特開 2022-191367 ＶＥＧＦ－Ａ及びＡＮＧ２に結合する抗体及び使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022191367

(43)【公開日】2022-12-27

(54)【発明の名称】ＶＥＧＦ－Ａ及びＡＮＧ２に結合する抗体及び使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20221220BHJP

   C07K 16/24 20060101ALI20221220BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20221220BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20221220BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20221220BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20221220BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20221220BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20221220BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20221220BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/24

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/395 N

A61P43/00 111

A61P43/00 105

C12P21/08

【審査請求】有

【請求項の数】16

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022163264

(22)【出願日】2022-10-11

(62)【分割の表示】P 2022521292の分割

【原出願日】2021-09-02

(31)【優先権主張番号】20194610.0

(32)【優先日】2020-09-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】20209591.5

(32)【優先日】2020-11-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(71)【出願人】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】弁理士法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】ベックマン，ローラント

(72)【発明者】

【氏名】フェン，セバスティアン

(72)【発明者】

【氏名】ハルトマン，グイド

(72)【発明者】

【氏名】インホフ－ユング，ザビーネ

(72)【発明者】

【氏名】イェンセン，クリスチャン・ホボルト

(72)【発明者】

【氏名】モルケン，イェルク

(72)【発明者】

【氏名】モルホイ，ミヒャエル

(72)【発明者】

【氏名】シャンツ，クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】シュペック，ヤニナ

(72)【発明者】

【氏名】ウルマー，クリストフ

(72)【発明者】

【氏名】ヴァイザー，バルバラ

(57)【要約】      （修正有）

【課題】二重特異性Ｆａｂフラグメントの形態の抗ＶＥＧＦ－Ａ／抗ＡＮＧ２抗体及びその使用方法を提供する。
【解決手段】ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、可変軽鎖ドメイン（ＶＬドメイン）及び可変重鎖ドメイン（ＶＨドメイン）の１つの同族対内のＶＥＧＦ－Ａパラトープ及びＡＮＧ２パラトープを含み、ＶＥＧＦ－Ａパラトープが、抗体のＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｌ１及びＣＤＲ－Ｌ３由来のアミノ酸残基を含み、ＡＮＧ２パラトープが、抗体のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ２由来のアミノ酸残基を含む、抗体を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含む、抗体。

【請求項2】

ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９及びＹ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６及びＲ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメイン、並びに、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、及び（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２及びＹ３を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｌ４６及びＦ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｅ５７を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインを含み、前記ＶＨドメイン及び前記ＶＬドメインのナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従っている、抗体。

【請求項3】

（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、請求項１又は２に記載の抗体。

【請求項4】

（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインであって、Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９、Ｙ３０、Ｄ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｋ５７、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｇ６５、Ｒ６６、Ｒ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８、及びＦ９９のアミノ酸残基を含むＶＨドメイン；並びに、（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインであって、Ｉ２、Ｙ３、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｅ３２、Ｌ４６、Ｆ４９、Ｄ５０、Ｆ５３、Ｋ５４、Ｖ５５、Ｙ５６、Ｅ５７、Ｙ９１、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４、及びＰ９５のアミノ酸残基を含むＶＬドメインを含み、前記ＶＨドメイン及び前記ＶＬドメインのナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従っている、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項5】

（ａ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号２０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項6】

配列番号１９のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含む、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体。

【請求項7】

前記抗体の抗体Ｆａｂフラグメントが、（ｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１に結合し、（ｉｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＡＮＧ２に結合する、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項8】

１８０ｍｇ／ｍｌの前記抗体Ｆａｂフラグメントを含む２０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨｉｓＨＣｌ、ｐＨ６．０溶液が、実施例８に記載されるラテックス－ビーズＤＬＳ法を用いた動的光散乱によって検出して２０℃で２０ｃＰ未満の粘度を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項9】

前記抗体がＦａｂフラグメントである、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項10】

請求項１から９のいずれかに記載の抗体をコードする、単離された核酸。

【請求項11】

請求項１０に記載の核酸を含む、宿主細胞。

【請求項12】

ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体を産生する方法であって、前記抗体が産生されるように請求項１１に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。

【請求項13】

前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬製剤。

【請求項15】

請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体を含むポート送達装置。

【請求項16】

医薬として使用するための、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗ＶＥＧＦ－Ａ／抗ＡＮＧ２抗体及びその使用方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に結合する二重特異性抗体は以前に報告されており、加齢黄斑変性症などの眼血管疾患の治療のために示唆されている。ＶＥＧＦに特異的に結合するＦａｂ結合アーム及びＡＮＧ２に特異的に結合する第２のＦａｂ結合アームを含む完全長ＩｇＧ１抗体であるファリシマブ（ＩＮＮ）は、ＤＭＥ及びｎＡＭＤの処置について臨床第ＩＩＩ相試験で現在評価されている最も進歩した二重特異性治療薬である（Ｓｈａｒｍａ，Ａ．，Ｋｕｍａｒ，Ｎ．，Ｋｕｐｐｅｒｍａｎｎ，Ｂ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｅｙｅ ３４，８０２－８０４（２０２０））。

【0003】

眼血管疾患の処置のためのＶＥＧＦ及びＡＮＧ２を標的とするさらなる組み合わせ処置がここ数年で示唆されている（例えば、国際公開第２０１６／１２２９９６号、国際公開第２０１８／０３７０００号、国際公開第２０１９／２００００６号、米国特許出願公開第２０２０／０１０２３８１号明細書）。

【0004】

可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）の１つの対に２つのパラトープを含む多重特異性抗体は、国際公開第２００８／０２７２３６号；国際公開第２０１０／１０８１２７号及びＢｏｓｔｒｏｍ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３（２００９）１６１０－１６１４並びに国際公開第２０１２／１６３５２０号に記載されている。

【0005】

国際公開第２０１２／１６３５２０号は、一対のＶＨ及びＶＬドメインに２つのパラトープを含む二重特異性抗体を開示している（「ＤｕｔａＦａｂ」）。国際公開第２０１２／１６３５２０号の二重特異性抗体の各パラトープは、重鎖ＣＤＲ－Ｈ１及びＣＤＲ－Ｈ３並びに軽鎖ＣＤＲ－Ｌ２が第一パラトープに寄与し、軽鎖ＣＤＲ－Ｌ１及びＣＤＲ－Ｌ３並びに重鎖ＣＤＲ－Ｈ２が第二パラトープに寄与する、重鎖及び軽鎖ＣＤＲからのアミノ酸を含む。個々のパラトープを含む単一特異性抗体は、第１のパラトープ又は第２のパラトープのいずれかが多様化している異なるＦａｂライブラリーから独立して単離される。上記単一特異性抗体のアミノ酸配列が同定され、バイパラトピックＶＨ及びＶＬ対に融合される。ＶＥＧＦ及びＩＬ－６に特異的に結合する例示的なＦａｂフラグメントの一例は、国際公開第２０１２／１６３５２０号に開示されている。

【0006】

しかし、例えば、標準治療と比較して有効性を改善し、作用持続時間を改善し、ひいては硝子体内注射の頻度を減少させ、患者の投与負荷を少なくすることによって、ＶＥＧＦ及びＡＮＧ２に結合する改善された治療用抗体が必要とされている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、二重特異性抗ＶＥＧＦ－Ａ／抗ＡＮＧ２抗体及びその使用方法に関する。

【課題を解決するための手段】

【0008】

一態様において、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、可変軽鎖ドメイン（ＶＬドメイン）及び可変重鎖ドメイン（ＶＨドメイン）の１つの同族対内のＶＥＧＦ－Ａパラトープ及びＡＮＧ２パラトープを含み、ＶＥＧＦ－Ａパラトープが、抗体のＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｌ１及びＣＤＲ－Ｌ３由来のアミノ酸残基を含み、ＡＮＧ２パラトープが、抗体のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ２由来のアミノ酸残基を含む、抗体を提供する。

【0009】

一態様において、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、可変軽鎖ドメイン（ＶＬドメイン）及び可変重鎖ドメイン（ＶＨドメイン）の１つの同族対内にＶＥＧＦ－Ａパラトープ及びＡＮＧ２パラトープを含み、可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインの対がヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に同時に結合する抗体を提供する。

【0010】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、可変軽鎖ドメイン（ＶＬドメイン）及び可変重鎖ドメイン（ＶＨドメイン）の１つの同族対内のＶＥＧＦ－Ａパラトープ及びＡＮＧ２パラトープを含み、配列番号１９の可変重鎖ドメイン及び配列番号２０の可変軽鎖ドメインを有する抗体と同一のヒトＶＥＧＦ－Ａ上のエピトープ及び同一のヒトＡＮＧ２上のエピトープに結合する抗体を提供する。

【0011】

一態様において、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントが、（ｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１に結合し、（ｉｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＡＮＧ２に結合する抗体を提供する。

【0012】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントが、静的光散乱（ＳＬＳ）によって測定して、一実施形態では材料及び一般的方法のセクションの「熱安定性」に記載されているＳＬＳによって測定して、７０℃以上の凝集開始温度を示す抗体を提供する。

【0013】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントが、静的光散乱（ＳＬＳ）によって測定して、一実施形態では材料及び一般的方法のセクションの「熱安定性」に記載されているＳＬＳによって測定して、８０℃を超える融解温度を示す抗体を提供する。

【0014】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、１８０ｍｇ／ｍｌの抗体Ｆａｂフラグメントを含む２０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨｉｓＨＣｌ、ｐＨ ６．０溶液が、実施例８に記載されるラテックス－ビーズＤＬＳ法を用いた動的光散乱によって検出して２０℃で２０ｃＰ未満の粘度を有する抗体を提供する。

【0015】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含む抗体を提供する。

【0016】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、配列番号２１のアミノ酸配列、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９及びＹ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６及びＲ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメイン；並びに、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、及び（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２及びＹ３を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｌ４６及びＦ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｅ５７を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインであって、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従っている抗体を提供する。

【0017】

一態様において、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９、Ｙ３０、Ｄ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｋ５７、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｇ６５、Ｒ６６、Ｒ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８、及びＦ９９を含むＶＨドメイン、並びにアミノ酸残基Ｉ２、Ｙ３、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｅ３２、Ｌ４６、Ｆ４９、Ｄ５０、Ｆ５３、Ｋ５４、Ｖ５５、Ｙ５６、Ｅ５７、Ｙ９１、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４、及びＰ９５を含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングはＫａｂａｔナンバリングシステムに従っている、抗体を提供する。一実施形態において、抗体は、ＶＨドメイン中に以下のアミノ酸残基Ｄ３５ｃ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｋ５７、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｇ６５、Ｒ６６、及びＤ９５と、ＶＬドメイン中に以下のアミノ酸残基Ｉ２、Ｙ３、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｅ３２、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４、及びＰ９５とを含むＶＥＧＦ－Ａパラトープ；並びに、ＶＨドメイン中に以下のアミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９、Ｙ３０、Ｄ３５ｂ、Ｒ９４、Ｖ９６、Ｆ９８、及びＦ９９と、ＶＬドメイン中に以下のアミノ酸残基Ｅ３２、Ｌ４６、Ｆ４９、Ｄ５０、Ｆ５３、Ｋ５４、Ｖ５５、Ｙ５６、Ｅ５７、及びＹ９１とを含むＡＮＧ２パラトープを含む。

【0018】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む抗体を提供する。

【0019】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに、（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む抗体を提供する。

【0020】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに、（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでおりＨ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９、Ｙ３０、Ｒ６６及びＲ９４を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでおりＩ２、Ｙ３、Ｌ４６、Ｆ４９、及びＥ５７を含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングはＫａｂａｔナンバリングシステムに従っている抗体を提供する。

【0021】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９及びＹ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６及びＲ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメイン；並びに、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、及び（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２及びＹ３を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｌ４６及びＦ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｅ５７を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従っており、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む抗体を提供する。

【0022】

一態様において、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１９のアミノ酸配列を含んでおり該アミノ酸置換が配列番号１９の１、２、４～２５、２８、３５ｄ～５４、５９、６０、６７～９３、９７、１０１～１１３の１つ又は複数の位置にあるＶＨドメイン；及び（ｂ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号２０のアミノ酸配列を含んでおり該アミノ酸置換が配列番号２０の１、４～２６、２７ｂ～２７ｄ、３３～４５、４７、４８、５１、５２、５８～９０、９６～１０７の位置にある可変軽鎖ドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングはＫａｂａｔナンバリングシステムに従っている抗体を提供する。

【0023】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、並びにＶＬドメイン（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含んでおり、（ａ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号２０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを含む抗体を提供する。

【0024】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９及びＹ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６及びＲ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワーク；並びに、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、及び（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２及びＹ３を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｌ４６及びＦ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｅ５７を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従っており、（ａ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号２０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメイン含む抗体を提供する。

【0025】

一態様では、本発明は、配列番号１９のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含む、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体を提供する。

【0026】

一態様では、本発明は、配列番号２４の重鎖アミノ酸配列及び配列番号２５の軽鎖アミノ酸配列を含む、ヒトＶＥＧＦ－及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体を提供する。

【0027】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、並びに、（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含む抗体を提供し、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントは、（ｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１に結合し、（ｉｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＡＮＧ２に結合する。

【0028】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９及びＹ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６及びＲ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメイン；並びに、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、及び（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２及びＹ３を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｌ４６及びＦ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｅ５７を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従っている抗体を提供し、該抗体は、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントは、（ｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１に結合し、（ｉｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＡＮＧ２に結合する。

【0029】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、並びに、（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含む抗体を提供し、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントは、７０℃以上の凝集開始温度を示す。

【0030】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９及びＹ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６及びＲ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメイン；並びに、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、及び（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２及びＹ３を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｌ４６及びＦ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｅ５７を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従っている抗体を提供し、該抗体は、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントは、７０℃以上の凝集開始温度を示す、抗体。

【0031】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、並びに、（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含む抗体を提供し、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントは、動的光散乱によって測定して８０℃を超える融解温度を示す、抗体を提供する。

【0032】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９及びＹ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６及びＲ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメイン；並びに、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、及び（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２及びＹ３を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｌ４６及びＦ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｅ５７を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従っている抗体を提供し、該抗体は、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントは、動的光散乱法により測定して８０℃を超える融解温度を示す。

【0033】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、並びに、（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含む抗体を提供し、１８０ｍｇ／ｍｌの抗体Ｆａｂフラグメントを含む２０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨｉｓＨＣｌ，ｐＨ ６．０溶液は、実施例８に記載されるラテックス－ビーズＤＬＳ法を用いた動的光散乱によって検出して２０℃で２０ｃＰ未満の粘度を有する。

【0034】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９及びＹ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６及びＲ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメイン；並びに、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、及び（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２及びＹ３を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｌ４６及びＦ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｅ５７を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従っている抗体を提供し、該抗体は、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、１８０ｍｇ／ｍｌの抗体Ｆａｂフラグメントを含む２０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨｉｓＨＣｌ、ｐＨ６．０溶液は、実施例８に記載されるラテックス－ビーズＤＬＳ法を用いた動的光散乱によって検出して２０℃で２０ｃＰ未満の粘度を有する。

【0035】

本発明の一実施形態は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体フラグメントに関する。本発明の一実施形態は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する二重特異性抗体フラグメントに関する。一実施形態では、抗体フラグメントは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２又はそれに由来する単鎖抗体から選択される。本発明の一実施形態は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合するＦａｂフラグメントに関する。本発明の一実施形態は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合するＦｖフラグメントに関する。

【0036】

本発明の一実施形態は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する完全長ＩｇＧ抗体に関する。

【0037】

一態様では、本発明は、本発明の抗体をコードする単離された核酸を提供する。

【0038】

一態様では、本発明は、本発明の核酸を含む宿主細胞を提供する。一実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。一実施形態では、宿主細胞は大腸菌細胞である。

【0039】

一態様では、本発明は、本発明の核酸を含む発現ベクターを提供する。

【0040】

一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体を産生する方法であって、抗体が産生されるように本発明の宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。

【0041】

一態様では、本発明は、本発明の方法によって産生される抗体を提供する。

【0042】

一態様では、本発明は、本発明の抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬製剤を提供する。

【0043】

一態様では、本発明は、本発明の抗体及び薬学的に許容される担体を含むプレフィルド・シリンジを提供する。

【0044】

一態様では、本発明は、本発明の抗体及び薬学的に許容される担体を含む眼インプラントを提供する。一実施形態では、本発明は、本発明の抗体を含むポート送達装置を含む。

【0045】

本発明の一態様では、抗体又は医薬製剤は、ポート送達装置によって投与される。

【0046】

一態様では、本発明は、医薬として使用するための、一実施形態では血管疾患の処置に使用するための本発明の抗体を提供する。

【0047】

一態様では、本発明は、医薬、一実施形態では血管疾患を処置するための医薬の製造における本発明の抗体又は本発明の医薬組成物の使用を提供する。

【0048】

一態様では、本発明は、有効量の本発明の抗体又は本発明の医薬組成物を個体に投与することを含む、血管疾患を有する個体を処置する方法を提供する。

【0049】

一態様において、本発明は、個体における血管新生を阻害する方法であって、血管新生を阻害するために有効量の本発明の抗体又は本発明の医薬組成物を個体に投与することを含む方法を提供する。

【0050】

本発明によれば、抗体Ｆａｂフラグメントの形態で提供される場合であっても、その標的抗原に独立して結合することができる治療用の抗ＶＥＧＦ－Ａ／抗ＡＮＧ２抗体が提供される。本発明の抗体は、眼血管疾患の処置に適している。本発明の抗体は、低い有効用量を支持する両方の標的に対する高い親和性、及び長期間に有利な高い安定性のような、その治療適用を可能にするいくつかの有益な特性を提供する。非抗体アプローチと比較して、本発明の抗体は、その高いヒト性並びに人工のドメイン及びリンカーの欠如のために、許容され得る傾向がより高い。また、本発明の抗体は、眼への適用に適した粘度を有する高濃度液体製剤で提供されることが有利である。高濃度で提供可能であるため、より高い用量の治療薬を１回の処置で適用することができ、より長い処置サイクルを可能にするので、本発明の抗体による処置は患者にとってより許容され得る。さらに、治療のための二重特異性Ｆａｂフラグメントとして使用される場合、本発明の抗体は、二重特異性完全長ＩｇＧ抗体と比較して、用量あたりより多くの結合部位を可能にする。

【図面の簡単な説明】

【0051】

【図1】本発明の抗ＶＥＧＦ－Ａ／抗ＡＮＧ２抗体のＦａｂフラグメントの概略図。ＣＤＲアミノ酸の配置を含む同族ＶＨ／ＶＬ対の上面図が示されている（上の画像）。ＶＨドメインは灰色で示され、ＶＬドメインは白色で示される。さらに、ＣＤＲ領域の空間的配置が示されている。本発明の抗体のパラトープ領域が強調されており（下の画像）、ＶＥＧＦ－ＡパラトープがＨ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ１及びＬ－ＣＤＲ２の領域に配置され、ＡＮＧ２パラトープがＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ３及びＬ－ＣＤＲ２の領域に配置される。

【図2】本発明の例示的な抗ＶＥＧＦ－Ａ／抗ＡＮＧ２抗体のＶＨドメインのアミノ酸配列。アミノ酸位置のＫａｂａｔナンバリング、並びにＣＤＲ及びＦＲ領域が示されている。ＶＥＧＦ－Ａパラトープ及び実施例１３で同定されたＡＮＧ２パラトープに寄与するアミノ酸位置を強調している。

【図3】本発明の例示的な抗ＶＥＧＦ－Ａ／抗ＡＮＧ２抗体のＶＬドメインのアミノ酸配列。アミノ酸位置のＫａｂａｔナンバリング、並びにＣＤＲ及びＦＲ領域が示されている。ＶＥＧＦ－Ａパラトープ及び実施例１３で同定されたＡＮＧ２パラトープに寄与するアミノ酸位置を強調している。

【図4】実施例５に従ってＳＰＲによって評価された、ＶＥＧＦ－Ａ及びＡＮＧ２に対する二重特異性抗体Ｐ１ＡＤ９８２０の独立した抗原結合。

【図5】実施例１１で試験した、示された抗体のＶＥＧＦ－Ａ１２１及びＶＥＧＦ－Ａ１６５ブロッキング活性。

【図6】実施例１１で試験した、本発明の示された抗体及び先行技術の抗体類似体のＶＥＧＦ－Ａ１２１及びＶＥＧＦ－Ａ１６５ブロッキング活性。

【図7】実施例１０で試験した、本発明の示された抗体及び先行技術の抗体類似体のＶＥＧＦ－Ａ阻害の分析のためのレポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）。

【図8】実施例１０で試験した、本発明の示された抗体及び先行技術の抗体類似体のＡＮＧ２阻害の分析のためのｐＴｉｅ２アッセイ。

【図9】実施例１２で試験した、Ｐ１ＡＤ９８２０によって媒介されるＡＮＧ１阻害。

【図10】実施例８で試験した、大腸菌で産生されたＰ１ＡＡ０９０２（左上）及びＰ１ＡＤ９８２０（右上）Ｆａｂフラグメント並びにＣＨＯで産生されたＰ１ＡＤ９８２０（中央）のラテックス－ビーズＤＬＳ法で測定した粘度。

