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特開2022-27576中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチド及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022027576
(43)【公開日】2022-02-10
(54)【発明の名称】中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチド及びその使用
(51)【国際特許分類】
G01N 27/62 20210101AFI20220203BHJP
G01N 30/88 20060101ALI20220203BHJP
G01N 30/72 20060101ALI20220203BHJP
G01N 30/06 20060101ALI20220203BHJP
C07K 7/08 20060101ALI20220203BHJP
C12Q 1/37 20060101ALI20220203BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20220203BHJP
C12N 15/57 20060101ALN20220203BHJP
C12N 9/74 20060101ALN20220203BHJP
【ＦＩ】
G01N27/62 V
G01N27/62 X ZNA
G01N27/62 D
G01N30/88 J
G01N30/72 C
G01N30/06 E
C07K7/08
C12Q1/37
C12N15/12
C12N15/57
C12N9/74
【審査請求】有
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021122762
(22)【出願日】2021-07-27
(31)【優先権主張番号】202010752988.2
(32)【優先日】2020-07-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(71)【出願人】
【識別番号】521331364
【氏名又は名称】山東省食品薬品検験研究院
【氏名又は名称原語表記】Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｔｒｏｌ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． ２７４９， Ｘｉｎｌｕｏ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｊｉｎａｎ Ｃｉｔｙ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ
(71)【出願人】
【識別番号】594196624
【氏名又は名称】山東大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002262
【氏名又は名称】ＴＲＹ国際特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】石 峰
(72)【発明者】
【氏名】咸 瑞卿
(72)【発明者】
【氏名】鞏 麗萍
(72)【発明者】
【氏名】王 維剣
(72)【発明者】
【氏名】遅 連利
(72)【発明者】
【氏名】王 聡聡
(72)【発明者】
【氏名】杭 宝建
(72)【発明者】
【氏名】張 迅杰
(72)【発明者】
【氏名】王 鳳山
【テーマコード（参考）】
2G041
4B050
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041EA04
2G041FA12
2G041LA06
4B050DD11
4B050LL03
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ03
4B063QQ36
4B063QQ79
4B063QR16
4B063QR48
4B063QS17
4B063QX10
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA17
4H045CA53
4H045DA89
4H045EA50
(57)【要約】 （修正有）
【課題】中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチド及びその使用方法を提供する。
【解決手段】化学分析の検出及び応用分野に関し、特に中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチド及びその使用に関する中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドはアミノ酸配列がＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲである。測定されるサンプルを取り、トリプシン酵素で分解する前処理を行い、酵素分解液の上清をテストサンプル溶液とし、テストサンプル溶液及び対照サンプル溶液を液体クロマトグラフィー－質量分析計に注入し、定性イオン対及び定量イオン対を選択し、測定されるサンプル中の蛇毒トロンビン様酵素の種属由来源及び含有量を測定する。本発明の方法は、簡単で、便利で、定量が正確で、中国長白山マムシ毒の品質基準のギャップを埋め、品質管理のレベルを高める。
【選択図】図１
【解決手段】化学分析の検出及び応用分野に関し、特に中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチド及びその使用に関する中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドはアミノ酸配列がＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲである。測定されるサンプルを取り、トリプシン酵素で分解する前処理を行い、酵素分解液の上清をテストサンプル溶液とし、テストサンプル溶液及び対照サンプル溶液を液体クロマトグラフィー－質量分析計に注入し、定性イオン対及び定量イオン対を選択し、測定されるサンプル中の蛇毒トロンビン様酵素の種属由来源及び含有量を測定する。本発明の方法は、簡単で、便利で、定量が正確で、中国長白山マムシ毒の品質基準のギャップを埋め、品質管理のレベルを高める。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アミノ酸配列がＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲであることを特徴とする、中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチド。
【請求項2】
請求項１に記載の中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドを用い、測定されるサンプル中の蛇毒トロンビン様酵素の種属由来源及び／又は含有量を測定する方法であって、
前記方法は、以下のステップ（１）から（５）を含み、
ステップ（１）において、測定されるサンプルを取り、トリプシンで酵素分解する前処理を行い、酵素分解液の上清をテストサンプル溶液として収集し、
ステップ（２）において、中国長白山マムシ毒に特徴的なポリペプチド対照サンプルを取り、トリプシンで酵素分解する前処理を行い、系列濃度の対照サンプル溶液を調製し、
ステップ（３）において、ステップ（１）の前記テストサンプル溶液及びステップ（２）の前記対照サンプル溶液をそれぞれ液体クロマトグラフィー－質量分析計に注入し、陽イオンエレクトロスプレーモードで多重反応モニタリングを行い、質量電荷比ｍ／ｚ二重荷電８７７．４→５５０．２を定性イオン対とし、二重荷電８７７．４→８９２．４を定量イオン対とし、前記液体クロマトグラフィーの条件は、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８；カラム：５０ｍｍ×２．１ｍｍ、１．７μｍ；カラム温度：４０℃；注入量：２μＬ；流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ；移動相Ａ：０．１％ギ酸溶液、移動相Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル；グラジエント溶出；溶出プロセス：０→１ｍｉｎ，移動相Ａ ８０％、１→５ｍｉｎ，移動相Ａ ８０％→１０％、５→７ｍｉｎ，移動相Ａ １０％→１０％であり、
