特開 2022-23181 Ｃ末端リジンで結合体化された免疫グロブリン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022023181

(43)【公開日】2022-02-07

(54)【発明の名称】Ｃ末端リジンで結合体化された免疫グロブリン

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20220131BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20220131BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20220131BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220131BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20220131BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220131BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220131BHJP

   C12N 9/10 20060101ALN20220131BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/00 ZNA

C07K16/46

C07K19/00

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 B

A61K47/68

A61K45/00

A61K39/395 Y

C12N9/10

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021176196

(22)【出願日】2021-10-28

(62)【分割の表示】P 2018531122の分割

【原出願日】2016-12-16

(31)【優先権主張番号】62/269,138

(32)【優先日】2015-12-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】506137147

【氏名又は名称】エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ジャレッド スピデル

(72)【発明者】

【氏名】アール アルボーン

【テーマコード（参考）】

4B050

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B050CC07

4B050DD02

4B050LL05

4B064AG26

4B064AG27

4B064BJ12

4B064CA21

4B064DA01

4B064DA05

4B064DA13

4B064DA14

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA83X

4B065AA86X

4B065AA87X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C076AA95

4C076EE59

4C084AA17

4C084NA13

4C085AA22

4C085AA25

4C085DD51

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045BA50

4H045BA57

4H045BA71

4H045BA72

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045DA83

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

【課題】Ｃ末端リジンで結合体化された免疫グロブリンの提供。
【解決手段】結合体化された免疫グロブリンおよび微生物トランスグルタミナーゼを使用して、結合体化された免疫グロブリンを作製するための方法が、本明細書中に提供される。１つの態様において、結合体化された免疫グロブリンを作製するための方法が、本明細書中に開示され、その方法は、微生物トランスグルタミナーゼ、およびアシル供与体基質を含む機能性物質とともに、免疫グロブリンをインキュベートする工程を含み、その免疫グロブリンはＣ末端リジンの後に少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、そのアシル供与体基質はグルタミン残基を含み、その機能性物質は治療薬または診断薬であり、その微生物トランスグルタミナーゼは、免疫グロブリンのＣ末端リジンを機能性物質上のアシル供与体基質のグルタミン残基に結合体化させ、それによって、結合体化された免疫グロブリンを作製する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

本願明細書に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１５年１２月１８日に出願された米国仮出願第６２／２６９，１３８への優先権を主張し、当該出願の内容全体は、本明細書において明示的に参考として援用される。

【0002】

技術分野
Ｃ末端リジンで結合体化された免疫グロブリンおよびそれを作製する方法が、本明細書中に提供される。

【背景技術】

【0003】

背景
モノクローナル抗体の有用性は、基礎研究から治療および診断での応用にまで広がっている。抗体を機能性物質（functional agent）に結合体化させることができれば、その
機能はさらに広がる。結合体化された抗体の製造には、通常、リンカー、薬物または他の機能性物質を、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）上の反応性のリジンシステイン残基（reactive lysine cysteine residues）に結合体化させる必要がある。Ｄｅｏｎａｒａｉｎら、“Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｆｏｒｍａｔｓ ｆｏｒ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２０１５），１０（５）：４６３－４８１を参照のこと。リジン結合体化は、代表的には、スクシンイミド（ＮＨＳ）に基づくか、またはイソチオシアネートに基づく化学反応によって媒介される。システインベースの結合体化は、鎖間ジスルフィド結合のいくつかを破壊することによって、遊離したチオール側鎖を生成するために、抗体の部分的還元を必要とする。次いで、チオール反応性の機能性物質が、その抗体上の遊離チオール基と反応して、抗体－薬物結合体（ＡＤＣ）を生成することができる。これらの方法は、両方とも、複数のリジンまたはシステインの改変をもたらし、複数の薬物対抗体比（ＤＡＲ）の分布およびランダムな位置における薬物改変を有する不均一なＡＤＣ混合物がもたらされる。

【0004】

明確なＤＡＲを有する均一なＡＤＣ生成物を生成する方法として部位特異的結合体化の技術を利用する最近の取り組みによって、不対のシステインの操作、非天然アミノ酸の組み込み、および部位特異的な酵素的修飾を含むいくつかの方法がもたらされた。これらの方法は、均一な生成物を生成するが、これらの方法には欠点がある。システインベースの結合体化には、キャッピングシステインを、グルタチオンを、またはさらには不対のシステインから軽鎖を除去する追加の工程が必要である。例えば、Ｊｕｎｕｔｕｌａら、“Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｄｒｕｇ ｔｏ ａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
Ｉｎｄｅｘ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６：９２５－９３２；Ｃｈｅｎら、“Ｃｈａｒｇｅ－ｂａｓｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ”，ＭＡｂｓ（２００９）１（６）：５６３－５７１；Ｇｏｍｅｚら、“Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｐＨ，ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｏｘｙｇｅｎ，ａｎｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｉｐｌｅ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ（２０１０），２６：１４３８－１４４５を参照のこと。さらに、システインベースの結合体化に現在用いられているマレイミドに基づく化学反応の血清不安定性が証明されており、効力低下またはオフターゲット毒性に対する懸念が広がっている。Ａｌｌｅｙら、“Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｎｋｅｒ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８）１９（３）：７５９－７６５；Ｓｈｅｎら、“Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１２）３０：１８４－１８９。非天然アミノ酸の組み込みには、遺伝的に改変された細胞に基づく系または無細胞系のいずれかにおける発現が必要である。Ｈａｌｌａｍら、“Ｕｎｎａｔｕｒａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｎｏｖｅｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０１４）６（１１）：１３０９－１３２４。さらに、非天然アミノ酸の存在は、患者において免疫原性の反応を引き起こし得る。しかしながら、部位特異的な酵素的修飾は、潜在的に抗体配列中の天然の野生型アミノ酸を利用することができ、それにより、免疫原性の危険を最小限にし得る。さらに、タンパク質を修飾する酵素によって通常形成される翻訳後の結合は、非常に安定している。

【0005】

グルタミンのγ－カルボキシアミド基（アシル供与体）とリジンのε－アミノ基（アシル受容体）との間の安定したイソペプチド結合の形成を触媒するトランスグルタミナーゼと呼ばれるタンパク質のファミリーを使用したタンパク質の部位特異的な酵素的修飾が探索されてきた（図１を参照のこと）（例えば、Ｙｏｋｏｙａｍａら、“Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ”，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００４）６４：４７－４５４；Ｓｔｒｏｐ，“Ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ”，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２０１４）２５（５）：８５５－８６２；Ｋｉｅｌｉｓｚｅｋら、“Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ”，Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０１４）５９：２４１－２５０を参照のこと）。最近、いくつかのグループが、ＡＤＣを生成する手段としてトランスグルタミナーゼを利用して探索している（例えば、Ｊｏｓｔｅｎら、“Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，（２０００）２４０：４７－５４；Ｍｉｎｄｔら、“Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＩｇＧ１ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｖｉａ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｎｄ Ｌｙｓｉｎｅ Ｕｓｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ”，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８）１９（１）：２７１－２７８）；Ｊｅｇｅｒら、“Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ
ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ”Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（２０１０）４９：９９９５－９９９７；Ｓｔｒｏｐら、“Ｌｏｃａｔｉｏｎ Ｍａｔｔｅｒｓ：Ｓｉｔｅ ｏｆ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ（２０１３）２０（２）：１６１－１６７；Ｄｅｎｎｌｅｒら、“Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ－Ｂａｓｅｄ Ｃｈｅｍｏ－Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｙｉｅｌｄｓ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１４）２５（３）：５６９－５７８；Ｓｉｅｇｍｕｎｄら、“Ｌｏｃｋｅｄ ｂｙ Ｄｅｓｉｇｎ：Ａ
Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ Ｔａｇ Ｅｎａｂｌｅｓ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ”，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（２０１５）５４（４５）：１３４２０－１３４２４を参照のこと）。トランスグルタミナーゼは、細菌からヒトに及ぶ生物に見出され、それらは、構造的および機能的に関係しているが、それぞれ、特定の細胞プロセスに関与している。細菌であるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓから単離された微生物トランスグルタミナーゼ（微生物トランスグルタミナーゼ）が、様々な用途に向けてタンパク質同士を共に架橋するために、食品産業全体で広く使用されている。それは、製造コストが低いことに加えて、広範囲のｐＨ条件、塩条件および温度条件の下で機能できるため、魅力的な結合体化の技法である。

【0006】

２０年を超える研究にもかかわらず、微生物トランスグルタミナーゼの基質特異性は、まだ明確に定義されていない。一般に、疎水性または正に帯電した隣接残基を有する露出したループ上のグルタミンまたはリジンが、好まれる傾向がある。Ｔａｇｕｃｈｉら、“Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ
ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｓ ｎａｔｕｒａｌ ｍｏｄｅｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ”，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００）１２８：４１５－４２５；Ｓｕｇｉｍｕｒａら、“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｐｈａｇｅ－ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｙ”，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．（２００８）４７７：３７９－３８３；Ｔａｇａｍｉら、“Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ａｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｄｏｃｋｉｎｇ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２００９）２２：７４７－７５２を参照のこと。アシル供与体であるグルタミンの環境が、アシル受容体であるリジンよりも重要であることが見出された。例えば、Ｏｈｔｓｕｋａら、“Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ｆｏｒ ｐｒｉｍａｒｙ ａｍｉｎｅｓ”，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．（２０００）４８：６２３０－６２３３；Ｏｈｔｓｕｋａら、“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅｓ ｕｓｉｎｇ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ａｃｙｌ ｄｏｎｏｒｓ”，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００）６４：２６０８－２６１３；Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎら、“Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ｄｉｓｐｌａｙｓ ｂｒｏａｄ ａｃｙｌ－ａｃｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１３）９８：２１９－２３０を参照のこと。

【0007】

微生物トランスグルタミナーゼの、アシル受容体アミンに対する特異性がより低いことに起因して、これまでの研究は、抗体のグルタミン残基のアミド基転移にだけ焦点を合わせてきた。上で言及したＪｏｓｔｅｎら、Ｍｉｎｄｔら、Ｊｅｇｅｒら、Ｓｔｒｏｐら、Ｄｅｎｎｌｅｒら、およびＳｉｅｇｍｕｎｄらを参照のこと。ヒトＩｇＧは、平均８０個のリジンを含み、その８０～９０％が、溶媒に露出していると予測されており（Ｇａｕｔｉｅｒら、“Ｌｙｓｉｎｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ＩｇＧｓ Ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｎａｔｉｖｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｂｏｔｔｏｍ－Ｕｐ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ”，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２０１５）１５（１６）：２７５６－２７６５；データ示さず）、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３およびＩｇＧ_４のＣ末端コドンは、リジンである（Ｅｌｌｉｓｏｎら、ＤＮＡ（１９８１）１：１１－１８；Ｅｌｌｉｓｏｎら（“Ｅｌｌｉｓｏｎら、２”），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８２）７９：１９８４－１９８８；Ｅｌｌｉｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．（１９８２）１０：４０７１－４０７９）。しかしながら、血清由来ＩｇＧは、このリジンを欠く（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８０）１２５：１０４８－１０５４；Ｅｄｅｌｍａｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６９）６３：７８－８５；Ｆｒａｎｇｉｏｎｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８０）１９：４３０４－４３０８；Ｐｉｎｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９７０）１１７：３３－４７）。同じことが、ＩｇＤについても観察されている（Ｗｈｉｔｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２８：７３３－７３７；Ｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８１）７８：５０４－５０８；Ｓｈｉｎｏｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８１）７８：７８５－７８９）。ＨＥＫ２９３細胞およびＣＨＯ細胞におけるＩｇＧ１の組換え発現も、Ｃ末端のＬｙｓ４４７を欠くタンパク質をもたらす（Ｅｌｌｉｓｏｎら；Ｈａｒｒｉｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９４：６１１－６２０；Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ（１９９５）７０５：１２９－１３４；Ｄｉｃｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２００８）１００：１１３２－１１４３）。

【0008】

今まで、当業者は、ＩｇＧの表面上に反応性リジンが多すぎることに起因して、リジンのアミド基を転移させるためにアミン供与体に基づく基質を利用すると、不均一なＡＤＣ生成物が生じるおそれがあると考えていた（ＪｏｓｔｅｎらおよびＪｅｇｅｒら）ので、免疫グロブリン上のリジン残基のアミド基を転移させるためにアミン供与体ベースの基質を使用することを思いとどまっていた。
したがって、結合体化の割合が予測可能な結合体を作製するために、免疫グロブリンを部位特異的に酵素的修飾する必要性がある。これによって、比較的一致する（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）ＤＡＲを有するＡＤＣの作製が可能になる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｄｅｏｎａｒａｉｎら、“Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｆｏｒｍａｔｓ ｆｏｒ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２０１５），１０（５）：４６３－４８１

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

要旨
本発明は、驚いたことに、微生物トランスグルタミナーゼによる野生型免疫グロブリンのリジンの修飾は観察されなかったが、Ｃ末端アミノ酸の伸長を用いてＣ末端免疫グロブリンリジン残基をカルボキシペプチダーゼによる切断から保護したとき、微生物トランスグルタミナーゼが、天然のＣ末端リジンをアシル受容体として利用できたことを開示する。驚いたことに、微生物トランスグルタミナーゼを用いたＣ末端リジンの結合体化は、結合体化される機能性物質の部位特異的かつ予測可能な組み込みをもたらす。

【0011】

１つの態様において、結合体化された免疫グロブリンを作製するための方法が、本明細書中に開示され、その方法は、微生物トランスグルタミナーゼ、およびアシル供与体基質を含む機能性物質とともに、免疫グロブリンをインキュベートする工程を含み、その免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後に少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、そのアシル供与体基質は、グルタミン残基を含み、その機能性物質は、治療薬または診断薬であり、その微生物トランスグルタミナーゼは、免疫グロブリンのＣ末端リジンを機能性物質上のアシル供与体基質のグルタミン残基に結合体化させ、それによって、結合体化された免疫グロブリンを作製する。

【0012】

別の態様において、結合体化された免疫グロブリンを作製するための方法が、本明細書中に開示され、その方法は、ｉ）微生物トランスグルタミナーゼおよびアシル供与体基質とともに免疫グロブリンをインキュベートする工程であって、ここで、その免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後に少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、そのアシル供与体基質は、グルタミン残基および反応基を含み、その微生物トランスグルタミナーゼは、免疫グロブリンのＣ末端リジンをアシル供与体基質のグルタミン残基に結合体化させる、工程、およびｉｉ）アシル供与体基質の反応基に機能性物質を結合体化させる工程であって、その機能性物質は、治療薬または診断薬である、工程を含み、それによって、結合体化された免疫グロブリンを作製する。

【0013】

１つの実施形態において、アシル供与体基質の反応基は、クリックケミストリーによって機能性物質に結合体化される。

【0014】

１つの実施形態において、Ｃ末端リジンは、免疫グロブリンの重鎖上のリジン４４７（Ｋ４４７）である。

【0015】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後に１つのアミノ酸残基を含み、そのＣ末端リジンの後の１つのアミノ酸残基は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミンまたはヒスチジンである。別の実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後に１つのアミノ酸残基を含み、そのＣ末端リジンの後の１つのアミノ酸残基は、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニンを含まない。

【0016】

１つの実施形態において、アシル供与体基質を含む機能性物質は、式（Ｉ）または（ＩＩ）：
（Ｚ）_ｍ－Ｇｌｎ－（Ｌ）_ｎ－（Ｙ） （Ｉ）
（Ｙ）－（Ｌ）_ｎ－Ｇｌｎ－（Ｚ）_ｍ （ＩＩ）
のうちの１つに記載のものであり、

【0017】

式中、Ｚは、カルボキシルベンジルオキシ（ＣＢＺ）基またはアミノ酸残基であり；Ｇｌｎは、グルタミンアミノ酸残基であり；各Ｌは、独立して、１～２０個の炭素原子の直鎖または分枝鎖のリンカーであり、ここで、それらの炭素原子のうちの１つまたは複数は、任意選択でかつ独立して、窒素原子、酸素原子または硫黄原子で置き換えられ得、ここで、各炭素原子および各窒素原子は、任意選択で置換され得るか；または各Ｌは、任意選択でかつ独立して、アミノ酸残基であり；ｍは、０～５の整数であり；ｎは、０～５の整数であり；Ｙは、機能性物質である。

【0018】

１つの実施形態において、アシル供与体基質を含む機能性物質は、式（Ｉ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり；Ｌは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）（－Ｏ（（ＣＨ_２）_２）－）、エチルアミン（－ＮＨ（（ＣＨ_２）_２）－）またはプロピルアミン（－ＮＨ（（ＣＨ_２）_３）－）であり；ｎは、０、１、２または３である。１つの実施形態において、Ｌは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）である。別の実施形態において、Ｌは、１つまたは複数のアミノ酸およびポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。別の実施形態において、アシル供与体基質を含む機能性物質は、式（Ｉ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり、Ｌは、アミノ酸である。１つの実施形態において、Ｌは、Ｇｌｙであり；ｍは、１であり；ｎは、１である。別の実施形態において、アシル供与体基質を含む機能性物質は、式（ＩＩ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり；ｍは、１であり；ｎは、２、３または４であり；少なくとも１つのＬは、Ｇｌｙであり；少なくとも１つのＬは、ＰＥＧ部分である。さらなる実施形態において、アシル供与体基質を含む機能性物質は、式（ＩＩ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり；ｍは、１であり；ｎは、４であり；１つのＬは、Ｇｌｙであり、残りの３つのＬ基は、それぞれＰＥＧ部分である。

【0019】

１つの実施形態において、アシル供与体基質は、式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）：
（Ｚ）_ｍ－Ｇｌｎ－（Ｌ）_ｎ－（Ｘ） （ＩＩＩ）
（Ｘ）－（Ｌ）_ｎ－Ｇｌｎ－（Ｚ）_ｍ （ＩＶ）
のうちの１つに記載のものであり、式中、Ｚは、カルボキシルベンジルオキシ（ＣＢＺ）基またはアミノ酸残基であり；Ｇｌｎは、グルタミンアミノ酸残基であり；各Ｌは、独立して、１～２０個の炭素原子の直鎖または分枝鎖のリンカーであり、ここで、それらの炭素原子のうちの１つまたは複数は、任意選択でかつ独立して、窒素原子、酸素原子または硫黄原子で置き換えられ得、ここで、各炭素原子および各窒素原子は、任意選択で置換され得るか；または各Ｌは、任意選択でかつ独立して、アミノ酸残基であり；ｍは、０～５の整数であり；ｎは、０～５の整数であり；Ｘは、反応基である。

【0020】

１つの実施形態において、Ｌは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）である。別の実施形態において、ｎが、２～５であるとき、少なくとも１つのＬは、１つまたは複数のアミノ酸を含み、他のＬは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である。１つの実施形態において、アシル供与体基質は、式（ＩＩＩ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり；Ｌは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）（－Ｏ（（ＣＨ_２）_２）－）、エチルアミン（－ＮＨ（（ＣＨ_２）_２）－）またはプロピルアミン（－ＮＨ（（ＣＨ_２）_３）－）であり；ｎは、０、１、２または３である。別の実施形態において、アシル供与体基質は、式（ＩＩＩ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり、Ｌは、アミノ酸である。１つの実施形態において、Ｌは、Ｇｌｙであり；ｎは、１であり；ｍは、１である。別の実施形態において、アシル供与体基質は、式（ＩＶ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり；ｍは、１であり；ｎは、１、２または３であり；少なくとも１つのＬは、Ｇｌｙである。

【0021】

別の実施形態において、Ｘは、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメタノール（ＢＣＮ）、

【化1】

ｔｒａｎｓ－シクロオクテン（ＴＣＯ）、アジド（Ｎ_３）、アルキン、テトラジンメチルシクロプロペン、ノルボルネン、ヒドラジド／ヒドラジンおよびアルデヒドからなる群より選択される反応基である。

【0022】

１つの実施形態において、治療薬は、抗体もしくはその抗原結合部分、化学療法剤、薬剤、放射性剤（ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）、細胞傷害剤、抗生物質、小分子、核酸またはポリペプチドである。別の実施形態において、診断薬は、フルオロフォア、蛍光色素、放射性核種または酵素である。

【0023】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基およびＣ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基を含む２つのアミノ酸残基をＣ末端リジンの後に有する。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンを除く任意のアミノ酸残基であり、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される。別の実施形態において、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基は、リジンまたはアルギニンである。別の実施形態において、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リジン、システイン、トリプトファン、アルギニン、セリンおよびグリシンからなる群より選択される。