【発明を実施するための形態】

【0052】

１．定義
本明細書で特に定義されていない限り、本発明に関連して使用される科学的及び技術的な用語は、当技術分野の当業者に一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本開示の方法及び技術は、一般的に、当技術分野で周知の従来の方法に従って行われる。一般的に、本明細書中に記載されている生化学、酵素学、分子生物学、及び細胞生物学、微生物学、遺伝学、及びタンパク質及び核酸の化学、並びにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法並びに技術は、当技術分野でよく知られ、一般的に使用されているものである。

【0053】

本明細書で特に定義されていない限り、「含む」という用語は、「からなる）」という用語を含むものとする。

【0054】

特定の値（例えば、温度、濃度、時間など）に関連して本明細書で使用される「約」という用語は、「約」という用語が指す特定の値の＋／－１％の変動を指すものとする。

【0055】

本明細書において「抗体」という用語は、最も広い意味で使用されており、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）、及び抗体フラグメントを含む多様な抗体構造を包含するが、これらに限られない。

【0056】

「単離された」抗体とは、その自然環境の構成要素から分離されているものである。いくつかの実施形態では、抗体は、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点フォーカシング（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィ（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）の方法によって決定される９５％超又は９９％超の純度に精製される。抗体純度の評価のための方法の総説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。

【0057】

本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体が同一であり、及び／又は同一のエピトープと結合しているが、例えば、自然に生じる突然変異を含むか、又はモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる可能性のあるバリアント抗体を除いて、そのようなバリアントは、一般的に微量で存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、改変詞「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈すべきではない。

【0058】

「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書で、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、又は本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すように同義に使用される。

【0059】

抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメイン又は定常領域の型を指す。抗体には、次の５種類の主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかを、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に更に分けることができる。特定の実施形態では、抗体はＩｇＧ１アイソタイプである。特定の実施形態では、抗体は、Ｆｃ領域エフェクター機能を低下させるためのＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異を有するＩｇＧ１アイソタイプのものである。他の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプのものである。特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４抗体の安定性を改善するためにヒンジ領域にＳ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４アイソタイプのものである。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類の１つに割り当てられてもよい。

【0060】

用語「Ｆｃ領域」とは、本明細書では定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。該用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域とを含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載される、ＥＵインデックスとも呼ばれる、ＥＵナンバリングシステムに従う。

【0061】

「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体と抗原との結合に関与する、抗体の重鎖又は軽鎖のドメインである。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、概して、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ：ＦＲ）と、３つの超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ：ＨＶＲ）とを含む（例えば、Ｋｉｎｄｔ等のＫｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照されたい）。本発明の抗体において、ＶＨドメイン及びＶＬドメインの単一の対、すなわち同族ＶＨ／ＶＬ対は、その２つの標的：ＶＥＧＦ－Ａ及びＡＮＧ２に特異的に結合する。

【0062】

「ＤｕｔａＦａｂ」は、国際公開第２０１２／１６３５２０号に開示されている二重特異性抗体である。ＤｕｔａＦａｂでは、ＶＨドメインとＶＬドメインの単一の対が２つの異なるエピトープに特異的に結合し、一方のパラトープはＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｌ１及びＣＤＲ－Ｌ３由来のアミノ酸残基を含み、他方のパラトープはＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ２由来のアミノ残基を含む。ＤｕｔａＦａｂは、同族ＶＨ／ＶＬ対内に２つの重複しないパラトープを含み、２つの異なるエピトープに同時に結合し得る。ＤｕｔａＦａｂ及び単一特異性Ｆａｂフラグメントを含むライブラリーのスクリーニングによるそれらの作製方法は、国際公開第２０１２／１６３５２０号に開示されている。

【0063】

「ヒト抗体」とは、ヒト若しくはヒト細胞により産生された抗体、又はヒト抗体レパートリなどのヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト由来の抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体フラグメントは、本明細書ではヒト抗体又はヒト抗体フラグメントとみなされる。

【0064】

「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において、最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１）、第１－３巻におけるようなサブグループである。一実施形態では、ＶＬについては、サブグループは、Ｋａｂａｔら（上記参照）におけるサブグループカッパＩである。一実施形態では、ＶＨについては、サブグループは、Ｋａｂａｔら（上記参照）におけるサブグループＩＩＩである。

【0065】

「抗体フラグメント」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子である。抗体フラグメントの例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限られない。

【0066】

「パラトープ」又は「抗原結合部位」とは、抗原を認識して抗原に結合する抗体の一部分を指し、本明細書では互換可能に使用される。パラトープは、Ｆｖ領域の三次構造において空間的に近接して配置された、抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインからの複数の個別のアミノ酸残基によって形成される。本発明の抗体は、１つの同族ＶＨ／ＶＬ対に２つのパラトープを含む。

【0067】

本明細書で使用される場合、「ＶＥＧＦ－Ａパラトープ」は、ＶＥＧＦ－Ａに結合するパラトープ又は抗原結合部位である。本発明の抗体のＶＥＧＦ－Ａパラトープは、抗体のＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｌ１及びＣＤＲ－Ｌ３由来のアミノ酸残基を含む。

【0068】

本明細書で使用される場合、「ＡＮＧ２パラトープ」は、ＡＮＧ２に結合するパラトープ又は抗原結合部位である。本発明の抗体のＡＮＧ２パラトープは、抗体のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ２由来のアミノ酸残基を含む。

【0069】

本明細書で使用される「血管内皮成長因子」、略して「ＶＥＧＦ」という用語は、特に示さない限り、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物源からの任意の天然ＶＥＧＦを指す。この用語は、「完全長」の未処理のＶＥＧＦだけでなく、細胞内での処理に起因する任意の形態のＶＥＧＦをも包含する。この用語はまた、ＶＥＧＦの自然発生的なバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントをも包含する。例示的なヒトＶＥＧＦのアミノ酸配列は、配列番号２６に示されている。

【0070】

用語「抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体」及び「ＶＥＧＦ－Ａに結合する抗体」とは、抗体がＶＥＧＦ－Ａの標的化において診断剤及び／又は治療薬剤として有用であるような充分な親和性を有して、ＶＥＧＦ－Ａに結合可能である抗体を指す。一実施形態では、無関係な非ＶＥＧＦ－Ａタンパク質への抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体の結合の程度は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されたＶＥＧＦ－Ａへの抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａに結合する抗体は、解離定数（Ｋ_Ｄ）が１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、又は０．０１ｎＭ以下である。抗体が１μＭ以下のＫ_Ｄを有する場合、抗体はＶＥＧＦ－Ａに「特異的に結合」すると言われる。

【0071】

本明細書で使用される「アンジオポエチン－２」、略して「ＡＮＧ２」という用語は、特に示さない限り、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物源からの任意の天然ＡＮＧ２を指す。この用語は、「完全長」の未処理のＡＮＧ２だけでなく、細胞内での処理に起因する任意の形態のＡＮＧ２をも包含する。この用語はまた、ＡＮＧ２の自然発生的なバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントをも包含する。例示的なヒトＡＮＧ２のアミノ酸配列は、配列番号２７に示されている。

【0072】

用語「抗ＡＮＧ２抗体」及び「抗－ＡＮＧ２に結合する抗体」とは、抗体が抗－ＡＮＧ２の標的化において診断剤及び／又は治療薬剤として有用であるような充分な親和性を有して、抗－ＡＮＧ２に結合可能である抗体を指す。一実施形態では、無関係な非抗－ＡＮＧ２タンパク質への抗－抗－ＡＮＧ２抗体の結合の程度は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定された抗－ＡＮＧ２への抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、ＡＮＧ２に結合する抗体は、解離定数（Ｋ_Ｄ）が１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、又は０．０３ｎＭ以下である。抗体が１μＭ以下のＫ_Ｄを有する場合、抗体は抗－ＡＮＧ２に「特異的に結合」すると言われる。

【0073】

本発明の抗体は、「ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に同時に結合」し、これは、（ａ）ヒトＡＮＧ２に結合した本発明の抗体Ｆａｂフラグメントが（同様に）ヒトＶＥＧＦ－Ａに特異的に結合し、（ｂ）ヒトＶＥＧＦ－Ａに結合した本発明の抗体Ｆａｂフラグメントが（同様に）ヒトＡＮＧ２に特異的に結合することを意味する。同時に結合することは、当技術分野で公知の方法で、例えば本明細書に記載の表面プラズモン共鳴によって評価され得る。

【0074】

本明細書において使用する用語「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」は、配列が超可変で、抗原に接触する残基を含む、抗体の可変ドメインの各領域を指す。一般的に抗体は、６つのＣＤＲを含む：ＶＨドメインに３つ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、ＶＬドメインに３つ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）。特に断りのない限り、本明細書では、ＣＤＲ残基及び可変ドメインの他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って付番されている（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１）。

【0075】

本明細書で使用する「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメインのアミノ酸残基を指す。可変ドメインのフレームワークは一般的に、４つのフレームワークドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からなる。したがって、ＣＤＲ及びＦＲアミノ酸配列は、一般に、以下の順番で現れる。（ａ）ＶＨドメイン中：ＦＲ１－ＣＤＲ－Ｈ１－ＦＲ２－ＣＤＲ－Ｈ２－ＦＲ３－ＣＤＲ－Ｈ３－ＦＲ４；及び（ｂ）ＶＬドメイン中：ＦＲ１－ＣＤＲ－Ｌ１－ＦＲ２－ＣＤＲ－Ｌ２－ＦＲ３－ＣＤＲ－Ｌ３－ＦＲ４。

【0076】

Ｋａｂａｔナンバリングシステムによれば、本明細書で使用される場合、フレームワーク及びＣＤＲ領域は、可変ドメインの以下の領域に位置する。

【表1】

【0077】

本明細書で言及されるＫａｂａｔナンバリングシステムによるアミノ酸位置は、本発明の抗体のアミノ酸配列と並べて図２及び図３に示されている。アミノ酸配列内のある特定の位置のアミノ酸への言及は、それぞれのアミノ酸及びアミノ酸位置を述べることによって当技術分野で周知のように本明細書でなされ、例えば、「Ｅ２」は、それぞれの抗体ドメインのアミノ酸配列のＫａｂａｔ位置２に位置するグルタミン酸残基を指す。

【0078】

「親和性」は、分子（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との単一の結合部位の間の非共有性相互作用の合計の強度を指す。別途示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（Ｋ_Ｄ）によって表し得る。親和性は、本明細書に記載するものを含め、当技術分野で一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な説明的、例示的な実施形態は、本明細書に記載されている。

【0079】

「エピトープ」との用語は、抗体が結合する相手である、タンパク質性又は非タンパク質性のいずれかの、抗原上の部位を示す。エピトープは、連続したアミノ酸ストレッチ部位から形成される場合（線状エピトープ）、又は非連続のアミノ酸を含む場合（構造的エピトープ）の両方があり、例えば、抗原の折り畳みに起因して（すなわち、タンパク質性抗原の三次折り畳みによって）空間的に近接して形成される。線状エピトープは、典型的には、タンパク質性抗原を変性剤に曝露した後も依然として抗体によって結合されているが、コンフォメーションエピトープは、典型的には、変性剤での処理により破壊される。エピトープは、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、又は８～１０個のアミノ酸を、独特な空間的構造で含む。

【0080】

特定のエピトープに結合する抗体（すなわち、同じエピトープに結合する抗体）のスクリーニングは、例えば、限定されないが、アラニンスキャニング、ペプチドブロット（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８（２００４）４４３－４６３）、ペプチド切断分析、エピトープ切除、エピトープ抽出、抗原の化学的修飾（Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．９（２０００）４８７－４９６を参照）、及びクロスブロッキング（「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．，ＮＹを参照）などの、当該技術分野で慣用の方法を用いて行われ得る。

【0081】

抗原構造系抗体プロファイリング（Ａｎｔｉｇｅｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：ＡＳＡＰ）は、変性促進型プロファイリング（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：ＭＡＰ）としても知られ、ＶＥＧＦ－Ａ又はＡＮＧ２に特異的に結合する多数のモノクローナル抗体を、化学的又は酵素的に修飾された抗原表面に対する多数の抗体のそれぞれの結合プロファイルに基づいて区分けすることができる（例えばＵＳ ２００４／０１０１９２０参照）。区分けされた各抗体は同じエピトープに結合するが、このエピトープは、他の区分けで表されるエピトープとは明確に異なることがあるか、又は部分的に重なっている独特なエピトープであり得る。

【0082】

また、競合結合は、抗体が本発明の参照抗体と同じＶＥＧＦ－Ａ又はＡＮＧ２のエピトープに結合するか、又は結合について競合するかを容易に決定するために使用することができる。たとえば、参照抗体と「同じＶＥＧＦ－Ａ及びＡＮＧ２上のエピトープに結合する抗原」は、それぞれの競合アッセイにおいて、参照抗体のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする抗体を指し、逆に、参照抗体は、それぞれの競合アッセイにおいて、抗体のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする。また例えば、抗体が参照抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体を飽和状態でＶＥＧＦ－Ａ又はＡＮＧ２に結合させることができる。過剰な参照抗体を除去した後、問題の抗体がＶＥＧＦ－Ａ又はＡＮＧ２に結合する能力が評価される。問題の抗体が参照抗体の飽和結合後にＶＥＧＦ－Ａ又はＡＮＧ２に結合できる場合、対象の抗体は、参照抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。しかし、問題の抗体が参照抗体の飽和結合後にＶＥＧＦ－Ａ又はＡＮＧ２に結合できない場合、対象の抗体は、参照抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する可能性がある。問題の抗体が同じエピトープに結合しているのか、又は立体的な理由で結合が妨害されているだけなのかを確認するためには、慣用的な実験を用いることができる（例えばペプチド変異や、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、又は当技術分野で利用可能なその他の定量的又は定性的な抗体結合アッセイを用いた結合分析など）。このアッセイは、２つのセットアップ、すなわち、両方の抗体が飽和抗体である状態で実施されるべきである。両方の設定において、第１の（飽和）抗体のみがＶＥＧＦ－Ａ又はＡＮＧ２に結合できる場合、問題の抗体と参照抗体は、ＶＥＧＦ－Ａ又はＡＮＧ２への結合をめぐって競合すると結論付けることができる。

【0083】

いくつかの実施形態では、競合結合アッセイで測定して、一方の抗体の１、５、１０、２０又は１００倍過剰が他方の結合を少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、さらには９９％以上阻害する場合、２つの抗体は同じ又は重複するエピトープに結合すると見なされる。（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０（１９９０）１４９５－１５０２を参照）。

【0084】

いくつかの実施形態では、一方の抗体の結合を低下又は排除する抗原のアミノ酸変異のうち、実質的にすべてのアミノ酸変異が他方の抗体の結合も低下又は排除する場合、２つの抗体は同じエピトープに結合するとみなされる。２つの抗体は、一方の抗体の結合を減少又は排除するアミノ酸変異のサブセットのみが、他方の抗体の結合を減少又は排除する場合、「重複エピトープ」を有するとみなされる。

【0085】

参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列の同一性率（％）」は、アラインメントの目的で、配列をアラインメントし、最大の配列同一性率を達成するために、必要ならばギャップを導入した後、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合であると定義される。アミノ酸配列同一性率を決定するためのアラインメントは、当該技術分野の技術の範囲内にある種々の様式で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージを用いて達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。あるいは、同一性率の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成することができる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成されており、ソースコードは、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）のユーザドキュメンテーションにファイルされており、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＴＸＵ５１００８７の下に登録されており、かつ、国際公開第２０００／００５３１９号に記載されている。

【0086】

しかしながら、別段の指定がない限り、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性％の値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃのｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを使用するか、又はその後にＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスを用いて生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」ＰＮＡＳ ８５：２４４４－２４４８；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９６）「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７－２５８；及び、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６：２４－３６により記載されており、ｗｗｗ．ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌ ｏｒ ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｓｓ／ｆａｓｔａから公に利用可能である。あるいは、ｇｇｓｅａｒｃｈ（グローバルタンパク質：タンパク質）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；ｏｐｅｎ：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を使用して、ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公共サーバを使用して配列を比較し、ローカルではなくグローバルなアライメントを確実に実行することができる。アミノ酸同一性率は、アウトプットアラインメントヘッダーで与えられる。

【0087】

「免疫コンジュゲート」は、１つ以上の異種分子にコンジュゲートされている抗体であり、限定されないが、細胞傷害剤を含む。

【0088】

「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基で構成され、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボース又はリボース）、及びリン酸基で構成される。多くは、核酸分子は、塩基配列によって記述され、ここで、当該塩基は、核酸分子の一次構造（線形構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’から３’へと表される。本明細書において、核酸分子という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線形又は環状であってもよい。これに加え、核酸分子という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖、並びに一本鎖形態及び二本鎖形態の両方を含む。さらに、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含むことができる。天然に存在しないヌクレオチドの例としては、誘導体化された糖若しくはリン酸骨格結合を有する修飾ヌクレオチド塩基又は化学的に修飾された残基が挙げられる。核酸分子は、例えば、宿主又は患者において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして適したＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子も包含する。そのようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、修飾されていなくてもよく、又は修飾されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、インビボで抗体を産生するために対象にｍＲＮＡを注入することができるように、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を高めるように化学修飾されてもよい（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｒｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１７、２０１７年６月１２日にオンラインで公開、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６又は欧州特許第２１０１８２３Ｂ１号明細書を参照）。

【0089】

「単離された」核酸とは、自然環境の構成要素から切り離されている核酸分子のことである。単離された核酸には、通常核酸分子を含む細胞内に含まれる核酸分子が含まれるが、核酸分子は、染色体外、又は天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

【0090】

抗体を「コードする単離された核酸」とは、抗体の重鎖及び軽鎖（又はそのフラグメント）をコードする１つ又は複数の核酸分子を指し、そのような核酸分子を単一のベクター又は別個のベクターに含み、そのような核酸分子が宿主細胞の１つ又は複数の位置に存在する。

【0091】

「ベクター」という用語は、本明細書では、連結している別の核酸を増殖可能な核酸分子を指す。この用語には、自己複製する核酸構造としてのベクターだけでなく、ベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターも含まれる。特定のベクターは、作動可能に連結された核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターを本明細書では、「発現ベクター」と呼ぶ。

【0092】

「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養」という用語は、互換可能に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫も含まれる。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらは、継代数によらず、一次形質転換細胞及びそれに由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と完全に同一の核酸含量でない場合があるが、突然変異を含んでもよい。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか若しくは選択されるのと同じ機能、又は生物活性を有する突然変異型の後代が本発明に含まれる。

【0093】

「医薬組成物」又は「医薬製剤」という用語は、調製物に含まれる有効成分の生物活性が有効になるような形態をしており、かつ、医薬組成物が投与されるであろう対象に対して容認できないほど毒性のある追加の成分を含まない、調製物を指す。

【0094】

「医薬的に許容される担体」は、有効成分以外の医薬組成物又は製剤中の成分であって、対象にとって非毒性である成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。

【0095】

薬剤、例えば、医薬組成物の「有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するために必要な投薬量及び所要期間で有効な量を指す。

【0096】

「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えば、サル）、ウサギ及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、個体又は対象は、ヒトである。

【0097】

本明細書で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びその文法的な変化形、例えば、「処置（ｔｒｅａｔ）する」又は「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」）は、処置される個体において疾患の本来の経過を変える試行における臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。処置の所望の効果としては、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行率を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び回復又は改良された予後が挙げられる。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるため、又は疾患の進行を遅延させるために使用される。