ステップ（４）において、ステップ（３）の前記定性イオン対及び定量イオン対を用いて作成したテストサンプル溶液のクロマトグラムに対照の特徴的なポリペプチドクロマトグラムの滞留時間と一致するピークが現れた場合、測定されるサンプルにアミノ酸配列ＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲが含まれることが示され、測定されるサンプルは中国長白山マムシに由来することが証明される一方、そうではない場合、中国長白山マムシに由来しないことが証明され、
ステップ（５）において、イオン対二重荷電８７７．４→８９２．４クロマトグラムを作成し、対照サンプルの系列標準溶液中の特徴的なポリペプチドの濃度を横座標とし、対応するピーク面積を縦座標とし、線形回帰方程式（ｒ＞０．９９）を計算し、回帰方程式からテストサンプル溶液の濃度を算出し、さらに測定されるサンプル中のトロンビン様酵素の含有量を算出することを特徴とする、方法。
前記方法は、以下のステップ（１）から（５）を含み、
ステップ（１）において、測定されるサンプルを取り、トリプシンで酵素分解する前処理を行い、酵素分解液の上清をテストサンプル溶液として収集し、
ステップ（２）において、中国長白山マムシ毒に特徴的なポリペプチド対照サンプルを取り、トリプシンで酵素分解する前処理を行い、系列濃度の対照サンプル溶液を調製し、
ステップ（３）において、ステップ（１）の前記テストサンプル溶液及びステップ（２）の前記対照サンプル溶液をそれぞれ液体クロマトグラフィー－質量分析計に注入し、陽イオンエレクトロスプレーモードで多重反応モニタリングを行い、質量電荷比ｍ／ｚ二重荷電８７７．４→５５０．２を定性イオン対とし、二重荷電８７７．４→８９２．４を定量イオン対とし、前記液体クロマトグラフィーの条件は、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８；カラム：５０ｍｍ×２．１ｍｍ、１．７μｍ；カラム温度：４０℃；注入量：２μＬ；流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ；移動相Ａ：０．１％ギ酸溶液、移動相Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル；グラジエント溶出；溶出プロセス：０→１ｍｉｎ，移動相Ａ ８０％、１→５ｍｉｎ，移動相Ａ ８０％→１０％、５→７ｍｉｎ，移動相Ａ １０％→１０％であり、
ステップ（４）において、ステップ（３）の前記定性イオン対及び定量イオン対を用いて作成したテストサンプル溶液のクロマトグラムに対照の特徴的なポリペプチドクロマトグラムの滞留時間と一致するピークが現れた場合、測定されるサンプルにアミノ酸配列ＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲが含まれることが示され、測定されるサンプルは中国長白山マムシに由来することが証明される一方、そうではない場合、中国長白山マムシに由来しないことが証明され、
ステップ（５）において、イオン対二重荷電８７７．４→８９２．４クロマトグラムを作成し、対照サンプルの系列標準溶液中の特徴的なポリペプチドの濃度を横座標とし、対応するピーク面積を縦座標とし、線形回帰方程式（ｒ＞０．９９）を計算し、回帰方程式からテストサンプル溶液の濃度を算出し、さらに測定されるサンプル中のトロンビン様酵素の含有量を算出することを特徴とする、方法。
【請求項3】
前記中国長白山マムシ毒に特徴的なポリペプチドの検出限界は２ｎｇ／ｍＬであり、定量限界は６ｎｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
ステップ（１）において、トリプシンで酵素分解する前処理の具体的な操作は、以下の通りであり、
測定されるサンプル２０ｍｇを取り、１０ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して定容し、２００μＬ秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で６０ｍｉｎ反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０ｍｉｎ反応させ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液１０μＬを加え、３７℃で９０ｍｉｎ酵素分解し、９０℃で１０ｍｉｎ不活性化させ、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離して上清液を得ることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
測定されるサンプル２０ｍｇを取り、１０ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して定容し、２００μＬ秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で６０ｍｉｎ反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０ｍｉｎ反応させ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液１０μＬを加え、３７℃で９０ｍｉｎ酵素分解し、９０℃で１０ｍｉｎ不活性化させ、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離して上清液を得ることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
ステップ（２）において、トリプシンで酵素分解する前処理の具体的な操作は、以下の通りであり、
特徴的なポリペプチド対照サンプル１０ｍｇを精密秤量し、１００ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して目盛りまで希釈し、均一になるまで振とうし、０．１ｍＬ、０．２５ｍＬ、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬをそれぞれ精密秤量し、それぞれ１００ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で目盛りまで希釈し、均一になるまで振とうし、それぞれ２００μＬ秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で６０ｍｉｎ反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０ｍｉｎ反応させ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液１０μＬを加え、３７℃で９０ｍｉｎ酵素分解し、９０℃で１０ｍｉｎ不活性化させ、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離して上清液を得ることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
特徴的なポリペプチド対照サンプル１０ｍｇを精密秤量し、１００ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して目盛りまで希釈し、均一になるまで振とうし、０．１ｍＬ、０．２５ｍＬ、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬをそれぞれ精密秤量し、それぞれ１００ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で目盛りまで希釈し、均一になるまで振とうし、それぞれ２００μＬ秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で６０ｍｉｎ反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０ｍｉｎ反応させ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液１０μＬを加え、３７℃で９０ｍｉｎ酵素分解し、９０℃で１０ｍｉｎ不活性化させ、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離して上清液を得ることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項6】
