特開 2022-191783 呼気凝縮液をサンプルとするウイルス検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022191783

(43)【公開日】2022-12-28

(54)【発明の名称】呼気凝縮液をサンプルとするウイルス検出方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/569 20060101AFI20221221BHJP

   G01N 33/497 20060101ALI20221221BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20221221BHJP

   C12Q 1/70 20060101ALN20221221BHJP

【ＦＩ】

G01N33/569 G

G01N33/497 A

G01N33/543 521

G01N33/569 J

G01N33/569 K

G01N33/569 L

C12Q1/70

【審査請求】未請求

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021100228

(22)【出願日】2021-06-16

(71)【出願人】

【識別番号】521264615

【氏名又は名称】株式会社ドーン

(74)【代理人】

【識別番号】100137338

【弁理士】

【氏名又は名称】辻田 朋子

(74)【代理人】

【識別番号】100196313

【弁理士】

【氏名又は名称】村松 大輔

(72)【発明者】

【氏名】濱田 誠輝

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G045AA28

2G045BA13

2G045BB03

2G045CB21

2G045CB22

2G045FB03

2G045JA07

4B063QA18

4B063QQ10

4B063QR48

4B063QR79

4B063QS33

4B063QS39

4B063QX01

(57)【要約】

【課題】ウイルス検出のための新規の技術を提供することを課題とする。
【解決手段】呼気凝縮液をサンプルとして抗原検査法によってウイルスを検出する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

呼気凝縮液をサンプルとして抗原検査法によってウイルスを検出することを特徴とする、ウイルス検出方法。

【請求項2】

前記抗原検査法が、ウイルス抗原を特異的に認識する抗体を用いるイムノクロマト法であることを特徴とする、請求項１に記載のウイルス検出方法。

【請求項3】

前記抗原検査法が、活性ウイルスを検出する方法であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のウイルス検出方法。

【請求項4】

前記ウイルスが、呼吸器感染症の病原ウイルスであることを特徴とする、請求項１～３の何れか一項に記載のウイルス検出方法。

【請求項5】

前記ウイルスが、ＲＳウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ハンタウイルス、風疹ウイルス、麻しんウイルス、ヒトメタニューモウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルスから選ばれることを特徴とする、請求項１～４の何れか一項に記載のウイルス検出方法。

【請求項6】

請求項１～５の何れか一項に記載のウイルス検出方法に用いるための検出キットであって、
呼気から呼気凝縮液を調製する呼気凝縮液収集用デバイスと、ウイルス抗原を検出するための抗原検査用デバイスと、を含むことを特徴とする、ウイルス検出キット。

【請求項7】

前記抗原検査用デバイスが、前記呼気凝縮液収集用デバイスにおける呼気収集部の内部空間に設けられていることを特徴とする、請求項６に記載のウイルス検出キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はウイルスの検出方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒトや動物に感染した病原ウイルスを検出する方法として、唾液、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、痰などを検体とする、イムノクロマト法やＰＣＲ法などが知られており、広く医療現場において採用されている。このうちイムノクロマト法は、検体を含むサンプル液を展開させ、検出対象と結合した標識抗体が凝集することによるテストラインの発色の有無で陽性／陰性を判定する方法であり、簡易迅速な検査が可能である点で有効である。
検体である唾液、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、痰は粘性を有するため、これら検体をそのままイムノクロマトグラフィーデバイスに展開させることができない。そのため、検体の粘性を解消するための検体処理液としてアジ化ナトリウムを含む緩衝液を使用することが一般的である（例えば特許文献１）。

【0003】

ところで呼気には様々な成分が含まれており、被験者の気道疾患や生理学的な状態を示唆することが知られている。呼気を分析するため、被験者から排出された呼気を冷却することで凝集し、呼気凝縮液を得る方法が提供されている(例えば特許文献２～４)。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２０１２－０３７２５３号公報

【特許文献2】特表２０１９－５１２６８７号公報

【特許文献3】特表２０２０－５１４７６７号公報

【特許文献4】特表２０１８－５３２９９９号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

上述の通りイムノクロマト法は簡易迅速にウイルスを検出することができるため有用である。しかし、唾液、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、痰など粘性のある検体を使用するため、一般的には劇薬であるアジ化ナトリウムが使用される。劇薬を使用することによる安全性の問題を解決するための手段が求められていた。
本発明は上記問題に鑑みて、ウイルス検出のための新規の技術を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らの鋭意研究努力により、呼気中に活性ウイルスが含まれていることが初めて見出された。本発明はかかる発見により完成されたものである。
上記課題を解決する本発明は、呼気凝縮液をサンプルとして抗原検査法によってウイルスを検出することを特徴とする、ウイルス検出方法である。
呼気凝縮液は一般的なウイルス検出のための検体である唾液、鼻腔ぬぐい液、咽頭ぬぐい液、痰などと異なり、粘性を有さない。したがって、粘性を解消するためにアジ化ナトリウムなどの劇薬の使用を伴わずとも、ウイルスの抗原検査が可能となる。

