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特開2022-22974抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を用いた医薬品及び検査キット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022022974
(43)【公開日】2022-02-07
(54)【発明の名称】抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を用いた医薬品及び検査キット
(51)【国際特許分類】
G01N 33/569 20060101AFI20220131BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20220131BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220131BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20220131BHJP
C07K 16/10 20060101ALN20220131BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20220131BHJP
【ＦＩ】
G01N33/569 L
A61P31/14
A61K39/395 S
A61K39/395 D
G01N33/531 A
C07K16/10 ZNA
C12N15/13
【審査請求】有
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021076810
(22)【出願日】2021-04-28
(31)【優先権主張番号】P 2020081543
(32)【優先日】2020-05-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2020115153
(32)【優先日】2020-07-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2020193808
(32)【優先日】2020-11-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】598041566
【氏名又は名称】学校法人北里研究所
(71)【出願人】
【識別番号】516255448
【氏名又は名称】株式会社Ｅｐｓｉｌｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】松村 佑太
(72)【発明者】
【氏名】東條 卓人
(72)【発明者】
【氏名】森本 拓也
(72)【発明者】
【氏名】石田 悠記
(72)【発明者】
【氏名】稲浦 峻亮
(72)【発明者】
【氏名】片山 和彦
(72)【発明者】
【氏名】芳賀 慧
(72)【発明者】
【氏名】戸高 玲子
(72)【発明者】
【氏名】澤田 成史
(72)【発明者】
【氏名】熊地 重文
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA19
4C085BA71
4C085DD23
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG02
4H045AA11
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA22
4H045EA29
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
【課題】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法、当該抗体を用いた医薬及び検査キットを提供する。
【解決手段】配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
【選択図】なし
【解決手段】配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
【請求項2】
配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット。
【請求項3】
配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を含有する医薬。
【請求項4】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療のための請求項３記載の医薬。
【請求項5】
抗体が、ＶＨＨ抗体、重鎖抗体又はＶＨＨ抗体多量体である、請求項１記載の方法、請求項２記載のキット、又は請求項３若しくは４記載の医薬。
【請求項6】
ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体である、請求項５記載の方法、キット又は医薬。
【請求項7】
ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインの１又は複数と、該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの１又は複数を連結した多量体である、請求項５記載の方法、キット又は医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法、当該抗体を用いた医薬及び検査キットに関する。
【背景技術】
【0002】
ＳＡＲＳコロナウイルス－２（Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２，；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）やＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）と同様ベータコロナウイルス属に属し、急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因となるＳＡＲＳ関連コロナウイルスである。２０１９年に中国湖北省武漢市付近で発生が初めて確認され、その後、ＣＯＶＩＤ－１９の世界的流行（パンデミック）を引き起こしている。
【0003】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、そのウイルスゲノムは２９，９０３塩基程度で、一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。また、ウイルス粒子（ビリオン）は、５０～２００ｎｍほどの大きさである。一般的なコロナウイルスと同様に、スパイクタンパク質、ヌクレオタンパク質、内在性膜タンパク質、エンベロープタンパク質として知られる４つのタンパク質と、ＲＮＡより構成されている。このうちヌクレオタンパク質がＲＮＡと結合してヌクレオカプシドを形成し、脂質と結合したスパイクタンパク質、内在性膜タンパク質、エンベロープタンパク質がその周りを取り囲んでエンベロープを形成する（非特許文献１、２）。
【0004】
スパイクタンパク質は、２つのサブユニット、Ｓ１及びＳ２からなる大きなＩ型膜貫通型タンパク質で、Ｓ１は主に、細胞表面の受容体を認識する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）が、Ｓ２には膜融合に必要な要素が含まれている。スパイクタンパク質は、中和抗体及びＴ細胞応答の誘導、並びに防御免疫において重要な役割を果たすとされている。
【0005】
Ｓ１に結合する既知の受容体には、ＡＣＥ２（アンジオテンシン変換酵素２）、ＤＰＰ４（ジペプチジルペプチダーゼ－４）、ＡＰＮ（アミノペプチダーゼＮ）、ＣＥＡＣＡＭ（癌胎児性抗原関連細胞接着分子１）、Ｏ－ａｃ Ｓｉａ（Ｏ－アセチル化シアル酸）があり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ヒトＡＣＥ２を介してヒト呼吸上皮細胞に感染することが報告されている（非特許文献３）。
【0006】
ＣＯＶＩＤ－１９のウイルス学的診断には主に遺伝子増幅法（ＰＣＲ）によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の遺伝子検出が行われている。ＰＣＲ検査は、現時点で使えるウイルス検査の中では最も正確とされているが、検査を実施するには時間や手間がかかり、ＰＣＲ検査を本当に必要な数まで拡大するのが難しいという問題が存在する。一方、ウイルスの検出には、ウイルスの遺伝物質を検出するＰＣＲとは異なり、ウイルス表面のタンパク質の断片を検出する抗原検査も存在する。抗原が検出できれば、高価な機械や訓練、労力がなくても、感染しているかどうかが数分で診断できる。したがって、信頼できる抗原検査があれば、検査規模を容易に拡大でき、自宅や診療現場でＣＯＶＩＤ－１９の診断ができるようになり、一刻も早い臨床現場への導入が求められている。また、血清中のウイルス特異的抗体を検出するイムノクロマト法や酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）を利用した血清学的診断法が検討されている。特に、ＣＯＶＩＤ－１９は、多くの症例において感染から発症までの潜伏期間が長いと考えられている。また、発症から１週間程度経過した後に症状が急速に悪化して重症肺炎に至るなど、臨床経過が長い症例も報告されている。そのため、ＣＯＶＩＤ－１９の診断において血清学的診断が有用となることが期待されている。
【0007】
一方、ラクダ科動物の血清中から見いだされた重鎖抗体の可変領域を利用した天然のシングルドメイン抗体であるＶＨＨ抗体は、その分子量がＩｇＧ抗体の１０分の１と小さく、耐酸性や耐熱性に優れる。また、ＩｇＧ抗体は培養細胞を用いて生産する必要があるが、ＶＨＨ抗体は大腸菌や酵母で生産できる。また、ＶＨＨ抗体は１本鎖のペプチドなので、蛋白質工学や化学修飾による機能の改変がしやすく、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を作製しやすいという特徴を有する。その一方で、基質との親和性が高いＶＨＨ抗体を取得するのは難しいという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 2020 Mar;579(7798):270-273.
【非特許文献2】A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 2020 Mar;579(7798):265-269.
【非特許文献3】Structure, Function, and Antigenicity of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein Cell. Volume 181, Issue 2, 16 April 2020, Pages 281-292.e6
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法、当該抗体を用いた医薬及び検査キットを提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を得るべく検討した結果、特定のアミノ酸数を有するＣＤＲ１～３をコンストラクトに含むＶＨＨ抗体ライブラリから、ｃＤＮＡディスプレイ法によるスクリーニングにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に反応性の高いクローンを得ることに成功した。
【0011】
すなわち、本発明は以下の１）～３）に係るものである。
１）配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
２）配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット。
３）配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を含有する医薬。
１）配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
２）配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット。
３）配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を含有する医薬。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出、すなわちＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症である急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の迅速な検出が可能となり、また当該疾患の予防又は治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】各ラウンドのセレクション後に出現した抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体候補の出現頻度の分布（上位１０に絞って表示）。矢印はＣｏＶＨＨ１の出現頻度を示す。
【図2】セレクションにより選抜されたＣｏＶＨＨ１とＣｏＶＨＨ１変異体のアミノ酸配列のアライメント図。＊は保存されたアミノ酸を示す。ＣｏＶＨＨ１のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸が置換されている場所を四角で囲うことで示した。
【図3】ＶＨＨ遺伝子を組み込んだ枯草菌培養上清についてのウエスタンブロッティング像。＊は目的タンパク質のバンドを示す。
【図4】バイオレイヤー干渉法によるＣｏＶＨＨ１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１タンパク質に対する結合活性測定。灰色線は計測された生データに基づく結合乖離曲線、黒線はフィッティング後の結合乖離曲線を示す。
【図5】ＥＬＩＳＡ法によるＣｏＶＨＨ１とＣｏＶＨＨ１二量体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１タンパク質に対する結合活性測定。
【図6】サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＣｏＶＨＨ１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１タンパク質に対する結合活性測定。
【図7】ＥＬＩＳＡ法によるＣｏＶＨＨ１のコロナウイルスＳ１タンパク質に対する結合特異性評価。
【図8】バイオレイヤー干渉法によるＣｏＶＨＨ１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１タンパク質に対する結合活性測定。黒線は計測された生データに基づく結合乖離曲線、灰色線はフィッティング後の結合乖離曲線を示す。
【図9】表面プラズモン共鳴法によるＣｏＶＨＨ１のｐＨ７．４におけるＳ１タンパク質に対する結合活性測定。黒線は計測された生データに基づく結合乖離曲線、灰色線はフィッティング後の結合乖離曲線を示す。
【図10】表面プラズモン共鳴法によるＣｏＶＨＨ１のｐＨ６．５におけるＳ１タンパク質に対する結合活性測定。黒線は計測された生データに基づく結合乖離曲線、灰色線はフィッティング後の結合乖離曲線を示す。
【図11】サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＣｏＶＨＨ１のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１タンパク質に対する結合活性測定。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体（以下、「本発明の抗体」と称する）は、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有する、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体である。
【0015】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、急性呼吸器疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因となる、ＳＡＲＳ関連コロナウイルスであり、そのウイルスゲノムは２９，９０３塩基程度の一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスである。本発明の抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体であるが、詳細には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のうちのＳ１サブユニットに結合する抗体である。
【0016】
本発明の抗体の構造ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の３つのＣＤＲを有する。ＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ；相補性決定領域）とは、配列可変な抗原認識部位又はランダム配列領域を含み、超可変領域とも云われる。本発明の抗体の構造ドメインにおいて、３つのＣＤＲは、Ｎ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の順で存在する。
【0017】
本発明の抗体の構造ドメインにおいて、
ＣＤＲ１は、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲ２は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲ３は、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる。
ここで、配列番号１で示されるアミノ酸配列はＧＳＴＦＳＤＹＶＭＡであり、配列番号２で示されるアミノ酸配列ＴＩＳＲＮＧＧＴＴＴであり、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３のアミノ酸配列はＶＧＧＤＧＤＳである。
ＣＤＲ１は、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲ２は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲ３は、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなる。
ここで、配列番号１で示されるアミノ酸配列はＧＳＴＦＳＤＹＶＭＡであり、配列番号２で示されるアミノ酸配列ＴＩＳＲＮＧＧＴＴＴであり、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３のアミノ酸配列はＶＧＧＤＧＤＳである。
【0018】
上記配列番号１～３で示されるアミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲは、配列番号１～３で示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲに変異が導入されたＣＤＲを意味する。また、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３に変異が導入されていても、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する結合能を有している限り、本発明の抗体のＣＤＲに包含される。
ここで、置換されるアミノ酸の位置は限定されないが、好ましい位置として、ＣＤＲ１においては３、４、５又は１０番目が挙げられ、ＣＤＲ２においては３、４、５、６、７、８、９又は１０番目が挙げられ、ＣＤＲ３においては１、２、３又は４番目が挙げられる。
また、置換後のアミノ酸の種類は限定されないが、好ましい置換として、極性や大きさが類似のアミノ酸への置換が挙げられる。また、スレオニン残基のアスパラギン残基、イソロイシン残基またはメチオニン残基への置換、フェニルアラニン残基のイソロイシン残基への置換、セリン残基のアルギニン残基またはアスパラギン残基への置換、アラニン残基のスレオニン残基への置換、アルギニン残基のセリン残基への置換、アスパラギン残基のチロシン残基への置換、グリシン残基のセリン残基への置換、バリン残基のフェニルアラニン残基またはイソロイシン残基への置換、アスパラギン酸残基のグリシン残基またはバリン残基への置換も好ましい置換として挙げられる。
置換されるアミノ酸の位置及び置換後のアミノ酸の種類の好ましい組み合わせとしては、ＣＤＲ１においては、３番目のスレオニン残基のアスパラギン残基への置換、４番目のフェニルアラニン残基のイソロイシン残基への置換、５番目のセリン残基のアルギニン残基への置換、１０番目のアラニン残基のスレオニン残基への置換、
ＣＤＲ２においては、３番目のセリン残基のアスパラギン残基への置換、４番目アルギニン残基のセリン残基への置換、５番目のアスパラギン残基のチロシン残基への置換、６番目のグリシン残基のセリン残基への置換、７番目のグリシン残基のセリン残基への置換、８番目のスレオニン残基のメチオニン残基への置換、９番目のスレオニン残基のイソロイシン残基への置換、１０番目のスレオニン残基のメチオニン残基への置換、
ＣＤＲ３においては、１番目のバリン残基のイソロイシン残基への置換、３番目のグリシン残基のバリン残基への置換、４番目のアスパラギン酸残基のグリシン残基またはバリン残基への置換、が好ましい。
ここで、置換されるアミノ酸の位置は限定されないが、好ましい位置として、ＣＤＲ１においては３、４、５又は１０番目が挙げられ、ＣＤＲ２においては３、４、５、６、７、８、９又は１０番目が挙げられ、ＣＤＲ３においては１、２、３又は４番目が挙げられる。
また、置換後のアミノ酸の種類は限定されないが、好ましい置換として、極性や大きさが類似のアミノ酸への置換が挙げられる。また、スレオニン残基のアスパラギン残基、イソロイシン残基またはメチオニン残基への置換、フェニルアラニン残基のイソロイシン残基への置換、セリン残基のアルギニン残基またはアスパラギン残基への置換、アラニン残基のスレオニン残基への置換、アルギニン残基のセリン残基への置換、アスパラギン残基のチロシン残基への置換、グリシン残基のセリン残基への置換、バリン残基のフェニルアラニン残基またはイソロイシン残基への置換、アスパラギン酸残基のグリシン残基またはバリン残基への置換も好ましい置換として挙げられる。
置換されるアミノ酸の位置及び置換後のアミノ酸の種類の好ましい組み合わせとしては、ＣＤＲ１においては、３番目のスレオニン残基のアスパラギン残基への置換、４番目のフェニルアラニン残基のイソロイシン残基への置換、５番目のセリン残基のアルギニン残基への置換、１０番目のアラニン残基のスレオニン残基への置換、
ＣＤＲ２においては、３番目のセリン残基のアスパラギン残基への置換、４番目アルギニン残基のセリン残基への置換、５番目のアスパラギン残基のチロシン残基への置換、６番目のグリシン残基のセリン残基への置換、７番目のグリシン残基のセリン残基への置換、８番目のスレオニン残基のメチオニン残基への置換、９番目のスレオニン残基のイソロイシン残基への置換、１０番目のスレオニン残基のメチオニン残基への置換、
ＣＤＲ３においては、１番目のバリン残基のイソロイシン残基への置換、３番目のグリシン残基のバリン残基への置換、４番目のアスパラギン酸残基のグリシン残基またはバリン残基への置換、が好ましい。
【0019】
なお、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する結合能は、当業者に公知の方法により評価できる。具体的には、後述する実施例に示すように、バイオレイヤー干渉法により、平衡乖離定数ＫＤを求めることにより評価できる。また、例えば抗原を固定したＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法、等温滴定カロリメトリー法、表面プラズモン共鳴測定法等を用いた方法によっても評価できる。
【0020】
