(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022031633
(43)【公開日】2022-02-22
(54)【発明の名称】プロテアーゼ変異体およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/57 20060101AFI20220215BHJP
C12N 9/54 20060101ALI20220215BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20220215BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220215BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220215BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220215BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220215BHJP
C11D 3/386 20060101ALI20220215BHJP
C11D 17/08 20060101ALI20220215BHJP
C11D 17/06 20060101ALI20220215BHJP
C12N 9/56 20060101ALI20220215BHJP
C12N 9/50 20060101ALN20220215BHJP
C12N 9/00 20060101ALN20220215BHJP
【FI】
C12N15/57
C12N9/54 ZNA
C12N15/31
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C11D3/386
C11D17/08
C11D17/06
C12N9/56
C12N9/50
C12N9/00
【審査請求】有
【請求項の数】14
【出願形態】OL
(21)【出願番号】P 2021167475
(22)【出願日】2021-10-12
(62)【分割の表示】P 2018557877の分割
【原出願日】2017-05-03
(31)【優先権主張番号】62/331,282
(32)【優先日】2016-05-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】509240479
【氏名又は名称】ダニスコ・ユーエス・インク
(74)【代理人】
【識別番号】100071010
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 行造
(74)【代理人】
【識別番号】100118647
【弁理士】
【氏名又は名称】赤松 利昭
(74)【代理人】
【識別番号】100123892
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 忠雄
(74)【代理人】
【識別番号】100169993
【弁理士】
【氏名又は名称】今井 千裕
(74)【代理人】
【識別番号】100173978
【弁理士】
【氏名又は名称】朴 志恩
(72)【発明者】
【氏名】ワイルズ、デイビッド エドワード
(72)【発明者】
【氏名】ムノス、ジェフリー ウェイン
(72)【発明者】
【氏名】アミン、ニーラム エス
(72)【発明者】
【氏名】マルケズ、デイヴィッド
(72)【発明者】
【氏名】フアン、ヴィクトリア
(72)【発明者】
【氏名】ヴィーラムトゥ、ジータ
(72)【発明者】
【氏名】大塚 怜
(72)【発明者】
【氏名】スーター、フィリップ エフ
(72)【発明者】
【氏名】タービット、デイヴィッド ジョン
(72)【発明者】
【氏名】ジャクソン、ミシェル
(72)【発明者】
【氏名】ペレズ-プラット ヴィヌエサ、エヴァ マリア
(72)【発明者】
【氏名】マゲニス、ユアン ジョン
(72)【発明者】
【氏名】ベイブ、リリア マリア
(72)【発明者】
【氏名】バスラー、ジョシュア ロイ
(72)【発明者】
【氏名】エステル、デービッド エー
(72)【発明者】
【氏名】アレクセーエフ、ビクター ユリエヴィッチ
(57)【要約】 (修正有)
【課題】洗浄用途および洗浄方法に有用なスブチリシン変異体を提供する。
【解決手段】X78N-X206Yを含むアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含む単離されたスブチリシン変異体であって、前記変異体は特定のアミノ酸配列を有するプロテアーゼと比較して1つ以上の改善された特性を有し、前記改善された特性は、改善されたプロテアーゼ活性、洗剤の改善された洗浄性能、および洗剤の改善された熱安定性から選択されるものである、スブチリシン変異体を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
78-X206A/D/F/G/H/M/N/P/R/S/Y、X78A/C/E/F
/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-206、X78N-X206
F/M/Y、X78G-X206D/F/H/M/N/P/R/Y、X78A/C/E/
F/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-X206A/D/F/G/H/
M/N/P/R/S/Y、18-X78N、X18K/R-X78N、18-X87R、
X18K/R-X87R、18-X206L/Y、X18K/R-X206L/Y、24
-X87R、X24F/L/P/R-X87R、24-X206Y、X24F/L/P-
206、X24F/L/P-X206Y、X24F/L/P-X209W、40-78、
X40E-78、40-X78G、X40E-X78G、40-87、X40E-87、
40-X87R、X40E-X87R、40-129、40-X129Q、X40E-1
29、X40E-X129Q、40-130、40-X130A、X40E-130、X
40E-X130A、40-206、X40E-206、40-X206Y、X40E-
X206Y、X78N-87、X78N-X87D/R、X78A/C/E/F/G/H
/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-87、X78G-X87D/R/T、
X78A/C/E/F/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-X87R、
X78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-129
、X78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-X1
29Q、X78A/C/E/F/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-X
130A、X78G-X130A/Q、X78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M
/P/Q/R/T/V/W/Y-130、78-X249N/R、X78N-249、X
78N-X249N/R、87-X206L/Y、X87D/R-X206L/Y、87
-X209W、X87D/R-X209W、87-X213A、X87D/R-213、
X87D/R-X213A、X87R-X249N/R、129-X206Y、X129
Q-X206Y、129-X249N/R、X129Q-249、X129Q-X249
N/R、130-X206Y、X130A-X206R/Y、130-X249N/R、
X130A-249、X130A-X249N/R、X206Y-209、X206Y-
X209W、206-X213A、X206L/Y-213、X206L/Y-X213
A、X206L/Y-249、X206L/Y-X249N/R、X209W-213、
X209W-X213A、X209W-249、X209W-X249N/R、18-2
4-78、X18K/R-24-78、18-X24F/L/P/R-78、18-24
-X78N、X18K/R-24-X78N、18-X24F/L/P/R-X78N、
X18K/R-X24F/L/P/R-78、X18K/R-X24F/L/P/R-X
78N、18-24-87、X18K/R-24-87、18-X24F/L/P/R-
87、18-24-X87D/R、X18K/R-24-X87D/R、18-X24F
/L/P/R-X87D/R、X18K/R-X24F/L/P/R-87、X18K/
R-X24F/L/P/R-X87D/R、18-24-129、X18K/R-24-
129、18-X24F/L/P/R-129、18-24-X129Q、X18K/R
-X24F/L/P/R-129、X18K/R-24-X129Q、18-X24F/
L/P/R-X129Q、X18K/R-X24F/L/P/R-X129Q、18-2
4-130、18-X24F/L/P/R-130、18-24-X130A、X18K
/R-24-130、X18K/R-X24F/L/P/R-130、X18K/R-2
4-X130A、18-X24F/L/P/R-X130A、X18K/R-X24F/
L/P/R-X130A、18-24-206、18-24-X206L/Y、18-X
24F/L/P/R-206、X18K/R-24-206、X18K/R-24-X2
06L/Y、18-X24F/L/P/R-X206L/Y、X18K/R-X24F/
L/P/R-206、X18K/R-X24F/L/P/R-X206L/Y、18-2
4-209、18-24-X209W、18-X24F/L/P/R-209、X18K
/R-24-209、X18K/R-24-X209W、18-X24F/L/P/R-
X209W、X18K/R-X24F/L/P/R-209、X18K/R-X24F/
L/P/R-X209W、18-78-87、18-X78N-87、18-78-X8
7D/R、X18K/R-78-87、X18K/R-X78N-87、X18K/R-
78-X87D/R、18-X78N-X87D/R、X18K/R-X78N-X87
D/R、18-78-129、18-X78N-129、18-78-X129Q、X1
8K/R-78-129、X18K/R-X78N-129、X18K/R-78-X1
29Q、18-X78N-X129Q、X18K/R-X78N-X129Q、18-7
8-130、18-X78N-130、18-78-X130A、X18K/R-78-
130、X18K/R-X78N-130、X18K/R-78-X130A、18-X
78N-X130A、X18K/R-X78N-X130A、18-78-206、18
-78-X206L/Y、18-X78N-206、X18K/R-78-206、18
-X78N-X206L/Y、X18K/R-X78N-206、X18K/R-78-
X206L/Y、X18K/R-X78N-X206L/Y、18-78-209、18
-X78N-209、18-78-X209W、X18K/R-78-209、X18K
/R-78-X209W、18-X78N-X209W、X18K/R-X78N-20
9、X18K/R-X78N-X209W、18-78-213、18-X78N-21
3、18-78-X213A、X18K/R-78-213、18-X78N-X213
A、X18K/R-X78N-213、X18K/R-78-X213A、X18K/R
-X78N-X213A、18-78-249、18-78-X249N/R、18-X
78N-249、X18K/R-78-249、18-X78N-X249N/R、X1
8K/R-X78N-249、X18K/R-78-X249N/R、X18K/R-X
78N-X249N/R、18-87-129、X18K/R-87-129、18-X
87D/R-129、18-87-X129Q、18-X87D/R-X129Q、X1
8K/R-87-X129Q、X18K/R-X87D/R-129、X18K/R-X
87D/R-X129Q、18-87-130、X18K/R-87-130、18-X
87D/R-130、18-87-X130A、18-X87D/R-X130A、X1
8K/R-87-X130A、X18K/R-X87D/R-130、X18K/R-X
87D/R-X130A、18-87-206、X18K/R-87-206、18-X
87D/R-206、18-87-X206L/Y、18-X87D/R-X206L/
Y、X18K/R-87-X206L/Y、X18K/R-X87D/R-206、X1
8K/R-X87D/R-X206L/Y、18-87-209、X18K/R-87-
209、18-X87D/R-209、18-87-X209W、18-X87D/R-
X209W、X18K/R-X87D/R-209、X18K/R-87-X209W、
X18K/R-X87D/R-X209W、18-X87D/R-213、18-87-
X213A、18-X87D/R-X213A、X18K/R-X87D/R-213、
X18K/R-87-X213A、X18K/R-X87D/R-X213A、18-8
7-249、X18K/R-87-249、18-X87D/R-249、18-87-
X249N/R、18-X87D/R-249N/R、18K/R-X87D/R-24
9、18K/R-87-X249N/R、18K/R-X87D/R-X249N/R、
18-129-130、X18K/R-129-130、18-X129Q-130、1
8-129-X130A、X18K/R-X129Q-130、X18K/R-129-
X130A、18-X129Q-X130A、X18K/R-X129Q-X130A、
18-129-206、X18K/R-129-206、18-X129Q-206、1
8-129-X206L/Y、X18K/R-X129Q-206、X18K/R-12
9-X206L/Y、18-X129Q-X206L/Y、X18K/R-X129Q-
X206L/Y、18-129-209、X18K/R-129-209、18-X12
9Q-209、18-129-X209W、X18K/R-X129Q-209、X18
K/R-129-X209W、18-X129Q-X209W、X18K/R-X129
Q-X209W、18-129-213、X18K/R-129-213、18-X12
9Q-213、18-129-X213A、X18K/R-X129Q-213、X18
K/R-129-X213A、18-X129Q-X213A、X18K/R-X129
Q-X213A、18-129-249、X18K/R-129-249、18-X12
9Q-249、18-129-X249N/R、X18K/R-X129Q-249、X
18K/R-129-X249N/R、18-X129Q-X249N/R、X18K/
R-X129Q-X249N/R、18-130-206、X18K/R-130-20
6、18-X130A-206、18-130-X206L/Y、X18K/R-X13
0A-206、X18K/R-130-X206L/Y、18-X130A-X206L
/Y、X18K/R-X130A-X206L/Y、18-130-209、X18K/
R-130-209、18-X130A-209、18-130-X209W、X18K
/R-X130A-209、X18K/R-130-X209W、18-X130A-X
209W、X18K/R-X130A-X209W、18-130-213、X18K/
R-130-213、18-X130A-213、18-130-X213A、X18K
/R-X130A-213、X18K/R-130-X213A、18-X130A-X
213A、X18K/R-X130A-X213A、18-130-249、X18K/
R-130-249、18-X130A-249、18-130-X249N/R、X1
8K/R-X130A-249、X18K/R-130-X249N/R、18-X13
0A-X249N/R、X18K/R-X130A-X249N/R、18-206-2
09、18-206-X209W、18-X206L/Y-209、18K/R-206
-209、18-X206L/Y-X209W、X18K/R-X206L/Y-209
、X18K/R-206-X209W、X18K/R-X206L/Y-X209W、1
8-206-213、X18K/R-206-213、18-206L/Y-213、1
8-206-X213A、X18K/R-X206L/Y-213、X18K/R-20
6-X213A、18-X206L/Y-X213A、X18K/R-X206L/Y-
X213A、18-206-249、X18K/R-206-249、18-206L/
Y-249、18-206-X249N/R、X18K/R-X206L/Y-249、
X18K/R-206-X249N/R、18-X206L/Y-X249N/R、X1
8K/R-X206L/Y-X249N/R、18-209-213、18-X209W
-213、X18K/R-209-213、18-209-X213A、18-X209
W-X213A、X18K/R-X209W-213、X18K/R-209-X213
A、X18K/R-X209W-X213A、18-209-249、18-X209W
-249、X18K/R-209-249、18-209-X249N/R、18-X2
09W-X249N/R、18K/R-X209W-249、X18K/R-209-X
249N/R、X18K/R-X209W-X249N/R、18-213-X249N
/R、X18K/R-X213A-249、X18K/R-213-X249N/R、1
8-X213A-X249N/R、X18K/R-X213A-X249N/R、24-
78-87、24-78-X87D/R、24-X78N-87、X24F/L/P/R
-78-87、24-X78N-X87D/R、X24R/P/F-78-X87D/R
、X24F/L/P/R-X78N-87、X24R/P/F-X78N-X87D/R
、X24F/L/P-78-129、X24F/L/P-X78N-129、X24F/
L/P-78-X129Q、X24F/L/P-X78N-X129Q、X24F/L/
P-78-130、X24F/L/P-X78N-130、X24F/L/P-78-X
130A、X24F/L/P-X78N-X130A、24-78-X206Y、X24
F/L/P-78-206、24-X78N-X206Y、X24F/L/P-X78N
-206、X24F/L/P-78-X206L/Y、X24F/L/P-X78N-X
206L/Y、X24F/L/P-78-209、X24F/L/P-X78N-209
、X24F/L/P-78-X209W、X24F/L/P-X78N-X209W、2
4-78-213、X24F/L/P/R-78-213、24-X78N-213、2
4-78-X213A、X24F/L/P/R-X78N-213、X24F/L/P/
R-78-X213A、24-X78N-X213A、X24F/L/P/R-X78N
-X213A、24-78-X249N/R、24-X78N-249、24-X78N
-X249N/R、X24F/L/P/R-X78N-249、X24F/L/P/R-
78-X249N/R、X24F/L/P/R-X78N-X249N/R、24-87
-129、X24F/L/P/R-87-129、24-X87D/R-129、24-
87-X129Q、X24F/L/P/R-X87D/R-129、X24F/L/P/
R-87-X129Q、24-X87D/R-X129Q、X24F/L/P/R-X8
7D/R-X129Q、24-87-130、X24F/L/P/R-87-130、2
4-X87D/R-130、24-87-X130A、X24F/L/P/R-X87D
/R-130、X24F/L/P/R-87-X130A、24-X87D/R-X13
0A、X24F/L/P/R-X87D/R-X130A、24-87-X206L/Y
、24-X87R-206、X24F/L/P/R-87-206、24-X87D/R
-X206L/Y、X24F/L/P/R-X87D/R-206、X24F/L/P/
R-87-X206L/Y、X24F/L/P/R-X87D/R-X206L/Y、2
4-87-X209W、X24F/L/P/R-87-X209W、24-87-X20
9W、24-87D/R-X209W、X24F/L/P/R-X87D/R-X209
W、24-X87D/R-213、24-87-X213A、24-X87D/R-X2
13A、X24F/L/P/R-X87D/R-213、X24F/L/P/R-87-
X213A、X24F/L/P/R-X87D/R-X213A、24-87-249、
X24F/L/P/R-87-249、24-X87D/R-249、24-87-X2
49N/R、X24F/L/P/R-X87D/R-249、X24F/L/P/R-8
7-X249N/R、24-X87D/R-X249N/R、X24F/L/P/R-X
87D/R-X249N/R、X24F/L/P-129-130、X24F/L/P-
X129Q-130、X24F/L/P-129-X130A、X24F/L/P-X1
29Q-X130A、X24F/L/P-129-206、24-129-X206Y、
X24F/L/P-X129Q-206、X24F/L/P-129-X206Y、24
-X129Q-X206Y、X24F/L/P-X129Q-X206L/Y、X24F
/L/P/R-X129Q-X206Y、X24F/L/P-129-209、X24F
/L/P-X129Q-209、X24F/L/P-129-X209W、X24F/L
/P-X129Q-X209W、24-129-213、X24F/L/P/R-129
-213、24-X129Q-213、24-129-X213A、X24F/L/P/
R-X129Q-213、X24F/L/P/R-129-X213A、24-X129
Q-X213A、X24F/L/P/R-X129Q-X213A、24-129-24
9、X24F/L/P/R-129-249、24-X129Q-249、24-129
-X249N/R、X24F/L/P/R-X129Q-249、X24F/L/P/R
-129-X249N/R、24-X129Q-X249N/R、X24F/L/P/R
-X129Q-X249N/R、X24F/L/P-130-206、24-130-X
206Y、X24F/L/P-X130A-206、X24F/L/P-130-X20
6L/Y、X24F/L/P/R-130-X206Y、24-X130A-X206Y
、X24F/L/P-X130A-X206L/Y、X24F/L/P/R-X130A
-X206Y、X24F/L/P-130-209、X24F/L/P-X130A-2
09、X24F/L/P-130-X209W、X24F/L/P-X130A-X20
9W、24-130-213、X24F/L/P/R-130-213、24-X130
A-213、24-130-X213A、X24F/L/P/R-X130A-213、
X24F/L/P/R-130-X213A、24-X130A-X213A、X24F
/L/P/R-X130A-X213A、24-130-249、X24F/L/P/R
-130-249、24-X130A-249、24-130-X249N/R、X24
F/L/P/R-X130A-249、X24F/L/P/R-130-X249N/R
、24-X130A-X249N/R、X24F/L/P/R-X130A-X249N
/R、24-X206Y-209、24F/L/P-206-209、24-X206Y
-X209W、X24F/L/P-X206L/Y-209、X24F/L/P/R-X
206Y-209、X24F/L/P-206-X209W、X24F/L/P-X20
6L/Y-X209W、X24F/L/P/R-X206Y-X209W、24-206
-213、X24F/L/P/R-206-213、24-X206L/Y-213、2
4-206-X213A、X24F/L/P/R-X206L/Y-213、X24F/
L/P/R-206-X213A、24-X206L/Y-X213A、X24F/L/
P/R-X206L/Y-X213A、24-206-249、24-X206L/Y-
249、X24F/L/P/R-206-249、24-206-X249N/R、24
-X206L/Y-X249N/R、X24F/L/P/R-X206L/Y-249、
X24F/L/P/R-206-X249N/R、X24F/L/P/R-X206L/
Y-X249N/R、24-209-213、24-X209W-213、X24F/L
/P/R-209-213、24-209-X213A、X24F/L/P/R-X20
9W-213、24-X209W-X213A、X24F/L/P/R-209-X21
3A、X24F/L/P/R-X209W-X213A、24-209-249、24-
X209W-249、X24F/L/P/R-209-249、24-209-X249
N/R、X24F/L/P/R-X209W-249、24-X209W-X249N/
R、X24F/L/P/R-209-X249N/R、X24F/L/P/R-X209
W-X249N/R、78-87-129、X78N-87-129、78-X87D/
R-129、78-87-X129Q、X78N-X87D/R-129、X78N-8
7-X129Q、78-X87D/R-X129Q、X78N-X87D/R-X129
Q、78-87-130、X78N-87-130、78-X87D/R-130、78
-87-X130A、X78N-X87D/R-130、X78N-87-X130A、
78-X87D/R-X130A、X78N-X87D/R-X130A、78-87-
206、78-87-X206L/R/Y、X78N-87-206、78-X87D/
R-206、78-X87D/R-X206L/R/Y、X78N-87-X206L/
R/Y、X78N-X87D/R-206、X78N-X87D/R-X206L/R/
Y、78-87-209、78-87-X209W、X78N-87-209、78-X
87D/R-209、X78N-X87D/R-209、78-X87D/R-X209
W、X78N-87-X209W、X78N-X87D/R-X209W、78-87-
213、X78N-87-213、78-X87D/R-213、78-87-X213
A、X78N-X87D/R-213、X78N-87-X213A、78-X87D/
R-X213A、X78N-X87D/R-X213A、78-87-249、78-8
7-X249N/R、X78N-87-249、78-87D/R-249、X78N-
X87D/R-249、78-X87D/R-X249N/R、X78N-87-X24
9N/R、X78N-X87D/R-X249N/R、78-129-X206R/Y、
X78N-129-X206Y、78-X129Q-X206R/Y、X78N-X12
9Q-X206Y、78-129-213、X78N-129-213、78-X129
Q-213、78-129-X213A、X78N-X129Q-213、X78N-1
29-X213A、78-X129Q-X213A、X78N-X129Q-X213A
、78-129-249、X78N-129-249、78-X129Q-249、78
-129-X249N/R、X78N-X129Q-249、X78N-129-X24
9N/R、78-X129Q-X249N/R、X78N-X129Q-X249N/R
、78-130-X206R/Y、X78N-130-X206Y、78-X130A-
X206R/Y、X78N-X130A-X206Y、78-130-213、X78N
-130-213、78-X130A-213、78-130-X213A、X78N-
X130A-213、X78N-130-X213A、78-X130A-X213A、
X78N-X130A-X213A、78-130-213、X78N-130-213
、78-X130A-213、78-130-X213A、X78N-X130A-21
3、X78N-130-X213A、78-X130A-X213A、X78N-X13
0A-X213A、78-130-249、X78N-130-249、78-X130
A-249、78-130-X249N/R、X78N-X130A-249、X78N
-130-X249N/R、78-X130A-X249N/R、X78N-X130A
-X249N/R、78-206-209、X78N-206-209、78-X206
L/Y-209、78-206-X209W、X78N-X206L/Y-209、X7
8N-206-X209W、78-X206L/Y-X209W、X78N-X206L
/Y-X209W、78-206-213、X78N-206-213、78-X206
L/Y-213、78-206-X213A、X78N-X206L/Y-213、X7
8N-206-X213A、78-X206L/Y-X213A、X78N-X206L
/Y-X213A、78-206-249、78-206-X249R/N、78-X2
06L/Y-249、X78N-206-249、X78N-206-X249N/R、
78-X206L/Y-X249N/R、X78N-X206L/Y-249、X78N
-X206L/Y-X249N/R、78-209-213、78-X209W-213
、78-209-X213A、X78N-209-213、X78N-X209W-21
3、X78N-209-X213A、78-X209W-X213A、X78N-X20
9W-X213A、78-209-249、78-X209W-249、78-209-
X249N/R、X78N-209-249、78-X209W-X249N/R、X7
8N-X209W-249、X78N-209-X249N/R、X78N-X209W
-X249N/R、78-213-249、78-X213A-249、X78N-21
3-249、78-213-X249N/R、X78N-X213A-249、X78N
-213-X249N/R、78-X213A-X249N/R、X78N-X213A
-X249N/R、87-129-130、X87D/R-129-130、87-X1
29Q-130、87-129-X130A、X87D/R-X129Q-130、X8
7D/R-129-X130A、87-X129Q-X130A、X87D/R-X12
9Q-X130A、87-129-206、X87D/R-129-206、87-X1
29Q-206、87-129-X206L/R/Y、X87D/R-X129Q-20
6、X87D/R-129-X206L/R/Y、87-X129Q-X206L/R/
Y、X87D/R-X129Q-X206L/R/Y、87-129-209、X87D
/R-129-209、87-X129Q-209、87-129-X209W、X87
D/R-X129Q-209、X87D/R-129-X209W、87-X129Q-
X209W、X87D/R-X129Q-X209W、87-129-213、X87D
/R-129-213、87-X129Q-213、87-129-X213A、X87
D/R-X129Q-213、X87D/R-129-X213A、87-X129Q-
X213A、X87D/R-X129Q-X213A、87-129-249、X87D
/R-129-249、87-X129Q-249、87-129-X249N/R、X
87D/R-X129Q-249、X87D/R-129-X249N/R、87-X1
29Q-X249N/R、X87D/R-X129Q-X249N/R、87-130-
206、X87D/R-130-206、87-X130A-206、87-130-X
206L/R/Y、X87D/R-X130A-206、X87D/R-130-X20
6L/R/Y、87-X130A-X206L/R/Y、X87D/R-X130A-X
206L/R/Y、87-130-209、X87D/R-130-209、87-X1
30A-209、87-130-X209W、X87D/R-X130A-209、X8
7D/R-130-X209W、87-X130A-X209W、X87D/R-X13
0A-X209W、87-130-213、X87D/R-130-213、87-X1
30A-213、87-130-X213A、X87D/R-X130A-213、X8
7D/R-130-X213A、87-X130A-X213A、X87D/R-X13
0A-X213A、87-130-249、X87D/R-130-249、87-X1
30A-249、87-130-X249N/R、X87D/R-X130A-249、
X87D/R-130-X249N/R、87-X130A-X249N/R、X87D
/R-X130A-X249N/R、87-206-209、X87D/R-206-2
09、87-X206L/Y-209、87-206-X209W、X87D/R-X2
06L/Y-209、X87D/R-206-X209W、87-X206L/Y-X2
09W、X87D/R-X206L/Y-X209W、87-206-213、87-X
206L/Y-213、87-206-X213A、X87D/R-206-213、X
87D/R-X206L/Y-213、X87D/R-206-X213A、87-X2
06L/Y-X213A、X87D/R-X206L/Y-X213A、87-206-
249、87-X206L/Y-249、87D/R-206-249、87-209-
X249N/R、X87R-206-X249N/R、X87D/R-X206L/Y-
249、87-X206L/Y-X249N/R、X87R-X206L/Y-X249
N/R、87-209-213、X87D/R-209-213、87-X209W-2
13、87-209-X213A、X87D/R-X209W-213、X87D/R-
209-X213A、87-X209W-X213A、X87D/R-X209W-X2
13A、87-209-249、87-X209W-249、87-209-X249N
/R、X87D/R-209-249、X87D/R-X209W-249、87-X2
09W-X249N/R、X87R-209-X249N/R、X87D/R-X209
W-X249N/R、87-213-249、87-X213A-249、X87D/R
-213-249、87-213-X249N/R、X87D/R-X213A-249
、X87D/R-213-X249N/R、87-X213A-X249N/R、X87
D/R-X213A-X249N/R、129-130-X206R/Y、X129Q-
130-X206R/Y、129-X130A-X206R/Y、X129Q-X130
A-X206R/Y、129-130-213、X129Q-130-213、129-
X130A-213、129-130-X213A、X129Q-X130A-213、
X129Q-130-X213A、129-X130A-X213A、X129Q-X1
30A-X213A、129-130-249、X129Q-130-249、129-
X130A-249、129-130-X249N/R、X129Q-X130A-24
9、X129Q-130-X249N/R、129-X130A-X249N/R、X1
29Q-X130A-X249N/R、129-X206Y-209、X129Q-X2
06Y-209、129-X206Y-X209W、X129Q-X206Y-X209
W、129-206-213、129-X206L/Y-213、129-206-X2
13A、X129Q-206-213、X129Q-X206L/Y-213、X129
Q-206-X213A、129-X206L/Y-X213A、X129Q-X206
L/Y-X213A、129-206-249、129-X206L/Y-249、12
9-206-X249N/R、X129Q-206-249、X129A-X206L/
Y-249、X129Q-206-X249N/R、129-X206L/Y-X249
N/R、X129Q-X206L/Y-X249N/R、129-209-213、12
9-X209W-213、129-209-X213A、X129Q-209-213、
X129Q-X209W-213、X129Q-209-X213A、129-X209
W-X213A、X129Q-X209W-X213A、129-209-249、12
9-X209W-249、129-209-X249N/R、X129Q-209-24
9、X129Q-X209W-249、X129Q-209-X249N/R、129-
X209W-X249N/R、X129Q-X209W-X249N/R、129-21
3-249、129-X213A-249、129-213-X249N/R、X129
Q-213-249、X129Q-X213A-249、129-X213A-X249
R、X129Q-213-X249N/R、X129Q-X213A-X249N/R、
130-X206Y-209、X130A-X206Y-209、130-X206Y-
X209W、X130A-X206Y-X209W、130-206-213、130-
X206L/Y-213、130-206-X213A、X130A-206-213、
X130A-X206L/Y-213、X130A-206-X213A、130-X2
06L/Y-X213A、X130A-X206L/Y-X213A、130-206-
249、130-X206L/Y-249、130-206-X249N/R、X130
A-206-249、X130A-X206L/Y-249、X130A-206-X2
49N/R、130-X206L/Y-X249N/R、X130A-X206L/Y-
X249N/R、130-209-213、130-X209W-213、130-20
9-X213A、X130A-209-213、X130A-X209W-213、X1
30A-209-X213A、130-X209W-X213A、X130A-X209
W-X213A、130-209-249、130-X209W-249、130-20
9-X249N/R、X130A-209-249、X130A-X209W-249、
X130A-209-X249N/R、130-X209W-X249N/R、X130
A-X209W-X249N/R、130-213-249、130-X213A-24
9、130-213-X249N/R、X130A-213-249、X130A-X2
13A-249、130-X213A-X249R、X130A-213-X249N/
R、X130A-X213A-X249N/R、130-209-249、130-X2
09W-249、130-209-X249N/R、X130A-209-249、X1
30A-X209W-249、X130A-209-X249N/R、130-X209
W-X249N/R、X130A-X209W-X249N/R、206-209-21
3、206-X209W-213、206-209-X213A、X206L/Y-20
9-213、206-X209W-X213A、X206L/Y-X209W-213、
X206L/Y-209-X213A、X206L/Y-X209W-X213A、20
6-209-249、206-X209W-249、206-209-X249N/R、
X206L/Y-209-249、X206L/Y-X209W-249、206-X2
09W-X249N/R、X206L/Y-209-X249N/R、X206L/Y-
X209W-X249N/R、206-213-249、206-X213A-249、
206-213-X249N/RX206L/Y-213-249、X206L/Y-X
213A-249、X206L/Y-213-X249N/R、206-X213A-X
249N/R、X206L/Y-X213A-X249N/R、209-213-249
、X209W-213-249、209-X213A-249、209-213-X24
9N/R、X209W-X213A-249、X209W-213-X249N/R、2
09-X213A-X249N/R、X209W-X213A-X249N/Rおよびこ
れらの組み合わせから選択される、2つ以上の位置でのアミノ酸置換の組み合わせを含む
アミノ酸配列を含む、単離されたスブチリシン変異体であって、Xは任意のアミノ酸であ
り、前記変異体はタンパク質分解活性を有し、さらに、前記変異体の各アミノ酸の位置は
、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus am
yloliquefaciens)スブチリシンBPN’配列の、対応するアミノ酸位置
にしたがって番号付けされており、これは前記変異体アミノ酸配列と前記BPN’アミノ
酸配列とのアラインメントにより決定されたものであるスブチリシン変異体。
【請求項2】
前記2つ以上の位置でのアミノ酸置換の組み合わせは、S78N-Q206F/M/Y
、S78G-Q206D/F/H/M/N/P/R/Y、N18K/R-S78N、N1
8K/R-S87R、N18K/R-Q206L/Y、S24F/L/P/R-S87R
、S24F/L/P-Q206L/Y、S24F/L/P/R-Q206Y、S24F/
L/P-Y209W、P40E-S78G、P40E-S87R、P40E-P129Q
、P40E-S130A、S78N-S87D/R、S78G-S87D/R/T、S7
8A/C/E/F/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-S87R、S7
8A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-P129Q
、S78A/C/E/F/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-S130
A、S78G-S130A/Q、S78N-H249N/R、S87D/R-Q206L
/R/Y、S87D/R-Y209W、S87D/R-T213A、S87R-H249
N/R、P129Q-Q206RY、P129Q-H249N/R、S130A-Q20
6R/Y、S130A-H249N/R、Q206Y-Y209W、Q206L/Y-T
213A、Q206L/Y-H249N/R、Y209W-T213A、Y209W-H
249N/R、N18K/R-S24F/L/P/R-S78N、N18K/R-S24
F/L/P/R-S87D/R、N18K/R-S24F/L/P/R-P129Q、N
18K/R-S24F/L/P/R-S130A、N18K/R-S24F/L/P/R
-Q206L/Y、N18K/R-S24F/L/P/R-Y209W、N18K/R-
S78N-S87D/R、N18K/R-S78N-P129Q、N18K/R-S78
N-S130A、N18K/R-S78N-Q206L/Y、N18K/R-S78N-
Y209W、N18K/R-S78N-T213A、N18K/R-S78N-H249
N/R、N18K/R-S87D/R-P129Q、N18K/R-S87D/R-S1
30A、N18K/R-S87D/R-Q206L/Y、N18K/R-S87D/R-
Y209W、N18K/R-S87D/R-T213A、N18K/R-S87D/R-
H249、N18K/R-P129Q-S130A、N18K/R-P129Q-Q20
6L/Y、N18K/R-P129Q-209、N18K/R-P129Q-T213A
、N18K/R-P129Q-H249N/R、N18K/R-S130A-Q206L
/Y、N18K/R-S130A-Y209W、N18K/R-S130A-T213A
、N18K/R-S130A-H249N/R、N18K/R-Q206L/Y-Y20
9W、N18K/R-Q206L/Y-T213A、N18K/R-Q206L/Y-H
249N/R、N18K/R-Y209W-T213A、N18K/R-Y209W-H
249N/R、N18K/R-T213A-H249N/R、S24F/L/P/R-S
78N-S87D/R、S24F/L/P-S78N-P129Q、S24F/L/P-
S78N-S130A、S24F/L/P-S78N-Q206L/Y、S24F/L/
P/R-S78N-Q206Y、S24F/L/P-S78N-Y209W、S24F/
L/P/R-S78N-T213A、S24F/L/P/R-S78N-H249N/R
、S24F/L/P/R-S87D/R-P129Q、S24F/L/P/R-S87D
/R-S130A、S24F/L/P/R-S87D/R-Q206L/Y、S24F/
L/P/R-87D/R-Y209W、S24F/L/P/R-S87D/R-T213
A、S24F/L/P/R-S87D/R-H249、S24F/L/P-P129Q-
S130A、S24F/L/P-P129Q-Q206L/Y、S24F/L/P/R-
P129Q-Q206Y、S24F/L/P-P129Q-Y209W、S24F/L/
P/R-P129Q-T213A、S24F/L/P/R-P129Q-H249N/R
、S24F/L/P-S130A-Q206L/Y、S24F/L/P/R-S130A
-Q206Y、S24F/L/P-S130A-Y209W、S24F/L/P/R-S
130A-T213A、S24F/L/P/R-S130A-H249N/R、S24F
/L/P-Q206L/Y-Y209W、S24F/L/P/R-Q206Y-Y209
W、S24F/L/P/R-Q206L/Y-T213A、S24F/L/P/R-Q2
06L/Y-H249N/R、S24F/L/P/R-Y209W-T213A、S24
F/L/P/R-Y209W-H249N/R、S78N-S87D/R-P129Q、
S78N-S87D/R-S130A、S78N-S87D/R-Q206L/Y、S7
8N-S87D/R-Y209W、S78N-S87D/R-T213A、S78N-S
87D/R-H249N/R、S78N-P129Q-Q206Y、S78N-P129
Q-T213A、S78N-P129Q-H249N/R、S78N-S130A-Q2
06Y、S78N-S130A-T213A、S78N-S130A-H249N/R、
S78N-Q206L/Y-T213A、S78N-Q206L/Y-H249N/R、
S78N-Y209W-T213A、S78N-Y209W-H249N/R、S78N
-T213A-H249N/R、S87D/R-P129Q-S130A、S87D/R
-P129Q-Q206L/R/Y、S87D/R-P129Q-Y209W、S87D
/R-P129Q-T213A、S87D/R-P129Q-H249N/R、S87D
/R-S130A-Q206L/R/Y、S87D/R-S130A-Y209W、S8
7D/R-S130A-T213A、S87D/R-S130A-H249N/R、S8
7D/R-Q206L/Y-Y209W、S87D/R-Q206L/Y-T213A、
87D/R-Q206L/Y-H249N/R、S87D/R-Y209W-T213A
、S87D/R-Y209W-H249N/R、S87D/R-T213A-H249N
/R、P129Q-S130A-Q206R/Y、P129Q-S130A-T213A
、P129Q-S130A-H249N/R、P129Q-Q206Y-Y209W、P
129Q-Q206L/Y-T213A、P129Q-Q206L/Y-H249N/R
、P129Q-Y209W-T213A、P129Q-Y209W-H249N/R、P
129Q-T213A-H249N/R、S130A-Q206Y-Y209W、S13
0A-Q206L/Y-T213A、S130A-Q206L/Y-H249N/R、S
130A-Y209W-T213A、S130A-Y209W-H249N/R、S13
0A-T213A-H249N/R、S130A-Y209W-H249N/R、Q20
6L/Y-Y209W-T213A、Q206L/Y-Y209W-H249N/R、Q
206L/Y-T213A-H249N/R、Y209W-T213A-H249N/R
およびこれらの組み合わせから選択される、請求項1に記載のスブチリシン変異体。
【請求項3】
(i)3-8、3-40、3-78、3-87、3-118、3-128、3-129
、3-130、3-210、3-211、3-215、3-217、3-261、3-2
62、8-40、8-76、8-87、8-118、8-128、8-210、8-21
5、8-261、18-78、18-87、18-118、18-206、24-87、
24-206、24-209、24-213、24-222、40-76、40-87、
40-118、40-128、40-210、40-215、40-217、40-26
1、76-210、76-211、76-213、76-215、76-217、76-
249、76-261、76-262、78-87、78-118、78-210、78
-213、78-222、78-249、87-206、87-209、87-213、
87-215、87-217、87-222、87-249、87-261、118-2
06、118-209、118-210、118-211、118-213、118-2
15、118-217、118-222、118-249、118-261、118-2
62、128-209、128-210、128-215、128-217、128-2
61、129-206、129-209、130-206、130-209、206-2
13、206-249、209-213、209-249、210-217、210-2
61、213-222、213-249、215-261、222-249およびこれら
の組み合わせ、
(ii)3-76-118、18-24-206、18-24-209、18-24-2
13、18-24-249、18-87-209、18-118-209、18-206
-209、18-209-213、18-209-222、18-209-249、18
-213-249、24-76-78、24-76-87、24-76-118、24-
76-209、24-76-222、24-76-249、24-78-87、24-7
8-118、24-78-206、24-78-209、24-78-222、24-7
8-249、24-87-118、24-87-209、24-87-222、24-8
7-249、24-118-209、24-118-222、24-118-249、2
4-206-209、24-206-249、24-209-213、24-209-2
22、24-209-249、24-213-249、24-222-249、76-7
8-118、76-78-87、76-78-129、76-78-130、76-78
-206、76-78-209、76-78-222、76-78-249、76-87
-118、76-87-206、76-87-209、76-87-249、76-11
8-128、76-118-206、76-118-209、76-118-222、7
6-118-249、76-209-222、76-209-249、78-87-11
8、78-87-129、78-87-130、78-87-206、78-87-20
9、78-87-222、78-87-249、78-118-129、78-118-
209、78-118-222、78-118-249、78-129-130、78-
209-222、78-209-249、78-222-249、87-118-206
、87-118-209、87-118-249、87-206-209、87-209
-222、87-209-249、87-222-249、118-209-213、1
18-209-222、118-209-249、118-222-249、206-2
09-249、209-213-222、209-213-249、209-222-2
49およびこれらの組み合わせ、
(iii)X3V-X8V、X3V-X40E、X3V-X78G/N、X3V-X87
D、X3V-X118R、X3V-X128R、X3V-X129Q、X3V-X130
A、X3V-X210I、X3V-X211P、X3V-X215K、X3V-X217
K、X3V-X261I、X3V-X262Q、X8V-X40E、X8V-X76D、
X8V-X87D、X8V-X118R、X8V-X128R、X8V-X210I、X
8V-X215K、X8V-X261I、X18R-X78N、X18R-X87R、X
18R-X118R、X18R-X206L、X24R-S78N、X24R-X87D
/R、X24R-X206L/Y、X24R-X209W、X24R-X213A、X2
4R-X222Q、X40E-X76D、X40E-X87D/R、X40E-X118
R、X40E-X128R、X40E-X210I、X40E-X215K、X40E-
X217K、X40E-X261I、X76D-X87D、X76D-X128R、X7
6D-X206F/R/M/Y、X76D-X210I、X76D-X211P、X76
D-X213A、X76D-X215K、X76D-X217K、X76D-X249R
、X76D-X261I、X76D-X262Q、X78G-X206F/L/M/Y、
X78G-X210I、X78G-X261I、X78G/N-X87D/R、X78G
/N-X118R、X78G/N-X128L、X78G/N-X129Q、X78G/
N-X130A、X78N-X213A、X78N-X222Q、X78N-X249R
、X87D-X118R、X87D-X128L/R、X87D-X129Q、X87D
-X130A、X87D/R-X209W、X87D-X210I、X87D-X215
K、X87D-X217K、X87D/R-X222Q、X87D/R-X249R、X
87R-X206F/L/M/R/Y、X87R-X213A、X87D/R-X261
I、X118R-X128R、X118R-X206F/M/L/R/Y、X118R-
X209W、X118R-X210II、X118R-X211P、X118R-X21
3A、X118R-X215K、X118R-X217K、X118R-X222Q、X
118R-X249R、X118R-X261I、X118R-X262Q、X128L
-X206F/L/M/R/Y、X128L-X209W、X128R-P210I、X
128R-A215K、X128R-L217K、X128R-N261I、X129Q
-X206F/L/M/R/Y、X129Q-X209W、X130A-X206F/L
/M/R/Y、S130A-Y209W、X206L/Y-X213A、X206L/Y
-X222Q、X206L/Y-X249R、X209W-X213A、X209W-X
222Q、X209W-X249R、X210I-X217K、X210I-X261I
、X213A-X222Q、X213A-X249R、X215K-X261I、X22
2Q-X249Rおよびこれらの組み合わせ、
(iv)X3V-X76D-X118R、X18R-X24R-X206L/Y、X18
R-X24R-X209W、X18R-X24R-X213A、X18R-X24R-X
249R、X18R-X87D/R-X209W、X18R-X118R-X209W、
X18R-X206L/Y-X209W、X18R-X206L/Y-X249R、X1
8R-X209W-X213A、X18R-X209W-X222Q、X18R-X20
9W-X249R、X18R-X213A-X249R、X24R-X76D-X78G
/N、X24R-X76D-X87D/R、X24R-X76D-X118R、X24R
-X76D-X209W、X24R-X76D-X222Q、X24R-X76D-X2
49R、X24R-X78G/N-X87D/R、X24R-X78G/N-X118R
、X24R-X78G/N-X206L/Y、X24R-X78G/N-X209W、X
24R-X78G/N-X222Q、X24R-X78G/N-X249R、X24R-
X87D/R-X118R、X24R-X87D/R-X209W、X24R-X87D
/R-X222Q、X24R-X87D/R-X249R、X24R-X118R-X2
09W、X24R-X118R-X222Q、X24R-X118R-X249R、X2
4R-X206L-X209W、X24R-X206L/Y-X249R、X24R-X
209W-X213A、X24R-X209W-X222Q、X24R-X209W-X
249R、X24R-X213A-X249R、X24R-X222Q-X249R、X
76D-X78G/N-X87D/R、X76D-X78G/N-X118R、X76D
-X78G/N-X129Q、X76D-X78G/N-X130A、X76D-X78
G/N-X206L、X76D-X78G/N-X209W、X76D-X78G/N-
X222Q、X76D-X78G/N-X249R、X76D-X87D/R-X118
R、X76D-X87D/R-X206L/Y、X76D-X87D/R-X209W、
X76D-X87D/R-X249R、X76D-X118R-X128R、X76D-
X118R-X206L/Y、X76D-X118R-X209W、X76D-X118
R-X222Q、X76D-X118R-X249R、X76D-X209W-X222
Q、X76D-X209W-X249R、X78G/N-X87D/R-X118R、X
78G/N-X87D/R-X129Q、X78G/N-X87D/R-X130A、X
78G/N-X87D/R-X206L/Y、X78G/N-X87D/R-X209W
、X78G/N-X87D/R-X222Q、X78G/N-X87D/R-X249R
、X78G/N-X118R-X129Q、X78G/N-X118R-X209W、X
78G/N-X118R-X222Q、X78G/N-X118R-X249R、X78
G/N-X129Q-X130A、X78G/N-X209W-X222Q、X78G/
N-X209W-X249R、X78G/N-X222Q-X249R、X87D/R-
X118R-X206L、X87D/R-X118R-X209W、X87D/R-X1
18R-X249R、X87D/R-X206L/Y-X209W、X87D/R-X2
09W-X222Q、X87D/R-X209W-X249R、X87D/R-X222
Q-X249R、X118R-X209W-X213A、X118R-X209W-X2
22Q、X118R-X209W-X249R、X118R-X222Q-X249R、
X206L-X209W-X249R、X209W-X213A-X222Q、X209
W-X213A-X249R、X209W-X222Q-X249Rおよびこれらの組み
合わせ、
(v)S3V-I8V、S3V-P40E、S3V-S78G/N、S3V-S87D、
S3V-G118R、S3V-S128R、S3V-P129Q、S3V-S130A、
S3V-P210I、S3V-G211P、S3V-A215K、S3V-L217K、
S3V-N261I、S3V-L262Q、I8V-P40E、I8V-N76D、I8
V-S87D、I8V-G118R、I8V-S128R、I8V-P210I、I8V
-A215K、I8V-N261I、N18R-S78N、N18R-S87R、N18
R-G118R、N18R-Q206L、S24R-S78N、S24R-S87D/R
、S24R-Q206L/Y、S24R-Y209W、S24R-T213A、S24R
-M222Q、P40E-N76D、P40E-S87D/R、P40E-G118R、
P40E-S128R、P40E-P210I、P40E-A215K、P40E-L2
17K、P40E-N261I、N76D-S87D、N76D-P210I、N76D
-S128R、N76D-Q206F/R/M/Y、N76D-P210I、N76D-
G211P、N76D-T213A、N76D-A215K、N76D-L217K、N
76D-H249R、N76D-N261I、N76D-L262Q、S78G-Q20
6F/L/M/Y、S78G-P210I、S78G-N261I、S78G/N-S8
7D/R、S78G/N-G118R、S78G/N-S128L、S78G/N-P1
29Q、S78G/N-S130A、S78N-T213A、S78N-M222Q、S
78N-H249R、S87D-G118R、S87D-S128L/R、S87D-P
129Q、S87D-S130A、S87D/R-Y209W、S87D-P210I、
S87D-A215K、S87D-L217K、S87D/R-M222Q、S87D/
R-H249R、S87R-Q206F/L/M/R/Y、S87R-T213A、S8
7D/R-N261I、G118R-S128R、G118R-Q206L/R/Y、G
118R-Y209W、G118R-P210I、G118R-G211P、G118R
-T213A、G118R-L217K、G118R-M222Q、G118R-H24
9R、G118R-N261I、G118R-L262Q、S128L-Q206F/L
/M/R/Y、S128L-Y209W、S128R-P210I、S128R-A21
5K、S128R-L217K、S128R-N261I、P129Q-Q206F/L
/M/R/Y、P129Q-Y209W、S130A-Q206F/L/M/R/Y、S
130A-Y209W、Q206L/Y-T213A、Q206L/Y-M222Q、Q
206L/Y-H249R、Y209W-T213A、Y209W-M222Q、Y20
9W-H249R、P210I-L217K、P210I-N261I、T213A-M
222Q、T213A-H249R、A215K-N261I、M222Q-H249R
およびこれらの組み合わせ、または
(vi)S3V-N76D-G118R、N18R-S24R-Q206L/Y、N18
R-S24R-Y209W、N18R-S24R-T213A、N18R-S24R-H
249R、N18R-S87D/R-Y209W、N18R-G118R-Y209W、
N18R-Q206L/Y-Y209W、N18R-Q206L/Y-H249R、N1
8R-Y209W-T213A、N18R-Y209W-M222Q、N18R-Y20
9W-H249R、N18R-T213A-H249R、S24R-N76D-S78G
/N、S24R-N76D-S87D/R、S24R-N76D-G118R、S24R
-N76D-Y209W、S24R-N76D-M222Q、S24R-N76D-H2
49R、S24R-S78G/N-S87D/R、S24R-S78G/N-G118R
、S24R-S78G/N-Q206L、Y209WS24R-S78G/N-Y209
W、S24R-S78G/N-M222Q、S24R-S78G/N-H249R、S2
4R-S87D/R-G118R、S24R-S87D/R-Y209W、S24R-S
87D/R-M222Q、S24R-S87D/R-H249R、S24R-G118R
-Y209W、S24R-G118R-M222Q、S24R-G118R-H249R
、S24R-Q206L/Y-Y209W、S24R-Q206L/Y-H249R、S
24R-Y209W-T213A、S24R-Y209W-M222Q、S24R-Y2
09W-H249R、S24R-T213A-H249R、S24R-M222Q-H2
49R、N76D-S78G/N-S87D/R、N76D-S78G/N-G118R
、N76D-S78G/N-P129Q、N76D-S78G/N-S130A、N76
D-S78G/N-Q206L、N76D-S78G/N-Y209W、N76D-S7
8G/N-M222Q、N76D-S78G/N-H249R、N76D-S87D/R
-G118R、N76D-S87D/R-Q206L/Y、N76D-S87D/R-Y
209W、N76D-S87D/R-H249R、N76D-G118R-S128R、
N76D-G118R-Q206L/Y、N76D-G118R-Y209W、N76D
-G118R-M222Q、N76D-G118R-H249R、N76D-Y209W
-M222Q、N76D-Y209W-H249R、S78G/N-S87D/R-G1
18R、S78G/N-S87D/R-P129Q、S78G/N-S87D/R-S1
30A、S78G/N-S87D/R-Q206L/Y、S78G/N-S87D/R-
Y209W、S78G/N-S87D/R-M222Q、S78G/N-S87D/R-
H249R、S78G/N-G118R-P129Q、S78G/N-G118R-Y2
09W、S78G/N-G118R-M222Q、S78G/N-G118R-H249
R、S78G/N-P129Q-S130A、S78G/N-Y209W-M222Q、
S78G/N-Y209W-H249R、S78G/N-M222Q-H249R、S8
7D/R-G118R-Q206L、S87D/R-G118R-Y209W、S87D
/R-G118R-H249R、S87D/R-Q206L/Y-Y209W、S87D
/R-Y209W-H249R、S87D/R-Y209W-M222Q、S87D/R
-M222Q-H249R、G118R-Y209W-T213A、G118R-Y20
9W-M222Q、G118R-Y209W-H249R、G118R-M222Q-H
249R、Q206L/Y-Y209W-H249R、Y209W-T213A-M22
2Q、Y209W-T213A-H249R、Y209W-M222Q-H249Rおよ
びこれらの組み合わせ
から選択される、2つ以上の置換を含むアミノ酸配列を含む単離されたスブチリシン変異
体であって、
前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシ
エンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシンBPN
’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは前記変異体ア
ミノ酸配列と前記BPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたものである
スブチリシン変異体。
【請求項4】
前記変異体のアミノ酸配列は、
(i)1、3、8、9、16、20、22、28、42、43、44、56、76、77
、82、88、89、99、100、101、103、104、108、116、118
、120、124、127、128、147、150、158、159、160、166
、185、188、194、204、210、211、212、215、216、217
、218、222、232、235、241、243、245、246、248、251
、252、254、256、259、261、262、268、270および271;
(ii)X1V、X3I/T/V、X8V、X9G、X16T、X20E/R、X22L
/W、X28T、X42I、X43R/S/Y、X44V、X56P、X76D、X77
D、X82D、X88S、X89H、X99N、X100S、X101F/G/H/Q/
T/V、X103A/D/P、X104I、X108S、X116L/M、X118A/
R/V、X120R、X124M、X127S/T、X128K/L/R、X147I、
X150T、X158E/T/V、X159D、X160Q、X166D/N、X185
Y、X188D、X194D/P、X204D、X210I/L、X211P、X212
D、X215K/V、X216Y、X217K、X218S、X222L/Q/S、X2
32V、X235T、X241K、X243S、X245R、X246V、X248D、
X251R、X252I、X254T、X256P、X259G、X261I/N、X2
62Q、X268A、X270P/TおよびX271D;または
(iii)A1V、S3I/T/V、I8V、S9G、A16T、G20E/R、T22
L/W、V28T、L42I、N43R/S/Y、I44V、S56P、N76D、N7
7D、L82D、A88S、E89H、S99N、G100S、S101F/G/H/Q
/T/V、S103A/D/P、V104I、A108S、N116L/M、G118A
/R/V、H120R、L124M、G127S/T、S128K/LR、V147I、
V150T、A158E/T/V、G159D、S160Q、S166D/N、N185
Y、S188D、A194D/P、N204D、P210I/L、G211P、S212
D、A215K/V、S216Y、L217K、N218S、M222L/Q/S、A2
32V、K235T、W241K、N243S、Q245R、I246V、N248D、
K251R、N252I、A254T、S256P、S259G、N261I/N、L2
62Q、V268A、A270P/TおよびE271D
から選択される1つ以上の置換をさらに含む、請求項1~3のいずれか一項に記載のスブ
チリシン変異体。
【請求項5】
前記変異体のアミノ酸配列は、
(i)3、8、22、28、43、76、89、99、101、103、104、108
、116、118、124、127、128、147、150、158、159、166
、188、194、210、211、212、215、217、222、232、235
、243、245、246、261、262、270および271;
(ii)X3T/V、X8V、X22W、X28T、X43S、X76D、X89H、X
99N、X101F/G/V、X103A/D/P、X104I、X108S、X116
M、X118R、X124M、X127T、X128L、X147I、X150T、X1
58E/T、X159D、X166D、X188D、X194D/P、X210I/L、
X211P、X212D、X215V、X217K、X222Q/S、X232V、X2
35T、X243S、X245R、X246V、X261I、X262Q、X270Tお
よびX271D;または
(iii)S3T/V、I8V、T22W、V28T、N43S、N76D、E89H、
S99N、S101F/G/V、S103A/D/P、V104I、A108S、N11
6M、G118R、L124M、G127T、S128L、V147I、V150T、A
158E/T、G159D、S166D、S188D、A194D/P、P210I/L
、G211P、S212D、A215V、L217K、M222Q/S、A232V、K
235T、N243S、Q245R、I246V、N261I、L262Q、A270T
およびE271D
から選択される1つ以上の置換をさらに含む、請求項1~4のいずれか一項に記載のスブ
チリシン変異体。
【請求項6】
前記変異体の前記アミノ酸配列は、
i)1、3、8、9、16、20、22、28、42、43、44、56、76、77、
82、88、100、101、103、104、108、116、118、120、12
4、127、128、147、150、158、159、160、166、185、19
4、204、210、211、212、215、216、217、218、222、23
2、241、245、248、251、252、254、256、259、261、26
2、268、270および271;
(ii)X1V、X3I/V、X8V、X9G、X16T、X20E/R、X22L/W
、X28T、X42I、X43R/Y、X44V、X56P、X76D、X77D、X8
2D、X88S、X100S、X101G/H/Q/T/V、X103A、X104I、
X108S、X116L/M、X118A/R/V、X120R、X124M、X127
S/T、X128K/L/R、X147I、X150T、X158E/V、X160Q、
X166D/N、X185Y、X194D/P、X204D、X210I、X211P、
X212D、X215K/V、X216Y、X217K、X218S、X222Q/S、
X232V、X241K、X245R、X248D、X251R、X252I、X254
T、X256P、X259G、X261I、X262Q、X268A、X270Pおよび
X271D;または
(iii)A1V、S3I/V、I8V、S9G、A16T、G20E/R、T22L/
W、V28T、L42I、N43R/Y、I44V、S56P、N76D、N77D、L
82D、A88S、G100S、S101G/H/Q/T/V、S103A、V104I
、A108S、N116L/M、G118A/R/V、H120R、L124M、G12
7S/T、S128K/LR、V147I、V150T、A158E/V、S160Q、
S166D/N、N185Y、A194D/P、N204D、P210I、G211P、
S212D、A215K/V、S216Y、L217K、N218S、M222Q/S、
A232V、W241K、Q245R、N248D、K251R、N252I、A254
T、S256P、S259G、N261I、L262Q、V268A、A270Pおよび
E271D
から選択される1つ以上の置換をさらに含む、請求項1~5のいずれか一項に記載のスブ
チリシン変異体。
【請求項7】
前記変異体のアミノ酸配列は、
(i)3、76、101、103、104、118、127、128、166、210、
217、222および261;
(ii)X3VX76D、X101F/G/V、X103A/D/P、X104I、X1
18R、X127T、X128L/R、X166D/N、X210I、X217K、X2
22Q/SおよびX261I;または
(iii)S3V、N76D、S101F/G/V、S103A/D/P、V104I、
G118R、G127T、S128L/R、S166D/N、P210I、L217K、
M222Q/SおよびN261I
から選択される1つ以上の置換をさらに含む、請求項1~6のいずれか一項に記載のスブ
チリシン変異体。
【請求項8】
76、87、118、128、129および130;X76D、X87D/R/T、X
118A/R/V、X128K/L/R、X129Q/RおよびX130A/Q;または
N76D、S87D/R/T、G118A/R/V、S128K/L/R、P129Q/
RおよびS130A/Qから選択される1、2、3、4、5または6つの位置での置換と
、
(i)1、3、8、9、16、18、20、22、24、28、40、42、43、44
、56、77、78、82、88、89、99、100、101、103、104、10
8、116、120、124、127、147、150、158、159、160、16
6、185、188、194、204、206、209、210、211、212、21
3、215、216、217、218、222、232、235、241、243、24
5、246、248、249、251、252、254、256、259、261、26
2、268、270および271;
(ii)X1V、X3I/T/V、X8V、X9G、X16T、X18K/R、X20E
/R、X22L/W、X24F/L/P/R、X28T、X40E、X42I、X43R
/S/Y、X44V、X56P、X77D、X78A/C/E/F/G/H/I/K/L
/M/N/P/Q/R/T/V/W/Y、X82D、X88S、X89H、X99N、X
100S、X101F/G/H/Q/T/V、X103A/D/P、X104I、X10
8S、X116L/M、X120R、X124M、X127S/T、X147I、X15
0T、X158E/T/V、X159D、X160Q、X166D/N、X185Y、X
188D、X194D/P、X204D、X206A/D/F/G/H/L/M/N/P
/R/S/Y、X209W、X210I、X211P、X212D、X213A、X21
5K/V、X216Y、X217K、X218S、X222L/Q/S、X232V、X
235T、X241K、X243S、X245R、X246V、X248D、X249N
/R、X251R、X252I、X254T、X256P、X259G、X261I、X
262Q、X268A、X270P/TおよびX271D;または
(iii)A1V、S3I/T/V、I8V、S9G、A16T、N18K/R、G20
E/R、T22L/W、S24F/L/P/R、V28T、P40E、L42I、N43
R/S、I44V、S56P、N77D、S78A/C/E/F/G/H/I/K/L/
M/N/P/Q/R/T/V/W/Y、L82D、A88S、E89H、S99N、G1
00S、S101F/G/H/Q/T/V、S103A/D/P、V104I、A108
S、N116L/M、H120R、L124M、G127S/T、V147I、V150
T、A158E/T/V、G159D、S160Q、S166D/N、N185Y、S1
88D、A194D/P、N204D、Q206A/D/F/G/H/L/M/N/P/
R/S/Y、Y209W、P210I、G211P、S212D、T213A、A215
K/V、S216Y、L217K、N218S、M222L/Q/S、A232V、K2
35T、W241K、N243S、Q245R、I246V、N248D、H249N/
R、K251R、N252I、A254T、S256P、S259G、N261I、L2
62Q、V268A、A270P/TおよびE271D
から選択される1つ以上の位置での1つ以上の置換とを組み合わせて含むアミノ酸配列を
含む、単離されたスブチリシン変異体であって、
Xは任意のアミノ酸であり、前記変異体はタンパク質分解活性を有し、
さらに、前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリク
エファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシ
ンBPN’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは前記
変異体アミノ酸配列と前記BPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたも
のであるスブチリシン変異体。
【請求項9】
前記アミノ酸配列は、76、87、118、128、129および130;X76D、
X87D/R/T、X118A/R/V、X128K/L/R、X129Q/RおよびX
130A/Q;またはN76D、S87D/R/T、G118A/R/V、S128K/
L/R、P129Q/RおよびS130A/Qから選択される1、2、3、4、5または
6つの位置での置換と、
(i)3、18、24、40、78、101、103、104、127、166、206
、209、210、211、213、217、222、249、261および262;
(ii)X3V、X18R、X24R、X40E、X78G/N、X101F/G/V、
X103A/D/P、X104I、X127T、X166D/N、X206L/R/Y、
X209W、X210I、X211P、X213A、X217K、X222Q/S、X2
49N/R、X261IおよびX262Q;または
(iii)S3V、N18R、S24R、P40E、S78G/N、G127T、S16
6D/N、Q206L/R/Y、Y209W、P210I、G211P、T213A、L
217K、M222Q/S、H249N/R、N261IおよびL262Qから選択され
る1つ以上の位置での1つ以上の置換とを組み合わせて含む、請求項8に記載のスブチリ
シン変異体。
【請求項10】
前記アミノ酸配列は、76、87、118、128、129、および130;X76D
、X87R、X118R、X128L、X129Q、およびX130A;またはN76D
、S87R、G118R、S128L、P129QおよびS130Aの各位置での置換と
、
(i)3、8、18、22、24、28、40、43、78、89、99、101、10
3、104、108、116、124、127、147、150、158、159、16
6、188、194、206、209、210、211、212、213、215、21
7、222、232、235、243、245、246、249、261、262、27
0および271;
(ii)X3T/V、X8V、X18R、X22W、X24R、X28T、X40E、X
43S、X78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/T/V/W
/Y、X89H、X99N、X101F/G/V、X103A/D/P、X104I、X
108S、X116M、X124M、X127T、X147I、X150T、X158E
/T、X159D、X166D、X188D、X194D/P、X206A/D/F/G
/H/LM/N/P/R/S/Y、X209W、X210I/L、X211P、X212
D、X213A、X215V、X217K、X222Q/S、X232V、X235T、
X243S、X245R、X246V、X249N/R、X261I、X262Q、X2
70TおよびX271D;または
(iii)S3T/V、I8V、N18R、T22W、S24R、V28T、P40E、
N43S、S78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/T/V/
W/Y、E89H、S99N、S101F/G/V、S103A/D/P、V104I、
A108S、N116M、L124M、G127T、V147I、V150T、A158
E/T、G159D、S166D、S188D、A194D/P、Q206A/D/F/
G/H/L/M/N/P/R/S/Y、Y209W、P210I/L、G211P、S2
12D、T213A、A215V、L217K、M222Q/S、A232V、K235
T、N243S、Q245R、I246V、H249N/R、N261I、L262Q、
A270TおよびE271D
から選択される1つ以上の位置での1つ以上の置換とを組み合わせて含む、請求項8また
は9に記載のスブチリシン変異体。
【請求項11】
前記アミノ酸配列は、76、87、118、128、129および130;X76D、
X87R、X118R、X128L、X129QおよびX130A;またはN76D、S
87R、G118R、S128L、P129QおよびS130Aの各位置での置換と、
(i)3、18、24、78、206および249;
(ii)X3V、X18R、X24R、X78G/N、X206L/R/YおよびX24
9N/R;または
(ii)S3V、N18R、S24R、S78G/N、Q206L/R/YおよびH24
9N/Rから選択される、1つ以上の位置での1つ以上の置換とを組み合わせて含む、請
求項8~10のいずれか一項に記載のスブチリシン変異体。
【請求項12】
前記スブチリシンは、
(i)3-8、3-40、3-78、3-87、3-118、3-128、3-129、
3-130、3-210、3-211、3-215、3-217、3-261、3-26
2、8-40、8-76、8-87、8-118、8-128、8-210、8-215
、8-261、18-78、18-87、18-118、18-206、24-87、2
4-206、24-209、24-213、24-222、40-76、40-87、4
0-118、40-128、40-210、40-215、40-217、40-261
、76-210、76-211、76-213、76-215、76-217、76-2
49、76-261、76-262、78-87、78-118、78-210、78-
213、78-222、78-249、87-206、87-209、87-213、8
7-215、87-217、87-222、87-249、87-261、118-20
6、118-209、118-210、118-211、118-213、118-21
5、118-217、118-222、118-249、118-261、118-26
2、128-209、128-210、128-215、128-217、128-26
1、129-206、129-209、130-206、130-209、206-21
3、206-249、209-213、209-249、210-217、210-26
1、213-222、213-249、215-261、222-249およびこれらの
組み合わせ、
(ii)3-76-118、18-24-206、18-24-209、18-24-2
13、18-24-249、18-87-209、18-118-209、18-206
-209、18-209-213、18-209-222、18-209-249、18
-213-249、24-76-78、24-76-87、24-76-118、24-
76-209、24-76-222、24-76-249、24-78-87、24-7
8-118、24-78-206、24-78-209、24-78-222、24-7
8-249、24-87-118、24-87-209、24-87-222、24-8
7-249、24-118-209、24-118-222、24-118-249、2
4-206-209、24-206-249、24-209-213、24-209-2
22、24-209-249、24-213-249、24-222-249、76-7
8-118、76-78-87、76-78-129、76-78-130、76-78
-206、76-78-209、76-78-222、76-78-249、76-87
-118、76-87-206、76-87-209、76-87-249、76-11
8-128、76-118-206、76-118-209、76-118-222、7
6-118-249、76-209-222、76-209-249、78-87-11
8、78-87-129、78-87-130、78-87-206、78-87-20
9、78-87-222、78-87-249、78-118-129、78-118-
209、78-118-222、78-118-249、78-129-130、78-
209-222、78-209-249、78-222-249、87-118-206
、87-118-209、87-118-249、87-206-209、87-209
-222、87-209-249、87-222-249、118-209-213、1
18-209-222、118-209-249、118-222-249、206-2
09-249、209-213-222、209-213-249、209-222-2
49およびこれらの組み合わせ、
(iii)X3V-X8V、X3V-X40E、X3V-X78G/N、X3V-X87
D、X3V-X118R、X3V-X128R、X3V-X129Q、X3V-X130
A、X3V-X210I、X3V-X211P、X3V-X215K、X3V-X217
K、X3V-X261I、X3V-X262Q、X8V-X40E、X8V-X76D、
X8V-X87D、X8V-X118R、X8V-X128R、X8V-X210I、X
8V-X215K、X8V-X261I、X18R-X78N、X18R-X87R、X
18R-X118R、X18R-X206L、X24R-S78N、X24R-X87D
/R、X24R-X206L/Y、X24R-X209W、X24R-X213A、X2
4R-X222Q、X40E-X76D、X40E-X87D/R、X40E-X118
R、X40E-X128R、X40E-X210I、X40E-X215K、X40E-
X217K、X40E-X261I、X76D-X87D、X76D-X128R、X7
6D-X206F/R/M/Y、X76D-X210I、X76D-X211P、X76
D-X213A、X76D-X215K、X76D-X217K、X76D-X249R
、X76D-X261I、X76D-X262Q、X78G-X206F/L/M/Y、
X78G-X210I、X78G-X261I、X78G/N-X87D/R、X78G
/N-X118R、X78G/N-X128L、X78G/N-X129Q、X78G/
N-X130A、X78N-X213A、X78N-X222Q、X78N-X249R
、X87D-X118R、X87D-X128L/R、X87D-X129Q、X87D
-X130A、X87D/R-X209W、X87D-X210I、X87D-X215
K、X87D-X217K、X87D/R-X222Q、X87D/R-X249R、X
87R-X206F/L/M/R/Y、X87R-X213A、X87D/R-X261
I、X118R-X128R、X118R-X206F/M/L/R/Y、X118R-
X209W、X118R-X210II、X118R-X211P、X118R-X21
3A、X118R-X215K、X118R-X217K、X118R-X222Q、X
118R-X249R、X118R-X261I、X118R-X262Q、X128L
-X206F/L/M/R/Y、X128L-X209W、X128R-P210I、X
128R-A215K、X128R-L217K、X128R-N261I、X129Q
-X206F/L/M/R/Y、X129Q-X209W、X130A-X206F/L
/M/R/Y、S130A-Y209W、X206L/Y-X213A、X206L/Y
-X222Q、X206L/Y-X249R、X209W-X213A、X209W-X
222Q、X209W-X249R、X210I-X217K、X210I-X261I
、X213A-X222Q、X213A-X249R、X215K-X261I、X22
2Q-X249Rおよびこれらの組み合わせ、
(iv)X3V-X76D-X118R、X18R-X24R-X206L/Y、X18
R-X24R-X209W、X18R-X24R-X213A、X18R-X24R-X
249R、X18R-X87D/R-X209W、X18R-X118R-X209W、
X18R-X206L/Y-X209W、X18R-X206L/Y-X249R、X1
8R-X209W-X213A、X18R-X209W-X222Q、X18R-X20
9W-X249R、X18R-X213A-X249R、X24R-X76D-X78G
/N、X24R-X76D-X87D/R、X24R-X76D-X118R、X24R
-X76D-X209W、X24R-X76D-X222Q、X24R-X76D-X2
49R、X24R-X78G/N-X87D/R、X24R-X78G/N-X118R
、X24R-X78G/N-X206L/Y、X24R-X78G/N-X209W、X
24R-X78G/N-X222Q、X24R-X78G/N-X249R、X24R-
X87D/R-X118R、X24R-X87D/R-X209W、X24R-X87D
/R-X222Q、X24R-X87D/R-X249R、X24R-X118R-X2
09W、X24R-X118R-X222Q、X24R-X118R-X249R、X2
4R-X206L-X209W、X24R-X206L/Y-X249R、X24R-X
209W-X213A、X24R-X209W-X222Q、X24R-X209W-X
249R、X24R-X213A-X249R、X24R-X222Q-X249R、X
76D-X78G/N-X87D/R、X76D-X78G/N-X118R、X76D
-X78G/N-X129Q、X76D-X78G/N-X130A、X76D-X78
G/N-X206L、X76D-X78G/N-X209W、X76D-X78G/N-
X222Q、X76D-X78G/N-X249R、X76D-X87D/R-X118
R、X76D-X87D/R-X206L/Y、X76D-X87D/R-X209W、
X76D-X87D/R-X249R、X76D-X118R-X128R、X76D-
X118R-X206L/Y、X76D-X118R-X209W、X76D-X118
R-X222Q、X76D-X118R-X249R、X76D-X209W-X222
Q、X76D-X209W-X249R、X78G/N-X87D/R-X118R、X
78G/N-X87D/R-X129Q、X78G/N-X87D/R-X130A、X
78G/N-X87D/R-X206L/Y、X78G/N-X87D/R-X209W
、X78G/N-X87D/R-X222Q、X78G/N-X87D/R-X249R
、X78G/N-X118R-X129Q、X78G/N-X118R-X209W、X
78G/N-X118R-X222Q、X78G/N-X118R-X249R、X78
G/N-X129Q-X130A、X78G/N-X209W-X222Q、X78G/
N-X209W-X249R、X78G/N-X222Q-X249R、X87D/R-
X118R-X206L、X87D/R-X118R-X209W、X87D/R-X1
18R-X249R、X87D/R-X206L/Y-X209W、X87D/R-X2
09W-X222Q、X87D/R-X209W-X249R、X87D/R-X222
Q-X249R、X118R-X209W-X213A、X118R-X209W-X2
22Q、X118R-X209W-X249R、X118R-X222Q-X249R、
X206L-X209W-X249R、X209W-X213A-X222Q、X209
W-X213A-X249R、X209W-X222Q-X249Rおよびこれらの組み
合わせ、または
(v)S3V-I8V、S3V-P40E、S3V-S78G/N、S3V-S87D、
S3V-G118R、S3V-S128R、S3V-P129Q、S3V-S130A、
S3V-P210I、S3V-G211P、S3V-A215K、S3V-L217K、
S3V-N261I、S3V-L262Q、I8V-P40E、I8V-N76D、I8
V-S87D、I8V-G118R、I8V-S128R、I8V-P210I、I8V
-A215K、I8V-N261I、N18R-S78N、N18R-S87R、N18
R-G118R、N18R-Q206L、S24R-S78N、S24R-S87D/R
、S24R-Q206L/Y、S24R-Y209W、S24R-T213A、S24R
-M222Q、P40E-N76D、P40E-S87D/R、P40E-G118R、
P40E-S128R、P40E-P210I、P40E-A215K、P40E-L2
17K、P40E-N261I、N76D-S87D、N76D-P210I、N76D
-S128R、N76D-Q206F/R/M/Y、N76D-P210I、N76D-
G211P、N76D-T213A、N76D-A215K、N76D-L217K、N
76D-H249R、N76D-N261I、N76D-L262Q、S78G-Q20
6F/L/M/Y、S78G-P210I、S78G-N261I、S78G/N-S8
7D/R、S78G/N-G118R、S78G/N-S128L、S78G/N-P1
29Q、S78G/N-S130A、S78N-T213A、S78N-M222Q、S
78N-H249R、S87D-G118R、S87D-S128L/R、S87D-P
129Q、S87D-S130A、S87D/R-Y209W、S87D-P210I、
S87D-A215K、S87D-L217K、S87D/R-M222Q、S87D/
R-H249R、S87R-Q206F/L/M/R/Y、S87R-T213A、S8
7D/R-N261I、G118R-S128R、G118R-Q206L/R/Y、G
118R-Y209W、G118R-P210I、G118R-G211P、G118R
-T213A、G118R-L217K、G118R-M222Q、G118R-H24
9R、G118R-N261I、G118R-L262Q、S128L-Q206F/L
/M/R/Y、S128L-Y209W、S128R-P210I、S128R-A21
5K、S128R-L217K、S128R-N261I、P129Q-Q206F/L
/M/R/Y、P129Q-Y209W、S130A-Q206F/L/M/R/Y、S
130A-Y209W、Q206L/Y-T213A、Q206L/Y-M222Q、Q
206L/Y-H249R、Y209W-T213A、Y209W-M222Q、Y20
9W-H249R、P210I-L217K、P210I-N261I、T213A-M
222Q、T213A-H249R、A215K-N261I、M222Q-H249R
およびこれらの組み合わせ、または
(vi)S3V-N76D-G118R、N18R-S24R-Q206L/Y、N18
R-S24R-Y209W、N18R-S24R-T213A、N18R-S24R-H
249R、N18R-S87D/R-Y209W、N18R-G118R-Y209W、
N18R-Q206L/Y-Y209W、N18R-Q206L/Y-H249R、N1
8R-Y209W-T213A、N18R-Y209W-M222Q、N18R-Y20
9W-H249R、N18R-T213A-H249R、S24R-N76D-S78G
/N、S24R-N76D-S87D/R、S24R-N76D-G118R、S24R
-N76D-Y209W、S24R-N76D-M222Q、S24R-N76D-H2
49R、S24R-S78G/N-S87D/R、S24R-S78G/N-G118R
、S24R-S78G/N-Q206L、Y209WS24R-S78G/N-Y209
W、S24R-S78G/N-M222Q、S24R-S78G/N-H249R、S2
4R-S87D/R-G118R、S24R-S87D/R-Y209W、S24R-S
87D/R-M222Q、S24R-S87D/R-H249R、S24R-G118R
-Y209W、S24R-G118R-M222Q、S24R-G118R-H249R
、S24R-Q206L/Y-Y209W、S24R-Q206L/Y-H249R、S
24R-Y209W-T213A、S24R-Y209W-M222Q、S24R-Y2
09W-H249R、S24R-T213A-H249R、S24R-M222Q-H2
49R、N76D-S78G/N-S87D/R、N76D-S78G/N-G118R
、N76D-S78G/N-P129Q、N76D-S78G/N-S130A、N76
D-S78G/N-Q206L、N76D-S78G/N-Y209W、N76D-S7
8G/N-M222Q、N76D-S78G/N-H249R、N76D-S87D/R
-G118R、N76D-S87D/R-Q206L/Y、N76D-S87D/R-Y
209W、N76D-S87D/R-H249R、N76D-G118R-S128R、
N76D-G118R-Q206L/Y、N76D-G118R-Y209W、N76D
-G118R-M222Q、N76D-G118R-H249R、N76D-Y209W
-M222Q、N76D-Y209W-H249R、S78G/N-S87D/R-G1
18R、S78G/N-S87D/R-P129Q、S78G/N-S87D/R-S1
30A、S78G/N-S87D/R-Q206L/Y、S78G/N-S87D/R-
Y209W、S78G/N-S87D/R-M222Q、S78G/N-S87D/R-
H249R、S78G/N-G118R-P129Q、S78G/N-G118R-Y2
09W、S78G/N-G118R-M222Q、S78G/N-G118R-H249
R、S78G/N-P129Q-S130A、S78G/N-Y209W-M222Q、
S78G/N-Y209W-H249R、S78G/N-M222Q-H249R、S8
7D/R-G118R-Q206L、S87D/R-G118R-Y209W、S87D
/R-G118R-H249R、S87D/R-Q206L/Y-Y209W、S87D
/R-Y209W-H249R、S87D/R-Y209W-M222Q、S87D/R
-M222Q-H249R、G118R-Y209W-T213A、G118R-Y20
9W-M222Q、G118R-Y209W-H249R、G118R-M222Q-H
249R、Q206L/Y-Y209W-H249R、Y209W-T213A-M22
2Q、Y209W-T213A-H249R、Y209W-M222Q-H249Rおよ
びこれらの組み合わせ
から選択される、2つ以上の位置に置換を含む、請求項8~11のいずれか一項に記載の
スブチリシン変異体。
【請求項13】
(i)S3V-S78N、N18R-G20R、N18R-S24R、N18R-N4
3R、N18R-R45T、N18R-H249R、G20R-N43R、G20R-R
45T、G20R-H249R、T22L-S24F、T22L-S78N、T22L-
S166D、T22L-T213A、S24R/F-S78N、S24R-N43R、S
24R-Y209W、S24F-S166D、S24R/F-T213A、S24R-H
249R、S24R-M222Q、N43R-Y209W、N43R-H249R、N4
3R-R45T、R45T-H249R、S78G/N-Q206Y/F、S78N-S
166D、S78N-T213A、S101A-S188D、S101A-P210I、
S101A-A232V、S103A-S188D、S103A-P210I、S103
A-A232V、V104I-S188D、V104I-P210I、V104I-A2
32V、S166D-T213A、S188D-P210I、S188D-A232V、
S188D-Q245R、P210I-A232V、A232V-Q245R、Q206
Y-T213A、Q206L/Y-M222Q、Q206L-H249R、M222Q-
H249R、Y209W-M222Q、T213A-H249R、Y209W-H249
Rおよびこれらの組み合わせ、(ii)S3V-S78N-S87R、S3V-S78N
-G118R、N18R-S24R-N76D、N18R-N76D-H249R、S2
4R-N43R-N76D、S24R-N76D-H249R、S24F-S78N-G
118R、S24F-G118R-S166D、S78N-G118R-S166D、T
22L-S24F-G118R、T22L-S78N-G118R、T22L-G118
R-S166D、T22L-G118R-T213A、S24F-G118R-T213
A、S78N-G118R-T213A、N18R-G20R-N76D、N18R-N
43R-N76D、N18R-R45T-N76D、G20R-N76D-H249R、
G20R-N43R-N76D、G20R-R45T-N76D、S24R-Y209W
-G118R、S24R-G118R-M222Q、S24R-G118R-H249R
、N43R-G118R-Y209W、N43R-R45T-N76D、N43R-N7
6D-H249R、R45T-N76D-H249R、N76D-S101A-S188
D、N76D-S101A-P210I、N76D-S101A-A232V、N76D
-S103A-S188D、N76D-S103A-P210I、N76D-S103A
-A232V、N76D-V104I-S188D、N76D-V104I-P210I
、N76D-V104I-A232V、N76D-S188D-P210I、N76D-
S188D-A232V、N76D-P210I-A232V、N76D-Q206Y-
T213A、N76D-S24R-Q206Y、N76D-S24R-M222Q、N7
6D-Q206Y-M222Q、N76D-T213A-H249R、N76D-T21
3A-M222Q、N76D-M222Q-H249R、N76D-S78N-S87R
、N76D-S78N-G118R、N76D-S78N-S128L、N76D-S7
8N-P129Q、N76D-S78N-S130A、N76D-S87R-Q206L
、N76D-G118R-Q206L、N76D-S128L-Q206L、N76D-
P129Q-Q206L、N76D-S130A-Q206L、N76D-Q206L-
H249R、S78G-S87R-Q206Y/F、S78G-G118R-Q206Y
/F、S78N-G118R-Y209W、S78N-S87D-G118R、S78N
-S87D-Q206Y、S87D-Y209W-G118R、S87D-G118R-
M222Q、S87D-G118R-H249R、G118R-Q206L-M222Q
、G118R-Y209W-M222Q、G118R-M222Q-H249R、Y20
9W-G118R-M222Q、Y209W-G118R-H249Rおよびこれらの組
み合わせ、または(iii)S3V-S78N-S87R-G118R、S3V-N76
D-S78N-G118R-P129Q、N18R-S24R-N76D-H249R-
N18R-S24R-N76D-S78N-Q206L、S24F-S78N-G118
R-S166D、S24R-N76D-S78N-Q206L-H249R、S24R-
S78N-G118R-Q206L-M222Q、S24R-N43R-G118R-Y
209W、T22L-S24F-S78N-G118R-S166D-T213A、N1
8R-G20R-N43R-R45T-N76D-H249R、N76D-S101A-
S103A-V104I-S188D-P210I-A232V-Q245R、G20R
-S24R-N43R-N76D、N76D-S78N-S87R-G118R-S12
8L-P129Q-S130A、N76D-S87R-G118R-S128L-P12
9Q-S130A-Q206L、N76D-S78N-S87R-G118R-S128
L-P129Q-S130A-Q206L、S24R-N76D-S87R-Q206Y
-T213A-M222Q-H249R、S24R-N76D-S78N-S87D-G
118R-Y209W-M222Q-H249R、N76D-S78N-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Y209W、N76D-S78N-S8
7D-Q206YおよびS78G-S87R-G118R-Q206Y/Fならびにこれ
らの組み合わせから選択される、2、3もしくは4またはそれより多くの置換を含むアミ
ノ酸配列を含む単離されたスブチリシン変異体であって、
前記2つ以上の位置での置換は、76、87、118、128、129および130;X
76D、X87R、X118R、X128L、X129QおよびX130A;またはN7
6D、S87R、G118R、S128L、P129QおよびS130Aから選択される
1つ以上の置換とさらに組み合わされ、Xは任意のアミノ酸であり、前記変異体はタンパ
ク質分解活性を有し、
さらに、前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリク
エファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシ
ンBPN’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは前記
変異体アミノ酸配列と前記BPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたも
のであるスブチリシン変異体。
【請求項14】
S3V-N76D、S24R-N76D、S24R-G118R、S24R-H249
R、N76D-S78G、N76D-S78N、N76D-Q206L、N76D-Y2
09W、N76D-M222Q、S78N-Q206L、S78N-Y209W、N76
D-S78N-Y209W、N76D-S78N-Q206L、N76D-Q206L-
Y209Wおよびこれらの組み合わせから選択される、2つ以上の置換を含むアミノ酸配
列を含む単離されたスブチリシン変異体であって、
前記2つ以上の位置での置換は、
(i)A1V、S3I/T/V、I8V、S9G、A16T、N18K/R、G20E/
R、T22L/W、S24F/L/P/R、V28T、P40E、L42I、N43R/
S、I44V、S56P、N77D、S78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/
N/P/Q/R/T/V/W/Y、L82D、A88S、E89H、S99N、G100
S、S101F/G/H/Q/T/V、S103A/D/P、V104I、A108S、
N116L/M、H120R、L124M、G127S/T、V147I、V150T、
A158E/T/V、G159D、S160Q、S166D/N、N185Y、S188
D、A194D/P、N204D、Q206A/D/F/G/H/L/M/N/P/R/
S/Y、Y209W、P210I、G211P、S212D、T213A、A215K/
V、S216Y、L217K、N218S、M222L/Q/S、A232V、K235
T、W241K、N243S、Q245R、I246V、N248D、H249N/R、
K251R、N252I、A254T、S256P、S259G、N261I、L262
Q、V268A、A270P/TおよびE271D;
(ii)S3T/V、I8V、N18R、T22W、S24R、V28T、P40E、N
43S、S78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/T/V/W
/Y、E89H、S99N、S101F/G/V、S103A/D/P、V104I、A
108S、N116M、L124M、G127T、V147I、V150T、A158E
/T、G159D、S166D、S188D、A194D/P、Q206A/D/F/G
/H/L/M/N/P/R/S/Y、Y209W、P210I/L、G211P、S21
2D、T213A、A215V、L217K、M222Q/S、A232V、K235T
、N243S、Q245R、I246V、H249N/R、N261I、L262Q、A
270TおよびE271D;
(iii)S3V、I8V、S24R、P40E、N76D、S78G/N、S87D/
R、G118R、S128L/R、P129Q、S130A、Q206F/L/M/Y、
Y209W、P210I、T213A、A215K、L217K、M222Q、H249
RおよびN261I;
(iv)I8V、P40E、S87D/R、S128L/R、P129Q、S130A、
P210I、T213A、A215K、L217KおよびN261I;
(v)S3V、N18R、S24R、P40E、S78G/N、G127T、S166D
/N、Q206L/R/Y、Y209W、P210I、G211P、T213A、L21
7K、M222Q/S、H249N/R、N261IおよびL262Q;または
(vi)S3V、N18R、S24R、S78G/N、Q206L/R/YおよびH24
9N/R
から選択される1つ以上の置換とさらに組み合わされ、
前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシ
エンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシンBPN
’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは前記変異体ア
ミノ酸配列と前記BPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたものである
スブチリシン変異体。
【請求項15】
前記アミノ酸配列は、
N18R-S87R-G118R-S166N-N204D-Q206L-Y209W;
N18R-S24R-L42I-G118R-Y209W-T213A-M222Q-H
249R;N18R-S24R-Y209W-T213A-H249R;N18R-S2
4R-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y-Y2
09W-T213A-H249R;S24R-S87D-G118R-Y209W-T2
13A-H249R;S9G-N18R-S24R-N76D-G118R-S166N
-Q206L-H249R;N18R-G118R-Q206L-Y209W-T213
A-M222Q-H249R;S24R-S87R-S166N;N18R-S24R-
S87R-Q206L-Y209W-T213A;N18R-S24R-G118R-A
158V-Y209W;N18R-S24R-S87D-Q206L-Y209W-M2
22Q-H249R;N18R-S24R-S87R-G127T;S24R-S166
N-Y209W-T213A;N76D-S78N-G118R-Y209W-H249
R;N18R-N76D-S78N-S87R-Q206L-Y209W-H249R-
S259G;N18R-S24R-S87D-N185Y-Q206L-Y209W-T
213A-M222Q-H249R;S24R-G118R-G127T-Y209W;
A1V-N18R-S24R-S56P-G127T-Q206L-Y209W;S87
R-Y209W;N18R-S87D-Y209W-M222Q-H249R;N18R
-S24R-G118R-S128L-P129Q-S130A-S166D-Y209
W-T213A;S87D-S166D-T213A-H249R;N18R-S24P
-S87D-S166N-Q206L-Y209W-M222Q-H249R;N76D
-S166N-Y209W-T213A-H249R;S24R-Q206L-Y209
W-T213A-M222Q-H249R;N18R-G118R-Q206L-Y20
9W;N18R-S24R-S166D-Q206Y-H249R-A254T;N18
R-S24R-S78N-Q206L-Y209W-T213A-M222Q-H249
R;N18R-S24R-G118R-G127T-Y209W;S24R-N76D-
G118R-S166N-Q206L-Y209W;S24R-N76D-S87R-Y
209W-T213A-M222Q-H249R;N18K-S87R-Y209W-T
213A-M222Q-H249R;N18R-S24R-S87R-Y209W;N1
8R-S78N-G118R-Y209W-T213A-M222Q-H249R-A2
70P;N18R-S166N-Y209W-T213A-M222Q;N76D-S7
8N-S87R-S103P-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q2
06L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S13
0A-Q206L-N243S;N76D-S78N-S87R-G118R-S128
L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;N18R-N76D-S78N
-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N18R
-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-
Q206L-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249N;N18R-S2
4R-N76D-S78N-S87R-S99N-G118R-S128L-P129Q
-S130A-A158T-Q206L-I246V-H249R;S24R-N76D
-S78N-S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;N18R
-S24R-N76D-S78N-S128L-P129Q-S130A-Q206L-
H249R;N76D-S78N-G118R-Q206L-H249R;N18R-I
44V-N76D-S78N-S87R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6L-H249R;N18R-N76D-S78N-S87R-Q206L-H249R
;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-S128L-P129Q-S1
30A-Q206L;N76D-S78N-G118R-Q206L;A16T-N18
R-S24R-N76D-S78N-G118R-S128L-P129Q-S130A
-Q206L;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-Q206L-K235T;S24R-N76D-S7
8N-Q206L-H249R;S24R-N76D-S78N-S87R-S128L
-P129Q-S130A-Q206L;N18R-N76D-S78N-S87R-S
128L-P129Q-S130A-Q206L;N18R-S24R-N76D-S7
8N-S128L-P129Q-S130A;S24R-N76D-S78N-H249
R;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P
129Q-S130A-Q206L-A270T;N18R-S24R-N76D-S7
8N-G118R-S128L-P129Q-S130A-H249R;N18R-S2
4R-N76D-S78N-M222Q-H249R;N76D-S78N-S87R-
Q206L-H249R;N18R-N76D-S78N-Q206L-H249R;N
18R-S24R-N76D-S78N-G118R-Q206L-K251R;N76
D-S78N-Q206L-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S
87R-Q206L;N18R-S24R-N76D-S78N-G118R-S128
L-P129Q-S130A;N76D-S78N-H120R-Q206L-H249
R;N18R-N76D-S78N-S87R-S128L-P129Q-S130A-
Q206L-H249R;N18R-G20E-N76D-S78N-G118R-H2
49R;S24R-N76D-S78N-G118R-S128L-P129Q-S13
0A;N76D-S78N-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6L-H249R;S24R-N76D-S78N-G118R-Q206L;N18R
-N76D-S78N-S128L-P129Q-S130A-Q206L-V268A
;N18R-N76D-S78N-S87R-Q206L-N218S-M222Q-H
249R;N18R-S24R-N76D-S87R-G118R-S128L-P12
9Q-S130A-H249R;N76D-S78N-S87R-G118R-S128
L-P129Q-S130A;N18R-S24R-N76D-S78N-H249R;
N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P12
9Q-S130A-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-
H249R;N76D-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-
Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S
130A-Q206L;N18R-S24R-N76D-S78N-Q206L-H24
9R;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206L-H249R;N76D-S78N-S87R-G
118R-S128L-P129Q-S130A-M222Q;S24R-N76D-S
87R-Q206Y-T213A-M222Q-H249R;S24R-N76D-S7
8N-S87D-G118R-Y209W-M222Q-H249R;S87D-Q20
6L-Y209W-T213A-H249R;S24R-N76D-S78N-S87R
-G118R-Q206L-M222Q;S24R-N76D-S78N-Q206L-
M222Q;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-Q
206L-M222Q;N76D-S78N-S87R-G118R-P129Q-Q2
06L-M222Q;N76D-S78N-S87R-G118R-S130A-Q20
6L-M222Q;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129
Q-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-S130A
-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-Q206L;
N76D-S78N-S87R-G118R-P129Q-Q206L;N76D-S7
8N-S87R-G118R-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R
-G118R-Q206L-M222Q;N76D-S78N-S87R-G118R-
Q206L;S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-Y209W-M2
22Q;S24R-N43R-N76D-S78N-S87R-G118R-Y209W
-M222Q;G20R-S24R-N43R-N76D-S78N-S87R-G11
8R-Y209W-M222Q;G20R-N43R-N76D-S78N-S87R-
G118R-Y209W-M222Q;S24R-N76D-S78N-S87R-G1
18R-Q206L-Y209W-T213A-M222Q;S24R-N76D-S7
8N-S87R-G118R-Q206L-T213A-M222Q;S24R-N76
D-S78N-S87R-G118R-Y209W-T213A-M222Q;S24R
-N76D-S78N-S87R-N116L-G118R-Y209W-M222Q;
G20R-S24R-N43R-N76D-S78N-S87R-N116L-G118
R-Y209W-M222Q;N18R-N76D-S87R-S128L-P129Q
-S130A-Q206L-Y209W-H249R;N18R-S87D-S166N
-Q206L-Y209W;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-G1
18R-G127T-Y209W-T213A;N18R-S24R-S166D-Q2
06Y-H249R;S24R-S78N-S87R-S166D-Q206L-Y20
9W-H249R;S3V-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-S101V-G
118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S
87R-G118R-G127T-S128L-P129Q-S130A-Q206L;
N76D-S78N-S87R-S101G-S103A-V104I-G118R-Q
206L;N76D-S78N-S87R-G118R-G127T-Q206L;N7
6D-S78N-S87R-G118R-G127T-P129Q-Q206L;N76
D-S78N-S87R-G118R-G127T-P129Q-S130A-Q206
L;N76D-S78N-S87R-S101G-S103A-V104I-G118R
-G127T-P129R-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-Q206L-S212D;N76D-S78N-
S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-S166D-Q206L
;S3V-N76D-S78N-S87R-S101G-S103A-V104I-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-T213A;N
76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q2
06L-A232V-Q245R;N76D-S78N-S87R-G118R-S12
8L-P129Q-S130A-G159D-S188D-Q206L-A232V-Q
245R;S3V-S24R-N76D-S78N-S87D-G118R-Y209W
-M222Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-S101V-G
118R-Y209W-M222Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S8
7D-S101G-S103A-V104I-G118R-Y209W-M222Q-H
249R;S24R-N76D-S78N-S87D-G118R-Y209W-M22
2Q-H249R-S212D;S3V-S24R-N76D-S78N-S87D-S
101G-S103A-V104I-G118R-Y209W-M222Q-H249R
;S24R-N76D-S78N-S87D-S101G-S103A-V104I-G
118R-G127T-Y209W-T213A-M222Q-H249R;S024R
-N074D-S76N-S085D-S099G-S101A-V102I-G116
R-Y203W-M216Q-A226V-Q239R-H243R;S24R-N76
D-S78N-S87D-S101G-S103A-V104I-G118R-Y209
W-H249R;S3V-S24R-N76D-S78N-S87D-S101G-S1
03A-V104I-G118R-Y209W-H249R;S24R-N76D-S7
8N-S87D-S101G-S103A-V104I-G118R-G127T-Y2
09W-T213A-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-S101
T-G118R-Y209W-M222Q-H249R;S24R-N76D-S78N
-S87D-S101H-G118R-Y209W-M222Q-H249R;S24R
-N76D-S78N-S87D-G118R-P129Q-Y209W-M222Q-
H249R;N76D-S78N-S87D-G118R-S128L-P129Q-S
130A-Q206L;S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S12
8L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;N18R-S24R-N76
D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206
L;S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-
S130A-Q206L;S24R-N76D-S78N-S87D-G118R-Y2
09W-H249R;S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-Y209
W-M222Q-H249R;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L
-P129Q-S130A-Y209W;N76D-S78N-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-Q206L-Y209W;N76D-S87R-
S128L-P129Q-S130A-Q206L-Y209W-H249R;N76D
-S87R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-Y209W;S24R
-N76D-S78N-S87D-G118R-Y209W-M222S-H249R;
N76D-S78N-S87D-G118R-Y209W-H249R;N76D-S7
8N-S87D-G118R-Y209W-M222S-H249R;S24R-N76
D-S78N-S87D-G118R-M222Q-H249R;N76D-S78N-
S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-M222S
;S3T-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S1
30A-Q206L;V28T-N76D-S78N-S87R-G118R-S128
L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-A108S
-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N
-S87R-N116M-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206
L;N76D-S78N-S87R-G118R-L124M-S128L-P129Q
-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-V150T-Q206L;N76D-S78N-S87R-G
118R-S128L-P129Q-S130A-A194D-Q206L;N76D-
S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-A158E-
Q206L;V28T-N76D-S78N-S87R-S101F-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-A194D-Q206L;S24R-V28T-N4
3S-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-A158E-Q206L;S24R-V28T-N76D-S78N-S87R-G
118R-S128L-P129Q-S130A-A194D-Q206L;S24R-
N76D-S78N-S87D-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q
206L-T213A;S24R-V28T-N76D-S78N-S87D-S101
V-A108S-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;S2
4R-V28T-N76D-S78N-S87D-S101V-N116M-G118R
-S128L-P129Q-S130A-A158E-Q206L;S24R-N76D
-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L
-T213A;N76D-S78N-S87R-S103D-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206L;S24R-V28T-N76D-S78N-S8
7R-S101V-A108S-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q
206L-T213A-L217K;S24R-N76D-S78N-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-L217K;S3V-S24
R-N76D-S78N-S87R-G100S-S101V-G118R-Q206L
-L217K;N76D-N77D-S78N-S87R-G118R-Q206L-T
213A;S24R-N76D-S78N-S87D-G100S-S101V-N11
6M-G118R-L124M-S128L-P129Q-S130A-A194D-Q
206L;S24R-V28T-N76D-S78N-S87R-G118V-S128
L-P129Q-S130A-Q206L-T213A-L217K;S3V-N76D
-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A;S3V-N
76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Y2
09W;N76D-S78G-S87R-G118R-S128L-P129Q-S13
0A-Q206F;N76D-S78G-S87R-G118R-S128L-P129
Q-S130A-Q206Y;S3V-N76D-S78G-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206F;S3V-N76D-S78G-S87
R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;S3V-N76D
-S78G-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y
;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-
Q206F;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S
130A-Q206M;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-Q206Y;S3V-N76D-S78N-S87R-G118R
-S128L-P129Q-S130A-Q206F;S3V-N76D-S78N-S
87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;S3V-N7
6D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6Y;P40E-N76D-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A;I8V-P40E-N76D-S87R-G118R-S128L-P129Q-S
130A;P40E-N76D-S87R-G118R-S128L-P129Q-S1
30A-P210I;P40E-N76D-S87R-G118R-S128L-P12
9Q-S130A-G211P;P40E-N76D-S87R-G118R-S128
L-P129Q-S130A-N261I;N76D-S78N-S87R-G118R
-S128L-P129Q-S130A-P210I;N76D-S78N-S87R-
G118R-S128L-P129Q-S130A-Y209W-L262Q;N76D
-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-P210I
-L262Q;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-
S130A-V147I-A194P-A215V-E271D;T22W-N76D-
S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-V147I-
A194P-A215V;T22W-N76D-S78N-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-V147I-A215V-E271D;N76D-S
87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-L217K;N76D-S
78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-L217K;N
76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-V1
50T;N76D-S78G-S87R-G118R-S128L-P129Q-S13
0A-P210L;N76D-S87R-E89H-G118R-S128L-P129
Q-S130A-Q206Y;S3V-N76D-S87R-E89H-G118R-S
128L-P129Q-S130A-P210L;N76D-S78Q-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78T-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S7
8V-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;N7
6D-S78W-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6D;N76D-S78Y-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206D;N76D-S78A-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206F;N76D-S78C-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78E-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78F-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78H-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S7
8K-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N7
6D-S78L-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6F;N76D-S78M-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206F;N76D-S78Q-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206F;N76D-S78T-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78W-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78Y-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78C-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206G;N76D-S7
8M-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206G;N7
6D-S78C-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6H;N76D-S78E-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206H;N76D-S78F-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206H;N76D-S78G-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206H;N76D-S78H-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206H;N76D-S78L-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206H;N76D-S78T-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206H;N76D-S7
8V-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206H;N7
6D-S78A-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6M;N76D-S78C-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206M;N76D-S78E-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206M;N76D-S78F-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78G-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78I-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78K-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S7
8L-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N7
6D-S78M-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6M;N76D-S78Q-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206M;N76D-S78R-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206M;N76D-S78T-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78V-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78Y-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78A-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206N;N76D-S7
8C-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206N;N7
6D-S78E-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6N;N76D-S78G-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206N;N76D-S78H-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206N;N76D-S78I-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206N;N76D-S78L-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206N;N76D-S78M-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206N;N76D-S78Q-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206N;N76D-S7
8R-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206P;N7
6D-S78W-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6P;N76D-S78A-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206R;N76D-S78C-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206R;N76D-S78E-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78F-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78G-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78H-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S7
8I-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N7
6D-S78L-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6R;N76D-S78M-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206R;N76D-S78P-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206R;N76D-S78Q-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78R-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78T-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78V-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S7
8C-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206S;N7
6D-S78E-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6S;N76D-S78H-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206S;N76D-S78M-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206S;N76D-S78W-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206S;N76D-S78C-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S78E-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S78H-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S7
8I-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;N7
6D-S78K-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6Y;N76D-S78L-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206Y;N76D-S78M-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206Y;N76D-S78Q-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S78R-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S78T-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S78W-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S7
8Y-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;N7
6D-S78H-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6A;N76D-S78H-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206D;N76D-S78I-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206D;N76D-S78L-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78P-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78C-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206A;N76D-S78Q-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206A;N76D-S7
8A-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;N7
6D-S78C-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6D;N76D-S78E-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206D;N76D-S78G-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206D;N76D-S78M-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78M-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206H;N76D-S78A-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206H;N76D-S78H-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;S3V-S24
R-N76D-S78N-S87D-G118R-Y209W-H249R;S3V-N
76D-S78N-S87D-G118R-Y209W-H249R;S3I-N43Y
-L82D-G127S-S216Y-L217K-S256P;G127S-S216
Y;S3V-I8V-P40E-N76D-S87D-G118R-S128R-A21
5K-N261I;S3V-I8V-P40E-N76D-G118R-S128R-P
210I-N261I;S3V-P40E-N76D-S87D-G118R-S128
R-P210I-L217K;S3V-N76D-G118R-S128R;S3V-N
76D-S87D-G118R-S128R;S3V-N76D-G118R-S128
R-P210I;S3V-N76D-G118R-S128R-N261I;S3V-P
40E-N76D-G118R;S3V-P40E-N76D-G118R-S128R
;S3V-I8V-P40E-N76D-G118R-S128R;S3V-P40E-
N76D-S87D-G118R-S128R;S3V-P40E-N76D-G118
R-S128R-S160Q;S3V-P40E-N76D-G118R-S128R-
P210I;S3V-P40E-N76D-G118R-S128R-G211P;S3
V-P40E-N76D-G118R-S128R-A215K;S3V-P40E-N
76D-G118R-S128R-L217K;S3V-P40E-N76D-G118
R-S128R-N261I;S3V-P40E-N76D-G118R-S128R-
L262Q;S3V-I8V-P40E-N76D-G118R;S3V-P40E-N
76D-S87D-G118R;S3V-P40E-N76D-G118R-S160Q
;S3V-P40E-N76D-G118R-Q206Y;S3V-P40E-N76D
-G118R-P210I;S3V-P40E-N76D-G118R-G211P;S
3V-P40E-N76D-G118R-A215;S3V-P40E-N76D-G1
18R-L217K;S3V-P40E-N76D-G118R-N261I;S3V-
P40E-N76D-G118R-L262Q;S3V-N76D-G118R-S12
8R-G211P;S3V-N76D-G118R-S128R-L262Q;T22W
-N76D-S78N-S87R-G118R-S128R-P129Q-S130A-
V147I-A194P-A215V-E271D;N76D-S78N-S87R-G
118R-S128R-P129Q-S130A;N76D-S78N-S87R-G1
18R-S128R-P129Q-S130A-V147I-A194P-A215V;
N76D-S78N-S87R-G118R-S128R-P129Q-S130A-V
147I-A194P-E271D;T22W-N76D-S78N-S87R-G11
8R-S128R-P129Q-S130A-A215V-E271D;T22W-N7
6D-S78N-S87R-G118R-S128R-P129Q-S130A-A19
4P-E271D;P40E-N76D-S78G-G118R-S128R-Q206
Y-L262Q;S3V-P40E-N76D-G118R-G211P-L217K-
N261I;I8V-P40E-N76D-S78G-G118R-Q206Y-L21
7K;S3V-I8V-N76D-S78G-S87D-G118R-P210I-A2
15K-N252I;S3V-P40E-N76D-G118R-S160Q-P210
I-L217K-N261I;I8V-N76D-S78G-G118R-S160Q-
Q206Y-N252I-N261I;I8V-P40E-N76D-G118R-P2
10I-A215K-N261I;I8V-P40E-N76D-S78G-G118R
-Q206Y-P210I-A215K-N261I;S3V-N76D-G118R-
S160Q-G211P-A215V-L262Q;S3V-N76D-S87D-G1
18R-S128R-P210I-G211P-N261I-L262Q;S3V-P4
0E-N76D-G118R-Q206Y-P210I-G211P-A215K-N2
61I;I8V-P40E-N76D-S78G-G118R-G211P-L217K
-N252I-N261I;S3V-P40E-N76D-S87D-G118R-S1
28R-P210I-L217K-N261I;S3V-P40E-N76D-G118
R-S160Q-P210I-W241K-L262Q;I8V-N76D-S78G-
G118R-P210I-A215V-N261I;N76D-S78G-S87D-G
118R-P210I-A215V-L217K-N261I-L262Q;S3V-P
40E-N76D-S78G-G118R-Q206Y-L217K;S3V-P40E
-N76D-S78G-G118R-S128L-P129Q-S130A-L217K
;S3V-P40E-N76D-S78G-G118R-S128L-P129Q-S1
30A-Q206Y-P210I-A215V-L217K;N76D-S78N-S8
7D-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;S3V-P40
E-N76D-S78G-G118R-S128L-P129Q-S130A-A215
K-N261I;S3V-N76D-S87D-G118R-S128L-P129Q-
S130A-P210I-L217K;N76D-S87R-G118R-S128K-
V150T-L217K;N76D-S78N-S87R-G118R-S128K-V
150T-L217K;N76D-S78N-S87R-G118R-S128K-V1
50T;S3V-N76D-S78G-S87D-G118A-S166N-A194P
-Q206M-P210I-N218S-N248D-N261I-L262Q;S3V
-N76D-S78G-S87T-S101Q-G118A-S130Q-S166N-
A194P-P210I-N218S-N248D-S256P-N261I;S3V-
N76D-S78G-S87D-S101Q-G118A-Q206M-P210I-L
217K-N218S-M222Q-N248D-S256P;およびS24L-N76
D-S78N-S87D-A88S-G118R-Q206Y-Y209W-H249R
から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む、請求項1~14のいずれか一項に記載
のスブチリシン変異体。
【請求項16】
前記アミノ酸配列は、
N76D-S78N-S87R-S103P-G118R-S128L-P129Q-S
130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-Q206L-N243S;N76D-S78N-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;N18R-N7
6D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6L;N18R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206L-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S
87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249N;
N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-S99N-G118R-S128
L-P129Q-S130A-A158T-Q206L-I246V-H249R;N1
8R-S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206L-K235T;N18R-S24R-N76D-S78N-S
87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-A270T;
N18R-S24R-N76D-S87R-G118R-S128L-P129Q-S1
30A-H249R;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P12
9Q-S130A;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-H249R;N76D-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G
118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N18R-S24R-N
76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q2
06L-H249R;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P12
9Q-S130A-M222Q;S3V-N76D-S78N-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-S
101V-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-
S78N-S87R-G118R-G127T-S128L-P129Q-S130A-
Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S
130A-Q206L-S212D;N76D-S78N-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-S166D-Q206L;S3V-N76D-S78
N-S87R-S101G-S103A-V104I-G118R-S128L-P12
9Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128
L-P129Q-S130A-Q206L-T213A;N76D-S78N-S87R
-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-A232V-Q24
5R;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-G159D-S188D-Q206L-A232V-Q245R;S24R-N76
D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206
L-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206L;S24R-N76D-S78N-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S7
8N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Y209W;N7
6D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6L-Y209W;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129
Q-S130A-Q206L-M222S;S3T-N76D-S78N-S87R-G
118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;V28T-N76D-S
78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N
76D-S78N-S87R-A108S-G118R-S128L-P129Q-S1
30A-Q206L;N76D-S78N-S87R-N116M-G118R-S12
8L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118
R-L124M-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78
N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-V150T-Q20
6L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-A194D-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L
-P129Q-S130A-A158E-Q206L;V28T-N76D-S78N-
S87R-S101F-G118R-S128L-P129Q-S130A-A194D
-Q206L;S24R-V28T-N43S-N76D-S78N-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-A158E-Q206L;S24R-V2
8T-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-A194D-Q206L;S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-Q206L-T213A;N76D-S78N-
S87R-S103D-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L
;S24R-V28T-N76D-S78N-S87R-S101V-A108S-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-T213A-L217K;
S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S1
30A-Q206L-L217K;S3V-N76D-S78N-S87R-G118R
-S128L-P129Q-S130A;S3V-N76D-S78N-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Y209W;N76D-S78G-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S7
8G-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;S3
V-N76D-S78G-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A
-Q206F;S3V-N76D-S78G-S87R-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-Q206M;S3V-N76D-S78G-S87R-G118R
-S128L-P129Q-S130A-Q206;N76D-S78N-S87R-G
118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78N-S
87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S
78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;S
3V-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206F;S3V-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P
129Q-S130A-Q206M;S3V-N76D-S78N-S87R-G118
R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;P40E-N76D-S87R
-G118R-S128L-P129Q-S130A;I8V-P40E-N76D-S
87R-G118R-S128L-P129Q-S130A;P40E-N76D-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-P210I;P40E-N7
6D-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-G211P;P4
0E-N76D-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-N26
1I;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-P210I;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Y209W-L262Q;N76D-S78N-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-P210I-L262Q;N76D-S78N-
S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-V147I-A194P
-A215V-E271D;T22W-N76D-S78N-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-V147I-A194P-A215V;T22W-
N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-V
147I-A215V-E271D;N76D-S87R-G118R-S128L-P
129Q-S130A-L217K;N76D-S78N-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-L217K;N76D-S78N-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-V150T;N76D-S78G-S87
R-G118R-S128L-P129Q-S130A-P210L;N76D-S87
R-E89H-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;S3V
-N76D-S87R-E89H-G118R-S128L-P129Q-S130A-
P210L;N76D-S78Q-S87R-G118R-S128L-P129Q-S
130A-Q206D;N76D-S78T-S87R-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-Q206D;N76D-S78V-S87R-G118R-S12
8L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78W-S87R-G118
R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78Y-S87R
-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78A
-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D
-S78C-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F
;N76D-S78E-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-
Q206F;N76D-S78F-S87R-G118R-S128L-P129Q-S
130A-Q206F;N76D-S78H-S87R-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-Q206F;N76D-S78K-S87R-G118R-S12
8L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78L-S87R-G118
R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78M-S87R
-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78Q
-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D
-S78T-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F
;N76D-S78W-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-
Q206F;N76D-S78Y-S87R-G118R-S128L-P129Q-S
130A-Q206F;N76D-S78C-S87R-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-Q206G;N76D-S78M-S87R-G118R-S12
8L-P129Q-S130A-Q206G;N76D-S78C-S87R-G118
R-S128L-P129Q-S130A-Q206H;N76D-S78E-S87R
-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206H;N76D-S78F
-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206H;N76D
-S78G-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206H
;N76D-S78H-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-
Q206H;N76D-S78L-S87R-G118R-S128L-P129Q-S
130A-Q206H;N76D-S78T-S87R-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-Q206H;N76D-S78V-S87R-G118R-S12
8L-P129Q-S130A-Q206H;N76D-S78A-S87R-G118
R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78C-S87R
-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78E
-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D
-S78F-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M
;N76D-S78G-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-
Q206M;N76D-S78I-S87R-G118R-S128L-P129Q-S
130A-Q206M;N76D-S78K-S87R-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-Q206M;N76D-S78L-S87R-G118R-S12
8L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78M-S87R-G118
R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78Q-S87R
-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78R
-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D
-S78T-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M
;N76D-S78V-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-
Q206M;N76D-S78Y-S87R-G118R-S128L-P129Q-S
130A-Q206M;N76D-S78A-S87R-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-Q206N;N76D-S78C-S87R-G118R-S12
8L-P129Q-S130A-Q206N;N76D-S78E-S87R-G118
R-S128L-P129Q-S130A-Q206N;N76D-S78G-S87R
-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206N;N76D-S78H
-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206N;N76D
-S78I-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206N
;N76D-S78L-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-
Q206N;N76D-S78M-S87R-G118R-S128L-P129Q-S
130A-Q206N;N76D-S78Q-S87R-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-Q206N;N76D-S78R-S87R-G118R-S12
8L-P129Q-S130A-Q206P;N76D-S78W-S87R-G118
R-S128L-P129Q-S130A-Q206P;N76D-S78A-S87R
-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78C
-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D
-S78E-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206R
;N76D-S78F-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-
Q206R;N76D-S78G-S87R-G118R-S128L-P129Q-S
130A-Q206R;N76D-S78H-S87R-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-Q206R;N76D-S78I-S87R-G118R-S12
8L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78L-S87R-G118
R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78M-S87R
-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78P
-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D
-S78Q-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206R
;N76D-S78R-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-
Q206R;N76D-S78T-S87R-G118R-S128L-P129Q-S
130A-Q206R;N76D-S78V-S87R-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-Q206R;N76D-S78C-S87R-G118R-S12
8L-P129Q-S130A-Q206S;N76D-S78E-S87R-G118
R-S128L-P129Q-S130A-Q206S;N76D-S78H-S87R
-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206S;N76D-S78M
-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206S;N76D
-S78W-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206S
;N76D-S78C-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-
Q206Y;N76D-S78E-S87R-G118R-S128L-P129Q-S
130A-Q206Y;N76D-S78H-S87R-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-Q206Y;N76D-S78I-S87R-G118R-S12
8L-P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S78K-S87R-G118
R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S78L-S87R
-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S78M
-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206;N76D-
S78Q-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;
N76D-S78R-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q
206Y;N76D-S78T-S87R-G118R-S128L-P129Q-S1
30A-Q206Y;N76D-S78W-S87R-G118R-S128L-P12
9Q-S130A-Q206Y;N76D-S78Y-S87R-G118R-S128
L-P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S78H-S87R-G118R
-S128L-P129Q-S130A-Q206A;N76D-S78H-S87R-
G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78I-
S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-
S78L-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;
N76D-S78P-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q
206D;N76D-S78C-S87R-G118R-S128L-P129Q-S1
30A-Q206A;N76D-S78Q-S87R-G118R-S128L-P12
9Q-S130A-Q206A;N76D-S78A-S87R-G118R-S128
L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78C-S87R-G118R
-S128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78E-S87R-
G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78G-
S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-
S78M-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;
N76D-S78M-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q
206H;N76D-S78A-S87R-G118R-S128L-P129Q-S1
30A-Q206H;およびN76D-S78H-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206M
から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む、請求項1~15のいずれか一項に記載
のスブチリシン変異体。
【請求項17】
前記アミノ酸配列は、
N18R-S24R-N76D-S78N-H249R;N18R-S24R-N76D
-S78N-S87R-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-Q20
6L-H249R;S24F-S78N-G118R-S166D;T22L-S24F
-S78N-G118R-S166D-T213A;S24R-N76D-S87R-Q
206Y-T213A-M222Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S8
7D-G118R-Y209W-M222Q-H249R;S87D-Q206L-Y2
09W-T213A-H249R;S24R-N76D-S78N-S87R-G118
R-Q206L-M222Q;S24R-N76D-S78N-Q206L-M222Q
;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-Q206L-
M222Q;N76D-S78N-S87R-G118R-P129Q-Q206L-M
222Q;N76D-S78N-S87R-G118R-S130A-Q206L-M2
22Q;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-Q20
6L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-S130A-Q206
L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-Q206L;N76D-
S78N-S87R-G118R-P129Q-Q206L;N76D-S78N-S8
7R-G118R-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118
R-Q206L-M222Q;N76D-S78N-S87R-G118R-Q206L
;S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-Y209W-M222Q;S
24R-N43R-N76D-S78N-S87R-G118R-Y209W-M222
Q;G20R-S24R-N43R-N76D-S78N-S87R-G118R-Y2
09W-M222Q;G20R-N43R-N76D-S78N-S87R-G118R
-Y209W-M222Q;S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-Q
206L-Y209W-T213A-M222Q;S24R-N76D-S78N-S8
7R-G118R-Q206L-T213A-M222Q;S24R-N76D-S78
N-S87R-G118R-Y209W-T213A-M222Q;S24R-N76D
-S78N-S87R-N116L-G118R-Y209W-M222Q;G20R-
S24R-N43R-N76D-S78N-S87R-N116L-G118R-Y20
9W-M222Q;N18R-N76D-S87R-S128L-P129Q-S130
A-Q206L-Y209W-H249R;N18R-S87D-S166N-Q206
L-Y209W;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-G
127T-Y209W-T213A;N18R-S24R-S166D-Q206Y-H
249R;S24R-S78N-S87R-S166D-Q206L-Y209W-H2
49R;N76D-S78N-S87R-S101G-S103A-V104I-G11
8R-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-G127T-Q206
L;N76D-S78N-S87R-G118R-G127T-P129Q-Q206L
;N76D-S78N-S87R-G118R-G127T-P129Q-S130A-
Q206L;N76D-S78N-S87R-S101G-S103A-V104I-G
118R-G127T-P129R-Q206L;S3V-S24R-N76D-S78
N-S87D-G118R-Y209W-M222Q-H249R;S24R-N76D
-S78N-S87D-S101V-G118R-Y209W-M222Q-H249R
;S24R-N76D-S78N-S87D-S101G-S103A-V104I-G
118R-Y209W-M222Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S8
7D-G118R-Y209W-S212D-M222Q-H249R;S3V-S24
R-N76D-S78N-S87D-S101G-S103A-V104I-G118R
-Y209W-M222Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-S
101G-S103A-V104I-G118R-G127T-Y209W-T213A
-M222Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-S101G-S
103A-V104I-G118R-Y209W-M222Q-A232V-Q245R
-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-S101G-S103A-V
104I-G118R-Y209W-H249R;S3V-S24R-N76D-S78
N-S87D-S101G-S103A-V104I-G118R-Y209W-H24
9R;S24R-N76D-S78N-S87D-S101G-S103A-V104I
-G118R-G127T-Y209W-T213A-H249R;S24R-N76D
-S78N-S87D-S101T-G118R-Y209W-M222Q-H249R
;S24R-N76D-S78N-S87D-S101H-G118R-Y209W-M
222Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-G118R-P12
9Q-Y209W-M222Q-H249R;N76D-S78N-S87D-G118
R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;S24R-N76D-S78N
-S87D-G118R-Y209W-H249R;S24R-N76D-S78N-S
87R-G118R-Y209W-M222Q-H249R;N76D-S87R-S1
28L-P129Q-S130A-Q206L-Y209W-H249R;N76D-S
87R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-Y209W;S24R-N
76D-S78N-S87D-G118R-Y209W-M222S-H249R;N7
6D-S78N-S87D-G118R-Y209W-H249R;N76D-S78N
-S87D-G118R-Y209W-M222S-H249R;S24R-N76D-
S78N-S87D-G118R-M222Q-H249R;S24R-N76D-S7
8N-S87D-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-T2
13A;S24R-V28T-N76D-S78N-S87D-S101V-A108S
-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;S24R-V28T
-N76D-S78N-S87D-S101V-N116M-G118R-S128L-
P129Q-S130A-A158E-Q206L;S3V-S24R-N76D-S7
8N-S87R-G100S-S101V-G118R-Q206L-L217K;N7
6D-N77D-S78N-S87R-G118R-Q206L-T213A;S24R
-N76D-S78N-S87D-G100S-S101V-N116M-G118R-
L124M-S128L-P129Q-S130A-A194D-Q206L;S24R
-V28T-N76D-S78N-S87R-G118V-S128L-P129Q-S
130A-Q206L-T213A-L217K;S3V-S24R-N76D-S78
N-S87D-G118R-Y209W-H249R;S3V-N76D-S78N-S
87D-G118R-Y209W-H249R;S3I-N43Y-L82D-G127
S-S216Y-L217K-S256P;G127S-S216Y;S3V-I8V-
P40E-N76D-S87D-G118R-S128R-A215K-N261I;S
3V-I8V-P40E-N76D-G118R-S128R-P210I-N261I
;S3V-P40E-N76D-S87D-G118R-S128R-P210I-L2
17K;S3V-N76D-G118R-S128R;S3V-N76D-S87D-G
118R-S128R;S3V-N76D-G118R-S128R-P210I;S3
V-N76D-G118R-S128R-N261I;S3V-P40E-N76D-G
118R;S3V-P40E-N76D-G118R-S128R;S3V-I8V-P
40E-N76D-G118R-S128R;S3V-P40E-N76D-S87D-
G118R-S128R;S3V-P40E-N76D-G118R-S128R-S1
60Q;S3V-P40E-N76D-G118R-S128R-P210I;S3V-
P40E-N76D-G118R-S128R-G211P;S3V-P40E-N76
D-G118R-S128R-A215K;S3V-P40E-N76D-G118R-
S128R-L217K;S3V-P40E-N76D-G118R-S128R-N2
61I;S3V-P40E-N76D-G118R-S128R-L262Q;S3V-
I8V-P40E-N76D-G118R;S3V-P40E-N76D-S87D-G
118R;S3V-P40E-N76D-G118R-S160Q;S3V-P40E-
N76D-G118R-Q206Y;S3V-P40E-N76D-G118R-P21
0I;S3V-P40E-N76D-G118R-G211P;S3V-P40E-N7
6D-G118R-A215K;S3V-P40E-N76D-G118R-L217K
;S3V-P40E-N76D-G118R-N261I;S3V-P40E-N76D
-G118R-L262Q;S3V-N76D-G118R-S128R-G211P;
S3V-N76D-G118R-S128R-L262Q;T22W-N76D-S78
N-S87R-G118R-S128R-P129Q-S130A-V147I-A19
4P-A215V-E271D;N76D-S78N-S87R-G118R-S128
R-P129Q-S130A;N76D-S78N-S87R-G118R-S128R
-P129Q-S130A-V147I-A194P-A215V;N76D-S78N
-S87R-G118R-S128R-P129Q-S130A-V147I-A194
P-E271D;T22W-N76D-S78N-S87R-G118R-S128R-
P129Q-S130A-A215V-E271D;T22W-N76D-S78N-S
87R-G118R-S128R-P129Q-S130A-A194P-E271D;
P40E-N76D-S78G-G118R-S128R-Q206Y-L262Q;S
3V-P40E-N76D-G118R-G211P-L217K-N261I;I8V
-P40E-N76D-S78G-G118R-Q206Y-L217K;S3V-I8
V-N76D-S78G-S87D-G118R-P210I-A215K-N252I
;S3V-P40E-N76D-G118R-S160Q-P210I-L217K-N
261I;I8V-N76D-S78G-G118R-S160Q-Q206Y-N25
2I-N261I;I8V-P40E-N76D-G118R-P210I-A215K
-N261I;I8V-P40E-N76D-S78G-G118R-Q206Y-P2
10I-A215K-N261I;S3V-N76D-G118R-S160Q-G21
1P-A215V-L262Q;S3V-N76D-S87D-G118R-S128R
-P210I-G211P-N261I-L262Q;S3V-P40E-N76D-G
118R-Q206Y-P210I-G211P-A215K-N261I;I8V-P
40E-N76D-S78G-G118R-G211P-L217K-N252I-N2
61I;S3V-P40E-N76D-S87D-G118R-S128R-P210I
-L217K-N261I;S3V-P40E-N76D-G118R-S160Q-P
210I-W241K-L262Q;I8V-N76D-S78G-G118R-P21
0I-A215V-N261I;N76D-S78G-S87D-G118R-P210
I-A215V-L217K-N261I-L262Q;S3V-P40E-N76D-
S78G-G118R-Q206Y-L217K;S3V-P40E-N76D-S78
G-G118R-S128L-P129Q-S130A-L217K;S3V-P40E
-N76D-S78G-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y
-P210I-A215V-L217K;N76D-S78N-S87D-G118R-
S128L-P129Q-S130A-Q206Y;S3V-P40E-N76D-S7
8G-G118R-S128L-P129Q-S130A-A215K-N261I;S
3V-N76D-S87D-G118R-S128L-P129Q-S130A-P21
0I-L217K;N76D-S87R-G118R-S128K-V150T-L21
7K;N76D-S78N-S87R-G118R-S128K-V150T-L217
K;N76D-S78N-S87R-G118R-S128K-V150T;S3V-N
76D-S78G-S87D-G118A-S166N-A194P-Q206M-P2
10I-N218S-N248D-N261I-L262Q;S3V-N76D-S78
G-S87T-S101Q-G118A-S130Q-S166N-A194P-P21
0I-N218S-N248D-S256P-N261I;S3V-N76D-S78G
-S87D-S101Q-G118A-Q206M-P210I-L217K-N218
S-M222Q-N248D-S256P;S24L-N76D-S78N-S87D-
A88S-G118R-Q206Y-Y209W-H249R;N18R-S87R-G
118R-S166N-N204D-Q206L-Y209W;N18R-S24R-L
42I-G118R-Y209W-T213A-M222Q-H249R;N18R-S
24R-Y209W-T213A-H249R;N18R-S24R-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y-Y209W-T213A-H
249R;S24R-S87D-G118R-Y209W-T213A-H249R;S
9G-N18R-S24R-N76D-G118R-S166N-Q206L-H249
R;N18R-G118R-Q206L-Y209W-T213A-M222Q-H24
9R;S24R-S87R-S166N;N18R-S24R-S87R-Q206L-
Y209W-T213A;N18R-S24R-G118R-A158V-Y209W;
N18R-S24R-S87D-Q206L-Y209W-M222Q-H249R;N
18R-S24R-S87R-G127T;S24R-S166N-Y209W-T21
3A;N76D-S78N-G118R-Y209W-H249R;N18R-N76D
-S78N-S87R-Q206L-Y209W-H249R-S259G;N18R-
S24R-S87D-N185Y-Q206L-Y209W-T213A-M222Q-
H249R;S24R-G118R-G127T-Y209W;A1V-N18R-S2
4R-S56P-G127T-Q206L-Y209W;S87R-Y209W;N18
R-S87D-Y209W-M222Q-H249R;N18R-S24R-G118R
-S128L-P129Q-S130A-S166D-Y209W-T213A;S87
D-S166D-T213A-H249R;N18R-S24P-S87D-S166N
-Q206L-Y209W-M222Q-H249R;N76D-S166N-Y209
W-T213A-H249R;S24R-Q206L-Y209W-T213A-M22
2Q-H249R;N18R-G118R-Q206L-Y209W;N18R-S24
R-S166D-Q206Y-H249R-A254T;N18R-S24R-S78N
-Q206L-Y209W-T213A-M222Q-H249R;N18R-S24R
-G118R-G127T-Y209W;S24R-N76D-G118R-S166N
-Q206L-Y209W;S24R-N76D-S87R-Y209W-T213A-
M222Q-H249R;N18K-S87R-Y209W-T213A-M222Q-
H249R;N18R-S24R-S87R-Y209W;N18R-S78N-G11
8R-Y209W-T213A-M222Q-H249R-A270P;N18R-S1
66N-Y209W-T213A-M222Q;S24R-N76D-S78N-S12
8L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;N18R-S24R-N76
D-S78N-S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;N76
D-S78N-G118R-Q206L-H249R;N18R-I44V-N76D-
S78N-S87R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;
N18R-N76D-S78N-S87R-Q206L-H249R;N18R-S24
R-N76D-S78N-S87R-S128L-P129Q-S130A-Q206L
;N76D-S78N-G118R-Q206L;A16T-N18R-S24R-N7
6D-S78N-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;S2
4R-N76D-S78N-Q206L-H249R;S24R-N76D-S78N-
S87R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N18R-N76D-S
78N-S87R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N18R-S2
4R-N76D-S78N-S128L-P129Q-S130A;S24R-N76D
-S78N-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-H249R;N18R-S24R-N76D-S78
N-M222Q-H249R;N76D-S78N-S87R-Q206L-H249R
;N18R-N76D-S78N-Q206L-H249R;N18R-S24R-N7
6D-S78N-G118R-Q206L-K251R;N76D-S78N-Q206
L-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-Q206L;N
18R-S24R-N76D-S78N-G118R-S128L-P129Q-S13
0A;N76D-S78N-H120R-Q206L-H249R;N18R-N76D
-S78N-S87R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249R
;N18R-G20E-N76D-S78N-G118R-H249R;S24R-N7
6D-S78N-G118R-S128L-P129Q-S130A;N76D-S78
N-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;S2
4R-N76D-S78N-G118R-Q206L;N18R-N76D-S78N-
S128L-P129Q-S130A-Q206L-V268A;およびN18R-N7
6D-S78N-S87R-Q206L-N218S-M222Q-H249R
から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む、請求項1~16のいずれか一項に記載
のスブチリシン変異体。
【請求項18】
前記変異体は、配列番号1、配列番号2または配列番号14に対して少なくとも70、
75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%ま
たは100%未満のアミノ酸配列同一性を有する、請求項1~17のいずれか一項に記載
のスブチリシン変異体。
【請求項19】
前記変異体は、親またはベンチマークプロテアーゼと比較して1つ以上の改善された特
性を有し、前記改善された特性は、改善されたプロテアーゼ活性、洗剤の改善された洗浄
性能、および洗剤の改善された熱安定性から選択される、請求項1~18のいずれか一項
に記載のスブチリシン変異体。
【請求項20】
前記親プロテアーゼは配列番号1、配列番号2、または配列番号14である、請求項1
9に記載のスブチリシン変異体。
【請求項21】
前記改善された特性は、
(i)改善されたプロテアーゼ活性であり、前記変異体は脱脂乳基質に対してPI>1を
有し、
(ii)改善された洗浄性能であり、前記変異体は卵黄スワッチ洗浄PI>1を有し、
(iii)改善された熱安定性であり、前記変異体は安定性PI>1を有し、かつ/また
は
(iv)改善された熱安定性であり、前記変異体は、任意選択により、50℃、59℃、
および/または61℃で測定した場合、残留活性≧10%を有する、
請求項19または20に記載の単離されたスブチリシン変異体。
【請求項22】
請求項1~21のいずれか一項に記載の1種以上のスブチリシン変異体を含む組成物で
あって、前記組成物は自動食器洗浄用組成物ではないことを条件とする、組成物。
【請求項23】
前記組成物は洗剤組成物である、請求項22に記載の組成物。
【請求項24】
前記組成物は洗濯用洗剤組成物または手洗いによる食器洗浄用洗剤組成物である、請求
項22または23に記載の組成物。
【請求項25】
前記組成物は、ゲル、タブレット、粉末、固体、顆粒、単位剤形およびこれらの組み合
わせから選択される、請求項22~24のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項26】
前記組成物は、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテ
アーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチ
ナーゼ、ペクテートリアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、リダクターゼ、オキシダー
ゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナ
ーゼ、ペントサナーゼ、β-グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コン
ドロイチナーゼ、およびラッカーゼから選択される1つ以上の追加の酵素をさらに含む、
請求項22~25のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項27】
洗浄を必要とする製品または表面を洗浄する方法であって、前記製品または表面を、請
求項1~21のいずれか一項に記載のスブチリシン変異体、または請求項22~26のい
ずれか一項に記載の組成物と接触させる工程を含む方法。
【請求項28】
請求項1~21のいずれか一項に記載のスブチリシン変異体をコードするポリヌクレオ
チド配列を含む単離された核酸配列。
【請求項29】
1つ以上の請求項28に記載の核酸配列を含む発現ベクターまたはカセット。
【請求項30】
前記1つ以上の核酸配列はプロモーターに作動可能に連結されている、請求項29に記
載の発現ベクターまたはカセット。
【請求項31】
請求項29もしく30に記載の発現ベクターもしくはカセット、または請求項28に記
載の核酸配列を含む組換え宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は2016年5月3日に出願された米国仮特許出願第62/331,282号に関
連し、かつその優先権の利益を主張するものであり、その出願は参照によりその全体が本
明細書に組み込まれる。
【0002】
本明細書では、洗浄用途および洗浄方法において有用な、1種以上のスブチリシン変異
体を開示する。一実施形態は、1種以上のスブチリシン変異体、例えば、1種以上のバチ
ルス属(Bacillus)の菌のスブチリシンポリペプチド変異体、および1種以上の
そのような変異体を含む1種以上の洗浄用組成物に関する。
【0003】
電子的に提出された配列表の参照
ASCIIテキストファイルとして申請書と共に電子的に提出された配列リスト(名称
:NB41117WOPCT_ST25;サイズ:895KB;作成日:2017年5月
2日)の内容は出願の一部を構成し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
プロテアーゼ(プロテイナーゼとしても知られる)は、他のタンパク質を分解する能力
を有する酵素タンパク質である。プロテアーゼは、タンパク質を形成しているペプチドま
たはポリペプチド鎖においてアミノ酸同士を結び付けているペプチド結合を加水分解する
ことによってタンパク質の異化を開始する、タンパク質分解能を有する。タンパク質消化
酵素としてのプロテアーゼのこの活性は、タンパク質分解活性と呼ばれる。タンパク質分
解活性を測定するための多くのよく知られた手順が存在する(Kalisz,「Micr
obial Proteinases、」In:Fiechter(ed.),Adva
nces in Biochemical Engineering/Biotechn
ology,(1988))。例えば、タンパク質分解活性は、市販の基質に対する各プ
ロテアーゼの加水分解能力を分析する、比較アッセイによって解明することができる。プ
ロテアーゼまたはタンパク質分解活性の分析において有用な典型的な基質には、ジメチル
カゼイン(Sigma C-9801)、ウシのコラーゲン(Sigma C-9879
)、ウシのエラスチン(Sigma E-1625)およびウシのケラチン(ICN B
iomedical 902111)が含まれるが、それらに限定されない。これらの基
質を利用する比色アッセイは、当該技術分野でよく知られている(例えば、両者とも参照
により本明細書に組み込まれる、国際公開第99/34011号パンフレットおよび米国
特許第6,376,450号明細書を参照されたい)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
セリンプロテアーゼは、広範囲の特異性および生物学的機能を有する多様なクラスの酵
素を含むカルボニルヒドロラーゼのサブグループである。多くの研究がセリンプロテアー
ゼ(例えば、スブチリシン)について行われてきたが、これは主に、洗浄および飼料用途
におけるそれらの有用性に起因する。多数の有用な変異体プロテアーゼが、これらの適用
に関する必要性に対処するために開発されてきたが、プロテアーゼ改善の必要性は依然と
して存在する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
一実施形態は、78-X206A/D/F/G/H/M/N/P/R/S/Y、X78
A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-206、X7
8N-X206F/M/Y、X78G-X206D/F/H/M/N/P/R/Y、X7
8A/C/E/F/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-X206A/D
/F/G/H/M/N/P/R/S/Y、18-X78N、X18K/R-X78N、1
8-X87R、X18K/R-X87R、18-X206L/Y、X18K/R-X20
6L/Y、24-X87R、X24F/L/P/R-X87R、24-X206Y、X2
4F/L/P-206、X24F/L/P-X206Y、X24F/L/P-X209W
、40-78、X40E-78、40-X78G、X40E-X78G、40-87、X
40E-87、40-X87R、X40E-X87R、40-129、40-X129Q
、X40E-129、X40E-X129Q、40-130、40-X130A、X40
E-130、X40E-X130A、40-206、X40E-206、40-X206
Y、X40E-X206Y、X78N-87、X78N-X87D/R、X78A/C/
E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-87、X78G-X8
7D/R/T、X78A/C/E/F/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/
Y-X87R、X78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/
W/Y-129、X78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V
/W/Y-X129Q、X78A/C/E/F/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/
V/W/Y-X130A、X78G-X130A/Q、X78A/C/E/F/G/H/
I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-130、78-X249N/R、X78
N-249、X78N-X249N/R、87-X206L/Y、X87D/R-X20
6L/Y、87-X209W、X87D/R-X209W、87-X213A、X87D
/R-213、X87D/R-X213A、X87R-X249N/R、129-X20
6Y、X129Q-X206Y、129-X249N/R、X129Q-249、X12
9Q-X249N/R、130-X206Y、X130A-X206R/Y、130-X
249N/R、X130A-249、X130A-X249N/R、X206Y-209
、X206Y-X209W、206-X213A、X206L/Y-213、X206L
/Y-X213A、X206L/Y-249、X206L/Y-X249N/R、X20
9W-213、X209W-X213A、X209W-249、X209W-X249N
/R、18-24-78、X18K/R-24-78、18-X24F/L/P/R-7
8、18-24-X78N、X18K/R-24-X78N、18-X24F/L/P/
R-X78N、X18K/R-X24F/L/P/R-78、X18K/R-X24F/
L/P/R-X78N、18-24-87、X18K/R-24-87、18-X24F
/L/P/R-87、18-24-X87D/R、X18K/R-24-X87D/R、
18-X24F/L/P/R-X87D/R、X18K/R-X24F/L/P/R-8
7、X18K/R-X24F/L/P/R-X87D/R、18-24-129、X18
K/R-24-129、18-X24F/L/P/R-129、18-24-X129Q
、X18K/R-X24F/L/P/R-129、X18K/R-24-X129Q、1
8-X24F/L/P/R-X129Q、X18K/R-X24F/L/P/R-X12
9Q、18-24-130、18-X24F/L/P/R-130、18-24-X13
0A、X18K/R-24-130、X18K/R-X24F/L/P/R-130、X
18K/R-24-X130A、18-X24F/L/P/R-X130A、X18K/
R-X24F/L/P/R-X130A、18-24-206、18-24-X206L
/Y、18-X24F/L/P/R-206、X18K/R-24-206、X18K/
R-24-X206L/Y、18-X24F/L/P/R-X206L/Y、X18K/
R-X24F/L/P/R-206、X18K/R-X24F/L/P/R-X206L
/Y、18-24-209、18-24-X209W、18-X24F/L/P/R-2
09、X18K/R-24-209、X18K/R-24-X209W、18-X24F
/L/P/R-X209W、X18K/R-X24F/L/P/R-209、X18K/
R-X24F/L/P/R-X209W、18-78-87、18-X78N-87、1
8-78-X87D/R、X18K/R-78-87、X18K/R-X78N-87、
X18K/R-78-X87D/R、18-X78N-X87D/R、X18K/R-X
78N-X87D/R、18-78-129、18-X78N-129、18-78-X
129Q、X18K/R-78-129、X18K/R-X78N-129、X18K/
R-78-X129Q、18-X78N-X129Q、X18K/R-X78N-X12
9Q、18-78-130、18-X78N-130、18-78-X130A、X18
K/R-78-130、X18K/R-X78N-130、X18K/R-78-X13
0A、18-X78N-X130A、X18K/R-X78N-X130A、18-78
-206、18-78-X206L/Y、18-X78N-206、X18K/R-78
-206、18-X78N-X206L/Y、X18K/R-X78N-206、X18
K/R-78-X206L/Y、X18K/R-X78N-X206L/Y、18-78
-209、18-X78N-209、18-78-X209W、X18K/R-78-2
09、X18K/R-78-X209W、18-X78N-X209W、X18K/R-
X78N-209、X18K/R-X78N-X209W、18-78-213、18-
X78N-213、18-78-X213A、X18K/R-78-213、18-X7
8N-X213A、X18K/R-X78N-213、X18K/R-78-X213A
、X18K/R-X78N-X213A、18-78-249、18-78-X249N
/R、18-X78N-249、X18K/R-78-249、18-X78N-X24
9N/R、X18K/R-X78N-249、X18K/R-78-X249N/R、X
18K/R-X78N-X249N/R、18-87-129、X18K/R-87-1
29、18-X87D/R-129、18-87-X129Q、18-X87D/R-X
129Q、X18K/R-87-X129Q、X18K/R-X87D/R-129、X
18K/R-X87D/R-X129Q、18-87-130、X18K/R-87-1
30、18-X87D/R-130、18-87-X130A、18-X87D/R-X
130A、X18K/R-87-X130A、X18K/R-X87D/R-130、X
18K/R-X87D/R-X130A、18-87-206、X18K/R-87-2
06、18-X87D/R-206、18-87-X206L/Y、18-X87D/R
-X206L/Y、X18K/R-87-X206L/Y、X18K/R-X87D/R
-206、X18K/R-X87D/R-X206L/Y、18-87-209、X18
K/R-87-209、18-X87D/R-209、18-87-X209W、18-
X87D/R-X209W、X18K/R-X87D/R-209、X18K/R-87
-X209W、X18K/R-X87D/R-X209W、18-X87D/R-213
、18-87-X213A、18-X87D/R-X213A、X18K/R-X87D
/R-213、X18K/R-87-X213A、X18K/R-X87D/R-X21
3A、18-87-249、X18K/R-87-249、18-X87D/R-249
、18-87-X249N/R、18-X87D/R-249N/R、18K/R-X8
7D/R-249、18K/R-87-X249N/R、18K/R-X87D/R-X
249N/R、18-129-130、X18K/R-129-130、18-X129
Q-130、18-129-X130A、X18K/R-X129Q-130、X18K
/R-129-X130A、18-X129Q-X130A、X18K/R-X129Q
-X130A、18-129-206、X18K/R-129-206、18-X129
Q-206、18-129-X206L/Y、X18K/R-X129Q-206、X1
8K/R-129-X206L/Y、18-X129Q-X206L/Y、X18K/R
-X129Q-X206L/Y、18-129-209、X18K/R-129-209
、18-X129Q-209、18-129-X209W、X18K/R-X129Q-
209、X18K/R-129-X209W、18-X129Q-X209W、X18K
/R-X129Q-X209W、18-129-213、X18K/R-129-213
、18-X129Q-213、18-129-X213A、X18K/R-X129Q-
213、X18K/R-129-X213A、18-X129Q-X213A、X18K
/R-X129Q-X213A、18-129-249、X18K/R-129-249
