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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022025967
(43)【公開日】2022-02-10
(54)【発明の名称】ＮＴＣＰ中和抗体、医薬組成物及びＮＴＣＰ検出キット
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20220203BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220203BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220203BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20220203BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20220203BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220203BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20220203BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C07K16/28
A61K39/395 N
A61K39/395 D
A61P31/20
A61P1/16
A61P35/00
G01N33/53 D
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020129195
(22)【出願日】2020-07-30
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３１年度、日本医療研究開発機構、Ｂ型肝炎創薬実用化等研究事業、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】519135633
【氏名又は名称】公立大学法人大阪
(71)【出願人】
【識別番号】510192802
【氏名又は名称】国立研究開発法人国立国際医療研究センター
(74)【代理人】
【識別番号】100124431
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 順也
(74)【代理人】
【識別番号】100174160
【弁理士】
【氏名又は名称】水谷 馨也
(74)【代理人】
【識別番号】100175651
【弁理士】
【氏名又は名称】迫田 恭子
(72)【発明者】
【氏名】立花 太郎
(72)【発明者】
【氏名】伊原 寛一郎
(72)【発明者】
【氏名】下遠野 邦忠
(72)【発明者】
【氏名】西辻 裕紀
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA13
4C085AA14
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】本発明の目的は、ＮＴＣＰ中和活性を有する抗体を提供することにある。
【解決手段】ＮＴＣＰ中和抗体は、ＮＴＣＰをブロックすることでＨＢＶ侵入を防止するＨＢＶ感染阻害作用を利用して、Ｂ型肝炎の予防及び／又は治療等が可能となる。
【選択図】なし
【解決手段】ＮＴＣＰ中和抗体は、ＮＴＣＰをブロックすることでＨＢＶ侵入を防止するＨＢＶ感染阻害作用を利用して、Ｂ型肝炎の予防及び／又は治療等が可能となる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ）中和抗体。
【請求項2】
配列番号１又は配列番号２に示すアミノ酸配列の第３位のアミノ酸残基を含むエピトープに特異的に結合する、請求項１に記載のＮＴＣＰ中和抗体。
【請求項3】
以下の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域：
（１－１）配列番号３～配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
（１－２）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び
（１－３）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）
並びに
以下の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域：
（２－１）配列番号１３～配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
（２－２）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列若しくはＬｙｓ－Ｖａｌを有する軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び
（２－３）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）
を含む、請求項１又は２に記載のＮＴＣＰ中和抗体。
（１－１）配列番号３～配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
（１－２）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び
（１－３）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）
並びに
以下の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域：
（２－１）配列番号１３～配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
（２－２）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列若しくはＬｙｓ－Ｖａｌを有する軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び
（２－３）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）
を含む、請求項１又は２に記載のＮＴＣＰ中和抗体。
【請求項4】
以下の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域：
（１－１－i）配列番号３～配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（１－１－ii）配列番号３～配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（１－１－iii）配列番号３～配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）；
（１－２－i）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（１－２－ii）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（１－２－iii）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）；及び
（１－３－i）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（１－３－ii）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（１－３－iii）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）
並びに
以下の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域：
（２－１－i）配列番号１３～配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（２－１－ii）配列番号１３～配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（２－１－iii）配列番号１３～配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）；
（２－２－i）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（２－２－ii）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（２－２－iii）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）；及び
（２－３－i）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（２－３－ii）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（２－３－iii）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）
を含む、請求項１又は２に記載のＮＴＣＰ中和抗体。
（１－１－i）配列番号３～配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（１－１－ii）配列番号３～配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（１－１－iii）配列番号３～配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）；
（１－２－i）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（１－２－ii）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（１－２－iii）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）；及び
（１－３－i）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（１－３－ii）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（１－３－iii）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）
並びに
以下の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域：
（２－１－i）配列番号１３～配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（２－１－ii）配列番号１３～配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（２－１－iii）配列番号１３～配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）；
（２－２－i）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（２－２－ii）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（２－２－iii）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）；及び
（２－３－i）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（２－３－ii）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（２－３－iii）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）
を含む、請求項１又は２に記載のＮＴＣＰ中和抗体。
【請求項5】
モノクローナル抗体である、請求項１～４のいずれかに記載のＮＴＣＰ中和抗体。
【請求項6】
キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１～５のいずれかに記載のＮＴＣＰ中和抗体。
【請求項7】
請求項１～６のいずれかに記載のＮＴＣＰ中和抗体をコードするＤＮＡ。
【請求項8】
請求項１～７のいずれかに記載のＮＴＣＰ中和抗体を含有する、医薬組成物。
【請求項9】
Ｂ型肝炎の予防及び／又は治療に用いられる、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項10】
肝硬変及び／又は肝細胞癌の予防及び／又は治療に用いられる、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項11】
ヒト又はマウスに用いられる、請求項８～１０のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項12】
請求項１～７のいずれかに記載のＮＴＣＰ中和抗体を含有する、ＮＴＣＰ検出キット。
【請求項13】
マウスＮＴＣＰの検出に用いられる、請求項１２に記載のＮＴＣＰ検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＮＴＣＰ中和抗体、医薬組成物及びＮＴＣＰ検出キットに関する。
【背景技術】
【0002】
Ｂ型肝炎は、世界で最も多く見られる肝臓の感染症で、肝臓を攻撃して傷つけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を原因として発症する。全世界では、２０億人がＢ型肝炎の罹患歴があり、そのうち２億５，７００万人は慢性感染者であり、ウイルスを取り除くことができていない（非特許文献１）。
【0003】
慢性のＢ型肝炎は、肝硬変や肝細胞癌の発症リスクを高める主要な問題となっている。このため、ＨＢＶへの対策が公衆衛生上の急務であり、ＨＢＶを治療又は予防する医薬品の開発が強く求められている。
【0004】
ＨＢＶの治療法として、ＨＢＶを中和するヒトモノクローナル抗体が開発されており、この抗体が、ＨＢＶ感染マウスで治療的に作用し、ＨＢＶ予防および慢性ＨＢＶ感染症の治療の新規臨床候補として示唆されることが報告されている。しかしながら、ＨＢＶをターゲットにした治療薬は、ウイルスが変異する性質に鑑みると、ウイルス変異に伴って効力を失うこととなる。
【0005】
一方で、ＨＢＶの感染メカニズムが明らかになっている。具体的には、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ）がＨＢＶの侵入標的として働くことが報告されている（非特許文献２）。受容体であるＮＴＣＰはＨＢＶと異なり変異しないため、抗ＨＢＶ薬の標的として理想的である。このような観点から、ＮＴＣＰを標的とするモノクローナル抗体が作製されている（非特許文献３）。しかしながら、このモノクローナル抗体にはＮＴＣＰの中和活性は無い。つまり、ＮＴＣＰの中和活性を有する抗体の作製は未だ成功されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】“一般的情報”、［online］、２０２０年、HEPATITIS B FOUNDATION、［令和年６月４日検索］、インターネット＜URL：https://www.hepb.org/languages/japanese/general/＞
【非特許文献2】Inhibitors of hepatitis B virus attachment and entry.Lempp FA, Urban S. Intervirology. 2014;57(3-4):151-7. doi: 10.1159/000360948.
