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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022031173
(43)【公開日】2022-02-18
(54)【発明の名称】酵母由来の細胞外膜小胞及びそれを含む皮膚外用剤
(51)【国際特許分類】
C12N 1/16 20060101AFI20220210BHJP
A61K 8/02 20060101ALI20220210BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20220210BHJP
A61K 8/9728 20170101ALI20220210BHJP
A61P 17/16 20060101ALI20220210BHJP
A61K 36/062 20060101ALI20220210BHJP
【ＦＩ】
C12N1/16 J
A61K8/02
A61Q19/00
A61K8/9728
A61P17/16
A61K36/062
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021123940
(22)【出願日】2021-07-29
(31)【優先権主張番号】P 2020132782
(32)【優先日】2020-08-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000119472
【氏名又は名称】一丸ファルコス株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】593061905
【氏名又は名称】株式会社 秋田今野商店
(74)【代理人】
【識別番号】110002697
【氏名又は名称】めぶき国際特許業務法人
(74)【代理人】
【識別番号】100110973
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 洋
(74)【代理人】
【識別番号】100116528
【弁理士】
【氏名又は名称】三宅 俊男
(72)【発明者】
【氏名】辻 祐太朗
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 賢一
(72)【発明者】
【氏名】今野 宏
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 冬彦
【テーマコード（参考）】
4B065
4C083
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA77X
4B065BA22
4B065BD08
4B065BD14
4B065CA44
4C083AA031
4C083AA032
4C083CC02
4C083EE12
4C083FF01
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA04
4C087BC14
4C087CA10
4C087MA63
4C087NA14
4C087ZA89
(57)【要約】
【課題】紫外線、熱などの外的刺激（ストレス）から皮膚を保護し、損傷を受けた皮膚を修復、改善する効果を有する新規な剤を見出すこと、及びこれを配合した皮膚外用剤を提供すること。
【解決手段】ヒートショックされた酵母に由来する、平均粒径１００～２００ｎｍの細胞外膜小胞、及びこれを含有する皮膚外用剤。
【選択図】図１
【解決手段】ヒートショックされた酵母に由来する、平均粒径１００～２００ｎｍの細胞外膜小胞、及びこれを含有する皮膚外用剤。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒートショックされた酵母に由来する、平均粒径１００～２００ｎｍの細胞外膜小胞。
【請求項2】
前記酵母がピキア属に属する請求項１に記載の細胞外膜小胞。
【請求項3】
前記酵母が、椿の樹液から単離されたピキア・ナガニシイ（Ｐｉｃｈｉａ ｎａｇａｎｉｓｈｉｉ）であり、かつ前記平均粒径が１７０ｎｍ以上である、請求項１又は２に記載の細胞外膜小胞。
【請求項4】
前記酵母がリンゴ由来のピキア・メンブラナファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）であり、かつ前記平均粒径が１８０ｎｍ以上である、請求項１又は２に記載の細胞外膜小胞。
【請求項5】
前記酵母がカバノキの樹液から単離されたピキア・ベロナエ（Ｐｉｃｈｉａ ｖｅｒｏｎａｅ）であり、かつ前記平均粒径が１２０ｎｍ以上である、請求項１又は２に記載の細胞外膜小胞。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞外膜小胞を含有する、皮膚をストレスから保護するための外用剤。
【請求項7】
皮膚のストレス保護作用を有する細胞外膜小胞の製造方法であって、
椿の樹液から単離されたピキア・ナガニシイ（Ｐｉｃｈｉａ ｎａｇａｎｉｓｈｉｉ）を、３６～３８℃の温度で培養して培養液を得る工程と、
前記培養液から菌体を除去して培養上清を回収する工程と、
前記培養上清から細胞外膜小胞を回収する工程と、
を含む、細胞外膜小胞の製造方法。
椿の樹液から単離されたピキア・ナガニシイ（Ｐｉｃｈｉａ ｎａｇａｎｉｓｈｉｉ）を、３６～３８℃の温度で培養して培養液を得る工程と、
前記培養液から菌体を除去して培養上清を回収する工程と、
前記培養上清から細胞外膜小胞を回収する工程と、
を含む、細胞外膜小胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、酵母由来の細胞外膜小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）に関し、さらに詳細には、ヒートショックされた酵母に由来する細胞外膜小胞及びそれを含む皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【0002】
皮膚は、人体の最外層に位置する組織であり、常に熱や太陽光線、化学物質、重金属、タバコの煙、排気ガスなどのストレスの影響を直接受けている。このような外的刺激（ストレス）から人体を保護するために、皮膚のバリヤー機能を維持、向上させることは極めて重要である。
