓ７７７９５０３８３、ｒｓ７７７７３１６９９、ｒｓ７５９９５３８１３、ｒｓ７６４５５０９９７、ｒｓ７６０１４１９６９、ｒｓ７５９９５５８０３、ｒｓ７７７７４０４８０、ｒｓ７７７７７４０５２、ｒｓ７７３０７０４７１、ｒｓ７６８４７６９２９、ｒｓ７６８４９６７６６、ｒｓ７６４４１４０４３、ｒｓ７７７８１５７８７、ｒｓ７９６６９４０８１、ｒｓ７９６６９４１０１、ｒｓ７６００２６５６３、ｒｓ７９６７００１８０、ｒｓ７７３２８１９３９、ｒｓ７５５６８８６０８、ｒｓ７６４４３７５３５、ｒｓ７６８５２１７４２、ｒｓ７７７８３５８１１、ｒｓ７６８５２６５５４、ｒｓ７７３２９０９０１、ｒｓ７６４４４８４８２、ｒｓ７６４４７０７４６、ｒｓ７７３１４９６３４、ｒｓ７７３２９６２１０、ｒｓ７６４４７６０３４、ｒｓ７５５７２８９２３、ｒｓ７６８５６３０６２、ｒｓ７７８０５２４３３、ｒｓ７７３３１９９４５、ｒｓ７７３３２４３１９、ｒｓ７７８０４２６２０、ｒｓ７６８７３３９９４、ｒｓ７７８０４４２０５、ｒｓ７９６９９７００４、ｒｓ７７７８８１７４１、ｒｓ７９６７７０４３６、ｒｓ７７３３６３２７９、ｒｓ７６００７７７２６、ｒｓ７６８５７１０８０、ｒｓ７５５７４３１６１、ｒｓ７５５７４６２６４、ｒｓ７７８１３１３８３、ｒｓ７６８７８５６４４、ｒｓ７９６８００１０４、ｒｓ７５５７６４０８２、ｒｓ７７３３９９４７８、ｒｓ７７８１４８７２７、ｒｓ７７３４０４０８２、ｒｓ７７３４０７４１５、ｒｓ７９６８３１６３１、ｒｓ７７３４０９６６１、ｒｓ７７８１５６８７８、ｒｓ７７８１６９４７０、ｒｓ７７３４３４６３５、ｒｓ７６８６１４３４１、ｒｓ７６０１２４７９６、ｒｓ７６８６２０３３９、ｒｓ７６８６３００６１、ｒｓ７９６８６１８４２、ｒｓ７６８８９６２１６、ｒｓ７６８６３５３７７、ｒｓ７６４５５５７８０、ｒｓ７７７９６３３９８、ｒｓ７６８９２５７４１、ｒｓ７９６８７２４９１、ｒｓ７７３２４３１５０、ｒｓ７７３５４８３５５、ｒｓ７６８９５００８６、ｒｓ７７７９７７２１６、ｒｓ７７３５７９５６６、ｒｓ７７３５８４４０４、ｒｓ７７８３４０３９８、ｒｓ７６８９７９２６３、ｒｓ７７７９８０９７１、ｒｓ７７８３４２０５９、ｒｓ７６０１６５２９５、ｒｓ７９６９０６１１５、ｒｓ７７８３５３３１７、ｒｓ７９６９１１６０８、ｒｓ７７３６０５１５０、ｒｓ７７３６０７６６９、ｒｓ７７３６１２３５８、ｒｓ７７８３７０１７２、ｒｓ７７３２６７２７２、ｒｓ７７８０１０２６３、ｒｓ７９６９３４８３０、ｒｓ７７３６３０００２、ｒｓ７７８３８９２６９、ｒｓ７７３６３８１１８、ｒｓ７７８３９９１３０、ｒｓ７７８０１８３６４、ｒｓ７６０１９３５２４、ｒｓ７６９０５０５２４、ｒｓ７６９０５１７６６、ｒｓ７７３６６０５１５、ｒｓ７７３６６２４５５、ｒｓ７７３２８９４３０、ｒｓ７７８０２０８４７、ｒｓ７９６９５０４２３、ｒｓ７７８０２６５２５、ｒｓ７９６９５２２３６、ｒｓ７６８７０７９２７、ｒｓ７９７０２１８６４、ｒｓ７７３６９４１８１、ｒｓ７９７０２１８８５、ｒｓ７７８０９５１５４、ｒｓ７７８１０１４４４、ｒｓ７７８１１２５６６、ｒｓ７７８１１６３６０、ｒｓ７７８５１１１８０、ｒｓ７７８５２０１８０、ｒｓ７７８１３１２３５、ｒｓ７６９１５３５７２、ｒｓ７６８７８４５７１、ｒｓ７７８１３５９４２、ｒｓ７７８５４４７１６、ｒｓ７７３３９４２３４、ｒｓ７７８５７０８４２、ｒｓ７６９１０３５３６、ｒｓ７７３８０８３４０、ｒｓ７７８５８３９２５、ｒｓ７６８８０５８６３、ｒｓ７７８２０４７３８、ｒｓ７７３８２５９９３、ｒｓ７７８６１９７７６、ｒｓ７７８２０６６４８、ｒｓ７７３４８４１１４、ｒｓ７６９２５３９９６、ｒｓ７７８２３３７３７、ｒｓ７７３４９５５２３、ｒｓ７７８７１９１１４、ｒｓ７６８９０８８７８、ｒｓ７７８７５４３０１、ｒｓ７７８２６４４１９、ｒｓ７７３５２４２４０、ｒｓ７７８７７２０５９、ｒｓ７７８７９８６３１、ｒｓ７６８９２６５０９、ｒｓ７６８９２９１４３、ｒｓ７７８８１０６２３、ｒｓ７７８８１４０７５、ｒｓ７７８８４２２９９、ｒｓ７６８９６５１６５、ｒｓ７７８３４０８６８、ｒｓ７６８９８１９２１、ｒｓ７７８３５１６７２、ｒｓ７７８３６０４５３、ｒｓ７６９０１３６５１、ｒｓ７７３６２３５３７、ｒｓ７６９０２３４８９、ｒｓ７７３６４５９７４、ｒｓ７７８４１６３５７、ｒｓ７７３６６７４１７、ｒｓ７７３６６７７７４、ｒｓ７７３６７６０１８、ｒｓ７６９０７１２９０、ｒｓ７６９０７１３６１、ｒｓ７６９０７６００３、ｒｓ７７８４４９２８５、ｒｓ７７８４９８２５４、ｒｓ７７３８１２６９５、ｒｓ７６９１０８１７１、ｒｓ７６９１２８７６３、ｒｓ７７８５１１０１４、ｒｓ７７３７５７９００、ｒｓ７７８５３２２２６、ｒｓ７６９１５７１４５、ｒｓ７６９１８７０３９、ｒｓ７６９２００２５７、ｒｓ７７８６０１００５、ｒｓ７７８６２０１３５、ｒｓ７６９２４５６３１、ｒｓ７７３８７７０６９、ｒｓ７７８７０４１２２、ｒｓ７７８７２０４８２、ｒｓ７７８７５６７４１、ｒｓ７７８７６００３８、ｒｓ７７８８０６８４１、及びｒｓ７７８８１０４２５である。
【0347】
１つの例では、本開示で使用するガイドＲＮＡは、表５に記載する少なくとも１つの２０ヌクレオチド（ｎｔ）標的核酸配列を含み得る。表５に提供するのは、遺伝子記号及び当該遺伝子の配列識別子（遺伝子配列番号）、当該標的遺伝子の上流及び／または下流の１～５キロ塩基対を含む遺伝子配列（拡張遺伝子配列番号）、ならびに２０ｎｔ標的核酸配列（２０ｎｔ標的配列の配列番号）である。配列表では、それぞれの標的遺伝子、その遺伝子をターゲティングするための鎖（配列表中で（＋）鎖または（－）鎖で示される）、関連するＰＡＭ型、及びそのＰＡＭ配列が、２０ｎｔ標的核酸配列（配列番号５３０５～７６０１２）の各々に関して記載されている。当技術分野では、「Ｔ」が「Ｕ」である場合のスペーサー配列は、表５に記載する２０ｎｔ配列に対応するＲＮＡ配列であり得ることが理解される。
【表5】
【0348】
１つの例では、本開示で使用するガイドＲＮＡは、少なくとも１つのスペーサー配列を含んでよく、これは、「Ｔ」が「Ｕ」である場合、２０ヌクレオチド（ｎｔ）標的配列、例えば、これに限定されないが、配列番号５３０５～７６０１２のいずれかに対応するＲＮＡ配列であり得る。
【0349】
１つの例では、本開示で使用するガイドＲＮＡは、少なくとも１つのスペーサー配列を含んでよく、これは、「Ｔ」が「Ｕ」である場合、２０ｎｔ配列、例えば、これに限定されないが、配列番号５３０５～７６０１２のいずれかに対応するＲＮＡ配列である。
【0350】
１つの例では、あるガイドＲＮＡは、ＮＡＡＡＡＣ、ＮＮＡＧＡＡＷ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＮＮＮＧＨＴＴ、ＮＲＧ、またはＹＴＮ等であるがこれらに限定されないＰＡＭ型と関連する２０ヌクレオチド（ｎｔ）標的核酸配列を含み得る。非限定的な例として、特定の標的遺伝子及び特定のＰＡＭ型の２０ｎｔ標的核酸配列は、「Ｔ」が「Ｕ」の場合、表６の２０ｎｔ核酸配列のいずれか１つに対応するＲＮＡ配列であり得る。
【表6】
【0351】
１つの例では、あるガイドＲＮＡは、ＹＴＮのＰＡＭ型と関連する２０ヌクレオチド（ｎｔ）標的核酸配列を含み得る。非限定的な例として、特定の標的遺伝子の２０ｎｔ標的核酸配列は、２０ｎｔコア配列を含む場合があり、ここで、該２０ｎｔコア配列は、「Ｔ」が「Ｕ」の場合、配列番号４０５３１～７６０１２に対応するＲＮＡ配列であり得る。別の非限定的な例として、特定の標的遺伝子の２０ｎｔ標的核酸配列は、コア配列を含む場合があり、ここで、該コア配列は、「Ｔ」が「Ｕ」の場合、配列番号４０５３１～７６０１２のいずれかに対応するＲＮＡ配列の断片、部分、または領域であり得る。
【0352】
ＶＩ．他の治療アプローチ
遺伝子編集は、特定の配列をターゲティングするように操作されたヌクレアーゼを用いて行うことができる。これまでのところ、４種の主要なヌクレアーゼ、すなわち、メガヌクレアーゼ及びそれらの誘導体、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ならびにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ系がある。これらのヌクレアーゼプラットフォームは、設計の難しさ、標的密度、及び作用機序の点で異なり、特に、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの特異性は、タンパク質－ＤＮＡ相互作用によるものであり、ＲＮＡ－ＤＮＡ相互作用は主にＣａｓ９を導く。
遺伝子編集は、特定の配列をターゲティングするように操作されたヌクレアーゼを用いて行うことができる。これまでのところ、４種の主要なヌクレアーゼ、すなわち、メガヌクレアーゼ及びそれらの誘導体、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ならびにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼ系がある。これらのヌクレアーゼプラットフォームは、設計の難しさ、標的密度、及び作用機序の点で異なり、特に、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの特異性は、タンパク質－ＤＮＡ相互作用によるものであり、ＲＮＡ－ＤＮＡ相互作用は主にＣａｓ９を導く。
【0353】
Ｃａｓ９等のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを本開示の方法に使用することができる。しかしながら、治療標的部位等の本明細書に記載の教示は、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＨＥ、もしくはＭｅｇａＴＡＬ等の他の形態のエンドヌクレアーゼに、またはヌクレアーゼの組み合わせを使用して適用され得る。しかしながら、本開示の教示をかかるエンドヌクレアーゼに適用するためには、とりわけ、特定の標的部位に向けられたタンパク質を操作する必要があるであろう。
【0354】
さらなる結合ドメインをＣａｓ９タンパク質に融合して特異性を高めることができる。これらの構築物の標的部位は、特定されたｇＲＮＡ特異的部位に位置することになるが、例えば、ジンクフィンガードメイン用のさらなる結合モチーフが必要になる。Ｍｅｇａ－ＴＡＬの場合、メガヌクレアーゼがＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインに融合され得る。該メガヌクレアーゼドメインは特異性を高め、切断を提供することができる。同様に、不活性化またはデッドＣａｓ９（ｄＣａｓ９）は、切断ドメインに融合することができ、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９標的部位及び該融合ＤＮＡ結合ドメインのための隣接結合部位を必要とする。これはおそらく、触媒的不活性化に加えて、追加の結合部位なしで結合を減少させるために、ｄＣａｓ９の何らかのタンパク質操作を必要とするであろう。
【0355】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＩＩ型エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインに連結された操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインからなるモジュラータンパク質である。ＦｏｋＩは二量体としてのみ機能するため、一対のＺＦＮを操作して、両側のＤＮＡ鎖上の同族の標的の「ハーフ部位」配列に結合し、それらの間に正確な間隔を置いて触媒活性ＦｏｋＩ二量体を形成することができるようにする必要がある。それ自体は配列特異性を有さないＦｏｋＩドメインが二量体化されると、ゲノム編集の開始段階としてＺＦＮのハーフ部位間にＤＮＡ二本鎖切断が生じる。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＩＩ型エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインに連結された操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインからなるモジュラータンパク質である。ＦｏｋＩは二量体としてのみ機能するため、一対のＺＦＮを操作して、両側のＤＮＡ鎖上の同族の標的の「ハーフ部位」配列に結合し、それらの間に正確な間隔を置いて触媒活性ＦｏｋＩ二量体を形成することができるようにする必要がある。それ自体は配列特異性を有さないＦｏｋＩドメインが二量体化されると、ゲノム編集の開始段階としてＺＦＮのハーフ部位間にＤＮＡ二本鎖切断が生じる。
【0356】
各ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、通常、豊富なＣｙｓ２－Ｈｉｓ２構造の３～６個のジンクフィンガーからなり、各フィンガーは主に標的ＤＮＡ配列の１つの鎖のヌクレオチドのトリプレットを認識するが、４番目のヌクレオチドとの交差鎖相互作用もまた重要であり得る。ＤＮＡとの重要な接触をする位置におけるあるフィンガーのアミノ酸の改変は、所与のフィンガーの配列特異性を変化させる。従って、４フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、１２ｂｐの標的配列を選択的に認識し、該標的配列は各フィンガーが寄与するトリプレット選好の複合物であるが、トリプレット選好は隣接するフィンガーによって様々な程度に影響され得る。ＺＦＮの重要な側面は、単に個々のフィンガーを修飾することによって、ほとんどどのゲノムアドレスにも容易に再標的化され得ることであるが、これを成功させるためにはかなりの専門知識が必要とされる。ＺＦＮのほとんどの用途では、４～６個のフィンガーのタンパク質が使用され、それぞれ１２～１８ｂｐを認識する。従って、一対のＺＦＮは、通常、ハーフ部位間の典型的な５～７ｂｐのスペーサーを別にして、２４～３６ｂｐの結合標的配列を認識する。結合部位は、１５～１７ｂｐ等のより大きなスペーサーでさらに分離することができる。設計過程で反復配列または遺伝子ホモログが排除されると仮定すると、この長さの標的配列はヒトゲノムにおいて独特である可能性が高い。それにもかかわらず、ＺＦＮタンパク質－ＤＮＡ相互作用はそれらの特異性において絶対的ではないため、２つのＺＦＮ間のヘテロ二量体として、または一方もしくは他方のＺＦＮのホモ二量体としてのいずれかで、オフターゲット結合及び切断事象が生じる。後者の可能性は、ＦｏｋＩドメインの二量体化界面を操作して、互いにのみ二量体になることができ、それら自体では二量体になれない偏性ヘテロダイマー変異体としても知られる「プラス」及び「マイナス」変異体を作製することによって効果的に排除されている。偏性ヘテロ二量体を強制することでホモ二量体の形成を防ぐ。これは、ＺＦＮ、及びこれらのＦｏｋＩ変異体を採用する任意の他のヌクレアーゼの特異性を非常に高めている。
【0357】
様々なＺＦＮベースの系が当技術分野において記載されており、それらの修正が定期的に報告されており、多数の参考文献がＺＦＮの設計を導くために使用される規則及びパラメータを記載している。例えば、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６（６）：２７５８－６３（１９９９）、Ｄｒｅｉｅｒ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３０３（４）：４８９－５０２（２０００）、Ｌｉｕ Ｑ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７（６）：３８５０－６（２００２）、Ｄｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０（４２）：３５５８８－９７（２００５）、及びＤｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６（３１）：２９４６６－７８（２００１）を参照されたい。
【0358】
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
ＴＡＬＥＮは、ＺＦＮと同様に、遺伝子操作されたＤＮＡ結合ドメインがＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに連結され、一対のＴＡＬＥＮが標的ＤＮＡの切断を達成するように直列に作用する、モジュラーヌクレアーゼの別の形式を表す。ＺＦＮとの主な違いは、ＤＮＡ結合ドメインの性質及びそれに関連する標的ＤＮＡ配列の認識特性である。ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合ドメインはＴＡＬＥタンパク質に由来し、これはもともと植物の細菌性病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．に記されていた。ＴＡＬＥは、３３～３５アミノ酸リピートの縦列配列からなり、各リピートは、通常２０ｂｐまでの長さの標的ＤＮＡ配列中の単一の塩基対を認識し、４０ｂｐまでの総標的配列長を与える。各リピートのヌクレオチド特異性は、位置１２及び１３のたった２つのアミノ酸を含むリピート可変二残基（ＲＶＤ）によって決定される。グアニン、アデニン、シトシン、及びチミン塩基は主に、それぞれ４つのＲＶＤ、すなわち、Ａｓｎ－Ａｓｎ、Ａｓｎ－Ｉｌｅ、Ｈｉｓ－Ａｓｐ、及びＡｓｎ－Ｇｌｙによって認識される。これは、ジンクフィンガーよりもはるかに単純な認識コードを構成し、ひいては、ヌクレアーゼ設計に関して後者よりも優れた利点を表す。それにもかかわらず、ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮのタンパク質－ＤＮＡ相互作用は、それらの特異性において絶対的なものではなく、ＴＡＬＥＮにもまた、オフターゲット活性を減少させるため、ＦｏｋＩドメインの偏性ヘテロダイマー変異体の使用が役立っている。
ＴＡＬＥＮは、ＺＦＮと同様に、遺伝子操作されたＤＮＡ結合ドメインがＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに連結され、一対のＴＡＬＥＮが標的ＤＮＡの切断を達成するように直列に作用する、モジュラーヌクレアーゼの別の形式を表す。ＺＦＮとの主な違いは、ＤＮＡ結合ドメインの性質及びそれに関連する標的ＤＮＡ配列の認識特性である。ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合ドメインはＴＡＬＥタンパク質に由来し、これはもともと植物の細菌性病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．に記されていた。ＴＡＬＥは、３３～３５アミノ酸リピートの縦列配列からなり、各リピートは、通常２０ｂｐまでの長さの標的ＤＮＡ配列中の単一の塩基対を認識し、４０ｂｐまでの総標的配列長を与える。各リピートのヌクレオチド特異性は、位置１２及び１３のたった２つのアミノ酸を含むリピート可変二残基（ＲＶＤ）によって決定される。グアニン、アデニン、シトシン、及びチミン塩基は主に、それぞれ４つのＲＶＤ、すなわち、Ａｓｎ－Ａｓｎ、Ａｓｎ－Ｉｌｅ、Ｈｉｓ－Ａｓｐ、及びＡｓｎ－Ｇｌｙによって認識される。これは、ジンクフィンガーよりもはるかに単純な認識コードを構成し、ひいては、ヌクレアーゼ設計に関して後者よりも優れた利点を表す。それにもかかわらず、ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮのタンパク質－ＤＮＡ相互作用は、それらの特異性において絶対的なものではなく、ＴＡＬＥＮにもまた、オフターゲット活性を減少させるため、ＦｏｋＩドメインの偏性ヘテロダイマー変異体の使用が役立っている。
【0359】
触媒機能が不活性化されるＦｏｋＩドメインのさらなる変異体が作製されている。ＴＡＬＥＮまたはＺＦＮ対のいずれかの半分が不活性ＦｏｋＩドメインを含む場合、ＤＳＢではなく、一本鎖ＤＮＡ切断（ニッキング）のみが標的部位で起こる。その結果は、Ｃａｓ９切断ドメインの１つが不活性化されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆｌ「ニッカーゼ」変異体の使用に匹敵する。ＤＮＡニックを使用して、ＨＤＲによるゲノム編集を促進することができるが、ＤＳＢによるよりも効率が低い。主な利点は、ＮＨＥＪによる修復過誤が発生しやすいＤＳＢとは異なり、オフターゲットニックが迅速かつ正確に修復されることである。
【0360】
様々なＴＡＬＥＮベースの系が当技術分野において記載されており、それらの修正が定期的に報告されている。例えば、Ｂｏｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６（５９５９）：１５０９－１２（２００９）、Ｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３５（６０６９）：７１６－９（２０１２）、及びＭｏｓｃｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６（５９５９）：１５０１（２００９）を参照されたい。「Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ」プラットフォームに基づくＴＡＬＥＮの使用、またはクローニングのスキームは、複数のグループによって記載されている。例えば、Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（１２）：ｅ８２（２０１１）、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（１４）：６３１５－２５（２０１１）、Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．６（２）：ｅ１６７６５（２０１１）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４１（６）：３３９－４７，Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｍａｙ １７（２０１４）、及びＣｅｒｍａｋ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １２３９：１３３－５９（２０１５）を参照されたい。
【0361】
ホーミングエンドヌクレアーゼ
ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）は、配列特異的なエンドヌクレアーゼであり、長い認識配列（１４～４４塩基対）を有し、高い特異性で、すなわち、多くの場合当該ゲノムの特異部位でＤＮＡを切断する。ＧＩＹ－ＹＩＧ、Ｈｉｓ－Ｃｉｓボックス、Ｈ－Ｎ－Ｈ、ＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ｘＫ、及びＶｓｒ様を含めた構造によって分類される少なくとも６つの既知のＨＥのファミリーがあり、これらは、真核生物、原生生物、細菌、古細菌、シアノバクテリア、及びファージを含めた広範な宿主に由来する。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮと同様に、ＨＥを使用して、ゲノム編集の最初の段階として、標的遺伝子座にＤＳＢを作り出すことができる。さらに、いくつかの天然のＨＥ及び操作されたＨＥは、ＤＮＡの一本鎖のみを切断し、部位特異的ニッカーゼとして機能する。ＨＥの大きな標的配列及びそれらが提供する特異性は、それらを部位特異的ＤＳＢを作り出すための魅力的な候補にしている。
ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）は、配列特異的なエンドヌクレアーゼであり、長い認識配列（１４～４４塩基対）を有し、高い特異性で、すなわち、多くの場合当該ゲノムの特異部位でＤＮＡを切断する。ＧＩＹ－ＹＩＧ、Ｈｉｓ－Ｃｉｓボックス、Ｈ－Ｎ－Ｈ、ＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ｘＫ、及びＶｓｒ様を含めた構造によって分類される少なくとも６つの既知のＨＥのファミリーがあり、これらは、真核生物、原生生物、細菌、古細菌、シアノバクテリア、及びファージを含めた広範な宿主に由来する。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮと同様に、ＨＥを使用して、ゲノム編集の最初の段階として、標的遺伝子座にＤＳＢを作り出すことができる。さらに、いくつかの天然のＨＥ及び操作されたＨＥは、ＤＮＡの一本鎖のみを切断し、部位特異的ニッカーゼとして機能する。ＨＥの大きな標的配列及びそれらが提供する特異性は、それらを部位特異的ＤＳＢを作り出すための魅力的な候補にしている。
【0362】
様々なＨＥベースの系が当技術分野において記載されており、それらの修正が定期的に報告されている。例えば、Ｓｔｅｅｎｔｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２４（８）：６６３－８０（２０１４）、Ｂｅｌｆｏｒｔ ａｎｄ Ｂｏｎｏｃｏｒａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１１２３：１－２６（２０１４）、Ｈａｆｅｚ ａｎｄ Ｈａｕｓｎｅｒ，Ｇｅｎｏｍｅ ５５（８）：５５３－６９（２０１２）による総説、及びそれらの引用文献を参照されたい。
【0363】
ＭｅｇａＴＡＬ／Ｔｅｖ－ｍＴＡＬＥＮ／ＭｅｇａＴｅｖ