本発明の抗体の構造ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の両端にフレームワーク領域を有するものであってもよい。
フレームワーク領域とは、抗体分子の可変領域において相補性決定領域を除く領域であり、保存性の高い領域を指す。
すなわち、本発明の構造ドメインは、一態様として、第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、ＣＤＲ２、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）、ＣＤＲ３及び第４フレームワーク領域（ＦＲ４）をこの順に有するものが挙げられる。
構造ドメインにおけるフレームワーク領域のアミノ酸配列としては以下のものが挙げられる。
ＦＲ１：配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ２：配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ３：配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ４：配列番号７で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
フレームワーク領域とは、抗体分子の可変領域において相補性決定領域を除く領域であり、保存性の高い領域を指す。
すなわち、本発明の構造ドメインは、一態様として、第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、ＣＤＲ２、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）、ＣＤＲ３及び第４フレームワーク領域（ＦＲ４）をこの順に有するものが挙げられる。
構造ドメインにおけるフレームワーク領域のアミノ酸配列としては以下のものが挙げられる。
ＦＲ１：配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ２：配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ３：配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ４：配列番号７で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【0021】
配列番号４～７で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるフレームワーク領域としては、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるフレームワーク領域が挙げられる。
【0022】
ここで、アミノ酸配列の同一性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときに両方の配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。配列同一性は、例えばＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ （Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用いて解析を行なうことにより算出できる。
【0023】
本発明の抗体のうち、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号７で示されるアミノ酸配列である構造ドメイン（配列番号９）を有する抗体は、後述する実施例において、ｃＤＮＡディスプレイ法によるスクリーニングにより得られた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に反応性の高いクローン（ＣｏＶＨＨ１）であり、好適な抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体である。
【0024】
本発明の抗体は、上記の構造ドメインを少なくとも１つ有するものであればその形態は限定されず、ＶＨＨ抗体のようなシングルドメイン抗体（ナノボディーとも呼ばれる）の他、一本鎖抗体、重鎖抗体、可変領域断片をペプチドリンカーなどで結合させた多量体、例えば二量体、更には、可変領域断片と抗原特異性の異なる可変領域断片の１または複数を連結した多量体であってもよい。
また、本発明の抗体はヒト化されていてもよい。ヒト化された抗体は、ヒトに投与することが可能であるため、医薬として応用することができる。
また、本発明の抗体はヒト化されていてもよい。ヒト化された抗体は、ヒトに投与することが可能であるため、医薬として応用することができる。
【0025】
本発明の抗体の作製方法は特に限定されず、当該技術分野における公知技術により容易に作製することができる。例えば、ペプチド固相合成法とネイティブ・ケミカル・リゲーション（Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ；ＮＣＬ）法を組み合わせて作製することや遺伝子工学的に作製することができるが、本発明の抗体をコードする核酸を適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞に導入し、組換え抗体として産生させる方法が好ましい。
【0026】
組換え抗体として産生において使用される宿主細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌、カビ、動物細胞、植物細胞、バキュロウイルス／昆虫細胞または酵母細胞等が挙げられる。
抗体を発現させるための発現用ベクターは、各種宿主細胞に適したベクターを用いることができる。発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のベクター；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のベクター；ｐＨＹ３００ＰＬＫ等の大腸菌と枯草菌で共用することができるシャトルベクター；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来ベクター；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
これらの発現ベクターは、各々のベクターに適した、複製開始点、選択マーカー及びプロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写集結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位及びポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。さらに、発現ベクターには、発現したポリペプチドの精製を容易にするため、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ及びＧＳＴタグなどを融合させて発現させるための塩基配列が挿入されていてもよい。
抗体を発現させるための発現用ベクターは、各種宿主細胞に適したベクターを用いることができる。発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のベクター；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のベクター；ｐＨＹ３００ＰＬＫ等の大腸菌と枯草菌で共用することができるシャトルベクター；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来ベクター；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
これらの発現ベクターは、各々のベクターに適した、複製開始点、選択マーカー及びプロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写集結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位及びポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。さらに、発現ベクターには、発現したポリペプチドの精製を容易にするため、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ及びＧＳＴタグなどを融合させて発現させるための塩基配列が挿入されていてもよい。
【0027】
発現させた本発明の抗体を培養菌体または培養細胞から抽出する際には、培養後、公知の方法で菌体または培養細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／または凍結融解などによって菌体または細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により、可溶性抽出液を取得する。得られた抽出液から、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて目的の抗体を取得することができる。
公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法または等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法または等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【0028】
本発明の抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合することから、これを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含有するか、または含有する可能性のある被験試料と接触させることによって、当該試料中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在すること、あるいは存在しないことを確認できる。
具体的には、本発明の抗体を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出は、本発明の抗体と、被験試料とを接触させ、本発明の抗体と前記被験試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との結合体を形成させる工程と、前記結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程、を備えてなる。
また、本発明の抗体は、血清中のウイルス特異的抗体の検出において、固定化した被験試料（血清）中に含まれる抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体（例えば血清抗体）に対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の一部を添加して結合させ、当該結合体状態にあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の存在を確認する抗体として使用することもできる。
具体的には、本発明の抗体を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出は、本発明の抗体と、被験試料とを接触させ、本発明の抗体と前記被験試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との結合体を形成させる工程と、前記結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程、を備えてなる。
また、本発明の抗体は、血清中のウイルス特異的抗体の検出において、固定化した被験試料（血清）中に含まれる抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体（例えば血清抗体）に対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の一部を添加して結合させ、当該結合体状態にあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原の存在を確認する抗体として使用することもできる。
【0029】
被験試料としては、気管スワブ、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、鼻腔洗浄液、鼻腔吸引液、鼻汁鼻かみ液、唾液、痰、血液、血清、尿、糞便、組織、細胞、組織又は細胞の破砕物等の生体試料の他、ウイルスが付着している可能性のある固体表面、例えばドアノブ、便器等から採取された試料が挙げられる。抗体は固相に固定されていてもよく、固相に固定されていなくてもよい。
上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程は、例えば、上記の結合体に、結合体中の本発明の抗体とは異なるエピトープを認識する、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を反応させることにより行うことができる。或いは、ホモジニアスアッセイにより、液相中で上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出してもよい。
上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する工程は、例えば、上記の結合体に、結合体中の本発明の抗体とは異なるエピトープを認識する、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体を反応させることにより行うことができる。或いは、ホモジニアスアッセイにより、液相中で上記の結合体中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出してもよい。
【0030】
また、本発明の抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出用キットの構成成分となり得る。当該キットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の診断薬として、またＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症治療薬の開発用のツールとして使用可能である。
当該検出キットは、本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の他、検出に必要な試薬及び器具、例えば抗体、固相担体、緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むことができる。
当該検出キットにおいて、本発明の抗体は固相に固定されていてもよい。固相としては、例えば、ビーズ、膜、反応容器の側面や底面、スライドガラス等の板状基板、イムノプレート等のウェル基板等が挙げられ、本発明の抗体が直接的又は間接的に固定される。
当該検出キットは、本発明の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体の他、検出に必要な試薬及び器具、例えば抗体、固相担体、緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むことができる。
当該検出キットにおいて、本発明の抗体は固相に固定されていてもよい。固相としては、例えば、ビーズ、膜、反応容器の側面や底面、スライドガラス等の板状基板、イムノプレート等のウェル基板等が挙げられ、本発明の抗体が直接的又は間接的に固定される。
【0031】
また、本発明の抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１サブユニットに結合し、ウイルスの細胞への結合を阻害することが考えられる。したがって、本発明の抗体は、哺乳動物に投与し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療するための医薬として利用することも可能である。哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ブタ等があげられるが、ヒトが好ましい。
本発明の抗体を医薬として用いる場合には、その態様は、経口、非経口のいずれでもよく、適宜、周知の薬学的に許容可能な無毒性の担体、希釈剤と組み合わせて用いることができる。非経口投与としては、典型的には注射剤が挙げられるが、噴霧剤等と共に吸入による投与も可能である。
本発明の抗体を医薬として用いる場合には、その態様は、経口、非経口のいずれでもよく、適宜、周知の薬学的に許容可能な無毒性の担体、希釈剤と組み合わせて用いることができる。非経口投与としては、典型的には注射剤が挙げられるが、噴霧剤等と共に吸入による投与も可能である。
【0032】
斯かる医薬において、その組成物中における本発明の抗体の含有量は適宜調整できる。
また、斯かる医薬は、本発明の抗体として、有効量を１週間に１～数回程度の間隔で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療が必要な対象、例えば患者に投与することにより適用することができる。この場合の投与方法としては、好適には静脈注射、点滴等が挙げられる。
また、斯かる医薬は、本発明の抗体として、有効量を１週間に１～数回程度の間隔で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療が必要な対象、例えば患者に投与することにより適用することができる。この場合の投与方法としては、好適には静脈注射、点滴等が挙げられる。
【0033】
本発明においては上述した実施形態に関し、さらに以下の態様が開示される。
＜１＞配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
＜２＞配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット。
＜３＞配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を含有する医薬。
＜４＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療のための＜３＞の医薬。
＜５＞抗体が、ＶＨＨ抗体、重鎖抗体又はＶＨＨ抗体多量体である、＜１＞の方法、＜２＞のキット、又は＜３＞若しくは＜４＞の医薬。
＜６＞ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体である、＜５＞の方法、キット又は医薬。
＜７＞ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインの１又は複数と、該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの１又は複数を連結した多量体である＜５＞の方法、キット又は医薬。
＜１＞配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を被験試料に接触させる工程を含む、試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出方法。
＜２＞配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を含有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出キット。
＜３＞配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を含有する医薬。
＜４＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療のための＜３＞の医薬。
＜５＞抗体が、ＶＨＨ抗体、重鎖抗体又はＶＨＨ抗体多量体である、＜１＞の方法、＜２＞のキット、又は＜３＞若しくは＜４＞の医薬。
＜６＞ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体である、＜５＞の方法、キット又は医薬。
＜７＞ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインの１又は複数と、該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの１又は複数を連結した多量体である＜５＞の方法、キット又は医薬。
【0034】
＜８＞医薬を製造するための、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体の使用。
＜９＞医薬として使用するための、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体。
＜１０＞医薬がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療のための医薬である、＜８＞の使用又は＜９＞の抗体。
＜１１＞配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を必要とする対象に投与する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療方法。
＜１２＞抗体が、ＶＨＨ抗体、重鎖抗体又はＶＨＨ抗体多量体である、＜８＞若しくは＜１０＞の使用、＜９＞若しくは＜１０＞の抗体、又は＜１１＞の方法。
＜１３＞ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体である、＜１２＞の使用、抗体又は方法。
＜１４＞ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインの１又は複数と、該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの１又は複数を連結した多量体である、＜１２＞の使用、抗体又は方法。
＜９＞医薬として使用するための、配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体。
＜１０＞医薬がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療のための医薬である、＜８＞の使用又は＜９＞の抗体。
＜１１＞配列番号１で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１と、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２と、配列番号３で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む構造ドメインを１つ以上有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に結合する抗体を必要とする対象に投与する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防又は治療方法。
＜１２＞抗体が、ＶＨＨ抗体、重鎖抗体又はＶＨＨ抗体多量体である、＜８＞若しくは＜１０＞の使用、＜９＞若しくは＜１０＞の抗体、又は＜１１＞の方法。
＜１３＞ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインを複数連結した多量体である、＜１２＞の使用、抗体又は方法。
＜１４＞ＶＨＨ抗体多量体が、前記構造ドメインの１又は複数と、該構造ドメインとは抗原特異性の異なる構造ドメインの１又は複数を連結した多量体である、＜１２＞の使用、抗体又は方法。
【0035】
＜１５＞配列番号１で示されるアミノ酸配列において１個のアミノ酸の他のアミノ酸への置換が、３番目のスレオニン残基のアスパラギン残基への置換、４番目のフェニルアラニン残基のイソロイシン残基への置換、５番目のセリン残基のアルギニン残基への置換、又は１０番目のアラニン残基のスレオニン残基への置換である、＜１＞の方法、＜２＞のキット、＜３＞若しくは＜４＞の医薬、＜８＞の使用、＜９＞の抗体、又は＜１１＞の方法。