【0098】

本明細書で使用される「眼疾患」という用語は、病理学的血管新生及び／又は萎縮に関連する任意の眼疾患を含む。眼疾患は、網膜又は角膜などの眼組織の構造内への新生血管の増殖及び／又は浸潤の変化又は非調節によって特徴付けることができる。眼疾患は、網膜組織（光受容体並びにその下の網膜色素上皮（ＲＰＥ）及び脈絡毛細管板）の萎縮によって特徴付けることができる。非限定的な眼疾患には、例えば、ＡＭＤ（例えば、滲出型ＡＭＤ、乾燥型ＡＭＤ、中間型ＡＭＤ、進行型ＡＭＤ、及び地図状萎縮（ＧＡ））、黄斑変性、黄斑浮腫、ＤＭＥ（例えば、焦点、非中心ＤＭＥ、及び、びまん性、中心関与ＤＭＥ）、網膜症、糖尿病性網膜症（ＤＲ）（例えば、増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、及び高所ＤＲ）、他の虚血関連網膜症、ＲＯＰ、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）（例えば、中心（ＣＲＶＯ）及び分岐（ＢＲＶＯ）形態）、ＣＮＶ（例えば、近視性ＣＮＶ）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連する疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連する疾患、中心性漿液性網膜症（ＣＳＲ）、病的近視、フォンヒッペル・リンダウ病、眼のヒストプラズマ症、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノーリー病、骨粗鬆症性偽神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）に関連する網膜異常、結膜下出血、ルベオーシス、眼血管新生疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧性網膜症、網膜血管腫状増殖、黄斑血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性、類嚢胞黄斑浮腫（ＣＭＥ）、血管炎、乳頭浮腫、限定されないが以下を含む網膜炎：ＣＭＶ網膜炎、眼黒色腫、網膜芽細胞腫、結膜炎（例えば、感染性結膜炎及び非感染性（例えば、アレルギー性）結膜炎）、レーバー先天性黒丸症（レーバー先天性黒丸症又はＬＣＡとしても知られる）、ブドウ膜炎（感染性及び非感染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎（例えば、多巣性脈絡膜炎）、眼ヒストプラズマ症、眼瞼炎、ドライアイ、外傷性眼損傷、シェーグレン病、並びに、疾患又は疾患が眼血管新生、血管漏出、及び／又は網膜浮腫若しくは網膜萎縮に関連する他の眼疾患を含む。さらなる例示的な眼疾患には、網膜分離症（網膜神経感覚層の異常な分裂）、ルベオーシス（隅角の血管新生）に関連する疾患、及び線維血管組織又は線維組織の異常な増殖によって引き起こされる疾患（増殖性硝子体網膜症のすべての形態を含む）が含まれる。角膜血管新生に関連する例示的な疾患には、限定するものではないが、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズオーバーウェア、アトピー性角膜炎、上輪部角膜炎、翼状片、乾性角膜炎、シェーグレン症候群、酒さ性ざ瘡（ａｃｎｅ ｒｏｓａｃｅａ）、フリクテン症（ｐｈｙｌｅｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ）、梅毒、マイクバクテリア感染症、脂肪変性症、化学的火傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染症、帯状疱疹感染症、原虫感染症、カポシ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン周辺角膜変性、周辺角質溶解、リウマチ性関節炎、全身性紅斑、多発性動脈炎、外傷、ウェゲナーサルコイドーシス、強膜炎、スティーブンジョンソン症候群、類天疱瘡、角膜放射状切開、及び角膜移植後拒絶反応が含まれる。血管漏出の増加、動脈瘤及び毛細血管脱落を含む、脈絡膜新生血管形成及び網膜血管系の欠陥に関連する例示的な疾患には、糖尿病性網膜症、黄斑変性、鎌状赤血球貧血、サルコイド、梅毒、弾性線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頸動脈閉塞性疾患、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎、マイコバクテリア感染症、ライム病、全身性エリテマトーデス、未熟児網膜症、網膜浮腫（黄斑浮腫を含む）、イールズ病、ベーチェット病、網膜炎又は脈絡膜炎を引き起こす感染症（例えば、多焦点脈絡膜）、推定眼ヒストプラズマ症、ベスト病（硝子体黄斑変性）、近視、視神経乳頭、扁平部炎、網膜剥離（例えば、慢性網膜剥離）、過粘度症候群、トキソプラスマ症、外傷及びレーザー後合併症が含まれるが、これらに限定されない。網膜組織の萎縮に関連する例示的な疾患（光受容体及びその下のＲＰＥ）には、萎縮性又は非滲出性ＡＭＤ（例えば、地図状萎縮又は進行性乾燥型ＡＭＤ）、黄斑萎縮（例えば、新生血管形成及び／又は地図状萎縮に関連する萎縮）、糖尿病性網膜症、シュタルガルト病、Ｓｏｒｓｂｙ Ｆｕｎｄｕｓジストロフィー、網膜分離症及び網膜色素変性症が含まれるが、これらに限定されない。

【0099】

「パッケージ添付文書」との用語は、治療製品の市販パッケージに通常含まれる指示を指すために用いられ、このような治療製品に関する適応症、使用、投薬量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告に関する情報を含む。

【0100】

２．本発明の実施形態の詳細な記載
一態様において、本発明は、部分的には、治療適用のための二重特異性抗体の提供に基づく。ある特定の態様では、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、例えば、血管疾患、例えば眼血管疾患の診断又は処置に有用である。

【0101】

Ａ．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する例示的抗体
一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体を提供する。一態様では、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する単離された抗体が提供される。一態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体を提供する。

【0102】

ある特定の態様では、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、ＶＬドメイン及びＶＨドメインの１つの同族対内にＶＥＧＦ－Ａパラトープ（すなわち、ＶＥＧＦ－Ａに結合する抗原結合部位）及びＡＮＧ２パラトープ（すなわち、ＡＮＧ２に結合する抗原結合部位）を含み、
ＶＥＧＦ－Ａパラトープは、抗体のＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｌ１及びＣＤＲ－Ｌ３由来のアミノ酸残基を含み、ＡＮＧ２パラトープは、抗体のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ２由来のアミノ酸残基を含む；及び／又は
可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインとの対は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に同時に結合する；及び／又は
配列番号１９の可変重鎖ドメイン及び配列番号２０の可変軽鎖ドメインを有する抗体と同一のヒトＶＥＧＦ－Ａ上のエピトープ及び同一のヒトＡＮＧ２上のエピトープに結合する；及び／又は
抗体の抗体Ｆａｂフラグメントが、（ｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１に結合し、（ｉｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＡＮＧ２に結合する；及び／又は
抗体の抗体Ｆａｂフラグメントが、７０℃以上の凝集開始温度を示す；及び／又は
抗体の抗体Ｆａｂフラグメントが、動的光散乱法により測定して８０℃を超える融解温度を示す；及び／又は
１８０ｍｇ／ｍｌの抗体Ｆａｂフラグメントを含む２０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨｉｓＨＣｌ、ｐＨ ６．０溶液が、実施例８に記載されるラテックス－ビーズＤＬＳ法を用いた動的光散乱によって検出して２０℃で２０ｃＰ未満の粘度を有する、抗体が提供される。

【0103】

別の態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、並びに（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含む、抗体を提供する。

【0104】

別の態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９及びＹ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６及びＲ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワーク；並びに、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、及び（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２及びＹ３を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｌ４６及びＦ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｅ５７を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従っている、抗体を提供する。

【0105】

別の態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９、Ｙ３０、Ｄ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｋ５７、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｇ６５、Ｒ６６、Ｒ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８、及びＦ９９を含むＶＨドメイン、並びにアミノ酸残基Ｉ２、Ｙ３、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｅ３２、Ｌ４６、Ｆ４９、Ｄ５０、Ｆ５３、Ｋ５４、Ｖ５５、Ｙ５６、Ｅ５７、Ｙ９１、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４、及びＰ９５を含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングはＫａｂａｔナンバリングシステムに従っている、抗体を提供する。一実施形態において、抗体は、ＶＨドメイン中に以下のアミノ酸残基Ｄ３５ｃ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｋ５７、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｇ６５、Ｒ６６、及びＤ９５と、ＶＬドメイン中に以下のアミノ酸残基Ｉ２、Ｙ３、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｅ３２、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４、及びＰ９５とを含むＶＥＧＦ－Ａパラトープ；並びに、ＶＨドメイン中に以下のアミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９、Ｙ３０、Ｄ３５ｂ、Ｒ９４、Ｖ９６、Ｆ９８、及びＦ９９と、ＶＬドメイン中に以下のアミノ酸残基Ｅ３２、Ｌ４６、Ｆ４９、Ｄ５０、Ｆ５３、Ｋ５４、Ｖ５５、Ｙ５６、Ｅ５７、及びＹ９１とを含むＡＮＧ２パラトープを含む。

【0106】

別の態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む抗体を提供する。

【0107】

別の態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインであって、Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９、Ｙ３０、Ｄ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｋ５７、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｇ６５、Ｒ６６、Ｒ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８、及びＦ９９のアミノ酸残基を含むＶＨドメイン；並びに、（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインであって、Ｉ２、Ｙ３、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｅ３２、Ｌ４６、Ｆ４９、Ｄ５０、Ｆ５３、Ｋ５４、Ｖ５５、Ｙ５６、Ｅ５７、Ｙ９１、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４、及びＰ９５のアミノ酸残基を含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従っている、抗体を提供する。

【0108】

別の態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに、（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む抗体を提供する。

【0109】

別の態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに、（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでおりＨ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９、Ｙ３０、Ｒ６６及びＲ９４を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでおりＩ２、Ｙ３、Ｌ４６、Ｆ４９、及びＥ５７を含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングはＫａｂａｔナンバリングシステムに従っている抗体を提供する。

【0110】

別の態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９及びＹ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６及びＲ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメイン；並びに、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、及び（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２及びＹ３を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｌ４６及びＦ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｅ５７を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従っており、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む抗体を提供する。

【0111】

別の態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）１個～１５個、１個～１０個又は１個～５個のアミノ酸置換を有する配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）１個～１５個、１個～１０個又は１個～５個のアミノ酸置換を有する配列番号２０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを含む抗体を提供する。

【0112】

別の態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）１個～１５個、１個～１０個又は１個～５個のアミノ酸置換を有する配列番号１９のアミノ酸配列を含んでおり該アミノ酸置換が配列番号１９の１、２、４～２５、２８、３５ｄ～５４、５９、６０、６７～９３、９７、１０１～１１３の１つ又は複数の位置にあるＶＨドメイン；及び（ｂ）１個～１５個、１個～１０個又は１個～５個のアミノ酸置換を有する配列番号２０のアミノ酸配列を含んでおり該アミノ酸置換が配列番号２０の１、４～２６、２７ｂ～２７ｄ、３３～４５、４７、４８、５１、５２、５８～９０、９６～１０７の位置にある可変軽鎖ドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングはＫａｂａｔナンバリングシステムに従っている抗体を提供する。

【0113】

別の態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに、（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含んでおり、（ａ）１個～１５個、１個～１０個又は１個～５個のアミノ酸置換を有する配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）１個～１５個、１個～１０個又は１個～５個のアミノ酸置換を有する配列番号２０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを含む抗体を提供する。

【0114】

別の態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９及びＹ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６及びＲ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメイン；並びに、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、及び（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２及びＹ３を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｌ４６及びＦ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｅ５７を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従っており、（ａ）１個～１５個、１個～１０個又は１個～５個のアミノ酸置換を有する配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）１個～１５個、１個～１０個又は１個～５個のアミノ酸置換を有する配列番号２０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメイン含む抗体を提供する。

【0115】

一態様では、本発明は、配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するＶＨドメインを含むヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体を提供する。ある特定の態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、その配列を含むヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する能力を保持する。ある特定の態様では、配列番号１９において合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。特定の態様では、ＶＨは、ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む。

【0116】

一態様では、本発明は、配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するＶＬドメインを含むヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体を提供する。ある特定の態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含むが、その配列を含むヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する能力を保持する。ある特定の態様では、配列番号２０において合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されている。ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。特定の態様では、ＶＬは、（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む。

【0117】

別の態様では、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、上に提供される態様のいずれかのＶＨ配列及び上に提供される態様のいずれかＶＬ配列を含む抗体が提供される。一態様では、抗体は、それぞれ配列番号１９及び配列番号２０のＶＨ及びＶＬ配列を含み、これらの配列の翻訳後修飾を含む。

【0118】

別の態様では、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、配列番号２４の重鎖アミノ酸配列及び配列番号２５の軽鎖アミノ酸配列を含む抗体が提供される。

【0119】

別の態様では、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、配列番号１７の重鎖アミノ酸配列及び配列番号１８の軽鎖アミノ酸配列を含む抗体が提供される。

【0120】

本発明のさらなる態様では、上記態様のいずれかによるヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体はモノクローナル抗体である。一態様では、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体は、抗体フラグメント、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）_２フラグメントである。別の態様では、抗体は、完全長抗体である。

【0121】

さらなる態様では、上記態様のいずれかによるヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体は、以下のセクション１～５に記載されるように、任意の特徴を単独で又は組み合わせて組み込むことができる。

【0122】

１．抗体親和性
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ又は≦０．０１ｎＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）でＶＥＧＦ－Ａに結合する。好ましい実施形態では、本明細書に提供される抗体は、≦１０ｐＭ、好ましい実施形態では≦５ｐＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）でヒトＶＥＧＦ－Ａに結合する。好ましい実施形態では、本明細書に提供される抗体は、≦１０ｐＭ、好ましい実施形態では≦５ｐＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）でヒトＶＥＧＦＡ－１２１に結合する。好ましい実施形態では、本明細書に提供される抗体は、≦１０ｐＭ、好ましい実施形態では≦５ｐＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）でヒトＶＥＧＦＡ－１６５に結合する。

【0123】

特定の実施形態では、ＡＮＧ２に結合する抗体は、解離定数（Ｋ_Ｄ）が１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、又は０．０３ｎＭ以下である。好ましい実施形態では、本明細書に提供される抗体は、≦１０ｐＭ、好ましい実施形態では≦５ｐＭの解離定数（Ｋ_Ｄ）でヒトＡＮＧ２に結合する。

【0124】

一態様では、Ｋ_Ｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。

【0125】

別の態様では、Ｋ_Ｄは、ＫｉｎＥｘＡアッセイを使用して測定される。一実施形態では、Ｋ_Ｄは、ＶＥＧＦ－Ａ結合のＫ_Ｄの検出又はＡＮＧ２結合のＫ_Ｄの検出に関する材料及び一般的方法のセクションにおいて下記に記載されるような条件下で、ＫｉｎＥｘＡアッセイを使用して測定される。

【0126】

例えば、ＶＥＧＦ－Ａに結合する抗体のＫ_Ｄを、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）製のＫｉｎＥｘＡ ３２００機器を使用するアッセイで測定し、１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の３０μｇの抗ＶＥＧＦ抗体ＭＡＢ２９３（Ｒ＆Ｄ）を使用してＫｉｎＥｘＡハンドブックのプロトコル（Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃｏａｔｉｎｇ，Ｓａｐｉｄｙｎｅ）に従って抗原でＰＭＭＡビーズをコーティングする。ランニング緩衝液として０．０１％ ＢＳＡ及び０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を使用して、ＫｉｎＥｘＡ平衡アッセイを室温で行い、試料及びビーズをＬｏｗＣｒｏｓｓ緩衝液（Ｃａｎｄｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中で調製する。流速は０．２５ｍｌ／分とする。一定量のＶＥＧＦＡ－１２１－Ｈｉｓ（５０ｐＭ及び第２の実験では５００ｐＭ）を、試験抗体で滴定し、平衡化した混合物を、ＫｉｎＥｘＡシステム中の抗ＶＥＧＦ抗体（Ｍａｂ２９３）が結合したビーズのカラムに、５０ｐＭの一定ＶＥＧＦについては７５０μｌの容量で、５００ｐＭの一定ＶＥＧＦについては１２５μｌの容量で吸引した。結合したＶＥＧＦＡ－１２１の検出は、２５０ｎｇ／ｍｌの濃度の二次ビオチン化抗ＶＥＧＦ抗体（ＢＡＦ２９３）を使用し、続いて、試料緩衝液中の２５０ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７コンジュゲートを注射することによって行う。Ｋ_Ｄは、「標準分析」法を使用して、ＫｉｎＥｘＡソフトウェア（バージョン４．０．１１）に含まれる一部位均一結合モデルを使用したデータの非線形回帰分析から得られる。ソフトウェアはＫ_Ｄを計算し、データ点を理論的Ｋ_Ｄ曲線に当てはめることによって９５％信頼区間を決定する。９５％信頼区間は、Ｋ_Ｄ低及びＫ_Ｄ高として与えられる。

【0127】

例えば、ＡＮＧ２に結合する抗体のＫ_Ｄを、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）製のＫｉｎＥｘＡ ３２００機器を使用するアッセイで測定し、１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２０μｇの抗Ａｎｇ２抗体ＭＡＢ０９８（Ｒ＆Ｄ）を使用してＫｉｎＥｘＡハンドブックのプロトコル（Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃｏａｔｉｎｇ，Ｓａｐｉｄｙｎｅ）に従って抗原でＰＭＭＡビーズをコーティングする。ランニング緩衝液として０．０１％ ＢＳＡ及び０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を使用して、ＫｉｎＥｘＡ平衡アッセイを室温で行い、試料及びビーズをＬｏｗＣｒｏｓｓ緩衝液（Ｃａｎｄｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中で調製する。流速は０．２５ｍｌ／分とする。一定量Ａｎｇ２－ＲＢＤ－ｍｕＦｃ（５０ｐＭ及び第２の実験では５００ｐＭ）を、試験抗体で滴定し、平衡化した混合物を、ＫｉｎＥｘＡシステム中の抗Ａｎｇ２抗体（ＭＡＢ０９８）が結合したビーズのカラムに、５０ｐＭの定常Ａｎｇ２については７５０μｌの容量で、５００ｐＭの定常Ａｎｇ２については１８８μｌの容量で吸引した。結合したＡｎｇ２の検出は、２５０ｎｇ／ｍｌの濃度の二次ビオチン化抗Ａｎｇ２抗体（ＢＡＭ０９８１）を使用し、続いて、試料緩衝液中の２５０ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７コンジュゲートを注射することによって行う。Ｋ_Ｄは、「標準分析」法を使用して、ＫｉｎＥｘＡソフトウェア（バージョン４．０．１１）に含まれる一部位均一結合モデルを使用したデータの非線形回帰分析から得られる。ソフトウェアはＫ_Ｄを計算し、データ点を理論的Ｋ_Ｄ曲線に当てはめることによって９５％信頼区間を決定する。９５％信頼区間は、Ｋ_Ｄ低及びＫ_Ｄ高として与えられる。

【0128】

２．抗体フラグメント
ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体は、抗体フラグメントである。

【0129】

一態様では、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、又はＦ（ａｂ’）_２断片、特にＦａｂ断片である。無傷の抗体をパパイン消化すると、重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ順にＶＨ及びＶＬ）に加えて、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）もそれぞれが含む、２つの同一の抗原結合フラグメント（いわゆる「Ｆａｂ」フラグメント）が得られる。よって「Ｆａｂフラグメント」とは、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む重鎖フラグメントを有する抗体フラグメントのことである。「Ｆａｂ’フラグメント」は、抗体ヒンジ領域から１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にて、残基を添加することによって、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基（複数価）が遊離チオール基を保持するＦａｂ’フラグメントである。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂフラグメント）と、Ｆｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）_２フラグメントが得られる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が長くなったＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２フラグメントの説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照のこと。

【0130】

抗体フラグメントは、限定されないが、本明細書に記載される、インタクト抗体のタンパク質分解による消化、及び組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌、ＣＨＯ）による組み換え産生を含む種々の技術によって作製することができる。

【0131】

好ましい実施形態では、本明細書において提供される抗体はＦａｂフラグメントである。

【0132】

１つの実施形態において、本明細書において提供する抗体のＶＨドメインはヒトＶＨ３フレームワークを含む。

【0133】

１つの実施形態において、本明細書において提供する抗体のＶＬドメインはヒトＶｋａｐｐａ１フレームワークを含む。

【0134】

１つの実施形態において、本明細書において提供する抗体のＣＬドメインはκアイソタイプのものである。

【0135】

１つの実施形態において、本明細書において提供する抗体のＣＨ１ドメインはヒトＩｇＧ１アイソタイプのものである。

【0136】

好ましい実施形態では、本明細書において提供される抗体は、κアイソタイプのＣＬドメイン及びヒトＩｇＧ１アイソタイプのＣＨ１ドメインを含むＦａｂフラグメントである。

【0137】

３．熱安定性
本明細書で提供される抗体は、優れた熱安定性を示す。ある特定の実施形態では、本明細書中に提供される抗体のＦａｂフラグメントは、７０℃以上の凝集開始温度を示す。ある特定の実施形態では、本明細書中に提供される抗体のＦａｂフラグメントは、動的光散乱によって測定して８０℃を超える融解温度を示す。

【0138】

４．多重特異性抗体
ある特定の態様では、本明細書で提供される抗体は多重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位、すなわち、異なる抗原上の異なるエピトープ又は同じ抗原上の異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の態様では、多重特異性抗体は３つ以上の結合特異性を有する。

【0139】

本明細書で提供される抗体を含む３つ以上の結合特異性を有する多重特異性抗体は、同じ抗原特異性の１つ又は複数の結合アームにドメインクロスオーバーを持つ非対称の形で、すなわちＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号及び国際公開第２０１５／１５０４４７号を参照）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（国際公開第２００９／０８０２５３号を参照）又は完全なＦａｂアーム（国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２０１６／０１６２９９号を参照、Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１８７－１１９１、及びＫｌｅｉｎ ａｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ８（２０１６）１０１０－２０も参照）を交換することによっても提供され得る。多重特異性抗体の様々なさらなる分子形式が当技術分野で知られており、本明細書に含まれる（例えばＳｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６７（２０１５）９５－１０６参照）。

【0140】

５．抗体変異体
ある特定の態様では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異形が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的性質を変化させることが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適正な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製されてもよい。このような改変としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。欠失、挿入及び置換の任意の組合せは、最終コンストラクトが、所望の特徴（例えば、抗原結合）を有する限り、最終コンストラクトに到達するように行うことができる。

【0141】

ある特定の態様では、１つ又は複数のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換変異誘発に関心のある部位には、ＣＤＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換は、以下の表において、「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化は、表１において、「例示的な置換」の見出しの下に提供され、またアミノ酸側鎖クラスを参照して以下に更に記載されるとおりである。目的の抗体中にアミノ酸置換を導入することができ、その産物を、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、減少した免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣについてスクリーニングする。

【0142】

【表2】

【0143】

アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って分類され得る。

【0144】

（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0145】

非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを伴うことになる。

【0146】

ある種類の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上のＣＤＲ残基を置換することを伴う。一般的に、更なる研究のために選択された結果の変異体は、親抗体と比較して特定の生物学的特性（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）において修飾（例えば、改善）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟した抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用い、簡便に作製され得る。簡単に言えば、１つ以上のＣＤＲ残基が変異され、そしてファージ上に表示された変異体抗体が、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）のためにスクリーニングされる。

【0147】

ある特定の態様では、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗体の抗原に結合する能力を実質的に低減させない限り、１つ以上のＣＤＲ内で生じ得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的な変更（例えば、本明細書で提供されるような保存的置換）は、ＣＤＲにおいて行われてもよい。そのような改変は、例えば、ＣＤＲ中の抗原接触残基の外側であってもよい。上述の特定のバリアントＶＨ及びＶＬ配列において、各ＣＤＲは、改変されていないか、又は１つ、２つ、又は３つ以下のアミノ酸置換を有するかのいずれかである。