ハイブリッドヌクレアーゼのさらなる例として、ＭｅｇａＴＡＬプラットフォーム及びＴｅｖ－ｍＴＡＬＥＮプラットフォームは、ＴＡＬＥの調節可能なＤＮＡ結合及び特異性の両方、ならびにＨＥの切断配列特異性を生かして、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインと触媒活性ＨＥとの融合を使用する。例えば、Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ４２：２５９１－２６０１（２０１４）、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇ３ ４：１１５５－６５（２０１４）、及びＢｏｉｓｓｅｌ ａｎｄ Ｓｃｈａｒｅｎｂｅｒｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．１２３９：１７１－９６（２０１５）を参照されたい。
ハイブリッドヌクレアーゼのさらなる例として、ＭｅｇａＴＡＬプラットフォーム及びＴｅｖ－ｍＴＡＬＥＮプラットフォームは、ＴＡＬＥの調節可能なＤＮＡ結合及び特異性の両方、ならびにＨＥの切断配列特異性を生かして、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインと触媒活性ＨＥとの融合を使用する。例えば、Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ４２：２５９１－２６０１（２０１４）、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇ３ ４：１１５５－６５（２０１４）、及びＢｏｉｓｓｅｌ ａｎｄ Ｓｃｈａｒｅｎｂｅｒｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．１２３９：１７１－９６（２０１５）を参照されたい。
【0364】
さらなる変形において、ＭｅｇａＴｅｖ構造は、メガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａ）と、ＧＩＹ－ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼＩ－ＴｅｖＩ由来のヌクレアーゼドメイン（Ｔｅｖ）の融合である。これら２つの活性部位は、ＤＮＡ基質上で約３０ｂｐ離れて位置しており、適合しない突出末端を有する２つのＤＳＢを生じる。例えば、Ｗｏｌｆｓ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ４２，８８１６－２９（２０１４）を参照されたい。既存のヌクレアーゼベースのアプローチの他の組み合わせが発展し、本明細書に記載の標的ゲノム修飾を達成するのに有用になることが見込まれる。
【0365】
ｄＣａｓ９－ＦｏｋＩまたはｄＣｐｆ１－Ｆｏｋ１及び他のヌクレアーゼ
上記のヌクレアーゼプラットフォームの構造的及び機能的特性を組み合わせることで、固有の欠失の一部を潜在的に克服することができるゲノム編集へのさらなるアプローチが提供される。例として、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集系は通常、単一のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを使用してＤＳＢを作り出す。標的化の特異性は、標的ＤＮＡとのワトソン・クリック塩基対合を経るガイドＲＮＡ中の２０または２４ヌクレオチド配列（それに加えて、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９の例では、隣接するＮＡＧまたはＮＧＧのＰＡＭ配列のさらなる２塩基）によって促進される。かかる配列は、ヒトゲノムにおいて独特であるのに十分な長さであるが、ＲＮＡ／ＤＮＡ相互作用の特異性は絶対的なものではなく、特に標的配列の５’ハーフにおいてかなりの乱雑が許容されることがあり、特異性を促進する塩基の数を事実上低減させる。これに対する１つの解決策は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１の触媒機能を完全に不活性化させること、すなわち、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合機能のみを保持すること、及びその代わりに不活性化されたＣａｓ９にＦｏｋＩドメインを融合させることであった。例えば、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３２：５６９－７６（２０１４）、及びＧｕｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２：５７７－８２（２０１４）を参照されたい。ＦｏｋＩが触媒的に活性になるためには二量体になる必要があるため、２個のＦｏｋＩ融合物をごく接近してつないで二量体を形成し、ＤＮＡを切断するために、２個のガイドＲＮＡが必要とされる。これは、本質的に、結合標的部位の塩基数を２倍にし、それによってＣＲＩＳＰＲベースの系による標的化のストリンジェンシーを高める。
上記のヌクレアーゼプラットフォームの構造的及び機能的特性を組み合わせることで、固有の欠失の一部を潜在的に克服することができるゲノム編集へのさらなるアプローチが提供される。例として、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集系は通常、単一のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを使用してＤＳＢを作り出す。標的化の特異性は、標的ＤＮＡとのワトソン・クリック塩基対合を経るガイドＲＮＡ中の２０または２４ヌクレオチド配列（それに加えて、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９の例では、隣接するＮＡＧまたはＮＧＧのＰＡＭ配列のさらなる２塩基）によって促進される。かかる配列は、ヒトゲノムにおいて独特であるのに十分な長さであるが、ＲＮＡ／ＤＮＡ相互作用の特異性は絶対的なものではなく、特に標的配列の５’ハーフにおいてかなりの乱雑が許容されることがあり、特異性を促進する塩基の数を事実上低減させる。これに対する１つの解決策は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１の触媒機能を完全に不活性化させること、すなわち、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合機能のみを保持すること、及びその代わりに不活性化されたＣａｓ９にＦｏｋＩドメインを融合させることであった。例えば、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３２：５６９－７６（２０１４）、及びＧｕｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２：５７７－８２（２０１４）を参照されたい。ＦｏｋＩが触媒的に活性になるためには二量体になる必要があるため、２個のＦｏｋＩ融合物をごく接近してつないで二量体を形成し、ＤＮＡを切断するために、２個のガイドＲＮＡが必要とされる。これは、本質的に、結合標的部位の塩基数を２倍にし、それによってＣＲＩＳＰＲベースの系による標的化のストリンジェンシーを高める。
【0366】
さらなる例として、ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインの触媒活性ＨＥ、例えば、Ｉ－ＴｅｖＩへの融合は、オフターゲット切断がさらに低減され得るという見込みで、ＴＡＬＥの調節可能なＤＮＡ結合及び特異性の両方、ならびにＩ－ＴｅｖＩの切断配列特異性を利用する。
【0367】
ＶＩＩ．キット
本開示は、本明細書に記載の方法を行うためのキットを提供する。あるキットは、ゲノムターゲティング核酸、ゲノムターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド、部位特異的ポリペプチド、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び／または本明細書に記載の方法の態様を行うために必要な任意の核酸もしくはタンパク質性分子、またはそれらの任意の組合せのうちの１つ以上を含み得る。
本開示は、本明細書に記載の方法を行うためのキットを提供する。あるキットは、ゲノムターゲティング核酸、ゲノムターゲティング核酸をコードするポリヌクレオチド、部位特異的ポリペプチド、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び／または本明細書に記載の方法の態様を行うために必要な任意の核酸もしくはタンパク質性分子、またはそれらの任意の組合せのうちの１つ以上を含み得る。
【0368】
あるキットは、（１）ゲノムターゲティング核酸をコードするヌクレオチド配列を含むベクター、（２）部位特異的ポリペプチドまたは該部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、ならびに（３）該ベクター（複数可）及びまたはポリペプチドの再構成及び／または希釈用の試薬を含み得る。
【0369】
あるキットは、（１）（ｉ）ゲノムターゲティング核酸をコードするヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター、ならびに（２）該ベクターの再構成及び／または希釈用の試薬を含み得る。
【0370】
上記キットのいずれかにおいて、該キットは、一分子ガイドゲノムターゲティング核酸を含むことができる。上記キットのいずれかにおいて、該キットは、二重分子ゲノムターゲティング核酸を含むことができる。上記キットのいずれかにおいて、該キットは、２つ以上の二重分子ガイドまたは一分子ガイドを含むことができる。該キットは、該核酸標的核酸をコードするベクターを含むことができる。
【0371】
上記キットのいずれかにおいて、該キットは、さらに、所望の遺伝子改変を達成するために挿入されるポリヌクレオチドを含むことができる。
【0372】
キットの成分は、別々の容器に入れる場合もあれば、単一の容器で組み合わせる場合もある。
【0373】
任意の上記キットは、さらに、１つ以上のさらなる試薬を含むことができる。かかるさらなる試薬は、緩衝剤、細胞にポリペプチドまたはポリヌクレオチドを導入するための緩衝剤、洗浄用緩衝剤、対照試薬、対照ベクター、対照ＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡからポリペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏで生成するための試薬、配列決定用のアダプター等から選択される。緩衝剤は、安定化用緩衝剤、再構成用緩衝剤、希釈用緩衝剤等でよい。キットはまた、当該エンドヌクレアーゼによるＤＮＡのオンターゲットの結合もしくは切断を促進もしくは増進させるため、または標的化の特異性を高めるために用いることができる１つ以上の成分を含むことができる。
【0374】
上述した成分に加えて、キットはさらに、本方法を実施するために該キットの成分を使用するための説明書を含むことができる。本方法を実施するための説明書は、適切な記録媒体に記録することができる。例えば、該説明書は、紙またはプラスチック等のような基材に印刷することができる。該説明書は、添付文書として、該キットまたはその成分の（すなわち、その包装または分包と関連する）容器のラベル等に含まれ得る。該説明書は、適切なコンピューター読み取り可能な記憶媒体、例えば、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブ等に含まれる電子記憶データファイルとして含まれ得る。一部の例では、実際の説明書を当該キットに含まずに、リモート・ソースから説明書を入手する手段（例えば、インターネット経由で）を提供する場合もある。この場合の例は、説明書を見ることができる、及び／または説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、説明書を入手するためのこの手段は、適切な基材に記録することができる。
【0375】
ＶＩＩＩ．本発明の特定の方法及び組成物
従って、本開示は、特に、本開示に従う以下の非限定的な方法に関する。第一の方法、すなわち、方法１において、本開示は、細胞の電位依存性ナトリウムチャネルタイプＸアルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）遺伝子を、以下を含むゲノム編集によって編集するための方法を提供する。すなわち、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ調節要素の中もしくはその近傍で、該ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の中もしくはその近傍の少なくとも１つのヌクレオチドの永久的な挿入、欠失、または突然変異の１つ以上をもたらす１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）をきたすために当該細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入し、それにより、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子産物の発現もしくは機能を低減または除去する。
