(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022022671
(43)【公開日】2022-02-07
(54)【発明の名称】モルホリン誘導体およびその製造方法
(51)【国際特許分類】
C07D 265/32 20060101AFI20220131BHJP
C12N 1/12 20060101ALN20220131BHJP
【ＦＩ】
C07D265/32 CSP
C12N1/12 C
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020113873
(22)【出願日】2020-07-01
(71)【出願人】
【識別番号】593053335
【氏名又は名称】リファインホールディングス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100196276
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 雄樹
(72)【発明者】
【氏名】彼谷 邦光
(72)【発明者】
【氏名】白石 不二雄
【テーマコード（参考）】
4B065
4C056
【Ｆターム（参考）】
4B065AA83X
4B065AC20
4B065BD11
4B065BD16
4B065CA08
4B065CA10
4B065CA16
4B065CA44
4B065CA60
4C056AA02
4C056AB01
4C056AC03
4C056AD01
4C056AE02
4C056AF08
4C056EA02
4C056EB04
4C056EC14
(57)【要約】
【課題】 天然由来のグリセリドを含む新規な酸性モルホリン誘導体を提供する。
【解決手段】 オーランチオキトリウム属の凍結乾燥細胞の脂質より１，２－ジ－ドコサペンタエノイルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸を単離した。
【選択図】図３
【解決手段】 オーランチオキトリウム属の凍結乾燥細胞の脂質より１，２－ジ－ドコサペンタエノイルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸を単離した。
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１，２－ジ－ドコサペンタエノイルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸。
【請求項2】
オーランチオキトリウム属の細胞由来のものである請求項１に記載の１，２－ジ－ドコサペンタエノイルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸。
【請求項3】
１，２－ジ－アセチルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸。
【請求項4】
オーランチオキトリウム属藻類細胞を凍結乾燥させる工程、この凍結乾燥細胞からクロロホルム／メタノール混合溶媒を用いて脂質を抽出する工程、抽出した抽出液に対して生理食塩水を抽出液１００容量部当たり１／５容量部添加し、遠心分離後、下相を分離する工程、得られた下相より溶媒を蒸発させ残渣を得る工程、残渣をクロロホルムで溶解し、カラムクロマトグラフィーで分画し、クロロホルムおよびクロロホルム／メタノール混合溶媒を用いて溶出させ、溶出したリン脂質画分回収する工程、リン脂質画分の溶媒を除去した後、クロロホルム／メタノール／水混合溶媒に再懸濁する工程、この再懸濁液をイオン交換クロマトグラフィー適用し、次いでクロロホルム／メタノール／水を適用した後、水の代わりにギ酸アンモニウム含有溶媒で酸性ＰＬ画分を溶出する工程、得られた溶出液を蒸発させ、残渣をリン酸含有水に懸濁する工程、およびこの懸濁液からヘキサンを用いて目的物を抽出する工程からなる、１，２－ジ－ドコサペンタエノイルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸の製造方法。
【請求項5】
前記目的物を抽出する工程の後に、薄層クロマトグラフィーによる精製工程を有するものである請求項４に記載の１，２－ジ－ドコサペンタエノイルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸の製造方法。
【請求項6】
１，２－ジ－ドコサペンタエノイルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸を弱アルカリ加水分解する工程、得られた加水分解物のｐＨを弱酸性に調節し、遊離した脂肪酸をｎ－ヘキサンで抽出する工程、抽出液をアルカリで中和した後、水相を乾燥させる工程、残渣をピリジン／無水酢酸混合溶媒を用いてアセチル化する工程、得られる溶液を乾燥させる工程、残渣をヘキサンに懸濁し、懸濁液を薄層クロマトグラフィーに適用し、溶媒としてクロロホルム／メタノール／水混合溶媒を用いて展開し、所期のＲｆ値のスポットより回収することを特徴とする１，２－ジ－アセチルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、モルホリン誘導体およびその製造方法に関する。詳しく述べると本発明は、オーランチオキトリウム(Aurantiochytrium)属藻類細胞からのグリセリドを含む新規な酸性モルホリン誘導体の製造方法およびこれにより得られたグリセリドを含む新規な酸性モルホリン誘導体に関するものである。
【背景技術】
【0002】
ラビリンチュラ類（Labyrinthulea）ヤブレツボカビ科（Thraustochytriaceae）の一種であるオーランチオキトリウム属は、奇数炭素鎖脂肪酸としてスクアレン、ドコサヘキサエン酸（DHA）、ペンタデカン酸の高含量の産生体として広く検討されている（非特許文献１～４）。
【0003】
また、オーランチオキトリウム属の主要な脂質は、スクアレン、カロテノイド、トリグリセリド、糖脂質、リン脂質からなることが知られている（非特許文献５～８）。
【0004】
ところで、モルホリンは、窒素原子と酸素原子を含む６員複素環化合物であり、多くの工業・有機合成において重要な部位であり、その物理化学的、生物学的、代謝学的特性から、しばしば薬用化学の分野で利用されている（非特許文献９）。
【0005】
そして、モルホリン誘導体は医薬品として合成され、その生物学的活性が検討されている（上記非特許文献９および非特許文献１０～１３）。
【0006】
さらに、天然物由来のモルホリン誘導体については、いくつかの報告がある。例えば、非特許文献１４には、海産海綿からチェロニンが単離され、抗菌・抗炎症作用を有していることが報告されている。また、非特許文献１５では、アリサンアマドコロ（Polygonatum altelobatum）から新規アルカロイドであるポリゴナフォリン（Polygonapholine）が単離されている。さらに、非特許文献１６では、ストレプトマイセス グロビスポラス（Streptomyces globisporus）から１つの抗腫瘍性抗生物質モルホリン誘導体が単離されている。また、非特許文献１７ではトゲアメフラシ（Bursatella leachii）らモルホリン誘導体であるsyn－３－イソプロピル－６－（４－メトキシベンジル）－４－メチルモルホリン２，５－ジイオネが単離されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Aasen, I. M. et al. Thraustochytrids as production organisms for docosahexaenoic acid (DHA), squalene, and carotenoids. Appl. Microbiol. Biotechnol. 100, 4309-4321 (2016).
【非特許文献2】Gupta, A., Barrow, C. J. & Puri, M. Omega-3 biotechnology: thraustochytrids as a novel source of omega-3 oils. Biotechnol. Adv. 30, 1733-1745 (2012).
【非特許文献3】Janthanomsuk, P., Verduyn, C. & Chauvatcharin, S. Improved docosahexaenoic acid production in Aurantiochytrium by glucose limited pH-auxostat fed-batch cultivation. Bioresour. Technol. 196, 592-599 (2015).
【非特許文献4】Kaya, K. et al. Thraustochytrid Aurantiochytrium sp. 18W-13a accummulates high amounts of squalene. Biosci. Biotechnol. Biochem. 75, 2246-2248 (2011).
【非特許文献5】Kaya, K., Ikeda, K., Kose, R., Sakakura, Y. & Sano, T. On the function of pentadecanoic acid and docosahexaenoic acid during culturing of the thraustochytrid, Aurantiochytriumsp. NB6-3. J. Biochem. Microb. Technol. 3, 1-7 (2015).
【非特許文献6】Aki, T. et al. Thraustochytrid as a potential source of carotenoids. J. Am. Oil Chem. Soc. 80, 789-794 (2003).
【非特許文献7】Chang, K. J. L. et al. Comparison of thraustochytrids Aurantiochytrium sp., Schizochytrium sp., Thraustochytrium sp., and Ulkenia sp. for production of biodiesel, long-chain omega-3 oils, and exopolysaccharide. Mar. Biotechnol. 16, 396-411 (2014).
【非特許文献8】Nakazawa A, et al. (2014) TLC screening of thraustochyrid strains for squalene production. J. Appl. Phycol.26, 29-41. (2014).
【非特許文献9】Arshad, F. et al. Revealing quinquennial anticancer journey of morpholine: a SAR based review. Eur. J. Med. Chem. 167, 324-356 (2019).
【非特許文献10】Kourounakis, A. P., Xanthopoulos, D. & Tzara, A. Morpholine as a privileged structure: a review on the medicinal chemistry and pharmacological activity of morpholine containing bioactive molecules. Med. Res. Rev. 10.1002/med.21634 (2019).
【非特許文献11】Pal’chikov, V. A. Morpholines. Synthesis and biological activity. Russ. J. Org. Chem. 49, 787-814 (2013).
【非特許文献12】Andrs, M. et al. Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K) and phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase (PIKK) inhibitors: importance of the morpholine ring. J. Med. Chem. 58, 41-71 (2015).
【非特許文献13】Wijtmans, R. et al. Biological relevance and synthesis of C-substituted morpholine derivatives. Synthesis 2004, 641-662 (2004).
【非特許文献14】Bobzin, S. C. & Faulkner, D. J. Aromatic alkaloids from the marine sponge Chelonaplysilla sp. J. Org. Chem. 56, 4403-4407 (1991).
【非特許文献15】Lin, C.-N. et al. Polygonapholine, an alkaloid with a novel skeleton, isolated from Polygonatum alte-lobatum. Tetrahedron 53, 2025-2028 (1997).
【非特許文献16】Minami, Y., Yoshida, K.-I., Azuma, R., Saeki, M. & Otani, T. Structure of an aromatization product of C-1027 chromophore. Tetrahedron Lett. 34, 2633-2636 (1993).
