▶ アドヴェラム バイオテクノロジーズ， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022028928
(43)【公開日】2022-02-16
(54)【発明の名称】眼性新血管形成を低減するための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
A61K 48/00 20060101AFI20220208BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20220208BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20220208BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220208BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220208BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20220208BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20220208BHJP
A61K 47/20 20060101ALI20220208BHJP
A61K 47/10 20060101ALI20220208BHJP
A61K 47/16 20060101ALI20220208BHJP
A61K 47/44 20170101ALI20220208BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20220208BHJP
A61K 31/46 20060101ALI20220208BHJP
A61K 31/496 20060101ALI20220208BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20220208BHJP
A61K 38/17 20060101ALN20220208BHJP
A61K 39/395 20060101ALN20220208BHJP
【ＦＩ】
A61K48/00
A61P27/02 ZNA
A61P9/10
A61P43/00 121
A61K35/76
A61K9/10
A61K47/26
A61K47/20
A61K47/10
A61K47/16
A61K47/44
A61K47/02
A61K31/46
A61K31/496
C12N15/864 100Z
A61K38/17
A61K39/395 N
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021197648
(22)【出願日】2021-12-06
(62)【分割の表示】P 2018565844の分割
【原出願日】2017-06-16
(31)【優先権主張番号】62/351,231
(32)【優先日】2016-06-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．プルロニック
(71)【出願人】
【識別番号】516279086
【氏名又は名称】アドヴェラム バイオテクノロジーズ， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】マーク ブルーメンクランツ
(72)【発明者】
【氏名】メヒディ ガスミ
(57)【要約】
【課題】眼性新血管形成を低減するための組成物および方法の提供
【解決手段】本開示は、抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸配列を有するｒＡＡＶベクターを含む薬学的組成物を被験体に投与することによる、被験体におけるＡＭＤ等の眼性新血管形成の予防または処置のための、薬学的組成物およびその方法を提供する。本開示は、ｓＦｌｔ－１、ラニビズマブまたはベバシズマブ等の抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸を含む薬学的に有効な量のベクターまたはウイルス粒子を含む薬学的組成物を網膜下または硝子体内投与することによる、被験体（例えば、ヒト被験体）におけるＡＭＤおよびＣＮＶ等の眼性新血管形成の予防または処置の薬学的組成物および方法に関する。
【選択図】なし
【解決手段】本開示は、抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸配列を有するｒＡＡＶベクターを含む薬学的組成物を被験体に投与することによる、被験体におけるＡＭＤ等の眼性新血管形成の予防または処置のための、薬学的組成物およびその方法を提供する。本開示は、ｓＦｌｔ－１、ラニビズマブまたはベバシズマブ等の抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸を含む薬学的に有効な量のベクターまたはウイルス粒子を含む薬学的組成物を網膜下または硝子体内投与することによる、被験体（例えば、ヒト被験体）におけるＡＭＤおよびＣＮＶ等の眼性新血管形成の予防または処置の薬学的組成物および方法に関する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本願は、２０１６年６月１６日に出願された米国仮出願第６２／３５１，２３１号の利益を主張し、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本願は、２０１６年６月１６日に出願された米国仮出願第６２／３５１，２３１号の利益を主張し、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、脈管形成および血管新生を刺激する、細胞によって産生されるシグナルタンパク質である。ＶＥＧＦは、血液循環が不適切なときに、組織への酸素供給を回復する系の一部であり得る。ＶＥＧＦの正常機能は、胚発生における新たな血管、傷害後の新たな血管、運動後の筋肉、および遮断された血管を迂回するための新たな血管を作製することであり得る。
【0003】
ＶＥＧＦの過剰発現は、哺乳動物における様々な疾患状況および状態に寄与することがある。ある特定のがんにおけるＶＥＧＦの発現は、がん細胞を成長および転移させることがある。ＶＥＧＦの過剰発現は、眼の網膜および身体の他の部分における血管性疾患を引き起こすことがある。
【0004】
ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）は、脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）および加齢性黄斑変性の発症を含む多数の疾患に関係づけられる。ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ活性に関連する眼疾患または状態の例として、新生血管（滲出型）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、ＤＭＥ患者における糖尿病性網膜症（ＤＲ）、虚血性網膜症、眼内新血管形成、乾性ＡＭＤ、網膜新血管形成、糖尿病性網膜虚血、糖尿病性網膜浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、網膜中心静脈閉塞および網膜静脈分枝閉塞が挙げられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
いくつかのタンパク質または抗体に基づく注射療法、例えば、ラニビズマブおよびベバシズマブは、ＡＭＤの処置に利用できるが、遺伝子療法は、一部の患者における炎症、感染および他の有害作用のリスクを増加し得る反復した注射を要求することなく、ｉｎ ｖｉｖｏで治療剤の延長したまたは持続した放出をもたらすことができるため、眼に抗ＶＥＧＦ剤を送達する遺伝子療法の方法は、患者に改善された処置選択肢をもたらすことができる。その上、服薬非遵守（ｎｏｎ－ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）は、視力喪失および眼疾患または状態の増悪をもたらし得るため、反復した注射を要求しないことにより、遺伝子療法は、反復した注射を要求する治療法に伴う患者服薬遵守およびアドヒアランスの課題に取り組む。投与のために診療所への反復したまたは高頻度の来診を要求する処置レジメンに対する服薬非遵守およびノンアドヒアランス（ｎｏｎ－ａｄｈｅｒｅｎｃｅ）の比率は、ＡＭＤにより最も影響を受ける高齢患者の間でより高い。よって、遺伝子療法による患者の眼への治療剤の送達は、より安全で、潜在的に対費用効果がより高く、患者のためにより便利な処置選択肢をもたらし、服薬非遵守およびノンアドヒアランスの問題に取り組むことにより、患者転帰を改善することができる。
【0006】
本開示は、ｓＦｌｔ－１、ラニビズマブまたはベバシズマブ等の抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸を含む薬学的に有効な量のベクターまたはウイルス粒子を含む薬学的組成物を網膜下または硝子体内投与することによる、被験体（例えば、ヒト被験体）におけるＡＭＤおよびＣＮＶ等の眼性新血管形成の予防または処置の薬学的組成物および方法に関する。
【0007】
一部の態様では、眼疾患または状態を処置する方法であって、眼への注射によって単位用量の薬学的懸濁物を霊長類被験体に投与するステップを含み、単位用量の薬学的懸濁物が、ＡＡＶ２におけるカプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸５７０～６１１に対応する位置に、ＬＧＥＴＴＲＰ、ＮＥＴＩＴＲＰ、ＫＡＧＱＡＮＮ、ＫＤＰＫＴＴＮ、ＫＤＴＤＴＴＲ、ＲＡＧＧＳＶＧ、ＡＶＤＴＴＫＦおよびＳＴＧＫＶＰＮから選択されるアミノ酸配列の挿入を含むバリアントカプシドタンパク質；ならびに抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）ポリペプチドをコードする異種配列を有する、１Ｅ１２～１Ｅ１３の間のベクターゲノムのｒＡＡＶを含む、方法が、本明細書に開示されている。一部の事例では、単位用量は、２Ｅ１２～６Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む。一部の事例では、被験体は、非ヒト霊長類である。一部の事例では、被験体は、ヒトである。一部の事例では、眼状態または疾患は、新生血管（滲出型）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞またはＤＭＥに伴う糖尿病性網膜症である。一部の事例では、眼状態または疾患は、脈絡膜新血管形成またはＡＭＤである。一部の事例では、懸濁物の投与は、カラー眼底写真撮影によって測定された場合に、ビヒクル対照と比較して、グレードＩＶ病変のパーセンテージの少なくとも５％の低下をもたらす。一部の事例では、グレードＩＶ病変のパーセンテージの低下は、少なくとも１０％である。一部の事例では、単位用量は、１００μＬ以下の容量を含む。一部の事例では、単位用量は、５０μＬ以下の容量を含む。一部の事例では、挿入は、ＡＡＶ２におけるアミノ酸５８７および５８８の間の位置におけるＬＧＥＴＴＲＰである。一部の事例では、被験体は、ラニビズマブ、ベバシズマブおよびｓＶＥＧＦＲ－１のうち少なくとも１種に対して応答性である。一部の事例では、被験体は、ラニビズマブまたはベバシズマブで前処置されている。一部の実例では、注射は、硝子体内である。一部の実例では、注射は、網膜下である。一部の事例では、注射による投与は、少なくとも２年間で１回以下行われる。一部の事例では、注射による投与は、少なくとも５年間で１回以下行われる。一部の事例では、投与は、一度限りの投与である。一部の事例では、本方法は、投与ステップに先立ち、懸濁物を撹拌して均一な分布を確実にするステップをさらに含む。一部の事例では、本方法は、投与ステップに先立ち、懸濁物を室温に温めるステップをさらに含む。一部の事例では、懸濁物は、界面活性物質をさらに含む。一部の事例では、界面活性物質は、ポリソルベート、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルジメチルアミンオキシド、ポリエトキシ化アルコール、ポリオキシエチレンソルビタン、オクトキシノール、Ｂｒｉｊ、プルロニックおよびポリオキシルヒマシ油から選択される。一部の事例では、懸濁物は、フェノール、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムをさらに含む。一部の事例では、本方法は、注射後に抗生物質溶液または硫酸アトロピン軟膏を投与するステップをさらに含む。一部の事例では、抗生物質溶液は、シプロフロキサシンを含む。一部の事例では、抗ＶＥＧＦポリペプチドは、ヒト化モノクローナル抗体である。一部の事例では、抗ＶＥＧＦポリペプチドは、抗体断片またはＦａｂである。一部の事例では、ヒト化モノクローナル抗体は、ラニビズマブまたはベバシズマブである。一部の事例では、抗ＶＥＧＦポリペプチドは、可溶性トランケート型のＶＥＧＦ受容体１（ｓＶＥＧＦＲ－１）である。
【0008】
他の態様では、眼状態または疾患を処置する方法であって、ＡＡＶ２におけるカプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸５７０～６１１に対応する位置に、ＬＧＥＴＴＲＰ、ＮＥＴＩＴＲＰ、ＫＡＧＱＡＮＮ、ＫＤＰＫＴＴＮ、ＫＤＴＤＴＴＲ、ＲＡＧＧＳＶＧ、ＡＶＤＴＴＫＦおよびＳＴＧＫＶＰＮから選択されるアミノ酸配列の挿入を含むバリアントカプシドタンパク質；ならびに抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）ポリペプチドをコードする異種配列を有するｒＡＡＶを含む懸濁組成物を撹拌するステップと、注射によりヒト被験体の眼に懸濁組成物を投与するステップとを含む方法も、本明細書に開示されている。一部の事例では、挿入は、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７および５８８の間のＬＧＥＴＴＲＰである。一部の事例では、被験体は、ラニビズマブまたはベバシズマブで前処置されていることによって特徴付けられる。一部の事例では、被験体は、ラニビズマブおよびベバシズマブのうち少なくとも１種に対して応答性である。一部の事例では、抗ＶＥＧＦポリペプチドは、ヒト化モノクローナル抗体である。一部の事例では、抗ＶＥＧＦポリペプチドは、抗体断片またはＦａｂである。一部の事例では、ヒト化モノクローナル抗体は、ラニビズマブまたはベバシズマブである。一部の事例では、抗ＶＥＧＦポリペプチドは、可溶性トランケート型のＶＥＧＦ受容体１（ｓＶＥＧＦＲ－１）である。一部の事例では、被験体に投与される容量は、５０μＬ以下である。一部の事例では、被験体に投与される容量は、１００μＬ以下である。一部の事例では、容量は、１Ｅ１２～１Ｅ１３の間のベクターゲノムの単位用量を含む。一部の事例では、容量は、２Ｅ１２～６Ｅ１２の間のベクターゲノムの単位用量を含む。一部の事例では、投与ステップは、少なくとも２年間で１回以下行われる。一部の事例では、投与ステップは、一度限りの注射である。一部の事例では、本方法は、組成物を投与する前に、少なくとも１種の承認された治療法に対する応答性に関して被験体をアッセイするステップをさらに含む。一部の事例では、承認された治療法は、ラニビズマブおよびベバシズマブを含む。一部の事例では、懸濁物は、薬学的に許容される賦形剤を含む。一部の事例では、賦形剤は、界面活性物質または安定剤を含む。一部の事例では、界面活性物質は、ポリソルベート、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルジメチルアミンオキシド、ポリエトキシ化アルコール、ポリオキシエチレンソルビタン、オクトキシノール、Ｂｒｉｊ、プルロニックおよびポリオキシルヒマシ油から選択される。一部の事例では、薬学的に許容される賦形剤は、フェノール、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを含む。一部の事例では、眼状態または疾患は、新生血管（滲出型）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞またはＤＭＥに伴う糖尿病性網膜症である。一部の事例では、眼状態または疾患は、脈絡膜新血管形成またはＡＭＤである。一部の事例では、注射は、硝子体内である。一部の実例では、注射は、網膜下である。一部の事例では、挿入は、ＡＡＶ２におけるアミノ酸５８７および５８８の間の位置におけるＬＧＥＴＴＲＰである。一部の事例では、本方法は、投与前に懸濁物を室温に温めるステップをさらに含む。
【0009】
他の態様では、ＡＡＶ２におけるカプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸５７０～６１１に対応する位置に、ＬＧＥＴＴＲＰ、ＮＥＴＩＴＲＰ、ＫＡＧＱＡＮＮ、ＫＤＰＫＴＴＮ、ＫＤＴＤＴＴＲ、ＲＡＧＧＳＶＧ、ＡＶＤＴＴＫＦおよびＳＴＧＫＶＰＮから選択されるアミノ酸配列の挿入を含むバリアントカプシドタンパク質；ならびに抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）ポリペプチドをコードする異種配列を有するｒＡＡＶを含む、単位用量の懸濁物を含む薬学的組成物も、本明細書に開示されている。一部の事例では、単位用量は、１Ｅ１２～１Ｅ１３の間のベクターゲノムである。一部の事例では、単位用量は、２Ｅ１２～６Ｅ１２の間のベクターゲノムである。一部の事例では、懸濁物は、冷蔵されている。一部の事例では、キットは、薬学的組成物および薬学的組成物を希釈するための溶液を含む。一部の事例では、溶液は、緩衝液、塩、アルコール、界面活性物質またはこれらのいずれかの組み合わせを含む。一部の事例では、キットは、シリンジをさらに含む。一部の事例では、抗ＶＥＧＦポリペプチドは、ヒト化モノクローナル抗体である。一部の事例では、抗ＶＥＧＦポリペプチドは、抗体断片またはＦａｂである。一部の事例では、ヒト化モノクローナル抗体は、ラニビズマブまたはベバシズマブである。一部の事例では、抗ＶＥＧＦポリペプチドは、可溶性トランケート型のＶＥＧＦ受容体１（ｓＶＥＧＦＲ－１）である。一部の事例では、挿入は、ＡＡＶ２におけるアミノ酸５８７および５８８の間の位置におけるＬＧＥＴＴＲＰである。
【0010】
参照による組込み
本明細書に言及されているあらゆる刊行物、特許および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが、参照により組み込まれていると特にかつ個々に示されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれている。
本明細書に言及されているあらゆる刊行物、特許および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが、参照により組み込まれていると特にかつ個々に示されているのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれている。
【0011】
本発明の新規特徴は、添付の特許請求の範囲において詳細に示される。本発明の特徴および利点のより深い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明および付随する図の参照によって得られる。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
眼疾患または状態を処置する方法であって、眼への注射によって単位用量の薬学的懸濁物を霊長類被験体に投与するステップを含み、前記単位用量の薬学的懸濁物が、
ＡＡＶ２におけるカプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸５７０～６１１に対応する位置に、ＬＧＥＴＴＲＰ、ＮＥＴＩＴＲＰ、ＫＡＧＱＡＮＮ、ＫＤＰＫＴＴＮ、ＫＤＴＤＴＴＲ、ＲＡＧＧＳＶＧ、ＡＶＤＴＴＫＦおよびＳＴＧＫＶＰＮから選択されるアミノ酸配列の挿入を含むバリアントカプシドタンパク質；ならびに抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）ポリペプチドをコードする異種配列を有する、１Ｅ１２～１Ｅ１３の間のベクターゲノムのｒＡＡＶを含む、方法。
（項目２）
前記単位用量が、２Ｅ１２～６Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記被験体が、非ヒト霊長類である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記被験体が、ヒトである、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記眼状態または疾患が、新生血管（滲出型）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞またはＤＭＥに伴う糖尿病性網膜症である、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記眼状態または疾患が、脈絡膜新血管形成またはＡＭＤである、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記懸濁物を投与するステップが、カラー眼底写真撮影によって測定された場合に、ビヒクル対照と比較して、グレードＩＶ病変のパーセンテージの少なくとも５％の低下をもたらす、項目１に記載の方法。
（項目８）
グレードＩＶ病変のパーセンテージの前記低下が、少なくとも１０％である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記単位用量が、１００μＬ以下の容量を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記単位用量が、５０μＬ以下の容量を含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記挿入が、ＡＡＶ２におけるアミノ酸５８７および５８８の間の位置におけるＬＧＥＴＴＲＰである、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記被験体が、ラニビズマブ、ベバシズマブおよびｓＶＥＧＦＲ－１のうち少なくとも１種に対して応答性である、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記被験体が、ラニビズマブまたはベバシズマブで前処置されている、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記注射が、硝子体内である、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記注射が、網膜下である、項目１に記載の方法。
（項目１６）
注射による前記投与が、少なくとも２年間で１回以下行われる、項目１に記載の方法。（項目１７）
注射による前記投与が、少なくとも５年間で１回以下行われる、項目１に記載の方法。（項目１８）
前記投与が、一度限りの投与である、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記投与ステップに先立ち、前記懸濁物を撹拌して均一な分布を確実にするステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記投与ステップに先立ち、前記懸濁物を室温に温めるステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記懸濁物が、界面活性物質をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記界面活性物質が、ポリソルベート、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルジメチルアミンオキシド、ポリエトキシ化アルコール、ポリオキシエチレンソルビタン、オクトキシノール、Ｂｒｉｊ、プルロニックおよびポリオキシルヒマシ油から選択される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記懸濁物が、フェノール、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記注射後に抗生物質溶液または硫酸アトロピン軟膏を投与するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記抗生物質溶液が、シプロフロキサシンを含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記抗ＶＥＧＦポリペプチドが、ヒト化モノクローナル抗体である、項目１に記載の方法。
（項目２７）
前記抗ＶＥＧＦポリペプチドが、抗体断片またはＦａｂである、項目１に記載の方法。（項目２８）
前記ヒト化モノクローナル抗体が、ラニビズマブまたはベバシズマブである、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記抗ＶＥＧＦポリペプチドが、可溶性トランケート型のＶＥＧＦ受容体１（ｓＶＥＧＦＲ－１）である、項目１に記載の方法。
（項目３０）
眼状態または疾患を処置する方法であって、
（ａ）ＡＡＶ２におけるカプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸５７０～６１１に対応する位置に、ＬＧＥＴＴＲＰ、ＮＥＴＩＴＲＰ、ＫＡＧＱＡＮＮ、ＫＤＰＫＴＴＮ、ＫＤＴＤＴＴＲ、ＲＡＧＧＳＶＧ、ＡＶＤＴＴＫＦおよびＳＴＧＫＶＰＮから選択されるアミノ酸配列の挿入を含むバリアントカプシドタンパク質；ならびに抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）ポリペプチドをコードする異種配列を有するｒＡＡＶを含む懸濁組成物を撹拌するステップと、
（ｂ）注射によりヒト被験体の眼に前記懸濁組成物を投与するステップと
を含む、方法。
（項目３１）
前記挿入が、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７および５８８の間のＬＧＥＴＴＲＰである、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記被験体が、ラニビズマブまたはベバシズマブで前処置されていることによって特徴付けられる、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記被験体が、ラニビズマブおよびベバシズマブのうち少なくとも１種に対して応答性である、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
前記抗ＶＥＧＦポリペプチドが、ヒト化モノクローナル抗体である、項目３０に記載の方法。
（項目３５）
前記抗ＶＥＧＦポリペプチドが、抗体断片またはＦａｂである、項目３０に記載の方法。
（項目３６）
前記ヒト化モノクローナル抗体が、ラニビズマブまたはベバシズマブである、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
前記抗ＶＥＧＦポリペプチドが、可溶性トランケート型のＶＥＧＦ受容体１（ｓＶＥＧＦＲ－１）である、項目３０に記載の方法。
（項目３８）
前記被験体に投与される容量が、５０μＬ以下である、項目３０に記載の方法。
（項目３９）
前記被験体に投与される容量が、１００μＬ以下である、項目３０に記載の方法。
（項目４０）
容量が、１Ｅ１２～１Ｅ１３の間のベクターゲノムの単位用量を含む、項目３０に記載の方法。
（項目４１）
容量が、２Ｅ１２～６Ｅ１２の間のベクターゲノムの単位用量を含む、項目３０に記載の方法。
（項目４２）
前記投与ステップが、少なくとも２年間で１回以下行われる、項目３０に記載の方法。（項目４３）
前記投与ステップが、一度限りの注射である、項目３０に記載の方法。
（項目４４）
前記組成物を投与する前に、少なくとも１種の承認された治療法に対する応答性に関して前記被験体をアッセイするステップをさらに含む、項目３０に記載の方法。
（項目４５）
前記承認された治療法が、ラニビズマブおよびベバシズマブを含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記懸濁物が、薬学的に許容される賦形剤を含む、項目３０に記載の方法。
（項目４７）
前記賦形剤が、界面活性物質または安定剤を含む、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記界面活性物質が、ポリソルベート、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルジメチルアミンオキシド、ポリエトキシ化アルコール、ポリオキシエチレンソルビタン、オクトキシノール、Ｂｒｉｊ、プルロニックおよびポリオキシルヒマシ油から選択される、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記薬学的に許容される賦形剤が、フェノール、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを含む、項目４６に記載の方法。
（項目５０）
前記眼状態または疾患が、新生血管（滲出型）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞またはＤＭＥに伴う糖尿病性網膜症である、項目３０に記載の方法。
（項目５１）
前記眼状態または疾患が、脈絡膜新血管形成またはＡＭＤである、項目３０に記載の方法。
（項目５２）
前記注射が、硝子体内である、項目３０に記載の方法。
（項目５３）
前記注射が、網膜下である、項目３０に記載の方法。
（項目５４）
前記挿入が、ＡＡＶ２におけるアミノ酸５８７および５８８の間の位置におけるＬＧＥＴＴＲＰである、項目３０に記載の方法。
（項目５５）
投与前に前記懸濁物を室温に温めるステップをさらに含む、項目３０に記載の方法。
（項目５６）
ＡＡＶ２におけるカプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸５７０～６１１に対応する位置に、ＬＧＥＴＴＲＰ、ＮＥＴＩＴＲＰ、ＫＡＧＱＡＮＮ、ＫＤＰＫＴＴＮ、ＫＤＴＤＴＴＲ、ＲＡＧＧＳＶＧ、ＡＶＤＴＴＫＦおよびＳＴＧＫＶＰＮから選択されるアミノ酸配列の挿入を含むバリアントカプシドタンパク質；ならびに抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）ポリペプチドをコードする異種配列を有するｒＡＡＶを含む、単位用量の懸濁物を含む薬学的組成物。
（項目５７）
前記単位用量が、１Ｅ１２～１Ｅ１３の間のベクターゲノムである、項目５６に記載の薬学的組成物。
（項目５８）
前記単位用量が、２Ｅ１２～６Ｅ１２の間のベクターゲノムである、項目５６に記載の薬学的組成物。
（項目５９）
前記懸濁物が、冷蔵されている、項目５６に記載の薬学的組成物。
（項目６０）
項目５６に記載の薬学的組成物および前記薬学的組成物を希釈するための溶液を含むキット。
（項目６１）
