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特開2022-23853低分子ＲＮＡ、並びに線維増殖性疾患及び／又は症候群の予防及び／又は治療におけるその応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022023853
(43)【公開日】2022-02-08
(54)【発明の名称】低分子ＲＮＡ、並びに線維増殖性疾患及び／又は症候群の予防及び／又は治療におけるその応用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20220201BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220201BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220201BHJP
A61P 31/06 20060101ALI20220201BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220201BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20220201BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20220201BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220201BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20220201BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20220201BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20220201BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20220201BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20220201BHJP
A61P 9/06 20060101ALI20220201BHJP
A61P 25/32 20060101ALI20220201BHJP
A61P 25/30 20060101ALI20220201BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20220201BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20220201BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20220201BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20220201BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20220201BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20220201BHJP
A61K 8/73 20060101ALI20220201BHJP
A61K 8/96 20060101ALI20220201BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20220201BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220201BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20220201BHJP
A61P 37/00 20060101ALI20220201BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20220201BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/63 Z
A61P43/00 105
A61P43/00 121
A61P31/06
A61P29/00 101
A61P9/00
A61P11/00
A61P35/00
A61P9/10
A61P9/12
A61P29/00
A61P31/12
A61P3/00
A61P3/10
A61P9/06
A61P25/32
A61P25/30
A61P1/18
A61P13/12
A61P17/00
A61P3/06
A61P7/00
A61K31/7088
A61K8/73
A61K8/96
A61Q19/08
A61P35/02
A61P27/02
A61P37/00
A61P25/28
【審査請求】有
【請求項の数】16
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021160557
(22)【出願日】2021-09-30
(62)【分割の表示】P 2019553481の分割
【原出願日】2017-03-30
(31)【優先権主張番号】201710219899.X
(32)【優先日】2017-03-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】506032129
【氏名又は名称】中国医学科学院基礎医学研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】蒋 澄宇
(72)【発明者】
【氏名】杜 澗超
(72)【発明者】
【氏名】梁 竹
(72)【発明者】
【氏名】許 剣涛
(72)【発明者】
【氏名】趙 妍
(57)【要約】 （修正有）
【課題】イワベンケイ由来の低分子ＲＮＡ、さらに、線維増殖性疾患及び／又は症候群を予防及び治療するためのその用途を提供する。
【解決手段】特定の配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む又は発現する核酸発現ベクター、該ポリヌクレオチドを含む化粧品組成物、並びにポリヌクレオチドを含む肺、心血管系、肝臓、膵臓、腎臓、脾臓、眼、神経系、骨髄、皮膚等の線維増殖性疾患及び／又は症候群を予防及び又は治療するための医薬組成物を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】特定の配列又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む又は発現する核酸発現ベクター、該ポリヌクレオチドを含む化粧品組成物、並びにポリヌクレオチドを含む肺、心血管系、肝臓、膵臓、腎臓、脾臓、眼、神経系、骨髄、皮膚等の線維増殖性疾患及び／又は症候群を予防及び又は治療するための医薬組成物を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６及び１７のいずれか１つに示される配列、又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項2】
前記配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６及び１７から選ばれる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項3】
前記配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、３、１０、１３及び１６から選ばれる、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項4】
前記配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（ＧＵＡＵＧＵＡＡＡＣＡＵＣＣＵＣＧＡＣＵＧＧＡＡＧＣＵ）である、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項5】
前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１～４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項6】
前記ポリヌクレオチドは、低分子ＲＮＡである、請求項１～５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項7】
前記ポリヌクレオチドの長さは、１２～４０ヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項8】
前記ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖である、請求項１～７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項9】
前記ポリヌクレオチドは、一本鎖である、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項10】
前記ポリヌクレオチドは、合成された又はヒト人工染色体ベクターで発現されたものである、請求項１～９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む又は発現する核酸発現ベクター。
【請求項12】
請求項１～１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、化粧品組成物。
【請求項13】
請求項１～１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、線維増殖性疾患及び／又は症候群を予防及び又は治療するための医薬組成物。
【請求項14】
前記線維増殖性疾患及び／又は症候群は、肺、心血管系、肝臓、膵臓、腎臓、脾臓、眼、神経系、骨髄及び皮膚の線維増殖性疾患及び／又は症候群から選ばれる請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記線維増殖性疾患及び／又は症候群は、珪肺症、石綿肺及び炭鉱夫塵肺を含む無機粉塵職業病、農夫肺、空調肺、加湿器肺、鳥飼育者肺及び砂糖きび肺を含む有機粉塵・過敏性肺炎；抗生物質、非ステロイド性抗炎症薬、心血管薬、抗腫瘍薬、経口血糖降下薬、及びモルヒネ系薬物から選ばれる医薬／治療関連疾患；結核、ウイルス性肺炎、感染性肺嚢胞などの感染症；心不全、先天性心疾患、成人呼吸窮迫症候群、慢性心不全、移植拒絶反応に関連する肺疾患を含む続発性肺疾患；特発性間質性肺炎、器質化肺炎を伴う閉塞性細気管支炎、肺リンパ管平滑筋腫を含む原発性肺疾患；全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、進行性全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、混合性結合組織病に関連する肺疾患を含むコラーゲン血管疾患に関連する肺疾患；びまん性肺胞出血症候群、肺胞蛋白症、好酸球性肺炎、肺血管炎、リンパ球性間質性肺炎、壊死性結節性肉芽腫、家族性肺線維症を含む肺胞充填性病変；
心筋梗塞後の代替性及び反応性線維化を含む虚血性心疾患；高血圧性心疾患；ウイルス性心筋炎を含む炎症性心筋症；ヘモクロマトーシス型心筋症、アミロイドーシス型心筋症、グリコーゲン蓄積性心筋症、糖尿病性心筋症を含む代謝性心筋症；ケシャン病；拡張型心筋症；肥大型心筋症、制限型心筋症；不整脈原性右室心筋症；
Ｂ型、Ｃ型、及びＤ型ウイルス性肝炎を含むウイルス性肝硬変；住血吸虫性肝硬変；アルコール性肝硬変；原発性胆汁性肝硬変、続発性肝内胆石症、門脈周囲の炎症を含む胆汁性肝硬変；肝レンズ核変性症、ヘモクロマトーシスを含む代謝性肝硬変；有機リン中毒、四塩化炭素中毒、肝毒性薬剤例えばイソニアジド、テトラサイクリン、クロルプロマジン中毒を含む中毒性肝硬変；栄養失調性肝硬変；慢性うっ血性心不全を含む心原性肝硬変；