【0148】

変異導入の標的となり得る抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５に記載されているように「アラニンスキャニング変異導入」と呼ばれる。この方法では、標的残基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電残基）の残基又はグループを同定し、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）で置換して、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定する。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入されてもよい。代替的に、又は追加的に、抗原－抗体複合体の結晶構造を使用して、抗体と抗原との間の接触点が特定され得る。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされるか、又は除去されてもよい。変異体は、所望の特性を有するか否かを判定するためにスクリーニングされてもよい。

【0149】

アミノ酸配列挿入には、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに１個又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントとしては、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ（抗体指向性酵素プロドラッグ治療法のための）又はポリペプチドへの抗体のＮ末端若しくはＣ末端の融合が挙げられ、これは抗体の血清半減期を増大させる。

【0150】

ａ） グリコシル化変異体
ある特定の態様では、本明細書において提供する抗体を変えて、抗体のグリコシル化の程度を増減させる。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作り出されるか、又は除去されるようにアミノ酸配列を改変させることにより好都合に達成され得る。

【0151】

抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに結合しているオリゴ糖を変化させることができる。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｎ－結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐型オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの態様では、本発明の抗体中のオリゴ糖の修飾が、特定の改良された特性を有する抗体バリアントを生成するために行われてもよい。

【0152】

一態様では、非フコシル化オリゴ糖、即ち、Ｆｃ領域へのフコース結合（直接又は間接）が欠落した、オリゴ糖構造を有する抗体多様体を提供する。このような非フコシル化オリゴ糖（「アフコシル化」オリゴ糖とも呼ばれる）は特に、二分枝オリゴ糖構造の幹に第１のＧｌｃＮＡｃが結合したフコース残基を欠く、Ｎ結合オリゴ糖である。一態様では、内在性又は親抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の比率が増加した抗体バリアントを提供する。例えば、非フコシル化オリゴ糖の割合は、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、又は場合によっては約１００％（即ち、フコシル化オリゴ糖が存在しない）であってもよい。非フコシル化オリゴ糖の割合は、例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号に記載のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法により測定した、Ａｓｎ２９７に結合した全てのオリゴ糖の合計（例えば、複合体、ハイブリッド、及びハイマンノース構造）に対する、フコース残基を欠くオリゴ糖の（平均）量である。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域の約２９７位に位置するアスパラギン残基を指す（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング）；ただし、Ａｓｎ２９７はまた、抗体のマイナーな配列変化のために、位置２９７の上流又は下流、すなわち位置２９４と３００の間の約±３個のアミノ酸に位置していてもよい。Ｆｃ領域に増加した割合の非フコシル化オリゴ糖を有するこのような抗体は、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体結合及び／又は改善されたエフェクター機能、特に改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；同第２００４／００９３６２１号を参照のこと。

【0153】

フコシル化が低下した抗体を産生可能な細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が不足しているＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３－５４５（１９８６）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４－６２２（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照されたい）、又はＧＤＰ－フコース合成若しくはトランスポータータンパク質の活性が低下若しくは消滅した細胞（例えば、米国特許出願公開第２００４２５９１５０号、同第２００５０３１６１３号、同第２００４１３２１４０号、同第２００４１１０２８２号を参照されたい）が挙げられる。

【0154】

さらなる態様では、抗体バリアントは、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されている二分されたオリゴ糖と共に提供される。このような抗体バリアントは、上述のとおり、低下したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。このような抗体バリアントの例は、例えばＵｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７，１７６－１８０（１９９９）；Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ Ｂｉｏｅｎｇ ９３，８５１－８６１（２００６）；国際公開第９９／５４３４２号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００３／０１１８７８号に記載されている。

【0155】

Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖の少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。このような抗体変異体は、ＣＤＣの機能を改善している可能性がある。かかる抗体変異型は、例えば、国際公開第ＷＯ１９９７／３００８７号、同第ＷＯ１９９８／５８９６４号、及び同第ＷＯ１９９９／２２７６４号に記載されている。

【0156】

ｂ） Ｆｃ領域変異体
ある特定の態様では、１つ以上のアミノ酸改変は、本明細書で提示される抗体のＦｃ領域に導入されてもよく、それにより、Ｆｃ領域変異体を作製する。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、又はＩｇＧ_４Ｆｃ領域）を含み得る。

【0157】

ある特定の態様では、本発明は、全てではないがいくつかのエフェクター機能を有することで、抗体のインビボ半減期が重要でありながら、特定のエフェクター機能（例えば補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ））が不必要、又は有害である用途に対して望ましい候補となる、抗体バリアントを想到する。ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低下／消失を確認するために、インビトロ及び／又はインビボの細胞毒性アッセイを実施することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実行して、抗体がＦｃγＲ結合を欠いている（そのため、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確認することができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、一方で単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現については、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：７０５９－７０６３（１９８６）を参照）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：１４９９－１５０２（１９８５）；５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照）に記載されている。代替としては、非放射性アッセイ法を採用してもよい（例えば、ＡＣＴＩ（商標）フローサイトメトリー用非放射性細胞毒性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、及び ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性試験法（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を参照されたい）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）及びナチュラルキラー（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ：ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、又は加えて、目的のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて、インビトロで評価され得る。また、抗体がＣ１ｑに結合することができず、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施してもよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び同第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照）、ＦｃＲｎ結合及びインビトロクリアランス／半減期の決定は、当該技術分野に既知の方法を使用して実施することもできる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）；ＷＯ２０１３／１２０９２９Ａｌを参照されたい）。

【0158】

エフェクター機能が低下した抗体としては、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ以上の置換を有する抗体が挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ変異体としては、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうち２つ以上での置換を有するＦｃ変異体が挙げられ、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。

【0159】

ＦｃＲへの結合が改善又は減少した特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号，及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）を参照されたい。）
ある特定の態様では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／又は３３４位（残基のＥＵナンバリング）での置換を有するＦｃ領域を含む。

【0160】

ある特定の態様では、抗体バリアントは、ＦｃγＲ結合を減少さあせる１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２３４及び２３５（ＥＵ付番の残基）を有するＦｃ領域を含む。一態様では、置換はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である。ある特定の態様では、抗体バリアントは、ヒトＩｇＧ_１Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域に、Ｄ２６５Ａ及び／又はＰ３２９Ｇを更に含む。一態様において、置換は、ヒトＩｇＧ_１Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域における、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ－ＰＧ）である。（例えば、国際公開第２０１２／１３０８３１号を参照されたい。）別の態様において、置換は、ヒトＩｇＧ_１Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域における、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ａ（ＬＡＬＡ－ＤＡ）である。

【0161】

いくつかの態様では、例えば米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されているように、Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の変化（すなわち向上又は低下のいずれか）をもたらすＦｃ領域内で変化が起こる。

【0162】

半減期が増大し、胎生Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が向上した、母体ＩｇＧを胎児に移行する役割を果たす抗体（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。それらの抗体は、Ｆｃ領域とＦｃＲｎとの結合を改善する１つ以上の置換をその中に有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体としては、Ｆｃ領域残基：２３８、２５２、２５４、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、又は４３４の１つ以上において置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものが挙げられる（例えば、米国特許第７，３７１，８２６号；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（２００６）２３５１４－２３５２４を参照のこと）。

【0163】

マウスＦｃマウスＦｃＲｎ相互作用に決定的なＦｃ領域残基は、部位特異的突然変異誘発により識別されている（例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９（２００２）５１７１－５１８０を参照のこと）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｈ４３３、Ｎ４３４、及びＨ４３５（ＥＵインデックス付番）が、相互作用に関与する（Ｍｅｄｅｓａｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１９９６）２５３３；Ｆｉｒａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（２００１）９９３；Ｋｉｍ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）５４２）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、及びＨ４３５が、ヒトＦｃとマウスＦｃＲｎの相互作用に決定的であることが発見された（Ｋｉｍ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（１９９９）２８１９）。ヒトＦｃ－ヒトＦｃＲｎ複合体の研究により、残基Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｈ４３５、及びＹ４３６が相互作用に決定的であることが示されている（Ｆｉｒａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（２００１）９９３；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１－６６０４）。Ｙｅｕｎｇ，Ｙ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２（２００９）７６６７－７６７１）において、残基２４８～２５９、及び３０１～３１７、及び３７６～３８２、及び４２４～４３７の様々な変異が報告され、調査されている。

【0164】

ある特定の態様では、抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を低下させる１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃの領域位置２５３、及び／又は３１０、及び／又は４３５（ＥＵ付番の残基）における変異を有するＦｃ領域を含む。ある特定の態様では、抗体バリアントは、位置２５３、３１０、及び４３５におけるアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様において、置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域における、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａである。例えば、Ｇｒｅｖｙｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９４（２０１５）５４９７－５５０８を参照のこと。

【0165】

ある特定の態様では、抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を低下させる１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置３１０、及び／又は４３３、及び／又は４３６（ＥＵ付番の残基）における変異を有するＦｃ領域を含む。ある特定の態様では、抗体バリアントは、位置３１０、４３３、及び４３６におけるアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様において、置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域における、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、及びＹ４３６Ａである。（例えば、国際公開第２０１４／１７７４６０号を参照されたい。）

【0166】

ある特定の態様では、抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を増加させる１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃの領域位置２５２、及び／又は２５４、及び／又は２５６（ＥＵ付番の残基）における変異を有するＦｃ領域を含む。ある特定の態様では、抗体バリアントは、位置２５２、２５４、及び２５６におけるアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様において、置換は、ヒトＩｇＧ_１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域におけるＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅである。Ｆｃ領域の変異体の他の例に関して、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照されたい。

【0167】

本明細書に報告されるような抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終わる完全なＣ末端であってもよい。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基のうち１つ又は２つが除去された、短くなったＣ末端であってもよい。１つの好ましい態様では、重鎖のＣ末端は短縮Ｃ末端末端ＰＧである。本明細書に報告される全ての態様のうちの１つの態様では、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、Ｃ末端グリシン－リシンジペプチドを含む（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＥＵインデックス付番のアミノ酸位置）。本明細書に報告される全ての態様のうちの１つの態様では、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、Ｃ末端グリシン残基を含む（Ｇ４４６、ＥＵインデックス付番のアミノ酸位置）。

【0168】

ｃ） システイン操作抗体変異体
ある特定の態様では、抗体の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体、例えば、ＴＨＩＯＭＡＢ^ＴＭを生成することが望ましい場合がある。特定の態様では、置換された残基は、抗体の利用しやすい部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書に更に記載されるように、抗体を薬物部位又はリンカー薬物部位等のような他の部位に複合して免疫コンジュゲートを作成するために使用することができる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号、同第８，３０，９３０号、同第７，８５５，２７５号、同第９，０００，１３０号、又は国際公開第２０１６０４０８５６号に記載のように生成することができる。

【0169】

６．免疫コンジュゲート
本発明はまた、１つ以上の薬剤にコンジュゲート（化学的に結合）された本明細書で提供される抗体を含む免疫コンジュゲートを提供し、１つの実施形態において、細胞傷害剤、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素、又はそのフラグメント）、又は放射性同位体などである。

【0170】

１つの実施形態において、本発明は、ポリマーにコンジュゲートされた本明細書に提供される抗体を含む免疫コンジュゲートを提供する。本明細書で使用される「ポリマー」という用語は、化学ポリマー及びタンパク質ポリマーを含む。１つの実施形態において、免疫コンジュゲートは、拡張された組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）にコンジュゲートされた本明細書に提供される抗体を含む。「拡張された組換えポリペプチド」は当技術分野で公知であり、例えば米国特許出願公開第２０１９００８３５７７号に開示されている。１つの実施形態において、免疫コンジュゲートは、（ａ）ＧＧＳＰＡＧＳＣＴＳＰ、ＧＡＳＡＳＣＡＰＳＴＧ、ＴＡＥＡＡＧＣＧＴＡＥＡＡ、及びＧＰＥＰＴＣＰＡＰＳＧから選択される配列を含み、（ｂ）３６～３０００個のＬ－アミノ酸残基長であり、及び／又は、（ｃ）グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）残基の合計がＸＴＥＮの全アミノ酸残基の９０％超を構成する、ＸＴＥＮを含む。

【0171】

Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているように、組換え方法及び組成物を使用して産生することができる。これらの方法のために、抗体をコードする１つ又は複数の単離された核酸が提供される。

【0172】

一態様では、本発明の抗体をコードする単離された核酸が提供される。

【0173】

一態様では、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体を作製する方法であって、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に好適な条件下で培養することと、任意に、抗体を宿主細胞（又は宿主細胞培養物）から回収することとを含む、方法が提供される。

【0174】

ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体の組換え産生に関しては、例えば、上述の抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために、１つ以上のベクター中に挿入される。このような核酸は、容易に単離することができ、一般的な手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。

【0175】

抗体コード化ベクターのクローニング又は発現のための好適な宿主細胞には、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、特に糖鎖修飾やＦｃエフェクター機能を必要としない場合には、細菌中で産生されてもよい。細菌中の抗体フラグメント及びポリペプチドの発現については、例えば、ＵＳ ５，６４８，２３７号、ＵＳ ５，７８９，１９９号及びＵＳ ５，８４０，５２３号を参照。（大腸菌における抗体フラグメントの発現を記載するＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｋ．Ａ．，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８，Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００３），ｐｐ．２４５－２５４も参照。）発現後、抗体は、適切なフラクション中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、更に精製されてもよい。１つの実施形態において、宿主細胞は大腸菌細胞である。

【0176】

脊椎動物細胞も、宿主として使用され得る。例えば、懸濁物中で成長するように適合した哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えばＧｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９－７４に記載されるような２９３細胞又は２９３Ｔ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３（１９８０）２４３－２５２に記載されるようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト頸部癌腫細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３（１９８２）４４－６８に記載）、ＭＲＣ５細胞及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７（１９８０）４２１６－４２２０）、及び、骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０が挙げられる。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説としては、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｗｕ，Ａ．Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８，Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００４），ｐｐ．２５５－２６８を参照。

【0177】

一態様において、宿主細胞は、真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。１つの好ましい実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。ＣＨＯ細胞における本発明の抗体の産生は、抗体の注射可能性を改善し得る。

【0178】

Ｃ．医薬組成物
さらなる態様において、例えば、以下の治療方法のいずれかにおいて使用するための、本明細書に提供される抗体のいずれかを含む、医薬組成物が提供される。一態様では、医薬組成物は、本明細書に提供される抗体のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の態様では、医薬組成物は、本明細書で提供される抗体のいずれかと、少なくとも１つのさらなる治療剤、例えば、以下に記載するものとを含む。

【0179】

本明細書に記載されているヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体の医薬組成物は、所望の純度を有するかかる抗体を１つ又は複数の必要に応じて存在する薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と、凍結乾燥された組成物又は水溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、一般的に、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、ヒスチジン、ホスファート、シトラート、アセタート及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；メチル若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン若しくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）、並びに／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｈａｌｏｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．）等のヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質等の介在性薬物分散剤を更に含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載される。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを、１つ以上の更なるグリコサミノグリカナーゼ（例えば、コンドロイチナーゼ）と組み合わせる。

【0180】

例示の凍結乾燥抗体組成物は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体組成物としては、米国特許第６，１７１，５８６号及びＷＯ２００６／０４４９０８に記載のものが挙げられ、後者の組成物は、ヒスチジン－酢酸緩衝液を含む。

【0181】

本明細書の医薬組成物はまた、処置されている特定の徴候に必要とされる複数の有効成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない補完的な活性を有するものも含みうる。そのような有効成分は、意図される目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。

【0182】

有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル中に封入されてもよく（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションに封入されてもよい。そのような技術が、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。

【0183】

徐放性の医薬組成物を調製することができる。徐放性調製物の好適な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、これらのマトリクスは、成形物品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態である。

【0184】

インビボ投与に使用される医薬組成物は、一般に無菌である。滅菌は、例えば滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成され得る。

【0185】

Ｄ．治療方法及び投与経路
本明細書中に提供されるヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する任意の抗体を治療方法において使用され得る。

【0186】

一態様では、医薬として使用するためのヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体が提供される。さらなる態様では、血管疾患の処置に使用するためのヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体が提供される。ある特定の態様では、処置方法に使用するためのヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体が提供される。ある特定の態様では、本発明は、血管疾患を有する個体を処置する方法に使用するためのヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する有効量の抗体を個体に投与することを含む抗体を提供する。そのような一態様では、本方法は、例えば以下に記載されるように、有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのさらなる治療剤）を個体に投与することをさらに含む。さらなる態様では、本発明は、血管新生の阻害に使用するためのヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体を提供する。ある特定の態様では、本発明は、個体における血管新生を阻害する方法で使用するためのヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、血管新生を阻害するためにヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する有効量の抗体を個体に投与することを含む抗体を提供する。上記の態様のいずれかによる「個体」は、好ましくはヒトである。

【0187】

さらなる態様では、眼疾患の処置に使用するためのヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体が提供される。一実施形態では、眼疾患は、ＡＭＤ（一実施形態では、滲出型ＡＭＤ、乾燥型ＡＭＤ、中間型ＡＭＤ、進行型ＡＭＤ、及び地図状萎縮（ＧＡ））、黄斑変性、黄斑浮腫、ＤＭＥ（一実施形態では、焦点、非中心ＤＭＥ、及び、びまん性、中心関与ＤＭＥ）、網膜症、糖尿病性網膜症（ＤＲ）（一実施形態では、増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、及び高所ＤＲ）、他の虚血関連網膜症、ＲＯＰ、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）（一実施形態では、中心（ＣＲＶＯ）及び分岐（ＢＲＶＯ）形態）、ＣＮＶ（一実施形態では、近視性ＣＮＶ）、角膜血管新生、角膜血管新生に関連する疾患、網膜血管新生、網膜／脈絡膜血管新生に関連する疾患、中心性漿液性網膜症（ＣＳＲ）、病的近視、フォンヒッペル・リンダウ病、眼のヒストプラズマ症、ＦＥＶＲ、コーツ病、ノーリー病、骨粗鬆症性偽神経膠腫症候群（ＯＰＰＧ）に関連する網膜異常、結膜下出血、ルベオーシス、眼血管新生疾患、血管新生緑内障、網膜色素変性症（ＲＰ）、高血圧性網膜症、網膜血管腫状増殖、黄斑血管拡張症、虹彩血管新生、眼内血管新生、網膜変性、類嚢胞黄斑浮腫（ＣＭＥ）、血管炎、乳頭浮腫、限定されないが以下を含む網膜炎：ＣＭＶ網膜炎、眼黒色腫、網膜芽細胞腫、結膜炎（一実施形態では、感染性結膜炎及び非感染性（一実施形態では、アレルギー性）結膜炎）、レーバー先天性黒丸症（レーバー先天性黒丸症又はＬＣＡとしても知られる）、ブドウ膜炎（感染性及び非感染性ブドウ膜炎を含む）、脈絡膜炎（一実施形態では、多巣性脈絡膜炎）、眼ヒストプラズマ症、眼瞼炎、ドライアイ、外傷性眼損傷、シェーグレン病、並びに、疾患又は疾患が眼血管新生、血管漏出、及び／又は網膜浮腫若しくは網膜萎縮に関連する他の眼疾患から選択される。一実施形態では、眼疾患は、ＡＭＤ（一実施形態では、滲出型ＡＭＤ、乾燥型ＡＭＤ、中間型ＡＭＤ、進行型ＡＭＤ、及び地図状萎縮（ＧＡ））、黄斑変性、黄斑浮腫、ＤＭＥ（一実施形態では、焦点、非中心ＤＭＥ、及び、びまん性、中心関与ＤＭＥ）、網膜症、糖尿病性網膜症（ＤＲ）（一実施形態では、増殖性ＤＲ（ＰＤＲ）、非増殖性ＤＲ（ＮＰＤＲ）、及び高所ＤＲから選択される。

【0188】

さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製におけるヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体の使用を提供する。一態様では、医薬は血管疾患の処置用である。さらなる態様では、医薬は、血管疾患を有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、血管疾患を処置する方法に使用するためのものである。そのような一つの態様では、該方法は、有効量の少なくとも１つの更なる治療剤、例えば、以下に記載されるものを個体に投与することを更に含む。

【0189】

一態様では、医薬は眼疾患の処置用である。さらなる態様では、医薬は、眼疾患を有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、眼疾患を処置する方法に使用するためのものである。そのような一つの態様では、該方法は、有効量の少なくとも１つの更なる治療剤、例えば、以下に記載されるものを個体に投与することを更に含む。

【0190】

さらなる態様では、本発明は、血管疾患を処置する方法を提供する。一態様では、本方法は、そのような血管疾患を有する個体に、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する有効量の抗体を投与することを含む。そのような一つの態様では、該方法は、有効量の少なくとも１つの更なる治療剤、以下に記載されるものを個体に投与することを更に含む。

【0191】

さらなる態様では、本発明は、眼疾患を処置する方法を提供する。一態様では、本方法は、そのような眼疾患を有する個体に、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する有効量の抗体を投与することを含む。そのような一つの態様では、該方法は、有効量の少なくとも１つの更なる治療剤、以下に記載されるものを個体に投与することを更に含む。

【0192】

上記の態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであってもよい。

【0193】

さらなる態様では、本発明は、例えば上記の治療方法のいずれかで使用するための、本明細書で提供されるヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体のいずれかを含む医薬組成物を提供する。一態様では、医薬組成物は、本明細書で提供されるヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の態様では、医薬組成物は、本明細書で提供されるヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体のいずれかと、例えば以下に記載される少なくとも１つのさらなる治療薬とを含む。