【0007】

本発明の好ましい形態では、前記抗原検査法が、ウイルス抗原を特異的に認識する抗体を用いるイムノクロマト法である。抗原検査法としてイムノクロマト法を使用することにより簡易迅速なウイルス検出が可能となる。

【0008】

本発明の好ましい形態では、前記抗原検査法が、活性ウイルスを検出する方法である。呼気に活性ウイルスが含まれているため、活性ウイルスを検出する抗原検査法を適用することができる。

【0009】

本発明の好ましい形態では、前記抗原検査法が、イムノアッセイ法である。イムノアッセイ法を採用することにより、簡易迅速なウイルス検出が可能となる。

【0010】

本発明は、呼吸器感染症の病原ウイルスの検出に適用することができる。

【0011】

また、本発明は、ＲＳウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ハンタウイルス、風疹ウイルス、麻しんウイルス、ヒトメタニューモウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルスから選ばれるウイルスの検出に適用することができる。

【0012】

また、本発明は、上述のウイルス検出方法に用いるための検出キットにも関する。具体的には、本発明は、呼気から呼気凝縮液を調製する呼気凝縮液収集用デバイスと、ウイルス抗原を検出するための抗原検査用デバイスと、を含むことを特徴とする、ウイルス検出キットである。

【0013】

本発明の好ましい形態では、前記抗原検査用デバイスが、前記呼気凝縮液収集用デバイスにおける呼気収集部の内部空間に設けられている。

【発明の効果】

【0014】

本発明によれば簡易迅速、かつ非侵襲なウイルス検出技術を提供できる。より具体的には、本発明は、サンプルの粘性解消のためのアジ化ナトリウムを含む緩衝液の使用を伴わずに、ウイルスの簡易迅速な検出を可能とする。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】本発明のウイルス検出方法の一実施形態の概略図である。

【図2】簡易的な呼気凝集液収集用デバイスの概略図を示す。図中の矢印図形は呼気の供給方向を示す。

【図3】呼気凝集液収集用デバイスの呼気収集部の内部空間に抗原検査デバイスが設けられている実施形態の検査キットの概略図を示す。図中の矢印図形は呼気の供給方向を示す。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下、本発明の実施の形態について説明する。なお、本発明の範囲が以下に説明する実施形態に限定されないことはいうまでもない。

【0017】

本発明は呼気凝縮液（ＥＢＣ）をサンプルとする。呼気凝縮液は、呼気を冷却することによって容易に採取することができる。具体的な方法は特に限定されず、特許文献２～４に開示されているような既存の呼気凝集装置を制限なく使用することができる。呼気の冷却についても冷却装置などの積極的な冷却手段によらずとも、呼気に含まれる水蒸気が結露を生じる程度の温度差を実現できるような構成であれば構わない。図２に示すような簡便な構造の呼気凝縮液収集用デバイス１０を用いてもよい。図２の呼気凝縮液収集用デバイス１０については後述する。

【0018】

本発明における「呼気凝縮液」には、呼気凝縮液の原液及び生理食塩水などで原液を希釈した希釈液が含まれる。本発明においては、呼気凝縮液をそのまま抗原検査法のサンプルとしてもよいし、必要に応じて呼気凝縮液に緩衝剤や界面活性剤などを添加したものをサンプルとしてもよい。

【0019】

呼気凝縮液は粘性の無い液体である。したがって、本発明は劇薬であるアジ化ナトリウムなどの粘性を解消する薬剤を含まずにサンプル調製が可能である点で、安全な検出技術の提供を可能としている。

【0020】

本発明は呼気凝縮液をサンプルとして抗原検査法によってウイルスを検出する。本発明者らは呼気凝縮液に活性ウイルスが含まれることを見出している。したがって、活性ウイルス抗原に対する抗原検査法に本発明を適用することが好ましい。

【0021】

抗原検査法としてはイムノアッセイが挙げられる。イムノアッセイとしては、イムノクロマト法やＥＬＩＳＡなどが例示できるが、簡易迅速なウイルス検出の観点でイムノクロマト法が殊更に好適に例示できる。

【0022】

イムノアッセイを用いる形態とする場合、使用する抗体はウイルス抗原を認識することができるものであれば、その種類は限定されない。ウイルスを構成する各種タンパク質（カプシドタンパク、スパイクタンパク、エンベロープタンパクなど）を特異的に認識する抗体を好適に用いることができる。