、18-X129Q-249、18-129-X249N/R、X18K/R-X129
Q-249、X18K/R-129-X249N/R、18-X129Q-X249N/
R、X18K/R-X129Q-X249N/R、18-130-206、X18K/R
-130-206、18-X130A-206、18-130-X206L/Y、X18
K/R-X130A-206、X18K/R-130-X206L/Y、18-X130
A-X206L/Y、X18K/R-X130A-X206L/Y、18-130-20
9、X18K/R-130-209、18-X130A-209、18-130-X20
9W、X18K/R-X130A-209、X18K/R-130-X209W、18-
X130A-X209W、X18K/R-X130A-X209W、18-130-21
3、X18K/R-130-213、18-X130A-213、18-130-X21
3A、X18K/R-X130A-213、X18K/R-130-X213A、18-
X130A-X213A、X18K/R-X130A-X213A、18-130-24
9、X18K/R-130-249、18-X130A-249、18-130-X24
9N/R、X18K/R-X130A-249、X18K/R-130-X249N/R
、18-X130A-X249N/R、X18K/R-X130A-X249N/R、1
8-206-209、18-206-X209W、18-X206L/Y-209、18
K/R-206-209、18-X206L/Y-X209W、X18K/R-X206
L/Y-209、X18K/R-206-X209W、X18K/R-X206L/Y-
X209W、18-206-213、X18K/R-206-213、18-206L/
Y-213、18-206-X213A、X18K/R-X206L/Y-213、X1
8K/R-206-X213A、18-X206L/Y-X213A、X18K/R-X
206L/Y-X213A、18-206-249、X18K/R-206-249、1
8-206L/Y-249、18-206-X249N/R、X18K/R-X206L
/Y-249、X18K/R-206-X249N/R、18-X206L/Y-X24
9N/R、X18K/R-X206L/Y-X249N/R、18-209-213、1
8-X209W-213、X18K/R-209-213、18-209-X213A、
18-X209W-X213A、X18K/R-X209W-213、X18K/R-2
09-X213A、X18K/R-X209W-X213A、18-209-249、1
8-X209W-249、X18K/R-209-249、18-209-X249N/
R、18-X209W-X249N/R、18K/R-X209W-249、X18K/
R-209-X249N/R、X18K/R-X209W-X249N/R、18-21
3-X249N/R、X18K/R-X213A-249、X18K/R-213-X2
49N/R、18-X213A-X249N/R、X18K/R-X213A-X249
N/R、24-78-87、24-78-X87D/R、24-X78N-87、X24
F/L/P/R-78-87、24-X78N-X87D/R、X24R/P/F-78
-X87D/R、X24F/L/P/R-X78N-87、X24R/P/F-X78N
-X87D/R、X24F/L/P-78-129、X24F/L/P-X78N-12
9、X24F/L/P-78-X129Q、X24F/L/P-X78N-X129Q、
X24F/L/P-78-130、X24F/L/P-X78N-130、X24F/L
/P-78-X130A、X24F/L/P-X78N-X130A、24-78-X2
06Y、X24F/L/P-78-206、24-X78N-X206Y、X24F/L
/P-X78N-206、X24F/L/P-78-X206L/Y、X24F/L/P
-X78N-X206L/Y、X24F/L/P-78-209、X24F/L/P-X
78N-209、X24F/L/P-78-X209W、X24F/L/P-X78N-
X209W、24-78-213、X24F/L/P/R-78-213、24-X78
N-213、24-78-X213A、X24F/L/P/R-X78N-213、X2
4F/L/P/R-78-X213A、24-X78N-X213A、X24F/L/P
/R-X78N-X213A、24-78-X249N/R、24-X78N-249、
24-X78N-X249N/R、X24F/L/P/R-X78N-249、X24F
/L/P/R-78-X249N/R、X24F/L/P/R-X78N-X249N/
R、24-87-129、X24F/L/P/R-87-129、24-X87D/R-
129、24-87-X129Q、X24F/L/P/R-X87D/R-129、X2
4F/L/P/R-87-X129Q、24-X87D/R-X129Q、X24F/L
/P/R-X87D/R-X129Q、24-87-130、X24F/L/P/R-8
7-130、24-X87D/R-130、24-87-X130A、X24F/L/P
/R-X87D/R-130、X24F/L/P/R-87-X130A、24-X87
D/R-X130A、X24F/L/P/R-X87D/R-X130A、24-87-
X206L/Y、24-X87R-206、X24F/L/P/R-87-206、24
-X87D/R-X206L/Y、X24F/L/P/R-X87D/R-206、X2
4F/L/P/R-87-X206L/Y、X24F/L/P/R-X87D/R-X2
06L/Y、24-87-X209W、X24F/L/P/R-87-X209W、24
-87-X209W、24-87D/R-X209W、X24F/L/P/R-X87D
/R-X209W、24-X87D/R-213、24-87-X213A、24-X8
7D/R-X213A、X24F/L/P/R-X87D/R-213、X24F/L/
P/R-87-X213A、X24F/L/P/R-X87D/R-X213A、24-
87-249、X24F/L/P/R-87-249、24-X87D/R-249、2
4-87-X249N/R、X24F/L/P/R-X87D/R-249、X24F/
L/P/R-87-X249N/R、24-X87D/R-X249N/R、X24F/
L/P/R-X87D/R-X249N/R、X24F/L/P-129-130、X2
4F/L/P-X129Q-130、X24F/L/P-129-X130A、X24F
/L/P-X129Q-X130A、X24F/L/P-129-206、24-129
-X206Y、X24F/L/P-X129Q-206、X24F/L/P-129-X
206Y、24-X129Q-X206Y、X24F/L/P-X129Q-X206L
/Y、X24F/L/P/R-X129Q-X206Y、X24F/L/P-129-2
09、X24F/L/P-X129Q-209、X24F/L/P-129-X209W
、X24F/L/P-X129Q-X209W、24-129-213、X24F/L/
P/R-129-213、24-X129Q-213、24-129-X213A、X2
4F/L/P/R-X129Q-213、X24F/L/P/R-129-X213A、
24-X129Q-X213A、X24F/L/P/R-X129Q-X213A、24
-129-249、X24F/L/P/R-129-249、24-X129Q-249
、24-129-X249N/R、X24F/L/P/R-X129Q-249、X24
F/L/P/R-129-X249N/R、24-X129Q-X249N/R、X24
F/L/P/R-X129Q-X249N/R、X24F/L/P-130-206、2
4-130-X206Y、X24F/L/P-X130A-206、X24F/L/P-
130-X206L/Y、X24F/L/P/R-130-X206Y、24-X130
A-X206Y、X24F/L/P-X130A-X206L/Y、X24F/L/P/
R-X130A-X206Y、X24F/L/P-130-209、X24F/L/P-
X130A-209、X24F/L/P-130-X209W、X24F/L/P-X1
30A-X209W、24-130-213、X24F/L/P/R-130-213、
24-X130A-213、24-130-X213A、X24F/L/P/R-X13
0A-213、X24F/L/P/R-130-X213A、24-X130A-X21
3A、X24F/L/P/R-X130A-X213A、24-130-249、X24
F/L/P/R-130-249、24-X130A-249、24-130-X249
N/R、X24F/L/P/R-X130A-249、X24F/L/P/R-130-
X249N/R、24-X130A-X249N/R、X24F/L/P/R-X130
A-X249N/R、24-X206Y-209、24F/L/P-206-209、2
4-X206Y-X209W、X24F/L/P-X206L/Y-209、X24F/
L/P/R-X206Y-209、X24F/L/P-206-X209W、X24F/
L/P-X206L/Y-X209W、X24F/L/P/R-X206Y-X209W
、24-206-213、X24F/L/P/R-206-213、24-X206L/
Y-213、24-206-X213A、X24F/L/P/R-X206L/Y-21
3、X24F/L/P/R-206-X213A、24-X206L/Y-X213A、
X24F/L/P/R-X206L/Y-X213A、24-206-249、24-X
206L/Y-249、X24F/L/P/R-206-249、24-206-X24
9N/R、24-X206L/Y-X249N/R、X24F/L/P/R-X206L
/Y-249、X24F/L/P/R-206-X249N/R、X24F/L/P/R
-X206L/Y-X249N/R、24-209-213、24-X209W-213
、X24F/L/P/R-209-213、24-209-X213A、X24F/L/
P/R-X209W-213、24-X209W-X213A、X24F/L/P/R-
209-X213A、X24F/L/P/R-X209W-X213A、24-209-
249、24-X209W-249、X24F/L/P/R-209-249、24-2
09-X249N/R、X24F/L/P/R-X209W-249、24-X209W
-X249N/R、X24F/L/P/R-209-X249N/R、X24F/L/P
/R-X209W-X249N/R、78-87-129、X78N-87-129、7
8-X87D/R-129、78-87-X129Q、X78N-X87D/R-129
、X78N-87-X129Q、78-X87D/R-X129Q、X78N-X87D
/R-X129Q、78-87-130、X78N-87-130、78-X87D/R
-130、78-87-X130A、X78N-X87D/R-130、X78N-87
-X130A、78-X87D/R-X130A、X78N-X87D/R-X130A
、78-87-206、78-87-X206L/R/Y、X78N-87-206、7
8-X87D/R-206、78-X87D/R-X206L/R/Y、X78N-87
-X206L/R/Y、X78N-X87D/R-206、X78N-X87D/R-X
206L/R/Y、78-87-209、78-87-X209W、X78N-87-2
09、78-X87D/R-209、X78N-X87D/R-209、78-X87D
/R-X209W、X78N-87-X209W、X78N-X87D/R-X209W
、78-87-213、X78N-87-213、78-X87D/R-213、78-
87-X213A、X78N-X87D/R-213、X78N-87-X213A、7
8-X87D/R-X213A、X78N-X87D/R-X213A、78-87-2
49、78-87-X249N/R、X78N-87-249、78-87D/R-24
9、X78N-X87D/R-249、78-X87D/R-X249N/R、X78N
-87-X249N/R、X78N-X87D/R-X249N/R、78-129-X
206R/Y、X78N-129-X206Y、78-X129Q-X206R/Y、X
78N-X129Q-X206Y、78-129-213、X78N-129-213、
78-X129Q-213、78-129-X213A、X78N-X129Q-213
、X78N-129-X213A、78-X129Q-X213A、X78N-X129
Q-X213A、78-129-249、X78N-129-249、78-X129Q
-249、78-129-X249N/R、X78N-X129Q-249、X78N-
129-X249N/R、78-X129Q-X249N/R、X78N-X129Q-
X249N/R、78-130-X206R/Y、X78N-130-X206Y、78
-X130A-X206R/Y、X78N-X130A-X206Y、78-130-2
13、X78N-130-213、78-X130A-213、78-130-X213
A、X78N-X130A-213、X78N-130-X213A、78-X130A
-X213A、X78N-X130A-X213A、78-130-213、X78N-
130-213、78-X130A-213、78-130-X213A、X78N-X
130A-213、X78N-130-X213A、78-X130A-X213A、X
78N-X130A-X213A、78-130-249、X78N-130-249、
78-X130A-249、78-130-X249N/R、X78N-X130A-2
49、X78N-130-X249N/R、78-X130A-X249N/R、X78
N-X130A-X249N/R、78-206-209、X78N-206-209、
78-X206L/Y-209、78-206-X209W、X78N-X206L/Y
-209、X78N-206-X209W、78-X206L/Y-X209W、X78
N-X206L/Y-X209W、78-206-213、X78N-206-213、
78-X206L/Y-213、78-206-X213A、X78N-X206L/Y
-213、X78N-206-X213A、78-X206L/Y-X213A、X78
N-X206L/Y-X213A、78-206-249、78-206-X249R/
N、78-X206L/Y-249、X78N-206-249、X78N-206-X
249N/R、78-X206L/Y-X249N/R、X78N-X206L/Y-2
49、X78N-X206L/Y-X249N/R、78-209-213、78-X2
09W-213、78-209-X213A、X78N-209-213、X78N-X
209W-213、X78N-209-X213A、78-X209W-X213A、X
78N-X209W-X213A、78-209-249、78-X209W-249、
78-209-X249N/R、X78N-209-249、78-X209W-X24
9N/R、X78N-X209W-249、X78N-209-X249N/R、X78
N-X209W-X249N/R、78-213-249、78-X213A-249、
X78N-213-249、78-213-X249N/R、X78N-X213A-2
49、X78N-213-X249N/R、78-X213A-X249N/R、X78
N-X213A-X249N/R、87-129-130、X87D/R-129-13
0、87-X129Q-130、87-129-X130A、X87D/R-X129Q
-130、X87D/R-129-X130A、87-X129Q-X130A、X87
D/R-X129Q-X130A、87-129-206、X87D/R-129-20
6、87-X129Q-206、87-129-X206L/R/Y、X87D/R-X
129Q-206、X87D/R-129-X206L/R/Y、87-X129Q-X
206L/R/Y、X87D/R-X129Q-X206L/R/Y、87-129-2
09、X87D/R-129-209、87-X129Q-209、87-129-X2
09W、X87D/R-X129Q-209、X87D/R-129-X209W、87
-X129Q-X209W、X87D/R-X129Q-X209W、87-129-2
13、X87D/R-129-213、87-X129Q-213、87-129-X2
13A、X87D/R-X129Q-213、X87D/R-129-X213A、87
-X129Q-X213A、X87D/R-X129Q-X213A、87-129-2
49、X87D/R-129-249、87-X129Q-249、87-129-X2
49N/R、X87D/R-X129Q-249、X87D/R-129-X249N/
R、87-X129Q-X249N/R、X87D/R-X129Q-X249N/R、
87-130-206、X87D/R-130-206、87-X130A-206、8
7-130-X206L/R/Y、X87D/R-X130A-206、X87D/R-
130-X206L/R/Y、87-X130A-X206L/R/Y、X87D/R-
X130A-X206L/R/Y、87-130-209、X87D/R-130-20
9、87-X130A-209、87-130-X209W、X87D/R-X130A
-209、X87D/R-130-X209W、87-X130A-X209W、X87
D/R-X130A-X209W、87-130-213、X87D/R-130-21
3、87-X130A-213、87-130-X213A、X87D/R-X130A
-213、X87D/R-130-X213A、87-X130A-X213A、X87
D/R-X130A-X213A、87-130-249、X87D/R-130-24
9、87-X130A-249、87-130-X249N/R、X87D/R-X13
0A-249、X87D/R-130-X249N/R、87-X130A-X249N
/R、X87D/R-X130A-X249N/R、87-206-209、X87D/
R-206-209、87-X206L/Y-209、87-206-X209W、X8
7D/R-X206L/Y-209、X87D/R-206-X209W、87-X20
6L/Y-X209W、X87D/R-X206L/Y-X209W、87-206-2
13、87-X206L/Y-213、87-206-X213A、X87D/R-20
6-213、X87D/R-X206L/Y-213、X87D/R-206-X213
A、87-X206L/Y-X213A、X87D/R-X206L/Y-X213A、
87-206-249、87-X206L/Y-249、87D/R-206-249、
87-209-X249N/R、X87R-206-X249N/R、X87D/R-X
206L/Y-249、87-X206L/Y-X249N/R、X87R-X206L
/Y-X249N/R、87-209-213、X87D/R-209-213、87-
X209W-213、87-209-X213A、X87D/R-X209W-213、
X87D/R-209-X213A、87-X209W-X213A、X87D/R-X
209W-X213A、87-209-249、87-X209W-249、87-20
9-X249N/R、X87D/R-209-249、X87D/R-X209W-24
9、87-X209W-X249N/R、X87R-209-X249N/R、X87D
/R-X209W-X249N/R、87-213-249、87-X213A-249
、X87D/R-213-249、87-213-X249N/R、X87D/R-X2
13A-249、X87D/R-213-X249N/R、87-X213A-X249
N/R、X87D/R-X213A-X249N/R、129-130-X206R/Y
、X129Q-130-X206R/Y、129-X130A-X206R/Y、X12
9Q-X130A-X206R/Y、129-130-213、X129Q-130-2
13、129-X130A-213、129-130-X213A、X129Q-X13
0A-213、X129Q-130-X213A、129-X130A-X213A、X
129Q-X130A-X213A、129-130-249、X129Q-130-2
49、129-X130A-249、129-130-X249N/R、X129Q-X
130A-249、X129Q-130-X249N/R、129-X130A-X24
9N/R、X129Q-X130A-X249N/R、129-X206Y-209、X
129Q-X206Y-209、129-X206Y-X209W、X129Q-X20
6Y-X209W、129-206-213、129-X206L/Y-213、129
-206-X213A、X129Q-206-213、X129Q-X206L/Y-2
13、X129Q-206-X213A、129-X206L/Y-X213A、X12
9Q-X206L/Y-X213A、129-206-249、129-X206L/Y
-249、129-206-X249N/R、X129Q-206-249、X129A
-X206L/Y-249、X129Q-206-X249N/R、129-X206L
/Y-X249N/R、X129Q-X206L/Y-X249N/R、129-209
-213、129-X209W-213、129-209-X213A、X129Q-2
09-213、X129Q-X209W-213、X129Q-209-X213A、1
29-X209W-X213A、X129Q-X209W-X213A、129-209
-249、129-X209W-249、129-209-X249N/R、X129Q
-209-249、X129Q-X209W-249、X129Q-209-X249N
/R、129-X209W-X249N/R、X129Q-X209W-X249N/R
、129-213-249、129-X213A-249、129-213-X249N
/R、X129Q-213-249、X129Q-X213A-249、129-X21
3A-X249R、X129Q-213-X249N/R、X129Q-X213A-X
249N/R、130-X206Y-209、X130A-X206Y-209、130
-X206Y-X209W、X130A-X206Y-X209W、130-206-2
13、130-X206L/Y-213、130-206-X213A、X130A-2
06-213、X130A-X206L/Y-213、X130A-206-X213A
、130-X206L/Y-X213A、X130A-X206L/Y-X213A、1
30-206-249、130-X206L/Y-249、130-206-X249N
/R、X130A-206-249、X130A-X206L/Y-249、X130A
-206-X249N/R、130-X206L/Y-X249N/R、X130A-X
206L/Y-X249N/R、130-209-213、130-X209W-213
、130-209-X213A、X130A-209-213、X130A-X209W
-213、X130A-209-X213A、130-X209W-X213A、X13
0A-X209W-X213A、130-209-249、130-X209W-249
、130-209-X249N/R、X130A-209-249、X130A-X20
9W-249、X130A-209-X249N/R、130-X209W-X249N
/R、X130A-X209W-X249N/R、130-213-249、130-X
213A-249、130-213-X249N/R、X130A-213-249、X
130A-X213A-249、130-X213A-X249R、X130A-213
-X249N/R、X130A-X213A-X249N/R、130-209-249
、130-X209W-249、130-209-X249N/R、X130A-209
-249、X130A-X209W-249、X130A-209-X249N/R、1
30-X209W-X249N/R、X130A-X209W-X249N/R、206
-209-213、206-X209W-213、206-209-X213A、X20
6L/Y-209-213、206-X209W-X213A、X206L/Y-X20
9W-213、X206L/Y-209-X213A、X206L/Y-X209W-X
213A、206-209-249、206-X209W-249、206-209-X
249N/R、X206L/Y-209-249、X206L/Y-X209W-249
、206-X209W-X249N/R、X206L/Y-209-X249N/R、X
206L/Y-X209W-X249N/R、206-213-249、206-X21
3A-249、206-213-X249N/RX206L/Y-213-249、X2
06L/Y-X213A-249、X206L/Y-213-X249N/R、206-
X213A-X249N/R、X206L/Y-X213A-X249N/R、209-
213-249、X209W-213-249、209-X213A-249、209-
213-X249N/R、X209W-X213A-249、X209W-213-X2
49N/R、209-X213A-X249N/R、X209W-X213A-X249
N/Rおよびこれらの組み合わせから選択される、2つ以上の位置でのアミノ酸置換の組
み合わせを含むアミノ酸配列を含む、単離されたスブチリシン変異体を提供する;ここで
、Xは任意のアミノ酸であり、前記変異体はタンパク質分解活性を有しており;さらに、
前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシ
エンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシンBPN
’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ
酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたものである。
【0007】
他の実施形態は、(i)3-8、3-40、3-78、3-87、3-118、3-1
28、3-129、3-130、3-210、3-211、3-215、3-217、3
-261、3-262、8-40、8-76、8-87、8-118、8-128、8-
210、8-215、8-261、18-78、18-87、18-118、18-20
6、24-87、24-206、24-209、24-213、24-222、40-7
6、40-87、40-118、40-128、40-210、40-215、40-2
17、40-261、76-210、76-211、76-213、76-215、76
-217、76-249、76-261、76-262、78-87、78-118、7
8-210、78-213、78-222、78-249、87-206、87-209
、87-213、87-215、87-217、87-222、87-249、87-2
61、118-206、118-209、118-210、118-211、118-2
13、118-215、118-217、118-222、118-249、118-2
61、118-262、128-209、128-210、128-215、128-2
17、128-261、129-206、129-209、130-206、130-2
09、206-213、206-249、209-213、209-249、210-2
17、210-261、213-222、213-249、215-261、222-2
49およびこれらの組み合わせ;(ii)3-76-118、18-24-206、18
-24-209、18-24-213、18-24-249、18-87-209、18
-118-209、18-206-209、18-209-213、18-209-22
2、18-209-249、18-213-249、24-76-78、24-76-8
7、24-76-118、24-76-209、24-76-222、24-76-24
9、24-78-87、24-78-118、24-78-206、24-78-209
、24-78-222、24-78-249、24-87-118、24-87-209
、24-87-222、24-87-249、24-118-209、24-118-2
22、24-118-249、24-206-209、24-206-249、24-2
09-213、24-209-222、24-209-249、24-213-249、
24-222-249、76-78-118、76-78-87、76-78-129、
76-78-130、76-78-206、76-78-209、76-78-222、
76-78-249、76-87-118、76-87-206、76-87-209、
76-87-249、76-118-128、76-118-206、76-118-2
09、76-118-222、76-118-249、76-209-222、76-2
09-249、78-87-118、78-87-129、78-87-130、78-
87-206、78-87-209、78-87-222、78-87-249、78-
118-129、78-118-209、78-118-222、78-118-249
、78-129-130、78-209-222、78-209-249、78-222
-249、87-118-206、87-118-209、87-118-249、87
-206-209、87-209-222、87-209-249、87-222-24
9、118-209-213、118-209-222、118-209-249、11
8-222-249、206-209-249、209-213-222、209-21
3-249、209-222-249およびこれらの組み合わせ;(iii)X3V-X
8V、X3V-X40E、X3V-X78G/N、X3V-X87D、X3V-X118
R、X3V-X128R、X3V-X129Q、X3V-X130A、X3V-X210
I、X3V-X211P、X3V-X215K、X3V-X217K、X3V-X261
I、X3V-X262Q、X8V-X40E、X8V-X76D、X8V-X87D、X
8V-X118R、X8V-X128R、X8V-X210I、X8V-X215K、X
8V-X261I、X18R-X78N、X18R-X87R、X18R-X118R、
X18R-X206L、X24R-S78N、X24R-X87D/R、X24R-X2
06L/Y、X24R-X209W、X24R-X213A、X24R-X222Q、X
40E-X76D、X40E-X87D/R、X40E-X118R、X40E-X12
8R、X40E-X210I、X40E-X215K、X40E-X217K、X40E
-X261I、X76D-X87D、X76D-X128R、X76D-X206F/R
/M/Y、X76D-X210I、X76D-X211P、X76D-X213A、X7
6D-X215K、X76D-X217K、X76D-X249R、X76D-X261
I、X76D-X262Q、X78G-X206F/L/M/Y、X78G-X210I
、X78G-X261I、X78G/N-X87D/R、X78G/N-X118R、X
78G/N-X128L、X78G/N-X129Q、X78G/N-X130A、X7
8N-X213A、X78N-X222Q、X78N-X249R、X87D-X118
R、X87D-X128L/R、X87D-X129Q、X87D-X130A、X87
D/R-X209W、X87D-X210I、X87D-X215K、X87D-X21
7K、X87D/R-X222Q、X87D/R-X249R、X87R-X206F/
L/M/R/Y、X87R-X213A、X87D/R-X261I、X118R-X1
28R、X118R-X206F/M/L/R/Y、X118R-X209W、X118
R-X210II、X118R-X211P、X118R-X213A、X118R-X
215K、X118R-X217K、X118R-X222Q、X118R-X249R
、X118R-X261I、X118R-X262Q、X128L-X206F/L/M
/R/Y、X128L-X209W、X128R-P210I、X128R-A215K
、X128R-L217K、X128R-N261I、X129Q-X206F/L/M
/R/Y、X129Q-X209W、X130A-X206F/L/M/R/Y、S13
0A-Y209W、X206L/Y-X213A、X206L/Y-X222Q、X20
6L/Y-X249R、X209W-X213A、X209W-X222Q、X209W
-X249R、X210I-X217K、X210I-X261I、X213A-X22
2Q、X213A-X249R、X215K-X261I、X222Q-X249Rおよ
びこれらの組み合わせ;(iv)X3V-X76D-X118R、X18R-X24R-
X206L/Y、X18R-X24R-X209W、X18R-X24R-X213A、
X18R-X24R-X249R、X18R-X87D/R-X209W、X18R-X
118R-X209W、X18R-X206L/Y-X209W、X18R-X206L
/Y-X249R、X18R-X209W-X213A、X18R-X209W-X22
2Q、X18R-X209W-X249R、X18R-X213A-X249R、X24
R-X76D-X78G/N、X24R-X76D-X87D/R、X24R-X76D
-X118R、X24R-X76D-X209W、X24R-X76D-X222Q、X
24R-X76D-X249R、X24R-X78G/N-X87D/R、X24R-X
78G/N-X118R、X24R-X78G/N-X206L/Y、X24R-X78
G/N-X209W、X24R-X78G/N-X222Q、X24R-X78G/N-
X249R、X24R-X87D/R-X118R、X24R-X87D/R-X209
W、X24R-X87D/R-X222Q、X24R-X87D/R-X249R、X2
4R-X118R-X209W、X24R-X118R-X222Q、X24R-X11
8R-X249R、X24R-X206L-X209W、X24R-X206L/Y-X
249R、X24R-X209W-X213A、X24R-X209W-X222Q、X
24R-X209W-X249R、X24R-X213A-X249R、X24R-X2
22Q-X249R、X76D-X78G/N-X87D/R、X76D-X78G/N
-X118R、X76D-X78G/N-X129Q、X76D-X78G/N-X13
0A、X76D-X78G/N-X206L、X76D-X78G/N-X209W、X
76D-X78G/N-X222Q、X76D-X78G/N-X249R、X76D-
X87D/R-X118R、X76D-X87D/R-X206L/Y、X76D-X8
7D/R-X209W、X76D-X87D/R-X249R、X76D-X118R-
X128R、X76D-X118R-X206L/Y、X76D-X118R-X209
W、X76D-X118R-X222Q、X76D-X118R-X249R、X76D
-X209W-X222Q、X76D-X209W-X249R、X78G/N-X87
D/R-X118R、X78G/N-X87D/R-X129Q、X78G/N-X87
D/R-X130A、X78G/N-X87D/R-X206L/Y、X78G/N-X
87D/R-X209W、X78G/N-X87D/R-X222Q、X78G/N-X
87D/R-X249R、X78G/N-X118R-X129Q、X78G/N-X1
18R-X209W、X78G/N-X118R-X222Q、X78G/N-X118
R-X249R、X78G/N-X129Q-X130A、X78G/N-X209W-
X222Q、X78G/N-X209W-X249R、X78G/N-X222Q-X2
49R、X87D/R-X118R-X206L、X87D/R-X118R-X209
W、X87D/R-X118R-X249R、X87D/R-X206L/Y-X209
W、X87D/R-X209W-X222Q、X87D/R-X209W-X249R、
X87D/R-X222Q-X249R、X118R-X209W-X213A、X11
8R-X209W-X222Q、X118R-X209W-X249R、X118R-X
222Q-X249R、X206L-X209W-X249R、X209W-X213A
-X222Q、X209W-X213A-X249R、X209W-X222Q-X24
9Rおよびこれらの組み合わせ;(v)S3V-I8V、S3V-P40E、S3V-S
78G/N、S3V-S87D、S3V-G118R、S3V-S128R、S3V-P
129Q、S3V-S130A、S3V-P210I、S3V-G211P、S3V-A
215K、S3V-L217K、S3V-N261I、S3V-L262Q、I8V-P
40E、I8V-N76D、I8V-S87D、I8V-G118R、I8V-S128
R、I8V-P210I、I8V-A215K、I8V-N261I、N18R-S78
N、N18R-S87R、N18R-G118R、N18R-Q206L、S24R-S
78N、S24R-S87D/R、S24R-Q206L/Y、S24R-Y209W、
S24R-T213A、S24R-M222Q、P40E-N76D、P40E-S87
D/R、P40E-G118R、P40E-S128R、P40E-P210I、P40
E-A215K、P40E-L217K、P40E-N261I、N76D-S87D、
N76D-P210I、N76D-S128R、N76D-Q206F/R/M/Y、N
76D-P210I、N76D-G211P、N76D-T213A、N76D-A21
5K、N76D-L217K、N76D-H249R、N76D-N261I、N76D
-L262Q、S78G-Q206F/L/M/Y、S78G-P210I、S78G-
N261I、S78G/N-S87D/R、S78G/N-G118R、S78G/N-
S128L、S78G/N-P129Q、S78G/N-S130A、S78N-T21
3A、S78N-M222Q、S78N-H249R、S87D-G118R、S87D
-S128L/R、S87D-P129Q、S87D-S130A、S87D/R-Y2
09W、S87D-P210I、S87D-A215K、S87D-L217K、S87
D/R-M222Q、S87D/R-H249R、S87R-Q206F/L/M/R/
Y、S87R-T213A、S87D/R-N261I、G118R-S128R、G1
18R-Q206L/R/Y、G118R-Y209W、G118R-P210I、G1
18R-G211P、G118R-T213A、G118R-L217K、G118R-
M222Q、G118R-H249R、G118R-N261I、G118R-L262
Q、S128L-Q206F/L/M/R/Y、S128L-Y209W、S128R-
P210I、S128R-A215K、S128R-L217K、S128R-N261
I、P129Q-Q206F/L/M/R/Y、P129Q-Y209W、S130A-
Q206F/L/M/R/Y、S130A-Y209W、Q206L/Y-T213A、
Q206L/Y-M222Q、Q206L/Y-H249R、Y209W-T213A、
Y209W-M222Q、Y209W-H249R、P210I-L217K、P210
I-N261I、T213A-M222Q、T213A-H249R、A215K-N2
61I、M222Q-H249Rおよびこれらの組み合わせ;または(vi)S3V-N
76D-G118R、N18R-S24R-Q206L/Y、N18R-S24R-Y2
09W、N18R-S24R-T213A、N18R-S24R-H249R、N18R
-S87D/R-Y209W、N18R-G118R-Y209W、N18R-Q206
L/Y-Y209W、N18R-Q206L/Y-H249R、N18R-Y209W-
T213A、N18R-Y209W-M222Q、N18R-Y209W-H249R、
N18R-T213A-H249R、S24R-N76D-S78G/N、S24R-N
76D-S87D/R、S24R-N76D-G118R、S24R-N76D-Y20
9W、S24R-N76D-M222Q、S24R-N76D-H249R、S24R-
S78G/N-S87D/R、S24R-S78G/N-G118R、S24R-S78
G/N-Q206L、Y209WS24R-S78G/N-Y209W、S24R-S7
8G/N-M222Q、S24R-S78G/N-H249R、S24R-S87D/R
-G118R、S24R-S87D/R-Y209W、S24R-S87D/R-M22
2Q、S24R-S87D/R-H249R、S24R-G118R-Y209W、S2
4R-G118R-M222Q、S24R-G118R-H249R、S24R-Q20
6L/Y-Y209W、S24R-Q206L/Y-H249R、S24R-Y209W
-T213A、S24R-Y209W-M222Q、S24R-Y209W-H249R
、S24R-T213A-H249R、S24R-M222Q-H249R、N76D-
S78G/N-S87D/R、N76D-S78G/N-G118R、N76D-S78
G/N-P129Q、N76D-S78G/N-S130A、N76D-S78G/N-
Q206L、N76D-S78G/N-Y209W、N76D-S78G/N-M222
Q、N76D-S78G/N-H249R、N76D-S87D/R-G118R、N7
6D-S87D/R-Q206L/Y、N76D-S87D/R-Y209W、N76D
-S87D/R-H249R、N76D-G118R-S128R、N76D-G118
R-Q206L/Y、N76D-G118R-Y209W、N76D-G118R-M2
22Q、N76D-G118R-H249R、N76D-Y209W-M222Q、N7
6D-Y209W-H249R、S78G/N-S87D/R-G118R、S78G/
N-S87D/R-P129Q、S78G/N-S87D/R-S130A、S78G/
N-S87D/R-Q206L/Y、S78G/N-S87D/R-Y209W、S78
G/N-S87D/R-M222Q、S78G/N-S87D/R-H249R、S78
G/N-G118R-P129Q、S78G/N-G118R-Y209W、S78G/
N-G118R-M222Q、S78G/N-G118R-H249R、S78G/N-
P129Q-S130A、S78G/N-Y209W-M222Q、S78G/N-Y2
09W-H249R、S78G/N-M222Q-H249R、S87D/R-G118
R-Q206L、S87D/R-G118R-Y209W、S87D/R-G118R-
H249R、S87D/R-Q206L/Y-Y209W、S87D/R-Y209W-
H249R、S87D/R-Y209W-M222Q、S87D/R-M222Q-H2
49R、G118R-Y209W-T213A、G118R-Y209W-M222Q、
G118R-Y209W-H249R、G118R-M222Q-H249R、Q206
L/Y-Y209W-H249R、Y209W-T213A-M222Q、Y209W-
T213A-H249R、Y209W-M222Q-H249Rおよびこれらの組み合わ
せから選択される、2つ以上の置換を含むアミノ酸配列を含む、単離されたスブチリシン
変異体を提供する;ここで、前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバ
チルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaci
ens)スブチリシンBPN’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされ
ており、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決
定されたものである。
【0008】
さらに他の実施形態は、76、87、118、128、129および130;X76D
、X87D/R/T、X118A/R/V、X128K/L/R、X129Q/Rおよび
X130A/Q;またはN76D、S87D/R/T、G118A/R/V、S128K
/L/R、P129Q/RおよびS130A/Qから選択される、1、2、3、4、5ま
たは6つの位置での置換と、(i)1、3、8、9、16、18、20、22、24、2
8、40、42、43、44、56、77、78、82、88、89、99、100、1
01、103、104、108、116、120、124、127、147、150、1
58、159、160、166、185、188、194、204、206、209、2
10、211、212、213、215、216、217、218、222、232、2
35、241、243、245、246、248、249、251、252、254、2
56、259、261、262、268、270、および271;(ii)X1V、X3
I/T/V、X8V、X9G、X16T、X18K/R、X20E/R、X22L/W、
X24F/L/P/R、X28T、X40E、X42I、X43R/S/Y、X44V、
X56P、X77D、X78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R
/T/V/W/Y、X82D、X88S、X89H、X99N、X100S、X101F
/G/H/Q/T/V、X103A/D/P、X104I、X108S、X116L/M
、X120R、X124M、X127S/T、X147I、X150T、X158E/T
/V、X159D、X160Q、X166D/N、X185Y、X188D、X194D
/P、X204D、X206A/D/F/G/H/L/M/N/P/R/S/Y、X20
9W、X210I、X211P、X212D、X213A、X215K/V、X216Y
、X217K、X218S、X222L/Q/S、X232V、X235T、X241K
、X243S、X245R、X246V、X248D、X249N/R、X251R、X
252I、X254T、X256P、X259G、X261I、X262Q、X268A
、X270P/TおよびX271Dまたは(iii)A1V、S3I/T/V、I8V、
S9G、A16T、N18K/R、G20E/R、T22L/W、S24F/L/P/R
、V28T、P40E、L42I、N43R/S、I44V、S56P、N77D、S7
8A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/T/V/W/Y、L82
D、A88S、E89H、S99N、G100S、S101F/G/H/Q/T/V、S
103A/D/P、V104I、A108S、N116L/M、H120R、L124M
、G127S/T、V147I、V150T、A158E/T/V、G159D、S16
0Q、S166D/N、N185Y、S188D、A194D/P、N204D、Q20
6A/D/F/G/H/L/M/N/P/R/S/Y、Y209W、P210I、G21
1P、S212D、T213A、A215K/V、S216Y、L217K、N218S
、M222L/Q/S、A232V、K235T、W241K、N243S、Q245R
、I246V、N248D、H249N/R、K251R、N252I、A254T、S
256P、S259G、N261I、L262Q、V268A、A270P/TおよびE
271Dから選択される、1つ以上の位置での1つ以上の置換とを組み合わせて含むアミ
ノ酸配列を含む、単離されたスブチリシン変異体に関する;ここで、Xは任意のアミノ酸
であり、前記変異体はタンパク質分解活性を有しており;さらに、前記変異体の各アミノ
酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacill
us amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’配列の、対応するア
ミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミ
ノ酸配列とのアラインメントにより決定されたものである。
【0009】
さらに他の実施形態は、S3V-S78N、N18R-G20R、N18R-S24R
、N18R-N43R、N18R-R45T、N18R-H249R、G20R-N43
R、G20R-R45T、G20R-H249R、T22L-S24F、T22L-S7
8N、T22L-S166D、T22L-T213A、S24R/F-S78N、S24
R-N43R、S24R-Y209W、S24F-S166D、S24R/F-T213
A、S24R-H249R、S24R-M222Q、N43R-Y209W、N43R-
H249R、N43R-R45T、R45T-H249R、S78G/N-Q206Y/
F、S78N-S166D、S78N-T213A、S101A-S188D、S101
A-P210I、S101A-A232V、S103A-S188D、S103A-P2
10I、S103A-A232V、V104I-S188D、V104I-P210I、
V104I-A232V、S166D-T213A、S188D-P210I、S188
D-A232V、S188D-Q245R、P210I-A232V、A232V-Q2
45R、Q206Y-T213A、Q206L/Y-M222Q、Q206L-H249
R、M222Q-H249R、Y209W-M222Q、T213A-H249R、Y2
09W-H249Rおよびこれらの組み合わせから選択される、2つ以上の位置での置換
を含むアミノ酸配列を含む単離されたスブチリシン変異体に関する;ここで、前記2つ以
上の位置での置換は、76、87、118、128、129および130;X76D、X
87R、X118R、X128L、X129QおよびX130A;またはN76D、S8
7R、G118R、S128L、P129QおよびS130Aから選択される1つ以上の
置換とさらに組み合わされ;Xは任意のアミノ酸であり、前記変異体はタンパク質分解活
性を有しており;さらに、前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチ
ルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefacie
ns)スブチリシンBPN’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされて
おり、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定
されたものである。
【0010】
さらに他の実施形態は、S3V-N76D、S24R-N76D、S24R-G118
R、S24R-H249R、N76D-S78G、N76D-S78N、N76D-Q2
06L、N76D-Y209W、N76D-M222Q、S78N-Q206L、S78
N-Y209W、N76D-S78N-Y209W、N76D-S78N-Q206L、
N76D-Q206L-Y209Wおよびこれらの組み合わせから選択される、2つ以上
の置換を含むアミノ酸配列を含む単離されたスブチリシン変異体に関する;ここで、前記
2つ以上の位置での置換は、(i)A1V、S3I/T/V、I8V、S9G、A16T
、N18K/R、G20E/R、T22L/W、S24F/L/P/R、V28T、P4
0E、L42I、N43R/S、I44V、S56P、N77D、S78A/C/E/F
/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/T/V/W/Y、L82D、A88S、E
89H、S99N、G100S、S101F/G/H/Q/T/V、S103A/D/P
、V104I、A108S、N116L/M、H120R、L124M、G127S/T
、V147I、V150T、A158E/T/V、G159D、S160Q、S166D
/N、N185Y、S188D、A194D/P、N204D、Q206A/D/F/G
/H/L/M/N/P/R/S/Y、Y209W、P210I、G211P、S212D
、T213A、A215K/V、S216Y、L217K、N218S、M222L/Q
/S、A232V、K235T、W241K、N243S、Q245R、I246V、N
248D、H249N/R、K251R、N252I、A254T、S256P、S25
9G、N261I、L262Q、V268A、A270P/T、およびE271D;(i
i)S3T/V、I8V、N18R、T22W、S24R、V28T、P40E、N43
S、S78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/T/V/W/Y
、E89H、S99N、S101F/G/V、S103A/D/P、V104I、A10
8S、N116M、L124M、G127T、V147I、V150T、A158E/T
、G159D、S166D、S188D、A194D/P、Q206A/D/F/G/H
/L/M/N/P/R/S/Y、Y209W、P210I/L、G211P、S212D
、T213A、A215V、L217K、M222Q/S、A232V、K235T、N
243S、Q245R、I246V、H249N/R、N261I、L262Q、A27
0TおよびE271D;(iii)S3V、I8V、S24R、P40E、N76D、S
78G/N、S87D/R、G118R、S128L/R、P129Q、S130A、Q
206F/L/M/Y、Y209W、P210I、T213A、A215K、L217K
、M222Q、H249RおよびN261I;(iv)I8V、P40E、S87D/R
、S128L/R、P129Q、S130A、P210I、T213A、A215K、L
217K、およびN261I;(v)S3V、N18R、S24R、P40E、S78G
/N、G127T、S166D/N、Q206L/R/Y、Y209W、P210I、G
211P、T213A、L217K、M222Q/S、H249N/R、N261Iおよ
びL262Q;または(vi)S3V、N18R、S24R、S78G/N、Q206L
/R/YおよびH249N/Rから選択される1つ以上の置換とさらに組み合わされ;前
記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示される、バチルス・アミロリクエファシ
エンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシンBPN
’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ
酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたものである。
【0011】
なおさらなる他の実施形態は、N18R-S87R-G118R-S166N-N20
4D-Q206L-Y209W;N18R-S24R-L42I-G118R-Y209
W-T213A-M222Q-H249R;N18R-S24R-Y209W-T213
A-H249R;N18R-S24R-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206Y-Y209W-T213A-H249R;S24R-S87D
-G118R-Y209W-T213A-H249R;S9G-N18R-S24R-N
76D-G118R-S166N-Q206L-H249R;N18R-G118R-Q
206L-Y209W-T213A-M222Q-H249R;S24R-S87R-S
166N;N18R-S24R-S87R-Q206L-Y209W-T213A;N1
8R-S24R-G118R-A158V-Y209W;N18R-S24R-S87D
-Q206L-Y209W-M222Q-H249R;N18R-S24R-S87R-
G127T;S24R-S166N-Y209W-T213A;N76D-S78N-G
118R-Y209W-H249R;N18R-N76D-S78N-S87R-Q20
6L-Y209W-H249R-S259G;N18R-S24R-S87D-N185
Y-Q206L-Y209W-T213A-M222Q-H249R;S24R-G11
8R-G127T-Y209W;A1V-N18R-S24R-S56P-G127T-
Q206L-Y209W;S87R-Y209W;N18R-S87D-Y209W-M
222Q-H249R;N18R-S24R-G118R-S128L-P129Q-S
130A-S166D-Y209W-T213A;S87D-S166D-T213A-
H249R;N18R-S24P-S87D-S166N-Q206L-Y209W-M
222Q-H249R;N76D-S166N-Y209W-T213A-H249R;
S24R-Q206L-Y209W-T213A-M222Q-H249R;N18R-
G118R-Q206L-Y209W;N18R-S24R-S166D-Q206Y-
H249R-A254T;N18R-S24R-S78N-Q206L-Y209W-T
213A-M222Q-H249R;N18R-S24R-G118R-G127T-Y
209W;S24R-N76D-G118R-S166N-Q206L-Y209W;S
24R-N76D-S87R-Y209W-T213A-M222Q-H249R;N1
8K-S87R-Y209W-T213A-M222Q-H249R;N18R-S24
R-S87R-Y209W;N18R-S78N-G118R-Y209W-T213A
-M222Q-H249R-A270P;N18R-S166N-Y209W-T213
A-M222Q;N76D-S78N-S87R-S103P-G118R-S128L
-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-Q206L-N243S;N76D-S78N-
S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249R
;N18R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S
130A-Q206L;N18R-N76D-S78N-S87R-G118R-S12
8L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;N18R-S24R-N76
D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206
L-H249N;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-S99N-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-A158T-Q206L-I246V-
H249R;S24R-N76D-S78N-S128L-P129Q-S130A-Q
206L-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S128L-P12
9Q-S130A-Q206L-H249R;N76D-S78N-G118R-Q20
6L-H249R;N18R-I44V-N76D-S78N-S87R-S128L-
P129Q-S130A-Q206L-H249R;N18R-N76D-S78N-S
87R-Q206L-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R
-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-G118R
-Q206L;A16T-N18R-S24R-N76D-S78N-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-Q206L;N18R-S24R-N76D-S78
N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-K23
5T;S24R-N76D-S78N-Q206L-H249R;S24R-N76D-
S78N-S87R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N18R-N
76D-S78N-S87R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N1
8R-S24R-N76D-S78N-S128L-P129Q-S130A;S24R
-N76D-S78N-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S87
R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-A270T;N1
8R-S24R-N76D-S78N-G118R-S128L-P129Q-S130
A-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-M222Q-H249R;
N76D-S78N-S87R-Q206L-H249R;N18R-N76D-S78
N-Q206L-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-G118R-
Q206L-K251R;N76D-S78N-Q206L-H249R;N18R-S
24R-N76D-S78N-S87R-Q206L;N18R-S24R-N76D-
S78N-G118R-S128L-P129Q-S130A;N76D-S78N-H
120R-Q206L-H249R;N18R-N76D-S78N-S87R-S12
8L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;N18R-G20E-N76
D-S78N-G118R-H249R;S24R-N76D-S78N-G118R-
S128L-P129Q-S130A;N76D-S78N-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206L-H249R;S24R-N76D-S78N-G
118R-Q206L;N18R-N76D-S78N-S128L-P129Q-S1
30A-Q206L-V268A;N18R-N76D-S78N-S87R-Q206
L-N218S-M222Q-H249R;N18R-S24R-N76D-S87R-
G118R-S128L-P129Q-S130A-H249R;N76D-S78N-
S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A;N18R-S24R-N
76D-S78N-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-
G118R-S128L-P129Q-S130A-H249R;N18R-S24R-
N76D-S78N-S87R-H249R;N76D-S87R-G118R-S12
8L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118
R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N18R-S24R-N76D
-S78N-Q206L-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;N
76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-M2
22Q;S24R-N76D-S87R-Q206Y-T213A-M222Q-H24
9R;S24R-N76D-S78N-S87D-G118R-Y209W-M222Q
-H249R;S87D-Q206L-Y209W-T213A-H249R;S24R
-N76D-S78N-S87R-G118R-Q206L-M222Q;S24R-N
76D-S78N-Q206L-M222Q;N76D-S78N-S87R-G118
R-S128L-P129Q-Q206L-M222Q;N76D-S78N-S87R
-G118R-P129Q-Q206L-M222Q;N76D-S78N-S87R-
G118R-S130A-Q206L-M222Q;N76D-S78N-S87R-G
118R-S128L-P129Q-Q206L;N76D-S78N-S87R-G1
18R-S128L-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G11
8R-S128L-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-P129
Q-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S130A-Q206L
;N76D-S78N-S87R-G118R-Q206L-M222Q;N76D-S
78N-S87R-G118R-Q206L;S24R-N76D-S78N-S87R
-G118R-Y209W-M222Q;S24R-N43R-N76D-S78N-S
87R-G118R-Y209W-M222Q;G20R-S24R-N43R-N76
D-S78N-S87R-G118R-Y209W-M222Q;G20R-N43R-
N76D-S78N-S87R-G118R-Y209W-M222Q;S24R-N7
6D-S78N-S87R-G118R-Q206L-Y209W-T213A-M22
2Q;S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-Q206L-T213A
-M222Q;S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-Y209W-T
213A-M222Q;S24R-N76D-S78N-S87R-N116L-G11
8R-Y209W-M222Q;G20R-S24R-N43R-N76D-S78N-
S87R-N116L-G118R-Y209W-M222Q;N18R-N76D-S
87R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-Y209W-H249R;
N18R-S87D-S166N-Q206L-Y209W;N18R-S24R-N7
6D-S78N-S87R-G118R-G127T-Y209W-T213A;N18
R-S24R-S166D-Q206Y-H249R;S24R-S78N-S87R-
S166D-Q206L-Y209W-H249R;S3V-N76D-S78N-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S7
8N-S87R-S101V-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q2
06L;N76D-S78N-S87R-G118R-G127T-S128L-P12
9Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-S101G-S103
A-V104I-G118R-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R
-G127T-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-G127T-
P129Q-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-G127T-P
129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-S101G-S1
03A-V104I-G118R-G127T-P129R-Q206L;N76D-S
78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-S
212D;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S1
30A-S166D-Q206L;S3V-N76D-S78N-S87R-S101G
-S103A-V104I-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206L-T213A;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L
-P129Q-S130A-Q206L-A232V-Q245R;N76D-S78N
-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-G159D-S188
D-Q206L-A232V-Q245R;S3V-S24R-N76D-S78N-S
87D-G118R-Y209W-M222Q-H249R;S24R-N76D-S7
8N-S87D-S101V-G118R-Y209W-M222Q-H249R;S2
4R-N76D-S78N-S87D-S101G-S103A-V104I-G118
R-Y209W-M222Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-
G118R-Y209W-M222Q-H249R-S212D;S3V-S24R-N
76D-S78N-S87D-S101G-S103A-V104I-G118R-Y2
09W-M222Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-S101
G-S103A-V104I-G118R-G127T-Y209W-T213A-M2
22Q-H249R;S024R-N074D-S76N-S085D-S099G-S
101A-V102I-G116R-Y203W-M216Q-A226V-Q239R
-H243R;S24R-N76D-S78N-S87D-S101G-S103A-V
104I-G118R-Y209W-H249R;S3V-S24R-N76D-S78
N-S87D-S101G-S103A-V104I-G118R-Y209W-H24
9R;S24R-N76D-S78N-S87D-S101G-S103A-V104I
-G118R-G127T-Y209W-T213A-H249R;S24R-N76D
-S78N-S87D-S101T-G118R-Y209W-M222Q-H249R
;S24R-N76D-S78N-S87D-S101H-G118R-Y209W-M
222Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-G118R-P12
9Q-Y209W-M222Q-H249R;N76D-S78N-S87D-G118
R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;S24R-N76D-S78N
-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249
R;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P
129Q-S130A-Q206L;S24R-N76D-S78N-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;S24R-N76D-S78
N-S87D-G118R-Y209W-H249R;S24R-N76D-S78N-
S87R-G118R-Y209W-M222Q-H249R;N76D-S78N-S
87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Y209W;N76D-S
78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-Y
209W;N76D-S87R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-Y
209W-H249R;N76D-S87R-S128L-P129Q-S130A-Q
206L-Y209W;S24R-N76D-S78N-S87D-G118R-Y20
9W-M222S-H249R;N76D-S78N-S87D-G118R-Y209
W-H249R;N76D-S78N-S87D-G118R-Y209W-M222S
-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-G118R-M222Q-H
249R;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S1
30A-Q206L-M222S;S3T-N76D-S78N-S87R-G118R
-S128L-P129Q-S130A-Q206L;V28T-N76D-S78N-
S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-
S78N-S87R-A108S-G118R-S128L-P129Q-S130A-
Q206L;N76D-S78N-S87R-N116M-G118R-S128L-P
129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-L1
24M-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-V150T-Q206L;N
76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-A1
94D-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P12
9Q-S130A-A158E-Q206L;V28T-N76D-S78N-S87R
-S101F-G118R-S128L-P129Q-S130A-A194D-Q20
6L;S24R-V28T-N43S-N76D-S78N-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-A158E-Q206L;S24R-V28T-N
76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-A1
94D-Q206L;S24R-N76D-S78N-S87D-G118R-S128
L-P129Q-S130A-Q206L-T213A;S24R-V28T-N76D
-S78N-S87D-S101V-A108S-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206L;S24R-V28T-N76D-S78N-S87D-S1
01V-N116M-G118R-S128L-P129Q-S130A-A158E-
Q206L;S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-Q206L-T213A;N76D-S78N-S87R-S10
3D-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;S24R-V2
8T-N76D-S78N-S87R-S101V-A108S-G118R-S128
L-P129Q-S130A-Q206L-T213A-L217K;S24R-N76
D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206
L-L217K;S3V-S24R-N76D-S78N-S87R-G100S-S1
01V-G118R-Q206L-L217K;N76D-N77D-S78N-S87
R-G118R-Q206L-T213A;S24R-N76D-S78N-S87D-
G100S-S101V-N116M-G118R-L124M-S128L-P129
Q-S130A-A194D-Q206L;S24R-V28T-N76D-S78N-
S87R-G118V-S128L-P129Q-S130A-Q206L-T213A
-L217K;S3V-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P1
29Q-S130A;S3V-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L
-P129Q-S130A-Y209W;N76D-S78G-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78G-S87R-G
118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;S3V-N76D-S7
8G-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;S3
V-N76D-S78G-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A
-Q206M;S3V-N76D-S78G-S87R-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-Q206Y;N76D-S78N-S87R-G118R-S12
8L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78N-S87R-G118
R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78N-S87R
-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;S3V-N76D-
S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;
S3V-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S13
0A-Q206M;S3V-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206Y;P40E-N76D-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A;I8V-P40E-N76D-S87R-G118
R-S128L-P129Q-S130A;P40E-N76D-S87R-G118R
-S128L-P129Q-S130A-P210I;P40E-N76D-S87R-
G118R-S128L-P129Q-S130A-G211P;P40E-N76D-
S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-N261I;N76D-
S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-P210I;
N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Y
209W-L262Q;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-P210I-L262Q;N76D-S78N-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-V147I-A194P-A215V-E
271D;T22W-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P12
9Q-S130A-V147I-A194P-A215V;T22W-N76D-S78
N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-V147I-A21
5V-E271D;N76D-S87R-G118R-S128L-P129Q-S13
0A-L217K;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129
Q-S130A-L217K;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L
-P129Q-S130A-V150T;N76D-S78G-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-P210L;N76D-S87R-E89H-G
118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;S3V-N76D-S8
7R-E89H-G118R-S128L-P129Q-S130A-P210L;N7
6D-S78Q-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6D;N76D-S78T-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206D;N76D-S78V-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206D;N76D-S78W-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78Y-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78A-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78C-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S7
8E-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N7
6D-S78F-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6F;N76D-S78H-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206F;N76D-S78K-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206F;N76D-S78L-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78M-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78Q-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78T-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S7
8W-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N7
6D-S78Y-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6F;N76D-S78C-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206G;N76D-S78M-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206G;N76D-S78C-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206H;N76D-S78E-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206H;N76D-S78F-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206H;N76D-S78G-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206H;N76D-S7
8H-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206H;N7
6D-S78L-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6H;N76D-S78T-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206H;N76D-S78V-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206H;N76D-S78A-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78C-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78E-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78F-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S7
8G-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N7
6D-S78I-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6M;N76D-S78K-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206M;N76D-S78L-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206M;N76D-S78M-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78Q-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78R-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78T-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S7
8V-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N7
6D-S78Y-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6M;N76D-S78A-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206N;N76D-S78C-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206N;N76D-S78E-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206N;N76D-S78G-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206N;N76D-S78H-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206N;N76D-S78I-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206N;N76D-S7
8L-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206N;N7
6D-S78M-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6N;N76D-S78Q-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206N;N76D-S78R-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206P;N76D-S78W-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206P;N76D-S78A-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78C-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78E-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S7
8F-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N7
6D-S78G-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6R;N76D-S78H-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206R;N76D-S78I-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206R;N76D-S78L-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78M-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78P-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78Q-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S7
8R-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N7
6D-S78T-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6R;N76D-S78V-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206R;N76D-S78C-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206S;N76D-S78E-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206S;N76D-S78H-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206S;N76D-S78M-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206S;N76D-S78W-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206S;N76D-S7
8C-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;N7
6D-S78E-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6Y;N76D-S78H-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206Y;N76D-S78I-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206Y;N76D-S78K-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S78L-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S78M-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S78Q-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S7
8R-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;N7
6D-S78T-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6Y;N76D-S78W-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206Y;N76D-S78Y-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206Y;N76D-S78H-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206A;N76D-S78H-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78I-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78L-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S7
8P-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;N7
6D-S78C-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6A;N76D-S78Q-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206A;N76D-S78A-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206D;N76D-S78C-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78E-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78G-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78M-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S7
8M-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206H;N7
6D-S78A-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6H;N76D-S78H-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206M;S3V-S24R-N76D-S78N-S87D-G118R-Y2
09W-H249R;S3V-N76D-S78N-S87D-G118R-Y209W
-H249R;S3I-N43Y-L82D-G127S-S216Y-L217K-S
256P;G127S-S216Y;S3V-I8V-P40E-N76D-S87D-
G118R-S128R-A215K-N261I;S3V-I8V-P40E-N76
D-G118R-S128R-P210I-N261I;S3V-P40E-N76D-
S87D-G118R-S128R-P210I-L217K;S3V-N76D-G1
18R-S128R;S3V-N76D-S87D-G118R-S128R;S3V-
N76D-G118R-S128R-P210I;S3V-N76D-G118R-S1
28R-N261I;S3V-P40E-N76D-G118R;S3V-P40E-N
76D-G118R-S128R;S3V-I8V-P40E-N76D-G118R-
S128R;S3V-P40E-N76D-S87D-G118R-S128R;S3V
-P40E-N76D-G118R-S128R-S160Q;S3V-P40E-N7
6D-G118R-S128R-P210I;S3V-P40E-N76D-G118R
-S128R-G211P;S3V-P40E-N76D-G118R-S128R-A
215K;S3V-P40E-N76D-G118R-S128R-L217K;S3V
-P40E-N76D-G118R-S128R-N261I;S3V-P40E-N7
6D-G118R-S128R-L262Q;S3V-I8V-P40E-N76D-G
118R;S3V-P40E-N76D-S87D-G118R;S3V-P40E-N
76D-G118R-S160Q;S3V-P40E-N76D-G118R-Q206
Y;S3V-P40E-N76D-G118R-P210I;S3V-P40E-N76
D-G118R-G211P;S3V-P40E-N76D-G118R-A215;S
3V-P40E-N76D-G118R-L217K;S3V-P40E-N76D-G
118R-N261I;S3V-P40E-N76D-G118R-L262Q;S3V
-N76D-G118R-S128R-G211P;S3V-N76D-G118R-S
128R-L262Q;T22W-N76D-S78N-S87R-G118R-S12
8R-P129Q-S130A-V147I-A194P-A215V-E271D;N
76D-S78N-S87R-G118R-S128R-P129Q-S130A;N7
6D-S78N-S87R-G118R-S128R-P129Q-S130A-V14
7I-A194P-A215V;N76D-S78N-S87R-G118R-S128
R-P129Q-S130A-V147I-A194P-E271D;T22W-N76
D-S78N-S87R-G118R-S128R-P129Q-S130A-A215
V-E271D;T22W-N76D-S78N-S87R-G118R-S128R-
P129Q-S130A-A194P-E271D;P40E-N76D-S78G-G
118R-S128R-Q206Y-L262Q;S3V-P40E-N76D-G11
8R-G211P-L217K-N261I;I8V-P40E-N76D-S78G-
G118R-Q206Y-L217K;S3V-I8V-N76D-S78G-S87D
-G118R-P210I-A215K-N252I;S3V-P40E-N76D-G
118R-S160Q-P210I-L217K-N261I;I8V-N76D-S7
8G-G118R-S160Q-Q206Y-N252I-N261I;I8V-P40
E-N76D-G118R-P210I-A215K-N261I;I8V-P40E-
N76D-S78G-G118R-Q206Y-P210I-A215K-N261I;
S3V-N76D-G118R-S160Q-G211P-A215V-L262Q;S
3V-N76D-S87D-G118R-S128R-P210I-G211P-N26
1I-L262Q;S3V-P40E-N76D-G118R-Q206Y-P210I
-G211P-A215K-N261I;I8V-P40E-N76D-S78G-G1
18R-G211P-L217K-N252I-N261I;S3V-P40E-N76
D-S87D-G118R-S128R-P210I-L217K-N261I;S3V
-P40E-N76D-G118R-S160Q-P210I-W241K-L262Q
;I8V-N76D-S78G-G118R-P210I-A215V-N261I;N
76D-S78G-S87D-G118R-P210I-A215V-L217K-N2
61I-L262Q;S3V-P40E-N76D-S78G-G118R-Q206Y
-L217K;S3V-P40E-N76D-S78G-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-L217K;S3V-P40E-N76D-S78G-G118R
-S128L-P129Q-S130A-Q206Y-P210I-A215V-L21
7K;N76D-S78N-S87D-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206Y;S3V-P40E-N76D-S78G-G118R-S128L-P
129Q-S130A-A215K-N261I;S3V-N76D-S87D-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-P210I-L217K;N76D-S8
7R-G118R-S128K-V150T-L217K;N76D-S78N-S87
R-G118R-S128K-V150T-L217K;N76D-S78N-S87R
-G118R-S128K-V150T;S3V-N76D-S78G-S87D-G1
18A-S166N-A194P-Q206M-P210I-N218S-N248D-
N261I-L262Q;S3V-N76D-S78G-S87T-S101Q-G11
8A-S130Q-S166N-A194P-P210I-N218S-N248D-S
256P-N261I;S3V-N76D-S78G-S87D-S101Q-G118
A-Q206M-P210I-L217K-N218S-M222Q-N248D-S2
56P;およびS24L-N76D-S78N-S87D-A88S-G118R-Q2
06Y-Y209W-H249Rから選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む、単離
されたスブチリシン変異体に関する;ここで、前記変異体はタンパク質分解活性を有し、
前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示される、バチルス・アミロリクエファ
シエンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシンBP
N’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミ
ノ酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたものである。
【0012】
さらに他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、配列番
号1、配列番号2または配列番号14のアミノ酸配列に対して、70%、75%、80%
、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%
、99%、または100%未満のアミノ酸配列同一性を有する。他の実施形態では、本明
細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、親プロテアーゼまたはベンチマークプロ
テアーゼと比較して1つ以上の改善された特性を有し、この改善された特性は、改善され
たプロテアーゼ活性、洗剤における改善された洗浄性能、および洗剤における改善された
熱安定性から選択される。
【0013】
他の実施形態は、組成物が自動食器洗浄用組成物ではないことを条件として、本明細書
に記載の1種以上のスブチリシン変異体を含む組成物に関する。さらに他の実施形態では
、洗剤組成物は自動食器洗浄用洗剤組成物、洗濯用組成物、および/または手洗い(手作
業)による食器洗浄用組成物である。さらなる実施形態は、洗浄を必要とする製品または
表面を洗浄する方法であって、製品または表面を、本明細書に記載の1種以上のスブチリ
シン変異体または1種以上の組成物と接触させることを含む方法に関する。さらに他の実
施形態は、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチ
ド配列を含む単離された核酸配列;前記単離された核酸配列を含む発現ベクター;および
/または前記発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【
図1】
図1は、B・レントゥス(B.lentus)スブチリシンGG36の成熟アミノ酸配列(配列番号1)とB・アミロリクエファシエンス(B.amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’の成熟アミノ酸配列(配列番号2)とのアラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本明細書で他に指示がない限り、本明細書に記載のスブチリシン変異体は、分子生物学
、微生物学、タンパク質精製、タンパク質工学、タンパク質およびDNA配列決定、組換
えDNA分野、ならびに工業用酵素の使用および開発で一般に使用される従来技術により
作製し、使用することができる。本明細書で提供されるいかなる見出しも、読者の利益の
ために提供されるものであり、明細書全体を読んで明らかになる様々な実施形態を限定す
るものではない。本明細書で提供されるいかなる定義も、全体として本明細書の文脈で解
釈されるべきである。本明細書で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「t
he」は、文脈上特に明記されない限り、複数形を含む。他に特に指示がない限り、核酸
は5’から3’への方向に左から右へと記載され、アミノ酸配列はアミノからカルボキシ
の方向へ左から右へとそれぞれ記載される。本明細書で使用される数値範囲は全て、それ
より狭い数値範囲が全て本明細書に明示されているかのように、そのようなより広い数値
範囲に入る全てのより狭い数値範囲を含む。
【0016】
本明細書に記載の各プロテアーゼ変異体の各アミノ酸位置は、GG36配列(配列番号
2)とBPN’配列との
図1のアラインメントによって決定された、B.アミロリクエフ
ァシエンス(B.amyloliquefaciens)スブチリシンプロテアーゼBP
N’(配列番号1)のアミノ酸配列における対応するアミノ酸位置の番号付けにしたがっ
て番号付けされている。例えば、親プロテアーゼがGG36である各スブチリシン変異体
における各アミノ酸置換の開始アミノ酸は、GG36親配列に明示されるものであり、B
PN’配列に明示されるものではない。すなわち、記載された1種以上のスブチリシン変
異体に含まれる、各置換の位置(出発アミノ酸ではない)を同定するためにBPN’配列
が参照される。したがって、本明細書に記載のスブチリシン変異体のアミノ酸配列などの
所与のアミノ酸配列は、例えば、後述するBLAST、MUSCLE、またはCLUST
ALなどのアライメントアルゴリズムを使用してBPN’配列とアラインさせることがで
き、BPN’配列中のアミノ酸残基とアラインする(好ましくは最適にアラインする)所
与のアミノ酸配列中のアミノ酸残基は、スブチリシンBPN’配列中の対応するアミノ酸
残基を参照することによって都合よく番号付けすることができる。
【0017】
本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体のアミノ酸置換は、以下の命名法の1
つ以上を用いて記載される:位置または出発アミノ酸:位置:置換アミノ酸。位置のみの
言及は、親またはベンチマーク分子中にその位置で存在し得る任意の出発アミノ酸、およ
びこのような出発アミノ酸が置換され得る任意のアミノ酸を包含する(すなわち、置換ア
ミノ酸は、そのような親またはベンチマーク分子の出発アミノ酸を必ず除外する)。置換
アミノ酸への言及は、スラッシュ(「/」)によって区切られたいくつかの置換アミノ酸
としてさらに表すことができる。例えば、X130A/N-209-213は3つのアミ
ノ酸置換の組み合わせを表し、Xはアラニン(A)またはアスパラギン(N)で置換する
ことができる130位の任意の出発アミノ酸であり、209は任意の出発アミノ酸を出発
アミノ酸ではないアミノ酸で置換することができる位置を表し、213は任意の出発アミ
ノ酸を出発アミノ酸ではないアミノ酸で置換することができる位置を表す。さらなる例と
して、S101F/G/H/T/Vは101位における5つの可能な置換を表し、出発ア
ミノ酸セリン(S)は、フェニルアラニン(F)、グリシン(G)、ヒスチジン(H)、
トレオニン(T)、またはバリン(V)で置換することができる。
【0018】
「スブチリシン」および「スブチリシンプロテアーゼ」はMEROPS-The Pe
ptidase Data base(Rawlings et al.,MEROPS
:the peptidase database,Nucl.Acids Res.3
4 Database issue,D270-272(2006))に記載されるS8
セリンプロテアーゼファミリーの任意のメンバーを指す。そこに記載されているように、
ペプチダーゼファミリーS8は、セリンエンドペプチダーゼスブチリシンおよびその同族
体を含む(Biochem.J.,290:205-218(1993))。多くのバチ
ルス属(Bacillus)の菌種は大量のスブチリシンを分泌する。
【0019】
「プロテアーゼ変異体」、「変異体プロテアーゼ」および「スブチリシン変異体」は、
アミノ酸配列が、参照プロテアーゼ(親またはベンチマークプロテアーゼであり得る)の
アミノ酸配列と、例えば1つ以上のアミノ酸の置換、欠失、および/または付加などによ
る、1種以上のアミノ酸だけ異なるプロテアーゼを指す。このような変異体のタンパク質
分解活性は、当該技術分野でよく知られた手順および/または本明細書に記載の手順を使
用して決定し得る。
【0020】
「バチルス(Bacillus)」属には、B・スブチリス(B.subtilis)
、B・リケニフォルミス(B.licheniformis)、B・レントゥス(B.l
entus)、B・ブレビス(B.brevis)、B・ステアロサーモフィルス(B.