前記液体クロマトグラフィー－質量分析計の質量分析の条件は、
エレクトロスプレーイオン源、陽イオンスキャンモード、多重反応モニタリング；ボルテックスイオンスプレー温度５００℃；イオン化電圧：５．５ｋＶ；コリジョンセル出口電圧：１０Ｖ、コリジョンセル入口電圧ＥＰ：１０Ｖ；衝突エネルギーＣＥ：いずれも４５Ｖ、デクラスタリング電圧ＤＰ：１３５Ｖであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
エレクトロスプレーイオン源、陽イオンスキャンモード、多重反応モニタリング；ボルテックスイオンスプレー温度５００℃；イオン化電圧：５．５ｋＶ；コリジョンセル出口電圧：１０Ｖ、コリジョンセル入口電圧ＥＰ：１０Ｖ；衝突エネルギーＣＥ：いずれも４５Ｖ、デクラスタリング電圧ＤＰ：１３５Ｖであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項7】
前記測定されるサンプルは蛇毒であることを特徴とする、請求項２から６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、化学分析の検出及び応用の分野に関し、特に、中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチド及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
中国長白山マムシ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｈａｌｙｓ）は、中国に特有な蛇種であり、主に中国東北部の長白山の山岳地帯に分布しており、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｈａｌｙｓ ｓｕｓｓｕｒｉｅｎｓｉｓ Ｅｍｅｌｉａｎｏｖとも呼ばれる。中国長白山マムシ毒を原料として抽出した蛇毒トロンビンは、アルギニンエステラーゼ及びアミダーゼ活性を有するセリンプロテアーゼであり、血液凝固過程で重要な役割を果たすことができる。その構造及び機能はヒトトロンビンに類似するため、「トロンビン様酵素」と呼ばれる。臨床的には、主に出血性疾患、特に毛細血管出血の治療に使用され、患者の出血時間を大幅に短縮し、出血量を減らすことができる。高効率、迅速な効果、長期的な効果、利便性、安全性、トロンビン阻害剤に影響されない等の利点を有するため、出血性疾患に対処するときの、臨床医の主な選択肢となっている。現在、中国で市販されている蛇毒トロンビン類製品は、主にアメリカハブ、ヒャッポダ、ラッセルクサリヘビ及び中国長白山マムシに由来する。異なる種類の蛇に由来するトロンビン様酵素は構造及び作用メカニズムが異なるため、対応する薬理作用も異なる。そのため、種属由来源及び含有量を判断する、特異性が高く感度が高い方法の開発は、蛇毒トロンビン類製品の品質の管理に非常に重要である。
【0003】
蛇毒は、蛇の毒腺から分泌される複雑な混合物であり、多種類のタンパク質、ポリペプチド、ヌクレオシド、酵素、金属イオン及びその他の低分子物質を含む。蛇毒は、自然界のすべての毒素の中で最も複雑な物質である可能性がある。蛇毒には５０種類以上のタンパク質分解酵素が微量に含まれている。既存の中国長白山マムシ毒に対する品質標準は、その種属由来源が管理されておらず、トロンビン様酵素の含有量を特異的に測定する方法がない。既知の蛇毒中のトロンビン様酵素の含有量を測定する方法は、主にゲル電気泳動法及び力価測定法であり、これらの方法は複雑で精度が低く、蛇毒の品質を正確に反映することができない。そのため、便利で、高速で、定量が正確な中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の定性定量方法の開発は、幅広い社会的及び経済的利益がある。
【発明の概要】
【0004】
従来技術の欠陥を克服するために、本発明によれば、中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチド、及び測定されるサンプル中の蛇毒トロンビン様酵素の種属由来源及び含有量の判定におけるその使用が提供される。本発明の方法は、簡単で、便利で、定量が正確で、中国長白山マムシ毒の品質基準のギャップを埋め、品質管理のレベルを高める。
【0005】
上記発明の目的を達成するために、本発明は以下の技術的解決策を採用する。
中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドのアミノ酸配列はＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲである。
中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドのアミノ酸配列はＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲである。
【0006】
さらに、中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドを用い、測定されるサンプル中の蛇毒トロンビン様酵素の種属由来源及び／又は含有量を測定する方法であって、
前記方法は、以下のステップ（１）から（５）を含む。
ステップ（１）において、測定されるサンプルを取り、トリプシンで酵素分解する前処理を行い、酵素分解液の上清をテストサンプル溶液として収集し、
ステップ（２）において、中国長白山マムシ毒に特徴的なポリペプチド対照サンプルを取り、トリプシンで酵素分解する前処理を行い、系列濃度の対照サンプル溶液を調製し、
ステップ（３）において、ステップ（１）の前記テストサンプル溶液及びステップ（２）の前記対照サンプル溶液をそれぞれ液体クロマトグラフィー－質量分析計に注入し、陽イオンエレクトロスプレーモードで多重反応モニタリングを行い、質量電荷比ｍ／ｚ二重荷電８７７．４→５５０．２及び二重荷電８７７．４→８９２．４を定性イオン対とし、二重荷電８７７．４→８９２．４を定量イオン対とし、
ステップ（４）において、ステップ（３）の前記定性イオン対及び定量イオン対を用いて作成したテストサンプル溶液のクロマトグラムに対照の特徴的なポリペプチドクロマトグラムの滞留時間と一致するピークが現れた場合、測定されるサンプルにアミノ酸配列ＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲが含まれることが示され、測定されるサンプルは中国長白山マムシに由来することが証明される一方、そうではない場合、中国長白山マムシに由来しないことが証明され、
ステップ（５）において、イオン対二重荷電８７７．４→８９２．４クロマトグラムを作成し、対照サンプルの系列標準溶液中の特徴的なポリペプチドの濃度を横座標とし、対応するピーク面積を縦座標とし、線形回帰方程式（ｒ＞０．９９）を計算し、回帰方程式からテストサンプル溶液の濃度を算出し、さらに測定されるサンプル中のトロンビン様酵素の含有量を算出する。
前記方法は、以下のステップ（１）から（５）を含む。
ステップ（１）において、測定されるサンプルを取り、トリプシンで酵素分解する前処理を行い、酵素分解液の上清をテストサンプル溶液として収集し、
ステップ（２）において、中国長白山マムシ毒に特徴的なポリペプチド対照サンプルを取り、トリプシンで酵素分解する前処理を行い、系列濃度の対照サンプル溶液を調製し、
ステップ（３）において、ステップ（１）の前記テストサンプル溶液及びステップ（２）の前記対照サンプル溶液をそれぞれ液体クロマトグラフィー－質量分析計に注入し、陽イオンエレクトロスプレーモードで多重反応モニタリングを行い、質量電荷比ｍ／ｚ二重荷電８７７．４→５５０．２及び二重荷電８７７．４→８９２．４を定性イオン対とし、二重荷電８７７．４→８９２．４を定量イオン対とし、
ステップ（４）において、ステップ（３）の前記定性イオン対及び定量イオン対を用いて作成したテストサンプル溶液のクロマトグラムに対照の特徴的なポリペプチドクロマトグラムの滞留時間と一致するピークが現れた場合、測定されるサンプルにアミノ酸配列ＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲが含まれることが示され、測定されるサンプルは中国長白山マムシに由来することが証明される一方、そうではない場合、中国長白山マムシに由来しないことが証明され、