前記溶液が、緩衝液、塩、アルコール、界面活性物質またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、項目６０に記載のキット。
（項目６２）
シリンジをさらに含む、項目６０に記載のキット。
（項目６３）
前記抗ＶＥＧＦポリペプチドが、ヒト化モノクローナル抗体である、項目５６に記載の薬学的組成物。
（項目６４）
前記抗ＶＥＧＦポリペプチドが、抗体断片またはＦａｂである、項目５６に記載の薬学的組成物。
（項目６５）
前記ヒト化モノクローナル抗体が、ラニビズマブまたはベバシズマブである、項目５６に記載の薬学的組成物。
（項目６６）
前記抗ＶＥＧＦポリペプチドが、可溶性トランケート型のＶＥＧＦ受容体１（ｓＶＥＧＦＲ－１）である、項目５６に記載の薬学的組成物。
（項目６７）
前記挿入が、ＡＡＶ２におけるアミノ酸５８７および５８８の間の位置におけるＬＧＥＴＴＲＰである、項目５６に記載の薬学的組成物。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
眼疾患または状態を処置する方法であって、眼への注射によって単位用量の薬学的懸濁物を霊長類被験体に投与するステップを含み、前記単位用量の薬学的懸濁物が、
ＡＡＶ２におけるカプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸５７０～６１１に対応する位置に、ＬＧＥＴＴＲＰ、ＮＥＴＩＴＲＰ、ＫＡＧＱＡＮＮ、ＫＤＰＫＴＴＮ、ＫＤＴＤＴＴＲ、ＲＡＧＧＳＶＧ、ＡＶＤＴＴＫＦおよびＳＴＧＫＶＰＮから選択されるアミノ酸配列の挿入を含むバリアントカプシドタンパク質；ならびに抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）ポリペプチドをコードする異種配列を有する、１Ｅ１２～１Ｅ１３の間のベクターゲノムのｒＡＡＶを含む、方法。
（項目２）
前記単位用量が、２Ｅ１２～６Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記被験体が、非ヒト霊長類である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記被験体が、ヒトである、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記眼状態または疾患が、新生血管（滲出型）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞またはＤＭＥに伴う糖尿病性網膜症である、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記眼状態または疾患が、脈絡膜新血管形成またはＡＭＤである、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記懸濁物を投与するステップが、カラー眼底写真撮影によって測定された場合に、ビヒクル対照と比較して、グレードＩＶ病変のパーセンテージの少なくとも５％の低下をもたらす、項目１に記載の方法。
（項目８）
グレードＩＶ病変のパーセンテージの前記低下が、少なくとも１０％である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記単位用量が、１００μＬ以下の容量を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記単位用量が、５０μＬ以下の容量を含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記挿入が、ＡＡＶ２におけるアミノ酸５８７および５８８の間の位置におけるＬＧＥＴＴＲＰである、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記被験体が、ラニビズマブ、ベバシズマブおよびｓＶＥＧＦＲ－１のうち少なくとも１種に対して応答性である、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記被験体が、ラニビズマブまたはベバシズマブで前処置されている、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記注射が、硝子体内である、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記注射が、網膜下である、項目１に記載の方法。
（項目１６）
注射による前記投与が、少なくとも２年間で１回以下行われる、項目１に記載の方法。（項目１７）
注射による前記投与が、少なくとも５年間で１回以下行われる、項目１に記載の方法。（項目１８）
前記投与が、一度限りの投与である、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記投与ステップに先立ち、前記懸濁物を撹拌して均一な分布を確実にするステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記投与ステップに先立ち、前記懸濁物を室温に温めるステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記懸濁物が、界面活性物質をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記界面活性物質が、ポリソルベート、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルジメチルアミンオキシド、ポリエトキシ化アルコール、ポリオキシエチレンソルビタン、オクトキシノール、Ｂｒｉｊ、プルロニックおよびポリオキシルヒマシ油から選択される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記懸濁物が、フェノール、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記注射後に抗生物質溶液または硫酸アトロピン軟膏を投与するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記抗生物質溶液が、シプロフロキサシンを含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記抗ＶＥＧＦポリペプチドが、ヒト化モノクローナル抗体である、項目１に記載の方法。
（項目２７）
前記抗ＶＥＧＦポリペプチドが、抗体断片またはＦａｂである、項目１に記載の方法。（項目２８）
前記ヒト化モノクローナル抗体が、ラニビズマブまたはベバシズマブである、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記抗ＶＥＧＦポリペプチドが、可溶性トランケート型のＶＥＧＦ受容体１（ｓＶＥＧＦＲ－１）である、項目１に記載の方法。
（項目３０）
眼状態または疾患を処置する方法であって、
（ａ）ＡＡＶ２におけるカプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸５７０～６１１に対応する位置に、ＬＧＥＴＴＲＰ、ＮＥＴＩＴＲＰ、ＫＡＧＱＡＮＮ、ＫＤＰＫＴＴＮ、ＫＤＴＤＴＴＲ、ＲＡＧＧＳＶＧ、ＡＶＤＴＴＫＦおよびＳＴＧＫＶＰＮから選択されるアミノ酸配列の挿入を含むバリアントカプシドタンパク質；ならびに抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）ポリペプチドをコードする異種配列を有するｒＡＡＶを含む懸濁組成物を撹拌するステップと、
（ｂ）注射によりヒト被験体の眼に前記懸濁組成物を投与するステップと
を含む、方法。
（項目３１）
前記挿入が、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７および５８８の間のＬＧＥＴＴＲＰである、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記被験体が、ラニビズマブまたはベバシズマブで前処置されていることによって特徴付けられる、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記被験体が、ラニビズマブおよびベバシズマブのうち少なくとも１種に対して応答性である、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
前記抗ＶＥＧＦポリペプチドが、ヒト化モノクローナル抗体である、項目３０に記載の方法。
（項目３５）
前記抗ＶＥＧＦポリペプチドが、抗体断片またはＦａｂである、項目３０に記載の方法。
（項目３６）
前記ヒト化モノクローナル抗体が、ラニビズマブまたはベバシズマブである、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
前記抗ＶＥＧＦポリペプチドが、可溶性トランケート型のＶＥＧＦ受容体１（ｓＶＥＧＦＲ－１）である、項目３０に記載の方法。
（項目３８）
前記被験体に投与される容量が、５０μＬ以下である、項目３０に記載の方法。
（項目３９）
前記被験体に投与される容量が、１００μＬ以下である、項目３０に記載の方法。
（項目４０）
容量が、１Ｅ１２～１Ｅ１３の間のベクターゲノムの単位用量を含む、項目３０に記載の方法。
（項目４１）
容量が、２Ｅ１２～６Ｅ１２の間のベクターゲノムの単位用量を含む、項目３０に記載の方法。
（項目４２）
前記投与ステップが、少なくとも２年間で１回以下行われる、項目３０に記載の方法。（項目４３）
前記投与ステップが、一度限りの注射である、項目３０に記載の方法。
（項目４４）
前記組成物を投与する前に、少なくとも１種の承認された治療法に対する応答性に関して前記被験体をアッセイするステップをさらに含む、項目３０に記載の方法。
（項目４５）
前記承認された治療法が、ラニビズマブおよびベバシズマブを含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記懸濁物が、薬学的に許容される賦形剤を含む、項目３０に記載の方法。
（項目４７）
前記賦形剤が、界面活性物質または安定剤を含む、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記界面活性物質が、ポリソルベート、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルジメチルアミンオキシド、ポリエトキシ化アルコール、ポリオキシエチレンソルビタン、オクトキシノール、Ｂｒｉｊ、プルロニックおよびポリオキシルヒマシ油から選択される、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記薬学的に許容される賦形剤が、フェノール、マンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを含む、項目４６に記載の方法。
（項目５０）
前記眼状態または疾患が、新生血管（滲出型）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞またはＤＭＥに伴う糖尿病性網膜症である、項目３０に記載の方法。
（項目５１）
前記眼状態または疾患が、脈絡膜新血管形成またはＡＭＤである、項目３０に記載の方法。
（項目５２）
前記注射が、硝子体内である、項目３０に記載の方法。
（項目５３）
前記注射が、網膜下である、項目３０に記載の方法。
（項目５４）
前記挿入が、ＡＡＶ２におけるアミノ酸５８７および５８８の間の位置におけるＬＧＥＴＴＲＰである、項目３０に記載の方法。
（項目５５）
投与前に前記懸濁物を室温に温めるステップをさらに含む、項目３０に記載の方法。
（項目５６）
ＡＡＶ２におけるカプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸５７０～６１１に対応する位置に、ＬＧＥＴＴＲＰ、ＮＥＴＩＴＲＰ、ＫＡＧＱＡＮＮ、ＫＤＰＫＴＴＮ、ＫＤＴＤＴＴＲ、ＲＡＧＧＳＶＧ、ＡＶＤＴＴＫＦおよびＳＴＧＫＶＰＮから選択されるアミノ酸配列の挿入を含むバリアントカプシドタンパク質；ならびに抗血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ）ポリペプチドをコードする異種配列を有するｒＡＡＶを含む、単位用量の懸濁物を含む薬学的組成物。
（項目５７）
前記単位用量が、１Ｅ１２～１Ｅ１３の間のベクターゲノムである、項目５６に記載の薬学的組成物。
（項目５８）
前記単位用量が、２Ｅ１２～６Ｅ１２の間のベクターゲノムである、項目５６に記載の薬学的組成物。
（項目５９）
前記懸濁物が、冷蔵されている、項目５６に記載の薬学的組成物。
（項目６０）
項目５６に記載の薬学的組成物および前記薬学的組成物を希釈するための溶液を含むキット。
（項目６１）
前記溶液が、緩衝液、塩、アルコール、界面活性物質またはこれらのいずれかの組み合わせを含む、項目６０に記載のキット。
（項目６２）
シリンジをさらに含む、項目６０に記載のキット。
（項目６３）
前記抗ＶＥＧＦポリペプチドが、ヒト化モノクローナル抗体である、項目５６に記載の薬学的組成物。
（項目６４）
前記抗ＶＥＧＦポリペプチドが、抗体断片またはＦａｂである、項目５６に記載の薬学的組成物。
（項目６５）
前記ヒト化モノクローナル抗体が、ラニビズマブまたはベバシズマブである、項目５６に記載の薬学的組成物。
（項目６６）
前記抗ＶＥＧＦポリペプチドが、可溶性トランケート型のＶＥＧＦ受容体１（ｓＶＥＧＦＲ－１）である、項目５６に記載の薬学的組成物。
（項目６７）
前記挿入が、ＡＡＶ２におけるアミノ酸５８７および５８８の間の位置におけるＬＧＥＴＴＲＰである、項目５６に記載の薬学的組成物。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【0013】
【0014】
【0015】
【発明を実施するための形態】
【0016】
いくつかの態様について、例証のために実例適用を参照しつつ後述する。本明細書に記載されている特色の十分な理解が得られるように、多数の具体的詳細、関係性および方法を示していることを理解されたい。しかし、関連技術分野における当業者であれば、このような具体的詳細のうち１種もしくは複数を用いずに、または他の方法を用いて、本明細書に記載されている特色を実施することができることを直ちに認識するであろう。一部の行為は、異なる順序でおよび／または他の行為もしくは事象と同時発生的に行われ得るため、本明細書に記載されている特色は、行為または事象の例証されている順序付けによって限定されない。さらに、例証されている行為または事象の全てが、本明細書に記載されている特色に従って方法論を実行することを要求されているとは限らない。
【0017】
本開示は、抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸配列（例えば、ｃＤＮＡ）を含む、霊長類（例えば、サルまたはヒト）の眼への硝子体内または網膜下注射によって遺伝子療法、ベクターまたは構築物を投与するステップを含む、眼疾患または状態の処置または予防の薬学的組成物および方法に関する。抗ＶＥＧＦ剤または導入遺伝子をコードする核酸配列を含む遺伝子療法、ベクターまたは構築物の硝子体内または網膜下注射の際に、抗ＶＥＧＦ遺伝子が、標的細胞または組織、例えば、網膜細胞においてｉｎ ｖｉｖｏで発現されて、抗ＶＥＧＦタンパク質または遺伝子産物を生成して、治療効果を生じる。
【0018】
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤を含む遺伝子療法、ベクターまたは構築物を使用して、霊長類またはヒト被験体における、新生血管（滲出型）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）、ＲＶＯ後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）および／またはＤＭＥ患者における糖尿病性網膜症（ＤＲ）、または新血管形成に関与する他のいずれかの関連する眼疾患もしくは状態（例えば、脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ））が挙げられるがこれらに限定されない、１種または複数の眼疾患または状態を処置または予防する。一部の実施形態では、本明細書に記載されている方法を使用して、標準治療の治療法または現存する処置、例えば、ラニビズマブまたはベバシズマブ注射に対して応答性である眼疾患または状態を処置する。一部の実施形態では、本明細書に記載されている方法を使用して、ＡＭＤ、ＲＶＯ、ＤＭＥ、ＤＲまたはＤＭＥ患者におけるＤＲのための少なくとも１種の現在の標準治療、例えば、ラニビズマブまたはベバシズマブ注射に対して応答性である眼疾患または状態を処置する。
【0019】
本開示は、抗ＶＥＧＦ剤、治療用導入遺伝子をコードする核酸、またはｓＶＥＧＦＲ－１、ラニビズマブ、ベバシズマブもしくは他のいずれか公知の抗（ant-）ＶＥＧＦ剤またはそれらのいずれかの機能的断片、変異体またはバリアントに対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）等の薬学的に有効量のベクター、例えば、ウイルスベクターを含む、遺伝子療法に適応された薬学的組成物を網膜下または硝子体内のいずれかで投与することによる、被験体（例えば、非ヒト霊長類またはヒト）における眼性新血管形成の予防または処置のための組成物および方法に関する。斯かる相同性は、核酸配列（例えば、ｃＤＮＡ）、アミノ酸配列、空間的コンフォメーションまたはタンパク質構造（例えば、二次、三次または四次構造）に基づくことができる。
【0020】
一部の態様では、本明細書に開示されているベクターは、カプシドタンパク質の溶媒曝露ＧＨループまたはループＩＶにおける部位に５～１１アミノ酸の挿入等の変異を含む、いずれかの血清型のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。一部の実施形態では、７－ｍｅｒアミノ酸配列が、ＡＡＶカプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶに挿入される。ＡＡＶカプシドのＧＨループ／ループＩＶについては、例えば、van Vlietら（２００６年）Mol. Ther.１４巻：８０９頁；Padronら（２００５年）J. Virol.７９巻：
５０４７頁；およびShenら（２００７年）Mol. Ther.１５巻：１９５５頁を参照された
い。一部の実施形態では、次の：ＬＧＥＴＴＲＰ、ＮＥＴＩＴＲＰ、ＫＡＧＱＡＮＮ、ＫＤＰＫＴＴＮ、ＫＤＴＤＴＲ、ＲＡＧＧＳＶＧ、ＡＶＤＴＴＫＦおよびＳＴＧＫＶＰＮのうちいずれか１種を含むアミノ酸配列を、ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１カプシドタンパク質）のＧＨループ／ループＩＶに挿入し、これにより、バリアントカプシドタンパク質をそれぞれ有するＡＡＶバリアントを作製する。一部の実施形態では、アミノ酸挿入は、各ＡＡＶ血清型において次の位置で行われる：ＡＡＶ２の５８７および５８８の間、ＡＡＶ１のアミノ酸５９０および５９１の間、ＡＡＶ５のアミノ酸５７５および５７６の間、ＡＡＶ６のアミノ酸５９０および５９１の間、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９および５９０の間、ＡＡＶ８のアミノ酸５９０および５９１の間、ＡＡＶ９のアミノ酸５８８および５８９の間またはＡＡＶ１０のアミノ酸５８９および５９０の間。
５０４７頁；およびShenら（２００７年）Mol. Ther.１５巻：１９５５頁を参照された
い。一部の実施形態では、次の：ＬＧＥＴＴＲＰ、ＮＥＴＩＴＲＰ、ＫＡＧＱＡＮＮ、ＫＤＰＫＴＴＮ、ＫＤＴＤＴＲ、ＲＡＧＧＳＶＧ、ＡＶＤＴＴＫＦおよびＳＴＧＫＶＰＮのうちいずれか１種を含むアミノ酸配列を、ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１カプシドタンパク質）のＧＨループ／ループＩＶに挿入し、これにより、バリアントカプシドタンパク質をそれぞれ有するＡＡＶバリアントを作製する。一部の実施形態では、アミノ酸挿入は、各ＡＡＶ血清型において次の位置で行われる：ＡＡＶ２の５８７および５８８の間、ＡＡＶ１のアミノ酸５９０および５９１の間、ＡＡＶ５のアミノ酸５７５および５７６の間、ＡＡＶ６のアミノ酸５９０および５９１の間、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９および５９０の間、ＡＡＶ８のアミノ酸５９０および５９１の間、ＡＡＶ９のアミノ酸５８８および５８９の間またはＡＡＶ１０のアミノ酸５８９および５９０の間。
【0021】
一部の実施形態では、アミノ酸は、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５７０および６１１の間の位置または別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質における対応する位置における２個の隣接するアミノ酸の間に挿入することができる。一部の実施形態では、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８７および５８８の間にＬＧＥＴＴＲＰアミノ酸挿入を含むＡＡＶ２ベクターが、本明細書に開示されている遺伝子療法に使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載されている処置方法は、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、ｓＶＥＧＦＲ－１、ラニビズマブまたはベバシズマブ）をコードする核酸配列を含む、いずれかの血清型のＡＡＶを含む薬学的組成物または製剤を網膜下または硝子体内投与するステップを含む。一部の態様では、本明細書に開示されている薬学的組成物の網膜下または硝子体内注射は、被験体の眼における標的細胞、例えば、網膜細胞における抗ＶＥＧＦ剤の発現をもたらし、これは、ｉｎ ｖｉｖｏでの新血管形成もしくはＶＥＧＦ発現の低下および／またはＶＥＧＦ発現もしくは活性の阻害、またはｉｎ ｖｉｖｏでのＶＥＧＦ－ＶＥＧＦＲ相互作用の破壊をもたらす。一部の実例では、抗ＶＥＧＦ剤の発現は、ｉｎ ｖｉｖｏで内在性ＶＥＧＦを隔離して、ｉｎ ｖｉｖｏで内在性ＶＥＧＦ受容体とのＶＥＧＦ結合または相互作用を防止する。
【0022】
タンパク質注射を上回る遺伝子療法の利点の１つは、遺伝子療法が、治療剤（例えば、抗ＶＥＧＦ剤）の延長したまたは継続した放出をもたらし、反復した注射を要求しないことである。治療剤のこのような延長したまたは持続した放出は、ｉｎ ｖｉｖｏで発現されて治療効果をもたらす、導入遺伝子をコードする核酸配列の送達に起因する。
【0023】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、眼における標的細胞または組織（例えば、網膜細胞）へのその感染力を増加させるカプシドバリアントタンパク質を含むことができ、標的細胞または組織への治療用導入遺伝子をコードする核酸配列のより効率的な送達を可能にし、該標的細胞または組織において、治療用導入遺伝子は、ある期間、例えば、少なくとも１、１．５、２、３、４、５、１０年間またはそれよりも長い期間にわたって発現され得る。本明細書に開示されている遺伝子療法は、目的の特異的組織または細胞型、例えば、光受容体細胞を標的とすることができ、これは、オフターゲット効果の最小化に役立つ、またはｉｎ ｖｉｖｏで治療用導入遺伝子のより標的化された送達をもたらすことができる。
【0024】
遺伝子療法によるｉｎ ｖｉｖｏにおける抗ＶＥＧＦ剤の延長したまたは持続した送達により、単一用量または一度限りの用量で、抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸配列を含む薬学的組成物を投与することができるであろう。一部の実施形態では、被験体に投与される遺伝子療法の用量の総数は、少なくとも１．５年間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、少なくとも５年間、少なくとも６年間、少なくとも７年間、少なくとも８年間、少なくとも９年間または少なくとも１０年間に１回以下である。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸配列を含む遺伝子療法の投与は、患者の生涯でただ一度限りまたは１回である。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸配列を含む遺伝子療法の一度限りの投与は、１年間を超えるまたは２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間を超えるまたはそれよりも長い期間持続する、患者における治療効果を生じることができる。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸配列を含む遺伝子療法は、少なくとも２年間もしくはそれよりも長い、少なくとも３年間もしくはそれよりも長い、少なくとも４年間もしくはそれよりも長い、少なくとも５年間もしくはそれよりも長い、少なくとも６年間もしくはそれよりも長い、少なくとも７年間もしくはそれよりも長い、少なくとも８年間もしくはそれよりも長い、少なくとも９年間もしくはそれよりも長いまたは少なくとも１０年間もしくはそれよりも長い期間で１回以下患者に投与される。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸配列を含む遺伝子療法は、少なくとも１種の現在の標準治療または少なくとも１種の現存する治療法、例えば、ラニビズマブまたはベバシズマブに対して応答性である患者に投与される。一部の実施形態では、遺伝子療法は、遺伝子療法を受ける前にラニビズマブまたはベバシズマブによる前処置を受けた患者に投与される。
【0025】
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸配列を含む遺伝子療法の一度限りの投与は、１年間を超えて、１．５年間を超えてまたは２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間を超えて、患者が、ラニビズマブ、ベバシズマブ、または眼における新血管形成のための他のいずれかのタンパク質に基づく治療薬もしくは標準治療処置を受ける必要をなくす。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸配列を含む遺伝子療法の注射を受ける患者は、患者の余生において、ラニビズマブ、ベバシズマブ、または眼における新血管形成のための他のいずれかのタンパク質に基づく治療薬もしくは標準治療処置のいかなる追加的な注射も必要としない。他の実施形態では、抗ＶＥＧＦ遺伝子療法の一度限りの注射を受ける患者は、遺伝子療法を受けてから少なくとも１．５、２、５、１０年間またはそれよりも長い期間が経過した後に、必要に応じてラニビズマブ、ベバシズマブおよび／または他のいずれかの承認された治療薬による治療法を開始することができる。
【0026】
本開示の用語法は、単に特定の事例の記載を目的としており、本開示の組成物、方法および組成物の限定を意図するものではない。
【0027】
本明細書に記載されている本開示の組成物および方法は、他に断りがなければ、当業者の技能範囲内で分子生物学（組換え技法を含む）、細胞生物学、生化学、免疫化学および眼科技法の従来技法および記載を用いることができる。斯かる従来技法は、被験体における網膜または視覚の観察および解析、組換えウイルスのクローニングおよび繁殖、薬学的組成物の製剤化、ならびに生化学的精製および免疫化学のための方法を含む。適した技法の具体的例証は、本明細書における実施例の参照により得ることができる。しかし、当然ながら等価な従来手順を使用することもできる。斯かる従来技法および記載は、Greenら
編、Genome Analysis: A Laboratory Manual Series（Ｉ～ＩＶ巻）（１９９９年）；Weinerら編、Genetic Variation: A Laboratory Manual（２００７年）；Dieffenbach, Dveksler編、PCR Primer: A Laboratory Manual（２００３年）；BowtellおよびSambrook、DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual（２００３年）；Mount、Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis（２００４年）；SambrookおよびRussell、Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual（２００６年）；ならびにSambrookおよびRussell、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（２００２年）（全てCold Spring Harbor Laboratory Pressより）；Stryer, L.、Biochemistry（第４版）W.H. Freeman, N.Y.（１９９５年）；Gait「Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach」IRL Press, London（１９８４年）；NelsonおよびCox、Lehninger, Principles of Biochemistry、第３版、W.H. Freeman Pub., New York（２０００年）；ならびにBergら、Biochemistry、第５版、W.H. Freeman Pub., New York（２００２年）等の標準研究室マニュアルに見出すことができ、これらの全ては、あらゆる目的のためにこれらの全体を参照により本明細書に組み込む。
編、Genome Analysis: A Laboratory Manual Series（Ｉ～ＩＶ巻）（１９９９年）；Weinerら編、Genetic Variation: A Laboratory Manual（２００７年）；Dieffenbach, Dveksler編、PCR Primer: A Laboratory Manual（２００３年）；BowtellおよびSambrook、DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual（２００３年）；Mount、Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis（２００４年）；SambrookおよびRussell、Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual（２００６年）；ならびにSambrookおよびRussell、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（２００２年）（全てCold Spring Harbor Laboratory Pressより）；Stryer, L.、Biochemistry（第４版）W.H. Freeman, N.Y.（１９９５年）；Gait「Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach」IRL Press, London（１９８４年）；NelsonおよびCox、Lehninger, Principles of Biochemistry、第３版、W.H. Freeman Pub., New York（２０００年）；ならびにBergら、Biochemistry、第５版、W.H. Freeman Pub., New York（２００２年）等の標準研究室マニュアルに見出すことができ、これらの全ては、あらゆる目的のためにこれらの全体を参照により本明細書に組み込む。