【0024】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基およびＣ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基を含む３つのアミノ酸残基をＣ末端リジンの後に有し、Ｃ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンではない。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リジン、システイン、トリプトファン、アルギニン、セリンおよびグリシンからなる群より選択される。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンではない。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リジン、システイン、トリプトファン、アルギニン、セリンおよびグリシンからなる群より選択される。

【0025】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基、Ｃ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基およびＣ末端リジンの後の４番目のアミノ酸残基を含む４つのアミノ酸残基をＣ末端リジンの後に有し、Ｃ末端リジンの後の４番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンではない。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リジン、システイン、トリプトファン、アルギニン、セリンおよびグリシンからなる群より選択される。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンではない。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リジン、システイン、トリプトファン、アルギニン、セリンおよびグリシンからなる群より選択される。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンではない。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リジン、システイン、トリプトファン、アルギニン、セリンおよびグリシンからなる群より選択される。

【0026】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基、Ｃ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基、Ｃ末端リジンの後の４番目のアミノ酸残基およびＣ末端リジンの後の５番目のアミノ酸残基を含む５つのアミノ酸残基をＣ末端リジンの後に有し、Ｃ末端リジンの後の５番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンではない。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リジン、システイン、トリプトファン、アルギニン、セリンおよびグリシンからなる群より選択される。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンではない。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リジン、システイン、トリプトファン、アルギニン、セリンおよびグリシンからなる群より選択される。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンではない。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リジン、システイン、トリプトファン、アルギニン、セリンおよびグリシンからなる群より選択される。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の４番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンではない。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の４番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リジン、システイン、トリプトファン、アルギニン、セリンおよびグリシンからなる群より選択される。

【0027】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後に９つ未満のアミノ酸残基を有し、Ｃ末端リジンの後の最後のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される。

【0028】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後に１３個未満のアミノ酸残基を有し、ここで、Ｃ末端リジンの後の最後のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される。

【0029】

１つの実施形態において、微生物トランスグルタミナーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓに由来する。

【0030】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ_１免疫グロブリンである。別の実施形態において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３またはＩｇＧ_４免疫グロブリンである。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、尾部を含まない、ＩｇＡ_１、ＩｇＡ_２またはＩｇＭ免疫グロブリンである。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、ＩｇＤまたはＩｇＥ免疫グロブリンである。

【0031】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンまたはヒト化免疫グロブリンである。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリンまたは非ヒト免疫グロブリンである。

【0032】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む。１つの実施形態において、免疫グロブリンの２本の重鎖の間に分子内架橋は、存在しない。

【0033】

１つの実施形態において、機能性物質と免疫グロブリンの比は、１：１～２：１である。

【0034】

別の態様において、免疫グロブリンおよび機能性物質を含む結合体化された免疫グロブリンが、本明細書中に記載され、ここで、その免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後に少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、その機能性物質は、アシル供与体基質を含み、そのアシル供与体基質は、グルタミン残基を含み、その機能性物質は、治療薬または診断薬であり、その免疫グロブリンのＣ末端リジンは、機能性物質のアシル供与体基質のグルタミン残基に結合体化される。

【0035】

別の態様において、免疫グロブリンおよび機能性物質を含む結合体化された免疫グロブリンが、本明細書中に記載され、ここで、その免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後に少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、Ｃ末端リジンは、アシル供与体基質上のグルタミン残基に結合体化され、そのアシル供与体基質は、反応基をさらに含み、その反応基は、機能性物質に結合体化され、その機能性物質は、治療薬または診断薬である。

【0036】

１つの実施形態において、Ｃ末端リジンは、免疫グロブリンの重鎖上のリジン４４７（Ｋ４４７）である。

【0037】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後に１つのアミノ酸残基を含み、そのＣ末端リジンの後の１つのアミノ酸残基は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミンまたはヒスチジンである。

【0038】

別の実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後に１つのアミノ酸残基を含み、そのＣ末端リジンの後の１つのアミノ酸残基は、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニンではない。

【0039】

１つの実施形態において、アシル供与体基質を含む機能性物質は、式（Ｉ）または（ＩＩ）：
（Ｚ）_ｍ－Ｇｌｎ－（Ｌ）_ｎ－（Ｙ） （Ｉ）
（Ｙ）－（Ｌ）_ｎ－Ｇｌｎ－（Ｚ）_ｍ （ＩＩ）
のうちの１つに記載のものであり、

【0040】

式中、Ｚは、カルボキシルベンジルオキシ（ＣＢＺ）基またはアミノ酸残基であり；Ｇｌｎは、グルタミンアミノ酸残基であり；各Ｌは、独立して、１～２０個の炭素原子の直鎖または分枝鎖のリンカーであり、ここで、それらの炭素原子のうちの１つまたは複数は、任意選択でかつ独立して、窒素原子、酸素原子または硫黄原子で置き換えられ得、ここで、各炭素原子および各窒素原子は、任意選択で置換され得るか；または各Ｌは、任意選択でかつ独立して、アミノ酸残基であり；ｍは、０～５の整数であり；ｎは、０～５の整数であり；Ｙは、機能性物質である。

【0041】

１つの実施形態において、アシル供与体基質を含む機能性物質は、式（Ｉ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり；Ｌは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）（－Ｏ（（ＣＨ_２）_２）－）、エチルアミン（－ＮＨ（（ＣＨ_２）_２）－）またはプロピルアミン（－ＮＨ（（ＣＨ_２）_３）－）であり；ｎは、０、１、２または３である。別の実施形態において、アシル供与体基質を含む機能性物質は、式（Ｉ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり、Ｌは、アミノ酸である。１つの実施形態において、Ｌは、Ｇｌｙであり；ｍは、１であり；ｎは、１である。１つの実施形態において、アシル供与体基質を含む機能性物質は、式（ＩＩ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり；ｍは、１であり；ｎは、１、２または３であり；少なくとも１つのＬは、Ｇｌｙである。１つの実施形態において、Ｌは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）である。別の実施形態において、Ｌは、１つまたは複数のアミノ酸およびポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。

【0042】

１つの実施形態において、アシル供与体基質は、式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）：
（Ｚ）_ｍ－Ｇｌｎ－（Ｌ）_ｎ－（Ｘ） （ＩＩＩ）
（Ｘ）－（Ｌ）_ｎ－Ｇｌｎ－（Ｚ）_ｍ （ＩＶ）
のうちの１つに記載のものであり、

【0043】

式中、Ｚは、カルボキシルベンジルオキシ（ＣＢＺ）基またはアミノ酸残基であり；Ｇｌｎは、グルタミンアミノ酸残基であり；各Ｌは、独立して、１～２０個の炭素原子の直鎖または分枝鎖のリンカーであり、ここで、それらの炭素原子のうちの１つまたは複数は、任意選択でかつ独立して、窒素原子、酸素原子または硫黄原子で置き換えられ得、ここで、各炭素原子および各窒素原子は、任意選択で置換され得るか；または各Ｌは、任意選択でかつ独立して、アミノ酸残基であり；ｍは、０～５の整数であり；ｎは、０～５の整数であり；Ｘは、反応基である。

【0044】

１つの実施形態において、アシル供与体基質は、式（ＩＩＩ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり；Ｌは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）（－Ｏ（（ＣＨ_２）_２）－）、エチルアミン（－ＮＨ（（ＣＨ_２）_２）－）またはプロピルアミン（－ＮＨ（（ＣＨ_２）_３）－）であり；ｎは、０、１、２または３である。別の実施形態において、アシル供与体基質は、式（ＩＩＩ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり、Ｌは、アミノ酸である。１つの実施形態において、Ｌは、Ｇｌｙであり；ｍは、１であり；ｎは、１である。別の実施形態において、アシル供与体基質は、式（ＩＶ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり；ｍは、１であり；ｎは、１、２または３であり；少なくとも１つのＬは、Ｇｌｙである。１つの実施形態において、Ｌは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）である。別の実施形態において、ｎが、２～５であるとき、少なくとも１つのＬは、１つまたは複数のアミノ酸を含み、１つまたは複数のＬは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。

【0045】

１つの実施形態において、Ｘは、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメタノール（ＢＣＮ）、

【化2】

ｔｒａｎｓ－シクロオクテン（ＴＣＯ）、アジド（Ｎ_３）、アルキン、テトラジンメチルシクロプロペン、ノルボルネン、ヒドラジド／ヒドラジンおよびアルデヒドからなる群より選択される反応基である。

【0046】

１つの実施形態において、治療薬は、抗体もしくはその抗原結合部分、化学療法剤、薬剤、放射性剤、細胞傷害剤、抗生物質、小分子、核酸またはポリペプチドである。別の実施形態において、診断薬は、フルオロフォア、蛍光色素、放射性核種または酵素である。

【0047】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基およびＣ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基を含む２つのアミノ酸残基をＣ末端リジンの後に有する。

【0048】

１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンを除く任意のアミノ酸残基であり、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基は、リジンまたはアルギニンである。

【0049】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基およびＣ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基を含む３つのアミノ酸残基をＣ末端リジンの後に有し、そのＣ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンではない。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リジン、システイン、トリプトファン、アルギニン、セリンおよびグリシンからなる群より選択される。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンではない。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リジン、システイン、トリプトファン、アルギニン、セリンおよびグリシンからなる群より選択される。

【0050】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基、Ｃ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基およびＣ末端リジンの後の４番目のアミノ酸残基を含む４つのアミノ酸残基をＣ末端リジンの後に有し、Ｃ末端リジンの後の４番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンではない。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リジン、システイン、トリプトファン、アルギニン、セリンおよびグリシンからなる群より選択される。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンではない。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リジン、システイン、トリプトファン、アルギニン、セリンおよびグリシンからなる群より選択される。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンではない。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リジン、システイン、トリプトファン、アルギニン、セリンおよびグリシンからなる群より選択される。

【0051】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基、Ｃ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基、Ｃ末端リジンの後の４番目のアミノ酸残基およびＣ末端リジンの後の５番目のアミノ酸残基を含む５つのアミノ酸残基をＣ末端リジンの後に有し、Ｃ末端リジンの後の５番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンではない。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リジン、システイン、トリプトファン、アルギニン、セリンおよびグリシンからなる群より選択される。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンではない。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リジン、システイン、トリプトファン、アルギニン、セリンおよびグリシンからなる群より選択される。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンではない。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リジン、システイン、トリプトファン、アルギニン、セリンおよびグリシンからなる群より選択される。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の４番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンではない。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の４番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リジン、システイン、トリプトファン、アルギニン、セリンおよびグリシンからなる群より選択される。

【0052】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後に９つ未満のアミノ酸残基を有し、Ｃ末端リジンの後の最後のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される。

【0053】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後に１３個未満のアミノ酸残基を有し、ここで、Ｃ末端リジンの後の最後のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される。

【0054】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ_１免疫グロブリンである。別の実施形態において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３またはＩｇＧ_４免疫グロブリンである。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、尾部を含まない、ＩｇＡ_１、ＩｇＡ_２またはＩｇＭ免疫グロブリンである。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、ＩｇＤまたはＩｇＥ免疫グロブリンである。

【0055】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンまたはヒト化免疫グロブリンである。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリンまたは非ヒト免疫グロブリンである。

【0056】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む。１つの実施形態において、免疫グロブリンの２本の重鎖の間に分子内架橋は存在しない。

【0057】

１つの実施形態において、機能性物質と免疫グロブリンの比は、１：１～２：１である。

【0058】

１つの実施形態において、機能性物質は、抗体またはその抗原結合部分であり、免疫グロブリンと機能性物質は、同じ抗原に結合するか、または異なる抗原に結合する。

【0059】

別の態様において、結合体化された免疫グロブリンをコードする核酸が、本明細書中に記載される。別の態様において、核酸を含むプラスミドが、本明細書中に記載される。別の実施形態において、プラスミドを含む単離された細胞が、本明細書中に記載される。

【0060】

別の態様において、結合体化された免疫グロブリンおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物が、本明細書中に記載される。

【0061】

１つの態様において、本明細書中に記載されるいずれかの方法によって作製される結合体化された免疫グロブリンが、本明細書中に記載される。

【0062】

１つの実施形態において、上記方法は、アシル供与体基質のグルタミン残基に結合体化された免疫グロブリンを精製した後にアシル供与体基質の反応基に機能性物質を結合体化させる工程をさらに含む。１つの実施形態において、その精製工程は、クロマトグラフィーまたはダイアフィルトレーションなどのサイズに基づく方法を含む。別の実施形態において、精製工程は、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷に基づく分離を含む。別の実施形態において、精製工程は、プロテインＡクロマトグラフィーまたはプロテインＧクロマトグラフィーなどの親和性に基づく工程を含む。

【図面の簡単な説明】

【0063】

要旨ならびに以下の詳細な説明は、添付の図面とあわせて読むと、さらに理解される。開示される方法および結合体化された免疫グロブリンを例証する目的で、図面に例示的な実施形態を示すが；しかしながら、それらの方法および結合体化された免疫グロブリンは、開示される特定の実施形態に限定されない。図面において、

【0064】

【図1】図１は、トランスグルタミナーゼ反応を示しており、ここで、そのトランスグルタミナーゼは、アシル供与体グルタミンとアシル受容体リジンとの間におけるイソペプチド結合の形成を触媒し、アンモニア分子が放出される。

【0065】

【図2-1】図２は、例示的なＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙアシル－供与体基質の構造を示している。

【図2-2】図２は、例示的なＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙアシル－供与体基質の構造を示している。

【0066】

【図3-1】図３は、例示的なＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙアシル－供与体基質のいくつかを合成する、可能な経路を示している。

【図3-2】図３は、例示的なＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙアシル－供与体基質のいくつかを合成する、可能な経路を示している。

【0067】

【図4】図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃを含む図４は、ヒトＩｇＧ_１ ＦａｂおよびＦｃ結晶構造における溶媒に露出したリジンを示しており；（Ａ）Ｆａｂ ＶＨ－ＣＨ１およびＶκ－Ｃκ、（Ｂ）Ｆａｂ ＶＨ－ＣＨ１およびＶλ－Ｃλ、および（Ｃ）Ｆｃ ＣＨ２およびＣＨ３を、１．４Åのプローブ半径でＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ４．５を用いて明らかにし、黄色で強調している。

【0068】

【図5】図５は、ヒトＩｇＧ_１（配列番号４０）、カッパ定常ドメイン（配列番号４１）およびラムダ定常ドメイン（配列番号４２）の配列を示している。１ＦＣ１（Ｆｃγ）、４Ｆ３Ｆ（ＣＨ１およびＣκ）および４ＨＫ０（Ｃλ）に基づく、溶媒に露出した定常ドメインリジンが、赤色で強調されており；ループ内のリジンには下線を引いている。定常ドメインは、ＥＵナンバリングシステムに従ってナンバリングしている。

【0069】

【図6-1】図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅおよび６Ｆを含む図６は、アシル供与体および微生物トランスグルタミナーゼとともにインキュベートされた抗体のＥＳＩ－ＭＳ解析を示している。抗体を、５０倍モル濃度過剰のＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＣＡＤ－ビオチンおよび１Ｕ／ｍＬの微生物トランスグルタミナーゼとともに３７℃で一晩インキュベートした。ＩｄｅＳ消化および還元の後、ＬＣ、ＦｄおよびＦｃの質量をＥＳＩ－ＭＳによって決定した。

【図6-2】図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅおよび６Ｆを含む図６は、アシル供与体および微生物トランスグルタミナーゼとともにインキュベートされた抗体のＥＳＩ－ＭＳ解析を示している。抗体を、５０倍モル濃度過剰のＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＣＡＤ－ビオチンおよび１Ｕ／ｍＬの微生物トランスグルタミナーゼとともに３７℃で一晩インキュベートした。ＩｄｅＳ消化および還元の後、ＬＣ、ＦｄおよびＦｃの質量をＥＳＩ－ＭＳによって決定した。

【0070】

【図7-1】図７は、抗体０１およびＫ－Ｔａｇ微生物トランスグルタミナーゼ反応のＥＳＩ－ＭＳ解析を示している。ＭＡｂを、Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＣＡＤ－ビオチンおよび微生物トランスグルタミナーゼとともに３７℃で一晩インキュベートした。脱グリコシル化および還元の後、（Ａ）抗体０１、（Ｂ）抗体０１－ＨＣ－ＫＴａｇおよび（Ｃ）抗体０１－ＬＣ－ＫＴａｇのＨＣおよびＬＣの質量をＥＳＩ－ＭＳによって決定した。

【図7-2】図７は、抗体０１およびＫ－Ｔａｇ微生物トランスグルタミナーゼ反応のＥＳＩ－ＭＳ解析を示している。ＭＡｂを、Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＣＡＤ－ビオチンおよび微生物トランスグルタミナーゼとともに３７℃で一晩インキュベートした。脱グリコシル化および還元の後、（Ａ）抗体０１、（Ｂ）抗体０１－ＨＣ－ＫＴａｇおよび（Ｃ）抗体０１－ＬＣ－ＫＴａｇのＨＣおよびＬＣの質量をＥＳＩ－ＭＳによって決定した。

【0071】

【図8】図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃを含む図８は、抗体０１のＣ末端伸長のＥＳＩ－ＭＳ解析を示している。（Ａ）抗体０１ ＭＡｂ、（Ｂ）抗体０１－Ｌおよび（Ｃ）抗体０１－ＬＬを、Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＣＡＤ－ビオチンおよび微生物トランスグルタミナーゼとともに３７℃で一晩インキュベートし、質量を、図７においてのようにＥＳＩ－ＭＳによって解析した。

【0072】

【図9A】図９Ａ～９Ｂを含む図９は、Ｌｙｓ４４７への一工程の薬物結合体化を示している。（Ａ）抗体０１－Ｌ、ならびに（Ｂ）Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＰＥＧ_２－ＡｕＦおよび微生物トランスグルタミナーゼとともに３７℃で一晩インキュベートした抗体０１－Ｌを、ＩｄｅＳで消化し、ＤＴＴで還元して、ＬＣフラグメント、ＦｄフラグメントおよびＦｃフラグメントを得た。それらのサンプルの２８０ｎｍの吸光度（ＡＵ２８０）および全イオン電流（ＴＩＣ）を、上記方法においてのように逆相ＬＣ－ＭＳによってモニターした。

【図9B】図９Ａ～９Ｂを含む図９は、Ｌｙｓ４４７への一工程の薬物結合体化を示している。（Ａ）抗体０１－Ｌ、ならびに（Ｂ）Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＰＥＧ_２－ＡｕＦおよび微生物トランスグルタミナーゼとともに３７℃で一晩インキュベートした抗体０１－Ｌを、ＩｄｅＳで消化し、ＤＴＴで還元して、ＬＣフラグメント、ＦｄフラグメントおよびＦｃフラグメントを得た。それらのサンプルの２８０ｎｍの吸光度（ＡＵ２８０）および全イオン電流（ＴＩＣ）を、上記方法においてのように逆相ＬＣ－ＭＳによってモニターした。

【0073】

【図10】図１０は、二量体ｍＡｂのＳＤＳ－ＰＡＧＥを示している。Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｎ_３またはＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＰＥＧ_３－ＢＣＮでアミド基転移された抗体０１－Ｌを混合し、２２℃で一晩インキュベートした。それらのサンプルを還元し、４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲルを用いるＳＤＳ－ＰＡＧＥによって解析した。ＨＣ－ＨＣ二量体の質量は、およそ１１０ｋＤａである。

【発明を実施するための形態】

【0074】

詳細な説明
開示される方法および結合体化された免疫グロブリンは、本開示の一部を形成する添付の図面と関連させて受け取られる以下の詳細な説明を参照することにより、さらに容易に理解され得る。開示される方法および結合体化された免疫グロブリンは、本明細書中に記載されるおよび／または示される特定の実施形態に限定されないこと、ならびに本明細書中で使用される用語は、単なる例として特定の実施形態を説明する目的のためのものであって、特許請求される方法または結合体化された免疫グロブリンの限定を意図していないことが理解されるべきである。

【0075】

別段具体的に述べられていない限り、可能な作用機序もしくは作用様式または改善の理由に関するいずれの説明も、単に例証的であると意味されており、開示される方法および結合体化された免疫グロブリンは、そのような任意の提案される作用機序もしくは作用様式または改善の理由の正確さまたは不正確さによって制約されるべきでない。