【0023】

活性ウイルスを検出する実施形態とする場合、ウイルスの表面に露出するウイルス抗原（カプシドタンパク、スパイクタンパク、エンベロープタンパクなど）を特異的に認識する抗体を好適に用いることができる。なお、具体的な抗原の設定については、検出しようとするウイルスの種類によって適宜設計することができる。

【0024】

図１を参照しながらイムノクロマト法を採用する実施形態について詳述する。イムノクロマト法とは、ラテラルフローアッセイとも称されるアッセイ系であり、サンプル液３を毛細管現象の利用により長軸方向に展開し、流路上に固相化抗体が保持されたテストライン２４における発色の有無に基づき、陽性／陰性を判定する方法である。

【0025】

イムノクロマトグラフィーデバイス２０には、展開方向の上流から下流に向けて、ａ）サンプル液を滴下するサンプルパッド２１、ｂ）抗原を特異的に認識する標識抗体が保持されているコンジュゲートパッド２２、ｃ）抗原に対する固相化抗体が保持されたテストライン２４、ｄ）前記標識抗体を特異的に認識する固相化抗体が保持されたコントロールライン２５、そしてｅ）展開された液を吸液する吸液パッド２６の順番で配置されていることが一般的である（いわゆるサンドウィッチ法）。サンプル液が展開する展開部はニトロセルロース膜などのメンブレン２３などにより構成される。テストライン２４とコントロールライン２５はメンブレン２３上に設けられる。

【0026】

図２には呼気凝縮液３をスポイト４により吸い上げ、サンプルパッド２１に滴下する実施形態を示す。なおサンプルパッド２１への呼気凝縮液３の供給は、図２に示すようなスポイト４を用いる形態に限定されない。
また、図２には呼気凝縮液３がビーカーなどの容器に貯留された形態を示すが、本発明はかかる実施形態に限定されない。図２に示すような呼気凝縮液収集用デバイス１０における呼気収集部１１に貯留された呼気凝集液３をスポイト４などで吸い上げてからサンプルパッド２１に滴下してもよいし、呼気収集部１１から直接、サンプルパッド２１に滴下してもよい。

【0027】

サンプル液３に抗原が含まれている場合、コンジュゲートパッド２２に保持されている標識抗体が抗原に結合する。そして、抗原－標識抗体の複合体がテストライン２４に保持されている固相化抗体と結合することで、テストライン２４上に複合体が濃縮され、標識抗体の標識に由来する発色が観察される。
また、サンプル液３に抗原が含まれているか否かに関わらず、サンプル液３の展開が正常に作動した場合には、標識抗体がコントロールライン２５に保持されている固相化抗体と結合することで、コントロールライン２５上に標識抗体が濃縮され、標識抗体の標識に由来する発色が観察される。

【0028】

標識抗体の標識の種類は特に限定されず、白金コロイドや金コロイドなどの金属粒子、ポリエチレン粒子やラテックス粒子などの樹脂粒子、アルカリフォスファターゼなどの発色性の酵素など、公知の標識技術を制限なく適用することができる。

【0029】

本発明の場合、コンジュゲートパッド２２に保持されている標識抗体、及びテストライン上の固相化抗体として、ウイルス抗原に対する抗体が採用される。

【0030】

抗原検査法に供する呼気凝縮液３の量は特に限定されないが、抗原検査法としてイムノクロマト法を適用する場合には、好ましくは５０～１００μｌ、より好ましくは６０～９０μｌ、さらに好ましくは７０～８０μｌの呼気凝縮液３をサンプルとして用意することが好ましい。

【0031】

本発明の検出方法によって検出することができるウイルスとしては、ＲＳウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ハンタウイルス、風疹ウイルス、麻しんウイルス、ヒトメタニューモウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルスなどが挙げられる。

【0032】

また、本発明の検出方法によって検出することができるウイルスとして、呼吸器感染症の病原ウイルスが挙げられる。呼吸器感染症の病原ウイルスとしては、ＲＳウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ハンタウイルス、風疹ウイルス、麻しんウイルス、ヒトメタニューモウイルス、サイトメガロウイルスなどが挙げられる。
本発明は、近年流行しているＣＯＶＩＤ－１９の検出にも適用することができる。

【0033】

本発明は、上述のウイルス検出方法に用いるための検出キットにも関する。本発明の検出キットは、呼気から呼気凝縮液を調製する呼気凝縮液収集用デバイス１０と、ウイルス抗原を検出するための抗原検査用デバイス２０を含む。