【0028】
一部の実施形態では、（ａ）（ｉ）バリアントＡＡＶ２カプシドタンパク質が、位置５８７および５８８の間にＬＧＥＴＴＲＰ挿入を含み、バリアントカプシドタンパク質が、対応する非バリアントＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比べて網膜細胞への感染力の増加を付与する、バリアントＡＡＶ２カプシドタンパク質；ならびに（ｉｉ）抗ＶＥＧＦ剤をコードする異種核酸配列を含む、遺伝子療法に適応された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ２）ビリオン；ならびに（ｂ）薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的製剤が、本明細書に開示されている。一部の実施形態では、コードされる遺伝子産物は、ラニビズマブ、ベバシズマブまたは他のいずれか公知の抗ＶＥＧＦ剤に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同性を有するポリペプチドである。
【0029】
抗ＶＥＧＦ遺伝子産物（例えば、ラニビズマブまたはベバシズマブ）が処置に対し必要が示されるまたは処置に承認される眼状態または疾患を処置する方法であって、網膜下または硝子体内注射によって被験体の眼に、遺伝子療法に適応された薬学的組成物を投与するステップ、すなわち、本明細書に記載されている通りに、ｉｎ ｖｉｖｏで抗ＶＥＧＦ遺伝子産物をコードする核酸配列を送達するステップを含む方法も、本明細書に開示されている。一部の実施形態では、遺伝子療法は、硝子体内注射によって投与される。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、ラニビズマブ、ベバシズマブ、ｓＶＥＧＦＲ－１またはこれらのいずれかのバリアントもしくは機能的断片である。
【0030】
公知の抗ＶＥＧＦタンパク質または融合タンパク質（例えば、ラニビズマブまたはベバシズマブ）に対して少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同性を有する融合タンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子療法またはベクターを含む薬学的組成物であって、凍結乾燥され得るまたは凍結乾燥形態で供給され得る薬学的組成物も、本明細書に開示されている。一部の実施形態では、凍結乾燥形態の薬学的組成物が、投与前に薬学的組成物を再構成するための溶液または緩衝液と共に、キットに提供される。一部の実施形態では、本明細書に開示されている薬学的組成物は、溶液、均質な溶液、懸濁物または冷蔵された懸濁物として供給される。
【0031】
（ａ）対応する非バリアントまたは無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比べて網膜細胞への感染力の増加を付与するバリアントＡＡＶカプシドタンパク質；（ｂ）抗ＶＥＧＦ活性を有するポリペプチドまたは治療用導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含む、脈絡膜新血管形成を低下させるための遺伝子療法に適応された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンも、本明細書に開示されている。一部の実施形態では、遺伝子療法に使用されるｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ２である。
【0032】
眼状態または疾患を処置する方法であって、ヒト被験体の眼に、本明細書に記載されている抗ＶＥＧＦ剤または抗ＶＥＧＦ活性を有するタンパク質を発現するための核酸配列の遺伝子療法およびｉｎ ｖｉｖｏ送達に適応されたｒＡＡＶビリオンを投与するステップを含み、ヒト被験体が、新血管形成に関連する眼状態と以前に診断された、方法も、本明細書に開示されている。一部の実施形態では、遺伝子療法は、承認された抗ＶＥＧＦ治療法、例えば、ラニビズマブまたはベバシズマブのうち少なくとも１種に対して応答性である患者に投与される。一部の実施形態では、遺伝子療法は、承認された治療法、例えば、ラニビズマブまたはベバシズマブのうち少なくとも１種で前処置された患者に投与される。一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子療法は、承認された治療法、例えば、ラニビズマブまたはベバシズマブ注射のうち少なくとも１種で前処置され、改善を示すことができなかった患者に投与される。一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子療法を受ける患者は、眼への複数の反復した注射を要求する治療法による患者の処置に不利となる１種または複数のリスク因子、例えば、炎症、感染、眼内圧上昇および／または他の有害作用の増加したリスクを有する。
【0033】
一部の実施形態では、（ａ）（ｉ）ＡＡＶ２におけるカプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸５７０～６１１に対応する位置にＬＧＥＴＴＲＰ、ＮＥＴＩＴＲＰ、ＫＡＧＱＡＮＮ、ＫＤＰＫＴＴＮ、ＫＤＴＤＴＴＲ、ＲＡＧＧＳＶＧ、ＡＶＤＴＴＫＦおよびＳＴＧＫＶＰＮから選択されたアミノ酸挿入を含むバリアントＡＡＶカプシドタンパク質であって、対応する非バリアントＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比べて網膜細胞への感染力の増加を付与するバリアントＡＡＶカプシドタンパク質；ならびに（ｉｉ）抗ＶＥＧＦ剤をコードする異種核酸配列を含む、遺伝子療法に適応された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン；ならびに（ｂ）薬学的に許容される賦形剤を含む方法および薬学的製剤が、本明細書に開示されている。一部の実施形態では、コードされる遺伝子産物は、融合タンパク質、抗体または抗体断片である。一部の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、本明細書に開示されている薬学的組成物における凝集を防止する界面活性物質を含む。
【0034】
他に定められていなければ、本明細書で使用されているあらゆる技術用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意義を有する。
【0035】
本明細書で使用されている用語法は、単に特定の事例の記載を目的としており、限定を意図するものではない。本明細書において、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」
および「その（the）」は、文脈がそれ以外を明らかに示さない限り、複数形も同様に含
むことが意図される。さらに、用語「含むこと（including）」、「含む（includes）」
、「有していること（having）」、「有する（has）」、「備える（with）」またはこれ
らの異形が、詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかで使用される程度まで、斯かる用語は、用語「含むこと（comprising）」と同様の様式で包括的であることが意図される。用語「含むこと（comprising）」は、本明細書において、「含むこと（including）」または「含有すること（containing）」と同義であり、包括的またはオープンエ
ンドである。
および「その（the）」は、文脈がそれ以外を明らかに示さない限り、複数形も同様に含
むことが意図される。さらに、用語「含むこと（including）」、「含む（includes）」
、「有していること（having）」、「有する（has）」、「備える（with）」またはこれ
らの異形が、詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかで使用される程度まで、斯かる用語は、用語「含むこと（comprising）」と同様の様式で包括的であることが意図される。用語「含むこと（comprising）」は、本明細書において、「含むこと（including）」または「含有すること（containing）」と同義であり、包括的またはオープンエ
ンドである。
【0036】
本明細書における「または」のいずれかの参照は、特に明記しない限り「および／または」を包含することが意図される。本明細書において、用語「約」がつく数は、この数プラス・マイナス１０％の数を指す。用語「約」がつく範囲は、その最小値のマイナス１０％およびその最大値のプラス１０％の範囲を指す。
【0037】
用語「被験体」、「患者」または「個体」は、非ヒト霊長類、例えば、アフリカミドリザルおよびアカゲザルならびにヒトを含む霊長類を指す。好まれる実施形態では、被験体は、ヒトまたはヒト患者である。
【0038】
用語「処置する」、「処置すること」、「処置」、「好転させる（ameliorate）」または「好転させること」および他の文法的等価物は、本明細書において、疾患もしくは状態症状を軽減すること、緩解することもしくは好転させること、追加的な症状を予防すること、症状の根底にある代謝的原因を好転させるもしくは予防すること、疾患もしくは状態を阻害すること、例えば、疾患もしくは状態の発症を止めること、疾患もしくは状態を緩和すること、疾患もしくは状態の退縮を引き起こすこと、疾患もしくは状態に起因する状態を緩和すること、または疾患もしくは状態の症状を停止することを含み、予防法を含むことが意図される。この用語は、治療利益および／または予防利益を達成することをさらに含む。治療利益とは、処置されている根底にある疾患の根絶または好転を意味する。また、治療利益は、一部の実施形態では、患者が依然として根底にある疾患を患っているにもかかわらず、患者に改善が観察されるように、根底にある疾患に関連する生理的症状のうち１種または複数の根絶または好転により達成される。予防利益のため、疾患の診断が為されていなかったとしても、薬学的組成物が、特定の疾患の発症リスクがある患者または疾患の生理的症状のうち１種もしくは複数を報告する患者に投与される。
【0039】
用語「投与する」、「投与すること」、「投与」その他は、本明細書において、生物学的作用の所望の部位への治療薬または薬学的組成物の送達を可能にするために使用される方法を指すことができる。このような方法は、眼への硝子体内または網膜下注射を含む。
【0040】
用語「有効量」、「治療有効量」または「薬学的に有効な量」は、本明細書において、処置されている疾患または状態の症状のうち１種または複数をある程度まで緩和するであろう、投与されている少なくとも１種の薬学的組成物または化合物の十分な量を指すことができる。
【0041】
用語「薬学的に許容される」は、本明細書において、本明細書に開示されている化合物の生物学的活性または特性を抑止しない、比較的無毒性の担体または希釈剤等の材料を指すことができる（すなわち、材料が個体に投与されたときに、望ましくない生物学的効果も引き起こさず、これが含有されている組成物の構成成分のいずれとも有害な様式で相互作用しない）。
【0042】
用語「薬学的組成物」または単純に「組成物」は、本明細書において、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、賦形剤その他等が挙げられるがこれらに限定されない、少なくとも１種の薬学的に許容される化学的構成成分と任意選択で混合された、生物学的に活性な化合物を指すことができる。
【0043】
「ＡＡＶベクター」または「ｒＡＡＶベクター」は、本明細書において、典型的には、細胞の遺伝的形質転換の目的の配列である、ＡＡＶ起源のものではないポリヌクレオチド配列（すなわち、治療用導入遺伝子、例えば、ラニビズマブをコードする核酸配列等、ＡＡＶにとって異種のポリヌクレオチド）を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを指す。一般に、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１個、一般に、２個のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する。ｒＡＡＶベクターという用語は、ｒＡＡＶベクター粒子およびｒＡＡＶベクタープラスミドの両方を包含する。ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）または自己相補的（ｓｃＡＡＶ）のいずれかであり得る。
【0044】
「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ｒＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１種のＡＡＶカプシドタンパク質（典型的には、野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質の全てによる）およびポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターで構成されたウイルス粒子を指す。粒子は、異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子等の野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、典型的に、「ｒＡＡＶベクター粒子」または単純に「ｒＡＡＶベクター」と称される。よって、ｒＡＡＶ粒子の産生は、ｒＡＡＶベクターの産生を必然的に含むが、これは、斯かるベクターが、ｒＡＡＶ粒子内に含有されるからである。
【0045】
用語「パッケージング」は、本明細書において、ｒＡＡＶ粒子のアセンブリおよびカプシド形成をもたらし得る一連の細胞内事象を指すことができる。
【0046】
ＡＡＶ「ｒｅｐ」および「ｃａｐ」遺伝子は、アデノ随伴ウイルスの複製およびカプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐは、本明細書において、ＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と称される。
【0047】
用語「ポリペプチド」は、天然に存在するタンパク質および天然に存在しないタンパク質（例えば、融合タンパク質）の両方、これらのペプチド、断片、変異体、誘導体およびアナログを包含することができる。ポリペプチドは、単量体、二量体、三量体またはポリマーであり得る。さらに、ポリペプチドは、それぞれ１種または複数の別個の活性を有する、多数の異なるドメインを含むことができる。疑わしさをなくすため、「ポリペプチド」は、２アミノ酸を超えるいずれかの長さであり得る。
【0048】
本明細書において、「ポリペプチドバリアント」または単純に「バリアント」は、その配列がアミノ酸修飾を含有するポリペプチドを指す。一部の実例では、修飾は、ネイティブまたは野生型タンパク質等、参照タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列と比較した、１個または複数のアミノ酸の挿入、重複、欠失、再配列または置換であり得る。バリアントは、参照タンパク質の配列における、ある位置における単一のアミノ酸が別のアミノ酸に変化された、１個または複数のアミノ酸点置換、１個または複数のアミノ酸がそれぞれ挿入または欠失された、１個または複数の挿入および／または欠失、および／またはアミノまたはカルボキシ末端のいずれか一方または両方におけるアミノ酸配列のトランケーションを有することができる。バリアントは、参照タンパク質または無修飾タンパク質と比較して、同じまたは異なる生物学的活性を有することができる。
【0049】
一部の実施形態では、バリアントは、例えば、その対応物参照タンパク質に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の全体的配列相同性を有することができ、参照タンパク質は、天然に存在するもしくは天然に存在しない、または天然に存在するタンパク質の誘導体もしくはバリアントであり得る。一部の実施形態では、バリアントは、野生型タンパク質に対して少なくとも約９０％の全体的配列相同性を有することができる。一部の実施形態では、バリアントは、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％または少なくとも約９９．９％の全体的配列同一性を示す。
【0050】
本明細書において、「組換え」は、（１）その天然に存在する環境から除去された、（２）天然では当該遺伝子が見出されるポリヌクレオチドの全体もしくは部分と会合していない、（３）天然ではそれが連結されていないポリヌクレオチドに操作可能に連結されている、または（４）天然では発生しない、生体分子、例えば、遺伝子またはタンパク質を指すことができる。用語「組換え」は、クローニングされたＤＮＡ単離物、化学合成されたポリヌクレオチドアナログ、または異種系によって生物学的に合成されたポリヌクレオチドアナログ、ならびに斯かる核酸によってコードされるタンパク質および／またはｍＲＮＡを参照して使用することができる。よって、例えば、微生物によって合成されるタンパク質は、例えば、細胞に存在する組換え遺伝子から合成されたｍＲＮＡから合成される場合、組換えである。
【0051】
「操作可能に連結された」または「作動可能に連結された」または「カップリングされた」は、遺伝的エレメントの近位を指すことができ、これらのエレメントは、予想される様式での操作を可能にする関係性にある。例えば、プロモーターが、コード配列の転写開始に役立つ場合、プロモーターは、コード領域に操作可能に連結され得る。この機能的関係性が維持される限りにおいて、プロモーターおよびコード領域の間に介在残基が存在していてもよい。
【0052】
用語「発現ベクター」または「発現構築物」または「カセット」または「プラスミド」または単純に「ベクター」は、配列をコードする核酸の一部または全体が転写され得、遺伝子療法に適応される、遺伝子産物をコードする核酸またはポリヌクレオチドを含有するＡＡＶまたはｒＡＡＶベクターを含む、いずれかの種類の遺伝的構築物を含むことができる。転写物は、タンパク質へと翻訳され得る。一部の事例では、転写物は、部分的に翻訳され得るまたは翻訳されない。ある特定の態様では、発現は、遺伝子の転写と、ｍＲＮＡから遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の態様では、発現は、目的の遺伝子をコードする核酸の転写のみを含む。発現ベクターは、標的細胞におけるタンパク質の発現を容易にするために、コード領域に操作可能に連結された制御エレメントを含むこともできる。制御エレメント、および発現のために制御エレメントが作動可能に連結される遺伝子（単数または複数）の組み合わせは、時に「発現カセット」と称されることがあり、発現カセットの多数が、本技術分野で公知であり利用できる、または本技術分野で利用できる構成成分から直ちに構築することができる。
【0053】
用語「異種」は、それが比較されている実体の残りとは遺伝子型として別個の実体を指すことができる。例えば、異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに遺伝子操作技法によって導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドであり得る。そのネイティブコード配列から除去され、それと連結した状態で天然に見出されないコード配列に操作可能に連結されたプロモーターは、異種プロモーターであり得る。
【0054】
本明細書において、「７ｍ８」は、７－ｍｅｒアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰを指す。
【0055】
「７ｍ８バリアント」は、カプシドタンパク質の溶媒曝露ＧＨループにアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰが挿入された、いずれかの血清型のものであり得るｒＡＡＶを指す。
【0056】
７ｍ８がｒＡＡＶ２に挿入される場合（ＡＡＶ２．７ｍ８とも称される）、７－ｍｅｒアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰは、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のＧＨループ、例えば、ＡＡＶ２カプシドタンパク質の位置５８７および５８８の間に挿入される。７ｍ８がｒＡＡＶ１に挿入される場合（ＡＡＶ１．７ｍ８とも称される）、７－ｍｅｒアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰは、ＡＡＶ１カプシドタンパク質のＧＨループ、例えば、ＡＡＶ１カプシドタンパク質のアミノ酸５９０および５９１の間に挿入される。７ｍ８がｒＡＡＶ５に挿入される場合（ＡＡＶ５．７ｍ８とも称される）、７－ｍｅｒアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰは、ＡＡＶ５カプシドタンパク質のＧＨループ、例えば、ＡＡＶ５カプシドタンパク質のアミノ酸５７５および５７６の間に挿入される。７ｍ８がｒＡＡＶ６に挿入される場合（ＡＡＶ６．７ｍ８とも称される）、７－ｍｅｒアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰは、ＡＡＶ６カプシドタンパク質のＧＨループ、例えば、ＡＡＶ６カプシドタンパク質のアミノ酸５９０および５９１の間に挿入される。７ｍ８がｒＡＡＶ７に挿入される場合（ＡＡＶ７．７ｍ８とも称される）、７－ｍｅｒアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰは、ＡＡＶ７カプシドタンパク質のＧＨループ、例えば、ＡＡＶ７カプシドタンパク質のアミノ酸５８９および５９０の間に挿入される。７ｍ８がｒＡＡＶ８に挿入される場合（ＡＡＶ８．７ｍ８とも称される）、７－ｍｅｒアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰは、ＡＡＶ８カプシドタンパク質のＧＨループ、例えば、ＡＡＶ８カプシドタンパク質のアミノ酸５９０および５９１の間に挿入される。７ｍ８がｒＡＡＶ９に挿入される場合（ＡＡＶ９．７ｍ８とも称される）、７－ｍｅｒアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰは、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のＧＨループ、例えば、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸５８８および５８９の間に挿入される。７ｍ８がｒＡＡＶ１０に挿入される場合（ＡＡＶ１０．７ｍ８とも称される）、７－ｍｅｒアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰは、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質のＧＨループ、例えば、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質のアミノ酸５８９および５９０の間に挿入される。
【0057】
一部の実施形態では、（ａ）カプシドタンパク質の溶媒曝露領域にアミノ酸修飾を含み、対応する非バリアントＡＡＶカプシドタンパク質と比べて網膜細胞への増加した感染力を示すバリアントＡＡＶカプシドタンパク質；および（ｂ）遺伝子産物または治療用導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、新血管形成を低下させるための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンが、本明細書に開示されており、霊長類またはヒト被験体の眼における硝子体内または網膜下注射による有効量のｒＡＡＶの投与は、眼における新血管形成の低下をもたらす。
【0058】
（ａ）バリアントＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶカプシドタンパク質の溶媒曝露領域にアミノ酸修飾を含み、バリアントカプシドタンパク質が、眼における内境界膜（ＩＬＭ）を横切る増加した能力を付与する、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質；および（ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、新血管形成を低下させるための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンも、本明細書に開示されており、霊長類またはヒト被験体の眼における硝子体内または網膜下注射による有効量のｒＡＡＶの投与は、眼における新血管形成の低下をもたらす。
【0059】
（ａ）バリアントＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ２における５８７に対応するアミノ酸位置の後にＬＧＥＴＴＲＰのペプチド挿入を含み、バリアントカプシドタンパク質が、霊長類における眼の内境界膜（ＩＬＭ）を越えて遺伝子産物を送達する増加した能力を付与する、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質；および（ｂ）遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンも、本明細書に開示されている。
【0060】
（ａ）（ｉ）カプシドタンパク質の溶媒曝露領域にアミノ酸修飾を含み、対応する非バリアントＡＡＶカプシドタンパク質と比べて網膜細胞への増加した感染力を示すバリアントＡＡＶカプシドタンパク質；および（ｉｉ）形質導入されると霊長類またはヒト被験体の眼における新血管形成を低下させる遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオン；ならびに（ｂ）薬学的に許容される賦形剤を含む、眼性状態または疾患を処置するための単位用量形態における遺伝子療法組成物も、本明細書に開示されており、ｒＡＡＶビリオンは、単位用量として霊長類の眼における硝子体内または網膜下注射によって投与されると、新血管形成を少なくとも部分的に低下させるのに十分な量にある。
【0061】
本明細書に記載されている単位用量のｒＡＡＶ遺伝子療法を被験体、例えば、ヒト被験体に投与するステップを含む、眼性状態または疾患を処置する方法も、本明細書に開示されている。
【0062】
用語「抗ＶＥＧＦ剤」は、内在性ＶＥＧＦおよび／または内在性ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）の活性もしくは機能、またはｉｎ ｖｉｖｏでのＶＥＧＦ－ＶＥＧＦＲ相互作用もしくは経路を低下、妨害、破壊、遮断および／または阻害することができる、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、多量体タンパク質、遺伝子産物、抗体、ヒトモノクローナル抗体、抗体断片、アプタマー、小分子、キナーゼ阻害剤、受容体もしくは受容体断片または核酸分子を含むいずれかの治療剤を含む。抗ＶＥＧＦ剤は、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞、組織または被験体に送達されると、新たな血管成長もしくは形成および／または浮腫または腫脹を低下させることができる、公知の治療剤のうちいずれか１種、例えば、ラニビズマブまたはベバシズマブであり得る。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、天然に存在する、天然に存在しないまたは合成であり得る。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、天然に存在する分子に由来し得、これはその後に、抗ＶＥＧＦ活性を付与するように修飾または変異されている。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、融合またはキメラタンパク質である。斯かるタンパク質において、機能的ドメインまたはポリペプチドは、部分またはポリペプチドに人工的に融合されて、ｉｎ ｖｉｖｏでＶＥＧＦを隔離するまたはＶＥＧＦＲデコイとして機能することができる融合またはキメラタンパク質が生じる。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、そのリガンドとの相互作用から内在性ＶＥＧＦＲを遮断する融合またはキメラタンパク質である。
【0063】
本明細書において、「ＶＥＧＦ」は、他のことが要求されない限り、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＶＥＧＦ－Ｆ、またはこれらのいずれかの組み合わせまたはいずれかの機能的断片もしくはバリアントが挙げられるがこれらに限定されない、ＶＥＧＦのいずれかのアイソフォームを指すことができる。他のことが要求されない限り、「ＶＥＧＦ」は、メンバー：ＶＥＧＦ－Ａ、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－ＣおよびＶＥＧＦ－Ｄ、またはこれらのいずれかの組み合わせ、機能的断片もしくはバリアントを含む、ＶＥＧＦファミリーのいずれかのメンバーを指すことができる。
【0064】
本明細書において、「ＶＥＧＦ受容体」または「ＶＥＧＦＲ」または「ＶＥＧＦ－Ｒ」は、ＶＥＧＦＲ－１（またはＦｌｔ－１）、ＶＥＧＦＲ－２（またはＦｌｋ－１／ＫＤＲ）およびＶＥＧＦＲ－３（またはＦｌｔ－４）が挙げられるがこれらに限定されない、ＶＥＧＦの受容体のうちいずれか１種を指すように使用することができる。ＶＥＧＦＲは、膜結合型もしくは可溶型の受容体または受容体の機能的断片もしくはトランケーションであり得る。
【0065】
抗ＶＥＧＦ剤の例として、ラニビズマブ、ベバシズマブまたはこれらのいずれかの組み合わせ、バリアントもしくは機能的断片が挙げられるがこれらに限定されない。
【0066】
本明細書で使用されているセクション見出しは、単に秩序立てることを目的としており、記載されている主題の限定として解釈するべきではない。
【0067】
ベクター
アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスおよびレンチウイルスを含む、様々なウイルスベクターを遺伝子療法において使用することができる。
アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスおよびレンチウイルスを含む、様々なウイルスベクターを遺伝子療法において使用することができる。