【非特許文献3】Development of a cell-based assay to identify hepatitis B virus entry inhibitors targeting the sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Miyakawa K et al., Oncotarget. 2018 May 4;9(34):23681-23694. doi: 10.18632/oncotarget.25348.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、ＮＴＣＰ中和活性を有する抗体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者は、これまでＮＴＣＰの中和活性を有する抗体は作製することができなかった理由を、ＮＴＣＰが複数回膜貫通型タンパク質であるため構造が複雑で、その細胞外領域が狭いことにあると考えた。そして、このようなＮＴＣＰの構造的特徴のため、抗原をマウスに免疫するような通常の抗体作製方法ではＮＴＣＰ中和活性を有する抗体を得ることができないと考えた。そこで、本発明者が鋭意検討した結果、ヒトＮＴＣＰをコードするｃＤＮＡをマウスに免疫し、マウス体内でヒトＮＴＣＰを発現させることを利用して抗体を産生させること、及び人工のレポーターＨＢＶを用いた独自の感染実験系によってスクリーニングすることで、ＮＴＣＰ和活性を有する抗体の取得に初めて成功した。本発明は、この知見に基づいてさらに検討を重ねることにより完成したものである。
【0009】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ）中和抗体。
項２． 配列番号１又は配列番号２に示すアミノ酸配列の第３位のアミノ酸残基を含むエピトープに特異的に結合する、項１に記載のＮＴＣＰ中和抗体。
項３． 以下の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域：
（１－１）配列番号３～配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
（１－２）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び
（１－３）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）
並びに
以下の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域：
（２－１）配列番号１３～配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
（２－２）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列若しくはＬｙｓ－Ｖａｌを有する軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び
（２－３）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）
を含む、項１又は２に記載のＮＴＣＰ中和抗体。
項４． 以下の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域：
（１－１－i）配列番号３～配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（１－１－ii）配列番号３～配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（１－１－iii）配列番号３～配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）；
（１－２－i）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（１－２－ii）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（１－２－iii）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）；及び
（１－３－i）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（１－３－ii）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（１－３－iii）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）
並びに
以下の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域：
（２－１－i）配列番号１３～配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（２－１－ii）配列番号１３～配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（２－１－iii）配列番号１３～配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）；
（２－２－i）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（２－２－ii）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（２－２－iii）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）；及び
（２－３－i）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（２－３－ii）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（２－３－iii）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）
を含む、項１又は２に記載のＮＴＣＰ中和抗体。
項５． モノクローナル抗体である、項１～４のいずれかに記載のＮＴＣＰ中和抗体。
項６． キメラ抗体又はヒト化抗体である、項１～５のいずれかに記載のＮＴＣＰ中和抗体。
項７． 項１～６のいずれかに記載のＮＴＣＰ中和抗体をコードするＤＮＡ。
項８． 項１～７のいずれかに記載のＮＴＣＰ中和抗体を含有する、医薬組成物。
項９． Ｂ型肝炎の予防及び／又は治療に用いられる、項８に記載の医薬組成物。
項１０． 肝硬変及び／又は肝細胞癌の予防及び／又は治療に用いられる、項８に記載の医薬組成物。
項１１． ヒト又はマウスに用いられる、項８～１０のいずれかに記載の医薬組成物。
項１２． 項１～７のいずれかに記載のＮＴＣＰ中和抗体を含有する、ＮＴＣＰ検出キット。
項１３． マウスＮＴＣＰの検出に用いられる、項１２に記載のＮＴＣＰ検出キット。
項１． タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ）中和抗体。
項２． 配列番号１又は配列番号２に示すアミノ酸配列の第３位のアミノ酸残基を含むエピトープに特異的に結合する、項１に記載のＮＴＣＰ中和抗体。
項３． 以下の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域：
（１－１）配列番号３～配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
（１－２）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び
（１－３）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）
並びに
以下の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域：
（２－１）配列番号１３～配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
（２－２）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列若しくはＬｙｓ－Ｖａｌを有する軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び
（２－３）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）
を含む、項１又は２に記載のＮＴＣＰ中和抗体。
項４． 以下の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域：
（１－１－i）配列番号３～配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（１－１－ii）配列番号３～配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（１－１－iii）配列番号３～配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）；
（１－２－i）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（１－２－ii）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（１－２－iii）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）；及び
（１－３－i）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（１－３－ii）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（１－３－iii）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）
並びに
以下の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域：
（２－１－i）配列番号１３～配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（２－１－ii）配列番号１３～配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（２－１－iii）配列番号１３～配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）；
（２－２－i）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（２－２－ii）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（２－２－iii）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）；及び
（２－３－i）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（２－３－ii）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（２－３－iii）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）
を含む、項１又は２に記載のＮＴＣＰ中和抗体。
項５． モノクローナル抗体である、項１～４のいずれかに記載のＮＴＣＰ中和抗体。
項６． キメラ抗体又はヒト化抗体である、項１～５のいずれかに記載のＮＴＣＰ中和抗体。
項７． 項１～６のいずれかに記載のＮＴＣＰ中和抗体をコードするＤＮＡ。
項８． 項１～７のいずれかに記載のＮＴＣＰ中和抗体を含有する、医薬組成物。
項９． Ｂ型肝炎の予防及び／又は治療に用いられる、項８に記載の医薬組成物。
項１０． 肝硬変及び／又は肝細胞癌の予防及び／又は治療に用いられる、項８に記載の医薬組成物。
項１１． ヒト又はマウスに用いられる、項８～１０のいずれかに記載の医薬組成物。
項１２． 項１～７のいずれかに記載のＮＴＣＰ中和抗体を含有する、ＮＴＣＰ検出キット。
項１３． マウスＮＴＣＰの検出に用いられる、項１２に記載のＮＴＣＰ検出キット。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、ＮＴＣＰ中和活性を有する抗体を提供することができる。このため、当該抗体がＮＴＣＰをブロックすることでＨＢＶ侵入を防止するＨＢＶ感染阻害作用を利用して、Ｂ型肝炎の予防及び／又は治療等が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】レポーターＨＢＶを用いたＮＴＣＰ中和抗体の感染試験結果を示す。
