(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022191310
(43)【公開日】2022-12-27
(54)【発明の名称】安定型ＶＡＭＰレポーターアッセイ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20221220BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20221220BHJP
C12N 15/53 20060101ALI20221220BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20221220BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20221220BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20221220BHJP
C12N 9/02 20060101ALI20221220BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20221220BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20221220BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20221220BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221220BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20221220BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20221220BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N15/53
C12N15/12
C07K19/00
C07K14/705
C12N9/02
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12Q1/02
G01N33/53 D
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022157328
(22)【出願日】2022-09-30
(62)【分割の表示】P 2019543949の分割
【原出願日】2018-02-14
(31)【優先権主張番号】1702500.8
(32)【優先日】2017-02-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】507330176
【氏名又は名称】ザ・ユニバーシティ・オブ・シェフィールド
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ダヴルトフ、バズベク
(72)【発明者】
【氏名】ピーデン、アンドリュー アレクサンダー
(72)【発明者】
【氏名】ルスト、アレクサンダー ミカエル ルドルフ
(72)【発明者】
【氏名】ドラン、シアラ ルイーズ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】破傷風神経毒活性、Ｂ型ボツリヌス神経毒活性、Ｄ型ボツリヌス神経毒活性、Ｆ型ボツリヌス神経毒活性、Ｇ型ボツリヌス神経毒活性などの神経毒活性の検出のためのポリペプチド、対応する核酸分子、発現ベクターおよび遺伝的に改変された細胞も提供する。また、その方法および使用を提供する。
【解決手段】ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドドメインを含むポリペプチドを提供する。
【選択図】図１
【解決手段】ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドドメインを含むポリペプチドを提供する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ
２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドドメインを含むポリペプチド。
２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドドメインを含むポリペプチド。
【請求項2】
ＶＡＭＰ２活性を有するポリペプチドドメインが、配列番号８もしくは配列番号２また
はそれらの保存的アミノ酸配列変異体、のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペ
プチド。
はそれらの保存的アミノ酸配列変異体、のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペ
プチド。
【請求項3】
ＶＡＭＰ１活性を有するポリペプチドドメインが、配列番号７もしくは配列番号１また
はそれらの保存的アミノ酸配列変異体、のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペ
プチド。
はそれらの保存的アミノ酸配列変異体、のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペ
プチド。
【請求項4】
ＶＡＭＰ３活性を有するポリペプチドドメインが、配列番号９もしくは配列番号３、ま
たはそれらの保存的アミノ酸配列変異体、のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリ
ペプチド。
たはそれらの保存的アミノ酸配列変異体、のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリ
ペプチド。
【請求項5】
ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドドメインが、配列番号４またはその保存的ア
ミノ酸配列変異体、のアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペ
プチド。
ミノ酸配列変異体、のアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペ
プチド。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項7】
請求項６に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項8】
請求項６に記載の核酸分子、または請求項７に記載の発現ベクターを含む、遺伝的に改
変された細胞。
変された細胞。
【請求項9】
前記細胞が、ＳｉＭａ神経芽細胞腫細胞、ＬＡＮ５神経芽細胞腫細胞、ＮＧ１０８神経
芽細胞腫細胞、不死化ニューロンおよび一次ニューロンからなる群から選択される、請求
項８に記載の遺伝的に改変された細胞。
芽細胞腫細胞、不死化ニューロンおよび一次ニューロンからなる群から選択される、請求
項８に記載の遺伝的に改変された細胞。
【請求項10】
神経毒活性の検出のための、請求項１～９のいずれか一項に記載のポリペプチド、核酸
分子、発現ベクター、または遺伝子改変細胞の使用であって、前記神経毒活性は、破傷風
神経毒活性、Ｂ型ボツリヌス神経毒活性、Ｄ型ボツリヌス神経毒活性、Ｆ型ボツリヌス神
経毒活性、Ｇ型ボツリヌス神経毒活性、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から
選択される、使用。
分子、発現ベクター、または遺伝子改変細胞の使用であって、前記神経毒活性は、破傷風
神経毒活性、Ｂ型ボツリヌス神経毒活性、Ｄ型ボツリヌス神経毒活性、Ｆ型ボツリヌス神
経毒活性、Ｇ型ボツリヌス神経毒活性、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から
選択される、使用。
【請求項11】
神経毒活性が、製剤、食品試料、臨床試料、または環境試料、またはそれらの任意の組
合せを含む試験試料中で検出される、請求項１０に記載の使用。
合せを含む試験試料中で検出される、請求項１０に記載の使用。
【請求項12】
前記神経毒活性が、破傷風トキソイド、またはボツリヌストキソイド、またはそれらの
組み合わせを含む試験試料において検出される、請求項１０または１１に記載の使用。
組み合わせを含む試験試料において検出される、請求項１０または１１に記載の使用。
【請求項13】
前記神経毒活性が、破傷風神経毒、Ｂ型ボツリヌス神経毒、Ｄ型ボツリヌス神経毒、Ｆ
型ボツリヌス神経毒、Ｇ型ボツリヌス神経毒、またはそれらの任意の組み合わせを含む試
験試料において検出される、請求項１０または１１に記載の使用。
型ボツリヌス神経毒、Ｇ型ボツリヌス神経毒、またはそれらの任意の組み合わせを含む試
験試料において検出される、請求項１０または１１に記載の使用。
【請求項14】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで神経毒活性を検出する方法であって、
（ａ）ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよびＶＡＭＰ１、Ｖ
ＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドを含むポリペプチドの発現を
可能にする条件下での、請求項８または９に記載の遺伝的に改変された細胞を培養するこ
と；
（ｂ）ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよびＶＡＭＰ１、Ｖ
ＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドを含むポリペプチドの神経毒
誘発性切断を可能にする条件下で、（ａ）の細胞を試験試料の存在下で培養すること；及
び
（ｃ）ポリペプチドの神経毒誘発切断のレベルの決定であって、ポリペプチドの神経毒誘
発切断の検出が神経毒活性の指標であり、神経毒活性は、破傷風神経毒活性、Ｂ型ボツリ
ヌス神経毒活性、Ｄ型ボツリヌス神経毒活性、Ｆ型ボツリヌス神経毒活性及びＧ型ボツリ
ヌス神経毒活性、又はこれらの組み合わせからなる群より選択される、決定；
を含む、方法。
（ａ）ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよびＶＡＭＰ１、Ｖ
ＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドを含むポリペプチドの発現を
可能にする条件下での、請求項８または９に記載の遺伝的に改変された細胞を培養するこ
と；
（ｂ）ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよびＶＡＭＰ１、Ｖ
ＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドを含むポリペプチドの神経毒
誘発性切断を可能にする条件下で、（ａ）の細胞を試験試料の存在下で培養すること；及
び
（ｃ）ポリペプチドの神経毒誘発切断のレベルの決定であって、ポリペプチドの神経毒誘
発切断の検出が神経毒活性の指標であり、神経毒活性は、破傷風神経毒活性、Ｂ型ボツリ
ヌス神経毒活性、Ｄ型ボツリヌス神経毒活性、Ｆ型ボツリヌス神経毒活性及びＧ型ボツリ
ヌス神経毒活性、又はこれらの組み合わせからなる群より選択される、決定；
を含む、方法。
【請求項15】
培養工程（ａ）および（ｂ）が同時に行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記試験試料が培養培地中に提供される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項17】
前記ポリペプチドの神経毒誘発性切断が、ＥＬＩＳＡ、イムノブロット、または生細胞
イメージングによって検出される、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
イメージングによって検出される、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記試験試料が、薬剤製品、食品試料、臨床試料、もしくは環境試料、またはそれらの
任意の組み合わせを含む、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
任意の組み合わせを含む、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記試験試料が破傷風トキソイド、またはボツリヌストキソイド、またはそれらの組み
合わせを含む、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法。
合わせを含む、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記試験試料が、破傷風神経毒、Ｂ型ボツリヌス神経毒、Ｄ型ボツリヌス神経毒、Ｆ型
ボツリヌス神経毒、Ｇ型ボツリヌス神経毒、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項
１４～１８のいずれか一項に記載の方法。
ボツリヌス神経毒、Ｇ型ボツリヌス神経毒、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項
１４～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
（ａ）ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメイン、およびＶＡＭＰ１、
ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドドメインを含むポリペプチ
ドをコードする核酸分子；並びに、
（ｂ）（ａ）の核酸分子によってコードされるポリペプチドを切断することができる、
神経毒活性を検出するための陽性対照
を含む、神経毒活性を検出するためのキット。
ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドドメインを含むポリペプチ
ドをコードする核酸分子；並びに、
（ｂ）（ａ）の核酸分子によってコードされるポリペプチドを切断することができる、
神経毒活性を検出するための陽性対照
を含む、神経毒活性を検出するためのキット。
【請求項22】
前記核酸分子が発現ベクターの一部である、請求項２１に記載のキット。
【請求項23】
前記核酸分子が遺伝的に改変された細胞内にある、請求項２１または２２に記載のキッ
ト。
ト。
【請求項24】
前記遺伝的に改変された細胞が、遺伝的に改変されたＳｉＭａ神経芽細胞腫細胞、ＬＡ
Ｎ５神経芽細胞腫細胞、ＮＧ１０８神経芽細胞腫細胞、不死化ニューロンおよび一次ニュ
ーロンからなる群から選択される、請求項２３に記載のキット。
Ｎ５神経芽細胞腫細胞、ＮＧ１０８神経芽細胞腫細胞、不死化ニューロンおよび一次ニュ
ーロンからなる群から選択される、請求項２３に記載のキット。
【請求項25】
前記キットが、ルシフェラーゼ活性の検出のための試薬をさらに含む、請求項２１～２
４のいずれか一項に記載のキット。
４のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインと、ＶＡＭＰ１、Ｖ
ＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドドメインとを含むポリペプチ
ドを提供する。ここでＶＡＭＰは小胞関連膜タンパク質を表す。対応する核酸分子、発現
ベクターおよび遺伝的に改変された細胞も提供される。本発明はまた、その方法および使
用を提供する。
ＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドドメインとを含むポリペプチ
ドを提供する。ここでＶＡＭＰは小胞関連膜タンパク質を表す。対応する核酸分子、発現
ベクターおよび遺伝的に改変された細胞も提供される。本発明はまた、その方法および使
用を提供する。
【背景技術】
【0002】
破傷風は、細菌クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)によって引き起こされ
る急性毒素媒介性疾患である。壊死性創傷におけるような好ましい嫌気性条件下では、こ
の遍在性バチルスは破傷風毒素、極めて強力な神経毒素を産生する可能性がある。破傷風
神経毒（本明細書では「ＴｅＮＴ」または「ＴＮｘ」とも呼ばれる）は中枢神経系におけ
る抑制性神経伝達を遮断し、特徴的な筋肉の硬直および痙攣をもたらす（１）。現代の集
中治療が可能であっても、致死率は高い（最大８０％）。
る急性毒素媒介性疾患である。壊死性創傷におけるような好ましい嫌気性条件下では、こ
の遍在性バチルスは破傷風毒素、極めて強力な神経毒素を産生する可能性がある。破傷風
神経毒（本明細書では「ＴｅＮＴ」または「ＴＮｘ」とも呼ばれる）は中枢神経系におけ
る抑制性神経伝達を遮断し、特徴的な筋肉の硬直および痙攣をもたらす（１）。現代の集
中治療が可能であっても、致死率は高い（最大８０％）。
【0003】
破傷風および関連するボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）は、主にニューロン特異的ガン
グリオシドおよびタンパク質との相互作用のために、高い親和性でニューロンに結合する
大きなマルチドメインタンパク質である（１、５）。この結合は、エフェクター部分から
構造的に分離された５０ｋＤａ結合ドメインによって媒介される。ニューロン結合に続い
て、神経毒はエンドサイトーシス小胞に内在化され、そこで酸性化のためにコンフォメー
ション変化を受ける。このｐＨ誘発構造変化により、軽鎖としても知られるプロテアーゼ
が、タンパク質分解標的が存在する細胞質ゾルへ放出される。特定のタンパク質分解標的
は破傷風神経毒、Ｂ型ボツリヌス神経毒、Ｄ型ボツリヌス神経毒、Ｆ型ボツリヌス神経毒
、およびＧ型ボツリヌス神経毒を含む、特定の神経毒に依存し、すべてが小胞関連膜タン
パク質（ＶＡＭＰ）１、２、および３を（切断部位は別々だが）切断する。
グリオシドおよびタンパク質との相互作用のために、高い親和性でニューロンに結合する
大きなマルチドメインタンパク質である（１、５）。この結合は、エフェクター部分から
構造的に分離された５０ｋＤａ結合ドメインによって媒介される。ニューロン結合に続い
て、神経毒はエンドサイトーシス小胞に内在化され、そこで酸性化のためにコンフォメー
ション変化を受ける。このｐＨ誘発構造変化により、軽鎖としても知られるプロテアーゼ
が、タンパク質分解標的が存在する細胞質ゾルへ放出される。特定のタンパク質分解標的
は破傷風神経毒、Ｂ型ボツリヌス神経毒、Ｄ型ボツリヌス神経毒、Ｆ型ボツリヌス神経毒
、およびＧ型ボツリヌス神経毒を含む、特定の神経毒に依存し、すべてが小胞関連膜タン
パク質（ＶＡＭＰ）１、２、および３を（切断部位は別々だが）切断する。
【0004】
ＶＡＭＰ１、２および３は神経伝達に必須であり、そしてそれらの切断により神経伝達
物質の分泌が遮断され、死に至る可能性がある（１、５）。一例として、ＶＡＭＰ２切断
は神経伝達物質放出の強力な遮断をもたらし、その後、神経筋麻痺をもたらす。残念なが
ら、切断されたＶＡＭＰ２は未知のニューロン内メカニズムによって非常に迅速に分解さ
れるため、切断されたＶＡＭＰ２分子の検出は事実上不可能である。
物質の分泌が遮断され、死に至る可能性がある（１、５）。一例として、ＶＡＭＰ２切断
は神経伝達物質放出の強力な遮断をもたらし、その後、神経筋麻痺をもたらす。残念なが
ら、切断されたＶＡＭＰ２は未知のニューロン内メカニズムによって非常に迅速に分解さ
れるため、切断されたＶＡＭＰ２分子の検出は事実上不可能である。
【0005】
ヒトおよび管理動物の両方において、破傷風は、破傷風トキソイド（解毒形態のＴｅＮＴ
）を含むワクチンでの免疫化によって予防される。破傷風トキソイドは、その免疫特性を
破壊することなく、ホルムアルデヒドで無毒化することによって、ＴｅＮＴから調製され
る。破傷風ワクチンの生産は、（ｉ）ＴｅＮＴの生産、（ｉｉ）ＴｅＮＴの化学的不活性
化、および（ｉｉｉ）残留ＴｅＮＴ活性の試験（２）を含む。製造方法は、トキソイドが
毒素に戻らないようなものである。
）を含むワクチンでの免疫化によって予防される。破傷風トキソイドは、その免疫特性を
破壊することなく、ホルムアルデヒドで無毒化することによって、ＴｅＮＴから調製され
る。破傷風ワクチンの生産は、（ｉ）ＴｅＮＴの生産、（ｉｉ）ＴｅＮＴの化学的不活性
化、および（ｉｉｉ）残留ＴｅＮＴ活性の試験（２）を含む。製造方法は、トキソイドが
毒素に戻らないようなものである。
【0006】
破傷風ワクチンの製造全体を通して、残留神経毒活性の検査が不可欠である。破傷風製
品の安全性を評価するために使用される伝統的なツールは何十年にもわたってほとんど変
わらず、評価は依然として神経筋麻痺に関連する致死効果を伴うげっ歯類バイオアッセイ
に依拠している。ＷＨＯガイドラインに従って、それぞれの新しいトキソイドバッチにつ
いて、モルモットまたはマウスを用いた残留ＴｅＮＴ麻痺活性の試験をしなければならな
い（２）。動物の安全性試験は費用がかかり、労力がかかり、時間がかかる（３、４）。
ワクチン産生後でさえ、ＴｅＮＴ活性の回復が起こり得るために、破傷風ワクチンの貯蔵
特性について、さらなるげっ歯類バイオアッセイ試験が行われる。ＷＨＯが最近、完全に
破傷風に対抗する割合がヒト集団の８０億人に達する、という目標を発表したことを考慮
すると、破傷風トキソイドの生産および評価のためには、新規で、進歩した、より効率的
な方法が必要である。
品の安全性を評価するために使用される伝統的なツールは何十年にもわたってほとんど変
わらず、評価は依然として神経筋麻痺に関連する致死効果を伴うげっ歯類バイオアッセイ
に依拠している。ＷＨＯガイドラインに従って、それぞれの新しいトキソイドバッチにつ
いて、モルモットまたはマウスを用いた残留ＴｅＮＴ麻痺活性の試験をしなければならな
い（２）。動物の安全性試験は費用がかかり、労力がかかり、時間がかかる（３、４）。
ワクチン産生後でさえ、ＴｅＮＴ活性の回復が起こり得るために、破傷風ワクチンの貯蔵
特性について、さらなるげっ歯類バイオアッセイ試験が行われる。ＷＨＯが最近、完全に
破傷風に対抗する割合がヒト集団の８０億人に達する、という目標を発表したことを考慮
すると、破傷風トキソイドの生産および評価のためには、新規で、進歩した、より効率的
な方法が必要である。
【0007】
破傷風トキソイドによる全ヒト免疫は既にＷＨＯの目的に基づいているが、多くの家畜
は破傷風だけでなくＤ型ボツリヌスに対しても日常的に免疫化されている（６）。ボツリ
ヌスワクチンはまた、残留神経毒活性があるかどうかを決定するために、開発中に試験す
る必要がある。破傷風ワクチンと同様に、げっ歯類バイオアッセイがボツリヌスワクチン
の安全性を評価するために通常使用されている。
は破傷風だけでなくＤ型ボツリヌスに対しても日常的に免疫化されている（６）。ボツリ
ヌスワクチンはまた、残留神経毒活性があるかどうかを決定するために、開発中に試験す
る必要がある。破傷風ワクチンと同様に、げっ歯類バイオアッセイがボツリヌスワクチン
の安全性を評価するために通常使用されている。
【0008】
破傷風およびボツリヌストキソイドの残留神経毒活性をテストするための新規な動物代
替アッセイが必要とされている。さらに、Ｂ型ボツリヌス神経毒素は、その効力試験を必
要とする認可された医薬である。動物置換アッセイは神経毒作用：細胞表面結合、内在化
および基質（例えば、ＶＡＭＰ２）切断の３つの工程の全てを考慮する必要があることは
、広く認められている。今日まで、２つの主要な問題が、このような細胞ベースのアッセ
イの開発を妨げてきた：破傷風およびボツリヌス神経毒素に強く結合する連続細胞株の欠
如、および切断された産物の急速な分解である（それによって、神経毒作用の産物の検出
を妨げる）。
替アッセイが必要とされている。さらに、Ｂ型ボツリヌス神経毒素は、その効力試験を必
要とする認可された医薬である。動物置換アッセイは神経毒作用：細胞表面結合、内在化
および基質（例えば、ＶＡＭＰ２）切断の３つの工程の全てを考慮する必要があることは
、広く認められている。今日まで、２つの主要な問題が、このような細胞ベースのアッセ
イの開発を妨げてきた：破傷風およびボツリヌス神経毒素に強く結合する連続細胞株の欠
如、および切断された産物の急速な分解である（それによって、神経毒作用の産物の検出
を妨げる）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよびＶＡＭ
Ｐ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドドメインを含む新規
レポーター分子を開発した。レポーター分子は、破傷風神経毒、Ｂ型ボツリヌス神経毒、
Ｄ型ボツリヌス神経毒、Ｆ型ボツリヌス神経毒および／またはＧ型ボツリヌス神経毒（な
らびに神経毒活性を保持するキメラを含むその改変型）によって切断され得る。レポータ
ー分子の切断により、２つの切断産物；ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチド
ドメインおよびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するポリペプチドドメ
インの一部を含む第１の断片；およびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有
するポリペプチドドメインの残りの部分を含む第２の断片が生成される。驚くべきことに
、ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインは、第１のフラグメントの細
胞内分解を低減または防止する。従って、有利なことに、新規なレポーター分子は、神経
毒活性の定量的測定のための新規な機構を提供する。
Ｐ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドドメインを含む新規
レポーター分子を開発した。レポーター分子は、破傷風神経毒、Ｂ型ボツリヌス神経毒、
Ｄ型ボツリヌス神経毒、Ｆ型ボツリヌス神経毒および／またはＧ型ボツリヌス神経毒（な
らびに神経毒活性を保持するキメラを含むその改変型）によって切断され得る。レポータ
ー分子の切断により、２つの切断産物；ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチド
ドメインおよびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するポリペプチドドメ
インの一部を含む第１の断片；およびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有
するポリペプチドドメインの残りの部分を含む第２の断片が生成される。驚くべきことに
、ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインは、第１のフラグメントの細
胞内分解を低減または防止する。従って、有利なことに、新規なレポーター分子は、神経
毒活性の定量的測定のための新規な機構を提供する。
【0010】
本発明者らは、Ｃ末端ＶＡＭＰ２ポリペプチドに結合したＮ末端ルシフェラーゼポリペ
プチドを含む新規レポーター分子をコードする新規核酸分子を生成することによって、本
発明を例示した。核酸分子は、遺伝的に改変されたＳｉＭａ神経芽細胞腫細胞株において
発現された。細胞を、適切なボツリヌスまたは破傷風神経毒の存在下で培養し、レポータ
ー分子の神経毒誘発性切断を研究した。驚くべきことに、新規レポーター分子の神経毒誘
発性切断は切断産物の分解の減少により、定量的に検出することができた。
プチドを含む新規レポーター分子をコードする新規核酸分子を生成することによって、本
発明を例示した。核酸分子は、遺伝的に改変されたＳｉＭａ神経芽細胞腫細胞株において
発現された。細胞を、適切なボツリヌスまたは破傷風神経毒の存在下で培養し、レポータ
ー分子の神経毒誘発性切断を研究した。驚くべきことに、新規レポーター分子の神経毒誘
発性切断は切断産物の分解の減少により、定量的に検出することができた。
【0011】
ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２およびＶＡＭＰ３の機能、構造および神経毒切断部位は非常に
類似しており、高度に保存されている。したがって、本発明はＣ末端ＶＡＭＰ２ポリペプ
チドドメイン（すなわち、ＶＡＭＰ２活性を有するポリペプチドドメイン）を含む新規レ
ポーター構築物を用いて例示されたが、本発明はＶＡＭＰ２活性を有するポリペプチドド
メインがＶＡＭＰ１またはＶＡＭＰ３活性を有するポリペプチドドメインで置換されたレ
ポーター構築物にも等しく適用される。
類似しており、高度に保存されている。したがって、本発明はＣ末端ＶＡＭＰ２ポリペプ
チドドメイン（すなわち、ＶＡＭＰ２活性を有するポリペプチドドメイン）を含む新規レ
ポーター構築物を用いて例示されたが、本発明はＶＡＭＰ２活性を有するポリペプチドド
メインがＶＡＭＰ１またはＶＡＭＰ３活性を有するポリペプチドドメインで置換されたレ
ポーター構築物にも等しく適用される。
【0012】
このようなポリペプチドをコードする核酸分子および発現ベクターもまた、本明細書中
に提供される。核酸分子および／または発現ベクターは任意の適切な宿主細胞（すなわち
、遺伝的に改変された細胞）内に存在し得る。
に提供される。核酸分子および／または発現ベクターは任意の適切な宿主細胞（すなわち
、遺伝的に改変された細胞）内に存在し得る。
【0013】
１つの局面において、本発明は、ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメ
イン、およびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチド
ドメインを含むポリペプチドを提供する。
イン、およびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチド
ドメインを含むポリペプチドを提供する。
【0014】
好ましくは、ＶＡＭＰ２活性を有するポリペプチドドメインが、配列番号８もしくは配
列番号２のアミノ酸配列、またはその保存的アミノ酸配列変異体を含む。
列番号２のアミノ酸配列、またはその保存的アミノ酸配列変異体を含む。
【0015】
好ましくは、ＶＡＭＰ１活性を有するポリペプチドドメインが、配列番号７もしくは配
列番号１のアミノ酸配列、またはその保存的アミノ酸配列変異体を含む。
列番号１のアミノ酸配列、またはその保存的アミノ酸配列変異体を含む。
【0016】
好ましくは、ＶＡＭＰ３活性を有するポリペプチドドメインが、配列番号９もしくは配
列番号３のアミノ酸配列、またはその保存的アミノ酸配列変異体を含む。
列番号３のアミノ酸配列、またはその保存的アミノ酸配列変異体を含む。
【0017】
好ましくは、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドドメインが、配列番号４のアミ
ノ酸配列またはその保存的アミノ酸配列変異体を含む。
ノ酸配列またはその保存的アミノ酸配列変異体を含む。
【0018】
一態様では、本発明は、本発明によるポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【0019】
一態様では、本発明は、本発明による核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
【0020】
一態様では、本発明は、本発明による核酸分子、または本発明による発現ベクターを含
む遺伝的に改変された細胞を提供する。
む遺伝的に改変された細胞を提供する。
【0021】
好ましくは、遺伝子改変細胞がＳｉＭａ神経芽細胞腫細胞、ＬＡＮ５神経芽細胞腫細胞
、ＮＧ１０８神経芽細胞腫細胞、不死化ニューロンおよび一次ニューロンからなる群から
選択される。
、ＮＧ１０８神経芽細胞腫細胞、不死化ニューロンおよび一次ニューロンからなる群から
選択される。
【0022】
１つの局面において、本発明は神経毒活性の検出のための、本発明によるポリペプチド
、核酸分子、発現ベクター、または遺伝的に改変された細胞の使用を提供し、ここで、神
経毒活性は、破傷風神経毒活性、Ｂ型ボツリヌス神経毒活性、Ｄ型ボツリヌス神経毒活性
、Ｆ型ボツリヌス神経毒活性およびＧ型ボツリヌス神経毒活性、またはそれらの任意の組
み合わせからなる群から選択される。
、核酸分子、発現ベクター、または遺伝的に改変された細胞の使用を提供し、ここで、神
経毒活性は、破傷風神経毒活性、Ｂ型ボツリヌス神経毒活性、Ｄ型ボツリヌス神経毒活性
、Ｆ型ボツリヌス神経毒活性およびＧ型ボツリヌス神経毒活性、またはそれらの任意の組
み合わせからなる群から選択される。
【0023】
好ましくは、神経毒活性が製剤、食品試料、臨床試料、環境試料、またはそれらの任意
の組合せを含む試験試料中で検出される。
の組合せを含む試験試料中で検出される。
【0024】
好ましくは、神経毒活性が破傷風トキソイドもしくはボツリヌストキソイド、またはそ
れらの組み合わせを含む試験試料において検出される。
れらの組み合わせを含む試験試料において検出される。
【0025】
好ましくは、神経毒活性が破傷風神経毒素、Ｂ型ボツリヌス神経毒素、Ｄ型ボツリヌス
神経毒素、Ｆ型ボツリヌス神経毒素もしくはＧ型ボツリヌス神経毒素、またはそれらの任
意の組合せを含む試験試料中で検出される。試験試料は天然に存在する神経毒および／ま
たは修飾された（例えば、キメラを含む人工的に修飾された）バージョンを含み得る。
神経毒素、Ｆ型ボツリヌス神経毒素もしくはＧ型ボツリヌス神経毒素、またはそれらの任
意の組合せを含む試験試料中で検出される。試験試料は天然に存在する神経毒および／ま
たは修飾された（例えば、キメラを含む人工的に修飾された）バージョンを含み得る。
【0026】
一態様では、本発明が以下（ａ）～（ｃ）を含む、試験試料中の神経毒活性を検出する
方法を提供する:
（ａ）ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよびＶＡＭＰ１、Ｖ
ＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドを含むポリペプチドの発現を
可能にする条件下で、本発明による遺伝的に改変された細胞を培養する工程；
（ｂ）（ａ）ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよびＶＡＭＰ
１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドを含むポリペプチドの
神経毒誘発性切断を可能にする条件下で、（ａ）の細胞を試験試料の存在下で培養する工