ステップ（５）において、イオン対二重荷電８７７．４→８９２．４クロマトグラムを作成し、対照サンプルの系列標準溶液中の特徴的なポリペプチドの濃度を横座標とし、対応するピーク面積を縦座標とし、線形回帰方程式（ｒ＞０．９９）を計算し、回帰方程式からテストサンプル溶液の濃度を算出し、さらに測定されるサンプル中のトロンビン様酵素の含有量を算出する。
【0007】
さらに、前記中国長白山マムシ毒に特徴的なポリペプチドの検出限界は２ｎｇ／ｍＬであり、定量限界は６ｎｇ／ｍＬである。
さらに、ステップ（１）において、トリプシンで酵素分解する前処理の具体的な操作は、以下の通りである。測定されるサンプル２０ｍｇを取り、１０ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して定容し、２００μＬ秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で６０ｍｉｎ反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０ｍｉｎ反応させ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液１０μＬを加え、３７℃で９０ｍｉｎ酵素分解し、９０℃で１０ｍｉｎ不活性化させ、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離して上清液を得る。
さらに、ステップ（１）において、トリプシンで酵素分解する前処理の具体的な操作は、以下の通りである。測定されるサンプル２０ｍｇを取り、１０ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して定容し、２００μＬ秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で６０ｍｉｎ反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０ｍｉｎ反応させ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液１０μＬを加え、３７℃で９０ｍｉｎ酵素分解し、９０℃で１０ｍｉｎ不活性化させ、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離して上清液を得る。
【0008】
さらに、ステップ（２）において、トリプシンで酵素分解する前処理の具体的な操作は、以下の通りである。特徴的なポリペプチド対照サンプル１０ｍｇを精密秤量し、１００ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して目盛りまで希釈し、均一になるまで振とうし、０．１ｍＬ、０．２５ｍＬ、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬをそれぞれ精密秤量し、それぞれ１００ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で目盛りまで希釈し、均一になるまで振とうし、それぞれ２００μＬ秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で６０ｍｉｎ反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０ｍｉｎ反応させ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液１０μＬを加え、３７℃で９０ｍｉｎ酵素分解し、９０℃で１０ｍｉｎ不活性化させ、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離して上清液を得る。
さらに、前記液体クロマトグラフィー－質量分析計の液体クロマトグラフィー及び質量分析の条件は以下の通りである。
さらに、前記液体クロマトグラフィー－質量分析計の液体クロマトグラフィー及び質量分析の条件は以下の通りである。
【0009】
液体クロマトグラフィーの条件は、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８；カラム：５０ｍｍ×２．１ｍｍ、１．７μｍ；カラム温度：４０℃；注入量：２μＬ；流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ；移動相Ａ：０．１％ギ酸溶液、移動相Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル；グラジエント溶出；溶出プロセス：０→１ｍｉｎ，移動相Ａ ８０％、１→５ｍｉｎ，移動相Ａ ８０％→１０％、５→７ｍｉｎ，移動相Ａ １０％→１０％である。
【0010】
質量分析の条件は、エレクトロスプレーイオン源、陽イオンスキャンモード、多重反応モニタリング；ボルテックスイオンスプレー温度５００℃；イオン化電圧：５．５ｋＶ；コリジョンセル出口電圧：１０Ｖ、コリジョンセル入口電圧ＥＰ：１０Ｖ；衝突エネルギーＣＥ：いずれも４５Ｖ、デクラスタリング電圧ＤＰ：１３５Ｖである。
前記方法において、前記測定されるサンプルは蛇毒である。
前記方法において、前記測定されるサンプルは蛇毒である。
【発明の効果】
【0011】
（１）大量の実験的研究及びタンパク質データベースの比較により、中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドセグメント（ＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲ）が見出された。アメリカハブ、ラッセルクサリヘビ及びヒャッポダ等の蛇種に由来するトロンビン様酵素のアミノ酸配列にはこのセグメントのアミノ酸配列が含まれないため、測定されるサンプルの蛇毒トロンビン様酵素の種属由来源及び含有量の判断に適用できる。
【0012】
（２）本発明に開示の定性定量方法は、簡単で、便利で、定量が正確で、中国長白山マムシ毒の品質基準のギャップを埋め、中国長白山マムシ毒の品質管理レベルを大幅に向上でき、中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素製品の臨床使用、有効性及び安全性を確保できる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドの一次マススペクトルである。
【図2】中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドの二次マススペクトルである。
【図3】特異性評価グラフである。
【図4】直線性と範囲グラフである。
【図5】検出限界と定量限界グラフである。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、実施例により本発明をさらに説明する。
以下の実施例で使用される試薬及び溶液の調製方法は以下の通りである。
（１）試薬：トリプシン（Ｓｉｇｍａ，バッチ番号ＳＬＢＳ８９５６）、中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素（錦州奥鴻薬業、純度９８．５％）、塩酸グアニジン（ＶＥＴＥＣ、バッチ番号ＷＸＢＣ４２６１Ｖ）、トリヒドロキシアミノメタン（戸市、バッチ番号２０１８１２０６）、ジチオトレイトール（ＢＢＩ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、バッチ番号Ｄ９１１ＢＡ００１１）、ヨードアセトアミド（ＢＢＩ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、バッチ番号Ｂ３２６ＢＡ１９４３）。他の試薬はいずれも分析試薬である。
（２）２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液：７９．０６ｍｇ重炭酸アンモニウムを秤量し、４０ｍＬ水を加えて溶解することで得られる。
（３）ジチオトレイトール（ＤＴＴ）溶液：１５．４２ｍｇジチオトレイトールを秤量し、５００μＬ水を加えて溶解することで得られる。
（４）ヨードアセトアミド（ＩＡ）溶液（使用時に調製）：１８．５ｍｇヨードアセトアミドを秤量し、５００μＬ水を加えて溶解することで得られる。