【0076】

本文全体にわたって、説明は、結合体化された免疫グロブリンおよびそれを作製する方法について言及する。本開示が、結合体化された免疫グロブリンに関連する特徴または実施形態を記載または主張する場合、そのような特徴または実施形態は、それを作製する方法にも等しく適用できる。同様に、本開示が、結合体化された免疫グロブリンを作製する方法に関連する特徴または実施形態を記載または主張する場合、そのような特徴または実施形態は、結合体化された免疫グロブリンにも等しく適用できる。

【0077】

特定の数値に対する言及は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、少なくともその特定の値を含む。値の範囲が、表現されるとき、別の実施形態は、一方の特定の値から、および／または他方の特定の値までを含む。さらに、範囲で述べられる値に対する言及は、その範囲内のそれぞれの値およびすべての値を含む。すべての範囲が、両端値を含む全てを含み、組み合わせることができる。

【0078】

値が、先行詞「約」の使用によって近似値として表現されるとき、その特定の値は、別の実施形態を形成すると理解される。

【0079】

明確にするために別々の実施形態の文脈で本明細書中に記載されている、開示される方法および結合体化された免疫グロブリンのある特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせても提供され得ることが認識されるべきである。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で記載されている、開示される方法および結合体化された免疫グロブリンの様々な特徴は、別々に、または任意の部分組み合わせででも、提供され得る。

【0080】

本明細書中で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、複数を含む。

【0081】

本説明の態様に関する様々な用語が、本明細書および特許請求の範囲の全体にわたって使用される。そのような用語は、別段示されない限り、当該分野におけるそれらの通常の意味を与えられるべきである。他の明確に定義される用語は、本明細書中に提供される定義と一致するように解釈されるべきである。

【0082】

用語「約」は、数値の範囲、カットオフまたは特定の値に関して使用されるとき、記述された値が、列挙された値から最大１０％変動し得ることを示すために使用される。したがって、用語「約」は、特定の値からの±１０％もしくはそれ未満の変動、±５％もしくはそれ未満の変動、±１％もしくはそれ未満の変動、±０．５％もしくはそれ未満の変動、または±０．１％もしくはそれ未満の変動を包含するために使用される。

【0083】

「酸性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨにおいて負電荷を示すアミノ酸のことを指す。遺伝的にコードされる疎水性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。

【0084】

用語「アシル供与体基質」とは、それの上に末端アシル基を有する基のことを指す。好ましくは、「アシル供与体基質」は、グルタミン残基を含む。アシル供与体基質は、任意選択でさらなる反応基を含み得る。第１の実施形態において、アシル供与体基質は、機能性物質に共有結合的に接続されている。第２の実施形態において、アシル供与体基質は、機能性物質に接続されていない。１つの実施形態において、アシル供与体基質は、グルタミン残基および反応基を含む。別の実施形態において、アシル供与体基質は、本明細書中にさらに記載されるような、１つまたは複数のリンカーを含む。上記の実施形態のいずれかにおいて、任意選択で、アシル供与体基質と機能性物質との間またはアシル供与体基質と反応基との間にリンカーが存在する。

【0085】

用語「抗体」は、本明細書中で使用されるとき、４本のポリペプチド鎖、すなわち２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖からなる任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子のことを広く指す。用語「抗体」は、本明細書中で使用されるとき、Ｉｇ分子の必須のエピトープ結合特性を保持している、免疫グロブリン分子の任意の抗原結合部分、変異体、バリアントまたは誘導体のことも指す。そのような変異体、バリアントまたは誘導体の抗体形式は、当該分野で公知であり、それらの非限定的な実施形態は、本明細書中で論じられる。１つの実施形態において、抗体は、ヒト化抗体である。別の実施形態において、抗体は、ヒト抗体である。別の実施形態において、抗体は、キメラ抗体である。別の実施形態において、抗体は、非ヒト抗体である。

【0086】

全長抗体では、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中でＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中でＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分され得る。ＶＨおよびＶＬは、それぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端へ向かって以下の順序で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１およびＩｇＡ_２）またはサブクラスのものであり得る。

【0087】

抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）という用語は、本明細書中で使用されるとき、抗原に特異的に結合する能力を保持している抗体の１つまたは複数のフラグメントのことを指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントによって発揮され得ることが示されている。そのような抗体の実施形態は、２つまたはそれより多い異なる抗原に特異的に結合する、二重特異性（bispecific）、二重特異性（dual specific）または多重特異性の形式でもあり得る。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される結合フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）_２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）単一の可変ドメインを含むｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６，Ｗｉｎｔｅｒら、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０５１４４Ａ１（参照により本明細書中に援用される））；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を用いて、ＶＬ領域とＶＨ領域とが対になって一価の分子を形成する単一タンパク質鎖として生成されることを可能にする合成リンカーによって結合され得る（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知であり；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照のこと）。そのような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含されると意図されている。ダイアボディなどの他の形態の一本鎖抗体も包含される。ダイアボディは、二価の二重特異性抗体であり、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、単一ポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメインの間で対形成できないほど短いリンカーを用いて発現されるため、それによって、それらのドメインを別の鎖の相補的なドメインと対形成させ、２つの抗原結合部位を生じさせる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１－１１２３を参照のこと）。そのような抗体結合部分は、当該分野で公知である（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．７９０ ｐｐ．（ＩＳＢＮ ３－５４０－４１３５４－５）。

【0088】

「塩基性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨにおいて正電荷を示すアミノ酸のことを指す。遺伝的にコードされる疎水性アミノ酸としては、ヒスチジン、リジンおよびアルギニンが挙げられる。

【0089】

本明細書中で使用されるとき、用語「生物学的サンプル」とは、被験体から得られたサンプルのことを指し、それらとしては、インビボまたはインビトロにおいて得られた生体組織または体液起源のサンプルが挙げられる。そのようなサンプルは、ヒトを含む哺乳動物から単離された、体液（例えば、血液、血漿、血清、乳、髄液、腹水または尿）、器官、組織、画分および細胞であり得るが、これらに限定されない。生物学的サンプルには、組織を含む生物学的サンプルの切片（例えば、器官または組織の断面部分）も含まれ得る。生物学的サンプルには、生物学的サンプルからの抽出物、例えば、生体液（例えば、血液または尿）からの抗原も含まれ得る。

【0090】

用語「Ｃ末端リジン」とは、免疫グロブリンの重鎖のＣ末端のことを指す。好ましくは、Ｃ末端リジンの後に少なくとも１つのアミノ酸残基が存在する。Ｃ末端リジンの後にただ１つのアミノ酸残基が存在する（アミノ酸位＋１）１つの実施形態において、そのＣ末端リジンのすぐ隣のアミノ酸残基は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミンおよびヒスチジンからなる群より選択される。１つより多いアミノ酸残基がＣ末端リジンに付加される場合（アミノ酸位＋１、＋２など）、Ｃ末端リジンのすぐ隣のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンを除く任意のアミノ酸から選択され得る。２つのアミノ酸残基がＣ末端リジンに付加される１つの実施形態において、Ｃ末端リジンのすぐ隣のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンを除く任意のアミノ酸であり、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基（アミノ酸位＋２）は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される。２つのアミノ酸残基がＣ末端リジンに付加される１つの実施形態において、Ｃ末端リジンに隣接する１番目のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、リジンまたはアルギニンである。

【0091】

１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後に１つのアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）が存在する。別の実施形態において、Ｃ末端リジンの後に２つのアミノ酸残基（アミノ酸位＋１および＋２）が存在する。なおも別の実施形態において、Ｃ末端リジンの後に、３つのアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２および＋３）、４つのアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３および＋４）、５つのアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４および＋５）、６つのアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５および＋６）、７つのアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６および＋７）、８つのアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７および＋８）、９つのアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８および＋９）、１０個のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９および＋１０）、１１個のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０および＋１１）、１２個のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１および＋１２）、１３個のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２および＋１３）、１４個のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３および＋１４）、１５個のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４および＋１５）、１６個のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、＋１５および＋１６）、１７個のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、＋１５、＋１６および＋１７）、１８個のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、＋１５、＋１６、＋１７および＋１８）、１９個のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、＋１５、＋１６、＋１７、＋１８および＋１９）または２０個のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、＋１５、＋１６、＋１７、＋１８、＋１９および＋２０）が存在する。

【0092】

１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後のアミノ酸残基は、ＧＴＹＦＱＡＹＧＴ（配列番号１）を含まない。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後のアミノ酸残基は、ＧＥＣＴＹＦＱＡＹＧＣＴＥ（配列番号２）を含まない。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後のアミノ酸残基は、ＧＥＮＴＹＦＱＡＹＧＮＴＥ（配列番号３）を含まない。

【0093】

１つの実施形態において、Ｃ末端リジンは、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３またはＩｇＧ_４のリジン４４７である。別の実施形態において、Ｃ末端リジンは、ＩｇＤまたはＩｇＥのＣ末端リジンである。別の実施形態において、用語「Ｃ末端リジン」とは、ＩｇＡ_１、ＩｇＡ_２またはＩｇＭの尾部の前の最後のリジン残基のことを指す。１つの実施形態において、ＩｇＡ_１、ＩｇＡ_２またはＩｇＭの尾部は、除去される。１つの実施形態において、ＩｇＡ_１、ＩｇＡ_２またはＩｇＭの尾部は、除去されない。それらの抗体についての尾部の配列を下記に示す：
ＩｇＡ_１ ＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ（配列番号４）
ＩｇＡ_２ ＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ（配列番号４）
ＩｇＭ ＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ（配列番号５）

【0094】

別の実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸残基が、免疫グロブリンの重鎖のＣ末端から除去、例えば、欠失され得、Ｃ末端リジン残基の後に少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基が、その免疫グロブリンに付加され得る。例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３またはＩｇＧ_４免疫グロブリンのアミノ酸残基４４６および４４７が欠失され得、Ｃ末端リジンの後に少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基が付加され得、次いで、微生物トランスグルタミナーゼが、その免疫グロブリンのＣ末端リジンをアシル供与体基質のグルタミン残基に結合体化させ得る。換言すれば、免疫グロブリンが、野生型のアミノ酸位４４６および４４７を除去するように変異している場合、そのＣ末端リジンは、例えば、その免疫グロブリンのアミノ酸位４４６に存在し得る。次いで、１つまたは複数のさらなるアミノ酸残基が、本明細書中に記載されるように、Ｃ末端リジンに、例えば、アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４などにおいて付加され得る。１つの実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸残基が、免疫グロブリンの重鎖のＣ末端から除去、例えば、欠失され得、Ｃ末端リジン残基に続いて、少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基が、本明細書中に記載されるように、その免疫グロブリンに、例えば、アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４などにおいて付加され得る。

【0095】

別の実施形態において、ＣＨ３ドメインは、免疫グロブリンの重鎖のＣ末端から除去され、Ｃ末端リジン残基の後に少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基が、その免疫グロブリンに付加され得る。別の実施形態において、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの両方が、免疫グロブリンの重鎖のＣ末端から除去され、Ｃ末端リジン残基の後に少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基が、その免疫グロブリンに付加され得る。別の実施形態において、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインが、免疫グロブリンの重鎖のＣ末端から除去され、Ｃ末端リジン残基の後に少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基が、その免疫グロブリンに付加され得る。なおも別の実施形態において、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインが、免疫グロブリンの重鎖のＣ末端から除去され、Ｃ末端リジン残基の後に少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基が、その免疫グロブリンに付加され得る。

【0096】

用語「クリックケミストリー」とは、高収率で非常に選択的な信頼できる正当なタンパク質の合成および／または結合体化のための特定の反応のことを指す。例えば、Ｋｉｎｇら、“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｉｅｌｄ ｏｆ Ｂｉｏｏｒｔｈａｇｏｎａｌ Ｂｏｎｄ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ－Ｐａｓｔ ａｎｄ Ｐｒｅｓｅｎｔ Ｔｒｅｎｄｓ”，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，（２０１４）２５（５）：８２５－８３９；ＭｃＫａｙら、“Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ：Ｂｉｏｏｒｔｈａｇｏｎａｌ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ”，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，（２０１４）２１（９）：１０７５－１１０１を参照のこと。

【0097】

用語「キメラ化された」、「キメラ」、「キメラ抗体」および同様の用語は、１つの供給源または種に由来する、重鎖可変領域および軽鎖可変領域、すなわち、抗原結合領域、ならびに異なる供給源または種に由来する重鎖定常領域および軽鎖定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリンのことを指す。これらの一部は、従来の技法（例えば、合成）によって化学的に一緒に繋がれ得るか、または遺伝子操作技法を用いて、連続したポリペプチドとして調製され得る（例えば、キメラ抗体のタンパク質部分をコードするＤＮＡが発現されて、連続したポリペプチド鎖が生成され得る）。本開示によって包含される他の形態の「キメラ免疫グロブリン」は、そのクラスまたはサブクラスが、元の免疫グロブリンのクラスまたはサブクラスから、改変または変更された免疫グロブリン（「クラススイッチ免疫グロブリン」とも称される）である。本開示全体にわたって、キメラ免疫グロブリンは、「ｘｉ」と称される。本明細書中で、「キメラ免疫グロブリン」および同様の用語は、その抗体を作製するために用いられるプロセスではなく、その免疫グロブリンの配列のことを指す。

【0098】

本明細書中で使用されるとき、「Ｌｙｓ４４７」または「リジン４４７」とは、免疫グロブリンの重鎖定常領域のアミノ酸位４４７におけるリジン残基のことを指し（ＥＵナンバリングシステムを用いてナンバリングされたとき）、それは、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＤおよびＩｇＥにおけるＣ末端のコドンである。

【0099】

本明細書中で使用されるとき、「機能性物質」とは、治療的、診断的または他の機能的な特性（複数可）を有する作用物質（agent）のことを指す。１つの実施形態において、
機能性物質は、治療薬であり得る。別の実施形態において、機能性物質は、診断薬であり得る。機能性物質は、大分子または小分子であり得る。大分子の機能性物質としては、抗体およびその抗原結合部分が挙げられるが、これらに限定されない。小分子の機能性物質としては、化学療法剤、細胞傷害剤、抗生物質、生物学的プロセスを制御し得る他の有機化合物（例えば、薬物）およびポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。

【0100】

用語「ヒト化」、「ヒト化免疫グロブリン」および同様の用語は、フレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親免疫グロブリンのそれと比べて異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含むように改変された免疫グロブリンのことを指す。たいていは、ヒト化免疫グロブリンは、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類）（ドナー免疫グロブリン）の超可変領域由来の残基によって置き換えられた、ヒト免疫グロブリン（レシピエント免疫グロブリン）である。いくつかの場合では、ヒト免疫グロブリンのＦＷＲ残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化免疫グロブリンは、レシピエント免疫グロブリンまたはドナー免疫グロブリンに見出されない残基を含み得る。これらの改変は、免疫グロブリンの性能をさらに洗練させるために行われる。一般に、ヒト化免疫グロブリンは、少なくとも１つの、代表的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含み、ここで、超可変ループの全部または実質的に全部が、非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、ＦＷＲの全部または実質的に全部が、ヒト免疫グロブリン配列のそれである。ヒト化免疫グロブリンは、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、代表的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含み得る。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８）３２３－３２７；およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４（１９８５）２６８－２７０を参照のこと。本開示全体にわたって、「ヒト化免疫グロブリン」は、「ｚｕ」と称される。本明細書中で、「ヒト化免疫グロブリン」および同様の用語は、その免疫グロブリンを作製するために用いられるプロセスではなく、その免疫グロブリンの配列のことを指す。

【0101】

用語「診断薬」とは、インビボイメージング研究（例えば、ＣＴ、ＭＲＩおよびＸ線）および／またはインビトロイメージング研究に有用であり得る化合物のことを指す。診断薬の非限定的な例としては、フルオロフォア、蛍光色素、放射性核種および酵素が挙げられる。

【0102】

用語「ドナー免疫グロブリン」とは、その可変領域、ＣＤＲ、またはそれらの他の機能的フラグメントもしくはアナログのアミノ酸配列をヒト化免疫グロブリンに与えることによって、そのドナー免疫グロブリンに特徴的な抗原特異性および中和活性をヒト化免疫グロブリンに提供する非ヒト免疫グロブリンのことを指す。

【0103】

用語「レシピエント免疫グロブリン」とは、その重鎖フレームワーク領域および／もしくは軽鎖フレームワーク領域ならびに／またはその重鎖定常領域および／もしくは軽鎖定常領域のアミノ酸配列をヒト化免疫グロブリンに提供するドナー免疫グロブリンとは異種の免疫グロブリンのことを指す。レシピエント免疫グロブリンは、任意の哺乳動物に由来し得る。好ましい実施形態において、レシピエント免疫グロブリンは、ヒトにおいて非免疫原性である。好ましくは、レシピエント免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。

【0104】

「ヒト化」とは、ヒト化免疫グロブリンを作製するプロセスのことを指し、上記の特徴を有するヒト化免疫グロブリンを作製するための任意のプロセスを含み、そのプロセスとしては、インシリコヒト化、種／宿主のＣＤＲを操作してヒト免疫グロブリンに組み込むこと、対応するヒトフレームワーク領域にマッチするようにキメラ免疫グロブリンのフレームワーク領域残基を置換することなどが挙げられるがこれらに限定されない。

【0105】

「免疫グロブリン」は、本明細書中で使用されるとき、カッパおよびラムダ軽鎖、ならびにアルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー重鎖を含む免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質のことを指す。全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５Ｋｄまたは２１４アミノ酸）は、ＮＨ_２末端における可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸）およびＣＯＯＨ末端におけるカッパまたはラムダ定常領域遺伝子よってコードされる。同様に、全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０Ｋｄまたは４４６アミノ酸）は、可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）および他の上述の定常領域遺伝子の１つ、例えば、ガンマ（約３３０アミノ酸をコードする）によってコードされる。「免疫グロブリン」は、（ａ）免疫グロブリンポリペプチド、すなわち、特異的抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む免疫グロブリンファミリーのポリペプチド（別段特定されない限り、すべての免疫グロブリンのアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、ＩｇＡ_２）、サブクラス、ならびに各アイソタイプの様々なモノマー型およびポリマー型を含む）；および（ｂ）抗原に免疫特異的に結合する、そのような免疫グロブリンポリペプチドの保存的に置換されたバリアントを含む。免疫グロブリンは、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８）に広く記載されている。

【0106】

本明細書中に開示される免疫グロブリンの１つの形態は、抗体の基本構造単位を構成する。例えば、抗体は、四量体を含み得、同一の２対の免疫グロブリン鎖からなり、その各対は、１本の軽鎖および１本の重鎖を有する。一般に、各対において、軽鎖可変領域および重鎖可変領域が、一体となって、抗原への結合に関与し、定常領域が、抗体のエフェクター機能に関与する。

【0107】

免疫グロブリンは、抗体のほかに他の種々の形態で存在し得、それらとしては、例えば、いくつかの例を挙げれば、全長免疫グロブリンの抗原結合フラグメントまたは抗原結合部分（例えば、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、（Ｆａｂ’）_２フラグメントおよびＦｖフラグメント）；および代替の抗体形式（例えば、一本鎖免疫グロブリン（ｓｃＦＶおよびｓｃＦａｂ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、線状抗体および多重特異性抗体）が挙げられる。例えば、Ｊａｍｅｓ Ｄ．Ｍａｒｋｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）（Ｃａｒｌ Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｅｄ．）を参照のこと。

【0108】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｆａｂフラグメントを含み得る。別の実施形態において、免疫グロブリンは、ＣＨ３ドメインを含み得る。別の実施形態において、免疫グロブリンは、重鎖を含み得る。

【0109】

本明細書中で使用されるとき、用語「免疫特異的に」とは、抗原であって、それに対して免疫グロブリンが生成された抗原に特異的に結合するが他のペプチドまたはタンパク質には特異的に結合しない、免疫グロブリンの能力を指す。抗原であって、それに対して免疫グロブリンが生成された抗原に免疫特異的に結合する免疫グロブリンは、例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅまたは当該分野で公知の他のアッセイによって決定されたとき、他のポリペプチドまたはタンパク質に結合し得ないか、または、抗原であって、それに対して免疫グロブリンが生成された抗原に対してよりも低い結合親和性で他のポリペプチドまたはタンパク質に結合し得る。免疫グロブリンは、実験技法（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および酵素結合免疫吸着決定法（ＥＬＩＳＡ）であるがこれらに限定されない）を用いて測定されたとき、任意の交差反応性抗原に対するよりも高い結合親和性で、抗原であって、それに対して免疫グロブリンが生成された抗原に結合するとき、その抗原に免疫特異的に結合する（例えば、抗体特異性に関する考察について、Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ ３３２－３３６（１９８９）を参照のこと）。

