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特開2022-19411人工多能性幹細胞由来の内胚葉細胞を製造する方法及びその利用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022019411
(43)【公開日】2022-01-27
(54)【発明の名称】人工多能性幹細胞由来の内胚葉細胞を製造する方法及びその利用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20220120BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20220120BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
C12N5/0735
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020123228
(22)【出願日】2020-07-17
(71)【出願人】
【識別番号】506218664
【氏名又は名称】公立大学法人名古屋市立大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】特許業務法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】松永 民秀
(72)【発明者】
【氏名】岩尾 岳洋
(72)【発明者】
【氏名】邱 施萌
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065BB11
4B065BB13
4B065BB19
4B065CA44
(57)【要約】
【課題】人工多能性幹細胞の維持培養法の形態や、人工多能性幹細胞の細胞株を問わずに、人工多能性幹細胞から内胚葉細胞へと安定して分化誘導することができる方法を提供すること。
【解決手段】人工多能性幹細胞を、血清代替物、アクチビンＡ、ホスホイノシチド３－キナーゼ阻害剤、及びＧＳＫ－３β阻害剤の存在下において培養する第一工程、及び前記第一工程後に、前記細胞を、血清代替物、アクチビンＡ、及び線維芽細胞増殖因子の存在下において培養する第二工程を含む、人工多能性幹細胞由来の内胚葉細胞を製造する方法。
【選択図】なし
【解決手段】人工多能性幹細胞を、血清代替物、アクチビンＡ、ホスホイノシチド３－キナーゼ阻害剤、及びＧＳＫ－３β阻害剤の存在下において培養する第一工程、及び前記第一工程後に、前記細胞を、血清代替物、アクチビンＡ、及び線維芽細胞増殖因子の存在下において培養する第二工程を含む、人工多能性幹細胞由来の内胚葉細胞を製造する方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
人工多能性幹細胞を、血清代替物、アクチビンＡ、ホスホイノシチド３－キナーゼ阻害剤、及びＧＳＫ－３β阻害剤の存在下において培養する第一工程、及び前記第一工程後に、前記細胞を、血清代替物、アクチビンＡ、及び線維芽細胞増殖因子の存在下において培養する第二工程を含む、人工多能性幹細胞由来の内胚葉細胞を製造する方法。
【請求項2】
第一工程において培養する人工多能性幹細胞が、フィーダーレス条件において培養した人工多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
第一工程に先立って、人工多能性幹細胞をジメチルスルホキシドの存在下において培養する工程を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
人工多能性幹細胞をジメチルスルホキシドの存在下において培養する工程が、０．１～１０％のジメチルスルホキシドを含む培地において１２時間から３日間培養する工程である、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項5】
第一工程を１２時間～４日間行う、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項6】
第二工程を１日～１０日間行う、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項7】
ホスホイノシチド３－キナーゼ阻害剤が、ＰＩ－１０３であり、ＧＳＫ－３β阻害剤がCHIR 99021である、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項8】
人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項9】
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法により人工多能性幹細胞由来の内胚葉細胞を製造する工程：及び
前記内胚葉細胞を分化誘導する工程を含む、
内胚葉由来の分化細胞の製造方法。
前記内胚葉細胞を分化誘導する工程を含む、
内胚葉由来の分化細胞の製造方法。
【請求項10】
前記内胚葉細胞を分化誘導する工程が、前記内胚葉細胞を、腸管上皮細胞に分化誘導する工程である、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、人工多能性幹細胞由来の内胚葉細胞を製造する方法に関する。本発明はさらに上記で製造した内胚葉細胞を分化誘導することによる内胚葉由来の分化細胞を製造する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
新薬開発において、腸管での薬物の吸収及び代謝の正確な予測が重要である。現在、小腸のモデル系としてはヒト結腸癌由来のＣａｃｏ－２細胞が多用されている。しかし、Ｃａｃｏ－２細胞における薬物トランスポーターの発現パターンはヒト小腸とは異なる。また小腸の主要な薬物代謝酵素であるＣＹＰ３Ａ４の発現およびＰＸＲのリガンドによるＣＹＰ３Ａ４の誘導はほとんど認められないことから、正確に小腸での薬物動態を評価することは難しい。したがって、小腸における薬物代謝および膜透過性を総合的に評価するためには初代小腸上皮細胞の利用が望ましいが、これは入手自体が困難である。
【0003】
ヒト人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ｉＰＳ細胞）は様々な細胞への分化が可能であるため、ヒトｉＰＳ細胞より分化誘導した細胞、組織及び臓器は新薬開発、再生医療分野への応用が期待されている。分化誘導過程において、全ての細胞は内胚葉、中胚葉及び外胚葉からなる三胚葉から発生し、それぞれの胚葉から消化・呼吸器官、心筋・赤血球及び神経・感覚器官などが形成される。
【0004】
特許文献１には、人工多能性幹細胞から内胚葉細胞を経て腸管幹細胞様細胞を製造し、さらに腸管上皮細胞様細胞へと分化させる方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開ＷＯ２０１８／１５１３０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上記の通り、人工多能性幹細胞は、腸管上皮細胞への分化過程において、まず内胚葉に分化し、次に腸管幹細胞に分化した後に、腸管上皮細胞に分化する。各段階の分化効率は、最終的に得られる腸管上皮細胞の性質に影響する。
【0007】
人工多能性幹細胞を培養するためのフィーダー細胞としては、マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）が一般的に用いられている。しかし、近年、ヒト人工多能性幹細胞のフィーダーレス条件下での培養法が開発された。この方法で培養したヒト人工多能性幹細胞は、増殖が早いこと、継代時の操作性が良いこと、異種動物細胞が存在しないためフィーダー細胞の種類やロットの違いによってヒト人工多能性幹細胞の未分化性に影響を与えないことなどの利点が挙げられる。
【0008】
本発明者らは、ヒト人工多能性幹細胞を、内胚葉を経由して腸管幹細胞及び腸管上皮細胞まで分化させる方法に関するこれまでの研究において、フィーダーレス培養で維持した人工多能性幹細胞を用いた場合に内胚葉への分化効率が悪いという問題や、人工多能性幹細胞の株によっては分化効率に差があるという問題があることを見出している。そこで、本発明は、人工多能性幹細胞の維持培養法の形態や、人工多能性幹細胞の細胞株を問わずに、人工多能性幹細胞から内胚葉細胞へと安定して分化誘導することができる方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、人工多能性幹細胞を培養して内胚葉細胞へと分化誘導する際の培地への添加因子を改良することにより、維持培養法の形態や、人工多能性幹細胞の細胞株を問わずに、人工多能性幹細胞から内胚葉細胞へと安定して分化誘導できることを見出した。本発明は上記知見に基づいて完成したものである。即ち、本発明によれば以下の発明が提供される。
【0010】
＜１＞ 人工多能性幹細胞を、血清代替物、アクチビンＡ、ホスホイノシチド３－キナーゼ阻害剤、及びＧＳＫ－３β阻害剤の存在下において培養する第一工程、及び前記第一工程後に、前記細胞を、血清代替物、アクチビンＡ、及び線維芽細胞増殖因子の存在下において培養する第二工程を含む、人工多能性幹細胞由来の内胚葉細胞を製造する方法。
＜２＞ 第一工程において培養する人工多能性幹細胞が、フィーダーレス条件において培養した人工多能性幹細胞である、＜１＞に記載の方法、
＜３＞ 第一工程に先立って、人工多能性幹細胞をジメチルスルホキシドの存在下において培養する工程を含む、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜４＞ 人工多能性幹細胞をジメチルスルホキシドの存在下において培養する工程が、０．１～１０％のジメチルスルホキシドを含む培地において１２時間から３日間培養する工程である、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の方法。
＜５＞ 第一工程を１２時間～４日間行う、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載の方法。
＜６＞ 第二工程を１日～１０日間行う、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の方法。
＜７＞ ホスホイノシチド３－キナーゼ阻害剤が、ＰＩ－１０３であり、ＧＳＫ－３β阻害剤がCHIR 99021である、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載の方法。
＜８＞ 人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、＜１＞から＜７＞の何れか一に記載の方法。
＜９＞ ＜１＞から＜８＞のいずれか一項に記載の方法により人工多能性幹細胞由来の内胚葉細胞を製造する工程：及び
前記内胚葉細胞を分化誘導する工程を含む、
内胚葉由来の分化細胞の製造方法。
＜１０＞ 前記内胚葉細胞を分化誘導する工程が、前記内胚葉細胞を、腸管上皮細胞に分化誘導する工程である、＜９＞に記載の方法。
＜２＞ 第一工程において培養する人工多能性幹細胞が、フィーダーレス条件において培養した人工多能性幹細胞である、＜１＞に記載の方法、
＜３＞ 第一工程に先立って、人工多能性幹細胞をジメチルスルホキシドの存在下において培養する工程を含む、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜４＞ 人工多能性幹細胞をジメチルスルホキシドの存在下において培養する工程が、０．１～１０％のジメチルスルホキシドを含む培地において１２時間から３日間培養する工程である、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の方法。
＜５＞ 第一工程を１２時間～４日間行う、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載の方法。
＜６＞ 第二工程を１日～１０日間行う、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の方法。
＜７＞ ホスホイノシチド３－キナーゼ阻害剤が、ＰＩ－１０３であり、ＧＳＫ－３β阻害剤がCHIR 99021である、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載の方法。
＜８＞ 人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、＜１＞から＜７＞の何れか一に記載の方法。
＜９＞ ＜１＞から＜８＞のいずれか一項に記載の方法により人工多能性幹細胞由来の内胚葉細胞を製造する工程：及び
前記内胚葉細胞を分化誘導する工程を含む、
内胚葉由来の分化細胞の製造方法。
＜１０＞ 前記内胚葉細胞を分化誘導する工程が、前記内胚葉細胞を、腸管上皮細胞に分化誘導する工程である、＜９＞に記載の方法。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、人工多能性幹細胞の維持培養法の形態や、人工多能性幹細胞の細胞株を問わずに、人工多能性幹細胞から内胚葉細胞へと安定して分化誘導することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【発明を実施するための形態】
【0013】
＜１＞人工多能性幹細胞由来の内胚葉細胞の製造
本発明は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）由来の内胚葉細胞を製造する方法に関する。
ｉＰＳ細胞由来の内胚葉細胞とは、ｉＰＳ細胞を内胚葉へ分化誘導することによって得られる、内胚葉系の分化細胞に分化することができる細胞である。ｉＰＳ細胞由来の内胚葉細胞を適切な条件で更に分化誘導することにより、内胚葉系の分化細胞を得ることができる。内胚葉は消化管のほか肺、甲状腺、膵臓、肝臓などの器官の組織、消化管に開口する分泌腺の細胞、腹膜、胸膜、喉頭、耳管や気管・気管支、尿路（膀胱、尿道の大部分、尿管の一部）などを形成する。よって、内胚葉系の分化細細胞としては、上記した器官又は組織の細胞を挙げることができる。本明細書において「分化誘導する」とは、特定の細胞系譜に沿って分化するように働きかけることをいう。