急性膵炎；膵管閉塞；慢性アルコール中毒；Ｏｄｄｉ括約筋機能異常；膵虚血；
高血圧を含む血管腎線維増殖性疾患及び／又は症候群；糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、強皮症、腎移植拒絶を含む免疫腎線維増殖性疾患及び／又は症候群；腎盂腎炎、腎結石などの感染性腎線維増殖性疾患及び／又は症候群；高脂血症、糖尿病、高尿酸血症、高カルシウム尿症を含む代謝性腎線維増殖性疾患及び／又は症候群；
脾臓線維増殖性疾患；
眼の外傷・術後の眼線維増殖性疾患及び／又は症候群、増殖性糖尿病網膜線維症；
脊髄外傷後の線維増殖性疾患及び／又は症候群、脳卒中瘢痕形成、アルツハイマー病；特発性・薬物誘発性骨髄線維症、真性赤血球増加症、慢性骨髄性白血病及びホジキン病；
粘膜線維症、瘢痕、ケロイド、及び皮膚肥厚を含む皮膚線維増殖性疾患及び／又は症候群から選ばれる、請求項１４に記載の医薬組成物。
心筋梗塞後の代替性及び反応性線維化を含む虚血性心疾患；高血圧性心疾患；ウイルス性心筋炎を含む炎症性心筋症；ヘモクロマトーシス型心筋症、アミロイドーシス型心筋症、グリコーゲン蓄積性心筋症、糖尿病性心筋症を含む代謝性心筋症；ケシャン病；拡張型心筋症；肥大型心筋症、制限型心筋症；不整脈原性右室心筋症；
Ｂ型、Ｃ型、及びＤ型ウイルス性肝炎を含むウイルス性肝硬変；住血吸虫性肝硬変；アルコール性肝硬変；原発性胆汁性肝硬変、続発性肝内胆石症、門脈周囲の炎症を含む胆汁性肝硬変；肝レンズ核変性症、ヘモクロマトーシスを含む代謝性肝硬変；有機リン中毒、四塩化炭素中毒、肝毒性薬剤例えばイソニアジド、テトラサイクリン、クロルプロマジン中毒を含む中毒性肝硬変；栄養失調性肝硬変；慢性うっ血性心不全を含む心原性肝硬変；
急性膵炎；膵管閉塞；慢性アルコール中毒；Ｏｄｄｉ括約筋機能異常；膵虚血；
高血圧を含む血管腎線維増殖性疾患及び／又は症候群；糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、強皮症、腎移植拒絶を含む免疫腎線維増殖性疾患及び／又は症候群；腎盂腎炎、腎結石などの感染性腎線維増殖性疾患及び／又は症候群；高脂血症、糖尿病、高尿酸血症、高カルシウム尿症を含む代謝性腎線維増殖性疾患及び／又は症候群；
脾臓線維増殖性疾患；
眼の外傷・術後の眼線維増殖性疾患及び／又は症候群、増殖性糖尿病網膜線維症；
脊髄外傷後の線維増殖性疾患及び／又は症候群、脳卒中瘢痕形成、アルツハイマー病；特発性・薬物誘発性骨髄線維症、真性赤血球増加症、慢性骨髄性白血病及びホジキン病；
粘膜線維症、瘢痕、ケロイド、及び皮膚肥厚を含む皮膚線維増殖性疾患及び／又は症候群から選ばれる、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項16】
さらに、他の抗線維化剤を含有する請求項１３～１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項17】
皮膚若返り美容法であって、それを必要とする対象に請求項１～１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１１に記載のベクター、請求項１２に記載の化粧品組成物、又は請求項１３～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与する、美容法。
【請求項18】
細胞を請求項１～１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１１に記載のベクター、請求項１２に記載の化粧品組成物、又は請求項１３～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物と接触させることを含む、α－ＳＭＡ、フィブロネクチン、ＣＯＬ１Ａ１及びＰＡＩ－１から選択される、１つ又は複数の線維化関連遺伝子の発現を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【相互参照】
【0001】
本出願は、２０１７年３月２９日に中国特許庁へ提出された、発明の名称が「低分子ＲＮＡ並びに線維増殖性疾患及び／又は症候群の予防及び／又は治療におけるその応用」である中国特許出願（出願番号201710219899.X）に基づき優先権を主張し、その全内容は、援用により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【0002】
本発明は、イワベンケイ由来の低分子ＲＮＡに関し、さらに、線維増殖性疾患及び／又は症候群の予防及び／又は治療におけるその用途に関する。
【背景技術】
【0003】
線維化は、線維芽細胞の増殖及び炎症性損傷、組織構造破壊を伴う大量の細胞外マトリックスの凝集を特徴とする一連の疾患の末期変化であり、つまり、正常組織が損傷された後の異常な修復により構造の異常をもたらすことである。肺線維症は、有害物質、自己免疫疾患、医薬品の副作用、感染症、重篤な外傷などの多種の異なる原因によって引き起こされる肺炎、肺泡の持続性損傷、細胞外マトリックスの破壊－修復－再構築の繰り返し及び過剰沈着により、正常な肺組織の変化、機能の喪失を引き起こす病気である。現在、線維化（肺線維症を含む）は、特異的、安全で効果的な治療法が依然として発見されていない。
【0004】
肺線維症患者の大多数は、原因不明（特発性肺線維症）であり、これらの一連の疾患は、特発性間質性肺炎（ＩＩＰ）、間質性肺疾患の１類である。肺線維症は、人間の呼吸機能に深刻な影響を及ぼし、乾性咳嗽、進行性呼吸困難（意識的に息が吸えなくなる）として現れ、且つ病気及び肺損傷の重症度に従って、患者の呼吸機能が悪化する。特発性肺線維症の発生率及びの死亡率は年々増加し、診断後の平均生存期間はわずか２．８年である。
【0005】
肺線維症患者は、肺胞が徐々に繊維状物質に置き換えられ、肺組織の硬化・肥厚をもたらし、肺のガス交換能が徐々に失われ、患者の異なる程度の低酸素による呼吸困難を生じ、最終的に呼吸不全で死亡する。肺線維症は、呼吸器疾患の４つの主要な疾患の１つであり、病因が複雑で、発症メカニズムが不明で、現在、既知の肺線維症の治療用医薬品及び方法は非常に限られており、且つ治療効果が不十分であり、予後が非常に悪く、５年生存率がわずか５０％である。
【0006】
現在、肺線維症の治療では、主に糖質コルチコイド、免疫抑制剤、例えば、プレドニゾン、シクロホスファミド、コルヒチンなどを採用する。近年の臨床実践により、臓器線維症に対して糖質コルチコイド、抗生物質及び免疫抑制剤を使用することで肺胞の早期炎症を軽減し、臨床症状を軽減できるが、線維症の発症が抑制されなく、ホルモン及び抗生物質の長期高用量投与は、深刻な合併症を引き起こすだけでなく、線維症の進行を促進させることが確認されている。酸素投与が含まれる他の治療法は、緩和作用を奏すだけであり、根本的に問題を解決することはできない。さらに、極端な場合の肺移植は、多くの適用条件によっても制限され、特に末期肺疾患の患者において移植成功率が非常に限られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
病因及び発症メカニズムは不明であるため、線維化の治療は、ずっと医薬分野の難しい問題の１つであり、新たな医薬品が研究・開発されているが、満足できる治療又は予防用医薬品及び有効な治療法が発見されていない。
従って、効果的な線維化治療又は予防用医薬品に対する大きなニーズは、依然として存在する。
従って、効果的な線維化治療又は予防用医薬品に対する大きなニーズは、依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、イワベンケイ由来の幾つかのｓＲＮＡが細胞モデルにおける線維化関連遺伝子発現を効果的に阻害し、及び／又は動物モデルにおけるマウスの肺線維症を効果的に軽減できることを意外に見出した。本発明は、この知見をもとになされたものである。
【0009】
一態様では、本発明は、
Ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６及び１７のいずれか１つに示される配列、又はその相補的配列、
Ｂ）線維化を予防／治療するための能力をもつ、Ａ）に示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％又は９８％の同一性を有する配列、
Ｃ）線維化を予防／治療するための能力をもつ、ストリンジェントな条件下でＡ）に示される配列とハイブリダイズする配列、
Ｄ）線維化を予防／治療するための能力をもつ、Ａ）に示される配列において１つ又は複数のヌクレオチドが付加、欠失、置換された配列、又は
Ｅ）線維化を予防／治療するための能力をもつ、Ａ）、Ｂ）、Ｃ）又はＤ）に示される配列の前駆体または修飾された変異体、を含むポリヌクレオチドを提供する。
Ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６及び１７のいずれか１つに示される配列、又はその相補的配列、
Ｂ）線維化を予防／治療するための能力をもつ、Ａ）に示される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％又は９８％の同一性を有する配列、
Ｃ）線維化を予防／治療するための能力をもつ、ストリンジェントな条件下でＡ）に示される配列とハイブリダイズする配列、
Ｄ）線維化を予防／治療するための能力をもつ、Ａ）に示される配列において１つ又は複数のヌクレオチドが付加、欠失、置換された配列、又は
Ｅ）線維化を予防／治療するための能力をもつ、Ａ）、Ｂ）、Ｃ）又はＤ）に示される配列の前駆体または修飾された変異体、を含むポリヌクレオチドを提供する。
【0010】
別の態様では、本発明は、上記の第１の態様に記載のポリヌクレオチドを含む、又は発現する核酸発現ベクターを提供する。
【0011】
第３の態様では、本発明は、上記の第１の態様に記載のポリヌクレオチド又は第２の態様に記載の核酸発現ベクターを含む医薬組成物を提供する。
【0012】
第４の態様では、本発明は、線維増殖性疾患及び／又は症候群を予防及び／又は治療する方法において、それを必要とする対象に本発明の第１の態様に記載のポリヌクレオチド、第２の態様に記載のベクター、第３の態様に記載の医薬組成物、及び／又は生体内での本発明に係るポリヌクレオチドの発生を内因的に活性化させるエリシターを投与する、ことを含む方法を提供する。１つの実施形態において、前記方法は、生体内で内因的に活性化させて本発明の第１の態様に記載のポリヌクレオチドを発生させる。それに対応して、本発明は、さらに、前記用途に用いられるポリヌクレオチド、ベクター、医薬組成物、及び内因性エリシター、並びに線維増殖性疾患及び／又は症候群を予防及び／又は治療するための医薬品の製造におけるそれらの用途を提供する。
【0013】
さらに、それに対応して、第５の態様では、本発明は、さらに生体内での本発明に係るポリヌクレオチドの発生を内因的に活性化させるエリシターを提供する。
【0014】
第６の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に記載のポリヌクレオチドを製造する方法において、本発明に係るポリヌクレオチドを合成する、及び／又は核酸発現ベクターから発現させること、及び／又はその能力を持つ細胞の本発明のポリヌクレオチの発現を内因的に活性化すること、を含む製造方法を提供する。
【発明の効果】
【0015】
以上のいずれか１つの態様によれば、本発明は、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質レベルでの１つ又は複数の線維化関連遺伝子の発現の効果的に阻害すること、及び／又は線維増殖性疾患及び／又は症候群の効果的に予防及び／又は治療すること、及び／又は以上の效果の１つ又は複数を達成できるポリヌクレオチドを提供すること、の少なくとも１つの効果を奏することができる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