【0110】

「リンカー」は、本明細書中で使用されるとき、免疫グロブリンを（アシル供与体基質を介して）機能性物質または反応基に接続するための直鎖または分枝鎖であり得るスペーサーのことを指す。そのようなリンカーは、切断可能（例えば、酸に不安定またはプロテアーゼによって切断可能）であり得るか、または切断不可能であり得る。１つの実施形態において、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である。別の実施形態において、リンカーは、１つまたは複数のアミノ酸およびポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。

【0111】

用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核細胞クローンもしくは原核細胞クローンまたはファージクローンを含む単一の細胞クローンに由来する抗体のことを指すのであって、それを作製する方法を指すのではない。モノクローナル抗体は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって作製される抗体に限定されない。

【0112】

「天然」とは、免疫グロブリンが由来する種からの野生型免疫グロブリン配列のことを指す。

【0113】

本明細書中で使用されるとき、「同一性パーセント」および同様の用語は、２つまたはそれより多い核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドの間の配列の関係性を説明するために使用され、（ａ）参照配列、（ｂ）比較ウィンドウ、（ｃ）配列同一性および（ｄ）配列同一性のパーセンテージを含む用語の文脈において、およびそれらの用語と関連されて理解される。
（ａ）「参照配列」は、配列比較のために基準として使用される定義された配列である。参照配列は、指定の配列のサブセットまたは全体；例えば、完全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全なｃＤＮＡもしくは遺伝子配列であり得る。ポリペプチドの場合、参照ポリペプチド配列の例示的な長さとしては、少なくとも約１６アミノ酸、少なくとも約２０アミノ酸、少なくとも約２５アミノ酸、少なくとも約３５アミノ酸、少なくとも約５０アミノ酸または少なくとも約１００アミノ酸が挙げられる。核酸の場合、参照核酸配列の例示的な長さとしては、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチドもしくは少なくとも約３００ヌクレオチド、またはそれらの周辺の、もしくはそれらの間の任意の整数が挙げられる。
（ｂ）「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の連続した指定のセグメントに対する言及を含み、ここで、そのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、参照配列と比較され得、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部は、参照配列（付加、置換または欠失を含まない）と比べて、それらの２つの配列の最適なアラインメントのために、付加、置換または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。例示的な比較ウィンドウは、少なくとも２０個の連続したヌクレオチド長またはアミノ酸長であり得、任意選択で、３０、４０、５０、１００またはそれより長くてよい。当業者は、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列にギャップを含めたことに起因して、参照配列に対して、誤りに導くような高い類似性を回避するために、代表的にはギャップペナルティ（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）が導入され、マッチ数から減じられることを理解している。
（ｃ）比較するための配列アラインメントの方法は、当該分野で周知である。比較のための最適な配列アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２，１９８１のローカルホモロジーアルゴリズム；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３，１９７０のホモロジーアラインメントアルゴリズム；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８：２４４４，１９８８の類似性検索法；これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．，によるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），７ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡを含むがこれらに限定されない）（ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ，７３：２３７－２４４，１９８８；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６：８８１－９０，１９８８；Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，８：１－６，１９９２；およびＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２４：７－３３１，１９９４によって十分に説明されている）によって行われ得る。データベース類似性検索に使用され得るＢＬＡＳＴファミリーのプログラムとしては、ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのＢＬＡＳＴＮ；タンパク質データベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのＢＬＡＳＴＸ；タンパク質データベース配列に対するタンパク質クエリー配列のためのＢＬＡＳＴＰ；ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質クエリー配列のためのＴＢＬＡＳＴＮ；およびヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのＴＢＬＡＳＴＸが挙げられる。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １９，Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５を参照のこと。上記プログラムの新しいバージョンまたは新しいプログラムが、将来、確実に利用可能になるので、それらも、本開示とともに使用され得る。
（ｄ）「同一性パーセント」は、２つの最適にアラインメントされた配列を比較ウィンドウにわたって比較することによって決定された値を意味し、ここで、その比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部は、参照配列（付加、置換または欠失を含まない）と比べて、それらの２つの配列の最適なアラインメントのために、付加、置換または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。そのパーセンテージは、両方の配列の中に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数で除算し、その結果に１００を乗算して、配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。

【0114】

「薬学的有効量」とは、被験体を処置する免疫グロブリンの量のことを指す。

【0115】

「薬学的に許容され得るキャリア」とは、被験体に投与するための、本明細書中に記載されるような免疫グロブリンについての薬学的製剤の構成成分のことを指す。例えば、薬学的に許容され得るキャリアは、リポソーム系、脂質系および／またはナノ粒子系であり得る。

【0116】

用語「反応基」は、本明細書中で使用されるとき、他の化合物（例えば、機能性物質）と反応して少なくとも１つの共有結合を形成し得る化学的官能基のことを指す。１つの実施形態において、反応基は、クリックケミストリーカップリング反応において反応性である。反応基の非限定的な例としては、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメタノール（ＢＣＮ）、

【化3】

ｔｒａｎｓ－シクロオクテン（ＴＣＯ）、アジド（Ｎ_３）、アルキン、テトラジンメチルシクロプロペン、ノルボルネン、ヒドラジド／ヒドラジンおよびアルデヒドが挙げられる。

【0117】

用語「被験体」は、本明細書中で使用されるとき、ヒトまたは非ヒト生物のことを指す。したがって、本明細書中に記載される方法、免疫グロブリンおよび結合体化された免疫グロブリンは、ヒトの疾患および状態ならびに獣医学的疾患および状態の両方に適用可能である。被験体は、「患者」、すなわち、疾患もしくは状態に対して診療を受けている生存しているヒトもしくは非ヒト生物、または病態の兆候もしくは特定の状態の存在／非存在について調査されている、既定の疾病を有しないヒトもしくは非ヒト生物であり得る。

【0118】

「置換する」とは、１つのアミノ酸残基を別のアミノ酸残基の代わりに用いることを指す。「置換する」には、例えば、アミノ酸残基をコードする１つまたは複数のＤＮＡ塩基対の中のミスセンス変異または１つのアミノ酸を別のアミノ酸で交換するタンパク質の操作が含まれる。

【0119】

本明細書中で使用されるとき、「処置する」および同様の用語は、疾患の症候の重症度および／または頻度を低下させること、疾患の症候および／または前記症候の根本原因を排除すること、疾患の症候および／またはそれらの根本原因の頻度または尤度を低下させること、ならびに疾患によって直接または間接的に引き起こされる損傷を改善または治療することを指す。

【0120】

用語「治療薬」は、状態を処置するために、投与することを必要とする被験体に投与され得る大分子または小分子を意味する。治療薬は、病状の１つまたは複数の症候に苦しんでいる被験体における病状の１つまたは複数の症候を処置するため、またはその発生を予防するため、その進行を遅延させるため、もしくはそれを回復させるために、投与され得る。治療薬としては、抗体またはその抗原結合部分、化学療法剤、放射性剤、細胞傷害剤、抗生物質などが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、治療薬は、小分子である。別の実施形態において、治療薬は、ポリペプチドである。

【0121】

本明細書中で使用されるとき、「～と９０％同一」は、参照項目（例えば、生物学的配列）と少なくとも９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、９９％同一または１００％同一を包含する。

【0122】

以下の省略形が、本開示全体にわたって使用される：抗体薬物結合体（ＡＤＣ）；薬物対抗体比（ＤＡＲ）；フレームワーク領域（ＦＷＲ）；相補性決定領域（ＣＤＲ）；アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）Ｆ（ＡｕＦ）；可変重鎖領域（ＶＨ）；可変軽鎖領域（ＶＬ）；可変カッパ（Ｖκ）；ガンマ定常領域（Ｃγ）；カッパ定常領域（Ｃκ）；モノクローナル抗体（ｍＡｂ）；ＥＵナンバリングシステムを用いてナンバリングされたとき免疫グロブリンの重鎖のアミノ酸位４４７におけるリジン（Ｌｙｓ４４７）。
結合体化された免疫グロブリンの作製

【0123】

結合体化された免疫グロブリンを作製するための方法が、本明細書中に開示され、その方法は、微生物トランスグルタミナーゼ、およびアシル供与体基質を含む機能性物質とともに、免疫グロブリンをインキュベートする工程を含み、ａ）その免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後に少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、ｂ）そのアシル供与体基質は、グルタミン残基を含み、ｃ）その機能性物質は、治療薬または診断薬であり、その微生物トランスグルタミナーゼは、免疫グロブリンのＣ末端リジンを機能性物質上のアシル供与体基質のグルタミン残基に結合体化させ、それによって、結合体化された免疫グロブリンを作製する。

【0124】

結合体化された免疫グロブリンを作製するための方法も本明細書中に開示され、その方法は、ｉ）微生物トランスグルタミナーゼおよびアシル供与体基質とともに免疫グロブリンをインキュベートする工程（ここで、ａ）その免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後に少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、ｂ）そのアシル供与体基質は、グルタミン残基および反応基を含み、その微生物トランスグルタミナーゼは、免疫グロブリンのＣ末端リジンをアシル供与体基質のグルタミン残基に結合体化させる）およびｉｉ）アシル供与体基質の反応基に機能性物質を結合体化させる工程（ここで、その機能性物質は、治療薬または診断薬である）を含み、それによって、結合体化された免疫グロブリンを作製する。

【0125】

結合体化は、アシル供与体基質を含む機能性物質を溶解液に溶解し、溶解した機能性物質を免疫グロブリンおよび微生物トランスグルタミナーゼとともに結合体化バッファー中でインキュベートすることによって行われ得る。結合体化は、アシル供与体基質を溶解液に溶解し、そのアシル供与体基質を免疫グロブリンおよび微生物トランスグルタミナーゼとともに結合体化バッファー中でインキュベートすることによっても行われ得る。

【0126】

水不溶性の機能性物質およびアシル供与体基質の場合、好適な溶解液としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの水混和性有機溶媒が挙げられる。水可溶性の機能性物質およびアシル供与体基質の場合、好適な溶解液としては、水または緩衝水溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水，ｐＨ７．２（１×ＰＢＳ）またはＤＰＢＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0127】

機能性物質またはアシル供与体基質の好適な濃度としては、約１０μＭ～約８００ｍＭ、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、約２５ｍＭ～約１００ｍＭ、約４０ｍＭ～約１００ｍＭ、約５５ｍＭ～約１００ｍＭ、約７０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０ｍＭ～約９０ｍＭ、約１０ｍＭ～約７５ｍＭ、約１０ｍＭ～約６０ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭまたは約１０ｍＭ～約３０ｍＭが挙げられる。

【0128】

いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約１０μＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約２５μＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約５０μＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約１００μＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約２５０μＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約５００μＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約７５０μＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約１ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約１０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約２０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約３０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約４０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約５０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約６０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約７０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約８０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約９０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約１００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約１５０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約２００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約２５０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約３００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約３５０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約４００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約４５０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約５００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約５５０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約６００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約６５０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約７００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約７５０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質の濃度は、約８００ｍＭであり得る。

【0129】

免疫グロブリンの好適な濃度としては、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約１５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約１２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌまたは約０．１ｍｇ／ｍｌ～約２ｍｇ／ｍｌが挙げられる。いくつかの実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌであり得る。いくつかの実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約０．５ｍｇ／ｍｌであり得る。いくつかの実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約１ｍｇ／ｍｌであり得る。いくつかの実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約２ｍｇ／ｍｌであり得る。いくつかの実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約５ｍｇ／ｍｌであり得る。いくつかの実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約１０ｍｇ／ｍｌであり得る。いくつかの実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約１５ｍｇ／ｍｌであり得る。いくつかの実施形態において、免疫グロブリンの濃度は、約２０ｍｇ／ｍｌであり得る。

【0130】

機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの好適な比としては、約１：１～１００：１が挙げられる。１つの実施形態において、機能性物質とアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、約２５：１～約７５：１である。別の実施形態において、機能性物質とアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、約４０：１～約６０：１である。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、１：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、２：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、３：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、４：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、５：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、６：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、７：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、８：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、９：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、１０：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、１１：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、１２：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、１３：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、１４：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、１５：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、１６：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、１７：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、１８：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、１９：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、２０：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、２５：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、３０：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、３５：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、４０：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、４５：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、５０：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、６０：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、７０：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、８０：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、９０：１であり得る。いくつかの実施形態において、機能性物質またはアシル供与体基質：免疫グロブリンの比は、１００：１であり得る。

【0131】

インキュベートする工程は、いくつかの好適な結合体化バッファー中で行われ得、その結合体化バッファーとしては、いくつかの例を挙げれば、例えば、ＤＰＢＳ、１×ＰＢＳ，ｐＨ７．２、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ホウ酸ナトリウム、ＴｒｉｓおよびＨＥＰＥＳが挙げられる。結合体化バッファーの濃度としては、約５ｍＭ～約２Ｍ、約５ｍＭ～約１Ｍ、約５ｍＭ～約５００ｍＭ、約５ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、約２０ｍＭ～約１００ｍＭ、約３０ｍＭ～約１００ｍＭ、約４５ｍＭ～約１００ｍＭ、約６０ｍＭ～約１００ｍＭ、約７５ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０ｍＭ～約９０ｍＭ、約１０ｍＭ～約７５ｍＭ、約１０ｍＭ～約６０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４５ｍＭまたは約１０ｍＭ～約３０ｍＭが挙げられる。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーの濃度は、約１０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーの濃度は、約２０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーの濃度は、約３０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーの濃度は、約４０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーの濃度は、約５０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーの濃度は、約６０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーの濃度は、約７０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーの濃度は、約８０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーの濃度は、約９０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーの濃度は、約１００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーの濃度は、約２５０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーの濃度は、約５００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーの濃度は、約７５０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーの濃度は、約１Ｍであり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーの濃度は、約１．２５Ｍであり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーの濃度は、約１．５Ｍであり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーの濃度は、約１．７５Ｍであり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーの濃度は、約２Ｍであり得る。

【0132】

結合体化バッファーは、塩化ナトリウムをさらに含み得る。塩化ナトリウムの好適な濃度としては、約０ｍＭ～約２Ｍ、約０ｍＭ～約１Ｍ、約１Ｍ～約２Ｍ、約５００ｍＭ～約１．５Ｍ、約２５ｍＭ～約５００ｍＭ、約５０ｍＭ～約５００ｍＭ、約７５ｍＭ～約５００ｍＭ、約１００ｍＭ～約５００ｍＭ、約１５０ｍＭ～約５００ｍＭ、約２００ｍＭ～約５００ｍＭ、約２５０ｍＭ～約５００ｍＭ、約３００ｍＭ～約５００ｍＭ、約３５０ｍＭ～約５００ｍＭ、約４００ｍＭ～約５００ｍＭ、約０ｍＭ～約４００ｍＭ、約０ｍＭ～約３５０ｍＭ、約０ｍＭ～約３００ｍＭ、約０ｍＭ～約２５０ｍＭ、約０ｍＭ～約２００ｍＭ、約０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約０ｍＭ～約１００ｍＭ、約０ｍＭ～約５０ｍＭまたは約０ｍＭ～約２５ｍＭが挙げられる。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウム濃度は、約２５ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウム濃度は、約５０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウム濃度は、約７５ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウム濃度は、約１００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウム濃度は、約１５０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウム濃度は、約２００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウム濃度は、約２５０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウム濃度は、約３００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウム濃度は、約３５０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウム濃度は、約４００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウム濃度は、約５００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウム濃度は、約７５０ｍＭであり得る。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウム濃度は、約１Ｍであり得る。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウム濃度は、約１．２５Ｍであり得る。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウム濃度は、約１．５Ｍであり得る。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウム濃度は、約１．７５Ｍであり得る。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウム濃度は、約２Ｍであり得る。

【0133】

結合体化バッファーのｐＨは、約４～約９であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約５～約８であり得る。別の実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約６～約７であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約４であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約４．５であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約５であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約５．５であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約６．０であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約６．５であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約６．６であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約６．７であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約６．８であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約６．９であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約７．０であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約７．１であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約７．２であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約７．３であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約７．４であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約７．５であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約７．６であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約７．７であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約７．８であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約７．９であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約８．０であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約８．１であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約８．２であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約８．３であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約８．４であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約８．５であり得る。いくつかの実施形態において、結合体化バッファーのｐＨは、約９であり得る。

【0134】

結合体化バッファーにおける機能性物質またはアシル供与体基質の溶解度を高めるために、結合体化バッファーにおける水混和性有機溶媒の最終濃度は、約０％～約２０％、約２％～約２０％、約５％～約２０％、約８％～約２０％、約１１％～約２０％、約１６％～約２０％、約０％～約１８％、約０％～約１５％、約０％～約１２％、約０％～約１０％、約０％～約８％、約０％～約６％または約０％～約２％であり得る。

【0135】

結合体化バッファーは、結合体化バッファーにおけるチオール反応性化合物の溶解度を高めるために、プロピレングリコールをさらに含み得る。プロピレングリコールの好適な濃度としては、約１％～約５０％、約２０％～約５０％、約３０％～約５０％、約４０％～約５０％、約１０％～約４０％、約１０％～約３０％または約１０％～約２０％が挙げられる。いくつかの実施形態において、プロピレングリコールの濃度は、約１％または約５％であり得る。いくつかの実施形態において、プロピレングリコールの濃度は、約１０％であり得る。いくつかの実施形態において、プロピレングリコールの濃度は、約２０％であり得る。いくつかの実施形態において、プロピレングリコールの濃度は、約３０％であり得る。いくつかの実施形態において、プロピレングリコールの濃度は、約４０％であり得る。いくつかの実施形態において、プロピレングリコールの濃度は、約５０％であり得る。

【0136】

結合体化バッファーは、結合体化バッファーにおける結合体化された免疫グロブリンの溶解度を高めるために非イオン性界面活性剤をさらに含み得る。例示的な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート－２０またはポリソルベート－８０が挙げられるが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤の好適な濃度としては、約０％～約１％、約０．１％～約１％、約０．３％～約１％、約０．５％～約１％、約０．７％～約１％、約０％～約０．８％、約０％～約０．６％、約０％～約０．４％または約０％～約０．２％が挙げられる。いくつかの実施形態において、非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．１％であり得る。いくつかの実施形態において、非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．２％であり得る。いくつかの実施形態において、非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．３％であり得る。いくつかの実施形態において、非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．４％であり得る。いくつかの実施形態において、非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．５％であり得る。いくつかの実施形態において、非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．６％であり得る。いくつかの実施形態において、非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．７％であり得る。いくつかの実施形態において、非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．８％であり得る。いくつかの実施形態において、非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．９％であり得る。いくつかの実施形態において、非イオン性界面活性剤の濃度は、約１．０％であり得る。

【0137】

インキュベートする工程は、約３０分間～約４８時間、約１時間～約４８時間、約２時間～約２４時間、約２４時間～約４８時間、約３０時間～約４８時間、約３６時間～約４８時間、約４２時間～約４８時間、約２時間～約４２時間、約２時間～約３６時間、約２時間～約３０時間、約２時間～約２４時間、約２時間～約１８時間、約２時間～約１２時間、約３０分間～約１時間、約３０分間～約２時間または約２時間～約６時間、行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、約３０分間行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、約１時間行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、約１．５時間行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、２時間行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、６時間行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、１２時間行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、１８時間行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、２４時間行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、３０時間行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、３６時間行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、４２時間行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、４８時間行われ得る。

【0138】

インキュベートする工程の温度は、約４℃～約５０℃、約１８℃～約３７℃、約２０℃～約３７℃、約２２℃～約３７℃、約２４℃～約３７℃、約２６℃～約３７℃、約２８℃～約３７℃、約３０℃～約３７℃、約３２℃～約３７℃、約３４℃～約３７℃、約１８℃～約３４℃、約１８℃～約３２℃、約１８℃～約３０℃、約１８℃～約２８℃、約１８℃～約２６℃または約１８℃～約２４℃であり得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、４℃において行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、１８℃において行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、２０℃において行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、２２℃において行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、２４℃において行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、２６℃において行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、２８℃において行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、３０℃において行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、３２℃において行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、３４℃において行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、３７℃において行われ得る。いくつかの実施形態において、インキュベートする工程は、５０℃において行われ得る。