【0003】
細胞は、熱や太陽光線、化学物質、重金属、タバコの煙、排気ガスなどの強いストレスにさらされると、それに対抗するためにヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）を産生し、ストレスによるダメージから組織を防御するシステムを有している。ＨＳＰは、細胞および生体が熱刺激のみならず、種々のストレスに応答して産生する特殊なタンパク質である。ＨＳＰの合成が増加すると、皮膚において、熱や太陽光線などのストレスに対する抵抗性が向上することが知られている。しかし、繰り返しストレスに晒されることで皮膚のバリヤー機能が低下し、かぶれ、乾燥又はひび割れを起こす。これに対する１つの方法として、酵母のＨＳＰを皮膚外用剤に配合することにより、皮膚の老化を防止する試みがなされている（特許文献１参照）。
【0004】
また、熱ストレスによる損傷から皮膚を保護するために、生理的に許容可能な媒体と共にアルテミア・サリーナ抽出物を含む組成物を、身体または顔の皮膚の少なくとも一部への局所適用する美容的ケア方法（特許文献２参照）や、酵母由来の熱ショックたんぱく質と、熱ショックたんぱく質産生促進剤としてライ麦発芽種子エキスを含有する皮膚外用剤（特許文献３）が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２００４－３３１６０２号公報
【特許文献2】特表２０１７－５０２０５０号公報
【特許文献3】特許第４５６２５３６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上記従来技術の方法によれば、ＨＳＰの作用により損傷を受けた皮膚を修復し、改善する一定の効果は期待されるものの、ＨＳＰそのものを皮膚外用剤に添加しているためタンパク質の分解や変性を起こしやすいなど、皮膚の保護作用にも限界があったと考えられる。
【0007】
そこで本発明は、紫外線、熱などの外的刺激（ストレス）から皮膚を保護し、損傷を受けた皮膚を修復、改善する効果を有する新規な剤を見出すこと、及びこれを配合した皮膚外用剤を提供すること、などを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、酵母が産生する細胞外膜小胞の粒子径が、培養温度により変化すること、そして、ヒートショックを受けた酵母由来の細胞外膜小胞が、表皮角化細胞の増殖促進作用を有することを見出して、本発明を完成した。
【0009】
すなわち、本発明は以下の実施形態を含む。
（１）ヒートショックされた酵母に由来する、平均粒径１００～２００ｎｍの細胞外膜小胞。
（２）酵母がピキア属に属する（１）に記載の細胞外膜小胞。
（３）酵母が、椿の樹液から単離されたピキア・ナガニシイ（Ｐｉｃｈｉａ ｎａｇａｎｉｓｈｉｉ）であり、かつその平均粒径が１７０ｎｍ以上である、（１）又は（２）に記載の細胞外膜小胞。
（４）酵母がリンゴ由来のピキア・メンブラナファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）であり、かつその平均粒径が１８０ｎｍ以上である、（１）又は（２）に記載の細胞外膜小胞。
（５）酵母がカバノキの樹液から単離されたピキア・ベロナエ（Ｐｉｃｈｉａ ｖｅｒｏｎａｅ）であり、かつその平均粒径が１２０ｎｍ以上である、（１）又は（２）に記載の細胞外膜小胞。
（６）（１）～（５）のいずれか一項に記載の細胞外膜小胞を含有する、皮膚をストレスから保護するための外用剤。
（７）皮膚のストレス保護作用を有する細胞外膜小胞の製造方法であって、椿の樹液から単離されたピキア・ナガニシイ（Ｐｉｃｈｉａ ｎａｇａｎｉｓｈｉｉ）を、３６～３８℃の温度で培養して培養液を得る工程と、培養液から菌体を除去して培養上清を回収する工程と、培養上清から細胞外膜小胞を回収する工程と、を含む、細胞外膜小胞の製造方法。
（１）ヒートショックされた酵母に由来する、平均粒径１００～２００ｎｍの細胞外膜小胞。
（２）酵母がピキア属に属する（１）に記載の細胞外膜小胞。
（３）酵母が、椿の樹液から単離されたピキア・ナガニシイ（Ｐｉｃｈｉａ ｎａｇａｎｉｓｈｉｉ）であり、かつその平均粒径が１７０ｎｍ以上である、（１）又は（２）に記載の細胞外膜小胞。
（４）酵母がリンゴ由来のピキア・メンブラナファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）であり、かつその平均粒径が１８０ｎｍ以上である、（１）又は（２）に記載の細胞外膜小胞。
（５）酵母がカバノキの樹液から単離されたピキア・ベロナエ（Ｐｉｃｈｉａ ｖｅｒｏｎａｅ）であり、かつその平均粒径が１２０ｎｍ以上である、（１）又は（２）に記載の細胞外膜小胞。
（６）（１）～（５）のいずれか一項に記載の細胞外膜小胞を含有する、皮膚をストレスから保護するための外用剤。
（７）皮膚のストレス保護作用を有する細胞外膜小胞の製造方法であって、椿の樹液から単離されたピキア・ナガニシイ（Ｐｉｃｈｉａ ｎａｇａｎｉｓｈｉｉ）を、３６～３８℃の温度で培養して培養液を得る工程と、培養液から菌体を除去して培養上清を回収する工程と、培養上清から細胞外膜小胞を回収する工程と、を含む、細胞外膜小胞の製造方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、紫外線、熱などの外的刺激（ストレス）から皮膚を保護し、損傷を受けた皮膚を修復、改善する効果を有する新規な剤、及びこれを配合した皮膚外用剤などを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【発明を実施するための形態】
【0012】
（定義）