本発明は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）由来の内胚葉細胞を製造する方法に関する。
ｉＰＳ細胞由来の内胚葉細胞とは、ｉＰＳ細胞を内胚葉へ分化誘導することによって得られる、内胚葉系の分化細胞に分化することができる細胞である。ｉＰＳ細胞由来の内胚葉細胞を適切な条件で更に分化誘導することにより、内胚葉系の分化細胞を得ることができる。内胚葉は消化管のほか肺、甲状腺、膵臓、肝臓などの器官の組織、消化管に開口する分泌腺の細胞、腹膜、胸膜、喉頭、耳管や気管・気管支、尿路（膀胱、尿道の大部分、尿管の一部）などを形成する。よって、内胚葉系の分化細細胞としては、上記した器官又は組織の細胞を挙げることができる。本明細書において「分化誘導する」とは、特定の細胞系譜に沿って分化するように働きかけることをいう。
【0014】
「人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）」とは、初期化因子の導入などにより体細胞をリプログラミングすることによって作製される、多能性（多分化能）と増殖能を有する細胞である。人工多能性幹細胞はＥＳ細胞に近い性質を示す。ｉＰＳ細胞の作製に使用する体細胞は特に限定されず、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。また、その由来も特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類）の体細胞、特に好ましくはヒトの体細胞を用いる。即ち、ｉＰＳ細胞は、特に好ましくはヒトｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞は、これまでに報告された各種方法によって作製することができる。また、今後開発されるｉＰＳ細胞作製法を適用することも当然に想定される。
【0015】
ｉＰＳ細胞作製法の最も基本的な手法は、転写因子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃの４因子を、ウイルスを利用して細胞へ導入する方法である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ， Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ： Ｃｅｌｌ １２６ （４）， ６６３－６７６， ２００６； Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｋ， ｅｔ ａｌ： Ｃｅｌｌ １３１ （５）， ８６１－７２， ２００７）。ヒトｉＰＳ細胞についてはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８及びＮｏｎｏｇの４因子の導入による樹立の報告がある（Ｙｕ Ｊ， ｅｔ ａｌ： Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８（５８５８），１９１７－１９２０，２００７）。ｃ－Ｍｙｃを除く３因子（Ｎａｋａｇａｗａ Ｍ， ｅｔ ａｌ： Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２６ （１）， １０１－１０６， ２００８）、Ｏｃｔ３／４及びＫｌｆ４の２因子（Ｋｉｍ Ｊ Ｂ， ｅｔ ａｌ： Ｎａｔｕｒｅ ４５４ （７２０４），６４６－６５０，２００８）、或いはＯｃｔ３／４のみ（Ｋｉｍ Ｊ Ｂ， ｅｔ ａｌ： Ｃｅｌｌ １３６（３），４１１－４１９，２００９）の導入によるｉＰＳ細胞の樹立も報告されている。また、遺伝子の発現産物であるタンパク質を細胞に導入する手法（Ｚｈｏｕ Ｈ， Ｗｕ Ｓ， Ｊｏｏ ＪＹ， ｅｔ ａｌ： Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４， ３８１－３８４，２００９；Ｋｉｍ Ｄ， Ｋｉｍ ＣＨ， Ｍｏｏｎ ＪＩ， ｅｔ ａｌ： Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４，４７２－４７６，２００９）も報告されている。一方、ヒストンメチル基転移酵素Ｇ９ａに対する阻害剤ＢＩＸ－０１２９４やヒストン脱アセチル化酵素阻害剤バルプロ酸（ＶＰＡ）或いはＢａｙＫ８６４４等を使用することによって作製効率の向上や導入する因子の低減などが可能であるとの報告もある（Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ， ｅｔ ａｌ： Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（７），７９５－７９７，２００８；Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ， ｅｔ ａｌ： Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（１１），１２６９－１２７５， ２００８；Ｓｉｌｖａ Ｊ， ｅｔ ａｌ： ＰＬｏＳ． Ｂｉｏｌ．６（１０），ｅ ２５３，２００８）。遺伝子導入法についても検討が進められ、レトロウイルスの他、レンチウイルス（Ｙｕ Ｊ， ｅｔ ａｌ： Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８（５８５８）， １９１７－１９２０，２００７）、アデノウイルス（Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ Ｍ， ｅｔ ａｌ： Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２（５９０３），９４５－９４９，２００８）、プラスミド（Ｏｋｉｔａ Ｋ， ｅｔ ａｌ： Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２ （５９０３）， ９４９－９５３， ２００８）、トランスポゾンベクター（Ｗｏｌｔｊｅｎ Ｋ， Ｍｉｃｈａｅｌ ＩＰ， Ｍｏｈｓｅｎｉ Ｐ， ｅｔ ａｌ： Ｎａｔｕｒｅ ４５８， ７６６－７７０， ２００９； Ｋａｊｉ Ｋ， Ｎｏｒｒｂｙ Ｋ， Ｐａｃ ａ Ａ， ｅｔ ａｌ： Ｎａｔｕｒｅ ４５８， ７７１－７７５， ２００９； Ｙｕｓａ Ｋ， Ｒａｄ Ｒ， Ｔａｋｅｄａ Ｊ， ｅｔ ａｌ： Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６， ３６３－３６９， ２００９）、或いはエピソーマルベクター（Ｙｕ Ｊ， Ｈｕ Ｋ， Ｓｍｕｇａ－Ｏｔｔｏ Ｋ， Ｔｉａｎ Ｓ， ｅｔ ａｌ： Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４， ７９７－８０１， ２００９）を遺伝子導入に利用した技術が開発されている。
【0016】
ｉＰＳ細胞への形質転換、即ち初期化（リプログラミング）が生じた細胞はＦｂｘｏ１５、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ／４、Ｆｇｆ－４、Ｅｓｇ－１及びＣｒｉｐｔ等の多能性幹細胞マーカー（未分化マーカー）の発現などを指標として選択することができる。選択された細胞をｉＰＳ細胞として回収する。
【0017】
ｉＰＳ細胞は、例えば、国立大学法人京都大学又は国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンターから提供を受けることもできる。
【0018】
本発明による人工多能性幹細胞由来の内胚葉細胞を製造する方法は、
人工多能性幹細胞を、血清代替物、アクチビンＡ、ホスホイノシチド３－キナーゼ阻害剤、及びＧＳＫ－３β阻害剤の存在下において培養する第一工程、及び
前記第一工程後に、前記細胞を、血清代替物、アクチビンＡ、及び線維芽細胞増殖因子の存在下において培養する第二工程、
を含む。
人工多能性幹細胞を、血清代替物、アクチビンＡ、ホスホイノシチド３－キナーゼ阻害剤、及びＧＳＫ－３β阻害剤の存在下において培養する第一工程、及び
前記第一工程後に、前記細胞を、血清代替物、アクチビンＡ、及び線維芽細胞増殖因子の存在下において培養する第二工程、
を含む。
【0019】
本発明において、特に言及しない培養条件は、動物細胞の培養において一般に採用されている条件とすればよい。例えば、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で培養する。また、基本培地として、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ＧＩＢＣＯ社等）、ハムＦ１２培地（ＨａｍＦ１２）（ＳＩＧＭＡ社、Ｇｉｂｃｏ社等）、ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ－ＭＥＭ）（ナカライテスク株式会社、シグマ社、Ｇｉｂｃｏ社等）、グラスゴー基本培地（Ｇｉｂｃｏ社等）、ＲＰＭＩ１６４０培地等を用いることができる。二種以上の基本培地を併用することにしてもよい。また、培地に添加可能な成分の例としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、抗生物質、２－メルカプトエタノール、ＰＶＡ、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、インスリン、トランスフェリン、セレニウムを挙げることができる。
【0020】
本発明において、第一工程において培養する人工多能性幹細胞は、フィーダーレス条件において培養した人工多能性幹細胞でもよいし、フィーダー細胞を用いて培養した人工多能性幹細胞でもよいが、好ましくは、フィーダーレス条件において培養した人工多能性幹細胞である。フィーダーレス条件とは、フィーダー細胞を用いない培養条件である。
【0021】
本発明においては、第一工程に先立って、人工多能性幹細胞をジメチルスルホキシドの存在下において培養してもよい。人工多能性幹細胞をジメチルスルホキシドの存在下において培養する場合には、ジメチルスルホキシドを含む培地を用いて培養を行えばよい。培地におけるジメチルスルホキシドの濃度は、例えば、０．１～１０％であり、好ましくは０．１～５％である。
ジメチルスルホキシドを含む培地における培養期間は、例えば、１２時間から３日間であり、好ましくは１２時間から１日間である。
ジメチルスルホキシドを含む培地における培養期間は、例えば、１２時間から３日間であり、好ましくは１２時間から１日間である。
【0022】
本発明における第一工程は、人工多能性幹細胞を、血清代替物、アクチビンＡ、ホスホイノシチド３－キナーゼ阻害剤、及びＧＳＫ－３β阻害剤の存在下において培養する工程である。「血清代替物、アクチビンＡ、ホスホイノシチド３－キナーゼ阻害剤、及びＧＳＫ－３β阻害剤の存在下」とは、これらの成分が培地中に添加された条件と同義である。従って、これらの成分が添加された培地を用いて培養を実施すればよい。
【0023】
血清代替物としては、Ｂ２７サプリメント、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）（富士フイルム和光純薬株式会社）などを使用することができる。血清代替物の添加量は、例えば０．１％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）であり、好ましくは０．１％（ｖ／ｖ）～５％（ｖ／ｖ）である。
培地中のアクチビンＡの濃度を例えば１０ ｎｇ／ｍＬ～２００ ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ ｎｇ／ｍＬ～１５０ ｎｇ／ｍＬとすることができる。
培地中のアクチビンＡの濃度を例えば１０ ｎｇ／ｍＬ～２００ ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ ｎｇ／ｍＬ～１５０ ｎｇ／ｍＬとすることができる。
【0024】
ホスホイノシチド３－キナーゼ阻害剤（ＰＩ３キナーゼ阻害剤）としては、ＰＩ－１０３、ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、ＬＹ２９４００２［２－（４－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）－８－ｐｈｅｎｙｌ－４Ｈ－１－ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ－４－ｏｎｅ］、ＺＳＴＫ４７４ ［２－（２－ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌ－１－ｙｌ）－４，６－ｄｉｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ－１，３，５－ｔｒｉａｚｉｎｅ］、ＳＦ－１１２６［Ｎ２－［４－Ｏｘｏ－４－［４－（４－ｏｘｏ－８－ｐｈｅｎｙｌ－４Ｈ－１－ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ－２－ｙｌ）ｍｏｒｐｈｏｌｉｎ－４－ｉｕｍ－４－ｙｌｍｅｔｈｏｘｙ］ｂｕｔｙｒｙｌ］－Ｌ－ａｒｇｉｎｙｌ－ｇｌｙｃｙｌ－Ｌ－ａｓｐａｒｔｙｌ－Ｌ－ｓｅｒｉｎｅ ａｃｅｔａｔｅ］、ＢＥＺ－２３５［２－Ｍｅｔｈｙｌ－２－［４－［３－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－８－（３－ｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌ）－２，３－ｄｉｈｙｄｒｏ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｃ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ－１－ｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］ｐｒｏｐａｎｅｎｉｔｒｉｌｅ］などが挙げられる。好ましくは、ＰＩ－１０３である。