【図2】野生型ＨＢＶを用いたＮＴＣＰ中和抗体の感染試験結果を示す。
【図3】ＮＴＣＰ断片の発現試験結果を示す。
【図4】ＮＴＣＰ断片について、ｍｙｃタグ抗体及び５Ａ９Ｃ６を用いた発現試験結果を示す。
【図5】ヒトＮＴＣＰとマウスＮＴＣＰをＨｅｐＧ２について、５Ａ９Ｃ６を用いた発現試験結果を示す。
【図6】ＮＴＣＰ断片の変異体について、ｍｙｃタグ抗体及び５Ａ９Ｃ６との結合能を試験した結果を示す。
【図7】ＮＴＣＰ断片の変異体のうちＡ３Ｍについて、レポーターＨＢＶを用いた感染試験結果を示す。
【図8】５Ａ９Ｃ６を用いたＮＴＣＰの蛍光検出結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
１．ＮＴＣＰ中和抗体
本発明は、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ）中和抗体である。つまり、本発明のＮＴＣＰ中和抗体は、複数回膜貫通型タンパク質であるＮＴＣＰに対して特異的に結合する特異的結合能と共に、ＮＴＣＰがＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を侵入させる機能を阻害する中和能を有することを特徴とする。
本発明は、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ）中和抗体である。つまり、本発明のＮＴＣＰ中和抗体は、複数回膜貫通型タンパク質であるＮＴＣＰに対して特異的に結合する特異的結合能と共に、ＮＴＣＰがＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を侵入させる機能を阻害する中和能を有することを特徴とする。
【0013】
本発明のＮＴＣＰ中和抗体は、ヒトＮＴＣＰに対して中和能を有するが、好ましくはマウスＮＴＣＰに対しても中和能を有する。
【0014】
ヒトＮＴＣＰは配列番号１で表される、３４９アミノ酸残基からなる膜タンパク質である。本発明のＮＴＣＰ中和抗体は、配列番号１の細胞外ドメインにおける第３位（アラニン残基）に特異的に結合することができる。つまり、本発明のＮＴＣＰ中和抗体は、配列番号１の第３位を含むエピトープに特異的に結合することができる。
【0015】
マウスのＮＴＣＰは配列番号２で示される、３６２アミノ酸残基からなる膜タンパク質である。本発明のＮＴＣＰ中和抗体は、配列番号２の細胞外ドメインにおける第３位（アラニン残基）に特異的に結合する。つまり、本発明のＮＴＣＰ中和抗体は、配列番号２の第３位を含むエピトープに特異的に結合する。
【0016】
本発明のＮＴＣＰ中和抗体のエピトープは、配列番号１又は２の第３位のアミノ酸残基を含んでいればよく、具体的な例として、配列番号１又は２の第３位のアミノ酸残基を含む連続する３個、４個、又は５個のアミノ酸配列からなる線状エピトープが挙げられる。例えば、エピトープが配列番号１又は２の第３位を含む連続する３個のアミノ酸配列からなる線状エピトープである場合、当該線状エピトープの具体的な配列としては、配列番号１又は２の第１位～第３位、第２位～第４位、又は第３位～第５位を構成するアミノ酸配列が挙げられる。
【0017】
また、本発明のＮＴＣＰ中和抗体のエピトープは、好ましくは、配列番号１又は２の第３位のアミノ酸残基を含み、且つ、配列番号１又は２の第６位のアミノ酸残基を含まない。この場合において、本発明のＮＴＣＰ中和抗体のエピトープの具体的な配列としては、列番号１又は２の第１位～第４位、第２位～第５位、又は第１位～第５位を構成するアミノ酸配列が挙げられる。
【0018】
本発明のＮＴＣＰ中和抗体のＣＤＲ（相補性決定領域）は、当該技術分野で知られている任意の方法を使用して定義することができる。具体的には、ＣＤＲを定義する方法として、Ｋａｂａｔ番号付けプログラム（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， ３２， ２９８－３００ （２０１６））、ＩＭＧＴシステム（Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２７，５５－７７ （２００３））、及びＰａｒａｔｏｍｅアルゴリズム（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４０ （Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）： Ｗ５２１－４ （２０１２）． ｄｏｉ： １０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｓ４８０及びＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ．８（２）：ｅ１００２３８８ （２０１２））等が挙げられる。好ましくは、Ｋａｂａｔ番号付けプログラム、ＩＭＧＴシステム、及びＰａｒａｔｏｍｅアルゴリズムを組み合わせ（Ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／Ｐａｒａｔｏｍｅ）、これら３つの方法で定義される配列をすべて網羅するようにＣＤＲを決定することができる。
【0019】
本発明のＮＴＣＰ中和抗体の具体的なＣＤＲを下記表に示す。下記表において、配列番号３、７、１１、１３、１６及び１８に示すアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／Ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより定義されるものであり；配列番号４、８、１２、１３、１７及び１８に示すアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔにより定義されるものであり；配列番号５、９、１１、１４、Ｌｙｓ－Ｖａｌ、及び１８に示すアミノ酸配列は、ＩＭＧＴにより定義されるものであり；配列番号６、１０、１１、１５、１６及び１９は、Ｐａｒａｔｏｍｅにより定義されるものである。
【0020】
【表1】
【0021】
本発明のＮＴＣＰ中和抗体の好適な態様として、以下の（１－１）～（１－３）の重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域と、以下の（２－１）～（２－３）の軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域とを含むものが挙げられる。
【0022】
（１－１）配列番号３～配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
（１－２）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び
（１－３）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）；並びに
（２－１）配列番号１３～配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
（２－２）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列若しくはＬｙｓ－Ｖａｌを有する軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び
（２－３）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）
を含む軽鎖可変領域。
（１－２）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、及び
（１－３）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）；並びに
（２－１）配列番号１３～配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
（２－２）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列若しくはＬｙｓ－Ｖａｌを有する軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、及び
（２－３）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）
を含む軽鎖可変領域。
【0023】
また、本発明のＮＴＣＰ中和抗体は、以下の（１－１－i）～（１－１－iii）のいずれかの重鎖相補性決定領域、以下の（１－２－i）～（１－２－iii）のいずれかの重鎖相補性決定領域、及び以下の（１－３－i）～（１－３－iii）のいずれかの重鎖相補性決定領域を含む重鎖可変領域と、（２－１－i）～（２－１－iii）のいずれかの軽鎖相補性決定領域、以下の（２－２－i）～（２－２－iii）のいずれかの軽鎖相補性決定領域、及び以下の（２－３－i）～（２－３－iii）のいずれかの軽鎖相補性決定領域を含む軽鎖可変領域を含むものであってもよい。
【0024】
（１－１－i）配列番号３～配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（１－１－ii）配列番号３～配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（１－１－iii）配列番号３～配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）；
（１－２－i）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（１－２－ii）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（１－２－iii）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）；及び
（１－３－i）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（１－３－ii）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（１－３－iii）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）。
（１－１－ii）配列番号３～配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（１－１－iii）配列番号３～配列番号６のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）；
（１－２－i）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（１－２－ii）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（１－２－iii）配列番号７～配列番号１０のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）；及び
（１－３－i）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（１－３－ii）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（１－３－iii）配列番号１１又は配列番号１２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）。
【0025】
（２－１－i）配列番号１３～配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（２－１－ii）配列番号１３～配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（２－１－iii）配列番号１３～配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）；
（２－２－i）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（２－２－ii）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（２－２－iii）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）；及び