本明細書において、「ヒートショック」とは、細胞を高温等のストレスに曝すことをいう。ヒートショックに対して細胞のホメオスタシス及び生存を維持するために、細胞内で発現されるヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）が知られている。この多重遺伝子スーパーファミリーのメンバーは、それらの分子サイズ及び関連する機能で表され、例えば、ＨＳＰｌ１０、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ４０、及び小ヒートショックタンパク質等が挙げられる。ＨＳＰは、ミスフォールディングしたタンパク質の立体構造及び細胞機能の復活を支援し、又はダメージを受けたタンパク質をプロテオソーム誘導性の分解を導く、分子シャペロンとして機能する。ＨＳＰ発現は、ヒートショック転写因子（ＨＳＦ）、特にＨＳＦ１により、迅速に誘導される。ＨＳＦは、制御される遺伝子のヒートショックエレメント（ＳＨＥ）配列への結合を通じて、ＨＳＰ遺伝子の転写を活性化する。
本明細書において、「ヒートショック」とは、細胞を高温等のストレスに曝すことをいう。ヒートショックに対して細胞のホメオスタシス及び生存を維持するために、細胞内で発現されるヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）が知られている。この多重遺伝子スーパーファミリーのメンバーは、それらの分子サイズ及び関連する機能で表され、例えば、ＨＳＰｌ１０、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ４０、及び小ヒートショックタンパク質等が挙げられる。ＨＳＰは、ミスフォールディングしたタンパク質の立体構造及び細胞機能の復活を支援し、又はダメージを受けたタンパク質をプロテオソーム誘導性の分解を導く、分子シャペロンとして機能する。ＨＳＰ発現は、ヒートショック転写因子（ＨＳＦ）、特にＨＳＦ１により、迅速に誘導される。ＨＳＦは、制御される遺伝子のヒートショックエレメント（ＳＨＥ）配列への結合を通じて、ＨＳＰ遺伝子の転写を活性化する。
【0013】
「細胞外膜小胞」とは、細胞から放出されるリン脂質を主成分とする膜で覆われた数十から数千ｎｍ程度の大きさを有する粒子をいう。細胞外膜小胞には、エクソソーム、マイクロベシクル、アポトーシス小体等が含まれる。多くの場合、細胞外膜小胞には、生体分子が存在している。例えば、エクソソーム又はマイクロベシクルは、ポリペプチド及び核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ノン・コーディングＲＮＡ等のＲＮＡ）から選択される少なくとも一種の生体分子を含む。例えば、アポトーシス小体は、断片化された核及び細胞小器官から選択される少なくとも一種を含む。細胞外膜小胞は、好ましくは、ポリペプチド及びＲＮＡから選択される少なくとも一種の生体分子を含む。ここで、ポリペプチドは、複数のアミノ酸がペプチド結合で結合した化合物をいい、分子量の比較的大きいタンパク質及び分子量の比較的小さいペプチドを含む。細胞外膜小胞のサイズの測定は、例えば、細胞外膜小胞のブラウン運動に基づく方法、光散乱法、および電気抵抗法などにより行うことができる。
【0014】
「平均粒径」とは、細胞外膜小胞の粒径を任意の測定方法で測定した値の平均値を意味する。測定方法としては、例えば、電気抵抗ナノパルス法（ｑＮＡＮＯ）、ナノ粒子トラキング法を用いた、細胞外膜小胞が溶液中にある状態で観測する湿式の測定方法や、透過型電子顕微鏡で細胞外膜小胞の形態を保ったまま観測する乾式の測定方法がある。
【0015】
（ヒートショックされた酵母由来の細胞外膜小胞）
本発明の一実施形態において、ヒートショックされた酵母に由来する、平均粒径１００～２００ｎｍの細胞外膜小胞（以下、「本実施形態の細胞外膜小胞」と称する場合がある。）が提供される。酵母は、野生酵母、分離菌株、又は市販されている酵母を制限なく使用可能である。野生酵母は、自然界に存在する酵母であり、果実の表面、樹液、花の蜜腺、土壌、海水中等、幅広く分布している。分離菌株は自然界から分離された、基本的には同一細胞からのクローンであり、遺伝的に同質の集団であると考えられる。
本発明の一実施形態において、ヒートショックされた酵母に由来する、平均粒径１００～２００ｎｍの細胞外膜小胞（以下、「本実施形態の細胞外膜小胞」と称する場合がある。）が提供される。酵母は、野生酵母、分離菌株、又は市販されている酵母を制限なく使用可能である。野生酵母は、自然界に存在する酵母であり、果実の表面、樹液、花の蜜腺、土壌、海水中等、幅広く分布している。分離菌株は自然界から分離された、基本的には同一細胞からのクローンであり、遺伝的に同質の集団であると考えられる。
【0016】
好ましい実施形態において、酵母は、自然界から分離、同定されたものであり、例えば、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）及びニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐ．）などから選択される一つ以上を含んでいてよい。ピキア属は、サッカロミセス科の酵母の属である。この属の１００を超える種が公知である。とりわけよく知られた種としては、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・ギリエルモンジィ（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、ピキア・ノルベゲンシス（Ｐｉｃｈｉａ ｎｏｒｖｅｇｅｎｓｉｓ）及びピキア・オーメリ（Ｐｉｃｈｉａ ｏｈｍｅｒｉ）、ピキア・ナガニシイ（Ｐｉｃｈｉａ ｎａｇａｎｉｓｈｉｉ）、ピキア・メンブラナファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・ベロナエ（Ｐｉｃｈｉａ ｖｅｒｏｎａｅ）、ピキア・アノマーラ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ）等が挙げられる。
【0017】
酵母の典型的なヒートショック方法は、例えば、酵母の至適生育温度以上の温度で培養することを含む。ここで、「酵母の至適生育温度」とは、対象となる酵母の増殖速度が最大となる温度を意味する。酵母の至適生育温度を超える温度条件とは、用いる酵母の種類によって異なるが、例えば、一般に至適生育温度より５℃以上高い温度であり、２５℃～４０℃の範囲が好ましい。ヒートショックタンパク質の発現をより促進するなどの観点から２５℃を超える温度が好ましく、３５℃以上が更に好ましい。
【0018】