ＰＩ３キナーゼ阻害剤の濃度は、例えば、１～１０００ｎｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは１０～１００ｎｍｏｌ／Ｌである。
ＰＩ３キナーゼ阻害剤の濃度は、例えば、１～１０００ｎｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは１０～１００ｎｍｏｌ／Ｌである。
【0025】
ＧＳＫ－３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ ９９０２１、ＳＢ２１６７６３、ＣＨＩＲ ９８０１４、ＴＷＳ１１９、Ｔｉｄｅｇｌｕｓｉｂ、ＳＢ４１５２８６、ＢＩＯ、ＡＺＤ２８５８、ＡＺＤ１０８０、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＴＤＺＤ－８、ＬＹ２０９０３１４、ＩＭ－１２、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ、Ｂｉｋｉｎｉｎ、１－Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅを例示することができる。
【0026】
ＧＳＫ－３β阻害剤の添加濃度の例（ＣＨＩＲ ９９０２１の場合）は、０．１μｍｏｌ／Ｌ～１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ～５０μｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌである。
【0027】
第一工程の培養期間は、例えば、１２時間～４日間であり、好ましくは１日間～３日間であり、一例としては２日間である。
活性や増殖率の低下を防止する等の理由から、必要に応じて培地交換をしてもよい。例えば、２４時間～２日に１回の頻度で培地交換するとよい。また、コンフルエント又はサブコンフルエントになった段階で継代するとよい。
活性や増殖率の低下を防止する等の理由から、必要に応じて培地交換をしてもよい。例えば、２４時間～２日に１回の頻度で培地交換するとよい。また、コンフルエント又はサブコンフルエントになった段階で継代するとよい。
【0028】
本発明における第二工程は、第一工程後の細胞を、血清代替物、アクチビンＡ、及び線維芽細胞増殖因子の存在下において培養する工程である。「血清代替物、アクチビンＡ、及び線維芽細胞増殖因子の存在下」とは、これらの成分が培地中に添加された条件と同義である。従って、これらの成分が添加された培地を用いて培養を実施すればよい。
【0029】
血清代替物としては、Ｂ２７サプリメント、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）（富士フイルム和光純薬株式会社）などを使用することができる。血清代替物の添加量は、例えば０．１％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）であり、好ましくは０．１％（ｖ／ｖ）～５％（ｖ／ｖ）である。
培地中のアクチビンＡの濃度は、例えば１０ ｎｇ／ｍＬ～２００ ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ ｎｇ／ｍＬ～１５０ ｎｇ／ｍＬとすることができる。
培地中のアクチビンＡの濃度は、例えば１０ ｎｇ／ｍＬ～２００ ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ ｎｇ／ｍＬ～１５０ ｎｇ／ｍＬとすることができる。
【0030】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）としては、広範な細胞および組織タイプの増殖および分化において重要な役割を担うＦＧＦファミリーのメンバーを意味する。ＦＧＦとしては、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２（塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）とも言う）、ＦＧＦ４、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、およびＦＧＦ２１などを使用することができる。
【0031】
ＦＧＦの濃度は、例えば１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬとすることができる。
【0032】
第二工程の培養期間は、例えば、１日間～１０日間であり、好ましくは２日間～７日間であり、一例としては５日間である。
活性や増殖率の低下を防止する等の理由から、必要に応じて培地交換をしてもよい。例えば、２４時間～２日に１回の頻度で培地交換するとよい。また、コンフルエント又はサブコンフルエントになった段階で継代するとよい。
活性や増殖率の低下を防止する等の理由から、必要に応じて培地交換をしてもよい。例えば、２４時間～２日に１回の頻度で培地交換するとよい。また、コンフルエント又はサブコンフルエントになった段階で継代するとよい。
【0033】
＜２＞内胚葉由来の分化細胞の製造
本発明においては、上記した本発明の方法により製造した前胚葉細胞を分化誘導することによって、内胚葉由来の分化細胞を製造することができる。
内胚葉細胞を分化誘導する工程としては、例えば、内胚葉細胞を腸管上皮細胞に分化誘導する工程である。
本発明においては、上記した本発明の方法により製造した前胚葉細胞を分化誘導することによって、内胚葉由来の分化細胞を製造することができる。
内胚葉細胞を分化誘導する工程としては、例えば、内胚葉細胞を腸管上皮細胞に分化誘導する工程である。
【0034】
腸管上皮細胞に分化誘導する以外にも、肝臓細胞に分化誘導することができ、また腸管上皮細胞又は肝臓細胞以外にも、内胚葉由来の各種の組織又は器官に分化誘導することができる。肝臓細胞への分化誘導については、例えば、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２９（３）：２３７－２４３ （２０１４） を参照することができる。具体的には、肝臓細胞への分化誘導は、アクチビンＡ、ジメチルスルホキシド、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、オンコスタチンＭ及びデキサメタゾンを用いて行うことができる。また、内胚葉由来組織や器官の分化誘導については、生化学 第８７巻第５号、ｐｐ．５７３－５８２（２０１５）を参照することができる。
【0035】
内胚葉細胞を腸管上皮細胞に分化誘導する工程は、内胚葉細胞を腸管幹細胞に分化する工程、及び腸管幹細胞を腸管上皮細胞に分化する工程により行いことができる。
腸管幹細胞への分化は、内胚葉細胞を、腸管幹細胞への分化を誘導する条件下で培養することにより行うことができる。内胚葉細胞が腸管幹細胞へ分化する限り、培養条件は特に限定されない。好ましくは、ＦＧＦ２（線維芽細胞増殖因子２）の存在下で培養を行う。好ましくはヒトＦＧＦ２（例えばヒト組換えＦＧＦ２）を用いる。
腸管幹細胞への分化は、内胚葉細胞を、腸管幹細胞への分化を誘導する条件下で培養することにより行うことができる。内胚葉細胞が腸管幹細胞へ分化する限り、培養条件は特に限定されない。好ましくは、ＦＧＦ２（線維芽細胞増殖因子２）の存在下で培養を行う。好ましくはヒトＦＧＦ２（例えばヒト組換えＦＧＦ２）を用いる。
【0036】
「ＦＧＦ２の存在下」とは、ＦＧＦ２が培地中に添加された条件と同義である。従って、ＦＧＦ２の存在下での培養を行うためには、ＦＧＦ２が添加された培地を用いればよい。ＦＧＦ２の添加濃度の例を示すと１００ ｎｇ／ｍＬ～５００ ｎｇ／ｍＬである。
【0037】
内胚葉細胞を腸管幹細胞に分化する工程の培養期間は、例えば２日間～１０日間、好ましくは３日間～７日間である。培養期間が短すぎると、期待される効果（分化効率の上昇、腸管幹細胞としての機能の獲得の促進）が十分に得られない。他方、当該培養期間が長すぎると、分化効率の低下を引き起こす。
【0038】
腸管幹細胞へ分化したことは、例えば、腸管幹細胞マーカーの発現を指標にして判定ないし評価することができる。腸管幹細胞マーカーの例を挙げると、ロイシンリッチリピートを含むGタンパク質共役受容体５（LGR5）、エフリンB2受容体（EphB2）である。
【0039】
（人工多能性幹細胞由来腸管幹細胞の培養）
ｉＰＳ細胞を分化誘導することによって得られるｉＰＳ細胞由来腸の管幹細胞は、ＧＳＫ－３β阻害剤、ヒストン脱アセチル化阻害剤、及び血清代替物の存在下で培養することができる。
ｉＰＳ細胞を分化誘導することによって得られるｉＰＳ細胞由来腸の管幹細胞は、ＧＳＫ－３β阻害剤、ヒストン脱アセチル化阻害剤、及び血清代替物の存在下で培養することができる。
【0040】
「ＧＳＫ－３β阻害剤、ヒストン脱アセチル化阻害剤、及び血清代替物の存在下」とは、これらの化合物が培地中に添加された条件と同義である。従って、これらの化合物が添加された培地を用いて培養を実施すればよい。これら３成分を併用することにより、腸管幹細胞の性質、即ち、未分化性、増殖能及び上皮細胞への分化能を維持させる効果を期待できる。尚、説明の便宜上、ＧＳＫ－３β阻害剤、ヒストン脱アセチル化阻害剤、及び血清代替物をまとめて、「第１群の成分」と呼ぶ。
【0041】
別の一態様（以下の説明において「第２培養方法」と呼ぶことがある）では、第１群の成分の内、ヒストン脱アセチル化阻害剤を省略する。換言すれば、ＧＳＫ－３β阻害剤及び血清代替物の存在下で培養することを特徴とし、簡素化された培養方法となる。
【0042】
ＧＳＫ－３β阻害剤としてＣＨＩＲ ９９０２１、ＳＢ２１６７６３、ＣＨＩＲ ９８０１４、ＴＷＳ１１９、Ｔｉｄｅｇｌｕｓｉｂ、ＳＢ４１５２８６、ＢＩＯ、ＡＺＤ２８５８、ＡＺＤ１０８０、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＴＤＺＤ－８、ＬＹ２０９０３１４、ＩＭ－１２、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ、Ｂｉｋｉｎｉｎ、１－Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅを例示することができる。同様にヒストン脱アセチル化阻害剤としてバルプロ酸、ボリノスタット、トリコスタチンＡ、ツバスタチンＡ、ギビノスタット、プラシノスタットを例示することができる。一方、血清代替物とは、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等をその未分化な状態を維持させたままで培養するために、分化誘導因子を含む血清の代わりとして使用される組成物である。好ましくは、ノックアウト血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ））を用いる。
【0043】
ＧＳＫ－３β阻害剤の添加濃度の例（ＣＨＩＲ ９９０２１の場合）を示すと１μＭ～１００μＭ、好ましくは３μＭ～３０μＭである。第２培養方法の場合には２μＭ～２０μＭも好ましい添加濃度範囲である。同様に、ヒストン脱アセチル化阻害剤の添加濃度の例（バルプロ酸の場合）を示すと０．１ ｍＭ～１０ ｍＭ、好ましくは０．５ ｍＭ～３ ｍＭであり、血清代替物の添加濃度の例（ＫＳＲの場合）を示すと５％（ｖ／ｖ）～２０％（ｖ／ｖ）、好ましくは５％（ｖ／ｖ）～１０％（ｖ／ｖ）である。
【0044】
活性や増殖率の低下を防止する等の理由から、必要に応じて培地交換をする。例えば、２４時間～３日に１回の頻度で培地交換するとよい。また、コンフルエント又はサブコンフルエントになった段階で継代するとよい。
【0045】
好ましい一態様では、上記の第１群の成分に加えて、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦβ受容体阻害剤及び線維芽細胞増殖因子からなる群より選択される一以上の化合物が更に存在する条件下で培養を実施する。尚、説明の便宜上、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦβ受容体阻害剤及び線維芽細胞増殖因子をまとめて、「第２群の成分」と呼ぶ。
【0046】
上皮成長因子を用いることにより、細胞増殖を促進させる効果を期待できる。同様に、ＴＧＦβ受容体阻害剤には間葉系細胞への転換と分化誘導因子を抑制する効果、線維芽細胞増殖因子には細胞増殖を促進させる効果と、分化を抑制する効果を期待できる。好ましくは、これら第２群の成分を全て併用する（第１群の成分と合わせ、合計で６成分が併用されることになる）。
【0047】
ＴＧＦβ受容体阻害剤として例えばＡ－８３－０１を用いることができる。また、線維芽細胞増殖因子としてはＦＧＦ２、ＦＧＦ４又はＦＧＦ１０を採用するとよい。これらＦＧＦファミリーの２つ又は３つを組み合わせて使用してもよい。
【0048】
上皮成長因子の添加濃度の例を示すと１０ ｎｇ／ｍＬ～５００ ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ ｎｇ／ｍＬ～２００ ｎｇ／ｍＬである。同様に、ＴＧＦβ受容体阻害剤の添加濃度の例（Ａ－８３－０１の場合）を示すと０．３μＭ～５μＭ、好ましくは０．５μＭ～３μＭであり、線維芽細胞増殖因子の添加濃度の例（ＦＧＦ２の場合）を示すと５ ｎｇ／ｍＬ～２００ ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ ｎｇ／ｍＬ～５０ ｎｇ／ｍＬである。第２培養方法の場合のＴＧＦβ受容体阻害剤の添加濃度については、０．３μＭ～３μＭ（Ａ－８３－０１の場合）も好ましい添加濃度範囲である。
【0049】
更に好ましい一態様では、ＢＭＰ阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＷｎｔアゴニストからなる群より選択される一以上の化合物が更に存在する条件下で培養を実施する。尚、説明の便宜上、ＢＭＰ阻害剤、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びＷｎｔアゴニストをまとめて、「第３群の成分」と呼ぶ。
【0050】