＜１６＞配列番号２で示されるアミノ酸配列において１個のアミノ酸の他のアミノ酸への置換が、３番目のセリン残基のアスパラギン残基への置換、４番目アルギニン残基のセリン残基への置換、５番目のアスパラギン残基のチロシン残基への置換、６番目のグリシン残基のセリン残基への置換、７番目のグリシン残基のセリン残基への置換、８番目のスレオニン残基のメチオニン残基への置換、９番目のスレオニン残基のイソロイシン残基への置換、又は１０番目のスレオニン残基のメチオニン残基への置換である、＜１＞の方法、＜２＞のキット、＜３＞若しくは＜４＞の医薬、＜８＞の使用、＜９＞の抗体、又は＜１１＞の方法。
＜１７＞配列番号３で示されるアミノ酸配列において１個のアミノ酸の他のアミノ酸への置換が、ＣＤＲ３においては、１番目のバリン残基のイソロイシン残基への置換、３番目のグリシン残基のバリン残基への置換、又は４番目のアスパラギン酸残基のグリシン残基またはバリン残基への置換である、＜１＞の方法、＜２＞のキット、＜３＞若しくは＜４＞の医薬、＜８＞の使用、＜９＞の抗体、又は＜１１＞の方法。
＜１８＞構造ドメインが、第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、ＣＤＲ２、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）、ＣＤＲ３及び第４フレームワーク領域（ＦＲ４）をこの順に有するものである、＜１＞の方法、＜２＞のキット、＜３＞若しくは＜４＞の医薬、＜８＞の使用、＜９＞の抗体、又は＜１１＞の方法。
＜１９＞ＦＲ１～ＦＲ４が以下のアミノ酸配列からなる、＜１８＞の方法、キット、医薬、使用又は抗体。
ＦＲ１：配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ２：配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ３：配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ４：配列番号７で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
＜２０＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号７で示されるアミノ酸配列である、＜１８＞の方法、キット、医薬、使用又は抗体。
＜１６＞配列番号２で示されるアミノ酸配列において１個のアミノ酸の他のアミノ酸への置換が、３番目のセリン残基のアスパラギン残基への置換、４番目アルギニン残基のセリン残基への置換、５番目のアスパラギン残基のチロシン残基への置換、６番目のグリシン残基のセリン残基への置換、７番目のグリシン残基のセリン残基への置換、８番目のスレオニン残基のメチオニン残基への置換、９番目のスレオニン残基のイソロイシン残基への置換、又は１０番目のスレオニン残基のメチオニン残基への置換である、＜１＞の方法、＜２＞のキット、＜３＞若しくは＜４＞の医薬、＜８＞の使用、＜９＞の抗体、又は＜１１＞の方法。
＜１７＞配列番号３で示されるアミノ酸配列において１個のアミノ酸の他のアミノ酸への置換が、ＣＤＲ３においては、１番目のバリン残基のイソロイシン残基への置換、３番目のグリシン残基のバリン残基への置換、又は４番目のアスパラギン酸残基のグリシン残基またはバリン残基への置換である、＜１＞の方法、＜２＞のキット、＜３＞若しくは＜４＞の医薬、＜８＞の使用、＜９＞の抗体、又は＜１１＞の方法。
＜１８＞構造ドメインが、第１フレームワーク領域（ＦＲ１）、ＣＤＲ１、第２フレームワーク領域（ＦＲ２）、ＣＤＲ２、第３フレームワーク領域（ＦＲ３）、ＣＤＲ３及び第４フレームワーク領域（ＦＲ４）をこの順に有するものである、＜１＞の方法、＜２＞のキット、＜３＞若しくは＜４＞の医薬、＜８＞の使用、＜９＞の抗体、又は＜１１＞の方法。
＜１９＞ＦＲ１～ＦＲ４が以下のアミノ酸配列からなる、＜１８＞の方法、キット、医薬、使用又は抗体。
ＦＲ１：配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ２：配列番号５で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ３：配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
ＦＲ４：配列番号７で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
＜２０＞ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４がこの順で連結され、ＣＤＲ１が配列番号１で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ２が配列番号２で示されるアミノ酸配列、ＣＤＲ３が配列番号３で示されるアミノ酸配列であり、ＦＲ１が配列番号４で示されるアミノ酸配列、ＦＲ２が配列番号５で示されるアミノ酸配列、ＦＲ３が配列番号６で示されるアミノ酸配列、ＦＲ４が配列番号７で示されるアミノ酸配列である、＜１８＞の方法、キット、医薬、使用又は抗体。
【実施例0036】
実施例１ 抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体のスクリーニング
＜材料と方法＞
１．スクリーニングの標的分子
標的分子として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓ１ Ｓｕｂｕｎｉｔ，Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Ｈｉｓタグ付きＳ１タンパク質、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を用いた。
＜材料と方法＞
１．スクリーニングの標的分子
標的分子として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓ１ Ｓｕｂｕｎｉｔ，Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Ｈｉｓタグ付きＳ１タンパク質、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を用いた。
【0037】
２．ｃＤＮＡディスプレイの合成
（１）初期ライブラリーの合成
ＶＨＨナイーブＤＮＡライブラリーＡｌｉｐＬｉｂ Ｌ ｈｉｎｇｅ（６０ ｎｇ/μＬ；ＲｅＰＨＡＧＥＮ）又はＡｌｉｐＬｉｂ Ｓ ｈｉｎｇｅ（６０ ｎｇ/μＬ；ＲｅＰＨＡＧＥＮ）を鋳型ＤＮＡにしたＰＣＲ増幅により、１ｘ１０１４の多様性をもつＡｌｉｐＬｉｂ Ｌ ｈｉｎｇｅ １ｓｔ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ又はＡｌｉｐＬｉｂ Ｓ ｈｉｎｇｅ １ｓｔ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔを調製した。ＡｌｉｐＬｉｂ Ｌ ｈｉｎｇｅのＰＣＲ増幅には、プライマーｐｈａｇｅ＿ｔｏ＿ｃＤＮＡ＿ｄｉｓ.とＬＨｉｎｇｅ－ＧＧＧＳ－Ｈｉｓ－Ｒｓを使用した。ＡｌｉｐＬｉｂ Ｓ ｈｉｎｇｅのＰＣＲ増幅には、プライマーｐｈａｇｅ＿ｔｏ＿ｃＤＮＡ＿ｄｉｓ.とＳＨｉｎｇｅ－ＧＧＧＳ－Ｈｉｓ－Ｒとを使用した。
ＰＣＲ用溶液の組成は２５０μＬ反応スケールに調整し、テストチューブ５本に分注した。テストチューブ１本あたり、３００ｎｇのＶＨＨナイーブＤＮＡライブラリーを鋳型ＤＮＡとし、上記プライマーまたはプライマーＳＨｉｎｇｅ－ＧＧＧＳ－Ｈｉｓ－Ｒ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＤＮＡポリメラーゼ(タカラバイオ)、５ｘ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｂｕｆｆｅｒ(タカラバイオ)、２．５ ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、及びＨ２Ｏ（Ｕｌｔｒａ Ｐｕｒｅ ＤＮａｓｅ/ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むものとした。
ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬのＰＣＲ産物あたり約２容量のビーズを加え、ピペッティングして混合し、数分間静置した後に上清を除去し、７０％エタノールを用いてビーズを洗浄した。この後、ビーズを風乾させ、適当量のＨ２Ｏを添加してビーズを懸濁させ、上清を回収した。その後、吸光度測定（Ａ２６０/Ａ２８０）によりＤＮＡ濃度を定量した。
次にＡｌｉｐＬｉｂ Ｌ ｈｉｎｇｅ １ｓｔ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ又はＡｌｉｐＬｉｂ Ｓ ｈｉｎｇｅ １ｓｔ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔを鋳型ＤＮＡにしたＰＣＲ増幅により、ＡｌｉｐＬｉｂ Ｌ ｈｉｎｇｅ ２ｎｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ又はＡｌｉｐＬｉｂ Ｓ ｈｉｎｇｅ ２ｎｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔを調製した。ＰＣＲ増幅にはプライマーとしてＴ７－Ω及びＨｉｓ－Ｃ （Ｙｔａｇ ｃｎｖＫ）とを使用した。
ＰＣＲ用溶液は５００μＬ反応スケールで調製し、１０本のテストチューブに分注した。各テストチューブは、３０００ｎｇの鋳型ＤＮＡ、プライマー（Ｔ７－Ω及びＨｉｓ－Ｃ）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＤＮＡポリメラーゼ(タカラバイオ)、５ｘ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｂｕｆｆｅｒ(タカラバイオ)、２．５ ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、Ｈ２Ｏ（Ｕｌｔｒａ Ｐｕｒｅ ＤＮａｓｅ/ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)を含むものとした。
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、目的位置に分離されたＶＨＨライブラリーフラグメント（ＰＣＲ産物）を含むゲルを切り出した後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ (タカラバイオ)を用いて精製して、ＡｌｉｐＬｉｂ Ｌ ｈｉｎｇｅ ２ｎｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ及びＡｌｉｐＬｉｂ Ｓ ｈｉｎｇｅ ２ｎｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔを得た。ＤＮＡ濃度は、吸光度測定（Ａ２６０/Ａ２８０）により行い、ＤＮＡ濃度を定量した。
４，５００ｎｇのＡｌｉｐＬｉｂ Ｌ ｈｉｎｇｅ ２ｎｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ及び４，５００ｎｇのＡｌｉｐＬｉｂ Ｓ ｈｉｎｇｅ ２ｎｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ（Ｅｐｓｉｌｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）をＰＣＲで増幅した。反応液は１サンプルあたり２５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１．５μＬの１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ、１．５μＬの１０μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒ、３００ｎｇのＤＮＡを混合し、ＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲで５０μＬになるように調製した。プライマーは５’－ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’（配列番号１０）と５’－ＴＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴ－３’（配列番号１１）を用いた。ＰＣＲは９５℃で５分間の後、９８℃で２０秒間、６５℃で１５秒間、７２℃で３０秒を５サイクル、そして７２℃で５分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ
ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬのＰＣＲ産物あたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、５分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。１．４ｍＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は３回行った。上清の除去後、磁気プレート上で３分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、１００μＬのＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で２分間静置した後、上清を回収した。
（１）初期ライブラリーの合成
ＶＨＨナイーブＤＮＡライブラリーＡｌｉｐＬｉｂ Ｌ ｈｉｎｇｅ（６０ ｎｇ/μＬ；ＲｅＰＨＡＧＥＮ）又はＡｌｉｐＬｉｂ Ｓ ｈｉｎｇｅ（６０ ｎｇ/μＬ；ＲｅＰＨＡＧＥＮ）を鋳型ＤＮＡにしたＰＣＲ増幅により、１ｘ１０１４の多様性をもつＡｌｉｐＬｉｂ Ｌ ｈｉｎｇｅ １ｓｔ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ又はＡｌｉｐＬｉｂ Ｓ ｈｉｎｇｅ １ｓｔ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔを調製した。ＡｌｉｐＬｉｂ Ｌ ｈｉｎｇｅのＰＣＲ増幅には、プライマーｐｈａｇｅ＿ｔｏ＿ｃＤＮＡ＿ｄｉｓ.とＬＨｉｎｇｅ－ＧＧＧＳ－Ｈｉｓ－Ｒｓを使用した。ＡｌｉｐＬｉｂ Ｓ ｈｉｎｇｅのＰＣＲ増幅には、プライマーｐｈａｇｅ＿ｔｏ＿ｃＤＮＡ＿ｄｉｓ.とＳＨｉｎｇｅ－ＧＧＧＳ－Ｈｉｓ－Ｒとを使用した。
ＰＣＲ用溶液の組成は２５０μＬ反応スケールに調整し、テストチューブ５本に分注した。テストチューブ１本あたり、３００ｎｇのＶＨＨナイーブＤＮＡライブラリーを鋳型ＤＮＡとし、上記プライマーまたはプライマーＳＨｉｎｇｅ－ＧＧＧＳ－Ｈｉｓ－Ｒ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＤＮＡポリメラーゼ(タカラバイオ)、５ｘ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｂｕｆｆｅｒ(タカラバイオ)、２．５ ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、及びＨ２Ｏ（Ｕｌｔｒａ Ｐｕｒｅ ＤＮａｓｅ/ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むものとした。
ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬのＰＣＲ産物あたり約２容量のビーズを加え、ピペッティングして混合し、数分間静置した後に上清を除去し、７０％エタノールを用いてビーズを洗浄した。この後、ビーズを風乾させ、適当量のＨ２Ｏを添加してビーズを懸濁させ、上清を回収した。その後、吸光度測定（Ａ２６０/Ａ２８０）によりＤＮＡ濃度を定量した。
次にＡｌｉｐＬｉｂ Ｌ ｈｉｎｇｅ １ｓｔ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ又はＡｌｉｐＬｉｂ Ｓ ｈｉｎｇｅ １ｓｔ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔを鋳型ＤＮＡにしたＰＣＲ増幅により、ＡｌｉｐＬｉｂ Ｌ ｈｉｎｇｅ ２ｎｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ又はＡｌｉｐＬｉｂ Ｓ ｈｉｎｇｅ ２ｎｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔを調製した。ＰＣＲ増幅にはプライマーとしてＴ７－Ω及びＨｉｓ－Ｃ （Ｙｔａｇ ｃｎｖＫ）とを使用した。
ＰＣＲ用溶液は５００μＬ反応スケールで調製し、１０本のテストチューブに分注した。各テストチューブは、３０００ｎｇの鋳型ＤＮＡ、プライマー（Ｔ７－Ω及びＨｉｓ－Ｃ）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＤＮＡポリメラーゼ(タカラバイオ)、５ｘ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｂｕｆｆｅｒ(タカラバイオ)、２．５ ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、Ｈ２Ｏ（Ｕｌｔｒａ Ｐｕｒｅ ＤＮａｓｅ/ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)を含むものとした。
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、目的位置に分離されたＶＨＨライブラリーフラグメント（ＰＣＲ産物）を含むゲルを切り出した後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ (タカラバイオ)を用いて精製して、ＡｌｉｐＬｉｂ Ｌ ｈｉｎｇｅ ２ｎｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ及びＡｌｉｐＬｉｂ Ｓ ｈｉｎｇｅ ２ｎｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔを得た。ＤＮＡ濃度は、吸光度測定（Ａ２６０/Ａ２８０）により行い、ＤＮＡ濃度を定量した。
４，５００ｎｇのＡｌｉｐＬｉｂ Ｌ ｈｉｎｇｅ ２ｎｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ及び４，５００ｎｇのＡｌｉｐＬｉｂ Ｓ ｈｉｎｇｅ ２ｎｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ（Ｅｐｓｉｌｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）をＰＣＲで増幅した。反応液は１サンプルあたり２５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１．５μＬの１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ、１．５μＬの１０μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒ、３００ｎｇのＤＮＡを混合し、ＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲで５０μＬになるように調製した。プライマーは５’－ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’（配列番号１０）と５’－ＴＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴ－３’（配列番号１１）を用いた。ＰＣＲは９５℃で５分間の後、９８℃で２０秒間、６５℃で１５秒間、７２℃で３０秒を５サイクル、そして７２℃で５分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ
ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬのＰＣＲ産物あたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、５分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。１．４ｍＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は３回行った。上清の除去後、磁気プレート上で３分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、１００μＬのＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で２分間静置した後、上清を回収した。
【0038】
（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。２５μＬのＲｉｂｏＭＡＸ（商標） Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｔ７ ２Ｘ Ｂｕｆｆｅｒ，２０ｐｍｏｌ ＰＣＲ産物、５μＬのＥｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを混合し，３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、５μＬのＲＱ１ ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅを添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。転写産物の精製はＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬの転写産物あたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、５分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。２００μＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は３回行った。上清の除去後、磁気プレート上で１０分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、２０μＬのＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で１分間静置した後、上清を回収した。精製後、ＮａｎｏＰａｄ ＤＳ－１１ＦＸ（ＤｅＮｏｖｉｘ）によりＲＮＡを定量した。
Ｔ７ ＲｉｂｏＭＡＸ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。２５μＬのＲｉｂｏＭＡＸ（商標） Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｔ７ ２Ｘ Ｂｕｆｆｅｒ，２０ｐｍｏｌ ＰＣＲ産物、５μＬのＥｎｚｙｍｅ Ｍｉｘを混合し，３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、５μＬのＲＱ１ ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅを添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。転写産物の精製はＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬの転写産物あたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、５分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。２００μＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は３回行った。上清の除去後、磁気プレート上で１０分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、２０μＬのＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で１分間静置した後、上清を回収した。精製後、ＮａｎｏＰａｄ ＤＳ－１１ＦＸ（ＤｅＮｏｖｉｘ）によりＲＮＡを定量した。