stearothermophilus)、B・アルカロフィルス(B.alkalop
hilus)、B・アミロリクエファシエンス(B.amyloliquefacien
s)、B・クラウシイ(B.clausii)、B・ハロデュランス(B.halodu
rans)、B・メガテリウム(B.megaterium)、B・コアグランス(B.
coagulans)、B・サーキュランス(B.circulans)、B・ロータス
(B.lautus)およびB.チューリンゲンシス(B.thuringiensis
)など(これらに限定されない)の、当業者に知られたバチルス(Bacillus)属
に属する全ての菌種が含まれる。バチルス(Bacillus)属が分類学的に再編成さ
れ続けていることは認識されている。したがって、この属は、再分類された種、例えば、
限定はしないが、現在、「ゲオバチルス・ステアロテルモフィルス(Geobacill
us stearothermophilus)」と称されている「B.ステアロテルモ
フィルス(B.stearothermophilus)」などの生物を含むものとする
。酸素の存在下での抵抗性内生胞子の生成は、バチルス(Bacillus)属の重要な
特徴であると考えられるが、この特徴はまた、最近名付けられたアリシクロバチルス属(
Alicyclobacillus)属、アンフィバチルス(Amphibacillu
s)属、アネウリニバチルス(Aneurinibacillus)属、アノキシバチル
ス(Anoxybacillus)属、ブレビバチルス(Brevibacillus)
属、フィロバチルス(Filobacillus)属、グラシリバチルス(Gracil
ibacillus)属、ハロバチルス(Halobacillus)属、パエニバチル
ス(Paenibacillus)属、サリバチルス(Salibacillus)属、
テルモバチルス(Thermobacillus)属、ウレイバチルス(Ureibac
illus)属およびビルジバチルス(Virgibacillus)属にも当てはまる
。
【0021】
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、鎖状に共有結
合された任意の長さのヌクレオチド単量体のポリマーを指す。DNA(デオキシリボ核酸
)、デオキシリボヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、およびRNA(リボ核酸)、リ
ボヌクレオチドのポリマーは、独特の生物学的機能を有するポリヌクレオチドまたは核酸
の例である。ポリヌクレオチドまたは核酸には、一本鎖、二本鎖もしくは三本鎖DNA、
ゲノムDNA、cDNA、RNA、DNA-RNAハイブリッド、またはプリンおよびピ
リミジン塩基を含むポリマーが含まれるが、これらに限定されない。以下は、ポリヌクレ
オチドの非限定的な例である:遺伝子、遺伝子断片、染色体断片、発現配列タグ(EST
)、エキソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、転移RNA(tRNA
)、リボソームRNA(rRNA)、リボザイム、相補的DNA(cDNA)、組換えポ
リヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DN
A、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ、およびプライマー。いくつかの実施形態で
は、ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの修飾
ヌクレオチド、ウラシル、フルオロリボースおよびチオエートなどの他の糖および連結基
、ならびにヌクレオチド分岐を含む。特定の実施形態では、ヌクレオチドの配列は、非ヌ
クレオチド成分によって中断される。
【0022】
「ベクター」は、核酸またはポリヌクレオチドを標的細胞または組織に導入または移入
するために使用される核酸構築物またはポリヌクレオチド構築物を指す。通常、ベクター
は外来DNAを別の細胞または組織に導入するために使用される。ベクターは一般に、導
入遺伝子であるDNA配列、およびベクターの「骨格」として働くより大きなポリヌクレ
オチド配列を含む。ベクターは、通常、挿入された導入遺伝子などの遺伝情報を標的細胞
または組織に移して、その標的細胞または組織において挿入導入遺伝子を単離、増殖、ま
たは発現するよう働く。ベクターとしては、プラスミド、クローニングベクター、バクテ
リオファージ、ウイルス(例えば、ウイルスベクター)、コスミド、発現ベクター、シャ
トルベクター、およびカセットが挙げられるが、これらに限定されない。通常、ベクター
は、複製起点、マルチクローニングサイト、および選択マーカーを含む。標的細胞へのベ
クターの導入プロセスは、一般に、トランスフェクションと称される。ウイルスベクター
による細胞のトランスフェクションは、通常、形質導入と呼ばれる。一実施形態では、本
明細書に記載の1種以上のベクターは、好適な宿主内でDNA配列の発現をもたらすこと
ができる好適なプロ配列(例えば、分泌、シグナルペプチド配列など)に作動可能に連結
した、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体(例えば、前駆体または成熟スブ
チリシン変異体)をコードするDNA配列を含む。
【0023】
「発現カセット」または「発現ベクター」は、標的細胞における目的の核酸(例えば、
外来の核酸または導入遺伝子)の発現のために、組換えにより、または合成により生成し
た核酸構築物またはベクターを指す。目的の核酸は、通常、目的のタンパク質を発現する
。発現ベクターまたは発現カセットは、通常、外来核酸の発現を駆動または促進するプロ
モーターヌクレオチド配列を含む。発現ベクターまたは発現カセットはまた、通常、標的
細胞中で特定の核酸の転写を許容する他の特定の核酸エレメントを含む。組み換え発現カ
セットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアDNA、プラスチドDNA、ウイルスま
たは核酸断片に組み込むことができる。いくつかの発現ベクターは、宿主細胞または宿主
細胞のゲノム中に異種DNA断片を組み込み、発現させる能力を有する。多くの原核細胞
発現ベクターおよび真核細胞発現ベクターが商業的に入手可能である。発現ベクターに組
み込まれた核酸配列からタンパク質を発現するのに適切な発現ベクターを選択することは
、当業者の知識の範囲内である。
【0024】
DNA構築物は、標的細胞または組織に導入され得る核酸の人工的に構築されたセグメ
ントである。DNA構築物は、通常、ベクターにサブクローニングされた目的タンパク質
をコードするヌクレオチド配列を含むDNAインサートを含む。ベクターは、細菌の増殖
のための細菌耐性遺伝子、および生物内で目的タンパク質を発現するためのプロモーター
を含み得る。DNAは、PCRによって、または当業者に知られた他の好適な技術によっ
てin vitroで生成することができる。いくつかの実施形態では、DNA構築物は
、目的の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、この配列は、例えば制御要素(例え
ば、プロモーターなど)の追加の要素に作動可能に連結している。DNA構築物は、選択
マーカーをさらに含んでもよく、ホモロジーボックスに隣接して入ってくる配列をさらに
含んでもよい。構築物は、末端に付加された他の非相同配列(例えば、スタッファー配列
またはフランク)を含み得る。いくつかの実施形態では、配列の末端は閉じられ、DNA
構築物は閉じた環を形成する。当該技術分野でよく知られた手法を用いてDNA構築物に
組み込まれる目的の核酸配列は、野生型、変異型、または改変された核酸であり得る。い
くつかの実施形態では、DNA構築物は、宿主細胞染色体に相同な1種以上の核酸配列を
含む。他の実施形態では、DNA構築物は、1種以上の非相同ヌクレオチド配列を含む。
一旦、DNA構築物がインビトロで組み立てられると、それは、例えば、1)異種配列を
宿主細胞の所望の標的配列に挿入する;2)宿主細胞染色体のある領域を変異させる(す
なわち、内因性配列を異種配列で置換する);3)標的遺伝子を欠失させる;かつ/また
は4)複製プラスミドを宿主に導入する、ために使用し得る。「DNA構築物」は、本明
細書では、発現カセットと互換的に使用される。
【0025】
「プラスミド」は、染色体DNAから独立に複製することができる染色体外DNA分子
を指す。プラスミドは二本鎖(ds)であり、環状であり得、通常、クローニングベクタ
ーとして使用される。
【0026】
「導入される」という用語は、核酸配列の細胞への導入に関連して使用する場合、核酸
配列を細胞へ移動させるのに好適な方法を指す。導入のためのこのような方法には、プロ
トプラスト融合、トランスフェクション、形質転換、エレクトロポレーション、接合、お
よび形質導入が含まれるが、これらに限定されない(例えば、Ferrari et a
l.,「Genetics,」in Hardwood et al.(eds.),B
acillus, Plenum Publishing Corp.,pp.57-7
2(1989))。
【0027】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係で配置されたときに、別の核酸配列と「作動可能
に連結される」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、プロモーターがコード配
列の転写に作用する場合、ヌクレオチドコード配列に作動可能に連結している。リボソー
ム結合部位が、コード配列の転写を促進するような位置にある場合、それはコード配列に
作動可能に連結し得る。通常、「作動可能に連結している」DNA配列は、隣接している
。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、適当な制限部位での
ライゲーションによって行われる。そのような部位が存在しない場合、従来の方法にした
がって、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用することができる。
【0028】
「遺伝子」はポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(例えば、DNAセグメント
)を指し、コード領域の前後の領域および個々のコードセグメント(エキソン)間の介在
配列(イントロン)を含む。
【0029】
細胞に関連して使用される場合、「組換え」は、通常、細胞が異種核酸配列の導入によ
って改変されたこと、または細胞がそのように改変された細胞に由来することを意味する
。例えば、組換え細胞は、天然(非組換え)形態の細胞の中に同じ形態でない遺伝子を含
むか、または組換え細胞は、改変され、細胞に再導入された天然遺伝子(天然形態の細胞
に存在する)を含み得る。組換え細胞は、細胞から核酸を除去することなく改変された細
胞に内因する核酸を含み得る。そのような改変には、遺伝子置換、部位特異的変異、およ
び当業者に知られた関連手法によって得られるものが含まれる。組換えDNA技術は、イ
ンビトロで組換えDNAを産生させ、そしてこの組換えDNAを発現または増殖させるこ
とができる細胞にこの組換えDNAを導入し、それによって組換えポリペプチドを産生す
る手法を含む。ポリヌクレオチドまたは核酸について「組換え」、「組換える」または「
組換えられた」ということは、一般に、新たなポリヌクレオチドまたは核酸を作製するた
めに、2つ以上の核酸またはポリヌクレオチド鎖もしくは断片を組み立てる、または組み
合わせることを指す。組換えポリヌクレオチドまたは核酸は、キメラと呼ばれることがあ
る。核酸またはポリペプチドは、人工のものまたは操作されたものである場合、あるいは
人工の、または操作されたタンパク質または核酸に由来する場合、「組換え体」である。
【0030】
核酸または遺伝子の「増幅」は、増幅された核酸または遺伝子がゲノム中に最初に存在
したときよりも高いコピー数で存在するように、特定のDNA配列が偏って複製されるプ
ロセスを指す。いくつかの実施形態では、薬物(例えば、阻害可能な酵素の阻害剤)の存
在下での増殖による細胞の選択は、薬物の存在下での増殖に必要な遺伝子産物をコードす
る内因性遺伝子の増幅、または、この核酸もしくは遺伝子産物をコードする外因性(すな
わち、導入)配列の増幅、またはその両方をもたらす。増幅は、鋳型特異性を伴う核酸複
製の特殊なケースである。これは、非特異的な鋳型複製(すなわち、鋳型依存性であるが
特定の鋳型に依存しない複製)と対比されるべきである。ここで、鋳型特異性は複製の忠
実度(すなわち、適切なポリヌクレオチド配列の合成)およびヌクレオチド(リボまたは
デオキシリボ)特異性とは区別される。鋳型特異性は、「標的」特異性に関してしばしば
記述される。標的配列は、それらが他の核酸から選別されることを求められるという意味
で「標的」である。増幅技術は、主にこの選別のために設計されてきた。
【0031】
「プライマー」は、精製制限消化などにおいて自然に生成されるか、合成的に生成され
るかにかかわらず、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下に
置かれた場合(すなわち、ヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼなどの誘発剤の存在下
、適切な温度およびpHで)、合成開始点として作用し得るオリゴヌクレオチド(ヌクレ
オチド残基のポリマー)を指す。増幅効率を最大にするためには、プライマーは一本鎖で
あることが好ましいが、あるいは二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは、
伸長生成物の生成に使用する前にまず、その鎖を分離する処理を行う。一態様では、プラ
イマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘発剤の存在下、伸長
生成物の合成を開始するには十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、
温度、プライマーの供給源、および使用する方法を含む種々の因子に依存する。
【0032】
「プローブ」は精製された制限消化物のように天然に存在するか、または合成的に、組
換え的に、またはPCR増幅によって産生されるかにかかわらず、オリゴヌクレオチドを
指し、これは、通常、目的とする別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることがで
きる。プローブは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。プローブは、特定の遺伝子配
列の検出、同定および単離に有用である。
【0033】
「標的」は、ポリメラーゼ連鎖反応に関して用いる場合、ポリメラーゼ連鎖反応に用い
るプライマーによって結合される核酸領域を指す。したがって、「標的」は、他の核酸配
列から選別されることが求められる。ヌクレオチド「セグメント」は、標的核酸配列内の
核酸の領域である。
【0034】
「ポリメラーゼ連鎖反応」(PCR)は、米国特許第4,683,195号明細書;同
第4,683,202号明細書;および同第4,965,188号明細書の方法を指し、
これらはクローニングまたは精製を行わずに、ゲノムDNA混合物中の標的配列のセグメ
ント濃度を増加させる方法を含む。標的配列を増幅するこのプロセスは、当該技術分野で
よく知られている。
【0035】
「増幅試薬」とは、プライマー、核酸鋳型、および増幅酵素以外の増幅に必要な試薬(
例えば、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、緩衝液など)をいう。通常、増幅試薬は、
その他の反応成分とともに、反応容器(試験管、マイクロウェルなど)内に加えられ、収
容される。
【0036】
「制限エンドヌクレアーゼ」または「制限酵素」は、制限部位として知られるヌクレオ
チドの特定の配列またはその付近で、二本鎖または一本鎖DNAを切断することができる
酵素(例えば、細菌酵素)を指す。制限部位を含むヌクレオチド配列は、所与の制限エン
ドヌクレアーゼまたは制限酵素によって認識され、かつ切断され、それは、しばしばDN
A断片の挿入部位である。制限部位を操作して、発現ベクターまたはDNA構築物にする
ことができる。
【0037】
「相同組み換え」は、同一、またはほぼ同一のヌクレオチド配列部位において、2つの
DNA分子間で、または対の染色体間でDNA断片を交換することを意味する。いくつか
の実施形態では、染色体組み込みは、相同組換えである。
【0038】
核酸またはポリヌクレオチドは、その天然の状態で、または当業者に知られた方法によ
って操作されたときに、転写および/または翻訳されてポリペプチドまたはその断片を産
生できる場合に、ポリペプチドを「コードする」と言われる。そのような核酸のアンチセ
ンス鎖はまた、配列をコードすると言われる。当該技術分野で知られているように、DN
A配列はRNAポリメラーゼによって転写されてRNA配列を生成することができ、RN
A配列は逆転写酵素によって逆転写されてDNA配列を生成することができる。
【0039】
「宿主株」または「宿主細胞」は、目的のDNA配列を含む発現ベクターまたはカセッ
トのための適切な宿主を指す。目的のDNA配列は、宿主株または宿主細胞において目的
のタンパク質を発現し得る。
【0040】
「タンパク質」または「ポリペプチド」は、アミノ酸残基のポリマー配列を含む。用語
「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書では互換的に使用される。遺伝子コ
ードの縮重のために、1種以上のヌクレオチド配列が、本明細書に記載の1種以上のスブ
チリシン変異体をコードし得る。
【0041】
「プロ配列」または「プロペプチド配列」は、シグナルペプチド配列とプロテアーゼの
分泌に必要な成熟プロテアーゼ配列との間のアミノ酸配列を指す。プロ配列またはプロペ
プチド配列の開裂により、成熟活性プロテアーゼが生成される。
【0042】
「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は、タンパク質の成熟形もしくは前駆体
形の分泌または直接輸送に関与する可能性があるアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配
列は、通常、前駆体または成熟タンパク質配列のN末端に位置する。シグナル配列は、内
因性であっても外因性であってもよい。1つの例示的な外因性シグナル配列は、B・レン
トゥス(B.lentus)(ATCC 21536)由来のスブチリシンのシグナル配
列の残りに融合した、B・スブチリス(B.subtilis)スブチリシン由来のシグ
ナル配列の最初の7つのアミノ酸残基を含む。シグナル配列は、通常、成熟タンパク質に
は存在しない。シグナル配列は、通常、タンパク質が輸送された後にシグナルペプチダー
ゼによってそのタンパク質から切除される。
【0043】
タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの「成熟」型は、シグナルペプチド配列お
よびプロペプチド配列を含まない、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの機能型
を指す。
【0044】
タンパク質もしくはペプチドの「前駆体」型は、そのタンパク質のアミノもしくはカル
ボニル末端に作動可能に連結しているプロ配列を有するタンパク質の成熟型を指す。前駆
体はまた、プロ配列のアミノ末端に作動可能に連結している「シグナル」配列を有し得る
。前駆体はまた、翻訳後活性に関与する追加のポリヌクレオチドを有し得る(例えば、ポ
リヌクレオチドはそこから切断されて、タンパク質またはペプチドの成熟型を残す)。
【0045】
「野生型」は、天然の、すなわち天然に存在する配列であるアミノ酸配列または核酸配
列を指す。
【0046】
「相同遺伝子」は、異なるものの、通常、関連する種の1対の遺伝子を指し、それらは
、互いに対応し、かつ互いに同一であるか、または非常に類似している。この用語は、種
形成(すなわち、新しい種の発生)によって分離された遺伝子(例えば、オルソロガス遺
伝子)、および遺伝子の複製によって分離された遺伝子(例えば、パラロガス遺伝子)を
包含する。
【0047】
「相同性」は、配列の類似性または同一性を指し、好ましくは同一性である。相同性は
、アミノ酸配列アラインメントによって、例えば、BLAST、MUSCLEまたはCL
USTALなどのプログラムを使用して決定することができる。他の技術は、例えば、S
mith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(19
81);Needleman andWunsch,J.Mol.Biol.48:44
3(1970);およびPearson and Lipman,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 85:2444(1988)に記載されている。BLAST
は、Altschul,et al.,「Gapped BLAST and PSI
BLAST a new generation of protein databa
se search programs」,Nucleic Acids Res.,2
5(17):3389-402(1997);Altschul et al.,J.
Mol.Biol.215:403-410,(1990);およびKarlin et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787(
1993)に記載されている。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、Natio
nal Center for Biotechnology Information
が公開している。MUSCLEは、Robert C.Edgar,「MUSCLE:
multiple sequence alignment with high ac
curacy and high throughput」,Nucl.Acids R
es.,32(5):1792-1797(2004)に記載されている。MUSCLE
分析を行うためのソフトウェアは、Biomatters Ltdから入手可能である。
CLUSTAL WアラインメントアルゴリズムはThompson et al.,N
ucleic Acids Res,22:4673-4680(1994)に記載され
ている。CLUSTAL Wアルゴリズムのデフォルトパラメーターには、次のパラメー
ターが含まれる:ギャップオープニングペナルティ(Gap opening pena
lty)=10.0;ギャップエクステンションペナルティ(Gap extensio
n penalty)=0.05;タンパク質重量マトリックス(Protein we
ight matrix)=BLOSUMシリーズ;DNA重量マトリックス(DNA
weight matrix)=IUB;ディレイ発散数列(%)(Delay div
ergent sequences %)=40;ギャップ分離距離(Gap sepa
ration distance)=8;DNAトランジション重量(DNA tran
sitions weight)=0.50;親水性残基のリスト=GPSNDQEKR
;負のマトリックスの使用(Use negative matrix)=OFF;トグ
ル残基特異的ペナルティ(Toggle Residue specific pena
lties)=ON;トグル親水性ペナルティ(Toggle hydrophilic
penalties=ON;およびトグルエンドギャップ分離ペナルティ(Toggl
e end gap separation penalty)=OFF。CLUSTA
Lアルゴリズムでは、いずれか一方の末端で発生する欠失が含まれる。例えば、500個
のアミノ酸からなるポリペプチドの一方の末端(またはポリペプチド内)で5個のアミノ
酸が欠失した変異体は、「参照」ポリペプチドに対して、99%(495個/500個の
同一残基×100)の配列同一性率を有する。そのような変異体は、ポリペプチドに対し
て「少なくとも99%の配列同一性」を有する変異体に包含されるであろう。
【0048】
親またはベンチマーク配列との、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体配列
のアミノ酸配列同一性率は、当業者であれば容易に得ることができる。目的の配列によっ
て共有されるアミノ酸同一性率は、配列をアラインし、例えば、BLAST、MUSCL
E、またはCLUSTALなどのプログラムを使用して、配列情報を直接比較することに
よって決定することができる。例えば、クエリ配列に対する対象配列の配列同一性率は、
これらの2つの配列を最適にアラインし、この2つの最適にアラインした配列を、比較す
る長さに亘って比較することによって算出することができる。両方の配列に同一の残基が
存在する最適なアラインメントの位置の数を決定し、これにより一致した位置の数を得、
次いでこの一致した位置の数を、比較長さ(特段の記載がない限り、クエリ配列の長さで
ある)の位置の総数で除す。得られた数を100倍して、クエリ配列に対する対象配列の
アミノ酸配列同一性率を得る。
【0049】
「最適なアラインメント」または「最適にアラインした」は、最も高い同一性スコア率
を与える2つ(または3つ以上)の配列のアラインメントを指す。例えば、2つのタンパ
ク質配列の最適なアラインメントは、各配列における最大数の同一のアミノ酸残基が互い
にアラインされるように配列を手動でアラインすることによって、あるいは本明細書に記
載の、または当該技術分野で知られたソフトウェアプログラムまたは方法を用いることに
よって達成することができる。一実施態様では、2つのポリペプチド配列は、この配列の
対で可能な最も高い類似性スコアを達成するように、これらの配列が、定義されたパラメ
ーター、例えば、定義されたアミノ酸置換行列、ギャップ存在ペナルティ(ギャップオー
プニングペナルティとも呼ばれる)、およびギャップエクステンションペナルティを用い
てアラインしたときに「最適にアラインされた」と見なされる。BLOSUM62スコア
リングマトリックス(Henikoff and Henikoff,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 89(22):10915(1992))が、ポリペプ
チド配列アラインメントのアルゴリズム(例えば、BLASTP)で、デフォルトのスコ
アリング置換行列としてしばしば使用される。ギャップ存在ペナルティには、アラインさ
れた配列の一方における単一のアミノ酸ギャップの導入が課せられ、ギャップエクステン
ションペナルティには、ギャップにおける各残基の位置が課せられる。用いられるアライ
ンメントパラメータの例は以下の通りである:BLOSUM62スコアリング行列、ギャ
ップ存在ペナルティ=11およびギャップエクステンションペナルティ=1。アラインメ
ントスコアは、可能な最も高い類似性スコアを達成するために、アラインメントが始まり
終了する各配列のアミノ酸の位置(例えば、アラインメントウィンドウ)によって定義さ
れ、また、任意選択により、一方または両方の配列への1つまたは複数のギャップの挿入
によって定義される。
【0050】
核酸またはポリヌクレオチドは、他の成分(限定されるものではないが、例えば、他の
タンパク質、核酸、細胞など)から部分的にまたは完全に分離されているとき、「単離さ
れている」。同様に、ポリペプチド、タンパク質またはペプチドは、他の成分(限定され
るものではないが、例えば、他のタンパク質、核酸、細胞など)から部分的または完全に
分離されているとき、「単離されている」。モルベースで、単離された種は、組成物中の
他の種よりも豊富である。例えば、単離された種は、存在する全ての高分子種の少なくと
も約50%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95
%、96%、97%、98%、99%、または100%(モルベースで)を含み得る。目
的の種は、実質的な同質性(すなわち、従来の検出方法では組成物中の汚染種を検出でき
ない)となるまで精製されることが好ましい。純度および同質性は、核酸またはタンパク
質試料をアガロースまたはポリアクリルアミドのゲル電気泳動にかけた後、染色によって
可視化するなど、当該技術分野でよく知られた多くの手法で決定することができる。必要
に応じて、高分解能技術、例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)または類似
の手段を、材料の精製に使用することができる。
【0051】
核酸もしくはポリペプチドに適用される「精製された」は、一般に、当該技術分野にお
いてよく知られた分析技術によって決定された他の成分を実質的に含まない核酸またはポ
リペプチドを示す(例えば、精製されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、電気泳
動ゲル、クロマトグラフィー溶出液および/または密度勾配遠心分離法に供された媒体に
おいて個別のバンドを形成する)。例えば、電気泳動ゲルにおいて実質的に1つのバンド
を生じる核酸またはポリペプチドは「精製されて」いる。精製された核酸またはポリペプ
チドは、少なくとも約50%純粋であり、通常、少なくとも約75%、80%、85%、
90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98、99%、9
9.5%、99.6%、99.7%、99.8%またはそれ以上純粋である(例えば、モ
ルベースでの重量パーセント)。一実施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリ
シン変異体および/またはポリヌクレオチドを含む酵素組成物は、当該技術分野でよく知
られた精製または富化技術を適用することによって、前記変異体またはポリヌクレオチド
を富化することができる。本明細書に記載の実質的に純粋なスブチリシン変異体および/
またはポリヌクレオチドは、通常、特定の組成物中に少なくとも約55重量%、60重量
%、70重量%、80重量%、85重量%、90重量%、91重量%、92重量%、93
重量%、94重量%、95重量%、96重量%、97重量%、98重量%、99重量%、
99.5重量%またはそれを超える(モルベースで)全高分子種を含む。
【0052】
「組み合わせ変異誘発」は、参照核酸配列の核酸変異体のライブラリーを生成する方法
を指す。これらのライブラリーでは、変異体は、所定のセットの変異から選択される1つ
またはいくつかの変異を含む。この方法は、所定のセットの変異のメンバーではなかった
ランダム変異を導入する手段も提供する。いくつかのこのような方法は、例えば、米国特
許第6,582,914号明細書に記載され、市販のキット(例えば、QuikChan
ge(登録商標)Multi Site-Directed Mutagenesis
Kit(Stratagene))で具体化されたものを含む。
【0053】
「改変核酸配列」および「改変遺伝子」は、本明細書では互換的に使用され、天然に存
在する(すなわち、野生型)核酸配列の欠失、挿入、または分断を含む核酸配列を指す。
いくつかの実施形態では、改変核酸配列の発現産物は、短縮タンパク質である(例えば、
改変が配列の欠失または分断である場合)。いくつかの実施形態では、短縮タンパク質は
、生物学的活性を維持する。代替の実施形態では、改変核酸配列の発現産物は、伸長タン
パク質(例えば、核酸配列への挿入を含む改変)である。いくつかの実施形態では、核酸
配列へのヌクレオチドの挿入は、短縮タンパク質を生じさせる(例えば、挿入が終止コド
ンを形成する場合)。したがって、挿入は、発現産物として短縮タンパク質または伸長タ
ンパク質をもたらし得る。
【0054】
「熱安定性」は例えば、タンパク質分解、加水分解、および/または洗浄プロセス中、
優勢な条件下で、所与の期間にわたって変化した温度に曝露された後にプロテアーゼが保
持する酵素活性の量を指す。変化した温度は、温度の上昇または低下を含む。一実施形態
では、熱安定性は1種以上の洗剤成分(例えば、界面活性剤、キレート剤、ビルダーなど
)および/または1種以上の硬度の水の存在下で測定される。
【0055】
「洗浄性能」は、タンパク質分解、加水分解、および/または洗浄プロセス中、優勢な
条件下で、プロテアーゼが示す洗浄活性を指す。一実施形態では、本明細書に記載の1種
以上のスブチリシン変異体または1種以上の参照プロテアーゼの洗浄性能は、例えば、食
物、草、血液、ミルクまたは卵タンパク質から生じる染みなどの、製品または表面上の1
種以上の酵素感受性の染みについて、1種以上の洗浄アッセイを使用することによって測
定し得る。変異プロテアーゼまたは参照プロテアーゼの洗浄能力は、製品または表面上の
染みを標準的な洗浄条件に置き、様々なクラマトグラフィー、分光光度法、または他の定
量法を用いて染みが除去される程度を評価することによって測定することができる。洗浄
アッセイおよび洗浄方法の例としては、例えば、国際公開第99/34011号パンフレ
ットおよび米国特許第6,605,458号明細書に記載されているもの、ならびに以下
に提示する実施例に含まれる洗浄アッセイおよび洗浄方法が挙げられるが、これらに限定
されない。洗浄性能は、本明細書に記載のスブチリシン変異体を参照スブチリシンプロテ
アーゼと、各種洗浄アッセイにおいて、標準的な洗浄サイクル条件の後、通常の分光光度
法または分析方法によって測定された、例えば、草、血液、ミルク、インクまたは卵など
の酵素感受性の染みに関して比較することにより決定することができる。
【0056】
本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体または参照プロテアーゼの「洗浄有効
量」は、特定の洗浄用組成物において所望のレベルの酵素活性を達成するプロテアーゼの
量を指す。そのような有効量は、当業者によって容易に確認され、使用する特定のプロテ
アーゼ、洗浄の適用、洗浄用組成物の具体的な組成、および液体または乾燥(例えば、粒
状、棒状)組成物が要求されるか否かなどの多くの因子に基づく。
【0057】
「洗浄補助材料」は、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体以外の、洗浄用
組成物に含まれる任意の液体、固体、または気体物質を指す。一実施形態では、洗浄用組
成物は本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体および1種以上の洗浄補助材料を
含む。各洗浄補助材料は、通常、洗浄用組成物の特定のタイプおよび形態(例えば、液体
、顆粒、粉末、バー、ペースト、スプレー、タブレット、ゲル、または発泡体組成物)に
よって選択される。各洗浄補助材料は本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体と
適合するものであることが好ましい。
【0058】
「洗浄用組成物」は、洗浄されるべき物体、製品、または表面からの化合物(例えば、
望ましくない化合物)の除去に有用なあらゆる組成物を指し、これらには、限定されるも
のではないが、例えば、布帛、布帛製品、皿類製品、食器具製品、ガラス製品、コンタク
トレンズ、他の固体基材、毛(シャンプー)(ヒトまたは動物の毛を含む)、皮膚(石鹸
またはおよびクリーム)、歯(口腔洗浄液、練り歯磨き)、製品または物体の表面(例え
ば、硬質表面、例えば、テーブル、テーブルトップ、壁、家具製品、床、天井、非皿類製
品、非食器具製品などの硬質表面)、コンタクトレンズなどが含まれる。この用語は、組
成物に、この組成物中で使用されるプロテアーゼおよび他の酵素と適合性があれば、望ま
れる洗浄用組成物の特定のタイプおよび製品の形態(例えば、液体、ゲル、顆粒、または
スプレー組成物)に対して選択されるあらゆる材料および/または添加化合物を包含する
。洗浄用組成物の材料の具体的な選択は、洗浄されるべき表面、物体、製品、または布帛
、および組成物の望ましい形態を考慮することによって容易に行われる。洗浄用組成物は
、産業および施設ならびに家庭における洗浄に使用される組成物を含む。
【0059】
洗浄用組成物は、あらゆる物体、製品、および/または表面の洗浄、漂白、殺菌、およ
び/または滅菌に適した任意の組成物を含む。そのような組成物としては、限定はされな
いが、例えば、液体、タブレット、ゲル、顆粒、単位剤形および/または固体組成物など
の液体および/または固体組成物(洗浄用組成物または洗剤組成物を含む);緻密の織ら
れた布帛用洗剤組成物;例えばガラス、木材、セラミックおよび金属カウンタートップな
らびに窓などの硬質表面洗浄用組成物;カーペット洗浄剤;オーブン洗浄剤;布帛消臭剤
、布帛柔軟剤、洗濯ブースター洗浄用または洗剤組成物;洗濯添加剤洗浄用組成物;洗濯
プレスポッター洗浄用組成物;ならびに手洗いまたは手作業による食器洗浄用組成物(例
えば、「手洗い」または「手作業」による食器洗浄用洗剤)および自動食器洗浄用組成物
(例えば、「自動食器洗浄用洗剤」)を含む食器洗浄用組成物が挙げられる。
【0060】
洗浄用組成物としては、例えば、粒状または粉末状の万能または強力洗剤、特に洗浄洗
剤;液状、粒子状、ゲル状、固形状、タブレット状、単位剤形またはペースト状の万能洗
剤、特に、いわゆる強力液体(HDL)洗剤または強力粉末洗剤(HDD)のタイプ;緻
密に織られた布帛用液体洗剤;手洗いまたは手作業用食器洗浄剤、例えば高起泡型洗剤;
家庭用または業務用の、各種タブレット状、粉末状、固形状、粒状、液状、ゲル状および
濯ぎ助剤型のものを含む、自動食器洗浄用または皿類もしくは食器具用洗剤;抗菌性手洗
浄型を含む液体の洗浄剤および殺菌剤、洗浄棒、口腔洗浄液、義歯洗浄剤、車用洗浄剤、
カーペット洗剤、浴室洗剤;ヒトおよび他の動物用のヘアシャンプーおよび/またはヘア
リンス;シャワーゲル、フォームバスおよび金属クリーナー;ならびに漂白付加剤、およ
び「ステインスティック」または前処理剤などの洗浄補助剤が挙げられる。いくつかの実
施形態では、粒状組成物は、「コンパクト」形であり、いくつかの実施形態では、液体組
成物は「濃縮」型である。
【0061】
「布帛洗浄用組成物」は、洗濯用添加組成物、ならびに染みが付いた布帛(例えば、布
、リネン、および他の織物材料)の浸漬および/または前処理で使用するのに適した組成
物を含む、手洗濯用および機械洗濯用洗剤組成物を指す。布帛洗浄用組成物は、産業およ
び施設ならびに家庭における洗浄に使用される組成物を含む。
【0062】
「洗剤組成物」は、汚れた物体を洗浄するための洗浄媒体に使用することを意図した組
成物に関連して使用される。
【0063】
「漂白する」は、材料のブライトニング(すなわちホワイトニング)および/または洗
浄を達成するために、十分な時間ならびに/または適切なpHおよび/もしくは温度条件
下で行う、材料(例えば、布帛、洗濯物、パルプなど)または表面の処理を指す。漂白に
適した化学物質の例としては、限定されるものではないが、例えば、ClO2、H2O2
、ペル酸、NO2などが挙げられる。
【0064】
本明細書では、1種以上のスブチリシン変異体、例えば、限定はされないが、種々の洗
浄用途に特によく適合しかつ有用である、セリンプロテアーゼ変異体およびスブチリシン
プロテアーゼ変異体が開示される。一実施形態は、1種以上の単離された、組換えの、実
質的に純粋な、かつ/または天然に存在しないスブチリシン変異体に関する。さらなる実
施形態は、酵素活性を有する1種以上のスブチリシン変異体に関する。他の実施形態では
、酵素活性はタンパク質分解活性である。さらに他の実施形態では、1種以上のスブチリ
シン変異体は、バチルス属(Bacillus)の菌種のスブチリシン変異体である。
【0065】
他の実施形態は、78-X206A/D/F/G/H/M/N/P/R/S/Y、X7
8A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-206、X
78N-X206F/M/Y、X78G-X206D/F/H/M/N/P/R/Y、X
78A/C/E/F/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-X206A/
D/F/G/H/M/N/P/R/S/Y、18-X78N、X18K/R-X78N、
18-X87R、X18K/R-X87R、18-X206L/Y、X18K/R-X2
06L/Y、24-X87R、X24F/L/P/R-X87R、24-X206Y、X
24F/L/P-206、X24F/L/P-X206Y、X24F/L/P-X209
W、40-78、X40E-78、40-X78G、X40E-X78G、40-87、
X40E-87、40-X87R、X40E-X87R、40-129、40-X129
Q、X40E-129、X40E-X129Q、40-130、40-X130A、X4
0E-130、X40E-X130A、40-206、X40E-206、40-X20
6Y、X40E-X206Y、X78N-87、X78N-X87D/R、X78A/C
/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-87、X78G-X
87D/R/T、X78A/C/E/F/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W
/Y-X87R、X78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V
/W/Y-129、X78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/
V/W/Y-X129Q、X78A/C/E/F/H/I/K/L/M/P/Q/R/T
/V/W/Y-X130A、X78G-X130A/Q、X78A/C/E/F/G/H
/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-130、78-X249N/R、X7
8N-249、X78N-X249N/R、87-X206L/Y、X87D/R-X2
06L/Y、87-X209W、X87D/R-X209W、87-X213A、X87
D/R-213、X87D/R-X213A、X87R-X249N/R、129-X2
06Y、X129Q-X206Y、129-X249N/R、X129Q-249、X1
29Q-X249N/R、130-X206Y、X130A-X206R/Y、130-
X249N/R、X130A-249、X130A-X249N/R、X206Y-20
9、X206Y-X209W、206-X213A、X206L/Y-213、X206
L/Y-X213A、X206L/Y-249、X206L/Y-X249N/R、X2
09W-213、X209W-X213A、X209W-249、X209W-X249
N/R、18-24-78、X18K/R-24-78、18-X24F/L/P/R-
78、18-24-X78N、X18K/R-24-X78N、18-X24F/L/P
/R-X78N、X18K/R-X24F/L/P/R-78、X18K/R-X24F
/L/P/R-X78N、18-24-87、X18K/R-24-87、18-X24
F/L/P/R-87、18-24-X87D/R、X18K/R-24-X87D/R
、18-X24F/L/P/R-X87D/R、X18K/R-X24F/L/P/R-
87、X18K/R-X24F/L/P/R-X87D/R、18-24-129、X1
8K/R-24-129、18-X24F/L/P/R-129、18-24-X129
Q、X18K/R-X24F/L/P/R-129、X18K/R-24-X129Q、
18-X24F/L/P/R-X129Q、X18K/R-X24F/L/P/R-X1
29Q、18-24-130、18-X24F/L/P/R-130、18-24-X1
30A、X18K/R-24-130、X18K/R-X24F/L/P/R-130、
X18K/R-24-X130A、18-X24F/L/P/R-X130A、X18K
/R-X24F/L/P/R-X130A、18-24-206、18-24-X206
L/Y、18-X24F/L/P/R-206、X18K/R-24-206、X18K
/R-24-X206L/Y、18-X24F/L/P/R-X206L/Y、X18K
/R-X24F/L/P/R-206、X18K/R-X24F/L/P/R-X206
L/Y、18-24-209、18-24-X209W、18-X24F/L/P/R-
209、X18K/R-24-209、X18K/R-24-X209W、18-X24
F/L/P/R-X209W、X18K/R-X24F/L/P/R-209、X18K
/R-X24F/L/P/R-X209W、18-78-87、18-X78N-87、
18-78-X87D/R、X18K/R-78-87、X18K/R-X78N-87
、X18K/R-78-X87D/R、18-X78N-X87D/R、X18K/R-
X78N-X87D/R、18-78-129、18-X78N-129、18-78-
X129Q、X18K/R-78-129、X18K/R-X78N-129、X18K
/R-78-X129Q、18-X78N-X129Q、X18K/R-X78N-X1
29Q、18-78-130、18-X78N-130、18-78-X130A、X1
8K/R-78-130、X18K/R-X78N-130、X18K/R-78-X1
30A、18-X78N-X130A、X18K/R-X78N-X130A、18-7
8-206、18-78-X206L/Y、18-X78N-206、X18K/R-7
8-206、18-X78N-X206L/Y、X18K/R-X78N-206、X1
8K/R-78-X206L/Y、X18K/R-X78N-X206L/Y、18-7
8-209、18-X78N-209、18-78-X209W、X18K/R-78-
209、X18K/R-78-X209W、18-X78N-X209W、X18K/R
-X78N-209、X18K/R-X78N-X209W、18-78-213、18
-X78N-213、18-78-X213A、X18K/R-78-213、18-X
78N-X213A、X18K/R-X78N-213、X18K/R-78-X213
A、X18K/R-X78N-X213A、18-78-249、18-78-X249
N/R、18-X78N-249、X18K/R-78-249、18-X78N-X2
49N/R、X18K/R-X78N-249、X18K/R-78-X249N/R、
X18K/R-X78N-X249N/R、18-87-129、X18K/R-87-
129、18-X87D/R-129、18-87-X129Q、18-X87D/R-
X129Q、X18K/R-87-X129Q、X18K/R-X87D/R-129、
X18K/R-X87D/R-X129Q、18-87-130、X18K/R-87-
130、18-X87D/R-130、18-87-X130A、18-X87D/R-
X130A、X18K/R-87-X130A、X18K/R-X87D/R-130、
X18K/R-X87D/R-X130A、18-87-206、X18K/R-87-
206、18-X87D/R-206、18-87-X206L/Y、18-X87D/
R-X206L/Y、X18K/R-87-X206L/Y、X18K/R-X87D/
R-206、X18K/R-X87D/R-X206L/Y、18-87-209、X1
8K/R-87-209、18-X87D/R-209、18-87-X209W、18
-X87D/R-X209W、X18K/R-X87D/R-209、X18K/R-8
7-X209W、X18K/R-X87D/R-X209W、18-X87D/R-21
3、18-87-X213A、18-X87D/R-X213A、X18K/R-X87
D/R-213、X18K/R-87-X213A、X18K/R-X87D/R-X2
13A、18-87-249、X18K/R-87-249、18-X87D/R-24
9、18-87-X249N/R、18-X87D/R-249N/R、18K/R-X
87D/R-249、18K/R-87-X249N/R、18K/R-X87D/R-
X249N/R、18-129-130、X18K/R-129-130、18-X12
9Q-130、18-129-X130A、X18K/R-X129Q-130、X18
K/R-129-X130A、18-X129Q-X130A、X18K/R-X129
Q-X130A、18-129-206、X18K/R-129-206、18-X12
9Q-206、18-129-X206L/Y、X18K/R-X129Q-206、X
18K/R-129-X206L/Y、18-X129Q-X206L/Y、X18K/
R-X129Q-X206L/Y、18-129-209、X18K/R-129-20
9、18-X129Q-209、18-129-X209W、X18K/R-X129Q
-209、X18K/R-129-X209W、18-X129Q-X209W、X18
K/R-X129Q-X209W、18-129-213、X18K/R-129-21
3、18-X129Q-213、18-129-X213A、X18K/R-X129Q
-213、X18K/R-129-X213A、18-X129Q-X213A、X18
K/R-X129Q-X213A、18-129-249、X18K/R-129-24
9、18-X129Q-249、18-129-X249N/R、X18K/R-X12
9Q-249、X18K/R-129-X249N/R、18-X129Q-X249N
/R、X18K/R-X129Q-X249N/R、18-130-206、X18K/
R-130-206、18-X130A-206、18-130-X206L/Y、X1
8K/R-X130A-206、X18K/R-130-X206L/Y、18-X13
0A-X206L/Y、X18K/R-X130A-X206L/Y、18-130-2
09、X18K/R-130-209、18-X130A-209、18-130-X2
09W、X18K/R-X130A-209、X18K/R-130-X209W、18
-X130A-X209W、X18K/R-X130A-X209W、18-130-2
13、X18K/R-130-213、18-X130A-213、18-130-X2
13A、X18K/R-X130A-213、X18K/R-130-X213A、18
-X130A-X213A、X18K/R-X130A-X213A、18-130-2
49、X18K/R-130-249、18-X130A-249、18-130-X2
49N/R、X18K/R-X130A-249、X18K/R-130-X249N/
R、18-X130A-X249N/R、X18K/R-X130A-X249N/R、
18-206-209、18-206-X209W、18-X206L/Y-209、1
8K/R-206-209、18-X206L/Y-X209W、X18K/R-X20
6L/Y-209、X18K/R-206-X209W、X18K/R-X206L/Y
-X209W、18-206-213、X18K/R-206-213、18-206L
/Y-213、18-206-X213A、X18K/R-X206L/Y-213、X
18K/R-206-X213A、18-X206L/Y-X213A、X18K/R-
X206L/Y-X213A、18-206-249、X18K/R-206-249、
18-206L/Y-249、18-206-X249N/R、X18K/R-X206
L/Y-249、X18K/R-206-X249N/R、18-X206L/Y-X2
49N/R、X18K/R-X206L/Y-X249N/R、18-209-213、
18-X209W-213、X18K/R-209-213、18-209-X213A
、18-X209W-X213A、X18K/R-X209W-213、X18K/R-
209-X213A、X18K/R-X209W-X213A、18-209-249、
18-X209W-249、X18K/R-209-249、18-209-X249N
/R、18-X209W-X249N/R、18K/R-X209W-249、X18K
/R-209-X249N/R、X18K/R-X209W-X249N/R、18-2
13-X249N/R、X18K/R-X213A-249、X18K/R-213-X
249N/R、18-X213A-X249N/R、X18K/R-X213A-X24
9N/R、24-78-87、24-78-X87D/R、24-X78N-87、X2
4F/L/P/R-78-87、24-X78N-X87D/R、X24R/P/F-7
8-X87D/R、X24F/L/P/R-X78N-87、X24R/P/F-X78
N-X87D/R、X24F/L/P-78-129、X24F/L/P-X78N-1
29、X24F/L/P-78-X129Q、X24F/L/P-X78N-X129Q
、X24F/L/P-78-130、X24F/L/P-X78N-130、X24F/
L/P-78-X130A、X24F/L/P-X78N-X130A、24-78-X
206Y、X24F/L/P-78-206、24-X78N-X206Y、X24F/
L/P-X78N-206、X24F/L/P-78-X206L/Y、X24F/L/
P-X78N-X206L/Y、X24F/L/P-78-209、X24F/L/P-
X78N-209、X24F/L/P-78-X209W、X24F/L/P-X78N
-X209W、24-78-213、X24F/L/P/R-78-213、24-X7
8N-213、24-78-X213A、X24F/L/P/R-X78N-213、X
24F/L/P/R-78-X213A、24-X78N-X213A、X24F/L/
P/R-X78N-X213A、24-78-X249N/R、24-X78N-249
、24-X78N-X249N/R、X24F/L/P/R-X78N-249、X24
F/L/P/R-78-X249N/R、X24F/L/P/R-X78N-X249N
/R、24-87-129、X24F/L/P/R-87-129、24-X87D/R
-129、24-87-X129Q、X24F/L/P/R-X87D/R-129、X
24F/L/P/R-87-X129Q、24-X87D/R-X129Q、X24F/
L/P/R-X87D/R-X129Q、24-87-130、X24F/L/P/R-
87-130、24-X87D/R-130、24-87-X130A、X24F/L/
P/R-X87D/R-130、X24F/L/P/R-87-X130A、24-X8
7D/R-X130A、X24F/L/P/R-X87D/R-X130A、24-87
-X206L/Y、24-X87R-206、X24F/L/P/R-87-206、2
4-X87D/R-X206L/Y、X24F/L/P/R-X87D/R-206、X
24F/L/P/R-87-X206L/Y、X24F/L/P/R-X87D/R-X
206L/Y、24-87-X209W、X24F/L/P/R-87-X209W、2
4-87-X209W、24-87D/R-X209W、X24F/L/P/R-X87
D/R-X209W、24-X87D/R-213、24-87-X213A、24-X
87D/R-X213A、X24F/L/P/R-X87D/R-213、X24F/L
/P/R-87-X213A、X24F/L/P/R-X87D/R-X213A、24
-87-249、X24F/L/P/R-87-249、24-X87D/R-249、
24-87-X249N/R、X24F/L/P/R-X87D/R-249、X24F
/L/P/R-87-X249N/R、24-X87D/R-X249N/R、X24F
/L/P/R-X87D/R-X249N/R、X24F/L/P-129-130、X
24F/L/P-X129Q-130、X24F/L/P-129-X130A、X24
F/L/P-X129Q-X130A、X24F/L/P-129-206、24-12
9-X206Y、X24F/L/P-X129Q-206、X24F/L/P-129-
X206Y、24-X129Q-X206Y、X24F/L/P-X129Q-X206
L/Y、X24F/L/P/R-X129Q-X206Y、X24F/L/P-129-
209、X24F/L/P-X129Q-209、X24F/L/P-129-X209
W、X24F/L/P-X129Q-X209W、24-129-213、X24F/L
/P/R-129-213、24-X129Q-213、24-129-X213A、X
24F/L/P/R-X129Q-213、X24F/L/P/R-129-X213A
、24-X129Q-X213A、X24F/L/P/R-X129Q-X213A、2
4-129-249、X24F/L/P/R-129-249、24-X129Q-24
9、24-129-X249N/R、X24F/L/P/R-X129Q-249、X2
4F/L/P/R-129-X249N/R、24-X129Q-X249N/R、X2
4F/L/P/R-X129Q-X249N/R、X24F/L/P-130-206、
24-130-X206Y、X24F/L/P-X130A-206、X24F/L/P
-130-X206L/Y、X24F/L/P/R-130-X206Y、24-X13
0A-X206Y、X24F/L/P-X130A-X206L/Y、X24F/L/P
/R-X130A-X206Y、X24F/L/P-130-209、X24F/L/P
-X130A-209、X24F/L/P-130-X209W、X24F/L/P-X
130A-X209W、24-130-213、X24F/L/P/R-130-213
、24-X130A-213、24-130-X213A、X24F/L/P/R-X1
30A-213、X24F/L/P/R-130-X213A、24-X130A-X2
13A、X24F/L/P/R-X130A-X213A、24-130-249、X2
4F/L/P/R-130-249、24-X130A-249、24-130-X24
9N/R、X24F/L/P/R-X130A-249、X24F/L/P/R-130
-X249N/R、24-X130A-X249N/R、X24F/L/P/R-X13
0A-X249N/R、24-X206Y-209、24F/L/P-206-209、
24-X206Y-X209W、X24F/L/P-X206L/Y-209、X24F
/L/P/R-X206Y-209、X24F/L/P-206-X209W、X24F
/L/P-X206L/Y-X209W、X24F/L/P/R-X206Y-X209
W、24-206-213、X24F/L/P/R-206-213、24-X206L
/Y-213、24-206-X213A、X24F/L/P/R-X206L/Y-2
13、X24F/L/P/R-206-X213A、24-X206L/Y-X213A
、X24F/L/P/R-X206L/Y-X213A、24-206-249、24-
X206L/Y-249、X24F/L/P/R-206-249、24-206-X2
49N/R、24-X206L/Y-X249N/R、X24F/L/P/R-X206
L/Y-249、X24F/L/P/R-206-X249N/R、X24F/L/P/
R-X206L/Y-X249N/R、24-209-213、24-X209W-21
3、X24F/L/P/R-209-213、24-209-X213A、X24F/L
/P/R-X209W-213、24-X209W-X213A、X24F/L/P/R
-209-X213A、X24F/L/P/R-X209W-X213A、24-209
-249、24-X209W-249、X24F/L/P/R-209-249、24-
209-X249N/R、X24F/L/P/R-X209W-249、24-X209
W-X249N/R、X24F/L/P/R-209-X249N/R、X24F/L/
P/R-X209W-X249N/R、78-87-129、X78N-87-129、
78-X87D/R-129、78-87-X129Q、X78N-X87D/R-12
9、X78N-87-X129Q、78-X87D/R-X129Q、X78N-X87
D/R-X129Q、78-87-130、X78N-87-130、78-X87D/
R-130、78-87-X130A、X78N-X87D/R-130、X78N-8
7-X130A、78-X87D/R-X130A、X78N-X87D/R-X130
A、78-87-206、78-87-X206L/R/Y、X78N-87-206、
78-X87D/R-206、78-X87D/R-X206L/R/Y、X78N-8
7-X206L/R/Y、X78N-X87D/R-206、X78N-X87D/R-
X206L/R/Y、78-87-209、78-87-X209W、X78N-87-
209、78-X87D/R-209、X78N-X87D/R-209、78-X87
D/R-X209W、X78N-87-X209W、X78N-X87D/R-X209
W、78-87-213、X78N-87-213、78-X87D/R-213、78
-87-X213A、X78N-X87D/R-213、X78N-87-X213A、
78-X87D/R-X213A、X78N-X87D/R-X213A、78-87-
249、78-87-X249N/R、X78N-87-249、78-87D/R-2
49、X78N-X87D/R-249、78-X87D/R-X249N/R、X78
N-87-X249N/R、X78N-X87D/R-X249N/R、78-129-
X206R/Y、X78N-129-X206Y、78-X129Q-X206R/Y、
X78N-X129Q-X206Y、78-129-213、X78N-129-213
、78-X129Q-213、78-129-X213A、X78N-X129Q-21
3、X78N-129-X213A、78-X129Q-X213A、X78N-X12
9Q-X213A、78-129-249、X78N-129-249、78-X129
Q-249、78-129-X249N/R、X78N-X129Q-249、X78N
-129-X249N/R、78-X129Q-X249N/R、X78N-X129Q
-X249N/R、78-130-X206R/Y、X78N-130-X206Y、7
8-X130A-X206R/Y、X78N-X130A-X206Y、78-130-
213、X78N-130-213、78-X130A-213、78-130-X21
3A、X78N-X130A-213、X78N-130-X213A、78-X130
A-X213A、X78N-X130A-X213A、78-130-213、X78N
-130-213、78-X130A-213、78-130-X213A、X78N-
X130A-213、X78N-130-X213A、78-X130A-X213A、
X78N-X130A-X213A、78-130-249、X78N-130-249
、78-X130A-249、78-130-X249N/R、X78N-X130A-
249、X78N-130-X249N/R、78-X130A-X249N/R、X7
8N-X130A-X249N/R、78-206-209、X78N-206-209
、78-X206L/Y-209、78-206-X209W、X78N-X206L/
Y-209、X78N-206-X209W、78-X206L/Y-X209W、X7
8N-X206L/Y-X209W、78-206-213、X78N-206-213
、78-X206L/Y-213、78-206-X213A、X78N-X206L/
Y-213、X78N-206-X213A、78-X206L/Y-X213A、X7
8N-X206L/Y-X213A、78-206-249、78-206-X249R
/N、78-X206L/Y-249、X78N-206-249、X78N-206-
X249N/R、78-X206L/Y-X249N/R、X78N-X206L/Y-
249、X78N-X206L/Y-X249N/R、78-209-213、78-X
209W-213、78-209-X213A、X78N-209-213、X78N-
X209W-213、X78N-209-X213A、78-X209W-X213A、
X78N-X209W-X213A、78-209-249、78-X209W-249
、78-209-X249N/R、X78N-209-249、78-X209W-X2
49N/R、X78N-X209W-249、X78N-209-X249N/R、X7
8N-X209W-X249N/R、78-213-249、78-X213A-249
、X78N-213-249、78-213-X249N/R、X78N-X213A-
249、X78N-213-X249N/R、78-X213A-X249N/R、X7
8N-X213A-X249N/R、87-129-130、X87D/R-129-1
30、87-X129Q-130、87-129-X130A、X87D/R-X129
Q-130、X87D/R-129-X130A、87-X129Q-X130A、X8
7D/R-X129Q-X130A、87-129-206、X87D/R-129-2
06、87-X129Q-206、87-129-X206L/R/Y、X87D/R-
X129Q-206、X87D/R-129-X206L/R/Y、87-X129Q-
X206L/R/Y、X87D/R-X129Q-X206L/R/Y、87-129-
209、X87D/R-129-209、87-X129Q-209、87-129-X
209W、X87D/R-X129Q-209、X87D/R-129-X209W、8
7-X129Q-X209W、X87D/R-X129Q-X209W、87-129-
213、X87D/R-129-213、87-X129Q-213、87-129-X
213A、X87D/R-X129Q-213、X87D/R-129-X213A、8
7-X129Q-X213A、X87D/R-X129Q-X213A、87-129-
249、X87D/R-129-249、87-X129Q-249、87-129-X
249N/R、X87D/R-X129Q-249、X87D/R-129-X249N
/R、87-X129Q-X249N/R、X87D/R-X129Q-X249N/R
、87-130-206、X87D/R-130-206、87-X130A-206、
87-130-X206L/R/Y、X87D/R-X130A-206、X87D/R
-130-X206L/R/Y、87-X130A-X206L/R/Y、X87D/R
-X130A-X206L/R/Y、87-130-209、X87D/R-130-2
09、87-X130A-209、87-130-X209W、X87D/R-X130
A-209、X87D/R-130-X209W、87-X130A-X209W、X8
7D/R-X130A-X209W、87-130-213、X87D/R-130-2
13、87-X130A-213、87-130-X213A、X87D/R-X130
A-213、X87D/R-130-X213A、87-X130A-X213A、X8
7D/R-X130A-X213A、87-130-249、X87D/R-130-2
49、87-X130A-249、87-130-X249N/R、X87D/R-X1
30A-249、X87D/R-130-X249N/R、87-X130A-X249
N/R、X87D/R-X130A-X249N/R、87-206-209、X87D
/R-206-209、87-X206L/Y-209、87-206-X209W、X
87D/R-X206L/Y-209、X87D/R-206-X209W、87-X2
06L/Y-X209W、X87D/R-X206L/Y-X209W、87-206-
213、87-X206L/Y-213、87-206-X213A、X87D/R-2
06-213、X87D/R-X206L/Y-213、X87D/R-206-X21
3A、87-X206L/Y-X213A、X87D/R-X206L/Y-X213A
、87-206-249、87-X206L/Y-249、87D/R-206-249
、87-209-X249N/R、X87R-206-X249N/R、X87D/R-
X206L/Y-249、87-X206L/Y-X249N/R、X87R-X206
L/Y-X249N/R、87-209-213、X87D/R-209-213、87
-X209W-213、87-209-X213A、X87D/R-X209W-213
、X87D/R-209-X213A、87-X209W-X213A、X87D/R-
X209W-X213A、87-209-249、87-X209W-249、87-2
09-X249N/R、X87D/R-209-249、X87D/R-X209W-2
49、87-X209W-X249N/R、X87R-209-X249N/R、X87
D/R-X209W-X249N/R、87-213-249、87-X213A-24
9、X87D/R-213-249、87-213-X249N/R、X87D/R-X
213A-249、X87D/R-213-X249N/R、87-X213A-X24
9N/R、X87D/R-X213A-X249N/R、129-130-X206R/
Y、X129Q-130-X206R/Y、129-X130A-X206R/Y、X1
29Q-X130A-X206R/Y、129-130-213、X129Q-130-
213、129-X130A-213、129-130-X213A、X129Q-X1
30A-213、X129Q-130-X213A、129-X130A-X213A、
X129Q-X130A-X213A、129-130-249、X129Q-130-
249、129-X130A-249、129-130-X249N/R、X129Q-
X130A-249、X129Q-130-X249N/R、129-X130A-X2
49N/R、X129Q-X130A-X249N/R、129-X206Y-209、
X129Q-X206Y-209、129-X206Y-X209W、X129Q-X2
06Y-X209W、129-206-213、129-X206L/Y-213、12
9-206-X213A、X129Q-206-213、X129Q-X206L/Y-
213、X129Q-206-X213A、129-X206L/Y-X213A、X1
29Q-X206L/Y-X213A、129-206-249、129-X206L/
Y-249、129-206-X249N/R、X129Q-206-249、X129
A-X206L/Y-249、X129Q-206-X249N/R、129-X206
L/Y-X249N/R、X129Q-X206L/Y-X249N/R、129-20
9-213、129-X209W-213、129-209-X213A、X129Q-
209-213、X129Q-X209W-213、X129Q-209-X213A、
129-X209W-X213A、X129Q-X209W-X213A、129-20
9-249、129-X209W-249、129-209-X249N/R、X129
Q-209-249、X129Q-X209W-249、X129Q-209-X249
N/R、129-X209W-X249N/R、X129Q-X209W-X249N/
R、129-213-249、129-X213A-249、129-213-X249
N/R、X129Q-213-249、X129Q-X213A-249、129-X2
13A-X249R、X129Q-213-X249N/R、X129Q-X213A-
X249N/R、130-X206Y-209、X130A-X206Y-209、13
0-X206Y-X209W、X130A-X206Y-X209W、130-206-
213、130-X206L/Y-213、130-206-X213A、X130A-
206-213、X130A-X206L/Y-213、X130A-206-X213
A、130-X206L/Y-X213A、X130A-X206L/Y-X213A、
130-206-249、130-X206L/Y-249、130-206-X249
N/R、X130A-206-249、X130A-X206L/Y-249、X130
A-206-X249N/R、130-X206L/Y-X249N/R、X130A-
X206L/Y-X249N/R、130-209-213、130-X209W-21
3、130-209-X213A、X130A-209-213、X130A-X209
W-213、X130A-209-X213A、130-X209W-X213A、X1
30A-X209W-X213A、130-209-249、130-X209W-24
9、130-209-X249N/R、X130A-209-249、X130A-X2
09W-249、X130A-209-X249N/R、130-X209W-X249
N/R、X130A-X209W-X249N/R、130-213-249、130-
X213A-249、130-213-X249N/R、X130A-213-249、
X130A-X213A-249、130-X213A-X249R、X130A-21
3-X249N/R、X130A-X213A-X249N/R、130-209-24
9、130-X209W-249、130-209-X249N/R、X130A-20
9-249、X130A-X209W-249、X130A-209-X249N/R、
130-X209W-X249N/R、X130A-X209W-X249N/R、20
6-209-213、206-X209W-213、206-209-X213A、X2
06L/Y-209-213、206-X209W-X213A、X206L/Y-X2
09W-213、X206L/Y-209-X213A、X206L/Y-X209W-
X213A、206-209-249、206-X209W-249、206-209-
X249N/R、X206L/Y-209-249、X206L/Y-X209W-24
9、206-X209W-X249N/R、X206L/Y-209-X249N/R、
X206L/Y-X209W-X249N/R、206-213-249、206-X2
13A-249、206-213-X249N/RX206L/Y-213-249、X
206L/Y-X213A-249、X206L/Y-213-X249N/R、206
-X213A-X249N/R、X206L/Y-X213A-X249N/R、209
-213-249、X209W-213-249、209-X213A-249、209
-213-X249N/R、X209W-X213A-249、X209W-213-X
249N/R、209-X213A-X249N/R、X209W-X213A-X24
9N/Rおよびこれらの組み合わせから選択される、2つ以上の位置でのアミノ酸置換の
組み合わせを含むアミノ酸配列を含む、単離されたスブチリシン変異体を提供する;ここ
で、Xは任意のアミノ酸であり、前記変異体はタンパク質分解活性を有しており;さらに
、前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファ
シエンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシンBP
N’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミ
ノ酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたものである。さら
なる実施形態は、78-X206A/D/F/G/H/M/N/P/R/S/Y、X78
A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-206、X7
8N-X206F/M/Y、X78G-X206D/F/H/M/N/P/R/Y、X7
8A/C/E/F/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-X206A/D
/F/G/H/M/N/P/R/S/Y、18-X78N、X18K/R-X78N、1
8-X87R、X18K/R-X87R、18-X206L/Y、X18K/R-X20
6L/Y、24-X87R、X24F/L/P/R-X87R、24-X206Y、X2
4F/L/P-206、X24F/L/P-X206Y、X24F/L/P-X209W
、40-78、X40E-78、40-X78G、X40E-X78G、40-87、X
40E-87、40-X87R、X40E-X87R、40-129、40-X129Q
、X40E-129、X40E-X129Q、40-130、40-X130A、X40
E-130、X40E-X130A、40-206、X40E-206、40-X206
Y、X40E-X206Y、X78N-87、X78N-X87D/R、X78A/C/
E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-87、X78G-X8
7D/R/T、X78A/C/E/F/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/
Y-X87R、X78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/
W/Y-129、X78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V
/W/Y-X129Q、X78A/C/E/F/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/
V/W/Y-X130A、X78G-X130A/Q、X78A/C/E/F/G/H/
I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-130、78-X249N/R、X78
N-249、X78N-X249N/R、87-X206L/Y、X87D/R-X20
6L/Y、87-X209W、X87D/R-X209W、87-X213A、X87D
/R-213、X87D/R-X213A、X87R-X249N/R、129-X20
6Y、X129Q-X206Y、129-X249N/R、X129Q-249、X12
9Q-X249N/R、130-X206Y、X130A-X206R/Y、130-X
249N/R、X130A-249、X130A-X249N/R、X206Y-209
、X206Y-X209W、206-X213A、X206L/Y-213、X206L
/Y-X213A、X206L/Y-249、X206L/Y-X249N/R、X20
9W-213、X209W-X213A、X209W-249、X209W-X249N
/R、18-24-78、X18K/R-24-78、18-X24F/L/P/R-7
8、18-24-X78N、X18K/R-24-X78N、18-X24F/L/P/
R-X78N、X18K/R-X24F/L/P/R-78、X18K/R-X24F/
L/P/R-X78N、18-24-87、X18K/R-24-87、18-X24F
/L/P/R-87、18-24-X87D/R、X18K/R-24-X87D/R、
18-X24F/L/P/R-X87D/R、X18K/R-X24F/L/P/R-8
7、X18K/R-X24F/L/P/R-X87D/R、18-24-129、X18
K/R-24-129、18-X24F/L/P/R-129、18-24-X129Q
、X18K/R-X24F/L/P/R-129、X18K/R-24-X129Q、1
8-X24F/L/P/R-X129Q、X18K/R-X24F/L/P/R-X12
9Q、18-24-130、18-X24F/L/P/R-130、18-24-X13
0A、X18K/R-24-130、X18K/R-X24F/L/P/R-130、X
18K/R-24-X130A、18-X24F/L/P/R-X130A、X18K/
R-X24F/L/P/R-X130A、18-24-206、18-24-X206L
/Y、18-X24F/L/P/R-206、X18K/R-24-206、X18K/
R-24-X206L/Y、18-X24F/L/P/R-X206L/Y、X18K/
R-X24F/L/P/R-206、X18K/R-X24F/L/P/R-X206L
/Y、18-24-209、18-24-X209W、18-X24F/L/P/R-2
09、X18K/R-24-209、X18K/R-24-X209W、18-X24F
/L/P/R-X209W、X18K/R-X24F/L/P/R-209、X18K/
R-X24F/L/P/R-X209W、18-78-87、18-X78N-87、1
8-78-X87D/R、X18K/R-78-87、X18K/R-X78N-87、
X18K/R-78-X87D/R、18-X78N-X87D/R、X18K/R-X
78N-X87D/R、18-78-129、18-X78N-129、18-78-X
129Q、X18K/R-78-129、X18K/R-X78N-129、X18K/
R-78-X129Q、18-X78N-X129Q、X18K/R-X78N-X12
9Q、18-78-130、18-X78N-130、18-78-X130A、X18
K/R-78-130、X18K/R-X78N-130、X18K/R-78-X13
0A、18-X78N-X130A、X18K/R-X78N-X130A、18-78
-206、18-78-X206L/Y、18-X78N-206、X18K/R-78
-206、18-X78N-X206L/Y、X18K/R-X78N-206、X18
K/R-78-X206L/Y、X18K/R-X78N-X206L/Y、18-78
-209、18-X78N-209、18-78-X209W、X18K/R-78-2
09、X18K/R-78-X209W、18-X78N-X209W、X18K/R-
X78N-209、X18K/R-X78N-X209W、18-78-213、18-
X78N-213、18-78-X213A、X18K/R-78-213、18-X7
8N-X213A、X18K/R-X78N-213、X18K/R-78-X213A
、X18K/R-X78N-X213A、18-78-249、18-78-X249N
/R、18-X78N-249、X18K/R-78-249、18-X78N-X24
9N/R、X18K/R-X78N-249、X18K/R-78-X249N/R、X
18K/R-X78N-X249N/R、18-87-129、X18K/R-87-1
29、18-X87D/R-129、18-87-X129Q、18-X87D/R-X
129Q、X18K/R-87-X129Q、X18K/R-X87D/R-129、X
18K/R-X87D/R-X129Q、18-87-130、X18K/R-87-1
30、18-X87D/R-130、18-87-X130A、18-X87D/R-X
130A、X18K/R-87-X130A、X18K/R-X87D/R-130、X
18K/R-X87D/R-X130A、18-87-206、X18K/R-87-2
06、18-X87D/R-206、18-87-X206L/Y、18-X87D/R
-X206L/Y、X18K/R-87-X206L/Y、X18K/R-X87D/R
-206、X18K/R-X87D/R-X206L/Y、18-87-209、X18
K/R-87-209、18-X87D/R-209、18-87-X209W、18-
X87D/R-X209W、X18K/R-X87D/R-209、X18K/R-87
-X209W、X18K/R-X87D/R-X209W、18-X87D/R-213
、18-87-X213A、18-X87D/R-X213A、X18K/R-X87D
/R-213、X18K/R-87-X213A、X18K/R-X87D/R-X21
3A、18-87-249、X18K/R-87-249、18-X87D/R-249
、18-87-X249N/R、18-X87D/R-249N/R、18K/R-X8
7D/R-249、18K/R-87-X249N/R、18K/R-X87D/R-X
249N/R、18-129-130、X18K/R-129-130、18-X129
Q-130、18-129-X130A、X18K/R-X129Q-130、X18K
/R-129-X130A、18-X129Q-X130A、X18K/R-X129Q
-X130A、18-129-206、X18K/R-129-206、18-X129
Q-206、18-129-X206L/Y、X18K/R-X129Q-206、X1
8K/R-129-X206L/Y、18-X129Q-X206L/Y、X18K/R
-X129Q-X206L/Y、18-129-209、X18K/R-129-209
、18-X129Q-209、18-129-X209W、X18K/R-X129Q-
209、X18K/R-129-X209W、18-X129Q-X209W、X18K
/R-X129Q-X209W、18-129-213、X18K/R-129-213
、18-X129Q-213、18-129-X213A、X18K/R-X129Q-
213、X18K/R-129-X213A、18-X129Q-X213A、X18K
/R-X129Q-X213A、18-129-249、X18K/R-129-249
、18-X129Q-249、18-129-X249N/R、X18K/R-X129
Q-249、X18K/R-129-X249N/R、18-X129Q-X249N/
R、X18K/R-X129Q-X249N/R、18-130-206、X18K/R
-130-206、18-X130A-206、18-130-X206L/Y、X18
K/R-X130A-206、X18K/R-130-X206L/Y、18-X130
A-X206L/Y、X18K/R-X130A-X206L/Y、18-130-20
9、X18K/R-130-209、18-X130A-209、18-130-X20
9W、X18K/R-X130A-209、X18K/R-130-X209W、18-
X130A-X209W、X18K/R-X130A-X209W、18-130-21
3、X18K/R-130-213、18-X130A-213、18-130-X21
3A、X18K/R-X130A-213、X18K/R-130-X213A、18-
X130A-X213A、X18K/R-X130A-X213A、18-130-24