程；
（ｃ）ポリペプチドの神経毒誘発性切断のレベルの決定であって、ここでポリペプチド
の神経毒誘発性切断の検出が、ポリペプチドの神経毒誘発切断のレベルの決定であって、
ポリペプチドの神経毒誘発切断の検出が神経毒活性を示し、神経毒活性は、破傷風神経毒
活性、Ｂ型ボツリヌス神経毒活性、Ｄ型ボツリヌス神経毒活性、Ｆ型ボツリヌス神経毒活
性及びＧ型ボツリヌス神経毒活性、又はこれらの組み合わせからなる群より選択される、
決定；
方法を提供する:
（ａ）ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよびＶＡＭＰ１、Ｖ
ＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドを含むポリペプチドの発現を
可能にする条件下で、本発明による遺伝的に改変された細胞を培養する工程；
（ｂ）（ａ）ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよびＶＡＭＰ
１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドを含むポリペプチドの
神経毒誘発性切断を可能にする条件下で、（ａ）の細胞を試験試料の存在下で培養する工
程；
（ｃ）ポリペプチドの神経毒誘発性切断のレベルの決定であって、ここでポリペプチド
の神経毒誘発性切断の検出が、ポリペプチドの神経毒誘発切断のレベルの決定であって、
ポリペプチドの神経毒誘発切断の検出が神経毒活性を示し、神経毒活性は、破傷風神経毒
活性、Ｂ型ボツリヌス神経毒活性、Ｄ型ボツリヌス神経毒活性、Ｆ型ボツリヌス神経毒活
性及びＧ型ボツリヌス神経毒活性、又はこれらの組み合わせからなる群より選択される、
決定；
【0027】
好ましくは、培養工程（ａ）および（ｂ）は同時に行われる。
【0028】
好ましくは、試験試料は培養培地中に提供される。
【0029】
好ましくは、ポリペプチドの神経毒誘導切断がＥＬＩＳＡ、イムノブロット、または生
細胞イメージングによって検出される。
細胞イメージングによって検出される。
【0030】
好ましくは、試験試料が薬剤製品、食品試料、臨床試料、環境試料、またはそれらの任
意の組合せを含む。
意の組合せを含む。
【0031】
好ましくは、試験試料が破傷風トキソイドもしくはボツリヌストキソイド、またはそれ
らの組み合わせを含む。
らの組み合わせを含む。
【0032】
好ましくは、試験試料が破傷風神経毒、Ｂ型ボツリヌス神経毒、Ｄ型ボツリヌス神経毒
、Ｆ型ボツリヌス神経毒、またはＧ型ボツリヌス神経毒、またはそれらの任意の組合せを
含む。試験試料は天然に存在する神経毒および／または修飾された（例えば、キメラを含
む人工的に修飾された）バージョンを含み得る。
、Ｆ型ボツリヌス神経毒、またはＧ型ボツリヌス神経毒、またはそれらの任意の組合せを
含む。試験試料は天然に存在する神経毒および／または修飾された（例えば、キメラを含
む人工的に修飾された）バージョンを含み得る。
【0033】
１つの局面において、本発明は、
(ａ)ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメイン、およびＶＡＭＰ１、Ｖ
ＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドドメインを含むポリペプチド
をコードする核酸分子；並びに、
(ｂ)（ａ）の核酸分子によってコードされるポリペプチドを切断することができる、神
経毒活性を検出するための陽性対照
を含む、神経毒活性を検出するためのキットを提供する。
(ａ)ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメイン、およびＶＡＭＰ１、Ｖ
ＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドドメインを含むポリペプチド
をコードする核酸分子；並びに、
(ｂ)（ａ）の核酸分子によってコードされるポリペプチドを切断することができる、神
経毒活性を検出するための陽性対照
を含む、神経毒活性を検出するためのキットを提供する。
【0034】
神経毒活性は、破傷風神経毒活性、Ｂ型ボツリヌス神経毒活性、Ｄ型ボツリヌス神経毒
活性、Ｆ型ボツリヌス神経毒活性、およびＧ型ボツリヌス神経毒活性からなる群から選択
され得る。
活性、Ｆ型ボツリヌス神経毒活性、およびＧ型ボツリヌス神経毒活性からなる群から選択
され得る。
【0035】
好ましくは、核酸分子は発現ベクターの一部である。
【0036】
好ましくは、核酸分子が遺伝的に改変された細胞内にある。
【0037】
好ましくは、遺伝的に改変された細胞が、遺伝的に改変されたＳｉＭａ神経芽細胞腫細
胞、ＬＡＮ５神経芽細胞腫細胞、ＮＧ１０８神経芽細胞腫細胞、不死化ニューロンおよび
一次ニューロンからなる群から選択される。
胞、ＬＡＮ５神経芽細胞腫細胞、ＮＧ１０８神経芽細胞腫細胞、不死化ニューロンおよび
一次ニューロンからなる群から選択される。
【0038】
好ましくは、キットがルシフェラーゼ活性の検出のための試薬をさらに含む。
【0039】
本明細書の説明および特許請求の範囲全体を通して、「含む」および「有する」という
用語およびそれらの変形は「含むが、それらに限定されない」ことを意味し、他の部分、
添加剤、成分、整数または工程を除外することを意図しない（そして除外しない）。
用語およびそれらの変形は「含むが、それらに限定されない」ことを意味し、他の部分、
添加剤、成分、整数または工程を除外することを意図しない（そして除外しない）。
【0040】
本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、単数形はその状況が他のことを要求し
ていない限り、複数形を含む。特に、不定冠詞が使用される場合は本明細書がその状況が
他のことを要求していない限り、単数だけでなく複数も意図していると理解されたい。
ていない限り、複数形を含む。特に、不定冠詞が使用される場合は本明細書がその状況が
他のことを要求していない限り、単数だけでなく複数も意図していると理解されたい。
【0041】
本発明の特定の態様、実施形態もしくは実施例と結び付けて記載される特徴、実体、特
性、化合物、化学的部分もしくは化学基は矛盾していない限り、本明細書に記載した任意
の他の態様、実施形態もしくは実施例に適用できると理解されたい。
性、化合物、化学的部分もしくは化学基は矛盾していない限り、本明細書に記載した任意
の他の態様、実施形態もしくは実施例に適用できると理解されたい。
【0042】
本明細書で言及される特許、科学および技術文献は、出願時に当業者に利用可能であっ
た知識を確立する。本明細書に引用されている、発行された特許、公開された特許出願、
および係属中の特許出願、ならびに他の刊行物の開示全体はそれぞれが、参照により組み
込まれることが明確にかつ個別に示さるのと、同じ程度まで、参照により本明細書に組み
込まれる。矛盾がある場合には、本開示が優先される。
た知識を確立する。本明細書に引用されている、発行された特許、公開された特許出願、
および係属中の特許出願、ならびに他の刊行物の開示全体はそれぞれが、参照により組み
込まれることが明確にかつ個別に示さるのと、同じ程度まで、参照により本明細書に組み
込まれる。矛盾がある場合には、本開示が優先される。
【0043】
本発明の様々な態様を、以下でさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0044】
本発明の実施形態は、添付の図面を参照して以下にさらに説明される:
【0045】
【図1】パネルＡ：細胞の感染のために示されたウイルスベクターに挿入された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）－ＶＡＭＰ２構築物を示す。パネルＢ：神経芽細胞腫細胞は、ピューロマイシン選択後に強いＧＦＰ－ＶＡＭＰ２発現を示す。明視野およびＧＦＰ蛍光画像を示す。パネルＣ：小胞構造（上部）に局在するＧＦＰ－ＶＡＭＰ２はｍＣｈｅｒｒｙタンパク質（右下部）に融合した破傷風軽鎖の発現時に、細胞質ゾル（左下部）に放出され得る。パネルＤ：安定な切断されたＧＦＰ－ＶＡＭＰ２産物は、ＧＦＰ抗体を使用する従来のイムノブロッティングによって検出され得る。
【図2】不死化マウスニューロンが切断されたＧＦＰ－ＶＡＭＰ２産物の出現によって証明されるように、ボツリヌス神経毒素Ｄ型に感受性であることを示す。毒素感受性細胞におけるＧＦＰ－ＶＡＭＰ２の切断（ブロット）およびＧＦＰ－ＶＡＭＰ２の細胞質転移（右パネル）に注目されたい。
【図3】ペルオキシダーゼＡＰＥＸ２（ＡＰＸ２）およびルシフェラーゼ（ＮａｎｏＬｕｃ）とのＶＡＭＰ２融合物が、ウイルス形質導入ＳｉＭａ神経芽細胞腫細胞において安定な形態で発現されることを示す；両方の構築物はＨＡタグ（イムノブロッティングのために使用される、左パネル）を担持する。ＨＡタグ免疫染色を用いて明らかにされるように、融合タンパク質は小胞構造に局在する（右パネル）。
【図4】ＮａｎｏＬｕｃ－ＶＡＭＰ２レポーターを運ぶように操作されたＳｉＭａ神経芽細胞腫細胞が１０ｎＭボツリヌス神経毒素Ｂ型およびＤでの４８時間の処理後に切断を示すことを示す。ＡＰＥＸ２－ＶＡＭＰレポーター分子はボツリヌス切断に耐性である。切断されたＶＡＭＰ２産物の出現は、全ＶＡＭＰ２抗体を用いたイムノブロッティングによって実証される。ボツリヌスＢ型切断産物と比較して、ボツリヌスＤ型切断産物の明らかにより速い遊走は、Ｇｌｎ７６の代わりにＬｙｓ５９位でのＶＡＭＰの切断されることと一致する。
【図5】ＢｏＮＴ ＢおよびＤ（ｎＭ）での滴定後のイムノブロットを示し、ＳｉＭａ細胞がＢｏＮＴ／ＤよりもＢｏＮＴ／Ｂに対してより感受性であることを明らかにする。抗ＶＡＭＰ２抗体を用いた検出は、ＢｏＮＴ／Ｂについては１ｎＭまで、ＢｏＮＴ／Ｄについては１０ｎＭまでの切断を示す。高度に特異的なＢｏＮＴ／Ｂ切断ＶＡＭＰ２およびＢｏＮＴ／Ｄ切断ＶＡＭＰ２抗体を用いる検出は、ＢｏＮＴ／Ｂについては３００ｐＭまで、ＢｏＮＴ／Ｄについては１０ｎＭまでの切断を示す。抗ＢｏＮＴ／Ｂ切断ＶＡＭＰ２抗体および抗ＢｏＮＴ／Ｄ切断ＶＡＭＰ２抗体は、それぞれ、ペプチドＡＬＱＡＧＡＳＱおよびペプチドＫＶＬＥＲＤＱＫに対して作られたものである。
【図6】イムノブロッティングとNanoLuc ELISAアッセイとの間の感度の比較を、２つの手法間のＥＣ50の比較で示す。しかし、NanoLucアッセイは、３０ｐＭまでのベースラインを上回る、ＢｏＮＴ／ＢによるＶＡＭＰ切断を検出する能力を有する、より高い感度を示した（右パネル）。NanoLuc ELISAアッセイは、高度に特異的なＢｏＮＴ切断ＶＡＭＰ２抗体を担持するマイクロプレート上でのボツリヌス切断ＮａｎｏＬｕｃ－ＶＡＭＰ産物の捕捉と、その後のマイクロプレートルミノメーター上での発光の読み取りとを含む。
【図7】イムノブロッティングを示し、ＮａｎｏＬｕｃアッセイは両方とも破傷風毒素によるＶＡＭＰ２の切断を検出するために使用され得るが、ＳｉＭａ神経芽細胞腫細胞における感受性はＢｏＮＴ／ＢおよびＢｏＮＴ／Ｄで見られるものよりも低い。
【図8】ヒトＶＡＭＰ１のアミノ酸配列（配列番号１）を提供する。ヒトＶＡＭＰ１のアミノ酸４０～１１８に下線が付けられている（配列番号７）。
【図9】ヒトＶＡＭＰ２のアミノ酸配列（配列番号２）を提供する。ヒトＶＡＭＰ２のアミノ酸３８～１１６に下線が付けられている（配列番号８）。
【図10】ヒトＶＡＭＰ３のアミノ酸配列（配列番号３）を提供する。ヒトＶＡＭＰ３のアミノ酸２１～１００に下線が付けられている（配列番号９）。
【図11】ＮａｎｏＬｕｃ（配列番号４）のアミノ酸配列を提供する。
【図12】ＨＡ－ＡＰＥＸ－ＶＡＭＰ２構築物の核酸配列（配列番号５）を提供する。
【図13】ＨＡ－ＮａｎｏＬｕｃ－ＶＡＭＰ２構築物の核酸配列（配列番号６）を提供する。
【図14】Ｎａｎｏｌｕｃ－ＶＡＭＰ２発現細胞が、本明細書でＩ－ＩＶと称される新規な合成バージョンのＢｏＮＴ／Ｂの能力を区別するために使用され得ることを示す。ＢｏＮＴ／Ｂ製剤Ｉ～ＩＶを指示範囲（ｎＭ）に６５時間適用した場合、イムノブロットはＮａｎｏｌｕｃ－ＶＡＭＰ２の切断の程度が異なることを示す。検出は、ペプチドＡＬＱＡＧＡＳＱに対して生成された切断ＶＡＭＰ２抗体を用いた。抗ＳＮＡＰ２５抗体をローディングコントロールとして使用した。
【図15】ヒトＶＡＭＰ１のアミノ酸４０～１１８（配列番号７）（本明細書においてＶＡＭＰ１のコアアミノ酸配列とも呼ばれる）を示す。
【図16】ヒトＶＡＭＰ２のアミノ酸３８～１１６（配列番号８）（本明細書においてＶＡＭＰ２のコアアミノ酸配列とも呼ばれる）を示す。
【図17】ヒトＶＡＭＰ３のアミノ酸２１～１００（配列番号９）（本明細書においてＶＡＭＰ３のコアアミノ酸配列とも呼ばれる）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0046】
数十年間、面倒な動物アッセイを、破傷風および／またはボツリヌス神経毒素作用にお
けるすべての重要な段階の高感度評価を可能にするインビトロアッセイに置き換えること
が強く望まれてきた。連続細胞株はマウスバイオアッセイに取って代わることができるア
ッセイを開発するために必要な感度を欠いていることが定説であるが、同時に、一次ニュ
ーロンまたは胚細胞由来ニューロンの使用は、それらが動物組織から新たに誘導されなけ
ればならなかったり、またはそれらが完全に分化するまでに複雑なプロトコールおよび週
／月を要することが、それら自体に難題があることを投げかけるものであった。治療用Ａ
型ボツリヌス神経毒素のＳＮＡＰ２５切断活性を測定する、ＳｉＭａ神経芽細胞腫細胞系
を利用した最初の細胞ベースの効力アッセイは、マウスバイオアッセイ（１１）より優れ
ていることが判明した（ＥＣ５０～１ Ｕ／ウェル）。しかし、破傷風および／またはボ
ツリヌス神経毒のＶＡＭＰ切断活性を測定するための同等のアッセイの開発は、ＶＡＭＰ
切断産物の急速な分解のために困難であることが証明されている。
けるすべての重要な段階の高感度評価を可能にするインビトロアッセイに置き換えること
が強く望まれてきた。連続細胞株はマウスバイオアッセイに取って代わることができるア
ッセイを開発するために必要な感度を欠いていることが定説であるが、同時に、一次ニュ
ーロンまたは胚細胞由来ニューロンの使用は、それらが動物組織から新たに誘導されなけ
ればならなかったり、またはそれらが完全に分化するまでに複雑なプロトコールおよび週
／月を要することが、それら自体に難題があることを投げかけるものであった。治療用Ａ
型ボツリヌス神経毒素のＳＮＡＰ２５切断活性を測定する、ＳｉＭａ神経芽細胞腫細胞系
を利用した最初の細胞ベースの効力アッセイは、マウスバイオアッセイ（１１）より優れ
ていることが判明した（ＥＣ５０～１ Ｕ／ウェル）。しかし、破傷風および／またはボ
ツリヌス神経毒のＶＡＭＰ切断活性を測定するための同等のアッセイの開発は、ＶＡＭＰ
切断産物の急速な分解のために困難であることが証明されている。
【0047】
本発明者らは、今回、ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよび
ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドドメインを含
む新規レポーター分子を開発した。レポーター分子は、破傷風神経毒、Ｂ型ボツリヌス神
経毒、Ｄ型ボツリヌス神経毒、Ｆ型ボツリヌス神経毒、および／またはＧ型ボツリヌス神
経毒（ならびに神経毒活性を保持するキメラを含むその改変型）によって切断され得る。
レポーター分子の切断は、２つの切断産物；ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプ
チドドメインおよびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するポリペプチド
ドメインの一部を含む第１の断片；およびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性
を有するポリペプチドドメインの残りの部分を含む第２の断片を生成する。驚くべきこと
に、ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインは、第１のフラグメントの
分解を低減または防止する。従って、有利なことには、新規なレポーター分子が神経毒活
性の定量的測定のための新規な機構を提供する。この新規なレポーター分子の使用（例え
ば、不死化ニューロン細胞株を使用する細胞ベースのアッセイにおける）はボツリヌスお
よび破傷風ワクチン産生を加速し、ならびにボツリヌス中毒の治療的ボツリヌス産物試験
および診断的検出を容易にすることが予想される。
ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドドメインを含
む新規レポーター分子を開発した。レポーター分子は、破傷風神経毒、Ｂ型ボツリヌス神
経毒、Ｄ型ボツリヌス神経毒、Ｆ型ボツリヌス神経毒、および／またはＧ型ボツリヌス神
経毒（ならびに神経毒活性を保持するキメラを含むその改変型）によって切断され得る。
レポーター分子の切断は、２つの切断産物；ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプ
チドドメインおよびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するポリペプチド
ドメインの一部を含む第１の断片；およびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性
を有するポリペプチドドメインの残りの部分を含む第２の断片を生成する。驚くべきこと
に、ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインは、第１のフラグメントの
分解を低減または防止する。従って、有利なことには、新規なレポーター分子が神経毒活
性の定量的測定のための新規な機構を提供する。この新規なレポーター分子の使用（例え
ば、不死化ニューロン細胞株を使用する細胞ベースのアッセイにおける）はボツリヌスお
よび破傷風ワクチン産生を加速し、ならびにボツリヌス中毒の治療的ボツリヌス産物試験
および診断的検出を容易にすることが予想される。
【0048】
本発明の有用性のさらなる例として、Ｎａｎｏｌｕｃ－ＶＡＭＰ２発現細胞が、ＢｏＮ
Ｔ／Ｂの新規な合成バージョンの効力を区別するために使用され得ることが示される（図
１４を参照のこと）。
Ｔ／Ｂの新規な合成バージョンの効力を区別するために使用され得ることが示される（図
１４を参照のこと）。
【0049】
（ポリペプチド）
ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメイン、およびＶＡＭＰ１、ＶＡＭ
Ｐ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドドメインを含むポリペプチドが提
供される。
ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメイン、およびＶＡＭＰ１、ＶＡＭ
Ｐ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドドメインを含むポリペプチドが提
供される。
【0050】
用語「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書中で交換可能
に使用される。
に使用される。
【0051】
用語ポリペプチド「ドメイン」はポリペプチド鎖の残りの部分から独立して進化し、機
能し、存在することができるポリペプチド配列の一部を指す。典型的には、ポリペプチド
内の各ドメインがコンパクトな三次元構造を形成し得、そしてしばしば、独立して安定で
あり得、そして折り畳まれ得る。本開示の文脈におけるポリペプチド「ドメイン」の例は
、ルシフェラーゼ活性を有するドメイン、ＶＡＭＰ１活性を有するドメイン、ＶＡＭＰ２
活性を有するドメイン、またはＶＡＭＰ３活性を有するドメインである。
能し、存在することができるポリペプチド配列の一部を指す。典型的には、ポリペプチド
内の各ドメインがコンパクトな三次元構造を形成し得、そしてしばしば、独立して安定で
あり得、そして折り畳まれ得る。本開示の文脈におけるポリペプチド「ドメイン」の例は
、ルシフェラーゼ活性を有するドメイン、ＶＡＭＰ１活性を有するドメイン、ＶＡＭＰ２
活性を有するドメイン、またはＶＡＭＰ３活性を有するドメインである。
【0052】
タンパク質のＮ末端（アミノ末端、ＮＨ2末端、Ｎ末端またはアミン末端としても知ら
れる）は、タンパク質またはポリペプチドが遊離アミン基（－ＮＨ2）を有するアミノ酸
で終結している始点である。慣例により、ペプチド配列は、Ｎ末端からＣ末端（左から右
へ）と書かれる。Ｃ末端（カルボキシル末端、カルボキシ末端、Ｃ末端尾部、Ｃ末端、ま
たはＣＯＯＨ末端としても知られる）は、遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）で終結され
たアミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の末端である。
れる）は、タンパク質またはポリペプチドが遊離アミン基（－ＮＨ2）を有するアミノ酸
で終結している始点である。慣例により、ペプチド配列は、Ｎ末端からＣ末端（左から右
へ）と書かれる。Ｃ末端（カルボキシル末端、カルボキシ末端、Ｃ末端尾部、Ｃ末端、ま
たはＣＯＯＨ末端としても知られる）は、遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）で終結され
たアミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の末端である。
【0053】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｎ末端」および「Ｃ末端」は例えば、ポリペプチ
ド内のドメインの相対位置を記載するために使用される。従って、「Ｎ末端」であるドメ
インは、ポリペプチドのＣ末端よりもＮ末端に（相対的な観点で）より近く位置する。逆
に、「Ｃ末端」であるドメインは、（相対的な観点で）ポリペプチドのＮ末端よりもＣ末
端の近くに位置する。本明細書中で使用される場合、用語「位置づけられた」は例えば、
ポリペプチドの直鎖状アミノ酸配列内のドメインの位置をいう。
ド内のドメインの相対位置を記載するために使用される。従って、「Ｎ末端」であるドメ
インは、ポリペプチドのＣ末端よりもＮ末端に（相対的な観点で）より近く位置する。逆
に、「Ｃ末端」であるドメインは、（相対的な観点で）ポリペプチドのＮ末端よりもＣ末
端の近くに位置する。本明細書中で使用される場合、用語「位置づけられた」は例えば、
ポリペプチドの直鎖状アミノ酸配列内のドメインの位置をいう。
【0054】
用語「Ｎ末端」および「Ｃ末端」は、ポリペプチド内の２つ以上のドメインの相対位置
を記載するために使用され得る。この文脈において、「Ｎ末端」であるドメインは、（相
対的な観点で）「Ｃ末端」であるドメインよりもポリペプチドのＮ末端により近く位置づ
けられる。逆に、「Ｃ末端」であるドメインは、（相対的な観点で）「Ｎ末端」であるド
メインよりもポリペプチドのＣ末端により近くに位置づけられる。
を記載するために使用され得る。この文脈において、「Ｎ末端」であるドメインは、（相
対的な観点で）「Ｃ末端」であるドメインよりもポリペプチドのＮ末端により近く位置づ
けられる。逆に、「Ｃ末端」であるドメインは、（相対的な観点で）「Ｎ末端」であるド
メインよりもポリペプチドのＣ末端により近くに位置づけられる。
【0055】
「Ｎ末端」であるドメインはポリペプチドのＮ末端であってもよいが、そうである必要
はない（すなわち、それは遊離アミン基を有するアミノ酸によって終結されるポリペプチ
ドの開始であってもよいが、そうである必要はない）。換言すれば、Ｎ末端ドメインの最
初のアミノ酸は、ポリペプチドの最初のアミノ酸である必要はない（しかし、そうであっ
てもよい）。この手段はポリペプチドのＮ末端と「Ｎ末端」ドメインの始まりとの間に、
他のアミノ酸、ポリペプチドドメイン（例えば、ＨＡタグなどのタグ）などが存在し得る
ことである（ただし、ドメインがポリペプチドのＣ末端よりもＮ末端により近くに位置づ
けられることを条件とする；またはドメインが「Ｃ末端」であるドメインよりもＮ末端に
より近くに位置づけられることを条件として、２つ以上のドメインの相対位置を記述する
ために使用される場合である）。
はない（すなわち、それは遊離アミン基を有するアミノ酸によって終結されるポリペプチ
ドの開始であってもよいが、そうである必要はない）。換言すれば、Ｎ末端ドメインの最
初のアミノ酸は、ポリペプチドの最初のアミノ酸である必要はない（しかし、そうであっ
てもよい）。この手段はポリペプチドのＮ末端と「Ｎ末端」ドメインの始まりとの間に、
他のアミノ酸、ポリペプチドドメイン（例えば、ＨＡタグなどのタグ）などが存在し得る
ことである（ただし、ドメインがポリペプチドのＣ末端よりもＮ末端により近くに位置づ
けられることを条件とする；またはドメインが「Ｃ末端」であるドメインよりもＮ末端に
より近くに位置づけられることを条件として、２つ以上のドメインの相対位置を記述する
ために使用される場合である）。
【0056】
同様に、「Ｃ末端」であるドメインはポリペプチドのＣ末端であってもよいが、そうで
ある必要はない（すなわち、遊離カルボキシル基を有する任意のアミノ酸によって終結さ
れるポリペプチドの末端であってもよいが、そうである必要はない）。換言すれば、Ｃ末
端ドメインの最後のアミノ酸はポリペプチドの最後のアミノ酸である必要はない（しかし
、そうであってもよい）。この手段はポリペプチドのＣ末端と「Ｃ末端」ドメインの末端
との間に、他のアミノ酸、ポリペプチドドメインなど（例えば、タグ）が存在し得ること
である（ただし、ドメインがポリペプチドのＮ末端よりもＣ末端により近くに位置づけら
れることを条件とする；または、ドメインが「Ｎ末端」であるドメインよりもＣ末端によ
り近くに位置づけられることを条件として、２つ以上のドメインの相対位置を記述するた
めに使用される場合である）。
ある必要はない（すなわち、遊離カルボキシル基を有する任意のアミノ酸によって終結さ
れるポリペプチドの末端であってもよいが、そうである必要はない）。換言すれば、Ｃ末
端ドメインの最後のアミノ酸はポリペプチドの最後のアミノ酸である必要はない（しかし
、そうであってもよい）。この手段はポリペプチドのＣ末端と「Ｃ末端」ドメインの末端
との間に、他のアミノ酸、ポリペプチドドメインなど（例えば、タグ）が存在し得ること
である（ただし、ドメインがポリペプチドのＮ末端よりもＣ末端により近くに位置づけら
れることを条件とする；または、ドメインが「Ｎ末端」であるドメインよりもＣ末端によ
り近くに位置づけられることを条件として、２つ以上のドメインの相対位置を記述するた
めに使用される場合である）。
【0057】
Ｎ末端ポリペプチドドメイン（Ａ）およびＣ末端ポリペプチドドメイン（Ｂ）を含むポ
リペプチドは、従来、Ａ－Ｂ、すなわちＮ末端からＣ末端（左から右）と書かれている。
例として、Ｎ末端酵素ルシフェラーゼ（例えば、ＮａｎｏＬｕｃまたは「Ｎｌｕｃ」）ド
メインおよびＣ末端ＶＡＭＰ２ドメインを含むポリペプチドは、従来、Ｎｌｕｃ－ＶＡＭ
Ｐ２（またはＮｌｕｃＶＡＭＰ２）と書かれる。
リペプチドは、従来、Ａ－Ｂ、すなわちＮ末端からＣ末端（左から右）と書かれている。
例として、Ｎ末端酵素ルシフェラーゼ（例えば、ＮａｎｏＬｕｃまたは「Ｎｌｕｃ」）ド
メインおよびＣ末端ＶＡＭＰ２ドメインを含むポリペプチドは、従来、Ｎｌｕｃ－ＶＡＭ
Ｐ２（またはＮｌｕｃＶＡＭＰ２）と書かれる。
【0058】
例として、本発明のポリペプチドは、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドドメイ
ンのＮ末端にＨＡタグを含み得る。他の適切なタグは当技術分野で周知であり、追加的に
または代替的に使用することができる。
ンのＮ末端にＨＡタグを含み得る。他の適切なタグは当技術分野で周知であり、追加的に
または代替的に使用することができる。
【0059】
ルシフェラーゼ活性を有するドメインと、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活
性を有するドメインとの間には、リンカーが存在してもよく、例えば、プロリングリシン
リンカーが使用されてもよい。他の適切なリンカーは当該分野で周知であり、そして付加
的にまたは代替的に使用され得る。
性を有するドメインとの間には、リンカーが存在してもよく、例えば、プロリングリシン
リンカーが使用されてもよい。他の適切なリンカーは当該分野で周知であり、そして付加
的にまたは代替的に使用され得る。
【0060】
本明細書で提供されるポリペプチドは、酵素的ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリ
ペプチドドメインを含む。
ペプチドドメインを含む。
【0061】
「ルシフェラーゼ活性」を有するポリペプチドドメインはルシフェラーゼ酵素の機能的
活性を保持する、すなわち、ルシフェリンおよびフリマジンなどの光子放出基質を酸化す
ることによって生物発光を生成することができるポリペプチドドメインを指す[ACS Chem
Biol. 2012 Nov 16; 7(11): 1848-1857 ‘Engineered Luciferase Reporter from a Deep
Sea Shrimp Utilizing a Novel Imidazopyrazinone Substrate’ Hall et al]。本明細
書中で使用される場合、「ルシフェラーゼ活性」を有するポリペプチドはルシフェリンま
たはフリマジンを酸化することによって生物発光を生じる、酸化酵素のルシフェラーゼク
ラス由来の任意のポリペプチドを含む（すなわち、任意の機能的ルシフェラーゼを含む）
。当業者は、当該分野で公知の慣用的な実験を用いて、ルシフェラーゼ活性を有するポリ
ペプチドドメインをどのように同定するかを容易に知っている。機能的ルシフェラーゼを
同定するための適切な実験は、［Beyond D-luciferin: Expanding the Scope of Biolumi
nescence Imaging in vivo. Spencer T. Adams, Jr., Stephen C. Miller Curr Opin Che
m Biol. 2014; 0: 112-120］に要約されている。
活性を保持する、すなわち、ルシフェリンおよびフリマジンなどの光子放出基質を酸化す
ることによって生物発光を生成することができるポリペプチドドメインを指す[ACS Chem
Biol. 2012 Nov 16; 7(11): 1848-1857 ‘Engineered Luciferase Reporter from a Deep
Sea Shrimp Utilizing a Novel Imidazopyrazinone Substrate’ Hall et al]。本明細
書中で使用される場合、「ルシフェラーゼ活性」を有するポリペプチドはルシフェリンま
たはフリマジンを酸化することによって生物発光を生じる、酸化酵素のルシフェラーゼク
ラス由来の任意のポリペプチドを含む（すなわち、任意の機能的ルシフェラーゼを含む）
。当業者は、当該分野で公知の慣用的な実験を用いて、ルシフェラーゼ活性を有するポリ
ペプチドドメインをどのように同定するかを容易に知っている。機能的ルシフェラーゼを
同定するための適切な実験は、［Beyond D-luciferin: Expanding the Scope of Biolumi
nescence Imaging in vivo. Spencer T. Adams, Jr., Stephen C. Miller Curr Opin Che
m Biol. 2014; 0: 112-120］に要約されている。
【0062】
一実施形態において、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドドメインは、配列番号
４に示されるアミノ酸配列、またはその機能的バリアント（または機能的フラグメント）
を含む。このようなバリアントは配列番号４の天然に存在する（例えば、対立遺伝子）、
合成の、または合成的に改善された機能的バリアントであり得る。用語「バリアント」は
また、ホモログを包含する。
４に示されるアミノ酸配列、またはその機能的バリアント（または機能的フラグメント）
を含む。このようなバリアントは配列番号４の天然に存在する（例えば、対立遺伝子）、
合成の、または合成的に改善された機能的バリアントであり得る。用語「バリアント」は
また、ホモログを包含する。
【0063】
機能的バリアントは、通常、配列番号４の１つ以上のアミノ酸の保存的置換、またはタ
ンパク質の非重要領域における非重要アミノ酸の置換、欠失または挿入のみを含む。した
がって、配列番号４の機能的バリアントは、配列番号４の保存的アミノ酸配列変異体であ
り得、その変異体はルシフェラーゼ活性を有する。
ンパク質の非重要領域における非重要アミノ酸の置換、欠失または挿入のみを含む。した
がって、配列番号４の機能的バリアントは、配列番号４の保存的アミノ酸配列変異体であ
り得、その変異体はルシフェラーゼ活性を有する。
【0064】
非機能的バリアントは、ルシフェラーゼ活性を有しない配列番号４のアミノ酸配列変異
体である。非機能的バリアントは、典型的には配列番号４のアミノ酸配列の非保存的置換
、欠失、または挿入もしくは早期切断、または重要なアミノ酸もしくは重要な領域におけ
る置換、挿入もしくは欠失を含む。機能的および非機能的バリアント（例えば、機能的お
よび非機能的対立遺伝子変異体）を同定するための方法は、当業者に周知である。
体である。非機能的バリアントは、典型的には配列番号４のアミノ酸配列の非保存的置換
、欠失、または挿入もしくは早期切断、または重要なアミノ酸もしくは重要な領域におけ
る置換、挿入もしくは欠失を含む。機能的および非機能的バリアント（例えば、機能的お
よび非機能的対立遺伝子変異体）を同定するための方法は、当業者に周知である。
【0065】
ルシフェラーゼにおける重要なアミノ酸および重要でないアミノ酸の概要は、［Engine
ered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazin
one substrate. Hall MP, Unch J, Binkowski BF, Valley MP, Butler BL, Wood MG, Ott
o P, Zimmerman K, Vidugiris G, Machleidt T, Robers MB, Benink HA, Eggers CT, Sla
ter MR, Meisenheimer PL, Klaubert DH, Fan F, Encell LP, Wood KV. ACS Chem Biol.