（５）０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液（使用時に調製）：トリプシン８．０ｍｇを秤量し、２０ｍＬ水を加えて溶解することで得られる。
以下の実施例で使用される試薬及び溶液の調製方法は以下の通りである。
（１）試薬：トリプシン（Ｓｉｇｍａ，バッチ番号ＳＬＢＳ８９５６）、中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素（錦州奥鴻薬業、純度９８．５％）、塩酸グアニジン（ＶＥＴＥＣ、バッチ番号ＷＸＢＣ４２６１Ｖ）、トリヒドロキシアミノメタン（戸市、バッチ番号２０１８１２０６）、ジチオトレイトール（ＢＢＩ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、バッチ番号Ｄ９１１ＢＡ００１１）、ヨードアセトアミド（ＢＢＩ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、バッチ番号Ｂ３２６ＢＡ１９４３）。他の試薬はいずれも分析試薬である。
（２）２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液：７９．０６ｍｇ重炭酸アンモニウムを秤量し、４０ｍＬ水を加えて溶解することで得られる。
（３）ジチオトレイトール（ＤＴＴ）溶液：１５．４２ｍｇジチオトレイトールを秤量し、５００μＬ水を加えて溶解することで得られる。
（４）ヨードアセトアミド（ＩＡ）溶液（使用時に調製）：１８．５ｍｇヨードアセトアミドを秤量し、５００μＬ水を加えて溶解することで得られる。
（５）０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液（使用時に調製）：トリプシン８．０ｍｇを秤量し、２０ｍＬ水を加えて溶解することで得られる。
【0015】
実施例１
中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドのスクリーニング及び決定
１、装置
Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｕｓｉｏｎ高分解能質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）、ＥＡＳＹ－ｎＬＣ １０００ナノリットル液体クロマトグラフ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）、ＣＰ２２５Ｄ電子天びん（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ドイツ），Ｓｉｇｍａ ３－３０Ｋ冷却遠心分離機（Ｓｉｇｍａ、ドイツ）、ミリポアＭｉｌｌｉ－ＱＡｄｖａｎｔａｇｅ Ａ１０超純水装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）
中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドのスクリーニング及び決定
１、装置
Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｕｓｉｏｎ高分解能質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）、ＥＡＳＹ－ｎＬＣ １０００ナノリットル液体クロマトグラフ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）、ＣＰ２２５Ｄ電子天びん（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ドイツ），Ｓｉｇｍａ ３－３０Ｋ冷却遠心分離機（Ｓｉｇｍａ、ドイツ）、ミリポアＭｉｌｌｉ－ＱＡｄｖａｎｔａｇｅ Ａ１０超純水装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）
【0016】
２、クロマトグラフィー質量分析条件
カラム：実験室で作製した０．２ｍｍ×３．５ｃｍ（粒子径５μｍ）のＲｅｐｒｏＳｉｌ－Ｐｕｒ Ｃ１８－ＡＱ Ｔｒａｐ ｃｏｌｕｍｎを用いて脱塩、濃縮し、実験室で作製した７５μｍ×２５ｃｍ（粒子径３μｍ）のＲｅｐｒｏＳｉｌ－Ｐｕｒ Ｃ１８－ＡＱナノリットル分析カラムを用いて分離した。移動相Ａは２％アセトニトリルの０．１％ギ酸水溶液であり、移動相Ｂは９８％アセトニトリルの０．１％ギ酸水溶液であった。ナノリットル分離ポンプの流速は３００ｎＬ／ｍｉｎであった。グラジエント溶出の設定を表１に示す。
質量分析条件：陽イオンモードで分析を行った。スプレー電圧は２．０ｋＶ、イオントランスファーキャピラリーの温度は２７５℃、Ｓ－Ｌｅｎｓ伝送効率は６０％に設定された。一次質量分析はＯｒｂｉｔｒａｐを質量分析計として採用し、解像度は６０，０００、収集範囲は３５０－１６５０であった。二次質量分析はＩＴを質量分析計として採用し、Ｒａｐｉｄ Ｓｃａｎモードでスキャンし、Ｔｏｐ２０データ依存モデルで前駆体イオンの選択を行い、ＨＣＤモードで断片化した。断片化エネルギーＮＣＥは３５％に設定された。
カラム：実験室で作製した０．２ｍｍ×３．５ｃｍ（粒子径５μｍ）のＲｅｐｒｏＳｉｌ－Ｐｕｒ Ｃ１８－ＡＱ Ｔｒａｐ ｃｏｌｕｍｎを用いて脱塩、濃縮し、実験室で作製した７５μｍ×２５ｃｍ（粒子径３μｍ）のＲｅｐｒｏＳｉｌ－Ｐｕｒ Ｃ１８－ＡＱナノリットル分析カラムを用いて分離した。移動相Ａは２％アセトニトリルの０．１％ギ酸水溶液であり、移動相Ｂは９８％アセトニトリルの０．１％ギ酸水溶液であった。ナノリットル分離ポンプの流速は３００ｎＬ／ｍｉｎであった。グラジエント溶出の設定を表１に示す。
【表1】
【0017】
３、データ採取
中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素５ｍｇを取り、１０ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して定容し、２００μＬ精密秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で１時間反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０ｍｉｎ静置し、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液（使用時に調製）１０μＬを加え、３７℃で９０ｍｉｎ反応させ、９０℃で１０ｍｉｎ不活性化させ、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清液をテストサンプル溶液として収集し、ナノリットル液体クロマトグラフィーにより分離して注入し、高分解能質量分析により一次及び二次マススペクトルを採取した。
中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素５ｍｇを取り、１０ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して定容し、２００μＬ精密秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で１時間反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０ｍｉｎ静置し、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液（使用時に調製）１０μＬを加え、３７℃で９０ｍｉｎ反応させ、９０℃で１０ｍｉｎ不活性化させ、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清液をテストサンプル溶液として収集し、ナノリットル液体クロマトグラフィーにより分離して注入し、高分解能質量分析により一次及び二次マススペクトルを採取した。
【0018】
４、データベース検索、スクリーニング及び決定