如何なる理論にも拘束されないが、ヒートショックされた酵母から回収される細胞外膜小胞は、それより低温で培養されたときに比べてその平均粒径が増加することから、細胞外膜小胞に内包されるポリペプチドや核酸の含有量が増加すると考えられる。種々の細胞由来のエクソソームに関するプロテオーム解析及びゲノム解析により、エクソソームは細胞型特異的であり、かつ分泌細胞の環境に基づいて制御される、広範囲のシグナル伝達因子を含むことが明らかになった（Ｗｅｂｂｅｒ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｐｔａｍｅｒ－ｂａｓｅｄ ａｒｒａｙ （ＳＯＭＡｓｃａｎ）ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１４．１３（４）：ｐ．１０５０－６４．）。ＨＳＰ７０はエクソソームの積み荷の成分であることが以前に示されている（Ｃｌａｙｔｏｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｂ－ｃｅｌｌ ｅｘｏｓｏｍｅｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，２００５．１１８（Ｐｔ１６）：ｐ．３６３１－８．）。エクソソームに含有される遺伝情報は、例えば、標的細胞の活性化、遊走、増殖、分化または脱分化を誘発することによって、またはアポトーシスまたは壊死を促進することによって、標的細胞の運命に影響を及ぼし得るか、または標的細胞の運命を指示することもできる。
【0019】
本実施形態の細胞外膜小胞は、１００～２００ｎｍの平均粒径を有するが、個々の粒子の直径は、約２０～５００ｎｍの範囲にあってもよい。好ましい実施形態において、細胞外膜小胞の平均粒径の下限は、１１０ｎｍ以上であり、さらに好ましくは１１５ｎｍ以上である。また、好ましい実施形態において、細胞外膜小胞の平均粒径の上限は、１９０ｎｍ以下であってもよい。
【0020】
この細胞外膜小胞の平均粒径は、酵母の種類によって変化してもよい。例えば、椿の樹液から単離されたピキア・ナガニシイ由来の細胞外膜小胞は、約１００ｎｍ～６５０ｎｍの直径を有しており、その平均粒径は、約１７０ｎｍ以上である。一方、リンゴ由来の酵母ピキア・メンブラナファシエンスの場合は、約１００ｎｍ～４００ｎｍの直径を有しており、その平均粒径は、約１８０ｎｍ以上である。これに対し、カバノキ（バーチ）の樹液由来の酵母ピキア・ベロナエは若干小さく、約１００ｎｍ～３００ｎｍの直径を有しており、その平均粒径は、約１２０ｎｍ以上である。
【0021】
（製造方法）
他の実施形態において、上記細胞外膜小胞は、自然界から単離された酵母を、至適生育温度以上の温度で培養して培養液を得る工程と、この培養液から菌体を除去して培養上清を回収する工程と、この培養上清から細胞外膜小胞を回収する工程と、を含む。酵母の培養方法は、通常酵母に使用される培養方法であれば、特に限定されず、公知の手法に従うことができる（参考文献としてＴｈｅ Ｙｅａｓｔｓ．Ａ Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ Ｓｔｕｄｙ，４ｔｈ ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＢＶ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ．２４０－２４１（１９９８）等がある）。例えば、振盪培養、通気培養、静置培養、撹拌培養等が挙げられる。また、バッチ式や連続式の何れでもよい。これらを単独で又は２種以上組み合わせて行うことができる。好ましい実施形態におけるピキア属酵母の培養条件（例えば、好気性、嫌気性、培地中のｐＨ、溶存酸素、培養温度及び培養時間等）は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。
他の実施形態において、上記細胞外膜小胞は、自然界から単離された酵母を、至適生育温度以上の温度で培養して培養液を得る工程と、この培養液から菌体を除去して培養上清を回収する工程と、この培養上清から細胞外膜小胞を回収する工程と、を含む。酵母の培養方法は、通常酵母に使用される培養方法であれば、特に限定されず、公知の手法に従うことができる（参考文献としてＴｈｅ Ｙｅａｓｔｓ．Ａ Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ Ｓｔｕｄｙ，４ｔｈ ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＢＶ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ．２４０－２４１（１９９８）等がある）。例えば、振盪培養、通気培養、静置培養、撹拌培養等が挙げられる。また、バッチ式や連続式の何れでもよい。これらを単独で又は２種以上組み合わせて行うことができる。好ましい実施形態におけるピキア属酵母の培養条件（例えば、好気性、嫌気性、培地中のｐＨ、溶存酸素、培養温度及び培養時間等）は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。
【0022】
このようにして得られた酵母の培養後は、ろ過又は遠心分離法などの通常の方法により培養液から菌体を除去して培養上清を回収することができる。例示的な一具現例としての遠心分離は、１０００～２００００×ｇ、または１５００～２００００×ｇ、または１５００～１５０００×ｇ、または１５００～１００００×ｇで３０～６０分間実施していてよい。このとき、遠心分離の速度又は時間を変化させて段階的に実施していてもよい。例えば、１５００～２０００×ｇの低速で遠心分離して培養液から酵母の菌体を分離及び除去し細胞と上澄培養液を分離した後、１００００～２００００×ｇの高速で遠心分離してさらに細胞又は細胞関連残骸及び残余物などを除去していてもよい。あるいは、菌体を除去した後に、０．３～０．５μｍ大きさのフィルターで濾過していてよい。この濾過工程によって遠心分離された培養液の純度を高めることができる。
【0023】
続いて、このようにして得られた酵母の培養上清を、１０００００×ｇ以上、具体的に、１０００００～２０００００×ｇ、又は１０００００～１５００００×ｇ、又は１５００００～２０００００×ｇで１～５時間の超遠心分離で沈降させて製造してもよい。