【0194】

本発明の抗体は、硝子体内投与（例えば、硝子体内注射）によって、又はポート送達装置を使用して投与され得る。一実施形態では、本発明の抗体は、ポート送達装置が再充填される前に、６ヶ月以上、一実施形態では８ヶ月以上、一実施形態では９ヶ月以上、一実施形態では１２ヶ月以上の期間にわたってポート送達装置を使用して投与される。一実施形態では、本発明の抗体は、ポート送達装置を使用して投与され、抗体は、１５０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で、一実施形態では２００ｍｇ／ｍｌ以上の濃度でポート送達装置に適用される。

【0195】

本発明の抗体は、単独で投与され得るか、又は併用療法において使用され得る。例えば、該併用療法には、本発明の抗体を投与することと、少なくとも１種類の追加の治療薬（例えば、１種類、２種類、３種類、４種類、５種類、又は６種類の追加の治療薬）を投与することとが含まれる。

【0196】

上の実施形態のいずれかに従った（又は適用される）特定の実施形態では、眼疾患は、増殖性網膜症、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性及び他の虚血関連網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病理学的近視、フォンヒッペル・リンダウ病、眼のヒストプラズマ症、ＣＲＶＯ及びＢＲＶＯを含む網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生、及び未熟児網膜症（ＲＯＰ）からなる群から選択される眼内血管新生疾患である。

【0197】

いくつかの例において、本明細書中に提供されるヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体は、眼障害、例えば、本明細書中に記載される眼障害（例えば、ＡＭＤ（例えば、滲出型ＡＭＤ）、ＤＭＥ、ＤＲ、ＲＶＯ、又はＧＡ）を処置するための少なくとも１つのさらなる治療剤と組み合わせて投与され得る。

【0198】

任意の適切なＡＭＤ治療剤は、眼障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、ＲＶＯ、又はＧＡ）を処置するために本明細書中に提供されるヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体と組み合わせてさらなる治療剤として投与することができ、限定するものではないが、ＶＥＧＦアンタゴニスト、例えば抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）（ラニビズマブ）、ＲＴＨ－２５８（以前はＥＳＢ－１００８、抗ＶＥＧＦ一本鎖抗体フラグメント；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、又は二重特異性抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン２二重特異性抗体、例えば、ファリシマブ；Ｒｏｃｈｅ））、可溶性ＶＥＧＦ受容体融合タンパク質（例えば、ＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト））、抗ＶＥＧＦ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）（例えば、アビシパル・ペゴル；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ／Ａｌｌｅｒｇａｎ）、又は抗ＶＥＧＦアプタマー（例えば、ＭＡＣＵＧＥＮ（登録商標）（ペガプタニブナトリウム）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）アンタゴニスト、例えば、抗ＰＤＧＦ抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体（例えば、ＲＥＧＮ２１７６－３）、抗ＰＤＧＦ－ＢＢペグ化アプタマー（例えば、ＦＯＶＩＳＴＡ（登録商標）；Ｏｐｈｔｈｏｔｅｃｈ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、可溶性ＰＤＧＦＲ受容体融合タンパク質、又は二重ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、小分子阻害剤（例えば、ＤＥ－１２０（Ｓａｎｔｅｎ）又はＸ－８２（ＴｙｒｏｇｅｎｅＸ））又は二重特異性抗ＰＤＧＦ／抗ＶＥＧＦ抗体））；光線力学的療法と組み合わせたＶＩＳＵＤＹＮＥ（登録商標）（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）；酸化防止剤；補体系アンタゴニスト、例えば補体因子Ｃ５アンタゴニスト（例えば、小分子阻害剤（例えば、ＡＲＣ－１９０５；Ｏｐｔｈｏｔｅｃｈ）又は抗Ｃ５抗体（例えば、ＬＦＧ－３１６；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、プロパージンアンタゴニスト（例えば、抗プロパージン抗体、例えば、ＣＬＧ－５６１；Ａｌｃｏｎ）、又は補体因子Ｄアンタゴニスト（例えば、抗補体因子Ｄ抗体、例えば、ランパリズマブ；Ｒｏｃｈｅ））；Ｃ３ブロッキングペプチド（例えば、ＡＰＬ－２、Ａｐｐｅｌｌｉｓ）；視覚サイクル調整剤（例えば、エミクススタット塩酸塩）；スクアラミン（例えば、ＯＨＲ－１０２；Ｏｈｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）；ビタミン及びミネラル補助剤（例えば、加齢性眼疾患試験１（ＡＲＥＤＳ１；亜鉛及び／又は酸化防止剤）及び試験２（ＡＲＥＤＳ２；亜鉛、酸化防止剤、ルテイン、ゼアキサンチン、及び／又はオメガ－３脂肪酸）に記載されているもの）；細胞ベースの治療、例えば、ＮＴ－５０１（Ｒｅｎｅｘｕｓ）；ＰＨ－０５２０６３８８（Ｐｆｉｚｅｒ）、ｈｕＣＮＳ－ＳＣ細胞移植（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ）、ＣＮＴＯ－２４７６（臍帯幹細胞株；Ｊａｎｓｓｅｎ）、ＯｐＲｅｇｅｎ（ＲＰＥ細胞の懸濁液；Ｃｅｌｌ Ｃｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、又はＭＡ０９－ｈＲＰＥ細胞移植（Ｏｃａｔａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；組織因子アンタゴニスト（例えば、ｈＩ－ｃｏｎ１；Ｉｃｏｎｉｃ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；α－アドレナリン受容体アゴニスト（例えば、酒石酸ブリモニジン；Ａｌｌｅｒｇａｎ）；ペプチドワクチン（例えば、Ｓ－６４６２４０；Ｓｈｉｏｎｏｇｉ）；アミロイドβ拮抗薬（例えば、抗βアミロイドモノクローナル抗体、例えばＧＳＫ－９３３７７６）；Ｓ１Ｐアンタゴニスト（例えば、抗Ｓ１Ｐ抗体、例えばｉＳＯＮＥＰ（商標）；Ｌｐａｔｈ Ｉｎｃ）；ＲＯＢＯ４アンタゴニスト（例えば、抗ＲＯＢＯ４抗体、例えばＤＳ－７０８０ａ；Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏ）；エンドスタチン及びアンジオスタチンを発現するレンチウイルスベクター（例えば、ＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ）；及びそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの例では、ＡＭＤ治療剤（前述のＡＭＤ治療剤のいずれかを含む）を共製剤化することができる。例えば、抗ＰＤＧＦＲ抗体ＲＥＧＮ２１７６－３は、アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ（登録商標））と共製剤化することができる。いくつかの例では、そのような共製剤は、本発明のヒトＶＥＧＦ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの例では、眼障害はＡＭＤ（例えば、滲出型ＡＭＤ）である。

【0199】

限定されないが、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標）又はＥＹＬＥＡ（登録商標））、コルチコステロイド（例えば、コルチコステロイドのインプラント（例えば、ＯＺＵＲＤＥＸ（登録商標）（デキサメタゾン硝子体内インプラント）又はＩＬＵＶＩＥＮ（登録商標）（フルオシノロンアセトニド硝子体内インプラント））又は硝子体内注射による投与のために製剤化されたコルチコステロイド（例えば、トリアムシノロンアセトニド））、又はそれらの組み合わせを含む任意の適切なＤＭＥ及び／又はＤＲ治療剤は、眼障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、ＲＶＯ、又はＧＡ）の処置のために、本発明のヒトＶＥＧＦ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体と組み合わせて投与することができる。いくつかの例では、眼障害はＤＭＥ及び／又はＤＲである。

【0200】

本明細書で提供されるヒトＶＥＧＦ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体は、例えば、レーザー光凝固（例えば、汎網膜光凝固（ＰＲＰ））、ドルーゼンレーザー発振、黄斑円孔手術、黄斑転座手術、埋め込み型小型望遠鏡、ＰＨＩ運動血管造影法（マイクロレーザー治療及びフィーダー血管処置としても知られる）、陽子線療法、微小刺激療法、網膜剥離及び硝子体手術、強膜バックル、黄斑下手術、経乳頭温熱療法、光化学系Ｉ療法、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用、体外レオフェレーシス（膜分画濾過及びレオセラピーとしても知られる）、マイクロチップ移植、幹細胞療法、遺伝子置換療法、リボザイム遺伝子療法（低酸素応答エレメントの遺伝子療法を含む、Ｏｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ；Ｌｅｎｔｉｐａｋ、Ｇｅｎｅｔｉｘ；及びＰＤＥＦ遺伝子療法、ＧｅｎＶｅｃ）、光受容体／網膜細胞移植（移植可能な網膜上皮細胞を含む、Ｄｉａｃｒｉｎ，Ｉｎｃ．；網膜細胞移植、例えば、Ａｓｔｅｌｌａｓ Ｐｈａｒｍａ ＵＳ，Ｉｎｃ．、ＲｅＮｅｕｒｏｎ、ＣＨＡ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、穿刺、及びそれらの組み合わせを含む、眼障害（例えば、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＤＲ、ＲＶＯ、又はＧＡ）の処置のための治療又は外科的手順と組み合わせて投与され得る。

【0201】

上述したそのような併用療法は、併用投与（ここでは、２つ以上の治療剤が同一又は別個の製剤中に含まれる）及び別個の投与を包含し、この場合、ヒトＶＥＧＦ及びヒトＡＮＧ２に結合する本発明の抗体の投与は、追加の治療剤又は薬剤の投与に先立って、同時に、及び／又はそれに続いて、行われ得る。一実施形態では、本発明のヒトＶＥＧＦ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体の投与及びさらなる治療薬の投与は、互いに約１、２、３、４、若しくは５ヶ月以内、又は約１、２、若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日以内に行われる。

【0202】

本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所的な処置のために望まれる場合、病変内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口輸液には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は皮下投与が含まれる。投薬は、投与が短期又は長期であるかに部分的に応じて、任意の好適な経路、例えば、静脈内又は皮下注射等の注射によるものであり得る。単回又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス輸注を含むが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールが、本明細書では企図される。

【0203】

本発明の抗体は、良好な医療行為と一致した方法で製剤化され、投与され、投与されるであろう。これに関連して考慮すべき要因としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の要因が挙げられる。抗体は、問題の疾患を予防又は処置するために現在使用されている１種以上の薬剤と一緒に製剤化されている必要はないが、任意に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、医薬組成物中に存在する抗体の量、疾患又は処置の種類、及び上述した他の要因に依存する。これらは、一般に、本明細書に記載のものと同じ投薬量及び投与経路によって、又は本明細書に記載の投薬量の約１～９９％、又は適切であると経験的／臨床的に判断される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。

【0204】

疾患の予防又は処置について、本発明の抗体の適切な投薬量は（単独で、又は１つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）、処置される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的又は治療目的で投与されるかどうか、以前の療法、患者の病歴及び抗体への応答、並びに主治医の裁量に依存するだろう。本発明の抗体は、好適には、患者に一度に又は一連の治療にわたって投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば、１回以上の別個の投与によるか、又は連続注入によるかにかかわらず、患者への投与のための初期候補投薬量であり得る。典型的な１日投薬量は、上述の因子に依存して、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。数日間又はそれ以上にわたる反復投与において、状態に応じ、処置は通常、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられる。抗体の１つの例示的な投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組合せ）のうちの１つ以上の用量が、患者に投与され得る。かかる用量は、断続的に、例えば毎週又は３週間毎（例えば、患者が約２～約２０回、又は例えば約６回の用量の抗体を受容するように）投与されてもよい。最初の多めの投与量、それに続く１回以上の量の少ない用量を投与してよい。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。

【0205】

Ｅ．製造物品
本発明の別の態様では、上述の障害の処置、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造物品が提供される。製造品は、容器と、容器上の又は容器に関連付けられたラベル又は添付文書を含む。適切な容器としては、例えば、バイアル、シリンジなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。容器は、状態を処置、予防、及び／又は診断するのに有効な別の組成物と単独で又は組み合わせて使用される組成物を保持し、無菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される症状を処置するために使用されることを示す。

【0206】

更に、製造物品は、（ａ）組成物を含む第１の容器を含み、この組成物は本発明の抗体を含み、（ｂ）組成物を含む第２の容器を含み、この組成物は細胞疾患性又は他の治療剤を更に含む。本発明のこの態様における製造物品は、組成物が特定の状態を処置するために使用され得ることを示すパッケージ添付文書を更に含んでいてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、製造物品は、薬学的に許容され得る緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液及びデキストロース溶液を含む第２の（又は第３の）容器を更に備えていてもよい。他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、注射器等、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。

【0207】

Ｆ．装置
本発明の抗体は、眼インプラントを使用して、一実施形態ではポート送達装置を使用して眼に投与され得る。

【0208】

ポート送達装置は、数ヶ月（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月、又はそれ以上）にわたって治療薬（例えば、本発明の抗体）を放出することができる埋め込み可能で再充填可能な装置である。使用され得る例示的なポート送達装置には、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第２０１０／０８８５４８号、国際公開第２０１５／０８５２３４号、国際公開第２０１３／１１６０６１号、国際公開第２０１２／０１９１７６号、国際公開第２０１３／０４０２４７号及び国際公開第２０１２／０１９０４７号に記載されているようなＦｏｒＳｉｇｈｔ Ｌａｂｓ，ＬＬＣ及び／又はＦｏｒＳｉｇｈｔ ＶＩＳＩＯＮ４からのものが含まれる。

【0209】

例えば、本発明は、本明細書中に記載される抗体のいずれかを含有するリザーバを備えるポート送達装置を提供する。ポート送達装置は、近位領域と、リザーバと流体連通して近位領域に結合された管状体と、リザーバと流体連通し、組成物を眼の中に放出するように構成された１つ以上の出口とをさらに備えてよい。管状体は、約０．５ｍｍ以下の眼の切開部又は開口部を通して挿入されるように構成された外径を有してよい。装置は、長さが約１ｍｍ～約１５ｍｍ（例えば、約１ｍｍ、約２ｍｍ、約４ｍｍ、約５ｍｍ、約６ｍｍ、約７ｍｍ、約９ｍｍ、約１１ｍｍ、約１３ｍｍ、又は約１５ｍｍの長さ）であってもよい。リザーバは、任意の適切な容積を有してもよい。場合によっては、リザーバは、約１μｌ～約１００μｌ（例えば、約１μｌ、約５μｌ、約１０μｌ、約２０μｌ、約５０μｌ、約７５μｌ、又は約１００μｌ）の容積を有する。デバイス又はその構成部品は、任意の適切な材料、例えばポリイミドで作製されてもよい。

【0210】

いくつかの例では、ポート送達装置は、本明細書に記載の抗体のいずれか及び１つ以上の追加の化合物を含有するリザーバを備える。

【0211】

いくつかの例では、ポート送達装置は、本明細書に記載の抗体又は抗体コンジュゲートのいずれか及び追加のＶＥＧＦアンタゴニストを含む。

【0212】

３．本発明の特定の実施形態
以下に、本発明の特定の実施形態を列挙する。

【0213】

１．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、可変軽鎖ドメイン（ＶＬドメイン）及び可変重鎖ドメイン（ＶＨドメイン）の１つの同族対内のＶＥＧＦ－Ａパラトープ及びＡＮＧ２パラトープを含み、ＶＥＧＦ－Ａパラトープが、抗体のＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｌ１及びＣＤＲ－Ｌ３由来のアミノ酸残基を含み、ＡＮＧ２パラトープが、抗体のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ２由来のアミノ酸残基を含む抗体。

【0214】

２．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、可変軽鎖ドメイン（ＶＬドメイン）及び可変重鎖ドメイン（ＶＨドメイン）の１つの同族対内にＶＥＧＦ－Ａパラトープ及びＡＮＧ２パラトープを含み、可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインの対がヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に同時に結合する抗体。

【0215】

３．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、可変軽鎖ドメイン（ＶＬドメイン）及び可変重鎖ドメイン（ＶＨドメイン）の１つの同族対内のＶＥＧＦ－Ａパラトープ及びＡＮＧ２パラトープを含み、配列番号１９の可変重鎖ドメイン及び配列番号２０の可変軽鎖ドメインを有する抗体と同一のヒトＶＥＧＦ－Ａ上のエピトープ及び同一のヒトＡＮＧ２上のエピトープに結合する抗体。

【0216】

４．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、可変軽鎖ドメイン（ＶＬドメイン）及び可変重鎖ドメイン（ＶＨドメイン）の１つの同族対内にＶＥＧＦ－Ａパラトープ及びＡＮＧ２パラトープを含み、
・ＶＥＧＦ－Ａパラトープは、抗体のＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｌ１及びＣＤＲ－Ｌ３由来のアミノ酸残基を含み、ＡＮＧ２パラトープは、抗体のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ２由来のアミノ酸残基を含む；及び／又は
・可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインとの対は、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に同時に結合する；及び／又は
・配列番号１９の可変重鎖ドメイン及び配列番号２０の可変軽鎖ドメインを有する抗体と同一のヒトＶＥＧＦ－Ａ上のエピトープ及び同一のヒトＡＮＧ２上のエピトープに結合する；及び／又は
・抗体の抗体Ｆａｂフラグメントが、（ｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１に結合し、（ｉｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＡＮＧ２に結合する；及び／又は
・抗体の抗体Ｆａｂフラグメントが、７０℃以上の凝集開始温度を示す；及び／又は
・抗体の抗体Ｆａｂフラグメントが、動的光散乱法により測定して８０℃を超える融解温度を示す；及び／又は
・１８０ｍｇ／ｍｌの抗体Ｆａｂフラグメントを含む２０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨｉｓＨＣｌ、ｐＨ６．０溶液が、実施例８に記載されるラテックス－ビーズＤＬＳ法を用いた動的光散乱によって検出して２０℃で２０ｃＰ未満の粘度を有する、抗体。

【0217】

５．（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含む、先行する実施形態のいずれか一つに記載の抗体。

【0218】

６．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含む、抗体。

【0219】

７．（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９及びＹ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６及びＲ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメイン；並びに、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、及び（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２及びＹ３を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｌ４６及びＦ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｅ５７を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従っている、先行する実施形態のいずれか一つに記載の抗体。

【0220】

８．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９及びＹ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６及びＲ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメイン；並びに、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、及び（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２及びＹ３を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｌ４６及びＦ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｅ５７を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従っている、抗体。

【0221】

９．アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９、Ｙ３０、Ｄ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｋ５７、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｇ６５、Ｒ６６、Ｒ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８、及びＦ９９を含むＶＨドメイン、並びにアミノ酸残基Ｉ２、Ｙ３、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｅ３２、Ｌ４６、Ｆ４９、Ｄ５０、Ｆ５３、Ｋ５４、Ｖ５５、Ｙ５６、Ｅ５７、Ｙ９１、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４、及びＰ９５を含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングはＫａｂａｔナンバリングシステムに従っている、先行する実施形態のいずれか一つに記載の抗体。

【0222】

１０．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、配列番号１９のＶＨドメイン及び配列番号２０のＶＬドメインを有する抗体のＶＥＧＦ－Ａパラトープ及びＡＮＧ２パラトープに含まれるアミノ酸残基を含む、抗体。

【0223】

１１．実施形態９又は１０に記載の抗体であって、
－－ＶＨドメイン中に以下のアミノ酸残基Ｄ３５ｃ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｋ５７、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｇ６５、Ｒ６６、及びＤ９５、並びにＶＬドメイン中に以下のアミノ酸残基Ｉ２、Ｙ３、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｅ３２、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４、及びＰ９５を含むＶＥＧＦ－Ａパラトープ；及び
－－ＶＨドメイン中に以下のアミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９、Ｙ３０、Ｄ３５ｂ、Ｒ９４、Ｖ９６、Ｆ９８、及びＦ９９、並びにＶＬドメイン中に以下のアミノ酸残基Ｅ３２、Ｌ４６、Ｆ４９、Ｄ５０、Ｆ５３、Ｋ５４、Ｖ５５、Ｙ５６、Ｅ５７、及びＹ９１を含むＡＮＧ２パラトープを含む、抗体。

【0224】

１２．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９、Ｙ３０、Ｄ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｋ５７、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｇ６５、Ｒ６６、Ｒ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８、及びＦ９９を含むＶＨドメイン、並びにアミノ酸残基Ｉ２、Ｙ３、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｅ３２、Ｌ４６、Ｆ４９、Ｄ５０、Ｆ５３、Ｋ５４、Ｖ５５、Ｙ５６、Ｅ５７、Ｙ９１、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４、及びＰ９５を含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングはＫａｂａｔナンバリングシステムに従っている、抗体。

【0225】

１３．実施形態１２に記載の抗体であって、
－－ＶＨドメイン中に以下のアミノ酸残基Ｄ３５ｃ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｋ５７、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｇ６５、Ｒ６６、及びＤ９５、並びにＶＬドメイン中に以下のアミノ酸残基Ｉ２、Ｙ３、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｅ３２、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４、及びＰ９５を含むＶＥＧＦ－Ａパラトープ；及び
－－ＶＨドメイン中に以下のアミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９、Ｙ３０、Ｄ３５ｂ、Ｒ９４、Ｖ９６、Ｆ９８、及びＦ９９、並びにＶＬドメイン中に以下のアミノ酸残基Ｅ３２、Ｌ４６、Ｆ４９、Ｄ５０、Ｆ５３、Ｋ５４、Ｖ５５、Ｙ５６、Ｅ５７、及びＹ９１を含むＡＮＧ２パラトープを含む、抗体。