【0039】
（３）ｍＲＮＡとピューロマイシンリンカーの連結
４μＬの０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４μＬの１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｐｍｏｌのｍＲＮＡ、２０ｐｍｏｌのｃｎｖＫ ｒｉｂｏＧ ｌｉｎｋｅｒを混合し、ＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲで２０μＬになるように反応液を調製した。アニーリングはＰｒｏＦｌｅｘ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、９０℃で２分間、７０℃で１分間、２５℃で３０秒、４℃でインキュベートの条件で行った。Ｒａｍｐ ｒａｔｅは０．１℃／秒に設定した。続いて、Ｈａｎｄｈｅｌｄ ＵＶ Ｌａｍｐ，６Ｗ、ＵＶＧＬ－５８、２５４／３６５ｎｍ、１００Ｖ（Ａｎａｌｙｔｉｋ ｊｅｎａ ＵＳ、Ａｎ Ｅｎｄｒｅｓｓ＋Ｈａｕｓｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて波長３６５ｎｍの紫外線を５分間照射した。ｍＲＮＡ－リンカー連結体は使用するまで遮光し、氷冷した。
４μＬの０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、４μＬの１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｐｍｏｌのｍＲＮＡ、２０ｐｍｏｌのｃｎｖＫ ｒｉｂｏＧ ｌｉｎｋｅｒを混合し、ＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲで２０μＬになるように反応液を調製した。アニーリングはＰｒｏＦｌｅｘ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、９０℃で２分間、７０℃で１分間、２５℃で３０秒、４℃でインキュベートの条件で行った。Ｒａｍｐ ｒａｔｅは０．１℃／秒に設定した。続いて、Ｈａｎｄｈｅｌｄ ＵＶ Ｌａｍｐ，６Ｗ、ＵＶＧＬ－５８、２５４／３６５ｎｍ、１００Ｖ（Ａｎａｌｙｔｉｋ ｊｅｎａ ＵＳ、Ａｎ Ｅｎｄｒｅｓｓ＋Ｈａｕｓｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて波長３６５ｎｍの紫外線を５分間照射した。ｍＲＮＡ－リンカー連結体は使用するまで遮光し、氷冷した。
【0040】
（４）無細胞翻訳
ｍＲＮＡ－リンカー連結体からのｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体の合成にはＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｔｒｅａｔｅｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。１０．５μＬのＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲ、１．５μＬの２０ｘ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｍｉｘ，５２．５μＬのＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ、１．５μＬのＲＮａｓｉｎ（商標） Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μＬ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、９μＬのｍＲＮＡ－リンカー連結体を混合した。この反応液を３７℃で１５分間インキュベートした後、３６μＬのＩＶＶ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（３Ｍ ＫＣｌ，１Ｍ ＭｇＣｌ２）混合液を加え、さらに３７℃で２０分間反応させることで、ｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体を合成した。
ｍＲＮＡ－リンカー連結体からのｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体の合成にはＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｔｒｅａｔｅｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。１０．５μＬのＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲ、１．５μＬの２０ｘ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｍｉｘ，５２．５μＬのＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ、１．５μＬのＲＮａｓｉｎ（商標） Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／μＬ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、９μＬのｍＲＮＡ－リンカー連結体を混合した。この反応液を３７℃で１５分間インキュベートした後、３６μＬのＩＶＶ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（３Ｍ ＫＣｌ，１Ｍ ＭｇＣｌ２）混合液を加え、さらに３７℃で２０分間反応させることで、ｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体を合成した。
【0041】
（５）ストレプトアビジン磁性体ビーズへの固定化
６０μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙ Ｏｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に６０μＬの２ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２Ｍ ＮａＣｌ、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ２０、２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８）を添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。この洗浄は２回行った。７５μＬのｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体、７５μＬの２ｘＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、洗浄済みのストレプトアビジン磁性体ビーズと混合し、室温で３０分間インキュベートした。磁性プレート上で１分間静置した後、上清を除去した。２００μＬのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８）を添加し、１分間ピペッティングした後、上清を除去した。この洗浄は２回行った。
６０μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍｙ Ｏｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に６０μＬの２ｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２Ｍ ＮａＣｌ、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ２０、２ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８）を添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。この洗浄は２回行った。７５μＬのｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体、７５μＬの２ｘＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、洗浄済みのストレプトアビジン磁性体ビーズと混合し、室温で３０分間インキュベートした。磁性プレート上で１分間静置した後、上清を除去した。２００μＬのＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８）を添加し、１分間ピペッティングした後、上清を除去した。この洗浄は２回行った。
【0042】
（６）逆転写反応
５５．５μＬのＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲ、１５μＬの５ｘ ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ Ｂｕｆｆｅｒ （Ｔｏｙｏｂｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、３μＬの２５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、１．５μＬのＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（１００Ｕ／μＬ）（Ｔｏｙｏｂｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を混合した。上記の反応液にストレプトアビジン磁性体ビーズ上に固定化されたｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体を添加し、４２℃、３０分間インキュベートすることで逆転写反応を行うことで、ｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を合成した。
５５．５μＬのＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲ、１５μＬの５ｘ ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ Ｂｕｆｆｅｒ （Ｔｏｙｏｂｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、３μＬの２５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、１．５μＬのＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（１００Ｕ／μＬ）（Ｔｏｙｏｂｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を混合した。上記の反応液にストレプトアビジン磁性体ビーズ上に固定化されたｍＲＮＡ－ＶＨＨ連結体を添加し、４２℃、３０分間インキュベートすることで逆転写反応を行うことで、ｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を合成した。
【0043】
（７）ビーズからの切り出し
ストレプトアビジン磁性体ビーズ上に固定化されたｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体に対して、Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）を添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。続いて、３０μＬの１０Ｕ ＲＮａｓｅ Ｔ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）含有Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた後、３７℃で１５分間静置することでｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を溶出させた。
ストレプトアビジン磁性体ビーズ上に固定化されたｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体に対して、Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）を添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。続いて、３０μＬの１０Ｕ ＲＮａｓｅ Ｔ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）含有Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた後、３７℃で１５分間静置することでｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を溶出させた。
【0044】
（８）精製
３０μＬのＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）を磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた後、Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁した。この洗浄操作は２回行った。ｃＤＮＡ－ペプチド連結体の溶出液とＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓ懸濁液を混合し、室温で３０分間インキュベートした後、磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。２００μＬのＨｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。この洗浄操作は２回行った。１０μＬのＨｉｓ－ｔａｇ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）を添加し、室温で１５分間インキュベートすることで、ｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を溶出した。
３０μＬのＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）を磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた後、Ｈｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁した。この洗浄操作は２回行った。ｃＤＮＡ－ペプチド連結体の溶出液とＨｉｓ Ｍａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｎｉ Ｂｅａｄｓ懸濁液を混合し、室温で３０分間インキュベートした後、磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。２００μＬのＨｉｓ－ｔａｇ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間ピペッティングすることで懸濁させた。磁気プレート上で１分間静置し、上清を捨てた。この洗浄操作は２回行った。１０μＬのＨｉｓ－ｔａｇ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（２０ ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、ｐＨ７．４）を添加し、室温で１５分間インキュベートすることで、ｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体を溶出した。
【0045】
３．セレクション
（１）標的分子の固相化とブロッキング
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓ１ Ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を標的分子として用いた。Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標） Ｐｌａｔｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに１００μＬの１００ｕｇ／ｍＬ（セレクションラウンド１、Ｒ１）、１０ｕｇ／ｍＬ（セレクションラウンド２、Ｒ２）、１ｕｇ／ｍＬ（セレクションラウンド３、Ｒ３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１タンパク質／ＰＢＳを添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ピペットを用いて丁寧にウェルに吸着しなかったＳ１タンパク質／ＰＢＳを取り除いた後、２００μＬの３％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ（０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で２時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にＢＳＡ／ＰＢＳＴを取り除いた後、２００μＬのＨＢＳＴ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）を添加し、５分静置した後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。
（１）標的分子の固相化とブロッキング
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓ１ Ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｈｉｓ Ｔａｇ）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を標的分子として用いた。Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標） Ｐｌａｔｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに１００μＬの１００ｕｇ／ｍＬ（セレクションラウンド１、Ｒ１）、１０ｕｇ／ｍＬ（セレクションラウンド２、Ｒ２）、１ｕｇ／ｍＬ（セレクションラウンド３、Ｒ３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１タンパク質／ＰＢＳを添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ピペットを用いて丁寧にウェルに吸着しなかったＳ１タンパク質／ＰＢＳを取り除いた後、２００μＬの３％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ（０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で２時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にＢＳＡ／ＰＢＳＴを取り除いた後、２００μＬのＨＢＳＴ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）を添加し、５分静置した後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。
【0046】
（２）セレクション
セレクションラウンド１（Ｒ１）では２００ｐｍｏｌ、セレクションラウンド２（Ｒ２）及びセレクションラウンド３（Ｒ３）では６ｐｍｏｌに調製されたｃＤＮＡディスプレイライブラリを用いた。各ｃＤＮＡディスプレイライブラリはＨＢＳＴ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２、０．５％Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を添加し、１００μＬに調製した。Ｓ１タンパク質が固相化されたウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にｃＤＮＡディスプレイ溶液を取り除いた後、２００μＬのＨＢＳＴを添加し、室温で５分間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は１０回行った。１００μＬの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（ｐＨ１１）を添加し、丁寧にピペッティングした後、室温で５分間静置した。静置後、上清を新しいチューブに回収した。
セレクションラウンド１（Ｒ１）では２００ｐｍｏｌ、セレクションラウンド２（Ｒ２）及びセレクションラウンド３（Ｒ３）では６ｐｍｏｌに調製されたｃＤＮＡディスプレイライブラリを用いた。各ｃＤＮＡディスプレイライブラリはＨＢＳＴ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２、０．５％Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を添加し、１００μＬに調製した。Ｓ１タンパク質が固相化されたウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にｃＤＮＡディスプレイ溶液を取り除いた後、２００μＬのＨＢＳＴを添加し、室温で５分間インキュベートした後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は１０回行った。１００μＬの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ（ｐＨ１１）を添加し、丁寧にピペッティングした後、室温で５分間静置した。静置後、上清を新しいチューブに回収した。
【0047】
４．ＰＣＲ増幅
溶出液をＰＣＲに供した。反応液は１サンプルあたり２５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１．５μＬの１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ、１．５μＬの１０μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒ、１２．５μＬのｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体、９．５
μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを混合し調製した。プライマーは５’－ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡ－３’（配列番号１２）と５’－ＴＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴ－３’（配列番号１１）を用いた。ＰＣＲは９５℃で２分間の後、９８℃で２０秒間、６８℃で１５秒間、７２℃で２０秒間を２２サイクル（Ｒ１）または２４サイクル（Ｒ２以降）、そして７２℃で５分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬのＰＣＲ産物あたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、５分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。２００μＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は２回行った。上清の除去後、磁気プレート上で５分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、４５μＬのＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で１分間静置した後、上清を回収した。