【0139】

組み込まれていない機能性物質またはアシル供与体基質は、いくつかの好適な樹脂を用いる脱塩クロマトグラフィーによって、結合体化された免疫グロブリンから分離され得、それらの樹脂としては、Ｇ－２５樹脂、Ｇ－５０樹脂、Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ１０、または５，０００～１０，０００Ｄａの範囲の排除限界を有する他の樹脂が挙げられるがこれらに限定されない。クロマトグラフィーは、スケールに応じて、カラム形式またはスピンカラム形式において行われ得る。脱塩に好適なバッファとしては、例えば、ＤＰＢＳ、１×ＰＢＳ、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ホウ酸ナトリウム、Ｔｒｉｓが挙げられるか、またはＨＥＰＥＳベースの緩衝液が、１×ＰＢＳの代わりに用いられ得る。

【0140】

第１の実施形態において、アシル供与体基質を介してＣ末端リジンで結合体化されたグルタミン残基を含むアシル供与体基質を含む機能性物質。この第１の実施形態において、機能性物質は、アシル供与体基質と合わせられた後、アシル供与体基質上の反応基を機能性物質と反応させることによって免疫グロブリンに結合体化される。第２の実施形態では、グルタミン残基および反応基を含むアシル供与体基質が、まず免疫グロブリンに結合体化され、次いで、その反応基が、機能性物質に繋がれる。

【0141】

アシル供与体基質は、リンカー「Ｌ」を含み得る。リンカーは、切断不可能なリンカーまたは切断可能なリンカーであり得る。例示的なリンカーとしては、例えば、ジスルフィド含有リンカー、アセタールに基づくリンカーおよびケタールに基づくリンカーが挙げられる。いくつかの態様において、リンカーは、切断不可能なリンカーであり得る。好適な切断不可能なリンカーとしては、１つまたは複数のアミノ酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはアルキルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＰＥＧを含み得る。いくつかの態様において、リンカーは、切断可能なリンカーであり得る。好適な切断可能なリンカーとしては、例えば、バリン－シトルリン－パラアミノベンジルが挙げられる。いくつかの態様において、リンカーは、ジスルフィド含有リンカーであり得る。いくつかの態様において、リンカーは、アセタールに基づくリンカーであり得る。いくつかの態様において、リンカーは、ケタールに基づくリンカーであり得る。リンカーは、１つもしくは複数のアミノ酸単独、または１つもしくは複数のＰＥＧ基などの別のリンカーと組み合わせた１つもしくは複数のアミノ酸でもあり得る。

【0142】

グルタミン残基を含むアシル供与体基質は、機能性物質の中に存在し得るか、機能性物質の一部であり得るか、または機能性物質に付着され得る。好適な機能性物質としては、例えば、フルオロフォア、蛍光色素、ポリペプチド、免疫グロブリン、抗生物質、核酸、放射性核種、化学的リンカー、小分子、キレート剤、脂質、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）および薬物が挙げられる。いくつかの態様において、機能性物質は、フルオロフォアを含み得る。いくつかの態様において、機能性物質は、蛍光色素を含み得る。いくつかの態様において、機能性物質は、ポリペプチドを含み得る。いくつかの態様において、機能性物質は、免疫グロブリンを含み得る。いくつかの態様において、機能性物質は、抗生物質を含み得る。いくつかの態様において、機能性物質は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含み得る。いくつかの態様において、機能性物質は、放射性核種を含み得る。いくつかの態様において、機能性物質は、小分子を含み得る。いくつかの態様において、機能性物質は、キレート剤（例えば、とりわけ、ＤＯＴＡ、ＣＨＸ－Ａ”－ＤＴＰＡ、ＮＯＴＡ）を含み得る。いくつかの態様において、機能性物質は、脂質を含み得る。いくつかの態様において、機能性物質は、薬物を含み得る。いくつかの態様において、機能性物質は、上に列挙された機能性物質のいずれかの組み合わせを含み得る。

【0143】

アシル供与体基質（すなわち、第１のアシル供与体基質）は、第２のアシル供与体基質またはリンカーに結合され得、その第２のアシル供与体基質またはリンカーは、第２の重鎖可変領域および第２の軽鎖可変領域を有する第２の免疫グロブリンに結合され、その第２の重鎖可変領域は、Ｃ末端リジンを有し、そのＣ末端リジンは、そのリジンの後に少なくとも１つのアミノ酸残基を有する。例えば、第１のアシル供与体基質および第２のアシル供与体基質は、それぞれ、第１および第２の機能性物質として第１および第２の化学的リンカーを有し得る。第１および第２の化学的リンカーは、いくつかの好適な手段（例えば、クリックケミストリーが挙げられる）によって互いに結合され得る。

【0144】

１つの実施形態において、アシル供与体基質を含む機能性物質は、式（Ｉ）または（ＩＩ）：
（Ｚ）_ｍ－Ｇｌｎ－（Ｌ）_ｎ－（Ｙ） （Ｉ）
（Ｙ）－（Ｌ）_ｎ－Ｇｌｎ－（Ｚ）_ｍ （ＩＩ）
のうちの１つに記載のものであり、式中、Ｚは、カルボキシルベンジルオキシ（ＣＢＺ）基またはアミノ酸残基であり；Ｇｌｎは、グルタミンアミノ酸残基であり；各Ｌは、独立して、１～２０個の炭素原子の直鎖または分枝鎖のリンカーであり、ここで、それらの炭素原子のうちの１つまたは複数は、任意選択でかつ独立して、窒素原子、酸素原子または硫黄原子で置き換えられ得、ここで、各炭素原子および各窒素原子は、任意選択で置換され得るか；または各Ｌは、任意選択でかつ独立して、アミノ酸残基であり；ｍは、０～５の整数であり；ｎは、０～５の整数であり；Ｙは、機能性物質である。

【0145】

別の実施形態において、アシル供与体基質は、式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）：
（Ｚ）_ｍ－Ｇｌｎ－（Ｌ）_ｎ－（Ｘ） （ＩＩＩ）
（Ｘ）－（Ｌ）_ｎ－Ｇｌｎ－（Ｚ）_ｍ （ＩＶ）
のうちの１つに記載のものであり、式中、Ｚは、カルボキシルベンジルオキシ（ＣＢＺ）基またはアミノ酸残基であり；Ｇｌｎは、グルタミンアミノ酸残基であり；各Ｌは、独立して、１～２０個の炭素原子の直鎖または分枝鎖のリンカーであり、ここで、それらの炭素原子のうちの１つまたは複数は、任意選択でかつ独立して、窒素原子、酸素原子または硫黄原子で置き換えられ得、ここで、各炭素原子および各窒素原子は、任意選択で置換され得るか；または各Ｌは、任意選択でかつ独立して、アミノ酸残基であり；ｍは、０～５の整数であり；ｎは、０～５の整数であり；Ｘは、反応基である。

【0146】

１つの実施形態において、Ｚは、ＣＢＺ基である。別の実施形態において、Ｚは、アミノ酸残基である。

【0147】

１つの実施形態において、Ｌは、アミノ酸残基である。１つの実施形態において、ｎは、２～５であり、各Ｌは、独立して、アミノ酸残基である。別の実施形態において、Ｌは、１～２０個の炭素原子の直鎖または分枝鎖のリンカーであり、ここで、その炭素原子のうちの１つまたは複数は、任意選択でかつ独立して、窒素原子、酸素原子または硫黄原子で置き換えられ得、ここで、各炭素原子および各窒素原子は、任意選択で置換され得る。別の実施形態において、Ｌは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分である。別の実施形態において、ｎは、２～５であり、１つまたは複数のＬは、１つまたは複数のアミノ酸を含み、１つまたは複数の追加のＬ基は、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。

【0148】

１つの実施形態において、ｍは、０である。別の実施形態において、ｍは、１である。別の実施形態において、ｍは、２である。別の実施形態において、ｍは、３である。別の実施形態において、ｍは、４である。別の実施形態において、ｍは、５である。

【0149】

１つの実施形態において、ｎは、０である。別の実施形態において、ｎは、１である。別の実施形態において、ｎは、２である。別の実施形態において、ｎは、３である。別の実施形態において、ｎは、４である。別の実施形態において、ｎは、５である。

【0150】

１つの実施形態において、Ｘは、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメタノール（ＢＣＮ）である。別の実施形態において、Ｘは、

【化4】

である。別の実施形態において、Ｘは、ｔｒａｎｓ－シクロオクテン（ＴＣＯ）である。別の実施形態において、Ｘは、アジド（Ｎ_３）である。別の実施形態において、Ｘは、アルキンである。別の実施形態において、Ｘは、テトラジンメチルシクロプロペンである。別の実施形態において、Ｘは、ノルボルネンである。別の実施形態において、Ｘは、ヒドラジド／ヒドラジンである。別の実施形態において、Ｘは、アルデヒドである。

【0151】

式（Ｉ）に記載のアシル供与体基質についての１つの実施形態において、Ｚは、ＣＢＺ基であり；Ｌは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）（－Ｏ（（ＣＨ_２）_２）－）、エチルアミン（－ＮＨ（（ＣＨ_２）_２）－）またはプロピルアミン（－ＮＨ（（ＣＨ_２）_３）－）であり；ｎは、０、１、２または３である。

【0152】

別の実施形態において、アシル供与体基質は、式（Ｉ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり、Ｌは、アミノ酸である。１つの実施形態において、Ｌは、Ｇｌｙである。この実施形態の１つの態様において、ｍは、１であり、ｎは、１である。

【0153】

１つの実施形態において、アシル供与体基質は、式（ＩＩ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり；ｍは、１であり；ｎは、１、２または３であり；少なくとも１つのＬは、Ｇｌｙである。

【0154】

式（ＩＩＩ）に記載のアシル供与体基質についての１つの実施形態において、Ｚは、ＣＢＺ基であり；Ｌは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）（－Ｏ（（ＣＨ_２）_２）－）、エチルアミン（－ＮＨ（（ＣＨ_２）_２）－）またはプロピルアミン（－ＮＨ（（ＣＨ_２）_３）－）であり；ｎは、０、１、２または３である。

【0155】

別の実施形態において、アシル供与体基質は、式（ＩＩＩ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり、Ｌは、アミノ酸である。１つの実施形態において、Ｌは、Ｇｌｙである。この実施形態の１つの態様において、ｍは、１であり、ｎは、１である。

【0156】

１つの実施形態において、アシル供与体基質は、式（ＩＶ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり；ｍは、１であり；ｎは、１、２または３であり；少なくとも１つのＬは、Ｇｌｙである。

【0157】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジン（例えば、Ｌｙｓ４４７）の後に付加された１～２０個のアミノ酸残基を有する。１つのアミノ酸残基がＣ末端リジンの後に付加されている１つの実施形態において、Ｃ末端リジンに隣接する付加されたアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミンおよびヒスチジンからなる群より選択される。１つのアミノ酸残基がＣ末端リジンの後に付加されている１つの実施形態において、Ｃ末端リジンに隣接する付加されたアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、プロリン、アスパラギン酸またはグルタミン酸ではない。１つのアミノ酸残基がＣ末端リジンの後に付加されている１つの実施形態において、Ｃ末端リジンに隣接する付加されたアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、リジンまたはアルギニンではない。

【0158】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジン（例えば、Ｌｙｓ４４７）の後に付加された２つのアミノ酸残基（アミノ酸位＋１および＋２）を有する。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジン（例えば、Ｌｙｓ４４７）の後に付加された３つのアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２および＋３）を有する。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジン（例えば、Ｌｙｓ４４７）の後に付加された４つのアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３および＋４））を有する。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジン（例えば、Ｌｙｓ４４７）の後に付加された５つのアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４および＋５）を有する。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジン（例えば、Ｌｙｓ４４７）の後に付加された６つのアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５および＋６）を有する。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジン（例えば、Ｌｙｓ４４７）の後に付加された７つのアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６および＋７）を有する。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジン（例えば、Ｌｙｓ４４７）の後に付加された８つのアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７および＋８）を有する。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジン（例えば、Ｌｙｓ４４７）の後に付加された９つのアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８および＋９）を有する。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジン（例えば、Ｌｙｓ４４７）の後に付加された１０個のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９および＋１０）を有する。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジン（例えば、Ｌｙｓ４４７）の後に付加された１１個のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０および＋１１）を有する。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジン（例えば、Ｌｙｓ４４７）の後に付加された１２個のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１および＋１２）を有する。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジン（例えば、Ｌｙｓ４４７）の後に付加された１３個のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２および＋１３）を有する。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジン（例えば、Ｌｙｓ４４７）の後に付加された１４個のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３および＋１４）を有する。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジン（例えば、Ｌｙｓ４４７）の後に付加された１５個のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４および＋１５）を有する。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジン（例えば、Ｌｙｓ４４７）の後に付加された１６個のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、＋１５および＋１６）を有する。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジン（例えば、Ｌｙｓ４４７）の後に付加された１７個のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、＋１５、＋１６および＋１７）を有する。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジン（例えば、Ｌｙｓ４４７）の後に付加された１８個のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、＋１５、＋１６、＋１７および＋１８）を有する。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジン（例えば、Ｌｙｓ４４７）の後に付加された１９個のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、＋１５、＋１６、＋１７、＋１８および＋１９）を有する。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジン（例えば、Ｌｙｓ４４７）の後に付加された２０個のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、＋１５、＋１６、＋１７、＋１８、＋１９および＋２０）を有する。

【0159】

１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジン（例えば、Ｌｙｓ４４７）の後に付加された９つ未満のアミノ酸残基を有する。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジン（例えば、Ｌｙｓ４４７）の後に付加された１３個未満のアミノ酸残基を有する。１つの実施形態において、免疫グロブリンは、Ｃ末端リジン（例えば、Ｌｙｓ４４７）の後に付加された配列：ＧＴＹＦＱＡＹＧＴ（配列番号１）、ＧＥＣＴＹＦＱＡＹＧＣＴＥ（配列番号２）またはＧＥＮＴＹＦＱＡＹＧＮＴＥ（配列番号３）を有しない。

【0160】

２つまたはそれより多いアミノ酸残基がＣ末端リジンの後に付加されているかまたは存在している１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後に付加されたまたは存在する最後のアミノ酸残基（すなわち、Ｃ末端リジンから最も遠い付加されたアミノ酸残基）は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される。２つまたはそれより多いアミノ酸残基がＣ末端リジンの後に付加されているかまたは存在している１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後に付加されたまたは存在する最後のアミノ酸残基は、リジンまたはアルギニンではない。

【0161】

開示される方法は、ヒト化免疫グロブリンに対して行われ得る。したがって、いくつかの実施形態において、免疫グロブリンは、ヒト化免疫グロブリンであり得る。

【0162】

開示される方法は、ヒト免疫グロブリンに対して行われ得る。したがって、いくつかの実施形態において、免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンであり得る。別の実施形態において、免疫グロブリンは、非ヒト免疫グロブリンであり得る。

【0163】

１つの実施形態において、開示される方法は、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３またはＩｇＧ_４免疫グロブリンに対して行われ得る。１つの実施形態において、その方法は、ＩｇＧ_１免疫グロブリンに対して行われる。１つの実施形態において、その方法は、ＩｇＧ_２免疫グロブリンに対して行われる。１つの実施形態において、その方法は、ＩｇＧ_３免疫グロブリンに対して行われる。１つの実施形態において、その方法は、ＩｇＧ_４免疫グロブリンに対して行われる。

【0164】

１つの実施形態において、開示される方法は、ＩｇＡ_１、ＩｇＡ_２またはＩｇＭ免疫グロブリンに対して行われ得る。１つの実施形態において、その方法は、ＩｇＡ_１免疫グロブリンに対して行われる。１つの実施形態において、その方法は、ＩｇＡ_２免疫グロブリンに対して行われる。１つの実施形態において、その方法は、ＩｇＭ免疫グロブリンに対して行われる。１つの実施形態において、ＩｇＡまたはＩｇＭ免疫グロブリンは、尾部を有する。別の実施形態において、ＩｇＡまたはＩｇＭ免疫グロブリンの尾部は、除去されている。

【0165】

１つの実施形態において、その方法は、ＩｇＤまたはＩｇＥ免疫グロブリンに対して行われる。１つの実施形態において、その方法は、ＩｇＤ免疫グロブリンに対して行われる。１つの実施形態において、その方法は、ＩｇＥ免疫グロブリンに対して行われる。

【0166】

本明細書中に記載される方法のため、１つの実施形態において、微生物トランスグルタミナーゼは、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ ｓｐ．Ｔ－２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ ＢＬ３２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの胞子、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ｃ２３６１、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ
ｓｐ．Ｃ１１１２、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ（別名、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ Ｍ５２１８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ ＪＴ４６／ｐＡＥ０５３、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｙｄｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｉｏｙａｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｇｒｉｓｅｏｃａｒｎｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌａｄａｋａｎｕｍ ＮＲＲＬ－３１９１、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．ｓ－８１１２またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ由来である。１つの実施形態において、微生物トランスグルタミナーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ由来である。

【0167】

本明細書中に記載される方法のため、１つの実施形態において、トランスグルタミナーゼは、Medicago sativa、Beta vulgaris、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ、Zea mays、Glycine max、Arabidopsis thaliana、Nicotiana tabacum、Chlamydomonas reinhardtii、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ、Oryza sativaおよびＲｏｓ
ｍａｒｉｎｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌからなる群より選択される植物から単離される。

【0168】

本明細書中に記載される方法のため、１つの実施形態において、トランスグルタミナーゼは、哺乳動物の（ｍａｍｉｌｌｉａｎ）トランスグルタミナーゼであり、トランスグルタミナーゼ１～７および第ＸＩＩＩ因子から単離される。

【0169】

１つの実施形態において、トランスグルタミナーゼは、本明細書中に記載される微生物トランスグルタミナーゼと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。１つの実施形態において、トランスグルタミナーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ由来の微生物トランスグルタミナーゼと少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。トランスグルタミナーゼ酵素は、Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ（登録商標）またはＺｅｄｉｒａ（製品番号Ｔ００１）から購入され得る。別の実施形態において、トランスグルタミナーゼは、精製される。別の実施形態において、トランスグルタミナーゼは、組換え的に発現され、続いて、当業者に公知の方法を用いて精製される。

【0170】

１つの実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書中に記載される方法において、約０．１単位／ｍＬ～約２５０単位／ｍＬの濃度で存在する。１つの実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書中に記載される方法において、約１単位／ｍＬ～約２５単位／ｍＬの濃度で存在する。１つの実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書中に記載される方法において、約１単位／ｍＬ～約２５単位／ｍＬの濃度で存在する。１つの実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書中に記載される方法において、約０．１単位／ｍＬの濃度で存在する。１つの実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書中に記載される方法において、約０．５単位／ｍＬの濃度で存在する。１つの実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書中に記載される方法において、約１単位／ｍＬの濃度で存在する。１つの実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書中に記載される方法において、約５単位／ｍＬの濃度で存在する。１つの実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書中に記載される方法において、約１０単位／ｍＬの濃度で存在する。１つの実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書中に記載される方法において、約１５単位／ｍＬの濃度で存在する。１つの実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書中に記載される方法において、約２０単位／ｍＬの濃度で存在する。１つの実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書中に記載される方法において、約２５単位／ｍＬの濃度で存在する。１つの実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書中に記載される方法において、約５０単位／ｍＬの濃度で存在する。１つの実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書中に記載される方法において、約７５単位／ｍＬの濃度で存在する。１つの実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書中に記載される方法において、約１００単位／ｍＬの濃度で存在する。１つの実施形態において、トランスグルタミナーゼ酵素は、本明細書中に記載される方法において、約１５０単位／ｍＬ、２００単位／ｍＬまたは２５０単位／ｍＬの濃度で存在する。

【0171】

本明細書中に提供される方法のために、１つの実施形態において、機能性物質と免疫グロブリンの比は、約１：１～約２：１である。１つの実施形態において、機能性物質と免疫グロブリンの比は、約１：１～約２：１である。１つの実施形態において、機能性物質と免疫グロブリンの比は、約１：１である。１つの実施形態において、機能性物質と免疫グロブリンの比は、約２：１である。１つの実施形態において、機能性物質と免疫グロブリンの比は、既知であり、本明細書中に開示される方法に従うことによって、一貫して再現性がある。機能性物質と免疫グロブリンの比は、本明細書中で使用されるとき、組成物中の抗体プールにおける機能性物質と免疫グロブリンの結合体化比の平均に基づいて算出される。