【0068】
一部の実施形態では、本開示の薬学的組成物および方法は、それを必要とするヒト被験体または患者（例えば、ＡＭＤ、ＲＶＯ、ＤＭＥと診断された患者）における網膜細胞への、抗ＶＥＧＦ剤、その機能的断片またはバリアントをコードする核酸配列（例えば、ｃＤＮＡ配列）の送達をもたらす。ｒＡＡＶまたはウイルスベクター等の送達系を使用した患者への治療用導入遺伝子の核酸の送達は、遺伝子療法とも称される。
【0069】
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤核酸配列の送達は、いずれか適した「ベクター」（「遺伝子送達」または「遺伝子移入ビヒクル」とも称される）を使用して行うことができる。ベクター（例えば、ｒＡＡＶ）、送達ビヒクル、遺伝子送達ビヒクルまたは遺伝子移入ビヒクルは、標的細胞、例えば、光受容体、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞または網膜色素上皮細胞を含む網膜細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む、いずれか適した高分子または分子の複合体を包含することができる。一部の事例では、標的細胞は、核酸分子または遺伝子が送達されるいずれかの細胞であり得る。送達されるポリヌクレオチドは、ラニビズマブをコードする配列等、治療用導入遺伝子のコード配列を含むことができる。
【0070】
本開示の組成物および方法は、非ヒト霊長類またはヒト被験体の眼または網膜細胞への抗ＶＥＧＦ（例えば、ラニビズマブ）核酸配列の送達のためのいずれか適した方法を提供する。一部の事例では、核酸分子、ポリヌクレオチドまたは遺伝子療法の送達は、非ヒト霊長類またはヒト被験体の眼への硝子体内注射のために製剤化または適応される。
【0071】
一部の実施形態では、適したベクターとして、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびレトロウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス等のウイルスベクター、リポソーム、脂質含有複合体、ナノ粒子、および網膜細胞にポリヌクレオチドを送達することができる他の高分子複合体が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結した強力な真核生物プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターまたは構成的プロモーターを含む。
【0072】
一部の実施形態では、ベクターは、１種または複数の核酸分子を組み込んだ組換えウイルスベクターを含む。本明細書に記載されている通り、核酸は、ポリヌクレオチドを指す。核酸およびポリヌクレオチドは、互換的に使用することができる。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。一部の事例では、核酸は、抗ＶＥＧＦ剤または治療用導入遺伝子の発現のためのＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、目的の遺伝子（例えば、ラニビズマブ）、イントロン、非翻訳領域（ＵＴＲ）、終結配列その他の転写物を含むことができる。他の実施形態では、ＤＮＡとして、プロモーター配列、目的の遺伝子（例えば、ラニビズマブ）、ＵＴＲ、終結配列その他等の配列を挙げることができるがこれらに限定されない。一部の事例では、ＤＮＡおよびＲＮＡの組み合わせを使用することができる。
【0073】
一部の実施形態では、本開示は、被験体におけるラニビズマブ、ベバシズマブ、ｓＦＬＴ－１またはこれらのいずれかの機能的断片もしくはバリアントの送達および発現のためのベクターとしての、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）等の組換えウイルスを提供する。
【0074】
一部の実施形態では、いずれか適したウイルスベクターは、本開示の組成物および方法による使用のために操作または最適化することができる。例えば、ヒトまたは霊長類被験体において複製欠損となるように、アデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する組換えウイルスベクターを変更することができる。一部の実施形態では、ハイブリッドウイルスベクター系は、当業者に公知の方法を使用して得て、網膜細胞への抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸の送達に使用することができる。一部の実施形態では、ウイルス送達系または遺伝子療法は、標的細胞ゲノム（例えば、網膜細胞のゲノム）に抗ＶＥＧＦ遺伝子を含む核酸配列を組み込み、時間をわたり遺伝子の安定した遺伝子発現をもたらすことができる。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ遺伝子は、標的細胞ゲノムに組み込まれず、標的細胞に導入されたプラスミドまたはベクターから発現される。
【0075】
一部の実施形態では、網膜細胞への抗ＶＥＧＦの核酸配列の送達に適したウイルスベクターは、小型の無エンベロープ一本鎖ＤＮＡウイルスであるＡＡＶまたはｒＡＡＶである。ｒＡＡＶは、非病原性ヒトパルボウイルスであり、複製のためにアデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびＣＭＶを含むヘルパーウイルスに依存性となるように作製することができる。野生型（ｗｔ）ＡＡＶへの曝露は、いかなるヒト病理も伴わないまたはこれを引き起こすことが公知ではなく、一般的な集団においてありふれており、これにより、ＡＡＶまたはｒＡＡＶは遺伝子療法に適した送達系となる。治療用導入遺伝子、例えば、ラニビズマブの送達のための遺伝子療法に使用されるＡＡＶおよびｒＡＡＶは、いずれかの血清型のものであり得る。一部の実施形態では、本開示の薬学的組成物および方法は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪおよびこれらのいずれかのハイブリッドまたはキメラＡＡＶを含む、いずれか適したＡＡＶ血清型の使用を提供する。一部の実施形態では、使用される血清型は、ウイルスの親和性または目的の標的細胞への感染力に基づく。一部の実施形態では、ＡＡＶ２またはｒＡＡＶ２が、硝子体内または網膜下注射による被験体の眼または網膜細胞へのラニビズマブをコードする核酸配列の送達に使用される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ２．７ｍ８が、被験体の網膜細胞へのラニビズマブの核酸配列の送達に使用される。
【0076】
一部の実施形態では、標的細胞、例えば、網膜細胞への増加した感染力を有するバリアントカプシドタンパク質を含むＡＡＶまたはｒＡＡＶウイルス、粒子またはビリオンを使用して、網膜細胞の形質導入を増加させる、または被験体における網膜細胞への遺伝子送達の標的化を増加させる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶカプシドタンパク質のカプシドタンパク質ＧＨループ／ループＩＶにアミノ酸修飾を含む。一部の事例では、修飾の部位は、ＡＡＶカプシドタンパク質のＧＨループ／ループＩＶの溶媒到達可能部分である。７ｍ８バリアントを含む、いくつかのＡＡＶカプシドバリアントが公知である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比べて、カプシドタンパク質のＧＨループに５アミノ酸～１１アミノ酸、例えば、７アミノ酸配列の挿入を含むバリアントＡＡＶカプシドタンパク質を含み、バリアントカプシドタンパク質は、対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞への感染力と比較して、網膜細胞への増加した感染力を付与する。一部の実施形態では、次のアミノ酸配列のうちいずれか１種の挿入は、カプシドタンパク質のＧＨループに挿入することができる：ＬＧＥＴＴＲＰ（７ｍ８）、ＮＥＴＩＴＲＰ、ＫＡＧＱＡＮＮ、ＫＤＰＫＴＴＮ、ＫＤＴＤＴＴＲ、ＲＡＧＧＳＶＧ、ＡＶＤＴＴＫＦおよびＳＴＧＫＶＰＮ。一部の実施形態では、ラニビズマブを含むｒＡＡＶ．７ｍ８が遺伝子療法に使用される。
【0077】
一部の実施形態では、次のアミノ酸配列：ＮＥＴＩＴＲＰ、ＫＡＧＱＡＮＮ、ＫＤＰＫＴＴＮ、ＫＤＴＤＴＴＲ、ＲＡＧＧＳＶＧ、ＡＶＤＴＴＫＦおよびＳＴＧＫＶＰＮのうちいずれか１種を、次の位置に挿入して、遺伝子療法における使用のためのｒＡＡＶバリアントを生成することができる：ＡＡＶ２カプシドタンパク質の位置５８７および５８８の間；ＡＡＶ１カプシドタンパク質のアミノ酸５９０および５９１の間；ＡＡＶ５カプシドタンパク質のアミノ酸５７５および５７６の間；ＡＡＶ６カプシドタンパク質のアミノ酸５９０および５９１の間；ＡＡＶ７カプシドタンパク質のアミノ酸５８９および５９０の間；ＡＡＶ８カプシドタンパク質のアミノ酸５９０および５９１の間；ＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸５８８および５８９の間；またはＡＡＶ１０カプシドタンパク質のアミノ酸５８９および５９０の間。
【0078】
一部の実施形態では、ラニビズマブ等の遺伝子産物をコードする核酸は、遺伝子の転写を開始するプロモーターによる転写制御下に置くことができる。一部の実施形態では、プロモーターは、「強力な」または構成的に活性なプロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーターである。一部の実施形態では、コネキシン３６プロモーターを使用して、治療用導入遺伝子、例えば、ラニビズマブの発現を駆動する。一部の実施形態では、組織特異的プロモーターを使用して、網膜細胞等の特異的組織または細胞における転写をもたらして、非標的化細胞に対する潜在的な毒性または望ましくない効果を低下させることができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶウイルスの生成に使用される組換えウイルスおよび／またはプラスミドは、ポリＡ（ポリアデニル化）配列、非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲまたは終結配列等、他の転写または調節エレメントを含むことができる。一部の実施形態では、２種またはそれよりも多いタンパク質の同時発現を可能にするまたは多重遺伝子もしくはポリシストロニックｍＲＮＡをもたらす配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または同様のエレメントを使用して、ベクターまたはプラスミドから２種以上の遺伝子を発現させることができる。
【0079】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶウイルスの生成に使用されるｒＡＡＶおよび／またはプラスミドは、次の核酸エレメントを含む：第１のＩＴＲ配列；プロモーター配列；イントロン配列；第１のＵＴＲ配列；抗ＶＥＧＦ導入遺伝子をコードする配列；第２のＵＴＲ配列；ポリＡ配列；および第２のＩＴＲ配列。一部の実施形態では、これらの核酸エレメントのそれぞれの間にリンカー配列が使用される。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ導入遺伝子をコードする配列は、抗ＶＥＧＦ導入遺伝子融合タンパク質またはその機能的断片をコードする配列を含む。
【0080】
一部の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、ベクターゲノムとして測定される。一部の事例では、本開示の組換えウイルスの単位用量は、１×１０１０～２×１０１０の間、２×１０１０～３×１０１０の間、３×１０１０～４×１０１０の間、４×１０１０～５×１０１０の間、５×１０１０～６×１０１０の間、６×１０１０～７×１０１０の間、７×１０１０～８×１０１０の間、８×１０１０～９×１０１０の間、９×１０１０～１０×１０１０の間、１×１０１１～２×１０１１の間、２×１０１１～３×１０１１の間、３×１０１１～４×１０１１の間、４×１０１１～５×１０１１の間、５×１０１１～６×１０１１の間、６×１０１１～７×１０１１の間、７×１０１１～８×１０１１の間、８×１０１１～９×１０１１の間、９×１０１１～１０×１０１１の間、１×１０１２～２×１０１２の間、２×１０１２～３×１０１２の間、３×１０１２～４×１０１２の間、４×１０１２～５×１０１２の間、５×１０１２～６×１０１２の間、６×１０１２～７×１０１２の間、７×１０１２～８×１０１２の間、８×１０１２～９×１０１２の間、９×１０１２～１０×１０１２の間、１×１０１３～２×１０１３の間、２×１０１３～３×１０１３の間、３×１０１３～４×１０１３の間、４×１０１３～５×１０１３の間、５×１０１３～６×１０１３の間、６×１０１３～７×１０１３の間、７×１０１３～８×１０１３の間、８×１０１３～９×１０１３の間または９×１０１３～１０×１０１３の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶは、約２．１×１０１２のベクターゲノムである。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶは、１０１０～１０１３の間、１０１０～１０１１の間、１０１１～１０１２の間、１０１２～１０１３の間、１０１３～１０１４の間、２×１０１１～４×１０１１の間、３×１０１１～５×１０１１の間、４×１０１１～６×１０１１の間、５×１０１１～７×１０１１の間、６×１０１１～８×１０１１の間、７×１０１１～９×１０１１の間、８×１０１１～１０×１０１１の間、１×１０１２～３×１０１２の間、２×１０１２～４×１０１２の間、３×１０１２～５×１０１２の間、４×１０１２～６×１０１２の間、５×１０１２～７×１０１２の間、６×１０１２～８×１０１２の間、７×１０１２～９×１０１２の間、８×１０１２～１０×１０１２の間、１×１０１３～５×１０１３の間、５×１０１３～１０×１０１３の間、１０１２～５×１０１２の間または５×１０１２～１×１０１３の間のベクターゲノムである。
【0081】
一部の事例では、本開示の組換えウイルスは、約１Ｅ１０、約１．５Ｅ１０、約２Ｅ１０、約２．５Ｅ１０、約３Ｅ１０、約３．５Ｅ１０、約４Ｅ１０、約４．５Ｅ１０、約５Ｅ１０、約５．５Ｅ１０、約６Ｅ１０、約６．５Ｅ１０、約７Ｅ１０、約７．５Ｅ１０、約８Ｅ１０、約８．５Ｅ１０、約９Ｅ１０、約９．５Ｅ１０、約１０Ｅ１０、約１Ｅ１１、約１．５Ｅ１１、約２Ｅ１１、約２．５Ｅ１１、約３Ｅ１１、約３．５Ｅ１１、約４Ｅ１１、約４．５Ｅ１１、約５Ｅ１１、約５．５Ｅ１１、約６Ｅ１１、約６．５Ｅ１１、約７Ｅ１１、約７．５Ｅ１１、約８Ｅ１１、約８．５Ｅ１１、約９Ｅ１１、約９．５Ｅ１１、約１０Ｅ１１、約１Ｅ１２、約１．３Ｅ１２、約１．５Ｅ１２、約２Ｅ１２、約２．１Ｅ１２、約２．３Ｅ１２、約２．５Ｅ１２、約２．７Ｅ１２、約２．９Ｅ１２、約３Ｅ１２、約３．１Ｅ１２、約３．３Ｅ１２、約３．５Ｅ１２、約３．７Ｅ１２、約３．９Ｅ１２、約４Ｅ１２、約４．１Ｅ１２、約４．３Ｅ１２、約４．５Ｅ１２、約４．７Ｅ１２、約４．９Ｅ１２、約５Ｅ１２、約５．１Ｅ１２、約５．３Ｅ１２、約５．５Ｅ１２、約５．７Ｅ１２、約５．９Ｅ１２、約６Ｅ１２、約６．１Ｅ１２、約６．３Ｅ１２、約６．５Ｅ１２、約６．７Ｅ１２、約６．９Ｅ１２、約７Ｅ１２、約７．１Ｅ１２、約７．３Ｅ１２、約７．５Ｅ１２、約７．７Ｅ１２、約７．９Ｅ１２、約８Ｅ１２、約８．１Ｅ１２、約８．３Ｅ１２、約８．５Ｅ１２、約８．７Ｅ１２、約８．９Ｅ１２、約９Ｅ１２、約９．１Ｅ１２、約９．３Ｅ１２、約９．５Ｅ１２、約９．７Ｅ１２、約９．９Ｅ１２、約１０Ｅ１２、約１０．１Ｅ１２、約１０．３Ｅ１２、約１０．５Ｅ１２、約１０．７Ｅ１２、約１０．９Ｅ１２、約１１Ｅ１２、約１１．５Ｅ１２、約１２Ｅ１２、約１２．５Ｅ１２、約１３Ｅ１２、約１３．５Ｅ１２、約１４Ｅ１２、約１４．５Ｅ１２、約１５Ｅ１２、約１５．５Ｅ１２、約１６Ｅ１２、約１６．５Ｅ１２、約１７Ｅ１２、約１７．５Ｅ１２、約１８Ｅ１２、約１８．５Ｅ１２、約１９Ｅ１２、約１９．５Ｅ１２、約２０Ｅ１２、約２０．５Ｅ１２、約３０Ｅ１２、約３０．５Ｅ１２、約４０Ｅ１２、約４０．５Ｅ１２、約５０Ｅ１２、約５０．５Ｅ１２、約６０Ｅ１２、約６０．５Ｅ１２、約７０Ｅ１２、約７０．５Ｅ１２、約８０Ｅ１２、約８０．５Ｅ１２、約９０Ｅ１２、約９５Ｅ１２または約１００Ｅ１２個であり、Ｅは、累乗法の底１０の略称であり、ｘＥｙは、ｘに、底１０のｙ乗（ｐｏｗｅｒ／ｅｘｐｏｎｅｎｔ）を掛けた数を指す。
【0082】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている薬学的組成物は、少なくとも５Ｅ１１、少なくとも５．５Ｅ１１、少なくとも６Ｅ１１、少なくとも６．５Ｅ１１、少なくとも７Ｅ１１、少なくとも７．５Ｅ１１、少なくとも８Ｅ１１、少なくとも８．５Ｅ１１、少なくとも９Ｅ１１、少なくとも９．５Ｅ１１、少なくとも１０Ｅ１１、少なくとも１Ｅ１２、少なくとも１．３Ｅ１２、少なくとも１．５Ｅ１２、少なくとも２Ｅ１２、少なくとも２．１Ｅ１２、少なくとも２．３Ｅ１２、少なくとも２．５Ｅ１２、少なくとも２．７Ｅ１２、少なくとも２．９Ｅ１２、少なくとも３Ｅ１２、少なくとも３．１Ｅ１２、少なくとも３．３Ｅ１２、少なくとも３．５Ｅ１２、少なくとも３．７Ｅ１２、少なくとも３．９Ｅ１２、少なくとも４Ｅ１２、少なくとも４．１Ｅ１２、少なくとも４．３Ｅ１２、少なくとも４．５Ｅ１２、少なくとも４．７Ｅ１２、少なくとも４．９Ｅ１２、少なくとも５Ｅ１２、少なくとも５．１Ｅ１２、少なくとも５．３Ｅ１２、少なくとも５．５Ｅ１２、少なくとも５．７Ｅ１２、少なくとも５．９Ｅ１２、少なくとも６Ｅ１２、少なくとも６．１Ｅ１２、少なくとも６．３Ｅ１２、少なくとも６．５Ｅ１２、少なくとも６．７Ｅ１２、少なくとも６．９Ｅ１２、少なくとも７Ｅ１２、少なくとも７．１Ｅ１２、少なくとも７．３Ｅ１２、少なくとも７．５Ｅ１２、少なくとも７．７Ｅ１２、少なくとも７．９Ｅ１２、少なくとも８Ｅ１２、少なくとも８．１Ｅ１２、少なくとも８．３Ｅ１２、少なくとも８．５Ｅ１２、少なくとも８．７Ｅ１２、少なくとも８．９Ｅ１２、少なくとも９Ｅ１２、少なくとも９．１Ｅ１２、少なくとも９．３Ｅ１２、少なくとも９．５Ｅ１２、少なくとも９．７Ｅ１２、少なくとも９．９Ｅ１２、少なくとも１０Ｅ１２、少なくとも１０．１Ｅ１２、少なくとも１０．３Ｅ１２、少なくとも１０．５Ｅ１２、少なくとも１０．７Ｅ１２、少なくとも１０．９Ｅ１２、少なくとも１１Ｅ１２、少なくとも１１．５Ｅ１２、少なくとも１２Ｅ１２、少なくとも１２．５Ｅ１２、少なくとも１３Ｅ１２、少なくとも１３．５Ｅ１２、少なくとも１４Ｅ１２、少なくとも１４．５Ｅ１２、少なくとも１５Ｅ１２、少なくとも１５．５Ｅ１２、少なくとも１６Ｅ１２、少なくとも１６．５Ｅ１２、少なくとも１７Ｅ１２、少なくとも１７．５Ｅ１２、少なくとも１８Ｅ１２、少なくとも１８．５Ｅ１２、少なくとも１９Ｅ１２、少なくとも１９．５Ｅ１２、少なくとも２０Ｅ１２、少なくとも２０．５Ｅ１２、少なくとも３０Ｅ１２、少なくとも３０．５Ｅ１２、少なくとも４０Ｅ１２、少なくとも４０．５Ｅ１２、少なくとも５０Ｅ１２、少なくとも５０．５Ｅ１２、少なくとも６０Ｅ１２、少なくとも６０．５Ｅ１２、少なくとも７０Ｅ１２、少なくとも７０．５Ｅ１２、少なくとも８０Ｅ１２、少なくとも８０．５Ｅ１２、少なくとも９０Ｅ１２、少なくとも９５Ｅ１２または少なくとも１００Ｅ１２のベクターゲノムの組換えウイルスを含み、Ｅは、累乗法の底１０の略称であり、ｘＥｙは、ｘに、底１０のｙ乗（ｐｏｗｅｒ／ｅｘｐｏｎｅｎｔ）を掛けた数を指す。
【0083】
一部の実施形態では、本開示のウイルスベクターは、感染多重度（ＭＯＩ）を使用して測定される。一部の事例では、ＭＯＩは、ベクターまたはウイルスゲノムの、核酸が送達され得る細胞に対する比または倍数を指す。一部の事例では、ＭＯＩは、１×１０６である。一部の事例では、本開示の組換えウイルスは、少なくとも１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７および１×１０１８ＭＯＩであり得る。一部の事例では、本開示の組換えウイルスは、１×１０８～１×１０１５ＭＯＩであり得る。一部の事例では、本開示の組換えウイルスは、多くても１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７および１×１０１８ＭＯＩであり得る。
【0084】
一部の実施形態では、核酸は、ウイルスを使用せずに（すなわち、非ウイルスベクターを用いて）送達することができ、核酸の量として測定することができる。一般に、いずれか適した量の核酸を、本開示の薬学的組成物および方法により使用することができる。一部の事例では、核酸は、少なくとも１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、２００ｐｇ、３００ｐｇ、４００ｐｇ、５００ｐｇ、６００ｐｇ、７００ｐｇ、８００ｐｇ、９００ｐｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇまたは５ｇである。一部の事例では、核酸は、多くても約１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、２００ｐｇ、３００ｐｇ、４００ｐｇ、５００ｐｇ、６００ｐｇ、７００ｐｇ、８００ｐｇ、９００ｐｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、３００ｎｇ、４００ｎｇ、５００ｎｇ、６００ｎｇ、７００ｎｇ、８００ｎｇ、９００ｎｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇまたは５ｇであり得る。
【0085】
一部の実施形態では、自己相補的ベクター（ｓｃ）を使用することができる。参照により本明細書に組み込むWu、Hum Gene Ther.２００７年、１８巻（２号）：１７１～８２頁によって示される通り、自己相補的ＡＡＶベクターの使用は、ウイルス第２鎖ＤＮＡ合成の必要を迂回することができ、導入遺伝子タンパク質のより優れた発現率をもたらすことができる。
【0086】
一部の態様では、いくつかのＡＡＶベクターを生成して、抗ＶＥＧＦ導入遺伝子による使用のための最適な血清型およびプロモーターの選択を可能にすることができる。
【0087】
一部の事例では、ベクターは、網膜細胞もしくは光受容体、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞または網膜色素上皮細胞等、特異的細胞へのより高い感染力を示す、標的化ベクター、特に、標的化ｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）であり得る。本開示における使用のためのウイルスベクターは、被験体における低い毒性および／または低い免疫原性を示し、被験体、例えば、ヒト患者において治療有効量の抗ＶＥＧＦ導入遺伝子を発現するウイルスベクターを含むことができる。
【0088】
７ｍ８バリアントカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ、またはｒＡＡＶ２．７ｍ８、ならびに非ヒト霊長類またはヒト被験体における抗ＶＥＧＦ導入遺伝子をコードする核酸配列を使用して、被験体の標的網膜細胞に抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸を送達するための薬学的組成物および方法が、本明細書に開示されている。一部の実例では、遺伝子療法による抗ＶＥＧＦ剤の送達を使用して、本明細書に開示されている眼性疾患または状態を少なくとも部分的に好転させるまたは予防することができる。
【0089】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶバリアント（例えば、７ｍ８バリアント）の網膜細胞感染力の増加は、対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％である。一部の実施形態では、網膜細胞への感染力の増加は、対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、５％～１００％の間、５％～９５％の間、５％～９０％の間、５％～８５％の間、５％～８０％の間、５％～７５％の間、５％～７０％の間、５％～６５％の間、５％～６０％の間、５％～５５％の間、５％～５０％の間、５％～４５％の間、５％～４０％の間、５％～３５％の間、５％～３０％の間、５％～２５％の間、５％～２０％の間、５％～１５％の間、５％～１０％の間の増加である。
【0090】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶバリアントの網膜細胞感染力の増加は、対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも１倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍または少なくとも２倍である。一部の実施形態では、感染力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍または少なくとも１０倍である。一部の実施形態では、感染力の増加は、対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも６５倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも８５倍、少なくとも９０倍または少なくとも１００倍である。
【0091】
一部の実施形態では、網膜細胞感染力の増加は、対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、１０倍～１００倍の間、１０倍～９５倍の間、１０倍～９０倍の間、１０倍～８５倍の間、１０倍～８０倍の間、１０倍～７５倍の間、１０倍～７０倍の間、１０倍～６５倍の間、１０倍～６０倍の間、１０倍～５５倍の間、１０倍～５０倍の間、１０倍～４５倍の間、１０倍～４０倍の間、１０倍～３５倍の間、１０倍～３０倍の間、１０倍～２５倍の間、１０倍～２０倍の間または１０倍～１５倍の間である。
【0092】
一部の実施形態では、網膜細胞感染力の増加は、対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、２倍～２０倍の間、２倍～１９倍の間、２倍～１８倍の間、２倍～１７倍の間、２倍～１６倍の間、２倍～１５倍の間、２倍～１４倍の間、２倍～１３倍の間、２倍～１２倍の間、２倍～１１倍の間、２倍～１０倍の間、２倍～９倍の間、２倍～８倍の間、２倍～７倍の間、２倍～６倍の間、２倍～５倍の間、２倍～４倍の間または２倍～３倍の間である。
【0093】
一部の実施形態では、本明細書に記載されているカプシドタンパク質のアミノ酸修飾は、被験体の眼における内境界膜（ＩＬＭ）を横切る対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンの能力と比較して、霊長類またはヒト被験体の眼におけるＩＬＭを横切る能力の増加を付与することができる。一部の実施形態では、ＩＬＭを横切る能力の増加は、対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％の増加である。一部の実施形態では、ＩＬＭを横切る能力の増加は、親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、５％～１００％の間、５％～９５％の間、５％～９０％の間、５％～８５％の間、５％～８０％の間、５％～７５％の間、５％～７０％の間、５％～６５％の間、５％～６０％の間、５％～５５％の間、５％～５０％の間、５％～４５％の間、５％～４０％の間、５％～３５％の間、５％～３０％の間、５％～２５％の間、５％～２０％の間、５％～１５％の間または５％～１０％の間の増加である。
【0094】
一部の実施形態では、ＩＬＭを横切る能力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも１倍、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍または少なくとも２倍である。一部の実施形態では、ＩＬＭを横切る能力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍または少なくとも１０倍である。一部の実施形態では、ＩＬＭを横切る能力の増加は、対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも６５倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも８５倍、少なくとも９０倍または少なくとも１００倍である。
【0095】
一部の実施形態では、ＩＬＭを横切る能力の増加は、対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、１０倍～１００倍の間、１０倍～９５倍の間、１０倍～９０倍の間、１０倍～８５倍の間、１０倍～８０倍の間、１０倍～７５倍の間、１０倍～７０倍の間、１０倍～６５倍の間、１０倍～６０倍の間、１０倍～５５倍の間、１０倍～５０倍の間、１０倍～４５倍の間、１０倍～４０倍の間、１０倍～３５倍の間、１０倍～３０倍の間、１０倍～２５倍の間、１０倍～２０倍の間または１０倍～１５倍の間である。
【0096】
一部の実施形態では、ＩＬＭを横切る能力の増加は、対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、２倍～２０倍の間、２倍～１９倍の間、２倍～１８倍の間、２倍～１７倍の間、２倍～１６倍の間、２倍～１５倍の間、２倍～１４倍の間、２倍～１３倍の間、２倍～１２倍の間、２倍～１１倍の間、２倍～１０倍の間、２倍～９倍の間、２倍～８倍の間、２倍～７倍の間、２倍～６倍の間、２倍～５倍の間、２倍～４倍の間または２倍～３倍の間である。
【0097】
一部の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスおよびＨＩＶに基づくウイルスを含むことができる。一部の実施形態では、ＨＩＶに基づくウイルスベクターを使用することができ、ＨＩＶに基づくウイルスベクターは、少なくとも２種のベクターを含み、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子は、ＨＩＶゲノムに由来し、ｅｎｖ遺伝子は、別のウイルスに由来する。一部の実施形態では、ＤＮＡウイルスベクターを使用することができる。このようなベクターは、オルソポックスまたはトリポックス（avipox）ベクター等のポックスベクター、単純ヘルペスＩウイルス（ＨＳＶ）ベクター［Geller, A. I.ら、J. Neurochem、６４巻：４８７頁（１９９５年）；Lim, F.ら、DNA Cloning: Mammalian Systems、D. Glover編（Oxford Univ. Press、Oxford England）（１９９５年）内；Geller, A. I.