【非特許文献17】Suntornchashwej, S., Chaichit, N., Isobe, M. & Suwanborirux, K. Hectochlorin and morpholine derivatives from the Thai sea hare, Bursatella leachii. J. Nat. Prod. 68, 951-955 (2005).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
上記したように、天然物由来のモルホリン誘導体に関して、非特許文献１４～１７にあるように従来いくつかの報告があるものの、生体成分中にモルホリン誘導体を見つけることは稀である。天然物から単離されたモルホリン誘導体は、例えば、医薬の分野において、新薬の開発に貢献する可能性があり、天然由来の新たなモルホリン誘導体の出現が望まれていた。
【0009】
従って本発明は、新規なモルホリン誘導体およびその製造方法を提供することを課題とする。本発明はまた、天然由来のグリセリドを含む新規な酸性モルホリン誘導体およびその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、オーランチオキトリウム属藻類の細胞からの酸性脂質を調べたところ、２－ヒドロキシ－３－オキソ－モルホリノプロピオン酸、グリセロールおよび脂肪酸からなるグリセリド（以下、単に「Ｍ－グリセリド」と称することもある。）を含む新規な酸性モルホリン誘導体を発見し、これを単離同定して、本発明に至ったものである。二次代謝物中のモルホリン部位が脂質代謝物としてのジアシルグリセリドの構成成分であるという点でユニークなものであり、今回明らかになった極性部位である２－ヒドロキシ－３－オキソモルホリノプロピオン酸（オーラニン酸）は、新規なモルホリン誘導体ある。
【0011】
すなわち上記課題を解決する本発明は、１，２－ジ－ドコサペンタエノイルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸である。
【0012】
本発明の一実施形態においては、オーランチオキトリウム属の細胞由来のものである１，２－ジ－ドコサペンタエノイルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸が示される。
【0013】
上記課題を解決する本発明はまた、１，２－ジ－アセチルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸である。
【0014】
上記課題を解決する本発明はまた、オーランチオキトリウム属藻類細胞を凍結乾燥させる工程、この凍結乾燥細胞からクロロホルム／メタノール混合溶媒を用いて脂質を抽出する工程、抽出した抽出液に対して生理食塩水を抽出液１００容量部当たり１／５容量部添加し、遠心分離後、下相を分離する工程、得られた下相より溶媒を蒸発させ残渣を得る工程、残渣をクロロホルムで溶解し、カラムクロマトグラフィーで分画し、クロロホルムおよびクロロホルム／メタノール混合溶媒を用いて溶出させ、溶出したリン脂質画分回収する工程、リン脂質画分の溶媒を除去した後、クロロホルム／メタノール／水混合溶媒に再懸濁する工程、この再懸濁液をイオン交換クロマトグラフィー適用し、次いでクロロホルム／メタノール／水を適用した後、水の代わりにギ酸アンモニウム含有溶媒で酸性ＰＬ画分を溶出する工程、得られた溶出液を蒸発させ、残渣をリン酸含有水に懸濁する工程、およびこの懸濁液からヘキサンを用いて目的物を抽出する工程からなる、１，２－ジ－ドコサペンタエノイルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸の製造方法によっても達成される。
【0015】
本発明の一実施形態においては、また前記目的物を抽出する工程の後に、薄層クロマトグラフィーによる精製工程を有するものである、１，２－ジ－ドコサペンタエノイルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸の製造方法が示される。
【0016】
上記課題はまた、１，２－ジ－ドコサペンタエノイルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸を弱アルカリ加水分解する工程、得られた加水分解物のｐＨを弱酸性に調節し、遊離した脂肪酸をｎ－ヘキサンで抽出する工程、抽出液をアルカリで中和した後、水相を乾燥させる工程、残渣をピリジン／無水酢酸混合溶媒を用いてアセチル化する工程、得られる溶液を乾燥させる工程、残渣をヘキサンに懸濁し、懸濁液を薄層クロマトグラフィーに適用し、溶媒としてクロロホルム／メタノール／水混合溶媒を用いて展開し、所期のＲｆ値のスポットより回収することを特徴とする１，２－ジアセチルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸の製造方法である。
【発明の効果】
【0017】
上記したようにモルホリンは、多くの工業・有機合成において重要な部位であり、その物理化学的、生物学的、代謝学的特性から、しばしば薬用化学の分野で利用されている。本発明に係るこのモルホリン誘導体含有グリセリドは、オーランチオキトリウムをはじめとする生物のライフサイクルにおいて重要な役割を果たしている可能性があり、例えば、薬用化学ないし医薬の分野において、新薬の開発に貢献する可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】本発明に係るＭ－グリセリドのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図2】本発明に係るアセチル化Ｍ－グリセリドおよびアセチル化Ｍ－グリセリド水和物のポジティブイオンモードＬＣ－ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【図3】（ａ）アセチル化Ｍ－グリセリド（１，２－ジ－アセチルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸） のＨＭＢＣとＣＯＳＹの相関と（ｂ）主要な完全なＭ－グリセリド（１，２－ジ－ドコサペンタエノイルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸）の構造を示した説明図である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
以下本発明を具体的実施形態に基づいて詳細に説明する。
Ｍ－グリセリド
本発明に係る新規化合物Ｍ－グリセリドは、１，２－ジ－ドコサペンタエノイルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸である。このＭ－グリセリドは、オーランチオキトリウム(Aurantiochytrium)属藻類細胞からの酸性脂質中より、単離回収および同定可能である。
Ｍ－グリセリド
本発明に係る新規化合物Ｍ－グリセリドは、１，２－ジ－ドコサペンタエノイルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸である。このＭ－グリセリドは、オーランチオキトリウム(Aurantiochytrium)属藻類細胞からの酸性脂質中より、単離回収および同定可能である。
【0020】
このＭ－グリセリドは、凍結乾燥したオーランチオキトリウ属藻類細胞の代表的には、約０．１～０．４質量％を占めている。このＭ－グリセリドは例えば図１に示すように、Peak I（８５％）とPeak II（１５％）から構成されている。このＭ－グリセリド（完全なＭ－グリセリド）および後述するアセチル化されたグリセリドの構造は、液体クロマトグラフィー－四重極飛行時間型クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ－Ｑ／ＴＯＦ）とＮＭＲ分光法によって解明した。２Ｄ－ＮＭＲ実験により、完全なＭ－グリセリドのPeak Iは１，２－ジドコサペンタエノイル－グリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸として解明され、Peak IIは１，２－パルミトイルドコサペンタエノイル－及び／又は１，２－ドコサペンタエノイルパルミトイル－グリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸と推定された。ドコサペンタエン酸の二重結合位置はω－６型（Ｃ２２：５）である。
【0021】
また本発明に係るＭ－グリセリドは負に帯電した生物系界面活性剤（biosurfactant)である。例えば、１．０μＭ程度の低濃度ではオーランチオキトリウム属の細胞増殖を有意に刺激する一方で、例えば、１００μＭ以上といった高濃度では、細胞増殖を阻害するという特徴を有する。
【0022】
（微生物）
原料となる微生物は、オーランチオキトリウム(Aurantiochytrium)属藻類細胞である。