図１及び図２は、ＴＧＦ－β１誘導性ＭＲＣ－５線維化細胞モデルにおけるイワベンケイ由来のｓＲＮＡ（ＨＪＴ ｓＲＮＡ）によるα－ＳＭＡ、フィブロネクチン、ＣＯＬ１Ａ１及びＰＡＩ－１の４つの線維化関連遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルのスクリーニング結果を示す。図１及び図２は、それぞれ、４８時間前にＮＣ ｓＲＮＡ及びＨＪＴ ｓＲＮＡをトランスフェクトし、ＭＲＣ－５をＴＧＦ－β１で刺激し、４８時間後、関連指標を検出する実験（予防群）、並びにＭＲＣ－５をＴＧＦ－β１で刺激し、３時間後、ＮＣ ｓＲＮＡ及びＨＪＴ ｓＲＮＡをトランスフェクトし、ＴＧＦ－β１刺激後７２時間で関連指標を検出する実験（治療群）の結果を示す。
【0017】
図３～図６は、ＴＧＦ－β１刺激によるＭＲＣ－５線維化細胞モデルにおいて、選ばれる４つのイワベンケイ由来のｓＲＮＡがいずれもα－ＳＭＡ、フィブロネクチン、ＣＯＬ１Ａ１、ＰＡＩ－１、ＴＧＦ－β及びＳＭＡＤ４のｍＲＮＡ発現レベルを効果的に低減させることができる。具体的には、図３～図６は、ＭＲＣ－５線維化細胞モデルにおけるＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ａ２、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ３及びｐｐｅ－ｍｉＲ－１６９ｃの抗線維化効果を順に示す。
【0018】
図７～図９は、ブレオマイシン誘発マウス肺線維症モデルにおいて、選ばれる４つのイワベンケイｓＲＮＡがいずれもマウスの死亡率を効果的に低下させ、マウスの体重減少の傾向を大幅に遅らせ、マウス肺線維化の症状を軽減させることができる結果を示す。
【0019】
具体的には、図７は、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ａ２がブレオマイシンによるマウスの死亡率を効果的に低減させるとともに、マウス体重の減少を遅らせ（図７Ａを参照）、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ３がブレオマイシンによるマウスの死亡率を効果的に低減させるとともに、マウス体重の減少を遅らせ（図７Ｂを参照）、ｐｐｅ－ｍｉＲ－１６９ｃがブレオマイシンによるマウスの死亡率を効果的に低減させるとともに、マウス体重の減少を遅らせた（図７Ｃを参照）ことを示す。
【0020】
図８は、ブレオマイシン誘発マウス肺線維症モデルにおけるＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の役割を示す。
【0021】
図９は、ブレオマイシンによる肺線維症マウスモデルにおいて、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７が肺組織線維化の症状を有効的に軽減させ、コラーゲン、フィブロネクチン及びα－ＳＭＡの発現を減少させることを示す。具体的には、図９Ａは、マウス右肺のヒドロキシプロリン含有量（μｇ／右肺）を示し、図９Ｂは、マウス肺組織に対するヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）を示し、図９Ｃは、マッソン染色によるα－ＳＭＡ、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）及びＣＯＬ３Ａ１の免疫組織化学的染色を施した結果を示し、図９Ｄは、図９Ｃに対応する病理統計学的分析結果を示す。
【0022】
図１０～図１２は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイの結果を示す。具体的には、図１０は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイによるＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７の標的遺伝子の検証を示し、図１１は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイによるＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ａ２の標的遺伝子の検証を示し、図１２は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイによるＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ３の標的遺伝子の検証を示す。
【0023】
図１３～図１４は、ＴＧＦ－β１で刺激されたＭＲＣ－５線維化細胞モデルにおけるα－ＳＭＡ、フィブロネクチンの２つの線維化関連遺伝子のタンパク質発現レベルのイワベンケイ由来のｓＲＮＡ（ＨＪＴ ｓＲＮＡ）によるスクリーニング結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0024】
以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明を何ら限定するものではなく、本発明の示唆に基づくいずれかの変更も本発明の保護範囲に含まれる。
【0025】
通常、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及び他の低分子ノンコーディングＲＮＡは、区別せずに低分子ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）と呼ばれる。特に明記しない限り、本明細書では、「低分子ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）」という用語は、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを含む各種の低分子ノンコーディングＲＮＡを指す。
【0026】
本明細書では、低分子ＲＮＡは、非天然型であってもよく、例えば、合成された、又は人工染色体ベクターで発現されたものである。「非天然型」という用語は、標的物質が自然環境で天然に存在しないことを意味し、これは、前記非天然型の物質が天然に存在する物質と同じ構造及び／又は組成を有することを排除しない。
【0027】
「線維化」という用語は、組織／器官での、線維性結合組織が増加し、実質細胞が減少するプロセス及び状態を指し、複数種の組織／器官で発生する可能性があり、継続的に進行すれば、器官の構造的損傷及び機能退化、さらには臓器不全をもたらし、人間の健康と生命への深刻な脅威につながる。
【0028】
「線維化を予防／治療するための能力」という用語は、標的物質自体が線維化を予防／治療できること、或いはそれに基づいて線維化を予防／治療可能な物質を生成できることを示す。つまり、この能力は、標的物質自体によって直接実現される必要はなく、その標的物質の結果の更なる応用であってもよい。
【0029】
「阻害」という用語は、特定の処置を経て目的とする生理活性を少なくとも一部低下させるか、又は完全に消失させることを意味する。
【0030】
「含む」、「含まれる」、「含有する」という用語は、挙げられた特徴的な要素の以外は、他の特徴的要素を追加してもよい。特に、挙げられた特徴的な要素のみで構成することもできる。
【0031】
１つの態様では、本発明は、
Ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６及び１７のいずれか１つに示される配列、又はその相補的配列、
Ｂ）線維化を予防／治療するための能力をもつ、Ａ）に示される配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列、
Ｃ）線維化を予防／治療するための能力をもつ、ストリンジェントな条件下でＡ）に示される配列とハイブリダイズする配列、
Ｄ）線維化を予防／治療するための能力をもつ、Ａ）に示される配列において１つ又は複数のヌクレオチドが付加、欠失、置換された配列、又は
Ｅ）線維化を予防／治療するための能力をもつ、Ａ）、Ｂ）、Ｃ）又はＤ）に示される配列の前駆体または修飾された変異体、を含むポリヌクレオチドを提供する。
Ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６及び１７のいずれか１つに示される配列、又はその相補的配列、
Ｂ）線維化を予防／治療するための能力をもつ、Ａ）に示される配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列、
Ｃ）線維化を予防／治療するための能力をもつ、ストリンジェントな条件下でＡ）に示される配列とハイブリダイズする配列、
Ｄ）線維化を予防／治療するための能力をもつ、Ａ）に示される配列において１つ又は複数のヌクレオチドが付加、欠失、置換された配列、又は
Ｅ）線維化を予防／治療するための能力をもつ、Ａ）、Ｂ）、Ｃ）又はＤ）に示される配列の前駆体または修飾された変異体、を含むポリヌクレオチドを提供する。
【0032】
１つの実施形態において、Ａ）に示される配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１０、１３及び１６から選ばれる、本発明に係るポリヌクレオチド。
【0033】
他の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡであり、例えば、ＲＮＡであり、好ましくは低分子ＲＮＡである。具体的には、前記ポリヌクレオチドの長さは、１０～５０ヌクレオチド、１２～４０ヌクレオチドであり、例えば、１６～３５又は１８～３０ヌクレオチドであり、より具体的には、上記ポリヌクレオチドの長さは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０ヌクレオチドである。
【0034】
１つの具体的な実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であり、好ましくは、一本鎖である。他の具体的な実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、非天然型であり、例えば、合成された又は人工染色体ベクターで発現されたものである。
【0035】
第２の態様では、本発明は、上記の第１の態様に記載のポリヌクレオチドを含む、又は発現する核酸発現ベクターを提供する。例えば、具体的には、前記核酸発現ベクターは、ＤＮＡであってもよいが、発現されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、ｓＲＮＡであってもよい。
【0036】
第３の態様では、本発明は、第１の態様に記載のポリヌクレオチド、又は第２の態様に記載の核酸発現ベクターを含む医薬組成物を提供する。
【0037】
１つの実施形態において、前記医薬組成物は、さらに、他の抗線維化剤を含む。具体的には、前記他の抗線維化剤は、例えば、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、ベクロメタゾンのような糖質コルチコイド、例えば、シクロホスファミド、アザチオプリン、メトトレキサートのような免疫抑制剤、例えば、アセチルシステイン、カルボシステインのような抗酸化剤、例えば、低分子量ヘパリンのような抗凝固薬、コルヒチン、インターフェロン、ＡＣＥＩ及びスタチン系薬剤のいずれか１つ種又は複数種を選択してもよい。
【0038】