2012, 7(11):1848-57］に提供されている。したがって、当業者は、配列番号４の保存的
アミノ酸配列変異体などの機能的バリアント（または機能的断片）を提供するために置換
され得るアミノ酸を容易に同定することができるだろう。配列番号４のホモログはまた、
当業者によって、標準的な配列アラインメントプログラムを用いて容易に同定され得る。
ered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazin
one substrate. Hall MP, Unch J, Binkowski BF, Valley MP, Butler BL, Wood MG, Ott
o P, Zimmerman K, Vidugiris G, Machleidt T, Robers MB, Benink HA, Eggers CT, Sla
ter MR, Meisenheimer PL, Klaubert DH, Fan F, Encell LP, Wood KV. ACS Chem Biol.
2012, 7(11):1848-57］に提供されている。したがって、当業者は、配列番号４の保存的
アミノ酸配列変異体などの機能的バリアント（または機能的断片）を提供するために置換
され得るアミノ酸を容易に同定することができるだろう。配列番号４のホモログはまた、
当業者によって、標準的な配列アラインメントプログラムを用いて容易に同定され得る。
【0066】
ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列またははその
部分もしくはフラグメントに対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８
０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、
パーセント同一性が参照配列（例えば、配列番号４）、またはその部分もしくは断片の全
長に対する同一性のパーセンテージとして計算することができる。
部分もしくはフラグメントに対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８
０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、
パーセント同一性が参照配列（例えば、配列番号４）、またはその部分もしくは断片の全
長に対する同一性のパーセンテージとして計算することができる。
【0067】
配列番号４に示されるアミノ酸配列は、ルシフェラーゼＮａｎｏＬｕｃ（Ｐｒｏｍｅｇ
ａにより販売される）のアミノ酸配列である。用語「ＮａｎｏＬｕｃ」および「ＮＬｕｃ
」は、本明細書において交換可能に使用される。ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼに関する
さらなる詳細はＨａｌｌら、ACS chem Biol ２０１２年、７、１８４８～１８５７頁に見
出すことができる。
ａにより販売される）のアミノ酸配列である。用語「ＮａｎｏＬｕｃ」および「ＮＬｕｃ
」は、本明細書において交換可能に使用される。ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼに関する
さらなる詳細はＨａｌｌら、ACS chem Biol ２０１２年、７、１８４８～１８５７頁に見
出すことができる。
【0068】
適切なルシフェラーゼの代替例としては、ホタルPhotinus pyralis由来のホタルルシフ
ェラーゼ（FLuc; EC 1.13.12.7）が含まれる。ホタルルシフェラーゼは、ＡＴＰおよび分
子酸素を用いてルシフェリンの酸素化を触媒し、基底状態への緩和時に光を放出する、非
常に不安定な一重項励起化合物であるオキシルシフェリンを生じる、ユーグロブリンタン
パク質である。様々な他の生物が様々な発光反応において異なるルシフェラーゼを使用し
て、それらの光産生を調節する（例えば、Jack-o-lanternマッシュルームOmphalotus ole
arius、ウミシイタケ（Renilla reniformis、そのルシフェラーゼＲｅｎｉｌｌａ-ルシフ
ェリン２-モノオキシゲナーゼ；ＲＬｕｃ）、および渦鞭毛藻のルシフェラーゼ）;ルシフ
ェラーゼの他の例には、修飾ホタルルシフェラーゼ（Ｕｌｔｒａ-ＧＬｏ;Photuris penny
sylvanica由来）、コメツキムシルシフェラーゼ（ＣＢＬｕｃ；Pyrophorus plagiophthal
amus由来）、Copepod crustaceanルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ；Gaussia princeps由来）お
よびOstracod crustaceanルシフェラーゼ（ＣＬｕｃ；Cypridina noctiluca由来）が含ま
れる）。当該分野で一般的に使用される異なるルシフェラーゼの概説はThorneら、Chem B
iol、２０１０年６月２５日；１７（６）；６４６－６５７に見出され得る。
ェラーゼ（FLuc; EC 1.13.12.7）が含まれる。ホタルルシフェラーゼは、ＡＴＰおよび分
子酸素を用いてルシフェリンの酸素化を触媒し、基底状態への緩和時に光を放出する、非
常に不安定な一重項励起化合物であるオキシルシフェリンを生じる、ユーグロブリンタン
パク質である。様々な他の生物が様々な発光反応において異なるルシフェラーゼを使用し
て、それらの光産生を調節する（例えば、Jack-o-lanternマッシュルームOmphalotus ole
arius、ウミシイタケ（Renilla reniformis、そのルシフェラーゼＲｅｎｉｌｌａ-ルシフ
ェリン２-モノオキシゲナーゼ；ＲＬｕｃ）、および渦鞭毛藻のルシフェラーゼ）;ルシフ
ェラーゼの他の例には、修飾ホタルルシフェラーゼ（Ｕｌｔｒａ-ＧＬｏ;Photuris penny
sylvanica由来）、コメツキムシルシフェラーゼ（ＣＢＬｕｃ；Pyrophorus plagiophthal
amus由来）、Copepod crustaceanルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ；Gaussia princeps由来）お
よびOstracod crustaceanルシフェラーゼ（ＣＬｕｃ；Cypridina noctiluca由来）が含ま
れる）。当該分野で一般的に使用される異なるルシフェラーゼの概説はThorneら、Chem B
iol、２０１０年６月２５日；１７（６）；６４６－６５７に見出され得る。
【0069】
本明細書中に提供されるポリペプチドは、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活
性を有するＣ末端ポリペプチドドメインをさらに含む。
性を有するＣ末端ポリペプチドドメインをさらに含む。
【0070】
本明細書中で使用される場合、「ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有す
る」ポリペプチドドメインは、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３タンパク質とし
て機能し得るポリペプチドドメインをいう。
る」ポリペプチドドメインは、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３タンパク質とし
て機能し得るポリペプチドドメインをいう。
【0071】
ＶＡＭＰは、Ｃ末端内在性膜ドメインによって特徴付けられるタンパク質のファミリー
を包含する。Ｎ末端（アイソフォームおよび種に依存して１～９０アミノ酸以上）は細胞
質ゾルに面し、そしてＳＮＡＰ-２５およびシンタキシンとの相互作用のためのＳＮＡＲ
Ｅモチーフを含む。全てのＶＡＭＰは、膜融合プロセスに関与する。ＶＡＭＰは、エキソ
サイトーシスの前提条件として、そのＮ末端鎖によってシンタキシンおよびＳＮＡＰ-２
５ファミリーメンバーと相互作用して、融合コアまたはＳＮＡＲＥ複合体を形成する。小
胞融合のためのＶＡＭＰの基本的な役割は、ＶＡＭＰノックアウト動物モデルを分析して
示されている。
を包含する。Ｎ末端（アイソフォームおよび種に依存して１～９０アミノ酸以上）は細胞
質ゾルに面し、そしてＳＮＡＰ-２５およびシンタキシンとの相互作用のためのＳＮＡＲ
Ｅモチーフを含む。全てのＶＡＭＰは、膜融合プロセスに関与する。ＶＡＭＰは、エキソ
サイトーシスの前提条件として、そのＮ末端鎖によってシンタキシンおよびＳＮＡＰ-２
５ファミリーメンバーと相互作用して、融合コアまたはＳＮＡＲＥ複合体を形成する。小
胞融合のためのＶＡＭＰの基本的な役割は、ＶＡＭＰノックアウト動物モデルを分析して
示されている。
【0072】
ＶＡＭＰ１およびＶＡＭＰ２はシナプトブレビンとして知られており、脳、脊髄および
末梢ニューロンにおいて発現される。それらは、神経伝達物質放出に関与するシナプス小
胞の構成要素である。ＶＡＭＰ３（セルブレビンとしても知られる）は、偏在的に発現し
、分泌顆粒および分泌小胞の構成成分として、調節性および構成的なエキソサイトーシス
に関与する［Nature Reviews Molecular Cell Biology 2, 98-106 (February 2001) ‘SN
ARE-mediated membrane fusion’ Y. A. Chen & R. H. Scheller］。
末梢ニューロンにおいて発現される。それらは、神経伝達物質放出に関与するシナプス小
胞の構成要素である。ＶＡＭＰ３（セルブレビンとしても知られる）は、偏在的に発現し
、分泌顆粒および分泌小胞の構成成分として、調節性および構成的なエキソサイトーシス
に関与する［Nature Reviews Molecular Cell Biology 2, 98-106 (February 2001) ‘SN
ARE-mediated membrane fusion’ Y. A. Chen & R. H. Scheller］。
【0073】
ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２およびＶＡＭＰ３はすべて、破傷風神経毒（ＴｅＮＴ）、Ｂ型
ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｂ）、Ｄ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｄ）、Ｆ型ボツ
リヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｆ）、およびＧ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｇ）の既知基
質である。神経毒は以下の表１に示すように、保存された切断部位配列でＶＡＭＰ１、Ｖ
ＡＭＰ２およびＶＡＭＰ３基質を切断する。
ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｂ）、Ｄ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｄ）、Ｆ型ボツ
リヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｆ）、およびＧ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｇ）の既知基
質である。神経毒は以下の表１に示すように、保存された切断部位配列でＶＡＭＰ１、Ｖ
ＡＭＰ２およびＶＡＭＰ３基質を切断する。
【0074】
【表1】
を保持し、すなわち小胞に存在し、ＳＮＡＲＥ複合体形成が可能であり、（ｉｉ）破傷風
神経毒（ＴｅＮＴ）、Ｂ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｂ）、Ｄ型ボツリヌス神経毒（
ＢｏＮＴ／Ｄ）、Ｆ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｆ）、およびＧ型ボツリヌス神経毒
（ＢｏＮＴ／Ｇ）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくと
も４つ、または少なくともすべてによって切断することが可能である、ポリペプチドドメ
インを表す。
【0075】
当業者は、当該分野で公知の慣用的な実験を使用して、小胞関連ＶＡＭＰ１活性を有す
るポリペプチドドメインをどのように同定するかを容易に知っている。機能的ＶＡＭＰ１
を同定するための適切な実験は［Identification of a minimal core of the synaptic S
NARE complex sufficient for reversible assembly and disassembly. Fasshauer D, El
iason WK, Brunger AT, Jahn R. Biochemistry. 1998 Jul 21;37(29):10354-62.］および
［Vesicular restriction of synaptobrevin suggests a role for calcium in membrane
fusion. Hu K, Carroll J, Fedorovich S, Rickman C, Sukhodub A, Davletov B. Natur
e. 2002 Feb 7;415(6872):646-50］に要約されている。
るポリペプチドドメインをどのように同定するかを容易に知っている。機能的ＶＡＭＰ１
を同定するための適切な実験は［Identification of a minimal core of the synaptic S
NARE complex sufficient for reversible assembly and disassembly. Fasshauer D, El
iason WK, Brunger AT, Jahn R. Biochemistry. 1998 Jul 21;37(29):10354-62.］および
［Vesicular restriction of synaptobrevin suggests a role for calcium in membrane
fusion. Hu K, Carroll J, Fedorovich S, Rickman C, Sukhodub A, Davletov B. Natur
e. 2002 Feb 7;415(6872):646-50］に要約されている。
【0076】
当業者はまた、破傷風神経毒（ＴｅＮＴ）、ボツリヌス神経毒Ｂ型（ＢｏＮＴ／Ｂ）、
ボツリヌス神経毒Ｄ型（ＢｏＮＴ／Ｄ）、ボツリヌス神経毒Ｆ型（ＢｏＮＴ／Ｆ）、およ
びボツリヌス神経毒Ｇ型（ＢｏＮＴ／Ｇ）の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくと
も３つ、少なくとも４つ、または少なくとも全てによって切断され得るポリペプチドドメ
インを、当該分野で公知の慣用的な実験を使用して、どのように同定するかを容易に認識
する。記載されるように切断され得るポリペプチドドメインを同定するための適切な実験
は、［Specificity of botulinum protease for human VAMP family proteins. Yamamoto
H, et al. Microbiol Immunol, 2012 Apr. PMID 22289120］に要約される。さらに、Ｖ
ＡＭＰ１の適切な切断部位配列の十分なガイダンスを表１に提供する。ポリペプチドドメ
イン中のこれらの保存された切断部位配列の１つ（または複数）の存在はまた、破傷風神
経毒（ＴｅＮＴ）、Ｂ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｂ）、Ｄ型ボツリヌス神経毒（Ｂ
ｏＮＴ／Ｄ）、Ｆ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｆ）、および／またはＧ型ボツリヌス
神経毒（ＢｏＮＴ／Ｇ）によって、適切に切断され得ることを示し得る。
ボツリヌス神経毒Ｄ型（ＢｏＮＴ／Ｄ）、ボツリヌス神経毒Ｆ型（ＢｏＮＴ／Ｆ）、およ
びボツリヌス神経毒Ｇ型（ＢｏＮＴ／Ｇ）の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくと
も３つ、少なくとも４つ、または少なくとも全てによって切断され得るポリペプチドドメ
インを、当該分野で公知の慣用的な実験を使用して、どのように同定するかを容易に認識
する。記載されるように切断され得るポリペプチドドメインを同定するための適切な実験
は、［Specificity of botulinum protease for human VAMP family proteins. Yamamoto
H, et al. Microbiol Immunol, 2012 Apr. PMID 22289120］に要約される。さらに、Ｖ
ＡＭＰ１の適切な切断部位配列の十分なガイダンスを表１に提供する。ポリペプチドドメ
イン中のこれらの保存された切断部位配列の１つ（または複数）の存在はまた、破傷風神
経毒（ＴｅＮＴ）、Ｂ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｂ）、Ｄ型ボツリヌス神経毒（Ｂ
ｏＮＴ／Ｄ）、Ｆ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｆ）、および／またはＧ型ボツリヌス
神経毒（ＢｏＮＴ／Ｇ）によって、適切に切断され得ることを示し得る。
【0077】
一実施形態では、ＶＡＭＰ１活性を有するポリペプチドドメインが、配列番号１に示さ
れるアミノ酸配列、またはその機能的バリアント（または機能的断片）を含む。このよう
な改変体は、配列番号１の天然に存在する（例えば、対立遺伝子）、合成の、または合成
的に改善された官能基バリアントであり得る。用語「バリアント」はまた、ホモログを包
含する。
れるアミノ酸配列、またはその機能的バリアント（または機能的断片）を含む。このよう
な改変体は、配列番号１の天然に存在する（例えば、対立遺伝子）、合成の、または合成
的に改善された官能基バリアントであり得る。用語「バリアント」はまた、ホモログを包
含する。
【0078】
一実施形態では、ＶＡＭＰ１活性を有するポリペプチドドメインが配列番号１のアミノ
酸４０～１１８、またはその機能的バリアント（または機能的断片）を含む。このような
改変体は配列番号１の天然に存在する（例えば、対立遺伝子）、合成の、または合成的に
改善された機能的バリアントであり得る。用語「バリアント」はまた、ホモログを包含す
る。
酸４０～１１８、またはその機能的バリアント（または機能的断片）を含む。このような
改変体は配列番号１の天然に存在する（例えば、対立遺伝子）、合成の、または合成的に
改善された機能的バリアントであり得る。用語「バリアント」はまた、ホモログを包含す
る。
【0079】
配列番号１のアミノ酸４０～１１８は、ＢｏＮＴ相互作用および切断のためのコアＶＡ
ＭＰ１アミノ酸配列を表す（アミノ酸４０～１１８が本明細書では配列番号７とも呼ばれ
、図８（下線アミノ酸のみ）および図１５に示される）。ＶＡＭＰ１アミノ酸配列、Ｂｏ
ＮＴ相互作用および切断部位は当該分野で周知である（例えば、Yamamoto H, Ida T, Tsu
tsuki H, Mori M, Matsumoto T, Kohda T, Mukamoto M, Goshima N, Kozaki S, Ihara H.
Microbiol Immunol. 2012 Apr;56(4):245-53を参照のこと）。従って、ＶＡＭＰ１活性
を有する他の適切なポリペプチドドメインもまた、当業者によって容易に決定され得る。
ＭＰ１アミノ酸配列を表す（アミノ酸４０～１１８が本明細書では配列番号７とも呼ばれ
、図８（下線アミノ酸のみ）および図１５に示される）。ＶＡＭＰ１アミノ酸配列、Ｂｏ
ＮＴ相互作用および切断部位は当該分野で周知である（例えば、Yamamoto H, Ida T, Tsu
tsuki H, Mori M, Matsumoto T, Kohda T, Mukamoto M, Goshima N, Kozaki S, Ihara H.
Microbiol Immunol. 2012 Apr;56(4):245-53を参照のこと）。従って、ＶＡＭＰ１活性
を有する他の適切なポリペプチドドメインもまた、当業者によって容易に決定され得る。
【0080】
機能的バリアントは、代表的には配列番号１の１つ以上のアミノ酸の保存的置換、また
はタンパク質の非重要領域における非重要アミノ酸の置換、欠失または挿入のみを含む。
したがって、配列番号１の機能的バリアントは、配列番号１の保存的アミノ酸配列変異体
であってもよく、その変異体はＶＡＭＰ１活性を有する。
はタンパク質の非重要領域における非重要アミノ酸の置換、欠失または挿入のみを含む。
したがって、配列番号１の機能的バリアントは、配列番号１の保存的アミノ酸配列変異体
であってもよく、その変異体はＶＡＭＰ１活性を有する。
【0081】
非機能的バリアントは、ＶＡＭＰ１活性を有さない配列番号１のアミノ酸配列変異体で
ある。非機能的バリアントは、典型的には配列番号１のアミノ酸配列の非保存的置換、欠
失、または挿入もしくは成熟前切断、または重要なアミノ酸もしくは重要な領域における
置換、挿入もしくは欠失を含む。機能的および非機能的バリアント（例えば、機能的およ
び非機能的対立遺伝子変異体）を同定するための方法は、当業者に周知である。
ある。非機能的バリアントは、典型的には配列番号１のアミノ酸配列の非保存的置換、欠
失、または挿入もしくは成熟前切断、または重要なアミノ酸もしくは重要な領域における
置換、挿入もしくは欠失を含む。機能的および非機能的バリアント（例えば、機能的およ
び非機能的対立遺伝子変異体）を同定するための方法は、当業者に周知である。
【0082】
ＶＡＭＰ１における臨界アミノ酸および非臨界アミノ酸の要約は、[Proc Natl Acad Sc
i U S A. 1998 Dec 22;95(26):15781-6. Conserved structural features of the synapt
ic fusion complex: SNARE proteins reclassified as Q- and R-SNAREs. Fasshauer D,
Sutton RB, Brunger AT, Jahn R]に提供される。したがって、当業者は、配列番号１の保
存的アミノ酸配列変異体などの機能的バリアント（または機能的断片）を提供するために
置換され得るアミノ酸を容易に同定することができるのであろう。配列番号１のホモログ
はまた、当業者によって、標準的な配列アラインメントプログラムを用いて容易に同定さ
れ得る。
i U S A. 1998 Dec 22;95(26):15781-6. Conserved structural features of the synapt
ic fusion complex: SNARE proteins reclassified as Q- and R-SNAREs. Fasshauer D,
Sutton RB, Brunger AT, Jahn R]に提供される。したがって、当業者は、配列番号１の保
存的アミノ酸配列変異体などの機能的バリアント（または機能的断片）を提供するために
置換され得るアミノ酸を容易に同定することができるのであろう。配列番号１のホモログ
はまた、当業者によって、標準的な配列アラインメントプログラムを用いて容易に同定さ
れ得る。
【0083】
ＶＡＭＰ１活性を有するポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、またはその部分
もしくはフラグメントに対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、
８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、同一性
パーセントが参照配列（例えば、配列番号１）、またはその部分もしくは断片の全長に対
する同一性のパーセンテージとして計算することができる。
もしくはフラグメントに対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、
８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、同一性
パーセントが参照配列（例えば、配列番号１）、またはその部分もしくは断片の全長に対
する同一性のパーセンテージとして計算することができる。
【0084】
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、天然に存在するヒトＶＡＭＰ１のアミノ酸配列
である。ヒトＶＡＭＰ１に関するさらなる詳細は、[Specificity of botulinum protease
for human VAMP family proteins. Yamamoto H, et al. Microbiol Immunol, 2012 Apr.
PMID 22289120]に見出すことができる。
である。ヒトＶＡＭＰ１に関するさらなる詳細は、[Specificity of botulinum protease
for human VAMP family proteins. Yamamoto H, et al. Microbiol Immunol, 2012 Apr.
PMID 22289120]に見出すことができる。
【0085】
「ＶＡＭＰ２活性」を有するポリペプチドドメインは（ｉ）ＶＡＭＰ２の機能的活性を
保持する、すなわち小胞に存在し、ＳＮＡＲＥ複合体形成が可能であり、（ｉｉ）破傷風
神経毒（ＴｅＮＴ）、Ｂ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｂ）、Ｄ型ボツリヌス神経毒（
ＢｏＮＴ／Ｄ）、Ｆ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｆ）、およびＧ型ボツリヌス神経毒
（ＢｏＮＴ／Ｇ）の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ
、または少なくともすべてによって切断され得るポリペプチドドメインを指す。
保持する、すなわち小胞に存在し、ＳＮＡＲＥ複合体形成が可能であり、（ｉｉ）破傷風
神経毒（ＴｅＮＴ）、Ｂ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｂ）、Ｄ型ボツリヌス神経毒（
ＢｏＮＴ／Ｄ）、Ｆ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｆ）、およびＧ型ボツリヌス神経毒
（ＢｏＮＴ／Ｇ）の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ
、または少なくともすべてによって切断され得るポリペプチドドメインを指す。
【0086】
当業者は、当該分野で公知の慣用的な実験を使用して、小胞関連ＶＡＭＰ２活性を有す
るポリペプチドドメインをどのように同定するかを容易に知っている。機能的ＶＡＭＰ２
を同定するための適切な実験は、[J Biol Chem. 1999 May 28; 274(22):15440-6. Mixed
and non-cognate SNARE complexes. Characterization of assembly and biophysical pr
operties. Fasshauer D, Antonin W, Margittai M, Pabst S, Jahn R.]および[Nature.
2002. Feb 7;415(6872):646-50. Vesicular restriction of synaptobrevin suggests a
role for calcium in membrane fusion. Hu K, Carroll J, Fedorovich S, Rickman C, S
ukhodub A, Daveltov B.]にまとめられている。
るポリペプチドドメインをどのように同定するかを容易に知っている。機能的ＶＡＭＰ２
を同定するための適切な実験は、[J Biol Chem. 1999 May 28; 274(22):15440-6. Mixed
and non-cognate SNARE complexes. Characterization of assembly and biophysical pr
operties. Fasshauer D, Antonin W, Margittai M, Pabst S, Jahn R.]および[Nature.
2002. Feb 7;415(6872):646-50. Vesicular restriction of synaptobrevin suggests a
role for calcium in membrane fusion. Hu K, Carroll J, Fedorovich S, Rickman C, S
ukhodub A, Daveltov B.]にまとめられている。
【0087】
当業者はまた、破傷風神経毒（ＴｅＮＴ）、ボツリヌス神経毒Ｂ型（ＢｏＮＴ／Ｂ）、
ボツリヌス神経毒Ｄ型（ＢｏＮＴ／Ｄ）、ボツリヌス神経毒Ｆ型（ＢｏＮＴ／Ｆ）、およ
びボツリヌス神経毒Ｇ型（ＢｏＮＴ／Ｇ）の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくと
も３つ、少なくとも４つ、または少なくとも全てによって切断され得るポリペプチドドメ
インを、当該分野で公知の慣用的な実験を使用して、どのように同定するかを容易に認識
する。記載されるように切断され得るポリペプチドドメインを同定するための適切な実験
は、[Specificity of botulinum protease for human VAMP family proteins. Yamamoto
H, et al. Microbiol Immunol, 2012 Apr. PMID 22289120]に要約される。さらに、ＶＡ
ＭＰ２の適切な切断部位配列の十分なガイダンスを表１に提供する。ポリペプチドドメイ
ン中のこれらの保存された切断部位配列の１つ（または複数）の存在はまた、破傷風神経
毒（ＴｅＮＴ）、Ｂ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｂ）、Ｄ型ボツリヌス神経毒（Ｂｏ
ＮＴ／Ｄ）、Ｆ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｆ）、および／またはＧ型ボツリヌス神
経毒（ＢｏＮＴ／Ｇ）によって、適切に切断され得ることを示し得る。
ボツリヌス神経毒Ｄ型（ＢｏＮＴ／Ｄ）、ボツリヌス神経毒Ｆ型（ＢｏＮＴ／Ｆ）、およ
びボツリヌス神経毒Ｇ型（ＢｏＮＴ／Ｇ）の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくと
も３つ、少なくとも４つ、または少なくとも全てによって切断され得るポリペプチドドメ
インを、当該分野で公知の慣用的な実験を使用して、どのように同定するかを容易に認識
する。記載されるように切断され得るポリペプチドドメインを同定するための適切な実験
は、[Specificity of botulinum protease for human VAMP family proteins. Yamamoto
H, et al. Microbiol Immunol, 2012 Apr. PMID 22289120]に要約される。さらに、ＶＡ
ＭＰ２の適切な切断部位配列の十分なガイダンスを表１に提供する。ポリペプチドドメイ
ン中のこれらの保存された切断部位配列の１つ（または複数）の存在はまた、破傷風神経
毒（ＴｅＮＴ）、Ｂ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｂ）、Ｄ型ボツリヌス神経毒（Ｂｏ
ＮＴ／Ｄ）、Ｆ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｆ）、および／またはＧ型ボツリヌス神
経毒（ＢｏＮＴ／Ｇ）によって、適切に切断され得ることを示し得る。
【0088】
１つの実施形態において、ＶＡＭＰ２活性を有するポリペプチドドメインは、配列番号
２に示されるアミノ酸配列、またはその機能的バリアント（または機能的フラグメント）
を含む。このような改変体は配列番号２の天然に存在する（例えば、対立遺伝子）、合成
の、または合成的に改善された機能的バリアントであり得る。用語「変異体」はまた、ホ
モログを包含する。
２に示されるアミノ酸配列、またはその機能的バリアント（または機能的フラグメント）
を含む。このような改変体は配列番号２の天然に存在する（例えば、対立遺伝子）、合成
の、または合成的に改善された機能的バリアントであり得る。用語「変異体」はまた、ホ
モログを包含する。
【0089】
一実施形態では、ＶＡＭＰ２活性を有するポリペプチドドメインが配列番号２のアミノ
酸３８～１１６、またはその機能的バリアント（または機能的断片）を含む。このような
改変体は配列番号２の天然に存在する（例えば、対立遺伝子）、合成の、または合成的に
改善された機能的バリアントであり得る。用語「変異体」はまた、ホモログを包含する。
酸３８～１１６、またはその機能的バリアント（または機能的断片）を含む。このような
改変体は配列番号２の天然に存在する（例えば、対立遺伝子）、合成の、または合成的に
改善された機能的バリアントであり得る。用語「変異体」はまた、ホモログを包含する。
【0090】
配列番号２のアミノ酸３８～１１６は、ＢｏＮＴ相互作用および切断のためのコアＶＡ
ＭＰ２アミノ酸配列を表す（アミノ酸３８～１１６が本明細書では配列番号８とも呼ばれ
、図９（下線アミノ酸のみ）および図１６に示される）。ＶＡＭＰ２アミノ酸配列、Ｂｏ
ＮＴ相互作用および切断部位は当該分野で周知である（例えば、Yamamoto H, Ida T, Tsu
tsuki H, Mori M, Matsumoto T, Kohda T, Mukamoto M, Goshima N, Kozaki S, Ihara H.