ＮＣＢＩ及びＵｎｉＰｒｏｔを用いて関連する蛇タンパク質ライブラリと毒液タンパク質ライブラリとを統合し、蛇と毒液データベースを構築した。Ｕｎｉｐｒｏｔによって提供されたＰｅｐｔｉｄｅｍａｓｓ機能によりトリプシン酵素を模倣して異なる蛇種の蛇毒トロンビン様酵素タンパク質を分解し、中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素タンパク質の配列と他の種の配列とを比較することにより他の種に対する中国長白山マムシの特徴的なポリペプチド配列を取得し、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒソフトウェア（バージョン２．２）によりデータベースで質量分析データを検索し、（１）８～２５アミノ酸、（２）人為的に修飾されやすいペプチドセグメントをできるだけ回避、（３）酵素切断時に漏れた切断部位がない等の原則に従って、質量分析応答と分離状況を組み合わせて「ＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲ」は中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドとして使用できることを決定した。測定結果は、特徴的なペプチドの分子量及び二次質量分析はいずれも理論値と一致することを示している。結果を図１、２に示す。
ＮＣＢＩ及びＵｎｉＰｒｏｔを用いて関連する蛇タンパク質ライブラリと毒液タンパク質ライブラリとを統合し、蛇と毒液データベースを構築した。Ｕｎｉｐｒｏｔによって提供されたＰｅｐｔｉｄｅｍａｓｓ機能によりトリプシン酵素を模倣して異なる蛇種の蛇毒トロンビン様酵素タンパク質を分解し、中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素タンパク質の配列と他の種の配列とを比較することにより他の種に対する中国長白山マムシの特徴的なポリペプチド配列を取得し、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒソフトウェア（バージョン２．２）によりデータベースで質量分析データを検索し、（１）８～２５アミノ酸、（２）人為的に修飾されやすいペプチドセグメントをできるだけ回避、（３）酵素切断時に漏れた切断部位がない等の原則に従って、質量分析応答と分離状況を組み合わせて「ＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲ」は中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の特徴的なポリペプチドとして使用できることを決定した。測定結果は、特徴的なペプチドの分子量及び二次質量分析はいずれも理論値と一致することを示している。結果を図１、２に示す。
【0019】
実施例２
多重反応モニタリング（ＭＲＭ）によりサンプル中の中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素を定性・定量分析した。
１、装置
ＳＣＩＥＸ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ６５００トリプル四重極質量分析計、ＣＰ２２５Ｄ電子天びん（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ドイツ）、Ｓｉｇｍａ ３－３０Ｋ冷却遠心分離機（Ｓｉｇｍａ、ドイツ）、ミリポアＭｉｌｌｉ－ＱＡｄｖａｎｔａｇｅ Ａ１０超純水装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）。
多重反応モニタリング（ＭＲＭ）によりサンプル中の中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素を定性・定量分析した。
１、装置
ＳＣＩＥＸ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ６５００トリプル四重極質量分析計、ＣＰ２２５Ｄ電子天びん（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ドイツ）、Ｓｉｇｍａ ３－３０Ｋ冷却遠心分離機（Ｓｉｇｍａ、ドイツ）、ミリポアＭｉｌｌｉ－ＱＡｄｖａｎｔａｇｅ Ａ１０超純水装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）。
【0020】
２、クロマトグラフィー質量分析条件
液体クロマトグラフィー条件：Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、１．７μｍ）；カラム温度：４０℃；注入量：２μＬ；流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ；移動相Ａ：０．１％ギ酸溶液、移動相Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル；グラジエント溶出；溶出プロセス：０→１ｍｉｎ，移動相Ａ ８０％；１→５ｍｉｎ，移動相Ａ ８０％→１０％；５→７ｍｉｎ，移動相Ａ １０％→１０％。
質量分析条件：エレクトロスプレーイオン源、陽イオンスキャンモード、多重反応モニタリング；定量イオン対：質量電荷比（ｍ／ｚ）８７７．４（二重荷電）→８９２．４；定性イオン対：ｍ／ｚ８７７．４（二重荷電）→５５０．２。ボルテックスイオンスプレー温度５００℃；イオン化電圧：５．５ｋＶ；コリジョンセルの出口電圧１０Ｖ；入口電圧ＥＰ １０Ｖ；衝突エネルギー（ＣＥ）：いずれも４５Ｖ、デクラスタリング電圧（ＤＰ）：１３５Ｖ。
液体クロマトグラフィー条件：Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、１．７μｍ）；カラム温度：４０℃；注入量：２μＬ；流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ；移動相Ａ：０．１％ギ酸溶液、移動相Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル；グラジエント溶出；溶出プロセス：０→１ｍｉｎ，移動相Ａ ８０％；１→５ｍｉｎ，移動相Ａ ８０％→１０％；５→７ｍｉｎ，移動相Ａ １０％→１０％。
質量分析条件：エレクトロスプレーイオン源、陽イオンスキャンモード、多重反応モニタリング；定量イオン対：質量電荷比（ｍ／ｚ）８７７．４（二重荷電）→８９２．４；定性イオン対：ｍ／ｚ８７７．４（二重荷電）→５５０．２。ボルテックスイオンスプレー温度５００℃；イオン化電圧：５．５ｋＶ；コリジョンセルの出口電圧１０Ｖ；入口電圧ＥＰ １０Ｖ；衝突エネルギー（ＣＥ）：いずれも４５Ｖ、デクラスタリング電圧（ＤＰ）：１３５Ｖ。
【0021】
３、溶液の調製
３．１対照サンプル溶液の調製
実施例１でスクリーニングした特徴的なポリペプチド対照サンプル１０ｍｇを精密秤量し、１００ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解し、目盛りまで希釈し、均一になるまで振とうし、それぞれ０．１ｍＬ、０．２５ｍＬ、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ精密秤量し、それぞれ１００ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で目盛りまで希釈し、均一になるまで振とうし、それぞれ２００μＬ精密秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃１時間反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０分間静置し、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液１０μＬを加え、３７℃で９０分間反応させ、９０℃で１０分間酵素分解し、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を対照サンプル系列標準溶液として収集した。
３．１対照サンプル溶液の調製