（２－３－i）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（２－３－ii）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（２－３－iii）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）。
（２－１－ii）配列番号１３～配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（２－１－iii）配列番号１３～配列番号１５のいずれかに示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）；
（２－２－i）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（２－２－ii）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（２－２－iii）配列番号１６又は配列番号１７に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）；及び
（２－３－i）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列と、
（２－３－ii）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列と、
（２－３－iii）配列番号１８又は配列番号１９に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列と、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）。
【0026】
上記（１－１－i）、（１－２－i）、（１－３－i）、（２－１－i）、（２－２－i）、（２－３－i）の、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入された重鎖及び／又は軽鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ及び／又はＬＣＤＲ；以下においてまとめてＣＤＲとも記載する）配列を含むＮＴＣＰ中和抗体は、ＮＴＣＰに対する中和活性が改変前のＣＤＲ配列を含むＮＴＣＰ中和抗体と同等又同等以上であることが望ましい。置換、欠失、付加及び／又は挿入されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１つのＣＤＲにつき１～３個、更に好ましくは１～２個、特に好ましくは１個が挙げられる。また、本発明のＮＴＣＰ中和抗体において、ＣＤＲ配列の中で、１つのアミノ酸配列に対して置換、欠失、付加及び／又は挿入されていてもよく、２以上のアミノ酸配列に対して置換、欠失、付加及び／又は挿入されてもよい。
【0027】
また、前記ＣＤＲのアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換に関しては、類似アミノ酸による置換（即ち保存的アミノ酸置換）は、抗体の中和活性に変化をもたらさないことが予測されるため好適である。具体的には、アミノ酸側鎖の性質に基づいて、次のような分類が確立している。
塩基性アミノ酸：リジン、アルギニン、ヒスチジン
酸性アミノ酸：グルタミン酸、アスパラギン酸
中性アミノ酸：グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、グルタミン、アスパラギン、プロリン
更に、前記中性アミノ酸は、極性側鎖を有するもの（アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するもの（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、アミド含有側鎖を有するもの（アスパラギン、グルタミン）、硫黄含有側鎖を有するもの（メチオニン、システイン）、芳香族側鎖を有するもの（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、水酸基含有側鎖を有するもの（セリン、トレオニン、チロシン）、脂肪族側鎖を有するもの（アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン）等に分類することもできる。
塩基性アミノ酸：リジン、アルギニン、ヒスチジン
酸性アミノ酸：グルタミン酸、アスパラギン酸
中性アミノ酸：グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、グルタミン、アスパラギン、プロリン
更に、前記中性アミノ酸は、極性側鎖を有するもの（アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するもの（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、アミド含有側鎖を有するもの（アスパラギン、グルタミン）、硫黄含有側鎖を有するもの（メチオニン、システイン）、芳香族側鎖を有するもの（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、水酸基含有側鎖を有するもの（セリン、トレオニン、チロシン）、脂肪族側鎖を有するもの（アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン）等に分類することもできる。
【0028】
１又は数個のアミノ酸残基を目的の他のアミノ酸に置換する方法については、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ－Ｇｏｔｏｈ Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ， Ｖｏｌ．１５２，ｐ．２７１－２７５（１９９５）； Ｚｏｌｌｅｒ ＭＪ． ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１００，ｐ．４６８－５００（１９８３）、Ｋｒａｍｅｒ Ｗ． ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｖｏｌ．１２，ｐ．９４４１－９４５６（１９８４）； Ｋｒａｍｅｒ Ｗ． ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１５４，ｐ．３５０－３６７（１９８７）； Ｋｕｎｋｅｌ ＴＡ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．８２，ｐ．４８８－４９２（１９８５）等）が知られており、当該部位特異的変異誘発法を用いてＣＤＲのアミノ酸配列にアミノ酸置換を行うことができる。また、他のアミノ酸に置換する方法としては、ＷＯ２００５／０８０４３２に記載されているライブラリー技術が挙げられる。
【0029】
上記（１－１－ii）、（１－２－ii）、（１－３－ii）、（２－１－ii）、（２－２－ii）、（２－３－ii）の、８０％以上の相同性を有するＣＤＲ配列を含むＮＴＣＰ中和抗体は、ＮＴＣＰに対する中和活性が改変前のＣＤＲ配列を含むＮＴＣＰ中和抗体と同等又同等以上であることが望ましい。配列同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは８５％以上又は９０％以上、更に好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、又は９８％以上、特に好ましくは９９％以上が挙げられる。ここで、配列番号３～配列番号１９に示すアミノ酸配列に対する配列同一性とは、配列番号３～配列番号１９に示すアミノ酸配列と比較して算出される配列同一性である。
【0030】
また、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴ ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２ ｂｉｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７－２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
【0031】
上記（１－１－iii）、（１－２－iii）、（１－３－iii）、（２－１－iii）、（２－２－iii）、（２－３－iii）における「ストリンジェントな条件下」とは、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Ｄｅｎｈａｒｔｚ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃～６５℃で４時間～一晩保温する条件をいう。
【0032】
ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、具体的には、以下の手法によって行われる。即ち、ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、32Ｐでラベルした各プローブを加えて、６５℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズしているＤＮＡを検出することができる。
【0033】
本発明のＮＴＣＰ中和抗体において、可変領域中のフレームワーク領域は、ＮＴＣＰに対する中和活性に実質的な影響を及ぼさない限り、特に限定されない。本発明のＮＴＣＰ中和抗体の具体的な配列としては、重鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号２０、軽鎖可変領域のアミノ酸配列として配列番号２１が挙げられる。また、本発明のＮＴＣＰ中和抗体において、定常領域のアミノ酸配列も、ＮＴＣＰに対する中和活性に実質的な影響を及ぼさない限り、特に限定されない。
【0034】
配列番号３～配列番号１９に示すＣＤＲのアミノ酸配列は、マウス抗体由来であり、本発明のＮＴＣＰ中和抗体は、マウス抗体であってもよいが、好ましくはキメラ抗体及びヒト化抗体が挙げられる。
【0035】
キメラ抗体とは、互いに由来の異なる領域同士を連結した抗体である。本発明のＮＴＣＰ中和抗体をキメラ抗体にする場合、医薬組成物や各種疾患の治療剤として用いる場合には、マウス抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域から構成されるマウス－ヒトキメラ抗体であることが好ましい。また、ＮＴＣＰの検出用キットに用いられる場合には、マウス－ヒトキメラ抗体、マウス抗体由来の可変領域とウサギ抗体由来の定常領域から構成されるマウス－ウサギキメラ抗体やマウス抗体由来の可変領域とヤギ抗体由来の定常領域から構成されるマウス－ヤギキメラ抗体も使用できる。
【0036】
また、ヒト化抗体とは、非ヒト由来のＣＤＲ配列をヒト抗体のフレームワーク領域上に移植したものであり、非ヒト由来抗体のＣＤＲとヒト抗体由来のフレームワーク領域とヒト抗体由来の定常領域とから構成される抗体である。ヒト化抗体は、ヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明のＮＴＣＰ中和抗体を医薬用途に使用する場合に好適である。
【0037】
キメラ抗体は、例えば、前記各ＣＤＲのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有するマウス抗体の定常領域をヒト抗体の定常領域に置換することにより作製することができる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．８１，ｐ．６８５１－６８５５（１９８４）； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１２，ｐ．６０４－６０８（１９８４）； Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３１４，ｐ．４５２－４５４（１９８５）等）。ヒト抗体の定常領域については公知のものを用いることができる。具体的には、以下の方法により、マウス－ヒトキメラ抗体を作製することができる。
【0038】