9、X18K/R-130-249、18-X130A-249、18-130-X24
9N/R、X18K/R-X130A-249、X18K/R-130-X249N/R
、18-X130A-X249N/R、X18K/R-X130A-X249N/R、1
8-206-209、18-206-X209W、18-X206L/Y-209、18
K/R-206-209、18-X206L/Y-X209W、X18K/R-X206
L/Y-209、X18K/R-206-X209W、X18K/R-X206L/Y-
X209W、18-206-213、X18K/R-206-213、18-206L/
Y-213、18-206-X213A、X18K/R-X206L/Y-213、X1
8K/R-206-X213A、18-X206L/Y-X213A、X18K/R-X
206L/Y-X213A、18-206-249、X18K/R-206-249、1
8-206L/Y-249、18-206-X249N/R、X18K/R-X206L
/Y-249、X18K/R-206-X249N/R、18-X206L/Y-X24
9N/R、X18K/R-X206L/Y-X249N/R、18-209-213、1
8-X209W-213、X18K/R-209-213、18-209-X213A、
18-X209W-X213A、X18K/R-X209W-213、X18K/R-2
09-X213A、X18K/R-X209W-X213A、18-209-249、1
8-X209W-249、X18K/R-209-249、18-209-X249N/
R、18-X209W-X249N/R、18K/R-X209W-249、X18K/
R-209-X249N/R、X18K/R-X209W-X249N/R、18-21
3-X249N/R、X18K/R-X213A-249、X18K/R-213-X2
49N/R、18-X213A-X249N/R、X18K/R-X213A-X249
N/R、24-78-87、24-78-X87D/R、24-X78N-87、X24
F/L/P/R-78-87、24-X78N-X87D/R、X24R/P/F-78
-X87D/R、X24F/L/P/R-X78N-87、X24R/P/F-X78N
-X87D/R、X24F/L/P-78-129、X24F/L/P-X78N-12
9、X24F/L/P-78-X129Q、X24F/L/P-X78N-X129Q、
X24F/L/P-78-130、X24F/L/P-X78N-130、X24F/L
/P-78-X130A、X24F/L/P-X78N-X130A、24-78-X2
06Y、X24F/L/P-78-206、24-X78N-X206Y、X24F/L
/P-X78N-206、X24F/L/P-78-X206L/Y、X24F/L/P
-X78N-X206L/Y、X24F/L/P-78-209、X24F/L/P-X
78N-209、X24F/L/P-78-X209W、X24F/L/P-X78N-
X209W、24-78-213、X24F/L/P/R-78-213、24-X78
N-213、24-78-X213A、X24F/L/P/R-X78N-213、X2
4F/L/P/R-78-X213A、24-X78N-X213A、X24F/L/P
/R-X78N-X213A、24-78-X249N/R、24-X78N-249、
24-X78N-X249N/R、X24F/L/P/R-X78N-249、X24F
/L/P/R-78-X249N/R、X24F/L/P/R-X78N-X249N/
R、24-87-129、X24F/L/P/R-87-129、24-X87D/R-
129、24-87-X129Q、X24F/L/P/R-X87D/R-129、X2
4F/L/P/R-87-X129Q、24-X87D/R-X129Q、X24F/L
/P/R-X87D/R-X129Q、24-87-130、X24F/L/P/R-8
7-130、24-X87D/R-130、24-87-X130A、X24F/L/P
/R-X87D/R-130、X24F/L/P/R-87-X130A、24-X87
D/R-X130A、X24F/L/P/R-X87D/R-X130A、24-87-
X206L/Y、24-X87R-206、X24F/L/P/R-87-206、24
-X87D/R-X206L/Y、X24F/L/P/R-X87D/R-206、X2
4F/L/P/R-87-X206L/Y、X24F/L/P/R-X87D/R-X2
06L/Y、24-87-X209W、X24F/L/P/R-87-X209W、24
-87-X209W、24-87D/R-X209W、X24F/L/P/R-X87D
/R-X209W、24-X87D/R-213、24-87-X213A、24-X8
7D/R-X213A、X24F/L/P/R-X87D/R-213、X24F/L/
P/R-87-X213A、X24F/L/P/R-X87D/R-X213A、24-
87-249、X24F/L/P/R-87-249、24-X87D/R-249、2
4-87-X249N/R、X24F/L/P/R-X87D/R-249、X24F/
L/P/R-87-X249N/R、24-X87D/R-X249N/R、X24F/
L/P/R-X87D/R-X249N/R、X24F/L/P-129-130、X2
4F/L/P-X129Q-130、X24F/L/P-129-X130A、X24F
/L/P-X129Q-X130A、X24F/L/P-129-206、24-129
-X206Y、X24F/L/P-X129Q-206、X24F/L/P-129-X
206Y、24-X129Q-X206Y、X24F/L/P-X129Q-X206L
/Y、X24F/L/P/R-X129Q-X206Y、X24F/L/P-129-2
09、X24F/L/P-X129Q-209、X24F/L/P-129-X209W
、X24F/L/P-X129Q-X209W、24-129-213、X24F/L/
P/R-129-213、24-X129Q-213、24-129-X213A、X2
4F/L/P/R-X129Q-213、X24F/L/P/R-129-X213A、
24-X129Q-X213A、X24F/L/P/R-X129Q-X213A、24
-129-249、X24F/L/P/R-129-249、24-X129Q-249
、24-129-X249N/R、X24F/L/P/R-X129Q-249、X24
F/L/P/R-129-X249N/R、24-X129Q-X249N/R、X24
F/L/P/R-X129Q-X249N/R、X24F/L/P-130-206、2
4-130-X206Y、X24F/L/P-X130A-206、X24F/L/P-
130-X206L/Y、X24F/L/P/R-130-X206Y、24-X130
A-X206Y、X24F/L/P-X130A-X206L/Y、X24F/L/P/
R-X130A-X206Y、X24F/L/P-130-209、X24F/L/P-
X130A-209、X24F/L/P-130-X209W、X24F/L/P-X1
30A-X209W、24-130-213、X24F/L/P/R-130-213、
24-X130A-213、24-130-X213A、X24F/L/P/R-X13
0A-213、X24F/L/P/R-130-X213A、24-X130A-X21
3A、X24F/L/P/R-X130A-X213A、24-130-249、X24
F/L/P/R-130-249、24-X130A-249、24-130-X249
N/R、X24F/L/P/R-X130A-249、X24F/L/P/R-130-
X249N/R、24-X130A-X249N/R、X24F/L/P/R-X130
A-X249N/R、24-X206Y-209、24F/L/P-206-209、2
4-X206Y-X209W、X24F/L/P-X206L/Y-209、X24F/
L/P/R-X206Y-209、X24F/L/P-206-X209W、X24F/
L/P-X206L/Y-X209W、X24F/L/P/R-X206Y-X209W
、24-206-213、X24F/L/P/R-206-213、24-X206L/
Y-213、24-206-X213A、X24F/L/P/R-X206L/Y-21
3、X24F/L/P/R-206-X213A、24-X206L/Y-X213A、
X24F/L/P/R-X206L/Y-X213A、24-206-249、24-X
206L/Y-249、X24F/L/P/R-206-249、24-206-X24
9N/R、24-X206L/Y-X249N/R、X24F/L/P/R-X206L
/Y-249、X24F/L/P/R-206-X249N/R、X24F/L/P/R
-X206L/Y-X249N/R、24-209-213、24-X209W-213
、X24F/L/P/R-209-213、24-209-X213A、X24F/L/
P/R-X209W-213、24-X209W-X213A、X24F/L/P/R-
209-X213A、X24F/L/P/R-X209W-X213A、24-209-
249、24-X209W-249、X24F/L/P/R-209-249、24-2
09-X249N/R、X24F/L/P/R-X209W-249、24-X209W
-X249N/R、X24F/L/P/R-209-X249N/R、X24F/L/P
/R-X209W-X249N/R、78-87-129、X78N-87-129、7
8-X87D/R-129、78-87-X129Q、X78N-X87D/R-129
、X78N-87-X129Q、78-X87D/R-X129Q、X78N-X87D
/R-X129Q、78-87-130、X78N-87-130、78-X87D/R
-130、78-87-X130A、X78N-X87D/R-130、X78N-87
-X130A、78-X87D/R-X130A、X78N-X87D/R-X130A
、78-87-206、78-87-X206L/R/Y、X78N-87-206、7
8-X87D/R-206、78-X87D/R-X206L/R/Y、X78N-87
-X206L/R/Y、X78N-X87D/R-206、X78N-X87D/R-X
206L/R/Y、78-87-209、78-87-X209W、X78N-87-2
09、78-X87D/R-209、X78N-X87D/R-209、78-X87D
/R-X209W、X78N-87-X209W、X78N-X87D/R-X209W
、78-87-213、X78N-87-213、78-X87D/R-213、78-
87-X213A、X78N-X87D/R-213、X78N-87-X213A、7
8-X87D/R-X213A、X78N-X87D/R-X213A、78-87-2
49、78-87-X249N/R、X78N-87-249、78-87D/R-24
9、X78N-X87D/R-249、78-X87D/R-X249N/R、X78N
-87-X249N/R、X78N-X87D/R-X249N/R、78-129-X
206R/Y、X78N-129-X206Y、78-X129Q-X206R/Y、X
78N-X129Q-X206Y、78-129-213、X78N-129-213、
78-X129Q-213、78-129-X213A、X78N-X129Q-213
、X78N-129-X213A、78-X129Q-X213A、X78N-X129
Q-X213A、78-129-249、X78N-129-249、78-X129Q
-249、78-129-X249N/R、X78N-X129Q-249、X78N-
129-X249N/R、78-X129Q-X249N/R、X78N-X129Q-
X249N/R、78-130-X206R/Y、X78N-130-X206Y、78
-X130A-X206R/Y、X78N-X130A-X206Y、78-130-2
13、X78N-130-213、78-X130A-213、78-130-X213
A、X78N-X130A-213、X78N-130-X213A、78-X130A
-X213A、X78N-X130A-X213A、78-130-213、X78N-
130-213、78-X130A-213、78-130-X213A、X78N-X
130A-213、X78N-130-X213A、78-X130A-X213A、X
78N-X130A-X213A、78-130-249、X78N-130-249、
78-X130A-249、78-130-X249N/R、X78N-X130A-2
49、X78N-130-X249N/R、78-X130A-X249N/R、X78
N-X130A-X249N/R、78-206-209、X78N-206-209、
78-X206L/Y-209、78-206-X209W、X78N-X206L/Y
-209、X78N-206-X209W、78-X206L/Y-X209W、X78
N-X206L/Y-X209W、78-206-213、X78N-206-213、
78-X206L/Y-213、78-206-X213A、X78N-X206L/Y
-213、X78N-206-X213A、78-X206L/Y-X213A、X78
N-X206L/Y-X213A、78-206-249、78-206-X249R/
N、78-X206L/Y-249、X78N-206-249、X78N-206-X
249N/R、78-X206L/Y-X249N/R、X78N-X206L/Y-2
49、X78N-X206L/Y-X249N/R、78-209-213、78-X2
09W-213、78-209-X213A、X78N-209-213、X78N-X
209W-213、X78N-209-X213A、78-X209W-X213A、X
78N-X209W-X213A、78-209-249、78-X209W-249、
78-209-X249N/R、X78N-209-249、78-X209W-X24
9N/R、X78N-X209W-249、X78N-209-X249N/R、X78
N-X209W-X249N/R、78-213-249、78-X213A-249、
X78N-213-249、78-213-X249N/R、X78N-X213A-2
49、X78N-213-X249N/R、78-X213A-X249N/R、X78
N-X213A-X249N/R、87-129-130、X87D/R-129-13
0、87-X129Q-130、87-129-X130A、X87D/R-X129Q
-130、X87D/R-129-X130A、87-X129Q-X130A、X87
D/R-X129Q-X130A、87-129-206、X87D/R-129-20
6、87-X129Q-206、87-129-X206L/R/Y、X87D/R-X
129Q-206、X87D/R-129-X206L/R/Y、87-X129Q-X
206L/R/Y、X87D/R-X129Q-X206L/R/Y、87-129-2
09、X87D/R-129-209、87-X129Q-209、87-129-X2
09W、X87D/R-X129Q-209、X87D/R-129-X209W、87
-X129Q-X209W、X87D/R-X129Q-X209W、87-129-2
13、X87D/R-129-213、87-X129Q-213、87-129-X2
13A、X87D/R-X129Q-213、X87D/R-129-X213A、87
-X129Q-X213A、X87D/R-X129Q-X213A、87-129-2
49、X87D/R-129-249、87-X129Q-249、87-129-X2
49N/R、X87D/R-X129Q-249、X87D/R-129-X249N/
R、87-X129Q-X249N/R、X87D/R-X129Q-X249N/R、
87-130-206、X87D/R-130-206、87-X130A-206、8
7-130-X206L/R/Y、X87D/R-X130A-206、X87D/R-
130-X206L/R/Y、87-X130A-X206L/R/Y、X87D/R-
X130A-X206L/R/Y、87-130-209、X87D/R-130-20
9、87-X130A-209、87-130-X209W、X87D/R-X130A
-209、X87D/R-130-X209W、87-X130A-X209W、X87
D/R-X130A-X209W、87-130-213、X87D/R-130-21
3、87-X130A-213、87-130-X213A、X87D/R-X130A
-213、X87D/R-130-X213A、87-X130A-X213A、X87
D/R-X130A-X213A、87-130-249、X87D/R-130-24
9、87-X130A-249、87-130-X249N/R、X87D/R-X13
0A-249、X87D/R-130-X249N/R、87-X130A-X249N
/R、X87D/R-X130A-X249N/R、87-206-209、X87D/
R-206-209、87-X206L/Y-209、87-206-X209W、X8
7D/R-X206L/Y-209、X87D/R-206-X209W、87-X20
6L/Y-X209W、X87D/R-X206L/Y-X209W、87-206-2
13、87-X206L/Y-213、87-206-X213A、X87D/R-20
6-213、X87D/R-X206L/Y-213、X87D/R-206-X213
A、87-X206L/Y-X213A、X87D/R-X206L/Y-X213A、
87-206-249、87-X206L/Y-249、87D/R-206-249、
87-209-X249N/R、X87R-206-X249N/R、X87D/R-X
206L/Y-249、87-X206L/Y-X249N/R、X87R-X206L
/Y-X249N/R、87-209-213、X87D/R-209-213、87-
X209W-213、87-209-X213A、X87D/R-X209W-213、
X87D/R-209-X213A、87-X209W-X213A、X87D/R-X
209W-X213A、87-209-249、87-X209W-249、87-20
9-X249N/R、X87D/R-209-249、X87D/R-X209W-24
9、87-X209W-X249N/R、X87R-209-X249N/R、X87D
/R-X209W-X249N/R、87-213-249、87-X213A-249
、X87D/R-213-249、87-213-X249N/R、X87D/R-X2
13A-249、X87D/R-213-X249N/R、87-X213A-X249
N/R、X87D/R-X213A-X249N/R、129-130-X206R/Y
、X129Q-130-X206R/Y、129-X130A-X206R/Y、X12
9Q-X130A-X206R/Y、129-130-213、X129Q-130-2
13、129-X130A-213、129-130-X213A、X129Q-X13
0A-213、X129Q-130-X213A、129-X130A-X213A、X
129Q-X130A-X213A、129-130-249、X129Q-130-2
49、129-X130A-249、129-130-X249N/R、X129Q-X
130A-249、X129Q-130-X249N/R、129-X130A-X24
9N/R、X129Q-X130A-X249N/R、129-X206Y-209、X
129Q-X206Y-209、129-X206Y-X209W、X129Q-X20
6Y-X209W、129-206-213、129-X206L/Y-213、129
-206-X213A、X129Q-206-213、X129Q-X206L/Y-2
13、X129Q-206-X213A、129-X206L/Y-X213A、X12
9Q-X206L/Y-X213A、129-206-249、129-X206L/Y
-249、129-206-X249N/R、X129Q-206-249、X129A
-X206L/Y-249、X129Q-206-X249N/R、129-X206L
/Y-X249N/R、X129Q-X206L/Y-X249N/R、129-209
-213、129-X209W-213、129-209-X213A、X129Q-2
09-213、X129Q-X209W-213、X129Q-209-X213A、1
29-X209W-X213A、X129Q-X209W-X213A、129-209
-249、129-X209W-249、129-209-X249N/R、X129Q
-209-249、X129Q-X209W-249、X129Q-209-X249N
/R、129-X209W-X249N/R、X129Q-X209W-X249N/R
、129-213-249、129-X213A-249、129-213-X249N
/R、X129Q-213-249、X129Q-X213A-249、129-X21
3A-X249R、X129Q-213-X249N/R、X129Q-X213A-X
249N/R、130-X206Y-209、X130A-X206Y-209、130
-X206Y-X209W、X130A-X206Y-X209W、130-206-2
13、130-X206L/Y-213、130-206-X213A、X130A-2
06-213、X130A-X206L/Y-213、X130A-206-X213A
、130-X206L/Y-X213A、X130A-X206L/Y-X213A、1
30-206-249、130-X206L/Y-249、130-206-X249N
/R、X130A-206-249、X130A-X206L/Y-249、X130A
-206-X249N/R、130-X206L/Y-X249N/R、X130A-X
206L/Y-X249N/R、130-209-213、130-X209W-213
、130-209-X213A、X130A-209-213、X130A-X209W
-213、X130A-209-X213A、130-X209W-X213A、X13
0A-X209W-X213A、130-209-249、130-X209W-249
、130-209-X249N/R、X130A-209-249、X130A-X20
9W-249、X130A-209-X249N/R、130-X209W-X249N
/R、X130A-X209W-X249N/R、130-213-249、130-X
213A-249、130-213-X249N/R、X130A-213-249、X
130A-X213A-249、130-X213A-X249R、X130A-213
-X249N/R、X130A-X213A-X249N/R、130-209-249
、130-X209W-249、130-209-X249N/R、X130A-209
-249、X130A-X209W-249、X130A-209-X249N/R、1
30-X209W-X249N/R、X130A-X209W-X249N/R、206
-209-213、206-X209W-213、206-209-X213A、X20
6L/Y-209-213、206-X209W-X213A、X206L/Y-X20
9W-213、X206L/Y-209-X213A、X206L/Y-X209W-X
213A、206-209-249、206-X209W-249、206-209-X
249N/R、X206L/Y-209-249、X206L/Y-X209W-249
、206-X209W-X249N/R、X206L/Y-209-X249N/R、X
206L/Y-X209W-X249N/R、206-213-249、206-X21
3A-249、206-213-X249N/RX206L/Y-213-249、X2
06L/Y-X213A-249、X206L/Y-213-X249N/R、206-
X213A-X249N/R、X206L/Y-X213A-X249N/R、209-
213-249、X209W-213-249、209-X213A-249、209-
213-X249N/R、X209W-X213A-249、X209W-213-X2
49N/R、209-X213A-X249N/R、X209W-X213A-X249
N/Rおよびこれらの組み合わせから選択される、2つ以上の位置でのアミノ酸置換の組
み合わせを含むアミノ酸配列を含む、単離されたスブチリシン変異体を提供する;ここで
、Xは任意のアミノ酸であり、前記変異体はタンパク質分解活性を有し、前記変異体のア
ミノ酸配列は、(i)1、3、8、9、16、20、22、28、42、43、44、5
6、76、77、82、88、89、99、100、101、103、104、108、
116、118、120、124、127、128、147、150、158、159、
160、166、185、188、194、204、210、211、212、215、
216、217、218、222、232、235、241、243、245、246、
248、251、252、254、256、259、261、262、268、270お
よび271;(ii)X1V、X3I/T/V、X8V、X9G、X16T、X20E/
R、X22L/W、X28T、X42I、X43R/S/Y、X44V、X56P、X7
6D、X77D、X82D、X88S、X89H、X99N、X100S、X101F/
G/H/Q/T/V、X103A/D/P、X104I、X108S、X116L/M、
X118A/R/V、X120R、X124M、X127S/T、X128K/L/R、
X147I、X150T、X158E/T/V、X159D、X160Q、X166D/
N、X185Y、X188D、X194D/P、X204D、X210I/L、X211
P、X212D、X215K/V、X216Y、X217K、X218S、X222L/
Q/S、X232V、X235T、X241K、X243S、X245R、X246V、
X248D、X251R、X252I、X254T、X256P、X259G、X261
I/N、X262Q、X268A、X270P/TおよびX271D;または(iii)
A1V、S3I/T/V、I8V、S9G、A16T、G20E/R、T22L/W、V
28T、L42I、N43R/S/Y、I44V、S56P、N76D、N77D、L8
2D、A88S、E89H、S99N、G100S、S101F/G/H/Q/T/V、
S103A/D/P、V104I、A108S、N116L/M、G118A/R/V、
H120R、L124M、G127S/T、S128K/LR、V147I、V150T
、A158E/T/V、G159D、S160Q、S166D/N、N185Y、S18
8D、A194D/P、N204D、P210I/L、G211P、S212D、A21
5K/V、S216Y、L217K、N218S、M222L/Q/S、A232V、K
235T、W241K、N243S、Q245R、I246V、N248D、K251R
、N252I、A254T、S256P、S259G、N261I/N、L262Q、V
268A、A270P/TおよびE271Dから選択される1つ以上の置換をさらに含み
、さらに、前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリ
クエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリ
シンBPN’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変
異体アミノ酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたものであ
る。またさらに他の実施形態は、78-X206A/D/F/G/H/M/N/P/R/
S/Y、X78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y
-206、X78N-X206F/M/Y、X78G-X206D/F/H/M/N/P
/R/Y、X78A/C/E/F/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-
X206A/D/F/G/H/M/N/P/R/S/Y、18-X78N、X18K/R
-X78N、18-X87R、X18K/R-X87R、18-X206L/Y、X18
K/R-X206L/Y、24-X87R、X24F/L/P/R-X87R、24-X
206Y、X24F/L/P-206、X24F/L/P-X206Y、X24F/L/
P-X209W、40-78、X40E-78、40-X78G、X40E-X78G、
40-87、X40E-87、40-X87R、X40E-X87R、40-129、4
0-X129Q、X40E-129、X40E-X129Q、40-130、40-X1
30A、X40E-130、X40E-X130A、40-206、X40E-206、
40-X206Y、X40E-X206Y、X78N-87、X78N-X87D/R、
X78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-87、
X78G-X87D/R/T、X78A/C/E/F/H/I/K/L/M/P/Q/R
/T/V/W/Y-X87R、X78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q
/R/T/V/W/Y-129、X78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/
Q/R/T/V/W/Y-X129Q、X78A/C/E/F/H/I/K/L/M/P
/Q/R/T/V/W/Y-X130A、X78G-X130A/Q、X78A/C/E
/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-130、78-X249
N/R、X78N-249、X78N-X249N/R、87-X206L/Y、X87
D/R-X206L/Y、87-X209W、X87D/R-X209W、87-X21
3A、X87D/R-213、X87D/R-X213A、X87R-X249N/R、
129-X206Y、X129Q-X206Y、129-X249N/R、X129Q-
249、X129Q-X249N/R、130-X206Y、X130A-X206R/
Y、130-X249N/R、X130A-249、X130A-X249N/R、X2
06Y-209、X206Y-X209W、206-X213A、X206L/Y-21
3、X206L/Y-X213A、X206L/Y-249、X206L/Y-X249
N/R、X209W-213、X209W-X213A、X209W-249、X209
W-X249N/R、18-24-78、X18K/R-24-78、18-X24F/
L/P/R-78、18-24-X78N、X18K/R-24-X78N、18-X2
4F/L/P/R-X78N、X18K/R-X24F/L/P/R-78、X18K/
R-X24F/L/P/R-X78N、18-24-87、X18K/R-24-87、
18-X24F/L/P/R-87、18-24-X87D/R、X18K/R-24-
X87D/R、18-X24F/L/P/R-X87D/R、X18K/R-X24F/
L/P/R-87、X18K/R-X24F/L/P/R-X87D/R、18-24-
129、X18K/R-24-129、18-X24F/L/P/R-129、18-2
4-X129Q、X18K/R-X24F/L/P/R-129、X18K/R-24-
X129Q、18-X24F/L/P/R-X129Q、X18K/R-X24F/L/
P/R-X129Q、18-24-130、18-X24F/L/P/R-130、18
-24-X130A、X18K/R-24-130、X18K/R-X24F/L/P/
R-130、X18K/R-24-X130A、18-X24F/L/P/R-X130
A、X18K/R-X24F/L/P/R-X130A、18-24-206、18-2
4-X206L/Y、18-X24F/L/P/R-206、X18K/R-24-20
6、X18K/R-24-X206L/Y、18-X24F/L/P/R-X206L/
Y、X18K/R-X24F/L/P/R-206、X18K/R-X24F/L/P/
R-X206L/Y、18-24-209、18-24-X209W、18-X24F/
L/P/R-209、X18K/R-24-209、X18K/R-24-X209W、
18-X24F/L/P/R-X209W、X18K/R-X24F/L/P/R-20
9、X18K/R-X24F/L/P/R-X209W、18-78-87、18-X7
8N-87、18-78-X87D/R、X18K/R-78-87、X18K/R-X
78N-87、X18K/R-78-X87D/R、18-X78N-X87D/R、X
18K/R-X78N-X87D/R、18-78-129、18-X78N-129、
18-78-X129Q、X18K/R-78-129、X18K/R-X78N-12
9、X18K/R-78-X129Q、18-X78N-X129Q、X18K/R-X
78N-X129Q、18-78-130、18-X78N-130、18-78-X1
30A、X18K/R-78-130、X18K/R-X78N-130、X18K/R
-78-X130A、18-X78N-X130A、X18K/R-X78N-X130
A、18-78-206、18-78-X206L/Y、18-X78N-206、X1
8K/R-78-206、18-X78N-X206L/Y、X18K/R-X78N-
206、X18K/R-78-X206L/Y、X18K/R-X78N-X206L/
Y、18-78-209、18-X78N-209、18-78-X209W、X18K
/R-78-209、X18K/R-78-X209W、18-X78N-X209W、
X18K/R-X78N-209、X18K/R-X78N-X209W、18-78-
213、18-X78N-213、18-78-X213A、X18K/R-78-21
3、18-X78N-X213A、X18K/R-X78N-213、X18K/R-7
8-X213A、X18K/R-X78N-X213A、18-78-249、18-7
8-X249N/R、18-X78N-249、X18K/R-78-249、18-X
78N-X249N/R、X18K/R-X78N-249、X18K/R-78-X2
49N/R、X18K/R-X78N-X249N/R、18-87-129、X18K
/R-87-129、18-X87D/R-129、18-87-X129Q、18-X
87D/R-X129Q、X18K/R-87-X129Q、X18K/R-X87D/
R-129、X18K/R-X87D/R-X129Q、18-87-130、X18K
/R-87-130、18-X87D/R-130、18-87-X130A、18-X
87D/R-X130A、X18K/R-87-X130A、X18K/R-X87D/
R-130、X18K/R-X87D/R-X130A、18-87-206、X18K
/R-87-206、18-X87D/R-206、18-87-X206L/Y、18
-X87D/R-X206L/Y、X18K/R-87-X206L/Y、X18K/R
-X87D/R-206、X18K/R-X87D/R-X206L/Y、18-87-
209、X18K/R-87-209、18-X87D/R-209、18-87-X2
09W、18-X87D/R-X209W、X18K/R-X87D/R-209、X1
8K/R-87-X209W、X18K/R-X87D/R-X209W、18-X87
D/R-213、18-87-X213A、18-X87D/R-X213A、X18K
/R-X87D/R-213、X18K/R-87-X213A、X18K/R-X87
D/R-X213A、18-87-249、X18K/R-87-249、18-X87
D/R-249、18-87-X249N/R、18-X87D/R-249N/R、1
8K/R-X87D/R-249、18K/R-87-X249N/R、18K/R-X
87D/R-X249N/R、18-129-130、X18K/R-129-130、
18-X129Q-130、18-129-X130A、X18K/R-X129Q-1
30、X18K/R-129-X130A、18-X129Q-X130A、X18K/
R-X129Q-X130A、18-129-206、X18K/R-129-206、
18-X129Q-206、18-129-X206L/Y、X18K/R-X129Q
-206、X18K/R-129-X206L/Y、18-X129Q-X206L/Y
、X18K/R-X129Q-X206L/Y、18-129-209、X18K/R-
129-209、18-X129Q-209、18-129-X209W、X18K/R
-X129Q-209、X18K/R-129-X209W、18-X129Q-X20
9W、X18K/R-X129Q-X209W、18-129-213、X18K/R-
129-213、18-X129Q-213、18-129-X213A、X18K/R
-X129Q-213、X18K/R-129-X213A、18-X129Q-X21
3A、X18K/R-X129Q-X213A、18-129-249、X18K/R-
129-249、18-X129Q-249、18-129-X249N/R、X18K
/R-X129Q-249、X18K/R-129-X249N/R、18-X129Q
-X249N/R、X18K/R-X129Q-X249N/R、18-130-206
、X18K/R-130-206、18-X130A-206、18-130-X206
L/Y、X18K/R-X130A-206、X18K/R-130-X206L/Y、
18-X130A-X206L/Y、X18K/R-X130A-X206L/Y、18
-130-209、X18K/R-130-209、18-X130A-209、18-
130-X209W、X18K/R-X130A-209、X18K/R-130-X2
09W、18-X130A-X209W、X18K/R-X130A-X209W、18
-130-213、X18K/R-130-213、18-X130A-213、18-
130-X213A、X18K/R-X130A-213、X18K/R-130-X2
13A、18-X130A-X213A、X18K/R-X130A-X213A、18
-130-249、X18K/R-130-249、18-X130A-249、18-
130-X249N/R、X18K/R-X130A-249、X18K/R-130-
X249N/R、18-X130A-X249N/R、X18K/R-X130A-X2
49N/R、18-206-209、18-206-X209W、18-X206L/Y
-209、18K/R-206-209、18-X206L/Y-X209W、X18K
/R-X206L/Y-209、X18K/R-206-X209W、X18K/R-X
206L/Y-X209W、18-206-213、X18K/R-206-213、1
8-206L/Y-213、18-206-X213A、X18K/R-X206L/Y
-213、X18K/R-206-X213A、18-X206L/Y-X213A、X
18K/R-X206L/Y-X213A、18-206-249、X18K/R-20
6-249、18-206L/Y-249、18-206-X249N/R、X18K/
R-X206L/Y-249、X18K/R-206-X249N/R、18-X206
L/Y-X249N/R、X18K/R-X206L/Y-X249N/R、18-20
9-213、18-X209W-213、X18K/R-209-213、18-209
-X213A、18-X209W-X213A、X18K/R-X209W-213、X
18K/R-209-X213A、X18K/R-X209W-X213A、18-20
9-249、18-X209W-249、X18K/R-209-249、18-209
-X249N/R、18-X209W-X249N/R、18K/R-X209W-24
9、X18K/R-209-X249N/R、X18K/R-X209W-X249N/
R、18-213-X249N/R、X18K/R-X213A-249、X18K/R
-213-X249N/R、18-X213A-X249N/R、X18K/R-X21
3A-X249N/R、24-78-87、24-78-X87D/R、24-X78N
-87、X24F/L/P/R-78-87、24-X78N-X87D/R、X24R
/P/F-78-X87D/R、X24F/L/P/R-X78N-87、X24R/P
/F-X78N-X87D/R、X24F/L/P-78-129、X24F/L/P-
X78N-129、X24F/L/P-78-X129Q、X24F/L/P-X78N
-X129Q、X24F/L/P-78-130、X24F/L/P-X78N-130
、X24F/L/P-78-X130A、X24F/L/P-X78N-X130A、2
4-78-X206Y、X24F/L/P-78-206、24-X78N-X206Y
、X24F/L/P-X78N-206、X24F/L/P-78-X206L/Y、X
24F/L/P-X78N-X206L/Y、X24F/L/P-78-209、X24
F/L/P-X78N-209、X24F/L/P-78-X209W、X24F/L/
P-X78N-X209W、24-78-213、X24F/L/P/R-78-213
、24-X78N-213、24-78-X213A、X24F/L/P/R-X78N
-213、X24F/L/P/R-78-X213A、24-X78N-X213A、X
24F/L/P/R-X78N-X213A、24-78-X249N/R、24-X7
8N-249、24-X78N-X249N/R、X24F/L/P/R-X78N-2
49、X24F/L/P/R-78-X249N/R、X24F/L/P/R-X78N
-X249N/R、24-87-129、X24F/L/P/R-87-129、24-
X87D/R-129、24-87-X129Q、X24F/L/P/R-X87D/R
-129、X24F/L/P/R-87-X129Q、24-X87D/R-X129Q
、X24F/L/P/R-X87D/R-X129Q、24-87-130、X24F/
L/P/R-87-130、24-X87D/R-130、24-87-X130A、X
24F/L/P/R-X87D/R-130、X24F/L/P/R-87-X130A
、24-X87D/R-X130A、X24F/L/P/R-X87D/R-X130A
、24-87-X206L/Y、24-X87R-206、X24F/L/P/R-87
-206、24-X87D/R-X206L/Y、X24F/L/P/R-X87D/R
-206、X24F/L/P/R-87-X206L/Y、X24F/L/P/R-X8
7D/R-X206L/Y、24-87-X209W、X24F/L/P/R-87-X
209W、24-87-X209W、24-87D/R-X209W、X24F/L/P
/R-X87D/R-X209W、24-X87D/R-213、24-87-X213
A、24-X87D/R-X213A、X24F/L/P/R-X87D/R-213、
X24F/L/P/R-87-X213A、X24F/L/P/R-X87D/R-X2
13A、24-87-249、X24F/L/P/R-87-249、24-X87D/
R-249、24-87-X249N/R、X24F/L/P/R-X87D/R-24
9、X24F/L/P/R-87-X249N/R、24-X87D/R-X249N/
R、X24F/L/P/R-X87D/R-X249N/R、X24F/L/P-129
-130、X24F/L/P-X129Q-130、X24F/L/P-129-X13
0A、X24F/L/P-X129Q-X130A、X24F/L/P-129-206
、24-129-X206Y、X24F/L/P-X129Q-206、X24F/L/
P-129-X206Y、24-X129Q-X206Y、X24F/L/P-X129
Q-X206L/Y、X24F/L/P/R-X129Q-X206Y、X24F/L/
P-129-209、X24F/L/P-X129Q-209、X24F/L/P-12
9-X209W、X24F/L/P-X129Q-X209W、24-129-213、
X24F/L/P/R-129-213、24-X129Q-213、24-129-X
213A、X24F/L/P/R-X129Q-213、X24F/L/P/R-129
-X213A、24-X129Q-X213A、X24F/L/P/R-X129Q-X
213A、24-129-249、X24F/L/P/R-129-249、24-X1
29Q-249、24-129-X249N/R、X24F/L/P/R-X129Q-
249、X24F/L/P/R-129-X249N/R、24-X129Q-X249
N/R、X24F/L/P/R-X129Q-X249N/R、X24F/L/P-13
0-206、24-130-X206Y、X24F/L/P-X130A-206、X2
4F/L/P-130-X206L/Y、X24F/L/P/R-130-X206Y、
24-X130A-X206Y、X24F/L/P-X130A-X206L/Y、X2
4F/L/P/R-X130A-X206Y、X24F/L/P-130-209、X2
4F/L/P-X130A-209、X24F/L/P-130-X209W、X24F
/L/P-X130A-X209W、24-130-213、X24F/L/P/R-1
30-213、24-X130A-213、24-130-X213A、X24F/L/
P/R-X130A-213、X24F/L/P/R-130-X213A、24-X1
30A-X213A、X24F/L/P/R-X130A-X213A、24-130-
249、X24F/L/P/R-130-249、24-X130A-249、24-1
30-X249N/R、X24F/L/P/R-X130A-249、X24F/L/P
/R-130-X249N/R、24-X130A-X249N/R、X24F/L/P
/R-X130A-X249N/R、24-X206Y-209、24F/L/P-20
6-209、24-X206Y-X209W、X24F/L/P-X206L/Y-20
9、X24F/L/P/R-X206Y-209、X24F/L/P-206-X209
W、X24F/L/P-X206L/Y-X209W、X24F/L/P/R-X206
Y-X209W、24-206-213、X24F/L/P/R-206-213、24
-X206L/Y-213、24-206-X213A、X24F/L/P/R-X20
6L/Y-213、X24F/L/P/R-206-X213A、24-X206L/Y
-X213A、X24F/L/P/R-X206L/Y-X213A、24-206-2
49、24-X206L/Y-249、X24F/L/P/R-206-249、24-
206-X249N/R、24-X206L/Y-X249N/R、X24F/L/P/
R-X206L/Y-249、X24F/L/P/R-206-X249N/R、X24
F/L/P/R-X206L/Y-X249N/R、24-209-213、24-X2
09W-213、X24F/L/P/R-209-213、24-209-X213A、
X24F/L/P/R-X209W-213、24-X209W-X213A、X24F
/L/P/R-209-X213A、X24F/L/P/R-X209W-X213A、
24-209-249、24-X209W-249、X24F/L/P/R-209-2
49、24-209-X249N/R、X24F/L/P/R-X209W-249、2
4-X209W-X249N/R、X24F/L/P/R-209-X249N/R、X
24F/L/P/R-X209W-X249N/R、78-87-129、X78N-8
7-129、78-X87D/R-129、78-87-X129Q、X78N-X87
D/R-129、X78N-87-X129Q、78-X87D/R-X129Q、X7
8N-X87D/R-X129Q、78-87-130、X78N-87-130、78
-X87D/R-130、78-87-X130A、X78N-X87D/R-130、
X78N-87-X130A、78-X87D/R-X130A、X78N-X87D/
R-X130A、78-87-206、78-87-X206L/R/Y、X78N-8
7-206、78-X87D/R-206、78-X87D/R-X206L/R/Y、
X78N-87-X206L/R/Y、X78N-X87D/R-206、X78N-X
87D/R-X206L/R/Y、78-87-209、78-87-X209W、X7
8N-87-209、78-X87D/R-209、X78N-X87D/R-209、
78-X87D/R-X209W、X78N-87-X209W、X78N-X87D/
R-X209W、78-87-213、X78N-87-213、78-X87D/R-
213、78-87-X213A、X78N-X87D/R-213、X78N-87-
X213A、78-X87D/R-X213A、X78N-X87D/R-X213A、
78-87-249、78-87-X249N/R、X78N-87-249、78-8
7D/R-249、X78N-X87D/R-249、78-X87D/R-X249N
/R、X78N-87-X249N/R、X78N-X87D/R-X249N/R、7
8-129-X206R/Y、X78N-129-X206Y、78-X129Q-X2
06R/Y、X78N-X129Q-X206Y、78-129-213、X78N-1
29-213、78-X129Q-213、78-129-X213A、X78N-X1
29Q-213、X78N-129-X213A、78-X129Q-X213A、X7
8N-X129Q-X213A、78-129-249、X78N-129-249、7
8-X129Q-249、78-129-X249N/R、X78N-X129Q-24
9、X78N-129-X249N/R、78-X129Q-X249N/R、X78N
-X129Q-X249N/R、78-130-X206R/Y、X78N-130-X
206Y、78-X130A-X206R/Y、X78N-X130A-X206Y、7
8-130-213、X78N-130-213、78-X130A-213、78-1
30-X213A、X78N-X130A-213、X78N-130-X213A、7
8-X130A-X213A、X78N-X130A-X213A、78-130-21
3、X78N-130-213、78-X130A-213、78-130-X213A
、X78N-X130A-213、X78N-130-X213A、78-X130A-
X213A、X78N-X130A-X213A、78-130-249、X78N-1
30-249、78-X130A-249、78-130-X249N/R、X78N-
X130A-249、X78N-130-X249N/R、78-X130A-X249
N/R、X78N-X130A-X249N/R、78-206-209、X78N-2
06-209、78-X206L/Y-209、78-206-X209W、X78N-
X206L/Y-209、X78N-206-X209W、78-X206L/Y-X2
09W、X78N-X206L/Y-X209W、78-206-213、X78N-2
06-213、78-X206L/Y-213、78-206-X213A、X78N-
X206L/Y-213、X78N-206-X213A、78-X206L/Y-X2
13A、X78N-X206L/Y-X213A、78-206-249、78-206
-X249R/N、78-X206L/Y-249、X78N-206-249、X78
N-206-X249N/R、78-X206L/Y-X249N/R、X78N-X2
06L/Y-249、X78N-X206L/Y-X249N/R、78-209-21
3、78-X209W-213、78-209-X213A、X78N-209-213
、X78N-X209W-213、X78N-209-X213A、78-X209W-
X213A、X78N-X209W-X213A、78-209-249、78-X20
9W-249、78-209-X249N/R、X78N-209-249、78-X2
09W-X249N/R、X78N-X209W-249、X78N-209-X249
N/R、X78N-X209W-X249N/R、78-213-249、78-X21
3A-249、X78N-213-249、78-213-X249N/R、X78N-
X213A-249、X78N-213-X249N/R、78-X213A-X249
N/R、X78N-X213A-X249N/R、87-129-130、X87D/R
-129-130、87-X129Q-130、87-129-X130A、X87D/
R-X129Q-130、X87D/R-129-X130A、87-X129Q-X1
30A、X87D/R-X129Q-X130A、87-129-206、X87D/R
-129-206、87-X129Q-206、87-129-X206L/R/Y、X
87D/R-X129Q-206、X87D/R-129-X206L/R/Y、87-
X129Q-X206L/R/Y、X87D/R-X129Q-X206L/R/Y、8
7-129-209、X87D/R-129-209、87-X129Q-209、87
-129-X209W、X87D/R-X129Q-209、X87D/R-129-X
209W、87-X129Q-X209W、X87D/R-X129Q-X209W、8
7-129-213、X87D/R-129-213、87-X129Q-213、87
-129-X213A、X87D/R-X129Q-213、X87D/R-129-X
213A、87-X129Q-X213A、X87D/R-X129Q-X213A、8
7-129-249、X87D/R-129-249、87-X129Q-249、87
-129-X249N/R、X87D/R-X129Q-249、X87D/R-129
-X249N/R、87-X129Q-X249N/R、X87D/R-X129Q-X
249N/R、87-130-206、X87D/R-130-206、87-X130
A-206、87-130-X206L/R/Y、X87D/R-X130A-206、
X87D/R-130-X206L/R/Y、87-X130A-X206L/R/Y、
X87D/R-X130A-X206L/R/Y、87-130-209、X87D/R
-130-209、87-X130A-209、87-130-X209W、X87D/
R-X130A-209、X87D/R-130-X209W、87-X130A-X2
09W、X87D/R-X130A-X209W、87-130-213、X87D/R
-130-213、87-X130A-213、87-130-X213A、X87D/
R-X130A-213、X87D/R-130-X213A、87-X130A-X2
13A、X87D/R-X130A-X213A、87-130-249、X87D/R
-130-249、87-X130A-249、87-130-X249N/R、X87
D/R-X130A-249、X87D/R-130-X249N/R、87-X130
A-X249N/R、X87D/R-X130A-X249N/R、87-206-20
9、X87D/R-206-209、87-X206L/Y-209、87-206-X
209W、X87D/R-X206L/Y-209、X87D/R-206-X209W
、87-X206L/Y-X209W、X87D/R-X206L/Y-X209W、8
7-206-213、87-X206L/Y-213、87-206-X213A、X8
7D/R-206-213、X87D/R-X206L/Y-213、X87D/R-2
06-X213A、87-X206L/Y-X213A、X87D/R-X206L/Y
-X213A、87-206-249、87-X206L/Y-249、87D/R-2
06-249、87-209-X249N/R、X87R-206-X249N/R、X
87D/R-X206L/Y-249、87-X206L/Y-X249N/R、X87
R-X206L/Y-X249N/R、87-209-213、X87D/R-209-
213、87-X209W-213、87-209-X213A、X87D/R-X20
9W-213、X87D/R-209-X213A、87-X209W-X213A、X
87D/R-X209W-X213A、87-209-249、87-X209W-24
9、87-209-X249N/R、X87D/R-209-249、X87D/R-X
209W-249、87-X209W-X249N/R、X87R-209-X249N
/R、X87D/R-X209W-X249N/R、87-213-249、87-X2
13A-249、X87D/R-213-249、87-213-X249N/R、X8
7D/R-X213A-249、X87D/R-213-X249N/R、87-X21
3A-X249N/R、X87D/R-X213A-X249N/R、129-130-
X206R/Y、X129Q-130-X206R/Y、129-X130A-X206
R/Y、X129Q-X130A-X206R/Y、129-130-213、X129
Q-130-213、129-X130A-213、129-130-X213A、X1
29Q-X130A-213、X129Q-130-X213A、129-X130A-
X213A、X129Q-X130A-X213A、129-130-249、X129
Q-130-249、129-X130A-249、129-130-X249N/R、
X129Q-X130A-249、X129Q-130-X249N/R、129-X1
30A-X249N/R、X129Q-X130A-X249N/R、129-X206
Y-209、X129Q-X206Y-209、129-X206Y-X209W、X1
29Q-X206Y-X209W、129-206-213、129-X206L/Y-
213、129-206-X213A、X129Q-206-213、X129Q-X2
06L/Y-213、X129Q-206-X213A、129-X206L/Y-X2
13A、X129Q-X206L/Y-X213A、129-206-249、129-
X206L/Y-249、129-206-X249N/R、X129Q-206-24
9、X129A-X206L/Y-249、X129Q-206-X249N/R、12
9-X206L/Y-X249N/R、X129Q-X206L/Y-X249N/R、
129-209-213、129-X209W-213、129-209-X213A、
X129Q-209-213、X129Q-X209W-213、X129Q-209-
X213A、129-X209W-X213A、X129Q-X209W-X213A、
129-209-249、129-X209W-249、129-209-X249N/
R、X129Q-209-249、X129Q-X209W-249、X129Q-20
9-X249N/R、129-X209W-X249N/R、X129Q-X209W-
X249N/R、129-213-249、129-X213A-249、129-21
3-X249N/R、X129Q-213-249、X129Q-X213A-249、
129-X213A-X249R、X129Q-213-X249N/R、X129Q-
X213A-X249N/R、130-X206Y-209、X130A-X206Y-
209、130-X206Y-X209W、X130A-X206Y-X209W、13
0-206-213、130-X206L/Y-213、130-206-X213A、
X130A-206-213、X130A-X206L/Y-213、X130A-20
6-X213A、130-X206L/Y-X213A、X130A-X206L/Y-
X213A、130-206-249、130-X206L/Y-249、130-20
6-X249N/R、X130A-206-249、X130A-X206L/Y-24
9、X130A-206-X249N/R、130-X206L/Y-X249N/R、
X130A-X206L/Y-X249N/R、130-209-213、130-X2
09W-213、130-209-X213A、X130A-209-213、X130
A-X209W-213、X130A-209-X213A、130-X209W-X2
13A、X130A-X209W-X213A、130-209-249、130-X2
09W-249、130-209-X249N/R、X130A-209-249、X1
30A-X209W-249、X130A-209-X249N/R、130-X209
W-X249N/R、X130A-X209W-X249N/R、130-213-24
9、130-X213A-249、130-213-X249N/R、X130A-21
3-249、X130A-X213A-249、130-X213A-X249R、X1
30A-213-X249N/R、X130A-X213A-X249N/R、130-
209-249、130-X209W-249、130-209-X249N/R、X1
30A-209-249、X130A-X209W-249、X130A-209-X2
49N/R、130-X209W-X249N/R、X130A-X209W-X249
N/R、206-209-213、206-X209W-213、206-209-X2
13A、X206L/Y-209-213、206-X209W-X213A、X206
L/Y-X209W-213、X206L/Y-209-X213A、X206L/Y-
X209W-X213A、206-209-249、206-X209W-249、20
6-209-X249N/R、X206L/Y-209-249、X206L/Y-X2
09W-249、206-X209W-X249N/R、X206L/Y-209-X2
49N/R、X206L/Y-X209W-X249N/R、206-213-249、
206-X213A-249、206-213-X249N/RX206L/Y-213
-249、X206L/Y-X213A-249、X206L/Y-213-X249N
/R、206-X213A-X249N/R、X206L/Y-X213A-X249N
/R、209-213-249、X209W-213-249、209-X213A-2
49、209-213-X249N/R、X209W-X213A-249、X209W
-213-X249N/R、209-X213A-X249N/R、X209W-X21
3A-X249N/Rおよびこれらの組み合わせから選択される、2つ以上の位置でのア
ミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含む、単離されたスブチリシン変異体を提
供する;ここで、Xは任意のアミノ酸であり、前記変異体はタンパク質分解活性を有して
おり、前記変異体のアミノ酸配列は、(i)3、8、22、28、43、76、89、9
9、101、103、104、108、116、118、124、127、128、14
7、150、158、159、166、188、194、210、211、212、21
5、217、222、232、235、243、245、246、261、262、27
0および271;(ii)X3T/V、X8V、X22W、X28T、X43S、X76
D、X89H、X99N、X101F/G/V、X103A/D/P、X104I、X1
08S、X116M、X118R、X124M、X127T、X128L、X147I、
X150T、X158E/T、X159D、X166D、X188D、X194D/P、
X210I/L、X211P、X212D、X215V、X217K、X222Q/S、
X232V、X235T、X243S、X245R、X246V、X261I、X262
Q、X270TおよびX271D;または(iii)S3T/V、I8V、T22W、V
28T、N43S、N76D、E89H、S99N、S101F/G/V、S103A/
D/P、V104I、A108S、N116M、G118R、L124M、G127T、
S128L、V147I、V150T、A158E/T、G159D、S166D、S1
88D、A194D/P、P210I/L、G211P、S212D、A215V、L2
17K、M222Q/S、A232V、K235T、N243S、Q245R、I246
V、N261I、L262Q、A270TおよびE271Dから選択される1つ以上の置
換をさらに含み、さらに、前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチ
ルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefacie
ns)スブチリシンBPN’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされて
おり、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定
されたものである。またさらに他の実施形態は、78-X206A/D/F/G/H/M
/N/P/R/S/Y、X78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/
T/V/W/Y-206、X78N-X206F/M/Y、X78G-X206D/F/
H/M/N/P/R/Y、X78A/C/E/F/H/I/K/L/M/P/Q/R/T
/V/W/Y-X206A/D/F/G/H/M/N/P/R/S/Y、18-X78N
、X18K/R-X78N、18-X87R、X18K/R-X87R、18-X206
L/Y、X18K/R-X206L/Y、24-X87R、X24F/L/P/R-X8
7R、24-X206Y、X24F/L/P-206、X24F/L/P-X206Y、
X24F/L/P-X209W、40-78、X40E-78、40-X78G、X40
E-X78G、40-87、X40E-87、40-X87R、X40E-X87R、4
0-129、40-X129Q、X40E-129、X40E-X129Q、40-13
0、40-X130A、X40E-130、X40E-X130A、40-206、X4
0E-206、40-X206Y、X40E-X206Y、X78N-87、X78N-
X87D/R、X78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/
W/Y-87、X78G-X87D/R/T、X78A/C/E/F/H/I/K/L/
M/P/Q/R/T/V/W/Y-X87R、X78A/C/E/F/G/H/I/K/
L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-129、X78A/C/E/F/G/H/I/K
/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-X129Q、X78A/C/E/F/H/I/
K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-X130A、X78G-X130A/Q、X
78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-130、
78-X249N/R、X78N-249、X78N-X249N/R、87-X206
L/Y、X87D/R-X206L/Y、87-X209W、X87D/R-X209W
、87-X213A、X87D/R-213、X87D/R-X213A、X87R-X
249N/R、129-X206Y、X129Q-X206Y、129-X249N/R
、X129Q-249、X129Q-X249N/R、130-X206Y、X130A
-X206R/Y、130-X249N/R、X130A-249、X130A-X24
9N/R、X206Y-209、X206Y-X209W、206-X213A、X20
6L/Y-213、X206L/Y-X213A、X206L/Y-249、X206L
/Y-X249N/R、X209W-213、X209W-X213A、X209W-2
49、X209W-X249N/R、18-24-78、X18K/R-24-78、1
8-X24F/L/P/R-78、18-24-X78N、X18K/R-24-X78
N、18-X24F/L/P/R-X78N、X18K/R-X24F/L/P/R-7
8、X18K/R-X24F/L/P/R-X78N、18-24-87、X18K/R
-24-87、18-X24F/L/P/R-87、18-24-X87D/R、X18
K/R-24-X87D/R、18-X24F/L/P/R-X87D/R、X18K/
R-X24F/L/P/R-87、X18K/R-X24F/L/P/R-X87D/R
、18-24-129、X18K/R-24-129、18-X24F/L/P/R-1
29、18-24-X129Q、X18K/R-X24F/L/P/R-129、X18
K/R-24-X129Q、18-X24F/L/P/R-X129Q、X18K/R-
X24F/L/P/R-X129Q、18-24-130、18-X24F/L/P/R
-130、18-24-X130A、X18K/R-24-130、X18K/R-X2
4F/L/P/R-130、X18K/R-24-X130A、18-X24F/L/P
/R-X130A、X18K/R-X24F/L/P/R-X130A、18-24-2
06、18-24-X206L/Y、18-X24F/L/P/R-206、X18K/
R-24-206、X18K/R-24-X206L/Y、18-X24F/L/P/R
-X206L/Y、X18K/R-X24F/L/P/R-206、X18K/R-X2
4F/L/P/R-X206L/Y、18-24-209、18-24-X209W、1
8-X24F/L/P/R-209、X18K/R-24-209、X18K/R-24
-X209W、18-X24F/L/P/R-X209W、X18K/R-X24F/L
/P/R-209、X18K/R-X24F/L/P/R-X209W、18-78-8
7、18-X78N-87、18-78-X87D/R、X18K/R-78-87、X
18K/R-X78N-87、X18K/R-78-X87D/R、18-X78N-X
87D/R、X18K/R-X78N-X87D/R、18-78-129、18-X7
8N-129、18-78-X129Q、X18K/R-78-129、X18K/R-
X78N-129、X18K/R-78-X129Q、18-X78N-X129Q、X
18K/R-X78N-X129Q、18-78-130、18-X78N-130、1
8-78-X130A、X18K/R-78-130、X18K/R-X78N-130
、X18K/R-78-X130A、18-X78N-X130A、X18K/R-X7
8N-X130A、18-78-206、18-78-X206L/Y、18-X78N
-206、X18K/R-78-206、18-X78N-X206L/Y、X18K/
R-X78N-206、X18K/R-78-X206L/Y、X18K/R-X78N
-X206L/Y、18-78-209、18-X78N-209、18-78-X20
9W、X18K/R-78-209、X18K/R-78-X209W、18-X78N
-X209W、X18K/R-X78N-209、X18K/R-X78N-X209W
、18-78-213、18-X78N-213、18-78-X213A、X18K/
R-78-213、18-X78N-X213A、X18K/R-X78N-213、X
18K/R-78-X213A、X18K/R-X78N-X213A、18-78-2
49、18-78-X249N/R、18-X78N-249、X18K/R-78-2
49、18-X78N-X249N/R、X18K/R-X78N-249、X18K/
R-78-X249N/R、X18K/R-X78N-X249N/R、18-87-1
29、X18K/R-87-129、18-X87D/R-129、18-87-X12
9Q、18-X87D/R-X129Q、X18K/R-87-X129Q、X18K/
R-X87D/R-129、X18K/R-X87D/R-X129Q、18-87-1
30、X18K/R-87-130、18-X87D/R-130、18-87-X13
0A、18-X87D/R-X130A、X18K/R-87-X130A、X18K/
R-X87D/R-130、X18K/R-X87D/R-X130A、18-87-2
06、X18K/R-87-206、18-X87D/R-206、18-87-X20
6L/Y、18-X87D/R-X206L/Y、X18K/R-87-X206L/Y
、X18K/R-X87D/R-206、X18K/R-X87D/R-X206L/Y
、18-87-209、X18K/R-87-209、18-X87D/R-209、1
8-87-X209W、18-X87D/R-X209W、X18K/R-X87D/R
-209、X18K/R-87-X209W、X18K/R-X87D/R-X209W
、18-X87D/R-213、18-87-X213A、18-X87D/R-X21
3A、X18K/R-X87D/R-213、X18K/R-87-X213A、X18
K/R-X87D/R-X213A、18-87-249、X18K/R-87-249
、18-X87D/R-249、18-87-X249N/R、18-X87D/R-2
49N/R、18K/R-X87D/R-249、18K/R-87-X249N/R、
18K/R-X87D/R-X249N/R、18-129-130、X18K/R-1
29-130、18-X129Q-130、18-129-X130A、X18K/R-
X129Q-130、X18K/R-129-X130A、18-X129Q-X130
A、X18K/R-X129Q-X130A、18-129-206、X18K/R-1
29-206、18-X129Q-206、18-129-X206L/Y、X18K/
R-X129Q-206、X18K/R-129-X206L/Y、18-X129Q-
X206L/Y、X18K/R-X129Q-X206L/Y、18-129-209、
X18K/R-129-209、18-X129Q-209、18-129-X209W
、X18K/R-X129Q-209、X18K/R-129-X209W、18-X1
29Q-X209W、X18K/R-X129Q-X209W、18-129-213、
X18K/R-129-213、18-X129Q-213、18-129-X213A
、X18K/R-X129Q-213、X18K/R-129-X213A、18-X1
29Q-X213A、X18K/R-X129Q-X213A、18-129-249、
X18K/R-129-249、18-X129Q-249、18-129-X249N
/R、X18K/R-X129Q-249、X18K/R-129-X249N/R、1
8-X129Q-X249N/R、X18K/R-X129Q-X249N/R、18-
130-206、X18K/R-130-206、18-X130A-206、18-1
30-X206L/Y、X18K/R-X130A-206、X18K/R-130-X
206L/Y、18-X130A-X206L/Y、X18K/R-X130A-X20
6L/Y、18-130-209、X18K/R-130-209、18-X130A-
209、18-130-X209W、X18K/R-X130A-209、X18K/R
-130-X209W、18-X130A-X209W、X18K/R-X130A-X
209W、18-130-213、X18K/R-130-213、18-X130A-
213、18-130-X213A、X18K/R-X130A-213、X18K/R
-130-X213A、18-X130A-X213A、X18K/R-X130A-X
213A、18-130-249、X18K/R-130-249、18-X130A-
249、18-130-X249N/R、X18K/R-X130A-249、X18K
/R-130-X249N/R、18-X130A-X249N/R、X18K/R-X
130A-X249N/R、18-206-209、18-206-X209W、18-
X206L/Y-209、18K/R-206-209、18-X206L/Y-X20
9W、X18K/R-X206L/Y-209、X18K/R-206-X209W、X
18K/R-X206L/Y-X209W、18-206-213、X18K/R-20
6-213、18-206L/Y-213、18-206-X213A、X18K/R-
X206L/Y-213、X18K/R-206-X213A、18-X206L/Y-
X213A、X18K/R-X206L/Y-X213A、18-206-249、X1
8K/R-206-249、18-206L/Y-249、18-206-X249N/
R、X18K/R-X206L/Y-249、X18K/R-206-X249N/R、
18-X206L/Y-X249N/R、X18K/R-X206L/Y-X249N/
R、18-209-213、18-X209W-213、X18K/R-209-213
、18-209-X213A、18-X209W-X213A、X18K/R-X209
W-213、X18K/R-209-X213A、X18K/R-X209W-X213
A、18-209-249、18-X209W-249、X18K/R-209-249
、18-209-X249N/R、18-X209W-X249N/R、18K/R-X
209W-249、X18K/R-209-X249N/R、X18K/R-X209W
-X249N/R、18-213-X249N/R、X18K/R-X213A-249
、X18K/R-213-X249N/R、18-X213A-X249N/R、X18
K/R-X213A-X249N/R、24-78-87、24-78-X87D/R、
24-X78N-87、X24F/L/P/R-78-87、24-X78N-X87D
/R、X24R/P/F-78-X87D/R、X24F/L/P/R-X78N-87
、X24R/P/F-X78N-X87D/R、X24F/L/P-78-129、X2
4F/L/P-X78N-129、X24F/L/P-78-X129Q、X24F/L
/P-X78N-X129Q、X24F/L/P-78-130、X24F/L/P-X
78N-130、X24F/L/P-78-X130A、X24F/L/P-X78N-
X130A、24-78-X206Y、X24F/L/P-78-206、24-X78
N-X206Y、X24F/L/P-X78N-206、X24F/L/P-78-X2
06L/Y、X24F/L/P-X78N-X206L/Y、X24F/L/P-78-
209、X24F/L/P-X78N-209、X24F/L/P-78-X209W、
X24F/L/P-X78N-X209W、24-78-213、X24F/L/P/R
-78-213、24-X78N-213、24-78-X213A、X24F/L/P
/R-X78N-213、X24F/L/P/R-78-X213A、24-X78N-
X213A、X24F/L/P/R-X78N-X213A、24-78-X249N/
R、24-X78N-249、24-X78N-X249N/R、X24F/L/P/R
-X78N-249、X24F/L/P/R-78-X249N/R、X24F/L/P
/R-X78N-X249N/R、24-87-129、X24F/L/P/R-87-
129、24-X87D/R-129、24-87-X129Q、X24F/L/P/R
-X87D/R-129、X24F/L/P/R-87-X129Q、24-X87D/
R-X129Q、X24F/L/P/R-X87D/R-X129Q、24-87-13
0、X24F/L/P/R-87-130、24-X87D/R-130、24-87-
X130A、X24F/L/P/R-X87D/R-130、X24F/L/P/R-8
7-X130A、24-X87D/R-X130A、X24F/L/P/R-X87D/
R-X130A、24-87-X206L/Y、24-X87R-206、X24F/L
/P/R-87-206、24-X87D/R-X206L/Y、X24F/L/P/R
-X87D/R-206、X24F/L/P/R-87-X206L/Y、X24F/L
/P/R-X87D/R-X206L/Y、24-87-X209W、X24F/L/P
/R-87-X209W、24-87-X209W、24-87D/R-X209W、X
24F/L/P/R-X87D/R-X209W、24-X87D/R-213、24-
87-X213A、24-X87D/R-X213A、X24F/L/P/R-X87D
/R-213、X24F/L/P/R-87-X213A、X24F/L/P/R-X8
7D/R-X213A、24-87-249、X24F/L/P/R-87-249、2
4-X87D/R-249、24-87-X249N/R、X24F/L/P/R-X8
7D/R-249、X24F/L/P/R-87-X249N/R、24-X87D/R
-X249N/R、X24F/L/P/R-X87D/R-X249N/R、X24F/
L/P-129-130、X24F/L/P-X129Q-130、X24F/L/P-
129-X130A、X24F/L/P-X129Q-X130A、X24F/L/P-
129-206、24-129-X206Y、X24F/L/P-X129Q-206、
X24F/L/P-129-X206Y、24-X129Q-X206Y、X24F/L
/P-X129Q-X206L/Y、X24F/L/P/R-X129Q-X206Y、
X24F/L/P-129-209、X24F/L/P-X129Q-209、X24F
/L/P-129-X209W、X24F/L/P-X129Q-X209W、24-1
29-213、X24F/L/P/R-129-213、24-X129Q-213、2
4-129-X213A、X24F/L/P/R-X129Q-213、X24F/L/
P/R-129-X213A、24-X129Q-X213A、X24F/L/P/R-
X129Q-X213A、24-129-249、X24F/L/P/R-129-24
9、24-X129Q-249、24-129-X249N/R、X24F/L/P/R
-X129Q-249、X24F/L/P/R-129-X249N/R、24-X12
9Q-X249N/R、X24F/L/P/R-X129Q-X249N/R、X24F
/L/P-130-206、24-130-X206Y、X24F/L/P-X130A
-206、X24F/L/P-130-X206L/Y、X24F/L/P/R-130
-X206Y、24-X130A-X206Y、X24F/L/P-X130A-X20
6L/Y、X24F/L/P/R-X130A-X206Y、X24F/L/P-130
-209、X24F/L/P-X130A-209、X24F/L/P-130-X20
9W、X24F/L/P-X130A-X209W、24-130-213、X24F/
L/P/R-130-213、24-X130A-213、24-130-X213A、
X24F/L/P/R-X130A-213、X24F/L/P/R-130-X213
A、24-X130A-X213A、X24F/L/P/R-X130A-X213A、
24-130-249、X24F/L/P/R-130-249、24-X130A-2
49、24-130-X249N/R、X24F/L/P/R-X130A-249、X
24F/L/P/R-130-X249N/R、24-X130A-X249N/R、X
24F/L/P/R-X130A-X249N/R、24-X206Y-209、24F
/L/P-206-209、24-X206Y-X209W、X24F/L/P-X20
6L/Y-209、X24F/L/P/R-X206Y-209、X24F/L/P-2
06-X209W、X24F/L/P-X206L/Y-X209W、X24F/L/P
/R-X206Y-X209W、24-206-213、X24F/L/P/R-206
-213、24-X206L/Y-213、24-206-X213A、X24F/L/
P/R-X206L/Y-213、X24F/L/P/R-206-X213A、24-
X206L/Y-X213A、X24F/L/P/R-X206L/Y-X213A、2
4-206-249、24-X206L/Y-249、X24F/L/P/R-206-
249、24-206-X249N/R、24-X206L/Y-X249N/R、X2
4F/L/P/R-X206L/Y-249、X24F/L/P/R-206-X249
N/R、X24F/L/P/R-X206L/Y-X249N/R、24-209-21
3、24-X209W-213、X24F/L/P/R-209-213、24-209
-X213A、X24F/L/P/R-X209W-213、24-X209W-X21
3A、X24F/L/P/R-209-X213A、X24F/L/P/R-X209W
-X213A、24-209-249、24-X209W-249、X24F/L/P/
R-209-249、24-209-X249N/R、X24F/L/P/R-X209
W-249、24-X209W-X249N/R、X24F/L/P/R-209-X2
49N/R、X24F/L/P/R-X209W-X249N/R、78-87-129
、X78N-87-129、78-X87D/R-129、78-87-X129Q、X
78N-X87D/R-129、X78N-87-X129Q、78-X87D/R-X
129Q、X78N-X87D/R-X129Q、78-87-130、X78N-87
-130、78-X87D/R-130、78-87-X130A、X78N-X87D
/R-130、X78N-87-X130A、78-X87D/R-X130A、X78
N-X87D/R-X130A、78-87-206、78-87-X206L/R/Y
、X78N-87-206、78-X87D/R-206、78-X87D/R-X20
6L/R/Y、X78N-87-X206L/R/Y、X78N-X87D/R-206
、X78N-X87D/R-X206L/R/Y、78-87-209、78-87-X
209W、X78N-87-209、78-X87D/R-209、X78N-X87D
/R-209、78-X87D/R-X209W、X78N-87-X209W、X78
N-X87D/R-X209W、78-87-213、X78N-87-213、78-
X87D/R-213、78-87-X213A、X78N-X87D/R-213、X
78N-87-X213A、78-X87D/R-X213A、X78N-X87D/R
-X213A、78-87-249、78-87-X249N/R、X78N-87-2
49、78-87D/R-249、X78N-X87D/R-249、78-X87D/
R-X249N/R、X78N-87-X249N/R、X78N-X87D/R-X2
49N/R、78-129-X206R/Y、X78N-129-X206Y、78-X