【0034】

呼気凝縮液収集用デバイス１０の種類は限定されず、呼気凝縮液を採取することができればその実施形態は制限されない。例えば、特許文献２～４に開示されているような既存の呼気凝集装置を制限なく使用することができる。呼気を凝縮させるために必要な冷却手段についても冷却装置などの積極的な冷却手段によらずとも、呼気に含まれる水蒸気が結露を生じる程度の温度差を実現できるような構成であれば構わない。

【0035】

また、図２に示すような簡便な構造の呼気凝縮液収集用デバイス１０を採用しても構わない。呼気凝集液収集用デバイス１０は呼気収集部１１と呼気吹き込み流路１２を備える。呼気収集部１１は呼気吹き込み流路１２以外が閉鎖された内部空間を備える。被験者は呼気吹き込み流路１２を通じて、呼気収集部１１の内部空間に向けて呼気を吹き込む。吹き込まれた呼気は呼気収集部１１の内部空間において冷却され凝集し、呼気凝集液として貯留される。

【0036】

呼気収集部１１はビニール袋のような拡大収縮可能なものであっても、箱などの形状固定のものであってもよい。呼気収集部１１として形状固定のものを採用する場合、呼気収集部１１の壁面を構成する素材は放熱性の高いもの（例えば金属等）であることが好ましい。呼気収集部１１を冷却装置によって冷却し、呼気を素早く凝縮できるような構成としてもよい。

【0037】

呼気吹き込み流路１２は呼気収集部１１に呼気を吹き込むことができれば、その具体的構成は特に限定されない。硬質素材で形成してもよいし、可撓性の素材で形成してもよい。また蛇腹構造を備えることで変形自在な構成としてもよい。
呼気吹き込み流路１２の流路内径は特に限定されず、例えば直径０．５ｃｍ～３ｃｍ、好ましくは１ｃｍ～２ｃｍに設計することができる。

【0038】

呼気凝集液に唾液や痰など粘性のある体液が混入しないように、呼気吹き込み流路１２にフィルター１３を設けてもよい。フィルター１３としてはガーゼなどを好適に例示することができる。なお、フィルター１３としてウイルスを吸着除去できるような目の細かい素材を採用すると、呼気収集部１１に吹き込まれる呼気中のウイルス量が低減し、偽陽性をもたらす可能性があるため、フィルター１３はウイルスを吸着除去しない程度の目の細かさを有するものであることが好ましい。

【0039】

なお、特段の呼気吹き込み流路１２を備えない形態としてもよい。すなわち、呼気収集部１１の一部に開口を設け、当該開口から呼気が吹き込まれる形態としてもよい。この場合、呼気収集部１１の開口にフィルター１３を設けることが好ましい。

【0040】

本発明のキットに含まれる抗原検査用デバイス２０としては、イムノクロマトグラフィーデバイス２０が好適に例示できる。イムノクロマトグラフィーデバイス２０の具体的な構成は特に限定されない。サンプルパッド２１、コンジュゲートパッド２２、ニトロセルロースなどで構成されテストライン２４・コントロールライン２５が設けられた展開部（メンブレン２３）、吸液パッド２６及びこれら構成要素を覆うハウジングなどを備える一般的な構成のイムノクロマトグラフィーデバイス２０を使用することができる。ハウジングにはサンプルパッド２１にサンプル液３を滴下するためのサンプル投入口およびテストライン２４、コントロールライン２５を外部から視認するための窓が開いていることが好ましい。

【0041】

また、本発明の検出キットは図３に示すような、抗原検査用デバイス２０が、呼気凝縮液収集用デバイス１０における呼気収集部１１の内部空間に設けられている実施形態としてもよい。抗原検査用デバイス２０を呼気収集部１１の内部空間に設けることによって、呼気収集部１１の内部空間で生成された呼気凝縮液を直接的に抗原検査用デバイス２０に供することができる。
この場合、抗原検査用デバイス２０を気密包装体２７に収容する実施形態としてもよい。呼気収集部１１に呼気凝縮液がある程度貯留された時点で、気密包装体２７を開封し、抗原検査用デバイス２０のサンプル供給口に呼気凝縮液を投入する使用形態を実現することができる。

【産業上の利用可能性】

【0042】

本発明は感染症の病原ウイルスの検出技術に応用することができる。

【符号の説明】

【0043】

１０ 呼気凝縮液収集用デバイス
１１ 呼気収集部
１２ 呼気吹き込み流路
１３ フィルター
２０ 抗原検査用デバイス（イムノクロマトグラフィーデバイス）
２１ サンプルパッド
２２ コンジュゲートパッド
２３ メンブレン
２４ テストライン
２５ コントロールライン
２６ 吸液パッド
２７ 気密包装体
３ 呼気凝縮液（サンプル液）
４ スポイト

【図1】

【図2】

【図3】