なお、後述する実施例においては、オーランチオキトリウム ＳＹＬＲ６＃３株およびＮＢ６－３株(Aurantiochytrium sp. SYLR6#3およびNB6-3)を使用したが、その菌株、系統等は特に制限されるものではない。また、本発明に係るＭ－グリセリドを製造するにおいて、その生産量を増やす上では、特に限定されるものではないが、細胞の有糸分裂期の対数期（接種後２４時間）の細胞を用いることが望ましい。
原料となる微生物は、オーランチオキトリウム(Aurantiochytrium)属藻類細胞である。
なお、後述する実施例においては、オーランチオキトリウム ＳＹＬＲ６＃３株およびＮＢ６－３株(Aurantiochytrium sp. SYLR6#3およびNB6-3)を使用したが、その菌株、系統等は特に制限されるものではない。また、本発明に係るＭ－グリセリドを製造するにおいて、その生産量を増やす上では、特に限定されるものではないが、細胞の有糸分裂期の対数期（接種後２４時間）の細胞を用いることが望ましい。
【0023】
このような原料となるオーランチオキトリウム(Aurantiochytrium)属藻類細胞の培養方法等は特に限定されるものではなく、従来公知の増殖培養方法を用いることができる。また、市販のオーランチオキトリウム(Aurantiochytrium)属藻類細胞を直接使用することも可能である。
【0024】
特に限定されるものではないが、培養条件の一例を挙げると、種培養培地は、１．２％海塩水溶液に溶解させた１％トリプトン、０．２％酵母エキスおよび２％グルコースを含有する培地を用いることができる。
【0025】
また、大量培養は、例えば、ｐＨコントローラーを備えたエアリフト式バイオリアクターを用い、エアバブリングで培地を混合して行うことができる。大量培養培地は、特に限定されるものではないが、例えば、グルコース３．６％、グルタミン酸ナトリウム０．５％、トリプトン１．０％、酵母エキス０．２％、および海塩１．０％を含有する組成の物を用いることができる。細胞は、例えば、１．０Ｍ ＮａＯＨの添加によって中性（ｐＨ７．０～８．５）に調整された培地で増殖させ、接種後（４８～７２時間）程度で収穫し、収穫された細胞は後述するように凍結乾燥される。
【0026】
（製造方法）
本発明のＭ－グリセリドは、オーランチオキトリウム属藻類の凍結乾燥細胞から抽出される酸性脂質を抽出し、この酸性脂質よりクロマトグラフィー技術により所期の分画を分離することで製造可能である。
本発明のＭ－グリセリドは、オーランチオキトリウム属藻類の凍結乾燥細胞から抽出される酸性脂質を抽出し、この酸性脂質よりクロマトグラフィー技術により所期の分画を分離することで製造可能である。
【0027】
具体的には、オーランチオキトリウム属藻類の凍結乾燥細を凍結乾燥させる工程、この凍結乾燥細胞からクロロホルム／メタノール混合溶媒、例えば、クロロホルム／メタノールの容量比２：１の混合溶媒、を用いて脂質を抽出する工程、抽出した抽出液に対して生理食塩水を抽出液１００容量部当たり約１／５容量部（０．２容量部）添加し、遠心分離後、下相を分離する工程、得られた下相より溶媒を、例えば、減圧下でロータリーエバポレーターを用いて、蒸発させ残渣を得る工程、残渣をクロロホルムで溶解し、カラムクロマトグラフィー、例えば、シリカゲルクロマトグラフィで分画し、クロロホルムおよびクロロホルム／メタノール混合溶媒、例えば、順にクロロホルム、クロロホルム／メタノール混合溶媒（容量比９：１）、およびクロロホルム／メタノール混合溶媒（容量比１：４）、を用いて、溶出させ、溶出したリン脂質画分回収する工程、リン脂質画分の溶媒を除去した後、クロロホルム／メタノール／水混合溶媒に再懸濁する工程、この再懸濁液をイオン交換クロマトグラフィー適用し、次いでクロロホルム／メタノール／水を適用した後、水の代わりにギ酸アンモニウム含有溶媒で酸性ＰＬ画分を溶出する工程、得られた溶出液を、例えば減圧下で、蒸発させ、残渣をリン酸含有水、例えば、０．１％リン酸含有水に懸濁する工程、およびこの懸濁液からヘキサン、例えばｎ－ヘキサンを用いて目的物を抽出する工程を経ることで、単離製造可能である。
【0028】
さらに好ましくは、上記製造工程により得られた抽出物からのＭ－グリセリドは、例えば薄層クロマトグラフィー技術により精製することが可能である。具体的には例えば、抽出物からのＭ－グリセリドを精製するために、蛍光指示薬を含むＴＬＣシリカゲルプレートに塗布し、展開溶媒としてクロロホルム／メタノール／水混合溶媒（容量比５：５：１）を用いて展開する。この場合、Ｍ－グリセリドはＲｆ０．７３で泳動するので。紫外線下で、Ｍ－グリセリドバンドをプレートから削り取り、クロロホルム／メタノール混合溶媒（容量比１：４）で溶出させ。Ｍ－グリセリドは、同じ溶媒系を用いてシリカゲルプレート上に再度クロマトグラフィーされることで精製され得る。
【0029】
本発明に係るＭ－グリセリドの同定は、後述するように、液体クロマトグラフィー－四重極飛行時間型クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ－Ｑ／ＴＯＦ）とＮＭＲ分光法によって解明可能である。
【0030】
アセチル化Ｍ－グリセリド
本発明に係るアセチル化Ｍ－グリセリドは、１，２－ジ－アセチルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸である。
本発明に係るアセチル化Ｍ－グリセリドは、１，２－ジ－アセチルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸である。
【0031】
当該アセチル化Ｍ－グリセリドは、本発明に係る上記Ｍ－グリセリドのモルホリン部位の構造を明らかとするために有用である。
【0032】
また、本発明に係るアセチル化Ｍ－グリセリドは、本発明に係る上記Ｍ－グリセリドと同様に、オーランチオキトリウム属の細胞増殖を刺激する。
【0033】
アセチル化Ｍ－グリセリドの製造方法
本発明に係るアセチル化Ｍ－グリセリドは、前述したようにして単離および同定されたＭ－グリセリド、すなわち、１，２－ジ－ドコサペンタエノイルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸を、例えば、メタノール溶解１．５Ｍ ＮａＯＨ中で、２５℃で２～３時間といった条件で、弱アルカリ加水分解する工程、得られた加水分解物のｐＨを弱酸性に調節、例えば、１．５Ｍ ＨＣｌでｐＨ２．５～３．０に調節し、遊離した脂肪酸をヘキサン、例えばｎ－ヘキサン、で抽出する工程、抽出液をアルカリ、例えば、１．０Ｍ ＮａＯＨ、で中和した後、水相を乾燥させる、例えば、Ｎ２の流れの下で蒸発させて乾燥させる工程、残渣をピリジン／無水酢酸混合溶媒を用いてアセチル化する、例えば、ピリジン／無水酢酸混合溶媒（容量比１：４）を用いて２５℃で一晩かけてアセチル化する工程、得られる溶液を、例えば、Ｎ２の流れの下で、乾燥させる工程、残渣をヘキサン、例えばｎ－ヘキサンに懸濁し、懸濁液を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に適用し、溶媒としてクロロホルム／メタノール／水混合溶媒、例えば、クロロホルム／メタノール／水混合溶媒（容量比５：５：１）を用いて展開し、所期のＲｆ値のスポットより回収する工程を有することにより製造できる。上記条件において、ＴＬＣ上のアセチル化Ｍ－グリセリドは、２０％ Ｈ２ＳＯ４を噴霧した後の炭化（charring)により検出され、アセチル化脂質のＲｆ値は０．６１であった。アセチル化Ｍ－グリセリドはＴＬＣプレートから掻き取り、クロロホルム／メタノール混合溶媒、例えば、クロロホルム／メタノール混合溶媒（容量比１：４）で抽出し得る。その結果、Ｎ２流下で乾燥させた後、無色のペースト状の物質としてアセチル化Ｍ－グリセリドを得ることができる。
本発明に係るアセチル化Ｍ－グリセリドは、前述したようにして単離および同定されたＭ－グリセリド、すなわち、１，２－ジ－ドコサペンタエノイルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸を、例えば、メタノール溶解１．５Ｍ ＮａＯＨ中で、２５℃で２～３時間といった条件で、弱アルカリ加水分解する工程、得られた加水分解物のｐＨを弱酸性に調節、例えば、１．５Ｍ ＨＣｌでｐＨ２．５～３．０に調節し、遊離した脂肪酸をヘキサン、例えばｎ－ヘキサン、で抽出する工程、抽出液をアルカリ、例えば、１．０Ｍ ＮａＯＨ、で中和した後、水相を乾燥させる、例えば、Ｎ２の流れの下で蒸発させて乾燥させる工程、残渣をピリジン／無水酢酸混合溶媒を用いてアセチル化する、例えば、ピリジン／無水酢酸混合溶媒（容量比１：４）を用いて２５℃で一晩かけてアセチル化する工程、得られる溶液を、例えば、Ｎ２の流れの下で、乾燥させる工程、残渣をヘキサン、例えばｎ－ヘキサンに懸濁し、懸濁液を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に適用し、溶媒としてクロロホルム／メタノール／水混合溶媒、例えば、クロロホルム／メタノール／水混合溶媒（容量比５：５：１）を用いて展開し、所期のＲｆ値のスポットより回収する工程を有することにより製造できる。上記条件において、ＴＬＣ上のアセチル化Ｍ－グリセリドは、２０％ Ｈ２ＳＯ４を噴霧した後の炭化（charring)により検出され、アセチル化脂質のＲｆ値は０．６１であった。アセチル化Ｍ－グリセリドはＴＬＣプレートから掻き取り、クロロホルム／メタノール混合溶媒、例えば、クロロホルム／メタノール混合溶媒（容量比１：４）で抽出し得る。その結果、Ｎ２流下で乾燥させた後、無色のペースト状の物質としてアセチル化Ｍ－グリセリドを得ることができる。