【0024】
一実施形態において、本実施形態の細胞外膜小胞は、遠心分離、超遠心分離、分画遠心分離、平衡密度勾配遠心分離、密度勾配、濾過、透析、及び自由流動電気泳動からなる群から選択される一つ以上の方法を用いて分離していてよいが、本実施形態の細胞外膜小胞の分離方法がこれらに制限されるものではない。
【0025】
密度勾配は、密度が異なる物質を区分するときに最も多く用いられる方法であって、この方法の具体的な例としては、フィコール、グリセロール、スクロース、塩化セシウム、イオジキサノールなどの密度勾配分離材料を用いて実施することができるが、これらに制限されるものではない。一側面において、密度勾配は、超遠心分離などとともに用いられていてよい。他の側面において、細胞外小胞を選別するためにゲル濾過又は限外濾過を用いていてよい。また他の側面において、大きさが小さい分子を除去するために、濾過に代えて透析を用いていてもよい。また他の側面において、自由流動電気泳動を用いていてよい。
【0026】
具体的な一実施形態において、皮膚のストレス保護作用を有する細胞外膜小胞の製造方法は、椿の樹液から単離されたピキア・ナガニシイを、３６～３８℃の温度で培養して培養液を得る工程と、培養液から菌体を除去して培養上清を回収する工程と、培養上清から細胞外膜小胞を回収する工程と、を含む。
【0027】
（皮膚外用剤）
他の側面において、本実施形態の細胞外膜小胞は、化粧品、外用医薬品、医薬部外品等の外用剤として用いることができ、上述した方法で得られる細胞外膜小胞を、製剤学的に許容される適当な製剤担体を用いて一般的な皮膚外用剤の形態に調製し、皮膚をストレスから保護するために用いられる。
他の側面において、本実施形態の細胞外膜小胞は、化粧品、外用医薬品、医薬部外品等の外用剤として用いることができ、上述した方法で得られる細胞外膜小胞を、製剤学的に許容される適当な製剤担体を用いて一般的な皮膚外用剤の形態に調製し、皮膚をストレスから保護するために用いられる。
【0028】
一実施形態において、上記皮膚外用剤は化粧料組成物である。化粧料組成物には、本実施形態の細胞外膜小胞の他、機能性添加物及び一般の化粧料組成物に含まれる成分がさらに含まれていてよい。前記機能性添加物としては、水溶性ビタミン、油溶性ビタミン、高分子ペプチド、高分子多糖、スフィンゴ脂質、及び海藻エキスからなる群から選択された成分を含んでいてよい。それ以外に含まれる配合成分（好ましくは、細胞外膜小胞の構造が壊れない程度に配合される成分）としては、油脂成分、保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、有機及び無機顔料、有機粉体、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、植物抽出物、ｐＨ調整剤、色素、香料、血行促進剤、冷感剤、制汗剤、精製水などが挙げられる。
【0029】
本実施形態において、化粧料組成物は、好ましくは細胞外膜小胞の構造が壊れない程度に、化粧水、ローション、クリーム、オイル、パウダー、ジェルなどの形態に製造される。このために、本発明の組成物は、化粧料組成物の製造に通常使用する溶媒や、適切な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含んでもよい。
【0030】
本発明の化粧料組成物内にさらに追加される溶媒の種類は特に限定しないが、例えば、好ましくは細胞外膜小胞の構造が壊れない程度に、水、食塩水、ＤＭＳＯまたはこれらの組み合わせを使用することができ、担体、賦形剤または希釈剤としては、精製水、オイル、ワックス、脂肪酸、脂肪酸アルコール、脂肪酸エステル、吸湿剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）、増粘剤、抗酸化剤、粘度安定化剤、キレート剤、緩衝剤などが含まれるが、これらに制限されるわけではない。また、必要に応じて、美白剤、保湿剤、ビタミン、紫外線遮断剤、香水、染料、抗生剤、抗バクテリア剤、抗真菌剤を含むことができる。
【0031】
前記オイルとしては、水素化植物性油、ヒマシ油、綿実油、オリーブ油、パーム核油、ホホバ油、アボカド油が用いられ、ワックスとしては、密蝋、鯨蝋、カルナウバ、カンデリラ、モンテイン、セレシン、液体パラフィン、ラノリンが用いられる。
【0032】
その他にも、好ましくは、細胞外膜小胞の構造が壊れない程度に、化粧品分野で広く知られた吸湿剤、増粘剤、抗酸化剤などを含むことができ、これらの種類と量は、当業界で公知のものによる。
【0033】
他の実施形態において、上記皮膚外用剤は、医薬組成物であってよい。この医薬組成物は、本実施形態の細胞外膜小胞の他、防腐剤、安定化剤、水和剤、又は浸透圧調節のための塩及び／又は緩衝剤などの薬剤学的補助剤、及びその他治療的に有用な物質をさらに含有していてよく、通常の方法によって多様な非経口投与剤の形態で剤形化していてよい。非経口投与剤の形態としては、経皮投与型の剤形が挙げられ、例えば、注射剤、点滴剤、軟膏、ローション、ゲル、クリーム、スプレー、懸濁剤、乳剤、坐剤、パッチなどの剤形であってもよいが、これらに制限されるものではない。
【0034】
前記有効成分の投与量の決定は当業者の技術水準内にあり、薬物の１日投与用量は、投与しようとする対象の症状進行程度、発病時期、年齢、健康状態、合併症などの様々な要因により変わるが、成人を基準としたとき、一般には、前記組成物１μｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ、他の一側面において、５０μｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇを１日１～３回分けて投与していてよく、前記投与量は、如何なる方法であっても本明細書の範囲を限定するものではない。
【0035】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。なお、以下の実施例において、各種成分の添加量を示す数値の単位％は、質量％を意味する。また、酵母培養液のＯＤ値とは、酵母培養液を分光光度計で測定したときの波長６００ｎｍの吸光度である。
【実施例0036】
【0037】
（酵母培養液の作製）