溶出液をＰＣＲに供した。反応液は１サンプルあたり２５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１．５μＬの１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ、１．５μＬの１０μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒ、１２．５μＬのｃＤＮＡ－ＶＨＨ連結体、９．５
μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを混合し調製した。プライマーは５’－ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡ－３’（配列番号１２）と５’－ＴＴＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴ－３’（配列番号１１）を用いた。ＰＣＲは９５℃で２分間の後、９８℃で２０秒間、６８℃で１５秒間、７２℃で２０秒間を２２サイクル（Ｒ１）または２４サイクル（Ｒ２以降）、そして７２℃で５分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬのＰＣＲ産物あたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、５分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。２００μＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は２回行った。上清の除去後、磁気プレート上で５分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、４５μＬのＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で１分間静置した後、上清を回収した。
【0048】
５．ＶＨＨ抗体候補配列の抽出
（１）ＰＣＲ産物の定量と濃度調製
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ(商標) ｄｓＤＮＡ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＰＣＲ産物の定量を行った。定量値に従い、各サンプルの濃度を１００ｎｇ／ｍＬに調製した。
（１）ＰＣＲ産物の定量と濃度調製
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ(商標) ｄｓＤＮＡ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＰＣＲ産物の定量を行った。定量値に従い、各サンプルの濃度を１００ｎｇ／ｍＬに調製した。
【0049】
（２）シーケンスライブラリーの調製
１ｓｔ ＰＣＲを行った。反応液は１サンプルあたり１２．５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．５μＬの１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ、０．５μＬの１０μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ、２．５μＬの前段落記載のＰＣＲ産物、９μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを混合し調製した。プライマーは５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮＮＮＮＡＴＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＴＧ－３’（配列番号１３）と５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮＮＮＮＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＧ－３’（配列番号１４）を用いた。ＰＣＲは９５℃で３分間の後、９８℃で２０秒間、６２℃で１５秒間、７２℃で２０秒を１６サイクル、そして７２℃で５分間の条件で行った。
ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬのＰＣＲ産物あたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、５分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。２００μＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は２回行った。上清の除去後、磁気プレート上で５分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、２０μＬのＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で１分間静置した後、上清を回収した。
続いて、Ｉｎｄｅｘ ＰＣＲを行った。反応液は１サンプルあたり１２．５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１μＬの１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒ（Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｉｎｄｅｘ Ｋｉｔ ｖ２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、１μＬの１０ μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒ（Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｉｎｄｅｘ Ｋｉｔ ｖ２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、２．５μＬのテンプレートＤＮＡ、８μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを混合し調製した。ＰＣＲは９５℃で３分間の後、９８℃で２０秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒を８サイクル、そして７２℃で５分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりＰＣＲ産物のサイズを確認後、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＰＣＲ産物の定量を行い、以下の式（１）に従ってモル濃度を算出した。得られた定量値に基づき、ＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲで希釈することで４ｎＭに調製した。
ＤＮＡ濃度［ｎｇ／μＬ］／（６６０［ｇ／ｍｏｌ］×５５０［ｂｐ］）×１０６＝ＤＮＡ濃度［ｎＭ］・・・（１）
１ｓｔ ＰＣＲを行った。反応液は１サンプルあたり１２．５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．５μＬの１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ、０．５μＬの１０μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ、２．５μＬの前段落記載のＰＣＲ産物、９μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを混合し調製した。プライマーは５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮＮＮＮＡＴＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＴＧ－３’（配列番号１３）と５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＮＮＮＮＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＧ－３’（配列番号１４）を用いた。ＰＣＲは９５℃で３分間の後、９８℃で２０秒間、６２℃で１５秒間、７２℃で２０秒を１６サイクル、そして７２℃で５分間の条件で行った。
ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。１μＬのＰＣＲ産物あたり１．８μＬのビーズを加え、ピペッティングによる混合後、５分間静置した。磁性プレート上で透明になるまで静置した後、上清を除去した。２００μＬの７０％エタノールを添加し、３０秒静置した後、上清を除去した。このエタノール洗浄は２回行った。上清の除去後、磁気プレート上で５分間静置し、ビーズを風乾させた。チューブを磁気プレートから下ろし、２０μＬのＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲを添加後、ピペッティングによりビーズを懸濁し５分静置した。チューブを磁気プレート上で１分間静置した後、上清を回収した。
続いて、Ｉｎｄｅｘ ＰＣＲを行った。反応液は１サンプルあたり１２．５μＬのＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｋａｐａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１μＬの１０μＭ Ｆｏｒｗａｒｄ ｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒ（Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｉｎｄｅｘ Ｋｉｔ ｖ２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、１μＬの１０ μＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒ（Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｉｎｄｅｘ Ｋｉｔ ｖ２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、２．５μＬのテンプレートＤＮＡ、８μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを混合し調製した。ＰＣＲは９５℃で３分間の後、９８℃で２０秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒を８サイクル、そして７２℃で５分間の条件で行った。ＰＣＲ産物の精製はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりＰＣＲ産物のサイズを確認後、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＰＣＲ産物の定量を行い、以下の式（１）に従ってモル濃度を算出した。得られた定量値に基づき、ＮＵＣＬＥＡＳＥ ＦＲＥＥ ＷＡＴＥＲで希釈することで４ｎＭに調製した。
ＤＮＡ濃度［ｎｇ／μＬ］／（６６０［ｇ／ｍｏｌ］×５５０［ｂｐ］）×１０６＝ＤＮＡ濃度［ｎＭ］・・・（１）
【0050】
（３）シーケンス
４ｎＭライブラリーを使用する際の推奨プロトコルに従って調製した。変性・希釈済みのサンプルライブラリーの最終濃度は７ｐＭになるように調製した。また、サンプルライブラリー中のＰｈｉＸ Ｃｏｎｔｒｏｌは５％になるように調製した。ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）とＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｎａｎｏ Ｋｉｔ ｖ２ ５００ ｃｙｃｌｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてシーケンスを行った。
４ｎＭライブラリーを使用する際の推奨プロトコルに従って調製した。変性・希釈済みのサンプルライブラリーの最終濃度は７ｐＭになるように調製した。また、サンプルライブラリー中のＰｈｉＸ Ｃｏｎｔｒｏｌは５％になるように調製した。ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）とＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｎａｎｏ Ｋｉｔ ｖ２ ５００ ｃｙｃｌｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてシーケンスを行った。
【0051】
（４）シーケンスデータからＶＨＨ抗体のアミノ酸配列の抽出と重複数の計測
ＭｉＳｅｑ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用いてＤｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇされた配列データを解析に供した。シーケンスデータからＶＨＨ抗体がコードされている塩基配列領域を抜き出し、アミノ酸配列に翻訳した。その後、各アミノ酸配列と完全に一致したアミノ酸配列数を計測した。
ＭｉＳｅｑ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用いてＤｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇされた配列データを解析に供した。シーケンスデータからＶＨＨ抗体がコードされている塩基配列領域を抜き出し、アミノ酸配列に翻訳した。その後、各アミノ酸配列と完全に一致したアミノ酸配列数を計測した。
【0052】
（５）抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＨＨ抗体候補配列の選抜
Ｒ２とＲ３のセレクション後のライブラリーに共通して出現するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列と各配列のクローン数を算出した。ＶＨＨ抗体全長のアミノ酸配列の完全一致によりクローン数を求めた結果、ＣｏＶＨＨ１がライブラリー中で最も優占していることがわかった（図１）。
ＣｏＶＨＨ１をコードする全塩基配列は配列番号８に示すとおりであり、そのアミノ酸配列はＡＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＱＶＥＴＧＧＳＬＲＬＳＣＱＡＳＧＳＴＦＳＤＹＶＭＡＷＦＲＱＲＰＧＫＥＲＥＦＶＡＴＩＳＲＮＧＧＴＴＴＹＧＳＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＳＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＡＶＧＧＤＧＤＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９）である。なお、アミノ酸をコードする塩基配列は配列番号８に示すコドンに限定されるものではない。当該アミノ酸配列において、１～２６番がＦＲ１、２７～３６番がＣＤＲ１、３７～５０番がＦＲ２、５１～６０番がＣＤＲ２、６１～９９番がＦＲ３、１００～１０６番がＣＤＲ３、１０８～１１７番がＦＲ４である。
Ｒ２とＲ３のセレクション後のライブラリーに共通して出現するＶＨＨ抗体のアミノ酸配列と各配列のクローン数を算出した。ＶＨＨ抗体全長のアミノ酸配列の完全一致によりクローン数を求めた結果、ＣｏＶＨＨ１がライブラリー中で最も優占していることがわかった（図１）。
ＣｏＶＨＨ１をコードする全塩基配列は配列番号８に示すとおりであり、そのアミノ酸配列はＡＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＱＶＥＴＧＧＳＬＲＬＳＣＱＡＳＧＳＴＦＳＤＹＶＭＡＷＦＲＱＲＰＧＫＥＲＥＦＶＡＴＩＳＲＮＧＧＴＴＴＹＧＳＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＳＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＹＡＶＧＧＤＧＤＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号９）である。なお、アミノ酸をコードする塩基配列は配列番号８に示すコドンに限定されるものではない。当該アミノ酸配列において、１～２６番がＦＲ１、２７～３６番がＣＤＲ１、３７～５０番がＦＲ２、５１～６０番がＣＤＲ２、６１～９９番がＦＲ３、１００～１０６番がＣＤＲ３、１０８～１１７番がＦＲ４である。
【0053】
（６）ＶＨＨ抗体のＣＤＲ領域アミノ酸配列の抽出
Ｒ２とＲ３のセレクション後のライブラリーに共通して出現し、さらに出現頻度の最も高かったＣｏＶＨＨ１とアミノ酸配列が類似したＣｏＶＨＨ１変異体について、ＣＤＲ領域の比較を行った（図２）。ＣｏＶＨＨ１変異体として、ＣＤＲ１領域変異体は４配列（ＣｏＶＨＨ１３０１（配列番号３４）、ＣｏＶＨＨ３１９（配列番号３５）、ＣｏＶＨＨ３９（配列番号３６）、ＣｏＶＨＨ３２７（配列番号３７））、ＣＤＲ２領域変異体は８配列（ＣｏＶＨＨ４７（配列番号３８）、ＣｏＶＨＨ１６（配列番号３９）、ＣｏＶＨＨ４９（配列番号４０）、ＣｏＶＨＨ５８（配列番号４１）、ＣｏＶＨＨ４１７（配列番号４２）、ＣｏＶＨＨ１１８（配列番号４３）、ＣｏＶＨＨ４１６（配列番号４４）、ＣｏＶＨＨ３３４２（配列番号４５））、ＣＤＲ３領域変異体は６配列（ＣｏＶＨＨ２０１（配列番号４６）、ＣｏＶＨＨ２０（配列番号４７）、ＣｏＶＨＨ１１２（配列番号４８）、ＣｏＶＨＨ２０１７（配列番号４９）、ＣｏＶＨＨ１３７（配列番号５０）、ＣｏＶＨＨ９６（配列番号５１））が見出された。
Ｒ２とＲ３のセレクション後のライブラリーに共通して出現し、さらに出現頻度の最も高かったＣｏＶＨＨ１とアミノ酸配列が類似したＣｏＶＨＨ１変異体について、ＣＤＲ領域の比較を行った（図２）。ＣｏＶＨＨ１変異体として、ＣＤＲ１領域変異体は４配列（ＣｏＶＨＨ１３０１（配列番号３４）、ＣｏＶＨＨ３１９（配列番号３５）、ＣｏＶＨＨ３９（配列番号３６）、ＣｏＶＨＨ３２７（配列番号３７））、ＣＤＲ２領域変異体は８配列（ＣｏＶＨＨ４７（配列番号３８）、ＣｏＶＨＨ１６（配列番号３９）、ＣｏＶＨＨ４９（配列番号４０）、ＣｏＶＨＨ５８（配列番号４１）、ＣｏＶＨＨ４１７（配列番号４２）、ＣｏＶＨＨ１１８（配列番号４３）、ＣｏＶＨＨ４１６（配列番号４４）、ＣｏＶＨＨ３３４２（配列番号４５））、ＣＤＲ３領域変異体は６配列（ＣｏＶＨＨ２０１（配列番号４６）、ＣｏＶＨＨ２０（配列番号４７）、ＣｏＶＨＨ１１２（配列番号４８）、ＣｏＶＨＨ２０１７（配列番号４９）、ＣｏＶＨＨ１３７（配列番号５０）、ＣｏＶＨＨ９６（配列番号５１））が見出された。
【0054】
実施例２ プロテアーゼ欠損組換え枯草菌によるＶＨＨの生産（１）遺伝子の人工合成
合成されるＣｏＶＨＨ１のアミノ酸配列は、配列番号９のＣ末端側にヒンジ配列を介したＨｉｓタグ配列（配列番号２５、ＥＰＫＴＰＫＰＱＳＨＨＨＨＨＨ）が付与された配列番号２６となる。そのため、ＣｏＶＨＨ１発現用の人工合成遺伝子には、配列番号２６をコードする塩基配列の３’末端に終止コドンが付与された配列番号２７となる。さらに、ＣｏＶＨＨ１発現用の人工合成遺伝子をプラスミドベクターに挿入するための配列として、配列番号２７に対して、ＧＣＡＧＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＡ（配列番号２８）が５’末端に、ＴＣＴＡＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴ（配列番号２９）が３’末端に付加されたものをユーロフィン社で人工合成し、実験に供した。
合成されるＣｏＶＨＨ１のアミノ酸配列は、配列番号９のＣ末端側にヒンジ配列を介したＨｉｓタグ配列（配列番号２５、ＥＰＫＴＰＫＰＱＳＨＨＨＨＨＨ）が付与された配列番号２６となる。そのため、ＣｏＶＨＨ１発現用の人工合成遺伝子には、配列番号２６をコードする塩基配列の３’末端に終止コドンが付与された配列番号２７となる。さらに、ＣｏＶＨＨ１発現用の人工合成遺伝子をプラスミドベクターに挿入するための配列として、配列番号２７に対して、ＧＣＡＧＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＡ（配列番号２８）が５’末端に、ＴＣＴＡＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴ（配列番号２９）が３’末端に付加されたものをユーロフィン社で人工合成し、実験に供した。
【0055】
（２）Ｈｉｓタグ付きＶＨＨ発現用プラスミドの構築
ｐＨＹ３００ＰＬＫをベースとして作製された組換えプラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７（特開２０１４－１５８４３０）をテンプレートとし、５’－ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧＧ－３’（配列番号１５）と５’－ＡＴＧＡＴＧＴＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧ－３’（配列番号１６）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。１６８株のゲノムをテンプレートとし、５’－ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＴＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＡＧＡＧ－３’（配列番号１７）と５’－ＣＴＴＴＣＴＴＡＡＣＡＴＣＡＴＡＧＴＡＧＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣ－３’（配列番号１８）のプライマーセットを用いたＰＣＲによりｓｐｏＶＧ遺伝子由来のプロモーターＤＮＡを増幅した。得られたプロモーターＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込み、ｓｐｏＶＧプロモーターと連結されたＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。５’－ＴＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＡＴＡＡＡ－３’（配列番号１９）及び５’－ＴＣＴＡＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＴＡＧＧＧ－３’（配列番号２０）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。得られたＰＣＲ断片に、（１）の人工合成遺伝子を含むＤＮＡをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて組み込み、人工合成ＶＨＨ遺伝子の各々を含むＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。このＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１発現用プラスミドをＣｏＶＨＨ１－Ｈｉｓ－ｐＨＹと呼ぶ。