129Q-X206R/Y、X78N-X129Q-X206Y、78-129-213
、X78N-129-213、78-X129Q-213、78-129-X213A、
X78N-X129Q-213、X78N-129-X213A、78-X129Q-X
213A、X78N-X129Q-X213A、78-129-249、X78N-12
9-249、78-X129Q-249、78-129-X249N/R、X78N-X
129Q-249、X78N-129-X249N/R、78-X129Q-X249N
/R、X78N-X129Q-X249N/R、78-130-X206R/Y、X78
N-130-X206Y、78-X130A-X206R/Y、X78N-X130A-
X206Y、78-130-213、X78N-130-213、78-X130A-2
13、78-130-X213A、X78N-X130A-213、X78N-130-
X213A、78-X130A-X213A、X78N-X130A-X213A、78
-130-213、X78N-130-213、78-X130A-213、78-13
0-X213A、X78N-X130A-213、X78N-130-X213A、78
-X130A-X213A、X78N-X130A-X213A、78-130-249
、X78N-130-249、78-X130A-249、78-130-X249N/
R、X78N-X130A-249、X78N-130-X249N/R、78-X13
0A-X249N/R、X78N-X130A-X249N/R、78-206-209
、X78N-206-209、78-X206L/Y-209、78-206-X209
W、X78N-X206L/Y-209、X78N-206-X209W、78-X20
6L/Y-X209W、X78N-X206L/Y-X209W、78-206-213
、X78N-206-213、78-X206L/Y-213、78-206-X213
A、X78N-X206L/Y-213、X78N-206-X213A、78-X20
6L/Y-X213A、X78N-X206L/Y-X213A、78-206-249
、78-206-X249R/N、78-X206L/Y-249、X78N-206-
249、X78N-206-X249N/R、78-X206L/Y-X249N/R、
X78N-X206L/Y-249、X78N-X206L/Y-X249N/R、78
-209-213、78-X209W-213、78-209-X213A、X78N-
209-213、X78N-X209W-213、X78N-209-X213A、78
-X209W-X213A、X78N-X209W-X213A、78-209-249
、78-X209W-249、78-209-X249N/R、X78N-209-24
9、78-X209W-X249N/R、X78N-X209W-249、X78N-2
09-X249N/R、X78N-X209W-X249N/R、78-213-249
、78-X213A-249、X78N-213-249、78-213-X249N/
R、X78N-X213A-249、X78N-213-X249N/R、78-X21
3A-X249N/R、X78N-X213A-X249N/R、87-129-130
、X87D/R-129-130、87-X129Q-130、87-129-X130
A、X87D/R-X129Q-130、X87D/R-129-X130A、87-X
129Q-X130A、X87D/R-X129Q-X130A、87-129-206
、X87D/R-129-206、87-X129Q-206、87-129-X206
L/R/Y、X87D/R-X129Q-206、X87D/R-129-X206L/
R/Y、87-X129Q-X206L/R/Y、X87D/R-X129Q-X206
L/R/Y、87-129-209、X87D/R-129-209、87-X129Q
-209、87-129-X209W、X87D/R-X129Q-209、X87D/
R-129-X209W、87-X129Q-X209W、X87D/R-X129Q-
X209W、87-129-213、X87D/R-129-213、87-X129Q
-213、87-129-X213A、X87D/R-X129Q-213、X87D/
R-129-X213A、87-X129Q-X213A、X87D/R-X129Q-
X213A、87-129-249、X87D/R-129-249、87-X129Q
-249、87-129-X249N/R、X87D/R-X129Q-249、X87
D/R-129-X249N/R、87-X129Q-X249N/R、X87D/R-
X129Q-X249N/R、87-130-206、X87D/R-130-206、
87-X130A-206、87-130-X206L/R/Y、X87D/R-X13
0A-206、X87D/R-130-X206L/R/Y、87-X130A-X20
6L/R/Y、X87D/R-X130A-X206L/R/Y、87-130-209
、X87D/R-130-209、87-X130A-209、87-130-X209
W、X87D/R-X130A-209、X87D/R-130-X209W、87-X
130A-X209W、X87D/R-X130A-X209W、87-130-213
、X87D/R-130-213、87-X130A-213、87-130-X213
A、X87D/R-X130A-213、X87D/R-130-X213A、87-X
130A-X213A、X87D/R-X130A-X213A、87-130-249
、X87D/R-130-249、87-X130A-249、87-130-X249
N/R、X87D/R-X130A-249、X87D/R-130-X249N/R、
87-X130A-X249N/R、X87D/R-X130A-X249N/R、87
-206-209、X87D/R-206-209、87-X206L/Y-209、8
7-206-X209W、X87D/R-X206L/Y-209、X87D/R-20
6-X209W、87-X206L/Y-X209W、X87D/R-X206L/Y-
X209W、87-206-213、87-X206L/Y-213、87-206-X
213A、X87D/R-206-213、X87D/R-X206L/Y-213、X
87D/R-206-X213A、87-X206L/Y-X213A、X87D/R-
X206L/Y-X213A、87-206-249、87-X206L/Y-249、
87D/R-206-249、87-209-X249N/R、X87R-206-X2
49N/R、X87D/R-X206L/Y-249、87-X206L/Y-X249
N/R、X87R-X206L/Y-X249N/R、87-209-213、X87D
/R-209-213、87-X209W-213、87-209-X213A、X87
D/R-X209W-213、X87D/R-209-X213A、87-X209W-
X213A、X87D/R-X209W-X213A、87-209-249、87-X
209W-249、87-209-X249N/R、X87D/R-209-249、X
87D/R-X209W-249、87-X209W-X249N/R、X87R-20
9-X249N/R、X87D/R-X209W-X249N/R、87-213-24
9、87-X213A-249、X87D/R-213-249、87-213-X24
9N/R、X87D/R-X213A-249、X87D/R-213-X249N/R
、87-X213A-X249N/R、X87D/R-X213A-X249N/R、1
29-130-X206R/Y、X129Q-130-X206R/Y、129-X13
0A-X206R/Y、X129Q-X130A-X206R/Y、129-130-2
13、X129Q-130-213、129-X130A-213、129-130-X
213A、X129Q-X130A-213、X129Q-130-X213A、129
-X130A-X213A、X129Q-X130A-X213A、129-130-2
49、X129Q-130-249、129-X130A-249、129-130-X
249N/R、X129Q-X130A-249、X129Q-130-X249N/R
、129-X130A-X249N/R、X129Q-X130A-X249N/R、1
29-X206Y-209、X129Q-X206Y-209、129-X206Y-X
209W、X129Q-X206Y-X209W、129-206-213、129-X
206L/Y-213、129-206-X213A、X129Q-206-213、X
129Q-X206L/Y-213、X129Q-206-X213A、129-X20
6L/Y-X213A、X129Q-X206L/Y-X213A、129-206-2
49、129-X206L/Y-249、129-206-X249N/R、X129Q
-206-249、X129A-X206L/Y-249、X129Q-206-X24
9N/R、129-X206L/Y-X249N/R、X129Q-X206L/Y-X
249N/R、129-209-213、129-X209W-213、129-209
-X213A、X129Q-209-213、X129Q-X209W-213、X12
9Q-209-X213A、129-X209W-X213A、X129Q-X209W
-X213A、129-209-249、129-X209W-249、129-209
-X249N/R、X129Q-209-249、X129Q-X209W-249、X
129Q-209-X249N/R、129-X209W-X249N/R、X129Q
-X209W-X249N/R、129-213-249、129-X213A-249
、129-213-X249N/R、X129Q-213-249、X129Q-X21
3A-249、129-X213A-X249R、X129Q-213-X249N/R
、X129Q-X213A-X249N/R、130-X206Y-209、X130A
-X206Y-209、130-X206Y-X209W、X130A-X206Y-X
209W、130-206-213、130-X206L/Y-213、130-206
-X213A、X130A-206-213、X130A-X206L/Y-213、X
130A-206-X213A、130-X206L/Y-X213A、X130A-X
206L/Y-X213A、130-206-249、130-X206L/Y-249
、130-206-X249N/R、X130A-206-249、X130A-X20
6L/Y-249、X130A-206-X249N/R、130-X206L/Y-X
249N/R、X130A-X206L/Y-X249N/R、130-209-213
、130-X209W-213、130-209-X213A、X130A-209-2
13、X130A-X209W-213、X130A-209-X213A、130-X
209W-X213A、X130A-X209W-X213A、130-209-249
、130-X209W-249、130-209-X249N/R、X130A-209
-249、X130A-X209W-249、X130A-209-X249N/R、1
30-X209W-X249N/R、X130A-X209W-X249N/R、130
-213-249、130-X213A-249、130-213-X249N/R、X
130A-213-249、X130A-X213A-249、130-X213A-X
249R、X130A-213-X249N/R、X130A-X213A-X249N
/R、130-209-249、130-X209W-249、130-209-X24
9N/R、X130A-209-249、X130A-X209W-249、X130A
-209-X249N/R、130-X209W-X249N/R、X130A-X20
9W-X249N/R、206-209-213、206-X209W-213、206
-209-X213A、X206L/Y-209-213、206-X209W-X21
3A、X206L/Y-X209W-213、X206L/Y-209-X213A、X
206L/Y-X209W-X213A、206-209-249、206-X209W
-249、206-209-X249N/R、X206L/Y-209-249、X20
6L/Y-X209W-249、206-X209W-X249N/R、X206L/Y
-209-X249N/R、X206L/Y-X209W-X249N/R、206-2
13-249、206-X213A-249、206-213-X249N/RX206
L/Y-213-249、X206L/Y-X213A-249、X206L/Y-21
3-X249N/R、206-X213A-X249N/R、X206L/Y-X213
A-X249N/R、209-213-249、X209W-213-249、209-
X213A-249、209-213-X249N/R、X209W-X213A-24
9、X209W-213-X249N/R、209-X213A-X249N/R、X2
09W-X213A-X249N/Rおよびこれらの組み合わせから選択される、2つ以
上の位置でのアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含む、単離されたスブチリ
シン変異体を提供する;ここで、Xは任意のアミノ酸であり、前記変異体はタンパク質分
解活性を有しており、前記変異体のアミノ酸配列は、(i)1、3、8、9、16、20
、22、28、42、43、44、56、76、77、82、88、100、101、1
03、104、108、116、118、120、124、127、128、147、1
50、158、159、160、166、185、194、204、210、211、2
12、215、216、217、218、222、232、241、245、248、2
51、252、254、256、259、261、262、268、270、271;(
ii)X1V、X3I/V、X8V、X9G、X16T、X20E/R、X22L/W、
X28T、X42I、X43R/Y、X44V、X56P、X76D、X77D、X82
D、X88S、X100S、X101G/H/Q/T/V、X103A、X104I、X
108S、X116L/M、X118A/R/V、X120R、X124M、X127S
/T、X128K/L/R、X147I、X150T、X158E/V、X160Q、X
166D/N、X185Y、X194D/P、X204D、X210I、X211P、X
212D、X215K/V、X216Y、X217K、X218S、X222Q/S、X
232V、X241K、X245R、X248D、X251R、X252I、X254T
、X256P、X259G、X261I、X262Q、X268A、X270PおよびX
271D;または(iii)A1V、S3I/V、I8V、S9G、A16T、G20E
/R、T22L/W、V28T、L42I、N43R/Y、I44V、S56P、N76
D、N77D、L82D、A88S、G100S、S101G/H/Q/T/V、S10
3A、V104I、A108S、N116L/M、G118A/R/V、H120R、L
124M、G127S/T、S128K/LR、V147I、V150T、A158E/
V、S160Q、S166D/N、N185Y、A194D/P、N204D、P210
I、G211P、S212D、A215K/V、S216Y、L217K、N218S、
M222Q/S、A232V、W241K、Q245R、N248D、K251R、N2
52I、A254T、S256P、S259G、N261I、L262Q、V268A、
A270P、およびE271Dから選択される1つ以上の置換をさらに含み、さらに、前
記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエ
ンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’
配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ酸
配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたものである。またさら
に他の実施形態は、78-X206A/D/F/G/H/M/N/P/R/S/Y、X7
8A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-206、X
78N-X206F/M/Y、X78G-X206D/F/H/M/N/P/R/Y、X
78A/C/E/F/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-X206A/
D/F/G/H/M/N/P/R/S/Y、18-X78N、X18K/R-X78N、
18-X87R、X18K/R-X87R、18-X206L/Y、X18K/R-X2
06L/Y、24-X87R、X24F/L/P/R-X87R、24-X206Y、X
24F/L/P-206、X24F/L/P-X206Y、X24F/L/P-X209
W、40-78、X40E-78、40-X78G、X40E-X78G、40-87、
X40E-87、40-X87R、X40E-X87R、40-129、40-X129
Q、X40E-129、X40E-X129Q、40-130、40-X130A、X4
0E-130、X40E-X130A、40-206、X40E-206、40-X20
6Y、X40E-X206Y、X78N-87、X78N-X87D/R、X78A/C
/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-87、X78G-X
87D/R/T、X78A/C/E/F/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W
/Y-X87R、X78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V
/W/Y-129、X78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/
V/W/Y-X129Q、X78A/C/E/F/H/I/K/L/M/P/Q/R/T
/V/W/Y-X130A、X78G-X130A/Q、X78A/C/E/F/G/H
/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-130、78-X249N/R、X7
8N-249、X78N-X249N/R、87-X206L/Y、X87D/R-X2
06L/Y、87-X209W、X87D/R-X209W、87-X213A、X87
D/R-213、X87D/R-X213A、X87R-X249N/R、129-X2
06Y、X129Q-X206Y、129-X249N/R、X129Q-249、X1
29Q-X249N/R、130-X206Y、X130A-X206R/Y、130-
X249N/R、X130A-249、X130A-X249N/R、X206Y-20
9、X206Y-X209W、206-X213A、X206L/Y-213、X206
L/Y-X213A、X206L/Y-249、X206L/Y-X249N/R、X2
09W-213、X209W-X213A、X209W-249、X209W-X249
N/R、18-24-78、X18K/R-24-78、18-X24F/L/P/R-
78、18-24-X78N、X18K/R-24-X78N、18-X24F/L/P
/R-X78N、X18K/R-X24F/L/P/R-78、X18K/R-X24F
/L/P/R-X78N、18-24-87、X18K/R-24-87、18-X24
F/L/P/R-87、18-24-X87D/R、X18K/R-24-X87D/R
、18-X24F/L/P/R-X87D/R、X18K/R-X24F/L/P/R-
87、X18K/R-X24F/L/P/R-X87D/R、18-24-129、X1
8K/R-24-129、18-X24F/L/P/R-129、18-24-X129
Q、X18K/R-X24F/L/P/R-129、X18K/R-24-X129Q、
18-X24F/L/P/R-X129Q、X18K/R-X24F/L/P/R-X1
29Q、18-24-130、18-X24F/L/P/R-130、18-24-X1
30A、X18K/R-24-130、X18K/R-X24F/L/P/R-130、
X18K/R-24-X130A、18-X24F/L/P/R-X130A、X18K
/R-X24F/L/P/R-X130A、18-24-206、18-24-X206
L/Y、18-X24F/L/P/R-206、X18K/R-24-206、X18K
/R-24-X206L/Y、18-X24F/L/P/R-X206L/Y、X18K
/R-X24F/L/P/R-206、X18K/R-X24F/L/P/R-X206
L/Y、18-24-209、18-24-X209W、18-X24F/L/P/R-
209、X18K/R-24-209、X18K/R-24-X209W、18-X24
F/L/P/R-X209W、X18K/R-X24F/L/P/R-209、X18K
/R-X24F/L/P/R-X209W、18-78-87、18-X78N-87、
18-78-X87D/R、X18K/R-78-87、X18K/R-X78N-87
、X18K/R-78-X87D/R、18-X78N-X87D/R、X18K/R-
X78N-X87D/R、18-78-129、18-X78N-129、18-78-
X129Q、X18K/R-78-129、X18K/R-X78N-129、X18K
/R-78-X129Q、18-X78N-X129Q、X18K/R-X78N-X1
29Q、18-78-130、18-X78N-130、18-78-X130A、X1
8K/R-78-130、X18K/R-X78N-130、X18K/R-78-X1
30A、18-X78N-X130A、X18K/R-X78N-X130A、18-7
8-206、18-78-X206L/Y、18-X78N-206、X18K/R-7
8-206、18-X78N-X206L/Y、X18K/R-X78N-206、X1
8K/R-78-X206L/Y、X18K/R-X78N-X206L/Y、18-7
8-209、18-X78N-209、18-78-X209W、X18K/R-78-
209、X18K/R-78-X209W、18-X78N-X209W、X18K/R
-X78N-209、X18K/R-X78N-X209W、18-78-213、18
-X78N-213、18-78-X213A、X18K/R-78-213、18-X
78N-X213A、X18K/R-X78N-213、X18K/R-78-X213
A、X18K/R-X78N-X213A、18-78-249、18-78-X249
N/R、18-X78N-249、X18K/R-78-249、18-X78N-X2
49N/R、X18K/R-X78N-249、X18K/R-78-X249N/R、
X18K/R-X78N-X249N/R、18-87-129、X18K/R-87-
129、18-X87D/R-129、18-87-X129Q、18-X87D/R-
X129Q、X18K/R-87-X129Q、X18K/R-X87D/R-129、
X18K/R-X87D/R-X129Q、18-87-130、X18K/R-87-
130、18-X87D/R-130、18-87-X130A、18-X87D/R-
X130A、X18K/R-87-X130A、X18K/R-X87D/R-130、
X18K/R-X87D/R-X130A、18-87-206、X18K/R-87-
206、18-X87D/R-206、18-87-X206L/Y、18-X87D/
R-X206L/Y、X18K/R-87-X206L/Y、X18K/R-X87D/
R-206、X18K/R-X87D/R-X206L/Y、18-87-209、X1
8K/R-87-209、18-X87D/R-209、18-87-X209W、18
-X87D/R-X209W、X18K/R-X87D/R-209、X18K/R-8
7-X209W、X18K/R-X87D/R-X209W、18-X87D/R-21
3、18-87-X213A、18-X87D/R-X213A、X18K/R-X87
D/R-213、X18K/R-87-X213A、X18K/R-X87D/R-X2
13A、18-87-249、X18K/R-87-249、18-X87D/R-24
9、18-87-X249N/R、18-X87D/R-249N/R、18K/R-X
87D/R-249、18K/R-87-X249N/R、18K/R-X87D/R-
X249N/R、18-129-130、X18K/R-129-130、18-X12
9Q-130、18-129-X130A、X18K/R-X129Q-130、X18
K/R-129-X130A、18-X129Q-X130A、X18K/R-X129
Q-X130A、18-129-206、X18K/R-129-206、18-X12
9Q-206、18-129-X206L/Y、X18K/R-X129Q-206、X
18K/R-129-X206L/Y、18-X129Q-X206L/Y、X18K/
R-X129Q-X206L/Y、18-129-209、X18K/R-129-20
9、18-X129Q-209、18-129-X209W、X18K/R-X129Q
-209、X18K/R-129-X209W、18-X129Q-X209W、X18
K/R-X129Q-X209W、18-129-213、X18K/R-129-21
3、18-X129Q-213、18-129-X213A、X18K/R-X129Q
-213、X18K/R-129-X213A、18-X129Q-X213A、X18
K/R-X129Q-X213A、18-129-249、X18K/R-129-24
9、18-X129Q-249、18-129-X249N/R、X18K/R-X12
9Q-249、X18K/R-129-X249N/R、18-X129Q-X249N
/R、X18K/R-X129Q-X249N/R、18-130-206、X18K/
R-130-206、18-X130A-206、18-130-X206L/Y、X1
8K/R-X130A-206、X18K/R-130-X206L/Y、18-X13
0A-X206L/Y、X18K/R-X130A-X206L/Y、18-130-2
09、X18K/R-130-209、18-X130A-209、18-130-X2
09W、X18K/R-X130A-209、X18K/R-130-X209W、18
-X130A-X209W、X18K/R-X130A-X209W、18-130-2
13、X18K/R-130-213、18-X130A-213、18-130-X2
13A、X18K/R-X130A-213、X18K/R-130-X213A、18
-X130A-X213A、X18K/R-X130A-X213A、18-130-2
49、X18K/R-130-249、18-X130A-249、18-130-X2
49N/R、X18K/R-X130A-249、X18K/R-130-X249N/
R、18-X130A-X249N/R、X18K/R-X130A-X249N/R、
18-206-209、18-206-X209W、18-X206L/Y-209、1
8K/R-206-209、18-X206L/Y-X209W、X18K/R-X20
6L/Y-209、X18K/R-206-X209W、X18K/R-X206L/Y
-X209W、18-206-213、X18K/R-206-213、18-206L
/Y-213、18-206-X213A、X18K/R-X206L/Y-213、X
18K/R-206-X213A、18-X206L/Y-X213A、X18K/R-
X206L/Y-X213A、18-206-249、X18K/R-206-249、
18-206L/Y-249、18-206-X249N/R、X18K/R-X206
L/Y-249、X18K/R-206-X249N/R、18-X206L/Y-X2
49N/R、X18K/R-X206L/Y-X249N/R、18-209-213、
18-X209W-213、X18K/R-209-213、18-209-X213A
、18-X209W-X213A、X18K/R-X209W-213、X18K/R-
209-X213A、X18K/R-X209W-X213A、18-209-249、
18-X209W-249、X18K/R-209-249、18-209-X249N
/R、18-X209W-X249N/R、18K/R-X209W-249、X18K
/R-209-X249N/R、X18K/R-X209W-X249N/R、18-2
13-X249N/R、X18K/R-X213A-249、X18K/R-213-X
249N/R、18-X213A-X249N/R、X18K/R-X213A-X24
9N/R、24-78-87、24-78-X87D/R、24-X78N-87、X2
4F/L/P/R-78-87、24-X78N-X87D/R、X24R/P/F-7
8-X87D/R、X24F/L/P/R-X78N-87、X24R/P/F-X78
N-X87D/R、X24F/L/P-78-129、X24F/L/P-X78N-1
29、X24F/L/P-78-X129Q、X24F/L/P-X78N-X129Q
、X24F/L/P-78-130、X24F/L/P-X78N-130、X24F/
L/P-78-X130A、X24F/L/P-X78N-X130A、24-78-X
206Y、X24F/L/P-78-206、24-X78N-X206Y、X24F/
L/P-X78N-206、X24F/L/P-78-X206L/Y、X24F/L/
P-X78N-X206L/Y、X24F/L/P-78-209、X24F/L/P-
X78N-209、X24F/L/P-78-X209W、X24F/L/P-X78N
-X209W、24-78-213、X24F/L/P/R-78-213、24-X7
8N-213、24-78-X213A、X24F/L/P/R-X78N-213、X
24F/L/P/R-78-X213A、24-X78N-X213A、X24F/L/
P/R-X78N-X213A、24-78-X249N/R、24-X78N-249
、24-X78N-X249N/R、X24F/L/P/R-X78N-249、X24
F/L/P/R-78-X249N/R、X24F/L/P/R-X78N-X249N
/R、24-87-129、X24F/L/P/R-87-129、24-X87D/R
-129、24-87-X129Q、X24F/L/P/R-X87D/R-129、X
24F/L/P/R-87-X129Q、24-X87D/R-X129Q、X24F/
L/P/R-X87D/R-X129Q、24-87-130、X24F/L/P/R-
87-130、24-X87D/R-130、24-87-X130A、X24F/L/
P/R-X87D/R-130、X24F/L/P/R-87-X130A、24-X8
7D/R-X130A、X24F/L/P/R-X87D/R-X130A、24-87
-X206L/Y、24-X87R-206、X24F/L/P/R-87-206、2
4-X87D/R-X206L/Y、X24F/L/P/R-X87D/R-206、X
24F/L/P/R-87-X206L/Y、X24F/L/P/R-X87D/R-X
206L/Y、24-87-X209W、X24F/L/P/R-87-X209W、2
4-87-X209W、24-87D/R-X209W、X24F/L/P/R-X87
D/R-X209W、24-X87D/R-213、24-87-X213A、24-X
87D/R-X213A、X24F/L/P/R-X87D/R-213、X24F/L
/P/R-87-X213A、X24F/L/P/R-X87D/R-X213A、24
-87-249、X24F/L/P/R-87-249、24-X87D/R-249、
24-87-X249N/R、X24F/L/P/R-X87D/R-249、X24F
/L/P/R-87-X249N/R、24-X87D/R-X249N/R、X24F
/L/P/R-X87D/R-X249N/R、X24F/L/P-129-130、X
24F/L/P-X129Q-130、X24F/L/P-129-X130A、X24
F/L/P-X129Q-X130A、X24F/L/P-129-206、24-12
9-X206Y、X24F/L/P-X129Q-206、X24F/L/P-129-
X206Y、24-X129Q-X206Y、X24F/L/P-X129Q-X206
L/Y、X24F/L/P/R-X129Q-X206Y、X24F/L/P-129-
209、X24F/L/P-X129Q-209、X24F/L/P-129-X209
W、X24F/L/P-X129Q-X209W、24-129-213、X24F/L
/P/R-129-213、24-X129Q-213、24-129-X213A、X
24F/L/P/R-X129Q-213、X24F/L/P/R-129-X213A
、24-X129Q-X213A、X24F/L/P/R-X129Q-X213A、2
4-129-249、X24F/L/P/R-129-249、24-X129Q-24
9、24-129-X249N/R、X24F/L/P/R-X129Q-249、X2
4F/L/P/R-129-X249N/R、24-X129Q-X249N/R、X2
4F/L/P/R-X129Q-X249N/R、X24F/L/P-130-206、
24-130-X206Y、X24F/L/P-X130A-206、X24F/L/P
-130-X206L/Y、X24F/L/P/R-130-X206Y、24-X13
0A-X206Y、X24F/L/P-X130A-X206L/Y、X24F/L/P
/R-X130A-X206Y、X24F/L/P-130-209、X24F/L/P
-X130A-209、X24F/L/P-130-X209W、X24F/L/P-X
130A-X209W、24-130-213、X24F/L/P/R-130-213
、24-X130A-213、24-130-X213A、X24F/L/P/R-X1
30A-213、X24F/L/P/R-130-X213A、24-X130A-X2
13A、X24F/L/P/R-X130A-X213A、24-130-249、X2
4F/L/P/R-130-249、24-X130A-249、24-130-X24
9N/R、X24F/L/P/R-X130A-249、X24F/L/P/R-130
-X249N/R、24-X130A-X249N/R、X24F/L/P/R-X13
0A-X249N/R、24-X206Y-209、24F/L/P-206-209、
24-X206Y-X209W、X24F/L/P-X206L/Y-209、X24F
/L/P/R-X206Y-209、X24F/L/P-206-X209W、X24F
/L/P-X206L/Y-X209W、X24F/L/P/R-X206Y-X209
W、24-206-213、X24F/L/P/R-206-213、24-X206L
/Y-213、24-206-X213A、X24F/L/P/R-X206L/Y-2
13、X24F/L/P/R-206-X213A、24-X206L/Y-X213A
、X24F/L/P/R-X206L/Y-X213A、24-206-249、24-
X206L/Y-249、X24F/L/P/R-206-249、24-206-X2
49N/R、24-X206L/Y-X249N/R、X24F/L/P/R-X206
L/Y-249、X24F/L/P/R-206-X249N/R、X24F/L/P/
R-X206L/Y-X249N/R、24-209-213、24-X209W-21
3、X24F/L/P/R-209-213、24-209-X213A、X24F/L
/P/R-X209W-213、24-X209W-X213A、X24F/L/P/R
-209-X213A、X24F/L/P/R-X209W-X213A、24-209
-249、24-X209W-249、X24F/L/P/R-209-249、24-
209-X249N/R、X24F/L/P/R-X209W-249、24-X209
W-X249N/R、X24F/L/P/R-209-X249N/R、X24F/L/
P/R-X209W-X249N/R、78-87-129、X78N-87-129、
78-X87D/R-129、78-87-X129Q、X78N-X87D/R-12
9、X78N-87-X129Q、78-X87D/R-X129Q、X78N-X87
D/R-X129Q、78-87-130、X78N-87-130、78-X87D/
R-130、78-87-X130A、X78N-X87D/R-130、X78N-8
7-X130A、78-X87D/R-X130A、X78N-X87D/R-X130
A、78-87-206、78-87-X206L/R/Y、X78N-87-206、
78-X87D/R-206、78-X87D/R-X206L/R/Y、X78N-8
7-X206L/R/Y、X78N-X87D/R-206、X78N-X87D/R-
X206L/R/Y、78-87-209、78-87-X209W、X78N-87-
209、78-X87D/R-209、X78N-X87D/R-209、78-X87
D/R-X209W、X78N-87-X209W、X78N-X87D/R-X209
W、78-87-213、X78N-87-213、78-X87D/R-213、78
-87-X213A、X78N-X87D/R-213、X78N-87-X213A、
78-X87D/R-X213A、X78N-X87D/R-X213A、78-87-
249、78-87-X249N/R、X78N-87-249、78-87D/R-2
49、X78N-X87D/R-249、78-X87D/R-X249N/R、X78
N-87-X249N/R、X78N-X87D/R-X249N/R、78-129-
X206R/Y、X78N-129-X206Y、78-X129Q-X206R/Y、
X78N-X129Q-X206Y、78-129-213、X78N-129-213
、78-X129Q-213、78-129-X213A、X78N-X129Q-21
3、X78N-129-X213A、78-X129Q-X213A、X78N-X12
9Q-X213A、78-129-249、X78N-129-249、78-X129
Q-249、78-129-X249N/R、X78N-X129Q-249、X78N
-129-X249N/R、78-X129Q-X249N/R、X78N-X129Q
-X249N/R、78-130-X206R/Y、X78N-130-X206Y、7
8-X130A-X206R/Y、X78N-X130A-X206Y、78-130-
213、X78N-130-213、78-X130A-213、78-130-X21
3A、X78N-X130A-213、X78N-130-X213A、78-X130
A-X213A、X78N-X130A-X213A、78-130-213、X78N
-130-213、78-X130A-213、78-130-X213A、X78N-
X130A-213、X78N-130-X213A、78-X130A-X213A、
X78N-X130A-X213A、78-130-249、X78N-130-249
、78-X130A-249、78-130-X249N/R、X78N-X130A-
249、X78N-130-X249N/R、78-X130A-X249N/R、X7
8N-X130A-X249N/R、78-206-209、X78N-206-209
、78-X206L/Y-209、78-206-X209W、X78N-X206L/
Y-209、X78N-206-X209W、78-X206L/Y-X209W、X7
8N-X206L/Y-X209W、78-206-213、X78N-206-213
、78-X206L/Y-213、78-206-X213A、X78N-X206L/
Y-213、X78N-206-X213A、78-X206L/Y-X213A、X7
8N-X206L/Y-X213A、78-206-249、78-206-X249R
/N、78-X206L/Y-249、X78N-206-249、X78N-206-
X249N/R、78-X206L/Y-X249N/R、X78N-X206L/Y-
249、X78N-X206L/Y-X249N/R、78-209-213、78-X
209W-213、78-209-X213A、X78N-209-213、X78N-
X209W-213、X78N-209-X213A、78-X209W-X213A、
X78N-X209W-X213A、78-209-249、78-X209W-249
、78-209-X249N/R、X78N-209-249、78-X209W-X2
49N/R、X78N-X209W-249、X78N-209-X249N/R、X7
8N-X209W-X249N/R、78-213-249、78-X213A-249
、X78N-213-249、78-213-X249N/R、X78N-X213A-
249、X78N-213-X249N/R、78-X213A-X249N/R、X7
8N-X213A-X249N/R、87-129-130、X87D/R-129-1
30、87-X129Q-130、87-129-X130A、X87D/R-X129
Q-130、X87D/R-129-X130A、87-X129Q-X130A、X8
7D/R-X129Q-X130A、87-129-206、X87D/R-129-2
06、87-X129Q-206、87-129-X206L/R/Y、X87D/R-
X129Q-206、X87D/R-129-X206L/R/Y、87-X129Q-
X206L/R/Y、X87D/R-X129Q-X206L/R/Y、87-129-
209、X87D/R-129-209、87-X129Q-209、87-129-X
209W、X87D/R-X129Q-209、X87D/R-129-X209W、8
7-X129Q-X209W、X87D/R-X129Q-X209W、87-129-
213、X87D/R-129-213、87-X129Q-213、87-129-X
213A、X87D/R-X129Q-213、X87D/R-129-X213A、8
7-X129Q-X213A、X87D/R-X129Q-X213A、87-129-
249、X87D/R-129-249、87-X129Q-249、87-129-X
249N/R、X87D/R-X129Q-249、X87D/R-129-X249N
/R、87-X129Q-X249N/R、X87D/R-X129Q-X249N/R
、87-130-206、X87D/R-130-206、87-X130A-206、
87-130-X206L/R/Y、X87D/R-X130A-206、X87D/R
-130-X206L/R/Y、87-X130A-X206L/R/Y、X87D/R
-X130A-X206L/R/Y、87-130-209、X87D/R-130-2
09、87-X130A-209、87-130-X209W、X87D/R-X130
A-209、X87D/R-130-X209W、87-X130A-X209W、X8
7D/R-X130A-X209W、87-130-213、X87D/R-130-2
13、87-X130A-213、87-130-X213A、X87D/R-X130
A-213、X87D/R-130-X213A、87-X130A-X213A、X8
7D/R-X130A-X213A、87-130-249、X87D/R-130-2
49、87-X130A-249、87-130-X249N/R、X87D/R-X1
30A-249、X87D/R-130-X249N/R、87-X130A-X249
N/R、X87D/R-X130A-X249N/R、87-206-209、X87D
/R-206-209、87-X206L/Y-209、87-206-X209W、X
87D/R-X206L/Y-209、X87D/R-206-X209W、87-X2
06L/Y-X209W、X87D/R-X206L/Y-X209W、87-206-
213、87-X206L/Y-213、87-206-X213A、X87D/R-2
06-213、X87D/R-X206L/Y-213、X87D/R-206-X21
3A、87-X206L/Y-X213A、X87D/R-X206L/Y-X213A
、87-206-249、87-X206L/Y-249、87D/R-206-249
、87-209-X249N/R、X87R-206-X249N/R、X87D/R-
X206L/Y-249、87-X206L/Y-X249N/R、X87R-X206
L/Y-X249N/R、87-209-213、X87D/R-209-213、87
-X209W-213、87-209-X213A、X87D/R-X209W-213
、X87D/R-209-X213A、87-X209W-X213A、X87D/R-
X209W-X213A、87-209-249、87-X209W-249、87-2
09-X249N/R、X87D/R-209-249、X87D/R-X209W-2
49、87-X209W-X249N/R、X87R-209-X249N/R、X87
D/R-X209W-X249N/R、87-213-249、87-X213A-24
9、X87D/R-213-249、87-213-X249N/R、X87D/R-X
213A-249、X87D/R-213-X249N/R、87-X213A-X24
9N/R、X87D/R-X213A-X249N/R、129-130-X206R/
Y、X129Q-130-X206R/Y、129-X130A-X206R/Y、X1
29Q-X130A-X206R/Y、129-130-213、X129Q-130-
213、129-X130A-213、129-130-X213A、X129Q-X1
30A-213、X129Q-130-X213A、129-X130A-X213A、
X129Q-X130A-X213A、129-130-249、X129Q-130-
249、129-X130A-249、129-130-X249N/R、X129Q-
X130A-249、X129Q-130-X249N/R、129-X130A-X2
49N/R、X129Q-X130A-X249N/R、129-X206Y-209、
X129Q-X206Y-209、129-X206Y-X209W、X129Q-X2
06Y-X209W、129-206-213、129-X206L/Y-213、12
9-206-X213A、X129Q-206-213、X129Q-X206L/Y-
213、X129Q-206-X213A、129-X206L/Y-X213A、X1
29Q-X206L/Y-X213A、129-206-249、129-X206L/
Y-249、129-206-X249N/R、X129Q-206-249、X129
A-X206L/Y-249、X129Q-206-X249N/R、129-X206
L/Y-X249N/R、X129Q-X206L/Y-X249N/R、129-20
9-213、129-X209W-213、129-209-X213A、X129Q-
209-213、X129Q-X209W-213、X129Q-209-X213A、
129-X209W-X213A、X129Q-X209W-X213A、129-20
9-249、129-X209W-249、129-209-X249N/R、X129
Q-209-249、X129Q-X209W-249、X129Q-209-X249
N/R、129-X209W-X249N/R、X129Q-X209W-X249N/
R、129-213-249、129-X213A-249、129-213-X249
N/R、X129Q-213-249、X129Q-X213A-249、129-X2
13A-X249R、X129Q-213-X249N/R、X129Q-X213A-
X249N/R、130-X206Y-209、X130A-X206Y-209、13
0-X206Y-X209W、X130A-X206Y-X209W、130-206-
213、130-X206L/Y-213、130-206-X213A、X130A-
206-213、X130A-X206L/Y-213、X130A-206-X213
A、130-X206L/Y-X213A、X130A-X206L/Y-X213A、
130-206-249、130-X206L/Y-249、130-206-X249
N/R、X130A-206-249、X130A-X206L/Y-249、X130
A-206-X249N/R、130-X206L/Y-X249N/R、X130A-
X206L/Y-X249N/R、130-209-213、130-X209W-21
3、130-209-X213A、X130A-209-213、X130A-X209
W-213、X130A-209-X213A、130-X209W-X213A、X1
30A-X209W-X213A、130-209-249、130-X209W-24
9、130-209-X249N/R、X130A-209-249、X130A-X2
09W-249、X130A-209-X249N/R、130-X209W-X249
N/R、X130A-X209W-X249N/R、130-213-249、130-
X213A-249、130-213-X249N/R、X130A-213-249、
X130A-X213A-249、130-X213A-X249R、X130A-21
3-X249N/R、X130A-X213A-X249N/R、130-209-24
9、130-X209W-249、130-209-X249N/R、X130A-20
9-249、X130A-X209W-249、X130A-209-X249N/R、
130-X209W-X249N/R、X130A-X209W-X249N/R、20
6-209-213、206-X209W-213、206-209-X213A、X2
06L/Y-209-213、206-X209W-X213A、X206L/Y-X2
09W-213、X206L/Y-209-X213A、X206L/Y-X209W-
X213A、206-209-249、206-X209W-249、206-209-
X249N/R、X206L/Y-209-249、X206L/Y-X209W-24
9、206-X209W-X249N/R、X206L/Y-209-X249N/R、
X206L/Y-X209W-X249N/R、206-213-249、206-X2
13A-249、206-213-X249N/RX206L/Y-213-249、X
206L/Y-X213A-249、X206L/Y-213-X249N/R、206
-X213A-X249N/R、X206L/Y-X213A-X249N/R、209
-213-249、X209W-213-249、209-X213A-249、209
-213-X249N/R、X209W-X213A-249、X209W-213-X
249N/R、209-X213A-X249N/R、X209W-X213A-X24
9N/Rおよびこれらの組み合わせから選択される、2つ以上の位置でのアミノ酸置換の
組み合わせを含むアミノ酸配列を含む、単離されたスブチリシン変異体を提供する;ここ
で、Xは任意のアミノ酸であり、前記変異体はタンパク質分解活性を有しており、前記変
異体のアミノ酸配列は、(i)3、76、101、103、104、118、127、1
28、166、210、217、222および261;(ii)X3VX76D、X10
1F/G/V、X103A/D/P、X104I、X118R、X127T、X128L
/R、X166D/N、X210I、X217K、X222Q/SおよびX261I;ま
たは(iii)S3V、N76D、S101F/G/V、S103A/D/P、V104
I、G118R、G127T、S128L/R、S166D/N、P210I、L217
K、M222Q/SおよびN261Iから選択される1つ以上の置換をさらに含み、さら
に、前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエフ
ァシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシンB
PN’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体ア
ミノ酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたものである。
【0066】
さらに他の実施形態は、78-X206L/Y、X78N-206、X78N-X20
6L/Y、18-X78N、X18K/R-X78N、18-X87R、X18K/R-
X87R、18-X206L/Y、X18K/R-X206L/Y、24-X87R、X
24F/P/R-X87R、24-X206L/Y、X24F/P/R-206、X24
F/P/R-X206L/Y、24-X209W、X24F/P/R-X209W、X7
8N-87、X78N-X87D/R、78-X129Q、X78N-X129Q、78
-X130A、X78N-130、X78N-209、78-X209W、X78N-X
209W、78-X249N/R、X78N-249、X78N-X249N/R、87
-X206L/Y、X87D/R-X206L/Y、87-X209W、X87D/R-
X209W、87-X213A、X87D/R-213、X87D/R-X213A、X
87R-X249N/R、129-X206L/Y、X129Q-206、X129Q-
X206L/Y、129-X209W、X129Q-X209W、129-X249N/
R、X129Q-249、X129Q-X249N/R、130-X206L/Y、X1
30A-206、X130A-X206L/Y、130-X209W、X130A-X2
09W、130-X249N/R、X130A-249、X130A-X249N/R、
206-X209W、X206L/Y-209、X206L/Y-X209W、206-
X213A、X206L/Y-213、X206L/Y-X213A、X206L/Y-
249、X206L/Y-X249N/R、X209W-213、X209W-X213
A、X209W-249、X209W-X249N/R、18-24-78、X18K/
R-24-78、18-X24F/P/R-78、18-24-X78N、X18K/R
-24-X78N、18-X24F/P/R-X78N、X18K/R-X24F/P/
R-78、X18K/R-X24F/P/R-X78N、18-24-87、X18K/
R-24-87、18-X24F/P/R-87、18-24-X87D/R、X18K
/R-24-X87D/R、18-X24F/P/R-X87D/R、X18K/R-X
24F/P/R-87、X18K/R-X24F/P/R-X87D/R、18-24-
129、X18K/R-24-129、18-X24F/P/R-129、18-24-
X129Q、X18K/R-X24F/P/R-129、X18K/R-24-X129
Q、18-X24F/P/R-X129Q、X18K/R-X24F/P/R-X129
Q、18-24-130、18-X24F/P/R-130、18-24-X130A、
X18K/R-24-130、X18K/R-X24F/P/R-130、X18K/R
-24-X130A、18-X24F/P/R-X130A、X18K/R-X24F/
P/R-X130A、18-24-206、18-24-X206L/Y、18-X24
F/P/R-206、X18K/R-24-206、X18K/R-24-X206L/
Y、18-X24F/P/R-X206L/Y、X18K/R-X24F/P/R-20
6、X18K/R-X24F/P/R-X206L/Y、18-24-209、18-2
4-X209W、18-X24F/P/R-209、X18K/R-24-209、X1
8K/R-24-X209W、18-X24F/P/R-X209W、X18K/R-X
24F/P/R-209、X18K/R-X24F/P/R-X209W、18-78-
87、18-X78N-87、18-78-X87D/R、X18K/R-78-87、
X18K/R-X78N-87、X18K/R-78-X87D/R、18-X78N-
X87D/R、X18K/R-X78N-X87D/R、18-78-129、18-X
78N-129、18-78-X129Q、X18K/R-78-129、X18K/R
-X78N-129、X18K/R-78-X129Q、18-X78N-X129Q、
X18K/R-X78N-X129Q、18-78-130、18-X78N-130、
18-78-X130A、X18K/R-78-130、X18K/R-X78N-13
0、X18K/R-78-X130A、18-X78N-X130A、X18K/R-X
78N-X130A、18-78-206、18-78-X206L/Y、18-X78
N-206、X18K/R-78-206、18-X78N-X206L/Y、X18K
/R-X78N-206、X18K/R-78-X206L/Y、X18K/R-X78
N-X206L/Y、18-78-209、18-X78N-209、18-78-X2
09W、X18K/R-78-209、X18K/R-78-X209W、18-X78
N-X209W、X18K/R-X78N-209、X18K/R-X78N-X209
W、18-78-213、18-X78N-213、18-78-X213A、X18K
/R-78-213、18-X78N-X213A、X18K/R-X78N-213、
X18K/R-78-X213A、X18K/R-X78N-X213A、18-78-
249、18-78-X249N/R、18-X78N-249、X18K/R-78-
249、18-X78N-X249N/R、X18K/R-X78N-249、X18K
/R-78-X249N/R、X18K/R-X78N-X249N/R、18-87-
129、X18K/R-87-129、18-X87D/R-129、18-87-X1
29Q、18-X87D/R-X129Q、X18K/R-87-X129Q、X18K
/R-X87D/R-129、X18K/R-X87D/R-X129Q、18-87-
130、X18K/R-87-130、18-X87D/R-130、18-87-X1
30A、18-X87D/R-X130A、X18K/R-87-X130A、X18K
/R-X87D/R-130、X18K/R-X87D/R-X130A、18-87-
206、X18K/R-87-206、18-X87D/R-206、18-87-X2
06L/Y、18-X87D/R-X206L/Y、X18K/R-87-X206L/
Y、X18K/R-X87D/R-206、X18K/R-X87D/R-X206L/
Y、18-87-209、X18K/R-87-209、18-X87D/R-209、
18-87-X209W、18-X87D/R-X209W、X18K/R-X87D/
R-209、X18K/R-87-X209W、X18K/R-X87D/R-X209
W、18-X87D/R-213、18-87-X213A、18-X87D/R-X2
13A、X18K/R-X87D/R-213、X18K/R-87-X213A、X1
8K/R-X87D/R-X213A、18-87-249、X18K/R-87-24
9、18-X87D/R-249、18-87-X249N/R、18-X87D/R-
249N/R、18K/R-X87D/R-249、18K/R-87-X249N/R
、18K/R-X87D/R-X249N/R、18-129-130、X18K/R-
129-130、18-X129Q-130、18-129-X130A、X18K/R
-X129Q-130、X18K/R-129-X130A、18-X129Q-X13
0A、X18K/R-X129Q-X130A、18-129-206、X18K/R-
129-206、18-X129Q-206、18-129-X206L/Y、X18K
/R-X129Q-206、X18K/R-129-X206L/Y、18-X129Q
-X206L/Y、X18K/R-X129Q-X206L/Y、18-129-209
、X18K/R-129-209、18-X129Q-209、18-129-X209
W、X18K/R-X129Q-209、X18K/R-129-X209W、18-X
129Q-X209W、X18K/R-X129Q-X209W、18-129-213
、X18K/R-129-213、18-X129Q-213、18-129-X213
A、X18K/R-X129Q-213、X18K/R-129-X213A、18-X
129Q-X213A、X18K/R-X129Q-X213A、18-129-249
、X18K/R-129-249、18-X129Q-249、18-129-X249
N/R、X18K/R-X129Q-249、X18K/R-129-X249N/R、
18-X129Q-X249N/R、X18K/R-X129Q-X249N/R、18
-130-206、X18K/R-130-206、18-X130A-206、18-
130-X206L/Y、X18K/R-X130A-206、X18K/R-130-
X206L/Y、18-X130A-X206L/Y、X18K/R-X130A-X2
06L/Y、18-130-209、X18K/R-130-209、18-X130A
-209、18-130-X209W、X18K/R-X130A-209、X18K/
R-130-X209W、18-X130A-X209W、X18K/R-X130A-
X209W、18-130-213、X18K/R-130-213、18-X130A
-213、18-130-X213A、X18K/R-X130A-213、X18K/
R-130-X213A、18-X130A-X213A、X18K/R-X130A-
X213A、18-130-249、X18K/R-130-249、18-X130A
-249、18-130-X249N/R、X18K/R-X130A-249、X18
K/R-130-X249N/R、18-X130A-X249N/R、X18K/R-
X130A-X249N/R、18-206-209、18-206-X209W、18
-X206L/Y-209、18K/R-206-209、18-X206L/Y-X2
09W、X18K/R-X206L/Y-209、X18K/R-206-X209W、
X18K/R-X206L/Y-X209W、18-206-213、X18K/R-2
06-213、18-206L/Y-213、18-206-X213A、X18K/R
-X206L/Y-213、X18K/R-206-X213A、18-X206L/Y
-X213A、X18K/R-X206L/Y-X213A、18-206-249、X
18K/R-206-249、18-206L/Y-249、18-206-X249N
/R、X18K/R-X206L/Y-249、X18K/R-206-X249N/R
、18-X206L/Y-X249N/R、X18K/R-X206L/Y-X249N
/R、18-209-213、18-X209W-213、X18K/R-209-21
3、18-209-X213A、18-X209W-X213A、X18K/R-X20
9W-213、X18K/R-209-X213A、X18K/R-X209W-X21
3A、18-209-249、18-X209W-249、X18K/R-209-24
9、18-209-X249N/R、18-X209W-X249N/R、18K/R-
X209W-249、X18K/R-209-X249N/R、X18K/R-X209
W-X249N/R、18-213-X249N/R、X18K/R-X213A-24
9、X18K/R-213-X249N/R、18-X213A-X249N/R、X1
8K/R-X213A-X249N/R、24-78-87、24-78-X87D/R
、24-X78N-87、X24F/P/R-78-87、24-X78N-X87D/
R、X24R/P/F-78-X87D/R、X24F/P/R-X78N-87、X2
4R/P/F-X78N-X87D/R、24-78-129、X24F/P/R-78
-129、24-X78N-129、24-78-X129Q、X24F/P/R-X7
8N-129、X24F/P/R-78-X129Q、24-X78N-X129Q、X
24F/P/R-X78N-X129Q、24-78-130、X24F/P/R-78
-130、24-X78N-130、24-78-X130A、X24F/P/R-X7
8N-130X24F/P/R-78-X130A、24-X78N-X130A、X2
4F/P/R-X78N-X130A、24-78-X206L/Y、X24F/P/R
-78-206、24-X78N-X206L/Y、X24F/P/R-X78N-20
6、X24F/P/R-78-X206L/Y、X24F/P/R-X78N-X206
L/Y、24-78-209、X24F/P/R-78-209、24-X78N-20
9、24-78-X209W、X24F/P/R-X78N-209、X24F/P/R
-78-X209W、24-X78N-X209W、X24F/P/R-X78N-X2
09W、24-78-213、X24F/P/R-78-213、24-X78N-21
3、24-78-X213A、X24F/P/R-X78N-213、X24F/P/R
-78-X213A、24-X78N-X213A、X24F/P/R-X78N-X2
13A、24-78-X249N/R、24-X78N-249、24-X78N-X2
49N/R、X24F/P/R-X78N-249、X24F/P/R-78-X249
N/R、X24F/P/R-X78N-X249N/R、24-87-129、X24F
/P/R-87-129、24-X87D/R-129、24-87-X129Q、X2
4F/P/R-X87D/R-129、X24F/P/R-87-X129Q、24-X
87D/R-X129Q、X24F/P/R-X87D/R-X129Q、24-87-
130、X24F/P/R-87-130、24-X87D/R-130、24-87-
X130A、X24F/P/R-X87D/R-130、X24F/P/R-87-X1
30A、24-X87D/R-X130A、X24F/P/R-X87D/R-X130
A、24-87-X206L/Y、24-X87R-206、X24F/P/R-87-
206、24-X87D/R-X206L/Y、X24F/P/R-X87D/R-20
6、X24F/P/R-87-X206L/Y、X24F/P/R-X87D/R-X2
06L/Y、24-87-X209W、X24F/P/R-87-X209W、24-8
7-X209W、24-87D/R-X209W、X24F/P/R-X87D/R-X
209W、24-X87D/R-213、24-87-X213A、24-X87D/R
-X213A、X24F/P/R-X87D/R-213、X24F/P/R-87-X
213A、X24F/P/R-X87D/R-X213A、24-87-249、X24
F/P/R-87-249、24-X87D/R-249、24-87-X249N/R
、X24F/P/R-X87D/R-249、X24F/P/R-87-X249N/R
、24-X87D/R-X249N/R、X24F/P/R-X87D/R-X249N
/R、24-129-130、X24F/P/R-129-130、24-X129Q-
130、24-129-X130A、X24F/P/R-X129Q-130、X24F
/P/R-129-X130A、24-X129Q-X130A、X24F/P/R-X
129Q-X130A、24-129-206、X24F/P/R-129-206、2
4-X129Q-206、24-129-X206L/Y、X24F/P/R-X129
Q-206、X24F/P/R-129-X206L/Y、24-X129Q-X206
L/Y、X24F/P/R-X129Q-X206L/Y、24-129-209、X2
4F/P/R-129-209、24-X129Q-209、24-129-X209W
、X24F/P/R-X129Q-209、X24F/P/R-129-X209W、2
4-X129Q-X209W、X24F/P/R-X129Q-X209W、24-12
9-213、X24F/P/R-129-213、24-X129Q-213、24-1
29-X213A、X24F/P/R-X129Q-213、X24F/P/R-129
-X213A、24-X129Q-X213A、X24F/P/R-X129Q-X21
3A、24-129-249、X24F/P/R-129-249、24-X129Q-
249、24-129-X249N/R、X24F/P/R-X129Q-249、X2
4F/P/R-129-X249N/R、24-X129Q-X249N/R、X24F
/P/R-X129Q-X249N/R、24-130-206、X24F/P/R-1
30-206、24-X130A-206、24-130-X206L/Y、X24F/
P/R-X130A-206、X24F/P/R-130-X206L/Y、24-X1
30A-X206L/Y、X24F/P/R-X130A-X206L/Y、24-13
0-209、X24F/P/R-130-209、24-X130A-209、24-1
30-X209W、X24F/P/R-X130A-209、X24F/P/R-130
-X209W、24-X130A-X209W、X24F/P/R-X130A-X20
9W、24-130-213、X24F/P/R-130-213、24-X130A-
213、24-130-X213A、X24F/P/R-X130A-213、X24F
/P/R-130-X213A、24-X130A-X213A、X24F/P/R-X
130A-X213A、24-130-249、X24F/P/R-130-249、2
4-X130A-249、24-130-X249N/R、X24F/P/R-X130
A-249、X24F/P/R-130-X249N/R、24-X130A-X249
N/R、X24F/P/R-X130A-X249N/R、24-206-209、24
-206-X209W、24-X206L/Y-209、24F/P/R-206-20
9、24-X206L/Y-X209W、X24F/P/R-X206L/Y-209、
X24F/P/R-206-X209W、X24F/P/R-X206L/Y-X209
W、24-206-213、X24F/P/R-206-213、24-X206L/Y
-213、24-206-X213A、X24F/P/R-X206L/Y-213、X
24F/P/R-206-X213A、24-X206L/Y-X213A、X24F/
P/R-X206L/Y-X213A、24-206-249、24-X206L/Y-
249、X24F/P/R-206-249、24-206-X249N/R、24-X
206L/Y-X249N/R、X24F/P/R-X206L/Y-249、X24F
/P/R-206-X249N/R、X24F/P/R-X206L/Y-X249N/
R、24-209-213、24-X209W-213、X24F/P/R-209-2
13、24-209-X213A、X24F/P/R-X209W-213、24-X2
09W-X213A、X24F/P/R-209-X213A、X24F/P/R-X2
09W-X213A、24-209-249、24-X209W-249、X24F/P
/R-209-249、24-209-X249N/R、X24F/P/R-X209W
-249、24-X209W-X249N/R、X24F/P/R-209-X249N
/R、X24F/P/R-X209W-X249N/R、78-87-129、X78N
-87-129、78-X87D/R-129、78-87-X129Q、X78N-X
87D/R-129、X78N-87-X129Q、78-X87D/R-X129Q、
X78N-X87D/R-X129Q、78-87-130、X78N-87-130、
78-X87D/R-130、78-87-X130A、X78N-X87D/R-13
0、X78N-87-X130A、78-X87D/R-X130A、X78N-X87
D/R-X130A、78-87-206、78-87-X206L/Y、X78N-8
7-206、78-X87D/R-206、78-X87D/R-X206L/Y、X7
8N-87-X206L/Y、X78N-X87D/R-206、X78N-X87D/
R-X206L/Y、78-87-209、78-87-X209W、X78N-87-
209、78-X87D/R-209、X78N-X87D/R-209、78-X87
D/R-X209W、X78N-87-X209W、X78N-X87D/R-X209
W、78-87-213、X78N-87-213、78-X87D/R-213、78
-87-X213A、X78N-X87D/R-213、X78N-87-X213A、
78-X87D/R-X213A、X78N-X87D/R-X213A、78-87-
249、78-87-X249N/R、X78N-87-249、78-87D/R-2
49、X78N-X87D/R-249、78-X87D/R-X249N/R、X78
N-87-X249N/R、X78N-X87D/R-X249N/R、78-129-
130、X78N-129-130、78-X129Q-130、78-129-X13
0A、X78N-X129Q-130、X78N-129-X130A、78-X129
Q-X130A、X78N-X129Q-X130A、78-129-206、X78N
-129-206、78-X129Q-206、78-129-X206L/Y、X78
N-X129Q-206、X78N-129-X206L/Y、78-X129Q-X2
06L/Y、X78N-X129Q-X206L/Y、78-129-209、X78N
-129-209、78-X129Q-209、78-129-X209W、X78N-
X129Q-209、X78N-129-X209W、78-X129Q-X209W、
X78N-X129Q-X209W、78-129-213、X78N-129-213
、78-X129Q-213、78-129-X213A、X78N-X129Q-21
3、X78N-129-X213A、78-X129Q-X213A、X78N-X12
9Q-X213A、78-129-249、X78N-129-249、78-X129
Q-249、78-129-X249N/R、X78N-X129Q-249、X78N
-129-X249N/R、78-X129Q-X249N/R、X78N-X129Q
-X249N/R、78-130-206、X78N-130-206、78-X130
A-206、78-130-X206L/Y、X78N-X130A-206、X78N
-130-X206L/Y、78-X130A-X206L/Y、X78N-X130A
-X206L/Y、78-130-209、X78N-130-209、78-X130
A-209、78-130-X209W、X78N-X130A-209、X78N-1
30-X209W、78-X130A-X209W、X78N-X130A-X209W
、78-130-213、X78N-130-213、78-X130A-213、78
-130-X213A、X78N-X130A-213、X78N-130-X213A
、78-X130A-X213A、X78N-X130A-X213A、78-130-
213、X78N-130-213、78-X130A-213、78-130-X21
3A、X78N-X130A-213、X78N-130-X213A、78-X130
A-X213A、X78N-X130A-X213A、78-130-249、X78N
-130-249、78-X130A-249、78-130-X249N/R、X78
N-X130A-249、X78N-130-X249N/R、78-X130A-X2
49N/R、X78N-X130A-X249N/R、78-206-209、X78N
-206-209、78-X206L/Y-209、78-206-X209W、X78
N-X206L/Y-209、X78N-206-X209W、78-X206L/Y-
X209W、X78N-X206L/Y-X209W、78-206-213、X78N
-206-213、78-X206L/Y-213、78-206-X213A、X78
N-X206L/Y-213、X78N-206-X213A、78-X206L/Y-
X213A、X78N-X206L/Y-X213A、78-206-249、78-2
06-X249R/N、78-X206L/Y-249、X78N-206-249、X
78N-206-X249N/R、78-X206L/Y-X249N/R、X78N-
X206L/Y-249、X78N-X206L/Y-X249N/R、78-209-
213、78-X209W-213、78-209-X213A、X78N-209-2
13、X78N-X209W-213、X78N-209-X213A、78-X209
W-X213A、X78N-X209W-X213A、78-209-249、78-X
209W-249、78-209-X249N/R、X78N-209-249、78-
X209W-X249N/R、X78N-X209W-249、X78N-209-X2
49N/R、X78N-X209W-X249N/R、78-213-249、78-X
213A-249、X78N-213-249、78-213-X249N/R、X78
N-X213A-249、X78N-213-X249N/R、78-X213A-X2
49N/R、X78N-X213A-X249N/R、87-129-130、X87D
/R-129-130、87-X129Q-130、87-129-X130A、X87
D/R-X129Q-130、X87D/R-129-X130A、87-X129Q-
X130A、X87D/R-X129Q-X130A、87-129-206、X87D
/R-129-206、87-X129Q-206、87-129-X206L/Y、X
87D/R-X129Q-206、X87D/R-129-X206L/Y、87-X1
29Q-X206L/Y、X87D/R-X129Q-X206L/Y、87-129-
209、X87D/R-129-209、87-X129Q-209、87-129-X
209W、X87D/R-X129Q-209、X87D/R-129-X209W、8
7-X129Q-X209W、X87D/R-X129Q-X209W、87-129-
213、X87D/R-129-213、87-X129Q-213、87-129-X
213A、X87D/R-X129Q-213、X87D/R-129-X213A、8
7-X129Q-X213A、X87D/R-X129Q-X213A、87-129-
249、X87D/R-129-249、87-X129Q-249、87-129-X
249N/R、X87D/R-X129Q-249、X87D/R-129-X249N
/R、87-X129Q-X249N/R、X87D/R-X129Q-X249N/R
、87-130-206、X87D/R-130-206、87-X130A-206、
87-130-X206L/Y、X87D/R-X130A-206、X87D/R-1
30-X206L/Y、87-X130A-X206L/Y、X87D/R-X130A
-X206L/Y、87-130-209、X87D/R-130-209、87-X1
30A-209、87-130-X209W、X87D/R-X130A-209、X8
7D/R-130-X209W、87-X130A-X209W、X87D/R-X13
0A-X209W、87-130-213、X87D/R-130-213、87-X1
30A-213、87-130-X213A、X87D/R-X130A-213、X8
7D/R-130-X213A、87-X130A-X213A、X87D/R-X13
0A-X213A、87-130-249、X87D/R-130-249、87-X1
30A-249、87-130-X249N/R、X87D/R-X130A-249、
X87D/R-130-X249N/R、87-X130A-X249N/R、X87D
/R-X130A-X249N/R、87-206-209、X87D/R-206-2
09、87-X206L/Y-209、87-206-X209W、X87D/R-X2
06L/Y-209、X87D/R-206-X209W、87-X206L/Y-X2
09W、X87D/R-X206L/Y-X209W、87-206-213、87-X
206L/Y-213、87-206-X213A、X87D/R-206-213、X
87D/R-X206L/Y-213、X87D/R-206-X213A、87-X2
06L/Y-X213A、X87D/R-X206L/Y-X213A、87-206-
249、87-X206L/Y-249、87D/R-206-249、87-209-
X249N/R、X87R-206-X249N/R、X87D/R-X206L/Y-
249、87-X206L/Y-X249N/R、X87R-X206L/Y-X249
N/R、87-209-213、X87D/R-209-213、87-X209W-2
13、87-209-X213A、X87D/R-X209W-213、X87D/R-
209-X213A、87-X209W-X213A、X87D/R-X209W-X2
13A、87-209-249、87-X209W-249、87-209-X249N
/R、X87D/R-209-249、X87D/R-X209W-249、87-X2
09W-X249N/R、X87R-209-X249N/R、X87D/R-X209
W-X249N/R、87-213-249、87-X213A-249、X87D/R
-213-249、87-213-X249N/R、X87D/R-X213A-249
、X87D/R-213-X249N/R、87-X213A-X249N/R、X87
D/R-X213A-X249N/R、129-130-206、X129Q-130-
206、129-X130A-206、129-130-X206L/Y、X129Q-
X130A-206、X129Q-130-X206L/Y、129-X130A-X2
06L/Y、X129Q-X130A-X206L/Y、129-130-209、X1
29Q-130-209、129-X130A-209、129-130-X209W、
X129Q-X130A-209、X129Q-130-X209W、129-X130
A-X209W、X129Q-X130A-X209W、129-130-213、X1
29Q-130-213、129-X130A-213、129-130-X213A、
X129Q-X130A-213、X129Q-130-X213A、129-X130
A-X213A、X129Q-X130A-X213A、129-130-249、X1
29Q-130-249、129-X130A-249、129-130-X249N/
R、X129Q-X130A-249、X129Q-130-X249N/R、129-
X130A-X249N/R、X129Q-X130A-X249N/R、129-20
6-209、X129Q-206-209、129-X206L/Y-209、129-
206-X209W、X129Q-X206L/Y-209、X129Q-206-X2
09W、129-X206L/Y-X209W、X129Q-X206L/Y-X209
W、129-206-213、129-X206L/Y-213、129-206-X2
13A、X129Q-206-213、X129Q-X206L/Y-213、X129
Q-206-X213A、129-X206L/Y-X213A、X129Q-X206
L/Y-X213A、129-206-249、129-X206L/Y-249、12
9-206-X249N/R、X129Q-206-249、X129A-X206L/
Y-249、X129Q-206-X249N/R、129-X206L/Y-X249
N/R、X129Q-X206L/Y-X249N/R、129-209-213、12
9-X209W-213、129-209-X213A、X129Q-209-213、
X129Q-X209W-213、X129Q-209-X213A、129-X209
W-X213A、X129Q-X209W-X213A、129-209-249、12
9-X209W-249、129-209-X249N/R、X129Q-209-24
9、X129Q-X209W-249、X129Q-209-X249N/R、129-
X209W-X249N/R、X129Q-X209W-X249N/R、129-21
3-249、129-X213A-249、129-213-X249N/R、X129
Q-213-249、X129Q-X213A-249、129-X213A-X249
R、X129Q-213-X249N/R、X129Q-X213A-X249N/R、
130-206-209、X130A-206-209、130-X206L/Y-20
9、130-209-X209W、X130A-X206L/Y-209、X130A-
206-X209W、130-X206L/Y-X209W、X130A-X206L/
Y-X209W、130-206-213、130-X206L/Y-213、130-
206-X213A、X130A-206-213、X130A-X206L/Y-21
3、X130A-206-X213A、130-X206L/Y-X213A、X130
A-X206L/Y-X213A、130-206-249、130-X206L/Y-
249、130-206-X249N/R、X130A-206-249、X130A-
X206L/Y-249、X130A-206-X249N/R、130-X206L/
Y-X249N/R、X130A-X206L/Y-X249N/R、130-209-
213、130-X209W-213、130-209-X213A、X130A-20
9-213、X130A-X209W-213、X130A-209-X213A、13
0-X209W-X213A、X130A-X209W-X213A、130-209-
249、130-X209W-249、130-209-X249N/R、X130A-
209-249、X130A-X209W-249、X130A-209-X249N/
R、130-X209W-X249N/R、X130A-X209W-X249N/R、
130-213-249、130-X213A-249、130-213-X249N/
R、X130A-213-249、X130A-X213A-249、130-X213
A-X249R、X130A-213-X249N/R、X130A-X213A-X2
49N/R、130-209-249、130-X209W-249、130-209-
X249N/R、X130A-209-249、X130A-X209W-249、X1