細胞外膜小胞を回収（作製）するために、先ず、椿由来の酵母培養液、リンゴ由来の酵母培養液、カバノキ由来の酵母培養液を作製した。これらの酵母培養液は、ＯＤ値２．５以上となるような酵母数を含有する酵母培養液（ｐＨは約５．０～６．５の液）とした。
細胞外膜小胞を回収（作製）するために、先ず、椿由来の酵母培養液、リンゴ由来の酵母培養液、カバノキ由来の酵母培養液を作製した。これらの酵母培養液は、ＯＤ値２．５以上となるような酵母数を含有する酵母培養液（ｐＨは約５．０～６．５の液）とした。
【0038】
椿由来の酵母培養液に含有するための酵母として椿の樹液から単離されたピキア・ナガニシイ（Ｐｉｃｈｉａ ｎａｇａｎｉｓｈｉｉ、ＡＯＫ－Ｙ１９１８）、リンゴ由来の酵母培養液に含有するための酵母としてピキア・メンブラナファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、ＡＯＫ－Ｙ１２３８）、カバノキ由来の酵母培養液に含有するための酵母としてカバノキの樹液から単離されたピキア・ベロナエ（Ｐｉｃｈｉａ ｖｅｒｏｎａｅ、ＡＯＫ－Ｙ１９１５）を、それぞれ、斜面培地（スラント）に塗付した保管菌株を準備した。菌株の保管は、酵母エキス０．３％（和光純薬 ３９８－０２１５１）、麦芽エキス０．３％（ベクトン・ディッキンソン ２１８６３０）、グルコース１．０％（和光純薬 ０４９－３１１６５）、ペプトン０．５％（和光純薬 ３９８－０２１１７）を蒸留水に溶解し、ｐＨ６．０に調整後、寒天１．５％（和光純薬工業 ０１０－１５８１５）を添加して、１２１℃、２０分でオートクレーブ滅菌した後、分注固化した寒天培地を用いて行った。これらの酵母は、出願人である株式会社秋田今野商店の製品である。
【0039】
椿由来の酵母培養液は、上記保管菌株ＡＯＫ－Ｙ１９１８から、リンゴ由来の酵母培養液は、上記保管菌株ＡＯＫ－Ｙ１２３８から、カバノキ由来の酵母培養液は、上記保管菌株ＡＯＫ－Ｙ１９１５から、下記表１記載の組成の前培養液１０ｍＬの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、２５℃にて１日間、１２０ｒｐｍで振とう培養を行った。
【0040】
【表1】
【0041】
続いて、ＯＤ値２．０以上となった前培養液０．５ｍＬを、表１記載の組成の本培養液５０ｍＬの入ったフラスコに添加し、１２０ｒｐｍで振とうしながら２日間継代培養を行った。このとき、培養温度を、椿由来の酵母については、２５℃と３７℃にて、リンゴ由来の酵母については、２０℃と２５℃にて、カバノキ由来の酵母については、２０℃と２５℃にて本培養を行った。２日間培養後は、何れの酵母もＯＤ値２．５以上となった。
【0042】
（酵母培養液からの細胞外膜小胞の回収方法）
酵母培養液５０ｍＬ（ＯＤ値２．５以上）を、３０００×ｇ、４℃にて、５分間遠心して菌体を沈殿させた。この遠心分離後の上清を回収し、０．４５μｍと０．２２μｍのフィルターで濾過した。濾液を、分画分子量１０万の分画膜を有する限外濾過遠心器を用いて、２０００×ｇ、４℃にて、３０分間遠心濾過した。この上清を、１０ｍＬのＰＢＳ（－）で回収した。
酵母培養液５０ｍＬ（ＯＤ値２．５以上）を、３０００×ｇ、４℃にて、５分間遠心して菌体を沈殿させた。この遠心分離後の上清を回収し、０．４５μｍと０．２２μｍのフィルターで濾過した。濾液を、分画分子量１０万の分画膜を有する限外濾過遠心器を用いて、２０００×ｇ、４℃にて、３０分間遠心濾過した。この上清を、１０ｍＬのＰＢＳ（－）で回収した。
【0043】
回収した上清を、超遠心分離機を用いて、１０００００×ｇ、４℃にて、３時間超遠心分離を行った。その後、上清を除去し、ＰＢＳ（－）５ｍＬにてペレットを懸濁した。回収した懸濁液を、再度同じ条件で超遠心分離を行い、ＰＢＳ（－）５ｍＬにてペレットを懸濁し、さらに２ｍＬのＰＢＳ（－）で洗いこんだ後、分画分子量１０万の分画膜を有する限外濾過遠心器を用いて、２０００×ｇ、４℃にて、３０分間遠心濾過した。２００μＬのＰＢＳ（－）を２回用いて上清を回収し、細胞外膜小胞サンプルとした。得られたサンプルは、ｑＮＡＮＯで粒度観察した。
【0044】
リンゴ由来の酵母培養液から回収した細胞外膜小胞サンプルの粒径分布をｑＮＡＮＯナノ粒子マルチアナライザー（ＩＺＯＮ社製）で測定した結果を図１に示す。図１（Ａ）は、上述した方法において２０℃で培養した酵母から回収したサンプルであり、平均粒径１２５ｎｍ（標準偏差３０．２ｎｍ）、最大粒径３１２ｎｍ及び最小粒径９５ｎｍであった。一方、図１（Ｂ）は、２５℃で培養した酵母から回収したサンプルであり、平均粒径１８８ｎｍ（標準偏差３４．６ｎｍ）、最大粒径３４８ｎｍ及び最小粒径１２７ｎｍであった。これらの結果より、リンゴ由来のピキア・メンブラナファシエンスは、２５℃の培養温度にてヒートショックを受けて平均粒径が有意に増大すると考えられる。椿由来の酵母ピキア・ナガニシイ及びカバノキ由来の酵母ピキア・ベロナエについても、それぞれ３７℃及び２５℃の培養温度にてヒートショックを受けて平均粒径が増大する傾向が認められた。
【0045】
（熱ストレスによる細胞増殖能変化の評価）
正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）は、クラボウから購入し、ＫＢＭ－ＧｏｌｄＴＭ基本培地（ロンザ社製）中、３７℃、５％ＣＯ２条件下に炭酸ガスインキュベータで培養した。実験初日に、２×１０４個／ｍＬのＮＨＥＫ細胞を２４ウェルプレートに播種した。３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養後、２日目に、２４ウェルプレート内の培養液をＥＧＦ及びＢＰＥを含まないＫＢＭ－ＧｏｌｄＴＭ基本培地に交換した。上記で回収した酵母の細胞外膜小胞を種々の濃度に希釈して各ウェルに添加した。ブランクには、細胞外膜小胞を含まないＰＢＳを添加した。サンプル添加３時間後に、培養プレートを４５℃の恒温槽に移し１時間保持した（ストレス処理）。このストレス処理操作を１日１回、３日間連続して行い、サンプル添加７２時間後の細胞を回収した。実験開始後５日目に、回収した細胞の細胞増殖能を、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（株式会社同仁化学研究所）を用いて測定した。ブランクを添加した細胞についてストレス処理しないものを無処置対照とした。