Microbiol Immunol. 2012 Apr;56(4):245-53を参照）。従って、ＶＡＭＰ２活性を有す
る他の適切なポリペプチドドメインもまた、当業者によって容易に決定され得る。
ＭＰ２アミノ酸配列を表す（アミノ酸３８～１１６が本明細書では配列番号８とも呼ばれ
、図９（下線アミノ酸のみ）および図１６に示される）。ＶＡＭＰ２アミノ酸配列、Ｂｏ
ＮＴ相互作用および切断部位は当該分野で周知である（例えば、Yamamoto H, Ida T, Tsu
tsuki H, Mori M, Matsumoto T, Kohda T, Mukamoto M, Goshima N, Kozaki S, Ihara H.
Microbiol Immunol. 2012 Apr;56(4):245-53を参照）。従って、ＶＡＭＰ２活性を有す
る他の適切なポリペプチドドメインもまた、当業者によって容易に決定され得る。
【0091】
機能的バリアントは、代表的には配列番号２の１つまたは複数のアミノ酸の保存的置換
、またはタンパク質の非重要領域における非重要アミノ酸の置換、欠失または挿入のみを
含む。したがって、配列番号２の機能的バリアントは、配列番号２の保存的アミノ酸配列
変異体であってもよく、その変異体はＶＡＭＰ２活性を有する。
、またはタンパク質の非重要領域における非重要アミノ酸の置換、欠失または挿入のみを
含む。したがって、配列番号２の機能的バリアントは、配列番号２の保存的アミノ酸配列
変異体であってもよく、その変異体はＶＡＭＰ２活性を有する。
【0092】
非機能的バリアントは、ＶＡＭＰ２活性を有さない配列番号２のアミノ酸配列変異体で
ある。非機能的バリアントは、典型的には配列番号２のアミノ酸配列の非保存的置換、欠
失、または挿入もしくは成熟前切断、または重要なアミノ酸もしくは重要な領域における
置換、挿入もしくは欠失を含む。機能的および非機能的バリアント（例えば、機能的およ
び非機能的対立遺伝子変異体）を同定するための方法は、当業者に周知である。
ある。非機能的バリアントは、典型的には配列番号２のアミノ酸配列の非保存的置換、欠
失、または挿入もしくは成熟前切断、または重要なアミノ酸もしくは重要な領域における
置換、挿入もしくは欠失を含む。機能的および非機能的バリアント（例えば、機能的およ
び非機能的対立遺伝子変異体）を同定するための方法は、当業者に周知である。
【0093】
小胞関連ＶＡＭＰ２における重要および非重要アミノ酸の要約は、[Proc Natl Acad Sc
i U S A. 1998 Dec 22;95(26):15781-6. Conserved structural features of the synapt
ic fusion complex: SNARE proteins reclassified as Q- and R-SNAREs. Fasshauer D,
Sutton RB, Brunger AT, Jahn R]と[Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 May 30;103(22):8
378-83. Conformation of the synaptobrevin transmembrane domain. Bowen M, Brunger
AT.]に提供されている。したがって、当業者は、配列番号２の保存的アミノ酸配列バリ
アントなどの機能的バリアント（または機能的断片）を提供するために置換され得るアミ
ノ酸を容易に同定することができるのであろう。SEQ ID NO:２のホモログはまた、当業者
によって、標準的な配列アラインメントプログラムを用いて容易に同定され得る。
i U S A. 1998 Dec 22;95(26):15781-6. Conserved structural features of the synapt
ic fusion complex: SNARE proteins reclassified as Q- and R-SNAREs. Fasshauer D,
Sutton RB, Brunger AT, Jahn R]と[Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 May 30;103(22):8
378-83. Conformation of the synaptobrevin transmembrane domain. Bowen M, Brunger
AT.]に提供されている。したがって、当業者は、配列番号２の保存的アミノ酸配列バリ
アントなどの機能的バリアント（または機能的断片）を提供するために置換され得るアミ
ノ酸を容易に同定することができるのであろう。SEQ ID NO:２のホモログはまた、当業者
によって、標準的な配列アラインメントプログラムを用いて容易に同定され得る。
【0094】
ＶＡＭＰ２活性を有するポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列、またはその部分
もしくはフラグメントに対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、
８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、同一性
パーセントが参照配列（例えば、配列番号２）、またはその部分もしくは断片の全長に対
する同一性のパーセンテージとして計算することができる。
もしくはフラグメントに対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、
８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、同一性
パーセントが参照配列（例えば、配列番号２）、またはその部分もしくは断片の全長に対
する同一性のパーセンテージとして計算することができる。
【0095】
配列番号２に示されるアミノ酸配列は、天然に存在するヒトＶＡＭＰ２のアミノ酸配列
である。ヒトＶＡＭＰ２に関するさらなる詳細は、[Substrate recognition of VAMP-2 b
y botulinum neurotoxin B and tetanus neurotoxin.Chen S, et al. J Biol Chem, 2008
Jul 25. PMID 18511417]に見出すことができる。
である。ヒトＶＡＭＰ２に関するさらなる詳細は、[Substrate recognition of VAMP-2 b
y botulinum neurotoxin B and tetanus neurotoxin.Chen S, et al. J Biol Chem, 2008
Jul 25. PMID 18511417]に見出すことができる。
【0096】
「ＶＡＭＰ３活性」を有するポリペプチドドメインは（ｉ）ＶＡＭＰ３の機能的活性を
保持し、すなわち小胞に存在し、ＳＮＡＲＥ複合体形成が可能であり、（ｉｉ）破傷風神
経毒（ＴｅＮＴ）、Ｂ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｂ）、Ｄ型ボツリヌス神経毒（Ｂ
ｏＮＴ／Ｄ）、Ｆ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｆ）、およびＧ型ボツリヌス神経毒（
ＢｏＮＴ／Ｇ）の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、
または少なくともすべてによって切断することができるポリペプチドである。
保持し、すなわち小胞に存在し、ＳＮＡＲＥ複合体形成が可能であり、（ｉｉ）破傷風神
経毒（ＴｅＮＴ）、Ｂ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｂ）、Ｄ型ボツリヌス神経毒（Ｂ
ｏＮＴ／Ｄ）、Ｆ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｆ）、およびＧ型ボツリヌス神経毒（
ＢｏＮＴ／Ｇ）の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、
または少なくともすべてによって切断することができるポリペプチドである。
【0097】
当業者は、当技術分野で公知の通常の実験を用いて、ＶＡＭＰ３活性を有するポリペプ
チドドメインをどのように同定するかを容易に知っている。機能的ＶＡＭＰ３を同定する
ための適切な実験は、[J Biol Chem. 1999 May 28; 274(22):15440-6. Mixed and non-co
gnate SNARE complexes. Characterization of assembly and biophysical properties.
Fasshauer D, Antonin W, Margittai M, Pabst S, Jahn R.]に記載されている。
チドドメインをどのように同定するかを容易に知っている。機能的ＶＡＭＰ３を同定する
ための適切な実験は、[J Biol Chem. 1999 May 28; 274(22):15440-6. Mixed and non-co
gnate SNARE complexes. Characterization of assembly and biophysical properties.
Fasshauer D, Antonin W, Margittai M, Pabst S, Jahn R.]に記載されている。
【0098】
当業者はまた、破傷風神経毒（ＴｅＮＴ）、ボツリヌス神経毒Ｂ型（ＢｏＮＴ／Ｂ）、
ボツリヌス神経毒Ｄ型（ＢｏＮＴ／Ｄ）、ボツリヌス神経毒Ｆ型（ＢｏＮＴ／Ｆ）、およ
びボツリヌス神経毒Ｇ型（ＢｏＮＴ／Ｇ）の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくと
も３つ、少なくとも４つ、または少なくとも全てによって切断され得るポリペプチドドメ
インを、当該分野で公知の慣用的な実験を使用して、どのように同定するかを容易に認識
する。記載されるように切断され得るポリペプチドドメインを同定するための適切な実験
は、［Specificity of botulinum protease for human VAMP family proteins. Yamamoto
H, et al. Microbiol Immunol, 2012 Apr. PMID 22289120］に要約される。さらに、Ｖ
ＡＭＰ３の適切な切断部位配列の十分なガイダンスを表１に提供する。ポリペプチドドメ
イン中のこれらの保存された切断部位配列の１つ（または複数）の存在はまた、破傷風神
経毒（ＴｅＮＴ）、Ｂ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｂ）、Ｄ型ボツリヌス神経毒（Ｂ
ｏＮＴ／Ｄ）、Ｆ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｆ）、および／またはＧ型ボツリヌス
神経毒（ＢｏＮＴ／Ｇ）によって、適切に切断され得ることを示し得る。
ボツリヌス神経毒Ｄ型（ＢｏＮＴ／Ｄ）、ボツリヌス神経毒Ｆ型（ＢｏＮＴ／Ｆ）、およ
びボツリヌス神経毒Ｇ型（ＢｏＮＴ／Ｇ）の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくと
も３つ、少なくとも４つ、または少なくとも全てによって切断され得るポリペプチドドメ
インを、当該分野で公知の慣用的な実験を使用して、どのように同定するかを容易に認識
する。記載されるように切断され得るポリペプチドドメインを同定するための適切な実験
は、［Specificity of botulinum protease for human VAMP family proteins. Yamamoto
H, et al. Microbiol Immunol, 2012 Apr. PMID 22289120］に要約される。さらに、Ｖ
ＡＭＰ３の適切な切断部位配列の十分なガイダンスを表１に提供する。ポリペプチドドメ
イン中のこれらの保存された切断部位配列の１つ（または複数）の存在はまた、破傷風神
経毒（ＴｅＮＴ）、Ｂ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｂ）、Ｄ型ボツリヌス神経毒（Ｂ
ｏＮＴ／Ｄ）、Ｆ型ボツリヌス神経毒（ＢｏＮＴ／Ｆ）、および／またはＧ型ボツリヌス
神経毒（ＢｏＮＴ／Ｇ）によって、適切に切断され得ることを示し得る。
【0099】
１つの実施形態において、ＶＡＭＰ３活性を有するポリペプチドドメインは、配列番号
３に示されるアミノ酸配列、またはその機能的バリアント（または機能的フラグメント）
を含む。このようなバリアントは配列番号３の天然に存在する（例えば、対立遺伝子）、
合成の、または合成的に改善された機能的バリアントであり得る。用語「バリアント」は
また、ホモログを包含する。
３に示されるアミノ酸配列、またはその機能的バリアント（または機能的フラグメント）
を含む。このようなバリアントは配列番号３の天然に存在する（例えば、対立遺伝子）、
合成の、または合成的に改善された機能的バリアントであり得る。用語「バリアント」は
また、ホモログを包含する。
【0100】
一実施形態では、ＶＡＭＰ３活性を有するポリペプチドドメインが配列番号３のアミノ
酸２１～１００、またはその機能的バリアント（または機能的断片）を含む。このような
改変体は配列番号３の天然に存在する（例えば、対立遺伝子）、合成の、または合成的に
改善された機能的バリアントであり得る。用語「バリアント」はまた、ホモログを包含す
る。
酸２１～１００、またはその機能的バリアント（または機能的断片）を含む。このような
改変体は配列番号３の天然に存在する（例えば、対立遺伝子）、合成の、または合成的に
改善された機能的バリアントであり得る。用語「バリアント」はまた、ホモログを包含す
る。
【0101】
配列番号３のアミノ酸２１～１００は、ＢｏＮＴ相互作用および切断のためのコアＶＡ
ＭＰ３アミノ酸配列を表す（アミノ酸２１～１００が本明細書では配列番号９とも呼ばれ
、図１０（下線アミノ酸のみ）および図１７に示される）。ＶＡＭＰ３アミノ酸配列、Ｂ
ｏＮＴ相互作用および切断部位は当該分野で周知である（例えば、Yamamoto H, Ida T, T
sutsuki H, Mori M, Matsumoto T, Kohda T, Mukamoto M, Goshima N, Kozaki S, Ihara
H. Microbiol Immunol. 2012 Apr;56(4):245-53を参照のこと）。従って、ＶＡＭＰ３活
性を有する他の適切なポリペプチドドメインもまた、当業者によって容易に決定され得る
。
ＭＰ３アミノ酸配列を表す（アミノ酸２１～１００が本明細書では配列番号９とも呼ばれ
、図１０（下線アミノ酸のみ）および図１７に示される）。ＶＡＭＰ３アミノ酸配列、Ｂ
ｏＮＴ相互作用および切断部位は当該分野で周知である（例えば、Yamamoto H, Ida T, T
sutsuki H, Mori M, Matsumoto T, Kohda T, Mukamoto M, Goshima N, Kozaki S, Ihara
H. Microbiol Immunol. 2012 Apr;56(4):245-53を参照のこと）。従って、ＶＡＭＰ３活
性を有する他の適切なポリペプチドドメインもまた、当業者によって容易に決定され得る
。
【0102】
機能的バリアントは、代表的には配列番号３の１つ以上のアミノ酸の保存的置換、また
はタンパク質の非重要領域における非重要アミノ酸の置換、欠失または挿入のみを含む。
したがって、配列番号３の機能的バリアントは、配列番号３の保存的アミノ酸配列バリア
ントであってもよく、その変異体はＶＡＭＰ３活性を有する。
はタンパク質の非重要領域における非重要アミノ酸の置換、欠失または挿入のみを含む。
したがって、配列番号３の機能的バリアントは、配列番号３の保存的アミノ酸配列バリア
ントであってもよく、その変異体はＶＡＭＰ３活性を有する。
【0103】
非機能的バリアントは、ＶＡＭＰ３活性を有さない配列番号３のアミノ酸配列バリアン
トである。非機能的バリアントは、典型的には配列番号３のアミノ酸配列の非保存的置換
、欠失、または挿入もしくは早期切断、または重要なアミノ酸もしくは重要な領域におけ
る置換、挿入もしくは欠失を含む。機能的および非機能的バリアント（例えば、機能的お
よび非機能的対立遺伝子バリアント）を同定するための方法は、当業者に周知である。
トである。非機能的バリアントは、典型的には配列番号３のアミノ酸配列の非保存的置換
、欠失、または挿入もしくは早期切断、または重要なアミノ酸もしくは重要な領域におけ
る置換、挿入もしくは欠失を含む。機能的および非機能的バリアント（例えば、機能的お
よび非機能的対立遺伝子バリアント）を同定するための方法は、当業者に周知である。
【0104】
ＶＡＭＰ３における重要アミノ酸および非重要アミノ酸の要約は、［Proc Natl Acad S
ci U S A. 1998 Dec 22;95(26):15781-6. Conserved structural features of the synap
tic fusion complex: SNARE proteins reclassified as Q- and R-SNAREs. Fasshauer D,
Sutton RB, Brunger AT, Jahn R］に提供されている。したがって、当業者は、配列番号
３の保存的アミノ酸配列バリアントなどの機能的バリアント（または機能的断片）を提供
するために置換され得るアミノ酸を容易に同定することができるのであろう。配列番号３
のホモログはまた、当業者によって、標準的な配列アラインメントプログラムを用いて容
易に同定され得る。
ci U S A. 1998 Dec 22;95(26):15781-6. Conserved structural features of the synap
tic fusion complex: SNARE proteins reclassified as Q- and R-SNAREs. Fasshauer D,
Sutton RB, Brunger AT, Jahn R］に提供されている。したがって、当業者は、配列番号
３の保存的アミノ酸配列バリアントなどの機能的バリアント（または機能的断片）を提供
するために置換され得るアミノ酸を容易に同定することができるのであろう。配列番号３
のホモログはまた、当業者によって、標準的な配列アラインメントプログラムを用いて容
易に同定され得る。
【0105】
ＶＡＭＰ３活性を有するポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列、またはその部分
もしくはフラグメントに対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、
８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、同一性
パーセントが参照配列（例えば、配列番号３）、またはその部分もしくは断片の全長に対
する同一性のパーセンテージとして計算することができる。
もしくはフラグメントに対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、
８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、同一性
パーセントが参照配列（例えば、配列番号３）、またはその部分もしくは断片の全長に対
する同一性のパーセンテージとして計算することができる。
【0106】
配列番号３に示されるアミノ酸配列は、天然に存在するヒトＶＡＭＰ３のアミノ酸配列
である。ヒトＶＡＭＰ３に関するさらなる詳細は、[Nature Reviews Molecular Cell Bio
logy 2, 98-106 (February 2001) SNARE-mediated membrane fusion’ Y. A. Chen & R.
H. Scheller]に見出される。
である。ヒトＶＡＭＰ３に関するさらなる詳細は、[Nature Reviews Molecular Cell Bio
logy 2, 98-106 (February 2001) SNARE-mediated membrane fusion’ Y. A. Chen & R.
H. Scheller]に見出される。
【0107】
「非必須」または「非重要」アミノ酸残基は生物学的活性を消失させることなく、また
はより好ましくは実質的に変化させることなく、野生型配列（例えば、配列番号１～４の
配列）から変化させることができる残基であるが、「必須」アミノ酸残基はそのような変
化をもたらす。例えば、本発明のポリペプチドの間で保存されるアミノ酸残基は、膜貫通
ドメイン中のアミノ酸残基が活性を有意に変化させることなく、概ね同等の疎水性を有す
る他の残基によって一般に置換され得ることを除いて、特に改変を受け入れ難いと予測さ
れる。
はより好ましくは実質的に変化させることなく、野生型配列（例えば、配列番号１～４の
配列）から変化させることができる残基であるが、「必須」アミノ酸残基はそのような変
化をもたらす。例えば、本発明のポリペプチドの間で保存されるアミノ酸残基は、膜貫通
ドメイン中のアミノ酸残基が活性を有意に変化させることなく、概ね同等の疎水性を有す
る他の残基によって一般に置換され得ることを除いて、特に改変を受け入れ難いと予測さ
れる。
【0108】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換さ
れたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義され
ている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジ
ン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、荷電していない極性側鎖（
例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システ
イン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、
フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、
バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリ
プトファン、ヒスチジン）を含む。従って、タンパク質中の非必須アミノ酸残基は、好ま
しくは同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形
態では飽和突然変異誘発などによって、コード配列の全部または一部に沿って突然変異を
ランダムに導入することができ、得られた突然変異体を生物学的活性についてスクリーニ
ングして、活性を保持する突然変異体を同定することができる。配列番号１～４の突然変
異誘発に続いて、コードされたタンパク質を組換え的に発現させることができ、タンパク
質の生物学的活性を決定することができる。
れたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義され
ている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジ
ン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、荷電していない極性側鎖（
例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システ
イン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、
フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、
バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリ
プトファン、ヒスチジン）を含む。従って、タンパク質中の非必須アミノ酸残基は、好ま
しくは同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形
態では飽和突然変異誘発などによって、コード配列の全部または一部に沿って突然変異を
ランダムに導入することができ、得られた突然変異体を生物学的活性についてスクリーニ
ングして、活性を保持する突然変異体を同定することができる。配列番号１～４の突然変
異誘発に続いて、コードされたタンパク質を組換え的に発現させることができ、タンパク
質の生物学的活性を決定することができる。
【0109】
本明細書中で使用される場合、タンパク質の「生物学的に活性な部分」または「生物学
的活性」を有するタンパク質部分は、分子と非分子との間の相互作用に関与するタンパク
質のフラグメントを含む。タンパク質の生物学的に活性な部分はタンパク質のアミノ酸配
列（例えば、配列番号１～４に示されるアミノ酸配列）に十分に相同であるかまたは由来
するアミノ酸配列を含むペプチドを含み、これは、全長タンパク質よりも少ないアミノ酸
を含み、そしてコードされるタンパク質の少なくとも１つの活性を示す。典型的には生物
学的に活性な部分がタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフ
を含み、例えば、生物学的に活性な部分は以下の活性；ルシフェラーゼ、ＶＡＭＰ１、Ｖ
ＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性のうちの１つを（適切に）保持し得る。
的活性」を有するタンパク質部分は、分子と非分子との間の相互作用に関与するタンパク
質のフラグメントを含む。タンパク質の生物学的に活性な部分はタンパク質のアミノ酸配
列（例えば、配列番号１～４に示されるアミノ酸配列）に十分に相同であるかまたは由来
するアミノ酸配列を含むペプチドを含み、これは、全長タンパク質よりも少ないアミノ酸
を含み、そしてコードされるタンパク質の少なくとも１つの活性を示す。典型的には生物
学的に活性な部分がタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフ
を含み、例えば、生物学的に活性な部分は以下の活性；ルシフェラーゼ、ＶＡＭＰ１、Ｖ
ＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性のうちの１つを（適切に）保持し得る。
【0110】
タンパク質の生物学的に活性な部分は例えば、配列番号１～４の長さが５０、１００、
１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００またはそれ以上のア
ミノ酸であるポリペプチドであり得る。タンパク質の生物学的に活性な部分は媒介される
活性（例えば、本明細書中に記載される生物学的活性）を調節する薬剤を開発するための
標的として使用され得る。
１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００またはそれ以上のア
ミノ酸であるポリペプチドであり得る。タンパク質の生物学的に活性な部分は媒介される
活性（例えば、本明細書中に記載される生物学的活性）を調節する薬剤を開発するための
標的として使用され得る。
【0111】
配列間の配列相同性または同一性（この用語は、本明細書において互換的に使用される
）の算出が以下のように行われる。
）の算出が以下のように行われる。
【0112】
２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配
列は最適な比較目的のために整列される（例えば、ギャップは最適な整列のために第１お
よび第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入され得、そして非相同配列は
比較目的のために無視され得る）。好ましい実施形態において、比較目的で整列された参
照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、よ
り好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好
ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８２％、８４％、８５％、８６％、８７％
、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％
、９８％、９９％、または１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレ
オチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が第２の
配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合、
分子はその位置で同一である（本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸「同一
性」はアミノ酸または核酸「相同性」と同等である）。２つの配列間の同一性パーセント
は、ギャップの数、および２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要が
ある各ギャップの長さを考慮に入れて、配列によって共有される同一位置の数の関数であ
る。
列は最適な比較目的のために整列される（例えば、ギャップは最適な整列のために第１お
よび第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入され得、そして非相同配列は
比較目的のために無視され得る）。好ましい実施形態において、比較目的で整列された参
照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、よ
り好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好
ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８２％、８４％、８５％、８６％、８７％
、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％
、９８％、９９％、または１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレ
オチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が第２の
配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合、
分子はその位置で同一である（本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸「同一
性」はアミノ酸または核酸「相同性」と同等である）。２つの配列間の同一性パーセント
は、ギャップの数、および２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要が
ある各ギャップの長さを考慮に入れて、配列によって共有される同一位置の数の関数であ
る。
【0113】
配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学アルゴリズムを使用
して行われ得る。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセント
は、Needlemanら、(1970) J. Mol. Biol. 48:444-453のアルゴリズム（ＧＣＧソフトウェ
アパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれたアル
ゴリズム）を用いて、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスの
いずれかを使用し、ギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６、または４、およ
び長さウェイト１、２、３、４、５、または６を使用して決定される。さらに別の好まし
い実施形態において、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントはＧＣＧソフトウェ
アパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）中のＧＡＰプログラムを使用し、NWSgap
dna.CMPマトリックスおよび４０、５０、６０、７０、または８０のギャップウェイト、
および１、２、３、４、５、または６の長さウェイトを用いて決定される。特に好ましい
パラメーターのセット（および、実施者が分子が本発明の配列同一性または相同性制限内
にあるかどうかを決定するために適用されるべきパラメーターについて不確かである場合
に使用されるべきもの）は、ギャップペナルティー１２、ギャップエクステンドペナルテ
ィー４、およびフレームシフトギャップペナルティー５を有するＢＬＯＳＵＭ６２スコア
リングマトリックスである。
して行われ得る。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセント
は、Needlemanら、(1970) J. Mol. Biol. 48:444-453のアルゴリズム（ＧＣＧソフトウェ
アパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれたアル
ゴリズム）を用いて、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスの
いずれかを使用し、ギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６、または４、およ
び長さウェイト１、２、３、４、５、または６を使用して決定される。さらに別の好まし
い実施形態において、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントはＧＣＧソフトウェ
アパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）中のＧＡＰプログラムを使用し、NWSgap
dna.CMPマトリックスおよび４０、５０、６０、７０、または８０のギャップウェイト、
および１、２、３、４、５、または６の長さウェイトを用いて決定される。特に好ましい
パラメーターのセット（および、実施者が分子が本発明の配列同一性または相同性制限内
にあるかどうかを決定するために適用されるべきパラメーターについて不確かである場合
に使用されるべきもの）は、ギャップペナルティー１２、ギャップエクステンドペナルテ
ィー４、およびフレームシフトギャップペナルティー５を有するＢＬＯＳＵＭ６２スコア
リングマトリックスである。
【0114】
あるいは、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性がＡＬＩＧＮ
プログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓら（１９８９)ＣＡＢ
ＩＯＳ ４：１１-１７のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル、
ギャップ長ペナルティー１２およびギャップペナルティー４を使用して決定され得る。
プログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓら（１９８９)ＣＡＢ
ＩＯＳ ４：１１-１７のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル、
ギャップ長ペナルティー１２およびギャップペナルティー４を使用して決定され得る。
【0115】
本明細書中に記載される核酸およびタンパク質配列は例えば、他のファミリーメンバー
または関連配列を同定するために、公的データベースに対する検索を行うための「クエリ
ー配列」として使用され得る。このような検索は、Altschul,ら、(1990) J. Mol. Biol.
215:403-410のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用い
て行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同なヌクレ
オチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を
用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコ
ア＝５０、ワード長＝３を用いて実施して、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配
列を得ることができる。比較目的のためにギャップ付きアラインメントを得るために、ギ
ャップ付きＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（1997, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402
）に記載されるように利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを
使用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデ
フォルトパラメーターを使用することができる。＜http://www.ncbi.nlm.nih.gov＞を参
照のこと。
または関連配列を同定するために、公的データベースに対する検索を行うための「クエリ
ー配列」として使用され得る。このような検索は、Altschul,ら、(1990) J. Mol. Biol.
215:403-410のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用い
て行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同なヌクレ
オチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を
用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコ
ア＝５０、ワード長＝３を用いて実施して、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配
列を得ることができる。比較目的のためにギャップ付きアラインメントを得るために、ギ
ャップ付きＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（1997, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402
）に記載されるように利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを
使用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデ
フォルトパラメーターを使用することができる。＜http://www.ncbi.nlm.nih.gov＞を参
照のこと。
【0116】
本明細書中に記載されるポリペプチドは、配列番号１～４のアミノ酸配列と十分にまた
は実質的に同一のアミノ酸配列を有し得る。「十分に同一」または「実質的に同一」とい
う用語は本明細書では第１および第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列が共通の構造ド
メインまたは共通の機能活性を有するように、第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列に
対して十分なまたは最小数の同一または同等の（例えば、類似の側鎖を有する）アミノ酸
残基またはヌクレオチドを含むような、第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列を指すた
めに使用される。例えば、少なくとも約６０％または６５％の同一性、おそらく７５％の
同一性、よりおそらく８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６
％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する共通の構造ドメインを含むアミノ酸ま
たはヌクレオチド配列は、本明細書中で十分にまたは実質的に同一であると定義される。
は実質的に同一のアミノ酸配列を有し得る。「十分に同一」または「実質的に同一」とい
う用語は本明細書では第１および第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列が共通の構造ド
メインまたは共通の機能活性を有するように、第２のアミノ酸またはヌクレオチド配列に
対して十分なまたは最小数の同一または同等の（例えば、類似の側鎖を有する）アミノ酸
残基またはヌクレオチドを含むような、第１のアミノ酸またはヌクレオチド配列を指すた
めに使用される。例えば、少なくとも約６０％または６５％の同一性、おそらく７５％の
同一性、よりおそらく８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６
％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する共通の構造ドメインを含むアミノ酸ま
たはヌクレオチド配列は、本明細書中で十分にまたは実質的に同一であると定義される。
【0117】
（核酸分子）
本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸分子も提供される。
本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸分子も提供される。
【0118】
ポリペプチドをコードする核酸分子は確立された標準的な方法、例えば、Beucage S.L.