従って、本開示は、特に、本開示に従う以下の非限定的な方法に関する。第一の方法、すなわち、方法１において、本開示は、細胞の電位依存性ナトリウムチャネルタイプＸアルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）遺伝子を、以下を含むゲノム編集によって編集するための方法を提供する。すなわち、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ調節要素の中もしくはその近傍で、該ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の中もしくはその近傍の少なくとも１つのヌクレオチドの永久的な挿入、欠失、または突然変異の１つ以上をもたらす１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）をきたすために当該細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入し、それにより、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子産物の発現もしくは機能を低減または除去する。
【0376】
別の方法、すなわち、方法２において、本開示は、ＳＣＮ１０Ａ関連の状態または障害を有する患者の治療のための以下を含むｅｘ ｖｉｖｏ方法を提供する。すなわち、電位依存性ナトリウムチャネルタイプＸアルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）遺伝子、またはＳＣＮ１０Ａ遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列の中もしくは近傍の、患者特異的な人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を編集し、編集されたｉＰＳＣを末梢神経系のニューロンに分化させ、該末梢神経系のニューロンを当該患者に投与する。
【0377】
別の方法、すなわち、方法３において、本開示は、ＳＣＮ１０Ａ関連の状態または障害を有する患者の治療のための以下を含むｅｘ ｖｉｖｏ方法を提供する。すなわち、患者特異的な人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を入手し、電位依存性ナトリウムチャネルタイプＸアルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）遺伝子、またはＳＣＮ１０Ａ遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列の中もしくは近傍のｉＰＳＣを編集し、編集されたｉＰＳＣを末梢神経系のニューロンに分化させ、該末梢神経系のニューロンを当該患者に投与する。
【0378】
別の方法、すなわち、方法４において、本開示は、編集段階が以下を含む方法２または３の方法を提供する。すなわち、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ調節要素の中もしくはその近傍で、該ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の中もしくはその近傍の少なくとも１つのヌクレオチドの永久的な挿入、欠失、または突然変異の１つ以上をもたらす１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）をきたすために該ｉＰＳＣに１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入し、それにより、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子産物の発現もしくは機能を低減または除去する。
【0379】
別の方法、すなわち、方法５において、本開示は、ＳＣＮ１０Ａ関連の状態または障害を有する患者の治療のための以下を含むｅｘ ｖｉｖｏ方法を提供する。すなわち、電位依存性ナトリウムチャネルタイプＸアルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）遺伝子、またはＳＣＮ１０Ａ遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列の中もしくは近傍の、間葉系幹細胞を編集し、編集された間葉系幹細胞を末梢神経系のニューロンに分化させ、該末梢神経系のニューロンを当該患者に投与する。
【0380】
別の方法、すなわち、方法６において、本開示は、ＳＣＮ１０Ａ関連の状態または障害を有する患者の治療のための以下を含むｅｘ ｖｉｖｏ方法を提供する。すなわち、当該患者から間葉系幹細胞を入手し、電位依存性ナトリウムチャネルタイプＸアルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）遺伝子、またはＳＣＮ１０Ａ遺伝子の調節要素をコードする他のＤＮＡ配列の中もしくは近傍の間葉系幹細胞を編集し、編集された間葉系幹細胞を末梢神経系のニューロンに分化させ、該末梢神経系のニューロンを当該患者に投与する。
【0381】
別の方法、すなわち、方法７において、本開示は、編集段階が以下を含む方法５または６の方法を提供する。すなわち、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ調節要素の中もしくはその近傍で、該ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の中もしくはその近傍の少なくとも１つのヌクレオチドの永久的な挿入、欠失、または突然変異の１つ以上をもたらす１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）をきたすために該間葉系幹細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入し、それにより、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子産物の発現もしくは機能を低減または除去する。
【0382】
別の方法、すなわち、方法８において、本開示は、ＳＣＮ１０Ａ関連の障害を有する患者の治療のための以下を含むｉｎ ｖｉｖｏ方法を提供する。すなわち、当該患者の細胞の電位依存性ナトリウムチャネルタイプＸアルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）遺伝子を編集する。
【0383】
別の方法、すなわち、方法９において、本開示は、編集段階が以下を含む方法８の方法を提供する。すなわち、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ調節要素の中もしくはその近傍で、該ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の中もしくはその近傍の少なくとも１つのヌクレオチドの永久的な挿入、欠失、または突然変異の１つ以上をもたらす１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）をきたすために当該細胞に１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼを導入し、それにより、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子産物の発現もしくは機能を低減または除去する。
【0384】
別の方法、すなわち、方法１０において、本開示は、当該細胞が末梢神経系のニューロンである方法８～９のいずれか１つの方法を提供する。
【0385】
別の方法、すなわち、方法１１において、本開示は、当該１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、直接の神経節内もしくは脊髄内注入を介して、または髄腔内送達によって末梢神経系のニューロンに送達される、方法１０の方法を提供する。
【0386】
別の方法、すなわち、方法１２において、本開示は、細胞のＳＣＮ１０Ａ遺伝子の連続ゲノム配列を改変する以下を含む方法を提供する。すなわち、１つ以上の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）をきたすために当該細胞を１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼと接触させる。
【0387】
別の方法、すなわち、方法１３において、本開示は、該連続ゲノム配列の改変が、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の１つ以上のエクソンで生じる、方法１２の方法を提供する。
【0388】
別の方法、すなわち、方法１４において、本開示は、当該１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、配列番号１～６２０の配列のいずれか及び配列番号１～６２０に開示する配列のいずれかに対して少なくとも９０％の相同性を有する変異体から選択される、方法１～１３のいずれか１つの方法を提供する。
【0389】
別の方法、すなわち、方法１５において、本開示は、当該１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、１つ以上のタンパク質またはポリペプチドである、方法１４の方法を提供する。
【0390】
別の方法、すなわち、方法１６において、本開示は、当該１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、該１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドである、方法１４の方法を提供する。
【0391】
別の方法、すなわち、方法１７において、本開示は、当該１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、該１つ以上のＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする１つ以上のリボ核酸（ＲＮＡ）である、方法１６の方法を提供する。
【0392】
別の方法、すなわち、方法１８において、本開示は、当該１つ以上のリボ核酸（ＲＮＡ）が、１つ以上の化学修飾ＲＮＡである、方法１７の方法を提供する。
【0393】
別の方法、すなわち、方法１９において、本開示は、当該１つ以上のリボ核酸（ＲＮＡ）が、コード領域において化学的に修飾される、方法１８の方法を提供する。
【0394】
別の方法、すなわち、方法２０において、本開示は、当該１つ以上のポリヌクレオチドまたは１つ以上のリボ核酸（ＲＮＡ）が、コドン最適化される、方法１６～１９のいずれか１つの方法を提供する。
【0395】
別の方法、すなわち、方法２１において、本開示は、当該方法がさらに、１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡを当該細胞に導入することを含む、方法１～２０のいずれか１つの方法を提供する。
【0396】
別の方法、すなわち、方法２２において、本開示は、当該１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡが、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の中または近傍のＤＮＡ配列に相補的なスペーサー配列を含む、方法２１の方法を提供する。
【0397】
別の方法、すなわち、方法２３において、本開示は、当該１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡが化学的に修飾される、方法２１～２２のいずれかの方法を提供する。
【0398】
別の方法、すなわち、方法２４において、本開示は、当該１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡが、当該１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼと事前複合体化される、方法２１～２３のいずれか１つの方法を提供する。
【0399】