ら、Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A.：９０巻、７６０３頁（１９９３年）；Geller,
A. I.ら、Proc Natl. Acad. Sci. USA：８７巻：１１４９頁（１９９０年）］等
のヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター［LeGal LaSalleら、Science、
２５９巻：９８８頁（１９９３年）；Davidsonら、Nat. Genet.３巻：２１９頁（１９９３年）；Yangら、J. Virol.６９巻：２００４頁（１９９５年）］およびアデノ随伴ウイルスベクター［Kaplitt, M. G.ら、Nat. Genet.８巻：１４８頁（１９９４年）］を含むことができ、これら文献の全体を参照により本明細書に組み込む。
ら、Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A.：９０巻、７６０３頁（１９９３年）；Geller,
A. I.ら、Proc Natl. Acad. Sci. USA：８７巻：１１４９頁（１９９０年）］等
のヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター［LeGal LaSalleら、Science、
２５９巻：９８８頁（１９９３年）；Davidsonら、Nat. Genet.３巻：２１９頁（１９９３年）；Yangら、J. Virol.６９巻：２００４頁（１９９５年）］およびアデノ随伴ウイルスベクター［Kaplitt, M. G.ら、Nat. Genet.８巻：１４８頁（１９９４年）］を含むことができ、これら文献の全体を参照により本明細書に組み込む。
【0098】
一部の実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターであり得る。本開示における使用のためのレンチウイルスベクターは、ヒトおよび非ヒト（ＳＩＶを含む）レンチウイルスに由来し得る。レンチウイルスベクターの例として、ベクター繁殖に要求される核酸配列と共に、抗ＶＥＧＦタンパク質遺伝子に作動可能に連結した組織特異的プロモーターを挙げることができる。核酸配列は、ウイルスＬＴＲ、プライマー結合部位、ポリプリントラクト、ａｔｔ部位およびカプシド形成部位を含むことができる。
【0099】
一部の実施形態では、ベクターは、アルファウイルスベクターであり得る。セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）およびシンドビスウイルス（ＳＩＮ）から作製されたベクター等、アルファウイルスに基づくベクターを本開示において使用することもできる。アルファウイルスの使用は、Lundstrom, K.、Intervirology ４３巻：２４７～２５７頁、２００
０年およびPerriら、Journal of Virology ７４巻：９８０２～９８０７頁、２０００年に記載されており、これらの全体を参照により本明細書に組み込む。
０年およびPerriら、Journal of Virology ７４巻：９８０２～９８０７頁、２０００年に記載されており、これらの全体を参照により本明細書に組み込む。
【0100】
一部の実施形態では、ベクターは、ポックスウイルスベクターであり得る。ポックスウイルスベクターは、細胞の細胞質に遺伝子を導入することができる。トリポックスウイルスベクターは、遺伝子または核酸の短期発現のみをもたらすことができる。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターを、本開示の組成物および方法により使用することができる。アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスよりも短期の発現（例えば、約１カ月間未満）をもたらすことができ、一部の態様では、はるかにより長い発現を示すことができる。選択される特定のベクターは、標的細胞および処置されている状態に依存することができる。
【0101】
目的の遺伝子産物をコードする核酸を被験体の標的細胞に送達するための組成物および方法が、本明細書に開示されている。一部の実例では、目的の遺伝子産物は、遺伝子産物を含むベクターの投与後に被験体に送達される。一部の実例では、遺伝子産物の送達を使用して、本明細書に開示されている疾患または状態を少なくとも部分的に好転させるまたは処置することができる。一部の実例では、組成物は、遺伝子療法として使用することができる、または遺伝子療法もしくはｉｎ ｖｉｖｏでの抗ＶＥＧＦの送達に適応される。
【0102】
一部の実例では、ベクター、送達ビヒクル、遺伝子送達ビヒクルまたは遺伝子移入ビヒクルは、標的細胞、組織または被験体に送達されるべきポリヌクレオチドを含む、いずれか適した高分子または分子の複合体を指す。一部の事例では、標的細胞は、核酸または遺伝子が送達されるいずれかの細胞であり得る。
【0103】
一部の実施形態では、ベクター、例えば、裸のＤＮＡまたはプラスミドは、ミセル；マイクロエマルション；リポソーム；ナノスフェア；ナノ粒子；ナノカプセル；固体脂質ナノ粒子；デンドリマー；ポリエチレンイミン誘導体および単層カーボンナノチューブ；ならびに標的細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介することができる他の高分子複合体を使用して、細胞、組織または被験体に送達することができる。一部の事例では、ベクターは、有機または無機分子であり得る。一部の事例では、ベクターは、小分子（すなわち、＜５ｋＤ）または高分子（すなわち、＞５ｋＤ）である。
【0104】
一部の実施形態では、ベクターは、１種または複数の核酸を組み込んだ組換えウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）を含む。本明細書に記載されている通り、核酸は、ポリヌクレオチドを含むことができる。一部の実例では、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。一部の事例では、核酸は、遺伝子産物またはアプタマーの発現のためのＤＮＡまたはＲＮＡを含む。一部の事例では、ＲＮＡ分子は、目的の遺伝子、イントロン、非翻訳領域、終結配列その他の転写物を含むことができる。他の事例では、ＤＮＡ分子は、ハイブリッドプロモーター遺伝子配列、強力な構成的プロモーター配列、目的の遺伝子、非翻訳領域、終結配列その他等の配列を含むことができる。一部の事例では、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれかの組み合わせを使用することができる。
【0105】
一部の実施形態では、本開示は、遺伝子産物の発現を媒介するためのベクター、またはｉｎ ｖｉｖｏで標的細胞もしくは被験体、例えば、眼または眼の硝子体に遺伝子産物を送達するための遺伝子療法として組換えウイルスを提供する。いずれか適した組換えウイルスベクターを、本開示の組成物および方法による使用に最適化されるように操作することができる。例えば、アデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来する組換えウイルスベクターを使用することができる。
【0106】
ヒトおよび非ヒトウイルスベクターの両方を使用することができ、ヒトまたは被験体において複製欠損となるように、組換えウイルスベクターを変更することができる。一部の実施形態では、ベクターは、抗ＶＥＧＦ剤等の遺伝子産物または治療剤をコードする治療用導入遺伝子に作動可能に連結したプロモーターを有するポリヌクレオチドを含む、複製欠損アデノウイルスまたはｒＡＡＶであり得る。
【0107】
一部の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスおよびＨＩＶに基づくウイルスを含むことができる。一部の実施形態では、ＨＩＶに基づくウイルスベクターを使用することができ、ＨＩＶに基づくウイルスベクターは、少なくとも２種のベクターを含み、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子は、ＨＩＶゲノムに由来し、ｅｎｖ遺伝子は、別のウイルスに由来する。一部の実施形態では、ＤＮＡウイルスベクターを使用することができる。このようなベクターは、オルソポックスまたはトリポックスベクター等のポックスベクター、単純ヘルペスＩウイルス（ＨＳＶ）ベクター［Geller, A. I.ら、J. Neurochem、６４巻：４８７頁（１９９５年）；Lim, F.ら、DNA Cloning: Mammalian Systems、D. Glover編（Oxford Univ. Press、Oxford England）（１９９５年）内；Geller, A. I.ら、Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A.：９０巻、７６０３頁（１９９３年）；Geller, A. I.ら
、Proc Natl. Acad. Sci. USA：８７巻：１１４９頁（１９９０年）］等のヘルペス
ウイルスベクター、アデノウイルスベクター［LeGal LaSalleら、Science、２５９巻：
９８８頁（１９９３年）；Davidsonら、Nat. Genet.３巻：２１９頁（１９９３年）；Yangら、J. Virol.６９巻：２００４頁（１９９５年）］およびアデノ随伴ウイルスベクター［Kaplitt, M. G.ら、Nat. Genet.８巻：１４８頁（１９９４年）］を含むことができ、これら文献の全体を参照により本明細書に組み込む。
、Proc Natl. Acad. Sci. USA：８７巻：１１４９頁（１９９０年）］等のヘルペス
ウイルスベクター、アデノウイルスベクター［LeGal LaSalleら、Science、２５９巻：
９８８頁（１９９３年）；Davidsonら、Nat. Genet.３巻：２１９頁（１９９３年）；Yangら、J. Virol.６９巻：２００４頁（１９９５年）］およびアデノ随伴ウイルスベクター［Kaplitt, M. G.ら、Nat. Genet.８巻：１４８頁（１９９４年）］を含むことができ、これら文献の全体を参照により本明細書に組み込む。
【0108】
一部の実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターであり得る。本開示における使用のためのレンチウイルスベクターは、ヒトおよび非ヒト（ＳＩＶを含む）レンチウイルスに由来し得る。レンチウイルスベクターの例として、ベクター繁殖に要求される核酸配列と共に、抗ＶＥＧＦタンパク質遺伝子に作動可能に連結した組織特異的プロモーターを挙げることができる。核酸配列は、ウイルスＬＴＲ、プライマー結合部位、ポリプリントラクト、ａｔｔ部位およびカプシド形成部位を含むことができる。
【0109】
一部の実施形態では、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターは、本開示の組成物および方法により使用することができる。使用される特定のベクター（例えば、レンチウイルス、アデノウイルスまたはＡＡＶ）は、標的細胞、ベクターから発現されるべき治療用導入遺伝子もしくは薬剤のサイズ、および／または処置されている状態に依存することができる。
【0110】
一部の実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、またはＡＡＶに由来する。ＡＡＶは、小型の無エンベロープ一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶは、非病原性ヒトパルボウイルスであり、複製のために、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびＣＭＶを含むヘルパーウイルスに依存することができる。野生型ＡＡＶへの曝露は、いかなるヒト病理も関連しない場合があるまたはそれを引き起こすことが公知ではない場合があり、一般的な集団においてありふれており、アデノウイルス感染に関連して生後１０年以内に通常発生する。
【0111】
一部の実例では、ｒＡＡＶは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはＤＪのネイティブまたは野生型ＡＡＶであり得る。一部の実例では、ｒＡＡＶは、少なくとも２種の血清型由来のカプシドタンパク質を含むキメラＡＡＶであり得る。一部の実施形態では、ｒＡＡＶウイルスまたはビリオンは、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質を含むことができる。一部の事例では、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比べて、置換、挿入、欠失およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸修飾を含むことができる。
【0112】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比べて、カプシドタンパク質における少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９または少なくとも２０アミノ酸の欠失を含むことができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、カプシドタンパク質における少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５または少なくとも１００アミノ酸の欠失を含むことができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、カプシドタンパク質における多くても約１００アミノ酸、多くても約２００、多くても約３００または多くても約４００アミノ酸の欠失を含むことができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、カプシドタンパク質における約１～約１００、約１～約９０、約１～約８０、約１～約７０、約１～約６０、約１～約５０、約１～約４０、約１～約３０、約１～約２０、約１～約１５、約１～約１０または約１～約５アミノ酸の欠失を含むことができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、カプシドタンパク質における約５アミノ酸～約２０アミノ酸、約５アミノ酸～約１９アミノ酸、約５アミノ酸～約１８アミノ酸、約５アミノ酸～約１７アミノ酸、約５アミノ酸～約１６アミノ酸、約５アミノ酸～約１５アミノ酸、約５アミノ酸～約１４アミノ酸、約５アミノ酸～約１３アミノ酸、約５アミノ酸～約１２アミノ酸、約５アミノ酸～約１１アミノ酸、約５アミノ酸～約１０アミノ酸、約５アミノ酸～約９アミノ酸、約５アミノ酸～約８アミノ酸、約５アミノ酸～約７アミノ酸または約５アミノ酸～約６アミノ酸の欠失を含むことができる。
【0113】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比べて、カプシドタンパク質における少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９または少なくとも２０アミノ酸の挿入を含むことができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、カプシドタンパク質における少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５または少なくとも１００アミノ酸の挿入を含むことができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、カプシドタンパク質における多くても約１００アミノ酸、多くても約２００、多くても約３００または多くても約４００アミノ酸の挿入を含むことができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、カプシドタンパク質における約１～約１００、約１～約９０、約１～約８０、約１～約７０、約１～約６０、約１～約５０、約１～約４０、約１～約３０、約１～約２０、約１～約１５、約１～約１０または約１～約５アミノ酸の挿入を含むことができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、カプシドタンパク質における約５アミノ酸～約２０アミノ酸、約５アミノ酸～約１９アミノ酸、約５アミノ酸～約１８アミノ酸、約５アミノ酸～約１７アミノ酸、約５アミノ酸～約１６アミノ酸、約５アミノ酸～約１５アミノ酸、約５アミノ酸～約１４アミノ酸、約５アミノ酸～約１３アミノ酸、約５アミノ酸～約１２アミノ酸、約５アミノ酸～約１１アミノ酸、約５アミノ酸～約１０アミノ酸、約５アミノ酸～約９アミノ酸、約５アミノ酸～約８アミノ酸、約５アミノ酸～約７アミノ酸または約５アミノ酸～約６アミノ酸の挿入を含むことができる。
【0114】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質と比べて、カプシドタンパク質における少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９または少なくとも２０アミノ酸の置換を含むことができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、カプシドタンパク質における約１アミノ酸～約２０アミノ酸、約１アミノ酸～約１９アミノ酸、約１アミノ酸～約１８アミノ酸、約１アミノ酸～約１７アミノ酸、約１アミノ酸～約１６アミノ酸、約１アミノ酸～約１５アミノ酸、約１アミノ酸～約１４アミノ酸、約１アミノ酸～約１３アミノ酸、約１アミノ酸～約１２アミノ酸、約１アミノ酸～約１１アミノ酸、約１アミノ酸～約１０アミノ酸、約１アミノ酸～約９アミノ酸、約１アミノ酸～約８アミノ酸、約１アミノ酸～約７アミノ酸、約１アミノ酸～約６アミノ酸、約１～約５アミノ酸、約１～約４アミノ酸、約１～約３アミノ酸または約１～約２アミノ酸の置換を含むことができる。
【0115】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、対応する親、無修飾カプシドタンパク質と比べて、カプシドタンパク質における少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９または少なくとも約２０個の総アミノ酸挿入、欠失または置換を含むことができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、対応する親、無修飾カプシドタンパク質と比べて、カプシドタンパク質における少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５または少なくとも約１００個の総アミノ酸挿入、欠失または置換を含むことができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、対応する親、無修飾カプシドタンパク質と比べて、カプシドタンパク質における少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００または少なくとも約４００個の総アミノ酸挿入、欠失または置換を含むことができる。
【0116】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、親、無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質のカプシドタンパク質に対して少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％相同であるアミノ酸配列を有するバリアントカプシドタンパク質を含む。
【0117】
一部の事例では、修飾は、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７または別のＡＡＶ血清型のカプシドサブユニットの対応する残基の後であり得る。残基５８７が、ＡＡＶ２カプシドタンパク質に基づくことに留意されたい。修飾は、ＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９等）における対応する部位に組み込むことができる。当業者であれば、様々なＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質のアミノ酸配列の比較に基づき、いずれか所与のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質における、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７に対応する修飾部位の場所が分かるであろう。例えば、ＡＡＶ１についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０４９５４２；ＡＡＶ５についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＤ１３７５６；ＡＡＶ６についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ９５４５９；ＡＡＶ７についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿０７７１７８；ＡＡＶ８についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿０７７１８０；ＡＡＶ９についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＳ９９２６４およびＡＡＶ１０についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＴ４６３３７を参照されたい。
【0118】
一部の実施形態では、アミノ酸修飾は、タンパク質ＧＨループまたはループＩＶにおける約５アミノ酸～約１１アミノ酸の挿入である。一部の実施形態では、アミノ酸修飾は、カプシドタンパク質の溶媒曝露領域を破壊して、ＧＨループを含む１個または複数のアミノ酸を含む挿入である。一部の特異的な実施形態では、修飾は、ＡＡＶ２のＶＰ１における残基５８７および５８８の間にアミノ酸配列ＬＧＥＴＴＲＰの挿入を含む。一部の実施形態では、他の挿入またはＡＡＶ２バリアントは、被験体に抗ＶＥＧＦ剤、例えば、ｓＦＬＴ－１、ラニビズマブまたはベバシズマブを送達するためのベクターまたは遺伝子療法として使用することができる。
【0119】
一部の実施形態では、本明細書に記載されているカプシドタンパク質のアミノ酸修飾は、対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞への感染力と比較して、眼性細胞への感染力の増加を付与することができる。一部の事例では、眼性細胞は、光受容体細胞（例えば、桿体；錐体）であり得る。一部の事例では、眼性細胞は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）であり得る。一部の事例では、網膜細胞は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞であり得る。一部の事例では、眼性細胞は、ミュラー細胞であり得る。一部の事例では、眼性細胞は、アストロサイトであり得る。一部の事例では、網膜細胞は、アマクリン細胞、双極細胞または水平細胞を含むことができる。
【0120】
一部の実施形態では、感染力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約１００％の増加である。一部の実施形態では、感染力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、約５％～約１００％の間、約５％～約９５％の間、約５％～約９０％の間、約５％～約８５％の間、約５％～約８０％の間、約５％～約７５％の間、約５％～約７０％の間、約５％～約６５％の間、約５％～約６０％の間、約５％～約５５％の間、約５％～約５０％の間、約５％～約４５％の間、約５％～約４０％の間、約５％～約３５％の間、約５％～約３０％の間、約５％～約２５％の間、約５％～約２０％の間、約５％～約１５％の間または約５％～約１０％の間の増加である。
【0121】
一部の実施形態では、感染力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍または少なくとも約２倍である。一部の実施形態では、感染力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍または少なくとも約１０倍である。一部の実施形態では、感染力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍または少なくとも約１００倍である。
【0122】
一部の実施形態では、感染力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、約１０倍～約１００倍の間、約１０倍～約９５倍の間、約１０倍～約９０倍の間、約１０倍～約８５倍の間、約１０倍～約８０倍の間、約１０倍～約７５倍の間、約１０倍～約７０倍の間、約１０倍～約６５倍の間、約１０倍～約６０倍の間、約１０倍～約５５倍の間、約１０倍～約５０倍の間、約１０倍～約４５倍の間、約１０倍～約４０倍の間、約１０倍～約３５倍の間、約１０倍～約３０倍の間、約１０倍～約２５倍の間、約１０倍～約２０倍の間または約１０倍～約１５倍の間である。
【0123】
一部の実施形態では、感染力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、約２倍～約２０倍の間、約２倍～約１９倍の間、約２倍～約１８倍の間、約２倍～約１７倍の間、約２倍～約１６倍の間、約２倍～約１５倍の間、約２倍～約１４倍の間、約２倍～約１３倍の間、約２倍～約１２倍の間、約２倍～約１１倍の間、約２倍～約１０倍の間、約２倍～約９倍の間、約２倍～約８倍の間、約２倍～約７倍の間、約２倍～約６倍の間、約２倍～約５倍の間、約２倍～約４倍の間または約２倍～約３倍の間である。
【0124】
一部の実施形態では、本明細書に記載されているカプシドタンパク質のアミノ酸修飾は、被験体の眼における内境界膜（ＩＬＭ）を横切る対応する親または無修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンの能力と比較して、被験体の眼におけるＩＬＭを横切る能力の増加を付与することができる。
【0125】
一部の実施形態では、ＩＬＭを横切る能力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約１００％の増加である。一部の実施形態では、ＩＬＭを横切る能力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、約５％～約１００％の間、約５％～約９５％の間、約５％～約９０％の間、約５％～約８５％の間、約５％～約８０％の間、約５％～約７５％の間、約５％～約７０％の間、約５％～約６５％の間、約５％～約６０％の間、約５％～約５５％の間、約５％～約５０％の間、約５％～約４５％の間、約５％～約４０％の間、約５％～約３５％の間、約５％～約３０％の間、約５％～約２５％の間、約５％～約２０％の間、約５％～約１５％の間または約５％～約１０％の間の増加である。
【0126】
一部の実施形態では、ＩＬＭを横切る能力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍または少なくとも約２倍である。一部の実施形態では、ＩＬＭを横切る能力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍または少なくとも約１０倍である。一部の実施形態では、ＩＬＭを横切る能力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍または少なくとも約１００倍である。
【0127】
一部の実施形態では、ＩＬＭを横切る能力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、約１０倍～約１００倍の間、約１０倍～約９５倍の間、約１０倍～約９０倍の間、約１０倍～約８５倍の間、約１０倍～約８０倍の間、約１０倍～約７５倍の間、約１０倍～約７０倍の間、約１０倍～約６５倍の間、約１０倍～約６０倍の間、約１０倍～約５５倍の間、約１０倍～約５０倍の間、約１０倍～約４５倍の間、約１０倍～約４０倍の間、約１０倍～約３５倍の間、約１０倍～約３０倍の間、約１０倍～約２５倍の間、約１０倍～約２０倍の間または約１０倍～約１５倍の間である。
【0128】
一部の実施形態では、ＩＬＭを横切る能力の増加は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンと比較して、約２倍～約２０倍の間、約２倍～約１９倍の間、約２倍～約１８倍の間、約２倍～約１７倍の間、約２倍～約１６倍の間、約２倍～約１５倍の間、約２倍～約１４倍の間、約２倍～約１３倍の間、約２倍～約１２倍の間、約２倍～約１１倍の間、約２倍～約１０倍の間、約２倍～約９倍の間、約２倍～約８倍の間、約２倍～約７倍の間、約２倍～約６倍の間、約２倍～約５倍の間、約２倍～約４倍の間または約２倍～約３倍の間である。
【0129】
遺伝子療法の利点の１つは、タンパク質を投与する従来方法と比較して、本明細書に開示されている抗ＶＥＧＦ剤等、治療剤のより低頻度の投与を要求すること、また、治療剤の延長したまたは継続した放出をもたらすことである。目的の特異的組織または細胞型を標的とするベクター、例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８を利用する遺伝子療法は、オフターゲット効果を最小化する、または抗ＶＥＧＦ剤等の治療剤のより標的化された送達をもたらすこともできる。遺伝子療法によるｉｎ ｖｉｖｏでの抗ＶＥＧＦ剤の延長したまたは持続した送達により、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間またはそれよりも長い期間に１回以下、薬学的組成物を投与することができるであろう。
【0130】
治療剤
一部の実施形態では、遺伝子療法は、非ヒト霊長類またはヒト被験体の眼または眼の硝子体への投与に適したまたは適応された抗ＶＥＧＦ活性を有する治療用導入遺伝子の送達に使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載されているカプシドバリアント（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）を含むｒＡＡＶは、抗ＶＥＧＦ剤をコードする異種核酸配列を含み、被験体への硝子体内または網膜下注射の際に、網膜細胞への抗ＶＥＧＦ遺伝子の配列の送達に使用される。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ遺伝子を含むｒＡＡＶは、遺伝子療法および硝子体内注射のために製剤化される。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ遺伝子は、その機能的断片またはバリアントを指す。一部の実施形態では、ｓＦＬＴ－１、ラニビズマブまたはベバシズマブ等の抗ＶＥＧＦ剤の核酸配列は、直ちに利用できるそのアミノ酸配列に由来する。一部の実施形態では、ｓＦＬＴ－１、ラニビズマブまたはベバシズマブ等の抗ＶＥＧＦ剤の核酸配列を、さらにコドン最適化して、被験体におけるその発現を改善する。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤の核酸配列および／またはアミノ酸配列は、ｉｎ ｖｉｖｏでのその活性、発現、安定性および／または溶解度を増強するように修飾される。