ら、(1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869によって記載されるホスホロアミダイ
ト法、またはMatthesら、(1984) EMBO J. 3, p 801-805によって記載される方法によって
合成的に調製されてもよい。ホスホロアミダイト法において、オリゴヌクレオチドは例え
ば、自動ＤＮＡ合成機において合成され、精製され、アニーリングされ、連結され、そし
て適切なベクターにおいてクローニングされる。
ら、(1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869によって記載されるホスホロアミダイ
ト法、またはMatthesら、(1984) EMBO J. 3, p 801-805によって記載される方法によって
合成的に調製されてもよい。ホスホロアミダイト法において、オリゴヌクレオチドは例え
ば、自動ＤＮＡ合成機において合成され、精製され、アニーリングされ、連結され、そし
て適切なベクターにおいてクローニングされる。
【0119】
ヌクレオチド配列は、混合ゲノムおよび合成起源、混合合成およびｃＤＮＡ起源、また
は合成、ゲノムまたはｃＤＮＡ起源の断片を（必要に応じて）標準技術に従って連結する
ことによって調製された混合ゲノムおよびｃＤＮＡ起源であってもよい。各連結断片は、
全ヌクレオチド配列の様々な部分に対応する。ＤＮＡ配列はまた、例えば、ＵＳ ４，６
８３，２０２またはSaiki Rら(Science(1988) 239、pp 487-491)に記載されるように、特
異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製され得る。
は合成、ゲノムまたはｃＤＮＡ起源の断片を（必要に応じて）標準技術に従って連結する
ことによって調製された混合ゲノムおよびｃＤＮＡ起源であってもよい。各連結断片は、
全ヌクレオチド配列の様々な部分に対応する。ＤＮＡ配列はまた、例えば、ＵＳ ４，６
８３，２０２またはSaiki Rら(Science(1988) 239、pp 487-491)に記載されるように、特
異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製され得る。
【0120】
ヌクレオチド配列は、標準的な技術に従って、ゲノムおよび外因性起源の混合物であり
得る。例えば、ヌクレオチド配列は、ｍＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のような遺伝子編集技術
を用いて生成されてもよく、ルシフェラーゼ活性を有するドメインをコードする核酸配列
は、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するドメインをコードする天然核
酸配列の上流に導入される。
得る。例えば、ヌクレオチド配列は、ｍＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のような遺伝子編集技術
を用いて生成されてもよく、ルシフェラーゼ活性を有するドメインをコードする核酸配列
は、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するドメインをコードする天然核
酸配列の上流に導入される。
【0121】
用語「核酸分子」または「ヌクレオチド配列」は本明細書中で使用される場合、オリゴ
ヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列、ならびにそのバリアント、ホモログ、フ
ラグメントおよび誘導体（例えば、その部分）をいう。ヌクレオチド配列はゲノム起源、
合成起源、または組換え起源のものであってもよく、それはセンス鎖またはアンチセンス
鎖を表すかにかかわらず、二本鎖または一本鎖であってもよい。本発明に関連する用語「
ヌクレオチド配列」はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、およびＲＮＡ(例えば、ｍ
ＲＮＡ）、ならびに、例えば、ヌクレオチドアナログの使用によって生成されたＤＮＡま
たはＲＮＡのアナログを含む。
ヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列、ならびにそのバリアント、ホモログ、フ
ラグメントおよび誘導体（例えば、その部分）をいう。ヌクレオチド配列はゲノム起源、
合成起源、または組換え起源のものであってもよく、それはセンス鎖またはアンチセンス
鎖を表すかにかかわらず、二本鎖または一本鎖であってもよい。本発明に関連する用語「
ヌクレオチド配列」はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、およびＲＮＡ(例えば、ｍ
ＲＮＡ）、ならびに、例えば、ヌクレオチドアナログの使用によって生成されたＤＮＡま
たはＲＮＡのアナログを含む。
【0122】
核酸分子は一本鎖または二本鎖でもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡ、より好ましくは
コード配列のｃＤＮＡである。好ましい実施形態では、本明細書で定義されるような特定
の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列自体は、それがその天然環境
にあるその天然関連配列に連結されている場合、その天然環境において天然ヌクレオチド
配列をカバーしない。参照を容易にするために、本発明者らは、この好ましい実施形態を
「非天然ヌクレオチド配列」または「非天然配列」と呼ぶ。この点に関して、用語「天然
ヌクレオチド配列」または「天然に存在する配列」はその天然環境にあり、それが天然に
関連するプロモーター全体に作動可能に連結される場合、そのプロモーターもまたその天
然環境にあるヌクレオチド配列を意味する。従って、本発明のポリペプチドはその天然の
生物においてヌクレオチド配列によって発現され得るが、ここで、ヌクレオチド配列はそ
の生物内で天然に関連するプロモーターの制御下にはない。
コード配列のｃＤＮＡである。好ましい実施形態では、本明細書で定義されるような特定
の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列自体は、それがその天然環境
にあるその天然関連配列に連結されている場合、その天然環境において天然ヌクレオチド
配列をカバーしない。参照を容易にするために、本発明者らは、この好ましい実施形態を
「非天然ヌクレオチド配列」または「非天然配列」と呼ぶ。この点に関して、用語「天然
ヌクレオチド配列」または「天然に存在する配列」はその天然環境にあり、それが天然に
関連するプロモーター全体に作動可能に連結される場合、そのプロモーターもまたその天
然環境にあるヌクレオチド配列を意味する。従って、本発明のポリペプチドはその天然の
生物においてヌクレオチド配列によって発現され得るが、ここで、ヌクレオチド配列はそ
の生物内で天然に関連するプロモーターの制御下にはない。
【0123】
好ましくは、ポリペプチドは天然ポリペプチドではない。この点に関して、用語「天然
ポリペプチド」または「天然に存在するポリペプチド」は、その天然の環境にあり、その
天然のヌクレオチド配列によって発現されているときの、ポリペプチド全体を意味する。
典型的には、本明細書中に定義されるような特定の特性を有するポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列が、組換えＤＮＡ技術（すなわち、組換えＤＮＡ）を用いて調製され
る。しかし、本発明の代替の実施形態において、ヌクレオチド配列は、当該分野で周知の
化学的方法を使用して、全体的にまたは部分的に合成され得る(C see Caruthers MHら、(
1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 and Horn Tら、(1980) Nuc Acids Res Symp Ser
225-232を参照のこと）。
ポリペプチド」または「天然に存在するポリペプチド」は、その天然の環境にあり、その
天然のヌクレオチド配列によって発現されているときの、ポリペプチド全体を意味する。
典型的には、本明細書中に定義されるような特定の特性を有するポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列が、組換えＤＮＡ技術（すなわち、組換えＤＮＡ）を用いて調製され
る。しかし、本発明の代替の実施形態において、ヌクレオチド配列は、当該分野で周知の
化学的方法を使用して、全体的にまたは部分的に合成され得る(C see Caruthers MHら、(
1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 and Horn Tら、(1980) Nuc Acids Res Symp Ser
225-232を参照のこと）。
【0124】
本明細書中で使用される場合、用語「組換え」は生体分子、例えば、（１）その天然に
存在する（天然の）環境から除去された、（２）天然に見出されるような核酸分子または
タンパク質の全てまたは一部と会合していない、（３）それが天然に連結していないポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドと作動可能に連結している、または（４）天然に存在し
ない遺伝子またはタンパク質をいう。
存在する（天然の）環境から除去された、（２）天然に見出されるような核酸分子または
タンパク質の全てまたは一部と会合していない、（３）それが天然に連結していないポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドと作動可能に連結している、または（４）天然に存在し
ない遺伝子またはタンパク質をいう。
【0125】
例として、ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよびＶＡＭＰ１
、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドドメインを含むポリペプ
チドは、組換え生体分子とみなされる（本明細書中に提供されるポリペプチドの全ての特
定の実施形態と同様）。同様に、本明細書中に提供されるポリペプチドをコードする核酸
分子はまた、「組換え体」である。
、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドドメインを含むポリペプ
チドは、組換え生体分子とみなされる（本明細書中に提供されるポリペプチドの全ての特
定の実施形態と同様）。同様に、本明細書中に提供されるポリペプチドをコードする核酸
分子はまた、「組換え体」である。
【0126】
（ハイブリダイゼーション）
本発明はまた、本発明の配列に相補的な配列、または本発明の配列またはそれに相補的な
配列のいずれかにハイブリダイズすることができる配列の使用を包含する。
本発明はまた、本発明の配列に相補的な配列、または本発明の配列またはそれに相補的な
配列のいずれかにハイブリダイズすることができる配列の使用を包含する。
【0127】
本明細書で使用される用語「ハイブリダイゼーション」は、「核酸の鎖が塩基対形成を
介して相補鎖と結合するプロセス」、ならびにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術にお
いて実施されるような増幅のプロセスを含むものとする。
介して相補鎖と結合するプロセス」、ならびにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術にお
いて実施されるような増幅のプロセスを含むものとする。
【0128】
ハイブリダイゼーション条件はBerger and Immel (1987, Guide to Molecular Cloning
Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA)に教
示されるように、ヌクレオチド結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づいており、以下で説
明するように決まった「ストリンジェンシー」を与える。
Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA)に教
示されるように、ヌクレオチド結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づいており、以下で説
明するように決まった「ストリンジェンシー」を与える。
【0129】
最大ストリンジェンシーは、典型的には約Ｔｍ－５℃（プローブのＴｍより５℃低い）
、Ｔｍより約５℃から１０℃低いところで高いストリンジェンシー、Ｔｍより約１０℃か
ら２０℃低いところで中間ストリンジェンシー、Ｔｍより約２０℃から２５℃低いところ
で低いストリンジェンシーである。当業者によって理解されるように、最大ストリンジェ
ンシーハイブリダイゼーションは同一のヌクレオチド配列を同定または検出するために使
用され得、一方、中間（または低）ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは類似の
または関連するポリヌクレオチド配列を同定または検出するために使用され得る。
、Ｔｍより約５℃から１０℃低いところで高いストリンジェンシー、Ｔｍより約１０℃か
ら２０℃低いところで中間ストリンジェンシー、Ｔｍより約２０℃から２５℃低いところ
で低いストリンジェンシーである。当業者によって理解されるように、最大ストリンジェ
ンシーハイブリダイゼーションは同一のヌクレオチド配列を同定または検出するために使
用され得、一方、中間（または低）ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは類似の
または関連するポリヌクレオチド配列を同定または検出するために使用され得る。
【0130】
好ましくは、本発明が中間ストリンジェンシー条件（例えば、５０℃および０．２×Ｓ
ＳＣ）または高ストリンジェンシー条件下（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ｛1×S
SC-0.15 M NaCl、0.015 M Na-クエン酸塩pH 7.0｝）で、本明細書中に定義されるヌクレ
オチド配列（またはその相補配列）にハイブリダイズし得る配列の使用を包含する。
ＳＣ）または高ストリンジェンシー条件下（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ｛1×S
SC-0.15 M NaCl、0.015 M Na-クエン酸塩pH 7.0｝）で、本明細書中に定義されるヌクレ
オチド配列（またはその相補配列）にハイブリダイズし得る配列の使用を包含する。
【0131】
（発現ベクター）
本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」または「構築物」は、それが作動可能
に連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。用語「ベクター」および「構築物」
は、本明細書において互換的に使用される。ベクターは、自律複製が可能であってもよく
、または宿主ＤＮＡに組み込まれてもよい。ベクターは、組換えＤＮＡの挿入のための制
限酵素部位を含み得、そして１つ以上の選択マーカーを含み得る。ベクターは、プラスミ
ド、バクテリオファージまたはコスミドの形態の核酸分子であり得る。好ましくは、ベク
ターは細胞における発現に適している（すなわち、ベクターは「発現ベクター」である）
。好ましくは、発現ベクターが神経細胞または神経細胞株における発現に適している。最
も好ましくは、ベクターが神経芽細胞腫細胞株（例えば、ＳｉＭａ神経芽細胞腫細胞、Ｌ
ＡＮ５神経芽細胞腫細胞、またはＮＧ１０８神経芽細胞腫細胞）、不死化ニューロン、一
次ニューロン、または遺伝的に改変された生物における発現に適している。
本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」または「構築物」は、それが作動可能
に連結された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。用語「ベクター」および「構築物」
は、本明細書において互換的に使用される。ベクターは、自律複製が可能であってもよく
、または宿主ＤＮＡに組み込まれてもよい。ベクターは、組換えＤＮＡの挿入のための制
限酵素部位を含み得、そして１つ以上の選択マーカーを含み得る。ベクターは、プラスミ
ド、バクテリオファージまたはコスミドの形態の核酸分子であり得る。好ましくは、ベク
ターは細胞における発現に適している（すなわち、ベクターは「発現ベクター」である）
。好ましくは、発現ベクターが神経細胞または神経細胞株における発現に適している。最
も好ましくは、ベクターが神経芽細胞腫細胞株（例えば、ＳｉＭａ神経芽細胞腫細胞、Ｌ
ＡＮ５神経芽細胞腫細胞、またはＮＧ１０８神経芽細胞腫細胞）、不死化ニューロン、一
次ニューロン、または遺伝的に改変された生物における発現に適している。
【0132】
好ましくは、（発現）ベクターが宿主細胞中で増殖することができ、将来の世代に安定
に伝達される。
に伝達される。
【0133】
本明細書で使用される「作動可能に連結された」とは、例えば、コーディング配列の発
現を指示するように連結された関係で、互いに機能的関係にあるコーディング配列と一緒
に、以下に記載される制御エレメントの単一または組み合わせをいう。
現を指示するように連結された関係で、互いに機能的関係にあるコーディング配列と一緒
に、以下に記載される制御エレメントの単一または組み合わせをいう。
【0134】
本明細書で使用される「調節配列」とは、遺伝子発現を制御することができるＤＮＡま
たはＲＮＡエレメントをいう。発現制御配列の例としては、プロモーター、エンハンサー
、サイレンサー、シャインダルガーノ配列、ＴＡＴＡｂｏｘ、内部リボソーム侵入部位（
ＩＲＥＳ）、転写因子のための付着部位、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、Ｒ
ＮＡ輸送シグナル、またはＵＶ光媒介遺伝子応答に重要な配列が挙げられる。好ましくは
、ベクターは、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節配列を含
む。調節配列には、組織特異的調節および／または誘導配列と同様に、構成的発現を指示
するものが含まれる。
たはＲＮＡエレメントをいう。発現制御配列の例としては、プロモーター、エンハンサー
、サイレンサー、シャインダルガーノ配列、ＴＡＴＡｂｏｘ、内部リボソーム侵入部位（
ＩＲＥＳ）、転写因子のための付着部位、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、Ｒ
ＮＡ輸送シグナル、またはＵＶ光媒介遺伝子応答に重要な配列が挙げられる。好ましくは
、ベクターは、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節配列を含
む。調節配列には、組織特異的調節および／または誘導配列と同様に、構成的発現を指示
するものが含まれる。
【0135】
「プロモーター」は、本明細書中で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転
写を開始するＤＮＡまたはＲＮＡ中のヌクレオチド配列をいう。プロモーターは、誘導性
であっても構成的に発現されてもよい。あるいは、プロモーターがリプレッサーまたは刺
激タンパク質の制御下にある。好ましくは、プロモーターがＳＶ４０、ＣＭＶ、Ａｃｔｉ
ｎ、ＥＦ１α、ＵＢ、ＲＣＶ、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＭＭＬＶ－ＬＴＲまたはＣＭＶ－ＬＴＲ
ハイブリッドプロモーターから選択される。
写を開始するＤＮＡまたはＲＮＡ中のヌクレオチド配列をいう。プロモーターは、誘導性
であっても構成的に発現されてもよい。あるいは、プロモーターがリプレッサーまたは刺
激タンパク質の制御下にある。好ましくは、プロモーターがＳＶ４０、ＣＭＶ、Ａｃｔｉ
ｎ、ＥＦ１α、ＵＢ、ＲＣＶ、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＭＭＬＶ－ＬＴＲまたはＣＭＶ－ＬＴＲ
ハイブリッドプロモーターから選択される。
【0136】
本明細書で使用される「転写ターミネーター」は、ＤＮＡをＲＮＡに転写することに関
与するＲＮＡポリメラーゼの機能を終結させるＤＮＡエレメントを指す。好ましい転写タ
ーミネーターは、ＧＣリッチダイアド対称領域が先行する、Ｔ残基の連続を特徴とする。
与するＲＮＡポリメラーゼの機能を終結させるＤＮＡエレメントを指す。好ましい転写タ
ーミネーターは、ＧＣリッチダイアド対称領域が先行する、Ｔ残基の連続を特徴とする。
【0137】
「翻訳制御エレメント」は、本明細書中で使用される場合、ｍＲＮＡの翻訳を制御する
ＤＮＡまたはＲＮＡエレメントをいう。好ましい翻訳制御エレメントは、リボソーム結合
部位である。好ましくは、翻訳制御エレメントがプロモーターとしての相同系（例えば、
プロモーターおよびその関連リボザイム結合部位）由来である。好ましいリボソーム結合
部位は、Ｔ７またはＴ３リボソーム結合部位である。
ＤＮＡまたはＲＮＡエレメントをいう。好ましい翻訳制御エレメントは、リボソーム結合
部位である。好ましくは、翻訳制御エレメントがプロモーターとしての相同系（例えば、
プロモーターおよびその関連リボザイム結合部位）由来である。好ましいリボソーム結合
部位は、Ｔ７またはＴ３リボソーム結合部位である。
【0138】
本明細書で使用される「制限酵素認識部位」は、制限酵素によって認識されるＤＮＡ上
のモチーフを指す。
のモチーフを指す。
【0139】
本明細書で使用される「選択マーカー」は、宿主細胞で発現される場合、前記選択マー
カー遺伝子を発現する細胞の選択を可能にする表現型を細胞に付与するタンパク質を指す
。一般に、これは、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイク
リン、ハイグロマイシン、ネオマイシンまたはメトトレキサートなどの抗生物質に対する
耐性を付与するタンパク質であり得る。抗生物質のさらなる例は、ペニシリン；アンピシ
リンＨＣＩ、アンピシリンＮａ、アモキシシリンＮａ、カルベニシリンナトリウム、ペニ
シリンＧ、セファロスポリン、セフォタキシムＮａ、セファレキシンＨＣＩ、バンコマイ
シン、シクロセリンである。他の例には、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、リ
ンコマイシン、テトラサイクリン、硫酸スペクチノマイシン、クリンダマイシンＨＣｌ、
クロルテトラサイクリンＨＣｌなどの静菌阻害剤が含まれる。
カー遺伝子を発現する細胞の選択を可能にする表現型を細胞に付与するタンパク質を指す
。一般に、これは、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイク
リン、ハイグロマイシン、ネオマイシンまたはメトトレキサートなどの抗生物質に対する
耐性を付与するタンパク質であり得る。抗生物質のさらなる例は、ペニシリン；アンピシ
リンＨＣＩ、アンピシリンＮａ、アモキシシリンＮａ、カルベニシリンナトリウム、ペニ
シリンＧ、セファロスポリン、セフォタキシムＮａ、セファレキシンＨＣＩ、バンコマイ
シン、シクロセリンである。他の例には、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、リ
ンコマイシン、テトラサイクリン、硫酸スペクチノマイシン、クリンダマイシンＨＣｌ、
クロルテトラサイクリンＨＣｌなどの静菌阻害剤が含まれる。
【0140】
発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベ
ルなどの因子に依存する。本発明の発現ベクターは宿主細胞に導入され得、それによって
、本明細書中に記載されるような核酸によってコードされるタンパク質またはポリペプチ
ド（融合タンパク質またはポリペプチドを含む）（例えば、ルシフェラーゼ活性を有する
Ｎ末端ポリペプチドドメインおよびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有す
るＣ末端ドメインを含むポリペプチド）を産生する。
ルなどの因子に依存する。本発明の発現ベクターは宿主細胞に導入され得、それによって
、本明細書中に記載されるような核酸によってコードされるタンパク質またはポリペプチ
ド（融合タンパク質またはポリペプチドを含む）（例えば、ルシフェラーゼ活性を有する
Ｎ末端ポリペプチドドメインおよびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有す
るＣ末端ドメインを含むポリペプチド）を産生する。
【0141】
好ましくは、ベクターが宿主細胞による本明細書に記載のポリペプチドの発現に必要な
遺伝エレメントを含む。宿主細胞における転写および翻訳に必要なエレメントには、プロ
モーター、目的タンパク質のコード領域、および転写ターミネーターが含まれる。
遺伝エレメントを含む。宿主細胞における転写および翻訳に必要なエレメントには、プロ
モーター、目的タンパク質のコード領域、および転写ターミネーターが含まれる。
【0142】
本発明の発現ベクターは、ｐＣＤＮＡ３、ｐＩＲＥＳ－ＮＥＯのような標準発現ベクタ
ー、またはｐＱＣＸＩＰ、ｐＱＣＸＩＮ、ｐＱＣＸＩＧ、ｐＬＸＩＮ、ｐＢＭＮ、ｐＢＡ
ＢＥ－ｈｙｇｒｏ、およびｐＢＡＢＥ－ｐｕｒｏのようなレトロウイルスベクターであり
得る。
ー、またはｐＱＣＸＩＰ、ｐＱＣＸＩＮ、ｐＱＣＸＩＧ、ｐＬＸＩＮ、ｐＢＭＮ、ｐＢＡ
ＢＥ－ｈｙｇｒｏ、およびｐＢＡＢＥ－ｐｕｒｏのようなレトロウイルスベクターであり
得る。
【0143】
用語「発現ベクター」、「発現構築物」、「構築物」および「ベクター」は、本明細書
において交換可能に使用される。
において交換可能に使用される。
【0144】
好ましくは、発現ベクターが高コピー数発現ベクターであり；あるいは発現ベクターが
低コピー数発現ベクターである。
低コピー数発現ベクターである。
【0145】
（発現ベクターの調製）
当業者は、発現ベクターの調製に利用可能な分子技術を知っている。
当業者は、発現ベクターの調製に利用可能な分子技術を知っている。
【0146】
本発明の発現ベクターに組み込むための核酸分子は、上記のように、相互にプライミン
グするオリゴヌクレオチドおよび本明細書に記載の核酸配列を用いて、核酸分子を合成す
ることによって調製することができる。
グするオリゴヌクレオチドおよび本明細書に記載の核酸配列を用いて、核酸分子を合成す
ることによって調製することができる。
【0147】
相補的な凝集末端を介してＤＮＡをベクターに作動可能に連結するために、多くの分子
技術が開発されてきた。一実施形態では、相補的ホモポリマートラクトを、ベクターＤＮ
Ａに挿入される核酸分子に付加することができる。次いで、ベクターおよび核酸分子は、
相補的ホモポリマーテール間の水素結合によって連結されて、組換えＤＮＡ分子を形成す
る。
技術が開発されてきた。一実施形態では、相補的ホモポリマートラクトを、ベクターＤＮ
Ａに挿入される核酸分子に付加することができる。次いで、ベクターおよび核酸分子は、
相補的ホモポリマーテール間の水素結合によって連結されて、組換えＤＮＡ分子を形成す
る。
【0148】
別の実施形態では、１つ以上の制限部位を含む合成リンカーを用いて、核酸分子を発現
ベクターに作動可能に連結する。一実施形態では、核酸分子が制限エンドヌクレアーゼ消
化によって生成される。好ましくは、核酸分子がバクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメ
ラーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（突出した３′－５′-エキソヌクレアーゼ活
性を有する３′－一本鎖末端を除去し、そして陥凹した３′－末端をそれらの重合活性で
充填し、それによって平滑末端ＤＮＡセグメントを生成する酵素）で処理される。次いで
、平滑末端セグメントを、平滑末端ＤＮＡ分子（例えば、バクテリオファージＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼ）の連結を触媒し得る酵素の存在下で、大モル過剰のリンカー分子と共にイン
キュベートする。従って、反応の生成物は、その末端にポリマーリンカー配列を有する核
酸分子である。次いで、これらの核酸分子は、適切な制限酵素で切断され、そして核酸分
子の末端と適合する末端を生成する酵素で切断された発現ベクターに連結される。
ベクターに作動可能に連結する。一実施形態では、核酸分子が制限エンドヌクレアーゼ消
化によって生成される。好ましくは、核酸分子がバクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメ
ラーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（突出した３′－５′-エキソヌクレアーゼ活
性を有する３′－一本鎖末端を除去し、そして陥凹した３′－末端をそれらの重合活性で
充填し、それによって平滑末端ＤＮＡセグメントを生成する酵素）で処理される。次いで
、平滑末端セグメントを、平滑末端ＤＮＡ分子（例えば、バクテリオファージＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼ）の連結を触媒し得る酵素の存在下で、大モル過剰のリンカー分子と共にイン
キュベートする。従って、反応の生成物は、その末端にポリマーリンカー配列を有する核
酸分子である。次いで、これらの核酸分子は、適切な制限酵素で切断され、そして核酸分
子の末端と適合する末端を生成する酵素で切断された発現ベクターに連結される。
【0149】
あるいは、ライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）部位を含むベクターを用い
ることができる。次いで、必要とされるＰＣＲ増幅核酸分子は制限消化または連結なしに
ＬＩＣベクターにクローニングされ得る（Aslanidis and de Jong、NuclAcidRes.18,6069
-6074(1990)、Haunら、Biotechniques 13,515-518）。
ることができる。次いで、必要とされるＰＣＲ増幅核酸分子は制限消化または連結なしに
ＬＩＣベクターにクローニングされ得る（Aslanidis and de Jong、NuclAcidRes.18,6069
-6074(1990)、Haunら、Biotechniques 13,515-518）。
【0150】
選択されたプラスミドへの挿入のために目的の核酸分子を単離および／または改変する
のに、ＰＣＲを使用することが好ましい。配列のＰＣＲ調製における使用のための適切な
プライマーは核酸分子の必要とされるコード領域を単離し、制限エンドヌクレアーゼまた
はＬＩＣ部位を付加し、コード領域を所望のリーディングフレームに配置するように設計
され得る。
のに、ＰＣＲを使用することが好ましい。配列のＰＣＲ調製における使用のための適切な
プライマーは核酸分子の必要とされるコード領域を単離し、制限エンドヌクレアーゼまた
はＬＩＣ部位を付加し、コード領域を所望のリーディングフレームに配置するように設計
され得る。
【0151】
好ましい実施形態において、本発明の発現ベクターに組み込むための核酸分子は、適切
なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、Saiki et al (1988) Science 239, 487-49
1によって開示されるようなポリメラーゼ連鎖反応の使用によって調製される。コード領
域は増幅されるが、プライマー自体は増幅された配列産物に組み込まれる。好ましい実施
形態において、増幅プライマーは、増幅された配列産物が適切なベクターにクローニング
されることを可能にする制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。
なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、Saiki et al (1988) Science 239, 487-49
1によって開示されるようなポリメラーゼ連鎖反応の使用によって調製される。コード領
域は増幅されるが、プライマー自体は増幅された配列産物に組み込まれる。好ましい実施
形態において、増幅プライマーは、増幅された配列産物が適切なベクターにクローニング
されることを可能にする制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。
【0152】
好ましくは、核酸分子がＰＣＲによって得られ、制限エンドヌクレアーゼ消化およびラ
イゲーション（当該分野で周知の技術）を使用して、発現ベクターに導入される。より好
ましくは、核酸分子がｐＣＤＮＡ３、ｐＩＲＥＳ－ＮＥＯ、またはｐＱＣＸＩＰ、ｐＱＣ
ＸＩＮ、ｐＱＣＸＩＧ、ｐＬＸＩＮ、ｐＢＭＮ、ｐＢＡＢＥ－ｈｙｇｒｏ、またはｐＢＡ
－ｐｕｒｏのようなレトロウイルスベクターのような発現ベクターに導入される。
イゲーション（当該分野で周知の技術）を使用して、発現ベクターに導入される。より好
ましくは、核酸分子がｐＣＤＮＡ３、ｐＩＲＥＳ－ＮＥＯ、またはｐＱＣＸＩＰ、ｐＱＣ
ＸＩＮ、ｐＱＣＸＩＧ、ｐＬＸＩＮ、ｐＢＭＮ、ｐＢＡＢＥ－ｈｙｇｒｏ、またはｐＢＡ
－ｐｕｒｏのようなレトロウイルスベクターのような発現ベクターに導入される。
【0153】
本発明の発現ベクターは、前述の核酸分子の単一コピー、または前述の核酸分子の複数
コピーを含むことができる。
コピーを含むことができる。
【0154】
本明細書中に記載される核酸分子および／または発現ベクターは、任意の適切な宿主細
胞内に存在し得る（それによって、遺伝的に改変された細胞を生成する）。
胞内に存在し得る（それによって、遺伝的に改変された細胞を生成する）。
【0155】
（宿主細胞）
本発明に関連する用語「宿主細胞」は、本発明によるヌクレオチド配列、または本明細書
で定義される特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む任意
の細胞を含む。好ましくは、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込まれる。
本発明に関連する用語「宿主細胞」は、本発明によるヌクレオチド配列、または本明細書
で定義される特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む任意
の細胞を含む。好ましくは、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込まれる。
【0156】
用語「宿主細胞」、「遺伝的に改変された細胞」および「組換え宿主細胞」は、互換的
に使用される。これらの用語は、それらがその天然環境にあるそれらの天然プロモーター