まず、所定のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含むマウス重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、化学合成、生化学的切断、再結合等により作製する。得られた重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、ヒト重鎖定常領域をコードするＤＮＡとライゲーションして発現用ベクターに組込むことにより重鎖発現ベクターを作製する。同様の方法で、軽鎖発現ベクターを作製する。得られた重鎖発現ベクター及び軽鎖発現ベクターを用いて、ＨＥＫ２９３細胞株、ＣＨＯ細胞、ＳＰ２／０細胞等の宿主細胞を共形質転換する。形質転換体を培養した後、形質転換体の培養液から目的のキメラ抗体を分離する。また、マウス－ヒトキメラ抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域中のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ， Ｋ．ｅｔａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．５３，ｐ．８５１－８５６（１９９３））。
【0039】
また、ヒト化抗体は、例えば、前記各アミノ酸配列を含むＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域上に移植することにより作製できる（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３２１，ｐ．５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３３２，ｐ．３２３－３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３９，ｐ．１５３４－１５３６（１９８８））。ＣＤＲ配列のうち、ＨＣＤＲ１（配列番号３）をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号２２に示し、ＨＣＤＲ２（配列番号７）をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号２３に示し、ＨＣＤＲ３（配列番号１１）をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号２４に示す。ＬＣＤＲ１（配列番号１３）をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号２５に示し、ＬＣＤＲ２（配列番号１６）をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号２６に示し、ＬＣＤＲ３（配列番号１８）をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号２７に示す。また、ＣＤＲ配列のうち、配列番号４、５、６は配列番号３の一部の配列で構成され、配列番号８、９、１０は配列番号７の一部で構成され、配列番号１２は配列番号１１の一部の配列で構成され、配列番号１７及びＬｙｓ－Ｖａｌは配列番号１６の一部の配列で構成され、配列番号１９は配列番号１８の一部の配列で構成されているから、これら配列番号４、５、６、８、９、１０、１２、１４、１５、１７、Ｌｙｓ－Ｖａｌ及び配列番号１９をコードするＤＮＡの塩基配列は、配列番号２２～２７に示す配列の一部で構成される配列として決定することができる。具体的には、以下の方法により、ヒト化抗体を作製することができる。
【0040】
所定のアミノ酸配列を有するＣＤＲと、４つのヒト抗体由来のフレームワーク領域を所定の順に連結した重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、化学合成、生化学的切断、再結合等により作製する。ここで、ヒト化抗体の各ＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成できるようにフレームワーク領域のアミノ酸を置換、欠失及び／又は付加等の変異を加えていてもよい（Ｓａｔｏ， Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．５３，ｐ．８５１－８５６（１９９３））。得られた重鎖可変領域をコードするＤＮＡを、ヒト重鎖定常領域をコードするＤＮＡとライゲーションして発現用ベクターに組込むことにより重鎖発現ベクターを作製する。同様に、軽鎖重鎖発現ベクターを作製する。得られた重鎖発現ベクター及び軽鎖発現ベクターを用いて、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞株（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＣＨＯ細胞、ＳＰ２／０細胞等の宿主細胞を共形質転換する。形質転換体を培養した後、形質転換体の培養液から目的のヒト化抗体を分離する。なお、ヒト抗体の定常領域については公知のものを用いることができる。
【0041】
また、本発明のＮＴＣＰ中和抗体のアイソタイプについては特に制限されないが、例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥが挙げられる。これらの中でも、ＩｇＧが好適である。
【0042】
本発明のＮＴＣＰ中和抗体の形態は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、モノクローナル抗体であることが好ましい。モノクローナル抗体の作製方法は特に限定されないが、例えば、“Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ，
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ．， Ｎａｔｕｒｅ． １９７５ Ａｕｇ ７；２５６（５５１７）：４９５－４９７．”に掲載されているようなハイブリドーマ法；米国特許第４８１６
５６７号に記載されているような組換え法；“Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａ
ｔｕｒｅ． １９９１ Ａｕｇ １５；３５２（６３３６）：６２４－６２８．”、又は
“Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９１ Ｄｅｃ ５；２２
２（３）：５８１－５９７．”に記載されているようなファージ抗体ライブラリーから単
離する方法、“タンパク質実験ハンドブック， 羊土社（２００３）：９２－９６．”に
掲載されている方法等により作製することができる。
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ．， Ｎａｔｕｒｅ． １９７５ Ａｕｇ ７；２５６（５５１７）：４９５－４９７．”に掲載されているようなハイブリドーマ法；米国特許第４８１６
５６７号に記載されているような組換え法；“Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａ
ｔｕｒｅ． １９９１ Ａｕｇ １５；３５２（６３３６）：６２４－６２８．”、又は
“Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９１ Ｄｅｃ ５；２２
２（３）：５８１－５９７．”に記載されているようなファージ抗体ライブラリーから単
離する方法、“タンパク質実験ハンドブック， 羊土社（２００３）：９２－９６．”に
掲載されている方法等により作製することができる。
【0043】
また、本発明のＮＴＣＰ中和抗体には、前記の抗原結合領域を含む限り、全長抗体（Ｆａｂ領域とＦｃ領域を有する抗体）のみならず、断片抗体も包含される。このような断片抗体として、Ｆｖ抗体、Ｆａｂ抗体、Ｆａｂ'抗体、Ｆ（ａｂ'）2抗体、ｓｃＦｖ抗体、ｄｓＦｖ抗体、ダイアボディ、ナノボディ等が挙げられる。また、本発明のＮＴＣＰ中和抗体には、前記の抗原結合領域を含む限り、多価特異性抗体（例えば二重特異性抗体）も包含する。これらの断片抗体及び多重特異性抗体は、従来公知の方法に従って作製することができる。
【0044】
本発明のＮＴＣＰ中和抗体は、ポリエチレングリコール、放射性物質、トキシン等の各種化合物と結合したコンジュゲート抗体又はコンジュゲート抗体断片であってもよい。また、本発明のＮＴＣＰ中和抗体は、必要に応じて、結合している糖鎖が改変されていてもよいし、他のタンパク質が融合していてもよい。
【0045】
２．ＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、上記のＮＴＣＰ中和抗体をコードしているＤＮＡである。本発明のＤＮＡは、例えば、上記のＮＴＣＰ中和抗体をコードしているＤＮＡを鋳型として、少なくともＮＴＣＰ中和抗体をコードしている領域をＰＣＲ等によって取得することにより得ることができる。また、本発明ＤＮＡは、遺伝子の合成法によって人工合成することもできる。
本発明のＤＮＡは、上記のＮＴＣＰ中和抗体をコードしているＤＮＡである。本発明のＤＮＡは、例えば、上記のＮＴＣＰ中和抗体をコードしているＤＮＡを鋳型として、少なくともＮＴＣＰ中和抗体をコードしている領域をＰＣＲ等によって取得することにより得ることができる。また、本発明ＤＮＡは、遺伝子の合成法によって人工合成することもできる。
【0046】
また、ＤＮＡの塩基配列の特定の部位に特定の変異を導入する場合、変異導入方法は公知であり、例えばＤＮＡの部位特異的変異導入法等が利用できる。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば、市販のキットを用いて行うこともできる。
【0047】
塩基配列に変異を導入したＤＮＡは、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を確認することができる。一旦、塩基配列が確定されると、その後は化学合成、クローニングされたプローブを鋳型としたＰＣＲ、又は当該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとするハイブリダイゼーションによって、前記ＮＴＣＰ中和抗体をコードするＤＮＡを得ることができる。
【0048】
また、部位特異的突然変異誘発法等によって前記ＮＴＣＰ中和抗体をコードするＤＮＡの変異型であって変異前と同等の機能を有するものを合成することができる。なお、前記ＮＴＣＰ中和抗体をコードするＤＮＡに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、メガプライマーＰＣＲ法等の公知の手法によって行うことができる。
【0049】
本発明のＤＮＡの塩基配列については、当業者であれば、本発明のＮＴＣＰ中和抗体の上記ＣＤＲの配列に従って適宜設計可能である。
【0050】
例えば、本発明のＤＮＡに含まれる重鎖可変領域をコードする塩基配列として、配列番号２８に示す塩基配列（配列番号２０で示される重鎖可変領域をコードする塩基配列）、及び軽鎖可変領域をコードする塩基配列として配列番号２９に示す塩基配列（配列番号２１で示される軽鎖可変領域をコードする塩基配列）が挙げられる。
【0051】
また、本発明のＤＮＡに含まれる重鎖可変領域をコードする塩基配列の他の例として、上記ＣＤＲを含む重鎖可変領域をコードし、且つ、配列番号２８及び配列番号２９に示す塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列も挙げられる。上記相同性として、好ましくは８５％以上又は９０％以上、更に好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、又は９８％以上、特に好ましくは９９％以上が挙げられる。また、「配列同一性」については上述の通りである。
【0052】
更に、本発明のＤＮＡに含まれる重鎖可変領域をコードする塩基配列の更なる例として、上記ＣＤＲを含む重鎖可変領域をコードし、且つ、配列番号２８及び配列番号２９に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列も挙げられる。また、「ストリンジェントな条件下」については上述の通りである。
【0053】
本発明のＤＮＡは、コドン利用頻度を宿主に最適化したものが好ましい。例えば、宿主として大腸菌を使用する場合であれば、コドン利用頻度を大腸菌に最適化させたＤＮＡが好適である。
【0054】
３．組換えベクター
組換えベクターは、本発明のＤＮＡを含む。本発明の組換えベクターは、発現ベクターに本発明のＤＮＡを挿入することにより得ることができる。
組換えベクターは、本発明のＤＮＡを含む。本発明の組換えベクターは、発現ベクターに本発明のＤＮＡを挿入することにより得ることができる。
【0055】
組換えベクターには、本発明のＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーター等の制御因子が含まれる。制御因子としては、代表的にはプロモーターが挙げられるが、更に必要に応じてエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位等の転写要素が含まれていてもよい。また、作動可能に連結とは、本発明のＤＮＡを調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の制御因子と本発明のＤＮＡが、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。