一部の実施形態では、遺伝子療法は、非ヒト霊長類またはヒト被験体の眼または眼の硝子体への投与に適したまたは適応された抗ＶＥＧＦ活性を有する治療用導入遺伝子の送達に使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載されているカプシドバリアント（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）を含むｒＡＡＶは、抗ＶＥＧＦ剤をコードする異種核酸配列を含み、被験体への硝子体内または網膜下注射の際に、網膜細胞への抗ＶＥＧＦ遺伝子の配列の送達に使用される。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ遺伝子を含むｒＡＡＶは、遺伝子療法および硝子体内注射のために製剤化される。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ遺伝子は、その機能的断片またはバリアントを指す。一部の実施形態では、ｓＦＬＴ－１、ラニビズマブまたはベバシズマブ等の抗ＶＥＧＦ剤の核酸配列は、直ちに利用できるそのアミノ酸配列に由来する。一部の実施形態では、ｓＦＬＴ－１、ラニビズマブまたはベバシズマブ等の抗ＶＥＧＦ剤の核酸配列を、さらにコドン最適化して、被験体におけるその発現を改善する。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤の核酸配列および／またはアミノ酸配列は、ｉｎ ｖｉｖｏでのその活性、発現、安定性および／または溶解度を増強するように修飾される。
【0131】
コドン最適化は、本技術分野で公知のいずれかの方法により達成することができる。コドン最適化は、ネイティブアミノ酸配列を維持しつつ、ネイティブ配列の少なくとも１個のコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００個もしくはそれを超える、またはそれよりも多いコドン）を、宿主細胞においてより高頻度で使用されるまたは最も高頻度で使用されるコドンで置き換えることにより、目的の標的または宿主細胞、例えば、ヒト網膜細胞における遺伝子の発現増強のために核酸配列を修飾するプロセスを指す。例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｂｌｅ Ｔｏｏｌ、http://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table；Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ、http://www.kazusa.or.jp/codon/；およびNakamura, Y.ら「Codon usage tabulated from the international DNA
sequence databases: status for the year 2000」Nucl. Acids Res.２８巻：２９２頁（２０００年）を含む、コドン使用表を直ちに利用できる。
sequence databases: status for the year 2000」Nucl. Acids Res.２８巻：２９２頁（２０００年）を含む、コドン使用表を直ちに利用できる。
【0132】
一部の実施形態では、遺伝子療法においてコードされる抗ＶＥＧＦ剤のアミノ酸配列は、次の抗ＶＥＧＦ剤：ｓＦＬＴ－１、ラニビズマブまたはベバシズマブのうちいずれか１種のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％または１００％相同である。一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子療法またはｒＡＡＶにおいて使用される核酸配列は、ｓＦＬＴ－１、ラニビズマブまたはベバシズマブのうちいずれか１種のアミノ酸配列の対応するｃＤＮＡ配列と比較され、ｓＦＬＴ－１、ラニビズマブまたはベバシズマブのうちいずれか１種の核酸配列の間で少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％または１００％配列相同性を示す。一部の事例では、遺伝子療法から発現される抗ＶＥＧＦは、ｓＦＬＴ－１、ラニビズマブまたはベバシズマブのうちいずれか１種に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％または１００％空間的に相同である（例えば、その二次、三次および四次構造またはコンフォメーションの観点から）。一部の事例では、本明細書に開示されている薬学的組成物および方法の抗ＶＥＧＦ剤は、標準治療において使用されるｓＦＬＴ－１、ラニビズマブまたはベバシズマブのうちいずれか１種に対して、多くても８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％または１００％空間的に相同である（例えば、二次、三次および四次構造またはコンフォメーション）。
【0133】
一部の実例では、本明細書に開示されているカプシドバリアント（例えば、７ｍ８バリアント）を含むｒＡＡＶに基づく遺伝子療法に含まれる抗ＶＥＧＦ剤は、抗ＶＥＧＦ剤（例えば、ｓＦＬＴ－１、ラニビズマブまたはベバシズマブ）の対応するｃＤＮＡ配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％相同性を有するタンパク質、融合タンパク質またはポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法および薬学的組成物は、ｓＦＬＴ－１、ラニビズマブもしくはベバシズマブ、またはこれらの機能的断片もしくはバリアントもしくは変異体を含む。一部の実施形態では、ｓＦＬＴ－１、ラニビズマブまたはベバシズマブのいずれかの核酸配列は、ｉｎ ｖｉｖｏでのその活性、発現および／または溶解度を増強するように修飾またはコドン最適化される。
【0134】
一部の実施形態では、ＡＡＶ２．７ｍ８は、ｓＦＬＴ－１、ラニビズマブまたはベバシズマブのうちいずれか１種の遺伝子療法または送達系として使用される。ＡＡＶ２．７ｍ８－ｓＶＥＧＦＲ－１は、ＡＡＶ２のカプシドタンパク質ＶＰ１の位置５８７および５８８の間に７ｍ８挿入を含むｒＡＡＶ２、ならびにｓＶＥＧＦＲ－１をコードする核酸配列を指す。ＡＡＶ２．７ｍ８－ラニビズマブは、ＡＡＶ２のカプシドタンパク質ＶＰ１の位置５８７および５８８の間に７ｍ８挿入を含むｒＡＡＶ２、ならびにラニビズマブをコードする核酸配列を指す。
【0135】
本開示は、１種または複数の治療剤を含む本明細書に開示されている方法および薬学的組成物を考慮する。一部の実施形態では、治療剤は、抗ＶＥＧＦ剤である。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、ｒＡＡＶベクターもしくは遺伝子療法から発現される、またはｉｎ ｖｉｖｏで標的細胞、組織もしくは被験体に送達される。遺伝子療法は、延長した期間ｉｎ ｖｉｖｏで治療剤、例えば、抗ＶＥＧＦ剤を提供する利点を有し、これにより、タンパク質に基づく治療法の投与と比較して、反復注射の必要が減少される。遺伝子療法の斯かる利点は、ｉｎ ｖｉｖｏでの治療剤のより持続した送達をもたらすことができ、これにより、現在の標準治療を上回る改善がもたらされる。その上、遺伝子療法は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば標的細胞への、治療剤のより標的化された送達をもたらし、オフターゲット効果を最小化することもできる。
【0136】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子産物は、発現されると、被験体の眼における新血管形成の低下をもたらすことができるポリペプチドであり得る。一部の事例では、発現されるポリペプチドは、抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）タンパク質もしくはペプチドまたは血管新生阻害剤であり得る。
【0137】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子産物は、ＶＥＧＦを標的とするまたは少なくとも部分的に阻害することができる抗ＶＥＧＦ抗体またはその断片であり得る。一部の実例では、抗体は、可変領域およびＦｃ領域の両方を含む全長抗体であり得る。一部の実例では、抗体は、単鎖ｆｖ断片であり得る。一部の実例では、抗体は、ＶＥＧＦエピトープに対する定義される結合親和性を有することができる。一部の実例では、抗体は、少なくとも約１ｍＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約１００ｎＭ、少なくとも約１０ｎＭ、少なくとも約１ｎＭ、少なくとも約１００ｐＭ、少なくとも約１０ｐＭまたは少なくとも約１ｐＭのＫｄを有することができる。一部の実例では、抗ＶＥＧＦ剤は、対応する内在性ＶＥＧＦＲまたはＶＥＧＦよりも強く、内在性ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲに結合する。抗ＶＥＧＦ剤のより強い結合は、抗ＶＥＧＦ剤が、内在性ＶＥＧＦを隔離すること、または内在性ＶＥＧＦＲとの相互作用から内在性タンパク質を遮断することを可能にする。
【0138】
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、ヒト化モノクローナル抗体であり得る。一部の実例では、ヒト化モノクローナル抗体は、ｒｈｕＭａｂであり得る。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、ラニビズマブ、モノクローナル抗体断片、またはそれらのバリアントもしくは断片であり得る。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシズマブ、組換えヒト化モノクローナル抗体、またはそれらのバリアントもしくは断片であり得る。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、ＰＡＮ－９０８０６またはそのバリアントもしくは断片である。一部の実施形態では、治療剤は、本明細書に開示されている抗ＶＥＧＦ剤、例えば、抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、融合タンパク質、アプタマー等を含む１種または複数のポリペプチドをコードする核酸配列である。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、ＶＥＧＦに結合する可溶性受容体デコイである、またはｉｎ ｖｉｖｏでＶＥＧＦを隔離し得る１種または複数のＶＥＧＦ受容体の可溶型である。
【0139】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている治療剤は、アプタマー、干渉ＲＮＡ、ｍＲＮＡその他等、核酸であり得る。一部の事例では、アプタマーは、ペガプタニブであり得る。一部の実施形態では、治療剤は、ステロイドまたは小分子であり得る。一部の実例では、ステロイドは、コルチコステロイドであり得る。コルチコステロイドの例として、トリアムシノロン、デキサメタゾン、フルオシノロンアセトニド、コルチゾン、プレドニゾロン、フルオロメトロン（flumetholone）およびこれらの誘導体を挙げることができる。一部の実例では、ステロイドは、抗炎症性ステロイドであり得る。
【0140】
本開示の組換えウイルス、遺伝子療法、薬学的組成物および方法は、米国特許第５，７１２，３８０号、同第５，８６１，４８４号および同第７，０７１，１５９号に開示されており、米国特許出願公開第２０１４／０３７１４３８号にも記載されている、ＶＥＧＦ結合タンパク質またはその機能的断片が挙げられるがこれらに限定されない、抗ＶＥＧＦタンパク質をコードする配列を含むことができる。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦタンパク質は、本明細書に記載されているｓＦＬＴ－１タンパク質、ラニビズマブまたはベバシズマブを含む。
【0141】
一部の実施形態では、本開示の遺伝子療法、薬学的組成物および方法は、抗ＶＥＧＦタンパク質、例えば、ｓＦｌｔ－１をコードする配列を含むことができる。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤として、ｓＦｌｔ－１ドメイン２または配列の配列を含むｓＦｌｔ－１の機能的断片が挙げられるがこれに限定されない。抗ＶＥＧＦ剤は、当業者に理解される遺伝暗号、標準技法を使用した、配列または斯かる配列をコードするＤＮＡから発現されるポリペプチドを含むことができる。
【0142】
本明細書において、ｓＦｌｔ－１タンパク質またはポリペプチドが、ｉｎ ｖｉｖｏでＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦ受容体に結合するように、「ｓＦｌｔ－１タンパク質」または「ｓＦｌｔ」または「ｓＶＥＧＦＲ－１」は、ヒトｓＦＬＴ－１配列に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％相同性を有するポリペプチド配列またはその機能的断片もしくはバリアントを指すように互換的に使用されている。図２は、ｓＦｌｔ－１の核酸配列を例証する。相同性は、２配列間のアラインメントの残基の％保存を指す（例えば、天然に存在するヒトｓＦＬＴ－１タンパク質は、機能的断片、挿入、欠失、置換を含む配列、偽断片（ｐｓｅｕｄｏｆｒａｇｍｅｎｔ）、偽遺伝子、スプライスバリアントまたは人工的に最適化された配列が挙げられるがこれらに限定されない、ｓＦＬＴ－１のいずれか適したバリアントを含むことができる）。一部の事例では、「ｓＦＬＴ－１タンパク質」は、天然に存在するヒトｓＦＬＴ－１タンパク質配列に対して、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同である。一部の実施形態では、「ｓＦＬＴ－１タンパク質」は、天然に存在するヒトｓＦＬＴ－１タンパク質配列に対して、多くても約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同である。一部の事例では、「ｓＦＬＴ－１タンパク質」は、天然に存在するヒトｓＦＬＴ－１タンパク質コンフォメーションに対して、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％空間的に相同である。一部の事例では、「ｓＦＬＴ－１タンパク質」は、天然に存在するヒトｓＦＬＴ－１タンパク質コンフォメーションに対して、多くても約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％空間的に相同である。
【0143】
一部の事例では、可溶性トランケート型のＶＥＧＦ受容体ＦＬＴ－１であるｓＦＬＴ－１は、ＶＥＧＦの唯一の公知の内在性阻害剤である。ｓＦＬＴ－１は、選択的ＲＮＡスプライシングによって生成することができ、膜近位免疫グロブリン様ドメイン、膜貫通領域および細胞内チロシンキナーゼドメインを欠く。
【0144】
一部の事例では、ｓＦＬＴ－１を含む本明細書に開示されている遺伝子療法または薬学的組成物の投与は、内在性ＶＥＧＦを結合もしくは隔離することによって、またはＶＥＧＦ受容体ＦＬＴｔ－１およびＦＬＫ－１／ＫＤＲの膜貫通アイソフォームと不活性ヘテロ二量体を形成することによって、ｉｎ ｖｉｖｏでＶＥＧＦまたはその活性を阻害または低下させることができる。ｓＦＬＴ－１のこれらの特性は、その全体を参照により本明細書に組み込む、KendallおよびThomas、１９９３年；Proc Natl Acad. Sci.９０巻：１０７０５～１０７０９頁に記載されている。一部の実施形態では、全長タンパク質の代わりに、ｓＦＬＴ－１の機能的断片を使用することができる。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ結合ドメイン（ドメイン２）、またはＫＤＲもしくは別のファミリーメンバーを使用して、ＶＥＧＦを結合および不活性化することができる。
【0145】
一部の実施形態では、本開示の方法および薬学的組成物は、ベバシズマブもしくはラニビズマブ、それらの機能的断片もしくはバリアントである抗ＶＥＧＦ剤を含む。Catt Research, Group；Martin, DF；Maguire, MG；Ying, GS；Grunwald, JE；Fine, SL；Jaffe, GJ（２０１１年）「Ranibizumab and Bevacizumab for Neovascular Age-Related Macular Degeneration.」New England Journal of Medicine.３６４巻（２０号）：１８９７～１９０８頁。
【0146】
ラニビズマブ軽鎖および重鎖アミノ酸配列は、ＤｒｕｇＢａｎｋデータベース、受託番号ＤＢ０１２７０に公開されている：
【化1】
【0147】
ベバシズマブ軽鎖および重鎖アミノ酸配列は、ＤｒｕｇＢａｎｋデータベース、受託番号ＤＢ００１１２（ＢＴＤ０００８７、ＢＩＯＤ０００８７）に公開されている：
【化2】
【0148】
ベバシズマブは、全ＶＥＧＦ－Ａアイソフォームに結合し、ＶＥＧＦ－Ａを阻害することにより血管新生を遮断する、組換えヒト化モノクローナルＩｇＧ１抗体である。Los, M.；Roodhart, J. M. L.；Voest, E. E.（２００７年）「Target Practice: Lessons from Phase III Trials with Bevacizumab and Vatalanib in the Treatment of Advanced Colorectal Cancer」The Oncologist.１２巻（４号）：４４３～５０頁；Shih, T；Lindley, C（２００６年１１月）「Bevacizumab: an angiogenesis inhibitor for the treatment of solid malignancies.」Clinical therapeutics.２８巻（１１号）：１７７９～８０２頁。
【0149】
ラニビズマブは、組換えヒト化ＩｇＧ１カッパーアイソタイプモノクローナル抗体断片であり、ベバシズマブよりも高い親和性で全ＶＥＧＦ－Ａアイソフォームに結合する。ラニビズマブは、Ｆｃ領域を欠く。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、ベバシズマブもしくはラニビズマブまたはそれらの機能的断片もしくはバリアントである。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、アミノ酸および／または核酸（例えば、ｃＤＮＡ）配列において、ベバシズマブまたはラニビズマブに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％または１００％相同である。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、当該分野で公知のアミノ酸および／または核酸（例えば、ｃＤＮＡ）配列において、ベバシズマブまたはラニビズマブに対して多くても約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％または１００％相同である。一部の事例では、抗ＶＥＧＦ剤は、二次、三次または四次構造を含むベバシズマブまたはラニビズマブタンパク質コンフォメーションに対して、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％または１００％空間的に相同である。
【0150】
アミノ酸配列を考慮すれば、対応するｃＤＮＡまたは核酸配列を直ちに生成して、本明細書に開示されている遺伝子療法において使用することができる。アミノ酸配列を逆翻訳するための方法は、http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/で利用できるＥＭＢＯＳＳ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｃｋ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｔｏｏｌを含む。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤の核酸配列は、本技術分野で公知の技法のいずれか、例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｂｌｅ
Ｔｏｏｌ、http://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table；Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ、http://www.kazusa.or.jp/codon/；およびNakamura, Y.
ら「Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases:
status for the year 2000」Nucl. Acids Res.２８巻：２９２頁（２０００年）を使用してコドン最適化される。
Ｔｏｏｌ、http://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table；Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ、http://www.kazusa.or.jp/codon/；およびNakamura, Y.
ら「Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases:
status for the year 2000」Nucl. Acids Res.２８巻：２９２頁（２０００年）を使用してコドン最適化される。
【0151】
薬学的組成物
一部の実施形態では、薬学的組成物は、１種または複数の活性成分、例えば、抗ＶＥＧＦ剤またはその断片もしくはバリアントをコードする核酸配列を含むＡＡＶ２．７ｍ８と共に、所望の治療または予防的効果を達成するための硝子体内または網膜下注射によるヒト患者への投与に適した１種または複数の賦形剤、担体、安定剤または増量剤を含有する製剤である。
一部の実施形態では、薬学的組成物は、１種または複数の活性成分、例えば、抗ＶＥＧＦ剤またはその断片もしくはバリアントをコードする核酸配列を含むＡＡＶ２．７ｍ８と共に、所望の治療または予防的効果を達成するための硝子体内または網膜下注射によるヒト患者への投与に適した１種または複数の賦形剤、担体、安定剤または増量剤を含有する製剤である。
【0152】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶまたはＡＡＶ２．７ｍ８および抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸配列を含む薬学的組成物は、再構成された溶液または懸濁物として供給される。他の実施形態では、ｒＡＡＶまたはＡＡＶ２．７ｍ８および抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸配列を含む薬学的組成物は、凍結乾燥形態で供給され、患者への投与前に再構成される。一部の実施形態では、本明細書に開示されている眼疾患または状態の処置または予防方法は、ｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）および抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸配列を含む凍結乾燥された薬学的組成物を緩衝液に先ず再構成、溶解または可溶化するステップを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）および本明細書に開示されている抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸配列を含む斯かる凍結乾燥された薬学的組成物は、凍結保護物質、界面活性物質、塩、安定剤またはこれらのいずれかの組み合わせをさらに含むことができる。
【0153】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶまたはＡＡＶ２．７ｍ８および抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸配列を含む薬学的組成物は、懸濁物として供給される。一部の実施形態では、懸濁物は冷蔵される。一部の実施形態では、懸濁物は溶液である。一部の実施形態では、薬学的組成物を含有する均質な溶液が、予め充填されたシリンジとして供給される。一部の実施形態では、本明細書に開示されている薬学的組成物は、懸濁物として供給される。一部の実施形態では、懸濁物は冷蔵される。一部の実施形態では、本明細書に開示されている眼疾患または状態の処置または予防方法は、患者への投与または硝子体内注射前に均一な分布を確実にするために、冷蔵された懸濁物を室温に温めるステップ、および／または懸濁物を撹拌するステップを含む。一部の実施形態では、懸濁物は、患者への投与前に希釈される。一部の実施形態では、斯かる薬学的組成物は、界面活性物質、塩、安定剤またはこれらのいずれかの組み合わせを含む。一部の実施形態では、薬学的組成物を含有する懸濁物は、予め充填されたシリンジとして供給される。
【0154】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子療法または薬学的組成物は、懸濁物または冷蔵された懸濁物として提供される。一部の実施形態では、懸濁物は、薬学的に許容される賦形剤、例えば、界面活性物質、グリセロール、非イオン性界面活性物質、緩衝液、グリコール、塩およびこれらのいずれかの組み合わせを含む。一部の実施形態では、塩酸および水酸化ナトリウムを使用して、溶液のｐＨを調整する。一部の実施形態では、冷蔵された懸濁物は、中性ｐＨ、または６．５～７．５の間のｐＨである。一部の実施形態では、冷蔵された懸濁物のｐＨは、やや塩基性（例えば、ｐＨ約７．５、８、８．２、８．４、８．５または９）である。一部の実施形態では、冷蔵された懸濁物または溶液のｐＨは、やや酸性（例えば、ｐＨ約６．５、６．３、６．１、６、５．５または５）である。一部の実施形態では、冷蔵された懸濁物は、溶液である。一部の実施形態では、冷蔵された懸濁物は、ミセルを含む。一部の実施形態では、冷蔵された懸濁物は、投与前に撹拌される。
【0155】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）および本明細書に開示されている抗ＶＥＧＦ剤を含む遺伝子療法は、本明細書に開示されている凍結乾燥またはフリーズドライされた薬学的組成物と、凍結乾燥された薬学的組成物を溶解、希釈または再構成するための緩衝溶液とを含むキットとして供給される。一部の実施形態では、キットは、ｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）を含むフリーズドライまたは凍結乾燥された薬学的組成物と、所望の濃度または容量に薬学的組成物を再構成するための溶液とを含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に開示されている薬学的組成物の再構成の際の凝集防止に役立つ緩衝液を含む。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤を含む遺伝子療法は、懸濁物として提供される。一部の実施形態では、薬学的組成物は、予め充填されたシリンジ内に提供される。一部の実施形態では、キットは、デュアルチャンバーシリンジを含み、チャンバーの一方は、薬学的組成物を溶解または希釈するための緩衝液を含有する。
【0156】
一部の実施形態では、キットは、注射のためのシリンジを含む。一部の実施形態では、再構成された溶液は、投与前に濾過される。一部の実施形態では、キットは、患者への投与前にキットにおける薬学的組成物を濾過するためのフィルターまたはフィルターシリンジを含む。
【0157】
一部の実施形態では、貯蔵安定性および取扱いの利便性のため、ｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）および本明細書に開示されている抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸配列を含む薬学的組成物は、被験体への投与に先立ち食塩水、緩衝液または水で再構成され得る、凍結乾燥（すなわち、フリーズドライ）または真空乾燥された粉末として製剤化することができる。代わりに、薬学的組成物は、水性溶液または懸濁物として製剤化することができる。薬学的組成物は、本明細書に開示されている抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸配列を含むｒＡＡＶビリオンまたは粒子を含有することができる。一部の実施形態では、異なるウイルスまたは送達系、例えば、ナノ粒子または脂質に基づく複合体を使用して、本明細書に開示されている抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸配列を送達することができる。リン酸塩、ＰＢＳもしくはＴｒｉｓ緩衝液、グリコール、グリセロール、食塩水、界面活性物質（例えば、プルロニックまたはポリソルベート）またはこれらのいずれかの組み合わせ等、様々な賦形剤を使用して、薬学的組成物を安定化することができる。その上、アルコール、ＤＭＳＯ、グリセロールおよびＰＥＧ等の凍結保護物質は、凍結乾燥の凍結もしくは乾燥条件下における安定剤として使用することができる、または冷蔵された懸濁物を作製するための安定剤として使用することができる。
【0158】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている抗ＶＥＧＦ遺伝子療法を含む凍結乾燥された薬学的組成物または薬学的組成物の懸濁物は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００μＬの容量（または再構成された容量）を有する。一部の実施形態では、本明細書に開示されている抗ＶＥＧＦ遺伝子療法を含む凍結乾燥または懸濁物形態の薬学的組成物は、０．１～０．５ｍＬの間、０．１～０．２ｍＬの間、０．３～０．５ｍＬの間、０．５～１．０ｍＬの間、０．５～０．７ｍＬの間、０．６～０．８ｍＬの間、０．８～１ｍＬの間、０．９～１．１ｍＬの間、１．０～１．２の間または１．０～１．５ｍＬの間の容量を有する。他の実施形態では、再構成された容量は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４または１．５ｍＬ以下である。
【0159】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている薬学的組成物は、硝子体内または網膜下注射による霊長類（例えば、非ヒト霊長類およびヒト被験体）への投与のために設計、操作または適応される。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸配列を含むｒＡＡＶビリオンを含む薬学的組成物は、被験体の眼への硝子体内注射のために製剤化される。一部の実施形態では、薬学的組成物は、約２、２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００μＬ以下の容量の硝子体内注射を可能にする濃度へと製剤化される。一部の実施形態では、本明細書に開示されている処置方法は、本明細書に開示されている抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸配列を含むｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８）を含む溶液または懸濁物の約２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０μＬの容量の硝子体内注射を含む。