【0226】

１４．（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、先行する実施形態のいずれか一つに記載の抗体。

【0227】

１５．先行する実施形態のいずれか一項に記載の抗体であって、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメインであって、Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９、Ｙ３０、Ｄ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｋ５７、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｇ６５、Ｒ６６、Ｒ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８、及びＦ９９のアミノ酸残基を含むＶＨドメイン；並びに、（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインであって、Ｉ２、Ｙ３、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｅ３２、Ｌ４６、Ｆ４９、Ｄ５０、Ｆ５３、Ｋ５４、Ｖ５５、Ｙ５６、Ｅ５７、Ｙ９１、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４、及びＰ９５のアミノ酸残基を含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従っている、先行する実施形態のいずれか一つに記載の抗体。

【0228】

１６．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに、（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む抗体。

【0229】

１７．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに、（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでおりＨ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９、Ｙ３０、Ｒ６６及びＲ９４を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでおりＩ２、Ｙ３、Ｌ４６、Ｆ４９、及びＥ５７を含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングはＫａｂａｔナンバリングシステムに従っている抗体。

【0230】

１８．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９及びＹ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６及びＲ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメイン；並びに、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、及び（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２及びＹ３を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｌ４６及びＦ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｅ５７を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従っており、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン及び（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む抗体。

【0231】

１９．（ａ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン、及び（ｂ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号２０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを含む、先行する実施形態のいずれか一つに記載の抗体。

【0232】

２０．（ａ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１９のアミノ酸配列を含んでおり該アミノ酸置換が配列番号１９の１、２、４～２５、２８、３５ｄ～５４、５９、６０、６７～９３、９７、１０１～１１３の１つ又は複数の位置にあるＶＨドメイン；及び（ｂ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号２０のアミノ酸配列を含んでおり該アミノ酸置換が配列番号２０の１、４～２６、２７ｂ～２７ｄ、３３～４５、４７、４８、５１、５２、５８～９０、９６～１０７の位置にある可変軽鎖ドメインを含む抗体であって、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングはＫａｂａｔナンバリングシステムに従っている、先行する実施形態のいずれか一つに記載の抗体。

【0233】

２１．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びにＶＬドメイン（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含んでおり、（ａ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号２０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメインを含む抗体。

【0234】

２２．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９及びＹ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６及びＲ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメイン；並びに、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、及び（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２及びＹ３を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｌ４６及びＦ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｅ５７を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従っており、（ａ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）１５個までのアミノ酸置換を有する配列番号２０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖ドメイン含む抗体。

【0235】

２３．配列番号１９のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含む、先行する実施形態のいずれか一つに記載の抗体。

【0236】

２４．配列番号１９のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含む、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体。

【0237】

２５．配列番号２４の重鎖アミノ酸配列及び配列番号２５の軽鎖アミノ酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一つの抗体。

【0238】

２６．配列番号２４の重鎖アミノ酸配列及び配列番号２５の軽鎖アミノ酸配列を含む、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体。

【0239】

２７．配列番号１７の重鎖アミノ酸配列及び配列番号１８の軽鎖アミノ酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一つの抗体。

【0240】

２８．配列番号１７の重鎖アミノ酸配列及び配列番号１８の軽鎖アミノ酸配列を含む、ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体。

【0241】

２９．抗体の抗体Ｆａｂフラグメントが、（ｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１に結合し、（ｉｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＡＮＧ２に結合する、先行する実施形態のいずれか一つに記載の抗体。

【0242】

３０．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントが、（ｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１に結合し、（ｉｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１に結合する抗体。

【0243】

３１．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに、（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含む抗体であって、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントが、（ｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１に結合し、（ｉｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＡＮＧ２に結合する、抗体。

【0244】

３２．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９及びＹ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６及びＲ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメイン；並びに、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、及び（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２及びＹ３を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｌ４６及びＦ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｅ５７を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従っており、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントが、（ｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１に結合し、（ｉｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＡＮＧ２に結合する抗体。

【0245】

３３．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、１対のＶＨ及びＶＬドメイン中に、（ｉ）アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９、Ｙ３０、Ｄ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｋ５７、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｇ６５、Ｒ６６、Ｒ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８、及びＦ９９を含むＶＨドメイン、並びに、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｉ２、Ｙ３、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｅ３２、Ｌ４６、Ｆ４９、Ｄ５０、Ｆ５３、Ｋ５４、Ｖ５５、Ｙ５６、Ｅ５７、Ｙ９１、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４、及びＰ９５を含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従っており、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントは、（ｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１に結合し、（ｉｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＡＮＧ２に結合する、抗体。

【0246】

３４．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに、（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントは、（ｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１に結合し、（ｉｉ）ＫｉｎＥｘＡによって測定して５０ｐＭ未満のＫ_ＤでヒトＡＮＧ２に結合する、抗体。

【0247】

３５．抗体Ｆａｂフラグメントが７０℃以上の凝集開始温度を示す、先行する実施形態のいずれか一つの抗体。

【0248】

３６．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントが７０℃以上の凝集開始温度を示す抗体。

【0249】

３７．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに、（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントは、７０℃以上の凝集開始温度を示す、抗体。

【0250】

３８．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９及びＹ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６及びＲ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメイン；並びに、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、及び（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２及びＹ３を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｌ４６及びＦ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｅ５７を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従っており、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントは７０℃以上の凝集開始温度を示す、抗体。

【0251】

３９．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、１対のＶＨ及びＶＬドメイン中に、（ｉ）アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９、Ｙ３０、Ｄ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｋ５７、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｇ６５、Ｒ６６、Ｒ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８、及びＦ９９を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｉ）アミノ酸残基Ｉ２、Ｙ３、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｅ３２、Ｌ４６、Ｆ４９、Ｄ５０、Ｆ５３、Ｋ５４、Ｖ５５、Ｙ５６、Ｅ５７、Ｙ９１、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４、及びＰ９５を含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングはＫａｂａｔナンバリングシステムに従っており、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントは７０℃以上の凝集開始温度を示す、抗体。

【0252】

４０．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに、（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントは、７０℃以上の凝集開始温度を示す、抗体。

【0253】

４１．抗体の抗体Ｆａｂフラグメントが、動的光散乱によって測定して８０℃を超える融解温度を示す、先行する実施形態のいずれか一つに記載の抗体。

【0254】

４２．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントが、動的光散乱によって測定して８０℃を超える融解温度を示す、抗体。

【0255】

４３．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントは、動的光散乱によって測定して８０℃を超える融解温度を示す、抗体。

【0256】

４４．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９及びＹ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６及びＲ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメイン；並びに、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、及び（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２及びＹ３を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｌ４６及びＦ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｅ５７を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従っており、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントは、動的光散乱によって測定して８０℃を超える融解温度を示す、抗体。

【0257】

４５．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、１対のＶＨ及びＶＬドメイン中に、（ｉ）アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９、Ｙ３０、Ｄ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｋ５７、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｇ６５、Ｒ６６、Ｒ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８、及びＦ９９を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｉ）アミノ酸残基Ｉ２、Ｙ３、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｅ３２、Ｌ４６、Ｆ４９、Ｄ５０、Ｆ５３、Ｋ５４、Ｖ５５、Ｙ５６、Ｅ５７、Ｙ９１、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４、及びＰ９５を含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングはＫａｂａｔナンバリングシステムに従っており、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントは、動的光散乱によって測定して８０℃を超える融解温度を示す、抗体。

【0258】

４６．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに、（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、抗体の抗体Ｆａｂフラグメントは、動的光散乱によって測定して８０℃を超える融解温度を示す、抗体。

【0259】

４７．１８０ｍｇ／ｍｌの抗体Ｆａｂフラグメントを含む２０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨｉｓＨＣｌ、ｐＨ６．０溶液が、実施例８に記載されるラテックス－ビーズＤＬＳ法を用いた動的光散乱によって検出して２０℃で２０ｃＰ未満の粘度を有する、先行する実施形態のいずれか一つに記載の抗体。

【0260】

４８．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、１８０ｍｇ／ｍｌの抗体Ｆａｂフラグメントを含む２０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨｉｓＨＣｌ、ｐＨ６．０溶液が、実施例８に記載されるラテックス－ビーズＤＬＳ法を用いた動的光散乱によって検出して２０℃で２０ｃＰ未満の粘度を有する抗体。

【0261】

４９．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに、（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、１８０ｍｇ／ｍｌの抗体Ｆａｂフラグメントを含む２０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨｉｓＨＣｌ，ｐＨ６．０溶液は、実施例８に記載されるラテックス－ビーズＤＬＳ法を用いた動的光散乱によって検出して２０℃で２０ｃＰ未満の粘度を有する抗体。

【0262】

５０．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、（ｄ）（ｉ）アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９及びＹ３０を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｒ６６及びＲ９４を含むＦＲ３を有するヒト重鎖フレームワークを含むＶＨドメイン；並びに、（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、（ｇ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３、及び（ｈ）（ｉ）アミノ酸残基Ｉ２及びＹ３を含むＦＲ１、（ｉｉ）アミノ酸残基Ｌ４６及びＦ４９を含むＦＲ２、（ｉｉｉ）アミノ酸残基Ｅ５７を含むＦＲ３を有するヒト軽鎖フレームワークを含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従っており、１８０ｍｇ／ｍｌの抗体Ｆａｂフラグメントを含む２０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨｉｓＨＣｌ、ｐＨ６．０溶液が、実施例８に記載されるラテックス－ビーズＤＬＳ法による動的光散乱によって検出して２０℃で２０ｃＰ未満の粘度を有する抗体。

【0263】

５１．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、１対のＶＨ及びＶＬドメイン中に、（ｉ）アミノ酸残基Ｈ３、Ｄ２６、Ｆ２７、Ｅ２９、Ｙ３０、Ｄ３５ｂ、Ｄ３５ｃ、Ｄ５５、Ｈ５６、Ｋ５７、Ｙ５８、Ｔ６１、Ｋ６２、Ｆ６３、Ｉ６４、Ｇ６５、Ｒ６６、Ｒ９４、Ｄ９５、Ｖ９６、Ｆ９８、及びＦ９９を含むＶＨドメイン、並びに（ｉｉ）アミノ酸残基Ｉ２、Ｙ３、Ｙ２７、Ｗ２７ａ、Ｅ３２、Ｌ４６、Ｆ４９、Ｄ５０、Ｆ５３、Ｋ５４、Ｖ５５、Ｙ５６、Ｅ５７、Ｙ９１、Ｒ９２、Ｙ９３、Ｈ９４、及びＰ９５を含むＶＬドメインを含み、ＶＨ及びＶＬドメインのナンバリングはＫａｂａｔナンバリングシステムに従っており、１８０ｍｇ／ｍｌの抗体Ｆａｂフラグメントを含む２０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨｉｓＨＣｌ、ｐＨ６．０溶液が、実施例８に記載されるラテックス－ビーズＤＬＳ法による動的光散乱によって検出して２０℃で２０ｃＰ未満の粘度を有する抗体。

【0264】

５２．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に特異的に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３を含むＶＨドメイン、並びに、（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｅ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、（ａ）配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨドメイン；及び（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含み、１８０ｍｇ／ｍｌの抗体Ｆａｂフラグメントを含む２０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨｉｓＨＣｌ、ｐＨ６．０溶液が、実施例８に記載されるラテックス－ビーズＤＬＳ法による動的光散乱によって検出して２０℃で２０ｃＰ未満の粘度を有する抗体。

【0265】

５３．モノクローナル抗体である、先行する実施形態のいずれか一つに記載の抗体。

【0266】

５４．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体フラグメントである、先行する実施形態のいずれか一つの抗体。

【0267】

５５．二重特異性である、先行する実施形態のいずれか一つに記載の抗体。

【0268】

５６．Ｆａｂフラグメントである、先行する実施形態のいずれか一つに記載の抗体。

【0269】

５７．二重特異性抗体フラグメントである、先行する実施形態のいずれか一つに記載の抗体。

【0270】

５８．多重特異性抗体である、先行する実施形態のいずれか一つに記載の抗体。

【0271】

５９．ヒトＶＥＧＦ－Ａに特異的に結合する、先行する実施形態のいずれか一つに記載の抗体。

【0272】

６０．ヒトＡＮＧ２に特異的に結合する、先行する実施形態のいずれか一つに記載の抗体。

【0273】

６１．実施形態１から５８のいずれか一つに記載の抗体をコードする、単離された核酸。

【0274】

６２．実施形態５９の核酸を含む、宿主細胞。

【0275】

６３．実施形態６１の核酸を含む、発現ベクター。

【0276】

６４．ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に結合する抗体を産生する方法であって、抗体が産生されるように実施形態６０に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、方法。

【0277】

６５．抗体を宿主細胞から回収することをさらに含む、実施形態６４に記載の方法。

【0278】

６６．宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞である、実施形態６４又は６５に記載の方法。

【0279】

６７．宿主細胞がＣＨＯ細胞である、実施形態６４又は６５に記載の方法。

【0280】

６８．実施形態６４又は６５の方法によって産生される抗体。

【0281】

６９．実施形態１から６０のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬製剤。

【0282】

７０．医薬として使用するための、実施形態１から６０のいずれか一項に記載の抗体。

【0283】

７１．血管疾患の処置における使用のための実施形態１から６０のいずれか一項に記載の抗体。

【0284】

７２．眼血管疾患の処置における使用のための実施形態１から６０のいずれか一項に記載の抗体。

【0285】

７３．医薬の製造における実施形態１から６０のいずれか１つに記載の抗体又は実施形態６５に記載の医薬組成物の使用。

【0286】

７４．血管新生を阻害するための医薬の製造における実施形態１から６０のいずれか１つに記載の抗体又は実施形態６５に記載の医薬組成物の使用。

【0287】

７５．血管疾患を有する個体を処置する方法であって、有効量の実施形態１から６０のいずれか一項に記載の抗体又は実施形態６９に記載の医薬製剤を個体に投与することを含む方法。

【0288】

７６．眼血管疾患を有する個体を処置する方法であって、有効量の実施形態１から６０のいずれか一項に記載の抗体又は実施形態６９に記載の医薬製剤を個体に投与することを含む方法。

【0289】

７７．個体における血管新生を阻害する方法であって、血管新生を阻害するために有効量の実施形態１から６０のいずれかに記載の抗体又は実施形態６９に記載の医薬製剤を個体に投与することを含む方法。

【0290】

７８．実施形態１から６０のいずれかに記載の抗体又は実施形態６９に記載の医薬製剤を含むポート送達装置。

【0291】

７９．ポート送達装置による眼投与のための実施形態１から６０のいずれかに記載の抗体又は実施形態６９に記載の医薬製剤。

【0292】

８０．投与が、ポート送達装置が補充される前の６ヶ月以上、一実施形態では８ヶ月以上、一実施形態では９ヶ月以上の期間にわたる、実施形態７９に記載のポート送達装置による眼投与のための実施形態１から６０のいずれかに記載の抗体又は実施形態６９に記載の医薬製剤。

【0293】

８１．ポート送達装置を使用して抗体又は医薬製剤を投与することによって医薬として使用するための実施形態１から６０のいずれかに記載のもの又は実施形態６９に記載の医薬製剤であって、抗体は１５０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で、一実施形態では２００ｍｇ／ｍｌ以上の濃度でポート送達装置に適用される。

【0294】

【表3】

【実施例0295】

以下の実施例は、本発明の理解を助けるために提供されており、その真の範囲は、特許請求の範囲に明記されている。本発明の要旨から逸脱することなく、記載された手順に変更を加えることができることが理解される。

【0296】

材料及び一般的方法
ヒトＶＥＧＦ－Ａ １２１親和性Ｋｉｎｅｘａ：
・ 機器及び材料：
Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）製のＫｉｎＥｘＡ ３２００機器とオートサンプラーを使用した。ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）ビーズはＳａｐｉｄｙｎｅから購入し、抗ＶＥＧＦ抗体はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した（Ｍａｂ２９３、ＢＡＦ２９３）。ストレプトアビジンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７コンジュゲートは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した（Ｓ２１３７４）。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン画分Ｖ）、ＶＥＧＦＡ－１２１（配列番号２８）を社内で調製した（Ｒｏｃｈｅ）。

【0297】

・ 抗原被覆ビーズの調製
ＰＭＭＡビーズをＫｉｎＥｘＡハンドブックのプロトコル（Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃｏａｔｉｎｇ，Ｓａｐｉｄｙｎｅ）に従ってコーティングした。最初に、１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の３０μｇの抗ＶＥＧＦ抗体ＭＡＢ２９３（Ｒ＆Ｄ）を、吸着コーティングのためのビーズのバイアル（２００ｍｇ）あたり添加した。室温で２時間回転させた後、上清を除去し、１ｍｌのブロッキング溶液（緩衝液中１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）で満たし、１時間ロックした。

【0298】

・ ＫｉｎＥｘＡ平衡アッセイ
すべてのＫｉｎＥｘＡ実験を、ランニング緩衝液として０．０１％ ＢＳＡ及び０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＢｉｏＲａｄ、＃１６１－０７８１）を含むＰＢＳ ｐＨ７．４を使用して室温（ＲＴ）で行った。試料及びビーズをＬｏｗＣｒｏｓｓ緩衝液（Ｃａｎｄｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中で調製して、以前の測定で観察された非特異的結合を減少させた。流速は０．２５ｍｌ／分とした。一定量のＶＥＧＦＡ－１２１－Ｈｉｓ（５０ｐＭ及び第２の実験では５００ｐＭ）を、４ｎＭで開始する２倍段階希釈（濃度範囲１．９５ｐＭ～４０００ｐＭ）によって試験抗体で滴定した。抗原－抗体複合体をＲＴで少なくとも８時間インキュベートして、平衡に到達させた。平衡化した混合物を、ＫｉｎＥｘＡシステム中の抗ＶＥＧＦ抗体（Ｍａｂ２９３）が結合したビーズのカラムに、５０ｐＭの一定ＶＥＧＦについては７５０μｌの容量で、５００ｐＭの一定ＶＥＧＦについては１２５μｌの容量で吸引し、溶液の平衡状態を乱すことなく未結合ＶＥＧＦＡ－１２１をビーズによって捕捉することを可能にした。２５０ｎｇ／ｍｌの濃度の二次ビオチン化抗ＶＥＧＦ抗体（ＢＡＦ２９３）を使用し、続いて、試料緩衝液中の２５０ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７コンジュゲートを注射することにより、結合したＶＥＧＦＡ－１２１を検出した。各試料を、すべての平衡実験について２連で測定した。Ｋ_Ｄは、「標準分析」法を使用して、ＫｉｎＥｘＡソフトウェア（バージョン４．０．１１）に含まれる一部位均一結合モデルを使用したデータの非線形回帰分析から得た。ソフトウェアはＫ_Ｄを計算し、データ点を理論的Ｋ_Ｄ曲線に当てはめることによって９５％信頼区間を決定する。９５％信頼区間は、Ｋ_Ｄ低及びＫ_Ｄ高として与えられる。

【0299】

最終Ｋ_Ｄ決定のために、異なる一定のＶＥＧＦＡ－１２１濃度を有する２つの測定値のｎ曲線決定を行った。ｎ曲線分析を使用して、同軸上で複数の標準Ｋ_Ｄ実験を分析して、Ｋ_Ｄのより正確な決定を得ることができる。

【0300】

ヒトＡＮＧ２親和性Ｋｉｎｅｘａ：
・ 機器及び材料
Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）製のＫｉｎＥｘＡ ３２００機器とオートサンプラーを使用した。ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）ビーズはＳａｐｉｄｙｎｅから購入し、抗Ａｎｇ２抗体はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した（ＭＡＢ０９８，ＢＡＭ０９８１）。ストレプトアビジンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７コンジュゲートは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した（Ｓ２１３７４）。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン画分Ｖ）、Ａｎｇ２（配列番号２７）を社内で調製した（Ｒｏｃｈｅ）。

【0301】

・ 抗原被覆ビーズの調製
ＰＭＭＡビーズをＫｉｎＥｘＡハンドブックのプロトコル（Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃｏａｔｉｎｇ，Ｓａｐｉｄｙｎｅ）に従ってコーティングした。最初に、１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２０μｇの抗Ａｎｇ２抗体ＭＡＢ０９８（Ｒ＆Ｄ）を、吸着コーティングのためのビーズのバイアル（２００ｍｇ）あたり添加した。室温で２時間回転させた後、上清を除去し、１ｍｌのブロッキング溶液（緩衝液中１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）で満たし、１時間ロックした。

【0302】

・ ＫｉｎＥｘＡ平衡アッセイ
すべてのＫｉｎＥｘＡ実験を、ランニング緩衝液として０．０１％ ＢＳＡ及び０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＢｉｏＲａｄ、＃１６１－０７８１）を含むＰＢＳ ｐＨ７．４を使用して室温（ＲＴ）で行った。試料及びビーズをＬｏｗＣｒｏｓｓ緩衝液（Ｃａｎｄｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中で調製して、以前の測定で観察された非特異的結合を減少させた。流速は０．２５ｍｌ／分とした。一定量のＡｎｇ２－ＲＢＤ－ｍｕＦｃ（５０ｐＭ及び第２の実験では５００ｐＭ）を、４ｎＭで開始する２倍段階希釈（濃度範囲１．９５ｐＭ～４０００ｐＭ）によって試験抗体で滴定した。抗原－抗体複合体をＲＴで少なくとも８時間インキュベートして、平衡に到達させた。平衡化した混合物を、ＫｉｎＥｘＡシステム中の抗Ａｎｇ２抗体（ＭＡＢ０９８）が結合したビーズのカラムに、５０ｐＭの一定Ａｎｇ２については７５０μｌの容量で、５００ｐＭの一定Ａｎｇ２については１８８μｌの容量で吸引し、溶液の平衡状態を乱すことなく未結合Ａｎｇ２をビーズによって捕捉することを可能にした。２５０ｎｇ／ｍｌの濃度の二次ビオチン化抗Ａｎｇ２抗体（ＢＡＭ０９８１）を使用し、続いて、試料緩衝液中の２５０ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７コンジュゲートを注射することにより、結合したＡｎｇ２を検出した。各試料を、すべての平衡実験について２連で測定した。Ｋ_Ｄは、「標準分析」法を使用して、ＫｉｎＥｘＡソフトウェア（バージョン４．０．１１）に含まれる一部位均一結合モデルを使用したデータの非線形回帰分析から得た。ソフトウェアはＫ_Ｄを計算し、データ点を理論的Ｋ_Ｄ曲線に当てはめることによって９５％信頼区間を決定する。９５％信頼区間は、Ｋ_Ｄ低及びＫ_Ｄ高として与えられる。