別の方法、すなわち、方法２５において、本開示は、当該事前複合体化が、当該１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡの、当該１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼに対する共有結合を伴う、方法２４の方法を提供する。
【0400】
別の方法、すなわち、方法２６において、本開示は、当該１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼがリポソームまたは脂質ナノ粒子に処方される、方法１４～２５のいずれか１つの方法を提供する。
【0401】
別の方法、すなわち、方法２７において、本開示は、当該１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、当該１つ以上のｇＲＮＡもしくは１つ以上のｓｇＲＮＡも含むリポソームまたは脂質ナノ粒子に処方される、方法２１～２５のいずれか１つの方法を提供する。
【0402】
別の方法、すなわち、方法２８において、本開示は、当該１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、ＡＡＶベクター粒子内でコードされる、方法１２または２１～２２のいずれか１つの方法を提供する。
【0403】
別の方法、すなわち、方法２９において、本開示は、当該１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡが、ＡＡＶベクター粒子内でコードされる、方法２１～２２のいずれかの方法を提供する。
【0404】
別の方法、すなわち、方法３０において、本開示は、当該１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼが、当該１つ以上のｇＲＮＡまたは１つ以上のｓｇＲＮＡもコードするＡＡＶベクター粒子内でコードされる、方法２１～２２のいずれかの方法を提供する。
【0405】
別の方法、すなわち、方法３１において、本開示は、当該ＡＶＶベクター粒子が、配列番号４７３４～５３０２及び表２に開示のもののいずれかからなる群から選択される、方法２８～３０のいずれかの方法を提供する。
【0406】
本開示はまた、配列番号５３０５～７６０１２のいずれかに対応するＲＮＡ配列である少なくとも１つのスペーサー配列を含む一分子ガイドＲＮＡを含む組成物、すなわち、組成物１を提供する。
【0407】
別の組成物、すなわち、組成物２において、本開示は、当該一分子ガイドＲＮＡが、さらにスペーサーエクステンション領域を含む、組成物１の一分子ガイドＲＮＡを提供する。
【0408】
別の組成物、すなわち、組成物３において、本開示は、当該一分子ガイドＲＮＡが、さらにｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション領域を含む、組成物１の一分子ガイドＲＮＡを提供する。
【0409】
別の組成物、すなわち、組成物４において、本開示は、当該一分子ガイドＲＮＡが化学的に修飾される、組成物１～３の一分子ガイドＲＮＡを提供する。
【0410】
別の組成物、すなわち、組成物５において、本開示は、部位特異的ポリペプチドと事前複合体化される組成物１～４の一分子ガイドＲＮＡを提供する。
【0411】
別の組成物、すなわち、組成物６において、本開示は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼと事前複合体化される組成物１～５の一分子ガイドＲＮＡを提供する。
【0412】
別の組成物、すなわち、組成物７において、本開示は、当該ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである、組成物６の組成物を提供する。
【0413】
別の組成物、すなわち、組成物８において、本開示は、当該Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ ３ Ｃａｓ９、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９、Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１、及びＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６ Ｃｐｆ１、ならびにこれらエンドヌクレアーゼに対して少なくとも９０％の相同性を有する変異体からなる群から選択される、組成物７の組成物を提供する。
【0414】
別の組成物、すなわち、組成物９において、本開示は、当該Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが、１つ以上の核移行シグナル（ＮＬＳ）を含む、組成物８の組成物を提供する。
【0415】
別の組成物、すなわち、組成物１０において、本開示は、少なくとも１つのＮＬＳが、当該Ｃａｓ９もしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼのアミノ末端の５０アミノ酸に、または５０アミノ酸以内にある、及び／または少なくとも１つのＮＬＳが、当該Ｃａｓ９もしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼのカルボキシ末端の５０アミノ酸に、または５０アミノ酸以内にある、組成物９の組成物を提供する。
【0416】
別の組成物、すなわち、組成物１１において、本開示は、組成物１～４のいずれかの一分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを提供する。
【0417】
別の組成物、すなわち、組成物１２において、本開示は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド及び組成物１～４の少なくとも１つの一分子ガイドＲＮＡを含む、非自然発生のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を提供する。
【0418】
別の組成物、すなわち、組成物１３において、本開示は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードする当該ポリヌクレオチドが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ ３ Ｃａｓ９、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ Ｃａｓ９、Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１、及びＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６ Ｃｐｆ１、ならびにこれらエンドヌクレアーゼに対して少なくとも９０％の相同性を有する変異体からなる群から選択される、組成物１２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を提供する。
【0419】
別の組成物、すなわち、組成物１４において、本開示は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードする当該ポリヌクレオチドが、１つ以上の核移行シグナル（ＮＬＳ）を含む、組成物１３のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を提供する。
【0420】
別の組成物、すなわち、組成物１５において、本開示は、少なくとも１つのＮＬＳが、Ｃａｓ９もしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードする当該ポリヌクレオチドのアミノ末端の５０アミノ酸に、または５０アミノ酸以内にある、及び／または少なくとも１つのＮＬＳが、Ｃａｓ９もしくはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードする当該ポリヌクレオチドのカルボキシ末端の５０アミノ酸に、または５０アミノ酸以内にある、組成物１４のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を提供する。
【0421】
別の組成物、すなわち、組成物１６において、本開示は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードする当該ポリヌクレオチドが、真核細胞での発現に対してコドン最適化される、組成物１５のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を提供する。
【0422】
別の組成物、すなわち、組成物１７において、本開示は、組成物１２～１６のいずれか１つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードするＤＮＡを提供する。
【0423】
別の組成物、すなわち、組成物１８において、本開示は、組成物１２～１７のいずれか１つのＤＮＡを含むベクターを提供する。
【0424】
別の組成物、すなわち、組成物１９において、本開示は、当該ベクターがプラスミドである組成物１８のベクターを提供する。
別の組成物、すなわち、組成物２０において、本開示は、当該ベクターがＡＡＶベクター粒子であり、該ＡＡＶベクター粒子が、配列番号４７３４～５３０２及び表２に開示のものからなる群から選択される、組成物１８のベクターを提供する。
別の組成物、すなわち、組成物２０において、本開示は、当該ベクターがＡＡＶベクター粒子であり、該ＡＡＶベクター粒子が、配列番号４７３４～５３０２及び表２に開示のものからなる群から選択される、組成物１８のベクターを提供する。
【0425】
ＩＸ．定義
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、本開示にとって必須の組成物、方法、及びそれらのそれぞれの成分（複数可）に関して用いられるが、必須であるかどうかにかかわらず、特定されていない要素の包含も受け入れる。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、本開示にとって必須の組成物、方法、及びそれらのそれぞれの成分（複数可）に関して用いられるが、必須であるかどうかにかかわらず、特定されていない要素の包含も受け入れる。
【0426】
「～から本質的になる」という用語は、所与の態様に必要な要素を指す。この用語は、本開示のその態様の基本的及び新規な、または機能的な特性（複数可）に実質的に影響を及ぼさない追加の要素の存在を許可する。
【0427】
「～からなる」という用語は、本明細書に記載の組成物、方法、及びそれらのそれぞれの成分を指し、これらは、当該態様のその記載に列挙されていない任意の要素を除く。
【0428】
単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その文脈が明らかにそうではないことを示さない限り、複数の言及を含む。
【0429】
本明細書に列挙される任意の数値範囲は、列挙範囲内に含まれる同じ数値精度の（すなわち、同じ特定の桁数を有する）すべての部分範囲を示す。例えば、列挙範囲「１．０～１０．０」は、列挙最小値１．０と列挙最大値１０．０の間の（及びそれらを含む）すべての部分範囲、例えば、本明細書の本文中に「２．４～７．６」の範囲が明示的に列挙されていない場合でも、「２．４～７．６」を示す。従って、本出願人は、本明細書に明示的に列挙される範囲内に含まれる同じ数値精度の任意の部分範囲を明示的に列挙するため、特許請求の範囲を含め、本明細書を補正する権利を留保する。すべてのかかる範囲は、本質的に本明細書に記載されており、従って、任意のかかる部分範囲を明示的に列挙するための補正は、米国特許法第１１２条（ａ）及びＥＰＣ１２３条（２）の要件を含めた、明細書記載要件、記載の十分性の要件、及び追加事項の要件に適合する。さらに、明示的に特定されていない限り、または文脈上必要とされない限り、本明細書に記載のすべての数値パラメータ（例えば、値、範囲、量、パーセンテージ等を表すもの）は、数字の前に「約」という単語が明示的に現れていない場合であっても、「約」という単語によって前置きされたものとして解釈され得る。さらに、本明細書に記載の数値パラメータは、報告された有効桁数、数値精度を考慮し、通常の丸め技法を適用することによって解釈されるべきである。本明細書に記載の数値パラメータは、該パラメータの数値を測定するために使用される基本的な測定技術に固有の変動特性を必然的に有することも理解される。
【0430】
本開示の１つ以上の例の詳細を以下の添付の説明に記載する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の材料及び方法を、本開示の実施または試験に用いることができるが、好ましい材料及び方法をここに記載する。本開示の他の特徴、目的、及び利点は、本説明から明らかになろう。本説明において、単数形は、その文脈が明らかにそうではないことを示さない限り、複数形も含む。他に定義されない限り、本説明で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、本説明が統制する。