実施例１でスクリーニングした特徴的なポリペプチド対照サンプル１０ｍｇを精密秤量し、１００ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解し、目盛りまで希釈し、均一になるまで振とうし、それぞれ０．１ｍＬ、０．２５ｍＬ、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ精密秤量し、それぞれ１００ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で目盛りまで希釈し、均一になるまで振とうし、それぞれ２００μＬ精密秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃１時間反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０分間静置し、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液１０μＬを加え、３７℃で９０分間反応させ、９０℃で１０分間酵素分解し、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を対照サンプル系列標準溶液として収集した。
【0022】
３．２テストサンプル溶液の調製
測定されるサンプル２０ｍｇを取り、１０ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して定容し、２００μＬ精密秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で１時間反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０分間静置し、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液（使用時に調製）１０μＬを加え、３７℃で９０分間反応させ、９０℃で１０分間酵素分解し、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清液をテストサンプル溶液として収集した。
測定されるサンプル２０ｍｇを取り、１０ｍＬメスフラスコに入れ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して定容し、２００μＬ精密秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で１時間反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０分間静置し、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液（使用時に調製）１０μＬを加え、３７℃で９０分間反応させ、９０℃で１０分間酵素分解し、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清液をテストサンプル溶液として収集した。
【0023】
３．３ブランク溶液の調製
２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液２００μＬを精密秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で１時間反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０分間静置し、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液（使用時に調製）１０μＬを加え、３７℃で９０分間反応させ、９０℃で１０分間酵素分解１０し、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清液をブランク溶液として収集した。
２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液２００μＬを精密秤量し、０．２ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール溶液１０μＬを加え、均一に混合し、６０℃で１時間反応させ、０．２ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液２０μＬを加え、暗所で３０分間静置し、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液７６０μＬ及び０．４ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液（使用時に調製）１０μＬを加え、３７℃で９０分間反応させ、９０℃で１０分間酵素分解１０し、室温まで放冷し、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清液をブランク溶液として収集した。
【0024】
４、測定法
前記測定される溶液をそれぞれ２μＬ取り、「２、クロマトグラフィー質量分析条件」に記載の条件で測定し、対照サンプル系列標準溶液中の特徴的なポリペプチドの濃度を横座標、対応するピーク面積を縦座標とし、線形回帰方程式（ｒ＞０．９９）を計算し、回帰方程式からテストサンプル溶液濃度を算出し、測定されるサンプル中のトロンビン様酵素の含有量を算出した。
前記測定される溶液をそれぞれ２μＬ取り、「２、クロマトグラフィー質量分析条件」に記載の条件で測定し、対照サンプル系列標準溶液中の特徴的なポリペプチドの濃度を横座標、対応するピーク面積を縦座標とし、線形回帰方程式（ｒ＞０．９９）を計算し、回帰方程式からテストサンプル溶液濃度を算出し、測定されるサンプル中のトロンビン様酵素の含有量を算出した。
【0025】
５、特異性の評価
テストサンプル溶液、ブランク溶液及び対照サンプル溶液をそれぞれ２μＬ取り、液体クロマトグラフィー－質量分析を行った結果、ブランク溶液は対照サンプル溶液のピーク位置に干渉ピークが現れる一方、テストサンプル溶液は対照サンプル溶液のピーク位置に応答ピークが現れた。これは、この方法が特異性が良好であることを示している（図１）。
テストサンプル溶液、ブランク溶液及び対照サンプル溶液をそれぞれ２μＬ取り、液体クロマトグラフィー－質量分析を行った結果、ブランク溶液は対照サンプル溶液のピーク位置に干渉ピークが現れる一方、テストサンプル溶液は対照サンプル溶液のピーク位置に応答ピークが現れた。これは、この方法が特異性が良好であることを示している（図１）。
【0026】
６、検出限界と定量限界
０．０２μｇ／ｍＬの対照サンプル溶液を取り、水で希釈して濃度が６ｎｇ／ｍＬ及び２ｎｇ／ｍＬの対照サンプル溶液を調製し、それぞれを２μＬ取り、高速液体クロマトグラフィー－質量分析計に注入し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対として測定した。対照サンプル溶液の濃度が２ｎｇ／ｍＬである場合、特徴的なポリペプチドの定量イオン対の信号対雑音比は３．４であり、濃度が６ｎｇ／ｍＬである場合、信号対雑音比は１１．８であった。従って、検出限界は２ｎｇ／ｍＬ、定量限界は６ｎｇ／ｍＬであった（図３）。
０．０２μｇ／ｍＬの対照サンプル溶液を取り、水で希釈して濃度が６ｎｇ／ｍＬ及び２ｎｇ／ｍＬの対照サンプル溶液を調製し、それぞれを２μＬ取り、高速液体クロマトグラフィー－質量分析計に注入し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対として測定した。対照サンプル溶液の濃度が２ｎｇ／ｍＬである場合、特徴的なポリペプチドの定量イオン対の信号対雑音比は３．４であり、濃度が６ｎｇ／ｍＬである場合、信号対雑音比は１１．８であった。従って、検出限界は２ｎｇ／ｍＬ、定量限界は６ｎｇ／ｍＬであった（図３）。
【0027】
７、直線性と範囲
「３．１対照サンプル溶液の調製」に記載の方法に従って最終濃度が０．０２μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬの対照サンプル系列標準溶液を調製し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対として測定した。対照サンプル系列標準溶液中の特徴的なポリペプチドの濃度を横座標とし、対応するピーク面積を縦座標として線形回帰方程式：ｙ＝７８３４１１ｘ－１０３２９（Ｒ２＝０．９９８）を計算した結果、０．０２μｇ／ｍＬ～０．４μｇ／ｍＬの範囲内では、特徴的なポリペプチドの濃度とピーク面積は線形関係にあった（図２）。
「３．１対照サンプル溶液の調製」に記載の方法に従って最終濃度が０．０２μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬの対照サンプル系列標準溶液を調製し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対として測定した。対照サンプル系列標準溶液中の特徴的なポリペプチドの濃度を横座標とし、対応するピーク面積を縦座標として線形回帰方程式：ｙ＝７８３４１１ｘ－１０３２９（Ｒ２＝０．９９８）を計算した結果、０．０２μｇ／ｍＬ～０．４μｇ／ｍＬの範囲内では、特徴的なポリペプチドの濃度とピーク面積は線形関係にあった（図２）。