の制御下にある場合、それらの天然環境における天然ヌクレオチドコード配列はカバーし
ておらず、遺伝的に改変された（例えば、形質転換またはトランスフェクトされた）細胞
をいう。これらの用語は特定の対象細胞を指し、また、そのような細胞の子孫または潜在
的な子孫を指す。突然変異または環境の影響のいずれかのために、次の世代では特定の修
飾が起こり得るので、このような子孫は実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、
なお本明細書中で使用される用語の範囲内に含まれる。
に使用される。これらの用語は、それらがその天然環境にあるそれらの天然プロモーター
の制御下にある場合、それらの天然環境における天然ヌクレオチドコード配列はカバーし
ておらず、遺伝的に改変された（例えば、形質転換またはトランスフェクトされた）細胞
をいう。これらの用語は特定の対象細胞を指し、また、そのような細胞の子孫または潜在
的な子孫を指す。突然変異または環境の影響のいずれかのために、次の世代では特定の修
飾が起こり得るので、このような子孫は実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、
なお本明細書中で使用される用語の範囲内に含まれる。
【0157】
遺伝子改変細胞は、真核細胞または原核細胞であり得る。好ましくは、遺伝子改変され
た細胞がクロストリジウム感受性細胞（例えば、クロストリジウム神経毒素が結合し、細
胞膜を横切って移動し得る細胞（例えば、クローン／細胞株））である。このような細胞
の例は周知であり、当業者は例えば破傷風神経毒素および／またはボツリヌス神経毒素（
例えば、ＢｏＮＴ型Ｂ、ＢｏＮＴ型Ｄ、ＢｏＮＴ型Ｆおよび／またはＢｏＮＴ型Ｇ）が細
胞膜を横切って結合および転位し得るか否かを試験することによって、このような細胞を
容易に同定し得る。これを試験するための通常の実験は周知であり、以下の実施例のセク
ションに記載される実験のいくつかを含む。適切な細胞には、神経芽細胞腫細胞株の細胞
（例えば、ＳｉＭａ神経芽細胞腫細胞、ＬＡＮ５神経芽細胞腫細胞、ＮＧ１０８神経芽細
胞腫細胞）、不死化ニューロン、一次ニューロン、または遺伝的に改変された生物が含ま
れる。
た細胞がクロストリジウム感受性細胞（例えば、クロストリジウム神経毒素が結合し、細
胞膜を横切って移動し得る細胞（例えば、クローン／細胞株））である。このような細胞
の例は周知であり、当業者は例えば破傷風神経毒素および／またはボツリヌス神経毒素（
例えば、ＢｏＮＴ型Ｂ、ＢｏＮＴ型Ｄ、ＢｏＮＴ型Ｆおよび／またはＢｏＮＴ型Ｇ）が細
胞膜を横切って結合および転位し得るか否かを試験することによって、このような細胞を
容易に同定し得る。これを試験するための通常の実験は周知であり、以下の実施例のセク
ションに記載される実験のいくつかを含む。適切な細胞には、神経芽細胞腫細胞株の細胞
（例えば、ＳｉＭａ神経芽細胞腫細胞、ＬＡＮ５神経芽細胞腫細胞、ＮＧ１０８神経芽細
胞腫細胞）、不死化ニューロン、一次ニューロン、または遺伝的に改変された生物が含ま
れる。
【0158】
宿主細胞ゲノムは任意の好適な手段、例えば、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ
３活性を有するタンパク質ドメインをコードする天然（内因性）核酸配列の上流にルシフ
ェラーゼ活性を有するタンパク質ドメインをコードする核酸配列を導入する遺伝子編集技
術のような、適切な手段を用いて、改変されて、本発明の核酸配列を生成し得る。あるい
はまたはさらに、宿主細胞は当該分野で公知の標準的な技術を使用して、本発明の発現ベ
クターで形質転換、感染またはトランスフェクトされ得る。
３活性を有するタンパク質ドメインをコードする天然（内因性）核酸配列の上流にルシフ
ェラーゼ活性を有するタンパク質ドメインをコードする核酸配列を導入する遺伝子編集技
術のような、適切な手段を用いて、改変されて、本発明の核酸配列を生成し得る。あるい
はまたはさらに、宿主細胞は当該分野で公知の標準的な技術を使用して、本発明の発現ベ
クターで形質転換、感染またはトランスフェクトされ得る。
【0159】
（宿主細胞の形質転換）
前述の核酸分子を含む、本発明の発現ベクターで形質転換、感染またはトランスフェク
トされた宿主細胞は、本明細書中に提供されるポリペプチドを産生（すなわち発現）する
ために使用され得る。
前述の核酸分子を含む、本発明の発現ベクターで形質転換、感染またはトランスフェク
トされた宿主細胞は、本明細書中に提供されるポリペプチドを産生（すなわち発現）する
ために使用され得る。
【0160】
本発明の発現ベクターは、従来の形質転換、トランスフェクションまたは形質導入技術
によって細胞に導入することができる。「形質転換」、「トランスフェクション」および
「形質導入」は、外来核酸を細胞に導入するための技術をいう。使用される特定の方法は
、典型的にはベクターのタイプおよび細胞の両方に依存する。前記技術はリン酸カルシウ
ムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ-デキストラン媒介トランスフェクション、リポ
フェクション、ケモポレーションまたはエレクトロポレーションを含むが、これらに限定
されない。
によって細胞に導入することができる。「形質転換」、「トランスフェクション」および
「形質導入」は、外来核酸を細胞に導入するための技術をいう。使用される特定の方法は
、典型的にはベクターのタイプおよび細胞の両方に依存する。前記技術はリン酸カルシウ
ムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ-デキストラン媒介トランスフェクション、リポ
フェクション、ケモポレーションまたはエレクトロポレーションを含むが、これらに限定
されない。
【0161】
細胞の形質転換、トランスフェクションまたは形質導入のための当技術分野で公知の技
術は例えば、Sambrookら、(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spri
ng Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y; Ausubelら(1987) Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY; Cohen et al (1972) Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 69, 2110; Luchanskyら(1988) Mol. Microbiol. 2, 637-646に開示
されている。
術は例えば、Sambrookら、(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spri
ng Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y; Ausubelら(1987) Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY; Cohen et al (1972) Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 69, 2110; Luchanskyら(1988) Mol. Microbiol. 2, 637-646に開示
されている。
【0162】
成功裏に形質転換された、トランスフェクトされた、または形質導入された細胞（また
は遺伝的に改変された細胞）、すなわち、本発明の発現ベクターまたは核酸分子を含む細
胞は、当該分野で周知の技術によって同定され得る。例えば、本発明の発現ベクターでト
ランスフェクトされた細胞は、ルシフェラーゼ活性およびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２または
ＶＡＭＰ３活性を有するタンパク質を産生するために培養され得る。細胞は、当該分野で
周知の技術によって、発現ベクターＤＮＡの存在について試験され得る。あるいはポリペ
プチド、またはその一部および断片の存在はそれにハイブリダイズする抗体を用いて検出
することができる。
は遺伝的に改変された細胞）、すなわち、本発明の発現ベクターまたは核酸分子を含む細
胞は、当該分野で周知の技術によって同定され得る。例えば、本発明の発現ベクターでト
ランスフェクトされた細胞は、ルシフェラーゼ活性およびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２または
ＶＡＭＰ３活性を有するタンパク質を産生するために培養され得る。細胞は、当該分野で
周知の技術によって、発現ベクターＤＮＡの存在について試験され得る。あるいはポリペ
プチド、またはその一部および断片の存在はそれにハイブリダイズする抗体を用いて検出
することができる。
【0163】
好ましい実施形態において、本発明は、形質転換細胞の培養物を含む。好ましくは、培
養物はクローン的に均一である。
養物はクローン的に均一である。
【0164】
細胞は前述の発現ベクターの単一コピー、または代わりに、発現ベクターの複数コピー
を含むことができる。
を含むことができる。
【0165】
（用途と方法）
本発明者らは驚くべきことに、神経毒活性（特に、破傷風、Ｂ型ボツリヌス、Ｄ型ボツ
リヌス、Ｆ型ボツリヌスおよび／またはＧ型ボツリヌス神経毒素活性）を検出するために
使用することができる新規なレポーター分子を同定した。特定の神経毒によるレポーター
分子の切断の際に、２つの切断フラグメント；ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペ
プチドドメインおよびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリ
ペプチドドメインの一部を含む第１のフラグメント；およびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２また
はＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドの残りの部分を含む第２のフラグメントが
生成される。有利には、第１のフラグメントが神経毒活性の検出（すなわち、レポーター
分子切断の検出）を可能にするのに十分に安定である。
本発明者らは驚くべきことに、神経毒活性（特に、破傷風、Ｂ型ボツリヌス、Ｄ型ボツ
リヌス、Ｆ型ボツリヌスおよび／またはＧ型ボツリヌス神経毒素活性）を検出するために
使用することができる新規なレポーター分子を同定した。特定の神経毒によるレポーター
分子の切断の際に、２つの切断フラグメント；ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペ
プチドドメインおよびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリ
ペプチドドメインの一部を含む第１のフラグメント；およびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２また
はＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドの残りの部分を含む第２のフラグメントが
生成される。有利には、第１のフラグメントが神経毒活性の検出（すなわち、レポーター
分子切断の検出）を可能にするのに十分に安定である。
【0166】
したがって、本発明のポリペプチド、核酸分子、発現ベクターまたは遺伝的に改変され
た細胞は神経毒活性の検出のために使用され得、ここで、神経毒活性は破傷風神経毒活性
、Ｂ型ボツリヌス神経毒活性、Ｄ型ボツリヌス神経毒活性、Ｆ型ボツリヌス神経毒活性お
よびＧ型ボツリヌス神経毒活性からなる群から選択される。
た細胞は神経毒活性の検出のために使用され得、ここで、神経毒活性は破傷風神経毒活性
、Ｂ型ボツリヌス神経毒活性、Ｄ型ボツリヌス神経毒活性、Ｆ型ボツリヌス神経毒活性お
よびＧ型ボツリヌス神経毒活性からなる群から選択される。
【0167】
本明細書で使用される「神経毒活性」とは、天然に存在する破傷風、Ｂ型ボツリヌス、
Ｄ型ボツリヌス、Ｆ型ボツリヌスおよびＧ型ボツリヌス神経毒素のいずれか１つの、それ
らの基質（この場合、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰまたはＶＡＭＰ３活性を有するポリペプチド
ドメイン）を切断する能力をいう。天然に存在する神経毒およびそれらのそれぞれの神経
毒活性は当該分野で周知であり、そしてより詳細に他の箇所に記載される（表１、ならび
にまた、例えば、Botulinum Neurotoxins. Editors: Rummel、Andreas、Binz、Thomas (E
ds.) Springer、Current Topics in Microbiology and Immunology,2013を参照のこと）
。
Ｄ型ボツリヌス、Ｆ型ボツリヌスおよびＧ型ボツリヌス神経毒素のいずれか１つの、それ
らの基質（この場合、ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰまたはＶＡＭＰ３活性を有するポリペプチド
ドメイン）を切断する能力をいう。天然に存在する神経毒およびそれらのそれぞれの神経
毒活性は当該分野で周知であり、そしてより詳細に他の箇所に記載される（表１、ならび
にまた、例えば、Botulinum Neurotoxins. Editors: Rummel、Andreas、Binz、Thomas (E
ds.) Springer、Current Topics in Microbiology and Immunology,2013を参照のこと）
。
【0168】
例えば、「破傷風神経毒活性」は、切断部位ＧＡＳＱ78ＦＥＳＳでのＶＡＭＰ１（また
はＶＡＭＰ１活性を有するポリペプチドドメイン）の切断、切断部位ＧＡＳＱ76ＦＥＴＳ
でのＶＡＭＰ２（またはＶＡＭＰ２活性を有するポリペプチドドメイン）の切断、および
／または切断部位ＧＡＳＱ59ＦＥＴＳでのＶＡＭＰ３（またはＶＡＭＰ３活性を有するポ
リペプチドドメイン）の切断を指す。
はＶＡＭＰ１活性を有するポリペプチドドメイン）の切断、切断部位ＧＡＳＱ76ＦＥＴＳ
でのＶＡＭＰ２（またはＶＡＭＰ２活性を有するポリペプチドドメイン）の切断、および
／または切断部位ＧＡＳＱ59ＦＥＴＳでのＶＡＭＰ３（またはＶＡＭＰ３活性を有するポ
リペプチドドメイン）の切断を指す。
【0169】
例えば、「Ｂ型ボツリヌス神経毒活性」は、切断部位ＧＡＳＱ78ＦＥＳＳでのＶＡＭＰ
１（またはＶＡＭＰ１活性を有するポリペプチドドメイン）の切断、切断部位ＧＡＳＱ76
ＦＥＴＳでのＶＡＭＰ２（またはＶＡＭＰ２活性を有するポリペプチドドメイン）の切断
、および／または切断部位ＧＡＳＱ59ＦＥＴＳでのＶＡＭＰ３（またはＶＡＭＰ３活性を
有するポリペプチドドメイン）の切断を指す。
１（またはＶＡＭＰ１活性を有するポリペプチドドメイン）の切断、切断部位ＧＡＳＱ76
ＦＥＴＳでのＶＡＭＰ２（またはＶＡＭＰ２活性を有するポリペプチドドメイン）の切断
、および／または切断部位ＧＡＳＱ59ＦＥＴＳでのＶＡＭＰ３（またはＶＡＭＰ３活性を
有するポリペプチドドメイン）の切断を指す。
【0170】
例えば、「Ｄ型ボツリヌス神経毒活性」は、切断部位ＲＤＱＫ61ＬＳＥＬでのＶＡＭＰ
１（またはＶＡＭＰ１活性を有するポリペプチドドメイン）の切断、切断部位ＲＤＱＫ 5
9ＬＳＥＬでのＶＡＭＰ２（またはＶＡＭＰ２活性を有するポリペプチドドメイン）の切
断、および／または切断部位ＲＤＱＫ 42ＬＳＥＬでのＶＡＭＰ３（またはＶＡＭＰ３活
性を有するポリペプチドドメイン）の切断を指す。
１（またはＶＡＭＰ１活性を有するポリペプチドドメイン）の切断、切断部位ＲＤＱＫ 5
9ＬＳＥＬでのＶＡＭＰ２（またはＶＡＭＰ２活性を有するポリペプチドドメイン）の切
断、および／または切断部位ＲＤＱＫ 42ＬＳＥＬでのＶＡＭＰ３（またはＶＡＭＰ３活
性を有するポリペプチドドメイン）の切断を指す。
【0171】
例えば、「Ｆ型ボツリヌス神経毒活性」は、切断部位ＥＲＤＱ60ＫＬＳＥでのＶＡＭＰ
１（またはＶＡＭＰ１活性を有するポリペプチドドメイン）の切断、切断部位ＥＲＤＱ58
ＫＬＳＥでのＶＡＭＰ２（またはＶＡＭＰ２活性を有するポリペプチドドメイン）の切断
、および／または切断部位ＥＲＤＱ41ＫＬＳＥでのＶＡＭＰ３（またはＶＡＭＰ３活性を
有するポリペプチドドメイン）の切断を指す。
１（またはＶＡＭＰ１活性を有するポリペプチドドメイン）の切断、切断部位ＥＲＤＱ58
ＫＬＳＥでのＶＡＭＰ２（またはＶＡＭＰ２活性を有するポリペプチドドメイン）の切断
、および／または切断部位ＥＲＤＱ41ＫＬＳＥでのＶＡＭＰ３（またはＶＡＭＰ３活性を
有するポリペプチドドメイン）の切断を指す。
【0172】
例えば、「Ｇ型ボツリヌス神経毒活性」は、切断部位ＥＳＳＡ83ＡＫＬＫでのＶＡＭＰ
１（またはＶＡＭＰ１活性を有するポリペプチドドメイン）の切断、切断部位ＥＴＳＡ81
ＡＫＬＫでのＶＡＭＰ２（またはＶＡＭＰ２活性を有するポリペプチドドメイン）の切断
、および／または切断部位ＥＴＳＡ64ＡＫＬＫでのＶＡＭＰ３（またはＶＡＭＰ３活性を
有するポリペプチドドメイン）の切断を指す。
１（またはＶＡＭＰ１活性を有するポリペプチドドメイン）の切断、切断部位ＥＴＳＡ81
ＡＫＬＫでのＶＡＭＰ２（またはＶＡＭＰ２活性を有するポリペプチドドメイン）の切断
、および／または切断部位ＥＴＳＡ64ＡＫＬＫでのＶＡＭＰ３（またはＶＡＭＰ３活性を
有するポリペプチドドメイン）の切断を指す。
【0173】
破傷風、Ｂ型ボツリヌス、Ｄ型ボツリヌス、Ｆ型ボツリヌスおよび／またはＧ型ボツリ
ヌス神経毒素の改変型（例えば、人工的に改変された、組換え体、キメラ、トキソイドな
ど）は「神経毒活性」（すなわち、表１に示される様式でＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２および
／またはＶＡＭＰ３を切断するそれらの能力）を保持し得る。従って、本発明は、このよ
うな改変された神経毒が「神経毒活性」を保持するかどうかを検出するために使用され得
る。このような使用および方法は、本発明に包含される。
ヌス神経毒素の改変型（例えば、人工的に改変された、組換え体、キメラ、トキソイドな
ど）は「神経毒活性」（すなわち、表１に示される様式でＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２および
／またはＶＡＭＰ３を切断するそれらの能力）を保持し得る。従って、本発明は、このよ
うな改変された神経毒が「神経毒活性」を保持するかどうかを検出するために使用され得
る。このような使用および方法は、本発明に包含される。
【0174】
ボツリヌス神経毒の多様性は、例えば、[Research in Microbiology, Volume 166, Iss
ue 4, May 2015, Pages 303-317, Genomes, neurotoxins and biology of Clostridium b
otulinum Group I and Group II, Andrew T. Carter, Michael W. Peck]に要約されてい
る。
ue 4, May 2015, Pages 303-317, Genomes, neurotoxins and biology of Clostridium b
otulinum Group I and Group II, Andrew T. Carter, Michael W. Peck]に要約されてい
る。
【0175】
従って、本発明は、これらの神経毒の天然に存在する形態の神経毒活性（および／また
は存在）、ならびにキメラまたはその人工的に改変された形態の神経毒活性を検出するた
めに使用され得る。従って、好都合には、これらの神経毒の改変形態を、神経毒活性の増
加または減少について試験するための手段を提供する。
は存在）、ならびにキメラまたはその人工的に改変された形態の神経毒活性を検出するた
めに使用され得る。従って、好都合には、これらの神経毒の改変形態を、神経毒活性の増
加または減少について試験するための手段を提供する。
【0176】
神経毒活性を検出するための任意の好適な手段を使用することができる。いくつかの標
準的な技術を使用して、本明細書に記載のポリペプチドの切断を検出し得る。例示的な技
術にはイムノブロッティング（ウェスタンブロッティングとしても知られる）、サンドイ
ッチＥＬＩＳＡアッセイまたは生細胞イメージングが含まれるが、これらに限定されない
。当該分野におけるこのような方法または通常の方法およびそれぞれをどのように実施す
るかの詳細は周知である（例えば、[Specificity of botulinum protease for human VAM
P family proteins. Yamamoto Hら、Microbiol Immunol, 2012 Apr. PMID 22289120; Sub
strate recognition of VAMP-2 by botulinum neurotoxin B and tetanus neurotoxin. C
hen Sら、J Biol Chem, 2008 Jul 25. PMID 18511417]を参照）。
準的な技術を使用して、本明細書に記載のポリペプチドの切断を検出し得る。例示的な技
術にはイムノブロッティング（ウェスタンブロッティングとしても知られる）、サンドイ
ッチＥＬＩＳＡアッセイまたは生細胞イメージングが含まれるが、これらに限定されない
。当該分野におけるこのような方法または通常の方法およびそれぞれをどのように実施す
るかの詳細は周知である（例えば、[Specificity of botulinum protease for human VAM
P family proteins. Yamamoto Hら、Microbiol Immunol, 2012 Apr. PMID 22289120; Sub
strate recognition of VAMP-2 by botulinum neurotoxin B and tetanus neurotoxin. C
hen Sら、J Biol Chem, 2008 Jul 25. PMID 18511417]を参照）。
【0177】
神経毒活性の検出は、遺伝的に改変された細胞の非存在下で、インビトロで行われ得る
。例えば、本発明のポリペプチドは神経毒（または以下に記載されるような試験試料）と
接触され得、そして切断された産物の存在が決定され得る（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウ
ェスタンブロッティングによって）。このような検出方法の開発は、十分に当業者の通常
の能力の範囲内である。
。例えば、本発明のポリペプチドは神経毒（または以下に記載されるような試験試料）と
接触され得、そして切断された産物の存在が決定され得る（例えば、ＥＬＩＳＡまたはウ
ェスタンブロッティングによって）。このような検出方法の開発は、十分に当業者の通常
の能力の範囲内である。
【0178】
あるいは、神経毒活性の検出が本明細書の他の場所に記載されるように、遺伝的に改変
された細胞を使用して行われ得る。有利には遺伝子改変された細胞が神経毒作用の３つの
段階、すなわち、細胞表面への結合、細胞サイトゾルへの神経毒ペプチダーゼの送達、お
よびその基質（このケースでは本発明のポリペプチド）の神経毒誘導切断の全てを試験す
るための手段を提供する。切断された産物の存在は（例えば、ＥＬＩＳＡまたは細胞溶解
物のウェスタンブロッティングによって）決定され得る。生細胞イメージングはまた、ポ
リペプチド（すなわち、ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよび
ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ドメインの一部を含むフラ
グメント）の神経毒切断によって生成される「第１フラグメント」が、もはや小胞結合さ
れないが、細胞サイトゾル中に存在するので、神経毒活性を検出するために使用され得る
。このような検出方法の開発は、十分に当業者の通常の能力の範囲内である。
された細胞を使用して行われ得る。有利には遺伝子改変された細胞が神経毒作用の３つの
段階、すなわち、細胞表面への結合、細胞サイトゾルへの神経毒ペプチダーゼの送達、お
よびその基質（このケースでは本発明のポリペプチド）の神経毒誘導切断の全てを試験す
るための手段を提供する。切断された産物の存在は（例えば、ＥＬＩＳＡまたは細胞溶解
物のウェスタンブロッティングによって）決定され得る。生細胞イメージングはまた、ポ
リペプチド（すなわち、ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよび
ＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ドメインの一部を含むフラ
グメント）の神経毒切断によって生成される「第１フラグメント」が、もはや小胞結合さ
れないが、細胞サイトゾル中に存在するので、神経毒活性を検出するために使用され得る
。このような検出方法の開発は、十分に当業者の通常の能力の範囲内である。
【0179】
切断されたポリペプチドのルシフェラーゼ活性はまた、神経毒誘導切断の検出に使用さ
れ得る。ルシフェラーゼ検出およびそのような方法の開発を含む標準的な技術は、十分に
当業者の通常の能力の範囲内である。ルシフェラーゼ検出方法の概説は、[Application o
f enzyme bioluminescence for medical diagnostics. Frank LA, Krasitskaya VV. Adv
Biochem Eng Biotechnol. 2014;144:175-97; Current advanced bioluminescence techno
logy in drug discovery. Hoshino H. Expert Opin Drug Discov. 2009 Apr;4(4):373-89
]に見出される。
れ得る。ルシフェラーゼ検出およびそのような方法の開発を含む標準的な技術は、十分に
当業者の通常の能力の範囲内である。ルシフェラーゼ検出方法の概説は、[Application o
f enzyme bioluminescence for medical diagnostics. Frank LA, Krasitskaya VV. Adv
Biochem Eng Biotechnol. 2014;144:175-97; Current advanced bioluminescence techno
logy in drug discovery. Hoshino H. Expert Opin Drug Discov. 2009 Apr;4(4):373-89
]に見出される。
【0180】
ポリペプチドの切断された末端に特異的な抗体はまた、神経毒誘導切断の検出に使用さ
れ得る。ポリペプチドの切断された末端に特異的な抗体を使用する１つの利点はそれらを
使用して、どの特定の神経毒（例えば、破傷風／ＢｏＮＴ型Ｂ、ＢｏＮＴ型Ｄ、ＢｏＮＴ
型ＦまたはＢｏＮＴ型Ｇ－表１を参照のこと）がポリペプチドの切断に関与するか（した
がって、どの神経毒が例えば、以下に記載されるような例えば試験サンプル内に存在する
か）を決定し得ることである。
れ得る。ポリペプチドの切断された末端に特異的な抗体を使用する１つの利点はそれらを
使用して、どの特定の神経毒（例えば、破傷風／ＢｏＮＴ型Ｂ、ＢｏＮＴ型Ｄ、ＢｏＮＴ
型ＦまたはＢｏＮＴ型Ｇ－表１を参照のこと）がポリペプチドの切断に関与するか（した
がって、どの神経毒が例えば、以下に記載されるような例えば試験サンプル内に存在する
か）を決定し得ることである。
【0181】
例として、ＢｏＮＴ／Ｂ切断ＶＡＭＰ２またはＢｏＮＴ／Ｄ切断ＶＡＭＰ２に特異的な
抗体を生成することができる（抗体は、それぞれ、ペプチドＡＬＱＡＧＡＳＱおよびペプ
チドＫＶＬＥＲＤＱＫに対して産生された（図５および対応する図の凡例を参照のこと）
。
抗体を生成することができる（抗体は、それぞれ、ペプチドＡＬＱＡＧＡＳＱおよびペプ
チドＫＶＬＥＲＤＱＫに対して産生された（図５および対応する図の凡例を参照のこと）
。
【0182】
本発明は、試験試料中の神経毒活性を検出するために使用することができる。
【0183】
本明細書で使用される場合、「試験試料」は神経毒活性の存在について試験される任意
の試料（既知、未知、または部分的に既知の組成を有する）であってもよく、神経毒活性
は破傷風神経毒活性、Ｂ型ボツリヌス神経毒活性、Ｄ型ボツリヌス神経毒活性、Ｆ型ボツ
リヌス神経毒活性およびＧ型ボツリヌス神経毒活性、またはそれらの任意の組合せからな
る群から選択される。
の試料（既知、未知、または部分的に既知の組成を有する）であってもよく、神経毒活性
は破傷風神経毒活性、Ｂ型ボツリヌス神経毒活性、Ｄ型ボツリヌス神経毒活性、Ｆ型ボツ
リヌス神経毒活性およびＧ型ボツリヌス神経毒活性、またはそれらの任意の組合せからな
る群から選択される。
【0184】
「試験試料」は薬剤商品（例えば、毒性もはやないが依然として抗原性であり、ワクチ
ンとして使用することができる、病原性微生物（例えば、破傷風またはボツリヌス）由来
の化学修飾毒素であるトキソイド、などの被験体に投与するためのワクチン）を含むこと
ができる。このような場合、本発明は、（望ましくない）残留神経毒活性を検出するため
に使用され得る。
ンとして使用することができる、病原性微生物（例えば、破傷風またはボツリヌス）由来
の化学修飾毒素であるトキソイド、などの被験体に投与するためのワクチン）を含むこと
ができる。このような場合、本発明は、（望ましくない）残留神経毒活性を検出するため
に使用され得る。
【0185】
本明細書で使用される場合、「対象」はヒトまたは動物（例えば、ワクチン接種される
）を指す。通常、動物は、霊長類、げっ歯類、家畜または狩猟動物などの脊椎動物である
。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク（例えば、アカゲ
ザル）が含まれる。げっ歯類には、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサ
ギおよびハムスターが含まれる。家畜および狩猟動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バ
イソン、バッファロー、ネコ種、例えばイエネコ、イヌ種（例えばイヌ、霧、オオカミ）
、鳥類（例えばニワトリ、エミュー、ダチョウ）、および魚（例えばマス、ナマズ、サケ
）が含まれる。本明細書に記載の態様の特定の実施形態では、対象は哺乳動物、例えば霊
長類、例えばヒトである。対象は、男性であっても女性であってもよい。被験体は完全に
発達した被験体（例えば、成人）または発達過程を受ける被験体（例えば、子供、乳児ま
たは胎児）であり得る。
）を指す。通常、動物は、霊長類、げっ歯類、家畜または狩猟動物などの脊椎動物である
。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク（例えば、アカゲ
ザル）が含まれる。げっ歯類には、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサ
ギおよびハムスターが含まれる。家畜および狩猟動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バ
イソン、バッファロー、ネコ種、例えばイエネコ、イヌ種（例えばイヌ、霧、オオカミ）
、鳥類（例えばニワトリ、エミュー、ダチョウ）、および魚（例えばマス、ナマズ、サケ
）が含まれる。本明細書に記載の態様の特定の実施形態では、対象は哺乳動物、例えば霊
長類、例えばヒトである。対象は、男性であっても女性であってもよい。被験体は完全に
発達した被験体（例えば、成人）または発達過程を受ける被験体（例えば、子供、乳児ま
たは胎児）であり得る。
【0186】
好ましくは、対象は哺乳動物である。哺乳動物はヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット
、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。
、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。
【0187】
適切な試験試料はまた、食品試料、臨床試料または環境試料（ここで、食品試料、臨床
試料または環境試料は、クロストリジウムで汚染されていてもよく、および／または神経
毒を含んでもよい）、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。このような場合
、本発明は、汚染の存在を検出するために使用することができる。
試料または環境試料は、クロストリジウムで汚染されていてもよく、および／または神経
毒を含んでもよい）、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。このような場合
、本発明は、汚染の存在を検出するために使用することができる。
【0188】
適切な試験試料はまた、破傷風神経毒、Ｂ型ボツリヌス神経毒、Ｄ型ボツリヌス神経毒
、Ｆ型ボツリヌス神経毒および／またはＧ型ボツリヌス神経毒（例えば、任意に治療的ま
たは非治療的使用のために製造される、既知のバッチの神経毒からの試験試料）、または
それらの任意の組み合わせを含む。このような場合、本発明は、神経毒の効力を検出また
は決定するために使用され得る。疑義を避けるために、試験試料中の神経毒は天然に存在
する神経毒であってもよく、またはその改変（例えば、キメラを含む人工的に改変）され
たバージョンであってもよい。
、Ｆ型ボツリヌス神経毒および／またはＧ型ボツリヌス神経毒（例えば、任意に治療的ま
たは非治療的使用のために製造される、既知のバッチの神経毒からの試験試料）、または
それらの任意の組み合わせを含む。このような場合、本発明は、神経毒の効力を検出また
は決定するために使用され得る。疑義を避けるために、試験試料中の神経毒は天然に存在
する神経毒であってもよく、またはその改変（例えば、キメラを含む人工的に改変）され
たバージョンであってもよい。
【0189】
好ましい方法において、神経毒活性は本発明の遺伝子改変細胞を用いて検出（または決
定）され、ここで、細胞はルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよ
びＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドを含むポリ
ペプチドの発現を可能にする条件下で培養される。この例では、遺伝子改変された細胞を
神経毒（または試験試料）と接触させ、切断産物の存在を（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェス
タンブロッティングまたは生細胞イメージングによって）決定することができる。このよ
うな方法の開発も、十分に当業者の通常の能力の範囲内である。
定）され、ここで、細胞はルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよ
びＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドを含むポリ
ペプチドの発現を可能にする条件下で培養される。この例では、遺伝子改変された細胞を
神経毒（または試験試料）と接触させ、切断産物の存在を（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェス
タンブロッティングまたは生細胞イメージングによって）決定することができる。このよ
うな方法の開発も、十分に当業者の通常の能力の範囲内である。
【0190】
したがって、試験試料中の神経毒活性を検出する方法が提供され、この方法は以下を含
む:
(ａ)ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよびＶＡＭＰ１、ＶＡ
ＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドを含むポリペプチドの発現を可
能にする条件下で、本発明による遺伝的に改変された細胞を培養する工程;
(ｂ)（ａ）ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよびＶＡＭＰ１
、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドを含むポリペプチドの神
経毒誘発切断を可能にする条件下で、（ａ）の細胞を試験試料の存在下で培養する工程
(ｃ)ポリペプチドの神経毒誘発切断のレベルを決定することであって、ここでポリペプ
チドの神経毒誘発切断の検出は神経毒活性の指標であり;
ここで、神経毒活性は、破傷風神経毒活性、Ｂ型ボツリヌス神経毒活性、Ｄ型ボツリヌ
ス神経毒活性、Ｆ型ボツリヌス神経毒活性およびＧ型ボツリヌス神経毒活性、またはそれ
らの任意の組み合わせからなる群から選択される。
む:
(ａ)ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよびＶＡＭＰ１、ＶＡ
ＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドを含むポリペプチドの発現を可
能にする条件下で、本発明による遺伝的に改変された細胞を培養する工程;
(ｂ)（ａ）ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよびＶＡＭＰ１
、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドを含むポリペプチドの神
経毒誘発切断を可能にする条件下で、（ａ）の細胞を試験試料の存在下で培養する工程
(ｃ)ポリペプチドの神経毒誘発切断のレベルを決定することであって、ここでポリペプ
チドの神経毒誘発切断の検出は神経毒活性の指標であり;
ここで、神経毒活性は、破傷風神経毒活性、Ｂ型ボツリヌス神経毒活性、Ｄ型ボツリヌ
ス神経毒活性、Ｆ型ボツリヌス神経毒活性およびＧ型ボツリヌス神経毒活性、またはそれ
らの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【0191】
工程（ａ）における培養条件は、ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメ
インおよびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドを
含むポリペプチドの発現を可能にするような条件である。ポリペプチドの発現を可能にす
るために培養条件を最適化することは、十分に当業者の通常の能力の範囲内である。さら
に、選択された培養条件がポリペプチド発現を可能にするか否かを同定することも通常で
あり、ポリペプチド発現量は、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティングのような標準
的な技術を用いて検出され得る。
インおよびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドを
含むポリペプチドの発現を可能にするような条件である。ポリペプチドの発現を可能にす
るために培養条件を最適化することは、十分に当業者の通常の能力の範囲内である。さら
に、選択された培養条件がポリペプチド発現を可能にするか否かを同定することも通常で
あり、ポリペプチド発現量は、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティングのような標準
的な技術を用いて検出され得る。
【0192】
細胞は、宿主細胞に応じて、当業者がよく知っている方法で増殖または培養される。使
用される培養培地（本明細書では「増殖培地」、「培地」または「培地」とも呼ばれる）
は、問題の細胞の要件を適切に満たさなければならない。好ましくは、培養培地は宿主細
胞の増殖を支持するのに十分である。種々の細胞のための適切な培養培地の説明はテキス
トブック「Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized A
pplications, Sixth Edition, R. Ian Freshney, 2010 John Wiley & Sons, Inc.」に記
載されている。例としてはＳｉＭａ神経芽細胞腫細胞（ＤＳＭＺ細胞コレクション由来）
を、１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ培地中で増殖させるという条件下で培養する
ことが好ましい。分化のために、プレートを１０μｇ／ｍｌラミニンでプレコートした。
ＳｉＭａ細胞を９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０４細胞、または４８ウェル
プレートに１ウェルあたり２×１０４細胞を播種し、分化培地（ＲＰＭＩ、Ｂ２７または
ＧＳ２１補充物、１ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１０μＭ ＡＴ－レチノイン酸を含む１％
ＮＥＡＡ）中で７２時間インキュベートした。
用される培養培地（本明細書では「増殖培地」、「培地」または「培地」とも呼ばれる）
は、問題の細胞の要件を適切に満たさなければならない。好ましくは、培養培地は宿主細
胞の増殖を支持するのに十分である。種々の細胞のための適切な培養培地の説明はテキス
トブック「Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized A
pplications, Sixth Edition, R. Ian Freshney, 2010 John Wiley & Sons, Inc.」に記
載されている。例としてはＳｉＭａ神経芽細胞腫細胞（ＤＳＭＺ細胞コレクション由来）
を、１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ培地中で増殖させるという条件下で培養する
ことが好ましい。分化のために、プレートを１０μｇ／ｍｌラミニンでプレコートした。
ＳｉＭａ細胞を９６ウェルプレートに１ウェルあたり１×１０４細胞、または４８ウェル
プレートに１ウェルあたり２×１０４細胞を播種し、分化培地（ＲＰＭＩ、Ｂ２７または
ＧＳ２１補充物、１ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１０μＭ ＡＴ－レチノイン酸を含む１％
ＮＥＡＡ）中で７２時間インキュベートした。
【0193】
遺伝的に修飾された細胞は二酸化炭素中でガスを発生させながら、０℃～１００℃、好
ましくは２５℃～４０℃の温度で、通常は糖の形態の炭素源、通常は酵母エキスのような
有機窒素源または硫酸アンモニウムのような塩、無機塩、鉄、マンガンおよびマグネシウ
ムの塩、および適切な場合にはビタミンのような微量元素、およびビタミンの形態で炭素
源、窒素源の１つ以上を含む液体培地中で増殖させることができる。
ましくは２５℃～４０℃の温度で、通常は糖の形態の炭素源、通常は酵母エキスのような
有機窒素源または硫酸アンモニウムのような塩、無機塩、鉄、マンガンおよびマグネシウ
ムの塩、および適切な場合にはビタミンのような微量元素、およびビタミンの形態で炭素
源、窒素源の１つ以上を含む液体培地中で増殖させることができる。
【0194】
好ましい炭素源は、単糖、二糖または多糖などの糖である。炭素源の例は、グルコース
、二酸化炭素、重炭酸ナトリウム、重炭酸塩、フルクトース、マンノース、ガラクトース
、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノ
ース、デンプンまたはセルロースである。好ましくは、炭素源は二酸化炭素である。ある
いは、炭素源は重炭酸塩である。様々な炭素源の混合物の添加も有利であり得る。
、二酸化炭素、重炭酸ナトリウム、重炭酸塩、フルクトース、マンノース、ガラクトース
、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノ
ース、デンプンまたはセルロースである。好ましくは、炭素源は二酸化炭素である。ある
いは、炭素源は重炭酸塩である。様々な炭素源の混合物の添加も有利であり得る。
【0195】
窒素源は、通常、有機または無機窒素化合物またはこれらの化合物を含む材料である。
窒素源の例は、液体または気体形態のアンモニアまたはアンモニウム塩（例えば硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムまたは硝酸アンモ
ニウム）、硝酸塩、尿素、アミノ酸または複雑な窒素源（例えばコーンスティープリカー
、大豆ミール、大豆タンパク質、酵母エキス、肉エキスなど）などを含む。窒素源は、単
独でまたは混合物として使用することができる。
窒素源の例は、液体または気体形態のアンモニアまたはアンモニウム塩（例えば硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムまたは硝酸アンモ
ニウム）、硝酸塩、尿素、アミノ酸または複雑な窒素源（例えばコーンスティープリカー
、大豆ミール、大豆タンパク質、酵母エキス、肉エキスなど）などを含む。窒素源は、単
独でまたは混合物として使用することができる。
【0196】
媒体中に存在し得る無機塩化合物は、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバル
ト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物、リンおよび硫酸塩を
含む。
ト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物、リンおよび硫酸塩を
含む。
【0197】
無機硫黄含有化合物（例えば、硫酸塩、亜硫酸塩、ジチオナイト、テトラチオネート、
チオ硫酸塩、硫化物）、または有機硫黄化合物（例えば、メルカプタンおよびチオール）
を、硫黄含有ファインケミカル、特にメチオニンの製造のための硫黄源として使用するこ
とができる。
チオ硫酸塩、硫化物）、または有機硫黄化合物（例えば、メルカプタンおよびチオール）
を、硫黄含有ファインケミカル、特にメチオニンの製造のための硫黄源として使用するこ
とができる。
【0198】
リン酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム
含有塩を、リンの供給源として使用することができる。
含有塩を、リンの供給源として使用することができる。
【0199】
キレート剤は、金属イオンを溶液中に保持するために媒体に添加されてもよい。特に好
適なキレート剤は、カテコールまたはプロトカテク酸などのジヒドロキシフェノールおよ
びクエン酸などの有機酸を含む。
適なキレート剤は、カテコールまたはプロトカテク酸などのジヒドロキシフェノールおよ
びクエン酸などの有機酸を含む。
【0200】
本発明に従って使用される培養培地はまた、ビタミンまたは増殖促進剤などの他の増殖
因子を含み得、これには、例えば、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン
酸、パントテン酸塩およびピリドキシンが含まれる。増殖因子および塩はしばしば、酵母
エキス、糖蜜、コーンスティープリカーなどの複合培地成分に由来する。さらに、培養培
地に適切な前駆体を添加することが可能である。培地化合物の正確な組成は特定の実験に
大きく依存し、各特定の場合について個々に決定される。培地の最適化に関する情報は、
教科書「Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach」(Editors P.M. Rhode
s, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)に記載されてい
る。増殖培地はまた、商業的供給業者、例えば、Standard 1（メルク）またはBHI（brain
heart infusion、ＤＩＦＣＯ）などから入手され得る。
因子を含み得、これには、例えば、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン
酸、パントテン酸塩およびピリドキシンが含まれる。増殖因子および塩はしばしば、酵母
エキス、糖蜜、コーンスティープリカーなどの複合培地成分に由来する。さらに、培養培
地に適切な前駆体を添加することが可能である。培地化合物の正確な組成は特定の実験に
大きく依存し、各特定の場合について個々に決定される。培地の最適化に関する情報は、
教科書「Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach」(Editors P.M. Rhode
s, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)に記載されてい
る。増殖培地はまた、商業的供給業者、例えば、Standard 1（メルク）またはBHI（brain
heart infusion、ＤＩＦＣＯ）などから入手され得る。
【0201】
液体培地のｐＨは一定に保つことができ、すなわち、培養期間中に調節することができ
、または調節しないことができる。
、または調節しないことができる。
【0202】
既知の培養方法の概要は、Ｃｈｍｉｅｌによる教科書（(Bioprozesstechnik 1. Einfuh
rung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess technology 1. Introduction to Biopr
ocess technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)）またはＳｔｏｒｈａｓ
による教科書(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and periphera
l equipment] (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)で見つけることができる。
rung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess technology 1. Introduction to Biopr
ocess technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)）またはＳｔｏｒｈａｓ
による教科書(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and periphera
l equipment] (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)で見つけることができる。
【0203】
すべての培地成分を、加熱（１．５バールおよび１２１℃で２０分）またはフィルター
滅菌のいずれかによって滅菌する。これらの成分は一緒に、または必要であれば別々に滅
菌することができる。全ての培地成分は、培養の開始時に存在してもよく、または所望に
よって連続的にもしくはバッチ式で添加されてもよい。
滅菌のいずれかによって滅菌する。これらの成分は一緒に、または必要であれば別々に滅
菌することができる。全ての培地成分は、培養の開始時に存在してもよく、または所望に
よって連続的にもしくはバッチ式で添加されてもよい。
【0204】
培養温度は、特定の実験および宿主細胞に依存して変化する。培養温度は通常、１５℃
～４５℃、好ましくは２５℃～４０℃、より好ましくは２５℃～３７℃であり、一定に保
つことができ、または実験中に変更することができる。単なる例として、ＳｉＭａ神経芽
細胞腫細胞については、温度が好ましくは２５～４０℃、より好ましくは３７℃である。
～４５℃、好ましくは２５℃～４０℃、より好ましくは２５℃～３７℃であり、一定に保
つことができ、または実験中に変更することができる。単なる例として、ＳｉＭａ神経芽
細胞腫細胞については、温度が好ましくは２５～４０℃、より好ましくは３７℃である。
【0205】
培地のｐＨは、５～８．５の範囲、好ましくは約７．０であるべきである。培養のため
のｐＨは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアおよびアンモニア水などの塩
基性化合物またはリン酸もしくは硫酸などの酸性化合物を添加することによって、培養中
に制御することができる。発泡は、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を
使用することによって制御することができる。ベクターの安定性を維持するために、選択
的効果を有する適切な物質、例えば抗生物質を培地に添加することが可能である。好気条
件は、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば周囲空気を培養物に導入することによって
維持される。培養物の温度は、通常２０℃～４５℃、好ましくは２５℃～４０℃である。
ポリペプチドの発現が起こるまで培養を続ける。この目的は、通常、６～９６時間以内に
達成される。
のｐＨは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアおよびアンモニア水などの塩
基性化合物またはリン酸もしくは硫酸などの酸性化合物を添加することによって、培養中
に制御することができる。発泡は、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を
使用することによって制御することができる。ベクターの安定性を維持するために、選択
的効果を有する適切な物質、例えば抗生物質を培地に添加することが可能である。好気条
件は、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば周囲空気を培養物に導入することによって
維持される。培養物の温度は、通常２０℃～４５℃、好ましくは２５℃～４０℃である。
ポリペプチドの発現が起こるまで培養を続ける。この目的は、通常、６～９６時間以内に
達成される。
【0206】
工程（ｂ）の培養条件は試験試料の存在下であり、ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端
ポリペプチドドメインおよびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末
端ポリペプチドを含むポリペプチドの神経毒誘導切断を可能にするような条件である。言
い換えれば、培養条件は、機能的神経毒が試験試料中に存在する場合、ポリペプチドの少
なくともいくらかの神経毒誘導性切断が起こるような条件である。ポリペプチドの神経毒
誘導切断を可能にする培養条件を最適化することは、十分に当業者の通常の能力の範囲内
である。さらに、選択された培養条件がポリペプチドの神経毒誘発性切断を可能にするか
否かを同定することもまた通常行われ、（他で述べるように）ポリペプチドの神経毒誘発
性切断の量は、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティングなどの標準的な技術を使用し
て検出され得る。
ポリペプチドドメインおよびＶＡＭＰ１、ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末
端ポリペプチドを含むポリペプチドの神経毒誘導切断を可能にするような条件である。言
い換えれば、培養条件は、機能的神経毒が試験試料中に存在する場合、ポリペプチドの少
なくともいくらかの神経毒誘導性切断が起こるような条件である。ポリペプチドの神経毒
誘導切断を可能にする培養条件を最適化することは、十分に当業者の通常の能力の範囲内
である。さらに、選択された培養条件がポリペプチドの神経毒誘発性切断を可能にするか
否かを同定することもまた通常行われ、（他で述べるように）ポリペプチドの神経毒誘発
性切断の量は、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティングなどの標準的な技術を使用し
て検出され得る。
【0207】
一実施形態において、培養工程（ａ）および（ｂ）は、同時に実施される。言い換えれ
ば、試験試料は、細胞培養の開始時に遺伝子改変細胞に添加されてもよく、またはポリペ
プチド発現がすでに開始された後に添加されてもよい。遺伝子改変細胞が試験試料の存在
下で培養される時点を最適化することは、十分に当業者の通常の能力の範囲内である。
ば、試験試料は、細胞培養の開始時に遺伝子改変細胞に添加されてもよく、またはポリペ
プチド発現がすでに開始された後に添加されてもよい。遺伝子改変細胞が試験試料の存在
下で培養される時点を最適化することは、十分に当業者の通常の能力の範囲内である。
【0208】
任意選択で、試験試料は培養培地中に提供される。
【0209】
他の場所に記載されるように、試験試料は、薬物製品、食品試料、臨床試料、または環
境試料、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。あるいは、試験試料が破傷風トキ
ソイド、ボツリヌストキソイド、またはそれらの組み合わせを含み得る。
境試料、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。あるいは、試験試料が破傷風トキ
ソイド、ボツリヌストキソイド、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【0210】
試験試料は、破傷風神経毒、Ｂ型ボツリヌス神経毒、Ｄ型ボツリヌス神経毒、Ｆ型ボツ
リヌス神経毒、Ｇ型ボツリヌス神経毒、またはそれらの任意の組合せを含み得る。疑義を
避けるために、試験試料中の神経毒は天然に存在する神経毒であってもよく、またはその
改変（例えば、キメラを含む人工的に改変された）バージョンであってもよい。
リヌス神経毒、Ｇ型ボツリヌス神経毒、またはそれらの任意の組合せを含み得る。疑義を
避けるために、試験試料中の神経毒は天然に存在する神経毒であってもよく、またはその
改変（例えば、キメラを含む人工的に改変された）バージョンであってもよい。
【0211】
本明細書で提供される方法は工程（ｃ）、すなわち、ポリペプチドの神経毒誘発切断の
レベルを決定する工程を含み、ここで、ポリペプチドの神経毒誘発切断の検出は、神経毒
活性を示し；そして神経毒活性が破傷風神経毒活性、Ｂ型ボツリヌス神経毒活性、Ｄ型ボ
ツリヌス神経毒活性、Ｆ型ボツリヌス神経毒活性およびＧ型ボツリヌス神経毒活性、また
はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
レベルを決定する工程を含み、ここで、ポリペプチドの神経毒誘発切断の検出は、神経毒
活性を示し；そして神経毒活性が破傷風神経毒活性、Ｂ型ボツリヌス神経毒活性、Ｄ型ボ
ツリヌス神経毒活性、Ｆ型ボツリヌス神経毒活性およびＧ型ボツリヌス神経毒活性、また
はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【0212】
ポリペプチドの神経毒誘導性切断のレベルは本明細書の他の箇所で議論される適切な標
準的技術（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、生細胞イメージングなど）
のいずれかを使用して決定（または検出）され得る。
準的技術（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、生細胞イメージングなど）
のいずれかを使用して決定（または検出）され得る。
【0213】
本明細書で使用される場合、神経毒誘導切断の「検出」は検出可能な、例えば、可視、
定量可能などの、任意のレベルまたは量の神経毒誘導切断を包含する。例として、これは
、試験の時点（試験の時点が例えば、細胞への試験試料の添加後６時間以上であり得る）
での基質（本発明のポリペプチド）の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％
、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％
、９０％、９５％または１００％の切断を含む。細胞への試験試料の添加後の適切な時点
（例えば、上記で使用される「試験の時点」）の他の例としては、少なくとも２４、少な
くとも４８時間または少なくとも７２時間、が含まれる。
定量可能などの、任意のレベルまたは量の神経毒誘導切断を包含する。例として、これは
、試験の時点（試験の時点が例えば、細胞への試験試料の添加後６時間以上であり得る）
での基質（本発明のポリペプチド）の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％
、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％
、９０％、９５％または１００％の切断を含む。細胞への試験試料の添加後の適切な時点
（例えば、上記で使用される「試験の時点」）の他の例としては、少なくとも２４、少な
くとも４８時間または少なくとも７２時間、が含まれる。
【0214】
「神経毒誘導切断」は本発明のポリペプチドの切断を指し、ここで、切断は神経毒の活
性に起因する（すなわち、これは、非特異的ポリペプチド分解または他の非神経毒酵素に
よる切断などの他の機構に起因するポリペプチドの切断を含まない）。神経毒誘発切断は
神経毒誘発切断が起こったことを確認するために、ＥＬＩＳＡまたは切断産物のサイズ（
例えば、ウェスタンブロットで）などの当技術分野の標準的な技法を使用して同定するこ
とができる。ポリペプチドの神経毒誘発切断の検出は神経毒活性を示す（例えば、切断の
レベルまたは量は、試験試料中の神経毒活性のレベルまたは量に比例する）。本発明の文
脈において、用語「神経毒誘導切断」および「神経毒活性」は、互換的に使用され得る。
性に起因する（すなわち、これは、非特異的ポリペプチド分解または他の非神経毒酵素に
よる切断などの他の機構に起因するポリペプチドの切断を含まない）。神経毒誘発切断は
神経毒誘発切断が起こったことを確認するために、ＥＬＩＳＡまたは切断産物のサイズ（
例えば、ウェスタンブロットで）などの当技術分野の標準的な技法を使用して同定するこ
とができる。ポリペプチドの神経毒誘発切断の検出は神経毒活性を示す（例えば、切断の
レベルまたは量は、試験試料中の神経毒活性のレベルまたは量に比例する）。本発明の文
脈において、用語「神経毒誘導切断」および「神経毒活性」は、互換的に使用され得る。
【0215】
本発明の特定の実施形態では、（上記で詳述したように）陰性対照を使用することが有
利であり得る。例えば、ポリペプチドの神経毒誘発切断のレベルを決定し、次いで、陰性
対照試料中のポリペプチドの切断のレベルまたはポリペプチドの切断のための所定の基準
レベルと比較することができ、試験試料の存在下での切断のレベルが対照試料と比較して
、または所定の基準レベルと比較して増加することにより、神経毒誘発切断の存在が同定
される。陰性対照には、同じ細胞を、同じ条件下で、試験試料の非存在下で、または神経
毒活性を欠くことが知られている試料、例えば熱不活性化試験試料の存在下で培養するこ
とが含まれる。
利であり得る。例えば、ポリペプチドの神経毒誘発切断のレベルを決定し、次いで、陰性
対照試料中のポリペプチドの切断のレベルまたはポリペプチドの切断のための所定の基準
レベルと比較することができ、試験試料の存在下での切断のレベルが対照試料と比較して
、または所定の基準レベルと比較して増加することにより、神経毒誘発切断の存在が同定
される。陰性対照には、同じ細胞を、同じ条件下で、試験試料の非存在下で、または神経
毒活性を欠くことが知られている試料、例えば熱不活性化試験試料の存在下で培養するこ
とが含まれる。
【0216】
さらに、または代替として、陽性対照を使用することが有利であり得る（例えば、トキ
ソイドの残留神経毒活性について試験する場合、偽陰性が生成されないことを確実にする
ために）。陽性対照の例は、機能性神経毒を含むことが知られている試験試料の存在下で
、同じ細胞を同じ条件下で培養することであり得る。
ソイドの残留神経毒活性について試験する場合、偽陰性が生成されないことを確実にする
ために）。陽性対照の例は、機能性神経毒を含むことが知られている試験試料の存在下で
、同じ細胞を同じ条件下で培養することであり得る。
【0217】
【0218】
他の適切な陽性対照および陰性対照の開発および使用は、十分に当業者の通常の能力の
範囲内である。
範囲内である。
【0219】
（キット）
神経毒活性を検出するためのキットもまた、本明細書中に提供され、ここで、該キットは
以下を含む
(ａ)ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよびＶＡＭＰ１、ＶＡ
ＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドドメインを含むポリペプチドを
コードする核酸分子；および
(ｂ)（ａ）の核酸分子によってコードされるポリペプチドを切断することができる、神
経毒活性を検出するための陽性対照。
神経毒活性を検出するためのキットもまた、本明細書中に提供され、ここで、該キットは
以下を含む
(ａ)ルシフェラーゼ活性を有するＮ末端ポリペプチドドメインおよびＶＡＭＰ１、ＶＡ
ＭＰ２またはＶＡＭＰ３活性を有するＣ末端ポリペプチドドメインを含むポリペプチドを
コードする核酸分子；および
(ｂ)（ａ）の核酸分子によってコードされるポリペプチドを切断することができる、神
経毒活性を検出するための陽性対照。
【0220】
神経毒活性は、破傷風神経毒活性、Ｂ型ボツリヌス神経毒活性、Ｄ型ボツリヌス神経毒
活性、Ｆ型ボツリヌス神経毒活性およびＧ型ボツリヌス神経毒活性、またはそれらの任意
の組み合わせからなる群から選択され得る。
活性、Ｆ型ボツリヌス神経毒活性およびＧ型ボツリヌス神経毒活性、またはそれらの任意
の組み合わせからなる群から選択され得る。
【0221】
（ａ）の核酸分子（およびコードされるポリペプチド）は、本明細書の他の箇所に詳細に
記載されている。
記載されている。
【0222】
好ましくは、核酸分子が発現ベクターの一部であってもよく、および／または遺伝子改
変細胞（例えば、遺伝子改変ＳｉＭａ神経芽細胞腫細胞）内にあってもよい（例えば、そ
の一部を形成してもよい；その中に存在してもよい）。このような核酸分子を含む発現ベ
クターおよび遺伝的に改変された細胞もまた、本明細書中に詳細に記載される。
変細胞（例えば、遺伝子改変ＳｉＭａ神経芽細胞腫細胞）内にあってもよい（例えば、そ
の一部を形成してもよい；その中に存在してもよい）。このような核酸分子を含む発現ベ
クターおよび遺伝的に改変された細胞もまた、本明細書中に詳細に記載される。
【0223】
本明細書で提供されるキットは神経毒活性を検出するための陽性対照をさらに含み、陽
性対照は、（ａ）の核酸分子によってコードされるポリペプチドを切断することができる
。
性対照は、（ａ）の核酸分子によってコードされるポリペプチドを切断することができる
。
【0224】
一実施形態では、陽性対照が破傷風神経毒、Ｂ型ボツリヌス神経毒、Ｄ型ボツリヌス神
経毒、Ｆ型ボツリヌス神経毒、およびＧ型ボツリヌス神経毒のうちの少なくとも１つの適
切な量を含み得る。別途記載したように、神経毒は自然に生じるかまたはその改変された
バージョンであって、改変されたバージョンは神経毒活性を保持している。
経毒、Ｆ型ボツリヌス神経毒、およびＧ型ボツリヌス神経毒のうちの少なくとも１つの適
切な量を含み得る。別途記載したように、神経毒は自然に生じるかまたはその改変された
バージョンであって、改変されたバージョンは神経毒活性を保持している。
【0225】
必要に応じて、キットは、ルシフェラーゼ活性の検出のための試薬をさらに含む。適切
な試薬は当該分野で周知であり、そしてルシフェリン、フリマジン、セレンテラジン、Ａ
ＴＰおよび他の公知のルシフェラーゼ基質を含むが、これらに限定されない［Beyond D-l
uciferin: expanding the scope of bioluminescence imaging in vivo. Adams ST Jr, M
iller SC. Curr Opin Chem Biol. 2014 Aug;21:112-20］。
な試薬は当該分野で周知であり、そしてルシフェリン、フリマジン、セレンテラジン、Ａ
ＴＰおよび他の公知のルシフェラーゼ基質を含むが、これらに限定されない［Beyond D-l
uciferin: expanding the scope of bioluminescence imaging in vivo. Adams ST Jr, M
iller SC. Curr Opin Chem Biol. 2014 Aug;21:112-20］。
【0226】
キットは以下のいずれかまたは全てを含み得る：アッセイ試薬、緩衝液、および１つ以
上の切断されたポリペプチドフラグメントに対する選択的結合パートナー（これらの全て
は輸送に適切な容器に収容され得る）。選択的結合パートナーは、切断されたポリペプチ
ド断片の１つに選択的に結合する抗体を含むことができる。このような抗体の例は、本明
細書の他の場所に記載される（図５および対応する図の説明も参照のこと）。
上の切断されたポリペプチドフラグメントに対する選択的結合パートナー（これらの全て
は輸送に適切な容器に収容され得る）。選択的結合パートナーは、切断されたポリペプチ
ド断片の１つに選択的に結合する抗体を含むことができる。このような抗体の例は、本明
細書の他の場所に記載される（図５および対応する図の説明も参照のこと）。
【0227】
いくつかの実施形態では、キットが連続した固体表面上に選択的結合パートナーを含む
。例示的なキットは、検出結合パートナーおよび神経毒活性を検出するための陽性対照を
有する容器を含む。
。例示的なキットは、検出結合パートナーおよび神経毒活性を検出するための陽性対照を
有する容器を含む。
【0228】
さらに、キットはキットに提供される材料の使用のための説明書（すなわち、プロトコ
ール）を含む説明資料を含み得る。指示資料は典型的には書面または印刷物を含むが、こ
れらはそのような指示を記憶し、それらをエンドユーザに伝達することができる任意の媒