ＢＭＰ阻害剤を用いることにより、幹細胞の分化を抑制し、幹細胞性を維持する効果を期待できる。同様に、Ｗｎｔシグナル活性化剤には幹細胞の増殖と幹細胞性を維持する効果、ＷｎｔアゴニストにはＷｎｔシグナルを活性化することで幹細胞の増殖と幹細胞性を維持する効果を期待できる。好ましくは、上記第２群の成分の全てと、これら第３群の成分の全てを併用する（第１培養方法の場合、第１群の成分と合わせ、合計で９成分が併用されることになる）。
【0051】
ＢＭＰ阻害剤として例えばＮｏｇｇｉｎを用いることができる。また、Ｗｎｔシグナル活性化剤として例えばＲ－ｓｐｏｎｄｉｎ １を用いることができる。Ｗｎｔアゴニストとして例えばＷｎｔ３ａを用いることができる。
【0052】
ＢＭＰ阻害剤の添加濃度の例（Ｎｏｇｇｉｎの場合）を示すと１０ ｎｇ／ｍＬ～５００ ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ ｎｇ／ｍＬ～２００ ｎｇ／ｍＬである。同様に、Ｗｎｔシグナル活性化剤の添加濃度の例（Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ １の場合）を示すと１０ ｎｇ／ｍＬ～１０００ ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ ｎｇ／ｍＬ～５００ ｎｇ／ｍＬであり、Ｗｎｔアゴニストの添加濃度の例（Ｗｎｔ３ａの場合）を示すと１０ ｎｇ／ｍＬ～５００ ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ ｎｇ／ｍＬ～２００ ｎｇ／ｍＬである。
【0053】
より一層好ましい一態様では、ニコチンアミド、Ｎ－アセチルシステイン、ｐ３８阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される一以上の化合物が更に存在する条件下で培養を実施する。尚、説明の便宜上、ニコチンアミド、Ｎ－アセチルシステイン、ｐ３８阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤をまとめて、「第４群の成分」と呼ぶ。
【0054】
ニコチンアミドを用いることにより、幹細胞性を維持する効果を期待できる。同様に、Ｎ－アセチルシステインには細胞死を抑制する効果、ｐ３８阻害剤には細胞ストレスや炎症を抑制する効果、及び分化を抑制する効果、ＲＯＣＫ阻害剤には細胞死を抑制する効果を期待できる。第１培養方法においては、好ましくは、上記第２群の成分の全てと、上記第３群の成分の全てと、これら第４群の成分の全てを併用する（第１群の成分と合わせ、合計で１３成分が併用されることになる）。第２培養方法においては、好ましくは、第３群の成分は省略し、第２群の成分の全てと、第４群の成分の内、ＲＯＣＫ阻害剤のみを併用する（第１群の成分（ＧＳＫ－３β阻害剤と血清代替物）と合わせ、合計で６成分が併用されることになる）。
【0055】
ｐ３８阻害剤として例えばＳＢ２０２１９０を用いることができる。また、ＲＯＣＫ阻害剤として例えばＹ－２７６３２を用いることができる。
【0056】
ニコチンアミドの添加濃度の例を示すと０．１ ｍｇ／ｍＬ～５ ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．５ ｍｇ／ｍＬ～２ ｍｇ／ｍＬである。同様に、Ｎ－アセチルシステインの添加濃度の例を示すと０．１ｍＭ～５ｍＭ、好ましくは０．５ ｍＭ～２ ｍＭであり、ｐ３８阻害剤の添加濃度の例（ＳＢ２０２１９０の場合）を示すと１μＭ～５０ ｍＭ、好ましくは５μＭ～２０ ｍＭであり、ＲＯＣＫ阻害剤の添加濃度の例（Ｙ－２７６３２の場合）を示すと１ μＭ～５０ μＭ、好ましくは３ μＭ～３０ μＭである。第２培養方法の場合のＲＯＣＫ阻害剤の添加濃度については、１ μＭ～１０ μＭ（Ｙ－２７６３２の場合）も好ましい添加濃度範囲である。尚、ＲＯＣＫ阻害剤については、培地交換に使用する培養液には含めないことが好ましい。但し、第２培養方法の場合は、培地中にＲＯＣＫ阻害剤が常時添加された条件を採用してもよい。
【0057】
その他の培養条件（培養温度など）は、動物細胞の培養において一般に採用されている条件とすればよい。即ち、例えば３７℃、５％ＣＯ２の環境下で培養すればよい。また、基本培地は、腸管幹細胞の維持、増殖が可能である限り特に限定されない。好ましくは、上皮細胞の培養に適した基本培地（例えばＤ－ＭＥＭとハムＦ１２培地の混合培地、Ｄ－ＭＥＭ）を用いる。培地に添加可能な成分の例としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、抗生物質、２－メルカプトエタノール、ＰＶＡ、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、インスリン、トランスフェリン、セレニウムを挙げることができる。典型的には培養皿などを用いて二次元的に細胞を培養する。本発明の方法によれば、二次元培養によってｉＰＳ細胞から腸管上皮細胞を得ることが可能となる。但し、ゲル状の培養基材あるいは３次元培養プレートなどを用いた３次元培養を実施することにしてもよい。
【0058】
尚、培養中又は培養後の細胞が所望の性質を維持しているか否かは、例えば、腸管幹細胞マーカーであるロイシンリッチリピートを含むＧタンパク質共役受容体５（ＬＧＲ５）、腸管前駆細胞マーカーであるＳＯＸ９、後腸マーカーであるＣＤＸ２の発現を指標として判定ないし評価することができる。
【0059】
さらに腸管上皮細胞へ分化するための分化工程の例として、以下に例１及び例２を示す。以下の例１及び例２において、特に言及しない培養条件は、動物細胞の培養において一般に採用されている条件とすればよい。例えば、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で培養することにし、基本培地は好ましくは上皮細胞の培養に適した基本培地（例えばＤ－ＭＥＭとハムＦ１２培地の混合培地、Ｄ－ＭＥＭ）を用いる。また、培地に添加可能な成分の例としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、抗生物質、２－メルカプトエタノール、ＰＶＡ、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、インスリン、トランスフェリン、セレニウムを挙げることができる。
【0060】
尚、腸管上皮細胞へ分化したことは、例えば、腸管上皮細胞マーカーや薬物動態関連遺伝子の発現、ペプチドの取り込み、或いはビタミンＤ受容体を介した薬物代謝酵素の発現誘導を指標にして判定ないし評価することができる。腸管上皮細胞マーカー及び薬物動態関連遺伝子の例を挙げると、ビリン １（Ｖｉｌｌｉｎ １）、スクラーゼ－イソマルターゼ、ＳＬＣ（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ）有機アニオントランスポーター２Ｂ１（ＳＬＣＯ２Ｂ１／ＯＡＴＰ２Ｂ１）、ＳＬＣ（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ）ファミリーメンバー１５Ａ１／ペプチドトランスポーター１（ＳＬＣ１５Ａ１／ＰＥＰＴ１）、ＳＬＣ（ｓｏｌｕｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ）ファミリーメンバー４６Ａ１／プロトン共役葉酸トランスポーター（ＳＬＣ４６Ａ１／ＰＣＦＴ）、ＡＴＰ結合カセットトランスポーターＢ１／多剤耐性タンパク１（ＡＢＣＢ１／ＭＤＲ１）、ＡＴＰ結合カセットトランスポーターＧ２／乳ガン耐性タンパク（ＡＢＣＧ２／ＢＣＲＰ）、尾側型ホメオボックス転写因子２（ＣＤＸ２）、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）、ウリジン２リン酸－グルクロン酸転移酵素１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）、ウリジン２リン酸－グルクロン酸転移酵素１Ａ４（ＵＧＴ１Ａ４）である。この中でも、腸管上皮に特異性の高いスクラーゼ－イソマルターゼ及びビリン１、小腸でのペプチドの吸収に関与するＳＬＣ１５Ａ１／ＰＥＰＴ１、小腸での有機アニオンの吸収に関与するＳＬＣＯ２Ｂ１／ＯＡＴＰ２Ｂ１は特に有効なマーカーである。
【0061】
（分化工程の例１）
この例では、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤及びＴＧＦβ受容体阻害剤からなる群より選択される一以上の化合物（以下、「第１誘導因子」とも呼ぶ）とＥＧＦ（以下、「第２誘導因子」とも呼ぶ）の存在下で培養を行い、腸管幹細胞を腸管上皮細胞へと分化させる。典型的には、本発明の培養方法を適用することで得られた細胞集団又はその一部を、選別することなく分化工程に供する。一方で、本発明の培養方法を適用することで得られた細胞集団の中から腸管幹細胞を選別した上で分化工程を実施することにしてもよい。腸管幹細胞の選別は例えば、細胞表面マーカーを指標にしてフローサイトメーター（セルソーター）で行えばよい。
この例では、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤及びＴＧＦβ受容体阻害剤からなる群より選択される一以上の化合物（以下、「第１誘導因子」とも呼ぶ）とＥＧＦ（以下、「第２誘導因子」とも呼ぶ）の存在下で培養を行い、腸管幹細胞を腸管上皮細胞へと分化させる。典型的には、本発明の培養方法を適用することで得られた細胞集団又はその一部を、選別することなく分化工程に供する。一方で、本発明の培養方法を適用することで得られた細胞集団の中から腸管幹細胞を選別した上で分化工程を実施することにしてもよい。腸管幹細胞の選別は例えば、細胞表面マーカーを指標にしてフローサイトメーター（セルソーター）で行えばよい。
【0062】
ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤及びＴＧＦβ受容体阻害剤からなる群より選択される一以上の化合物（第１誘導因子）とＥＧＦ（第２誘導因子）の存在下とは、第１誘導因子と第２誘導因子が培地中に添加された条件と同義である。従って、第１誘導因子と第２誘導因子の存在下での培養を行うためには、第１誘導因子と第２誘導因子が添加された培地を用いればよい。
【0063】
ＭＥＫ１阻害剤として、ＰＤ９８０５９、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ１８４１６１、ＰＤ０３２５９０１、Ｕ０１２６、ＭＥＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｉ、ＭＥＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ、ＭＥＫ１／２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ、ＳＬ３２７を挙げることができる。同様に、ＤＮＡメチル化阻害剤として５－アザ－２’－デオキシシチジン、５－アザシチジン、ＲＧ１０８、ゼブラリンを挙げることができる。ＴＧＦβ受容体阻害剤については、Ａ－８３－０１がＴＧＦ－β受容体ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７に阻害活性を示した実験結果を考慮すれば、好ましくは、ＴＧＦ－β受容体ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７の一以上に対して阻害活性を示すものを用いるとよい。例えば、Ａ－８３－０１、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ５２５３３４、Ｄ４４７６、ＡＬＫ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＬＹ２１５７２９９、ＬＹ３６４９４７、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘが当該条件を満たす。
【0064】
ＭＥＫ１阻害剤の添加濃度の例（ＰＤ９８０５９の場合）を示すと４μＭ～１００μＭ、好ましくは１０～４０μＭである。同様にメチル化阻害剤の添加濃度の例（５－アザ－２’－デオキシシチジンの場合）を示すと、１μＭ～２５μＭ、好ましくは２．５μＭ～１０μＭであり、ＴＧＦβ受容体阻害剤の添加濃度の例（Ａ－８３－０１の場合）を示すと０．１μＭ～２．５μＭ、好ましくは０．２μＭ～１μＭである。
【0065】
好ましい一態様では、第１誘導因子として、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤の中の二以上を併用する。異なる二以上の第１誘導因子を併用することにより、相加的又は相乗的効果が得られ、腸管上皮への分化を促進できる。最も好ましくは、全て（即ち３種類）の第１誘導因子を併用する。
【0066】
当該工程の期間（培養期間）は例えば７日間～３０日間、好ましくは１０日間～２０日間である。当該培養期間が短すぎると、期待される効果（分化効率の上昇、腸管上皮細胞としての機能の獲得の促進）が十分に得られない。他方、当該培養期間が長すぎると、分化効率の低下を引き起こす。
【0067】
好ましい一態様では当該工程として２段階の培養、即ち、本発明の培養方法を適用することで得られた腸管幹細胞をＧＳＫ阻害剤（例えばＧＳＫ３ｉＸＶ）及び／又はＢＭＰ阻害剤（例えばドルソモルフィン）とＥＧＦの存在下で培養する工程（分化工程１）とそれに続いて、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤及びＴＧＦβ受容体阻害剤からなる群より選択される一以上の化合物（第１誘導因子）とＥＧＦ（第２誘導因子）の存在下で培養する工程（分化工程２）を行う。従って、この態様では、第１誘導因子と第２誘導因子を用いた培養の前に、ＧＳＫ阻害剤及び／又はＢＭＰ阻害剤の存在下での培養を行うことになる。ＧＳＫ阻害剤及び／又はＢＭＰ阻害剤の存在下での培養の主たる目的は、腸管幹細胞の増殖を促進することである。
【0068】
分化工程１と分化工程２を行う場合、分化工程１の培養期間は例えば３日間～１４日間、好ましくは４日間～１０日間であり、分化工程２の培養期間は例えば３日間～２１日間、好ましくは５日間～１５日間である。
【0069】