【0303】

最終Ｋ_Ｄ決定のために、異なる一定のＡｎｇ２濃度を有する２つの測定値のｎ曲線決定を行った。ｎ曲線分析を使用して、同軸上で複数の標準Ｋ_Ｄ実験を分析して、Ｋ_Ｄのより正確な決定を得ることができる。

【0304】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した場合のヒトＶＥＧＦ－Ａ結合動態：
抗Ｈｉｓ捕捉抗体（ａｎｔｉ－Ｈｉｓ ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ２８９９５０５６）を、標準的なアミンカップリング化学を用いてＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ Ｃ１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＢＲ１００５３５）に固定化し、約６００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度を得た。ランニングバッファー及び希釈バッファーとして、ＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ ７．４，０．０５％界面活性剤Ｐ２０）を使用した。ヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１－Ｈｉｓを表面に捕捉した結果、それぞれ約１０及び２０ＲＵのリガンド密度であった。試験抗体の段階希釈（３．７～３００ｎＭ、１：３希釈）をそれぞれ６０秒間連続して注入し、３０μｌ／ｍｉｎの流速で３６００秒間解離をモニターした（シングルサイクル動態）。５μｌ／分の流量で６０秒間、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５を注入することによって表面を再生した。バルク屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことで補正し、ヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１を捕捉していない対照フローセルから得られた応答を差し引くことで補正した。Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェア内の１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを用いて、曲線適合を行った。

【0305】

交差反応性試験のための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した場合のＶＥＧＦ－Ａ結合動態：
抗Ｈｉｓ捕捉抗体（ａｎｔｉ－Ｈｉｓ ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ２８９９５０５６）を、標準的なアミンカップリング化学を用いてＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ Ｃ１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＢＲ１００５３５）に固定化し、約６００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度を得た。ランニングバッファー及び希釈バッファーとして、ＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ ７．４，０．０５％界面活性剤Ｐ２０）を使用した。示された種由来のＶＥＧＦ－Ａ１２１－Ｈｉｓを表面に捕捉した結果、それぞれ約１０及び２０ＲＵのリガンド密度であった。試験抗体の段階希釈（３．７～３００ｎＭ、１：３希釈）をそれぞれ６０秒間連続して注入し、３０μｌ／ｍｉｎの流速で３６００秒間解離をモニターした（シングルサイクル動態）。５μｌ／分の流量で６０秒間、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５を注入することによって表面を再生した。バルク屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことで補正し、ＶＥＧＦ－Ａ１２１を捕捉していない対照フローセルから得られた応答を差し引くことで補正した。Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェア内の１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを用いて、曲線適合を行った。

【0306】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した場合のヒトＡＮＧ ２結合動態：
抗Ｆａｂ捕捉抗体（ａｎｔｉ－Ｈｉｓ ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ２８９５８３２５）を、標準的なアミンカップリング化学を用いてＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ Ｃ１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＢＲ１００５３５）に固定化し、約８００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度を得た。ランニングバッファー及び希釈バッファーとして、ＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ ７．４，０．０５％界面活性剤Ｐ２０）を使用し、測定温度は２５℃とした。試験抗体は、５０ｎＭの溶液を５μｌ／ｍｉｎの流量で６０秒間注入することによって捕捉された。３０μｌ／分（０．０７ｎＭ－５０ｎＭ、１：３希釈）の流量で１８０秒間、溶液中の様々な濃度のヒトＡｎｇ２－ＲＢＤを注射することによって会合を測定した。解離段階は、最大９００秒間モニタリングされ、３０μｌ／分の流速で試料溶液からランニングバッファーに切り替えることで誘発された。１０ｍＭグリシンｐＨ２．１を流速３０μｌ／分で６０秒間注入することによって表面を再生した。バルク屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことで補正し、試験抗体を捕捉していない参照フローセルから得られた応答を差し引くことで補正した。Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェア内の１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを用いて、曲線適合を行った。

【0307】

交差反応性試験のための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した場合のＡＮＧ２結合動態：
抗Ｆａｂ捕捉抗体（ａｎｔｉ－Ｈｉｓ ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ２８９５８３２５）を、標準的なアミンカップリング化学を用いてＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ Ｃ１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＢＲ１００５３５）に固定化し、約８００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度を得た。ランニングバッファー及び希釈バッファーとして、ＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ ７．４，０．０５％界面活性剤Ｐ２０）を使用し、測定温度は２５℃とした。試験抗体は、５０ｎＭの溶液を５μｌ／ｍｉｎの流量で６０秒間注入することによって捕捉された。３０μｌ／分（０．０７ｎＭ－５０ｎＭ、１：３希釈）の流量で１８０秒間、溶液中の様々な濃度の示された種由来のＡｎｇ２－ＲＢＤを注射することによって会合を測定した。解離段階は、最大６００秒間モニタリングされ、３０μｌ／分の流速で試料溶液からランニングバッファーに切り替えることで誘発された。１０ｍＭグリシンｐＨ２．１を流速３０μｌ／分で６０秒間注入することによって表面を再生した。バルク屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことで補正し、抗体を捕捉していない参照フローセルから得られた応答を差し引くことで補正した。Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェア内の１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを用いて、曲線適合を行った。

【0308】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による標的抗原への独立した結合の評価
捕捉システム（抗Ｆａｂ補足抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ２８９５８３２５））の約５０００レゾナンスユニット（ＲＵ）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅによって供給されるアミンカップリングキットを使用することにより、ｐＨ５．０において、ＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＢＲ－１００５－３０）に結合した。試料及び系緩衝液はＨＢＳ－Ｐ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）であった。フローセルの温度を２５℃に設定し、試料ブロックの温度を１２℃に設定した。捕捉前に、フローセルをランニングバッファーで３回プライミングした。

【0309】

６．５μｇ／ｍｌ溶液を５μｌ／分の流量で６０秒間注入することによって、二重特異性Ｆａｂを捕捉した。二重特異性Ｆａｂへの各リガンドの独立した結合を、順次又は同時に追加された（１０μｌ／分の流量）各リガンドの活性結合能を決定することによって分析した。

【0310】

１） １μｇ／ｍｌの濃度のヒトＶＥＧＦＡ－１２１を６０秒間注入する（抗原の単一結合を同定する）。

【0311】

２） ５μｇ／ｍｌの濃度のヒトＡｎｇ２を６０秒間注入する（抗原の単一結合を同定する）。

【0312】

３） １μｇ／ｍｌの濃度のヒトＶＥＧＦＡ－１２１を６０秒間注入し、続いて５μｇ／ｍｌの濃度のヒトＡｎｇ２を６０秒間追加注入する（ＶＥＧＦＡ－１２１の存在下でのＡｎｇ２の結合を同定する）。

【0313】

４） ５μｇ／ｍｌの濃度のヒトＡｎｇ２を６０秒間注入し、続いて１μｇ／ｍｌの濃度のヒトＶＥＧＦＡ－１２１を６０秒間追加注入する（Ａｎｇ２の存在下でのＶＥＧＦＡ－１２１の結合を同定する）。

【0314】

５） １μｇ／ｍｌの濃度のヒトＶＥＧＦＡ－１２１及び５μｇ／ｍｌの濃度のヒトＡｎｇ２の６０秒間の同時注入（ＶＥＧＦＡ－１２１とＡｎｇ２の結合を同時に同定する）。

【0315】

１０ｍＭグリシンｐＨ２．１を流速３０μｌ／分で６０秒間注入することによって表面を再生した。バルク屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことで補正し、二重特異性Ｆａｂを捕捉していない参照フローセルから得られた応答を差し引くことで補正した。手法３、４、及び５の結果として得られる最終シグナルが、手法１及び２の個々の最終シグナルの合計に等しい場合、二重特異性抗体は、両方の抗原を互いに独立して結合することができる。

【0316】

熱安定性
二重特異性抗体Ｆａｂフラグメントの試料を、２０ｍＭヒスチジン／塩化ヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中、１ｍｇ／ｍＬの濃度で調製し、１０μＬマイクロキュベットアレイに移した。試料を３０℃から９０℃まで０．１℃／分の速度で加熱しながら、ＵＮｃｌｅ機器（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ）を使用して、静的光散乱データ並びに２６６ｎｍレーザーで励起した際の蛍光データを記録する。サンプルを３連で測定した。

【0317】

開始温度の評価は、ＵＮｃｌｅ分析ソフトウェアによって行った。凝集開始温度は、散乱光強度が増加し始める温度であると定義される。タンパク質の変性を、熱に対する蛍光シグナルの重心平均（ＢＣＭ）のシフトによってモニターした。融解温度は、温度曲線に対するＢＣＭ（ｎｍ）の変曲点として定義される。

【0318】

物理化学的安定性：
抗体試料を２０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨｉｓＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０中に製剤化し、３つのアリコートに分割して、一方のアリコートをそれぞれＰＢＳ中に再緩衝化し、２つのアリコートを元の製剤中に維持した。ＰＢＳアリコート及び１つのＨｉｓ／ＨｉｓＣｌアリコートを１ｍｇ／ｍｌ中４０℃（Ｈｉｓ／ＮａＣｌ）又は３７℃（ＰＢＳ）で２週間（２ｗ）インキュベートし、ＰＢＳ試料をさらに合計４週間（４ｗ）インキュベートした。第三の対照アリコート試料を－８０℃で保存した。インキュベーションが終了した後、試料を相対活性濃度（Ｂｉａｃｏｒｅ；両方のストレスを受けたアリコートの各結合剤の活性濃度は、ストレスを受けていない４℃のアリコートに対して正規化される）、凝集（ＳＥＣ）及びフラグメント化（キャピラリー電気泳動又はＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＣＥ－ＳＤＳ）について分析し、未処理対照と比較した。

【0319】

機能安定性試験のためにＳＰＲによって評価されたヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２結合動態
ＶＥＧＦＡ－１２１（社内）、プロテインＡ（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ２１１８１）及び抗ヒトＦａｂ捕捉抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ２８９５８３２５）を、標準的なアミンカップリング化学反応を使用してＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ２９１０４９８８）に異なるフローセル上に固定化し、その結果、ｈＶＥＧＦＡ－１２１及びプロテインＡについては３０００の表面密度及び抗ヒトＦａｂ捕捉抗体については１２０００の共鳴単位（ＲＵ）が得られた。ランニングバッファー及び希釈バッファーとして、ＨＢＳ－Ｎ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。以下の濃度測定のための試料及びランニングバッファーは、ＨＢＳ－Ｐ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．０５％界面活性剤Ｐ２０；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）であった。フローセルの温度を２５℃に設定し、試料ブロックの温度を１２℃に設定した。濃度測定の前に、フローセルをランニングバッファーで２回プライミングした。まず、ヒトＡｎｇ２－ＲＢＤ－ｈＦｃ二量体を、１０μｇ／ｍｌ溶液を１０μｌ／分の流量で１２０秒間注入することによって捕捉した。試験した抗体を、１μｇ／ｍｌの濃度で５μｌ／分の流速で６０秒間溶液に注入した。解離段階は、最大３０秒間モニタリングされ、試料溶液からランニングバッファーに切り替えることで誘発された。

【0320】

３０μｌ／分の流速で１０ｍＭグリシンｐＨ２．０溶液で３０秒間洗浄することによって、ｈＶＥＧＦＡ－１２１表面を再生した。３０μｌ／分の流速で１０ｍＭグリシンｐＨ１．５溶液で３０秒間洗浄することによって、プロテインＡ表面を再生した。最後に、１０ｍＭグリシンｐＨ２．１溶液を流速３０μｌ／分で６０秒間洗浄することによって、抗ヒトＦａｂ抗体表面を再生した。

【0321】

ブランク表面から得られた応答を差し引くことにより、バルク屈折率の差異を補正した。評価のために、結合応答を得た。

【0322】

相対活性濃度は、各温度ストレスを加えられた試料を、対応するストレスを加えられていない試料に対して参照することにより計算した。

【数1】

抗原の結合シグナルを正規化するために、ｈＶＥＧＦ－Ａ１２１結合及びＡｎｇ２結合を、抗体試料のその抗Ｆａｂ結合に対して正規化した：

【数2】

【0323】

実施例１：
二重特異性抗ＶＥＧＦ－Ａ／抗ＡＮＧ２ Ｆａｂフラグメントの作製
二重特異性抗ＶＥＧＦ－Ａ／抗ＡＮＧ２ Ｆａｂフラグメントは、ＶＥＧＦ－Ａ及びＡＮＧ２に結合する単一特異性抗体の独立したスクリーニング、及びその後のＶＥＧＦ－Ａ及びＡＮＧ２に結合するＦａｂフラグメントを形成するバイパラトピックＨＣ／ＬＣ対へのアミノ酸配列の併合によって、例えば国際公開第２０１２／１６３５２０号に記載されている方法によって生成された。

【0324】

合成Ｆａｂフラグメントの２つの異なるファージディスプレイライブラリーを利用し、第１のファージディスプレイライブラリーでは、ＦａｂフラグメントのＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ２領域内の残基が多様化しており、第２のファージディスプレイライブラリーでは、ＦａｂフラグメントのＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ３及びＣＤＲ－Ｈ２領域内の残基が多様化していた。各ライブラリーにおいて、他の３つのＣＤＲ領域は不変ダミー配列として多様化されないままであった。両方のライブラリーにおいて、ファージディスプレイを促進するために、ＦａｂフラグメントのＣＨ１ドメインをリンカーを介して切断型遺伝子－ＩＩＩタンパク質に融合した。

【0325】

ファージライブラリーパニングによって、第１のライブラリーをヒトＡＮＧ２に対する結合剤について濃縮し、第２のライブラリーをヒトＶＥＧＦ－Ａに対する結合剤について濃縮した。パニング後、ファージミドベクターの両方の濃縮プールについてプラスミドミニプレップを作製した。ミニプレップを制限酵素で消化して、切断型遺伝子－ＩＩＩタンパク質をコードする領域を切り出し、ライゲーションによって再環状化して、それぞれＡＮＧ２結合剤又はＶＥＧＦ－Ａ結合剤が濃縮された可溶性Ｆａｂフラグメントをコードする発現ベクターのプールを得た。これらのベクタープールをＴＧ１大腸菌細胞に形質転換し、個々のコロニーを採取し、マイクロタイタープレートにおける個々のＦａｂクローンの可溶性発現のために培養した。可溶性Ｆａｂフラグメントを含む上清を、標準的なＥＬＩＳＡ法を使用してＡＮＧ２又はＶＥＧＦ－Ａへの結合についてスクリーニングし、特異的結合剤を産生するＴＧ１クローンをＤＮＡプラスミド調製及び配列決定に供して、それぞれＡＮＧ２又はＶＥＧＦ－Ａのいずれかに特異的に結合するＶＨ及びＶＬ配列の対を得た。

【0326】

二重特異性抗ＶＥＧＦ－Ａ／抗ＡＮＧ２のＶＨ及びＶＬ配列の対を、（１）ＡＮＧ２特異的ＦａｂのＶＨ配列中の無関係なＶＨ残基５２ｂ～６５をＶＥＧＦ－Ａ特異的Ｆａｂの選択されたＶＨ残基５２ｂ～６５で置換し、その結果、潜在的にＶＥＧＦ－Ａ特異的パラトープの一部であるＣＤＲ－Ｈ２残基をＡＮＧ２結合剤重鎖に置換すること、及び（２）ＶＥＧＦ－Ａ特異的ＦａｂのＶＬ配列中の無関係なＶＬ残基４９～５７をＡＮＧ２特異的Ｆａｂの選択されたＶＬ残基４９～５７で置換し、その結果、潜在的にＡＮＧ２特異的パラトープの一部であるＣＤＲ－Ｌ２残基をＶＥＧＦ－Ａ結合剤軽鎖に置換することによって、インシリコで設計した。

【0327】

実施例２：
二重特異性抗ＶＥＧＦ－Ａ／抗ＡＮＧ２ ＦａｂフラグメントＰ１ＡＡ８９０６の発現
得られた二重特異性抗ＶＥＧＦ－Ａ／抗ＡＮＧ２のＶＨ及びＶＬ配列の設計された対を合成し、ＣＨ１及びＣｋａｐｐａドメインをコードする遺伝子配列とインフレームで大腸菌発現ベクターにクローニングした。ベクターをＴＧ１大腸菌細胞に形質転換し、二重特異性抗体Ｆａｂフラグメントの可溶性発現のために個々のコロニーを培養した。ＴＧ１培養上清からアフィニティークロマトグラフィにより二重特異性抗体を精製し、ＡＮＧ２及びＶＥＧＦ－Ａの両方に対する特異的結合を検証した。

【0328】

二重特異性抗ＶＥＧＦ－Ａ／抗ＡＮＧ２抗体「Ｐ１ＡＡ８９０６」を選択し、配列番号９の重鎖と配列番号１０の軽鎖とを特徴とする。

【0329】

さらなる分析のために、本発明の抗ＶＥＧＦ－Ａ／抗ＡＮＧ２抗体を、標準的な組換え方法によってＣＨＯ細胞に形質転換して発現させた。

【0330】

実施例３：
二重特異性抗ＶＥＧＦ－Ａ／抗ＡＮＧ２ ＦａｂフラグメントＰ１ＡＡ８９０６の特徴付け
二重特異性抗体Ｐ１ＡＡ８９０６の結合親和性を、「材料及び一般的方法」のセクションで上記したようにＳＰＲ及びＫｉｎＥｘＡによって評価した。

【0331】

【表4】

【0332】

ＫｉｎＥｘＡ分析を以下の条件下で行った：ＶＥＧＦ－Ａ－１２１濃度：１００ｐＭ／１０００ｐＭ（ＣＢＰ）、Ｐ１ＡＡ８９０６ ４ｎＭ－０ｐＭ（１：２希釈、１２倍）、プレインキュベーション時間ＲＴで約８時間。

【0333】

【表5】

【0334】

ＫｉｎＥｘＡ分析を以下の条件下で行った：ＶＥＧＦ－Ａ－１２１濃度：１００ｐＭ／１０００ｐＭ（ＣＢＰ）、Ｐ１ＡＡ８９０６ ４ｎＭ－０ｐＭ（１：２希釈、１２倍）、プレインキュベーション時間ＲＴで約８時間。

【0335】

二重特異性抗体Ｐ１ＡＡ ８９０６の熱安定性を、「材料及び一般的方法」のセクションで上記したように評価した。

【0336】

【表6】

【0337】

二重特異性抗体Ｐ１ＡＡ ８９０６の物理化学的安定性を、「材料及び一般的方法」のセクションで上記したように評価した。

【0338】

【表7】

【0339】

【表8】

【0340】

実施例４：
二重特異性抗ＶＥＧＦ－Ａ／抗ＡＮＧ２ ＦａｂフラグメントＰ１ＡＡ８９０６の改善
上記のように、Ｐ１ＡＡ８９０６は、高い熱安定性及びＶＥＧＦ－Ａに対する有利な親和性を示しながら、ナノモル範囲でのＡＮＧ２に対する親和性、並びにストレス下で増加する高分子量不純物を形成する傾向を示す。眼への治療薬の注入を必要とする眼血管疾患の処置のために、治療効果の持続性を高め、患者にとっての不都合を最小限に抑えるために、標的抗原に対する高い親和性及び非常に高い濃度で治療薬を提供することが望ましい。したがって、意図された目的のために、親和性を高め、物理化学的安定性を改善することが望ましい。

【0341】

その結果、臨床適用のために、抗体は、例えばＡＮＧ２結合に関して、さらなる改善（特にｏｆｆ－ｒａｔｅを改善することによる）、及びストレスに対する感受性の低減を必要とした。ＶＨ及びＶＬドメインに異なるアミノ酸置換を導入することによって、数回の成熟を行った。熟成中、抗体Ｐ１ＡＡ８９０６に由来する候補抗体をスクリーニングし、収率、親和性、同時抗原結合、親水性、安定性、粘度及び他のパラメータに関するそれらの所望の特性に基づいて選択した。

【0342】

改善された候補抗体Ｐ１ＡＡ０９０２を、複数の試験された候補抗体分子から選択した。この分子から開始して、ＶＨ及びＶＬドメインに異なるアミノ酸置換を再度導入することによって、さらなる最適化ラウンドを行った。候補選択は、他の有利な特性、例えばＶＥＧＦ－Ａ親和性、同時抗原結合及び熱安定性を維持しながら、その所望の特性、特にＡＮＧ２結合の改善及び高濃度での注射可能性の保証に基づいた。