第４の態様では、本発明は、線維増殖性疾患及び／又は症候群を予防及び／又は治療する方法において、それを必要とする対象に本発明に係る第１の態様に記載のポリヌクレオチド、第２の態様に記載のベクター、第３の態様に記載の医薬組成物、及び／又は生体内での本発明に係るポリヌクレオチド的発生を内因的に活性化させるエリシターを投与する、ことを含む方法を提供する。１つの実施形態において、前記方法は、生体内で内因的に活性化させて本発明に係る第１の態様に記載のポリヌクレオチドを発生する。それに対応して、本発明は、さらに、第４の態様の用途に用いられるポリヌクレオチド、ベクター、医薬組成物、及び内因性エリシター、並びに線維増殖性疾患及び／又は症候群を予防及び／又は治療するための医薬品の製造におけるそれらの用途を提供する。
【0039】
１つの実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチド、ベクター、医薬／化粧品組成物は、非侵襲的投与（例えば、表面投与）及び／又は注射投与のために製剤化され、例えば、経消化管、経気道及び／又は注射投与のため、例えば、経口、吸入及び／又は注射投与のために製剤化されている。場合によっては、侵襲的投与経路（例えば、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、腹腔内、標的組織内注射を含む注射による投与）を使用することが好ましく、他の場合には、非侵襲的投与途径を使用することが好ましい。
【0040】
他の実施形態において、前記線維増殖性疾患及び／又は症候群は、肺、心血管系、肝臓、膵臓、腎臓、脾臓、眼、神経系、骨髄及び皮膚の線維増殖性疾患及び／又は症候群から選ばれる。
【0041】
１つの具体的な実施形態において、前記線維増殖性疾患及び／又は症候群は、
珪肺症、石綿肺及び炭鉱夫塵肺を含む無機粉塵職業病；農夫肺、空調肺・加湿器肺、鳥飼育者肺及び砂糖きび肺を含む有機粉塵及び過敏性肺炎；抗生物質、非ステロイド性抗炎症薬、心血管薬、抗腫瘍薬、経口血糖降下薬、及びモルヒネ系薬物から選ばれる医薬／治療関連疾患；結核、ウイルス性肺炎、感染性肺嚢胞などの感染症；心不全、先天性心疾患、成人呼吸窮迫症候群、慢性心不全、移植拒絶反応に関連する肺疾患を含む続発性肺疾患；特発性間質性肺炎、器質化肺炎を伴う閉塞性細気管支炎、肺リンパ管平滑筋腫を含む原発性肺疾患；全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、進行性全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、混合性結合組織病に関連する肺疾患を含むコラーゲン血管疾患に関連する肺疾患；びまん性肺胞出血症候群、肺胞蛋白症、好酸球性肺炎、肺血管炎、リンパ球性間質性肺炎、壊死性結節性肉芽腫、家族性肺線維症を含む肺胞充填性病変；
珪肺症、石綿肺及び炭鉱夫塵肺を含む無機粉塵職業病；農夫肺、空調肺・加湿器肺、鳥飼育者肺及び砂糖きび肺を含む有機粉塵及び過敏性肺炎；抗生物質、非ステロイド性抗炎症薬、心血管薬、抗腫瘍薬、経口血糖降下薬、及びモルヒネ系薬物から選ばれる医薬／治療関連疾患；結核、ウイルス性肺炎、感染性肺嚢胞などの感染症；心不全、先天性心疾患、成人呼吸窮迫症候群、慢性心不全、移植拒絶反応に関連する肺疾患を含む続発性肺疾患；特発性間質性肺炎、器質化肺炎を伴う閉塞性細気管支炎、肺リンパ管平滑筋腫を含む原発性肺疾患；全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、進行性全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、混合性結合組織病に関連する肺疾患を含むコラーゲン血管疾患に関連する肺疾患；びまん性肺胞出血症候群、肺胞蛋白症、好酸球性肺炎、肺血管炎、リンパ球性間質性肺炎、壊死性結節性肉芽腫、家族性肺線維症を含む肺胞充填性病変；
【0042】
心筋梗塞後の代替性・反応性線維化を含む虚血性心疾患；高血圧性心疾患；ウイルス性心筋炎を含む炎症性心筋症；ヘモクロマトーシス型心筋症、アミロイドーシス型心筋症、グリコーゲン蓄積性心筋症、糖尿病性心筋症を含む代謝性心筋症；ケシャン病；拡張型心筋症；肥大型心筋症、制限型心筋症；不整脈原性右室心筋症；
【0043】
Ｂ型、Ｃ型、及びＤ型ウイルス性肝炎を含むウイルス性肝硬変；住血吸虫性肝硬変；アルコール性肝硬変；原発性胆汁性肝硬変、続発性肝内胆石症、門脈周囲の炎症を含む胆汁性肝硬変；肝レンズ核変性症、ヘモクロマトーシスを含む代謝性肝硬変；有機リン中毒、四塩化炭素中毒、肝毒性薬剤例えばイソニアジド、テトラサイクリン、クロルプロマジン中毒を含む中毒性肝硬変；栄養失調性肝硬変；慢性うっ血性心不全を含む心原性肝硬変；
【0044】
急性膵炎；膵管閉塞；慢性アルコール中毒；Ｏｄｄｉ括約筋機能異常；膵虚血；
【0045】
高血圧を含む血管腎線維増殖性疾患及び／又は症候群；糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、強皮症、腎移植拒絶を含む免疫腎線維増殖性疾患及び／又は症候群；腎盂腎炎、腎結石などの感染性腎線維増殖性疾患及び／又は症候群；高脂血症、糖尿病、高尿酸血症、高カルシウム尿症を含む代謝性腎線維増殖性疾患及び／又は症候群；
【0046】
脾臓線維増殖性疾患；
眼の外傷・術後の眼線維増殖性疾患及び／又は症候群、増殖性糖尿病網膜線維症；
眼の外傷・術後の眼線維増殖性疾患及び／又は症候群、増殖性糖尿病網膜線維症；
【0047】
脊髄外傷後の線維増殖性疾患及び／又は症候群、脳卒中瘢痕形成、アルツハイマー病；
【0048】
特発性・薬物誘発性骨髄線維症、真性赤血球増加症、慢性骨髄性白血病及びホジキン病；
【0049】
口腔粘膜線維症、瘢痕、ケロイド、及び皮膚肥厚を含む皮膚線維増殖性障害及び／又は症候群、からなる群から選ばれる。
【0050】
他の実施形態において、前記方法は、さらに、それを必要とする対象に時間及び／又は空間で別々に及び／又は一緒に他の抗線維化剤を投与することを含む。具体的には、前記他の抗線維化剤は、例えば、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、ベクロメタゾンのような糖質コルチコイド、例えば、シクロホスファミド、アザチオプリン、メトトレキサートのような免疫抑制剤、例えば、アセチルシステイン、カルボシステインのような抗酸化剤、例えば、低分子量ヘパリンのような抗凝固薬、コルヒチン、インターフェロン、ＡＣＥＩ及びスタチン系薬剤のいずれか１種又は複数種を選択してもよい。
【0051】
他の実施形態において、前記方法は、生体内での本発明に係る第１の態様に記載のポリヌクレオチドの発生を内因的に活性化させることを含む。そのために、本発明は、さらに、生体内での前記ポリヌクレオチドの発生を内因的に活性化させるエリシターを提供する。
【0052】
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象に本発明に係るポリヌクレオチド、ベクター、医薬／化粧品組成物、及び／又は生体内で本発明に係るポリヌクレオチドの発生を内因的に活性化させるエリシターを投与することを含む皮膚若返り美容法を提供する。１つの実施形態において、前記物質は、非侵襲的手段、例えば、表面投与によって投与される。
【0053】
別の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に記載のポリヌクレオチドを、合成する及び／又は核酸発現ベクターから発現させる、ことを含む第１の態様に係るポリヌクレオチドの製造方法を提供する。
【実施例0054】
以下の実施例は、図面と組み合わせて列挙されて本明細書に開示される発明を説明するためのものだけであるが、いかなる場合にも、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
１．実験関連方法及びプロセス
１．実験関連方法及びプロセス
【0055】
１．１ イワベンケイ由来ＲＮＡの抽出及び精製
新鮮なイワベンケイに由来する低分子ＲＮＡの抽出は、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ＃２１７００４）の製造元によって提供される取扱説明書に従って行う。
汁液ＲＮＡの抽出は、
（１）イワベンケイの汁液２００μｌには、ＣＴＡＢライセート１ｍｌを加え、さらに２０μｌβ－メルカプトエタノールを加え、激しく振盪するステップと、
（２）６５℃、３０ｍｉｎで、渦巻きを発生させながら連続的に振盪するステップと、
（３）１２，０００ｒｐｍ、４℃で７ｍｉｎ遠心させた後、上清８００μｌを採取し、エタノール ３８０μｌを加え、均一に混合するステップと、
（４）４℃で２０ｍｉｎ放置するステップと、
（５）１２，０００ｒｐｍ、４℃で１５ｍｉｎ遠心し、上清８００μｌを採取し、０．８倍の体積のクロロホルムを添加し、均一に激しく混合するステップと、
（６）１０ｍｉｎ放置し、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１５ｍｉｎ遠心するステップと、
（７）上清６００μｌを採取し、予備冷却されたイソプロパノール６００μｌを加え、均一に混合した後、－２０℃で２０ｍｉｎ放置させるステップと、
（８）１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０ｍｉｎ遠心し、上清を捨てた後、沈殿物を７５％エタノールで２回洗浄するステップと、
（９）ＤＥＰＣで処理されたＨ2ＯでＲＮＡを溶解させるステップと、を含む。
新鮮なイワベンケイに由来する低分子ＲＮＡの抽出は、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ＃２１７００４）の製造元によって提供される取扱説明書に従って行う。
汁液ＲＮＡの抽出は、
（１）イワベンケイの汁液２００μｌには、ＣＴＡＢライセート１ｍｌを加え、さらに２０μｌβ－メルカプトエタノールを加え、激しく振盪するステップと、
（２）６５℃、３０ｍｉｎで、渦巻きを発生させながら連続的に振盪するステップと、
（３）１２，０００ｒｐｍ、４℃で７ｍｉｎ遠心させた後、上清８００μｌを採取し、エタノール ３８０μｌを加え、均一に混合するステップと、
（４）４℃で２０ｍｉｎ放置するステップと、
（５）１２，０００ｒｐｍ、４℃で１５ｍｉｎ遠心し、上清８００μｌを採取し、０．８倍の体積のクロロホルムを添加し、均一に激しく混合するステップと、
（６）１０ｍｉｎ放置し、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１５ｍｉｎ遠心するステップと、
（７）上清６００μｌを採取し、予備冷却されたイソプロパノール６００μｌを加え、均一に混合した後、－２０℃で２０ｍｉｎ放置させるステップと、
（８）１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０ｍｉｎ遠心し、上清を捨てた後、沈殿物を７５％エタノールで２回洗浄するステップと、
（９）ＤＥＰＣで処理されたＨ2ＯでＲＮＡを溶解させるステップと、を含む。
【0056】
１．２ ヒト血液、マウス肺及び細胞トータルＲＮＡの抽出及びハイスループットシーケンス
（１）細胞にＴＲＩｚｏｌライセートを加え、室温で５分間放置し、十分に溶解させる（マウス肺組織の場合、組織１００ｍｇにＴＲＩｚｏｌライセート１．０ｍｌを加え、ホモジナイザーで研磨させ、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０ｍｉｎ遠心し、よくホモジナイズされていない組織沈殿物を除去する）ステップと、
（２）１２，０００ｒｐｍ、４℃で５ｍｉｎ遠心し、沈殿物を捨てるステップと、
（３）２００μｌ／ｍｌ ＴＲＩｚｏｌの割合でクロロホルムを加え、十分に振盪してよく混合させ、室温で１５ｍｉｎ放置するステップと、
（４）１２，０００ｒｐｍ、４℃で１５ｍｉｎ遠心し、上層の水相を吸い取り、別の遠心管に入れるステップと、
（５）ステップ（４）を繰り返し、上層の水相と同じ量のクロロホルムを加え、よく混合した後、室温で１０ｍｉｎ放置し、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１５ｍｉｎ遠心するステップと、