【0056】
発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージ、プラスミド、又はウイルスから遺伝子組換え用として構築されたものが好適である。具体的には、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ－Ｂｌｕｅ）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０）、酵母由来プラスミド（例えばｐＳＨ１９）、動物細胞発現プラスミド（例えばｐＡ１－１１、ｐｃＤＮＡ３．１－Ｖ５／Ｈｉｓ－ＴＯＰＯ）、λファージなどのバクテリオファージ、ウイルス由来のベクター等が挙げられる。
【0057】
４．形質転換体
形質転換体は、上記の本発明のＤＮＡ又は上記の組換えベクターを用いて宿主を形質転換することによって得られる。
形質転換体は、上記の本発明のＤＮＡ又は上記の組換えベクターを用いて宿主を形質転換することによって得られる。
【0058】
形質転換体の製造に使用される宿主としては、遺伝子の導入が可能であり、且つ自律増殖可能で本発明の遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、ヒト及びヒトを除く哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ウシ、サル等）の細胞、より具体的には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、サル細胞ＣＯＳ－７、ヒト胎児由来腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）；昆虫細胞；植物細胞；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等に属する細菌；放線菌等；酵母等；糸状菌等が挙げられる。
【0059】
形質転換体は、宿主に上記の本発明のＤＮＡ又は上記の組換えベクターを導入することによって得ることができる。本発明のＤＮＡ又は組換えベクターを導入する方法は、目的の遺伝子が宿主に導入できる限り特に限定されない。また、ＤＮＡを導入する場所も、目的の遺伝子が発現できる限り特に限定されず、プラスミド上であってもよいし、ゲノム上であってもよい。本発明のＤＮＡ又は組換えベクターを導入する具体的な方法としては、例えば、組換えベクター法、ゲノム編集法が挙げられる。
【0060】
宿主に本発明のＤＮＡ又は組換えベクターを導入する条件は、導入方法及び宿主の種類等に応じて適宜設定すればよい。宿主が細菌の場合であれば、例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセルを用いる方法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が酵母の場合であれば、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、スフェロプラスト法及び酢酸リチウム法等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等が挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合であれば、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法及びエレクトロポレーション法等が挙げられる。宿主が植物の場合であれば、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法及びＰＥＧ法等が挙げられる。
【0061】
５．ＮＴＣＰ中和抗体の製造方法
本発明のＮＴＣＰ中和抗体は、前記の形質転換体を培養することによって製造することができる。形質転換体の培養条件は、宿主の栄養生理的性質を考慮して適宜設定すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられる。得られた培養物から、適宜ＮＴＣＰ中和抗体を回収し、精製することができる。
本発明のＮＴＣＰ中和抗体は、前記の形質転換体を培養することによって製造することができる。形質転換体の培養条件は、宿主の栄養生理的性質を考慮して適宜設定すればよいが、好ましくは液体培養が挙げられる。得られた培養物から、適宜ＮＴＣＰ中和抗体を回収し、精製することができる。
【0062】
６．医薬組成物
本発明は、前記本発明のＮＴＣＰ中和抗体を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、ＮＴＣＰ中和抗体を有効成分として、ＮＴＣＰのトランスポーター機能を効果的に阻害することで、薬理効果を奏することができる。
本発明は、前記本発明のＮＴＣＰ中和抗体を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、ＮＴＣＰ中和抗体を有効成分として、ＮＴＣＰのトランスポーター機能を効果的に阻害することで、薬理効果を奏することができる。
【0063】
本発明の医薬組成物は、前記本発明のＮＴＣＰ中和抗体を有効量含んでさえいればよく、その他に、医薬的に許容される担体又は添加剤を含んでいてもよい。このような担体又は添加剤としては、例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、矯味剤等が挙げられる。
【0064】
また、本発明の医薬組成物の投与形態については、経口的又は非経口的のいずれであってもよく、具体的には、経口投与；静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、経
鼻投与、経肺投与、経皮投与、経粘膜投与、眼内投与等の非経口投与が挙げられる。
鼻投与、経肺投与、経皮投与、経粘膜投与、眼内投与等の非経口投与が挙げられる。
【0065】
本発明の医薬組成物の製剤形態については、採用する投与形態に応じて、その製剤形態を適宜設定することができる。例えば、経口投与で使用される場合には、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の製剤形態に調製すればよく、非経口投与で使用される場合には、液剤、懸濁液、エマルジョン、スプレー剤、坐剤、点眼剤等の製剤形態に調製すればよい。
【0066】
本発明の医薬組成物は、上記本発明のＮＴＣＰ中和抗体の作用により、ＮＴＣＰがＨＢＶの細胞内侵入を媒介する機能を効果的に阻害できるため、ＨＢＶの感染を阻害する用途に有効に用いることができる。具体的には、本発明の医薬組成物は、ＨＢＶの感染予防によるＢ型肝炎の予防、及び／又は、ＨＢＶの感染連鎖を阻害することによる治療に用いることができる。また、これまでのＮＴＣＰを標的とする低分子化合物の中には、ＨＢＶの細胞内侵入を阻害するとともにＮＴＣＰ本来の機能である肝細胞への胆汁酸取り込みを阻害するものがあったが、本発明のＮＴＣＰ中和抗体は胆汁酸取り込みを阻害せずにＨＢＶの侵入を阻害することが期待できるため、本発明の医薬組成物は、胆汁酸取り込みの副作用の回避が期待できる。
【0067】
特に、本発明の医薬組成物は、ＨＢＶワクチンが無効である患者に対する感染予防、及び免疫不全等によりＨＢＶが活性化した患者に対する再感染予防を目的として好適に用いられる。
【0068】
さらに、本発明の医薬組成物は、ＨＢＶの感染連鎖を阻害することによりＢ型肝炎の憎悪及び進展に関する病態に対して予防及び／又は治療効果を示すため、肝硬変及び／又は肝細胞癌の予防及び／又は治療を目的としても好適に用いられる。
【0069】
本発明の医薬組成物は、Ｂ型肝炎の予防及び／又は治療に用いられる場合、ＨＢＶワクチン、Ｂ型肝炎治療薬等の、他のＢ型肝炎の予防及び／又は治療に用いられる薬剤と併用してもよい。また、本発明の医薬組成物は、肝硬変及び／又は肝細胞癌の予防及び／又は治療に用いられる場合、他の肝硬変及び／又は肝細胞癌の予防及び／又は治療に用いられる薬剤と併用してもよい。本発明の医薬組成物が他の薬剤と併用される場合、前記本発明のＮＴＣＰ中和抗体と他の薬剤を同一の医薬組成物に含有させて製剤化してもよく、また前記本発明のＮＴＣＰ中和抗体と他の薬剤を別々の医薬組成物に含有させて製剤化してもよい。
【0070】
上記本発明のＮＴＣＰ中和抗体は、ヒトのＮＴＣＰだけでなくマウスのＮＴＣＰに対しても共通して中和活性を示すため、本発明の医薬組成物は、ヒト又はマウスに対して適用することができる。
【0071】
本発明の医薬組成物の投与量及び投与回数は、投与形態、患者の年齢や体重、疾患の種類や症状の程度等によって異なり、一律に規定することはできないが、例えばヒトの場合、１回の投与当たり、上記本発明のＮＴＣＰ中和抗体の重量換算で１２０ｍｇ～４８０ｍｇに相当する量を、７～３０日に１回程度の頻度で投与すればよい。なお、投与回数を減らすために徐放性製剤を用いること、又はオスモティックポンプ等で長期間にわたって少量ずつ投与することもできる。これらのいずれの投与方法においても、ＮＴＣＰの活性を充分に阻害する濃度になるような投与経路、投与方法を採用することが好ましい。
【0072】
７．ＮＴＣＰ検出キット
本発明は、上記本発明のＮＴＣＰ中和抗体を利用したＮＴＣＰ検出キットを提供する。本発明のＮＴＣＰ検出キットは、上記本発明のＮＴＣＰ中和抗体と、検体中のＮＴＣＰとの抗原抗体反応を利用して検体中のＮＴＣＰを免疫測定することができる。
本発明は、上記本発明のＮＴＣＰ中和抗体を利用したＮＴＣＰ検出キットを提供する。本発明のＮＴＣＰ検出キットは、上記本発明のＮＴＣＰ中和抗体と、検体中のＮＴＣＰとの抗原抗体反応を利用して検体中のＮＴＣＰを免疫測定することができる。
【0073】
検体としては、ＮＴＣＰの検出が求められるものであることを限度として特に制限されず、具体的には、肝細胞組織、幹細胞、及びこれらの抽出液等が挙げられる。
【0074】
本発明のＮＴＣＰ検出キットは、サンドイッチ法、競合法、凝集法等のいずれの免疫測定に基づいていてもよい。また、免疫測定としては、標識の種類に応じて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法、放射性同位体免疫測定法等が挙げられ、測定の簡易性及び／又は迅速性の観点から、好ましくは酵素免疫測定法が挙げられる。
【0075】
また、本発明の本発明のＮＴＣＰ検出キットには、前記本発明のＮＴＣＰ中和抗体以外に、更に免疫測定の測定原理や標識の種類に応じて、他の試薬や器具が含まれていてもよい。例えば、酵素免疫測定法を選択する場合、前記本発明のＮＴＣＰ中和抗体以外に、測定プレート、色原性基質溶液、反応停止液、洗浄液、標準溶液等が含まれていてもよい。また、サンドイッチ法を採用する場合には、キャプチャー抗体として使用される前記本発明のＮＴＣＰ中和抗体は、固相に固定化された状態で提供されてもよい。
【0076】
上記本発明のＮＴＣＰ中和抗体は、ヒトのＮＴＣＰだけでなくマウスのＮＴＣＰに対しても共通して結合活性を示すため、本発明のＮＴＣＰ検出キットは、マウスの実験系において好適に用いることができる。
【実施例0077】
以下に本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されて解釈されるものではない。
【0078】
［試験例１：ＤＮＡ免疫及び腸骨リンパ節法によるモノクローナル抗体作製及び一次スクリーニング］
マウスへのＤＮＡ免疫用プラスミドを構築するため、ＰＣＲで増幅したＮＴＣＰ遺伝子断片をｐＤＮＡｉｍｍｕ３ベクターに挿入し、ｐＤＮＡｉｍｍｕ３－ＮＴＣＰを得た。ｐＤＮＡｉｍｍｕ３－ＮＴＣＰプラスミド溶液をマウス腹側皮内に注射し、電気穿孔法にてプラスミドをマウスの皮内細胞に導入した。１２週間後、ｐＣＡＮ－ＮＴＣＰプラスミドを導入することによって２９３細胞ＮＴＣＰを強制発現させたＮＴＣＰ強制発現２９３細胞を、マウスの尾部に免疫し、４日後に脾臓を採取した。
マウスへのＤＮＡ免疫用プラスミドを構築するため、ＰＣＲで増幅したＮＴＣＰ遺伝子断片をｐＤＮＡｉｍｍｕ３ベクターに挿入し、ｐＤＮＡｉｍｍｕ３－ＮＴＣＰを得た。ｐＤＮＡｉｍｍｕ３－ＮＴＣＰプラスミド溶液をマウス腹側皮内に注射し、電気穿孔法にてプラスミドをマウスの皮内細胞に導入した。１２週間後、ｐＣＡＮ－ＮＴＣＰプラスミドを導入することによって２９３細胞ＮＴＣＰを強制発現させたＮＴＣＰ強制発現２９３細胞を、マウスの尾部に免疫し、４日後に脾臓を採取した。
【0079】