【0160】
一部の実例では、本明細書に記載されている抗ＶＥＧＦ導入遺伝子の核酸配列を含むＡＡＶ２．７ｍ８ビリオンは、遺伝子療法薬学的組成物の構成成分であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されている７ｍ８バリアントカプシドタンパク質を含むいずれかの血清型のｒＡＡＶビリオンを使用して、凍結乾燥された薬学的組成物または薬学的組成物の懸濁物を作製することができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶビリオンは、ｒＡＡＶ２である。一部の実施形態では、凍結乾燥形態または懸濁物形態の薬学的組成物は、７ｍ８バリアントカプシドタンパク質および本明細書に開示されている抗ＶＥＧＦ剤をコードするＤＮＡ配列を有するｒＡＡＶ２を含む。
【0161】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている薬学的組成物は、ヒト患者または非ヒト霊長類における治療剤としての抗ＶＥＧＦ剤の遺伝子療法または硝子体内送達に適応される。一部の実施形態では、薬学的組成物の単位用量は、１×１０１０～１×１０１３の間のウイルスゲノム（ｖｇ）を含む。一部の実施形態では、単位用量は、約２．１×１０１１、約２．１×１０１２または約２．１×１０１３のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、１×１０１０～３×１０１２のベクターゲノムである。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、１×１０９～３×１０１３のベクターゲノムである。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、１×１０１０～１×１０１１のベクターゲノムである。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、１×１０８～３×１０１４のベクターゲノムである。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、少なくとも１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７または１×１０１８のベクターゲノムである。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、１×１０１０～５×１０１３のベクターゲノムである。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、多くても約１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７および１×１０１８のベクターゲノムである。
【0162】
一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、ｐｆｕ（プラーク形成単位）として測定することができる。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量のｐｆｕは、約１×１０８～約１×１０１２ｐｆｕであり得る。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量のｐｆｕは、少なくとも約１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１または１×１０１２ｐｆｕであり得る。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量のｐｆｕは、多くても約１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１または１×１０１２ｐｆｕであり得る。
【0163】
一部の事例では、本開示のウイルスベクターは、ベクターゲノム（ｖｇ）として測定することができる。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、１×１０１０～１×１０１３のベクターゲノムであり得る。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、１×１０９～１×１０１４のベクターゲノムであり得る。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、１×１０１０～１×１０１１のベクターゲノムであり得る。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、１×１０８～１×１０１５のベクターゲノムであり得る。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、少なくとも１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７および１×１０１８のベクターゲノムである。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、１×１０８～１×１０１５のベクターゲノムである。一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、多くても約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７および１×１０１８のベクターゲノムである。一部の実施形態では、単位用量は、１０１０～１０１１の間、１０１１～１０１２の間、１０１０～１０１２の間、１０１２～１０１３の間、１０１１～１０１３の間、１０１２～１０１３の間、１０１２～１０１４の間、１０１１～１０１４の間、１０１１～１０１５の間、１０１２～１０１５の間、１０１３～１０１４の間、１０１４～１０１５の間、１０１５～１０１６の間、１０１６～１０１７の間、１０１７～１０１８の間、１０１８～１０１９の間または１０１９～１０２０の間のベクターゲノムである。
【0164】
一部の実施形態では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、１×１０１０～２×１０１０の間、２×１０１０～３×１０１０の間、３×１０１０～４×１０１０の間、４×１０１０～５×１０１０の間、５×１０１０～６×１０１０の間、６×１０１０～７×１０１０の間、７×１０１０～８×１０１０の間、８×１０１０～９×１０１０の間、９×１０１０～１０×１０１０の間、１×１０１１～２×１０１１の間、２×１０１１～３×１０１１の間、２×１０１１～２．５×１０１１の間、２．５×１０１１～３×１０１１の間、３×１０１１～４×１０１１の間、４×１０１１～５×１０１１の間、５×１０１１～６×１０１１の間、６×１０１１～７×１０１１の間、７×１０１１～８×１０１１の間、８×１０１１～９×１０１１の間、９×１０１１～１０×１０１１の間、１×１０１２～２×１０１２の間、２×１０１２～３×１０１２の間、２．５×１０１２～３×１０１２の間、３×１０１２～４×１０１２の間、４×１０１２～５×１０１２の間、５×１０１２～６×１０１２の間、６×１０１２～７×１０１２の間、７×１０１２～８×１０１２の間、８×１０１２～９×１０１２の間、９×１０１２～１０×１０１２の間、１×１０１３～２×１０１３の間、２×１０１３～３×１０１３の間、３×１０１３～４×１０１３の間、４×１０１３～５×１０１３の間、５×１０１３～６×１０１３の間、６×１０１３～７×１０１３の間、７×１０１３～８×１０１３の間、８×１０１３～９×１０１３の間または９×１０１３～１０×１０１３の間のベクターゲノムである。
【0165】
一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶの単位用量は、２×１０１１～８×１０１１の間または２×１０１２～８×１０１２の間のベクターゲノムである。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶの単位用量は、１０１０～１０１３の間、１０１０～１０１１の間、１０１１～１０１２の間、１０１２～１０１３の間または１０１３～１０１４の間のベクターゲノムである。
【0166】
一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶの単位用量は、１×１０１０～２×１０１０の間、２×１０１０～４×１０１０の間、３×１０１０～５×１０１０の間、４×１０１０～６×１０１０の間、５×１０１０～７×１０１０の間、６×１０１０～８×１０１０の間、７×１０１０～９×１０１０の間、８×１０１０～１０１１の間、１×１０１１～２×１０１１の間、２×１０１１～４×１０１１の間、３×１０１１～５×１０１１の間、４×１０１１～６×１０１１の間、５×１０１１～７×１０１１の間、６×１０１１～８×１０１１の間、７×１０１１～９×１０１１の間、８×１０１１～１０×１０１１の間、１×１０１２～３×１０１２の間、２×１０１２～４×１０１２の間、３×１０１２～５×１０１２の間、４×１０１２～６×１０１２の間、５×１０１２～７×１０１２の間、６×１０１２～８×１０１２の間、７×１０１２～９×１０１２の間、８×１０１２～１０×１０１２の間、１×１０１３～５×１０１３の間、５×１０１３～１０×１０１３の間、１０１２～５×１０１２の間、５×１０１２～１×１０１３の間、７×１０１２～１×１０１３の間、８×１０１２～２×１０１３の間、９×１０１２～２×１０１３の間、９×１０１２～２×１０１３の間、９×１０１２～４×１０１３の間、１×１０１３～３×１０１３の間、１×１０１３～２×１０１３の間、２×１０１３～３×１０１３の間、３×１０１３～４×１０１３の間、４×１０１３～５×１０１３の間、５×１０１３～６×１０１３の間、６×１０１３～７×１０１３の間、７×１０１３～８×１０１３の間、８×１０１３～９×１０１３の間または８×１０１３～１×１０１４の間のベクターゲノムである。
【0167】
一部の実施形態では、凝集を回避するために、より低い量または範囲のベクターゲノムが単位用量に選択される。一部の実施形態では、より少ない容量を注射に使用することができるように、より高い量または範囲のベクターゲノムが単位用量に選択される。より少ない容量（例えば、５０、４０、３０、２０、１０または５μＬ未満）の注射は、眼圧の変化および硝子体内注射に伴う他の有害作用の低下に役立つことができる。一部の実施形態では、より高濃度のｒＡＡＶは、標的細胞への治療用導入遺伝子の効率的送達を確実にするためにも役立つ。
【0168】
一部の実施形態では、単位用量は、２Ｅ１２～６Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、単位用量は、約１Ｅ１２、１．５Ｅ１２、２Ｅ１２、２．５Ｅ１２、３Ｅ１２、３．５Ｅ１２、４Ｅ１２、４．５Ｅ１２、５Ｅ１２、５．５Ｅ１２、６Ｅ１２、６．５Ｅ１２、７Ｅ１２、７．５Ｅ１２、８Ｅ１２、８．５Ｅ１２、９Ｅ１２または９．５Ｅ１２のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、単位用量は、１Ｅ１２～１．５Ｅ１２の間、１．５Ｅ１２～２Ｅ１２の間、２Ｅ１２～２．５Ｅ１２の間、２．５Ｅ１２～３．０Ｅ１２の間、３．０Ｅ１２～３．５Ｅ１２の間、３．５Ｅ１２～４．０Ｅ１２の間、４．０Ｅ１２～４．５Ｅ１２の間、４．５Ｅ１２～５．０Ｅ１２の間、５．０Ｅ１２～５．５Ｅ１２の間、５．５Ｅ１２～６．０Ｅ１２の間、６．０Ｅ１２～６．５Ｅ１２の間、６．５Ｅ１２～７．０Ｅ１２の間、７．０Ｅ１２～７．５Ｅ１２の間、７．５Ｅ１２～８．０Ｅ１２の間、８．０Ｅ１２～８．５Ｅ１２の間、８．５Ｅ１２～９．０Ｅ１２の間、９．０Ｅ１２～９．５Ｅ１２の間または９．５Ｅ１２～１０Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、単位用量は、少なくとも１Ｅ１２、１．５Ｅ１２、２Ｅ１２、２．５Ｅ１２、３Ｅ１２、３．５Ｅ１２、４Ｅ１２、４．５Ｅ１２、５Ｅ１２、５．５Ｅ１２、６Ｅ１２、６．５Ｅ１２、７Ｅ１２、７．５Ｅ１２、８Ｅ１２、８．５Ｅ１２、９Ｅ１２または９．５Ｅ１２のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、単位用量は、１Ｅ１２、１．５Ｅ１２、２Ｅ１２、２．５Ｅ１２、３Ｅ１２、３．５Ｅ１２、４Ｅ１２、４．５Ｅ１２、５Ｅ１２、５．５Ｅ１２、６Ｅ１２、６．５Ｅ１２、７Ｅ１２、７．５Ｅ１２、８Ｅ１２、８．５Ｅ１２、９Ｅ１２または９．５Ｅ１２以下のベクターゲノムを含む。
【0169】
一部の事例では、本開示の薬学的組成物の単位用量は、感染多重度（ＭＯＩ）を使用して測定することができる。一部の事例では、ＭＯＩは、核酸（nucleic）が送達され得る
細胞に対するベクターまたはウイルスゲノムの比または倍数を指すことができる。一部の事例では、ＭＯＩは、１×１０６であり得る。一部の事例では、ＭＯＩは、約１×１０５～約１×１０７の間であり得る。一部の事例では、ＭＯＩは、１×１０４～１×１０８であり得る。一部の事例では、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７および１×１０１８ＭＯＩであり得る。一部の事例では、本開示の組換えウイルスは、約１×１０８～約１×１０１５ＭＯＩであり得る。一部の事例では、本開示の組換えウイルスは、多くても約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７および１×１０１８ＭＯＩであり得る。一部の実施形態では、ＭＯＩは、１×１０１０～２×１０１０の間、２×１０１０～４×１０１０の間、３×１０１０～５×１０１０の間、４×１０１０～６×１０１０の間、５×１０１０～７×１０１０の間、６×１０１０～８×１０１０の間、７×１０１０～９×１０１０の間、８×１０１０～１０１１の間、１×１０１１～２×１０１１の間、２×１０１１～４×１０１１の間、３×１０１１～５×１０１１の間、４×１０１１～６×１０１１の間、５×１０１１～７×１０１１の間、６×１０１１～８×１０１１の間、７×１０１１～９×１０１１の間、８×１０１１～１０×１０１１の間、１×１０１２～３×１０１２の間、２×１０１２～４×１０１２の間、３×１０１２～５×１０１２の間、４×１０１２～６×１０１２の間、５×１０１２～７×１０１２の間、６×１０１２～８×１０１２の間、７×１０１２～９×１０１２の間、８×１０１２～１０×１０１２の間、１×１０１３～５×１０１３の間、５×１０１３～１０×１０１３の間、１０１２～５×１０１２の間、５×１０１２～１×１０１３の間、７×１０１２～１×１０１３の間、８×１０１２～２×１０１３の間、９×１０１２～２×１０１３の間、９×１０１２～２×１０１３の間、９×１０１２～４×１０１３の間、１×１０１３～３×１０１３の間、１×１０１３～２×１０１３の間、２×１０１３～３×１０１３の間、３×１０１３～４×１０１３の間、４×１０１３～５×１０１３の間、５×１０１３～６×１０１３の間、６×１０１３～７×１０１３の間、７×１０１３～８×１０１３の間、８×１０１３～９×１０１３の間または８×１０１３～１×１０１４の間である。
細胞に対するベクターまたはウイルスゲノムの比または倍数を指すことができる。一部の事例では、ＭＯＩは、１×１０６であり得る。一部の事例では、ＭＯＩは、約１×１０５～約１×１０７の間であり得る。一部の事例では、ＭＯＩは、１×１０４～１×１０８であり得る。一部の事例では、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７および１×１０１８ＭＯＩであり得る。一部の事例では、本開示の組換えウイルスは、約１×１０８～約１×１０１５ＭＯＩであり得る。一部の事例では、本開示の組換えウイルスは、多くても約１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７および１×１０１８ＭＯＩであり得る。一部の実施形態では、ＭＯＩは、１×１０１０～２×１０１０の間、２×１０１０～４×１０１０の間、３×１０１０～５×１０１０の間、４×１０１０～６×１０１０の間、５×１０１０～７×１０１０の間、６×１０１０～８×１０１０の間、７×１０１０～９×１０１０の間、８×１０１０～１０１１の間、１×１０１１～２×１０１１の間、２×１０１１～４×１０１１の間、３×１０１１～５×１０１１の間、４×１０１１～６×１０１１の間、５×１０１１～７×１０１１の間、６×１０１１～８×１０１１の間、７×１０１１～９×１０１１の間、８×１０１１～１０×１０１１の間、１×１０１２～３×１０１２の間、２×１０１２～４×１０１２の間、３×１０１２～５×１０１２の間、４×１０１２～６×１０１２の間、５×１０１２～７×１０１２の間、６×１０１２～８×１０１２の間、７×１０１２～９×１０１２の間、８×１０１２～１０×１０１２の間、１×１０１３～５×１０１３の間、５×１０１３～１０×１０１３の間、１０１２～５×１０１２の間、５×１０１２～１×１０１３の間、７×１０１２～１×１０１３の間、８×１０１２～２×１０１３の間、９×１０１２～２×１０１３の間、９×１０１２～２×１０１３の間、９×１０１２～４×１０１３の間、１×１０１３～３×１０１３の間、１×１０１３～２×１０１３の間、２×１０１３～３×１０１３の間、３×１０１３～４×１０１３の間、４×１０１３～５×１０１３の間、５×１０１３～６×１０１３の間、６×１０１３～７×１０１３の間、７×１０１３～８×１０１３の間、８×１０１３～９×１０１３の間または８×１０１３～１×１０１４の間である。
【0170】
眼での使用に適した薬学的組成物は、無菌注射用溶液、懸濁物または分散物の即時調製のための無菌水性溶液または分散物および無菌粉末を含む。硝子体内投与のため、適した担体は、生理食塩水、静菌水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）および／または等張剤（isotonic agent）、例えば、グリセロールを含む。全事例では、薬学的組成物は、無菌でな
ければならず、容易にシリンジ使用可能（syringability）または注射可能（injectability）である程度まで流動性であるべきである。薬学的組成物は、製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および真菌等の微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。一部の実施形態では、薬学的組成物は、塩またはグリセロール等、等張剤を含むことができる。一部の実施形態では、界面活性物質または安定剤を薬学的組成物に添加して、凝集を防止する。
ければならず、容易にシリンジ使用可能（syringability）または注射可能（injectability）である程度まで流動性であるべきである。薬学的組成物は、製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および真菌等の微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。一部の実施形態では、薬学的組成物は、塩またはグリセロール等、等張剤を含むことができる。一部の実施形態では、界面活性物質または安定剤を薬学的組成物に添加して、凝集を防止する。
【0171】
一部の実例では、賦形剤は、担体であり得る。担体は、例えば、水、食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールその他）およびこれらのいずれかの組み合わせを含有する溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチン等のコーティングの使用により、分散物の場合は要求される粒子サイズの維持により、ならびにポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ（商標）、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０）、ドデシル硫酸ナトリウム（ラウリル硫酸ナトリウム）、ラウリルジメチルアミンオキシド、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、ポリエトキシ化アルコール、ポリオキシエチレンソルビタン、オクトキシノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（商標））、Ｎ，Ｎ－ジメチルドデシルアミン－Ｎ－オキシド、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＨＴＡＢ）、ポリオキシル１０ラウリルエーテル、Ｂｒｉｊ ７２１（商標）、胆汁酸塩（デオキシコール酸ナトリウム、コール酸ナトリウム）、プルロニック酸（Ｆ－６８、Ｆ－１２７）、ポリオキシルヒマシ油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（商標））ノニルフェノールエトキシレート（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標））、シクロデキストリンおよび塩化エチルベンゼトニウム（Ｈｙａｍｉｎｅ（商標））等の界面活性物質の使用により、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、クレゾール、アスコルビン酸、チメロサールその他によって達成することができる。多くの場合、組成物に等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい可能性がある。内部組成物の延長した吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによってもたらされ得る。一部の実施形態では、薬学的担体は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ポリソルベートおよびスクロースを含む。一部の実施形態では、薬学的組成物は、ポリソルベート、ポロクサマーまたはプルロニック等、界面活性物質、例えば、非イオン性界面活性物質を含む。一部の実施形態では、非イオン性界面活性物質の添加は、懸濁物または溶液における凝集を低下させる。
【0172】
一部の実施形態では、本開示に有用な薬学的組成物は、キット中に包装して、本開示の適用を容易にすることができる。一部の態様では、本方法は、本開示の組換え核酸（例えば、抗ＶＥＧＦ剤の核酸配列を含むｒＡＡＶ）を含むキットを提供する。一部の態様では、本方法は、本開示の凍結乾燥形態の組換えウイルスおよび患者への投与前にウイルスを再構成するための溶液を含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、本開示の懸濁物形態の組換えウイルスおよび懸濁物を希釈するための溶液を含む。一部の実施形態では、懸濁物は、予め充填されたシリンジとして供給される。一部の実施形態では、懸濁物またはそのキットは、冷蔵されている。一部の実施形態では、懸濁物は、投与前に室温に温められる。一部の実施形態では、懸濁物は、投与前に均一な分布を確実にするために撹拌される。
【0173】
一部の実施形態では、キットは、本明細書に提供される組換えウイルスと、組換えウイルスの治療有効量で被験体の眼または網膜細胞に投与するための指示とを含む。一部の態様では、キットは、組換えウイルスを投与するための薬学的に許容される塩または溶液を含む。任意選択で、キットは、ラベルまたは別個の挿入物の形態の、適した操作上のパラメータのための指示をさらに含むことができる。例えば、キットは、溶液もしくは懸濁物から単位用量の組換えウイルスを調製するおよび／または凍結乾燥された組成物をどのように再構成するかを医師または研究室の技術者に知らせる標準的な指示を有することができる。一部の実施形態では、任意選択で、キットは、シリンジ、フィルターニードル、延長チューブ、カニューレまたは網膜下注射器等、投与のためのデバイスをさらに含む。
【0174】
一部の実施形態では、薬学的組成物は、冷蔵された懸濁物として提供される。一部の実施形態では、冷蔵された懸濁物は、シリンジおよび／または希釈用緩衝液を含み得るキット中に提供される。一部の実施形態では、冷蔵された懸濁物は、予め充填されたシリンジとして提供される。
【0175】
一部の実施形態では、いずれか適した方法を、本明細書に記載されている薬学的組成物における使用のための組換えウイルス（例えば、ｒＡＡＶ）の生化学的精製において使用することができる。組換えＡＡＶウイルスは、直接的に細胞からまたは細胞を含む培養培地から収集することができる。ウイルスは、ｒＡＡＶウイルスの懸濁物を凍結乾燥または作製する前に、ゲル濾過、濾過、クロマトグラフィー、親和性精製、勾配超遠心分離またはサイズ排除方法等、様々な生化学的手段を使用して精製することができる。
【0176】
適応症
一部の事例では、本明細書に記載されているバリアントカプシドタンパク質および治療用導入遺伝子を含むいずれかの血清型のｒＡＡＶビリオン、またはその薬学的組成物は、眼の新血管形成またはＣＮＶに関連する眼状態または疾患を少なくとも部分的に好転させることができる。一部の実施形態では、カプシドバリアントタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンは、ヒト被験体の眼への抗ＶＥＧＦ導入遺伝子の送達に使用される。
一部の事例では、本明細書に記載されているバリアントカプシドタンパク質および治療用導入遺伝子を含むいずれかの血清型のｒＡＡＶビリオン、またはその薬学的組成物は、眼の新血管形成またはＣＮＶに関連する眼状態または疾患を少なくとも部分的に好転させることができる。一部の実施形態では、カプシドバリアントタンパク質を含むｒＡＡＶビリオンは、ヒト被験体の眼への抗ＶＥＧＦ導入遺伝子の送達に使用される。
【0177】
本明細書に記載されている遺伝子療法または薬学的組成物の適応症は、新生血管（滲出型）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、網膜静脈閉塞およびＤＭＥ患者における糖尿病性網膜症（ＤＲ）を含む。一部の事例では、本明細書に開示されている方法および薬学的組成物を使用して、抗ＶＥＧＦ導入遺伝子が承認されたまたは適応となる眼状態または疾患を予防または処置することができる。一部の実施形態では、遺伝子療法（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８に基づく遺伝子療法）を使用して、ＣＮＶ、滲出型ＡＭＤ、乾性ＡＭＤ、ＲＶＯ後の黄斑浮腫、ＤＭＥ、およびＤＭＥ患者における糖尿病性網膜症が挙げられるがこれらに限定されない、眼状態／疾患のための少なくとも１種の現在の標準治療に対して応答性である眼状態または疾患を処置または予防する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ遺伝子療法を使用して、新血管形成またはＣＮＶによって特徴付けられるいずれかの眼状態または障害を処置または予防する。別の態様では、本開示は、例えば：ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＲＶＯ、血管新生関連疾患、がん、自己免疫性疾患、感染性疾患生物その他等の疾患の処置のための本明細書に提供される薬学的組成物を提供する。
【0178】
一部の実施形態では、眼状態は、糖尿病性黄斑浮腫であり得る。糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）は、黄斑内の血管からの流体の漏出による、真性糖尿病における網膜の腫脹である。黄斑は、網膜の中心部分であり、これは、色を検出する特殊化された神経終末である錐体が豊富な小区域であり、昼間視力は錐体に依存する。黄斑浮腫が発達するにつれて、中心視野の中央またはすぐ横でぼやけが起こる。糖尿病性黄斑浮腫による失明は、数カ月間の期間にわたり進行し、明瞭に焦点を合わせることを不可能にし得る。ＤＭＥの一般的症状は、霧視、飛蚊症、複視であり、処置せずにおくと最終的に盲目となる。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法および薬学的組成物は、ＤＭＥの処置に使用される。
【0179】
一部の実施形態では、眼状態は、網膜静脈閉塞であり得る。網膜静脈閉塞は、網膜から血液を運び出す小さい静脈の遮断である。網膜は、光の像を神経シグナルに変換し、これを脳に送る、眼の内側の背部にある組織の層である。網膜静脈閉塞は、ほとんどの場合、動脈の硬化（アテローム性動脈硬化）および血餅の形成に起因する。網膜におけるより小さい静脈（分枝状静脈またはＢＲＶＯ）の遮断は、多くの場合、アテローム性動脈硬化によって肥厚または硬化した網膜動脈が交差し、網膜静脈に圧力をかける場所で起こる。網膜静脈閉塞の症状は、片眼の全体または一部における突発性のぼやけまたは視力喪失を含むことができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法および薬学的組成物は、網膜静脈閉塞の処置に使用される。
【0180】
一部の実施形態では、眼状態は、滲出型ＡＭＤとしても公知の、脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）であり得る。脈絡膜新血管形成は、ブルッフ膜における破損を通した、網膜色素上皮下（ｓｕｂ－ＲＰＥ）または網膜下腔への、脈絡膜に起源をもつ新たな血管の成長を伴う場合があり、これは、失明の主原因となり得る。ＣＮＶは、数週間以内に認められる、中心視の突発性の増悪を生じることができる。起こり得る他の症状は、色覚障害および変形視症（直線が波形に見える歪み）を含む。新たな血管の出血は、ＣＮＶの症状の発病を加速することができる。ＣＮＶは、眼の奥の圧迫感を含むこともできる。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法および薬学的組成物は、新血管形成に関連するＣＮＶまたは眼状態の処置に使用される。
【0181】
進行型の「滲出型」形態（新生血管または滲出性）のＡＭＤは、より一般的でないが、患者における中心視の急速で多くの場合実質的な喪失を高頻度で引き起こすことがある。滲出型形態のＡＭＤにおいて、脈絡膜新血管形成は、網膜色素上皮の下およびそれを通って成長し得る血管のネットワークを形成および発達させる。これは、網膜下腔への血漿の漏出および／または出血を伴うため、黄斑において起こる場合、中心視の重篤な突発性の喪失が存在し得る。用語「ＡＭＤ」は、他に明記されていなければ、乾性ＡＭＤまたは滲出型ＡＭＤのいずれかであり得る。本開示は、ＡＭＤ、滲出型ＡＭＤおよび／または乾性ＡＭＤの処置または予防を考慮する。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法および薬学的組成物は、ＡＭＤの処置に使用される。
【0182】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法および薬学的組成物は、ラニビズマブまたはベバシズマブ等の現在の標準治療または承認された治療法のうち少なくとも１種に対して応答性である眼疾患または状態の予防または処置に使用される。一部の実施形態では、患者は、抗ＶＥＧＦ遺伝子療法の投与を受けるまたはそれに適格となる前に、ラニビズマブ、ベバシズマブ、および眼疾患もしくは状態のための他のいずれかの承認された治療薬のうちいずれか１種またはこれらの任意の組み合わせで前処置されている。
【0183】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法および薬学的組成物、すなわち、抗ＶＥＧＦ剤を含むＡＡＶ遺伝子療法は、カラー眼底写真撮影によるＣＮＶ形成後のグレードＩＶ病変のパーセンテージによって測定された場合に、ビヒクルまたは緩衝液対照と比較して、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％の、新血管形成またはＣＮＶの低下をもたらす。