【0431】
本開示を、以下の非限定的な実施例によってさらに詳しく説明する。
【実施例0432】
Ｘ．実施例
本開示は、本発明の例示的な非限定的態様を与える以下の実施例を参照することにより、さらに十分に理解されるであろう。
本開示は、本発明の例示的な非限定的態様を与える以下の実施例を参照することにより、さらに十分に理解されるであろう。
【0433】
これら実施例は、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の永久的な欠失または突然変異をもたらし、ＳＣＮ１０Ａタンパク質活性を低減または除去する、本明細書において「ゲノム修飾」と呼ばれる規定の治療的ゲノム欠失、挿入、または置換を、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子において作り出すための例示的なゲノム編集技術としてのＣＲＩＳＰＲ系の使用を記載する。
【0434】
様々なＣａｓオルソログを切断に関して評価する。ｇＲＮＡは、ＲＮＡとして送達し、プラスミド中でＵ６プロモーターから発現させる。対応するＣａｓタンパク質は、ｍＲＮＡとして送達して目的の細胞株にノックインし構成的に発現させるか、またはタンパク質として送達する。すべての形式でのｇＲＮＡ活性は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でＴＩＤＥ分析を用いて評価する。
【0435】
規定の治療的修飾の導入は、本明細書に記載及び説明する通り、疼痛の潜在的な改善のための新規な治療方法を表す。
【0436】
実施例１－ＳＣＮ１０Ａ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ９標的部位
ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各領域を、ＮＲＧ配列を有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列表の配列番号１２７５４～４０５３０に示す通り、該ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー配列を次に特定した。
ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各領域を、ＮＲＧ配列を有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列表の配列番号１２７５４～４０５３０に示す通り、該ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー配列を次に特定した。
【0437】
実施例２－ＳＣＮ１０Ａ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９標的部位
ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各領域を、ＮＮＧＲＲＴ配列を有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列表の配列番号６７７２～９９８３に示す通り、該ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー配列を次に特定した。
ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各領域を、ＮＮＧＲＲＴ配列を有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列表の配列番号６７７２～９９８３に示す通り、該ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー配列を次に特定した。
【0438】
実施例３－ＳＣＮ１０Ａ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＳｔＣａｓ９標的部位
ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各領域を、ＮＮＡＧＡＡＷ配列を有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列表の配列番号５７０３～６７７１に示す通り、該ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー配列を次に特定した。
ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各領域を、ＮＮＡＧＡＡＷ配列を有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列表の配列番号５７０３～６７７１に示す通り、該ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー配列を次に特定した。
【0439】
実施例４－ＳＣＮ１０Ａ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＴｄＣａｓ９標的部位
ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各領域を、ＮＡＡＡＡＣ配列を有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列表の配列番号５３０５～５７０２に示す通り、該ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー配列を次に特定した。
ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各領域を、ＮＡＡＡＡＣ配列を有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列表の配列番号５３０５～５７０２に示す通り、該ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー配列を次に特定した。
【0440】
実施例５－ＳＣＮ１０Ａ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／ＮｍＣａｓ９標的部位
ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各領域を、ＮＮＮＮＧＨＴＴ配列を有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列表の配列番号９９８４～１２７５３に示す通り、該ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー配列を次に特定した。
ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各領域を、ＮＮＮＮＧＨＴＴ配列を有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列表の配列番号９９８４～１２７５３に示す通り、該ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー配列を次に特定した。
【0441】
実施例６－ＳＣＮ１０Ａ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１標的部位
ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各領域を、ＹＴＮ配列を有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列表の配列番号４０５３１～７６０１２に示す通り、該ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー配列を次に特定した。
ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の領域を、標的部位についてスキャンした。各領域を、ＹＴＮ配列を有するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）についてスキャンした。配列表の配列番号４０５３１～７６０１２に示す通り、該ＰＡＭに対応するｇＲＮＡの２０ｂｐスペーサー配列を次に特定した。
【0442】
実施例７－ガイド鎖のバイオインフォマティクス分析
候補のガイドを次に、オンターゲット及びオフターゲットの両方の部位での理論的結合ならびに実験的に評価される活性の両方を含む単一過程または多段過程でスクリーニング及び選択する。実例として、隣接ＰＡＭとともに特定のオンターゲットの部位、例えば、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子内の部位とマッチする配列を有する候補のガイドを、以下により詳細に記載及び説明する通り、オフターゲットでの結合を評価するために利用可能な様々なバイオインフォマティクスツールの１つ以上を用いて、同様の配列を有するオフターゲットの部位で切断するそれらの可能性を評価し、目的のもの以外の染色体位置での影響の可能性を評価することができる。
候補のガイドを次に、オンターゲット及びオフターゲットの両方の部位での理論的結合ならびに実験的に評価される活性の両方を含む単一過程または多段過程でスクリーニング及び選択する。実例として、隣接ＰＡＭとともに特定のオンターゲットの部位、例えば、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子内の部位とマッチする配列を有する候補のガイドを、以下により詳細に記載及び説明する通り、オフターゲットでの結合を評価するために利用可能な様々なバイオインフォマティクスツールの１つ以上を用いて、同様の配列を有するオフターゲットの部位で切断するそれらの可能性を評価し、目的のもの以外の染色体位置での影響の可能性を評価することができる。
【0443】
オフターゲット活性の可能性が比較的低いと予測される候補を、次にそれらのオンターゲット活性、その後様々な部位でのオフターゲット活性を測定するために実験的に評価することができる。好ましいガイドは、選択された遺伝子座で所望のレベルの遺伝子編集を達成するために十分に高いオンターゲット活性、及び他の染色体遺伝子座での改変の可能性を低減するために比較的低いオフターゲット活性を有する。オンターゲット対オフターゲットの活性比は、しばしばガイドの「特異性」と呼ばれる。
【0444】
予測されるオフターゲット活性の最初のスクリーニング用には、既知の公開された多くのバイオインフォマティクスツールがあり、これらを用いて、最も可能性の高いオフターゲット部位を予測することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ系における標的部位への結合は、相補的配列間のワトソン・クリック塩基対合によって引き起こされるため、相違（ひいてはオフターゲット結合の可能性の減少）の程度は、本質的に一次配列の違いであるミスマッチ及びバルジ、すなわち、非相補性塩基に変化される塩基、ならびに標的部位に対して、潜在的なオフターゲット部位での塩基の挿入または欠失に関連している。ＣＯＳＭＩＤ（ＣＲＩＳＰＲ Ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ Ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈ Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ，Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）（ｃｒｉｓｐｒ．ｂｍｅ．ｇａｔｅｃｈ．ｅｄｕにてウェブ上で利用可能）と呼ばれる典型的なバイオインフォマティクスツールが、かかる類似性をまとめている。他のバイオインフォマティクスツールとしては、ａｕｔｏＣＯＳＭＩＤ及びＣＣＴｏｐが挙げられるがこれらに限定されない。
【0445】