30A-209-X249N/R、130-X209W-X249N/R、X130A-
X209W-X249N/R、206-209-213、206-X209W-213、
206-209-X213A、X206L/Y-209-213、206-X209W-
X213A、X206L/Y-X209W-213、X206L/Y-209-X213
A、X206L/Y-X209W-X213A、206-209-249、206-X2
09W-249、206-209-X249N/R、X206L/Y-209-249、
X206L/Y-X209W-249、206-X209W-X249N/R、X206
L/Y-209-X249N/R、X206L/Y-X209W-X249N/R、20
6-213-249、206-X213A-249、206-213-X249N/RX
206L/Y-213-249、X206L/Y-X213A-249、X206L/Y
-213-X249N/R、206-X213A-X249N/R、X206L/Y-X
213A-X249N/R、209-213-249、X209W-213-249、2
09-X213A-249、209-213-X249N/R、X209W-X213A
-249、X209W-213-X249N/R、209-X213A-X249N/R
、X209W-X213A-X249N/Rおよびこれらの組み合わせから選択される、
2つ以上の位置でのアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含む、単離されたス
ブチリシン変異体を提供する;ここでXは任意のアミノ酸であり、前記変異体はタンパク
質分解活性を有しており、さらに、前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示さ
れるバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquef
aciens)スブチリシンBPN’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付
けされており、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントに
より決定されたものである。さらに他の実施形態は、78-X206L/Y、X78N-
206、X78N-X206L/Y、18-X78N、X18K/R-X78N、18-
X87R、X18K/R-X87R、18-X206L/Y、X18K/R-X206L
/Y、24-X87R、X24F/P/R-X87R、24-X206L/Y、X24F
/P/R-206、X24F/P/R-X206L/Y、24-X209W、X24F/
P/R-X209W、X78N-87、X78N-X87D/R、78-X129Q、X
78N-X129Q、78-X130A、X78N-130、X78N-209、78-
X209W、X78N-X209W、78-X249N/R、X78N-249、X78
N-X249N/R、87-X206L/Y、X87D/R-X206L/Y、87-X
209W、X87D/R-X209W、87-X213A、X87D/R-213、X8
7D/R-X213A、X87R-X249N/R、129-X206L/Y、X129
Q-206、X129Q-X206L/Y、129-X209W、X129Q-X209
W、129-X249N/R、X129Q-249、X129Q-X249N/R、13
0-X206L/Y、X130A-206、X130A-X206L/Y、130-X2
09W、X130A-X209W、130-X249N/R、X130A-249、X1
30A-X249N/R、206-X209W、X206L/Y-209、X206L/
Y-X209W、206-X213A、X206L/Y-213、X206L/Y-X2
13A、X206L/Y-249、X206L/Y-X249N/R、X209W-21
3、X209W-X213A、X209W-249、X209W-X249N/R、18
-24-78、X18K/R-24-78、18-X24F/P/R-78、18-24
-X78N、X18K/R-24-X78N、18-X24F/P/R-X78N、X1
8K/R-X24F/P/R-78、X18K/R-X24F/P/R-X78N、18
-24-87、X18K/R-24-87、18-X24F/P/R-87、18-24
-X87D/R、X18K/R-24-X87D/R、18-X24F/P/R-X87
D/R、X18K/R-X24F/P/R-87、X18K/R-X24F/P/R-X
87D/R、18-24-129、X18K/R-24-129、18-X24F/P/
R-129、18-24-X129Q、X18K/R-X24F/P/R-129、X1
8K/R-24-X129Q、18-X24F/P/R-X129Q、X18K/R-X
24F/P/R-X129Q、18-24-130、18-X24F/P/R-130、
18-24-X130A、X18K/R-24-130、X18K/R-X24F/P/
R-130、X18K/R-24-X130A、18-X24F/P/R-X130A、
X18K/R-X24F/P/R-X130A、18-24-206、18-24-X2
06L/Y、18-X24F/P/R-206、X18K/R-24-206、X18K
/R-24-X206L/Y、18-X24F/P/R-X206L/Y、X18K/R
-X24F/P/R-206、X18K/R-X24F/P/R-X206L/Y、18
-24-209、18-24-X209W、18-X24F/P/R-209、X18K
/R-24-209、X18K/R-24-X209W、18-X24F/P/R-X2
09W、X18K/R-X24F/P/R-209、X18K/R-X24F/P/R-
X209W、18-78-87、18-X78N-87、18-78-X87D/R、X
18K/R-78-87、X18K/R-X78N-87、X18K/R-78-X87
D/R、18-X78N-X87D/R、X18K/R-X78N-X87D/R、18
-78-129、18-X78N-129、18-78-X129Q、X18K/R-7
8-129、X18K/R-X78N-129、X18K/R-78-X129Q、18
-X78N-X129Q、X18K/R-X78N-X129Q、18-78-130、
18-X78N-130、18-78-X130A、X18K/R-78-130、X1
8K/R-X78N-130、X18K/R-78-X130A、18-X78N-X1
30A、X18K/R-X78N-X130A、18-78-206、18-78-X2
06L/Y、18-X78N-206、X18K/R-78-206、18-X78N-
X206L/Y、X18K/R-X78N-206、X18K/R-78-X206L/
Y、X18K/R-X78N-X206L/Y、18-78-209、18-X78N-
209、18-78-X209W、X18K/R-78-209、X18K/R-78-
X209W、18-X78N-X209W、X18K/R-X78N-209、X18K
/R-X78N-X209W、18-78-213、18-X78N-213、18-7
8-X213A、X18K/R-78-213、18-X78N-X213A、X18K
/R-X78N-213、X18K/R-78-X213A、X18K/R-X78N-
X213A、18-78-249、18-78-X249N/R、18-X78N-24
9、X18K/R-78-249、18-X78N-X249N/R、X18K/R-X
78N-249、X18K/R-78-X249N/R、X18K/R-X78N-X2
49N/R、18-87-129、X18K/R-87-129、18-X87D/R-
129、18-87-X129Q、18-X87D/R-X129Q、X18K/R-8
7-X129Q、X18K/R-X87D/R-129、X18K/R-X87D/R-
X129Q、18-87-130、X18K/R-87-130、18-X87D/R-
130、18-87-X130A、18-X87D/R-X130A、X18K/R-8
7-X130A、X18K/R-X87D/R-130、X18K/R-X87D/R-
X130A、18-87-206、X18K/R-87-206、18-X87D/R-
206、18-87-X206L/Y、18-X87D/R-X206L/Y、X18K
/R-87-X206L/Y、X18K/R-X87D/R-206、X18K/R-X
87D/R-X206L/Y、18-87-209、X18K/R-87-209、18
-X87D/R-209、18-87-X209W、18-X87D/R-X209W、
X18K/R-X87D/R-209、X18K/R-87-X209W、X18K/R
-X87D/R-X209W、18-X87D/R-213、18-87-X213A、
18-X87D/R-X213A、X18K/R-X87D/R-213、X18K/R
-87-X213A、X18K/R-X87D/R-X213A、18-87-249、
X18K/R-87-249、18-X87D/R-249、18-87-X249N/
R、18-X87D/R-249N/R、18K/R-X87D/R-249、18K/
R-87-X249N/R、18K/R-X87D/R-X249N/R、18-129
-130、X18K/R-129-130、18-X129Q-130、18-129-
X130A、X18K/R-X129Q-130、X18K/R-129-X130A、
18-X129Q-X130A、X18K/R-X129Q-X130A、18-129
-206、X18K/R-129-206、18-X129Q-206、18-129-
X206L/Y、X18K/R-X129Q-206、X18K/R-129-X206
L/Y、18-X129Q-X206L/Y、X18K/R-X129Q-X206L/
Y、18-129-209、X18K/R-129-209、18-X129Q-209
、18-129-X209W、X18K/R-X129Q-209、X18K/R-12
9-X209W、18-X129Q-X209W、X18K/R-X129Q-X209
W、18-129-213、X18K/R-129-213、18-X129Q-213
、18-129-X213A、X18K/R-X129Q-213、X18K/R-12
9-X213A、18-X129Q-X213A、X18K/R-X129Q-X213
A、18-129-249、X18K/R-129-249、18-X129Q-249
、18-129-X249N/R、X18K/R-X129Q-249、X18K/R-
129-X249N/R、18-X129Q-X249N/R、X18K/R-X129
Q-X249N/R、18-130-206、X18K/R-130-206、18-X
130A-206、18-130-X206L/Y、X18K/R-X130A-206
、X18K/R-130-X206L/Y、18-X130A-X206L/Y、X18
K/R-X130A-X206L/Y、18-130-209、X18K/R-130-
209、18-X130A-209、18-130-X209W、X18K/R-X13
0A-209、X18K/R-130-X209W、18-X130A-X209W、X
18K/R-X130A-X209W、18-130-213、X18K/R-130-
213、18-X130A-213、18-130-X213A、X18K/R-X13
0A-213、X18K/R-130-X213A、18-X130A-X213A、X
18K/R-X130A-X213A、18-130-249、X18K/R-130-
249、18-X130A-249、18-130-X249N/R、X18K/R-X
130A-249、X18K/R-130-X249N/R、18-X130A-X24
9N/R、X18K/R-X130A-X249N/R、18-206-209、18-
206-X209W、18-X206L/Y-209、18K/R-206-209、1
8-X206L/Y-X209W、X18K/R-X206L/Y-209、X18K/
R-206-X209W、X18K/R-X206L/Y-X209W、18-206-
213、X18K/R-206-213、18-206L/Y-213、18-206-
X213A、X18K/R-X206L/Y-213、X18K/R-206-X213
A、18-X206L/Y-X213A、X18K/R-X206L/Y-X213A、
18-206-249、X18K/R-206-249、18-206L/Y-249、
18-206-X249N/R、X18K/R-X206L/Y-249、X18K/R
-206-X249N/R、18-X206L/Y-X249N/R、X18K/R-X
206L/Y-X249N/R、18-209-213、18-X209W-213、X
18K/R-209-213、18-209-X213A、18-X209W-X213
A、X18K/R-X209W-213、X18K/R-209-X213A、X18K
/R-X209W-X213A、18-209-249、18-X209W-249、X
18K/R-209-249、18-209-X249N/R、18-X209W-X2
49N/R、18K/R-X209W-249、X18K/R-209-X249N/R
、X18K/R-X209W-X249N/R、18-213-X249N/R、X18
K/R-X213A-249、X18K/R-213-X249N/R、18-X213
A-X249N/R、X18K/R-X213A-X249N/R、24-78-87、
24-78-X87D/R、24-X78N-87、X24F/P/R-78-87、2
4-X78N-X87D/R、X24R/P/F-78-X87D/R、X24F/P/
R-X78N-87、X24R/P/F-X78N-X87D/R、24-78-129
、X24F/P/R-78-129、24-X78N-129、24-78-X129Q
、X24F/P/R-X78N-129、X24F/P/R-78-X129Q、24-
X78N-X129Q、X24F/P/R-X78N-X129Q、24-78-130
、X24F/P/R-78-130、24-X78N-130、24-78-X130A
、X24F/P/R-X78N-130X24F/P/R-78-X130A、24-X
78N-X130A、X24F/P/R-X78N-X130A、24-78-X206
L/Y、X24F/P/R-78-206、24-X78N-X206L/Y、X24F
/P/R-X78N-206、X24F/P/R-78-X206L/Y、X24F/P
/R-X78N-X206L/Y、24-78-209、X24F/P/R-78-20
9、24-X78N-209、24-78-X209W、X24F/P/R-X78N-
209、X24F/P/R-78-X209W、24-X78N-X209W、X24F
/P/R-X78N-X209W、24-78-213、X24F/P/R-78-21
3、24-X78N-213、24-78-X213A、X24F/P/R-X78N-
213、X24F/P/R-78-X213A、24-X78N-X213A、X24F
/P/R-X78N-X213A、24-78-X249N/R、24-X78N-24
9、24-X78N-X249N/R、X24F/P/R-X78N-249、X24F
/P/R-78-X249N/R、X24F/P/R-X78N-X249N/R、24
-87-129、X24F/P/R-87-129、24-X87D/R-129、24
-87-X129Q、X24F/P/R-X87D/R-129、X24F/P/R-8
7-X129Q、24-X87D/R-X129Q、X24F/P/R-X87D/R-
X129Q、24-87-130、X24F/P/R-87-130、24-X87D/
R-130、24-87-X130A、X24F/P/R-X87D/R-130、X2
4F/P/R-87-X130A、24-X87D/R-X130A、X24F/P/R
-X87D/R-X130A、24-87-X206L/Y、24-X87R-206、
X24F/P/R-87-206、24-X87D/R-X206L/Y、X24F/P
/R-X87D/R-206、X24F/P/R-87-X206L/Y、X24F/P
/R-X87D/R-X206L/Y、24-87-X209W、X24F/P/R-8
7-X209W、24-87-X209W、24-87D/R-X209W、X24F/
P/R-X87D/R-X209W、24-X87D/R-213、24-87-X21
3A、24-X87D/R-X213A、X24F/P/R-X87D/R-213、X
24F/P/R-87-X213A、X24F/P/R-X87D/R-X213A、2
4-87-249、X24F/P/R-87-249、24-X87D/R-249、2
4-87-X249N/R、X24F/P/R-X87D/R-249、X24F/P/
R-87-X249N/R、24-X87D/R-X249N/R、X24F/P/R-
X87D/R-X249N/R、24-129-130、X24F/P/R-129-1
30、24-X129Q-130、24-129-X130A、X24F/P/R-X1
29Q-130、X24F/P/R-129-X130A、24-X129Q-X130
A、X24F/P/R-X129Q-X130A、24-129-206、X24F/P
/R-129-206、24-X129Q-206、24-129-X206L/Y、X
24F/P/R-X129Q-206、X24F/P/R-129-X206L/Y、2
4-X129Q-X206L/Y、X24F/P/R-X129Q-X206L/Y、2
4-129-209、X24F/P/R-129-209、24-X129Q-209、
24-129-X209W、X24F/P/R-X129Q-209、X24F/P/R
-129-X209W、24-X129Q-X209W、X24F/P/R-X129Q
-X209W、24-129-213、X24F/P/R-129-213、24-X1
29Q-213、24-129-X213A、X24F/P/R-X129Q-213、
X24F/P/R-129-X213A、24-X129Q-X213A、X24F/P
/R-X129Q-X213A、24-129-249、X24F/P/R-129-2
49、24-X129Q-249、24-129-X249N/R、X24F/P/R-
X129Q-249、X24F/P/R-129-X249N/R、24-X129Q-
X249N/R、X24F/P/R-X129Q-X249N/R、24-130-20
6、X24F/P/R-130-206、24-X130A-206、24-130-X
206L/Y、X24F/P/R-X130A-206、X24F/P/R-130-X
206L/Y、24-X130A-X206L/Y、X24F/P/R-X130A-X
206L/Y、24-130-209、X24F/P/R-130-209、24-X1
30A-209、24-130-X209W、X24F/P/R-X130A-209、
X24F/P/R-130-X209W、24-X130A-X209W、X24F/P
/R-X130A-X209W、24-130-213、X24F/P/R-130-2
13、24-X130A-213、24-130-X213A、X24F/P/R-X1
30A-213、X24F/P/R-130-X213A、24-X130A-X213
A、X24F/P/R-X130A-X213A、24-130-249、X24F/P
/R-130-249、24-X130A-249、24-130-X249N/R、X
24F/P/R-X130A-249、X24F/P/R-130-X249N/R、2
4-X130A-X249N/R、X24F/P/R-X130A-X249N/R、2
4-206-209、24-206-X209W、24-X206L/Y-209、24
F/P/R-206-209、24-X206L/Y-X209W、X24F/P/R-
X206L/Y-209、X24F/P/R-206-X209W、X24F/P/R-
X206L/Y-X209W、24-206-213、X24F/P/R-206-21
3、24-X206L/Y-213、24-206-X213A、X24F/P/R-X
206L/Y-213、X24F/P/R-206-X213A、24-X206L/Y
-X213A、X24F/P/R-X206L/Y-X213A、24-206-249
、24-X206L/Y-249、X24F/P/R-206-249、24-206-
X249N/R、24-X206L/Y-X249N/R、X24F/P/R-X206
L/Y-249、X24F/P/R-206-X249N/R、X24F/P/R-X2
06L/Y-X249N/R、24-209-213、24-X209W-213、X2
4F/P/R-209-213、24-209-X213A、X24F/P/R-X20
9W-213、24-X209W-X213A、X24F/P/R-209-X213A
、X24F/P/R-X209W-X213A、24-209-249、24-X209
W-249、X24F/P/R-209-249、24-209-X249N/R、X2
4F/P/R-X209W-249、24-X209W-X249N/R、X24F/P
/R-209-X249N/R、X24F/P/R-X209W-X249N/R、78
-87-129、X78N-87-129、78-X87D/R-129、78-87-
X129Q、X78N-X87D/R-129、X78N-87-X129Q、78-X
87D/R-X129Q、X78N-X87D/R-X129Q、78-87-130、
X78N-87-130、78-X87D/R-130、78-87-X130A、X7
8N-X87D/R-130、X78N-87-X130A、78-X87D/R-X1
30A、X78N-X87D/R-X130A、78-87-206、78-87-X2
06L/Y、X78N-87-206、78-X87D/R-206、78-X87D/
R-X206L/Y、X78N-87-X206L/Y、X78N-X87D/R-20
6、X78N-X87D/R-X206L/Y、78-87-209、78-87-X2
09W、X78N-87-209、78-X87D/R-209、X78N-X87D/
R-209、78-X87D/R-X209W、X78N-87-X209W、X78N
-X87D/R-X209W、78-87-213、X78N-87-213、78-X
87D/R-213、78-87-X213A、X78N-X87D/R-213、X7
8N-87-X213A、78-X87D/R-X213A、X78N-X87D/R-
X213A、78-87-249、78-87-X249N/R、X78N-87-24
9、78-87D/R-249、X78N-X87D/R-249、78-X87D/R
-X249N/R、X78N-87-X249N/R、X78N-X87D/R-X24
9N/R、78-129-130、X78N-129-130、78-X129Q-13
0、78-129-X130A、X78N-X129Q-130、X78N-129-X
130A、78-X129Q-X130A、X78N-X129Q-X130A、78-
129-206、X78N-129-206、78-X129Q-206、78-129
-X206L/Y、X78N-X129Q-206、X78N-129-X206L/Y
、78-X129Q-X206L/Y、X78N-X129Q-X206L/Y、78-
129-209、X78N-129-209、78-X129Q-209、78-129
-X209W、X78N-X129Q-209、X78N-129-X209W、78-
X129Q-X209W、X78N-X129Q-X209W、78-129-213、
X78N-129-213、78-X129Q-213、78-129-X213A、X
78N-X129Q-213、X78N-129-X213A、78-X129Q-X2
13A、X78N-X129Q-X213A、78-129-249、X78N-129
-249、78-X129Q-249、78-129-X249N/R、X78N-X1
29Q-249、X78N-129-X249N/R、78-X129Q-X249N/
R、X78N-X129Q-X249N/R、78-130-206、X78N-130
-206、78-X130A-206、78-130-X206L/Y、X78N-X1
30A-206、X78N-130-X206L/Y、78-X130A-X206L/
Y、X78N-X130A-X206L/Y、78-130-209、X78N-130
-209、78-X130A-209、78-130-X209W、X78N-X130
A-209、X78N-130-X209W、78-X130A-X209W、X78N
-X130A-X209W、78-130-213、X78N-130-213、78-
X130A-213、78-130-X213A、X78N-X130A-213、X7
8N-130-X213A、78-X130A-X213A、X78N-X130A-X
213A、78-130-213、X78N-130-213、78-X130A-21
3、78-130-X213A、X78N-X130A-213、X78N-130-X
213A、78-X130A-X213A、X78N-X130A-X213A、78-
130-249、X78N-130-249、78-X130A-249、78-130
-X249N/R、X78N-X130A-249、X78N-130-X249N/R
、78-X130A-X249N/R、X78N-X130A-X249N/R、78-
206-209、X78N-206-209、78-X206L/Y-209、78-2
06-X209W、X78N-X206L/Y-209、X78N-206-X209W
、78-X206L/Y-X209W、X78N-X206L/Y-X209W、78-
206-213、X78N-206-213、78-X206L/Y-213、78-2
06-X213A、X78N-X206L/Y-213、X78N-206-X213A
、78-X206L/Y-X213A、X78N-X206L/Y-X213A、78-
206-249、78-206-X249R/N、78-X206L/Y-249、X7
8N-206-249、X78N-206-X249N/R、78-X206L/Y-X
249N/R、X78N-X206L/Y-249、X78N-X206L/Y-X24
9N/R、78-209-213、78-X209W-213、78-209-X213
A、X78N-209-213、X78N-X209W-213、X78N-209-X
213A、78-X209W-X213A、X78N-X209W-X213A、78-
209-249、78-X209W-249、78-209-X249N/R、X78N
-209-249、78-X209W-X249N/R、X78N-X209W-249
、X78N-209-X249N/R、X78N-X209W-X249N/R、78-
213-249、78-X213A-249、X78N-213-249、78-213
-X249N/R、X78N-X213A-249、X78N-213-X249N/R
、78-X213A-X249N/R、X78N-X213A-X249N/R、87-
129-130、X87D/R-129-130、87-X129Q-130、87-1
29-X130A、X87D/R-X129Q-130、X87D/R-129-X13
0A、87-X129Q-X130A、X87D/R-X129Q-X130A、87-
129-206、X87D/R-129-206、87-X129Q-206、87-1
29-X206L/Y、X87D/R-X129Q-206、X87D/R-129-X
206L/Y、87-X129Q-X206L/Y、X87D/R-X129Q-X20
6L/Y、87-129-209、X87D/R-129-209、87-X129Q-
209、87-129-X209W、X87D/R-X129Q-209、X87D/R
-129-X209W、87-X129Q-X209W、X87D/R-X129Q-X
209W、87-129-213、X87D/R-129-213、87-X129Q-
213、87-129-X213A、X87D/R-X129Q-213、X87D/R
-129-X213A、87-X129Q-X213A、X87D/R-X129Q-X
213A、87-129-249、X87D/R-129-249、87-X129Q-
249、87-129-X249N/R、X87D/R-X129Q-249、X87D
/R-129-X249N/R、87-X129Q-X249N/R、X87D/R-X
129Q-X249N/R、87-130-206、X87D/R-130-206、8
7-X130A-206、87-130-X206L/Y、X87D/R-X130A-
206、X87D/R-130-X206L/Y、87-X130A-X206L/Y、
X87D/R-X130A-X206L/Y、87-130-209、X87D/R-1
30-209、87-X130A-209、87-130-X209W、X87D/R-
X130A-209、X87D/R-130-X209W、87-X130A-X209
W、X87D/R-X130A-X209W、87-130-213、X87D/R-1
30-213、87-X130A-213、87-130-X213A、X87D/R-
X130A-213、X87D/R-130-X213A、87-X130A-X213
A、X87D/R-X130A-X213A、87-130-249、X87D/R-1
30-249、87-X130A-249、87-130-X249N/R、X87D/
R-X130A-249、X87D/R-130-X249N/R、87-X130A-
X249N/R、X87D/R-X130A-X249N/R、87-206-209、
X87D/R-206-209、87-X206L/Y-209、87-206-X20
9W、X87D/R-X206L/Y-209、X87D/R-206-X209W、8
7-X206L/Y-X209W、X87D/R-X206L/Y-X209W、87-
206-213、87-X206L/Y-213、87-206-X213A、X87D
/R-206-213、X87D/R-X206L/Y-213、X87D/R-206
-X213A、87-X206L/Y-X213A、X87D/R-X206L/Y-X
213A、87-206-249、87-X206L/Y-249、87D/R-206
-249、87-209-X249N/R、X87R-206-X249N/R、X87
D/R-X206L/Y-249、87-X206L/Y-X249N/R、X87R-
X206L/Y-X249N/R、87-209-213、X87D/R-209-21
3、87-X209W-213、87-209-X213A、X87D/R-X209W
-213、X87D/R-209-X213A、87-X209W-X213A、X87
D/R-X209W-X213A、87-209-249、87-X209W-249、
87-209-X249N/R、X87D/R-209-249、X87D/R-X20
9W-249、87-X209W-X249N/R、X87R-209-X249N/R
、X87D/R-X209W-X249N/R、87-213-249、87-X213
A-249、X87D/R-213-249、87-213-X249N/R、X87D
/R-X213A-249、X87D/R-213-X249N/R、87-X213A
-X249N/R、X87D/R-X213A-X249N/R、129-130-20
6、X129Q-130-206、129-X130A-206、129-130-X2
06L/Y、X129Q-X130A-206、X129Q-130-X206L/Y、
129-X130A-X206L/Y、X129Q-X130A-X206L/Y、12
9-130-209、X129Q-130-209、129-X130A-209、12
9-130-X209W、X129Q-X130A-209、X129Q-130-X2
09W、129-X130A-X209W、X129Q-X130A-X209W、12
9-130-213、X129Q-130-213、129-X130A-213、12
9-130-X213A、X129Q-X130A-213、X129Q-130-X2
13A、129-X130A-X213A、X129Q-X130A-X213A、12
9-130-249、X129Q-130-249、129-X130A-249、12
9-130-X249N/R、X129Q-X130A-249、X129Q-130-
X249N/R、129-X130A-X249N/R、X129Q-X130A-X2
49N/R、129-206-209、X129Q-206-209、129-X206
L/Y-209、129-206-X209W、X129Q-X206L/Y-209、
X129Q-206-X209W、129-X206L/Y-X209W、X129Q-
X206L/Y-X209W、129-206-213、129-X206L/Y-21
3、129-206-X213A、X129Q-206-213、X129Q-X206
L/Y-213、X129Q-206-X213A、129-X206L/Y-X213
A、X129Q-X206L/Y-X213A、129-206-249、129-X2
06L/Y-249、129-206-X249N/R、X129Q-206-249、
X129A-X206L/Y-249、X129Q-206-X249N/R、129-
X206L/Y-X249N/R、X129Q-X206L/Y-X249N/R、12
9-209-213、129-X209W-213、129-209-X213A、X1
29Q-209-213、X129Q-X209W-213、X129Q-209-X2
13A、129-X209W-X213A、X129Q-X209W-X213A、12
9-209-249、129-X209W-249、129-209-X249N/R、
X129Q-209-249、X129Q-X209W-249、X129Q-209-
X249N/R、129-X209W-X249N/R、X129Q-X209W-X2
49N/R、129-213-249、129-X213A-249、129-213-
X249N/R、X129Q-213-249、X129Q-X213A-249、12
9-X213A-X249R、X129Q-213-X249N/R、X129Q-X2
13A-X249N/R、130-206-209、X130A-206-209、13
0-X206L/Y-209、130-209-X209W、X130A-X206L/
Y-209、X130A-206-X209W、130-X206L/Y-X209W、
X130A-X206L/Y-X209W、130-206-213、130-X206
L/Y-213、130-206-X213A、X130A-206-213、X130
A-X206L/Y-213、X130A-206-X213A、130-X206L/
Y-X213A、X130A-X206L/Y-X213A、130-206-249、
130-X206L/Y-249、130-206-X249N/R、X130A-20
6-249、X130A-X206L/Y-249、X130A-206-X249N/
R、130-X206L/Y-X249N/R、X130A-X206L/Y-X249
N/R、130-209-213、130-X209W-213、130-209-X2
13A、X130A-209-213、X130A-X209W-213、X130A-
209-X213A、130-X209W-X213A、X130A-X209W-X2
13A、130-209-249、130-X209W-249、130-209-X2
49N/R、X130A-209-249、X130A-X209W-249、X130
A-209-X249N/R、130-X209W-X249N/R、X130A-X2
09W-X249N/R、130-213-249、130-X213A-249、13
0-213-X249N/R、X130A-213-249、X130A-X213A-
249、130-X213A-X249R、X130A-213-X249N/R、X1
30A-X213A-X249N/R、130-209-249、130-X209W-
249、130-209-X249N/R、X130A-209-249、X130A-
X209W-249、X130A-209-X249N/R、130-X209W-X2
49N/R、X130A-X209W-X249N/R、206-209-213、20
6-X209W-213、206-209-X213A、X206L/Y-209-21
3、206-X209W-X213A、X206L/Y-X209W-213、X206
L/Y-209-X213A、X206L/Y-X209W-X213A、206-20
9-249、206-X209W-249、206-209-X249N/R、X206
L/Y-209-249、X206L/Y-X209W-249、206-X209W-
X249N/R、X206L/Y-209-X249N/R、X206L/Y-X209
W-X249N/R、206-213-249、206-X213A-249、206-
213-X249N/RX206L/Y-213-249、X206L/Y-X213A
-249、X206L/Y-213-X249N/R、206-X213A-X249N
/R、X206L/Y-X213A-X249N/R、209-213-249、X20
9W-213-249、209-X213A-249、209-213-X249N/R
、X209W-X213A-249、X209W-213-X249N/R、209-X
213A-X249N/R、X209W-X213A-X249N/Rおよびこれらの組
み合わせから選択される、2つ以上の位置でのアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸
配列を含む、単離されたスブチリシン変異体を提供する;ここで、Xは任意のアミノ酸で
あり、前記変異体はタンパク質分解活性を有しており、前記変異体のアミノ酸配列は、(
i)1、3、9、16、20、22、28、42、43、44、56、76、77、99
、100、101、103、104、108、116、118、120、124、127
、128、150、158、159、166、185、188、194、204、212
、217、218、222、232、235、243、245、246、251、254
、259、268および270、(ii)X1V、X3T/V、X9G、X16T、X2
0E/R、X22L、X28T、X42I、X43R/S、X44V、X56P、X76
D、X77D、X99N、X100S、X101F/G/H/T/V、X103A/D/
P、X104I、X108S、X116L/M、X118R/V、X120R、X124
M、X127T、X128L、X150T、X158E/T/V、X159D、X166
D/N、X185Y、X188D、X194D、X204D、X212D、X217K、
X218S、X222L/Q/S、X232V、X235T、X243S、X245R、
X246V、X251R、X254T、X259G、X268AおよびX270P/Tま
たは(iii)A1V、S3T/V、S9G、A16T、G20E/R、T22L、V2
8T、L42I、N43R/S、I44V、S56P、N76D、N77D、S99N、
G100S、S101F/G/H/T/V、S103A/D/P、V104I、A108
S、N116L/M、G118R/V、H120R、L124M、G127T、S128
L、V150T、A158E/T/V、G159D、S166D/N、N185Y、S1
88D、A194D、N204D、S212D、L217K、N218S、M222L/
Q/S、A232V、K235T、N243S、Q245R、I246V、K251R、
A254T、S259G、V268AおよびA270P/Tから選択される1つ以上の置
換をさらに含み、さらに、前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチ
ルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefacie
ns)スブチリシンBPN’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされて
おり、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定
されたものである。またさらに他の実施形態は、78-X206L/Y、X78N-20
6、X78N-X206L/Y、18-X78N、X18K/R-X78N、18-X8
7R、X18K/R-X87R、18-X206L/Y、X18K/R-X206L/Y
、24-X87R、X24F/P/R-X87R、24-X206L/Y、X24F/P
/R-206、X24F/P/R-X206L/Y、24-X209W、X24F/P/
R-X209W、X78N-87、X78N-X87D/R、78-X129Q、X78
N-X129Q、78-X130A、X78N-130、X78N-209、78-X2
09W、X78N-X209W、78-X249N/R、X78N-249、X78N-
X249N/R、87-X206L/Y、X87D/R-X206L/Y、87-X20
9W、X87D/R-X209W、87-X213A、X87D/R-213、X87D
/R-X213A、X87R-X249N/R、129-X206L/Y、X129Q-
206、X129Q-X206L/Y、129-X209W、X129Q-X209W、
129-X249N/R、X129Q-249、X129Q-X249N/R、130-
X206L/Y、X130A-206、X130A-X206L/Y、130-X209
W、X130A-X209W、130-X249N/R、X130A-249、X130
A-X249N/R、206-X209W、X206L/Y-209、X206L/Y-
X209W、206-X213A、X206L/Y-213、X206L/Y-X213
A、X206L/Y-249、X206L/Y-X249N/R、X209W-213、
X209W-X213A、X209W-249、X209W-X249N/R、18-2
4-78、X18K/R-24-78、18-X24F/P/R-78、18-24-X
78N、X18K/R-24-X78N、18-X24F/P/R-X78N、X18K
/R-X24F/P/R-78、X18K/R-X24F/P/R-X78N、18-2
4-87、X18K/R-24-87、18-X24F/P/R-87、18-24-X
87D/R、X18K/R-24-X87D/R、18-X24F/P/R-X87D/
R、X18K/R-X24F/P/R-87、X18K/R-X24F/P/R-X87
D/R、18-24-129、X18K/R-24-129、18-X24F/P/R-
129、18-24-X129Q、X18K/R-X24F/P/R-129、X18K
/R-24-X129Q、18-X24F/P/R-X129Q、X18K/R-X24
F/P/R-X129Q、18-24-130、18-X24F/P/R-130、18
-24-X130A、X18K/R-24-130、X18K/R-X24F/P/R-
130、X18K/R-24-X130A、18-X24F/P/R-X130A、X1
8K/R-X24F/P/R-X130A、18-24-206、18-24-X206
L/Y、18-X24F/P/R-206、X18K/R-24-206、X18K/R
-24-X206L/Y、18-X24F/P/R-X206L/Y、X18K/R-X
24F/P/R-206、X18K/R-X24F/P/R-X206L/Y、18-2
4-209、18-24-X209W、18-X24F/P/R-209、X18K/R
-24-209、X18K/R-24-X209W、18-X24F/P/R-X209
W、X18K/R-X24F/P/R-209、X18K/R-X24F/P/R-X2
09W、18-78-87、18-X78N-87、18-78-X87D/R、X18
K/R-78-87、X18K/R-X78N-87、X18K/R-78-X87D/
R、18-X78N-X87D/R、X18K/R-X78N-X87D/R、18-7
8-129、18-X78N-129、18-78-X129Q、X18K/R-78-
129、X18K/R-X78N-129、X18K/R-78-X129Q、18-X
78N-X129Q、X18K/R-X78N-X129Q、18-78-130、18
-X78N-130、18-78-X130A、X18K/R-78-130、X18K
/R-X78N-130、X18K/R-78-X130A、18-X78N-X130
A、X18K/R-X78N-X130A、18-78-206、18-78-X206
L/Y、18-X78N-206、X18K/R-78-206、18-X78N-X2
06L/Y、X18K/R-X78N-206、X18K/R-78-X206L/Y、
X18K/R-X78N-X206L/Y、18-78-209、18-X78N-20
9、18-78-X209W、X18K/R-78-209、X18K/R-78-X2
09W、18-X78N-X209W、X18K/R-X78N-209、X18K/R
-X78N-X209W、18-78-213、18-X78N-213、18-78-
X213A、X18K/R-78-213、18-X78N-X213A、X18K/R
-X78N-213、X18K/R-78-X213A、X18K/R-X78N-X2
13A、18-78-249、18-78-X249N/R、18-X78N-249、
X18K/R-78-249、18-X78N-X249N/R、X18K/R-X78
N-249、X18K/R-78-X249N/R、X18K/R-X78N-X249
N/R、18-87-129、X18K/R-87-129、18-X87D/R-12
9、18-87-X129Q、18-X87D/R-X129Q、X18K/R-87-
X129Q、X18K/R-X87D/R-129、X18K/R-X87D/R-X1
29Q、18-87-130、X18K/R-87-130、18-X87D/R-13
0、18-87-X130A、18-X87D/R-X130A、X18K/R-87-
X130A、X18K/R-X87D/R-130、X18K/R-X87D/R-X1
30A、18-87-206、X18K/R-87-206、18-X87D/R-20
6、18-87-X206L/Y、18-X87D/R-X206L/Y、X18K/R
-87-X206L/Y、X18K/R-X87D/R-206、X18K/R-X87
D/R-X206L/Y、18-87-209、X18K/R-87-209、18-X
87D/R-209、18-87-X209W、18-X87D/R-X209W、X1
8K/R-X87D/R-209、X18K/R-87-X209W、X18K/R-X
87D/R-X209W、18-X87D/R-213、18-87-X213A、18
-X87D/R-X213A、X18K/R-X87D/R-213、X18K/R-8
7-X213A、X18K/R-X87D/R-X213A、18-87-249、X1
8K/R-87-249、18-X87D/R-249、18-87-X249N/R、
18-X87D/R-249N/R、18K/R-X87D/R-249、18K/R-
87-X249N/R、18K/R-X87D/R-X249N/R、18-129-1
30、X18K/R-129-130、18-X129Q-130、18-129-X1
30A、X18K/R-X129Q-130、X18K/R-129-X130A、18
-X129Q-X130A、X18K/R-X129Q-X130A、18-129-2
06、X18K/R-129-206、18-X129Q-206、18-129-X2
06L/Y、X18K/R-X129Q-206、X18K/R-129-X206L/
Y、18-X129Q-X206L/Y、X18K/R-X129Q-X206L/Y、
18-129-209、X18K/R-129-209、18-X129Q-209、1
8-129-X209W、X18K/R-X129Q-209、X18K/R-129-
X209W、18-X129Q-X209W、X18K/R-X129Q-X209W、
18-129-213、X18K/R-129-213、18-X129Q-213、1
8-129-X213A、X18K/R-X129Q-213、X18K/R-129-
X213A、18-X129Q-X213A、X18K/R-X129Q-X213A、
18-129-249、X18K/R-129-249、18-X129Q-249、1
8-129-X249N/R、X18K/R-X129Q-249、X18K/R-12
9-X249N/R、18-X129Q-X249N/R、X18K/R-X129Q-
X249N/R、18-130-206、X18K/R-130-206、18-X13
0A-206、18-130-X206L/Y、X18K/R-X130A-206、X
18K/R-130-X206L/Y、18-X130A-X206L/Y、X18K/
R-X130A-X206L/Y、18-130-209、X18K/R-130-20
9、18-X130A-209、18-130-X209W、X18K/R-X130A
-209、X18K/R-130-X209W、18-X130A-X209W、X18
K/R-X130A-X209W、18-130-213、X18K/R-130-21
3、18-X130A-213、18-130-X213A、X18K/R-X130A
-213、X18K/R-130-X213A、18-X130A-X213A、X18
K/R-X130A-X213A、18-130-249、X18K/R-130-24
9、18-X130A-249、18-130-X249N/R、X18K/R-X13
0A-249、X18K/R-130-X249N/R、18-X130A-X249N
/R、X18K/R-X130A-X249N/R、18-206-209、18-20
6-X209W、18-X206L/Y-209、18K/R-206-209、18-
X206L/Y-X209W、X18K/R-X206L/Y-209、X18K/R-
206-X209W、X18K/R-X206L/Y-X209W、18-206-21
3、X18K/R-206-213、18-206L/Y-213、18-206-X2
13A、X18K/R-X206L/Y-213、X18K/R-206-X213A、
18-X206L/Y-X213A、X18K/R-X206L/Y-X213A、18
-206-249、X18K/R-206-249、18-206L/Y-249、18
-206-X249N/R、X18K/R-X206L/Y-249、X18K/R-2
06-X249N/R、18-X206L/Y-X249N/R、X18K/R-X20
6L/Y-X249N/R、18-209-213、18-X209W-213、X18
K/R-209-213、18-209-X213A、18-X209W-X213A、
X18K/R-X209W-213、X18K/R-209-X213A、X18K/R
-X209W-X213A、18-209-249、18-X209W-249、X18
K/R-209-249、18-209-X249N/R、18-X209W-X249
N/R、18K/R-X209W-249、X18K/R-209-X249N/R、X
18K/R-X209W-X249N/R、18-213-X249N/R、X18K/
R-X213A-249、X18K/R-213-X249N/R、18-X213A-
X249N/R、X18K/R-X213A-X249N/R、24-78-87、24
-78-X87D/R、24-X78N-87、X24F/P/R-78-87、24-
X78N-X87D/R、X24R/P/F-78-X87D/R、X24F/P/R-
X78N-87、X24R/P/F-X78N-X87D/R、24-78-129、X
24F/P/R-78-129、24-X78N-129、24-78-X129Q、X
24F/P/R-X78N-129、X24F/P/R-78-X129Q、24-X7
8N-X129Q、X24F/P/R-X78N-X129Q、24-78-130、X
24F/P/R-78-130、24-X78N-130、24-78-X130A、X
24F/P/R-X78N-130X24F/P/R-78-X130A、24-X78
N-X130A、X24F/P/R-X78N-X130A、24-78-X206L/
Y、X24F/P/R-78-206、24-X78N-X206L/Y、X24F/P
/R-X78N-206、X24F/P/R-78-X206L/Y、X24F/P/R
-X78N-X206L/Y、24-78-209、X24F/P/R-78-209、
24-X78N-209、24-78-X209W、X24F/P/R-X78N-20
9、X24F/P/R-78-X209W、24-X78N-X209W、X24F/P
/R-X78N-X209W、24-78-213、X24F/P/R-78-213、
24-X78N-213、24-78-X213A、X24F/P/R-X78N-21
3、X24F/P/R-78-X213A、24-X78N-X213A、X24F/P
/R-X78N-X213A、24-78-X249N/R、24-X78N-249、
24-X78N-X249N/R、X24F/P/R-X78N-249、X24F/P
/R-78-X249N/R、X24F/P/R-X78N-X249N/R、24-8
7-129、X24F/P/R-87-129、24-X87D/R-129、24-8
7-X129Q、X24F/P/R-X87D/R-129、X24F/P/R-87-
X129Q、24-X87D/R-X129Q、X24F/P/R-X87D/R-X1
29Q、24-87-130、X24F/P/R-87-130、24-X87D/R-
130、24-87-X130A、X24F/P/R-X87D/R-130、X24F
/P/R-87-X130A、24-X87D/R-X130A、X24F/P/R-X
87D/R-X130A、24-87-X206L/Y、24-X87R-206、X2
4F/P/R-87-206、24-X87D/R-X206L/Y、X24F/P/R
-X87D/R-206、X24F/P/R-87-X206L/Y、X24F/P/R
-X87D/R-X206L/Y、24-87-X209W、X24F/P/R-87-
X209W、24-87-X209W、24-87D/R-X209W、X24F/P/
R-X87D/R-X209W、24-X87D/R-213、24-87-X213A
、24-X87D/R-X213A、X24F/P/R-X87D/R-213、X24
F/P/R-87-X213A、X24F/P/R-X87D/R-X213A、24-
87-249、X24F/P/R-87-249、24-X87D/R-249、24-
87-X249N/R、X24F/P/R-X87D/R-249、X24F/P/R-
87-X249N/R、24-X87D/R-X249N/R、X24F/P/R-X8
7D/R-X249N/R、24-129-130、X24F/P/R-129-130
、24-X129Q-130、24-129-X130A、X24F/P/R-X129
Q-130、X24F/P/R-129-X130A、24-X129Q-X130A、
X24F/P/R-X129Q-X130A、24-129-206、X24F/P/R
-129-206、24-X129Q-206、24-129-X206L/Y、X24
F/P/R-X129Q-206、X24F/P/R-129-X206L/Y、24-
X129Q-X206L/Y、X24F/P/R-X129Q-X206L/Y、24-
129-209、X24F/P/R-129-209、24-X129Q-209、24
-129-X209W、X24F/P/R-X129Q-209、X24F/P/R-1
29-X209W、24-X129Q-X209W、X24F/P/R-X129Q-X
209W、24-129-213、X24F/P/R-129-213、24-X129
Q-213、24-129-X213A、X24F/P/R-X129Q-213、X2
4F/P/R-129-X213A、24-X129Q-X213A、X24F/P/R
-X129Q-X213A、24-129-249、X24F/P/R-129-249
、24-X129Q-249、24-129-X249N/R、X24F/P/R-X1
29Q-249、X24F/P/R-129-X249N/R、24-X129Q-X2
49N/R、X24F/P/R-X129Q-X249N/R、24-130-206、
X24F/P/R-130-206、24-X130A-206、24-130-X20
6L/Y、X24F/P/R-X130A-206、X24F/P/R-130-X20
6L/Y、24-X130A-X206L/Y、X24F/P/R-X130A-X20
6L/Y、24-130-209、X24F/P/R-130-209、24-X130
A-209、24-130-X209W、X24F/P/R-X130A-209、X2
4F/P/R-130-X209W、24-X130A-X209W、X24F/P/R
-X130A-X209W、24-130-213、X24F/P/R-130-213
、24-X130A-213、24-130-X213A、X24F/P/R-X130
A-213、X24F/P/R-130-X213A、24-X130A-X213A、
X24F/P/R-X130A-X213A、24-130-249、X24F/P/R
-130-249、24-X130A-249、24-130-X249N/R、X24
F/P/R-X130A-249、X24F/P/R-130-X249N/R、24-
X130A-X249N/R、X24F/P/R-X130A-X249N/R、24-
206-209、24-206-X209W、24-X206L/Y-209、24F/
P/R-206-209、24-X206L/Y-X209W、X24F/P/R-X2
06L/Y-209、X24F/P/R-206-X209W、X24F/P/R-X2
06L/Y-X209W、24-206-213、X24F/P/R-206-213、
24-X206L/Y-213、24-206-X213A、X24F/P/R-X20
6L/Y-213、X24F/P/R-206-X213A、24-X206L/Y-X
213A、X24F/P/R-X206L/Y-X213A、24-206-249、2
4-X206L/Y-249、X24F/P/R-206-249、24-206-X2
49N/R、24-X206L/Y-X249N/R、X24F/P/R-X206L/
Y-249、X24F/P/R-206-X249N/R、X24F/P/R-X206
L/Y-X249N/R、24-209-213、24-X209W-213、X24F
/P/R-209-213、24-209-X213A、X24F/P/R-X209W
-213、24-X209W-X213A、X24F/P/R-209-X213A、X
24F/P/R-X209W-X213A、24-209-249、24-X209W-
249、X24F/P/R-209-249、24-209-X249N/R、X24F
/P/R-X209W-249、24-X209W-X249N/R、X24F/P/R
-209-X249N/R、X24F/P/R-X209W-X249N/R、78-8
7-129、X78N-87-129、78-X87D/R-129、78-87-X1
29Q、X78N-X87D/R-129、X78N-87-X129Q、78-X87
D/R-X129Q、X78N-X87D/R-X129Q、78-87-130、X7
8N-87-130、78-X87D/R-130、78-87-X130A、X78N
-X87D/R-130、X78N-87-X130A、78-X87D/R-X130
A、X78N-X87D/R-X130A、78-87-206、78-87-X206
L/Y、X78N-87-206、78-X87D/R-206、78-X87D/R-
X206L/Y、X78N-87-X206L/Y、X78N-X87D/R-206、
X78N-X87D/R-X206L/Y、78-87-209、78-87-X209
W、X78N-87-209、78-X87D/R-209、X78N-X87D/R-
209、78-X87D/R-X209W、X78N-87-X209W、X78N-X
87D/R-X209W、78-87-213、X78N-87-213、78-X87
D/R-213、78-87-X213A、X78N-X87D/R-213、X78N
-87-X213A、78-X87D/R-X213A、X78N-X87D/R-X2
13A、78-87-249、78-87-X249N/R、X78N-87-249、
78-87D/R-249、X78N-X87D/R-249、78-X87D/R-X
249N/R、X78N-87-X249N/R、X78N-X87D/R-X249N
/R、78-129-130、X78N-129-130、78-X129Q-130、
78-129-X130A、X78N-X129Q-130、X78N-129-X13
0A、78-X129Q-X130A、X78N-X129Q-X130A、78-12
9-206、X78N-129-206、78-X129Q-206、78-129-X
206L/Y、X78N-X129Q-206、X78N-129-X206L/Y、7
8-X129Q-X206L/Y、X78N-X129Q-X206L/Y、78-12
9-209、X78N-129-209、78-X129Q-209、78-129-X
209W、X78N-X129Q-209、X78N-129-X209W、78-X1
29Q-X209W、X78N-X129Q-X209W、78-129-213、X7
8N-129-213、78-X129Q-213、78-129-X213A、X78
N-X129Q-213、X78N-129-X213A、78-X129Q-X213
A、X78N-X129Q-X213A、78-129-249、X78N-129-2
49、78-X129Q-249、78-129-X249N/R、X78N-X129
Q-249、X78N-129-X249N/R、78-X129Q-X249N/R、
X78N-X129Q-X249N/R、78-130-206、X78N-130-2
06、78-X130A-206、78-130-X206L/Y、X78N-X130
A-206、X78N-130-X206L/Y、78-X130A-X206L/Y、
X78N-X130A-X206L/Y、78-130-209、X78N-130-2
09、78-X130A-209、78-130-X209W、X78N-X130A-
209、X78N-130-X209W、78-X130A-X209W、X78N-X
130A-X209W、78-130-213、X78N-130-213、78-X1
30A-213、78-130-X213A、X78N-X130A-213、X78N
-130-X213A、78-X130A-X213A、X78N-X130A-X21
3A、78-130-213、X78N-130-213、78-X130A-213、
78-130-X213A、X78N-X130A-213、X78N-130-X21
3A、78-X130A-X213A、X78N-X130A-X213A、78-13
0-249、X78N-130-249、78-X130A-249、78-130-X
249N/R、X78N-X130A-249、X78N-130-X249N/R、7
8-X130A-X249N/R、X78N-X130A-X249N/R、78-20
6-209、X78N-206-209、78-X206L/Y-209、78-206
-X209W、X78N-X206L/Y-209、X78N-206-X209W、7
8-X206L/Y-X209W、X78N-X206L/Y-X209W、78-20
6-213、X78N-206-213、78-X206L/Y-213、78-206
-X213A、X78N-X206L/Y-213、X78N-206-X213A、7
8-X206L/Y-X213A、X78N-X206L/Y-X213A、78-20
6-249、78-206-X249R/N、78-X206L/Y-249、X78N
-206-249、X78N-206-X249N/R、78-X206L/Y-X24
9N/R、X78N-X206L/Y-249、X78N-X206L/Y-X249N
/R、78-209-213、78-X209W-213、78-209-X213A、
X78N-209-213、X78N-X209W-213、X78N-209-X21
3A、78-X209W-X213A、X78N-X209W-X213A、78-20
9-249、78-X209W-249、78-209-X249N/R、X78N-2
09-249、78-X209W-X249N/R、X78N-X209W-249、X
78N-209-X249N/R、X78N-X209W-X249N/R、78-21
3-249、78-X213A-249、X78N-213-249、78-213-X
249N/R、X78N-X213A-249、X78N-213-X249N/R、7
8-X213A-X249N/R、X78N-X213A-X249N/R、87-12
9-130、X87D/R-129-130、87-X129Q-130、87-129
-X130A、X87D/R-X129Q-130、X87D/R-129-X130A
、87-X129Q-X130A、X87D/R-X129Q-X130A、87-12
9-206、X87D/R-129-206、87-X129Q-206、87-129
-X206L/Y、X87D/R-X129Q-206、X87D/R-129-X20
6L/Y、87-X129Q-X206L/Y、X87D/R-X129Q-X206L
/Y、87-129-209、X87D/R-129-209、87-X129Q-20
9、87-129-X209W、X87D/R-X129Q-209、X87D/R-1
29-X209W、87-X129Q-X209W、X87D/R-X129Q-X20
9W、87-129-213、X87D/R-129-213、87-X129Q-21
3、87-129-X213A、X87D/R-X129Q-213、X87D/R-1
29-X213A、87-X129Q-X213A、X87D/R-X129Q-X21
3A、87-129-249、X87D/R-129-249、87-X129Q-24
9、87-129-X249N/R、X87D/R-X129Q-249、X87D/R
-129-X249N/R、87-X129Q-X249N/R、X87D/R-X12
9Q-X249N/R、87-130-206、X87D/R-130-206、87-
X130A-206、87-130-X206L/Y、X87D/R-X130A-20
6、X87D/R-130-X206L/Y、87-X130A-X206L/Y、X8
7D/R-X130A-X206L/Y、87-130-209、X87D/R-130
-209、87-X130A-209、87-130-X209W、X87D/R-X1
30A-209、X87D/R-130-X209W、87-X130A-X209W、
X87D/R-X130A-X209W、87-130-213、X87D/R-130
-213、87-X130A-213、87-130-X213A、X87D/R-X1
30A-213、X87D/R-130-X213A、87-X130A-X213A、
X87D/R-X130A-X213A、87-130-249、X87D/R-130
-249、87-X130A-249、87-130-X249N/R、X87D/R-
X130A-249、X87D/R-130-X249N/R、87-X130A-X2
49N/R、X87D/R-X130A-X249N/R、87-206-209、X8
7D/R-206-209、87-X206L/Y-209、87-206-X209W
、X87D/R-X206L/Y-209、X87D/R-206-X209W、87-
X206L/Y-X209W、X87D/R-X206L/Y-X209W、87-20
6-213、87-X206L/Y-213、87-206-X213A、X87D/R
-206-213、X87D/R-X206L/Y-213、X87D/R-206-X
213A、87-X206L/Y-X213A、X87D/R-X206L/Y-X21
3A、87-206-249、87-X206L/Y-249、87D/R-206-2
49、87-209-X249N/R、X87R-206-X249N/R、X87D/
R-X206L/Y-249、87-X206L/Y-X249N/R、X87R-X2
06L/Y-X249N/R、87-209-213、X87D/R-209-213、
87-X209W-213、87-209-X213A、X87D/R-X209W-2
13、X87D/R-209-X213A、87-X209W-X213A、X87D/
R-X209W-X213A、87-209-249、87-X209W-249、87
-209-X249N/R、X87D/R-209-249、X87D/R-X209W
-249、87-X209W-X249N/R、X87R-209-X249N/R、X
87D/R-X209W-X249N/R、87-213-249、87-X213A-
249、X87D/R-213-249、87-213-X249N/R、X87D/R
-X213A-249、X87D/R-213-X249N/R、87-X213A-X
249N/R、X87D/R-X213A-X249N/R、129-130-206、
X129Q-130-206、129-X130A-206、129-130-X206
L/Y、X129Q-X130A-206、X129Q-130-X206L/Y、12
9-X130A-X206L/Y、X129Q-X130A-X206L/Y、129-
130-209、X129Q-130-209、129-X130A-209、129-
130-X209W、X129Q-X130A-209、X129Q-130-X209
W、129-X130A-X209W、X129Q-X130A-X209W、129-
130-213、X129Q-130-213、129-X130A-213、129-
130-X213A、X129Q-X130A-213、X129Q-130-X213
A、129-X130A-X213A、X129Q-X130A-X213A、129-
130-249、X129Q-130-249、129-X130A-249、129-
130-X249N/R、X129Q-X130A-249、X129Q-130-X2
49N/R、129-X130A-X249N/R、X129Q-X130A-X249
N/R、129-206-209、X129Q-206-209、129-X206L/
Y-209、129-206-X209W、X129Q-X206L/Y-209、X1
29Q-206-X209W、129-X206L/Y-X209W、X129Q-X2
06L/Y-X209W、129-206-213、129-X206L/Y-213、
129-206-X213A、X129Q-206-213、X129Q-X206L/
Y-213、X129Q-206-X213A、129-X206L/Y-X213A、
X129Q-X206L/Y-X213A、129-206-249、129-X206
L/Y-249、129-206-X249N/R、X129Q-206-249、X1
29A-X206L/Y-249、X129Q-206-X249N/R、129-X2
06L/Y-X249N/R、X129Q-X206L/Y-X249N/R、129-
209-213、129-X209W-213、129-209-X213A、X129
Q-209-213、X129Q-X209W-213、X129Q-209-X213
A、129-X209W-X213A、X129Q-X209W-X213A、129-
209-249、129-X209W-249、129-209-X249N/R、X1
29Q-209-249、X129Q-X209W-249、X129Q-209-X2
49N/R、129-X209W-X249N/R、X129Q-X209W-X249
N/R、129-213-249、129-X213A-249、129-213-X2
49N/R、X129Q-213-249、X129Q-X213A-249、129-
X213A-X249R、X129Q-213-X249N/R、X129Q-X213
A-X249N/R、130-206-209、X130A-206-209、130-
X206L/Y-209、130-209-X209W、X130A-X206L/Y-
209、X130A-206-X209W、130-X206L/Y-X209W、X1
30A-X206L/Y-X209W、130-206-213、130-X206L/
Y-213、130-206-X213A、X130A-206-213、X130A-
X206L/Y-213、X130A-206-X213A、130-X206L/Y-
X213A、X130A-X206L/Y-X213A、130-206-249、13
0-X206L/Y-249、130-206-X249N/R、X130A-206-
249、X130A-X206L/Y-249、X130A-206-X249N/R、
130-X206L/Y-X249N/R、X130A-X206L/Y-X249N/
R、130-209-213、130-X209W-213、130-209-X213
A、X130A-209-213、X130A-X209W-213、X130A-20
9-X213A、130-X209W-X213A、X130A-X209W-X213
A、130-209-249、130-X209W-249、130-209-X249
N/R、X130A-209-249、X130A-X209W-249、X130A-
209-X249N/R、130-X209W-X249N/R、X130A-X209
W-X249N/R、130-213-249、130-X213A-249、130-
213-X249N/R、X130A-213-249、X130A-X213A-24
9、130-X213A-X249R、X130A-213-X249N/R、X130
A-X213A-X249N/R、130-209-249、130-X209W-24
9、130-209-X249N/R、X130A-209-249、X130A-X2
09W-249、X130A-209-X249N/R、130-X209W-X249
N/R、X130A-X209W-X249N/R、206-209-213、206-
X209W-213、206-209-X213A、X206L/Y-209-213、
206-X209W-X213A、X206L/Y-X209W-213、X206L/
Y-209-X213A、X206L/Y-X209W-X213A、206-209-
249、206-X209W-249、206-209-X249N/R、X206L/
Y-209-249、X206L/Y-X209W-249、206-X209W-X2
49N/R、X206L/Y-209-X249N/R、X206L/Y-X209W-
X249N/R、206-213-249、206-X213A-249、206-21
3-X249N/RX206L/Y-213-249、X206L/Y-X213A-2
49、X206L/Y-213-X249N/R、206-X213A-X249N/R
、X206L/Y-X213A-X249N/R、209-213-249、X209W
-213-249、209-X213A-249、209-213-X249N/R、X
209W-X213A-249、X209W-213-X249N/R、209-X21
3A-X249N/R、X209W-X213A-X249N/Rおよびこれらの組み合
わせから選択される、2つ以上の位置でのアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列
を含む、単離されたスブチリシン変異体を提供する;ここで、Xは任意のアミノ酸であり
、前記変異体はタンパク質分解活性を有しており、前記変異体のアミノ酸配列は、(i)
3、28、43、76、99、100、101、103、104、108、116、11
8、124、127、128、150、158、159、166、188、194、21
2、217、222、232、235、243、245、246および270、(ii)
X3T/V、X28T、X43S、X76D、X99N、X100S、X101F/G/
V、X103A/D/P、X104I、X108S、X116M、X118R、X124
M、X127T、X128L、X150T、X158E/T、X159D、X166D、
X188D、X194D、X212D、X217K、X222Q/S、X232V、X2
35T、X243S、X245R、X246VおよびX270Tまたは(iii)S3V
/T、V28T、N43S、N76D、S99N、G100S、S101F/G/V、S
103A/D/P、V104I、A108S、N116M、G118R、L124M、G
127T、S128L、V150T、A158E/T、G159D、S166D、S18
8D、A194D、S212D、L217K、M222Q/S、A232V、K235T
、N243S、Q245R、I246VおよびA270Tから選択される1つ以上の置換
をさらに含み、さらに、前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチル
ス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefacien
s)スブチリシンBPN’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされてお
り、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定さ
れたものである。なおさらなる実施形態は、78-X206L/Y、X78N-206、
X78N-X206L/Y、18-X78N、X18K/R-X78N、18-X87R
、X18K/R-X87R、18-X206L/Y、X18K/R-X206L/Y、2
4-X87R、X24F/P/R-X87R、24-X206L/Y、X24F/P/R
-206、X24F/P/R-X206L/Y、24-X209W、X24F/P/R-
X209W、X78N-87、X78N-X87D/R、78-X129Q、X78N-
X129Q、78-X130A、X78N-130、X78N-209、78-X209
W、X78N-X209W、78-X249N/R、X78N-249、X78N-X2
49N/R、87-X206L/Y、X87D/R-X206L/Y、87-X209W
、X87D/R-X209W、87-X213A、X87D/R-213、X87D/R
-X213A、X87R-X249N/R、129-X206L/Y、X129Q-20
6、X129Q-X206L/Y、129-X209W、X129Q-X209W、12
9-X249N/R、X129Q-249、X129Q-X249N/R、130-X2
06L/Y、X130A-206、X130A-X206L/Y、130-X209W、
X130A-X209W、130-X249N/R、X130A-249、X130A-
X249N/R、206-X209W、X206L/Y-209、X206L/Y-X2
09W、206-X213A、X206L/Y-213、X206L/Y-X213A、
X206L/Y-249、X206L/Y-X249N/R、X209W-213、X2
09W-X213A、X209W-249、X209W-X249N/R、18-24-
78、X18K/R-24-78、18-X24F/P/R-78、18-24-X78
N、X18K/R-24-X78N、18-X24F/P/R-X78N、X18K/R
-X24F/P/R-78、X18K/R-X24F/P/R-X78N、18-24-
87、X18K/R-24-87、18-X24F/P/R-87、18-24-X87
D/R、X18K/R-24-X87D/R、18-X24F/P/R-X87D/R、
X18K/R-X24F/P/R-87、X18K/R-X24F/P/R-X87D/
R、18-24-129、X18K/R-24-129、18-X24F/P/R-12
9、18-24-X129Q、X18K/R-X24F/P/R-129、X18K/R
-24-X129Q、18-X24F/P/R-X129Q、X18K/R-X24F/
P/R-X129Q、18-24-130、18-X24F/P/R-130、18-2
4-X130A、X18K/R-24-130、X18K/R-X24F/P/R-13
0、X18K/R-24-X130A、18-X24F/P/R-X130A、X18K
/R-X24F/P/R-X130A、18-24-206、18-24-X206L/
Y、18-X24F/P/R-206、X18K/R-24-206、X18K/R-2
4-X206L/Y、18-X24F/P/R-X206L/Y、X18K/R-X24
F/P/R-206、X18K/R-X24F/P/R-X206L/Y、18-24-
209、18-24-X209W、18-X24F/P/R-209、X18K/R-2
4-209、X18K/R-24-X209W、18-X24F/P/R-X209W、
X18K/R-X24F/P/R-209、X18K/R-X24F/P/R-X209
W、18-78-87、18-X78N-87、18-78-X87D/R、X18K/
R-78-87、X18K/R-X78N-87、X18K/R-78-X87D/R、
18-X78N-X87D/R、X18K/R-X78N-X87D/R、18-78-
129、18-X78N-129、18-78-X129Q、X18K/R-78-12
9、X18K/R-X78N-129、X18K/R-78-X129Q、18-X78
N-X129Q、X18K/R-X78N-X129Q、18-78-130、18-X
78N-130、18-78-X130A、X18K/R-78-130、X18K/R
-X78N-130、X18K/R-78-X130A、18-X78N-X130A、
X18K/R-X78N-X130A、18-78-206、18-78-X206L/
Y、18-X78N-206、X18K/R-78-206、18-X78N-X206
L/Y、X18K/R-X78N-206、X18K/R-78-X206L/Y、X1
8K/R-X78N-X206L/Y、18-78-209、18-X78N-209、
18-78-X209W、X18K/R-78-209、X18K/R-78-X209
W、18-X78N-X209W、X18K/R-X78N-209、X18K/R-X
78N-X209W、18-78-213、18-X78N-213、18-78-X2
13A、X18K/R-78-213、18-X78N-X213A、X18K/R-X
78N-213、X18K/R-78-X213A、X18K/R-X78N-X213
A、18-78-249、18-78-X249N/R、18-X78N-249、X1
8K/R-78-249、18-X78N-X249N/R、X18K/R-X78N-
249、X18K/R-78-X249N/R、X18K/R-X78N-X249N/
R、18-87-129、X18K/R-87-129、18-X87D/R-129、
18-87-X129Q、18-X87D/R-X129Q、X18K/R-87-X1
29Q、X18K/R-X87D/R-129、X18K/R-X87D/R-X129
Q、18-87-130、X18K/R-87-130、18-X87D/R-130、
18-87-X130A、18-X87D/R-X130A、X18K/R-87-X1
30A、X18K/R-X87D/R-130、X18K/R-X87D/R-X130
A、18-87-206、X18K/R-87-206、18-X87D/R-206、
18-87-X206L/Y、18-X87D/R-X206L/Y、X18K/R-8
7-X206L/Y、X18K/R-X87D/R-206、X18K/R-X87D/
R-X206L/Y、18-87-209、X18K/R-87-209、18-X87
D/R-209、18-87-X209W、18-X87D/R-X209W、X18K
/R-X87D/R-209、X18K/R-87-X209W、X18K/R-X87
D/R-X209W、18-X87D/R-213、18-87-X213A、18-X
87D/R-X213A、X18K/R-X87D/R-213、X18K/R-87-
X213A、X18K/R-X87D/R-X213A、18-87-249、X18K
/R-87-249、18-X87D/R-249、18-87-X249N/R、18
-X87D/R-249N/R、18K/R-X87D/R-249、18K/R-87
-X249N/R、18K/R-X87D/R-X249N/R、18-129-130
、X18K/R-129-130、18-X129Q-130、18-129-X130
A、X18K/R-X129Q-130、X18K/R-129-X130A、18-X
129Q-X130A、X18K/R-X129Q-X130A、18-129-206
、X18K/R-129-206、18-X129Q-206、18-129-X206
L/Y、X18K/R-X129Q-206、X18K/R-129-X206L/Y、
18-X129Q-X206L/Y、X18K/R-X129Q-X206L/Y、18
-129-209、X18K/R-129-209、18-X129Q-209、18-
129-X209W、X18K/R-X129Q-209、X18K/R-129-X2
09W、18-X129Q-X209W、X18K/R-X129Q-X209W、18
-129-213、X18K/R-129-213、18-X129Q-213、18-
129-X213A、X18K/R-X129Q-213、X18K/R-129-X2
13A、18-X129Q-X213A、X18K/R-X129Q-X213A、18
-129-249、X18K/R-129-249、18-X129Q-249、18-
129-X249N/R、X18K/R-X129Q-249、X18K/R-129-
X249N/R、18-X129Q-X249N/R、X18K/R-X129Q-X2
49N/R、18-130-206、X18K/R-130-206、18-X130A