また、ＣｏＶＨＨ二量体については以下のように構築を行った。ＣｏＶＨＨ１二量体についてはＣｏＶＨＨ１発現用の人工合成遺伝子をテンプレートとし、５’－ＧＣＡＧＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧ－３’（配列番号２１）及び５’－ＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＣＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＧＡＧ－３’（配列番号２２）のプライマーセット、及びＶＨＨ１をテンプレートとし、５’－ＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＡＡＧＴＧＣＡＡＣＴＧＧＴＴＧＡＧＴＣＴＧ－３’（配列番号２３）及び５’－ＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＡＧＡＴＴＡＡＴＧ－３’（配列番号２４）のプライマーセットを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）によるＰＣＲにより得られたＰＣＲ断片（遺伝子）をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて上記と同様にｓｐｏＶＧプロモーターと連結されたＶＨＨ発現用プラスミドへと組み込んだ。このＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１二量体発現用プラスミドをＣｏＶＨＨ１（ｄｉｍｅｒ）－Ｈｉｓ－ｐＨＹと呼ぶ。
ｐＨＹ３００ＰＬＫをベースとして作製された組換えプラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７（特開２０１４－１５８４３０）をテンプレートとし、５’－ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧＧ－３’（配列番号１５）と５’－ＡＴＧＡＴＧＴＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧ－３’（配列番号１６）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。１６８株のゲノムをテンプレートとし、５’－ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＴＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧＧＧＡＧＡＧ－３’（配列番号１７）と５’－ＣＴＴＴＣＴＴＡＡＣＡＴＣＡＴＡＧＴＡＧＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣ－３’（配列番号１８）のプライマーセットを用いたＰＣＲによりｓｐｏＶＧ遺伝子由来のプロモーターＤＮＡを増幅した。得られたプロモーターＤＮＡを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプラスミド配列に組み込み、ｓｐｏＶＧプロモーターと連結されたＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。５’－ＴＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＡＴＡＡＡ－３’（配列番号１９）及び５’－ＴＣＴＡＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＴＡＧＧＧ－３’（配列番号２０）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。得られたＰＣＲ断片に、（１）の人工合成遺伝子を含むＤＮＡをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて組み込み、人工合成ＶＨＨ遺伝子の各々を含むＶＨＨ発現用プラスミドを構築した。このＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１発現用プラスミドをＣｏＶＨＨ１－Ｈｉｓ－ｐＨＹと呼ぶ。
また、ＣｏＶＨＨ二量体については以下のように構築を行った。ＣｏＶＨＨ１二量体についてはＣｏＶＨＨ１発現用の人工合成遺伝子をテンプレートとし、５’－ＧＣＡＧＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧ－３’（配列番号２１）及び５’－ＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＣＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＧＡＧ－３’（配列番号２２）のプライマーセット、及びＶＨＨ１をテンプレートとし、５’－ＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＡＡＧＴＧＣＡＡＣＴＧＧＴＴＧＡＧＴＣＴＧ－３’（配列番号２３）及び５’－ＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＡＧＡＴＴＡＡＴＧ－３’（配列番号２４）のプライマーセットを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）によるＰＣＲにより得られたＰＣＲ断片（遺伝子）をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて上記と同様にｓｐｏＶＧプロモーターと連結されたＶＨＨ発現用プラスミドへと組み込んだ。このＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１二量体発現用プラスミドをＣｏＶＨＨ１（ｄｉｍｅｒ）－Ｈｉｓ－ｐＨＹと呼ぶ。
【0056】
（３）ＦＬＡＧタグ付きＶＨＨ発現用プラスミドの構築
ＣｏＶＨＨ１－Ｈｉｓ－ｐＨＹをテンプレートとし、５’－ＧＣＡＧＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＧＣＡＡＣＴＧＧＴＴＧＡＧ－３’（配列番号３１）及び５’－ＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＡＧＡＴＴＡＴＴＴＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＡＴＡＧＴＣＣＧＡＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＧＧＴＧＴＴＴＴＧ－３’（配列番号３２）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりＦＬＡＧタグ付きＣｏＶＨＨ１のＰＣＲ断片を増幅した。前述のｓｐｏＶＧプロモーターと連結されたＶＨＨ発現用プラスミドをテンプレートとし、５’－ＴＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＡＴＡＡＡ－３’（配列番号１９）及び５’－ＴＣＴＡＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＴＡＧＧＧ－３’（配列番号２０）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。得られたプラスミドＰＣＲ断片に、ＦＬＡＧタグ付きＣｏＶＨＨ１のＰＣＲ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて組み込みこんだ。このＦＬＡＧタグ付きＣｏＶＨＨ１二量体発現用プラスミドをＣｏＶＨＨ１－ＦＬＡＧ－ｐＨＹと呼ぶ。
構築したプラスミドを、下記（４）に示す手順に従ってＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株から、特開２００６－１７４７０７号に記載されている方法に従って、９種の細胞外プロテアーゼ遺伝子（ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥ及びａｐｒＸ）を全て欠損させ、さらに特許第４３３６０８２に記載されている方法に従い、胞子形成に関与するｓｉｇＦ遺伝子を欠損させることにより得られた株（Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦ）に導入した。
ＣｏＶＨＨ１－Ｈｉｓ－ｐＨＹをテンプレートとし、５’－ＧＣＡＧＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＧＣＡＡＣＴＧＧＴＴＧＡＧ－３’（配列番号３１）及び５’－ＡＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＴＡＧＡＴＴＡＴＴＴＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＴＴＡＴＡＧＴＣＣＧＡＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＧＧＴＧＴＴＴＴＧ－３’（配列番号３２）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりＦＬＡＧタグ付きＣｏＶＨＨ１のＰＣＲ断片を増幅した。前述のｓｐｏＶＧプロモーターと連結されたＶＨＨ発現用プラスミドをテンプレートとし、５’－ＴＧＣＴＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＡＴＡＡＡ－３’（配列番号１９）及び５’－ＴＣＴＡＴＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＴＡＧＧＧ－３’（配列番号２０）のプライマーセットとＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いたＰＣＲによりプラスミド配列を増幅した。得られたプラスミドＰＣＲ断片に、ＦＬＡＧタグ付きＣｏＶＨＨ１のＰＣＲ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて組み込みこんだ。このＦＬＡＧタグ付きＣｏＶＨＨ１二量体発現用プラスミドをＣｏＶＨＨ１－ＦＬＡＧ－ｐＨＹと呼ぶ。
構築したプラスミドを、下記（４）に示す手順に従ってＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８株から、特開２００６－１７４７０７号に記載されている方法に従って、９種の細胞外プロテアーゼ遺伝子（ｅｐｒ、ｗｐｒＡ、ｍｐｒ、ｎｐｒＢ、ｂｐｒ、ｎｐｒＥ、ｖｐｒ、ａｐｒＥ及びａｐｒＸ）を全て欠損させ、さらに特許第４３３６０８２に記載されている方法に従い、胞子形成に関与するｓｉｇＦ遺伝子を欠損させることにより得られた株（Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦ）に導入した。
【0057】
（４）組換え枯草菌の作製
枯草菌株へのプラスミド導入は以下に示すプロトプラスト法によって行った。１ｍＬのＬＢ液体培地にグリセロールストックした枯草菌を植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍで一晩振とう培養した。翌日、新たな１ｍＬのＬＢ液体培地にこの培養液を１０μＬ植菌し、３７℃、２１０ｒｐｍで約２時間振とう培養した。この培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、１，２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去したペレットをＬｙｓｏｚｙｍｅ（ＳＩＧＭＡ）４ｍｇ／ｍＬを含むＳＭＭＰ５００μＬに懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、３，５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去したペレットをＳＭＭＰ４００μＬに懸濁した。この懸濁液３３μＬを各種プラスミドと混合し、さらに４０％ＰＥＧを１００μＬ添加してボルテックスした。この液にＳＭＭＰを３５０μＬ加えて転倒混和し、３０℃、２１０ｒｐｍで１時間振とうした後、ＤＭ３寒天培地プレートに全量塗布し、３０℃で２～３日間インキュベートした。
枯草菌株へのプラスミド導入は以下に示すプロトプラスト法によって行った。１ｍＬのＬＢ液体培地にグリセロールストックした枯草菌を植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍで一晩振とう培養した。翌日、新たな１ｍＬのＬＢ液体培地にこの培養液を１０μＬ植菌し、３７℃、２１０ｒｐｍで約２時間振とう培養した。この培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、１，２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去したペレットをＬｙｓｏｚｙｍｅ（ＳＩＧＭＡ）４ｍｇ／ｍＬを含むＳＭＭＰ５００μＬに懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、３，５００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除去したペレットをＳＭＭＰ４００μＬに懸濁した。この懸濁液３３μＬを各種プラスミドと混合し、さらに４０％ＰＥＧを１００μＬ添加してボルテックスした。この液にＳＭＭＰを３５０μＬ加えて転倒混和し、３０℃、２１０ｒｐｍで１時間振とうした後、ＤＭ３寒天培地プレートに全量塗布し、３０℃で２～３日間インキュベートした。
【0058】
（５）ＶＨＨ産生
（４）で作製した組換え枯草菌を１ｍＬの５０ｐｐｍテトラサイクリンを含むＬＢ培地に植菌し、３２℃で一晩往復振とうし、前培養液とした。Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦは、前培養液をひだ付き三角フラスコに入れた２０ｍＬの２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。培養終了時に１ｍＬの培養液をマイクロチューブにて４℃、１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を回収した。各ＶＨＨについてはＮｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（富士フィルム和光純薬）を用い、キットのプロトコルに従って精製した。溶出液にはＰＢＳ（５０ｍＭ イミダゾール）を用いた。
培養上清における抗体の生産を確認するため、ウエスタンブロッティングを行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥについては、ゲルはスーパーセップエース、１５－２０％（トリシンゲル）（富士フィルム和光純薬）を用い、各ウェルに０．５μＬの培養上清を含むサンプルをアプライした後に１２０Ｖで３時間泳動した。分子量マーカーにはｘＬ ｌａｄｄｅｒ（Ｂｒｏａｄ）（アプロサイエンス）を用いた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉ ＰＶＤＦ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐａｃｋｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）、及びＴｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いてタンパク質をＰＶＤＦ膜へ転写した。抗体は６×－Ｈｉｓ Ｔａｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（３Ｄ５），ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）またはＡＮＴＩ－ＦＬＡＧ Ｍ２－ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンンジュゲート（シグマアルドリッチ）を、抗体反応にはｉＢｉｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて目的タンパク質を検出した（図３）。
（４）で作製した組換え枯草菌を１ｍＬの５０ｐｐｍテトラサイクリンを含むＬＢ培地に植菌し、３２℃で一晩往復振とうし、前培養液とした。Ｄｐｒ９ΔｓｉｇＦは、前培養液をひだ付き三角フラスコに入れた２０ｍＬの２×Ｌ－ｍａｌ培地に１％接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。培養終了時に１ｍＬの培養液をマイクロチューブにて４℃、１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を回収した。各ＶＨＨについてはＮｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（富士フィルム和光純薬）を用い、キットのプロトコルに従って精製した。溶出液にはＰＢＳ（５０ｍＭ イミダゾール）を用いた。
培養上清における抗体の生産を確認するため、ウエスタンブロッティングを行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥについては、ゲルはスーパーセップエース、１５－２０％（トリシンゲル）（富士フィルム和光純薬）を用い、各ウェルに０．５μＬの培養上清を含むサンプルをアプライした後に１２０Ｖで３時間泳動した。分子量マーカーにはｘＬ ｌａｄｄｅｒ（Ｂｒｏａｄ）（アプロサイエンス）を用いた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉ ＰＶＤＦ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐａｃｋｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）、及びＴｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を用いてタンパク質をＰＶＤＦ膜へ転写した。抗体は６×－Ｈｉｓ Ｔａｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（３Ｄ５），ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）またはＡＮＴＩ－ＦＬＡＧ Ｍ２－ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンンジュゲート（シグマアルドリッチ）を、抗体反応にはｉＢｉｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。１－Ｓｔｅｐ Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて目的タンパク質を検出した（図３）。
【0059】
その結果、ＣｏＶＨＨ１とＣｏＶＨＨ１二量体が合成されていることが確認された。この方法で合成されるＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１のアミノ酸配列は配列番号２６に示す通りであり、Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１二量体は配列番号３０に示す通りであり、ＦＬＡＧタグ付きＣｏＶＨＨ１のアミノ酸配列は配列番号３３に示す通りである。
【0060】
実施例３ バイオレイヤー干渉法による結合活性測定
ＢＬＩｔｚ ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｅｒ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を用いてＮｉ－ＮＴＡセンサーチップに固相化したＣｏＶＨＨ１のＳ１タンパク質に対する結合活性を測定した。Ａｄｖａｎｃｅｄ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｍｏｄｅを選択し、２５０μＬの各測定液をＢｌａｃｋ ０．５ｍＬ Ｔｕｂｅに添加して測定した。測定前にＤｉｐ ａｎｄ Ｒｅａｄ（商標） Ｎｉ－ＮＴＡ（ＮＴＡ）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）の先端を１００μＬのＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ，ｐＨ７．４）に１晩浸漬させることでチップを水和させた。ラン毎の測定順は以下の通りである；１）Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｔｅｐ：ＰＢＳＴ中で３０秒間の測定、２）Ｌｏａｄｉｎｇ ｓｔｅｐ：ＰＢＳＴで希釈調製した１－１０μｇ／ｍＬ Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１で１２０秒間の測定、３）Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｔｅｐ： ＰＢＳＴ中で３０秒間の測定、４）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：ＰＢＳＴで希釈し調製した０－６９３．１ｎＭ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ｓｕｂｕｎｉｔ－Ｆｃ（Ｆｃタグ付きＳ１タンパク質、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）で１８０秒間の測定、５）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：ＰＢＳＴ中で３００秒間の測定。ＢＬＩｔｚ Ｐｒｏソフトウェアバージョン（１．２．１．５）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてＧｌｏｂａｌ Ｆｉｔｔｉｎｇを行い、結合活性を算出した（図４）。
その結果、ＣｏＶＨＨ１のＳ１タンパク質に対する平衡乖離定数（ＫＤ）は７．１３１ｘ１０－９Ｍ（ｋａ＝１．６０４ｘ１０４（１／Ｍｓ）、ｋｄ＝１．１４４ｘ１０－４（１／ｓ））であった。
ＢＬＩｔｚ ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｅｒ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を用いてＮｉ－ＮＴＡセンサーチップに固相化したＣｏＶＨＨ１のＳ１タンパク質に対する結合活性を測定した。Ａｄｖａｎｃｅｄ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｍｏｄｅを選択し、２５０μＬの各測定液をＢｌａｃｋ ０．５ｍＬ Ｔｕｂｅに添加して測定した。測定前にＤｉｐ ａｎｄ Ｒｅａｄ（商標） Ｎｉ－ＮＴＡ（ＮＴＡ）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）の先端を１００μＬのＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ，ｐＨ７．４）に１晩浸漬させることでチップを水和させた。ラン毎の測定順は以下の通りである；１）Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｔｅｐ：ＰＢＳＴ中で３０秒間の測定、２）Ｌｏａｄｉｎｇ ｓｔｅｐ：ＰＢＳＴで希釈調製した１－１０μｇ／ｍＬ Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１で１２０秒間の測定、３）Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｔｅｐ： ＰＢＳＴ中で３０秒間の測定、４）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：ＰＢＳＴで希釈し調製した０－６９３．１ｎＭ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ｓｕｂｕｎｉｔ－Ｆｃ（Ｆｃタグ付きＳ１タンパク質、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）で１８０秒間の測定、５）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：ＰＢＳＴ中で３００秒間の測定。ＢＬＩｔｚ Ｐｒｏソフトウェアバージョン（１．２．１．５）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてＧｌｏｂａｌ Ｆｉｔｔｉｎｇを行い、結合活性を算出した（図４）。