【実施例0034】
以下本発明を実施例に基づきより具体的に説明するが、以下に示す実施例は本発明の理解を容易なものとすることのみを目的として示されるものであって、本発明が以下の実施例に何ら限定されるものではない。当業者であれば、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、以下の実施例の記載内容に基づき、多くの変更ないし修飾態様が実施可能であることを容易に理解できるものであると思料する。なお、以下において「％」および「部」は、特に言及しない限りすべて質量による、「質量％」および「質量部」を表すものである。
【0035】
＜方法＞
材料
ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ａ２５は、ＧＥヘルスケア ユーケー リミテッド(GE Healthcare UK Ltd(Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire HP7 9NA, England)から入手した。酵母エキスおよびトリプトンは、ベクトン ディキンソン アンド カンパニー(Becton, Dickinson and Company (Sparks, MD, USA)から購入した。海塩は、レッド シー ソルト ＵＳＡ(Red Sea Salt USA (Huston, TX, USA)から入手した。他のすべての化学物質および溶媒は分析グレードであった。
材料
ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ａ２５は、ＧＥヘルスケア ユーケー リミテッド(GE Healthcare UK Ltd(Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire HP7 9NA, England)から入手した。酵母エキスおよびトリプトンは、ベクトン ディキンソン アンド カンパニー(Becton, Dickinson and Company (Sparks, MD, USA)から購入した。海塩は、レッド シー ソルト ＵＳＡ(Red Sea Salt USA (Huston, TX, USA)から入手した。他のすべての化学物質および溶媒は分析グレードであった。
【0036】
微生物
沖縄諸島の海水から単離されたオーランチオキトリウム ＳＹＬＲ６＃３株およびＮＢ６－３株(Aurantiochytrium sp. SYLR6#3およびNB6-3)は、オーピーバイオファクトリー株式会社（OP Bio Factory Co., Ltd、日本国沖縄県）から購入した。
沖縄諸島の海水から単離されたオーランチオキトリウム ＳＹＬＲ６＃３株およびＮＢ６－３株(Aurantiochytrium sp. SYLR6#3およびNB6-3)は、オーピーバイオファクトリー株式会社（OP Bio Factory Co., Ltd、日本国沖縄県）から購入した。
【0037】
培養条件
種培養培地は、１．２％海塩水溶液に溶解させた１％トリプトン、０．２％酵母エキスおよび２％グルコースを含有するものとした。
大量培養は、ｐＨコントローラーを備えた５Ｌのエアリフト式バイオリアクター（初期培地３．０Ｌ）で行った。培地の混合はエアバブリングで行った。バイオリアクターは、２５±１．２℃に維持された清浄空間に設置した。大量培養培地は、グルコース３．６％、グルタミン酸ナトリウム０．５％、トリプトン１．０％、酵母エキス０．２％、および海塩１．０％を含有するものとした。空気は１．２ｖｖｍ（volume per volume per minute）で供給した。気泡を作るために、空気をセラミックス製スパージャーに通した。細胞は、１．０Ｍ ＮａＯＨの添加によって制御されたｐＨ７．４の培地で増殖させ、接種後７２時間で収穫した。７２時間培養の間に、培地中のグルコース含量は０．２％以下に達した。収穫された細胞は凍結乾燥され、－２５℃で保存された。
種培養培地は、１．２％海塩水溶液に溶解させた１％トリプトン、０．２％酵母エキスおよび２％グルコースを含有するものとした。
大量培養は、ｐＨコントローラーを備えた５Ｌのエアリフト式バイオリアクター（初期培地３．０Ｌ）で行った。培地の混合はエアバブリングで行った。バイオリアクターは、２５±１．２℃に維持された清浄空間に設置した。大量培養培地は、グルコース３．６％、グルタミン酸ナトリウム０．５％、トリプトン１．０％、酵母エキス０．２％、および海塩１．０％を含有するものとした。空気は１．２ｖｖｍ（volume per volume per minute）で供給した。気泡を作るために、空気をセラミックス製スパージャーに通した。細胞は、１．０Ｍ ＮａＯＨの添加によって制御されたｐＨ７．４の培地で増殖させ、接種後７２時間で収穫した。７２時間培養の間に、培地中のグルコース含量は０．２％以下に達した。収穫された細胞は凍結乾燥され、－２５℃で保存された。
【0038】
Ｍ－グリセリドの抽出と単離
凍結乾燥細胞材料１０ｇからクロロホルム／メタノールの容量比２：１の混合溶媒で脂質を抽出した。抽出液に対して、０．９％ＮａＣｌ溶液を０．２部添加した。遠心分離後、下相を分離し、減圧下でロータリーエバポレーターを用いて蒸発させた。残渣をクロロホルムで溶解し、シリカゲルクロマトグラフィー（ベッド容積：２０ｍＬ、クロロホルムを用いて調製）で分画し、１００ｍＬのクロロホルム、クロロホルム／メタノール混合溶媒（容量比９：１）、およびクロロホルム／メタノール混合溶媒（容量比１：４）で溶出した。リン脂質（ＰＬ）画分をクロロホルム／メタノール混合溶媒（容量比１：４）から回収した。溶媒を除去した後、ＰＬ画分をクロロホルム／メタノール／水混合溶媒（容量比５：５：１）に再懸濁した。この懸濁液をＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ａ２５（２０ ｍＬ、formateタイプ）に適用し、１００ ｍＬのクロロホルム／メタノール／水混合溶媒（容量比５：５：１）をカラムに通し、次いで１００ ｍＬのクロロホルム／メタノール／０．２Ｍ ギ酸アンモニウム（容量比５：５：１）をカラムに通した。酸性ＰＬ画分をアンモニウム塩含有溶媒で溶出した。溶出液を減圧下で蒸発させた。Ｍ－グリセリドおよび酸性ＰＬ含有残渣を０．１％リン酸含有水に懸濁した。この懸濁液からＭ－グリセリドをｎ－ヘキサンを用いて抽出した。
凍結乾燥細胞材料１０ｇからクロロホルム／メタノールの容量比２：１の混合溶媒で脂質を抽出した。抽出液に対して、０．９％ＮａＣｌ溶液を０．２部添加した。遠心分離後、下相を分離し、減圧下でロータリーエバポレーターを用いて蒸発させた。残渣をクロロホルムで溶解し、シリカゲルクロマトグラフィー（ベッド容積：２０ｍＬ、クロロホルムを用いて調製）で分画し、１００ｍＬのクロロホルム、クロロホルム／メタノール混合溶媒（容量比９：１）、およびクロロホルム／メタノール混合溶媒（容量比１：４）で溶出した。リン脂質（ＰＬ）画分をクロロホルム／メタノール混合溶媒（容量比１：４）から回収した。溶媒を除去した後、ＰＬ画分をクロロホルム／メタノール／水混合溶媒（容量比５：５：１）に再懸濁した。この懸濁液をＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ａ２５（２０ ｍＬ、formateタイプ）に適用し、１００ ｍＬのクロロホルム／メタノール／水混合溶媒（容量比５：５：１）をカラムに通し、次いで１００ ｍＬのクロロホルム／メタノール／０．２Ｍ ギ酸アンモニウム（容量比５：５：１）をカラムに通した。酸性ＰＬ画分をアンモニウム塩含有溶媒で溶出した。溶出液を減圧下で蒸発させた。Ｍ－グリセリドおよび酸性ＰＬ含有残渣を０．１％リン酸含有水に懸濁した。この懸濁液からＭ－グリセリドをｎ－ヘキサンを用いて抽出した。
【0039】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
抽出物からＭ－グリセリドを精製するために、蛍光指示薬を含むＴＬＣシリカゲルプレートに塗布し、展開溶媒としてクロロホルム／メタノール／水混合溶媒（容量比５：５：１）を用いて展開した。Ｍ－グリセリドはＲｆ０．７３で泳動した。紫外線下で、Ｍ－グリセリドバンドをプレートから削り取り、クロロホルム／メタノール混合溶媒（容量比１：４）で溶出させた。Ｍ－グリセリドは、同じ溶媒系を用いてシリカゲルプレート上に再度クロマトグラフィーされた。精製されたＭ－グリセリドは、さらなる構造解析のために利用された。
抽出物からＭ－グリセリドを精製するために、蛍光指示薬を含むＴＬＣシリカゲルプレートに塗布し、展開溶媒としてクロロホルム／メタノール／水混合溶媒（容量比５：５：１）を用いて展開した。Ｍ－グリセリドはＲｆ０．７３で泳動した。紫外線下で、Ｍ－グリセリドバンドをプレートから削り取り、クロロホルム／メタノール混合溶媒（容量比１：４）で溶出させた。Ｍ－グリセリドは、同じ溶媒系を用いてシリカゲルプレート上に再度クロマトグラフィーされた。精製されたＭ－グリセリドは、さらなる構造解析のために利用された。