採取した脾臓からリンパ球を単離し、ポリエチレングリコールを用いてマウスミエローマ細胞株Ｓｐ２と融合させ、融合細胞（ハイブリドーマ）を得た。ハイブリドーマを９６ウエルプレートに播種し、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、１００ｍＭヒポキサンチン（ＳＩＧＭＡ）、０．４ｍＭアミノプテリン（ＳＩＧＭＡ）、１６ｍＭチミジン（Ｗａｋｏ）を添加した培地中で培養した。
【0080】
７日後、各ハイブリドーマの培養上清を使い、ＮＴＣＰ強制発現２９３細胞との反応性をフローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ）でスクリーニングした。その結果、ＮＴＣＰ強制発現細胞を認識する陽性４ウェルを得た。これら陽性４ウェルのハイブリドーマについて限界希釈法にてクローニングを行い、４クローン（１Ｄ１Ａ２，５Ａ９Ｃ６，６Ｃ５Ｃ８，６Ｄ１０Ｂ４）のＮＴＣＰ認識モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを樹立した。アイソタイピングキット（ＢＤ）を使って抗体のアイソタイプを調べたところ、１Ｄ１Ａ２がＩｇＧ２ａ（ｋ型）、５Ａ９Ｃ６がＩｇＧ１（ｋ型）、６Ｃ５Ｃ８がＩｇＧ２ｂ（ｋ型）、６Ｄ１０Ｂ４がＩｇＧ２ｂ（ｋ型）であった。各抗体は、ハイブリドーマの培養上清からイオン交換カラムを使って精製し、後述の試験例に用いた。
【0081】
なお、５Ａ９Ｃ６の抗体遺伝子可変領域の配列を決定するため、５Ａ９Ｃ６産生ハイブリドーマをＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）で溶解し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ｔｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型にマウスＩｇＧ１特異的プライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行い、重鎖および軽鎖抗体遺伝子をクローニングした。その結果、重鎖可変領域として配列番号２８に示す塩基配列、軽鎖可変領域として配列番号２９に示す塩基配列を決定した。
【0082】
［試験例２：レポーターＨＢＶを用いたＮＴＣＰ中和抗体のスクリーニング（二次スクリーニング）］
本試験例では、ＨｅｐＧ２にＮＴＣＰを強制発現させたＮＴＣＰ強制発現細胞（ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ）にＮａｎｏＬｕｃ（ＮＬ）を発現するレポーターＨＢＶを感染させる感染実験系を用い、試験例１で得たモノクローナル抗体を添加することにより、感染阻害の如何をＮＬ活性に基づいて評価した。
本試験例では、ＨｅｐＧ２にＮＴＣＰを強制発現させたＮＴＣＰ強制発現細胞（ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ）にＮａｎｏＬｕｃ（ＮＬ）を発現するレポーターＨＢＶを感染させる感染実験系を用い、試験例１で得たモノクローナル抗体を添加することにより、感染阻害の如何をＮＬ活性に基づいて評価した。
【0083】
ＨｅｐＧ２細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ナカライテスク）、及び１００Ｕ／ｍｌ非必須アミノ酸（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて培養した。
【0084】
ＰＣＲで増幅したＮＴＣＰ－ｍｙｃ断片をｐＣＡＮプラスミドに挿入し、ｐＣＡＮ－ＮＴＣＰ－ｍｙｃを得た。ｐＣＡＮ－ＮＴＣＰ－ｍｙｃをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（インビトロジェン）でＨｅｐＧ２細胞に導入し、５００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８（インビトロジェン）で１か月クローンを選択し、ＮＴＣＰ－ｍｙｃを発現するＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ－ｍｙｃを樹立した。
【0085】
ｐＨＢＶ１．２／ＮＬ（ＮａｎｏＬｕｃ）及びｐＨＢＶ－ｄｅｌｔａ ｅｐｓｉｌｏｎをＬｉｐｏｆｅｃａｔａｍｉｎ３０００でＨｅｐＧ２細胞に導入し、１週間後、上清を０．４５μｍフィルターに通した。さらにＰＥＧ溶液（１３％ ＰＥＧ６０００、１．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＨＥＰＳ ｐＨ７．６）により、１００，０００ｇで３時間遠心し、ペレットをＴＮＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で懸濁し、５００倍濃縮することによって、ＮＬを発現するレポーターＨＢＶを得た。
【0086】
９６ウェルコラーゲンコートプレートにＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ－ｍｙｃを５万細胞／ウェルとなるように播いて、２４時間３７℃、５％ＣＯ2で培養した。試験例１で得られたモノクローナル抗体（Ｃ５Ｃ８、５Ａ９Ｃ６、１Ｄ１Ａ２、６Ｄ１０Ｂ４）、及びコントロール抗体（ＮＴＣＰに結合しない抗ＴＯＭＭ３４モノクローナル抗体（ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ）：ネガティブコントロール）については、６．２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、又は２００μｇ／ｍｌの濃度で、ＰｒｅＳ１（感染阻害ペプチド：ポジティブコントロール）については０．６２５ｎＭ、１．２５ｎＭ、２．５ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、又は２０ｎＭの濃度で、１時間、ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ－ｍｙｃ処理し、ＮＬを発現するレポーターＨＢＶを２００μｇ／ｍｌの抗体共存下で感染させた。
【0087】
感染５日後、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ(R) Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ；１１１０、プロメガ社）を用いてＮＬ活性を測定した結果を図１に示す。図１に示すとおり、５Ａ９Ｃ６がウイルス感染を約５０％阻害するＮＴＣＰ中和抗体であることが認められた。なお、細胞毒性をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（プロメガ）で測定した結果、５Ａ９Ｃ６に対する毒性はないことを確認した。
【0088】
［試験例３：野生型ＨＢＶを用いたＮＴＣＰ中和活性の確認］
本試験例では、初代肝培養細胞（フェニックスバイオ社）及び野生型ＨＢＶを用い、試験例２で中和活性を確認した５Ａ９Ｃ６の、野生型ＢＨＶに対する感染阻害効果を確認した。
本試験例では、初代肝培養細胞（フェニックスバイオ社）及び野生型ＨＢＶを用い、試験例２で中和活性を確認した５Ａ９Ｃ６の、野生型ＢＨＶに対する感染阻害効果を確認した。
【0089】
野生型ＨＢＶは、ＨｅｐＡＤ３８細胞の上清からＨＢＶ ｇｅｎｏｔｙｏｅＤのウイルスをＰＥＧ溶液（１３％ ＰＥＧ６０００、１．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ。ｐＨ７．６）により、１００，０００ｇで３時間遠心し、ペレットをＴＮＥ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で懸濁し、１００倍濃縮して作製した。
【0090】
５Ａ９Ｃ６及びコントロール抗体をそれぞれ２００μｇ／ｍｌで１時間、初代肝培養細胞に暴露し、５００ゲノム／細胞となるよう野生型ＨＢＶを２００μｇ／ｍｌの抗体共存下で感染させた。感染７日後、ＨＢｅ抗原量をルミパルス（富士レビオ）で測定した。結果を図２に示す。図２に示す通り、コントロール抗体と比較し５Ａ９Ｃ６は野生型ＨＢＶ感染を約５０％阻害するＮＴＣＰ中和抗体であることが認められた。なお、細胞毒性をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（プロメガ）で測定した結果、５Ａ９Ｃ６に対する毒性はないことを確認した。
【0091】
［試験例４：ＣＤＲ解析］
本試験例では、試験例２及び３で中和活性を確認した５Ａ９Ｃ６のＣＤＲを、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ及びＰａｒａｔｏｍｅを用いて解析した。その結果、上記表１に示すＣＤＲを決定した。また、５Ａ９Ｃ６のシグナルペプチドを、ＳｉｇｎａｌＰ５．０を用いて解析した。その結果、重鎖可変領域のシグナルペプチドのアミノ酸配列は配列番号２０に示すアミノ酸配列の１位～１９位に該当する配列であり、軽鎖可変領域のシグナルペプチドのアミノ酸配列は配列番号２１に示すアミノ酸配列の１位～１８位に該当する配列であった。
本試験例では、試験例２及び３で中和活性を確認した５Ａ９Ｃ６のＣＤＲを、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ及びＰａｒａｔｏｍｅを用いて解析した。その結果、上記表１に示すＣＤＲを決定した。また、５Ａ９Ｃ６のシグナルペプチドを、ＳｉｇｎａｌＰ５．０を用いて解析した。その結果、重鎖可変領域のシグナルペプチドのアミノ酸配列は配列番号２０に示すアミノ酸配列の１位～１９位に該当する配列であり、軽鎖可変領域のシグナルペプチドのアミノ酸配列は配列番号２１に示すアミノ酸配列の１位～１８位に該当する配列であった。
【0092】
［試験例５：エピトープ解析］
本試験例では、試験例２及び３で中和活性を確認した５Ａ９Ｃ６のエピトープを解析した。
本試験例では、試験例２及び３で中和活性を確認した５Ａ９Ｃ６のエピトープを解析した。
【0093】
ヒトＮＴＣＰ（配列番号１）にｍｙｃタグを融合し、配列番号１の第１位－第１６０位からなる断片、第８１位－第３４９位からなる断片、第１６１位－第３４９位からなる断片をＰＣＲで増幅し、それぞれ、ＣＳＩＩ－ＣＭＶ－ＭＣＳ（ＣＭＶプロモーターを含むレンチウイルス構築物のバックボーンベクター）に挿入した。それぞれのベクターをＨｅｐＧ２細胞に導入し、その発現をウエスタンブロッティングで確認した。結果を図３に示す。図３に示す通り、それぞれのＮＴＣＰ断片について、ｍｙｃタグ抗体（セルシグナリングテクノロジー）により発現を確認した。５Ａ９Ｃ６を用いて同様に発現確認を行った。結果を図４に示す。図４に示す通り、配列番号１の第１位－第１６０位からなるＮＴＣＰ断片のみが発現を確認できた。図３及び図４の結果から、５Ａ９Ｃ６のエピトープが配列番号１の第１位－第１６０位のいずれかにあることが示された。
【0094】
次に、ヒトＮＴＣＰとマウスＮＴＣＰをＨｅｐＧ２に発現させ、５Ａ９Ｃ６を用いてウエスタンブロット法でその発現を検討した。結果を図５に示す。図５が示す通り、５Ａ９Ｃ６はヒトＮＴＣＰ、マウスＮＴＣＰの両方と結合できた。
【0095】
ヒトＮＴＣＰは９回膜貫通の膜タンパク質で、Ｎ末端側が細胞外ドメインとして知られている。５Ａ９Ｃ６はＨＢＶ感染阻害効果があることから、ＮＴＣＰの細胞外ドメインを認識すると考えられ、またヒトＮＴＣＰおよびマウスＮＴＣＰと結合でき、さらに配列番号１の第１位－第１６０位のいずれかにエピトープを有すると結論付けられた。
【0096】
上記の結論に基づくと、エピトープの候補としては、第３位のアラニン周辺、第２８位のセリン周辺、第４０位のロイシン周辺、第４４位のシステイン周辺が示唆された。そこでこれらの部位に変異を有する変異体（Ａ３Ｍ、Ｓ２８Ｇ、Ｖ２９Ａ、Ｉ３０Ａ、Ｌ４０Ａ、Ｓ４１Ａ、Ｃ４４Ａ、Ｔ４５Ａ）を作製してＨｅｐＧ２に発現させ、ｍｙｃタグ抗体及び５Ａ９Ｃ６との結合能をウエスタンブロット法で検討した。結果を図６に示す。図６に示す通り、ＮＴＣＰ３番目のアラニンをメチオニンに変えた変異体（Ａ３Ｍ）のみ５Ａ９Ｃ６と結合できなかった。
【0097】
さらにＡ３ＭをＨｅｐＧ２細胞に発現させ（ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ－Ａ３Ｍ－ｍｙｃ細胞）、５Ａ９Ｃ６のＨＢＶ感染阻害効果の検討を行った。具体的には、５Ａ９Ｃ６及びコントロール抗体をそれぞれ２００μｇ／ｍｌで１時間、野生型ＨｅｐＧ２細胞又はＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ－Ａ３Ｍ－ｍｙｃ細胞に暴露し、レポーターＨＢＶを２００μｇ／ｍｌの抗体共存下で感染させた。感染５日後、ＮＬ活性を測定した結果を図７に示す。図７に示すとおり、コントロール抗体と比較し５Ａ９Ｃ６の抗ＨＢＶ阻害効果は全く観察されなかった。結果、５Ａ９Ｃ６がＮＴＣＰの３番目のアラニンを認識するＮＴＣＰ中和抗体と結論づけた。