体で提供することができる。適切な媒体としては電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、
テープ、カートリッジ、チップ）および光学媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）が挙げられる
が、これらに限定されない。メディアは、教材を提供するインターネットサイトへのアド
レスを含むことができる。そのような指示は、本明細書で詳述される方法または使用のい
ずれかに従うことができる。
ール）を含む説明資料を含み得る。指示資料は典型的には書面または印刷物を含むが、こ
れらはそのような指示を記憶し、それらをエンドユーザに伝達することができる任意の媒
体で提供することができる。適切な媒体としては電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、
テープ、カートリッジ、チップ）および光学媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）が挙げられる
が、これらに限定されない。メディアは、教材を提供するインターネットサイトへのアド
レスを含むことができる。そのような指示は、本明細書で詳述される方法または使用のい
ずれかに従うことができる。
【0229】
本明細書で特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学
用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。例え
ば、Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2
d Ed., John Wiley and Sons, NY (1 94);およびHale and Marham, The Harper Collins
Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)は当業者に、本発明で使用される
用語の多くの一般的な辞書を提供する。本明細書中に記載されるものと類似または同等の
任意の方法および材料が本発明の実施において使用されるが、好ましい方法および材料は
本明細書中に記載される。したがって、直ぐ下で定義される用語は、本明細書全体を参照
することによって、より完全に説明される。また、本明細書で使用される場合、単数形の
用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は文脈が明確にそわないことを示さない限り、
複数形の参照を含む。他に示さない限り、核酸は、５′から３′の方向で左から右に書か
れ；アミノ酸配列がそれぞれ、アミノからカルボキシの方向で左から右に書かれる。本発
明は記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬に限定されず、これらは当業者
によって使用される文脈に依存して変化し得ることが理解されるべきである。
用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。例え
ば、Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2
d Ed., John Wiley and Sons, NY (1 94);およびHale and Marham, The Harper Collins
Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)は当業者に、本発明で使用される
用語の多くの一般的な辞書を提供する。本明細書中に記載されるものと類似または同等の
任意の方法および材料が本発明の実施において使用されるが、好ましい方法および材料は
本明細書中に記載される。したがって、直ぐ下で定義される用語は、本明細書全体を参照
することによって、より完全に説明される。また、本明細書で使用される場合、単数形の
用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は文脈が明確にそわないことを示さない限り、
複数形の参照を含む。他に示さない限り、核酸は、５′から３′の方向で左から右に書か
れ；アミノ酸配列がそれぞれ、アミノからカルボキシの方向で左から右に書かれる。本発
明は記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬に限定されず、これらは当業者
によって使用される文脈に依存して変化し得ることが理解されるべきである。
【0230】
本発明の態様は、以下の非限定的な実施例によって実証される。
【実施例0231】
ＶＡＭＰ２分子を遺伝子操作することによって、本発明者らは、神経毒で切断されたＶ
ＡＭＰ２の分解を防ぐことができることを示した。このようなアプローチの実施可能性を
実証するために、本発明者らは、ウイルス形質導入を使用して、緑色蛍光タンパク質ＧＦ
Ｐ-ＶＡＭＰ２キメラタンパク質をＳｉＭａ神経芽細胞腫細胞に導入した（図１Ａおよび
Ｂ）。
ＡＭＰ２の分解を防ぐことができることを示した。このようなアプローチの実施可能性を
実証するために、本発明者らは、ウイルス形質導入を使用して、緑色蛍光タンパク質ＧＦ
Ｐ-ＶＡＭＰ２キメラタンパク質をＳｉＭａ神経芽細胞腫細胞に導入した（図１Ａおよび
Ｂ）。
【0232】
本発明者らは、ＧＦＰ－ＶＡＭＰ２が予想通り小胞内に局在することを観察した（図１
Ｃ、上）。次に、本発明者らは、ｍＣｈｅｒｒｙ標識破傷風軽鎖（ＶＡＭＰ２切断ドメイ
ン）をＳｉＭａ細胞にトランスフェクトした（図１Ｃ、右下）。トランスフェクションの
２日後、本発明者らは、破傷風発現細胞において、ＧＦＰ-ＶＡＭＰ２切断産物の細胞質
ゾルへの再分布を検出した（図１Ｃ、左下）。重要なことに、イムノブロッティングは安
定なＧＦＰ-ＶＡＭＰ２切断産物を明らかにし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで破傷風作用を定量す
る可能性を開いた（図１Ｄ）。これらの結果は、ＴＮｘ作用の全ての段階：結合、転座お
よびＶＡＭＰ２切断の忠実な複製を有する細胞株を操作することが可能であることを示唆
する。操作された細胞株の１つのさらなる利点は家畜の免疫化（６）のために、またはＢ
型、Ｄ型、Ｆ型およびＧ型ボツリヌス神経毒素に基づくボツリヌス医薬の生産において使
用される、ボツリヌス毒素を試験するためのその潜在的な有用性である。注目すべきは、
破傷風軽鎖でトランスフェクトされたＬ６ＧＬＵＴ４ｍｙｃ筋芽細胞において、切断され
たＧＦＰ-ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３産物の出現が以前に観察されたことである（１２
）。
Ｃ、上）。次に、本発明者らは、ｍＣｈｅｒｒｙ標識破傷風軽鎖（ＶＡＭＰ２切断ドメイ
ン）をＳｉＭａ細胞にトランスフェクトした（図１Ｃ、右下）。トランスフェクションの
２日後、本発明者らは、破傷風発現細胞において、ＧＦＰ-ＶＡＭＰ２切断産物の細胞質
ゾルへの再分布を検出した（図１Ｃ、左下）。重要なことに、イムノブロッティングは安
定なＧＦＰ-ＶＡＭＰ２切断産物を明らかにし、ｉｎ ｖｉｔｒｏで破傷風作用を定量す
る可能性を開いた（図１Ｄ）。これらの結果は、ＴＮｘ作用の全ての段階：結合、転座お
よびＶＡＭＰ２切断の忠実な複製を有する細胞株を操作することが可能であることを示唆
する。操作された細胞株の１つのさらなる利点は家畜の免疫化（６）のために、またはＢ
型、Ｄ型、Ｆ型およびＧ型ボツリヌス神経毒素に基づくボツリヌス医薬の生産において使
用される、ボツリヌス毒素を試験するためのその潜在的な有用性である。注目すべきは、
破傷風軽鎖でトランスフェクトされたＬ６ＧＬＵＴ４ｍｙｃ筋芽細胞において、切断され
たＧＦＰ-ＶＡＭＰ２またはＶＡＭＰ３産物の出現が以前に観察されたことである（１２
）。
【0233】
【0234】
ウェスタンブロットは、ハイスループットスクリーニングまたは品質管理（ＱＣ）検証
には使用不可能である。放出されたＧＦＰ-ＶＡＭＰ２はアレルガン（１１）によって特
許された方法であるＢｏｔｏｘによる切断されたＳＮＡＰ２５の検出について説明された
ように、ＥＬＩＳＡサンドイッチイムノアッセイによって定量することができる。実際、
抗原上の異なる部位に結合する２つの抗体に基づくサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイはロ
バストで、感度が高く、検証に適している。サンドイッチＥＬＩＳＡについては、追加の
レポーター結合工程（１１）を必要とする増強された化学発光検出プラットフォームを使
用することができる。
には使用不可能である。放出されたＧＦＰ-ＶＡＭＰ２はアレルガン（１１）によって特
許された方法であるＢｏｔｏｘによる切断されたＳＮＡＰ２５の検出について説明された
ように、ＥＬＩＳＡサンドイッチイムノアッセイによって定量することができる。実際、
抗原上の異なる部位に結合する２つの抗体に基づくサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイはロ
バストで、感度が高く、検証に適している。サンドイッチＥＬＩＳＡについては、追加の
レポーター結合工程（１１）を必要とする増強された化学発光検出プラットフォームを使
用することができる。
【0235】
しかし、本発明者らはそれらがＧＦＰ分子をレポーター酵素で置換する場合、それらは
最終的な抗体検出工程を除去することによって、ＶＡＭＰ切断の検出を有意に加速し得る
と仮定した。本発明者らはＧＦＰ、ルシフェラーゼまたはペルオキシダーゼ酵素を担持す
るＶＡＭＰ２レポーターの特異的捕捉を可能にし、正確な破傷風対ボツリヌス検出を可能
にする、破傷風およびボツリヌス産生ＶＡＭＰ２断片を認識する抗体を設計した。一般に
、神経毒の適用は、ＶＡＭＰ２の切断およびレポーターＶＡＭＰ２産物の細胞サイトゾル
への放出を導く。これは、全長ＶＡＭＰ２抗体または切断ＶＡＭＰ２抗体を用いたウェス
タンイムノブロッティングによって確認することができる。固有の変動性を有するウェス
タンブロットは検証することが困難であるので、細胞ベースのアッセイのための容易な酵
素読み取りが、ＱＣ環境のために開発されなければならない。必要なＶＡＭＰ２-レポー
ターの１つの利点は、切断された産物の検出のための経済的なハイスループットアッセイ
の確立の可能性である。
最終的な抗体検出工程を除去することによって、ＶＡＭＰ切断の検出を有意に加速し得る
と仮定した。本発明者らはＧＦＰ、ルシフェラーゼまたはペルオキシダーゼ酵素を担持す
るＶＡＭＰ２レポーターの特異的捕捉を可能にし、正確な破傷風対ボツリヌス検出を可能
にする、破傷風およびボツリヌス産生ＶＡＭＰ２断片を認識する抗体を設計した。一般に
、神経毒の適用は、ＶＡＭＰ２の切断およびレポーターＶＡＭＰ２産物の細胞サイトゾル
への放出を導く。これは、全長ＶＡＭＰ２抗体または切断ＶＡＭＰ２抗体を用いたウェス
タンイムノブロッティングによって確認することができる。固有の変動性を有するウェス
タンブロットは検証することが困難であるので、細胞ベースのアッセイのための容易な酵
素読み取りが、ＱＣ環境のために開発されなければならない。必要なＶＡＭＰ２-レポー
ターの１つの利点は、切断された産物の検出のための経済的なハイスループットアッセイ
の確立の可能性である。
【0236】
破傷風およびＢ型ボツリヌス神経毒素によって切断されたＶＡＭＰ分子の捕捉のために
、本発明者らは、ＶＡＭＰ捕捉アッセイの開発に役立ち得るＶＡＭＰ２の破傷風切断末端
（ＱＡＧＡＳＱ76）を特異的に認識するカスタムメイドのＶＡＭＰ２抗体を使用し得る。
酵素に融合した切断されたＶＡＭＰ２の捕捉は、神経毒の検出を大幅に単純化する単一工
程での切断産物の量の定量を可能にするが、これは細胞環境において実証されていない。
ルシフェラーゼは、ルシフェリンの酸化を介して光の放出を触媒する生物発光酵素である
。一方、ペルオキシダーゼは、発色基質から蛍光、および発光までの様々な検出オプショ
ンを提供する。ルシフェラーゼおよびペルオキシダーゼの両方は生体分子イメージングお
よび生化学アッセイ系において非常に一般的となっており、最適化された形態の開発を促
す。本発明者らはＶＡＭＰ２とＮａｎｏＬｕｃ（最適化ルシフェラーゼ、Ｐｒｏｍｅｇａ
）およびＡＰＥＸ２（最適化ペルオキシダーゼ）との融合物を調製し、プラスミドをレト
ロウイルスベクターにパッケージングした。本発明者らは、ＳｉＭａ神経芽細胞腫細胞に
おけるこれらの新しいＶＡＭＰ２レポーターの安定な発現を観察した（図３）。興味深い
ことに、本発明者らはＡＰＥＸ２－ＶＡＭＰ２融合分子は破傷風またはボツリヌス神経毒
素によって切断され得ないが、Ｎｌｕｃ－ＶＡＭＰ２は予想される切断を示したことを見
出した（図４）。
、本発明者らは、ＶＡＭＰ捕捉アッセイの開発に役立ち得るＶＡＭＰ２の破傷風切断末端
（ＱＡＧＡＳＱ76）を特異的に認識するカスタムメイドのＶＡＭＰ２抗体を使用し得る。
酵素に融合した切断されたＶＡＭＰ２の捕捉は、神経毒の検出を大幅に単純化する単一工
程での切断産物の量の定量を可能にするが、これは細胞環境において実証されていない。
ルシフェラーゼは、ルシフェリンの酸化を介して光の放出を触媒する生物発光酵素である
。一方、ペルオキシダーゼは、発色基質から蛍光、および発光までの様々な検出オプショ
ンを提供する。ルシフェラーゼおよびペルオキシダーゼの両方は生体分子イメージングお
よび生化学アッセイ系において非常に一般的となっており、最適化された形態の開発を促
す。本発明者らはＶＡＭＰ２とＮａｎｏＬｕｃ（最適化ルシフェラーゼ、Ｐｒｏｍｅｇａ
）およびＡＰＥＸ２（最適化ペルオキシダーゼ）との融合物を調製し、プラスミドをレト
ロウイルスベクターにパッケージングした。本発明者らは、ＳｉＭａ神経芽細胞腫細胞に
おけるこれらの新しいＶＡＭＰ２レポーターの安定な発現を観察した（図３）。興味深い
ことに、本発明者らはＡＰＥＸ２－ＶＡＭＰ２融合分子は破傷風またはボツリヌス神経毒
素によって切断され得ないが、Ｎｌｕｃ－ＶＡＭＰ２は予想される切断を示したことを見
出した（図４）。
【0237】
本発明者らは、ＮａｎｏＬｕｃ－ＶＡＭＰ２を担持するＳｉＭａ神経芽細胞腫細胞のＢ
ｏＮＴ／Ｂおよび／Ｄに対する感度を、全長および切断されたＶＡＭＰ２抗体を使用する
イムノブロッティングによって定量した。図５は、ボツリヌス神経毒素の検出がタイプに
よって異なることを実証する。具体的には本発明者らがＢｏＮＴ／Ｂによる３００ピコモ
ルのＶＡＭＰの切断を検出することができたが、ＢｏＮＴ／Ｄに対するＳｉＭａ細胞の感
受性はナノモルの範囲であった。
ｏＮＴ／Ｂおよび／Ｄに対する感度を、全長および切断されたＶＡＭＰ２抗体を使用する
イムノブロッティングによって定量した。図５は、ボツリヌス神経毒素の検出がタイプに
よって異なることを実証する。具体的には本発明者らがＢｏＮＴ／Ｂによる３００ピコモ
ルのＶＡＭＰの切断を検出することができたが、ＢｏＮＴ／Ｄに対するＳｉＭａ細胞の感
受性はナノモルの範囲であった。
【0238】
次に、本発明者らは、ＢｏＮＴ／Ｂ切断末端（ＱＡＧＡＳＱ７６）を認識するＶＡＭＰ
２抗体でコーティングされた９６ウェルプレートを調製した。本発明者らは、Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ－１００処理ＳｉＭａ細胞抽出物を、ＮａｎｏＬｕｃ－ＶＡＭＰ２の捕捉のために
これらのプレートに適用した。捕捉されたレポーター酵素を、ＮａｎｏＧｌｏ試薬（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）を用いて定量した。図６は、図５に由来するＮａｎｏＬｕｃベースの検出方
法およびウェスタンイムノブロッティングの定量化の直接比較を示す。
２抗体でコーティングされた９６ウェルプレートを調製した。本発明者らは、Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ－１００処理ＳｉＭａ細胞抽出物を、ＮａｎｏＬｕｃ－ＶＡＭＰ２の捕捉のために
これらのプレートに適用した。捕捉されたレポーター酵素を、ＮａｎｏＧｌｏ試薬（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）を用いて定量した。図６は、図５に由来するＮａｎｏＬｕｃベースの検出方
法およびウェスタンイムノブロッティングの定量化の直接比較を示す。
【0239】
【0240】
この一連の作業により、（ｉ）細胞由来ボツリヌスおよび破傷風切断ＶＡＭＰ分子を捕
捉することが可能であること、および（ｉｉ）酵素との融合がＶＡＭＰ分子を安定化させ
るだけでなく、ＶＡＭＰ標的化ボツリヌスおよび破傷風神経毒素のハイスループットスク
リーニングのための高感度な読み出しも可能となることが示された。
捉することが可能であること、および（ｉｉ）酵素との融合がＶＡＭＰ分子を安定化させ
るだけでなく、ＶＡＭＰ標的化ボツリヌスおよび破傷風神経毒素のハイスループットスク
リーニングのための高感度な読み出しも可能となることが示された。
【0241】
現在、神経毒活性の検出のためにクロストリジウム感受性細胞クローンにＮａｎｏＬｕ
ｃ－ＶＡＭＰ２構築物を形質導入することが可能である。ＮａｎｏＬｕｃ－ＶＡＭＰ２構
築物は、世界中の破傷風産物の試験の基礎となる可能性を有する。破傷風ワクチンは必須
の世界医薬品のＷＨＯリスト上にあり、したがって、我々の細胞ベースのアッセイのため
の潜在的な市場規模は重要であり得る。２０１２年、ＷＨＯは、２０２０年までに破傷風
に対するグローバルな予防接種の適用範囲をもたらすことを目的としたグローバルワクチ
ン行動計画を立ち上げた。グラクソスミスクライン、サノフィパスツール、マスバイオロ
ジックスなどの主要なワクチン生産者は、開発途上国に安価で大量の普通ワクチンを提供
するために資金投入している。したがって、扱いにくい動物モデルを細胞ベースのアッセ
イに置き換えることは、英国政府の課題において高位である。破傷風トキソイドおよびボ
ツリヌスワクチンは、畜産で使用されているが、我々の細胞ベースのアッセイのための別
の潜在的な市場の代表例である。本発明者らのＶＡＭＰ２－ＮａｎｏＬｕｃは、ボツリヌ
スベースの治療薬の医薬製造にも利用することができる。
ｃ－ＶＡＭＰ２構築物を形質導入することが可能である。ＮａｎｏＬｕｃ－ＶＡＭＰ２構
築物は、世界中の破傷風産物の試験の基礎となる可能性を有する。破傷風ワクチンは必須
の世界医薬品のＷＨＯリスト上にあり、したがって、我々の細胞ベースのアッセイのため
の潜在的な市場規模は重要であり得る。２０１２年、ＷＨＯは、２０２０年までに破傷風
に対するグローバルな予防接種の適用範囲をもたらすことを目的としたグローバルワクチ
ン行動計画を立ち上げた。グラクソスミスクライン、サノフィパスツール、マスバイオロ
ジックスなどの主要なワクチン生産者は、開発途上国に安価で大量の普通ワクチンを提供
するために資金投入している。したがって、扱いにくい動物モデルを細胞ベースのアッセ
イに置き換えることは、英国政府の課題において高位である。破傷風トキソイドおよびボ
ツリヌスワクチンは、畜産で使用されているが、我々の細胞ベースのアッセイのための別
の潜在的な市場の代表例である。本発明者らのＶＡＭＰ２－ＮａｎｏＬｕｃは、ボツリヌ
スベースの治療薬の医薬製造にも利用することができる。
【0242】
【0243】
（材料及び方法）
（ウイルス形質導入）
ウイルスｐＱＣＸＩＰプラスミドは、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位にクローン化さ
れたＶＡＭＰ２融合配列を有する市販品（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で入手した。ＨＥＫ－２９
３細胞を、１０% FBSを含むＤＭＥＭ(Life Technologies)中で培養した。ウイルスのパッ
ケージングのために、ＨＥＫ－２９３細胞を１０ｃｍディッシュに播種し、７０～９０％
コンフルエントになるまで増殖させた。コンフルエントに達したら、細胞をＰＢＳで洗浄
し、培地を６ｍｌのＳｉＭａ細胞増殖培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）で置換した。次い
で、細胞を３７℃で２時間インキュベートした後、ウイルスプラスミドでトランスフェク
ションした。５．２５μｇのＶＡＭＰ２融合ｐＱＣＸＩＰプラスミド、２．６μｇのＶＳ
Ｖ－Ｇプラスミド（ウイルスエンベロープ）および２．６μｇのレトロウイルスＧａｇ－
Ｐｏｌプラスミド（グループ特異的抗原およびポリメラーゼ）を、４００μｌのＯｐｔｉ
ｍｅｍ(Life Technologies)中に希釈し、ボルテックスした。ポリエチレンイミン（Ｐｏ
ｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、４００μｌのＯｐｔｉｍｅｍ中で０．１３ｍｇ／ｍｌに希釈
し、これをＤＮＡと合わせ、続いて室温で２０分間インキュベートした。混合物を細胞に
滴下し、次いで３７℃で一晩放置した。さらに９ｍｌのＳｉＭａ増殖培地を細胞に添加し
、次いで、これを３２℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ＨＥＫ－２９３細
胞からの上清を回収し、６μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）と混合した後、０．４
５μｍのフィルターシリンジを通過させた。濾過培地３ｍｌを、６ウェルプレート中で５
０％コンフルエントに増殖させたＳｉＭａ細胞に添加し、続いて室温で２０分間インキュ
ベートした。プレートを室温で９０分間２５００ｒｐｍで遠心分離し、細胞を３７℃で２
４時間インキュベートした。培地を新鮮なＳｉＭａ増殖培地に交換し、細胞をさらに２４
時間またはコンフルエントに達するまで増殖させた。細胞を２５ｃｍ２フラスコで増殖さ
せ、１μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）で培養して、陽性形質導入細胞を選択
した。
（ウイルス形質導入）
ウイルスｐＱＣＸＩＰプラスミドは、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位にクローン化さ
れたＶＡＭＰ２融合配列を有する市販品（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で入手した。ＨＥＫ－２９
３細胞を、１０% FBSを含むＤＭＥＭ(Life Technologies)中で培養した。ウイルスのパッ
ケージングのために、ＨＥＫ－２９３細胞を１０ｃｍディッシュに播種し、７０～９０％
コンフルエントになるまで増殖させた。コンフルエントに達したら、細胞をＰＢＳで洗浄
し、培地を６ｍｌのＳｉＭａ細胞増殖培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）で置換した。次い
で、細胞を３７℃で２時間インキュベートした後、ウイルスプラスミドでトランスフェク
ションした。５．２５μｇのＶＡＭＰ２融合ｐＱＣＸＩＰプラスミド、２．６μｇのＶＳ
Ｖ－Ｇプラスミド（ウイルスエンベロープ）および２．６μｇのレトロウイルスＧａｇ－
Ｐｏｌプラスミド（グループ特異的抗原およびポリメラーゼ）を、４００μｌのＯｐｔｉ
ｍｅｍ(Life Technologies)中に希釈し、ボルテックスした。ポリエチレンイミン（Ｐｏ
ｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、４００μｌのＯｐｔｉｍｅｍ中で０．１３ｍｇ／ｍｌに希釈
し、これをＤＮＡと合わせ、続いて室温で２０分間インキュベートした。混合物を細胞に
滴下し、次いで３７℃で一晩放置した。さらに９ｍｌのＳｉＭａ増殖培地を細胞に添加し
、次いで、これを３２℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ＨＥＫ－２９３細
胞からの上清を回収し、６μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）と混合した後、０．４
５μｍのフィルターシリンジを通過させた。濾過培地３ｍｌを、６ウェルプレート中で５
０％コンフルエントに増殖させたＳｉＭａ細胞に添加し、続いて室温で２０分間インキュ
ベートした。プレートを室温で９０分間２５００ｒｐｍで遠心分離し、細胞を３７℃で２
４時間インキュベートした。培地を新鮮なＳｉＭａ増殖培地に交換し、細胞をさらに２４
時間またはコンフルエントに達するまで増殖させた。細胞を２５ｃｍ２フラスコで増殖さ
せ、１μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）で培養して、陽性形質導入細胞を選択
した。
【0244】
（ＮａｎｏＬｕｃアッセイ）
ＳｉＭａ細胞（ＤＳＭＺ）およびＨＥＫ‐２９３細胞（ＡＴＣＣ）を３７℃、５％ＣＯ
２で増殖させた。ＳｉＭａ細胞を、１０％ＦＢＳ(Life Technologies)を補充したＲＰＭ
Ｉ(Life Technologies)中で培養した。ＶＡＭＰ２切断の検出のために、ＳｉＭａ ＮＬ
ｕｃ－ＶＡＭＰ２細胞を４８ウェルプレートに播種し、以前に記載されたように分化させ
た（Ｒｕｓｔら、２０１６）。次いで、細胞を示された濃度の毒素で処理し、７２時間イ
ンキュベートした。毒素インキュベーション後、培地を除去し、ウェルをＰＢＳで１回洗
浄した。次いで、４０μｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００ベースの細胞抽出溶液（０．５％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および１×ＳｉｇｍａＦａｓｔプロテアーゼ阻害剤を含むＰＢ
Ｓ）を添加することによって、細胞を透過処理した。細胞を掻き取り、氷上のチューブに
移し、３～４分毎にボルテックスしながら２０分間インキュベートした。細胞抽出物を１
４０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を、アッセイが行われるまで－２０℃
で貯蔵するために新しいチューブに移した。プロテインＡ(Thermo-Fisher)でプレコート
した９６ウェルプレートを、約３μｇ／ｍｌの抗切断ＶＡＭＰ２抗体と共に４℃で一晩イ
ンキュベートした。ウェルを、０．０５% Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ－Ｔ）を含有するＰＢＳで
３回洗浄し、続いて１％ＢＳＡで１時間ブロッキングした。ウェルを再度ＰＢＳ－Ｔで３
回洗浄した後、細胞抽出物（３５μｌのＰＢＳ－Ｔを含む１５μｌの細胞抽出物）を加え
、２０℃で９０分間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔでさらに３回洗浄した後、Ｎａｎｏ
－Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）（５０μｌのＰＢＳ－Ｔ中２μｌ）をウェルに加え、プ
レートを室温で、暗所で５分間インキュベートした。発光は、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａ
ｓｃｅｎｔプレートリーダー(Labsystems)を用いて測定した。
ＳｉＭａ細胞（ＤＳＭＺ）およびＨＥＫ‐２９３細胞（ＡＴＣＣ）を３７℃、５％ＣＯ
２で増殖させた。ＳｉＭａ細胞を、１０％ＦＢＳ(Life Technologies)を補充したＲＰＭ
Ｉ(Life Technologies)中で培養した。ＶＡＭＰ２切断の検出のために、ＳｉＭａ ＮＬ
ｕｃ－ＶＡＭＰ２細胞を４８ウェルプレートに播種し、以前に記載されたように分化させ
た（Ｒｕｓｔら、２０１６）。次いで、細胞を示された濃度の毒素で処理し、７２時間イ
ンキュベートした。毒素インキュベーション後、培地を除去し、ウェルをＰＢＳで１回洗
浄した。次いで、４０μｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００ベースの細胞抽出溶液（０．５％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および１×ＳｉｇｍａＦａｓｔプロテアーゼ阻害剤を含むＰＢ
Ｓ）を添加することによって、細胞を透過処理した。細胞を掻き取り、氷上のチューブに
移し、３～４分毎にボルテックスしながら２０分間インキュベートした。細胞抽出物を１
４０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を、アッセイが行われるまで－２０℃
で貯蔵するために新しいチューブに移した。プロテインＡ(Thermo-Fisher)でプレコート
した９６ウェルプレートを、約３μｇ／ｍｌの抗切断ＶＡＭＰ２抗体と共に４℃で一晩イ
ンキュベートした。ウェルを、０．０５% Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ－Ｔ）を含有するＰＢＳで
３回洗浄し、続いて１％ＢＳＡで１時間ブロッキングした。ウェルを再度ＰＢＳ－Ｔで３
回洗浄した後、細胞抽出物（３５μｌのＰＢＳ－Ｔを含む１５μｌの細胞抽出物）を加え
、２０℃で９０分間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔでさらに３回洗浄した後、Ｎａｎｏ
－Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）（５０μｌのＰＢＳ－Ｔ中２μｌ）をウェルに加え、プ
レートを室温で、暗所で５分間インキュベートした。発光は、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａ
ｓｃｅｎｔプレートリーダー(Labsystems)を用いて測定した。
【0245】
ＨＡ－ＡＰＥＸ２－ＶＡＭＰ２およびＨＡ－ＮａｎｏＬｕｃ－ＶＡＭＰ２を合成し、Ｎ
ｏｔＩおよびＥｃｏｒＩを用いてレトロウイルス発現ベクターｐＱＣＸＩＰにクローニン
グした。
ｏｔＩおよびＥｃｏｒＩを用いてレトロウイルス発現ベクターｐＱＣＸＩＰにクローニン
グした。
【0246】
（参考文献）
1. Pellizzari R, Rossetto O, Schiavo G, Montecucco C. Tetanus and botulinum ne
urotoxins: mechanism of action and therapeutic uses. Philos Trans R Soc Lond B B
iol Sci. 354:259-68 (1999).
2. Council of Europe. Tetanus vaccine, monographs 0452/0697. European Pharmaco
poeia (7th and 8th ed., 2013-14).
3. Behrensdorf-Nicol HA, Weisser K, Kramer B. BINACLE assay for in vitro detec
tion of active tetanus neurotoxin in toxoids. ALTEX 32:137-42 (2015).
4. Sesardic T.Bioassays for evaluation of medical products derived from bacter
ial toxins.Curr Opin Microb.15:310 (2012).
5. Davletov, B., Bajohrs, M. and Binz, T. Beyond BOTOX: advantages and limitat
ions of individual botulinum neurotoxins Trends Neurosci 28, 446-552 (2005).
6. Report on botulism in cattle by Advisory committee on the microbiological saf
ety of food. http://acmsf.food.gov.uk/sites/default/files/mnt/drupal_data/source
s/files/multimedia/pdfs/botulismincattlereport1206.pdf
7. Hubbard K, Beske P, Lyman M, McNutt P. Functional Evaluation of Biological
Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Ne
urons. J Vis Exp. 96 (2015).
8. Jat PS, Noble MD, Ataliotis P, Tanaka Y, Yannoutsos N, et al. Direct deriva
tion of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.
PNAS USA 88: 5096-5100 (1991).
9. Doran C, Chetrit J, Holley MC, Grundy D, Nassar MA ‘Mouse DRG Cell Line wi
th Properties of Nociceptor’ PLoS One 10(6):e0128670 (2015).
10. Darios F, Niranjan D, Ferrari E, Zhang F, Soloviev M, Rummel A, Bigalke H,
Suckling J, Ushkaryov Y, Naumenko N, Shakirzyanova A, Giniatullin R, Maywood E,
Hastings M, Binz T, Davletov B. SNARE tagging allows stepwise assembly of a mul
timodular medicinal toxin. PNAS USA 107:18197-201 (2010).
11. Fernandez-Salas E, Wang J, Molina Y, Nelson JB, Jacky BP, Aoki KR. Botulin
um neurotoxin serotype A specific cell-based potency assay to replace the mouse
bioassay. PLoS One. 7:e49516 (2012).
12. Randhawa VK et al. VAMP2, but Not VAMP3/Cellubrevin, Mediates Insulin-depe
ndent Incorporation of GLUT4 into the Plasma Membrane of L6 Myoblasts. Mol Biol
Cell. 11(7): 2403-2417 (2000).
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-10-26
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書又は図面に記載の発明。