バイオインフォマティクスを用いて、オフターゲット切断を最小にし、突然変異及び染色体再配置の有害作用を低減した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系に関する研究で、特にＰＡＭ領域から遠位でのガイド鎖のＤＮＡ配列への塩基対ミスマッチ及び／またはバルジを伴う非特異的ハイブリダイゼーションに起因するオフターゲット活性の可能性が示唆された。従って、塩基対ミスマッチに加えて、ＲＮＡガイド鎖とゲノム配列間に挿入及び／または欠失を有する潜在的なオフターゲット部位を特定することができるバイオインフォマティクスツールを有することが重要である。該オフターゲット予測アルゴリズムに基づくバイオインフォマティクスツールであるＣＣＴｏｐを用いて、潜在的なＣＲＩＳＰＲのオフターゲット部位についてゲノムを検索した（ＣＣＴｏｐは、ｃｒｉｓｐｒ．ｃｏｓ．ｕｎｉ－ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／にてウェブ上で利用可能である）。その出力は、ミスマッチの数及び位置に基づく潜在的なオフターゲット部位のリストをランク付けして、より多くの情報に基づく標的部位の選択を可能にし、オフターゲット切断の可能性が高い部位の使用を回避した。
【0446】
ある領域におけるｇＲＮＡ標的部位の推定されたオンターゲット及び／またはオフターゲット活性を量るさらなるバイオインフォマティクスのパイプラインを使用した。活性を予測するために使用され得る他の特徴としては、問題の細胞型に関する情報、ＤＮＡアクセシビリティ、クロマチン状態、転写因子の結合部位、転写因子の結合データ、及び他のＣＨＩＰ－ｓｅｑデータが挙げられる。編集効率を予測するさらなる因子、例えば、ｇＲＮＡ対の相対位置及び方向、局所的配列の特徴、ならびにマイクロホモロジー等を検討した。
【0447】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的部位の最初の評価及びスクリーニングは、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子のエクソン１～１７、イントロン１～１６、エクソン１の上流１００～３００ｂｐに位置する配列、及び隣接イントロン配列の１００～３００ｂｐに重点を置いた。これらのｇＲＮＡはまた、１つ以上のヌクレオチド、エクソン配列、及び／またはイントロン配列を編集するために使用することもできる。
【0448】
最初のバイオインフォマティクス分析では、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子のエクソン１～１７、イントロン１～１６、エクソン１の上流１００～３００ｂｐに位置する配列、及びイントロン配列に隣接する１００～３００ｂｐ配列をターゲティングする１０９５のｇＲＮＡが特定された。予測オフターゲット部位のさらなる分析及びＳＣＮ１０Ａ遺伝子内のｇＲＮＡ標的部位の評価によって、１９２のｇＲＮＡがスクリーニング用に選択された。ＳＣＮ１０Ａ遺伝子のエクソン１～９をターゲティングする１９２の単一ｇＲＮＡの優先順位リストを、ｓｐＣａｓ９を用いて切断効率について調べた（表７）。
【表7-1】
【表7-2】
【表7-3】
【表7-4】
【表7-5】
【0449】
これらの配列番号は、ゲノム標的のＤＮＡ配列を表しているが、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡのスペーサー配列は、このＤＮＡ配列のＲＮＡバージョンになることに留意されたい。
【0450】
実施例８－ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ｇＲＮＡのスクリーニングにおける好ましいガイドの検討
同族ＤＮＡ標的領域を編集することができる広範囲のｇＲＮＡ対を特定するため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ｇＲＮＡのスクリーニングを行った。関連ゲノム配列を、ｇＲＮＡ設計ソフトウェアを用いる分析に供した。得られたｇＲＮＡのリストは、配列の一意性（ゲノムの他の部位で完全なマッチがないｇＲＮＡのみを選抜した）、及び最小のオフターゲット予測に基づいて上記のｇＲＮＡの選択リストに絞った。このｇＲＮＡのセットをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸを用いてＣａｓ９を構成的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの４８時間後に採取し、ゲノムＤＮＡを単離し、ＴＩＤＥ分析を用いて切断効率を評価した（図２Ａ～Ｈ、図３Ａ～Ｃ）。
同族ＤＮＡ標的領域を編集することができる広範囲のｇＲＮＡ対を特定するため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ｇＲＮＡのスクリーニングを行った。関連ゲノム配列を、ｇＲＮＡ設計ソフトウェアを用いる分析に供した。得られたｇＲＮＡのリストは、配列の一意性（ゲノムの他の部位で完全なマッチがないｇＲＮＡのみを選抜した）、及び最小のオフターゲット予測に基づいて上記のｇＲＮＡの選択リストに絞った。このｇＲＮＡのセットをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸを用いてＣａｓ９を構成的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクションの４８時間後に採取し、ゲノムＤＮＡを単離し、ＴＩＤＥ分析を用いて切断効率を評価した（図２Ａ～Ｈ、図３Ａ～Ｃ）。
【0451】
有意な活性を有するｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ対をその後培養細胞中で追跡調査し、ＳＣＮ１０Ａのタンパク質発現を測定してもよい。オフターゲット事象も追跡することができる。様々な細胞をトランスフェクトすることができ、遺伝子修正のレベル及び起こり得るオフターゲット事象が測定され得る。これらの実験で、ヌクレアーゼ及びドナーの設計ならびに送達が最適化される。
【0452】
実施例９－オフターゲット活性に関する細胞内での好ましいガイドの検討
上記実施例におけるＩＶＴスクリーニングからの最良のオンターゲット活性を有するｇＲＮＡを、オフターゲット活性に関して、ハイブリッドキャプチャ分析、ＧＵＩＤＥ Ｓｅｑ．、及び全ゲノム配列決定を他の方法に加えて用いて検討した。
上記実施例におけるＩＶＴスクリーニングからの最良のオンターゲット活性を有するｇＲＮＡを、オフターゲット活性に関して、ハイブリッドキャプチャ分析、ＧＵＩＤＥ Ｓｅｑ．、及び全ゲノム配列決定を他の方法に加えて用いて検討した。
【0453】
実施例１０－関連する動物モデルでのｉｎ ｖｉｖｏ試験
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／ガイドの組み合わせを評価した後、先頭の処方を動物モデルにてｉｎ ｖｉｖｏで試験する。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／ガイドの組み合わせを評価した後、先頭の処方を動物モデルにてｉｎ ｖｉｖｏで試験する。
【0454】
ヒト細胞での培養で、上記の通り、ヒト標的及びバックグラウンドヒトゲノムに対する直接の試験が可能になる。
【0455】
前臨床有効性及び安全性評価は、マウスモデルにおける末梢神経系の改変マウスまたはヒトニューロンの生着を通して観察することができる。修飾細胞は、生着後数か月で観察することができる。
【0456】
ＸＩ．均等物及び範囲
当業者であれば、日常的な実験のみを用いて、本明細書に記載の本発明に従う特定の実施例に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。本開示の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲に記載の通りである。
当業者であれば、日常的な実験のみを用いて、本明細書に記載の本発明に従う特定の実施例に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。本開示の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲に記載の通りである。
【0457】
ある群の１つ以上の成員間に「または」を含む特許請求の範囲または説明は、当該群の成員のうちの１つ、２つ以上、またはすべてが、所与の製品または過程の中に含まれ、その中で使用され、またはそれに関連する場合に、それとは反対に示されない限り、または文脈から明らかでない限り、満たされると見なされる。本開示は、当該群の厳密に１つの成員が所与の製品または過程に含まれ、その中で使用され、またはそれに関連する例を含む。本開示は、２つ以上または全部の群の成員が所与の製品または過程に含まれ、その中で使用され、またはそれに関連する例を含む。
【0458】
さらに、従来技術の範囲内にある本開示のいかなる特定の例も、特許請求の範囲のいずれか１つ以上から明示的に除外され得ることを理解されたい。かかる例は当業者に既知であると考えられることから、該除外が本明細書に明示的に記載されていない場合であっても、それらは除外され得る。本開示の組成物のいかなる特定の例（例えば、任意の抗生物質、治療成分、または活性成分、任意の製造方法、任意の使用方法等）も、先行技術の存在との関係の有無にかかわらず、何らかの理由で、特許請求の範囲のいずれか１つ以上から除外することができる。
【0459】
使用されている単語は、限定ではなく記述の単語であること、及び添付の特許請求の範囲内において、そのより広い観点で、本開示の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく変更がなされ得ることを理解されたい。
【0460】
本発明は、いくつかの記載された実施例に関して、ある程度の特殊性でかなり詳しく説明されてきたが、いかなるかかる項目もしくは実施例またはいかなる特定の実施例にも限定されることを意図するものでなく、添付の特許請求の範囲に関して、従来技術を考慮し、かかる特許請求の範囲の最大限広範な解釈を与えるように、従って、意図される本発明の範囲を効果的に包含するように解釈されるべきである。
【0461】
例示的実施例に関する注記
本開示は、本開示の様々な態様及び／またはその潜在的な用途を例示する目的で様々な特定の態様の説明を提供すると同時に、当業者には、変形及び修正が想到されるであろうことが理解される。
本開示は、本開示の様々な態様及び／またはその潜在的な用途を例示する目的で様々な特定の態様の説明を提供すると同時に、当業者には、変形及び修正が想到されるであろうことが理解される。
【0462】
従って、本明細書に記載の本発明（複数可）は、本明細書に提供する特定の例示的な態様によってより狭く定義されるものではなく、少なくともそれらが請求される通りの広さであるように理解されるべきである。
【0463】
本明細書で特定される任意の特許、刊行物、または他の開示資料は、特に明記しない限り、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれるが、ただし、組み込まれた資料が本明細書に明示的に記載されている既存の説明、定義、記述、または他の開示資料と矛盾しない範囲内においてのみである。従って、必要な範囲で、本明細書に記載されている明示的な開示は、参照することにより組み込まれるいかなる矛盾する資料にも優先する。参照することにより本明細書に組み込まれるといわれるが、本明細書に記載の既存の定義、記述、または他の開示試料と矛盾するいかなる試料またはその一部も、組み込まれた試料及び既存の開示資料間で矛盾が生じない限りにおいてのみ組み込まれる。出願人らは、参照することにより本明細書に組み込まれる任意の主題またはその一部を明示的に列挙するために、本明細書を補正する権利を留保する。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-11-04
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゲノム編集によって細胞内で電位依存性ナトリウムチャネルＸ型アルファサブユニット（ＳＣＮ１０Ａ）遺伝子を編集するための、
（ａ）１つまたは複数のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、または前記１つまたは複数のＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド、及び
（ｂ）１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ、または前記１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡをコードする１つまたは複数の核酸
を含み、前記１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、前記ＳＣＮ１０Ａ遺伝子内またはその近傍のＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列である、スペーサー配列を含む組成物であって、