【0098】
［試験例６：ＮＴＣＰ検出試験］
本試験例では、５Ａ９Ｃ６のＮＴＣＰ検出能を試験した。具体的には、チャンバー上にＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ－ｍｙｃを播き、細胞を４％ホルムアルデヒドで１０分間固定し、５％ＦＢＳでブロッキングした後、５００倍希釈で５Ａ９Ｃ６を細胞に添加し、室温で１時間反応させた。細胞を洗浄し、Ａｌｅｘａ４８８－ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（インビトロジェン）を５００倍希釈で添加し、１時間反応させて洗浄し、共焦点レーザー顕微鏡でＮＴＣＰの発現を観察した。
本試験例では、５Ａ９Ｃ６のＮＴＣＰ検出能を試験した。具体的には、チャンバー上にＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ－ｍｙｃを播き、細胞を４％ホルムアルデヒドで１０分間固定し、５％ＦＢＳでブロッキングした後、５００倍希釈で５Ａ９Ｃ６を細胞に添加し、室温で１時間反応させた。細胞を洗浄し、Ａｌｅｘａ４８８－ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（インビトロジェン）を５００倍希釈で添加し、１時間反応させて洗浄し、共焦点レーザー顕微鏡でＮＴＣＰの発現を観察した。
【0099】
結果、ＮＴＣＰの発現がないＨｅｐＧ２では全くシグナルは観察されなかったが、図８に示すように、ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰでは膜状に強いＮＴＣＰのシグナルが観察された。
【配列表フリーテキスト】
【0100】
配列番号３は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより決定される重鎖相補性決定領域１の配列である。
配列番号４は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔにより決定される重鎖相補性決定領域１の配列である。
配列番号５は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ＩＭＧＴにより決定される重鎖相補性決定領域１の配列である。
配列番号６は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｐａｒａｔｏｍｅにより決定される重鎖相補性決定領域１の配列である。
配列番号７は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより決定される重鎖相補性決定領域２の配列である。
配列番号８は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔにより決定される重鎖相補性決定領域２の配列である。
配列番号９は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ＩＭＧＴにより決定される重鎖相補性決定領域２の配列である。
配列番号１０は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｐａｒａｔｏｍｅにより決定される重鎖相補性決定領域２の配列である。
配列番号１１は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより決定される重鎖相補性決定領域３の配列である。
配列番号１２は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔにより決定される重鎖相補性決定領域３の配列である。
配列番号１３は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより決定される軽鎖相補性決定領域１の配列である。
配列番号１４は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ＩＭＧＴにより決定される軽鎖相補性決定領域１の配列である。
配列番号１５は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｐａｒａｔｏｍｅにより決定される軽鎖相補性決定領域１の配列である。
配列番号１６は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより決定される軽鎖相補性決定領域２の配列である。
配列番号１７は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔにより決定される軽鎖相補性決定領域２の配列である。
配列番号１８は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより決定される軽鎖相補性決定領域３の配列である。
配列番号１９は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｐａｒａｔｏｍｅにより決定される軽鎖相補性決定領域３の配列である。
配列番号２０は、ＮＴＣＰ抗体の重鎖可変領域の配列である。
配列番号２１は、ＮＴＣＰ抗体の軽鎖可変領域の配列である。
配列番号２２は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより決定される重鎖相補性決定領域１をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号２３は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより決定される重鎖相補性決定領域２をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号２４は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより決定される重鎖相補性決定領域３をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号２５は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより決定される軽鎖相補性決定領域１をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号２６は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより決定される軽鎖相補性決定領域２をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号２７は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより決定される軽鎖相補性決定領域３をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号２８は、ＮＴＣＰ抗体の重鎖可変領域をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号２９は、ＮＴＣＰ抗体の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号４は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔにより決定される重鎖相補性決定領域１の配列である。
配列番号５は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ＩＭＧＴにより決定される重鎖相補性決定領域１の配列である。
配列番号６は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｐａｒａｔｏｍｅにより決定される重鎖相補性決定領域１の配列である。
配列番号７は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより決定される重鎖相補性決定領域２の配列である。
配列番号８は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔにより決定される重鎖相補性決定領域２の配列である。
配列番号９は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ＩＭＧＴにより決定される重鎖相補性決定領域２の配列である。
配列番号１０は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｐａｒａｔｏｍｅにより決定される重鎖相補性決定領域２の配列である。
配列番号１１は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより決定される重鎖相補性決定領域３の配列である。
配列番号１２は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔにより決定される重鎖相補性決定領域３の配列である。
配列番号１３は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより決定される軽鎖相補性決定領域１の配列である。
配列番号１４は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ＩＭＧＴにより決定される軽鎖相補性決定領域１の配列である。
配列番号１５は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｐａｒａｔｏｍｅにより決定される軽鎖相補性決定領域１の配列である。
配列番号１６は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより決定される軽鎖相補性決定領域２の配列である。
配列番号１７は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔにより決定される軽鎖相補性決定領域２の配列である。
配列番号１８は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより決定される軽鎖相補性決定領域３の配列である。
配列番号１９は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｐａｒａｔｏｍｅにより決定される軽鎖相補性決定領域３の配列である。
配列番号２０は、ＮＴＣＰ抗体の重鎖可変領域の配列である。
配列番号２１は、ＮＴＣＰ抗体の軽鎖可変領域の配列である。
配列番号２２は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより決定される重鎖相補性決定領域１をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号２３は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより決定される重鎖相補性決定領域２をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号２４は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより決定される重鎖相補性決定領域３をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号２５は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより決定される軽鎖相補性決定領域１をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号２６は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより決定される軽鎖相補性決定領域２をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号２７は、ＮＴＣＰ中和抗体の、ｋａｂａｔ／ＩＭＧＴ／ｐａｒａｔｏｍｅの組み合わせにより決定される軽鎖相補性決定領域３をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号２８は、ＮＴＣＰ抗体の重鎖可変領域をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号２９は、ＮＴＣＰ抗体の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡの配列である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】