（６）上層の水相を吸い取り、別の新たなＥＰチューブに０．５ｍｌ／ｍｌ ＴＲＩｚｏｌでイソプロパノールを加えてよく混合し、室温で５～１０ｍｉｎ放置するステップと、
（７）１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０ｍｉｎ遠心し、上清を捨てるステップと、
（８）７５％ エタノールを１ｍｌ加え、遠心管を温和に振盪させ、沈殿物を懸濁させるステップと、
（９）８０００ｇ、４℃で５ｍｉｎ遠心し、上清をできるだけ捨てるステップと、
（１０）室温で５～１０ｍｉｎ乾燥させ、ＤＥＰＣ ５０μｌで処理されたＨ2ＯでＲＮＡサンプルを溶解させるステップと、を含む。
（１）細胞にＴＲＩｚｏｌライセートを加え、室温で５分間放置し、十分に溶解させる（マウス肺組織の場合、組織１００ｍｇにＴＲＩｚｏｌライセート１．０ｍｌを加え、ホモジナイザーで研磨させ、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０ｍｉｎ遠心し、よくホモジナイズされていない組織沈殿物を除去する）ステップと、
（２）１２，０００ｒｐｍ、４℃で５ｍｉｎ遠心し、沈殿物を捨てるステップと、
（３）２００μｌ／ｍｌ ＴＲＩｚｏｌの割合でクロロホルムを加え、十分に振盪してよく混合させ、室温で１５ｍｉｎ放置するステップと、
（４）１２，０００ｒｐｍ、４℃で１５ｍｉｎ遠心し、上層の水相を吸い取り、別の遠心管に入れるステップと、
（５）ステップ（４）を繰り返し、上層の水相と同じ量のクロロホルムを加え、よく混合した後、室温で１０ｍｉｎ放置し、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１５ｍｉｎ遠心するステップと、
（６）上層の水相を吸い取り、別の新たなＥＰチューブに０．５ｍｌ／ｍｌ ＴＲＩｚｏｌでイソプロパノールを加えてよく混合し、室温で５～１０ｍｉｎ放置するステップと、
（７）１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０ｍｉｎ遠心し、上清を捨てるステップと、
（８）７５％ エタノールを１ｍｌ加え、遠心管を温和に振盪させ、沈殿物を懸濁させるステップと、
（９）８０００ｇ、４℃で５ｍｉｎ遠心し、上清をできるだけ捨てるステップと、
（１０）室温で５～１０ｍｉｎ乾燥させ、ＤＥＰＣ ５０μｌで処理されたＨ2ＯでＲＮＡサンプルを溶解させるステップと、を含む。
【0057】
１．３ ＲＴ－ｑＰＣＲの検出
１）ｓＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、逆転写キット（Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔ．ｎｏ．４３６８８１３）で、ステムループ法（Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ法）によりｓＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、逆転写系は、テンプレートＲＮＡ（１５０ｎｇ／μｌ）１０μｌ、１０Ｘ ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ ２．０μｌ、２５Ｘ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（１００ｍＭ）０．８μｌ、Ｕ６ＲＴプライマー（１０μＭ）２．０μｌ、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７ＲＴプライマー（１０μＭ）２．０μｌ、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅTM逆転写酵素１．０μｌ、ＲＮａｓｅ阻害剤１．０μｌ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ Ｈ2Ｏ １．２μｌ、一過性遠心分離後、ＰＣＲ機器にセットし反応させ、反応条件は、（１）２５℃、１０ｍｉｎ、（２）３７℃、１２０ｍｉｎ、（３）８５℃、５ｍｉｎ、（４）４℃で反応を終了させることである。反応終了後、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ2Ｏ ２０μｌを加え、最終的な容量が４０μｌになるように補充する。使用したプライマー配列は、以下の通りであり、
ヒトＵ６ＲＴ：ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＡＡＡＡＡＴＡＴＧ（配列番号１８）、
ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７ＲＴ：ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＣＧＣＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＧＣＴＴＡＣＡＡ（配列番号１９）。
２）定量ＰＣＲ増幅反応は、ｑＰＣＲ反応系の全容量が１０μｌであり、２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ５μＬ、フォワードプライマー（１０μＭ）０．５μｌ、リバースプライマー（１０μＭ）０．５μｌ、逆転写されたｃＤＮＡ １μｌ、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ2Ｏ ３μｌを含む。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０リアルタイムＰＣＲ装置を使用し、ＰＣＲ反応条件は、９５℃で５ｍｉｎ予備変性し、ＰＣＲ増幅サイクルを開始させ、（１）９５℃、１０ｓ、（２）５５℃、１０ｓ、（３）７２℃、２０ｓ、合計４０サイクルを行い、最後、４０℃で１０ｓ維持して降温させる。増幅反応のフォワードプライマー及びリバースプライマーは、いずれも北京ケイ科新業生物技術有限公司（ＴｓｉｎｇｋｅＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ，Ｂｅｉｊｉｎｇ）によって設計、合成されたものである。使用したプライマー配列は、以下の通りであり、
ヒトＵ６Ｆ：ＧＣＧＣＧＴＣＧＴＧＡＡＧＣＧＴＴＣ（配列番号２０）、
ヒトＵ６Ｒ：ＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴ（配列番号２１）、
ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７Ｆ：ＴＣＧＣＧＣＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴ（配列番号２２）、
ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７Ｒ：ＧＴＧＣＡＣＧＣＴＣＣＧＡＧＧＴ（配列番号２３）。
３）ΔΔＣｔ法によって相対発現量を計算する。
１）ｓＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、逆転写キット（Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ｃａｔ．ｎｏ．４３６８８１３）で、ステムループ法（Ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ法）によりｓＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、逆転写系は、テンプレートＲＮＡ（１５０ｎｇ／μｌ）１０μｌ、１０Ｘ ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ ２．０μｌ、２５Ｘ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（１００ｍＭ）０．８μｌ、Ｕ６ＲＴプライマー（１０μＭ）２．０μｌ、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７ＲＴプライマー（１０μＭ）２．０μｌ、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅTM逆転写酵素１．０μｌ、ＲＮａｓｅ阻害剤１．０μｌ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ Ｈ2Ｏ １．２μｌ、一過性遠心分離後、ＰＣＲ機器にセットし反応させ、反応条件は、（１）２５℃、１０ｍｉｎ、（２）３７℃、１２０ｍｉｎ、（３）８５℃、５ｍｉｎ、（４）４℃で反応を終了させることである。反応終了後、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ2Ｏ ２０μｌを加え、最終的な容量が４０μｌになるように補充する。使用したプライマー配列は、以下の通りであり、
ヒトＵ６ＲＴ：ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＡＡＡＡＡＴＡＴＧ（配列番号１８）、
ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７ＲＴ：ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＣＧＣＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＧＣＴＴＡＣＡＡ（配列番号１９）。
２）定量ＰＣＲ増幅反応は、ｑＰＣＲ反応系の全容量が１０μｌであり、２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ５μＬ、フォワードプライマー（１０μＭ）０．５μｌ、リバースプライマー（１０μＭ）０．５μｌ、逆転写されたｃＤＮＡ １μｌ、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ2Ｏ ３μｌを含む。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０リアルタイムＰＣＲ装置を使用し、ＰＣＲ反応条件は、９５℃で５ｍｉｎ予備変性し、ＰＣＲ増幅サイクルを開始させ、（１）９５℃、１０ｓ、（２）５５℃、１０ｓ、（３）７２℃、２０ｓ、合計４０サイクルを行い、最後、４０℃で１０ｓ維持して降温させる。増幅反応のフォワードプライマー及びリバースプライマーは、いずれも北京ケイ科新業生物技術有限公司（ＴｓｉｎｇｋｅＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ．，Ｌｔｄ，Ｂｅｉｊｉｎｇ）によって設計、合成されたものである。使用したプライマー配列は、以下の通りであり、
ヒトＵ６Ｆ：ＧＣＧＣＧＴＣＧＴＧＡＡＧＣＧＴＴＣ（配列番号２０）、
ヒトＵ６Ｒ：ＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴ（配列番号２１）、
ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７Ｆ：ＴＣＧＣＧＣＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴ（配列番号２２）、
ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７Ｒ：ＧＴＧＣＡＣＧＣＴＣＣＧＡＧＧＴ（配列番号２３）。
３）ΔΔＣｔ法によって相対発現量を計算する。
【0058】
１．４ タンパク質サンプルの収集及びＢＣＡ法による濃度の測定
（１）培地を捨て、ＰＢＳバッファーで２回洗浄し、適量の予冷されたＲＩＰＡライセートを加え、細胞をピペットチップでこそげ遠心管に移し、氷上で２０ｍｉｎ溶解する。
（２）ＢＣＡ試薬Ａ及びＢ（５０：１、ｖ／ｖ）を十分に混合し、ＢＣＡワーキング試薬を調製する。