【0172】

少なくとも２つのさらなるアミノ酸残基がＣ末端リジンの後に存在し、その少なくとも２つのさらなるアミノ酸残基のうちの１つがリジンを含む、本明細書中に提供される実施形態において、機能性物質と免疫グロブリンの比は、リジンであるさらなるアミノ酸残基の数に基づいて増加する。例えば、２つのさらなるアミノ酸残基がＣ末端リジンの後に存在し、そのさらなるアミノ酸残基のうちの１つもリジンであるとき、２つのリジン残基が存在することにより、４つのアミド基転移部位および約２：１～約４：１という機能性物質と免疫グロブリンの比を有する抗体がもたらされる。別の例として、５つのさらなるアミノ酸残基がＣ末端リジンの後に存在し、そのさらなるアミノ酸残基のうちの２つがリジンであるとき、（合計）３つのリジン残基が存在することにより、６つのアミド基転移部位および約２：１～約６：１という機能性物質と免疫グロブリンの比を有する抗体がもたらされる。
結合体化された免疫グロブリン

【0173】

本明細書中に開示される免疫グロブリンのいずれかを含む結合体化された免疫グロブリンも本明細書中に開示され、ここで、そのＣ末端位置におけるリジン（例えば、４４７位のリジン、すなわち「Ｌｙｓ４４７」）は、そのＣ末端リジンの後に少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基を有し、アシル供与体基質を含む機能性物質に結合体化され、そのアシル供与体基質は、グルタミン残基を含む。さらなる実施形態は、本明細書中に開示される免疫グロブリンのいずれかを含む結合体化された免疫グロブリンを含み、ここで、そのＣ末端位置におけるリジン（例えば、４４７位のリジン、すなわち「Ｌｙｓ４４７」）は、そのＣ末端リジンの後に少なくとも１つのさらなるアミノ酸残基を有し、アシル供与体基質に結合体化され、そのアシル供与体基質は、グルタミン残基および反応基を含み、その反応基は、その免疫グロブリンへのアシル供与体基質の結合体化の後に機能性物質と反応させることができる。

【0174】

１つの実施形態において、Ｃ末端リジンに隣接するアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミンまたはヒスチジンを含む。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンに隣接するアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、グリシンを含む。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンに隣接するアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、アラニンを含む。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンに隣接するアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、バリンを含む。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンに隣接するアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、ロイシンを含む。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンに隣接するアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、イソロイシンを含む。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンに隣接するアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、メチオニンを含む。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンに隣接するアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、フェニルアラニンを含む。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンに隣接するアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、チロシンを含む。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンに隣接するアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、トリプトファンを含む。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンに隣接するアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、セリンを含む。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンに隣接するアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、トレオニンを含む。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンに隣接するアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、システインを含む。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンに隣接するアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、アスパラギンを含む。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンに隣接するアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、グルタミンを含む。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンに隣接するアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、ヒスチジンを含む。１つのアミノ酸残基がＣ末端リジンの後に付加されている１つの実施形態において、Ｃ末端リジンに隣接する付加されたアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニンではない。

【0175】

別の実施形態において、１つより多いアミノ酸が、Ｃ末端リジンに付加される場合、最後のさらなるアミノ酸（すなわち、付加されたアミノ酸残基のＣ末端に位置するアミノ酸）は、リジンまたはアルギニンを除く任意のアミノ酸であり得る。例えば、２つのアミノ酸残基が、Ｃ末端リジンの後に付加される場合、その配列は、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）およびＣ末端リジンの後の２番目のアミノ酸（アミノ酸位＋２）を含み、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンを除く任意のアミノ酸残基であり、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基（アミノ酸位＋２）は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される。１つの実施形態において、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基は、リジンまたはアルギニンである。別の実施形態において、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基（アミノ酸位＋２）は、リジンまたはアルギニンではない。

【0176】

別の例として、５つのアミノ酸残基がＣ末端リジンの後に付加される場合（アミノ酸位＋１、＋２、＋３、＋４および＋５）、その配列は、Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１）、Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基（アミノ酸位＋２）、Ｃ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基（アミノ酸位＋３）、Ｃ末端リジンの後の４番目のアミノ酸残基（アミノ酸位＋４）およびＣ末端リジンの後の５番目のアミノ酸残基（アミノ酸位＋５）を含む。Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンを除く任意のアミノ酸残基であり得る。Ｃ末端リジンの後の２番目、３番目および４番目のアミノ酸残基は、任意のアミノ酸であり得る。しかしながら、Ｃ末端リジンの後の５番目のアミノ酸残基（アミノ酸位＋５）は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される。別の実施形態において、Ｃ末端リジンの後の５番目のアミノ酸残基（アミノ酸位＋５）は、リジンまたはアルギニンではない。別の実施形態において、Ｃ末端リジンの後の１番目、２番目、３番目または４番目のアミノ酸残基（アミノ酸位＋１、＋２、＋３および／または＋４）は、それぞれリジンまたはアルギニンであり得る。

【0177】

いくつかの実施形態において、免疫グロブリンは、ヒト化免疫グロブリンであり得る。他の実施形態において、免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。別の実施形態において、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリンである。

【0178】

グルタミン残基および反応基を含むアシル供与体基質は、リンカー「Ｌ」も含み得る。同様に、グルタミン残基を含むアシル供与体基質を含む機能性物質は、機能性物質とその分子のアシル供与体基質部分との間にリンカーを有し得る。リンカーは、切断不可能なリンカーまたは切断可能なリンカーであり得る。例示的なリンカーとしては、例えば、ジスルフィド含有リンカー、アセタールに基づくリンカーおよびケタールに基づくリンカーが挙げられる。いくつかの態様において、リンカーは、切断不可能なリンカーであり得る。好適な切断不可能なリンカーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはアルキルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＰＥＧを含み得る。いくつかの態様において、リンカーは、切断可能なリンカーであり得る。好適な切断可能なリンカーとしては、例えば、バリン－シトルリン－パラアミノベンジルが挙げられる。いくつかの態様において、リンカーは、ジスルフィド含有リンカーであり得る。いくつかの態様において、リンカーは、アセタールに基づくリンカーであり得る。いくつかの態様において、リンカーは、ケタールに基づくリンカーであり得る。

【0179】

本発明の結合体化された免疫グロブリンは、機能性物質を含む。好適な機能性物質としては、例えば、治療薬または診断薬が挙げられる。好適な機能性物質としては、例えば、フルオロフォア、蛍光色素、ポリペプチド、免疫グロブリン、抗生物質、核酸、放射性核種、化学的リンカー、小分子、キレート剤、脂質および薬物が挙げられる。いくつかの態様において、機能性物質は、フルオロフォアを含み得る。いくつかの態様において、機能性物質は、蛍光色素を含み得る。いくつかの態様において、機能性物質は、ポリペプチドを含み得る。いくつかの態様において、機能性物質は、免疫グロブリンを含み得る。いくつかの態様において、機能性物質は、抗生物質を含み得る。いくつかの態様において、機能性物質は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を含み得る。いくつかの態様において、機能性物質は、放射性核種を含み得る。いくつかの態様において、機能性物質は、小分子を含み得る。いくつかの態様において、機能性物質は、キレート剤（例えば、とりわけ、ＤＯＴＡ、ＣＨＸ－Ａ”－ＤＴＰＡ、ＮＯＴＡ）を含み得る。いくつかの態様において、機能性物質は、脂質を含み得る。いくつかの態様において、機能性物質は、薬物を含み得る。いくつかの態様において、機能性物質は、上に列挙された機能性物質のいずれかの組み合わせを含み得る。

【0180】

したがって、開示される結合体化された免疫グロブリンとしては、免疫グロブリン－フルオロフォアＣ末端リジン結合体、免疫グロブリン－蛍光色素Ｃ末端リジン結合体、免疫グロブリン－ポリペプチドＣ末端リジン結合体、免疫グロブリン－免疫グロブリンＣ末端リジン結合体、免疫グロブリン－抗生物質Ｃ末端リジン結合体、免疫グロブリン－核酸Ｃ末端リジン結合体、免疫グロブリン－放射性核種Ｃ末端リジン結合体、免疫グロブリン－化学的リンカーＣ末端リジン結合体、免疫グロブリン－小分子Ｃ末端リジン結合体、免疫グロブリン－キレート剤Ｃ末端リジン結合体、免疫グロブリン－脂質Ｃ末端リジン結合体および免疫グロブリン－薬物Ｃ末端リジン結合体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0181】

本明細書中に開示される任意の免疫グロブリンが、本明細書中に開示される機能性物質のいずれかに結合体化され得る。例えば、結合体化された免疫グロブリンは、フルオロフォア、蛍光色素、ポリペプチド、免疫グロブリン、抗生物質、核酸、放射性核種、化学的リンカー、小分子、キレート剤、脂質または薬物を含み得る。

【0182】

いくつかの実施形態において、免疫グロブリンは、アウリスタチンなどの小分子抗腫瘍剤（antineoplastic agent）に結合体化され得る。いくつかの態様において、機能性物
質は、アウリスタチンＦ（ＡｕＦ）であり得る。したがって、開示される結合体化された免疫グロブリンは、アウリスタチンＦに結合体化された上に開示された免疫グロブリンのいずれか（ＡｕＦ Ｌｙｓ４４７結合体）を含む。
薬学的組成物

【0183】

薬学的組成物も本明細書中に提供される。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、本明細書中に開示される免疫グロブリンのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、本明細書中に開示される結合体化された免疫グロブリンのいずれかを含み得る。１つの実施形態において、薬学的組成物は、結合体化された免疫グロブリンおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む。
免疫グロブリンをコードする核酸分子およびそれを含む宿主細胞

【0184】

本明細書中に開示される免疫グロブリンのいずれかをコードする核酸分子も本明細書中に提供される。１つの例として、１つの実施形態において、その核酸分子は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む免疫グロブリンをコードし、その軽鎖可変領域は、Ｃ末端位置にリジン（例えば、４４７位または「Ｌｙｓ４４７」）、ならびにそのＣ末端リジンの後に、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミンおよびヒスチジンから選択される１つまたは複数のアミノ酸を有する。

【0185】

開示される核酸分子のいずれかを含む宿主細胞も開示される。好適な宿主細胞としては、いくつかの例を挙げれば、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0186】

以下の実施例は、本明細書中に開示される実施形態のいくつかをさらに説明するために提供される。実施例は、開示される実施形態を例証することを意図しているのであって、限定することを意図していない。

【実施例0187】

実施例１：材料および方法
変異誘発
ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬを製造者のプロトコルに従って使用して、変異を作製した。ＤＮＡ配列決定によって所望の変異を確認した。
トランスフェクションおよび安定細胞株の作製

【0188】

ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅを用いてトランスフェクトされる各１ミリリットルの細胞について、３３３．３ｎｇのＨＣプラスミドおよび３３３．３ｎｇのＬＣプラスミドを、５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で５～１０分間インキュベートした。同様に、２．６７μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅを５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ中でインキュベートした。そのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ溶液をＤＮＡ混合物に加え、室温で２０～３０分間インキュベートした。そのＤＮＡ：ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ混合物を、かき混ぜながら細胞に加え、３７℃、８％ＣＯ_２において１２５ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。翌日、細胞１ｍＬあたり５μＬのエンハンサー１および５０μＬのエンハンサー２を、上記のトランスフェクションしたものに加え、インキュベーションをさらに７～１０日間続けた。

【0189】

トランスフェクションの１～３日後に、５μｇ／ｍＬブラストサイジンおよび４００μｇ／ｍＬゼオシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を含むＴ７５フラスコ内の１４ｍＬのＤＭＥＭに１ｍＬのトランスフェクタントを加えることによって、抗体を発現している安定したプールを選択した。薬物耐性細胞をコンフルエントまで生育させた後、２４～４８時間にわたって、培地をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地で置き換えた。フラスコを軽く叩くことによって細胞を物理的に外し（トリプシン処理は低生存率をもたらした。データ示さず）、次いで、その細胞を、１２５ｍＬ振盪フラスコ内の３０ｍＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ
２９３発現培地中に６×１０^５細胞／ｍＬで播種した。培養物を、３７℃、８％ＣＯ_２において１２５ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。
ＭＡｂの作製

【0190】

安定にトランスフェクトされた細胞株のプールを、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地中に０．６～１×１０^６細胞／ｍＬで播種した。細胞を、３７℃、８％ＣＯ_２において１２５ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。培養物が１×１０^６細胞／ｍＬの密度に達した２日後、培養物に、最終濃度が１０ｇ／ＬのＳｅｌｅｃｔ Ｓｏｙｔｏｎｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、５ｍＭの吉草酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）および１：１００のＣＤ Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を供給した。細胞生存率が５０％未満になったら（７～１０日間）、培養物をＢｅｃｋｍａｎ ＪＬＡ８．１０００ローターにおいて８０００ｒｐｍで１時間遠心分離した。次いで、上清を０．２μｍ ＰＥＳフィルターで濾過し、精製するまで４℃または－２０℃で保存した。
ＭＡｂの精製

【0191】

ＭＡｂを、２つの方法のうちの１つを用いて精製した。１０ｍＬ未満のｍＡｂ上清の場合、プロテインＡ樹脂によるバッチ精製法を用いて、アフィニティークロマトグラフィーを行った。２５ｍＬを超えるＭＡｂ上清は、予め充填されたプロテインＡカラムを用いて精製した。
バッチ精製

【0192】

Ｐｒｏｓｅｐ－ｖＡ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、ＤＰＢＳで平衡化し、１００μＬを３～６ｍＬのサンプルに加えた。４℃で１時間から一晩インキュベーションした後、その樹脂を１ｍＬのＤＰＢＳで３回洗浄し、１８，０００×ｇで３０秒間遠心分離した。４００μＬの０．１Ｍグリシン，ｐＨ２．９を加えてサンプルをその樹脂から溶出させた後、１８，０００×ｇで３０秒間、遠心分離した。サンプルを４０μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０で中和した。０．５ｍＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ，１０ｋカットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用い、１８，０００×ｇで３～５分間の遠心分離によってサンプルを約１００μＬまで濃縮することによって、緩衝液を交換した。濃縮されたサンプルを４００μＬのＤＰＢＳで希釈した後、遠心分離した。このプロセスを合計４回繰り返した。
カラム精製

【0193】

プロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１０カラム体積（ＣＶ）の２０ｍＭリン酸ナトリウム，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．２で平衡化した。次いで、サンプルを充填した後、未結合の材料を１０ＣＶの平衡緩衝液で洗浄した。５ＣＶの０．１Ｍグリシン，ｐＨ２．９を用いることによって、サンプルを溶出した。ｍＡｂを含む画分をプールし、ＭＷＣＯ ２０Ｋ Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてＤＰＢＳで透析した。
Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ基質合成

【0194】

Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＯＨをＢａｃｈｅｍから購入し、Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＣＡＤ－ビオチンをＺｅｄｉｒａから購入した（図２）。

【0195】

Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ペンタフルオロフェニルエステル（Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＰＦＰ）の合成は、Ｐａｓｔｅｒｎａｃｋら｛Ｐａｓｔｅｒｎａｃｋ，１９９７ １５／同上｝から改変を加えたものであった（図３）。Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＯＨ（３２８．８ｍｇ、０．９７５ｍｍｏｌ）およびペンタフルオロフェノール（Ｓｉｇｍａ、１８３．３ｍｇ、０．９９６ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。次いで、ＥＤＡＣ－ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ、２０１ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）を加え、その反応物をＮ_２下、室温において２時間インキュベートした。その反応物に１００ｍＬの冷ジエチルエーテルを加え、－８０℃で一晩沈殿させた。粗生成物を遠心分離によって回収し、２０ｍＬの６０℃のメタノールから再結晶化させた。最終生成物を冷ジエチルエーテルでリンスし、Ｎ_２流で乾燥させた。最終収量は、２１９．０４ｍｇ（４４．７％）であった。ＥＳＩ－ＭＳ（０．１％ギ酸中の５０％アセトニトリルにおける直接注入）ｍ／ｚ ５０４．０（［Ｍ＋Ｈ］、８６％）、５２６．０（［Ｍ＋Ｎａ］、１００％）、５４２．０（［Ｍ＋Ｋ］、２２％）。
Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－プロピルアジド（Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｎ_３）

【0196】

Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＰＦＰ（２１．２４ｍｇ、４．２２×１０^－５ｍｏｌ）およびアジドプロピルアミン（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ、ＤＭＦ中４２．２μＬの０．９１Ｍ原液、３．８４×１０^－５ｍｏｌ）を、０．４２ｍＬという最終体積のＤＭＦに溶解した。反応物をＮ２下で一晩、室温において振盪した。生成物を、水中０．１％ギ酸／アセトニトリル中０．１％ギ酸の移動相を用いるＨＰＬＣによって精製した。生成物を真空中で乾燥させた。最終収量は、１０．７ｍｇ（６０．４％）であった。ＥＳＩ－ＭＳ（グラジエント精製）ｍ／ｚ ４２０．２（［Ｍ＋Ｈ］、１００％）、４４２．１（［Ｍ＋Ｎａ］、３２％）。
Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＰＥＧ_３－ｅｎｄｏ－ビシクロノニン（bicyclononyne）（Ｚ－
Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＰＥＧ_３－ＢＣＮ）

【0197】

Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＰＦＰ（１８．４ｍｇ、３．６６×１０^－５ｍｏｌ）およびｅｎｄｏ－ビシクロ［６，１，０］ノナ－４－イン－９－イル－ＰＥＧ_３－アミン（Ｃｏｎｊｕ－Ｐｒｏｂｅ、ＤＭＦ中１７５μＬの０．２７Ｍ原液、４．７５×１０^－５ｍｏｌ）を０．３７ｍＬという最終体積のＤＭＦに溶解した。反応物をＮ_２下で一晩、室温において振盪した。生成物を、水中０．１％ギ酸／アセトニトリル中０．１％ギ酸の移動相を用いるＨＰＬＣによって精製した。生成物を真空中で乾燥させた。最終収量は、０．６ｍｇ（２％）であった。ＥＳＩ－ＭＳ（グラジエント精製）ｍ／ｚ６８８．２（［Ｍ＋Ｈ］、１００％）、７１０．２（［Ｍ＋Ｎａ］、６９％）。
Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＰＥＧ_２－アウリスタチンＦ（Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＰＥＧ_２－ＡｕＦ）

【0198】

Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＰＦＰ（２２．２ｍｇ、４．３７×１０^－５ｍｏｌ）を０．８５ｍＬのＤＭＦに溶解し、１，２－エチレンジアミン（２．３×１０^－５Ｌ、３．５×１０^－４ｍｏｌ）を加え、混合した。反応物をＮ_２下で一晩、室温において振盪した。生成物を、水中０．１％ギ酸／アセトニトリル中０．１％ギ酸の移動相を用いるＨＰＬＣによって精製した。生成物を真空中で乾燥させた。Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＮＨ_２の最終収量は、３．８ｍｇ（２３％）であった。ＥＳＩ－ＭＳ（グラジエント精製）ｍ／ｚ ３８０．１（［Ｍ＋Ｈ］、１００％）。Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＮＨ２（３．８ｍｇ、１．０１×１０^－５ｍｏｌ）およびＮＨＳ－ＰＥＧ_２－ＡｕＦ（１０．３ｍｇ、１．０３×１０^－５ｍｏｌ）を０．２ｍＬのＤＭＦに溶解した。トリエチルアミン（１４μＬ、１×１０^－４ｍｏｌ）を加え、反応物をＮ_２下、室温において一晩インキュベートした。反応物の半分を、水中０．１％ギ酸／アセトニトリル中０．１％ギ酸の移動相を用いるＨＰＬＣによって精製した。生成物を真空中で乾燥させた。ＣＢＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＰＥＧ_２－ＡｕＦの最終収量は、３．８ｍｇ（６０％）であった。ＥＳＩ－ＭＳ（グラジエント精製）ｍ／ｚ ６３４．０（［Ｍ＋Ｈ］^２＋、１００％）、６４５．１（［Ｍ＋Ｎａ］^２＋、４５％）．１２６７．０（［Ｍ＋Ｈ］、１６％）。
微生物トランスグルタミナーゼ反応