【0040】
Ｍ－グリセリドのアセチル化
上記で得られた精製Ｍ－グリセリドは、メタノール溶解１．５Ｍ ＮａＯＨ中で、２５℃で１時間の弱アルカリ加水分解にかけられた（Kaya, K., Uchida, K. & Kusumi, T. Identification of taurine-containing lipid in tetrahymena pyriformisNT-1. Biochim. Biophys. Acta 835, 77-82 (1985).を参照のこと。なお、この文献の関連部分はその関連により本明細書中に取り込まれる。）。
上記で得られた精製Ｍ－グリセリドは、メタノール溶解１．５Ｍ ＮａＯＨ中で、２５℃で１時間の弱アルカリ加水分解にかけられた（Kaya, K., Uchida, K. & Kusumi, T. Identification of taurine-containing lipid in tetrahymena pyriformisNT-1. Biochim. Biophys. Acta 835, 77-82 (1985).を参照のこと。なお、この文献の関連部分はその関連により本明細書中に取り込まれる。）。
【0041】
加水分解後、加水分解物のｐＨを１．５Ｍ ＨＣｌで４．０に調節した。Ｍ－グリセリドから遊離した脂肪酸をｎ－ヘキサンで抽出した。１．０Ｍ ＮａＯＨで中和した後、水相をＮ２の流れの下で蒸発させて乾燥させた。残渣をピリジン／無水酢酸混合溶媒（容量比１：４）を用いて、２５℃で一晩かけてアセチル化した。反応後、溶液をＮ２の流れの下で乾燥させた。残渣をｎ－ヘキサンに懸濁し、ＴＬＣプレート上に滴下し、溶媒としてクロロホルム／メタノール／水混合溶媒（容量比５：５：１）を用いて展開した。ＴＬＣ上のアセチル化Ｍ－グリセリドは、２０％ Ｈ２ＳＯ４を噴霧した後の炭化（charring)により検出された。アセチル化脂質のＲｆ値は０．６１であった。アセチル化Ｍ－グリセリドをプレートから掻き取り、クロロホルム／メタノール混合溶媒（容量比１：４）で抽出した。その結果、Ｎ２流下で乾燥させた後、無色のペースト状の物質が得られ、これをＮＭＲおよびＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に利用した。
【0042】
Ｍ－グリセリドのＨＰＬＣ分析
Ｍ－グリセリドは、ポンプ（ＬＣ－２０ＡＤ）、コントローラー、脱ガス装置、カラムオーブン、ＰＤＡ検出器、およびワークステーションからなる島津プロミネンスＨＰＬＣを用いてさらに精製した。
Ｍ－グリセリドは、ポンプ（ＬＣ－２０ＡＤ）、コントローラー、脱ガス装置、カラムオーブン、ＰＤＡ検出器、およびワークステーションからなる島津プロミネンスＨＰＬＣを用いてさらに精製した。
【0043】
ＨＰＬＣの条件は以下の通りであった：
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ ５ ＮＨ４カラム（４．６×１５０ ｍｍ）；
カラム温度：４０℃；
移動相：アセトニトリル／メタノール／リン酸でｐＨ４．０に調整した水中の０．２％トリメチルアミン混合溶媒（容量比６７０：２２０：１１０）；
流速：１．０ ｍＬ／ｍｉｎ。
その結果、２０５ｎｍにピークが検出された。
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ ５ ＮＨ４カラム（４．６×１５０ ｍｍ）；
カラム温度：４０℃；
移動相：アセトニトリル／メタノール／リン酸でｐＨ４．０に調整した水中の０．２％トリメチルアミン混合溶媒（容量比６７０：２２０：１１０）；
流速：１．０ ｍＬ／ｍｉｎ。
その結果、２０５ｎｍにピークが検出された。
【0044】
脂肪酸のガスクロマトグラフィー分析
Ｍ－グリセリドの脂肪酸を１４％ ＢＦ３－メタノール溶液を用いて７０℃で２０分間かけて、メチルエステルに転化した。脂肪酸メチルエステルの分析は、ＤＢ－２３カラム（長さ６０ｍ×内径０．２５ｍｍ、膜厚０．１５μｍ； J&W Scientific製）を用いたＧＣ－ＦＩＤ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ－２０２５、島津製作所製）を用いて行った。
Ｍ－グリセリドの脂肪酸を１４％ ＢＦ３－メタノール溶液を用いて７０℃で２０分間かけて、メチルエステルに転化した。脂肪酸メチルエステルの分析は、ＤＢ－２３カラム（長さ６０ｍ×内径０．２５ｍｍ、膜厚０．１５μｍ； J&W Scientific製）を用いたＧＣ－ＦＩＤ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ－２０２５、島津製作所製）を用いて行った。
【0045】
ガスクロマトグラフィー分析の操作条件は以下の通りであった：
カラム温度： ５０℃を１分間保持、（２５℃／ｍｉｎの速度で）１７５℃に昇温、次いで（４℃／ｍｉｎの速度で）２３０℃に昇温して、５分間保持；
ＦＩＤポート温度：２５０℃；
キャリアガス（Ｈｅ）流量：２．０６ ｍＬ／ｍｉｎ；
ＦＩＤ水素ガス流量：４０ ｍＬ／ｍｉｎ；
空気流量４５０ ｍＬ／ｍｉｎ。
カラム温度： ５０℃を１分間保持、（２５℃／ｍｉｎの速度で）１７５℃に昇温、次いで（４℃／ｍｉｎの速度で）２３０℃に昇温して、５分間保持；
ＦＩＤポート温度：２５０℃；
キャリアガス（Ｈｅ）流量：２．０６ ｍＬ／ｍｉｎ；
ＦＩＤ水素ガス流量：４０ ｍＬ／ｍｉｎ；
空気流量４５０ ｍＬ／ｍｉｎ。
【0046】
ＮＭＲ
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）および１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ）スペクトルをＪＥＯＬ ＪＮＭ－ＥＣＡ５００分光計（日本電子株式会社製）を用いて記録した。ＣＤＣｌ３またはＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ（容積比１：１）を溶媒として使用した。
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ）および１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ）スペクトルをＪＥＯＬ ＪＮＭ－ＥＣＡ５００分光計（日本電子株式会社製）を用いて記録した。ＣＤＣｌ３またはＣＤＣｌ３／ＣＤ３ＯＤ（容積比１：１）を溶媒として使用した。
【0047】
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ
ＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルは、Ｎｅｘｅｒａ ＵＨＰＬＣおよび四重極飛行時間型（Ｑ－ＴＯＦ型）質量分析計（ＬＣＭＳ－９０３０、島津製作所製）から構成されるＬＣ／Ｑ－ＴＯＦシステム上で記録した。
ＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルは、Ｎｅｘｅｒａ ＵＨＰＬＣおよび四重極飛行時間型（Ｑ－ＴＯＦ型）質量分析計（ＬＣＭＳ－９０３０、島津製作所製）から構成されるＬＣ／Ｑ－ＴＯＦシステム上で記録した。
【0048】
ＬＣ条件は以下の通りであった：
カラム： Ｋｉｎｅｔｅｘ Ｃ８ （内径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、膜厚２．６μｍ）、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製（アメリカ合衆国）；
溶媒：均一溶媒（isocratic)、２０ｍＭ ギ酸アンモニウム３０％と、アセトニトリル／イソプロパノール混合溶媒（容量比１：１）７０％
流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ；
カラム温度：４０℃。
カラム： Ｋｉｎｅｔｅｘ Ｃ８ （内径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、膜厚２．６μｍ）、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製（アメリカ合衆国）；
溶媒：均一溶媒（isocratic)、２０ｍＭ ギ酸アンモニウム３０％と、アセトニトリル／イソプロパノール混合溶媒（容量比１：１）７０％
流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ；
カラム温度：４０℃。
【0049】
ＭＳ条件は以下の通りであった。
イオン化モード：ＥＳＩポジティブ／ネガティブ；
キャピラリー電圧：４．５ｋＶ（ポジティブ）／３．５ｋＶ（ネガティブ）；
乾燥ガス：１０Ｌ／ｍｉｎ；
ネブライザガス：２．０Ｌ／ｍｉｎ；
加熱ガス：１０Ｌ／ｍｉｎ；
界面温度：３００℃。
イオン化モード：ＥＳＩポジティブ／ネガティブ；
キャピラリー電圧：４．５ｋＶ（ポジティブ）／３．５ｋＶ（ネガティブ）；
乾燥ガス：１０Ｌ／ｍｉｎ；
ネブライザガス：２．０Ｌ／ｍｉｎ；
加熱ガス：１０Ｌ／ｍｉｎ；
界面温度：３００℃。
【0050】
細胞増殖活性