各工程において、途中で継代培養を行ってもよい。例えばコンフルエント又はサブコンフルエントになった際に細胞の一部を採取して別の培養容器に移し、培養を継続する。分化を促進するために細胞密度を低く設定することが好ましい。例えば１×１０４個／ｃｍ２～１×１０６個／ｃｍ２程度の細胞密度で細胞を播種するとよい。
【0070】
培地交換や継代培養などに伴う、細胞の回収の際には、細胞死を抑制するためにＹ－２７６３２等のＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）で予め細胞を処理しておくとよい。
【0071】
（分化工程の例２）
この例では、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤及びＥＧＦの存在下（以下、この条件を「第１条件」と呼ぶ）、且つｃＡＭＰが細胞へ供給される条件下（以下、この条件を「第２条件」と呼ぶ）で培養し、本発明の培養方法を適用することで得られた腸管幹細胞を腸管上皮細胞へと分化させる。典型的には、本発明の培養方法を適用することで得られた細胞集団又はその一部を、選別することなく分化工程に供する。一方で、本発明の培養方法を適用することで得られた細胞集団の中から腸管幹細胞を選別した上で分化工程を実施することにしてもよい。腸管幹細胞の選別は例えば、細胞表面マーカーを指標にしてフローサイトメーター（セルソーター）で行えばよい。
この例では、ＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤及びＥＧＦの存在下（以下、この条件を「第１条件」と呼ぶ）、且つｃＡＭＰが細胞へ供給される条件下（以下、この条件を「第２条件」と呼ぶ）で培養し、本発明の培養方法を適用することで得られた腸管幹細胞を腸管上皮細胞へと分化させる。典型的には、本発明の培養方法を適用することで得られた細胞集団又はその一部を、選別することなく分化工程に供する。一方で、本発明の培養方法を適用することで得られた細胞集団の中から腸管幹細胞を選別した上で分化工程を実施することにしてもよい。腸管幹細胞の選別は例えば、細胞表面マーカーを指標にしてフローサイトメーター（セルソーター）で行えばよい。
【0072】
第１条件、即ちＭＥＫ１阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、ＴＧＦβ受容体阻害剤及びＥＧＦの存在下とは、これらの化合物が培地中に添加された条件と同義である。従って、第１条件を満たすためには、これらの化合物が添加された培地を用いればよい。
【0073】
ＭＥＫ１阻害剤として、ＰＤ９８０５９、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ１８４１６１、ＰＤ０３２５９０１、Ｕ０１２６、ＭＥＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｉ、ＭＥＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ、ＭＥＫ１／２ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＩ、ＳＬ３２７を挙げることができる。同様に、ＤＮＡメチル化阻害剤として５－アザ－２’－デオキシシチジン、５－アザシチジン、ＲＧ１０８、ゼブラリンを挙げることができる。ＴＧＦβ受容体阻害剤については、Ａ－８３－０１がＴＧＦ－β受容体ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７に阻害活性を示した実験結果を考慮すれば、好ましくは、ＴＧＦ－β受容体ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ７の一以上に対して阻害活性を示すものを用いるとよい。例えば、Ａ－８３－０１、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ５２５３３４、Ｄ４４７６、ＡＬＫ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＬＹ２１５７２９９、ＬＹ３６４９４７、ＧＷ７８８３８８、ＲｅｐＳｏｘが当該条件を満たす。
【0074】
ＭＥＫ１阻害剤の添加濃度の例（ＰＤ９８０５９の場合）を示すと４μＭ～１００μＭ、好ましくは１０～４０μＭである。同様にメチル化阻害剤の添加濃度の例（５－アザ－２’－デオキシシチジンの場合）を示すと、１μＭ～２５μＭ、好ましくは２．５μＭ～１０μＭであり、ＴＧＦβ受容体阻害剤の添加濃度の例（Ａ－８３－０１の場合）を示すと０．１μＭ～２．５μＭ、好ましくは０．２μＭ～１μＭである。尚、例示した化合物、即ち、ＰＤ９８０５９、５－アザ－２’－デオキシシチジン及びＡ－８３－０１とは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物（ＰＤ９８０５９、５－アザ－２’－デオキシシチジン、Ａ－８３－０１）の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、予備実験によって確認することができる。
【0075】
第２条件、即ち、ｃＡＭＰが細胞へ供給される条件とは、細胞内へ取り込み可能な化合物であって、細胞内に取り込まれるとｃＡＭＰシグナルを刺激する化合物が存在する条件と同義である。従って、第２条件を満たすためには、例えば、細胞内への取り込み可能なｃＡＭＰ誘導体、アデニル酸シクラーゼ活性化作用を有する化合物（例えば、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）、またはｃＡＭＰ分解酵素ホスホジエステラーゼの阻害作用を有する化合物（例えば、ＩＢＭＸ）が添加された培地を用いればよい。ｃＡＭＰ誘導体としてＰＫＡ活性剤（例えば、８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ（８－Ｂｒｏｍｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ－３’，５’－ｃｙｃｌｉｃ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ， ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ ： ７６９３９－４６－３）、６－Ｂｎｚ－ｃＡＭＰ（Ｎ６－Ｂｅｎｚｏｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ－３’，５’－ｃｙｃｌｉｃ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ ｓａｌｔ， ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ ： １１３５３０６－２９－４）、ｃＡＭＰＳ－Ｒｐ（（Ｒ）－Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ， ｃｙｃｌｉｃ ３’，５’－（ｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ） ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ， ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ ： １５１８３７－０９－１）、ｃＡＭＰＳ－Ｓｐ（（Ｓ）－Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ， ｃｙｃｌｉｃ ３’，５’－（ｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ） ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ， ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ ： ９３６０２－６６－５）、Ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ－ｃＡＭＰ（Ｎ６，Ｏ２’－Ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ３’，５’－ｃｙｃｌｉｃ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ ｓａｌｔ， ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ ： １６９８０－８９－５）、８－Ｃｌ－ｃＡＭＰ（８－Ｃｈｌｏｒｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ－ ３’， ５’－ ｃｙｃｌｉｃ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓａｌｔ， ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ ： １２４７０５－０３－９））、Ｅｐａｃ活性剤（Ｒｐ－８－Ｂｒ－ｃＡＭＰＳ（８－Ｂｒｏｍｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ ３’，５’－ｃｙｃｌｉｃ Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ， Ｒｐ－Ｉｓｏｍｅｒ ． ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ， ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ ： １２９７３５－００－８）、８－ＣＰＴ－ｃＡＭＰ（８－（４－Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏ）ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ３’，５’－ｃｙｃｌｉｃ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ， ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ ： ９３８８２－１２－３）、８－ｐＣＰＴ－２’－Ｏ－Ｍｅ－ｃＡＭＰ（８－（４－Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏ）－２’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ ３’，５’－ｃｙｃｌｉｃ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ， ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ ： ６３４２０７－５３－７）等）を採用することができる。ｃＡＭＰ誘導体の添加濃度の例（８－Ｂｒ－ｃＡＭＰの場合）を示すと、０．１ ｍＭ～１０ ｍＭ、好ましくは０．２ ｍＭ～５ ｍＭ、更に好ましくは０．５ ｍＭ～２ ｍＭである。尚、例示した化合物、即ち、８－Ｂｒ－ｃＡＭＰとは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物（８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ）の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、予備実験によって確認することができる。
【0076】
当該工程の期間（培養期間）は例えば７日間～４０日間、好ましくは１０日間～３０日間である。当該培養期間が短すぎると、期待される効果（分化効率の上昇、腸管上皮細胞としての機能の獲得の促進）が十分に得られない。他方、当該培養期間が長すぎると、分化効率の低下を引き起こす。
【0077】
目的の細胞（腸管上皮細胞）のみからなる細胞集団又は目的の細胞が高比率（高純度）で含まれた細胞集団を得ようと思えば、目的の細胞に特徴的な細胞表面マーカーを指標にして培養後の細胞集団を選別・分取すればよい。
【0078】
なお、培地交換や継代培養などに伴う、細胞の回収の際には、細胞死を抑制するためにＹ－２７６３２等のＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）で予め細胞を処理しておくとよい。
【0079】
＜３＞腸管上皮細胞の用途
腸管上皮細胞の第１の用途として各種アッセイが提供される。腸管上皮細胞は、腸管、特に小腸のモデル系に利用可能であり、腸管、特に小腸での薬物動態（吸収、代謝など）の評価や毒性の評価に有用である。換言すれば、腸管上皮細胞は、化合物の体内動態の評価や毒性の評価にその利用が図られる。
腸管上皮細胞の第１の用途として各種アッセイが提供される。腸管上皮細胞は、腸管、特に小腸のモデル系に利用可能であり、腸管、特に小腸での薬物動態（吸収、代謝など）の評価や毒性の評価に有用である。換言すれば、腸管上皮細胞は、化合物の体内動態の評価や毒性の評価にその利用が図られる。
【0080】
具体的には、腸管上皮細胞を用いて被検物質の吸収性ないし膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、毒性等を試験することができる。即ち、（ｉ）本発明の方法により得た腸管上皮細胞胞で構成された細胞層を用意する工程と、（ｉｉ）前記細胞層に被検物質を接触させる工程と、（ｉｉｉ）前記細胞層を透過した被検物質を定量し、被検物質の吸収性ないし膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、又は毒性を評価する工程を行うことができる。
【0081】
工程（ｉ）では、典型的には、半透過性膜（多孔性膜）の上で腸管上皮細胞を培養し、細胞層を形成させる。具体的には、例えば、カルチャーインサートを備えた培養容器（例えば、コーニング社が提供するトランスウェル（登録商標））を使用し、カルチャーインサート内に細胞を播種して培養することにより、腸管上皮細胞で構成された細胞層を得る。
【0082】