前記編集は、前記組成物を、前記細胞に導入して、前記ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ制御エレメント内またはその近傍で１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を行い、前記ＳＣＮ１０Ａ遺伝子内またはその近傍に少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的挿入、欠失または変異をもたらし、それによって、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子産物の発現または機能を低減または除去することを含み、
前記１つまたは複数のｇＲＮＡ、または１つまたは複数のｓｇＲＮＡのスペーサー配列は、配列番号３９４０２、４０００２、３６７２３、２６０７４、２６１９０、２６１５０、３６７１９、３９７９５、２６０８７、３６２９３、４００５７、４００５８、３９９９８、２６１８０、３９４１５、２５５３３、３９９９４、３６２５３、４００２６、２６０６３、４００２３、３９８０９、４０００６、３９３７９、２６０８９、または２５８８２に対応するＲＮＡ配列である、組成物。
（ａ）１つまたは複数のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、または前記１つまたは複数のＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド、及び
（ｂ）１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ、または前記１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡをコードする１つまたは複数の核酸
を含み、前記１つまたは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、前記ＳＣＮ１０Ａ遺伝子内またはその近傍のＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列である、スペーサー配列を含む組成物であって、
前記編集は、前記組成物を、前記細胞に導入して、前記ＳＣＮ１０Ａ遺伝子またはＳＣＮ１０Ａ制御エレメント内またはその近傍で１つまたは複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を行い、前記ＳＣＮ１０Ａ遺伝子内またはその近傍に少なくとも１つのヌクレオチドの１つまたは複数の恒久的挿入、欠失または変異をもたらし、それによって、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子産物の発現または機能を低減または除去することを含み、
前記１つまたは複数のｇＲＮＡ、または１つまたは複数のｓｇＲＮＡのスペーサー配列は、配列番号３９４０２、４０００２、３６７２３、２６０７４、２６１９０、２６１５０、３６７１９、３９７９５、２６０８７、３６２９３、４００５７、４００５８、３９９９８、２６１８０、３９４１５、２５５３３、３９９９４、３６２５３、４００２６、２６０６３、４００２３、３９８０９、４０００６、３９３７９、２６０８９、または２５８８２に対応するＲＮＡ配列である、組成物。
【請求項2】
ＳＣＮ１０Ａ関連状態または障害を有する患者を処置するための、末梢神経系のニューロンを含む組成物であって、
前記末梢神経系のニューロンが、
（ａ）請求項１で定義された編集にしたがって、患者特異的誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または間葉系幹細胞を、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子または前記ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の制御エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍で編集すること；及び
（ｂ）前記編集されたｉＰＳＣまたは間葉系幹細胞を末梢神経系のニューロンに分化させること、
によって調製され、
前記組成物が前記患者に投与される、組成物。
前記末梢神経系のニューロンが、
（ａ）請求項１で定義された編集にしたがって、患者特異的誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または間葉系幹細胞を、ＳＣＮ１０Ａ遺伝子または前記ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の制御エレメントをコードする他のＤＮＡ配列内またはその近傍で編集すること；及び
（ｂ）前記編集されたｉＰＳＣまたは間葉系幹細胞を末梢神経系のニューロンに分化させること、
によって調製され、
前記組成物が前記患者に投与される、組成物。
【請求項3】
細胞内でＳＣＮ１０Ａ遺伝子の連続ゲノム配列を変化させるための、請求項１に記載の組成物であって、
前記変化は、前記細胞を前記組成物と接触させて、１種または複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を行うことを含む、組成物。
前記変化は、前記細胞を前記組成物と接触させて、１種または複数の一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）を行うことを含む、組成物。
【請求項4】
前記連続ゲノム配列の変化が前記ＳＣＮ１０Ａ遺伝子の１つまたは複数のエキソンで生じる、請求項３に記載の組成物。
【請求項5】
前記１種または複数のＣａｓ９エンドヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、または前記ｓｐＣａｓ９エンドヌクレアーゼと少なくとも９０％配列同一性を有するバリアントである、請求項１に記載の組成物。
【請求項6】
前記１種または複数のＣａｓ９エンドヌクレアーゼが１つまたは複数のタンパク質またはポリペプチドである、請求項１または５に記載の組成物。
【請求項7】
前記１つまたは複数のＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする１種または複数のポリヌクレオチドが、１つまたは複数のＤＮＡである、請求項１または５に記載の組成物。
【請求項8】
前記１つまたは複数のＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドが、１つまたは複数のＲＮＡである、請求項１または５に記載の組成物。
【請求項9】
前記１つまたは複数のＲＮＡが、化学修飾されている、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記１つまたは複数のＲＮＡが、前記コード領域で化学修飾されている、請求項８に記載の組成物。
【請求項11】
前記１つもしくは複数のＤＮＡまたは１つもしくは複数のＲＮＡが、コドン最適化されている、請求項７～１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項12】
前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが化学修飾されている、請求項１または５に記載の組成物。
【請求項13】
前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡが、前記１つまたは複数のＣａｓ９エンドヌクレアーゼと事前複合体化されている、請求項１または５に記載の組成物。
【請求項14】
前記事前複合体化が、前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡと前記１つまたは複数のＣａｓ９エンドヌクレアーゼとの共有結合を伴う、請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
前記１つまたは複数のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、または１つもしくは複数のＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドが、リポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化されている、請求項１または５に記載の組成物。
【請求項16】
前記１つまたは複数のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、または１つもしくは複数のＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドが、前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ、または前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡをコードする前記１つもしくは複数の核酸も含むリポソームまたは脂質ナノ粒子に製剤化されている、請求項１または５に記載の組成物。
【請求項17】
前記１つまたは複数のＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする前記１つまたは複数のポリヌクレオチドが、ＡＡＶベクター粒子によって提供される、請求項１または５に記載の組成物。
【請求項18】
前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡをコードする前記１つまたは複数の核酸が、ＡＡＶベクター粒子によって提供される、請求項１または５に記載の組成物。
【請求項19】
前記１つまたは複数のＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする前記１つまたは複数のポリヌクレオチド、および前記１つもしくは複数のｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡをコードする前記１つまたは複数の核酸が、ＡＡＶベクター粒子によって提供される、請求項１または５に記載の組成物。
【請求項20】
前記ＡＡＶベクター粒子が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９からなる群から選択される、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項21】
配列番号３９４０２、４０００２、３６７２３、２６０７４、２６１９０、２６１５０、３６７１９、３９７９５、２６０８７、３６２９３、４００５７、４００５８、３９９９８、２６１８０、３９４１５、２５５３３、３９９９４、３６２５３、４００２６、２６０６３、４００２３、３９８０９、４０００６、３９３７９、２６０８９、または２５８８２に対応するＲＮＡ配列である少なくとも１つのスペーサー配列を含む、一分子ガイドＲＮＡ。
【請求項22】
前記一分子ガイドＲＮＡがスペーサーエクステンション領域をさらに含む、請求項２１に記載の一分子ガイドＲＮＡ。
【請求項23】
前記一分子ガイドＲＮＡがｔｒａｃｒＲＮＡエクステンション領域をさらに含む、請求項２１または２２に記載の一分子ガイドＲＮＡ。
【請求項24】
前記一分子ガイドＲＮＡが化学修飾されている、請求項２１～２３に記載の一分子ガイドＲＮＡ。
【請求項25】
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと事前複合体化している、請求項２１～２４のいずれか１項に記載の一分子ガイドＲＮＡ。
【請求項26】
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ９）、又は前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに対して少なくとも９０％相同性を有するバリアントである、請求項２５に記載の一分子ガイドＲＮＡ。
【請求項27】
前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが１つまたは複数の核移行シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項２５又は２６に記載の一分子ガイドＲＮＡ。
【請求項28】
少なくとも１つのＮＬＳが、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのアミノ末端に、またはその５０アミノ酸以内にあり、及び／または少なくとも１つのＮＬＳが、前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのカルボキシ末端に、またはその５０アミノ酸以内にある、請求項２７に記載の一分子ガイドＲＮＡ。
【請求項29】
請求項２１～２４のいずれか１項に記載の一分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【外国語明細書】