オーランチオキトリウムの上記株の細胞を、様々な濃度（１．０～１０００μＭ）のＭ－グリセリドまたは（０．１～１００μＭ）のアセチル化Ｍ－グリセリドを含む増殖培地（１％トリプトン、０．２％酵母エキス、２％グルコース、および１．２％海塩）を用いて、２５℃で２４時間または４８時間、１６ウェルプレートで培養した。
オーランチオキトリウムの上記株の細胞を、様々な濃度（１．０～１０００μＭ）のＭ－グリセリドまたは（０．１～１００μＭ）のアセチル化Ｍ－グリセリドを含む増殖培地（１％トリプトン、０．２％酵母エキス、２％グルコース、および１．２％海塩）を用いて、２５℃で２４時間または４８時間、１６ウェルプレートで培養した。
【0051】
データの利用可能性
この分析データをＨＰＬＣで検証した。表５に示すように、ＨＰＬＣによる定量データが得られた。この定量法をＭ－グリセリドの分析に適用したところ、標準偏差（ＳＤ）は平均値（ｎ＝４）の５．５％未満であった。このことから、この方法の正確性はＭ－グリセリドの同定法としては十分であることが示された。
この分析データをＨＰＬＣで検証した。表５に示すように、ＨＰＬＣによる定量データが得られた。この定量法をＭ－グリセリドの分析に適用したところ、標準偏差（ＳＤ）は平均値（ｎ＝４）の５．５％未満であった。このことから、この方法の正確性はＭ－グリセリドの同定法としては十分であることが示された。
【0052】
＜結果＞
Ｍ－グリセリドの分画精製
上記したように接種後７２時間後に細胞を採取し、凍結乾燥した細胞の約０．２％としてＭ－グリセリドの収量を得た。Ｍ－グリセリドは、クロロホルム／メタノール／水混合溶媒（容量比５：５：１）を溶媒として用いたＴＬＣ上でＲｆ ０．７３を示した。ＴＬＣプレート上のスポットは、モリブデン試薬（Dittmer, J. C. & Lester, R. L. A simple, specific spray for the detection of phospholipids on thin-layer chromatograms. J. Lipid Res. 5, 126-127 (1964)を参照のこと。なお、この文献の関連部分はその関連により本明細書中に取り込まれる。）に対して陰性であった。
Ｍ－グリセリドの分画精製
上記したように接種後７２時間後に細胞を採取し、凍結乾燥した細胞の約０．２％としてＭ－グリセリドの収量を得た。Ｍ－グリセリドは、クロロホルム／メタノール／水混合溶媒（容量比５：５：１）を溶媒として用いたＴＬＣ上でＲｆ ０．７３を示した。ＴＬＣプレート上のスポットは、モリブデン試薬（Dittmer, J. C. & Lester, R. L. A simple, specific spray for the detection of phospholipids on thin-layer chromatograms. J. Lipid Res. 5, 126-127 (1964)を参照のこと。なお、この文献の関連部分はその関連により本明細書中に取り込まれる。）に対して陰性であった。
【0053】
精製されたＭ－グリセリドのＨＰＬＣクロマトグラムでは、図１に示すように、２つのピークがＲｔ－１２．５４分（Peak I）と１４．４８分（Peak II）で検出された。Peak Iは全面積の８５％、Peak IIは全面積の１５％をそれぞれ占めていた。このＭ－グリセリドは、実験に供したオーランチオキトリウム ＳＹＬＲ６＃３株およびＮＢ６－３株のいずれに関しても検出された。
【0054】
Ｍ－グリセリドのＮＭＲおよびＭＳスペクトルの解析
Ｍ－グリセリドのPeak Iの１Ｈおよび１３Ｃ－ＮＭＲ化学シフトを表１に示す。１Ｈ－１Ｈ－ＣＯＳＹ、ＤＥＰＴ、ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣの２次元スペクトルが得られた。これらのスペクトルから、グリセロールの存在が判明した。プロトンはＨ－１（２Ｈ，δ，４．１３ｐｐｍ）、Ｈ－２（１Ｈ，ｄ，５．２６ｐｐｍ）、Ｈ－３（２Ｈ，δ，３．７３ｐｐｍ）と割り当てられた。さらに、グリセロールの１位および２位の炭素は脂肪酸でエステル化されていた。また、グリセロールのＣ－３はエーテル結合により極性部位と結合していた。１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルでは、１６０～１８０ｐｐｍの間に４つの第４級炭素が検出された。ＨＭＢＣスペクトルから、ＤＰＡ Ｉ（１７３．３８ ｐｐｍ）およびＤＰＡ ＩＩ （１７３．６７ ｐｐｍ）のＣ－１の炭素がエステル化されたものとして割り当てられていることが示唆された。また、１７７．１７ｐｐｍの化学シフトから、Ｍ－グリセリドにはカルボン酸基が存在することが示唆された。また、１６９．３４ｐｐｍの第四級炭素はモルホリン環のＣ－３（＞Ｃ＝Ｏ）のカルボニル炭素であることが示唆された。
Ｍ－グリセリドのPeak Iの１Ｈおよび１３Ｃ－ＮＭＲ化学シフトを表１に示す。１Ｈ－１Ｈ－ＣＯＳＹ、ＤＥＰＴ、ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣの２次元スペクトルが得られた。これらのスペクトルから、グリセロールの存在が判明した。プロトンはＨ－１（２Ｈ，δ，４．１３ｐｐｍ）、Ｈ－２（１Ｈ，ｄ，５．２６ｐｐｍ）、Ｈ－３（２Ｈ，δ，３．７３ｐｐｍ）と割り当てられた。さらに、グリセロールの１位および２位の炭素は脂肪酸でエステル化されていた。また、グリセロールのＣ－３はエーテル結合により極性部位と結合していた。１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルでは、１６０～１８０ｐｐｍの間に４つの第４級炭素が検出された。ＨＭＢＣスペクトルから、ＤＰＡ Ｉ（１７３．３８ ｐｐｍ）およびＤＰＡ ＩＩ （１７３．６７ ｐｐｍ）のＣ－１の炭素がエステル化されたものとして割り当てられていることが示唆された。また、１７７．１７ｐｐｍの化学シフトから、Ｍ－グリセリドにはカルボン酸基が存在することが示唆された。また、１６９．３４ｐｐｍの第四級炭素はモルホリン環のＣ－３（＞Ｃ＝Ｏ）のカルボニル炭素であることが示唆された。
【0055】
ＮＭＲの結果から、Ｍ－グリセリドのPeak Iの構造は、ジアシルグリセリドとモルホリン部位（Ｃ７Ｈ１０ＮＯ５）がエーテル結合で結合したものと決定された。
【0056】
ＭＳスペクトルのネガティブイオンモードでは、Peak Iからのｍ／ｚ ９０４．５９４８ ［Ｃ５４Ｈ８２ＮＯ１０（ｃａｌｃｄ， ９０４．５９４４， Δ ０．４ ｍＤａ）］とPeak IIからのｍ／ｚ ８３０．５７８９，［Ｃ４８Ｈ８０ＮＯ１０（ｃａｌｃｄ， ８３０．５７８８， Δ ０．１ ｍＤａ）］の値が観測された。メジャーなPeak Iからは、ｍ／ｚ ５７４ ［ｍ／ｚ ９０４－３３０ （Ｃ２２Ｈ３４Ｏ２）］のフラグメントイオンが確認された。この遊離されたイオンは、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２＝５、ＤＰＡ）のニュートラル欠損によるものであった。他のフラグメントイオンは、ｍ／ｚ８８６［ｍ／ｚ ９０４からのＨ２Ｏの欠損］、３２９［Ｃ２２Ｈ３４Ｏ２－Ｈ（ＤＰＡ）］－、２４４［Ｃ１０Ｈ１５ＮＯ６－Ｈ］－、およびｍ／ｚ １８８［Ｃ７Ｈ１０ＮＯ５－Ｈ］－で観察された。Peak IIの場合、ｍ／ｚ ８１２［ｍ／ｚ ８３０からのＨ２Ｏの欠損］、５７４［ｍ／ｚ ８３０－２５６（Ｃ１６Ｈ３２Ｏ２）］、５００［ｍ／ｚ ８３０－３３０（Ｃ２２Ｈ３４Ｏ２）］、３２９［（Ｃ２２Ｈ３４Ｏ２）－Ｈ］－および２５５［（Ｃ１６Ｈ３２Ｏ２）－Ｈ］－、にフラグメントイオンが観察され、また、ｍ／ｚ ２４４［Ｃ１０Ｈ１５ＮＯ６－Ｈ］－および１８８［Ｃ７Ｈ１０ＮＯ５－Ｈ］－も検出された。ｍ／ｚ２５５のフラグメントイオンはパルミチン酸（Ｃ１６＝０）と推定された。また、Peak IとPeak IIとのいずれのスペクトルにも、ｍ／ｚ ２４４［［Ｃ１０Ｈ１５ＮＯ６－Ｈ］－、１８８［Ｃ７Ｈ１１ＮＯ５－Ｈ］－および１７０［Ｃ７Ｈ９ＮＯ４－Ｈ］－にフラグメントイオンが検出された。この結果から、Peak IとPeak IIは同じ部位から構成されていることが示唆された。これらの結果を表２にまとめた。
【0057】
ＭＳで得られたモルホリン部位の化学式は、ＮＭＲで得られたモルホリン部位の化学式（Ｃ７Ｈ１０ＮＯ５）とは異なっていた。ＭＳの結果から、モルホリン部位はＣ７Ｈ１２ＮＯ６であることが示唆された。モルホリン部位のＭＳデータは、［Ｃ７Ｈ１０ＮＯ５＋Ｈ２Ｏ］として説明される。これは、モルホリン部位のどこかで余分なＨ２Ｏが結合して水和物として存在していることを示唆している。ＮＭＲとＭＳの結果から、Peak IとPeak IIはＭ－グリセリドを主成分とし、その水和物を副成分として含んでいると考えられた（表２）。水和物のプロトンおよび関連する第四級炭素のシグナルはＮＭＲ分析には弱すぎるものであった。しかし、脂肪酸の１Ｈ－ＮＭＲシグナルの多くはモルホリン部位のシグナルと重なっており、モルホリン部位がどのようなものであるかは不明であった。
【0058】
アセチル化Ｍ－グリセリドの解明