正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）は、クラボウから購入し、ＫＢＭ－ＧｏｌｄＴＭ基本培地（ロンザ社製）中、３７℃、５％ＣＯ２条件下に炭酸ガスインキュベータで培養した。実験初日に、２×１０４個／ｍＬのＮＨＥＫ細胞を２４ウェルプレートに播種した。３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養後、２日目に、２４ウェルプレート内の培養液をＥＧＦ及びＢＰＥを含まないＫＢＭ－ＧｏｌｄＴＭ基本培地に交換した。上記で回収した酵母の細胞外膜小胞を種々の濃度に希釈して各ウェルに添加した。ブランクには、細胞外膜小胞を含まないＰＢＳを添加した。サンプル添加３時間後に、培養プレートを４５℃の恒温槽に移し１時間保持した（ストレス処理）。このストレス処理操作を１日１回、３日間連続して行い、サンプル添加７２時間後の細胞を回収した。実験開始後５日目に、回収した細胞の細胞増殖能を、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（株式会社同仁化学研究所）を用いて測定した。ブランクを添加した細胞についてストレス処理しないものを無処置対照とした。
【0046】
その結果を図２～図４に示す。グラフの横軸について説明する。「Ｃｏｎｔｒｏｌ ｎｏｒｍａｌ」は、細胞外膜小胞を含まないＰＢＳ（ブランク）を添加した細胞（ＮＨＥＫ）について、ストレス処理しない無処置対照群を意味する。「ｂｌａｎｋ」は、細胞（ＮＨＥＫ）をストレス処置したが、酵母由来の細胞外膜小胞を添加していない群を意味する。、粒子数（個／ｍＬ）は、所定の温度で培養した酵母由来の細胞外膜小胞の個数を意味する。また、グラフの縦軸に示した細胞増殖率（％）は、各サンプルを添加した場合の細胞数を、Ｃｏｎｔｒｏｌ ｎｏｒｍａｌ（１００％とする）と比較したときの相対値（％）で示す。図２（Ａ）は、椿由来の酵母を２５℃で培養した培養液から回収した細胞外膜小胞を用いた測定結果である。図２（Ｂ）は、同酵母を３７℃にて培養した培養液から回収した細胞外膜小胞を用いた測定結果である。無処置対象群に比べて、正常ヒト表皮角化細胞をストレス処理したブランクでは細胞増殖率が大きく低下するが、３７℃で培養した酵母由来の細胞外小胞を添加した場合には、濃度依存的に有意に細胞増殖率が回復した。一方、２５℃で培養した酵母由来の細胞外小胞を添加した場合には有意差は認められなかった。図３及び図４は、酵母の種類をそれぞれリンゴ由来及びカバノキ由来の酵母に変えて同様の評価を行った結果である。いずれの酵母についてもヒートショック条件である２５℃で培養した場合の細胞外膜小胞を添加すると、正常ヒト表皮角化細胞の細胞増殖率が有意に回復した。これらの結果より、ヒートショックされた酵母に由来する細胞外膜小胞は、正常ヒト表皮角化細胞をストレスから保護する作用を有することが示唆された。
【0047】
（実験２：麹エキス培地により作製された酵母に由来する細胞外膜小胞の作用効果の確認）
この実験２では、麹エキス培地により作製された酵母に由来する細胞外膜小胞の作用効果を確認した。この確認結果を以下記載する。
この実験２では、麹エキス培地により作製された酵母に由来する細胞外膜小胞の作用効果を確認した。この確認結果を以下記載する。
【0048】
（酵母培養液の作製）
細胞外膜小胞を回収（作製）するために、先ず、リンゴ由来の酵母培養液を作製した。これらの酵母培養液は、ＯＤ値２．５以上となるような酵母数を含有する酵母培養液（培養開始時のｐＨは８．０の液）とした。
細胞外膜小胞を回収（作製）するために、先ず、リンゴ由来の酵母培養液を作製した。これらの酵母培養液は、ＯＤ値２．５以上となるような酵母数を含有する酵母培養液（培養開始時のｐＨは８．０の液）とした。
【0049】
リンゴ由来の酵母培養液に含有するための酵母としてピキア・メンブラナファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、ＡＯＫ－Ｙ１２３８）を、斜面培地（スラント）に塗付した保管菌株を準備した。
【0050】
当該保管菌株の酵母を、下記表２記載の組成の培地１０ｍＬの入った試験管に白金耳を用いて植菌し、２５℃にて１日間、１２０ｒｐｍで振とう培養を行った。
【0051】
【表2】
【0052】
なお、表２に記載の米麹エキスは、秋田今野商店が製造の種麹「Ｎｏ．５」（菌種：Aspergillus oryzae）と精米歩合７０％の秋田県産米を用いて、以下のように製造された。まず、当該秋田県産米を洗浄及び吸水の後に１時間蒸して放冷した。当該放冷の後の米に、当該種麹を接種して、麹蓋を用いて３５℃前後、湿度９０％前後に維持して５日間培養した。当該培養を経て米麹を得た。当該米麹に対し４倍量の精製水を加え、６０℃で６時間湯煎した、当該湯煎後に、当該湯煎物を濾過し、さらに煮沸濃縮の後に再び濾過し、清澄な麹抽出液（米麹エキス）を得た。
【0053】
続いて、ＯＤ値２．０以上となった前培養液０．５ｍＬを、表２記載の組成の培地５０ｍＬの入ったフラスコに添加し、１２０ｒｐｍで振とうしながら２日間継代培養を行った。このとき、培養温度を、リンゴ由来の酵母については、２０℃又は２５℃にて本培養を行った。この２５℃の本培養は、この２０℃の本培養と違い、当該酵母に対してヒートショックを与える条件での培養である。２日間培養後は、何れの酵母もＯＤ値２．５以上となった。
【0054】
（酵母培養液からの細胞外膜小胞の回収方法）
酵母培養液５０ｍＬ（ＯＤ値２．５以上）を、３０００×ｇ、４℃にて、５分間遠心して菌体を沈殿させた。この遠心分離後の上清を回収し、０．４５μｍと０．２２μｍのフィルターで濾過した。濾液を、分画分子量１０万の分画膜を有する限外濾過遠心器を用いて、２０００×ｇ、４℃にて、３０分間遠心濾過した。この上清を、１０ｍＬのＰＢＳ（－）で回収した。
酵母培養液５０ｍＬ（ＯＤ値２．５以上）を、３０００×ｇ、４℃にて、５分間遠心して菌体を沈殿させた。この遠心分離後の上清を回収し、０．４５μｍと０．２２μｍのフィルターで濾過した。濾液を、分画分子量１０万の分画膜を有する限外濾過遠心器を用いて、２０００×ｇ、４℃にて、３０分間遠心濾過した。この上清を、１０ｍＬのＰＢＳ（－）で回収した。