【0028】
８、再現性
テストサンプル溶液の調製方法に従って、６つの溶液を並行して調製し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対として測定した。その結果、並行して測定した６回の含有量ＲＳＤは２．２％であり、方法の再現性が良好であることを示している。
テストサンプル溶液の調製方法に従って、６つの溶液を並行して調製し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対として測定した。その結果、並行して測定した６回の含有量ＲＳＤは２．２％であり、方法の再現性が良好であることを示している。
【表2】
【0029】
９、精度の評価
テストサンプル溶液を取り、６回の連続注入を繰り返し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対としてピーク面積を測定した結果、ＲＳＤは２．６％であった。これは、装置の精度が良好であることを示している。
テストサンプル溶液を取り、６回の連続注入を繰り返し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対としてピーク面積を測定した結果、ＲＳＤは２．６％であった。これは、装置の精度が良好であることを示している。
【表3】
【0030】
１０、安定性評価
テストサンプル溶液を取り、処理した後、８℃で静置し、それぞれ０、２、４、６、８、１６及び２４時間目に注入して測定し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対として測定した結果、ピーク面積ＲＳＤは３．０％であった。これは、テストサンプル溶液中の特徴的なポリペプチドが８℃で２４時間以内で安定であることを示している。
テストサンプル溶液を取り、処理した後、８℃で静置し、それぞれ０、２、４、６、８、１６及び２４時間目に注入して測定し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対として測定した結果、ピーク面積ＲＳＤは３．０％であった。これは、テストサンプル溶液中の特徴的なポリペプチドが８℃で２４時間以内で安定であることを示している。
【表4】
【0031】
１１、回収率の測定
特徴的なポリペプチドの含有量が既知の蛇毒サンプル（含有量０．５３μｇ／ｍｇ）１９．８０ｍｇを精密秤量し、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して１０ｍＬまで希釈し、２００μＬ／組で９組取り、それぞれに適量の特徴的なポリペプチド対照サンプル溶液を加え、「３．２テストサンプル溶液の調製」に記載の方法により回収率測定溶液を調製し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対として測定した。その結果、３つの並行回収率はいずれも９１．１８％～１０７．８４％の範囲内にあり、平均回収率は９６．２３％であり、ＲＳＤは６．６％であった。この方法は回収率が良好であった。
特徴的なポリペプチドの含有量が既知の蛇毒サンプル（含有量０．５３μｇ／ｍｇ）１９．８０ｍｇを精密秤量し、２５ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウム溶液で溶解して１０ｍＬまで希釈し、２００μＬ／組で９組取り、それぞれに適量の特徴的なポリペプチド対照サンプル溶液を加え、「３．２テストサンプル溶液の調製」に記載の方法により回収率測定溶液を調製し、８７７．４（二重荷電）→８９２．４を定量イオン対として測定した。その結果、３つの並行回収率はいずれも９１．１８％～１０７．８４％の範囲内にあり、平均回収率は９６．２３％であり、ＲＳＤは６．６％であった。この方法は回収率が良好であった。
【表5】
【0032】
１２、サンプル検出
「３、溶液の調製」、「４、測定法」に記載の方法により中国長白山マムシ毒（２０１８０６０１Ｆ、２０１８０７０２Ｆ、２０１７０８０２）と標識されたサンプル、アメリカハブ蛇毒（２００４１７１、２００４１７２、２００４１７３、２００４１７４）と標識されたサンプル、及び蛇種が未知の蛇毒サンプル（２０２００３０４、２０２００４０５）を検出した。
「３、溶液の調製」、「４、測定法」に記載の方法により中国長白山マムシ毒（２０１８０６０１Ｆ、２０１８０７０２Ｆ、２０１７０８０２）と標識されたサンプル、アメリカハブ蛇毒（２００４１７１、２００４１７２、２００４１７３、２００４１７４）と標識されたサンプル、及び蛇種が未知の蛇毒サンプル（２０２００３０４、２０２００４０５）を検出した。
【0033】
１２．１定性分析
前記蛇毒サンプルの前処理方法及び分析方法により検出した結果、質量電荷比（ｍ／ｚ）８７７．４（二重荷電）→５５０．２及び８７７．４（二重荷電）→８９２．４イオン対を用いて作成したテストサンプルのイオン電流クロマトグラムにおいて、３バッチの中国長白山マムシ毒サンプルはいずれも対照の特徴的なポリペプチドのクロマトグラムの滞留時間（０．８８分間）と一致したピークが現れ、４バッチのアメリカハブ蛇毒及び２バッチの未知蛇毒はいずれも対照の特徴的なポリペプチドのクロマトグラムの滞留時間にピークが現れなかった。従って、３バッチの中国長白山マムシ毒にはいずれも特徴的なポリペプチドＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲが検出され、中国長白山マムシに由来することが確認された。４バッチのアメリカハブ蛇毒及び２バッチの未知蛇毒にはいずれもこの特徴的なポリペプチドが検出されなかったため、この６パッチの蛇毒は中国長白山マムシに由来するものではないことを示している。
前記蛇毒サンプルの前処理方法及び分析方法により検出した結果、質量電荷比（ｍ／ｚ）８７７．４（二重荷電）→５５０．２及び８７７．４（二重荷電）→８９２．４イオン対を用いて作成したテストサンプルのイオン電流クロマトグラムにおいて、３バッチの中国長白山マムシ毒サンプルはいずれも対照の特徴的なポリペプチドのクロマトグラムの滞留時間（０．８８分間）と一致したピークが現れ、４バッチのアメリカハブ蛇毒及び２バッチの未知蛇毒はいずれも対照の特徴的なポリペプチドのクロマトグラムの滞留時間にピークが現れなかった。従って、３バッチの中国長白山マムシ毒にはいずれも特徴的なポリペプチドＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲが検出され、中国長白山マムシに由来することが確認された。４バッチのアメリカハブ蛇毒及び２バッチの未知蛇毒にはいずれもこの特徴的なポリペプチドが検出されなかったため、この６パッチの蛇毒は中国長白山マムシに由来するものではないことを示している。
【0034】
１２．２定量分析
特徴的なポリペプチド（ＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲ）が検出されたサンプルに対して、回帰方程式からテストサンプル溶液の濃度を算出し、さらにサンプル中のトロンビン様酵素の含有量を算出した。結果を表６に示す。３バッチの粗毒の含有量はいずれも０．４μｇ／ｍｇ以上であった。従って、この方法は、サンプル中の中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の含有量の測定に適用できる。
以上の実施例は本発明の好適な実施形態であり、本発明の実施形態は実施例に制限されず、本発明の趣旨から逸脱しない範囲内で行われた変更、修飾、組み合わせ、置換、簡素化はいずれも同等置換であり、本発明の保護範囲に含まれるべきである。
特徴的なポリペプチド（ＴＬＣＡＧＶＭＥＧＧＩＤＴＣＮＲ）が検出されたサンプルに対して、回帰方程式からテストサンプル溶液の濃度を算出し、さらにサンプル中のトロンビン様酵素の含有量を算出した。結果を表６に示す。３バッチの粗毒の含有量はいずれも０．４μｇ／ｍｇ以上であった。従って、この方法は、サンプル中の中国長白山マムシ毒トロンビン様酵素の含有量の測定に適用できる。
【表6】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】