モルホリン部位の構造を明らかにするために、Ｍ－グリセリド中の脂肪酸をアセチル基で置換した。アセチル化したＭ－グリセリドを逆相ＬＣ－Ｑ／ＴＯＦで分析した。ｍ／ｚ ３４８（Ｃ１４Ｈ２１ＮＯ９）の前駆体イオンをＬＣ－ＭＳ／ＭＳにかけたところ、Ｒｔ １．２２５分に全生成物イオンのイオンクロマトグラムに大きなピークが観測された。また、ｍ／ｚ ３６６（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ１０）の前駆体イオンでは、Ｒｔ １．１５２分に小さなブロードなピークが観測された（図２を参照のこと）。これらの結果は、Ｍ－グリセリドがＣ１４Ｈ２１ＮＯ９（Ｍ－グリセリド）をメジャーピーク（８６％）、Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ１０（Ｍ－グリセリド水和物）をマイナーピーク（１４％）として有していることを示すものであった。
モルホリン部位の構造を明らかにするために、Ｍ－グリセリド中の脂肪酸をアセチル基で置換した。アセチル化したＭ－グリセリドを逆相ＬＣ－Ｑ／ＴＯＦで分析した。ｍ／ｚ ３４８（Ｃ１４Ｈ２１ＮＯ９）の前駆体イオンをＬＣ－ＭＳ／ＭＳにかけたところ、Ｒｔ １．２２５分に全生成物イオンのイオンクロマトグラムに大きなピークが観測された。また、ｍ／ｚ ３６６（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ１０）の前駆体イオンでは、Ｒｔ １．１５２分に小さなブロードなピークが観測された（図２を参照のこと）。これらの結果は、Ｍ－グリセリドがＣ１４Ｈ２１ＮＯ９（Ｍ－グリセリド）をメジャーピーク（８６％）、Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ１０（Ｍ－グリセリド水和物）をマイナーピーク（１４％）として有していることを示すものであった。
【0059】
双方のグリセリドのポジティブモードおよびネガティブモードでのＬＣ－ＭＳ／ＭＳフラグメントを表３に示す。両モードで得られたアセチル化Ｍ－グリセリドとその水和物のフラグメントの正確なｍ／ｚの大部分は、互いによく一致していた。これらの結果は、グリセリドと水和物の構造が一致していることを示唆していた。
【0060】
フラグメントの化学式は、フラグメントのすべての構造がモルホリノプロピオン酸部位を含むことを示した。
【0061】
表２および表３に示すように、完全なＭ-グリセリドとアセチル化Ｍ-グリセリドの両方から、Ｃ１０Ｈ１５ＮＯ６（ネガティブモードではｍ／ｚ２４４およびポジティブモードではｍ／ｚ２４６）、Ｃ７Ｈ１１ＮＯ５（ネガティブモードではｍ／ｚ１８８）、およびＣ７Ｈ９ＮＯ４（ネガティブモードではｍ／ｚ１７０およびポジティブモードではｍ／ｚ１７２）のフラグメントの化学式が得られた。このことから、完全なＭ－グリセリドに含まれるモルホリノプロピオン酸部位は、アセチル化されたＭ－グリセリドに保存されていることが明らかになった。
【0062】
１Ｈ－１Ｈ ＣＯＳＹおよびＨＭＢＣ分光法による広範なＮＭＲ分析により、グリセロール、モルホリンおよびプロピオン酸のスピン系が明らかになった（表４を参照のこと）。２つのアセチル基の存在は、完全なグリセリドがジアシルグリセリドであることを支持した。モルホリンとグリセロールの単位では、モルホリンのＨ－２（δ ４．８４ ｐｐｍ）がモルホリンのＣ－２とグリセロールのＣ－３との間にエーテル結合があることを示唆していた。また、ＨＭＢＣスペクトルの相関もこの結合を支持するものであった。
【0063】
ＣＯＳＹスペクトルとＨＭＢＣスペクトルから、２－オキシ－３－オキソモルホリノプロピオン酸の構造を推論した。ＣＯＳＹスペクトルでは、モルホリン単位のＨ－５（δ ３．１８ｐｐｍ）からＨ－６（δ ３．７５ｐｐｍ）までの連結の関係が決定された。モルホリン環単位では、Ｈ－６（δ ３．７５ ｐｐｍ）とＣ－６（δ ６６．９１ ｐｐｍ）の化学シフトが、Ｃ－６は酸素原子に結合していることを示唆した。加えて、Ｈ－５（δ ３．１８ ｐｐｍ）とＣ－５（δ ４６．１６ ｐｐｍ）の化学シフトが、Ｃ－５は窒素原子に結合していることを示唆した。さらに、モルホリン環単位のＣ－３はＨＭＢＣスペクトルにおいて当該環のＨ－２およびＨ－５と相関していた。また、モルホリン環のＨ－６とＣ－２の間にもＨＭＢＣの相関が見られた。これらの結果から、モルホリン環を明らかにした。
【0064】
モルホリン部位のプロピオン酸単位において、Ｈ－２（δ ２．４５ｐｐｍ）からＨ－３（δ ３．４８ｐｐｍ）の連結の関係がＣＯＳＹスペクトルで観測され、そして、Ｃ－１（δ １７７．４２ｐｐｍ）とプロピオン酸単位のＨ－２およびＨ－３との相関がＨＭＢＣスペクトルにおいて認められた。また、ＨＭＢＣスペクトルは、プロピオン酸単位のＨ－３がモルホリン環単位のＣ－３およびＣ－５と相関していることも示した。
【0065】
これらの結果から、アセチル化Ｍ－グリセリドの構造は、１，２－ジアセチルグリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸（図３（ａ）参照のこと。）であることが明らかとなった。一方で、余剰のＨ２Ｏを含むアセチル化Ｍ－グリセリド（水和物）の構造はまだ不明であった。
【0066】
完全なＭ－グリセリドの解明
上記の構造は、完全なＭ－グリセリドとそのアセチル化誘導体の極性部位のＭＳ／ＭＳ断片化の.比較によって確認された。上記の結果から、表２のPeak Iのｍ／ｚ ９０４は、Peak IIのｍ／ｚ ８３０とともに｛［Ｍ－グリセリド水和物－Ｈ］－として示された。完全なＭ－グリセリドとそのアセチル化誘導体との双方のＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて、ｍ／ｚ ２４４［Ｃ１０Ｈ１５Ｏ６－Ｈ］－、１８８［Ｃ７Ｈ１１ＮＯ５－Ｈ］－及び１７０［Ｃ７Ｈ９ＮＯ４－Ｈ］－のフラグメントイオンが観測された。さらに、完全なＭ－グリセリドのモルホリン環上のＨＭＢＣ相関はアセチル化Ｍ－グリセリドのそれと同じであった。
上記の構造は、完全なＭ－グリセリドとそのアセチル化誘導体の極性部位のＭＳ／ＭＳ断片化の.比較によって確認された。上記の結果から、表２のPeak Iのｍ／ｚ ９０４は、Peak IIのｍ／ｚ ８３０とともに｛［Ｍ－グリセリド水和物－Ｈ］－として示された。完全なＭ－グリセリドとそのアセチル化誘導体との双方のＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて、ｍ／ｚ ２４４［Ｃ１０Ｈ１５Ｏ６－Ｈ］－、１８８［Ｃ７Ｈ１１ＮＯ５－Ｈ］－及び１７０［Ｃ７Ｈ９ＮＯ４－Ｈ］－のフラグメントイオンが観測された。さらに、完全なＭ－グリセリドのモルホリン環上のＨＭＢＣ相関はアセチル化Ｍ－グリセリドのそれと同じであった。
【0067】
完全なＭ－グリセリドは２つの脂肪酸分子から構成されていた。メジャーピークであるPeak I（図１）にはＤＰＡが２分子含まれており、マイナーピーク（Peak II）にはＤＰＡとパルミチン酸（Ｃ１６：０）が含まれていた。
【0068】
１Ｈ－および１３Ｃ－ＮＭＲスペクトル（表２）における完全なＭ－グリセリドのPeak IにおけるＤＰＡの化学シフトに関しては、ＤＰＡ－ＩおよびＤＰＡ－ＩＩのＣ－１が、それぞれ、δ １７３．３８ｐｐｍおよび１７３．６７ｐｐｍで観測された。
ＤＰＡ－Ｉ（δ ０．８９ｐｐｍ）およびＤＰＡ－ＩＩ（δ ０．９７ｐｐｍ）の炭素鎖末端として、ＤＰＡ－Ｉ（δ ２．２９ｐｐｍ）およびＤＰＡ－ＩＩ（δ ２．３７ｐｐｍ）のＨ－２、ＤＰＡ－Ｉ（δ １．５４ｐｐｍ）およびＤＰＡ－ＩＩ（δ １．５８ｐｐｍ）のＨ－３、並びにＤＰＡ－Ｉ（δ ０．８９ｐｐｍ）およびＤＰＡ－ＩＩ（δ ０．９７ｐｐｍ）の炭素鎖末端としてのＨ－２２が割り当てられた。また、ＤＰＡの二重結合関連シグナルである、－ＣＨ２－ＣＨ ２－ＣＨ＝ （δ ２．０７ｐｐｍ）、＝ＣＨ－ＣＨ ２－ＣＨ＝（δ ２．８５ｐｐｍ）および－ＣＨ＝ＣＨ－（δ ５．３８ｐｐｍ）もまた割り当てられた。
ＤＰＡ－Ｉ（δ ０．８９ｐｐｍ）およびＤＰＡ－ＩＩ（δ ０．９７ｐｐｍ）の炭素鎖末端として、ＤＰＡ－Ｉ（δ ２．２９ｐｐｍ）およびＤＰＡ－ＩＩ（δ ２．３７ｐｐｍ）のＨ－２、ＤＰＡ－Ｉ（δ １．５４ｐｐｍ）およびＤＰＡ－ＩＩ（δ １．５８ｐｐｍ）のＨ－３、並びにＤＰＡ－Ｉ（δ ０．８９ｐｐｍ）およびＤＰＡ－ＩＩ（δ ０．９７ｐｐｍ）の炭素鎖末端としてのＨ－２２が割り当てられた。また、ＤＰＡの二重結合関連シグナルである、－ＣＨ２－ＣＨ ２－ＣＨ＝ （δ ２．０７ｐｐｍ）、＝ＣＨ－ＣＨ ２－ＣＨ＝（δ ２．８５ｐｐｍ）および－ＣＨ＝ＣＨ－（δ ５．３８ｐｐｍ）もまた割り当てられた。
【0069】
ＤＰＡはω－３型とω－６型の２つの異性体を有する。異性体を確認するために、Peak ＩとPeak IIの脂肪酸をＫＭｎＯ４／ＫＩＯ４(Sano, T., Nohara, K., Shiraishi, F. & Kaya, K. A method for micro-determination of total microcystin content in waterblooms of cyanobacteria (blue-green algae). Int. J. Environ. Anal. Chem. 49, 163-170 (1992) を参照のこと。なお、この文献の関連部分はその関連により本明細書中に取り込まれる。）で酸化し、形成されたアルカン酸をＧＣでメチルエステル誘導体として同定した。ピークはＲｔ ４．７６３分に検出された。このＲｔは正真正銘のヘキサン酸メチルとよく一致した。これらの結果から、ＤＰＡはω－６ ドコサペンタエン酸と同定された。また、Peak IIの脂肪酸もω－６として同定された。