【0055】
回収した上清を、超遠心分離機を用いて、１０００００×ｇ、４℃にて、３時間超遠心分離を行った。その後、上清を除去し、ＰＢＳ（－）５ｍＬにてペレットを懸濁した。回収した懸濁液を、再度同じ条件で超遠心分離を行い、ＰＢＳ（－）５ｍＬにてペレットを懸濁し、さらに２ｍＬのＰＢＳ（－）で洗いこんだ後、分画分子量１０万の分画膜を有する限外濾過遠心器を用いて、２０００×ｇ、４℃にて、３０分間遠心濾過した。２００μＬのＰＢＳ（－）を２回用いて上清を回収し、細胞外膜小胞サンプルとした。
【0056】
（熱ストレスによる細胞増殖能変化の評価）
正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）は、クラボウから購入し、ＫＢＭ－ＧｏｌｄＴＭ基本培地（ロンザ社製）中、３７℃、５％ＣＯ２条件下に炭酸ガスインキュベータで培養した。実験初日に、２×１０４個／ｍＬのＮＨＥＫ細胞を２４ウェルプレートに播種した。３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養後、２日目に、２４ウェルプレート内の培養液をＥＧＦ及びＢＰＥを含まないＫＢＭ－ＧｏｌｄＴＭ基本培地に交換した。上記で回収した酵母の細胞外膜小胞を最終濃度（１×１０６ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ）になるように各ウェルに添加して、以下のような実験群を設定した。実験群とストレス処理を以下説明する。
正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）は、クラボウから購入し、ＫＢＭ－ＧｏｌｄＴＭ基本培地（ロンザ社製）中、３７℃、５％ＣＯ２条件下に炭酸ガスインキュベータで培養した。実験初日に、２×１０４個／ｍＬのＮＨＥＫ細胞を２４ウェルプレートに播種した。３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養後、２日目に、２４ウェルプレート内の培養液をＥＧＦ及びＢＰＥを含まないＫＢＭ－ＧｏｌｄＴＭ基本培地に交換した。上記で回収した酵母の細胞外膜小胞を最終濃度（１×１０６ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ）になるように各ウェルに添加して、以下のような実験群を設定した。実験群とストレス処理を以下説明する。
【0057】
・群１：当該細胞外膜小胞を添加しない群（ＰＢＳのみ添加した群）で、以下ストレス処理を行わず、３７℃にて５％ＣＯ２条件下という通常培養のみを行った群。
・群２：当該細胞外膜小胞を添加しない群（ＰＢＳのみ添加した群）で、以下ストレス処理を行った群。
・群３：当該細胞外膜小胞（表２による培養を当該２０℃の本培養を行って作製した酵母から作製）を最終濃度（１×１０６ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ）となるように添加した群で、以下ストレス処理を行った群。
・群４：当該細胞外膜小胞（表２による培養を当該２５℃の本培養（酵母にヒートショックを与える条件）で行って作製した酵母から作製）を最終濃度（１×１０６ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ）となるように添加した群で、以下ストレス処理を行った群。
・ストレス処理：培養プレートを４５℃の恒温槽に移し１時間保持する処理。この処理操作を１日１回、３日間連続して行った。
・群２：当該細胞外膜小胞を添加しない群（ＰＢＳのみ添加した群）で、以下ストレス処理を行った群。
・群３：当該細胞外膜小胞（表２による培養を当該２０℃の本培養を行って作製した酵母から作製）を最終濃度（１×１０６ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ）となるように添加した群で、以下ストレス処理を行った群。
・群４：当該細胞外膜小胞（表２による培養を当該２５℃の本培養（酵母にヒートショックを与える条件）で行って作製した酵母から作製）を最終濃度（１×１０６ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ）となるように添加した群で、以下ストレス処理を行った群。
・ストレス処理：培養プレートを４５℃の恒温槽に移し１時間保持する処理。この処理操作を１日１回、３日間連続して行った。
【0058】
当該群１から群４の培養を当該サンプル添加後７２時間（ストレス処理を除き、３７℃、５％ＣＯ２条件下に炭酸ガスインキュベータで培養）培養を行った。当該培養後、各群の細胞を回収した。実験開始後５日目に、回収した細胞の細胞数（細胞増殖能）を、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（株式会社同仁化学研究所）を用いて測定した。
【0059】
【表3】
【0060】
その結果を表３に示す。測定結果は、各実験群それぞれの平均値（ｎ＝４）を記載するが、群１の値を１００として記載する。表３中の「＊＊」は、群２の測定結果と比べての有意差（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、ｐ＜０．０１）を示す。群２と比べて、少なくとも、細胞外膜小胞（表２による培養を当該２５℃の本培養（酵母にヒートショックを与える条件）で行って作製した酵母から作製）を添加した群（群４）では、正常ヒト表皮角化細胞の細胞増殖能が高いこと（細胞増殖能が回復したこと）が確認できた。この実験２の結果からも、「所定の酵母に由来する細胞外膜小胞が、正常ヒト表皮角化細胞をストレスから保護する作用を有すること」が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【0061】
本発明で提供する植物由来の細胞外小胞体は、皮膚透過度に優れかつ、吸収時、皮膚保湿、皮膚美白、シワ改善および老化防止などの皮膚改善効果に優れているだけでなく、皮膚に対する刺激や副作用がなく安全である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