【0184】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法および薬学的組成物、すなわち、抗ＶＥＧＦ剤を含むＡＡＶ遺伝子療法は、カラー眼底写真撮影によるＣＮＶ形成後のグレードＩＶ病変のパーセンテージによって測定された場合に、承認された治療法に匹敵する、新血管形成またはＣＮＶの低下をもたらす。一部の実施形態では、ＣＮＶの低下または治療効果は、遺伝子療法に基づかない注射またはタンパク質注射と比較して、抗ＶＥＧＦ剤を含む遺伝子療法の投与により、より長く持続する。
【0185】
一部の事例では、ｒＡＡＶビリオンまたはその薬学的組成物は、眼状態、疾患またはこれらの組み合わせを少なくとも部分的に好転させることができる。一部の実例では、眼状態または疾患は、眼の新血管形成に関連することができる。一部の事例では、眼状態または疾患は、本開示の抗ＶＥＧＦ剤に対して応答性であるかまたはそれによって処置可能である、いずれかの状態または疾患である。
【0186】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子療法は、例えば、異常ＶＥＧＦおよび／またはＶＥＧＦＲ活性または発現、ＡＭＤ、糖尿病性網膜症および子癇前症の結果としての異常新血管形成が関与する、いずれかの眼疾患または状態の処置に使用される。一部の実施形態では、遺伝子療法における抗ＶＥＧＦ剤は、ＶＥＧＦ－Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよび胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、またはこれらのいずれかの組み合わせもしくはバリアントを含む、哺乳動物におけるＶＥＧＦファミリーのメンバーを阻害するまたはこれに干渉する薬剤である。一部の実施形態では、遺伝子療法における抗ＶＥＧＦ剤は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける血管新生に関する追加的な適応症に対する治療特性を有することもできる、ＶＥＧＦ関連タンパク質のうちいずれか１種、例えば、一部のウイルスによって発現されるＶＥＧＦ－Ｅおよび一部のヘビの毒液に見出されるＶＥＧＦ－Ｆを阻害するまたはこれに干渉する薬剤である。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、ｉｎ ｖｉｖｏで胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）に干渉する、これに結合する、またはこれを阻害することもできる。
【0187】
使用方法
一部の実施形態では、本開示は、病理学的血管新生関連眼疾患を処置するための方法であって、斯かる処置を必要とするヒト被験体に薬学的に有効な量の本明細書に提供される薬学的組成物を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、疾患は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、滲出型ＡＭＤ、乾性ＡＭＤ、網膜新血管形成、脈絡膜新血管形成糖尿病性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞、網膜中心静脈閉塞、網膜静脈分枝閉塞、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、虚血性網膜症および糖尿病性網膜浮腫ならびにこれらのいずれかの組み合わせを含む眼性新生血管疾患の群から選択される。
一部の実施形態では、本開示は、病理学的血管新生関連眼疾患を処置するための方法であって、斯かる処置を必要とするヒト被験体に薬学的に有効な量の本明細書に提供される薬学的組成物を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、疾患は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、滲出型ＡＭＤ、乾性ＡＭＤ、網膜新血管形成、脈絡膜新血管形成糖尿病性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞、網膜中心静脈閉塞、網膜静脈分枝閉塞、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、虚血性網膜症および糖尿病性網膜浮腫ならびにこれらのいずれかの組み合わせを含む眼性新生血管疾患の群から選択される。
【0188】
一部の実施形態では、バリアントカプシドタンパク質（例えば、ｒＡＡＶ．７ｍ８）および抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸配列を含むｒＡＡＶを含む薬学的組成物は、乾性ＡＭＤおよび滲出型ＡＭＤを含むＡＭＤの処置または予防に使用される。一部の実施形態では、バリアントカプシドタンパク質（例えば、ｒＡＡＶ．７ｍ８）および抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸配列を含むｒＡＡＶを含む薬学的組成物は、ＣＮＶの処置もしくは予防またはグレードＩＶ ＣＮＶ病変の低下に使用される。一部の実施形態では、バリアントカプシドタンパク質（例えば、ｒＡＡＶ．７ｍ８）および抗ＶＥＧＦ剤をコードする核酸配列を含むｒＡＡＶを含む薬学的組成物は、ＡＭＤ、滲出型ＡＭＤ、乾性ＡＭＤ、網膜新血管形成、脈絡膜新血管形成糖尿病性網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞、網膜中心静脈閉塞、網膜静脈分枝閉塞、ＲＶＯ、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血、虚血性網膜症および糖尿病性網膜浮腫、ＤＭＥ患者におけるＤＲならびにこれらのいずれかの組み合わせのうちいずれか１種の処置または予防に使用される。
【0189】
一部の実施形態では、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＲＶＯまたはＤＲを処置する方法は、抗ＶＥＧＦ剤、例えば、ラニビズマブまたはベバシズマブの核酸配列を含む遺伝子療法を患者に投与する前に、承認された治療法、例えば、ラニビズマブまたはベバシズマブ注射で同患者を前処置するステップを含む。一部の実施形態では、患者は、本明細書に開示されている抗ＶＥＧＦ遺伝子療法の一度限りの用量を受ける前に、承認された治療法で前処置される。一部の実施形態では、患者は、本明細書に開示されている抗ＶＥＧＦ遺伝子療法の一度限りの用量を受ける前に、ラニビズマブまたはベバシズマブ注射のうちいずれか１種に対して応答性である。一部の実施形態では、ラニビズマブもしくはベバシズマブのいずれか１種に対して応答性である患者、またはラニビズマブもしくはベバシズマブのうち１種で前処置された患者は、本明細書に開示されているラニビズマブまたはベバシズマブ遺伝子療法で処置され、患者がＡＭＤのためのこれらの処置のいずれも受けない少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間もしくはそれよりも長いまたは１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間を超えるもしくはそれよりも長い期間が続く。一部の事例では、患者が、ラニビズマブまたはベバシズマブ遺伝子療法の硝子体内注射を受けた後に、患者は、少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間またはそれよりも長い期間が経過するまで、ラニビズマブもしくはベバシズマブタンパク質注射または別の承認された治療法を受けることを開始しない。
【0190】
一部の実施形態では、本明細書に開示されているラニビズマブもしくはベバシズマブ遺伝子療法または他のいずれかの抗ＶＥＧＦ遺伝子療法は、一度限りの投与である。一部の実施形態では、患者が、本明細書に開示されているラニビズマブまたはベバシズマブ遺伝子療法の単位用量を受けた後に、患者は、他のいずれかの承認されたタンパク質に基づく治療薬の使用を必要としない。
【0191】
一部の事例では、ＣＮＶまたはＡＭＤのための承認された治療法の反復した注射に伴う有害作用、例えば、炎症または細菌感染を経験する患者は、本明細書に開示されている抗ＶＥＧＦ遺伝子療法またはラニビズマブもしくはベバシズマブ遺伝子療法による処置の候補であり得る。一部の事例では、遺伝子療法は、患者の生涯で１回のみの注射を要求するため、または少なくとも２、５、１０、２０、３０、４０もしくは５０年間で１回以下与えられるため、斯かるリスクは、遺伝子療法においてより低い。一部の事例では、遺伝子療法の治療効果は、より長く持続し、一度限りの遺伝子療法注射の費用は、タンパク質の複数の反復した注射の合わせた費用よりも低くなり得るため、本明細書に開示されている抗ＶＥＧＦ遺伝子療法またはラニビズマブもしくはベバシズマブ遺伝子療法による処置は、タンパク質に基づく注射よりも対費用効果が高くなることができる。
【0192】
また、服薬非遵守（例えば、患者が、１回または複数の予定された注射を忘れるまたは見逃す場合）は、視力喪失および眼疾患または状態の増悪をもたらし得るため、反復した注射を要求しないことにより、遺伝子療法は、反復した注射を要求する治療法に伴う患者服薬遵守およびアドヒアランスの課題に取り組む。投与のために診療所への反復したまたは高頻度の来診を要求する処置レジメンに対する服薬非遵守およびノンアドヒアランスの比率は、ＡＭＤによって最も影響を受ける高齢患者の間でより高い。したがって、例えば、一度限りの硝子体内注射としての遺伝子療法による患者の眼への抗ＶＥＧＦ剤の送達は、患者により便利な処置選択肢をもたらし、服薬非遵守およびノンアドヒアランスの問題に取り組むことにより患者転帰を改善することができる。
【0193】
一部の実施形態では、使用方法は、現在の標準治療と考慮される承認された薬物、例えば、ラニビズマブ注射またはベバシズマブ注射でヒト患者または被験体を前処置するステップと、ラニビズマブまたはベバシズマブに対する患者の応答性を決定するステップと、承認された治療法に対して応答性である患者に本明細書に記載されている抗ＶＥＧＦ遺伝子療法を投与するステップとを含む。承認された治療法または現在の標準治療に対する患者の応答性の決定として、血液検査、イムノアッセイ、ｅｘ ｖｉｖｏ実験、または患者へのラニビズマブもしくはベバシズマブタンパク質注射の投与、およびラニビズマブもしくはベバシズマブに対する患者の応答性のアッセイを挙げることができるがこれらに限定されない。
【0194】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている抗ＶＥＧＦ遺伝子療法の使用方法は、薬物のラベルに従って、本明細書に記載されている凍結乾燥形態の薬学的組成物（すなわち、抗ＶＥＧＦ核酸配列を含むｒＡＡＶ２．７ｍ８）を再構成するステップと、被験体またはヒト患者に前記再構成された抗ＶＥＧＦ遺伝子療法を投与するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されている抗ＶＥＧＦ遺伝子療法の使用方法は、薬物のラベルに従って本明細書に記載されている薬学的組成物の懸濁物を投与するステップと、被験体またはヒト患者に抗ＶＥＧＦ遺伝子療法の前記懸濁物を投与するステップとを含む。一部の実施形態では、懸濁物を投与するための追加的なステップは、使用前に懸濁物を撹拌するステップおよび／または懸濁物を室温に温めるステップを含む。
【0195】
一部の実施形態では、斯かるヒト患者は、承認されたタンパク質注射または現在の標準治療、例えば、ラニビズマブ注射またはベバシズマブ注射で前処置された。一部の実施形態では、斯かる患者は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間もしくはそれよりも長い期間に、ｒＡＡＶ２．７ｍ８－ラニビズマブ遺伝子療法の１回以下の注射もしくは投与を受ける；または２、３、４、５、６、７、８、９、１０年間を超えるもしくはそれよりも長い期間内に、ｒＡＡＶ２．７ｍ８－ラニビズマブ遺伝子療法の１回以下の注射もしくは投与を受ける。
【0196】
一部の実施形態では、眼状態または疾患を予防または処置する方法であって、それを必要とする個体、例えば、承認された薬物に対して応答性の眼状態または疾患を有する個体に、本明細書に記載されている抗ＶＥＧＦ剤、例えば、ラニビズマブまたはベバシズマブをコードする核酸配列を含む有効量のｒＡＡＶビリオンまたはその薬学的組成物を投与するステップを含む方法も、本明細書に開示されている。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ２．７ｍ８－ラニビズマブビリオンは、眼内注射、硝子体内注射、網膜下注射または個体の眼への他のいずれかの便利な投与様式もしくは経路により投与することができる。他の便利な投与様式または経路は、例えば、静脈内、外用、点眼等を含むことができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されている方法および薬学的組成物は、硝子体内注射による投与を伴う。
【0197】
本明細書に記載されている「治療有効量」は、臨床治験により決定することができる、比較的広範囲であり得る。眼への直接的な注射または硝子体内注射のため、治療有効用量は、およそ１０１１～１０１２または１０１２～１０１３のベクターゲノムの７ｍ８－ラニビズマブまたは他のいずれかの抗ＶＥＧＦ遺伝子療法であり得る。一部の実施形態では、７ｍ８－ラニビズマブまたは他のいずれかの抗ＶＥＧＦ遺伝子療法の単位用量または治療有効量は、１０１０～１０１１の間、１０１１～１０１２の間、１０１０～１０１２の間、１０１２～１０１３の間、１０１１～１０１３の間、１０１２～１０１３の間、１０１２～１０１４の間、１０１１～１０１４の間、１０１１～１０１５の間、１０１２～１０１５の間、１０１３～１０１４の間、１０１４～１０１５の間、１０１５～１０１６の間、１０１６～１０１７の間、１０１７～１０１８の間、１０１８～１０１９の間または１０１９～１０２０の間のベクターゲノムである。一部の実施形態では、本開示の７ｍ８－ラニビズマブまたは他のいずれかの抗ＶＥＧＦ遺伝子療法を含む薬学的組成物の単位用量は、１×１０１０～２×１０１０の間、２×１０１０～３×１０１０の間、３×１０１０～４×１０１０の間、４×１０１０～５×１０１０の間、５×１０１０～６×１０１０の間、６×１０１０～７×１０１０の間、７×１０１０～８×１０１０の間、８×１０１０～９×１０１０の間、９×１０１０～１０×１０１０の間、１×１０１１～２×１０１１の間、２×１０１１～３×１０１１の間、２×１０１１～２．５×１０１１の間、２．５×１０１１～３×１０１１の間、３×１０１１～４×１０１１の間、４×１０１１～５×１０１１の間、５×１０１１～６×１０１１の間、６×１０１１～７×１０１１の間、７×１０１１～８×１０１１の間、８×１０１１～９×１０１１の間、９×１０１１～１０×１０１１の間、１×１０１２～２×１０１２の間、２×１０１２～３×１０１２の間、２．５×１０１２～３×１０１２の間、３×１０１２～４×１０１２の間、４×１０１２～５×１０１２の間、５×１０１２～６×１０１２の間、６×１０１２～７×１０１２の間、７×１０１２～８×１０１２の間、８×１０１２～９×１０１２の間、９×１０１２～１０×１０１２の間、１×１０１３～２×１０１３の間、２×１０１３～３×１０１３の間、３×１０１３～４×１０１３の間、４×１０１３～５×１０１３の間、５×１０１３～６×１０１３の間、６×１０１３～７×１０１３の間、７×１０１３～８×１０１３の間、８×１０１３～９×１０１３の間または９×１０１３～１０×１０１３の間のベクターゲノムである。一部の実施形態では、本開示の７ｍ８－ラニビズマブまたは他のいずれかの抗ＶＥＧＦ遺伝子療法の単位用量は、２．１×１０１１～２．１×１０１２の間のベクターゲノムである。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶの単位用量は、１０１０～１０１３の間、１０１０～１０１１の間、１０１１～１０１２の間、１０１２～１０１３の間または１０１３～１０１４の間のベクターゲノムである。
【0198】
一部の実施形態では、本開示の７ｍ８－ラニビズマブまたは他のいずれかの抗ＶＥＧＦ遺伝子療法の単位用量は、１×１０１０～２×１０１０の間、２×１０１０～４×１０１０の間、３×１０１０～５×１０１０の間、４×１０１０～６×１０１０の間、５×１０１０～７×１０１０の間、６×１０１０～８×１０１０の間、７×１０１０～９×１０１０の間、８×１０１０～１０１１の間、１×１０１１～２×１０１１の間、２×１０１１～４×１０１１の間、３×１０１１～５×１０１１の間、４×１０１１～６×１０１１の間、５×１０１１～７×１０１１の間、６×１０１１～８×１０１１の間、７×１０１１～９×１０１１の間、８×１０１１～１０×１０１１の間、１×１０１２～３×１０１２の間、２×１０１２～４×１０１２の間、３×１０１２～５×１０１２の間、４×１０１２～６×１０１２の間、５×１０１２～７×１０１２の間、６×１０１２～８×１０１２の間、７×１０１２～９×１０１２の間、８×１０１２～１０×１０１２の間、１×１０１３～５×１０１３の間、５×１０１３～１０×１０１３の間、１０１２～５×１０１２の間、５×１０１２～１×１０１３の間、７×１０１２～１×１０１３の間、８×１０１２～２×１０１３の間、９×１０１２～２×１０１３の間、９×１０１２～２×１０１３の間、９×１０１２～４×１０１３の間、１×１０１３～３×１０１３の間、１×１０１３～２×１０１３の間、２×１０１３～３×１０１３の間、３×１０１３～４×１０１３の間、４×１０１３～５×１０１３の間、５×１０１３～６×１０１３の間、６×１０１３～７×１０１３の間、７×１０１３～８×１０１３の間、８×１０１３～９×１０１３の間または８×１０１３～１×１０１４の間のベクターゲノムである。
【0199】
一部の実施形態では、５～１０年間の期間内にヒト患者または被験体に注射される７ｍ８－ラニビズマブまたは他のいずれかの抗ＶＥＧＦ遺伝子療法の総量は、１０１０～１０１３、１０１０～１０１１、１０１１～１０１２、１０１２～１０１３もしくは１０１３～１０１４以下のベクターゲノム、または１×１０１０～２×１０１０、２×１０１０～４×１０１０、３×１０１０～５×１０１０、４×１０１０～６×１０１０、５×１０１０～７×１０１０、６×１０１０～８×１０１０、７×１０１０～９×１０１０、８×１０１０～１０１１、１×１０１１～２×１０１１、２×１０１１～４×１０１１、３×１０１１～５×１０１１、４×１０１１～６×１０１１、５×１０１１～７×１０１１、６×１０１１～８×１０１１、７×１０１１～９×１０１１、８×１０１１～１０×１０１１、１×１０１２～３×１０１２、２×１０１２～４×１０１２、３×１０１２～５×１０１２、４×１０１２～６×１０１２、５×１０１２～７×１０１２、６×１０１２～８×１０１２、７×１０１２～９×１０１２、８×１０１２～１０×１０１２、１×１０１３～５×１０１３、５×１０１３～１０×１０１３、１０１２～５×１０１２、５×１０１２～１×１０１３、７×１０１２～１×１０１３、８×１０１２～２×１０１３、９×１０１２～２×１０１３、９×１０１２～２×１０１３、９×１０１２～４×１０１３、１×１０１３～３×１０１３、１×１０１３～２×１０１３、２×１０１３～３×１０１３、３×１０１３～４×１０１３、４×１０１３～５×１０１３、５×１０１３～６×１０１３、６×１０１３～７×１０１３、７×１０１３～８×１０１３、８×１０１３～９×１０１３または８×１０１３～１×１０１４以下のベクターゲノムである。
【0200】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている薬学的組成物の治療有効量は、２Ｅ１２～６Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、単位用量は、約１Ｅ１２、１．５Ｅ１２、２Ｅ１２、２．５Ｅ１２、３Ｅ１２、３．５Ｅ１２、４Ｅ１２、４．５Ｅ１２、５Ｅ１２、５．５Ｅ１２、６Ｅ１２、６．５Ｅ１２、７Ｅ１２、７．５Ｅ１２、８Ｅ１２、８．５Ｅ１２、９Ｅ１２または９．５Ｅ１２のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、単位用量は、１Ｅ１２～１．５Ｅ１２の間、１．５Ｅ１２～２Ｅ１２の間、２Ｅ１２～２．５Ｅ１２の間、２．５Ｅ１２～３．０Ｅ１２の間、３．０Ｅ１２～３．５Ｅ１２の間、３．５Ｅ１２～４．０Ｅ１２の間、４．０Ｅ１２～４．５Ｅ１２の間、４．５Ｅ１２～５．０Ｅ１２の間、５．０Ｅ１２～５．５Ｅ１２の間、５．５Ｅ１２～６．０Ｅ１２の間、６．０Ｅ１２～６．５Ｅ１２の間、６．５Ｅ１２～７．０Ｅ１２の間、７．０Ｅ１２～７．５Ｅ１２の間、７．５Ｅ１２～８．０Ｅ１２の間、８．０Ｅ１２～８．５Ｅ１２の間、８．５Ｅ１２～９．０Ｅ１２の間、９．０Ｅ１２～９．５Ｅ１２の間または９．５Ｅ１２～１０Ｅ１２の間のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、単位用量は、少なくとも１Ｅ１２、１．５Ｅ１２、２Ｅ１２、２．５Ｅ１２、３Ｅ１２、３．５Ｅ１２、４Ｅ１２、４．５Ｅ１２、５Ｅ１２、５．５Ｅ１２、６Ｅ１２、６．５Ｅ１２、７Ｅ１２、７．５Ｅ１２、８Ｅ１２、８．５Ｅ１２、９Ｅ１２または９．５Ｅ１２のベクターゲノムを含む。一部の実施形態では、単位用量は、１Ｅ１２、１．５Ｅ１２、２Ｅ１２、２．５Ｅ１２、３Ｅ１２、３．５Ｅ１２、４Ｅ１２、４．５Ｅ１２、５Ｅ１２、５．５Ｅ１２、６Ｅ１２、６．５Ｅ１２、７Ｅ１２、７．５Ｅ１２、８Ｅ１２、８．５Ｅ１２、９Ｅ１２、９．５Ｅ１２または１０Ｅ１２以下のベクターゲノムを含む。
【0201】
一部の実施形態では、単位用量のためにより低い濃度（例えば、ベクターゲノム）を使用して、より高い濃度で起こり得る凝集を防止する。一部の実施形態では、単位用量のためにより高い濃度、例えば、より多いベクターゲノムを選択して、遺伝子療法の有効性を増加させる、または遺伝子療法の１回の注射もしくは一度限りの投与における抗ＶＥＧＦ導入遺伝子の送達を最大化する。一部の実施形態では、より高い濃度の本明細書に開示されている薬学的組成物は、より少ない容量の注射を可能にし、これにより、硝子体内注射に伴う有害作用、例えば、上昇した眼内圧、炎症、刺激または疼痛を低下させることができる。
【0202】
一部の実施形態では、７ｍ８－ラニビズマブもしくは他のいずれかの抗ＶＥＧＦ遺伝子療法またはその薬学的組成物は、単一用量または一度限りの用量として投与することができる。一部の実施形態では、２回以上の投与を用いて、様々な間隔の持続した期間にわたる所望のレベルの遺伝子発現を達成することができる、例えば、少なくとも２年間または少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０年間もしくはそれよりも長い期間で１回以下。一部の実施形態では、７ｍ８－ラニビズマブまたは他のいずれかの抗ＶＥＧＦ遺伝子療法の硝子体内注射は、少なくとも１年間または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０年間もしくはそれよりも長い期間、患者が承認されたタンパク質注射を受ける必要をなくす。
【実施例0203】
（実施例１：サルにおける７ｍ８－ｓＶＥＧＦＲ－１の効能評価）
【0204】
目的：アフリカミドリザルにおけるレーザー光凝固によって誘導される脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）の発達を阻害するための、２×１０１２ｖｇでの硝子体内（ＩＶＴ）投与の後の７ｍ８－ｓＦＬＴ－１の効能を評価すること。さらなる目的は、眼の組織における限局性ｓＦＬＴ－１発現を評価することであってもよい。
【0205】
サルにおけるＣＮＶ病変モデルは、滲出型ＡＭＤなどの新血管形成に関連する眼疾患を処置するための療法の潜在的効能を評価するための標準の霊長類モデルとして一般的に容認され、広く使われている。
【0206】
被験体の補充：眼圧測定、細隙灯生体顕微鏡検査法、眼底検査、カラー眼底写真撮影（ＣＦＰ）、蛍光血管造影（ＦＡ）および光干渉断層撮影（ＯＣＴ）によって眼および全般的な健康状態を評価するために、サルはベースラインスクリーニングを受けた。正常な所見を有する３９頭の動物を研究に登録し、ベースライン体重および性別によって４つの処置群に無作為化した（表１）。ベースライン検査の後、アトロピン１％眼軟膏を塗布した。
【表1】
【0207】
処置スケジュールに従って研究の０日目に群１～２のサルはＩＶＴ ＡＡＶ２．７ｍ８－ｓＦＬＴ－１またはビヒクルＯＵを受けた（表１）。ＩＶＴ投薬の前に、局所的局部麻酔を投与し（０．５％プロパラカイン）、眼を５％Ｂｅｔａｄｉｎｅで消毒し、無菌のノーマルセーラインですすいだ。硝子体中心を標的として、下の耳側四半部（temporal quadrant）の縁から２ｍｍ後方に置かれた３１ゲージ０．５インチの針を使用してＩＶＴ注射を投与することができる。
【0208】
全てのＩＶＴ注射の後に、０．３％シプロフロキサシンまたは同等の抗生物質眼科用液剤、および１％硫酸アトロピン軟膏の局所投与を行うことができる。
【0209】
５６日目に、レーザー熱傷により耳側血管アーケードの間でＣＮＶを誘導した。Ｉｒｉｄｅｘ Ｏｃｕｌｉｇｈｔ ＴＸ ５３２ｎｍレーザーを１００ｍｓのレーザー持続期間、スポットサイズ５０μｍ、出力７５０ｍＷで用いて、眼科医が９つのレーザースポットを各眼に対称的に置いた。レーザースポットは、０．９×接触レーザーレンズを使用して適用した。レーザースポット配置の間の参照のためにレーザー処置の前（および、ブレブ配置の後）に得られたカラー眼底画像の上に、レーザースポットの標的位置を訓練された眼科医がマッピングした。レーザー病変を記録するために、レーザー処置の直後にカラー眼底写真撮影を実行した。レーザー直後に重度の網膜／網膜下出血を示すいかなるスポットも、分析から排除した。図１は、レーザー照射によるＣＮＶ病変の誘導の後の、非ヒト霊長類の眼の例示的な眼底写真を図示する。
【0210】
網膜の両側のカラー眼底画像は、Ｔｏｐｃｏｎ ＴＲＣ－５０ＥＸ網膜カメラをＣａｎｏｎ ６Ｄデジタル画像化ハードウェアおよびＮｅｗ Ｖｉｓｉｏｎ Ｆｕｎｄｕｓ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアと一緒に使用して、窩を中心にした５０度の視野で捕捉した。１０％フルオレセインナトリウムの０.１ｍＬ／ｋｇの静
脈内投与で、ＦＡを実行した。ＣＮＶ病変の血管撮影図におけるフルオレセイン漏出は、画像強度の均一な調整の後に生成されるコンポジットを評価するマスキングされた眼科医によってグレード分けされた（Ｉ～ＩＶ；表２）。病変のグレード分け評価は、２名の他の訓練された眼科医によって眼底の画像で確認された。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、後期の未加工血管撮影図の画像蛍光デンシトメトリー分析を実行することもできる。
脈内投与で、ＦＡを実行した。ＣＮＶ病変の血管撮影図におけるフルオレセイン漏出は、画像強度の均一な調整の後に生成されるコンポジットを評価するマスキングされた眼科医によってグレード分けされた（Ｉ～ＩＶ；表２）。病変のグレード分け評価は、２名の他の訓練された眼科医によって眼底の画像で確認された。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、後期の未加工血管撮影図の画像蛍光デンシトメトリー分析を実行することもできる。
【表2】
【0211】
全般的な健康について、被験体を１日に２回評価した。１週間に１回、詳細な観察を実行した。ベースラインスクリーニング時および生存中の研究の間の２週ごとに体重を得た。
【0212】
８５日目に、または画像の検査を保留する場合は８５日目より少し後に、眼底画像化の質を確認してから、全ての動物をペントバルビタールで安楽死させた。次いで動物をペントバルビタールで安楽死させ、眼球を摘出した。過剰な眼窩組織は切り取り、ＯＤおよびＯＳ眼球の両方を液体窒素で瞬間凍結させ、次いで、室温で凍結組織平面に沿って切開し、脈絡膜部分組織（choroidal sub-tissue）と一緒に硝子体および網膜を単離した。硝
子体の収集の後、ＲＰＥ／脈絡膜と一緒の神経網膜の５ｍｍのパンチを黄斑ならびに上部、下部、耳側および鼻側の領域から採取した。余地があるときは、さらなる周辺のパンチを行った。各パンチからの、根底にあるＲＰＥ／脈絡膜組織を伴う網膜を、事前に風袋を計測したラベル付きの低温チューブに移し、秤量し、液体窒素で瞬間凍結させた。パンチ生検の収集の前後に、パンチが収集された領域を記録するために、平らにマウントした網膜の写真を配向の表示と一緒に撮影した。
子体の収集の後、ＲＰＥ／脈絡膜と一緒の神経網膜の５ｍｍのパンチを黄斑ならびに上部、下部、耳側および鼻側の領域から採取した。余地があるときは、さらなる周辺のパンチを行った。各パンチからの、根底にあるＲＰＥ／脈絡膜組織を伴う網膜を、事前に風袋を計測したラベル付きの低温チューブに移し、秤量し、液体窒素で瞬間凍結させた。パンチ生検の収集の前後に、パンチが収集された領域を記録するために、平らにマウントした網膜の写真を配向の表示と一緒に撮影した。
【0213】
統計的方法：異なる病変グレードの発生数を評価するために、フィッシャー直接検定を使用した。ＯＣＴ ＣＮＶ複合エリアおよび血管撮影図画像デンシトメトリーデータを分析するために、反復測定による二元ＡＮＯＶＡおよび続くチューキー－クレイマー検定またはコントラスト法（contrast procedure）を使用した。データが正規分布せず、不均
一な分散を有する場合、ノンパラメトリック検定を適用した。０．０５またはそれ未満のＰ値は、統計的に有意とみなした。
一な分散を有する場合、ノンパラメトリック検定を適用した。０．０５またはそれ未満のＰ値は、統計的に有意とみなした。
【0214】
図３は、ＡＡＶ２．７ｍ８－ｓＶＥＧＦＲ－１または製剤緩衝液だけを含むビヒクル対照のいずれかを硝子体内注射した第３群および第４群の動物の、１４および２８日目のグレードＩＶ病変のパーセンテージのプロットを図示する。試験被験体の各群において注射の直後にレーザー照射によってＣＮＶ病変を誘導し、各病変をＩ～ＩＶのスケールでグレード分けするためにカラー眼底写真撮影を使用した。硝子体内投与したときの１４日目に収集された眼底画像について、ＡＡＶ２．７ｍ８－ｓＶＥＧＦＲ－１で処置したサルは、ビヒクル単独の投与と比較してグレードＩＶ病変の量のわずかな減少を示した。２８日目には、硝子体内のＡＡＶ２．７ｍ８－ｓＦＬＴ－１で処置したサルは、ビヒクル単独の投与と比較してグレードＩＶ病変の量の顕著な減少を示さなかった。
【0215】
（実施例２：サルにおける７ｍ８－ラニビズマブの効能評価）
【0216】
同じプロトコールならびにＡＡＶ２のカプシドタンパク質ＶＰ１の位置５８７および５８８の間に挿入された７ｍ８配列およびラニビズマブをコードする核酸配列を含むｒＡＡＶ２であるＡＡＶ２．７ｍ８－ラニビズマブを使用して、実施例１に記載のものと類似のｉｎ ｖｉｖｏ研究をサルにおいて実行した。
【0217】
図４に図示する通り、硝子体内投与されたＡＡＶ２．７ｍ８－ラニビズマブは、レーザーによって誘導されるグレードＩＶ ＣＮＶ病変の発生を阻止した。ＡＡＶ２．７ｍ８－ラニビズマブ、ラニビズマブ単独（陽性対照）または製剤緩衝液を含むビヒクル対照を、２×１０１２ｖｇの用量で硝子体内注射により非ヒト霊長類の眼に投与した。次いで全ての群においてレーザー照射によってＣＮＶ病変を誘導し、各病変をＩ～ＩＶのスケールでグレード分けするためにカラー眼底写真撮影を使用した。次いでグレードＩＶ病変のパーセンテージの測定値を平均して、プロットした。１４日目（薄灰色バー）および２８日目（暗灰色バー）には、ＡＡＶ２．７ｍ８－ラニビズマブは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＣＮＶ病変をラニビズマブ単独と同等のレベルに大幅に低減した。
【0218】
サルにおけるこれらのｉｎ ｖｉｖｏ研究は、ＡＡＶ２．７ｍ８－ラニビズマブがヒトのための実行可能な遺伝子療法選択肢であり得ることを示唆した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】