（３）新鮮に調製されたＢＳＡ標準液及び被験サンプルを２５μｌずつ採取し、９６ウェルプレートに加え、１ウェル当たりＢＣＡワーキング試薬２００μｌを加え、よく混合する。
（４）３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした後、室温まで冷却し、又は室温で２ｈ放置する。
（５）紫外可視分光光度計（Ｓｙｎｅｒｇｙ ４マルチファンクションマイクロプレートリーダー）を使用し、５６２ｎｍでその吸光度を測定し、サンプル中のタンパク質濃度を標準曲線から計算する。
（６）ＲＩＰＡライセートでサンプルの濃度を調整し、各サンプルの濃度の一貫性を確保する。
（１）培地を捨て、ＰＢＳバッファーで２回洗浄し、適量の予冷されたＲＩＰＡライセートを加え、細胞をピペットチップでこそげ遠心管に移し、氷上で２０ｍｉｎ溶解する。
（２）ＢＣＡ試薬Ａ及びＢ（５０：１、ｖ／ｖ）を十分に混合し、ＢＣＡワーキング試薬を調製する。
（３）新鮮に調製されたＢＳＡ標準液及び被験サンプルを２５μｌずつ採取し、９６ウェルプレートに加え、１ウェル当たりＢＣＡワーキング試薬２００μｌを加え、よく混合する。
（４）３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした後、室温まで冷却し、又は室温で２ｈ放置する。
（５）紫外可視分光光度計（Ｓｙｎｅｒｇｙ ４マルチファンクションマイクロプレートリーダー）を使用し、５６２ｎｍでその吸光度を測定し、サンプル中のタンパク質濃度を標準曲線から計算する。
（６）ＲＩＰＡライセートでサンプルの濃度を調整し、各サンプルの濃度の一貫性を確保する。
【0059】
１．５ ウェスタンブロット法による検出（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）
（１）ゲルの作製：濃度が１０％の分離ゲル（下層ゲル）及び濃度が５％の濃縮ゲル（上層ゲル）、１５ウェルのコームで構成されるレーンを採用し、各レーン当たりタンパク質サンプルのサンプルロード量が等しくなる。
（２）サンプルの処理：サンプルを等量の２×ｌｏａｄｉｎｇ ｂｅｆｆｅｒに加え、９７℃で金属浴に１０分間入れた後、氷上に置いて、用意する。
（３）タンパク質の電気泳動：電気泳動用バッファーを加え、電気泳動の初期電圧が８０Ｖであり、ブロモフェノールブルー色素が分離ゲルに到達した後、電圧を１２０Ｖに上げ、ブロモフェノールブルー色素が分離ゲルの底部に達し、又は全てゲルから泳ぎ出すまでに電気泳動を続ける。
（４）ウェット式ブロッティング：（負極）スポンジ－ろ紙－ゲル－ＰＶＤＦメンブレン－ろ紙－スポンジ（正極）の順序に従って組み込まれ、説明書に従って取り付け、ブロッティング装置全体を４℃の冷室にセットし、定電流３００ｍＡで、１２０ｍｉｎブロッティングする。
（５）ブロッキング：ブロッティング終了後、３％ ＢＳＡブロッキング溶液中に入れ、室温で１ｈブロッキングする。
（６）一次抗体のインキュベーション：ブロッキング後のＰＶＤＦメンブレンをプラスチックバッグに移し、一次抗体を含有する３％ ＢＳＡブロッキング溶液（一次抗体の濃度は抗体の説明書に従って決定する）、バッグ内の気泡を取り除き、密閉後、４℃で一晩インキュベートする。
（７）メンブレンの洗浄：ＰＶＤＦメンブレンを取り出し、１回１０分間、ＴＢＳＴでメンブレンを３回洗浄する。
（８）二次抗体のインキュベーション：ＴＢＳＴを捨て、二次抗体を含有する３％ ＢＳＡブロッキング溶液を加え、室温で２時間インキュベートする。
（９）メンブレンの洗浄：ＰＶＤＦメンブレンを取り出し、１回１０分間、ＴＢＳＴでメンブレンを３回洗浄する。
（１０）現像：Ｗｅｓｔｅｒｎ現像液を調製し、調製された現像液をメンブレン結合タンパク質の側面に均一に滴下し、メンブレンをしがみつくフィルムで慎重に包み、Ｘ線撮影用暗室にセットしてシートを１０～２０ｍｉｎ押し、最後に現像液、定着液を加えて観察する。
（１１）スキャン及び解析：ネガフィルムをＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅにより解析・処理し、Ｉｍａｇｅ Ｊによりグレースケールを解析する。
（１）ゲルの作製：濃度が１０％の分離ゲル（下層ゲル）及び濃度が５％の濃縮ゲル（上層ゲル）、１５ウェルのコームで構成されるレーンを採用し、各レーン当たりタンパク質サンプルのサンプルロード量が等しくなる。
（２）サンプルの処理：サンプルを等量の２×ｌｏａｄｉｎｇ ｂｅｆｆｅｒに加え、９７℃で金属浴に１０分間入れた後、氷上に置いて、用意する。
（３）タンパク質の電気泳動：電気泳動用バッファーを加え、電気泳動の初期電圧が８０Ｖであり、ブロモフェノールブルー色素が分離ゲルに到達した後、電圧を１２０Ｖに上げ、ブロモフェノールブルー色素が分離ゲルの底部に達し、又は全てゲルから泳ぎ出すまでに電気泳動を続ける。
（４）ウェット式ブロッティング：（負極）スポンジ－ろ紙－ゲル－ＰＶＤＦメンブレン－ろ紙－スポンジ（正極）の順序に従って組み込まれ、説明書に従って取り付け、ブロッティング装置全体を４℃の冷室にセットし、定電流３００ｍＡで、１２０ｍｉｎブロッティングする。
（５）ブロッキング：ブロッティング終了後、３％ ＢＳＡブロッキング溶液中に入れ、室温で１ｈブロッキングする。
（６）一次抗体のインキュベーション：ブロッキング後のＰＶＤＦメンブレンをプラスチックバッグに移し、一次抗体を含有する３％ ＢＳＡブロッキング溶液（一次抗体の濃度は抗体の説明書に従って決定する）、バッグ内の気泡を取り除き、密閉後、４℃で一晩インキュベートする。
（７）メンブレンの洗浄：ＰＶＤＦメンブレンを取り出し、１回１０分間、ＴＢＳＴでメンブレンを３回洗浄する。
（８）二次抗体のインキュベーション：ＴＢＳＴを捨て、二次抗体を含有する３％ ＢＳＡブロッキング溶液を加え、室温で２時間インキュベートする。
（９）メンブレンの洗浄：ＰＶＤＦメンブレンを取り出し、１回１０分間、ＴＢＳＴでメンブレンを３回洗浄する。
（１０）現像：Ｗｅｓｔｅｒｎ現像液を調製し、調製された現像液をメンブレン結合タンパク質の側面に均一に滴下し、メンブレンをしがみつくフィルムで慎重に包み、Ｘ線撮影用暗室にセットしてシートを１０～２０ｍｉｎ押し、最後に現像液、定着液を加えて観察する。
（１１）スキャン及び解析：ネガフィルムをＱｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅにより解析・処理し、Ｉｍａｇｅ Ｊによりグレースケールを解析する。
【0060】
１．６ ブレオマイシン誘導性マウス肺線維症モデルの構築
６～８週齢で体重が２０～２５ｇの雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを選択し、麻酔下で気管支を介して生理食塩水で調製されたブレオマイシン溶液（３．５Ｕ／ｋｇ）１００μＬを投与し、対照群に１００μＬの生理食塩水を投与し、マウスの体重と死亡率を毎日記録し、２１ｄ日目にマウスを処理する。ヒドロキシプロリンの測定のために右肺を採取し、左肺を採取して４％パラホルムアルデヒドで固定した後、パラフィン包埋し、切片を作成し、ヘマトキシリン－エオシン染色（ＨＥ染色）、マッソントリクローム染色及び免疫細胞化学による検出を行う。組織の病理切片及び線維化指標の結果を組み合わせ、ブレオマイシン誘導性マウス肺線維症モデルの構築に成功したかどうかを評価する。
６～８週齢で体重が２０～２５ｇの雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを選択し、麻酔下で気管支を介して生理食塩水で調製されたブレオマイシン溶液（３．５Ｕ／ｋｇ）１００μＬを投与し、対照群に１００μＬの生理食塩水を投与し、マウスの体重と死亡率を毎日記録し、２１ｄ日目にマウスを処理する。ヒドロキシプロリンの測定のために右肺を採取し、左肺を採取して４％パラホルムアルデヒドで固定した後、パラフィン包埋し、切片を作成し、ヘマトキシリン－エオシン染色（ＨＥ染色）、マッソントリクローム染色及び免疫細胞化学による検出を行う。組織の病理切片及び線維化指標の結果を組み合わせ、ブレオマイシン誘導性マウス肺線維症モデルの構築に成功したかどうかを評価する。
【0061】
１．７ ルシフェラーゼレポーター遺伝子による標的遺伝子の検出
実験材料
ヒト胎児腎細胞２９３Ｔ；１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）；ペ
ニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）；トランスフェクト試薬：ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びリポソームＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子システム：ｐｓｉＣＨＥＣＫ２（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃ２０８１）
実験方法
（１）１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した２９３Ｔ細胞を４８ウェルプレートに１ウェルあたり約３ｘ１０4個細胞で分注し、接着後、ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１００ｎＭのＮＣ ｓＲＮＡ／ｓＲＮＡをトランスフェクトする。
（２）２４時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でｐｓｉＣＨＥＣＫ２－３’－ＵＴＲ又はｐｓｉＣＨＥＣＫ２－３’－ｍＵＴＲのプラスミドをトランスフェクトする。
（３）プラスミドをトランスフェクトした８時間、１４時間又は２４時間後にＤｕａｌ－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ１９１０）のマニュアルにおける使用方法に従って蛍光強度を検出する。
２．試験の実施例
実験材料
ヒト胎児腎細胞２９３Ｔ；１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）；ペ
ニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）；トランスフェクト試薬：ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びリポソームＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子システム：ｐｓｉＣＨＥＣＫ２（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃ２０８１）
実験方法
（１）１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した２９３Ｔ細胞を４８ウェルプレートに１ウェルあたり約３ｘ１０4個細胞で分注し、接着後、ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１００ｎＭのＮＣ ｓＲＮＡ／ｓＲＮＡをトランスフェクトする。
（２）２４時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でｐｓｉＣＨＥＣＫ２－３’－ＵＴＲ又はｐｓｉＣＨＥＣＫ２－３’－ｍＵＴＲのプラスミドをトランスフェクトする。
（３）プラスミドをトランスフェクトした８時間、１４時間又は２４時間後にＤｕａｌ－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｅ１９１０）のマニュアルにおける使用方法に従って蛍光強度を検出する。
２．試験の実施例
【0062】
２．１ イワベンケイ由来のｓＲＮＡの同定