工程（ｉｉ）での「接触」は、典型的には、培地に被検物質を添加することによって行われる。被検物質の添加のタイミングは特に限定されない。従って、被検物質を含まない培地で培養を開始した後、ある時点で被検物質を添加することにしても、予め被検物質を含む培地で培養を開始することにしてもよい。
【0083】
被検物質には様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を用いることができる。有機化合物の例として核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミン（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ９、Ｂ１２、Ｃ、Ａ、Ｄ、Ｅ等）を例示できる。医薬品、栄養食品、食品添加物、農薬、香粧品（化粧品）等の既存成分或いは候補成分も好ましい被検物質の一つである。植物抽出液、細胞抽出液、培養上清などを被検物質として用いてもよい。２種類以上の被検物質を同時に添加することにより、被検物質間の相互作用、相乗作用などを調べることにしてもよい。被検物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なアッセイ系を構築することができる。
【0084】
被検物質を接触させる期間は任意に設定可能である。接触期間は例えば１０分間～３日間、好ましくは１時間～１日間である。接触を複数回に分けて行うことにしてもよい。
【0085】
工程（ｉｉｉ）では、細胞層を透過した被検物質を定量する。例えば、トランスウェル（登録商標）のようなカルチャーインサートを備えた培養容器を使用した場合には、カルチャーインサートを透過した被検物質、即ち、細胞層を介して上部もしくは下部容器内に移動した被検物質を、被検物質に応じて、質量分析、液体クロマトグラフィー、免疫学的手法（例えば蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法））等の測定方法で定量する。定量結果（細胞層を透過した被検物質の量）と被検物質の使用量（典型的には培地への添加量）に基づき、被検物質の吸収性ないし膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、又は毒性を判定・評価する。
【0086】
別の態様（第２の態様）としては、被検物質の代謝又は吸収を評価する方法が提供される。当該方法では、（Ｉ）腸管上皮細胞に被検物質を接触させる工程と、（ＩＩ）被検物質の代謝若しくは吸収、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、又は毒性を測定・評価する工程を行う。
【0087】
工程（Ｉ）、即ち腸管上皮細胞と被検物質の接触は、上記工程（ｉｉ）と同様に実施することができる。但し、予め細胞層を形成させることは必須ではない。
【0088】
工程（Ｉ）の後、被検物質の代謝若しくは吸収、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、又は毒性を測定・評価する（工程（ＩＩ））。工程（Ｉ）の直後、即ち、被検物質の接触の後、実質的な時間間隔を置かずに代謝等を測定・評価しても、或いは、一定の時間（例えば１０分～５時間）を経過した後に代謝等を測定・評価することにしてもよい。代謝の測定は、例えば、代謝産物の検出によって行うことができる。この場合には、通常、工程（Ｉ）後の培養液をサンプルとして、予想される代謝産物を定性的又は定量的に測定する。測定方法は代謝産物に応じて適切なものを選択すればよいが、例えば、質量分析、液体クロマトグラフィー、免疫学的手法（例えば蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法））等を採用可能である。
【0089】
典型的には、被検物質の代謝産物が検出されたとき、「被検物質が代謝された」と判定ないし評価する。また、代謝産物の量に応じて被検物質の代謝量を評価することができる。代謝産物の検出結果と、被検物質の使用量（典型的には培地への添加量）に基づき、被検物質の代謝効率を算出することにしてもよい。
【0090】
腸管上皮細胞における薬物代謝酵素（シトクロムＰ４５０（特にＣＹＰ３Ａ４）、ウリジン２リン酸－グルクロン酸転移酵素（特にＵＧＴ１Ａ８、ＵＧＴ１Ａ１０）、硫酸転移酵素（特にＳＵＬＴ１Ａ３など））の発現を指標として被検物質の代謝を測定することも可能である。薬物代謝酵素の発現はｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルで評価することができる。例えば、薬物代謝酵素のｍＲＮＡレベルに上昇を認めたとき、「被検物質が代謝された」と判定することができる。同様に、薬物代謝酵素の活性に上昇を認めたとき、「被検物質が代謝された」と判定することができる。代謝産物を指標として判定する場合と同様に、薬物代謝酵素の発現量に基づいて定量的な判定・評価を行うことにしてもよい。
【0091】
被検物質の吸収を評価するためには、例えば、培養液中の被検物質の残存量を測定する。通常、工程（Ｉ）後の培養液をサンプルとして被検物質を定量する。測定方法は被検物質に応じて適切なものを選択すればよい。例えば、質量分析、液体クロマトグラフィー、免疫学的手法（例えば蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法））等を採用可能である。典型的には、培養液中の被検物質の含有量の低下を認めたとき、「被検物質が吸収された」と判定・評価する。また、低下の程度に応じて被検物質の吸収量ないし吸収効率を判定・評価することができる。尚、細胞内に取り込まれた被検物質の量を測定することによっても、吸収の評価は可能である。
尚、代謝の測定・評価と吸収の測定・評価を同時に又は並行して行うことにしてもよい。
尚、代謝の測定・評価と吸収の測定・評価を同時に又は並行して行うことにしてもよい。
【0092】
本発明の方法で調製した腸管上皮細胞の第２の用途としては、腸管上皮細胞を含有する細胞製剤である。本発明の細胞製剤は各種腸疾患の治療に適用可能である。特に、障害された（機能不全を含む）腸管上皮組織の再生・再建用の材料としての利用が想定される。即ち、再生医療への貢献を期待できる。本発明の細胞製剤は、例えば、本発明の方法によって得られた腸管上皮細胞を生理食塩水や緩衝液（例えばリン酸系緩衝液）等に懸濁すること、或いは当該細胞を用いて三次元組織体（オルガノイドやスフェロイド）を作製することによって調製することができる。治療上有効量の細胞を投与できるように、一回投与分の量として例えば１×１０５個～１×１０１０個の細胞を含有させるとよい。細胞の含有量は、使用目的、対象疾患、適用対象（レシピエント）の性別、年齢、体重、患部の状態、細胞の状態などを考慮して適宜調整することができる。
【0093】
細胞の保護を目的としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）や血清アルブミン等を、細菌の混入を阻止することを目的として抗生物質等を、細胞の活性化、増殖又は分化誘導などを目的として各種の成分（ビタミン類、サイトカイン、成長因子、ステロイド等）を本発明の細胞製剤に含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を本発明の細胞製剤に含有させてもよい。
【実施例0094】
＜方法＞
（１）細胞
ヒトｉＰＳ細胞としてＷｉｎｄｙおよびＫ株を使用した。両細胞株は国立成育医療研究センター研究所の梅澤明弘博士より供与された。ｉＰＳ細胞の維持培養時のフィーダー細胞としてはＭＥＦを使用した。
（１）細胞
ヒトｉＰＳ細胞としてＷｉｎｄｙおよびＫ株を使用した。両細胞株は国立成育医療研究センター研究所の梅澤明弘博士より供与された。ｉＰＳ細胞の維持培養時のフィーダー細胞としてはＭＥＦを使用した。
【0095】
（２）培地
オンフィーダー培養：
ＭＥＦの培養には１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－グルタミン（Ｌ－Ｇｌｕ）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ、１００ μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。ＭＥＦの剥離液には０．０５％トリプシン－エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を、ＭＥＦの保存液にはセルバンカー１を用いた。ヒトｉＰＳ細胞の維持培養には２０％ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）、０．８％ ＮＥＡＡ、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－Ｇｌｕ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ２－メルカプトエタノール（２－ＭｅＥ）、５ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）２を含むＤＭＥＭ Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を用いた。ヒトｉＰＳ細胞の剥離液には１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ、０．２５％トリプシン、２０％ ＫＳＲ、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウムを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いた。ヒトｉＰＳ細胞の保存液には霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用凍結保存液を用いた。
オンフィーダー培養：
ＭＥＦの培養には１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－グルタミン（Ｌ－Ｇｌｕ）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ、１００ μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。ＭＥＦの剥離液には０．０５％トリプシン－エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を、ＭＥＦの保存液にはセルバンカー１を用いた。ヒトｉＰＳ細胞の維持培養には２０％ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）、０．８％ ＮＥＡＡ、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－Ｇｌｕ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ２－メルカプトエタノール（２－ＭｅＥ）、５ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）２を含むＤＭＥＭ Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を用いた。ヒトｉＰＳ細胞の剥離液には１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ、０．２５％トリプシン、２０％ ＫＳＲ、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウムを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いた。ヒトｉＰＳ細胞の保存液には霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用凍結保存液を用いた。
【0096】
フィーダーレス培養：
培地はｍＴｅＳＲ１を用いた。ヒトｉＰＳ細胞の剥離液には０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを用いた。ヒトｉＰＳ細胞の保存液にはＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）凍結保存溶液を用いた。
培地はｍＴｅＳＲ１を用いた。ヒトｉＰＳ細胞の剥離液には０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを用いた。ヒトｉＰＳ細胞の保存液にはＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）凍結保存溶液を用いた。
【0097】
（３）ヒトｉＰＳ細胞の培養
オンフィーダー培養：
ヒトｉＰＳ細胞はマイトマイシンＣ処理を施したＭＥＦ（６×１０５ｃｅｌｌｓ／１００ｍｍディッシュ）上に播種し、５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ条件下ＣＯ２インキュベーター中３７℃にて培養した。ヒトｉＰＳ細胞の継代は、３～５日培養後、１：２～１：３のスプリット比で行った。ヒトｉＰＳ細胞は解凍４８時間後に培地を交換し、それ以降は毎日交換した。
オンフィーダー培養：
ヒトｉＰＳ細胞はマイトマイシンＣ処理を施したＭＥＦ（６×１０５ｃｅｌｌｓ／１００ｍｍディッシュ）上に播種し、５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ条件下ＣＯ２インキュベーター中３７℃にて培養した。ヒトｉＰＳ細胞の継代は、３～５日培養後、１：２～１：３のスプリット比で行った。ヒトｉＰＳ細胞は解凍４８時間後に培地を交換し、それ以降は毎日交換した。
【0098】
フィーダーレス培養：
ＤＭＥＭ／Ｆ１２にて成長因子を除去したマトリゲルを３０倍希釈し、この希釈液で細胞培養用プレートをコートした。コートしたプレートを４℃下に１０時間以上置いた。使用３０分前に、室温まで戻した。ｉＰＳ細胞をマトリゲルでコートしたプレートに播種し、５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ条件下ＣＯ２インキュベーター中３７℃にて培養した。ヒトｉＰＳ細胞の継代は、３～５日培養後、１：６のスプリット比で行った。ヒトｉＰＳ細胞は解凍時にＹ－２７６３２ μｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、２４時間後に培地を交換し、それ以降は毎日交換した。