【0199】

１００μｇ／ｍＬから２．５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲のＭＡｂを、ＤＰＢＳ中の、７８５μＭ Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ビオチン（Ｚｅｄｉｒａ）、Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｎ_３、Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＢＣＮまたはＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＰＥＧ_２－ＡｕＦおよび１Ｕ／ｍＬ微生物トランスグルタミナーゼ（Ｚｅｄｉｒａ）とともに、３７℃で少なくとも１６時間インキュベートした。
ｍＡｂ結合体化の超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）／ＥＳＩ－ＭＳ解析

【0200】

精製された抗体を、ＤＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬに希釈した（１．０ｍｇ／ｍＬ未満の場合は、サンプルを元の濃度のままにした）。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む反応物を、Ｚｅｂａ脱塩スピンカラムを用いて脱塩した。次いで、それらのｍＡｂを、ＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＮＥＢ）を用いて脱グリコシル化するか、またはＩｄｅＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によってＦａｂ’_２フラグメントおよびＦｃフラグメントに消化した。ｍＡｂを脱グリコシル化するために、Ｇ７緩衝液（５または１０μＬ）およびＰＮＧａｓｅ Ｆ（１または２μＬ）をｍＡｂ（５０または１００μＬ）に加えた。その反応物を、２サイクル：１．）マイクロ波出力１０Ｗ、３７℃、１０分、次いで、３～５分待つ；２．）マイクロ波出力２Ｗ、３７℃、１０分にわたって、Ｄｉｓｃｏｖｅｒマイクロ波（ＣＥＭ）においてインキュベートした。ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を２０ｍＭという最終濃度になるまで加えた後、６０℃で３分間インキュベーションすることによって、脱グリコシル化されたサンプルの一部を還元した。Ｆａｂ’_２フラグメントおよびＦｃフラグメントを生成するために、５０Ｕ／μＬのＩｄｅＳを０．５ｍｇ／ｍＬのｍＡｂに加え、３７℃で０．５～１時間インキュベートした。上記のように還元した抗体０１－Ｃ以外のＩｄｅＳサンプルは、還元しなかった。

【0201】

次いで、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣおよびＱ－Ｔｏｆ Ｐｒｅｍｉｅｒ質量分析計を用いて、サンプルを解析した。サンプル（各０．５～２μｇ）を、６５℃のＭａｓｓＰｒｅｐ脱塩マイクロカラム上に注入し、０．０５ｍＬ／分での、９５％の移動相Ａによる５分間の平衡化、１０分間のグラジエント（５～９０％Ｂ）、および１０分間の９５％の移動相Ａによる再平衡化によって、そのカラムから溶出した。移動相Ａは、水中０．１％ギ酸であった。移動相Ｂは、アセトニトリル中０．１％ギ酸であった。Ｑ－Ｔｏｆ質量分析計を陽イオンＶ－モードで作動させ、５００～４０００ｍ／ｚの範囲において検出した。ソースパラメータは、以下のとおりであった：キャピラリー電圧、２．２５ｋＶ（インタクト抗体）～２．５０ｋＶ（還元抗体）；サンプリングコーン電圧、６５．０Ｖ（インタクト抗体）または５０．０Ｖ（還元抗体）；ソース温度、１００℃；脱溶媒和温度、２５０℃；脱溶媒和ガス流、５５０Ｌ／時間。タンパク質のピークをＭａｓｓＬｙｎｘのＭａｘＥｎｔ１関数を用いてデコンボリュートした。
逆相液体クロマトグラフィー（ＬＣ）－ＭＳ

【0202】

抗体０１－Ｌ（１ｍｇ／ｍＬ）を、１Ｕ／ｍＬ ＴＧａｓｅの存在下、３７℃において５０倍モル濃度過剰のＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＰＥＧ_２－ＡｕＦとともに一晩インキュベートした。ｍＡｂをＩｄｅＳによってＦａｂ’_２フラグメントおよびＦｃフラグメントに消化し、上記のようにＤＴＴで還元した。ＳＱＤおよびＰＤＡ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ
Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣを用いてサンプルを解析した。サンプル（０．５～２μｇ）を、６５℃のＰｒｏｔｅｏｍｉｘ ＲＰ－１０００カラム（４．６×５０ｍｍ、Ｓｅｐａｘ）上に注入した。ＬＣフラグメント、ＦｃフラグメントおよびＦｄフラグメントの分離を、１ｍＬ／分の流速での、７５％の移動相Ａ（水中０．１％ＴＦＡ）における１．５分間の平衡化および１３．５分間のグラジエント［２５～６５％移動相Ｂ（アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）］で行った。

【0203】

ＳＱＤ質量分析計を陽イオンＶ－モードで作動させ、２００～２０００ｍ／ｚの範囲において検出した。ソースパラメータは、以下のとおりであった：キャピラリー電圧、３．００ｋＶ；サンプリングコーン電圧、４０℃；ソース温度、１２０℃；脱溶媒和温度、２５０℃；脱溶媒和ガス流、８００Ｌ／時間。スキャン時間、１秒。タンパク質のピークをＭａｓｓＬｙｎｘのＭａｘＥｎｔ１関数によってデコンボリュートした。ＰＤＡ検出器は、２８０ｎｍであった。
実施例２：ＩｇＧ抗体上の溶媒に露出したリジンの解析

【0204】

ＩｇＧ１－カッパＦａｂ（抗体０１、４Ｆ３Ｆ）、ＩｇＧ１－ラムダＦａｂ（４ＨＫ０）およびＩｇＧ１ Ｆｃ（１ＦＣ１）の結晶構造を、潜在的なアシル受容体部位について調べた。微生物トランスグルタミナーゼが、溶媒に露出したループ内の基質グルタミンおよびリジンを好む傾向があるので｛Ｓｐｏｌａｏｒｅ，２０１２ １７／同上｝、溶媒に露出したリジンを、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ｖ４．５を用いて１．４Åのプローブ半径で強調した（図４）。抗体０１ ＶＨには、溶媒に露出したリジンは７つあり、３つがループ内にある。リジンの数は、異なる可変領域ファミリーおよび体細胞超変異の利用に起因して、ｍＡｂごとに異なり得るので、４Ｆ３Ｆの構造における類した位置の残基に基づいて、他の５つの抗体のＶＨ領域におけるリジンの溶媒露出も解析した。これらのＶＨ領域は、潜在的に１～５個の溶媒に露出したリジンを含み、１または２個がループ内に存在する。抗体０１ Ｖκでは、溶媒に露出したリジンが６つあり、４つがループ内にある。他の４つの抗体のＶＫ領域は、潜在的に３～５個の溶媒に露出したリジンを含み、２つがループ内にある。抗体０５は、ラムダ鎖を使用しているので、リジンの溶媒露出は、４ＨＫ０の結晶構造を用いて、軽鎖の配列類似性に基づいて決定した。抗体０５は、潜在的に２つの溶媒に露出したリジンをＶλドメインに有し、ただ１つがループ内にある。

【0205】

ＣＨ１およびカッパの定常ドメイン、Ｆｃならびにラムダを、それぞれ４Ｆ３Ｆ、１ＦＣ１および４ＨＫ０の結晶構造を用いて解析した。ＩｇＧ_１定常ドメインは、２３個の溶媒に露出したリジンを有し、１３個がループ内にある。カッパ定常領域は、８つのリジンを有し、５つがループ内にある。ラムダは、６つの溶媒に露出したリジンを有し、半数がループ内にある。合計すると、解析された抗体は、ｍＡｂ１つあたり、ループ内に４２～５０個の溶媒に露出したリジンを有する。

【0206】

微生物トランスグルタミナーゼが、ＩｇＧ抗体上の天然のリジン残基のアミド基を転移させられるかを決定するために、抗体を、５０倍モル濃度過剰のＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＣＡＤ－ビオチンおよび１Ｕ／ｍＬ微生物トランスグルタミナーゼとともに３７℃で一晩インキュベートした。サンプルをＩｄｅＳで消化し、ＤＴＴで還元し、ＬＣフラグメント、ＦｄフラグメントおよびＦｃフラグメントの質量を質量分析によって解析した。これらのサンプルは、脱グリコシル化しなかったので、Ｇ０Ｆ（＋１４４５Ｄａ）およびＧ１Ｆ（＋１６０８Ｄａ）グリコフォームに対応する２つの質量ピークが各Ｆｃに対して観察された。抗体０４は、ＶＨにＮ結合型グリコシル化部位も含むので、２つのグリカン種Ｇ２ＦＳおよびＧ２ＦＳ２が観察された。そのＦｃに対する質量の観測値と理論値との間の－１３０～－１３２Ｄａという差異によって証明されるように、すべてのサンプルが、Ｃ末端リジン（１２８Ｄａ）を欠いた。種々の抗体において４２～５０個の潜在的なアシル受容体リジンが存在するが、ＨＣもＬＣも、アシル供与体基質によって改変されなかった（図６、表１）。

【表1】

【0207】

抗体０１のＨＣまたはＬＣのＣ末端に遺伝的に融合された２つの既知のリジンアシル受容体部位を有するペプチド（ＧＧＳＴＫＨＫＩＰＧＧＳ（配列番号６）；｛Ｔａｋａｚａｗａ，２００４
２３／同上｝を含むように作製された２つのポジティブコントロール（それぞれＨＣ－ＫＴａｇまたはＬＣ－ＫＴａｇ）も同様に解析した。ＫＴａｇ ｍＡｂを、Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＣＡＤ－ビオチンおよび微生物トランスグルタミナーゼとともにインキュベートした。サンプルをＰＮＧａｓｅ Ｆによって脱グリコシル化し、ＤＴＴで還元した。重鎖および軽鎖の質量を質量分析によって解析した。ＬＣ－ＫＴａｇ ｍＡｂは、最大２つのＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＣＡＤ－ビオチン分子で修飾され、これは、ＫＴａｇにおける２つのリジンの修飾と一致した（図７、表２）。

【表2】

【0208】

ＨＣおよびＬＣの質量を、図７においてＥＳＩ－ＭＳによって決定した。各フラグメントの理論的質量をアミノ酸配列によって確定し、それを、観察された質量から減算することにより、質量の変化（Δ質量）を決定した。－１２８ＤａというΔ質量は、Ｌｙｓ４４７の切断に起因し、＋６３１ＤａというΔ質量は、１つのＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＣＡＤ－ビオチンの付加を示す。質量の変化をＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＣＡＤ－ビオチンの質量で除算することによって、ＨＣまたはＬＣ上に結合体化されたＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＣＡＤ－ビオチン分子の数を決定した。単一のＨＣまたはＬＣピークのシグナル強度を、サンプル中のすべてのＨＣまたはＬＣのピークの強度の合計で除算することによって、結合体化のパーセンテージを決定した。

【0209】

ＨＣへのＫＴａｇの付加は、驚いたことに、ちょうど２つではなく、最大３つのＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＣＡＤ－ビオチン分子をＨＣに付加した。ＫＴａｇには２つのリジンしか存在しないので、ｍＡｂの中のリジンが、第３のアシル受容体部位であった。ＫＴａｇに近いことを考えると、最も可能性のあるｍＡｂリジン受容体部位は、重鎖Ｌｙｓ４４７であった。
実施例３：Ｌｙｓ４４７のアミド基転移には単一アミノ酸の伸長で十分である

【0210】

Ｌｙｓ４４７は、代表的には、ＨＥＫ２９３細胞およびＣＨＯ細胞における組換えＩｇＧ発現中において、カルボキシペプチダーゼＢによって切断される｛Ｈａｒｒｉｓ，１９９０ ７／同上；Ｈａｒｒｉｓ，１９９５ ６／同上；Ｄｉｃｋ，２００８ ３／同上｝。しかしながら、ＨＣのＣ末端にＫＴａｇを付加すると、Ｌｙｓ４４７の除去が阻止され、それにより、微生物トランスグルタミナーゼが、Ｌｙｓ４４７をアシル受容体部位として利用することが可能になる。微生物トランスグルタミナーゼが、ＫＴａｇなしでアシル受容体としてＬｙｓ４４７を利用できるかを決定するために、抗体０１のＣ末端に１つまたは２つのロイシンを付加することによって（それぞれ抗体０１－ＨＣ－Ｌまたは抗体０１－ＨＣ－ＬＬ）、Ｌｙｓ４４７の切断を阻止した。精製されたｍＡｂを、Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＣＡＤ－ビオチンおよび微生物トランスグルタミナーゼとともにインキュベートし、脱グリコシル化されたＨＣの質量を解析した。実際に、１つまたは２つのロイシンのいずれかの付加が、Ｌｙｓ４４７を保持し、そのＨＣは、Ｌｙｓ４４７のアミド基転移と一致する単一のアシル供与体基質で修飾された（図８；表３）。

【表3】

【0211】

ＨＣおよびＬＣの質量をＥＳＩ－ＭＳによって決定した。ｍＡｂへのＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＣＡＤ－ビオチン（Δ質量＝６３１Ｄａ）のパーセント結合体化を表２におけるように決定した。

【0212】

Ｃ末端ロイシンを他の２つのｍＡｂに付加した。野生型ｍＡｂおよび変異体ｍＡｂを、微生物トランスグルタミナーゼおよびＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＣＡＤ－ビオチンとともに３７℃で一晩インキュベートした。各サンプルのＦｃフラグメントを上記のように質量分析によって解析した。抗体０１と同様に、Ｃ末端ロイシンの付加によって、変異体ｍＡｂのアミド基転移はもたらされたが、野生型ｍＡｂのアミド基転移はもたらされなかった（表４）。

【表4】

【0213】

他のアミノ酸がＬｙｓ４４７の切断を阻止し得るか、およびそれらは、微生物トランスグルタミナーゼがＬｙｓ４４７を修飾するための適切な環境を提供したかを決定するために、残りのアミノ酸を単一残基伸長としてＣ末端に付加した。Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＣＡＤ－ビオチンを用いた微生物トランスグルタミナーゼによる修飾についてサンプルを解析した。Ｆｃフラグメントの質量を上記のように質量分析によって解析した。驚くことではないが、追加のＣ末端リジンまたはアルギニンは、カルボキシペプチダーゼＢの基質であるので、それらは、Ｌｙｓ４４７の切断を保護しなかった（表５）。残りのアミノ酸のうち、Ｃ末端プロリンおよび酸性残基だけが、基質への１００％結合体化を促進しなかった。Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＣＡＤ－ビオチンへの結合体化（＋６３１Ｄａ）に関連する平均＋６２８Ｄａシフトに加えて、＋４００Ｄａという質量シフトも観察された。これは、Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＣＡＤ－ビオチンの合成またはＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＣＡＤ－ビオチンの分解のいずれかからのＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＣＡＤの低パーセンテージにおそらく起因する。

【表5-1】

【表5-2】

【0214】

追加の（ａｄｄｉｔｉｏｎ）単一リジンまたはアルギニンのＣ末端アミノ酸の切断に起因して、Ｌｙｓ４４７におけるアミド基転移に対するいずれかのアミノ酸の効果は評価する（ａｃｃｅｓｓｅｄ）ことができなかった。ゆえに、リジンバリアントおよびアルギニンバリアントのＣ末端にロイシンを付加した。さらに、その追加のＣ末端ロイシンの効果も、プロリンバリアント、アスパラギン酸バリアントおよびグルタミン酸バリアントを用いて調査した。追加のロイシンは、試験されたすべてのＣ末端バリアントのアミド基転移に対して正の効果を有した（表６）。リジンまたはアルギニンの切断を阻止することによって、Ｌｙｓ４４７は、１００％アミド基転移された。さらに、ＫＬバリアントにおける追加のリジンもアミド基転移したことから、４つのアミド基転移部位を有する抗体がもたらされた。また、Ｃ末端ロイシンは、プロリンバリアントのアミド基転移を６１．３％に増加させ、酸性残基バリアントは、中程度にアミド基転移された（表６）。

【表6】

実施例４：様々な抗体アイソタイプのＣ末端リジンのアミド基転移

【0215】

ＣＨ３（またはＩｇＥおよびＩｇＭの場合はＣＨ４）のＣ末端残基は、すべてのヒトアイソタイプにおいてリジンである（表７）。ゆえに、このリジンを、他のアイソタイプに対する結合体化部位として利用できる可能性がある。抗体０１のＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３およびＩｇＧ_４バージョンを、追加のＣ末端ロイシンまたはアスパラギン酸ありまたはなしで作製した。それらのｍＡｂを、微生物トランスグルタミナーゼおよびＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＣＡＤ－ビオチンとともに３７℃で一晩インキュベートし、Ｆｃフラグメントの質量を上記のように質量分析によって解析した。ＩｇＧ_１と同様に、追加のＣ末端残基が存在しない場合、ＨＥＫ２９３細胞における発現中にＣ末端リジンは除去された（表８）。野生型のＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３もしくはＩｇＧ_４またはＣ末端アスパラギン酸を用いたときは、アミド基転移は見られなかったが、Ｃ末端ロイシンは、それらのｍＡｂのアミド基転移を促進した。

【表7】

【表8】

実施例５：アシル供与体基質

【0216】

Ｃ末端リジンへの結合体化の有用性の１つは、部位特異的ＡＤＣを製造する場合である。Ｃ末端リジンへの機能性物質の結合体化は、２つの方法のうちの１つによって達成され得る。第１に、２工程方法は、反応基（例えば、ＢＣＮ、ＤＢＣＯ、ＴＣＯ、アジド（Ｎ_３）、アルキン、テトラジンまたはマレイミド）を用いて合成されたアシル供与体へのＣ末端リジンの微生物トランスグルタミナーゼ結合体化を必要とし得る。第２の工程は、例えば、銅非含有クリックケミストリーまたはチオール反応性化学を用いて、その反応基に機能性物質を結合体化させることを含み得る。ゆえに、アミノ－ＰＥＧ３－ＢＣＮまたはアミノプロピル－Ｎ_３を、方法の項において詳述したように、Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙのヒドロキシル基に付加した。上記のように、抗体０１－ＨＣ－Ｌを、Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ、Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＣＡＤ－ビオチン、Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｎ_３またはＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＰＥＧ３－ＢＣＮおよび微生物トランスグルタミナーゼとともにインキュベートした。サンプルを脱塩し、脱グリコシル化し、還元し、ＥＳＩ－ＭＳによって解析して、ｍＡｂへの基質の付加を決定した。４つすべての基質が、抗体０１－ＨＣ－Ｌに効率的に結合体化された（表９）。

【表9】

【0217】

第２の方法は、単一の結合体化工程を含み、アシル供与体基を有する機能性物質が合成される。ＰＥＧ２－アウリスタチンＦ上にＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ基を合成することによって（Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＰＥＧ２－ＡｕＦ）、この方法を試験した。Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＰＥＧ２－ＡｕＦを、抗体０１－Ｌおよび微生物トランスグルタミナーゼとともに３７℃で一晩インキュベートした。ＩｄｅＳで消化し、ＤＴＴによって還元した後、２８０ｎｍの吸光度をモニターし、逆相ＬＣ－ＭＳによって解析した。抗体０１－Ｌに対しては、３つのピークが観察された（図９）。各ピークの質量をＥＳＩ－ＭＳによって解析したところ、第１のピークがＬＣであり、第２のピークがＦｃであり、第３のピークがＦｄであることが明らかになった。Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＰＥＧ２－ＡｕＦおよび微生物トランスグルタミナーゼとともにインキュベートされた抗体０１－Ｌに対しては、第４のピークが観察された。このピークは、Ｆｄピークと完全には分離できなかったが、このピークの大部分の面積（図９Ｂ、挿入図）が、ＦｃおよびＦｃ－Ｚ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＰＥＧ_２－ＡｕＦピークの総面積の７５．４％であることが明らかになった（表１０）。ゆえに、１．５８を超えるＤＡＲが達成された。

【表10】

実施例６：二量体抗体分子の生成

【0218】

免疫グロブリンのＣ末端リジン上に官能基を付加する別の有用性は、二量体ｍＡｂ－ｍＡｂ分子の生成である。例えば、ＢＣＮが結合体化されたｍＡｂが、銅非含有クリックケミストリーを用いて、Ｎ_３が結合体化されたｍＡｂに結合体化され得る。ゆえに、等体積のＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｎ３またはＺ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－ＰＥＧ３－ＢＣＮ抗体０１－ＨＣ－Ｌ反応物を混合し、２２℃で一晩インキュベートさせた。その還元反応物を、４～１２％ビス－Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲルを用いるＳＤＳ－ＰＡＧＥによって二量体化ＨＣ（約１１０ｋＤａ）について解析した（図１０）。実際に、ＢＣＮおよびＮ３で修飾された重鎖は、二量体重鎖分子を形成した。