上記の項目１．１を参照すると、キット及び改良されたＣＴＡＢ法を利用し、それぞれ新鮮なイワベンケイ及びイワベンケイ生薬の煎じ薬からＲＮＡを抽出し、アガロースゲル電気泳動により、ＲＮＡ断片は２０ｎｔ以下の低分子ＲＮＡ断片（ｓｍａｌｌ ＲＮＡ、ｓＲＮＡ）であることを示した。次の試験では、イワベンケイの煎じ薬を７日連続で飲んだ後の０時間及び２４時間のヒトの全血、イワベンケイ由来のＲＮＡを３日連続で胃内投与した後の１２時間、２４時間及び４８時間後のマウス的肺組織、並びにイワベンケイ由来のＲＮＡを加えた後の２４ｈのＡ５４９細胞についてはそれぞれハイスループットシーケンス（ＳＥ３６、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２５００）を行った。バイオインフォマティクスの方法により、次の条件に従ってマウス肺、ヒト血液又はＡ５４９細胞に進入した低分子ＲＮＡ断片を識別した。即ち、（１）ヒト血液、マウス肺組織又はＡ５４９細胞に存在するイワベンケイ由来の低分子ＲＮＡ、（２）ヒト又はマウスのゲノムに合わせないイワベンケイ由来の低分子ＲＮＡ。上記の方法により、本発明者らは、予想外に、３つのヒト血液へ進入したイワベンケイ由来の低分子ＲＮＡを発見し（表１を参照）、ヒト血液におけるその存在比の順に応じて、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ１～３と順次に命名し、８つのマウス肺組織へ進入したイワベンケイ由来の低分子ＲＮＡを発見し（表２を参照）、マウス肺組織におけるその存在比の順に応じて、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ１～８と順次に命名し、２つのＡ５４９細胞へ進入したイワベンケイ由来の低分子ＲＮＡを発見し、Ａ５４９細胞におけるその存在比の順に応じて、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ａ１～２と順次に命名した（表３を参照）。なお、本発明者は、さらに、イワベンケイのうち、ｍｉＲｂａｓｅデータベースに合わせられる、４つの低分子ＲＮＡをスクリーニングし、後の実験を行った（表４を参照）。
上記の項目１．１を参照すると、キット及び改良されたＣＴＡＢ法を利用し、それぞれ新鮮なイワベンケイ及びイワベンケイ生薬の煎じ薬からＲＮＡを抽出し、アガロースゲル電気泳動により、ＲＮＡ断片は２０ｎｔ以下の低分子ＲＮＡ断片（ｓｍａｌｌ ＲＮＡ、ｓＲＮＡ）であることを示した。次の試験では、イワベンケイの煎じ薬を７日連続で飲んだ後の０時間及び２４時間のヒトの全血、イワベンケイ由来のＲＮＡを３日連続で胃内投与した後の１２時間、２４時間及び４８時間後のマウス的肺組織、並びにイワベンケイ由来のＲＮＡを加えた後の２４ｈのＡ５４９細胞についてはそれぞれハイスループットシーケンス（ＳＥ３６、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２５００）を行った。バイオインフォマティクスの方法により、次の条件に従ってマウス肺、ヒト血液又はＡ５４９細胞に進入した低分子ＲＮＡ断片を識別した。即ち、（１）ヒト血液、マウス肺組織又はＡ５４９細胞に存在するイワベンケイ由来の低分子ＲＮＡ、（２）ヒト又はマウスのゲノムに合わせないイワベンケイ由来の低分子ＲＮＡ。上記の方法により、本発明者らは、予想外に、３つのヒト血液へ進入したイワベンケイ由来の低分子ＲＮＡを発見し（表１を参照）、ヒト血液におけるその存在比の順に応じて、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ１～３と順次に命名し、８つのマウス肺組織へ進入したイワベンケイ由来の低分子ＲＮＡを発見し（表２を参照）、マウス肺組織におけるその存在比の順に応じて、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ１～８と順次に命名し、２つのＡ５４９細胞へ進入したイワベンケイ由来の低分子ＲＮＡを発見し、Ａ５４９細胞におけるその存在比の順に応じて、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ａ１～２と順次に命名した（表３を参照）。なお、本発明者は、さらに、イワベンケイのうち、ｍｉＲｂａｓｅデータベースに合わせられる、４つの低分子ＲＮＡをスクリーニングし、後の実験を行った（表４を参照）。
【0063】
表１ ヒト血液中のイワベンケイ由来のｓＲＮＡ配列及び命名
【0064】
表２ マウス肺中のイワベンケイ由来のｓＲＮＡ配列及び命名
【0065】
表３ Ａ５４９細胞中のイワベンケイ由来のｓＲＮＡ配列及び命名
【0066】
表４ イワベンケイ由来のｍｉＲｂａｓｅデータベースに合わせられるｓＲＮＡ配列及び命名
【0067】
２．２ ｓＲＮＡの抗線維化活性
２．２．１ ＴＧＦ－β１で刺激されたＭＲＣ－５線維化細胞モデルにおけるイワベンケイ由来のｓＲＮＡのスクリーニング及び同定
ＴＧＦ－β１ ３ｎｇ／ｍｌによりＭＲＣ－５細胞を４８ｈ（図１）又は７２ｈ（図２～図６）刺激した後、ＲＮＡサンプルを採取し、ＲＴ－ＰＣＲ法で線維化関連遺伝子α－ＳＭＡ、フィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）、ＣＯＬ１Ａ１、ＰＡＩ－１、ＳＭＡＤ４及びＴＧＦ－βのｍＲＮＡの相対発現を検出した。
α－ＳＭＡ、フィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）、ＣＯＬ１Ａ１及びＰＡＩ－１は、４つの線維化関連遺伝子である。イワベンケイ由来のｓＲＮＡを使用してＴＧＦ－β１で刺激されたＭＲＣ－５線維化細胞モデルを処理し、上記の４つの線維化関連遺伝子のｍＲＮＡレベルの発現を検出することにより、ヒト血液、マウス肺及びＡ５４９細胞へ進入した低分子ＲＮＡについて抗線維化機能のスクリーニングを行った。結果は図１及び２に示すように、予防及び治療の両方の試験において、多種のイワベンケイ由来のｓＲＮＡはいずれもＭＲＣ－５細胞中のｍＲＮＡレベルでの線維化関連遺伝子の発現を阻害することができる。
２．２．１ ＴＧＦ－β１で刺激されたＭＲＣ－５線維化細胞モデルにおけるイワベンケイ由来のｓＲＮＡのスクリーニング及び同定
ＴＧＦ－β１ ３ｎｇ／ｍｌによりＭＲＣ－５細胞を４８ｈ（図１）又は７２ｈ（図２～図６）刺激した後、ＲＮＡサンプルを採取し、ＲＴ－ＰＣＲ法で線維化関連遺伝子α－ＳＭＡ、フィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）、ＣＯＬ１Ａ１、ＰＡＩ－１、ＳＭＡＤ４及びＴＧＦ－βのｍＲＮＡの相対発現を検出した。
α－ＳＭＡ、フィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）、ＣＯＬ１Ａ１及びＰＡＩ－１は、４つの線維化関連遺伝子である。イワベンケイ由来のｓＲＮＡを使用してＴＧＦ－β１で刺激されたＭＲＣ－５線維化細胞モデルを処理し、上記の４つの線維化関連遺伝子のｍＲＮＡレベルの発現を検出することにより、ヒト血液、マウス肺及びＡ５４９細胞へ進入した低分子ＲＮＡについて抗線維化機能のスクリーニングを行った。結果は図１及び２に示すように、予防及び治療の両方の試験において、多種のイワベンケイ由来のｓＲＮＡはいずれもＭＲＣ－５細胞中のｍＲＮＡレベルでの線維化関連遺伝子の発現を阻害することができる。
【0068】
ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ３、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ａ２及びｐｐｅ－ｍｉＲ１６９ｃの４つのｓＲＮＡ配列を選択してその後の検証実験を行い、２４ｈ時間前にＮＣ ｓＲＮＡ及びＨＪＴ ｓＲＮＡをトランスフェクトし、ＴＧＦ－β１によってＭＲＣ－５を７２ｈ刺激した後、関連指標を検出した。それぞれは、図３～図６に示すように、ＴＧＦ－β１誘導性ＭＲＣ－５線維化細胞モデルにおいて、上記の４つのｓＲＮＡは、いずれもα－ＳＭＡ、フィブロネクチン、ＣＯＬ１Ａ１、ＰＡＩ－１、ＴＧＦ－β及びＳＭＡＤ４のｍＲＮＡ発現レベルを効果的に低減させることができる。
本発明者らは、イワベンケイ由来のｓＲＮＡ（ＨＪＴ ｓＲＮＡ）によるＴＧＦ－β１誘導性ＭＲＣ－５線維化細胞モデルにおけるα－ＳＭＡ、フィブロネクチンの２つの線維化関連遺伝子のタンパク質発現レベルをスクリーニングした。図１３及び図１４は、それぞれ、２４時間前にＮＣ ｓＲＮＡ及びＨＪＴ ｓＲＮＡをトランスフェクトし、ＴＧＦ－β１でＭＲＣ－５を７２時間刺激した後、関連指標（予防群）を検出した実験結果を示した。図１３及び図１４に示すように、多種のイワベンケイ由来のｓＲＮＡは、いずれもタンパク質レベルでＭＲＣ－５細胞中の線維化関連遺伝子の発現を阻害することができる。中でも、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５、６、８、１０に対応するＨＪＴ ｓＲＮＡは、フィブロネクチンのタンパク質発現レベルを大幅に低減させることができ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、５、６、８、１０、１６、１７に対応するＨＪＴ ｓＲＮＡは、α－ＳＭＡのタンパク質発現レベルを低減させることができる。
本発明者らは、イワベンケイ由来のｓＲＮＡ（ＨＪＴ ｓＲＮＡ）によるＴＧＦ－β１誘導性ＭＲＣ－５線維化細胞モデルにおけるα－ＳＭＡ、フィブロネクチンの２つの線維化関連遺伝子のタンパク質発現レベルをスクリーニングした。図１３及び図１４は、それぞれ、２４時間前にＮＣ ｓＲＮＡ及びＨＪＴ ｓＲＮＡをトランスフェクトし、ＴＧＦ－β１でＭＲＣ－５を７２時間刺激した後、関連指標（予防群）を検出した実験結果を示した。図１３及び図１４に示すように、多種のイワベンケイ由来のｓＲＮＡは、いずれもタンパク質レベルでＭＲＣ－５細胞中の線維化関連遺伝子の発現を阻害することができる。中でも、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５、６、８、１０に対応するＨＪＴ ｓＲＮＡは、フィブロネクチンのタンパク質発現レベルを大幅に低減させることができ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、５、６、８、１０、１６、１７に対応するＨＪＴ ｓＲＮＡは、α－ＳＭＡのタンパク質発現レベルを低減させることができる。
【0069】
２．２．２ ブレオマイシン誘導性マウス肺線維症モデルにおけるイワベンケイ由来のｓＲＮＡの作用
上記の項目１．６によれば、ブレオマイシン誘導性マウス肺線維症モデルにおいて、上記の４つのイワベンケイ由来のｓＲＮＡの、線維化に対する効果を測定した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、ブレオマイシン（ＢＬＭ、Ｎｉｐｐｏｎ Ｋａｙａｋｕ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用量３．５Ｕ／ｋｇで気管内投与するとともに、ＮＣ ｓＲＮＡ、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ａ２、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ３及びｐｐｅ－ｍｉＲ－１６９ｃのａｇｏｍｉｒ（蘇州吉瑪遺伝子株式有限会社製）を用量８ｍｇ／ｋｇ、生理食塩水で希釈された１００μｌ全容量で気管内投与した。ブレオマイシン投与後７日目、１３日目及び１６日目にそれぞれＮＣ ｓＲＮＡ、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ａ２、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ３及びｐｐｅ－ｍｉＲ－１６９ｃのａｇｏｍｉｒを用量４ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。図７～図９に示すように、本発明者らは、選択された４つのイワベンケイ由来のｓＲＮＡは、いずれも驚くほどマウスの死亡率を著しく低下させ、マウスの体重減少を大幅に遅らせ、マウスの肺線維症の症状を緩和できることを見出した。