ＤＭＥＭ／Ｆ１２にて成長因子を除去したマトリゲルを３０倍希釈し、この希釈液で細胞培養用プレートをコートした。コートしたプレートを４℃下に１０時間以上置いた。使用３０分前に、室温まで戻した。ｉＰＳ細胞をマトリゲルでコートしたプレートに播種し、５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ条件下ＣＯ２インキュベーター中３７℃にて培養した。ヒトｉＰＳ細胞の継代は、３～５日培養後、１：６のスプリット比で行った。ヒトｉＰＳ細胞は解凍時にＹ－２７６３２ μｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、２４時間後に培地を交換し、それ以降は毎日交換した。
【0099】
（４）ヒトｉＰＳ細胞の内胚葉への分化
標準プロトコール：
オンフィーダー培養したヒトｉＰＳ細胞の内胚葉への分化は、ヒトｉＰＳ細胞が培養ディッシュに対し、未分化コロニーの占める割合が約７０％になった状態で開始した。０．５％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）＋グルタマックス培地で２日間、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ＋グルタマックス培地で１日間または５日間培養することで内胚葉に分化させた。
標準プロトコール：
オンフィーダー培養したヒトｉＰＳ細胞の内胚葉への分化は、ヒトｉＰＳ細胞が培養ディッシュに対し、未分化コロニーの占める割合が約７０％になった状態で開始した。０．５％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）＋グルタマックス培地で２日間、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ＋グルタマックス培地で１日間または５日間培養することで内胚葉に分化させた。
【0100】
本発明のプロトコール：
フィーダーレス条件で培養したヒトｉＰＳ細胞が培養ディッシュに対し、細胞がコンフルエント又はサブコンフルエントになった状態で開始した。０．２％Ｂ２７サプリメント、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ、５０ｎｍｏｌ／Ｌ ＰＩ－１０３、２μｍｏｌ／Ｌ ＣＨＩＲ９９０２１、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１％ＮＥＡＡを含むＲＰＭＩ培地で２日間、０．２％Ｂ２７サプリメント、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ、２０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１％ＮＥＡＡを含むＲＰＭＩ培地で５日間培養することで内胚葉に分化させた。分化開始２４時間前に、１％ＤＭＳＯを添加したまたは添加していないｍＴｅＳＲにて培地交換を行った。
フィーダーレス条件で培養したヒトｉＰＳ細胞が培養ディッシュに対し、細胞がコンフルエント又はサブコンフルエントになった状態で開始した。０．２％Ｂ２７サプリメント、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ、５０ｎｍｏｌ／Ｌ ＰＩ－１０３、２μｍｏｌ／Ｌ ＣＨＩＲ９９０２１、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１％ＮＥＡＡを含むＲＰＭＩ培地で２日間、０．２％Ｂ２７サプリメント、１００ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ、２０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１％ＮＥＡＡを含むＲＰＭＩ培地で５日間培養することで内胚葉に分化させた。分化開始２４時間前に、１％ＤＭＳＯを添加したまたは添加していないｍＴｅＳＲにて培地交換を行った。
【0101】
（５）ヒトｉＰＳ細胞由来内胚葉の腸管上皮細胞への分化
内胚葉の腸管上皮細胞への分化は、ヒトｉＰＳ細胞由来内胚葉を用い、２％ＦＢＳ、２％Ｂ２７サプリメント、１％グルタマックス、２５０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２で４日間培養することで腸管幹細胞へ分化させた。ＦＧＦ２処理後、Ｙ－２７６３２（Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤）を１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ条件下ＣＯ２インキュベーター中３７℃にて６０分間処理した細胞をアクターゼにて剥離し、あらかじめＤＭＥＭ／Ｆ１２にて３０倍に希釈した成長因子を除去したマトリゲルにてコートした細胞培養用２４ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに播種した。その後、４％ＦＢＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌグルタマックス、１％ＮＥＡＡ、２％Ｂ２７サプリメント、１％Ｎ２サプリメント、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子（ＥＧＦ）、１０μｍｏｌ／Ｌ Ｙ－２７６３２を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２で１日間、４％ＦＢＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌグルタマックス、１％ＮＥＡＡ、２％Ｂ２７サプリメント、１％Ｎ２サプリメント、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、５０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ及び３０μｍｏｌ／Ｌフォルスコリンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２で６日間、４％ＦＢＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌグルタマックス、１％ＮＥＡＡ、２％Ｂ２７サプリメント、１％Ｎ２サプリメント、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、５０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、２０μｍｏｌ／Ｌ ＰＤ９８０５９、５μｍｏｌ／Ｌ ５－アザ－２’－デオキシシチジン、０．５μｍｏｌ／Ｌ Ａ－８３－０１、３０μｍｏｌ／Ｌフォルスコリンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２で１２日間培養することで腸管上皮細胞へ分化させた。
内胚葉の腸管上皮細胞への分化は、ヒトｉＰＳ細胞由来内胚葉を用い、２％ＦＢＳ、２％Ｂ２７サプリメント、１％グルタマックス、２５０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ２を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２で４日間培養することで腸管幹細胞へ分化させた。ＦＧＦ２処理後、Ｙ－２７６３２（Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤）を１０μｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、５％ＣＯ２／９５％ａｉｒ条件下ＣＯ２インキュベーター中３７℃にて６０分間処理した細胞をアクターゼにて剥離し、あらかじめＤＭＥＭ／Ｆ１２にて３０倍に希釈した成長因子を除去したマトリゲルにてコートした細胞培養用２４ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅに播種した。その後、４％ＦＢＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌグルタマックス、１％ＮＥＡＡ、２％Ｂ２７サプリメント、１％Ｎ２サプリメント、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子（ＥＧＦ）、１０μｍｏｌ／Ｌ Ｙ－２７６３２を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２で１日間、４％ＦＢＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌグルタマックス、１％ＮＥＡＡ、２％Ｂ２７サプリメント、１％Ｎ２サプリメント、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、５０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ及び３０μｍｏｌ／Ｌフォルスコリンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２で６日間、４％ＦＢＳ、２ｍｍｏｌ／Ｌグルタマックス、１％ＮＥＡＡ、２％Ｂ２７サプリメント、１％Ｎ２サプリメント、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、５０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、２０μｍｏｌ／Ｌ ＰＤ９８０５９、５μｍｏｌ／Ｌ ５－アザ－２’－デオキシシチジン、０．５μｍｏｌ／Ｌ Ａ－８３－０１、３０μｍｏｌ／Ｌフォルスコリンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２で１２日間培養することで腸管上皮細胞へ分化させた。
【0102】
（６）総リボ核酸（ＲＮＡ）抽出
総ＲＮＡはヒトｉＰＳ細胞の分化誘導終了後、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＲＮＡｄｖａｎｃｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔの添付マニュアルに従い抽出した。
総ＲＮＡはヒトｉＰＳ細胞の分化誘導終了後、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＲＮＡｄｖａｎｃｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔの添付マニュアルに従い抽出した。
【0103】
（７）逆転写反応
相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成は、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｋｉｔを使用し、添付マニュアルに従い行った。
相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成は、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｋｉｔを使用し、添付マニュアルに従い行った。
【0104】
（８）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ法
Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲはＫＡＰＡ ＳＹＢＲ Ｆａｓｔ ｑＰＣＲ Ｋｉｔを用い、ｃＤＮＡを鋳型にして、反応は添付マニュアルに従い行った。結果は内在性コントロールとしてヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を用いて補正した。
Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲはＫＡＰＡ ＳＹＢＲ Ｆａｓｔ ｑＰＣＲ Ｋｉｔを用い、ｃＤＮＡを鋳型にして、反応は添付マニュアルに従い行った。結果は内在性コントロールとしてヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を用いて補正した。
【0105】
（１０）ローダミンの輸送実験
分化誘導終了後、ローダミン１２３を含むハンクス平衡塩溶液をセルカルチャーインサートの頂側膜側もしくは基底膜側に加え、３７℃にてインキュベーションし、溶液を加えた反対側のチャンバーより経時的にサンプリングした。ローダミンの見かけの膜透過係数は蛍光プレートリーダーを用いて測定した蛍光強度より（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５２８ ｎｍ）算出した。Ｅｆｆｌｕｘ ｒａｔｉｏは基底膜側から頂側膜側への見かけの膜透過係数を頂側膜側から基底膜側への見かけの膜透過係数で除することで算出した。なお、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）値はＭｉｌｌｉｃｅｌｌ ＥＲＳ－２を用いて測定した。
分化誘導終了後、ローダミン１２３を含むハンクス平衡塩溶液をセルカルチャーインサートの頂側膜側もしくは基底膜側に加え、３７℃にてインキュベーションし、溶液を加えた反対側のチャンバーより経時的にサンプリングした。ローダミンの見かけの膜透過係数は蛍光プレートリーダーを用いて測定した蛍光強度より（励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５２８ ｎｍ）算出した。Ｅｆｆｌｕｘ ｒａｔｉｏは基底膜側から頂側膜側への見かけの膜透過係数を頂側膜側から基底膜側への見かけの膜透過係数で除することで算出した。なお、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）値はＭｉｌｌｉｃｅｌｌ ＥＲＳ－２を用いて測定した。