【0070】
以上の結果から、メジャーなＭ－グリセリドのPeak Iは、１，２－ジドコサペンタエンノイル－（Ｃ２２：５，ω－６）グリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルホリノプロピオン酸として解明され（図３（ｂ）を参照のこと。）、一方、マイナーなPeak IIは、１，２－パルミトイル－ドコサペンタエノイル－および／または１，２－ドコサペンタエノイル－パルミトイル－グリセリル－２’－オキシ－３’－オキソモルフォリノプロピオン酸と推定された。
【0071】
オーランチオキトリウム株ＳＹＬＲ６＃３の細胞周期におけるＭ－グリセリド含量の変化
オーランチオキトリウム株ＳＹＬＲ６＃３の培養中のＭ－グリセリドの含有量を調べたところ、その含有量にばらつきがあることがわかった（表５参照のこと。）。最も高い含有量（凍結乾燥細胞の０．４％）は、対数中期の細胞から得られた。対数末期（または初期静止期）の細胞では、Ｍ－グリセリド含量は約０．２％であり、徐々に減少し、死期まで一定の値を示した。中間定常期と死期の細胞では、その値は約０．１％であった。細胞のライフサイクルにおけるＭ－グリセリド含量の変化は、細胞の成長に関係していると考えられる。
オーランチオキトリウム株ＳＹＬＲ６＃３の培養中のＭ－グリセリドの含有量を調べたところ、その含有量にばらつきがあることがわかった（表５参照のこと。）。最も高い含有量（凍結乾燥細胞の０．４％）は、対数中期の細胞から得られた。対数末期（または初期静止期）の細胞では、Ｍ－グリセリド含量は約０．２％であり、徐々に減少し、死期まで一定の値を示した。中間定常期と死期の細胞では、その値は約０．１％であった。細胞のライフサイクルにおけるＭ－グリセリド含量の変化は、細胞の成長に関係していると考えられる。
【0072】
細胞増殖に及ぼすＭ－グリセリドの影響
Ｍ－グリセリドの細胞増殖活性を調べるために、Ｍ－グリセリドのPeak IをＨＰＬＣで単離した。Ｍ－グリセリドは、８６％のｄｉ－ＤＰＡ Ｍ－グリセリドと１４％のその水和物から構成されていた。また、アセチル化Ｍ－グリセリドは、上記Ｍ－グリセリドのそれと同比率で構成されていた。
Ｍ－グリセリドの細胞増殖活性を調べるために、Ｍ－グリセリドのPeak IをＨＰＬＣで単離した。Ｍ－グリセリドは、８６％のｄｉ－ＤＰＡ Ｍ－グリセリドと１４％のその水和物から構成されていた。また、アセチル化Ｍ－グリセリドは、上記Ｍ－グリセリドのそれと同比率で構成されていた。
【0073】
オーランチオキトリウム株ＳＹＬＲ６＃３細胞を、様々な濃度のＭ－グリセリドまたはアセチル化Ｍ－グリセリドを含む増殖培地を用いて、１６ウェルプレート中で２５℃で２４時間または４８時間培養した。Ｍ－グリセリドは、培地中で容易に乳化した。一方、アセチル化Ｍ－グルセリドは、培地中によく溶解した。Ｍ－グリセリドの場合、４８時間の培養では、１．０μＭの濃度でのみ細胞増殖が有意に刺激された（表６を参照のこと）。２４時間の培養では、１００μＭおよび１０００μＭの濃度で細胞増殖が阻害された。アセチル化Ｍ－グリセリドを調べたところ、培養４８時間では０．１μＭの濃度でのみ細胞増殖は有意に刺激された（表６）。アセチル化Ｍ－グリセリドの方がＭ－グリセリドよりも細胞増殖刺激効果が高いように思われる。この刺激効果はアセチル化Ｍ－グリセリドの溶解性に関係している可能性が高い。
【0074】
＜議論＞
Ｍ-グリセリド水和物
アセチル化Ｍ－グリセリド水和物の分子式（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ１０）がＭＳ／ＭＳスペクトル（表３）から得られた一方で、１Ｈ－ＮＭＲおよび１３Ｃ－ＮＭＲから得られたアセチル化Ｍ－グリセリドの分子式はＣ１４Ｈ２１ＮＯ９であった。また、ＭＳ／ＭＳから得られた分子式には余分なＨ２Ｏが含まれていた。余分なＨ２Ｏがモルホリン環と結合して水和物となった可能性が高い。もしＨ２Ｏがケトン水和物を形成したのであれば，モルホリン部位のＣ－２［＞Ｃ（－Ｏ－）２ ，９６．２２ ｐｐｍ］の化学シフトのように，［＞Ｃ（ＯＨ）２］の１３Ｃ－ＮＭＲの化学シフトは１００ ｐｐｍに現れるはずであった。しかし、Ｃ－３の化学シフトは１６３．９１ ｐｐｍに出現した（表４）。この化学シフトは、Ｃ－３がケトン水和物ではなく、ケトン（＞Ｃ＝Ｏ）であることを示唆している。さらに、アミド結合におけるケトン水和物の存在は知られていない。
Ｍ-グリセリド水和物
アセチル化Ｍ－グリセリド水和物の分子式（Ｃ１４Ｈ２３ＮＯ１０）がＭＳ／ＭＳスペクトル（表３）から得られた一方で、１Ｈ－ＮＭＲおよび１３Ｃ－ＮＭＲから得られたアセチル化Ｍ－グリセリドの分子式はＣ１４Ｈ２１ＮＯ９であった。また、ＭＳ／ＭＳから得られた分子式には余分なＨ２Ｏが含まれていた。余分なＨ２Ｏがモルホリン環と結合して水和物となった可能性が高い。もしＨ２Ｏがケトン水和物を形成したのであれば，モルホリン部位のＣ－２［＞Ｃ（－Ｏ－）２ ，９６．２２ ｐｐｍ］の化学シフトのように，［＞Ｃ（ＯＨ）２］の１３Ｃ－ＮＭＲの化学シフトは１００ ｐｐｍに現れるはずであった。しかし、Ｃ－３の化学シフトは１６３．９１ ｐｐｍに出現した（表４）。この化学シフトは、Ｃ－３がケトン水和物ではなく、ケトン（＞Ｃ＝Ｏ）であることを示唆している。さらに、アミド結合におけるケトン水和物の存在は知られていない。
【0075】
本実施例では、Ｍ－グリセリド中の水和物の位置を特定することはできなかった。おそらく、Ｍ－グリセリド中の水和物タイプの含有量が少なすぎて、１３Ｃ－ＮＭＲで第四級炭素［＞Ｃ（－ＯＨ）２］を検出することができなかったのではないかと考えられる。アセチル化Ｍ－グリセリドとその水和物のＭＳ／ＭＳスペクトルから、Ｍ－グリセリドの水和物は脱水によりＭ－グリセリドに変換されていることがわかった。
【0076】
Ｍ－グリセリド含量の変化と細胞増殖
Ｍ－グリセリド含量の変化が観察された。最も高い含有量が観察されたのは、有糸分裂期の対数期（接種後２４時間）の細胞であった。Ｍ－グリセリドは細胞分裂に重要な役割を果たしている可能性がある。最も可能性が高いのは、細胞分裂には内因性のＭ－グリセリドの濃度で十分であり、外因性のＭ－グリセリドは必要ないということである。対数期を過ぎると、内因性Ｍ－グリセリドの濃度が急激に低下し、細胞分裂が遅くなる。このとき、外因性Ｍ－グリセリドが取り込まれ、細胞増殖に利用されることがある。
Ｍ－グリセリド含量の変化が観察された。最も高い含有量が観察されたのは、有糸分裂期の対数期（接種後２４時間）の細胞であった。Ｍ－グリセリドは細胞分裂に重要な役割を果たしている可能性がある。最も可能性が高いのは、細胞分裂には内因性のＭ－グリセリドの濃度で十分であり、外因性のＭ－グリセリドは必要ないということである。対数期を過ぎると、内因性Ｍ－グリセリドの濃度が急激に低下し、細胞分裂が遅くなる。このとき、外因性Ｍ－グリセリドが取り込まれ、細胞増殖に利用されることがある。
【0077】
Ｍ－グリセリドは負に帯電した生物系界面活性剤（biosurfactant)である。高濃度（１００または１０００Ｍ）では、培養の２４時間後に細胞増殖が阻害された。アセチル化されたＭ－グリセリドによって誘導される阻害が明確に観察されなかったため、この阻害はＭ－グリセリドの界面活性作用に関連している可能性がある。
【0078】
天然物中のモルホリン誘導体
前記したように 天然物由来のモルホリン誘導体については、いくつかの報告があったが、本発明に係る物質は、モルホリン部位が脂質代謝物としてのジアシルグリセリドの構成成分であるという点でユニークなものである。すなわち、今回明らかになった極性部位である２－ヒドロキシ－３－オキソモルホリノプロピオン酸（オーラニン酸）は、新規なモルホリン誘導体である。このモルホリン誘導体含有グリセリドは、オーランチオキトリウム属をはじめとする生物のライフサイクルにおいて重要な役割を果たしている可能性がある。本発明に係る新規物質のように、天然物から単離されたモルホリン誘導体は、新薬の開発に貢献する可能性がある。
前記したように 天然物由来のモルホリン誘導体については、いくつかの報告があったが、本発明に係る物質は、モルホリン部位が脂質代謝物としてのジアシルグリセリドの構成成分であるという点でユニークなものである。すなわち、今回明らかになった極性部位である２－ヒドロキシ－３－オキソモルホリノプロピオン酸（オーラニン酸）は、新規なモルホリン誘導体である。このモルホリン誘導体含有グリセリドは、オーランチオキトリウム属をはじめとする生物のライフサイクルにおいて重要な役割を果たしている可能性がある。本発明に係る新規物質のように、天然物から単離されたモルホリン誘導体は、新薬の開発に貢献する可能性がある。
【0079】
【表1】
【0080】
【表2】
【0081】
【表3】
【0082】
【表4】
【0083】
【表5】
【0084】
【表6】
【図1】
【図2】
【図3】