上記の項目１．６によれば、ブレオマイシン誘導性マウス肺線維症モデルにおいて、上記の４つのイワベンケイ由来のｓＲＮＡの、線維化に対する効果を測定した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、ブレオマイシン（ＢＬＭ、Ｎｉｐｐｏｎ Ｋａｙａｋｕ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用量３．５Ｕ／ｋｇで気管内投与するとともに、ＮＣ ｓＲＮＡ、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ａ２、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ３及びｐｐｅ－ｍｉＲ－１６９ｃのａｇｏｍｉｒ（蘇州吉瑪遺伝子株式有限会社製）を用量８ｍｇ／ｋｇ、生理食塩水で希釈された１００μｌ全容量で気管内投与した。ブレオマイシン投与後７日目、１３日目及び１６日目にそれぞれＮＣ ｓＲＮＡ、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ａ２、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ３及びｐｐｅ－ｍｉＲ－１６９ｃのａｇｏｍｉｒを用量４ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。図７～図９に示すように、本発明者らは、選択された４つのイワベンケイ由来のｓＲＮＡは、いずれも驚くほどマウスの死亡率を著しく低下させ、マウスの体重減少を大幅に遅らせ、マウスの肺線維症の症状を緩和できることを見出した。
【0070】
２．２．３ ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイによる検出イワベンケイ由来のｓＲＮＡの抗線維化標的の検出
上記の項目１．７によれば、ルシフェラーゼレポーター遺伝子システムを使用してイワベンケイ由来のｓＲＮＡの細胞内標的遺伝子を検出した。図１０～図１２に示すように、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７は、α－ＳＭＡ、フィブロネクチン及びＣＯＬ３Ａ１を直接標的とすることにより抗線維化機能を発揮することができ、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ａ２は、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＧＦ－β及びＳＭＡＤ４を直接標的とすることにより抗線維化機能を発揮することができ、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ３は、ＣＯＬ１Ａ１及びＣＯＬ３Ａ１を直接標的とすることにより抗線維化機能を発揮することができる。
上記の項目１．７によれば、ルシフェラーゼレポーター遺伝子システムを使用してイワベンケイ由来のｓＲＮＡの細胞内標的遺伝子を検出した。図１０～図１２に示すように、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｍ７は、α－ＳＭＡ、フィブロネクチン及びＣＯＬ３Ａ１を直接標的とすることにより抗線維化機能を発揮することができ、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ａ２は、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＴＧＦ－β及びＳＭＡＤ４を直接標的とすることにより抗線維化機能を発揮することができ、ＨＪＴ－ｓＲＮＡ－ｈ３は、ＣＯＬ１Ａ１及びＣＯＬ３Ａ１を直接標的とすることにより抗線維化機能を発揮することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2021-10-28
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（ＧＵＡＵＧＵＡＡＡＣＡＵＣＣＵＣＧＡＣＵＧＧＡＡＧＣＵ）で示される配列、又はその相補的配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項2】
前記ポリヌクレオチドが含む配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で示される配列である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項3】
前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項4】
前記ポリヌクレオチドは、低分子ＲＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項5】
前記ポリヌクレオチドの長さは、１２～４０ヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項6】
前記ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項7】
前記ポリヌクレオチドは、一本鎖である、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項8】
前記ポリヌクレオチドは、合成された又はヒト人工染色体ベクターで発現されたものである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む又は発現する核酸発現ベクター。
【請求項10】
請求項１～８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、化粧品組成物。
【請求項11】
請求項１～８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、線維増殖性疾患及び／又は症候群を予防及び／又は治療するための医薬組成物。
【請求項12】
前記線維増殖性疾患及び／又は症候群は、肺、心血管系、肝臓、膵臓、腎臓、脾臓、眼、神経系、骨髄及び皮膚の線維増殖性疾患及び／又は症候群から選ばれる請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記線維増殖性疾患及び／又は症候群は、珪肺症、石綿肺及び炭鉱夫塵肺を含む無機粉塵職業病、農夫肺、空調肺、加湿器肺、鳥飼育者肺及び砂糖きび肺を含む有機粉塵・過敏性肺炎；抗生物質、非ステロイド性抗炎症薬、心血管薬、抗腫瘍薬、経口血糖降下薬、及びモルヒネ系薬物から選ばれる医薬／治療関連疾患；結核、ウイルス性肺炎、感染性肺嚢胞などの感染症；心不全、先天性心疾患、成人呼吸窮迫症候群、慢性心不全、移植拒絶反応に関連する肺疾患を含む続発性肺疾患；特発性間質性肺炎、器質化肺炎を伴う閉塞性細気管支炎、肺リンパ管平滑筋腫を含む原発性肺疾患；全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、進行性全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、混合性結合組織病に関連する肺疾患を含むコラーゲン血管疾患に関連する肺疾患；びまん性肺胞出血症候群、肺胞蛋白症、好酸球性肺炎、肺血管炎、リンパ球性間質性肺炎、壊死性結節性肉芽腫、家族性肺線維症を含む肺胞充填性病変；
心筋梗塞後の代替性及び反応性線維化を含む虚血性心疾患；高血圧性心疾患；ウイルス性心筋炎を含む炎症性心筋症；ヘモクロマトーシス型心筋症、アミロイドーシス型心筋症、グリコーゲン蓄積性心筋症、糖尿病性心筋症を含む代謝性心筋症；ケシャン病；拡張型心筋症；肥大型心筋症、制限型心筋症；不整脈原性右室心筋症；
Ｂ型、Ｃ型、およびＤ型ウイルス性肝炎を含むウイルス性肝硬変；住血吸虫性肝硬変；アルコール性肝硬変；原発性胆汁性肝硬変、続発性肝内胆石症、門脈周囲の炎症を含む胆汁性肝硬変；肝レンズ核変性症、ヘモクロマトーシスを含む代謝性肝硬変；有機リン中毒、四塩化炭素中毒、肝毒性薬剤例えばイソニアジド、テトラサイクリン、クロルプロマジン中毒を含む中毒性肝硬変；栄養失調性肝硬変；慢性うっ血性心不全を含む心原性肝硬変；
急性膵炎；膵管閉塞；慢性アルコール中毒；Ｏｄｄｉ括約筋機能異常；膵虚血；
高血圧を含む血管腎線維増殖性疾患及び／又は症候群；糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、強皮症、腎移植拒絶を含む免疫腎線維増殖性疾患及び／又は症候群；腎盂腎炎、腎結石などの感染性腎線維増殖性疾患及び／又は症候群；高脂血症、糖尿病、高尿酸血症、高カルシウム尿症を含む代謝性腎線維増殖性疾患及び／又は症候群；
脾臓線維増殖性疾患；
眼の外傷・術後の眼線維増殖性疾患及び／又は症候群、増殖性糖尿病網膜線維症；
脊髄外傷後の線維増殖性疾患及び／又は症候群、脳卒中瘢痕形成、アルツハイマー病；特発性・薬物誘発性骨髄線維症、真性赤血球増加症、慢性骨髄性白血病およびホジキン病；
粘膜線維症、瘢痕、ケロイド、および皮膚肥厚を含む皮膚線維増殖性疾患及び／又は症候群から選ばれる、請求項１２に記載の医薬組成物。
心筋梗塞後の代替性及び反応性線維化を含む虚血性心疾患；高血圧性心疾患；ウイルス性心筋炎を含む炎症性心筋症；ヘモクロマトーシス型心筋症、アミロイドーシス型心筋症、グリコーゲン蓄積性心筋症、糖尿病性心筋症を含む代謝性心筋症；ケシャン病；拡張型心筋症；肥大型心筋症、制限型心筋症；不整脈原性右室心筋症；
Ｂ型、Ｃ型、およびＤ型ウイルス性肝炎を含むウイルス性肝硬変；住血吸虫性肝硬変；アルコール性肝硬変；原発性胆汁性肝硬変、続発性肝内胆石症、門脈周囲の炎症を含む胆汁性肝硬変；肝レンズ核変性症、ヘモクロマトーシスを含む代謝性肝硬変；有機リン中毒、四塩化炭素中毒、肝毒性薬剤例えばイソニアジド、テトラサイクリン、クロルプロマジン中毒を含む中毒性肝硬変；栄養失調性肝硬変；慢性うっ血性心不全を含む心原性肝硬変；
急性膵炎；膵管閉塞；慢性アルコール中毒；Ｏｄｄｉ括約筋機能異常；膵虚血；
高血圧を含む血管腎線維増殖性疾患及び／又は症候群；糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、強皮症、腎移植拒絶を含む免疫腎線維増殖性疾患及び／又は症候群；腎盂腎炎、腎結石などの感染性腎線維増殖性疾患及び／又は症候群；高脂血症、糖尿病、高尿酸血症、高カルシウム尿症を含む代謝性腎線維増殖性疾患及び／又は症候群；
脾臓線維増殖性疾患；
眼の外傷・術後の眼線維増殖性疾患及び／又は症候群、増殖性糖尿病網膜線維症；
脊髄外傷後の線維増殖性疾患及び／又は症候群、脳卒中瘢痕形成、アルツハイマー病；特発性・薬物誘発性骨髄線維症、真性赤血球増加症、慢性骨髄性白血病およびホジキン病；
粘膜線維症、瘢痕、ケロイド、および皮膚肥厚を含む皮膚線維増殖性疾患及び／又は症候群から選ばれる、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項14】
さらに、他の抗線維化剤を含有する請求項１１～１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項15】
皮膚若返り美容法であって、それを必要とする対象に請求項１に記載のポリヌクレオチド、請求項９に記載のベクター、請求項１０に記載の化粧品組成物、又は請求項１１に記載の医薬組成物を投与する、美容法。
【請求項16】
細胞を請求項１に記載のポリヌクレオチド、請求項９に記載のベクター、請求項１０に記載の化粧品組成物、又は請求項１１に記載の医薬組成物と接触させることを含む、α－ＳＭＡ、フィブロネクチン、ＣＯＬ１Ａ１及びＰＡＩ－１から選択される、１つ又は複数の線維化関連遺伝子の発現を阻害する方法。