【0106】
【表1】
【0107】
＜結果及び考察＞
（１）フィーダーレスで培養したヒトｉＰＳ細胞Ｗｉｎｄｙ株の標準プロトコールでの内胚葉への分化の検討
フィーダーレスで維持培養したヒトｉＰＳ細胞Ｗｉｎｄｙ株を標準プロトコールにて内胚葉まで分化誘導を行い、標準プロトコールのフィーダーレス細胞に対する適用性を検討した。各マーカー遺伝子の発現を解析することによって分化の程度を評価した。その結果、ＯＣＴ４の発現について、オンフィーダーで培養したヒトｉＰＳ細胞由来内胚葉は未分化のヒトｉＰＳ細胞より低下したものの、フィーダーレスで維持培養したヒトｉＰＳ細胞由来内胚葉では未分化のヒトｉＰＳ細胞細胞より高い発現が認められた。ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ１及びＧＡＴＡ４については、オンフィーダーで培養したヒトｉＰＳ細胞から分化させた内胚葉は未分化のｉＰＳ細胞に比べ、９６倍、１０７倍及び１０２２倍の高い発現が認められたことに対し、フィーダーレスで培養したヒトｉＰＳ細胞から分化させた内胚葉は未分化のｉＰＳ細胞の２倍、８倍及び１４倍しか発現が認められなかった（図１～図４、ヒトｉＰＳ細胞は Ｗｉｎｄｙ株、ｎ＝２、発現量は未分化細胞を１とした相対値で示す。）。
以上のことから、同じ株のヒトｉＰＳ細胞であっても、維持培養の方法が異なることで、既存の分化誘導プロトコールでは内胚葉に十分に分化誘導することができないことが明らかとなった。
（１）フィーダーレスで培養したヒトｉＰＳ細胞Ｗｉｎｄｙ株の標準プロトコールでの内胚葉への分化の検討
フィーダーレスで維持培養したヒトｉＰＳ細胞Ｗｉｎｄｙ株を標準プロトコールにて内胚葉まで分化誘導を行い、標準プロトコールのフィーダーレス細胞に対する適用性を検討した。各マーカー遺伝子の発現を解析することによって分化の程度を評価した。その結果、ＯＣＴ４の発現について、オンフィーダーで培養したヒトｉＰＳ細胞由来内胚葉は未分化のヒトｉＰＳ細胞より低下したものの、フィーダーレスで維持培養したヒトｉＰＳ細胞由来内胚葉では未分化のヒトｉＰＳ細胞細胞より高い発現が認められた。ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ１及びＧＡＴＡ４については、オンフィーダーで培養したヒトｉＰＳ細胞から分化させた内胚葉は未分化のｉＰＳ細胞に比べ、９６倍、１０７倍及び１０２２倍の高い発現が認められたことに対し、フィーダーレスで培養したヒトｉＰＳ細胞から分化させた内胚葉は未分化のｉＰＳ細胞の２倍、８倍及び１４倍しか発現が認められなかった（図１～図４、ヒトｉＰＳ細胞は Ｗｉｎｄｙ株、ｎ＝２、発現量は未分化細胞を１とした相対値で示す。）。
以上のことから、同じ株のヒトｉＰＳ細胞であっても、維持培養の方法が異なることで、既存の分化誘導プロトコールでは内胚葉に十分に分化誘導することができないことが明らかとなった。
【0108】
（２）内胚葉への分化に対する改良プロトコール（本発明のプロトコール）の検討
（２－１）アクチビンＡの処理時間の検討：
オンフィーダーで維持培養したヒトｉＰＳ細胞を用いて、標準プロトコールで内胚葉まで分化させた。その際、アクチビンＡの処理時間を３もしくは７日間処理し、マーカー遺伝子の発現を比較した。アクチビンＡを７日間処理した群では、アクチビンＡを３日間処理した群と比較したところ、ＯＣＴ４発現の低下、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ１及びＧＡＴＡ４発現の上昇が確認された（図５～図８、ｎ＝２、発現量は未分化細胞を１とした相対値で示す）。その結果、アクチビンＡを長時間処理することで分化効率を改善できることが示唆された。しかしながら、フィーダーレスで維持培養したヒトｉＰＳ細胞の分化誘導の際に、アクチビンＡを長時間処理することで、細胞の生存率の低下が認められた（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）。したがって、フィーダーレスにて維持培養したヒトｉＰＳ細胞の内胚葉まで分化誘導法はさらなる改善が必要であることが示唆された。
（２－１）アクチビンＡの処理時間の検討：
オンフィーダーで維持培養したヒトｉＰＳ細胞を用いて、標準プロトコールで内胚葉まで分化させた。その際、アクチビンＡの処理時間を３もしくは７日間処理し、マーカー遺伝子の発現を比較した。アクチビンＡを７日間処理した群では、アクチビンＡを３日間処理した群と比較したところ、ＯＣＴ４発現の低下、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ１及びＧＡＴＡ４発現の上昇が確認された（図５～図８、ｎ＝２、発現量は未分化細胞を１とした相対値で示す）。その結果、アクチビンＡを長時間処理することで分化効率を改善できることが示唆された。しかしながら、フィーダーレスで維持培養したヒトｉＰＳ細胞の分化誘導の際に、アクチビンＡを長時間処理することで、細胞の生存率の低下が認められた（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）。したがって、フィーダーレスにて維持培養したヒトｉＰＳ細胞の内胚葉まで分化誘導法はさらなる改善が必要であることが示唆された。
【0109】
（２－２）分化誘導因子の検討：
フィーダーレスで維持培養したヒトｉＰＳ細胞Ｗｉｎｄｙ株をより効率的に内胚葉まで分化誘導するために、改良したプロトコールで分化誘導を行い、遺伝子発現レベルの評価を行った。さらに、分化誘導を行う前に１％ＤＭＳＯ前処理の有無による分化効率への影響も検討した。ＯＣＴ４の発現は改良プロトコールによって分化誘導した内胚葉では未分化のｉＰＳ細胞より低下した。標準プロトコールを用いた際には１％ＤＭＳＯの前処理より、ＯＣＴ４の発現はやや減少した。改良プロトコールで分化した内胚葉はＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ１及びＧＡＴＡ４の発現は未分化のｉＰＳ細胞および標準プロトコールで分化した内胚葉より著しく増加した。１％ＤＭＳＯを前処理することでの標準プロトコールで分化した細胞のＳＯＸ１７及びＧＡＴＡ４の遺伝子発現レベルの上昇が認められた。一方、改良プロトコールで分化した細胞へのＤＭＳＯ前処理の効果は十分に認められなかった（図９～図１２、ｎ＝２、発現量は未分化細胞を１とした相対値で示す）。以上の結果から、ヒトｉＰＳ細胞を用い、改良プロトコールにて分化誘導することで、より効率よく内胚葉へ分化することが可能になることが示唆された。
フィーダーレスで維持培養したヒトｉＰＳ細胞Ｗｉｎｄｙ株をより効率的に内胚葉まで分化誘導するために、改良したプロトコールで分化誘導を行い、遺伝子発現レベルの評価を行った。さらに、分化誘導を行う前に１％ＤＭＳＯ前処理の有無による分化効率への影響も検討した。ＯＣＴ４の発現は改良プロトコールによって分化誘導した内胚葉では未分化のｉＰＳ細胞より低下した。標準プロトコールを用いた際には１％ＤＭＳＯの前処理より、ＯＣＴ４の発現はやや減少した。改良プロトコールで分化した内胚葉はＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ１及びＧＡＴＡ４の発現は未分化のｉＰＳ細胞および標準プロトコールで分化した内胚葉より著しく増加した。１％ＤＭＳＯを前処理することでの標準プロトコールで分化した細胞のＳＯＸ１７及びＧＡＴＡ４の遺伝子発現レベルの上昇が認められた。一方、改良プロトコールで分化した細胞へのＤＭＳＯ前処理の効果は十分に認められなかった（図９～図１２、ｎ＝２、発現量は未分化細胞を１とした相対値で示す）。以上の結果から、ヒトｉＰＳ細胞を用い、改良プロトコールにて分化誘導することで、より効率よく内胚葉へ分化することが可能になることが示唆された。
【0110】
（３）分化誘導した内胚葉の腸管幹細胞への分化についての検討
次にフィーダーレスで維持培養したヒトｉＰＳ細胞Ｗｉｎｄｙ株を改良プロトコール（１％ＤＭＳＯ前処理）にて分化した内胚葉を使用し、腸管幹細胞まで分化誘導し、ＣＤＸ２の遺伝子発現レベルにて分化の程度を評価した。分化した腸管幹細胞においてＣＤＸ２は未分化のｉＰＳ細胞および分化させた内胚葉より顕著に高い発現が認められた。更に、この発現レベルはヒト成人小腸と同程度であった（図１３、ｎ＝２、発現量は未分化細胞を１とした相対値で示す）。これらの結果から、改良プロトコールにて分化した内胚葉は腸管幹細胞への分化能を有することが示唆された。
次にフィーダーレスで維持培養したヒトｉＰＳ細胞Ｗｉｎｄｙ株を改良プロトコール（１％ＤＭＳＯ前処理）にて分化した内胚葉を使用し、腸管幹細胞まで分化誘導し、ＣＤＸ２の遺伝子発現レベルにて分化の程度を評価した。分化した腸管幹細胞においてＣＤＸ２は未分化のｉＰＳ細胞および分化させた内胚葉より顕著に高い発現が認められた。更に、この発現レベルはヒト成人小腸と同程度であった（図１３、ｎ＝２、発現量は未分化細胞を１とした相対値で示す）。これらの結果から、改良プロトコールにて分化した内胚葉は腸管幹細胞への分化能を有することが示唆された。
【0111】
（４）分化誘導した内胚葉の腸管上皮細胞への分化についての検討
フィーダーレスで維持培養したヒトｉＰＳ細胞Ｗｉｎｄｙ株を改良したプロトコールで内胚葉に分化させ、さらにそこから腸管幹細胞または腸管上皮細胞まで分化させた。その際、ＤＭＳＯ前処理の影響も検討した。その結果、分化した腸管上皮細胞におけるＣＤＸ２、ＬＧＲ５及びＶｉｌｌｉｎ １の遺伝子発現はヒト成人小腸と同等もしくは高いレベルの発現が認められ、１％ ＤＭＳＯの前処理群において、これらの遺伝子の発現はやや高い傾向が認められた。分化した腸管上皮細胞におけるＣＹＰ３Ａ４及びＭＵＣ２の遺伝子発現はＣａｃｏ－２細胞より顕著に高かった。腸管幹細胞マーカーであるＬＧＲ５以外の各マーカー遺伝子の発現は、分化した腸管上皮細胞の方が分化した腸管幹細胞より高かった（図１４～図１８、Ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）、発現量はヒト成人小腸を１とした相対値で示す）。
フィーダーレスで維持培養したヒトｉＰＳ細胞Ｗｉｎｄｙ株を改良したプロトコールで内胚葉に分化させ、さらにそこから腸管幹細胞または腸管上皮細胞まで分化させた。その際、ＤＭＳＯ前処理の影響も検討した。その結果、分化した腸管上皮細胞におけるＣＤＸ２、ＬＧＲ５及びＶｉｌｌｉｎ １の遺伝子発現はヒト成人小腸と同等もしくは高いレベルの発現が認められ、１％ ＤＭＳＯの前処理群において、これらの遺伝子の発現はやや高い傾向が認められた。分化した腸管上皮細胞におけるＣＹＰ３Ａ４及びＭＵＣ２の遺伝子発現はＣａｃｏ－２細胞より顕著に高かった。腸管幹細胞マーカーであるＬＧＲ５以外の各マーカー遺伝子の発現は、分化した腸管上皮細胞の方が分化した腸管幹細胞より高かった（図１４～図１８、Ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）、発現量はヒト成人小腸を１とした相対値で示す）。
【0112】
また、１％ＤＭＳＯ前処理無しの細胞より分化した腸管上皮細胞のバリア機能を評価するために、経時的にＴＥＥＲ値を測定した。分化終了時点のＴＥＥＲ値は６００ Ω・ｃｍ２であり、強固なタイトジャンクションを有していることが明らかになった（図１９、ｎ＝２）。
【0113】
次にセルカルチャーインサート上で分化誘導を行い、排出トランスポーターであるＰ－ｇｐの基質であるローダミン１２３およびその阻害薬であるベラパミルを用いてＰ－ｇｐの輸送活性を評価した。その結果、分化誘導した腸管上皮細胞では、阻害薬未処理群において、高いｅｆｆｌｕｘ ｒａｔｉｏを示した（図２０、Ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）、ベラパミル１０μｍｏｌ／Ｌ）。また、阻害薬存在下でその値は約２まで低下した。
【0114】
Ｗｉｎｄｙとは別のヒトｉＰＳ細胞株（Ｋ株）を改良プロトコールで内胚葉に分化誘導し、さらにそこから腸管上皮細胞までの分化誘導を行った。分化の程度を遺伝子レベルにて評価したところ、１％ ＤＭＳＯを前処理することで、各マーカー遺伝子の発現レベルは上昇した。また、ＣＤＸ２、Ｐ－ｇｐ及びＶｉｌｌｉｎ １の遺伝子発現レベルは、ヒト成人小腸と同程度もしくはより高かった（図２１～図２４、Ｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３）、発現量はヒト成人小腸を１とした相対値で示す）。
【0115】
＜結論＞
以上の結果より、ヒトｉＰＳ細胞の内胚葉分化誘導においてアクチビンＡの長時間処理は短時間処理より分化効率を向上させることが示唆された。また、改良プロトコール（本発明の方法）はヒトｉＰＳ細胞から内胚葉への分化に効果的であることが示され、この方法で分化誘導した内胚葉は腸管幹細胞および腸管上皮細胞への分化能を十分有していることが明らかとなった。また、１％ＤＭＳＯを前処理することで腸管上皮細胞への分化の促進または分化効率の向上に寄与することが示された。したがって、１％ＤＭＳＯの前処理と改良プロトコール（本発明の方法）の組合せは細胞株や維持培養の方法に関わらず、ヒトｉＰＳ細胞から内胚葉、さらには腸管幹細胞及び腸管上皮細胞への分化において有用であることが示唆された。
以上の結果より、ヒトｉＰＳ細胞の内胚葉分化誘導においてアクチビンＡの長時間処理は短時間処理より分化効率を向上させることが示唆された。また、改良プロトコール（本発明の方法）はヒトｉＰＳ細胞から内胚葉への分化に効果的であることが示され、この方法で分化誘導した内胚葉は腸管幹細胞および腸管上皮細胞への分化能を十分有していることが明らかとなった。また、１％ＤＭＳＯを前処理することで腸管上皮細胞への分化の促進または分化効率の向上に寄与することが示された。したがって、１％ＤＭＳＯの前処理と改良プロトコール（本発明の方法）の組合せは細胞株や維持培養の方法に関わらず、ヒトｉＰＳ細胞から内胚葉、さらには腸管幹細胞及び腸管上皮細胞への分化において有用であることが示唆された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