【0343】

さらに改善された候補抗体Ｐ１ＡＤ９８２０を、複数の試験された候補抗体分子から選択した。

【0344】

【表9】

【0345】

図２及び図３は、生成された二重特異性フラグメントの可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインのアラインメントを示す。ＶＨ及びＶＬドメイン内のアミノ酸位置のナンバリングは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従う。簡単にするために、ナンバリングを図に含め、フレームワーク及びＣＤＲアミノ酸位置をさらに例示する。

【0346】

候補抗体を実施例２に記載のように発現させた。

【0347】

実施例５：
改善された抗ＶＥＧＦ－Ａ／抗ＡＮＧ２ Ｆａｂフラグメントの抗原結合速度論
候補抗体についてのヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に対する結合速度論を、示されたＦａｂフラグメント（表４に示されるアミノ酸配列）を使用して上記のように評価した。本発明の抗体の抗原結合動態を先行技術の分子であるファリシマブ（ＩＮＮ、以前はＲＧ７７１６とも呼ばれていた）、抗ＶＥＧＦ結合剤アフリベルセプト（ＩＮＮ）、及びブロルシズマブ（ＩＮＮ）、及び抗ＡＮＧ２結合剤ネスバクマブ（ＩＮＮ）と比較するために、前述の先行技術の抗体を、それぞれのＩＮＮに開示されている同一のアミノ酸配列の組換え発現によって調製した。参照分子は、本明細書では、それらがインハウス調製物であったことを強調するために「類似体」とも呼ばれる。

【0348】

【表10】

【0349】

【表11】

【0350】

【表12】

【0351】

【表13】

【0352】

【表14】

【0353】

【表15】

【0354】

ヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２に対する候補抗体の独立した結合を、「材料及び一般的方法」のセクションで上記したようにＳＰＲによって分析した。

【0355】

【表16】

【0356】

他の種由来のＶＥＧＦ－Ａ及びＡＮＧ２に対する交差反応性を、「材料及び一般的方法」のセクションに上述したように評価した。

【0357】

【表17】

【0358】

【表18】

【0359】

実施例６
改善された抗ＶＥＧＦ－Ａ／抗ＡＮＧ２ Ｆａｂフラグメントの熱安定性
示された二重特異性抗体の熱安定性を、「材料及び一般的方法」のセクションにおいて上記で記載されるように、実施例３の場合と同じ条件下で評価した。

【0360】

【表19】

【0361】

実施例７：
改善された二重特異性抗ＶＥＧＦ－Ａ／抗ＡＮＧ２ Ｆａｂフラグメントの生物物理学的特性（安定性）
示された二重特異性抗体の物理化学的安定性を、「材料及び一般的方法」のセクションにおいて上記で記載されるように、実施例３の場合と同じ条件下で評価した。

【0362】

【表20】

【0363】

実施例８：
改善された二重特異性抗ＶＥＧＦ－Ａ／抗ＡＮＧ２ Ｆａｂフラグメントの生物物理学的特性（動的光散乱（ＤＬＳ）による粘度評価）
前述のＰ１ＡＡ０９０２及びＰ１ＡＤ９８２０ Ｆａｂフラグメントを、標準的な方法によって大腸菌細胞で発現させた。

【0364】

粘度は、前述のようにラテックス－ビーズＤＬＳ法を用いて測定した（Ｈｅ Ｆ ｅｔ ａｌ．；Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１０ Ａｐｒ １；３９９（１）：１４１－３）。具体的には、示された材料を使用して以下のプロトコルに従った。

【0365】

粘度評価：
機器及び材料
・ Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅマイクロプレートを備えたＷｙａｔｔ ＤＬＳプレートリーダー
・ ３０００ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ（商標）サイズ規格（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒカタログ－番号３３００Ａ）
・ Ｔｗｅｅｎ２０（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１３３２４６５００１）及びシリコーン油、例えば（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒカタログ番号Ａ１２７２８）
・ 濃度決定のためのＵＶ光度計（例えば、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ８０００）。

【0366】

サンプル調製
抗体試料を再緩衝化し、２０ｍＭ Ｈｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ６．０（緩衝液）及び０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０（最終濃度）で希釈した。０．０３％固形分のビーズ濃度を添加した。少なくとも４つの異なる濃度を調製し、可能な限り最高濃度は約２００ｍｇ／ｍＬであった。抗体を含まない対照として２つのブランク試料が必要であった：１つは水に再懸濁したナノスフェアビーズを含み、もう１つは緩衝液に再懸濁したナノスフェアビーズを含む。試料をマイクロプレートに移し、各ウェルをシリコーン油で覆った。

【0367】

Ｗｙａｔｔ ＤＬＳプレートリーダーによる測定
すべての試料及びブランクを、１５℃～３５℃の異なる温度で５℃ステップで分析した。取得時間は３０秒であり、取得数は試料及び温度あたり４０であった。

【0368】

データ解析
ｎｍ単位の生データＤａｐｐ（見かけの半径）をソフトウェアテンプレート（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ７．０以上）の概要に示した。粘度は、式（ηｒｅａｌ＝Ｄａｐｐ＊ηＨ２Ｏ／Ｄｒｅａｌ）を用いて算出した。Ｄｒｅａｌはブランク試料で測定されたビーズサイズであり、これはビーズサイズ（３００ｎｍ）に等しい。計算した粘度をエクセル曲線で示した。ムーニー曲線フィット（Ｅｘｃｅｌ）を用いて、所与の濃度で粘度を外挿することが可能である。ここで、粘度が２０ｃＰを超える場合の最大タンパク質濃度を算出した。

【0369】

２０℃で２０ｃＰの粘度を達成するための示された抗体の最大濃度を以下に示す。結果を図１０にも示す。

【0370】

【表21】

【0371】

結果は、本発明の抗体が、注射可能性のための許容され得る粘度限界未満の粘度を含む高濃度で製剤化され得ることを示す。両方の試験された抗体が高度に濃縮可能であることが示されているが、その効果はＰ１ＡＤ９８２０抗体においてより顕著である。

【0372】

結果として、本発明の抗体は、制限された注射体積で高モル用量を提供することを可能にするので、眼用途に非常に適しており、これは、高い効力と組み合わせた場合、高い耐久性をもたらし、その結果、投与頻度を低下させ、これは、患者側の困難を軽減するために望ましい。

【0373】

別の一連の実験において、標準的な組換え方法に従ってＣＨＯ細胞中で生成されたＰ１ＡＤ９８２０の粘度を上記のように分析した。

【0374】

２０℃で２０ｃＰの粘度を達成するための示された抗体の最大濃度を以下に示す。結果を図１０にも示す。

【0375】

【表22】

【0376】

実施例９：
改善された抗ＶＥＧＦ－Ａ／抗ＡＮＧ２ Ｆａｂフラグメントの機能的安定性
Ｐ１ＡＤ９８２０ Ｆａｂフラグメントを、「材料及び一般的方法」のセクション（物理化学的安定性）で上述したように異なるストレス条件下で処理した。得られたストレス負荷抗体試料の抗原結合を上記のように分析した（「材料及び一般的方法」のセクション：機能安定性試験のためにＳＰＲによって評価されたヒトＶＥＧＦ－Ａ及びヒトＡＮＧ２結合動態）。

【0377】

【表23】

【0378】

実施例１０：
改善された抗ＶＥＧＦ－Ａ／抗ＡＮＧ２ Ｆａｂフラグメントの機能的特徴付け
候補抗体のＡＮＧ２及びＶＥＧＦ－Ａ阻害を細胞ベースのアッセイで評価した：
ＡＮＧ２阻害：ｐＴｉｅ２－アッセイ
候補抗体及び選択された参照分子（配列番号２９及び３０による組換え発現によるインハウス調製物のネスバクマブ類似体）を、ＭＥＭ Ａｌｐｈａ－Ｍｅｄｉｕｍ中２５０ｎＭ～０．１４ｎＭの範囲の１１の濃度でプレインキュベートした。４０μｌ中の３倍濃縮抗Ａｎｇ２抗体を、３倍濃縮ｃ＝３．９μｇ／ｍｌで４０μｌのＡｎｇ－２と混合し、細胞インキュベーター内で３０分間インキュベートした。次いで、ウェルあたり４００００細胞の密度で選択せずにＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地に懸濁した４０μｌ／ウェルのＨｅｋ２９３＿ＨＯＭＳＡ－Ｔｉｅ２－Ｃｌｏｎｅ２２＿Ｂ１１細胞を室温で１０分間添加した。次いで、プロテアーゼ阻害剤を含む冷溶解緩衝液の添加によってＡｎｇ２リン酸化を停止した。次いで、ｍａｘｉｓｏｒｐ－プレートに結合した抗Ｔｉｅ２抗体によって、細胞溶解物からＴｉｅ２を、振盪しながら室温で９０分間固定化した。ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０での洗浄工程の後、リン酸化Ｔｉｅ２に特異的なビオチン化抗体をＲＴで１時間、３μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。３回の洗浄工程の後、ＨＲＰ結合ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎｅ）を最終濃度１００ｍＵ／ｍｌまで添加し、Ｔｅｃａｎ Ｓｕｎｒｉｓｅプレートリーダーを用いて４０５／６９０ｎｍで１Ｍ Ｈ２ＳＯ２による停止後、最終測色エンドポイント評価のために常温で３０分間ＰＯＤ変換した（ｗｉｃｈ ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ ＰＯＤ）。結果を以下及び図８に示す。

【0379】

【表24】

【0380】

ＶＥＧＦ－Ａ阻害：レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）
アッセイのために、３７．５μｌの４倍濃縮試験抗体又は参照分子を、４倍濃縮３７．５μｌのＶＥＧＦ－Ａ１２１（Ｒ＆Ｄ、ｃ＝１００μｇ／ｍｌ）と共に室温で１５分間プレインキュベートした。次いで、混合物を、４００００細胞／ウェルの密度で７５μｌ／ウェルのＨｅｋ＿ＮＦＡＴ＿ＫＤＲ＿Ｌｕｃ細胞に添加し、細胞インキュベーター内で５時間インキュベートした。最後に、ウェルあたり１００μｌのＢｉｏＧｌｏ試薬を添加した後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｐｒｏ Ｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ）を使用して発光を評価した。結果を以下及び図７に示す。

【0381】

【表25】

【0382】

実施例１１：
ｈＶＥＧＦ－Ａ１２１及びｈＶＥＧＦ－Ａ１６５のブロッキング活性（ＶＥＧＦベースラインアッセイ）
Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃４４２４０４）を、１μｇ／ｍＬの最終濃度で室温で１時間、２００ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、ｐＨ９．４中の５０μＬ／ウェルのｈＶＥＧＦＲ－１－Ｆｃでコーティングした。示されている候補Ｆａｂフラグメントを、２８０μＬのＰＢＳＴ－１％ＢＳＡ中４０９．６ ｎＭの濃度に希釈した。２倍段階希釈では、この希釈Ｆａｂ試料１４０μＬを、１４０μＬのＰＢＳＴ－１％ＢＳＡと混合し、穏やかなピペッティングによって７回混合した。この２倍希釈工程をさらに９回繰り返した。丸底９６ウェルプレートに、ＰＢＳＴ－１％ＢＳＡ中の２ｎＭ ＶＥＧＦ－Ａ１２１又は２ｎＭ ＶＥＧＦ－Ａ１６５を５０μＬ／ウェルで予め充填した。５０μＬのＦａｂ希釈液をＶＥＧＦプレートに添加し、６回混合し、１．５時間インキュベートした。続いて、ｍａｘｉｓｏｒｐプレートをＰＢＳＴで２回洗浄した後、２００μＬの２％ ＭＰＢＳＴを添加し、続いて室温で４５分間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴで２回洗浄した。５０μｌのＦａｂ－ＶＥＧＦプレミックスをＭａｘｉｓｏｒｐプレートに移し、室温で１．５時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳＴで２回洗浄し、５０μＬの抗ＶＥＧＦ－バイオ抗体（ＰＢＳＴで１：２０００希釈）及びＳＡ－ＨＲＰ（ＰＢＳＴで１：２０００希釈）を添加し、室温で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで６回洗浄し、５０μＬのＴＭＢ基質溶液を添加し、室温で３０分間インキュベートした。最後に、５０μＬの１Ｎ硫酸を添加して反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を読み取る。結果を図５及び図６に示す。

【0383】

実施例１２：
ＡＮＧ１に対するＡＮＧ２の選択的結合
Ａｎｇ－１に対するＡｎｇ－２の選択性は、眼の安全性にとって重要な属性であり得る：Ｐ１ＡＤ９８２０ ＦａｂのＡＮＧ１阻害を細胞ベースのアッセイで評価した。

【0384】

ＡＮＧ－１は、飢餓条件下で増殖させたＨＵＶＥＣの生存率のわずかな誘導物質である。したがって、ＡＮＧ－１中和抗体で生存率を阻害することができる。抗体ＲＯ５３１４１９６（以前はＬＣ－０８－Ｔｈｏｍａｓ Ｍ，Ｋｉｅｎａｓｔ Ｙ，Ｓｃｈｅｕｅｒ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－２ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒａｌ ａｎｄ ａｎｔｉ－ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｓｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔ ｐｒｏｆｉｌｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ Ｐａｎ－Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－１／－２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３；８（２）：ｅ５４９２３．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５４９２３）は、ＡＮＧ－１を中和することによってＨＵＶＥＣ生存率を阻害し、アッセイの陽性対照として使用した。Ｇｉｂｃｏ製のＡＦ（付着因子）（カタログ番号Ｓ－００６－１００）でコーティングされたＣｏｒｎｉｎｇ製の細胞培養フラスコＴ１６２（カタログ番号３１５１）を、第５継代までＨＵＶＥＣを維持するために使用した。生存率アッセイのために、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を用いてＨＵＶＥＣを剥離し、続いてＰＢＳ－／－を用いて洗浄工程を行った。その後、細胞を、フィブロネクチンでコーティングされた９６ウェルプレート上の０．５％ ＦＢＳを含むＥＢＭ－２に、１００μｌ中１０．０００細胞／ウェルの細胞密度で播種した。細胞を３７℃、５％ ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、Ｐ１ＡＤ９８２０又はＡｎｇ－１結合陽性対照ＲＯ５３１４１９６をＥＢＭ／０．５％ ＦＢＳで希釈して、１０倍の作業濃度にした。開始濃度は１０００μｇ／ｍｌであり、続いて３倍８段階希釈系列で４５７．２μｇ／ｍｌで終了した。ＡＮＧ－１を、２４００ｎｇ／ｍｌに相当する２０倍の作業濃度に設定した。次に、１０μｌの１０倍予備希釈したＰ１ＡＤ９８２０、続いて５μｌの２０ｘＡＮＧ－１溶液をプレートあたり４連ウェルで細胞に添加した。各実験日に、各条件を二連のプレートで実施した。細胞を３７℃、５％ ＣＯ２で７２時間インキュベートした。分析のために、１１μｌのａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）を各ウェルに添加し、続いて細胞培養インキュベーター内で４時間インキュベートした。６００ｎｍの参照波長を用いて５７０ｎｍで吸光度を検出した。

【0385】

各実験について、各条件を四連で実施した２つのアッセイプレートを使用して条件を複製した。刺激されていない細胞のバックグラウンドシグナルを実験ウェルから差し引いて、条件ごとの平均シグナルを計算した。１００％応答レベルを、追加の処理なしでＡＮＧ－１（１２０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した細胞から計算し、抗体処理ウェルからのシグナルを１００％応答の阻害率として表した。Ｐ１ＡＤ９８２０及びＲＯ５３１４１９６については、各抗体処理に対する阻害率をｎ＝４の独立した実験で測定し、平均及び平均の標準誤差を計算した。ＩＣ_５０値を、ＥｘｃｅｌＸＬｆｉｔソフトウェア（ＩＤＢＳ）を使用して各抗体濃度についての平均データから計算した。濃度－応答曲線を、基礎阻害活性及び最大阻害活性に対して計算された５パラメーターロジスティックモデル（Ａ＋（（Ｂ－Ａ）／（１＋（（Ｃ／ｘ）＾Ｄ））））を使用して非線形回帰分析によってフィッティングした。

【0386】

細胞ベースのアッセイは、Ｐ１ＡＤ９８２０によって媒介されるＡＮＧ１阻害を検出しなかった。

【0387】

実施例１３：
Ｐ１ＡＤ９８２０ Ｆａｂフラグメントの構造解析
Ｐ１ＡＤ９８２０ Ｆａｂの構造分析を、以下のようにＸ線結晶学によって行った：
三元複合体アンジオポエチン２－ＲＢＤ－ＶＥＧＦ－Ａ１２１－Ｐ１ＡＤ９８２０の複合体形成及び精製。複合体形成のために、Ｐ１ＡＤ９８２０ ＦａｂとヒトＶＥＧＦ－Ａ１２１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を１．１：１のモル比で混合した。４℃で４５分間インキュベートした後、アンジオポエチン２－ＲＢＤを、Ｐ１ＡＤ９８２０に対するモル比１．２５：１で添加し、続いて４℃でさらに６０分間インキュベートした。得られた三元複合体をＰＮＧａｓｅＦ（ＮＥＢ）で３７℃にて１３時間さらに脱グリコシル化し、最終工程においてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（１６／６００）カラムでのゲルろ過クロマトグラフィによって精製した。三元複合体を含有する画分をプールし、３．５５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。

【0388】

三元アンジオポエチン２－ＲＢＤ－ＶＥＧＦ－Ａ１２１－Ｐ１ＡＤ９８２０の結晶化。最初の結晶化試験は、２１℃のシッティングドロップ型蒸気拡散装置を用いて、タンパク質濃度１４．５ｍｇ／ｍｌで行った。結晶は３５％ ＭＰＤ、０．１Ｍリン酸Ｎａ／Ｋ ｐＨ６．２の外に、１日以内に出現した。プレート状の結晶は１週間で成長し、最終的なサイズは１００ｘ８０ｘ３０μｍになった。この結晶は、さらなる最適化の手順を踏むことなく、スクリーニングプレートから直接採取した。

【0389】

データ収集と構造決定。データ収集のために、結晶を追加の凍結保護剤なしで沈殿剤溶液中１００Ｋでフラッシュ冷却した。回折データは、Ｓｗｉｓｓ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（スイス・ビリゲン）のビームラインＸ１０ＳＡにおいて、ＰＩＬＡＴＵＳ ６Ｍ検出器を用いて波長１．００００Åで収集した。データはＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ，Ｗ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６６，１３３－１４４（２０１０））で処理され、ＳＡＤＡＢＳ（ＢＲＵＫＥＲ）でスケーリングされている。結晶は空間群Ｃ２に属し、セル軸はａ＝１６５．７４Å、ｂ＝９０．２７Å、ｃ＝１２７．８９Å、β＝１１２．０５°で、２．０８Åの分解能で回折している。構造は、探索モデルとしてＡｎｇ２－ＶＥＧＦ－Ｆａｂ三元複合体の関連するインハウス構造の座標を使用して、ＰＨＡＳＥＲでの分子置換（ＭｃＣｏｙ，Ａ．Ｊ，Ｇｒｏｓｓｅ－Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ，Ｒ．Ｗ．，Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．，Ｓｔｏｒｏｎｉ，Ｌ．Ｃ．，ａｎｄ Ｒｅａｄ，Ｒ．Ｊ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．４０，６５８－６７４（２００７））によって決定した。ＣＣＰ４スイート（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｎｕｍｂｅｒ ４ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５０，７６０－７６３（１９９４））及びＢｕｓｔｅｒ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ，Ｇ．，Ｂｌａｎｃ，Ｅ．，Ｂｒａｎｄｌ，Ｍ．，Ｆｌｅｎｓｂｕｒｇ，Ｃ．，Ｋｅｌｌｅｒ，Ｐ．，Ｐａｃｉｏｒｅｋ，Ｗ．，Ｒｏｖｅｒｓｉ，Ｐ．，Ｓｈａｒｆｆ，Ａ．，Ｓｍａｒｔ，Ｏ．Ｓ．，Ｖｏｎｒｈｅｉｎ，Ｃ．，Ｗｏｍａｃｋ，Ｔ．Ｏ．（２０１１）．Ｂｕｓｔｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．９．５ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ：Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ Ｌｔｄ）からのプログラムを使用して、その後データを改良した。差動電子密度を用いたタンパク質の手動による再構築はＣＯＯＴを用いて行った（Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．，Ｌｏｈｋａｍｐ，Ｂ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｗ．Ｇ．ａｎｄ Ｃｏｗｔａｎ，Ｋ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ Ｄ６６，４８６－５０１（２０１０））。両構造体のデータ収集と精密化の統計を表２３にまとめた。グラフィック表示はすべて、ＰＹＭＯＬ（ＤｅＬａｎｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，２００２）で作成した。

【0390】

【表26】

【0391】

それぞれの抗原ＶＥＧＦ－Ａ及びＡＮＧ２と接触しているアミノ酸残基を、三元複合体アンジオポエチン２－ＲＢＤ－ＶＥＧＦ－Ａ１２１－Ｐ１ＡＤ９８２０の結晶構造から同定した。ＶＨ及びＶＬドメイン内のパラトープアミノ酸残基の位置の例示を図２及び図３に示す。

【0392】

抗原結合に寄与すると同定されたアミノ酸残基を表２４（可変重鎖ドメインアミノ酸残基について）及び表２５（可変軽鎖ドメインアミノ酸残基について）に同定する。アミノ酸位置は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従ってナンバリングされる（図２及び図３において同じナンバリングが使用される）。抗原結合に関与するアミノ酸位置は、ＶＨ又はＶＬドメイン中のそれらのＫａｂａｔ位置によって同定される（図２及び図３のナンバリングも参照）。

【0393】

【表27】

【0394】

【表28】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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【外国語明細書】