その結果、ＣｏＶＨＨ１のＳ１タンパク質に対する平衡乖離定数（ＫＤ）は７．１３１ｘ１０－９Ｍ（ｋａ＝１．６０４ｘ１０４（１／Ｍｓ）、ｋｄ＝１．１４４ｘ１０－４（１／ｓ））であった。
【0061】
実施例４ ＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標） Ｐｌａｔｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルにＰＢＳで希釈し調整した１００μＬの０－１０μｇ／ｍＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ｓｕｂｕｎｉｔ－Ｆｃ（Ｆｃタグ付きＳ１タンパク質、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ピペットを用いて丁寧にウェルに吸着しなかったＳ１タンパク質分散液を取り除いた後、２００μＬの５％スキムミルク／ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にスキムミルクを取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、５分静置した後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。Ｓ１タンパク質を固相化した各ウェルに対して１００μＬの２μｇ／ｍＬ Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１又はＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１二量体／ＰＢＳＴを添加し、室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にＶＨＨ抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、５分静置した後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。一次抗体にはＡｎｔｉ－Ｈｉｓ－ｔａｇ ｍＡｂ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ、ＯＧＨｉｓ）（ＭＥＤＩＣＡＬ ＆ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）を用いた。ＰＢＳＴにより一次抗体を１／５，０００に希釈した。各ウェルに１００μＬの一次抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧に一次抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、５分静置した後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。一次抗体の検出にはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（東京化成工業）を用いた。ＰＢＳＴによりＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ溶液を１／５，０００に希釈し、各ウェルに１００μＬずつ添加した後、室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ溶液を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、５分静置した後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し，遮光下で２０分間インキュベートした後、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）を用いて吸光度４５０ｎｍを測定した。その結果、ＣｏＶＨＨ１及びＣｏＶＨＨ１二量体ともにＳ１タンパク質に対する結合活性が認められた。さらにＣｏＶＨＨ１を二量体化することにより、結合活性が向上することがわかった（図５）。
Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標） Ｐｌａｔｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルにＰＢＳで希釈し調整した１００μＬの０－１０μｇ／ｍＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ｓｕｂｕｎｉｔ－Ｆｃ（Ｆｃタグ付きＳ１タンパク質、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）を添加し、シーリング後、４℃で一晩静置した。ピペットを用いて丁寧にウェルに吸着しなかったＳ１タンパク質分散液を取り除いた後、２００μＬの５％スキムミルク／ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にスキムミルクを取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、５分静置した後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。Ｓ１タンパク質を固相化した各ウェルに対して１００μＬの２μｇ／ｍＬ Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１又はＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１二量体／ＰＢＳＴを添加し、室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にＶＨＨ抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、５分静置した後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。一次抗体にはＡｎｔｉ－Ｈｉｓ－ｔａｇ ｍＡｂ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ、ＯＧＨｉｓ）（ＭＥＤＩＣＡＬ ＆ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）を用いた。ＰＢＳＴにより一次抗体を１／５，０００に希釈した。各ウェルに１００μＬの一次抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧に一次抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、５分静置した後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。一次抗体の検出にはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（東京化成工業）を用いた。ＰＢＳＴによりＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ溶液を１／５，０００に希釈し、各ウェルに１００μＬずつ添加した後、室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ溶液を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、５分静置した後、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し，遮光下で２０分間インキュベートした後、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）を用いて吸光度４５０ｎｍを測定した。その結果、ＣｏＶＨＨ１及びＣｏＶＨＨ１二量体ともにＳ１タンパク質に対する結合活性が認められた。さらにＣｏＶＨＨ１を二量体化することにより、結合活性が向上することがわかった（図５）。
【0062】
実施例５ 中和活性試験
前記の方法で取得したＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１とＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１二量体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性を測定した。ＣｏＶＨＨ１溶液とＣｏＶＨＨ１二量体溶液は２％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）と混合することで、それぞれ３２３.４μｇ／ｍＬと１２２．５μｇ／ｍＬの濃度になるように調製した。１００μＬの各混合液と１００μＬの２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを混合することで２倍希釈液を調製し、同様にして２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを用いて１２８倍希釈まで抗体の２倍希釈系列溶液を調製した（表１）。
前記の方法で取得したＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１とＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１二量体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和活性を測定した。ＣｏＶＨＨ１溶液とＣｏＶＨＨ１二量体溶液は２％Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）と混合することで、それぞれ３２３.４μｇ／ｍＬと１２２．５μｇ／ｍＬの濃度になるように調製した。１００μＬの各混合液と１００μＬの２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを混合することで２倍希釈液を調製し、同様にして２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを用いて１２８倍希釈まで抗体の２倍希釈系列溶液を調製した（表１）。
【0063】
【表1】
【0064】
９６ウェルプレートにＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１またはＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１二量体の各２倍希釈系列溶液を１００μＬ添加し、さらに２．５×１０５ｐｆｕ／ｍＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２溶液（国立感染症研究所から入手）をそれぞれ１００μＬずつ添加した。その後、３７℃で２時間インキュベートした後、４℃で一晩インキュベートし、抗体とウイルスを接触させた。Ｖｅｒｏ－Ｅ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ細胞バンクより購入）を播種したウェルに、抗体とウイルスを接触させた溶液１００μＬを加え、３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養した。コントロールとして、ＣｏＶＨＨ１とＣｏＶＨＨ１二量体の溶解に用いているＰＢＳ（５０ｍＭ イミダゾール含有）を用いた。培養開始３日後に顕微鏡により細胞変性効果（ＣＰＥ）を測定し中和活性を評価した。結果を表２に示す。
【0065】
【表2】
【0066】
その結果、イミダゾールを添加した場合ではすべてのウェルで細胞変性が認められたのに対し、ＣｏＶＨＨ１は４．０４３μｇ／ｗｅｌｌで中和活性能を示し、ＣｏＶＨＨ１二量体は０．８７５０μｇ／ｗｅｌｌで中和活性能を示すことが明らかとなった。即ち、ＣｏＶＨＨ１の中和活性は、多量体化することにより高まることが示された。
【0067】
実施例６ サンドイッチＥＬＩＳＡによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１タンパク質の検出
Ｐｉｅｒｃｅ(商品商標) Ｎｉｃｋｅｌ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ、Ｃｌｅａｒ、９６－Ｗｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに１００μＬの５μｇ／ｍＬ Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１を添加し、４℃で一晩静置した。ピペットを用いて丁寧にウェルに吸着しなかったＶＨＨ抗体を取り除いた後、２００μＬの５％スキムミルク／ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にブロッキング剤を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。ＶＨＨ抗体を固相化した各ウェルに対して１００μＬの０～１μｇ／ｍＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ｓｕｂｕｎｉｔ－Ｆｃ（Ｆｃタグ付きＳ１タンパク質、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）／ＰＢＳＴを添加し、室温で５０分間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にＦｃタグ付きＳ１タンパク質を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。一次抗体にはＲａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ－Ｓｈｅｅｐ ＩｇＧ Ｆｃ（Ａｂｃａｍ）を用いた。ＰＢＳＴにより一次抗体を１／５，０００に希釈した。各ウェルに１００μＬの一次抗体を添加し、室温で５０分間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧に一次抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。二次抗体にはＧｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＨＲＰ）（ａｂｃａｍ）を用いた。ＰＢＳＴにより二次抗体を１／５，０００に希釈した。各ウェルに１００μＬの二次抗体を添加し、室温で５０分間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧に二次抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し、遮光下で３０分間インキュベートした後、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）を用いて吸光度４５０ｎｍを測定した。
Ｐｉｅｒｃｅ(商品商標) Ｎｉｃｋｅｌ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ、Ｃｌｅａｒ、９６－Ｗｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに１００μＬの５μｇ／ｍＬ Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１を添加し、４℃で一晩静置した。ピペットを用いて丁寧にウェルに吸着しなかったＶＨＨ抗体を取り除いた後、２００μＬの５％スキムミルク／ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にブロッキング剤を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。ＶＨＨ抗体を固相化した各ウェルに対して１００μＬの０～１μｇ／ｍＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ｓｕｂｕｎｉｔ－Ｆｃ（Ｆｃタグ付きＳ１タンパク質、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）／ＰＢＳＴを添加し、室温で５０分間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にＦｃタグ付きＳ１タンパク質を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。一次抗体にはＲａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ－Ｓｈｅｅｐ ＩｇＧ Ｆｃ（Ａｂｃａｍ）を用いた。ＰＢＳＴにより一次抗体を１／５，０００に希釈した。各ウェルに１００μＬの一次抗体を添加し、室温で５０分間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧に一次抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。二次抗体にはＧｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＨＲＰ）（ａｂｃａｍ）を用いた。ＰＢＳＴにより二次抗体を１／５，０００に希釈した。各ウェルに１００μＬの二次抗体を添加し、室温で５０分間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧に二次抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し、遮光下で３０分間インキュベートした後、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）を用いて吸光度４５０ｎｍを測定した。
【0068】
その結果、ＣｏＶＨＨ１をプレートに固相化することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１タンパク質を検出することが出来ることが明らかになった（図６）。
【0069】
実施例７ ＥＬＩＳＡによるＣｏＶＨＨ１の結合特異性評価
Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標） Ｐｌａｔｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに１００μＬの０－１０μｇ／ｍＬ コロナウイルスのＨｉｓタグ付きＳ１タンパク質/ＰＢＳを添加、シーリング後、４℃で一晩静置した。コロナウイルスのＳ１タンパク質としては、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ＨＫＵ１（ｉｓｏｌａｔｅ Ｎ１）（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）Ｓｐｉｋｅ／Ｓ１ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓ１ Ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｈｉｓ Ｔａｇ）、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３）Ｓｐｉｋｅ／Ｓ１ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓ１ Ｓｕｂｕｎｉｔ、 Ｈｉｓ Ｔａｇ）、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）Ｓｐｉｋｅ／Ｓ１ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓ１ Ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｈｉｓ Ｔａｇ）、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）Ｓｐｉｋｅ Ｓ１ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓ１ Ｓｕｂｕｎｉｔ，Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓｐｉｋｅ／Ｓ１ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓ１ Ｓｕｂｕｎｉｔ、ａａ １－７２５、Ｈｉｓ Ｔａｇ）（いずれもＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＳＡＲＳ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｋｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ （Ｓ１）、Ｈｉｓ－Ｔａｇ （ＨＥＫ２９３）（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いた。ピペットを用いて丁寧にウェルに吸着しなかったＳ１タンパク質分散液を取り除いた後、２００μＬの５％スキムミルク／ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にスキムミルクを取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。Ｓ１タンパク質を固相化した各ウェルに対して１００μＬの２０μｇ／ｍＬ ＦＬＡＧタグ付きＣｏＶＨＨ１／ＰＢＳＴを添加し、室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にＶＨＨ抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。検出抗体にはモノクローナル抗ＦＬＡＧ（登録商標） Ｍ２抗体－ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識 マウス宿主抗体（Ｍｅｒｃｋ）を用いた。ＰＢＳＴにより検出抗体を１／５０００に希釈した。各ウェルに１００μＬの検出抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧に検出抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し、遮光下で３０分間インキュベートし、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）を用いて吸光度４５０ｎｍを測定した。
Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ（商標） Ｐｌａｔｅ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに１００μＬの０－１０μｇ／ｍＬ コロナウイルスのＨｉｓタグ付きＳ１タンパク質/ＰＢＳを添加、シーリング後、４℃で一晩静置した。コロナウイルスのＳ１タンパク質としては、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ＨＫＵ１（ｉｓｏｌａｔｅ Ｎ１）（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）Ｓｐｉｋｅ／Ｓ１ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓ１ Ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｈｉｓ Ｔａｇ）、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３）Ｓｐｉｋｅ／Ｓ１ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓ１ Ｓｕｂｕｎｉｔ、 Ｈｉｓ Ｔａｇ）、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）Ｓｐｉｋｅ／Ｓ１ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓ１ Ｓｕｂｕｎｉｔ、Ｈｉｓ Ｔａｇ）、Ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）Ｓｐｉｋｅ Ｓ１ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓ１ Ｓｕｂｕｎｉｔ，Ｈｉｓ Ｔａｇ）、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓｐｉｋｅ／Ｓ１ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓ１ Ｓｕｂｕｎｉｔ、ａａ １－７２５、Ｈｉｓ Ｔａｇ）（いずれもＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＳＡＲＳ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｋｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ （Ｓ１）、Ｈｉｓ－Ｔａｇ （ＨＥＫ２９３）（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いた。ピペットを用いて丁寧にウェルに吸着しなかったＳ１タンパク質分散液を取り除いた後、２００μＬの５％スキムミルク／ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にスキムミルクを取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。Ｓ１タンパク質を固相化した各ウェルに対して１００μＬの２０μｇ／ｍＬ ＦＬＡＧタグ付きＣｏＶＨＨ１／ＰＢＳＴを添加し、室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にＶＨＨ抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。検出抗体にはモノクローナル抗ＦＬＡＧ（登録商標） Ｍ２抗体－ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識 マウス宿主抗体（Ｍｅｒｃｋ）を用いた。ＰＢＳＴにより検出抗体を１／５０００に希釈した。各ウェルに１００μＬの検出抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧に検出抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し、遮光下で３０分間インキュベートし、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）を用いて吸光度４５０ｎｍを測定した。
【0070】
その結果、ＣｏＶＨＨ１はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１タンパク質に対しては結合を示したが、その他のコロナウイルスのＳ１タンパク質に対する結合は認められなかった（図７）。
【0071】
実施例８ バイオレイヤー干渉法による結合活性測定
Ｓ１タンパク質に対するＣｏＶＨＨ１の結合活性をより高精度に測定するため、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ ３８４システム（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を用いて、ＨＩＳ１Ｋセンサーチップに固相化したＣｏＶＨＨ１のＳ１タンパク質に対する結合活性を測定した。バッファーにはＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を用い、反応温度は２５℃に設定した。５０μＬの各反応液は３８４－ｗｅｌｌ ｂｌａｃｋ ｐｌａｔｅ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）の各ウェルに入れて測定した。測定条件は以下の通りである。１）Ｂａｓｅｌｉｎｅ
ｓｔｅｐ：ＰＢＳＴ中で３０秒間の測定、２）Ｌｏａｄｉｎｇ ｓｔｅｐ：ＰＢＳＴで希釈調製したＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１でＢｉｎｄｉｎｇが０．３ｎｍになるように測定、３）Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｔｅｐ：ＰＢＳＴ中で３０秒間の測定、４）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：ＰＢＳＴで希釈し調製した０－２４５．８ｎＭ ＳＡＲＳ―ＣｏＶ―２ (２０１９－ｎＣｏＶ) Ｓｐｉｋｅ Ｓ１－Ｆｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎで１８０秒間の測定、５）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：ＰＢＳＴ中で２４０秒間の測定。ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ (Ｄａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ Ｖｅｒｓｉｏｎ １１．１．２．４８）を用いて１：１のＦｉｔｔｉｎｇを行い、結合活性を算出した（図８）。その結果、ＣｏＶＨＨ１のＳ１タンパク質に対する平衡乖離定数（ＫＤ）は１．４０ｘ１０－９Ｍ（ｋａ＝６．７２ｘ１０４（１／Ｍｓ）、ｋｄ＝９．４２ｘ１０－４（１／ｓ））であった。
Ｓ１タンパク質に対するＣｏＶＨＨ１の結合活性をより高精度に測定するため、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ ３８４システム（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を用いて、ＨＩＳ１Ｋセンサーチップに固相化したＣｏＶＨＨ１のＳ１タンパク質に対する結合活性を測定した。バッファーにはＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を用い、反応温度は２５℃に設定した。５０μＬの各反応液は３８４－ｗｅｌｌ ｂｌａｃｋ ｐｌａｔｅ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）の各ウェルに入れて測定した。測定条件は以下の通りである。１）Ｂａｓｅｌｉｎｅ
ｓｔｅｐ：ＰＢＳＴ中で３０秒間の測定、２）Ｌｏａｄｉｎｇ ｓｔｅｐ：ＰＢＳＴで希釈調製したＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１でＢｉｎｄｉｎｇが０．３ｎｍになるように測定、３）Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｔｅｐ：ＰＢＳＴ中で３０秒間の測定、４）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：ＰＢＳＴで希釈し調製した０－２４５．８ｎＭ ＳＡＲＳ―ＣｏＶ―２ (２０１９－ｎＣｏＶ) Ｓｐｉｋｅ Ｓ１－Ｆｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎで１８０秒間の測定、５）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ：ＰＢＳＴ中で２４０秒間の測定。ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ (Ｄａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ＨＴ Ｖｅｒｓｉｏｎ １１．１．２．４８）を用いて１：１のＦｉｔｔｉｎｇを行い、結合活性を算出した（図８）。その結果、ＣｏＶＨＨ１のＳ１タンパク質に対する平衡乖離定数（ＫＤ）は１．４０ｘ１０－９Ｍ（ｋａ＝６．７２ｘ１０４（１／Ｍｓ）、ｋｄ＝９．４２ｘ１０－４（１／ｓ））であった。
【0072】
実施例９ 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法共鳴法による結合活性の測定
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ）を用いてＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＮＴＡ（Ｃｙｔｉｖａ）に固相化したＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１のＳ１タンパク質に対する結合活性を測定した。Ｗｉｚａｒｄ、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ／Ａｆｆｉｎｉｔｙのモードで測定した。温度は２５℃に設定した。ランニング緩衝液には１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０μＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ ７．４）又は５０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０μＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ ６．５）を用いた。ラン毎の測定順は以下の通りである；１）ＶＨＨの固相化：流速を１０μＬ／ｍＬに設定し、０．５ｍＭ ＮｉＣｌ２水溶液を６０秒間添加し、その後、ランニング緩衝液で希釈したＨｉｓタグ付きＶＨＨ溶液を６０秒間添加することで２００ＲＵ固定化した。２）結合活性の測定：流速を３０μＬ／ｍＬに設定し、ランニング緩衝液で希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ Ｓ１－Ｆｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｆｃタグ付きＳ１タンパク質、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）をＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ１８０秒間、Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ４００秒間に設定して相互作用させた。３）センサーチップ表面の再生：流速を３０μＬ／ｍＬに設定し、３５０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ ８．０）を６０秒間添加することで固相化されたＨｉｓタグ付きＶＨＨを溶離した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ソフトウェアバージョン２．０）（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて１：１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌによる解析を行い、結合活性を算出した（図９、図１０）。その結果、Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１のＳ１タンパク質に対する平衡乖離定数（ＫＤ）はｐＨ７．４で３．７７ｘ１０－９Ｍ（ｋａ＝８．８７ｘ１０４（１／Ｍｓ）、ｋｄ＝３．３５ｘ１０－４（１／ｓ））、ｐＨ６．５で４．３２ｘ１０－１２Ｍ（ｋａ＝６．９７ｘ１０４（１／Ｍｓ）、ｋｄ＝３．０１ｘ１０－７（１／ｓ））であった。
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ）を用いてＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＮＴＡ（Ｃｙｔｉｖａ）に固相化したＨｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１のＳ１タンパク質に対する結合活性を測定した。Ｗｉｚａｒｄ、Ｋｉｎｅｔｉｃｓ／Ａｆｆｉｎｉｔｙのモードで測定した。温度は２５℃に設定した。ランニング緩衝液には１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０μＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ ７．４）又は５０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０μＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ ６．５）を用いた。ラン毎の測定順は以下の通りである；１）ＶＨＨの固相化：流速を１０μＬ／ｍＬに設定し、０．５ｍＭ ＮｉＣｌ２水溶液を６０秒間添加し、その後、ランニング緩衝液で希釈したＨｉｓタグ付きＶＨＨ溶液を６０秒間添加することで２００ＲＵ固定化した。２）結合活性の測定：流速を３０μＬ／ｍＬに設定し、ランニング緩衝液で希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ Ｓ１－Ｆｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｆｃタグ付きＳ１タンパク質、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）をＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ１８０秒間、Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ４００秒間に設定して相互作用させた。３）センサーチップ表面の再生：流速を３０μＬ／ｍＬに設定し、３５０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ ８．０）を６０秒間添加することで固相化されたＨｉｓタグ付きＶＨＨを溶離した。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ソフトウェアバージョン２．０）（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて１：１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌによる解析を行い、結合活性を算出した（図９、図１０）。その結果、Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１のＳ１タンパク質に対する平衡乖離定数（ＫＤ）はｐＨ７．４で３．７７ｘ１０－９Ｍ（ｋａ＝８．８７ｘ１０４（１／Ｍｓ）、ｋｄ＝３．３５ｘ１０－４（１／ｓ））、ｐＨ６．５で４．３２ｘ１０－１２Ｍ（ｋａ＝６．９７ｘ１０４（１／Ｍｓ）、ｋｄ＝３．０１ｘ１０－７（１／ｓ））であった。
【0073】
実施例１０ ＣｏＶＨＨ１及びＣｏＶＨＨ１変異体の合成
ＣｏＶＨＨ１（配列番号９）及びＣｏＶＨＨ１変異体（ＣｏＶＨＨ１３０１（配列番号３４）、ＣｏＶＨＨ３１９（配列番号３５）、ＣｏＶＨＨ３９（配列番号３６）、ＣｏＶＨＨ３２７（配列番号３７）、ＣｏＶＨＨ４７（配列番号３８）、ＣｏＶＨＨ１６（配列番号３９）、ＣｏＶＨＨ４９（配列番号４０）、ＣｏＶＨＨ５８（配列番号４１）、ＣｏＶＨＨ４１７（配列番号４２）、ＣｏＶＨＨ１１８（配列番号４３）、ＣｏＶＨＨ４１６（配列番号４４）、ＣｏＶＨＨ３３４２（配列番号４５）、ＣｏＶＨＨ２０１（配列番号４６）、ＣｏＶＨＨ２０（配列番号４７）、ＣｏＶＨＨ１１２（配列番号４８）、ＣｏＶＨＨ２０１７（配列番号４９）、ＣｏＶＨＨ１３７（配列番号５０）、ＣｏＶＨＨ９６（配列番号５１））のＣ末端側にＥＬＩＳＡのためＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号５２）を付与したものを実施例２の方法に従い合成した。それぞれのＶＨＨを合成するための人工合成遺伝子の配列は表３に示す通りである。これら人工合成遺伝子をもとに、実施例２の（２）以降の手順に従って、ＣｏＶＨＨ１及びＣｏＶＨＨ１変異体を合成した。その結果、ＣｏＶＨＨ１１８を除く全てのＣｏＶＨＨ１及びＣｏＶＨＨ１変異体が合成されたことが確認された。
ＣｏＶＨＨ１（配列番号９）及びＣｏＶＨＨ１変異体（ＣｏＶＨＨ１３０１（配列番号３４）、ＣｏＶＨＨ３１９（配列番号３５）、ＣｏＶＨＨ３９（配列番号３６）、ＣｏＶＨＨ３２７（配列番号３７）、ＣｏＶＨＨ４７（配列番号３８）、ＣｏＶＨＨ１６（配列番号３９）、ＣｏＶＨＨ４９（配列番号４０）、ＣｏＶＨＨ５８（配列番号４１）、ＣｏＶＨＨ４１７（配列番号４２）、ＣｏＶＨＨ１１８（配列番号４３）、ＣｏＶＨＨ４１６（配列番号４４）、ＣｏＶＨＨ３３４２（配列番号４５）、ＣｏＶＨＨ２０１（配列番号４６）、ＣｏＶＨＨ２０（配列番号４７）、ＣｏＶＨＨ１１２（配列番号４８）、ＣｏＶＨＨ２０１７（配列番号４９）、ＣｏＶＨＨ１３７（配列番号５０）、ＣｏＶＨＨ９６（配列番号５１））のＣ末端側にＥＬＩＳＡのためＧＧＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号５２）を付与したものを実施例２の方法に従い合成した。それぞれのＶＨＨを合成するための人工合成遺伝子の配列は表３に示す通りである。これら人工合成遺伝子をもとに、実施例２の（２）以降の手順に従って、ＣｏＶＨＨ１及びＣｏＶＨＨ１変異体を合成した。その結果、ＣｏＶＨＨ１１８を除く全てのＣｏＶＨＨ１及びＣｏＶＨＨ１変異体が合成されたことが確認された。
【0074】
【表3】
【0075】
実施例１１ サンドイッチＥＬＩＳＡによるＣｏＶＨＨ１変異体の結合活性の評価
Ｐｉｅｒｃｅ(商品商標) Ｎｉｃｋｅｌ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ、Ｃｌｅａｒ、９６－Ｗｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに実施例１０にて合成した１００μＬの５μｇ／ｍＬ Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１または各ＣｏＶＨＨ１変異体を添加し、４℃で一晩静置した。ピペットを用いて丁寧にウェルに吸着しなかったＶＨＨ抗体を取り除いた後、２００μＬの５％スキムミルク／ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にブロッキング剤を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。ＶＨＨ抗体を固相化した各ウェルに対して１００μＬの０～０．１μｇ／ｍＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ Ｓ１－Ｆｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｆｃタグ付きＳ１タンパク質、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）／ＰＢＳＴを添加し、室温で５０分間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にＦｃタグ付きＳ１タンパク質を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。検出抗体にはＧｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（ＨＲＰ）（アブカム）を用いた。ＰＢＳＴにより一次抗体を１／５，０００に希釈した。各ウェルに１００μＬの検出抗体を添加し、室温で５０分間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧に検出抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し、遮光下で２０分間インキュベートした後、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）を用いて吸光度４５０ｎｍを測定した。
Ｐｉｅｒｃｅ(商品商標) Ｎｉｃｋｅｌ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ、Ｃｌｅａｒ、９６－Ｗｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに実施例１０にて合成した１００μＬの５μｇ／ｍＬ Ｈｉｓタグ付きＣｏＶＨＨ１または各ＣｏＶＨＨ１変異体を添加し、４℃で一晩静置した。ピペットを用いて丁寧にウェルに吸着しなかったＶＨＨ抗体を取り除いた後、２００μＬの５％スキムミルク／ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０含有ＰＢＳ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にブロッキング剤を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。ＶＨＨ抗体を固相化した各ウェルに対して１００μＬの０～０．１μｇ／ｍＬ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（２０１９－ｎＣｏＶ）Ｓｐｉｋｅ Ｓ１－Ｆｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｆｃタグ付きＳ１タンパク質、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）／ＰＢＳＴを添加し、室温で５０分間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧にＦｃタグ付きＳ１タンパク質を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。検出抗体にはＧｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（ＨＲＰ）（アブカム）を用いた。ＰＢＳＴにより一次抗体を１／５，０００に希釈した。各ウェルに１００μＬの検出抗体を添加し、室温で５０分間インキュベートした。ピペットを用いて丁寧に検出抗体を取り除いた後、２００μＬのＰＢＳＴを添加し、ピペットを用いて丁寧に取り除いた。この洗浄操作は３回行った。発色基質はＯＰＤタブレット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＳｔａｂｌｅ Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し調製した。各ウェルに１００μＬの発色基質を添加し、遮光下で２０分間インキュベートした後、直ちにＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）を用いて吸光度４５０ｎｍを測定した。
【0076】
その結果、スクリーニングにより取得されたＣｏＶＨＨ１変異体のうち、ＣｏＶＨＨ１３０１（配列番号３４）、ＣｏＶＨＨ３１９（配列番号３５）、ＣｏＶＨＨ３９（配列番号３６）、ＣｏＶＨＨ３２７（配列番号３７）、ＣｏＶＨＨ４７（配列番号３８）、ＣｏＶＨＨ１６（配列番号３９）、ＣｏＶＨＨ４９（配列番号４０）、ＣｏＶＨＨ５８（配列番号４１）、ＣｏＶＨＨ４１７（配列番号４２）、ＣｏＶＨＨ４１６（配列番号４４）、ＣｏＶＨＨ３３４２（配列番号４５）、ＣｏＶＨＨ２０（配列番号４７）、ＣｏＶＨＨ１１２（配列番号４８）、ＣｏＶＨＨ２０１７（配列番号４９）、ＣｏＶＨＨ１３７（配列番号５０）について、ＣｏＶＨＨ１と同様にＳＡＲＳ―ＣｏＶ―２のＳ１タンパク質に対する結合活性があることが確認された（図１１）。このことから、ｃＤＮＡディスプレイ法によるスクリーニングを経て取得されたＣｏＶＨＨ１変異体（ＣｏＶＨＨ１のいずれかのＣＤＲ領域に1つのアミノ酸変異を持つＶＨＨ抗体）はＳＡＲＳ―ＣｏＶ―２のＳ１タンパク質に対する結合活性があることが示された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】