【0219】

当業者は、本発明の好ましい実施形態に対して数多くの変更および改変が行われ得ることおよびそのような変更および改変が本発明の精神から逸脱することなく行われ得ることを十分に理解する。ゆえに、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神および範囲に含まれるそのような等価なバリエーションのすべてを包含することが意図されている。
例えば、本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
（項目１）
結合体化された免疫グロブリンを作製するための方法であって、該方法は、
微生物トランスグルタミナーゼおよびアシル供与体基質を含む機能性物質とともに、免疫グロブリンをインキュベートする工程であって、
ａ）該免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後に少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、
ｂ）該アシル供与体基質は、グルタミン残基を含み、
ｃ）該機能性物質は、治療薬または診断薬であり、
該微生物トランスグルタミナーゼは、該免疫グロブリンの該Ｃ末端リジンを、該機能性物質上の該アシル供与体基質の該グルタミン残基に結合体化させる、工程を含み、それによって、該結合体化された免疫グロブリンを作製する、方法。
（項目２）
結合体化された免疫グロブリンを作製するための方法であって、該方法は、
ｉ）微生物トランスグルタミナーゼおよびアシル供与体基質とともに免疫グロブリンをインキュベートする工程であって、
ａ）該免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後に少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、
ｂ）該アシル供与体基質は、グルタミン残基および反応基を含み、
該微生物トランスグルタミナーゼは、該免疫グロブリンの該Ｃ末端リジンを該アシル供与体基質の該グルタミン残基に結合体化させる、工程、および
ｉｉ）該アシル供与体基質の該反応基に機能性物質を結合体化させる工程であって、ここで、該機能性物質は、治療薬または診断薬である、工程
を含み、それによって、該結合体化された免疫グロブリンを作製する、方法。
（項目３）
前記アシル供与体基質の前記反応基が、クリックケミストリーによって前記機能性物質に結合体化される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記Ｃ末端リジンが、前記免疫グロブリンの重鎖上のリジン４４７（Ｋ４４７）である、項目１または項目２に記載の方法。
（項目５）
前記免疫グロブリンが、前記Ｃ末端リジンの後に１つのアミノ酸残基を含み、該Ｃ末端リジンの後の該１つのアミノ酸残基は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミンまたはヒスチジンである、項目１または項目２に記載の方法。
（項目６）
前記免疫グロブリンが、前記Ｃ末端リジンの後に１つのアミノ酸残基を含み、該Ｃ末端リジンの後の該１つのアミノ酸残基は、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニンを含まない、項目１または項目２に記載の方法。
（項目７）
前記アシル供与体基質を含む前記機能性物質が、式（Ｉ）または（ＩＩ）：
（Ｚ）_ｍ－Ｇｌｎ－（Ｌ）_ｎ－（Ｙ） （Ｉ）
（Ｙ）－（Ｌ）_ｎ－Ｇｌｎ－（Ｚ）_ｍ （ＩＩ）
（式中、
Ｚは、カルボキシルベンジルオキシ（ＣＢＺ）基またはアミノ酸残基であり；
Ｇｌｎは、グルタミンアミノ酸残基であり；
各Ｌは、独立して、１～２０個の炭素原子の直鎖または分枝鎖のリンカーであり、ここで、該炭素原子の１つまたは複数は、任意選択でかつ独立して、窒素原子、酸素原子または硫黄原子で置き換えられ得、ここで、各炭素原子および各窒素原子は、任意選択で置換され得るか；または各Ｌは、任意選択でかつ独立して、アミノ酸残基であり；
ｍは、０～５の整数であり；
ｎは、０～５の整数であり；
Ｙは、機能性物質である）
のうちの１つに記載のものである、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記アシル供与体基質を含む前記機能性物質が、式（Ｉ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり；各Ｌは、独立して、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）（－Ｏ（（ＣＨ_２）_２）－）、エチルアミン（－ＮＨ（（ＣＨ_２）_２）－）またはプロピルアミン（－ＮＨ（（ＣＨ_２）_３）－）であり；ｎは、０、１、２、３、４または５である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記アシル供与体基質を含む前記機能性物質が、式（Ｉ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり、Ｌは、アミノ酸である、項目７に記載の方法。
（項目１０）
Ｌが、Ｇｌｙであり；ｍが、１であり；ｎが、０である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
Ｌが、Ｇｌｙであり；ｍが、１であり；ｎが、１である、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記アシル供与体基質を含む前記機能性物質が、式（ＩＩ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり；ｍは、１であり；ｎは、１、２または３であり；少なくとも１つのＬは、Ｇｌｙである、項目７に記載の方法。
（項目１３）
前記アシル供与体基質が、式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）：
（Ｚ）_ｍ－Ｇｌｎ－（Ｌ）_ｎ－（Ｘ） （ＩＩＩ）
（Ｘ）－（Ｌ）_ｎ－Ｇｌｎ－（Ｚ）_ｍ （ＩＶ）
（式中、
Ｚは、カルボキシルベンジルオキシ（ＣＢＺ）基またはアミノ酸残基であり；
Ｇｌｎは、グルタミンアミノ酸残基であり；
各Ｌは、独立して、１～２０個の炭素原子の直鎖または分枝鎖のリンカーであり、ここで、該炭素原子のうちの１つまたは複数は、任意選択でかつ独立して、窒素原子、酸素原子または硫黄原子で置き換えられ得、ここで、各炭素原子および各窒素原子は、任意選択で置換され得るか；または各Ｌは、任意選択でかつ独立して、アミノ酸残基であり；
ｍは、０～５の整数であり；
ｎは、０～５の整数であり；
Ｘは、反応基である）
のうちの１つに記載のものである、項目２に記載の方法。
（項目１４）
前記アシル供与体基質が、式（ＩＩＩ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり；各Ｌは、独立して、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）（－Ｏ（（ＣＨ_２）_２）－）、エチルアミン（－ＮＨ（（ＣＨ_２）_２）－）またはプロピルアミン（－ＮＨ（（ＣＨ_２）_３）－）であり；ｎは、０、１、２、３、４または５である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記アシル供与体基質が、式（ＩＩＩ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり、１つまたは複数のＬは、アミノ酸である、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
Ｌが、Ｇｌｙであり；ｍが、１であり；ｎが、１である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
ｍが、１であり；ｎが、０である、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記アシル供与体基質が、式（ＩＶ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり；ｍは、１であり；ｎは、１、２または３であり；少なくとも１つのＬは、Ｇｌｙである、項目１３に記載の方法。
（項目１９）
Ｘが、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメタノール（ＢＣＮ）、

【化5】

ｔｒａｎｓ－シクロオクテン（ＴＣＯ）、アジド（Ｎ_３）、アルキン、テトラジンメチルシクロプロペン、ノルボルネン、ヒドラジド／ヒドラジンおよびアルデヒドからなる群より選択される反応基である、項目１３に記載の方法。
（項目２０）
前記治療薬が、抗体もしくはその抗原結合部分、化学療法剤、薬剤、放射性剤、細胞傷害剤、抗生物質、小分子、核酸またはポリペプチドである、項目１または項目２に記載の方法。
（項目２１）
前記診断薬が、フルオロフォア、蛍光色素、放射性核種または酵素である、項目１または項目２に記載の方法。
（項目２２）
前記免疫グロブリンが、前記Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基および該Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基を含む２つのアミノ酸残基を該Ｃ末端リジンの後に有する、項目１または項目２に記載の方法。
（項目２３）
前記Ｃ末端リジンの後の前記１番目のアミノ酸残基が、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンを除く任意のアミノ酸残基であり；該Ｃ末端リジンの後の前記２番目のアミノ酸残基が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記Ｃ末端リジンの後の前記１番目のアミノ酸残基が、リジンまたはアルギニンである、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記免疫グロブリンが、前記Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基、該Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基および該Ｃ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基を含む３つのアミノ酸残基を該Ｃ末端リジンの後に有し、ここで、該Ｃ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される、項目１または項目２に記載の方法。
（項目２６）
前記免疫グロブリンが、前記Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基、該Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基、該Ｃ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基および該Ｃ末端リジンの後の４番目のアミノ酸残基を含む４つのアミノ酸残基を該Ｃ末端リジンの後に有し、ここで、該Ｃ末端リジンの後の該４番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される、項目１または項目２に記載の方法。
（項目２７）
前記免疫グロブリンが、前記Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基、該Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基、該Ｃ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基、該Ｃ末端リジンの後の４番目のアミノ酸残基および該Ｃ末端リジンの後の５番目のアミノ酸残基を含む５つのアミノ酸残基を該Ｃ末端リジンの後に有し、ここで、該Ｃ末端リジンの後の該５番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される、項目１または項目２に記載の方法。
（項目２８）
前記免疫グロブリンが、前記Ｃ末端リジンの後に９つ未満のアミノ酸残基を有し、ここで、該Ｃ末端リジンの後の最後のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される、項目１または項目２に記載の方法。
（項目２９）
前記免疫グロブリンが、前記Ｃ末端リジンの後に１３個未満のアミノ酸残基を有し、ここで、該Ｃ末端リジンの後の最後のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される、項目１または項目２に記載の方法。
（項目３０）
前記微生物トランスグルタミナーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓの微生物トランスグルタミナーゼである、項目１または項目２に記載の方法。
（項目３１）
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ_１免疫グロブリンである、項目１または項目２に記載の方法。
（項目３２）
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３またはＩｇＧ_４免疫グロブリンである、項目１または項目２に記載の方法。
（項目３３）
前記免疫グロブリンが、尾部を含まない、ＩｇＡ_１、ＩｇＡ_２またはＩｇＭ免疫グロブリンである、項目１または項目２に記載の方法。
（項目３４）
前記免疫グロブリンが、ＩｇＤまたはＩｇＥ免疫グロブリンである、項目１または項目２に記載の方法。
（項目３５）
前記免疫グロブリンが、ヒト免疫グロブリンまたはヒト化免疫グロブリンである、前記の項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記免疫グロブリンが、キメラ免疫グロブリンまたは非ヒト免疫グロブリンである、前記の項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記免疫グロブリンが、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む、前記の項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
機能性物質と免疫グロブリンの比が、１：１～２：１である、前記の項目のいずれかに記載の方法。
（項目３９）
免疫グロブリンおよび機能性物質を含む、結合体化された免疫グロブリンであって、ここで、
ａ）該免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後に少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、
ｂ）該機能性物質は、アシル供与体基質を含み、該アシル供与体基質は、グルタミン残基を含み、
ｃ）該機能性物質は、治療薬または診断薬であり、
該免疫グロブリンの該Ｃ末端リジンは、該機能性物質の該アシル供与体基質の該グルタミン残基に結合体化されている、結合体化された免疫グロブリン。
（項目４０）
免疫グロブリンおよび機能性物質を含む、結合体化された免疫グロブリンであって、ここで、
ａ）該免疫グロブリンは、Ｃ末端リジンの後に少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、
ｂ）該Ｃ末端リジンは、アシル供与体基質上のグルタミン残基に結合体化され、該アシル供与体基質は、反応基をさらに含み、
ｃ）該反応基は、機能性物質に結合体化され、該機能性物質は、治療薬または診断薬である、
結合体化された免疫グロブリン。
（項目４１）
前記Ｃ末端リジンが、前記免疫グロブリンの重鎖上のリジン４４７（Ｋ４４７）である、項目３９または項目４０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目４２）
前記免疫グロブリンが、前記Ｃ末端リジンの後に１つのアミノ酸残基を含み、該Ｃ末端リジンの後の該１つのアミノ酸残基は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミンまたはヒスチジンである、項目３９または項目４０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目４３）
前記免疫グロブリンが、前記Ｃ末端リジンの後に１つのアミノ酸残基を含み、該Ｃ末端リジンの後の該１つのアミノ酸残基は、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジンまたはアルギニンではない、項目３９または項目４０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目４４）
前記アシル供与体基質を含む前記機能性物質が、式（Ｉ）または（ＩＩ）：
（Ｚ）_ｍ－Ｇｌｎ－（Ｌ）_ｎ－（Ｙ） （Ｉ）
（Ｙ）－（Ｌ）_ｎ－Ｇｌｎ－（Ｚ）_ｍ （ＩＩ）
（式中、
Ｚは、カルボキシルベンジルオキシ（ＣＢＺ）基またはアミノ酸残基であり；
Ｇｌｎは、グルタミンアミノ酸残基であり；
各Ｌは、独立して、１～２０個の炭素原子の直鎖または分枝鎖のリンカーであり、ここで、該炭素原子のうちの１つまたは複数は、任意選択でかつ独立して、窒素原子、酸素原子または硫黄原子で置き換えられ得、ここで、各炭素原子および各窒素原子は、任意選択で置換され得るか；または各Ｌは、任意選択でかつ独立して、アミノ酸残基であり；
ｍは、０～５の整数であり；
ｎは、０～５の整数であり；
Ｙは、機能性物質である）
のうちの１つに記載のものである、項目３９に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目４５）
前記アシル供与体基質を含む前記機能性物質が、式（Ｉ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり；Ｌは、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）（－Ｏ（（ＣＨ_２）_２）－）、エチルアミン（－ＮＨ（（ＣＨ_２）_２）－）またはプロピルアミン（－ＮＨ（（ＣＨ_２）_３）－）であり；ｎは、０、１、２、３、４または５である、項目４４に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目４６）
前記アシル供与体基質を含む前記機能性物質が、式（Ｉ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり、Ｌは、アミノ酸である、項目４４に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目４７）
ｍが、１であり；ｎが、０である、項目４６に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目４８）
Ｌが、Ｇｌｙであり；ｍが、１であり；ｎが、１である、項目４６に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目４９）
前記アシル供与体基質を含む前記機能性物質が、式（ＩＩ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり；ｍは、１であり；ｎは、１、２または３であり；少なくとも１つのＬは、Ｇｌｙである、項目４４に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目５０）
前記アシル供与体基質が、式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）：
（Ｚ）_ｍ－Ｇｌｎ－（Ｌ）_ｎ－（Ｘ） （ＩＩＩ）
（Ｘ）－（Ｌ）_ｎ－Ｇｌｎ－（Ｚ）_ｍ （ＩＶ）
（式中、
Ｚは、カルボキシルベンジルオキシ（ＣＢＺ）基またはアミノ酸残基であり；
Ｇｌｎは、グルタミンアミノ酸残基であり；
各Ｌは、独立して、１～２０個の炭素原子の直鎖または分枝鎖のリンカーであり、ここで、該炭素原子のうちの１つまたは複数は、任意選択でかつ独立して、窒素原子、酸素原子または硫黄原子で置き換えられ得、ここで、各炭素原子および各窒素原子は、任意選択で置換され得るか；または各Ｌは、任意選択でかつ独立して、アミノ酸残基であり；
ｍは、０～５の整数であり；
ｎは、０～５の整数であり；
Ｘは、反応基である）
のうちの１つに記載のものである、項目４０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目５１）
前記アシル供与体基質が、式（ＩＩＩ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり；各Ｌは、独立して、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）（－Ｏ（（ＣＨ_２）_２）－）、エチルアミン（－ＮＨ（（ＣＨ_２）_２）－）またはプロピルアミン（－ＮＨ（（ＣＨ_２）_３）－）であり；ｎは、０、１、２、３、４または５である、項目５０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目５２）
前記アシル供与体基質が、式（ＩＩＩ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり、Ｌは、アミノ酸である、項目５０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目５３）
ｍが、１であり；ｎが、０である、項目５２に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目５４） Ｌが、Ｇｌｙであり；ｍが、１であり；ｎが、１である、項目５２に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目５５）
前記アシル供与体基質が、式（ＩＶ）に記載のものであり、式中、Ｚは、ＣＢＺ基であり；ｍは、１であり；ｎは、１、２または３であり；少なくとも１つのＬは、Ｇｌｙである、項目５０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目５６）
Ｘが、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメタノール（ＢＣＮ）、

【化6】

ｔｒａｎｓ－シクロオクテン（ＴＣＯ）、アジド（Ｎ_３）、アルキン、テトラジンメチルシクロプロペン、ノルボルネン、ヒドラジド／ヒドラジンおよびアルデヒドからなる群より選択される反応基である、項目５０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目５７）
前記治療薬が、抗体もしくはその抗原結合部分、化学療法剤、薬剤、放射性剤、細胞傷害剤、抗生物質、小分子、核酸またはポリペプチドである、項目３９または項目４０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目５８）
前記診断薬が、フルオロフォア、蛍光色素、放射性核種または酵素である、項目３９または項目４０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目５９）
前記免疫グロブリンが、前記Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基および該Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基を含む２つのアミノ酸残基を該Ｃ末端リジンの後に有する、項目３９または項目４０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目６０）
前記Ｃ末端リジンの後の前記１番目のアミノ酸残基が、アスパラギン酸、グルタミン酸またはプロリンを除く任意のアミノ酸残基であり；該Ｃ末端リジンの後の前記２番目のアミノ酸残基が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される、項目５９に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目６１）
前記Ｃ末端リジンの後の前記１番目のアミノ酸残基が、リジンまたはアルギニンである、項目６０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目６２）
前記免疫グロブリンが、前記Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基、該Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基および該Ｃ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基を含む３つのアミノ酸残基を該Ｃ末端リジンの後に有し、ここで、該Ｃ末端リジンの後の該３番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される、項目３９または項目４０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目６３）
前記免疫グロブリンが、前記Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基、該Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基、該Ｃ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基および該Ｃ末端リジンの後の４番目のアミノ酸残基を含む４つのアミノ酸残基を該Ｃ末端リジンの後に有し、ここで、該Ｃ末端リジンの後の該４番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される、項目３９または項目４０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目６４）
前記免疫グロブリンが、前記Ｃ末端リジンの後の１番目のアミノ酸残基、該Ｃ末端リジンの後の２番目のアミノ酸残基、該Ｃ末端リジンの後の３番目のアミノ酸残基、該Ｃ末端リジンの後の４番目のアミノ酸残基および該Ｃ末端リジンの後の５番目のアミノ酸残基を含む５つのアミノ酸残基を該Ｃ末端リジンの後に有し、ここで、該Ｃ末端リジンの後の該５番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される、項目３９または項目４０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目６５）
前記免疫グロブリンが、前記Ｃ末端リジンの後に９つ未満のアミノ酸残基を有し、ここで、該Ｃ末端リジンの後の最後のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される、項目３９または項目４０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目６６）
前記免疫グロブリンが、前記Ｃ末端リジンの後に１３個未満のアミノ酸残基を有し、ここで、該Ｃ末端リジンの後の最後のアミノ酸残基は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、トレオニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、トリプトファンおよびグリシンからなる群より選択される、項目３９または項目４０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目６７）
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ_１免疫グロブリンである、項目３９または項目４０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目６８）
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３またはＩｇＧ_４免疫グロブリンである、項目３９または項目４０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目６９）
前記免疫グロブリンが、ＩｇＡ_１、ＩｇＡ_２またはＩｇＭ免疫グロブリンである、項目３９または項目４０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目７０）
前記免疫グロブリンが、ＩｇＤまたはＩｇＥ免疫グロブリンである、項目３９または項目４０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目７１）
前記免疫グロブリンが、ヒト免疫グロブリンまたはヒト化免疫グロブリンである、項目３９または項目４０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目７２）
前記免疫グロブリンが、キメラ免疫グロブリンまたは非ヒト免疫グロブリンである、項目３９または項目４０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目７３）
前記免疫グロブリンが、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む、項目３９または項目４０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目７４）
前記免疫グロブリンの前記２本の重鎖の間に分子内架橋が存在しない、項目７３に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目７５）
機能性物質と免疫グロブリンの比が、１：１～２：１である、項目３９または項目４０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目７６）
前記機能性物質が、抗体またはその抗原結合部分であり、前記免疫グロブリンおよび該機能性物質は、同じ抗原に結合するか、または異なる抗原に結合する、項目３９または項目４０に記載の結合体化された免疫グロブリン。
（項目７７）
項目３９～７６のいずれか１項に記載の結合体化された免疫グロブリンをコードする、核酸。
（項目７８）
項目７７に記載の核酸を含む、プラスミド。
（項目７９）
項目７８に記載のプラスミドを含む、単離された細胞。
（項目８０）
項目３９～７６のいずれか１項に記載の結合体化された免疫グロブリンおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目８１）
項目１～３８のいずれか１項に記載の方法によって作製される、結合体化された免疫グロブリン。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【配列表】

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