-206、18-130-X206L/Y、X18K/R-X130A-206、X18
K/R-130-X206L/Y、18-X130A-X206L/Y、X18K/R-
X130A-X206L/Y、18-130-209、X18K/R-130-209、
18-X130A-209、18-130-X209W、X18K/R-X130A-2
09、X18K/R-130-X209W、18-X130A-X209W、X18K/
R-X130A-X209W、18-130-213、X18K/R-130-213、
18-X130A-213、18-130-X213A、X18K/R-X130A-2
13、X18K/R-130-X213A、18-X130A-X213A、X18K/
R-X130A-X213A、18-130-249、X18K/R-130-249、
18-X130A-249、18-130-X249N/R、X18K/R-X130A
-249、X18K/R-130-X249N/R、18-X130A-X249N/R
、X18K/R-X130A-X249N/R、18-206-209、18-206-
X209W、18-X206L/Y-209、18K/R-206-209、18-X2
06L/Y-X209W、X18K/R-X206L/Y-209、X18K/R-20
6-X209W、X18K/R-X206L/Y-X209W、18-206-213、
X18K/R-206-213、18-206L/Y-213、18-206-X213
A、X18K/R-X206L/Y-213、X18K/R-206-X213A、18
-X206L/Y-X213A、X18K/R-X206L/Y-X213A、18-2
06-249、X18K/R-206-249、18-206L/Y-249、18-2
06-X249N/R、X18K/R-X206L/Y-249、X18K/R-206
-X249N/R、18-X206L/Y-X249N/R、X18K/R-X206L
/Y-X249N/R、18-209-213、18-X209W-213、X18K/
R-209-213、18-209-X213A、18-X209W-X213A、X1
8K/R-X209W-213、X18K/R-209-X213A、X18K/R-X
209W-X213A、18-209-249、18-X209W-249、X18K/
R-209-249、18-209-X249N/R、18-X209W-X249N/
R、18K/R-X209W-249、X18K/R-209-X249N/R、X18
K/R-X209W-X249N/R、18-213-X249N/R、X18K/R-
X213A-249、X18K/R-213-X249N/R、18-X213A-X2
49N/R、X18K/R-X213A-X249N/R、24-78-87、24-7
8-X87D/R、24-X78N-87、X24F/P/R-78-87、24-X7
8N-X87D/R、X24R/P/F-78-X87D/R、X24F/P/R-X7
8N-87、X24R/P/F-X78N-X87D/R、24-78-129、X24
F/P/R-78-129、24-X78N-129、24-78-X129Q、X24
F/P/R-X78N-129、X24F/P/R-78-X129Q、24-X78N
-X129Q、X24F/P/R-X78N-X129Q、24-78-130、X24
F/P/R-78-130、24-X78N-130、24-78-X130A、X24
F/P/R-X78N-130X24F/P/R-78-X130A、24-X78N-
X130A、X24F/P/R-X78N-X130A、24-78-X206L/Y、
X24F/P/R-78-206、24-X78N-X206L/Y、X24F/P/R
-X78N-206、X24F/P/R-78-X206L/Y、X24F/P/R-X
78N-X206L/Y、24-78-209、X24F/P/R-78-209、24
-X78N-209、24-78-X209W、X24F/P/R-X78N-209、
X24F/P/R-78-X209W、24-X78N-X209W、X24F/P/R
-X78N-X209W、24-78-213、X24F/P/R-78-213、24
-X78N-213、24-78-X213A、X24F/P/R-X78N-213、
X24F/P/R-78-X213A、24-X78N-X213A、X24F/P/R
-X78N-X213A、24-78-X249N/R、24-X78N-249、24
-X78N-X249N/R、X24F/P/R-X78N-249、X24F/P/R
-78-X249N/R、X24F/P/R-X78N-X249N/R、24-87-
129、X24F/P/R-87-129、24-X87D/R-129、24-87-
X129Q、X24F/P/R-X87D/R-129、X24F/P/R-87-X1
29Q、24-X87D/R-X129Q、X24F/P/R-X87D/R-X129
Q、24-87-130、X24F/P/R-87-130、24-X87D/R-13
0、24-87-X130A、X24F/P/R-X87D/R-130、X24F/P
/R-87-X130A、24-X87D/R-X130A、X24F/P/R-X87
D/R-X130A、24-87-X206L/Y、24-X87R-206、X24F
/P/R-87-206、24-X87D/R-X206L/Y、X24F/P/R-X
87D/R-206、X24F/P/R-87-X206L/Y、X24F/P/R-X
87D/R-X206L/Y、24-87-X209W、X24F/P/R-87-X2
09W、24-87-X209W、24-87D/R-X209W、X24F/P/R-
X87D/R-X209W、24-X87D/R-213、24-87-X213A、2
4-X87D/R-X213A、X24F/P/R-X87D/R-213、X24F/
P/R-87-X213A、X24F/P/R-X87D/R-X213A、24-87
-249、X24F/P/R-87-249、24-X87D/R-249、24-87
-X249N/R、X24F/P/R-X87D/R-249、X24F/P/R-87
-X249N/R、24-X87D/R-X249N/R、X24F/P/R-X87D
/R-X249N/R、24-129-130、X24F/P/R-129-130、2
4-X129Q-130、24-129-X130A、X24F/P/R-X129Q-
130、X24F/P/R-129-X130A、24-X129Q-X130A、X2
4F/P/R-X129Q-X130A、24-129-206、X24F/P/R-1
29-206、24-X129Q-206、24-129-X206L/Y、X24F/
P/R-X129Q-206、X24F/P/R-129-X206L/Y、24-X1
29Q-X206L/Y、X24F/P/R-X129Q-X206L/Y、24-12
9-209、X24F/P/R-129-209、24-X129Q-209、24-1
29-X209W、X24F/P/R-X129Q-209、X24F/P/R-129
-X209W、24-X129Q-X209W、X24F/P/R-X129Q-X20
9W、24-129-213、X24F/P/R-129-213、24-X129Q-
213、24-129-X213A、X24F/P/R-X129Q-213、X24F
/P/R-129-X213A、24-X129Q-X213A、X24F/P/R-X
129Q-X213A、24-129-249、X24F/P/R-129-249、2
4-X129Q-249、24-129-X249N/R、X24F/P/R-X129
Q-249、X24F/P/R-129-X249N/R、24-X129Q-X249
N/R、X24F/P/R-X129Q-X249N/R、24-130-206、X2
4F/P/R-130-206、24-X130A-206、24-130-X206L
/Y、X24F/P/R-X130A-206、X24F/P/R-130-X206L
/Y、24-X130A-X206L/Y、X24F/P/R-X130A-X206L
/Y、24-130-209、X24F/P/R-130-209、24-X130A-
209、24-130-X209W、X24F/P/R-X130A-209、X24F
/P/R-130-X209W、24-X130A-X209W、X24F/P/R-X
130A-X209W、24-130-213、X24F/P/R-130-213、2
4-X130A-213、24-130-X213A、X24F/P/R-X130A-
213、X24F/P/R-130-X213A、24-X130A-X213A、X2
4F/P/R-X130A-X213A、24-130-249、X24F/P/R-1
30-249、24-X130A-249、24-130-X249N/R、X24F/
P/R-X130A-249、X24F/P/R-130-X249N/R、24-X1
30A-X249N/R、X24F/P/R-X130A-X249N/R、24-20
6-209、24-206-X209W、24-X206L/Y-209、24F/P/
R-206-209、24-X206L/Y-X209W、X24F/P/R-X206
L/Y-209、X24F/P/R-206-X209W、X24F/P/R-X206
L/Y-X209W、24-206-213、X24F/P/R-206-213、24
-X206L/Y-213、24-206-X213A、X24F/P/R-X206L
/Y-213、X24F/P/R-206-X213A、24-X206L/Y-X21
3A、X24F/P/R-X206L/Y-X213A、24-206-249、24-
X206L/Y-249、X24F/P/R-206-249、24-206-X249
N/R、24-X206L/Y-X249N/R、X24F/P/R-X206L/Y-
249、X24F/P/R-206-X249N/R、X24F/P/R-X206L/
Y-X249N/R、24-209-213、24-X209W-213、X24F/P
/R-209-213、24-209-X213A、X24F/P/R-X209W-2
13、24-X209W-X213A、X24F/P/R-209-X213A、X24
F/P/R-X209W-X213A、24-209-249、24-X209W-24
9、X24F/P/R-209-249、24-209-X249N/R、X24F/P
/R-X209W-249、24-X209W-X249N/R、X24F/P/R-2
09-X249N/R、X24F/P/R-X209W-X249N/R、78-87-
129、X78N-87-129、78-X87D/R-129、78-87-X129
Q、X78N-X87D/R-129、X78N-87-X129Q、78-X87D/
R-X129Q、X78N-X87D/R-X129Q、78-87-130、X78N
-87-130、78-X87D/R-130、78-87-X130A、X78N-X
87D/R-130、X78N-87-X130A、78-X87D/R-X130A、
X78N-X87D/R-X130A、78-87-206、78-87-X206L/
Y、X78N-87-206、78-X87D/R-206、78-X87D/R-X2
06L/Y、X78N-87-X206L/Y、X78N-X87D/R-206、X7
8N-X87D/R-X206L/Y、78-87-209、78-87-X209W、
X78N-87-209、78-X87D/R-209、X78N-X87D/R-20
9、78-X87D/R-X209W、X78N-87-X209W、X78N-X87
D/R-X209W、78-87-213、X78N-87-213、78-X87D/
R-213、78-87-X213A、X78N-X87D/R-213、X78N-8
7-X213A、78-X87D/R-X213A、X78N-X87D/R-X213
A、78-87-249、78-87-X249N/R、X78N-87-249、78
-87D/R-249、X78N-X87D/R-249、78-X87D/R-X24
9N/R、X78N-87-X249N/R、X78N-X87D/R-X249N/R
、78-129-130、X78N-129-130、78-X129Q-130、78
-129-X130A、X78N-X129Q-130、X78N-129-X130A
、78-X129Q-X130A、X78N-X129Q-X130A、78-129-
206、X78N-129-206、78-X129Q-206、78-129-X20
6L/Y、X78N-X129Q-206、X78N-129-X206L/Y、78-
X129Q-X206L/Y、X78N-X129Q-X206L/Y、78-129-
209、X78N-129-209、78-X129Q-209、78-129-X20
9W、X78N-X129Q-209、X78N-129-X209W、78-X129
Q-X209W、X78N-X129Q-X209W、78-129-213、X78N
-129-213、78-X129Q-213、78-129-X213A、X78N-
X129Q-213、X78N-129-X213A、78-X129Q-X213A、
X78N-X129Q-X213A、78-129-249、X78N-129-249
、78-X129Q-249、78-129-X249N/R、X78N-X129Q-
249、X78N-129-X249N/R、78-X129Q-X249N/R、X7
8N-X129Q-X249N/R、78-130-206、X78N-130-206
、78-X130A-206、78-130-X206L/Y、X78N-X130A-
206、X78N-130-X206L/Y、78-X130A-X206L/Y、X7
8N-X130A-X206L/Y、78-130-209、X78N-130-209
、78-X130A-209、78-130-X209W、X78N-X130A-20
9、X78N-130-X209W、78-X130A-X209W、X78N-X13
0A-X209W、78-130-213、X78N-130-213、78-X130
A-213、78-130-X213A、X78N-X130A-213、X78N-1
30-X213A、78-X130A-X213A、X78N-X130A-X213A
、78-130-213、X78N-130-213、78-X130A-213、78
-130-X213A、X78N-X130A-213、X78N-130-X213A
、78-X130A-X213A、X78N-X130A-X213A、78-130-
249、X78N-130-249、78-X130A-249、78-130-X24
9N/R、X78N-X130A-249、X78N-130-X249N/R、78-
X130A-X249N/R、X78N-X130A-X249N/R、78-206-
209、X78N-206-209、78-X206L/Y-209、78-206-X
209W、X78N-X206L/Y-209、X78N-206-X209W、78-
X206L/Y-X209W、X78N-X206L/Y-X209W、78-206-
213、X78N-206-213、78-X206L/Y-213、78-206-X
213A、X78N-X206L/Y-213、X78N-206-X213A、78-
X206L/Y-X213A、X78N-X206L/Y-X213A、78-206-
249、78-206-X249R/N、78-X206L/Y-249、X78N-2
06-249、X78N-206-X249N/R、78-X206L/Y-X249N
/R、X78N-X206L/Y-249、X78N-X206L/Y-X249N/R
、78-209-213、78-X209W-213、78-209-X213A、X7
8N-209-213、X78N-X209W-213、X78N-209-X213A
、78-X209W-X213A、X78N-X209W-X213A、78-209-
249、78-X209W-249、78-209-X249N/R、X78N-209
-249、78-X209W-X249N/R、X78N-X209W-249、X78
N-209-X249N/R、X78N-X209W-X249N/R、78-213-
249、78-X213A-249、X78N-213-249、78-213-X24
9N/R、X78N-X213A-249、X78N-213-X249N/R、78-
X213A-X249N/R、X78N-X213A-X249N/R、87-129-
130、X87D/R-129-130、87-X129Q-130、87-129-X
130A、X87D/R-X129Q-130、X87D/R-129-X130A、8
7-X129Q-X130A、X87D/R-X129Q-X130A、87-129-
206、X87D/R-129-206、87-X129Q-206、87-129-X
206L/Y、X87D/R-X129Q-206、X87D/R-129-X206L
/Y、87-X129Q-X206L/Y、X87D/R-X129Q-X206L/Y
、87-129-209、X87D/R-129-209、87-X129Q-209、
87-129-X209W、X87D/R-X129Q-209、X87D/R-129
-X209W、87-X129Q-X209W、X87D/R-X129Q-X209W
、87-129-213、X87D/R-129-213、87-X129Q-213、
87-129-X213A、X87D/R-X129Q-213、X87D/R-129
-X213A、87-X129Q-X213A、X87D/R-X129Q-X213A
、87-129-249、X87D/R-129-249、87-X129Q-249、
87-129-X249N/R、X87D/R-X129Q-249、X87D/R-1
29-X249N/R、87-X129Q-X249N/R、X87D/R-X129Q
-X249N/R、87-130-206、X87D/R-130-206、87-X1
30A-206、87-130-X206L/Y、X87D/R-X130A-206、
X87D/R-130-X206L/Y、87-X130A-X206L/Y、X87D
/R-X130A-X206L/Y、87-130-209、X87D/R-130-2
09、87-X130A-209、87-130-X209W、X87D/R-X130
A-209、X87D/R-130-X209W、87-X130A-X209W、X8
7D/R-X130A-X209W、87-130-213、X87D/R-130-2
13、87-X130A-213、87-130-X213A、X87D/R-X130
A-213、X87D/R-130-X213A、87-X130A-X213A、X8
7D/R-X130A-X213A、87-130-249、X87D/R-130-2
49、87-X130A-249、87-130-X249N/R、X87D/R-X1
30A-249、X87D/R-130-X249N/R、87-X130A-X249
N/R、X87D/R-X130A-X249N/R、87-206-209、X87D
/R-206-209、87-X206L/Y-209、87-206-X209W、X
87D/R-X206L/Y-209、X87D/R-206-X209W、87-X2
06L/Y-X209W、X87D/R-X206L/Y-X209W、87-206-
213、87-X206L/Y-213、87-206-X213A、X87D/R-2
06-213、X87D/R-X206L/Y-213、X87D/R-206-X21
3A、87-X206L/Y-X213A、X87D/R-X206L/Y-X213A
、87-206-249、87-X206L/Y-249、87D/R-206-249
、87-209-X249N/R、X87R-206-X249N/R、X87D/R-
X206L/Y-249、87-X206L/Y-X249N/R、X87R-X206
L/Y-X249N/R、87-209-213、X87D/R-209-213、87
-X209W-213、87-209-X213A、X87D/R-X209W-213
、X87D/R-209-X213A、87-X209W-X213A、X87D/R-
X209W-X213A、87-209-249、87-X209W-249、87-2
09-X249N/R、X87D/R-209-249、X87D/R-X209W-2
49、87-X209W-X249N/R、X87R-209-X249N/R、X87
D/R-X209W-X249N/R、87-213-249、87-X213A-24
9、X87D/R-213-249、87-213-X249N/R、X87D/R-X
213A-249、X87D/R-213-X249N/R、87-X213A-X24
9N/R、X87D/R-X213A-X249N/R、129-130-206、X1
29Q-130-206、129-X130A-206、129-130-X206L/
Y、X129Q-X130A-206、X129Q-130-X206L/Y、129-
X130A-X206L/Y、X129Q-X130A-X206L/Y、129-13
0-209、X129Q-130-209、129-X130A-209、129-13
0-X209W、X129Q-X130A-209、X129Q-130-X209W、
129-X130A-X209W、X129Q-X130A-X209W、129-13
0-213、X129Q-130-213、129-X130A-213、129-13
0-X213A、X129Q-X130A-213、X129Q-130-X213A、
129-X130A-X213A、X129Q-X130A-X213A、129-13
0-249、X129Q-130-249、129-X130A-249、129-13
0-X249N/R、X129Q-X130A-249、X129Q-130-X249
N/R、129-X130A-X249N/R、X129Q-X130A-X249N/
R、129-206-209、X129Q-206-209、129-X206L/Y-
209、129-206-X209W、X129Q-X206L/Y-209、X129
Q-206-X209W、129-X206L/Y-X209W、X129Q-X206
L/Y-X209W、129-206-213、129-X206L/Y-213、12
9-206-X213A、X129Q-206-213、X129Q-X206L/Y-
213、X129Q-206-X213A、129-X206L/Y-X213A、X1
29Q-X206L/Y-X213A、129-206-249、129-X206L/
Y-249、129-206-X249N/R、X129Q-206-249、X129
A-X206L/Y-249、X129Q-206-X249N/R、129-X206
L/Y-X249N/R、X129Q-X206L/Y-X249N/R、129-20
9-213、129-X209W-213、129-209-X213A、X129Q-
209-213、X129Q-X209W-213、X129Q-209-X213A、
129-X209W-X213A、X129Q-X209W-X213A、129-20
9-249、129-X209W-249、129-209-X249N/R、X129
Q-209-249、X129Q-X209W-249、X129Q-209-X249
N/R、129-X209W-X249N/R、X129Q-X209W-X249N/
R、129-213-249、129-X213A-249、129-213-X249
N/R、X129Q-213-249、X129Q-X213A-249、129-X2
13A-X249R、X129Q-213-X249N/R、X129Q-X213A-
X249N/R、130-206-209、X130A-206-209、130-X2
06L/Y-209、130-209-X209W、X130A-X206L/Y-20
9、X130A-206-X209W、130-X206L/Y-X209W、X130
A-X206L/Y-X209W、130-206-213、130-X206L/Y-
213、130-206-X213A、X130A-206-213、X130A-X2
06L/Y-213、X130A-206-X213A、130-X206L/Y-X2
13A、X130A-X206L/Y-X213A、130-206-249、130-
X206L/Y-249、130-206-X249N/R、X130A-206-24
9、X130A-X206L/Y-249、X130A-206-X249N/R、13
0-X206L/Y-X249N/R、X130A-X206L/Y-X249N/R、
130-209-213、130-X209W-213、130-209-X213A、
X130A-209-213、X130A-X209W-213、X130A-209-
X213A、130-X209W-X213A、X130A-X209W-X213A、
130-209-249、130-X209W-249、130-209-X249N/
R、X130A-209-249、X130A-X209W-249、X130A-20
9-X249N/R、130-X209W-X249N/R、X130A-X209W-
X249N/R、130-213-249、130-X213A-249、130-21
3-X249N/R、X130A-213-249、X130A-X213A-249、
130-X213A-X249R、X130A-213-X249N/R、X130A-
X213A-X249N/R、130-209-249、130-X209W-249、
130-209-X249N/R、X130A-209-249、X130A-X209
W-249、X130A-209-X249N/R、130-X209W-X249N/
R、X130A-X209W-X249N/R、206-209-213、206-X2
09W-213、206-209-X213A、X206L/Y-209-213、20
6-X209W-X213A、X206L/Y-X209W-213、X206L/Y-
209-X213A、X206L/Y-X209W-X213A、206-209-24
9、206-X209W-249、206-209-X249N/R、X206L/Y-
209-249、X206L/Y-X209W-249、206-X209W-X249
N/R、X206L/Y-209-X249N/R、X206L/Y-X209W-X2
49N/R、206-213-249、206-X213A-249、206-213-
X249N/RX206L/Y-213-249、X206L/Y-X213A-249
、X206L/Y-213-X249N/R、206-X213A-X249N/R、X
206L/Y-X213A-X249N/R、209-213-249、X209W-2
13-249、209-X213A-249、209-213-X249N/R、X20
9W-X213A-249、X209W-213-X249N/R、209-X213A
-X249N/R、X209W-X213A-X249N/Rおよびこれらの組み合わせ
から選択される、2つ以上の位置でのアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含
む、単離されたスブチリシン変異体を提供する;ここで、Xは任意のアミノ酸であり、前
記変異体はタンパク質分解活性を有しており、前記変異体のアミノ酸配列は、(i)76
、101、103、104、118、127、128、166および222、(ii)X
76D、X101F/G/V、X103A/D/P、X104I、X118R、X127
T、X128L、X166D/NおよびX222Q/Sまたは(iii)N76D、S1
01F/G/V、S103A/D/P、V104I、G118R、G127T、S128
L、S166D/NおよびM222Q/Sから選択される1つ以上の置換をさらに含み、
さらに、前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリク
エファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシ
ンBPN’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異
体アミノ酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたものである
。
【0067】
他の実施形態は、S78N-Q206F/M/Y、S78G-Q206D/F/H/M
/N/P/R/Y、N18K/R-S78N、N18K/R-S87R、N18K/R-
Q206L/Y、S24F/L/P/R-S87R、S24F/L/P-Q206L/Y
、S24F/L/P/R-Q206Y、S24F/L/P-Y209W、P40E-S7
8G、P40E-S87R、P40E-P129Q、P40E-S130A、S78N-
S87D/R、S78G-S87D/R/T、S78A/C/E/F/H/I/K/L/
M/P/Q/R/T/V/W/Y-S87R、S78A/C/E/F/G/H/I/K/
L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-P129Q、S78A/C/E/F/H/I/K
/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-S130A、S78G-S130A/Q、S7
8N-H249N/R、S87D/R-Q206L/R/Y、S87D/R-Y209W
、S87D/R-T213A、S87R-H249N/R、P129Q-Q206RY、
P129Q-H249N/R、S130A-Q206R/Y、S130A-H249N/
R、Q206Y-Y209W、Q206L/Y-T213A、Q206L/Y-H249
N/R、Y209W-T213A、Y209W-H249N/R、N18K/R-S24
F/L/P/R-S78N、N18K/R-S24F/L/P/R-S87D/R、N1
8K/R-S24F/L/P/R-P129Q、N18K/R-S24F/L/P/R-
S130A、N18K/R-S24F/L/P/R-Q206L/Y、N18K/R-S
24F/L/P/R-Y209W、N18K/R-S78N-S87D/R、N18K/
R-S78N-P129Q、N18K/R-S78N-S130A、N18K/R-S7
8N-Q206L/Y、N18K/R-S78N-Y209W、N18K/R-S78N
-T213A、N18K/R-S78N-H249N/R、N18K/R-S87D/R
-P129Q、N18K/R-S87D/R-S130A、N18K/R-S87D/R
-Q206L/Y、N18K/R-S87D/R-Y209W、N18K/R-S87D
/R-T213A、N18K/R-S87D/R-H249、N18K/R-P129Q
-S130A、N18K/R-P129Q-Q206L/Y、N18K/R-P129Q
-209、N18K/R-P129Q-T213A、N18K/R-P129Q-H24
9N/R、N18K/R-S130A-Q206L/Y、N18K/R-S130A-Y
209W、N18K/R-S130A-T213A、N18K/R-S130A-H24
9N/R、N18K/R-Q206L/Y-Y209W、N18K/R-Q206L/Y
-T213A、N18K/R-Q206L/Y-H249N/R、N18K/R-Y20
9W-T213A、N18K/R-Y209W-H249N/R、N18K/R-T21
3A-H249N/R、S24F/L/P/R-S78N-S87D/R、S24F/L
/P-S78N-P129Q、S24F/L/P-S78N-S130A、S24F/L
/P-S78N-Q206L/Y、S24F/L/P/R-S78N-Q206Y、S2
4F/L/P-S78N-Y209W、S24F/L/P/R-S78N-T213A、
S24F/L/P/R-S78N-H249N/R、S24F/L/P/R-S87D/
R-P129Q、S24F/L/P/R-S87D/R-S130A、S24F/L/P
/R-S87D/R-Q206L/Y、S24F/L/P/R-87D/R-Y209W
、S24F/L/P/R-S87D/R-T213A、S24F/L/P/R-S87D
/R-H249、S24F/L/P-P129Q-S130A、S24F/L/P-P1
29Q-Q206L/Y、S24F/L/P/R-P129Q-Q206Y、S24F/
L/P-P129Q-Y209W、S24F/L/P/R-P129Q-T213A、S
24F/L/P/R-P129Q-H249N/R、S24F/L/P-S130A-Q
206L/Y、S24F/L/P/R-S130A-Q206Y、S24F/L/P-S
130A-Y209W、S24F/L/P/R-S130A-T213A、S24F/L
/P/R-S130A-H249N/R、S24F/L/P-Q206L/Y-Y209
W、S24F/L/P/R-Q206Y-Y209W、S24F/L/P/R-Q206
L/Y-T213A、S24F/L/P/R-Q206L/Y-H249N/R、S24
F/L/P/R-Y209W-T213A、S24F/L/P/R-Y209W-H24
9N/R、S78N-S87D/R-P129Q、S78N-S87D/R-S130A
、S78N-S87D/R-Q206L/Y、S78N-S87D/R-Y209W、S
78N-S87D/R-T213A、S78N-S87D/R-H249N/R、S78
N-P129Q-Q206Y、S78N-P129Q-T213A、S78N-P129
Q-H249N/R、S78N-S130A-Q206Y、S78N-S130A-T2
13A、S78N-S130A-H249N/R、S78N-Q206L/Y-T213
A、S78N-Q206L/Y-H249N/R、S78N-Y209W-T213A、
S78N-Y209W-H249N/R、S78N-T213A-H249N/R、S8
7D/R-P129Q-S130A、S87D/R-P129Q-Q206L/R/Y、
S87D/R-P129Q-Y209W、S87D/R-P129Q-T213A、S8
7D/R-P129Q-H249N/R、S87D/R-S130A-Q206L/R/
Y、S87D/R-S130A-Y209W、S87D/R-S130A-T213A、
S87D/R-S130A-H249N/R、S87D/R-Q206L/Y-Y209
W、S87D/R-Q206L/Y-T213A、87D/R-Q206L/Y-H24
9N/R、S87D/R-Y209W-T213A、S87D/R-Y209W-H24
9N/R、S87D/R-T213A-H249N/R、P129Q-S130A-Q2
06R/Y、P129Q-S130A-T213A、P129Q-S130A-H249
N/R、P129Q-Q206Y-Y209W、P129Q-Q206L/Y-T213
A、P129Q-Q206L/Y-H249N/R、P129Q-Y209W-T213
A、P129Q-Y209W-H249N/R、P129Q-T213A-H249N/
R、S130A-Q206Y-Y209W、S130A-Q206L/Y-T213A、
S130A-Q206L/Y-H249N/R、S130A-Y209W-T213A、
S130A-Y209W-H249N/R、S130A-T213A-H249N/R、
S130A-Y209W-H249N/R、Q206L/Y-Y209W-T213A、
Q206L/Y-Y209W-H249N/R、Q206L/Y-T213A-H249
N/R、Y209W-T213A-H249N/Rおよびこれらの組み合わせから選択さ
れる、2つ以上の位置でのアミノ酸置換の組み合わせを含む、単離されたスブチリシン変
異体を提供する;ここで、前記変異体はタンパク質分解活性を有しており、前記変異体の
各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエンス(Ba
cillus amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’配列の、対
応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ酸配列とBP
N’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたものである。さらに他の実施形態
は、S78N-Q206F/M/Y、S78G-Q206D/F/H/M/N/P/R/
Y、N18K/R-S78N、N18K/R-S87R、N18K/R-Q206L/Y
、S24F/L/P/R-S87R、S24F/L/P-Q206L/Y、S24F/L
/P/R-Q206Y、S24F/L/P-Y209W、P40E-S78G、P40E
-S87R、P40E-P129Q、P40E-S130A、S78N-S87D/R、
S78G-S87D/R/T、S78A/C/E/F/H/I/K/L/M/P/Q/R
/T/V/W/Y-S87R、S78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q
/R/T/V/W/Y-P129Q、S78A/C/E/F/H/I/K/L/M/P/
Q/R/T/V/W/Y-S130A、S78G-S130A/Q、S78N-H249
N/R、S87D/R-Q206L/R/Y、S87D/R-Y209W、S87D/R
-T213A、S87R-H249N/R、P129Q-Q206RY、P129Q-H
249N/R、S130A-Q206R/Y、S130A-H249N/R、Q206Y
-Y209W、Q206L/Y-T213A、Q206L/Y-H249N/R、Y20
9W-T213A、Y209W-H249N/R、N18K/R-S24F/L/P/R
-S78N、N18K/R-S24F/L/P/R-S87D/R、N18K/R-S2
4F/L/P/R-P129Q、N18K/R-S24F/L/P/R-S130A、N
18K/R-S24F/L/P/R-Q206L/Y、N18K/R-S24F/L/P
/R-Y209W、N18K/R-S78N-S87D/R、N18K/R-S78N-
P129Q、N18K/R-S78N-S130A、N18K/R-S78N-Q206
L/Y、N18K/R-S78N-Y209W、N18K/R-S78N-T213A、
N18K/R-S78N-H249N/R、N18K/R-S87D/R-P129Q、
N18K/R-S87D/R-S130A、N18K/R-S87D/R-Q206L/
Y、N18K/R-S87D/R-Y209W、N18K/R-S87D/R-T213
A、N18K/R-S87D/R-H249、N18K/R-P129Q-S130A、
N18K/R-P129Q-Q206L/Y、N18K/R-P129Q-209、N1
8K/R-P129Q-T213A、N18K/R-P129Q-H249N/R、N1
8K/R-S130A-Q206L/Y、N18K/R-S130A-Y209W、N1
8K/R-S130A-T213A、N18K/R-S130A-H249N/R、N1
8K/R-Q206L/Y-Y209W、N18K/R-Q206L/Y-T213A、
N18K/R-Q206L/Y-H249N/R、N18K/R-Y209W-T213
A、N18K/R-Y209W-H249N/R、N18K/R-T213A-H249
N/R、S24F/L/P/R-S78N-S87D/R、S24F/L/P-S78N
-P129Q、S24F/L/P-S78N-S130A、S24F/L/P-S78N
-Q206L/Y、S24F/L/P/R-S78N-Q206Y、S24F/L/P-
S78N-Y209W、S24F/L/P/R-S78N-T213A、S24F/L/
P/R-S78N-H249N/R、S24F/L/P/R-S87D/R-P129Q
、S24F/L/P/R-S87D/R-S130A、S24F/L/P/R-S87D
/R-Q206L/Y、S24F/L/P/R-87D/R-Y209W、S24F/L
/P/R-S87D/R-T213A、S24F/L/P/R-S87D/R-H249
、S24F/L/P-P129Q-S130A、S24F/L/P-P129Q-Q20
6L/Y、S24F/L/P/R-P129Q-Q206Y、S24F/L/P-P12
9Q-Y209W、S24F/L/P/R-P129Q-T213A、S24F/L/P
/R-P129Q-H249N/R、S24F/L/P-S130A-Q206L/Y、
S24F/L/P/R-S130A-Q206Y、S24F/L/P-S130A-Y2
09W、S24F/L/P/R-S130A-T213A、S24F/L/P/R-S1
30A-H249N/R、S24F/L/P-Q206L/Y-Y209W、S24F/
L/P/R-Q206Y-Y209W、S24F/L/P/R-Q206L/Y-T21
3A、S24F/L/P/R-Q206L/Y-H249N/R、S24F/L/P/R
-Y209W-T213A、S24F/L/P/R-Y209W-H249N/R、S7
8N-S87D/R-P129Q、S78N-S87D/R-S130A、S78N-S
87D/R-Q206L/Y、S78N-S87D/R-Y209W、S78N-S87
D/R-T213A、S78N-S87D/R-H249N/R、S78N-P129Q
-Q206Y、S78N-P129Q-T213A、S78N-P129Q-H249N
/R、S78N-S130A-Q206Y、S78N-S130A-T213A、S78
N-S130A-H249N/R、S78N-Q206L/Y-T213A、S78N-
Q206L/Y-H249N/R、S78N-Y209W-T213A、S78N-Y2
09W-H249N/R、S78N-T213A-H249N/R、S87D/R-P1
29Q-S130A、S87D/R-P129Q-Q206L/R/Y、S87D/R-
P129Q-Y209W、S87D/R-P129Q-T213A、S87D/R-P1
29Q-H249N/R、S87D/R-S130A-Q206L/R/Y、S87D/
R-S130A-Y209W、S87D/R-S130A-T213A、S87D/R-
S130A-H249N/R、S87D/R-Q206L/Y-Y209W、S87D/
R-Q206L/Y-T213A、87D/R-Q206L/Y-H249N/R、S8
7D/R-Y209W-T213A、S87D/R-Y209W-H249N/R、S8
7D/R-T213A-H249N/R、P129Q-S130A-Q206R/Y、P
129Q-S130A-T213A、P129Q-S130A-H249N/R、P12
9Q-Q206Y-Y209W、P129Q-Q206L/Y-T213A、P129Q
-Q206L/Y-H249N/R、P129Q-Y209W-T213A、P129Q
-Y209W-H249N/R、P129Q-T213A-H249N/R、S130A
-Q206Y-Y209W、S130A-Q206L/Y-T213A、S130A-Q
206L/Y-H249N/R、S130A-Y209W-T213A、S130A-Y
209W-H249N/R、S130A-T213A-H249N/R、S130A-Y
209W-H249N/R、Q206L/Y-Y209W-T213A、Q206L/Y
-Y209W-H249N/R、Q206L/Y-T213A-H249N/R、Y20
9W-T213A-H249N/Rおよびこれらの組み合わせから選択される、2つ以上
の位置でのアミノ酸置換の組み合わせを含む、単離されたスブチリシン変異体を提供する
;ここで、前記変異体はタンパク質分解活性を有しており、前記変異体のアミノ酸配列は
、(i)1、3、8、9、16、20、22、28、42、43、44、56、76、7
7、82、88、89、99、100、101、103、104、108、116、11
8、120、124、127、128、147、150、158、159、160、16
6、185、188、194、204、210、211、212、215、216、21
7、218、222、232、235、241、243、245、246、248、25
1、252、254、256、259、261、262、268、270および271;
(ii)X1V、X3I/T/V、X8V、X9G、X16T、X20E/R、X22L
/W、X28T、X42I、X43R/S/Y、X44V、X56P、X76D、X77
D、X82D、X88S、X89H、X99N、X100S、X101F/G/H/Q/
T/V、X103A/D/P、X104I、X108S、X116L/M、X118A/
R/V、X120R、X124M、X127S/T、X128K/L/R、X147I、
X150T、X158E/T/V、X159D、X160Q、X166D/N、X185
Y、X188D、X194D/P、X204D、X210I/L、X211P、X212
D、X215K/V、X216Y、X217K、X218S、X222L/Q/S、X2
32V、X235T、X241K、X243S、X245R、X246V、X248D、
X251R、X252I、X254T、X256P、X259G、X261I/N、X2
62Q、X268A、X270P/TおよびX271D;または(iii)A1V、S3
I/T/V、I8V、S9G、A16T、G20E/R、T22L/W、V28T、L4
2I、N43R/S/Y、I44V、S56P、N76D、N77D、L82D、A88
S、E89H、S99N、G100S、S101F/G/H/Q/T/V、S103A/
D/P、V104I、A108S、N116L/M、G118A/R/V、H120R、
L124M、G127S/T、S128K/LR、V147I、V150T、A158E
/T/V、G159D、S160Q、S166D/N、N185Y、S188D、A19
4D/P、N204D、P210I/L、G211P、S212D、A215K/V、S
216Y、L217K、N218S、M222L/Q/S、A232V、K235T、W
241K、N243S、Q245R、I246V、N248D、K251R、N252I
、A254T、S256P、S259G、N261I/N、L262Q、V268A、A
270P/TおよびE271Dから選択される1つ以上の置換をさらに含み、さらに、前
記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエ
ンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’
配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ酸
配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたものである。またさら
に他の実施形態は、S78N-Q206F/M/Y、S78G-Q206D/F/H/M
/N/P/R/Y、N18K/R-S78N、N18K/R-S87R、N18K/R-
Q206L/Y、S24F/L/P/R-S87R、S24F/L/P-Q206L/Y
、S24F/L/P/R-Q206Y、S24F/L/P-Y209W、P40E-S7
8G、P40E-S87R、P40E-P129Q、P40E-S130A、S78N-
S87D/R、S78G-S87D/R/T、S78A/C/E/F/H/I/K/L/
M/P/Q/R/T/V/W/Y-S87R、S78A/C/E/F/G/H/I/K/
L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-P129Q、S78A/C/E/F/H/I/K
/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-S130A、S78G-S130A/Q、S7
8N-H249N/R、S87D/R-Q206L/R/Y、S87D/R-Y209W
、S87D/R-T213A、S87R-H249N/R、P129Q-Q206RY、
P129Q-H249N/R、S130A-Q206R/Y、S130A-H249N/
R、Q206Y-Y209W、Q206L/Y-T213A、Q206L/Y-H249
N/R、Y209W-T213A、Y209W-H249N/R、N18K/R-S24
F/L/P/R-S78N、N18K/R-S24F/L/P/R-S87D/R、N1
8K/R-S24F/L/P/R-P129Q、N18K/R-S24F/L/P/R-
S130A、N18K/R-S24F/L/P/R-Q206L/Y、N18K/R-S
24F/L/P/R-Y209W、N18K/R-S78N-S87D/R、N18K/
R-S78N-P129Q、N18K/R-S78N-S130A、N18K/R-S7
8N-Q206L/Y、N18K/R-S78N-Y209W、N18K/R-S78N
-T213A、N18K/R-S78N-H249N/R、N18K/R-S87D/R
-P129Q、N18K/R-S87D/R-S130A、N18K/R-S87D/R
-Q206L/Y、N18K/R-S87D/R-Y209W、N18K/R-S87D
/R-T213A、N18K/R-S87D/R-H249、N18K/R-P129Q
-S130A、N18K/R-P129Q-Q206L/Y、N18K/R-P129Q
-209、N18K/R-P129Q-T213A、N18K/R-P129Q-H24
9N/R、N18K/R-S130A-Q206L/Y、N18K/R-S130A-Y
209W、N18K/R-S130A-T213A、N18K/R-S130A-H24
9N/R、N18K/R-Q206L/Y-Y209W、N18K/R-Q206L/Y
-T213A、N18K/R-Q206L/Y-H249N/R、N18K/R-Y20
9W-T213A、N18K/R-Y209W-H249N/R、N18K/R-T21
3A-H249N/R、S24F/L/P/R-S78N-S87D/R、S24F/L
/P-S78N-P129Q、S24F/L/P-S78N-S130A、S24F/L
/P-S78N-Q206L/Y、S24F/L/P/R-S78N-Q206Y、S2
4F/L/P-S78N-Y209W、S24F/L/P/R-S78N-T213A、
S24F/L/P/R-S78N-H249N/R、S24F/L/P/R-S87D/
R-P129Q、S24F/L/P/R-S87D/R-S130A、S24F/L/P
/R-S87D/R-Q206L/Y、S24F/L/P/R-87D/R-Y209W
、S24F/L/P/R-S87D/R-T213A、S24F/L/P/R-S87D
/R-H249、S24F/L/P-P129Q-S130A、S24F/L/P-P1
29Q-Q206L/Y、S24F/L/P/R-P129Q-Q206Y、S24F/
L/P-P129Q-Y209W、S24F/L/P/R-P129Q-T213A、S
24F/L/P/R-P129Q-H249N/R、S24F/L/P-S130A-Q
206L/Y、S24F/L/P/R-S130A-Q206Y、S24F/L/P-S
130A-Y209W、S24F/L/P/R-S130A-T213A、S24F/L
/P/R-S130A-H249N/R、S24F/L/P-Q206L/Y-Y209
W、S24F/L/P/R-Q206Y-Y209W、S24F/L/P/R-Q206
L/Y-T213A、S24F/L/P/R-Q206L/Y-H249N/R、S24
F/L/P/R-Y209W-T213A、S24F/L/P/R-Y209W-H24
9N/R、S78N-S87D/R-P129Q、S78N-S87D/R-S130A
、S78N-S87D/R-Q206L/Y、S78N-S87D/R-Y209W、S
78N-S87D/R-T213A、S78N-S87D/R-H249N/R、S78
N-P129Q-Q206Y、S78N-P129Q-T213A、S78N-P129
Q-H249N/R、S78N-S130A-Q206Y、S78N-S130A-T2
13A、S78N-S130A-H249N/R、S78N-Q206L/Y-T213
A、S78N-Q206L/Y-H249N/R、S78N-Y209W-T213A、
S78N-Y209W-H249N/R、S78N-T213A-H249N/R、S8
7D/R-P129Q-S130A、S87D/R-P129Q-Q206L/R/Y、
S87D/R-P129Q-Y209W、S87D/R-P129Q-T213A、S8
7D/R-P129Q-H249N/R、S87D/R-S130A-Q206L/R/
Y、S87D/R-S130A-Y209W、S87D/R-S130A-T213A、
S87D/R-S130A-H249N/R、S87D/R-Q206L/Y-Y209
W、S87D/R-Q206L/Y-T213A、87D/R-Q206L/Y-H24
9N/R、S87D/R-Y209W-T213A、S87D/R-Y209W-H24
9N/R、S87D/R-T213A-H249N/R、P129Q-S130A-Q2
06R/Y、P129Q-S130A-T213A、P129Q-S130A-H249
N/R、P129Q-Q206Y-Y209W、P129Q-Q206L/Y-T213
A、P129Q-Q206L/Y-H249N/R、P129Q-Y209W-T213
A、P129Q-Y209W-H249N/R、P129Q-T213A-H249N/
R、S130A-Q206Y-Y209W、S130A-Q206L/Y-T213A、
S130A-Q206L/Y-H249N/R、S130A-Y209W-T213A、
S130A-Y209W-H249N/R、S130A-T213A-H249N/R、
S130A-Y209W-H249N/R、Q206L/Y-Y209W-T213A、
Q206L/Y-Y209W-H249N/R、Q206L/Y-T213A-H249
N/R、Y209W-T213A-H249N/Rおよびこれらの組み合わせから選択さ
れる、2つ以上の位置でのアミノ酸置換の組み合わせを含む、単離されたスブチリシン変
異体を提供する;ここで、前記変異体はタンパク質分解活性を有しており、前記変異体の
アミノ酸配列は、(i)3、8、22、28、43、76、89、99、101、103
、104、108、116、118、124、127、128、147、150、158
、159、166、188、194、210、211、212、215、217、222
、232、235、243、245、246、261、262、270および271;(
ii)X3T/V、X8V、X22W、X28T、X43S、X76D、X89H、X9
9N、X101F/G/V、X103A/D/P、X104I、X108S、X116M
、X118R、X124M、X127T、X128L、X147I、X150T、X15
8E/T、X159D、X166D、X188D、X194D/P、X210I/L、X
211P、X212D、X215V、X217K、X222Q/S、X232V、X23
5T、X243S、X245R、X246V、X261I、X262Q、X270Tおよ
びX271D;または(iii)S3T/V、I8V、T22W、V28T、N43S、
N76D、E89H、S99N、S101F/G/V、S103A/D/P、V104I
、A108S、N116M、G118R、L124M、G127T、S128L、V14
7I、V150T、A158E/T、G159D、S166D、S188D、A194D
/P、P210I/L、G211P、S212D、A215V、L217K、M222Q
/S、A232V、K235T、N243S、Q245R、I246V、N261I、L
262Q、A270TおよびE271D;から選択される1つ以上の置換をさらに含み、
さらに、前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリク
エファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシ
ンBPN’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異
体アミノ酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたものである
。さらに他の実施形態は、S78N-Q206F/M/Y、S78G-Q206D/F/
H/M/N/P/R/Y、N18K/R-S78N、N18K/R-S87R、N18K
/R-Q206L/Y、S24F/L/P/R-S87R、S24F/L/P-Q206
L/Y、S24F/L/P/R-Q206Y、S24F/L/P-Y209W、P40E
-S78G、P40E-S87R、P40E-P129Q、P40E-S130A、S7
8N-S87D/R、S78G-S87D/R/T、S78A/C/E/F/H/I/K
/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-S87R、S78A/C/E/F/G/H/I
/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-P129Q、S78A/C/E/F/H/
I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/Y-S130A、S78G-S130A/Q
、S78N-H249N/R、S87D/R-Q206L/R/Y、S87D/R-Y2
09W、S87D/R-T213A、S87R-H249N/R、P129Q-Q206
RY、P129Q-H249N/R、S130A-Q206R/Y、S130A-H24
9N/R、Q206Y-Y209W、Q206L/Y-T213A、Q206L/Y-H
249N/R、Y209W-T213A、Y209W-H249N/R、N18K/R-
S24F/L/P/R-S78N、N18K/R-S24F/L/P/R-S87D/R
、N18K/R-S24F/L/P/R-P129Q、N18K/R-S24F/L/P
/R-S130A、N18K/R-S24F/L/P/R-Q206L/Y、N18K/
R-S24F/L/P/R-Y209W、N18K/R-S78N-S87D/R、N1
8K/R-S78N-P129Q、N18K/R-S78N-S130A、N18K/R
-S78N-Q206L/Y、N18K/R-S78N-Y209W、N18K/R-S
78N-T213A、N18K/R-S78N-H249N/R、N18K/R-S87
D/R-P129Q、N18K/R-S87D/R-S130A、N18K/R-S87
D/R-Q206L/Y、N18K/R-S87D/R-Y209W、N18K/R-S
87D/R-T213A、N18K/R-S87D/R-H249、N18K/R-P1
29Q-S130A、N18K/R-P129Q-Q206L/Y、N18K/R-P1
29Q-209、N18K/R-P129Q-T213A、N18K/R-P129Q-
H249N/R、N18K/R-S130A-Q206L/Y、N18K/R-S130
A-Y209W、N18K/R-S130A-T213A、N18K/R-S130A-
H249N/R、N18K/R-Q206L/Y-Y209W、N18K/R-Q206
L/Y-T213A、N18K/R-Q206L/Y-H249N/R、N18K/R-
Y209W-T213A、N18K/R-Y209W-H249N/R、N18K/R-
T213A-H249N/R、S24F/L/P/R-S78N-S87D/R、S24
F/L/P-S78N-P129Q、S24F/L/P-S78N-S130A、S24
F/L/P-S78N-Q206L/Y、S24F/L/P/R-S78N-Q206Y
、S24F/L/P-S78N-Y209W、S24F/L/P/R-S78N-T21
3A、S24F/L/P/R-S78N-H249N/R、S24F/L/P/R-S8
7D/R-P129Q、S24F/L/P/R-S87D/R-S130A、S24F/
L/P/R-S87D/R-Q206L/Y、S24F/L/P/R-87D/R-Y2
09W、S24F/L/P/R-S87D/R-T213A、S24F/L/P/R-S
87D/R-H249、S24F/L/P-P129Q-S130A、S24F/L/P
-P129Q-Q206L/Y、S24F/L/P/R-P129Q-Q206Y、S2
4F/L/P-P129Q-Y209W、S24F/L/P/R-P129Q-T213
A、S24F/L/P/R-P129Q-H249N/R、S24F/L/P-S130
A-Q206L/Y、S24F/L/P/R-S130A-Q206Y、S24F/L/
P-S130A-Y209W、S24F/L/P/R-S130A-T213A、S24
F/L/P/R-S130A-H249N/R、S24F/L/P-Q206L/Y-Y
209W、S24F/L/P/R-Q206Y-Y209W、S24F/L/P/R-Q
206L/Y-T213A、S24F/L/P/R-Q206L/Y-H249N/R、
S24F/L/P/R-Y209W-T213A、S24F/L/P/R-Y209W-
H249N/R、S78N-S87D/R-P129Q、S78N-S87D/R-S1
30A、S78N-S87D/R-Q206L/Y、S78N-S87D/R-Y209
W、S78N-S87D/R-T213A、S78N-S87D/R-H249N/R、
S78N-P129Q-Q206Y、S78N-P129Q-T213A、S78N-P
129Q-H249N/R、S78N-S130A-Q206Y、S78N-S130A
-T213A、S78N-S130A-H249N/R、S78N-Q206L/Y-T
213A、S78N-Q206L/Y-H249N/R、S78N-Y209W-T21
3A、S78N-Y209W-H249N/R、S78N-T213A-H249N/R
、S87D/R-P129Q-S130A、S87D/R-P129Q-Q206L/R
/Y、S87D/R-P129Q-Y209W、S87D/R-P129Q-T213A
、S87D/R-P129Q-H249N/R、S87D/R-S130A-Q206L
/R/Y、S87D/R-S130A-Y209W、S87D/R-S130A-T21
3A、S87D/R-S130A-H249N/R、S87D/R-Q206L/Y-Y
209W、S87D/R-Q206L/Y-T213A、87D/R-Q206L/Y-
H249N/R、S87D/R-Y209W-T213A、S87D/R-Y209W-
H249N/R、S87D/R-T213A-H249N/R、P129Q-S130A
-Q206R/Y、P129Q-S130A-T213A、P129Q-S130A-H
249N/R、P129Q-Q206Y-Y209W、P129Q-Q206L/Y-T
213A、P129Q-Q206L/Y-H249N/R、P129Q-Y209W-T
213A、P129Q-Y209W-H249N/R、P129Q-T213A-H24
9N/R、S130A-Q206Y-Y209W、S130A-Q206L/Y-T21
3A、S130A-Q206L/Y-H249N/R、S130A-Y209W-T21
3A、S130A-Y209W-H249N/R、S130A-T213A-H249N
/R、S130A-Y209W-H249N/R、Q206L/Y-Y209W-T21
3A、Q206L/Y-Y209W-H249N/R、Q206L/Y-T213A-H
249N/R、Y209W-T213A-H249N/Rおよびこれらの組み合わせから
選択される、2つ以上の位置でのアミノ酸置換の組み合わせを含む、単離されたスブチリ
シン変異体を提供する;ここで、前記変異体はタンパク質分解活性を有しており、前記変
異体のアミノ酸配列は、(i)1、3、8、9、16、20、22、28、42、43、
44、56、76、77、82、88、100、101、103、104、108、11
6、118、120、124、127、128、147、150、158、159、16
0、166、185、194、204、210、211、212、215、216、21
7、218、222、232、241、245、248、251、252、254、25
6、259、261、262、268、270、271;(ii)X1V、X3I/V、
X8V、X9G、X16T、X20E/R、X22L/W、X28T、X42I、X43
R/Y、X44V、X56P、X76D、X77D、X82D、X88S、X100S、
X101G/H/Q/T/V、X103A、X104I、X108S、X116L/M、
X118A/R/V、X120R、X124M、X127S/T、X128K/L/R、
X147I、X150T、X158E/V、X160Q、X166D/N、X185Y、
X194D/P、X204D、X210I、X211P、X212D、X215K/V、
X216Y、X217K、X218S、X222Q/S、X232V、X241K、X2
45R、X248D、X251R、X252I、X254T、X256P、X259G、
X261I、X262Q、X268A、X270PおよびX271D;または(iii)
A1V、S3I/V、I8V、S9G、A16T、G20E/R、T22L/W、V28
T、L42I、N43R/Y、I44V、S56P、N76D、N77D、L82D、A
88S、G100S、S101G/H/Q/T/V、S103A、V104I、A108
S、N116L/M、G118A/R/V、H120R、L124M、G127S/T、
S128K/LR、V147I、V150T、A158E/V、S160Q、S166D
/N、N185Y、A194D/P、N204D、P210I、G211P、S212D
、A215K/V、S216Y、L217K、N218S、M222Q/S、A232V
、W241K、Q245R、N248D、K251R、N252I、A254T、S25
6P、S259G、N261I、L262Q、V268A、A270PおよびE271D
から選択される1つ以上の置換をさらに含み、さらに、前記変異体の各アミノ酸の位置は
、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus am
yloliquefaciens)スブチリシンBPN’配列の、対応するアミノ酸位置
にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミノ酸配列と
のアラインメントにより決定されたものである。またさらに他の実施形態は、S78N-
Q206F/M/Y、S78G-Q206D/F/H/M/N/P/R/Y、N18K/
R-S78N、N18K/R-S87R、N18K/R-Q206L/Y、S24F/L
/P/R-S87R、S24F/L/P-Q206L/Y、S24F/L/P/R-Q2
06Y、S24F/L/P-Y209W、P40E-S78G、P40E-S87R、P
40E-P129Q、P40E-S130A、S78N-S87D/R、S78G-S8
7D/R/T、S78A/C/E/F/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/W/
Y-S87R、S78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V/
W/Y-P129Q、S78A/C/E/F/H/I/K/L/M/P/Q/R/T/V
/W/Y-S130A、S78G-S130A/Q、S78N-H249N/R、S87
D/R-Q206L/R/Y、S87D/R-Y209W、S87D/R-T213A、
S87R-H249N/R、P129Q-Q206RY、P129Q-H249N/R、
S130A-Q206R/Y、S130A-H249N/R、Q206Y-Y209W、
Q206L/Y-T213A、Q206L/Y-H249N/R、Y209W-T213
A、Y209W-H249N/R、N18K/R-S24F/L/P/R-S78N、N
18K/R-S24F/L/P/R-S87D/R、N18K/R-S24F/L/P/
R-P129Q、N18K/R-S24F/L/P/R-S130A、N18K/R-S
24F/L/P/R-Q206L/Y、N18K/R-S24F/L/P/R-Y209
W、N18K/R-S78N-S87D/R、N18K/R-S78N-P129Q、N
18K/R-S78N-S130A、N18K/R-S78N-Q206L/Y、N18
K/R-S78N-Y209W、N18K/R-S78N-T213A、N18K/R-
S78N-H249N/R、N18K/R-S87D/R-P129Q、N18K/R-
S87D/R-S130A、N18K/R-S87D/R-Q206L/Y、N18K/
R-S87D/R-Y209W、N18K/R-S87D/R-T213A、N18K/
R-S87D/R-H249、N18K/R-P129Q-S130A、N18K/R-
P129Q-Q206L/Y、N18K/R-P129Q-209、N18K/R-P1
29Q-T213A、N18K/R-P129Q-H249N/R、N18K/R-S1
30A-Q206L/Y、N18K/R-S130A-Y209W、N18K/R-S1
30A-T213A、N18K/R-S130A-H249N/R、N18K/R-Q2
06L/Y-Y209W、N18K/R-Q206L/Y-T213A、N18K/R-
Q206L/Y-H249N/R、N18K/R-Y209W-T213A、N18K/
R-Y209W-H249N/R、N18K/R-T213A-H249N/R、S24
F/L/P/R-S78N-S87D/R、S24F/L/P-S78N-P129Q、
S24F/L/P-S78N-S130A、S24F/L/P-S78N-Q206L/
Y、S24F/L/P/R-S78N-Q206Y、S24F/L/P-S78N-Y2
09W、S24F/L/P/R-S78N-T213A、S24F/L/P/R-S78
N-H249N/R、S24F/L/P/R-S87D/R-P129Q、S24F/L
/P/R-S87D/R-S130A、S24F/L/P/R-S87D/R-Q206
L/Y、S24F/L/P/R-87D/R-Y209W、S24F/L/P/R-S8
7D/R-T213A、S24F/L/P/R-S87D/R-H249、S24F/L
/P-P129Q-S130A、S24F/L/P-P129Q-Q206L/Y、S2
4F/L/P/R-P129Q-Q206Y、S24F/L/P-P129Q-Y209
W、S24F/L/P/R-P129Q-T213A、S24F/L/P/R-P129
Q-H249N/R、S24F/L/P-S130A-Q206L/Y、S24F/L/
P/R-S130A-Q206Y、S24F/L/P-S130A-Y209W、S24
F/L/P/R-S130A-T213A、S24F/L/P/R-S130A-H24
9N/R、S24F/L/P-Q206L/Y-Y209W、S24F/L/P/R-Q
206Y-Y209W、S24F/L/P/R-Q206L/Y-T213A、S24F
/L/P/R-Q206L/Y-H249N/R、S24F/L/P/R-Y209W-
T213A、S24F/L/P/R-Y209W-H249N/R、S78N-S87D
/R-P129Q、S78N-S87D/R-S130A、S78N-S87D/R-Q
206L/Y、S78N-S87D/R-Y209W、S78N-S87D/R-T21
3A、S78N-S87D/R-H249N/R、S78N-P129Q-Q206Y、
S78N-P129Q-T213A、S78N-P129Q-H249N/R、S78N
-S130A-Q206Y、S78N-S130A-T213A、S78N-S130A
-H249N/R、S78N-Q206L/Y-T213A、S78N-Q206L/Y
-H249N/R、S78N-Y209W-T213A、S78N-Y209W-H24
9N/R、S78N-T213A-H249N/R、S87D/R-P129Q-S13
0A、S87D/R-P129Q-Q206L/R/Y、S87D/R-P129Q-Y
209W、S87D/R-P129Q-T213A、S87D/R-P129Q-H24
9N/R、S87D/R-S130A-Q206L/R/Y、S87D/R-S130A
-Y209W、S87D/R-S130A-T213A、S87D/R-S130A-H
249N/R、S87D/R-Q206L/Y-Y209W、S87D/R-Q206L
/Y-T213A、87D/R-Q206L/Y-H249N/R、S87D/R-Y2
09W-T213A、S87D/R-Y209W-H249N/R、S87D/R-T2
13A-H249N/R、P129Q-S130A-Q206R/Y、P129Q-S1
30A-T213A、P129Q-S130A-H249N/R、P129Q-Q206
Y-Y209W、P129Q-Q206L/Y-T213A、P129Q-Q206L/
Y-H249N/R、P129Q-Y209W-T213A、P129Q-Y209W-
H249N/R、P129Q-T213A-H249N/R、S130A-Q206Y-
Y209W、S130A-Q206L/Y-T213A、S130A-Q206L/Y-
H249N/R、S130A-Y209W-T213A、S130A-Y209W-H2
49N/R、S130A-T213A-H249N/R、S130A-Y209W-H2
49N/R、Q206L/Y-Y209W-T213A、Q206L/Y-Y209W-
H249N/R、Q206L/Y-T213A-H249N/R、Y209W-T213
A-H249N/Rおよびこれらの組み合わせから選択される、2つ以上の位置でのアミ
ノ酸置換の組み合わせを含む、単離されたスブチリシン変異体を提供する;ここで、前記
変異体はタンパク質分解活性を有しており、前記変異体のアミノ酸配列は、(i)3、7
6、101、103、104、118、127、128、166、210、217、22
2および261;(ii)X3VX76D、X101F/G/V、X103A/D/P、
X104I、X118R、X127T、X128L/R、X166D/N、X210I、
X217K、X222Q/SおよびX261I;または(ii)S3V、N76D、S1
01F/G/V、S103A/D/P、V104I、G118R、G127T、S128
L/R、S166D/N、P210I、L217K、M222Q/SおよびN261Iか
ら選択される1つ以上の置換をさらに含み、さらに、前記変異体の各アミノ酸の位置は、
配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amy
loliquefaciens)スブチリシンBPN’配列の、対応するアミノ酸位置に
したがって番号付けされており、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミノ酸配列との
アラインメントにより決定されたものである。
【0068】
なおさらなる他の実施形態は、S78N-Q206L/Y、N18K/R-S78N、
N18K/R-S87R、N18K/R-Q206L/Y、S24F/P/R-S87R
、S24F/P/R-Q206L/Y、S24F/P/R-Q206L/Y、S24F/
P/R-Y209W、S78N-S87D/R、S78N-P129Q、S78N-S1
30A、S78N-Y209W、S78N-H249N/R、S78N-H249N/R
、S87D/R-Q206L/Y、S87D/R-Y209W、S87D/R-T213
A、S87R-H249N/R、P129Q-Q206L/Y、P129Q-Y209W
、P129Q-H249N/R、S130A-Q206L/Y、S130A-Y209W
、S130A-H249N/R、Q206L/Y-Y209W、Q206L/Y-T21
3A、Q206L/Y-H249N/R、Y209W-T213A、Y209W-H24
9N/R、N18K/R-S24F/P/R-S78N、N18K/R-S24F/P/
R-S87D/R、N18K/R-S24F/P/R-P129Q、N18K/R-S2
4F/P/R-S130A、N18K/R-S24F/P/R-Q206L/Y、N18
K/R-S24F/P/R-Y209W、N18K/R-S78N-S87D/R、N1
8K/R-S78N-P129Q、N18K/R-S78N-S130A、N18K/R
-S78N-Q206L/Y、N18K/R-S78N-Y209W、N18K/R-S
78N-T213A、N18K/R-S78N-H249N/R、N18K/R-S87
D/R-P129Q、N18K/R-S87D/R-S130A、N18K/R-S87
D/R-Q206L/Y、N18K/R-S87D/R-Y209W、N18K/R-S
87D/R-T213A、N18K/R-S87D/R-H249、N18K/R-P1
29Q-S130A、N18K/R-P129Q-Q206L/Y、N18K/R-P1
29Q-209、N18K/R-P129Q-T213A、N18K/R-P129Q-
H249N/R、N18K/R-S130A-Q206L/Y、N18K/R-S130
A-Y209W、N18K/R-S130A-T213A、N18K/R-S130A-
H249N/R、N18K/R-Q206L/Y-Y209W、N18K/R-Q206
L/Y-T213A、N18K/R-Q206L/Y-H249N/R、N18K/R-
Y209W-T213A、N18K/R-Y209W-H249N/R、N18K/R-
T213A-H249N/R、S24F/P/R-S78N-S87D/R、S24F/
P/R-S78N-P129Q、S24F/P/R-S78N-S130A、S24F/
P/R-S78N-Q206L/Y、S24F/P/R-S78N-Y209W、S24
F/P/R-S78N-T213A、S24F/P/R-S78N-H249N/R、S
24F/P/R-S87D/R-P129Q、S24F/P/R-S87D/R-S13
0A、S24F/P/R-S87D/R-Q206L/Y、S24F/P/R-87D/
R-Y209W、S24F/P/R-S87D/R-T213A、S24F/P/R-S
87D/R-H249、S24F/P/R-P129Q-S130A、S24F/P/R
-P129Q-Q206L/Y、S24F/P/R-P129Q-Y209W、S24F
/P/R-P129Q-T213A、S24F/P/R-P129Q-H249N/R、
S24F/P/R-S130A-Q206L/Y、S24F/P/R-S130A-Y2
09W、S24F/P/R-S130A-T213A、S24F/P/R-S130A-
H249N/R、S24F/P/R-Q206L/Y-Y209W、S24F/P/R-
Q206L/Y-T213A、S24F/P/R-Q206L/Y-H249N/R、S
24F/P/R-Y209W-T213A、S24F/P/R-Y209W-H249N
/R、S78N-S87D/R-P129Q、S78N-S87D/R-S130A、S
78N-S87D/R-Q206L/Y、S78N-S87D/R-Y209W、S78
N-S87D/R-T213A、S78N-S87D/R-H249N/R、S78N-
P129Q-S130A、S78N-P129Q-Q206L/Y、S78N-P129
Q-Y209W、S78N-P129Q-T213A、S78N-P129Q-H249
N/R、S78N-S130A-Q206L/Y、S78N-S130A-Y209W、
S78N-S130A-T213A、S78N-S130A-T213A、S78N-S
130A-H249N/R、S78N-Q206L/Y-T213A、S78N-Q20
6L/Y-H249N/R、S78N-Y209W-T213A、S78N-Y209W
-H249N/R、S78N-T213A-H249N/R、S87D/R-P129Q
-S130A、S87D/R-P129Q-Q206L/Y、S87D/R-P129Q
-Y209W、S87D/R-P129Q-T213A、S87D/R-P129Q-H
249N/R、S87D/R-S130A-Q206L/Y、S87D/R-S130A
-Y209W、S87D/R-S130A-T213A、S87D/R-S130A-H
249N/R、S87D/R-Q206L/Y-Y209W、S87D/R-Q206L
/Y-T213A、87D/R-Q206L/Y-H249N/R、S87D/R-Y2
09W-T213A、S87D/R-Y209W-H249N/R、S87D/R-T2
13A-H249N/R、P129Q-S130A-Q206L/Y、P129Q-S1
30A-Y209W、P129Q-S130A-T213A、P129Q-S130A-
H249N/R、P129Q-Q206L/Y-Y209W、P129Q-Q206L/
Y-T213A、P129Q-Q206L/Y-H249N/R、P129Q-Y209
W-T213A、P129Q-Y209W-H249N/R、P129Q-T213A-
H249N/R、S130A-Q206L/Y-Y209W、S130A-Q206L/
Y-T213A、S130A-Q206L/Y-H249N/R、S130A-Y209
W-T213A、S130A-Y209W-H249N/R、S130A-T213A-
H249N/R、S130A-Y209W-H249N/R、Q206L/Y-Y209
W-T213A、Q206L/Y-Y209W-H249N/R、Q206L/Y-T2
13A-H249N/R、Y209W-T213A-H249N/Rおよびこれらの組み
合わせから選択される、2つ以上の位置でのアミノ酸置換の組み合わせを含む、単離され
たスブチリシン変異体を提供する;ここで、前記変異体はタンパク質分解活性を有してお
り、前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエフ
ァシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシンB
PN’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体ア
ミノ酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたものである。
【0069】
他の実施形態は、S78N-Q206L/Y、N18K/R-S78N、N18K/R
-S87R、N18K/R-Q206L/Y、S24F/P/R-S87R、S24F/
P/R-Q206L/Y、S24F/P/R-Q206L/Y、S24F/P/R-Y2
09W、S78N-S87D/R、S78N-P129Q、S78N-S130A、S7
8N-Y209W、S78N-H249N/R、S78N-H249N/R、S87D/
R-Q206L/Y、S87D/R-Y209W、S87D/R-T213A、S87R
-H249N/R、P129Q-Q206L/Y、P129Q-Y209W、P129Q
-H249N/R、S130A-Q206L/Y、S130A-Y209W、S130A
-H249N/R、Q206L/Y-Y209W、Q206L/Y-T213A、Q20
6L/Y-H249N/R、Y209W-T213A、Y209W-H249N/R、N
18K/R-S24F/P/R-S78N、N18K/R-S24F/P/R-S87D
/R、N18K/R-S24F/P/R-P129Q、N18K/R-S24F/P/R
-S130A、N18K/R-S24F/P/R-Q206L/Y、N18K/R-S2
4F/P/R-Y209W、N18K/R-S78N-S87D/R、N18K/R-S
78N-P129Q、N18K/R-S78N-S130A、N18K/R-S78N-
Q206L/Y、N18K/R-S78N-Y209W、N18K/R-S78N-T2
13A、N18K/R-S78N-H249N/R、N18K/R-S87D/R-P1
29Q、N18K/R-S87D/R-S130A、N18K/R-S87D/R-Q2
06L/Y、N18K/R-S87D/R-Y209W、N18K/R-S87D/R-
T213A、N18K/R-S87D/R-H249、N18K/R-P129Q-S1
30A、N18K/R-P129Q-Q206L/Y、N18K/R-P129Q-20
9、N18K/R-P129Q-T213A、N18K/R-P129Q-H249N/
R、N18K/R-S130A-Q206L/Y、N18K/R-S130A-Y209
W、N18K/R-S130A-T213A、N18K/R-S130A-H249N/
R、N18K/R-Q206L/Y-Y209W、N18K/R-Q206L/Y-T2
13A、N18K/R-Q206L/Y-H249N/R、N18K/R-Y209W-
T213A、N18K/R-Y209W-H249N/R、N18K/R-T213A-
H249N/R、S24F/P/R-S78N-S87D/R、S24F/P/R-S7
8N-P129Q、S24F/P/R-S78N-S130A、S24F/P/R-S7
8N-Q206L/Y、S24F/P/R-S78N-Y209W、S24F/P/R-
S78N-T213A、S24F/P/R-S78N-H249N/R、S24F/P/
R-S87D/R-P129Q、S24F/P/R-S87D/R-S130A、S24
F/P/R-S87D/R-Q206L/Y、S24F/P/R-87D/R-Y209
W、S24F/P/R-S87D/R-T213A、S24F/P/R-S87D/R-
H249、S24F/P/R-P129Q-S130A、S24F/P/R-P129Q
-Q206L/Y、S24F/P/R-P129Q-Y209W、S24F/P/R-P
129Q-T213A、S24F/P/R-P129Q-H249N/R、S24F/P
/R-S130A-Q206L/Y、S24F/P/R-S130A-Y209W、S2
4F/P/R-S130A-T213A、S24F/P/R-S130A-H249N/
R、S24F/P/R-Q206L/Y-Y209W、S24F/P/R-Q206L/
Y-T213A、S24F/P/R-Q206L/Y-H249N/R、S24F/P/
R-Y209W-T213A、S24F/P/R-Y209W-H249N/R、S78
N-S87D/R-P129Q、S78N-S87D/R-S130A、S78N-S8
7D/R-Q206L/Y、S78N-S87D/R-Y209W、S78N-S87D
/R-T213A、S78N-S87D/R-H249N/R、S78N-P129Q-
S130A、S78N-P129Q-Q206L/Y、S78N-P129Q-Y209
W、S78N-P129Q-T213A、S78N-P129Q-H249N/R、S7
8N-S130A-Q206L/Y、S78N-S130A-Y209W、S78N-S
130A-T213A、S78N-S130A-T213A、S78N-S130A-H
249N/R、S78N-Q206L/Y-T213A、S78N-Q206L/Y-H
249N/R、S78N-Y209W-T213A、S78N-Y209W-H249N
/R、S78N-T213A-H249N/R、S87D/R-P129Q-S130A
、S87D/R-P129Q-Q206L/Y、S87D/R-P129Q-Y209W
、S87D/R-P129Q-T213A、S87D/R-P129Q-H249N/R
、S87D/R-S130A-Q206L/Y、S87D/R-S130A-Y209W
、S87D/R-S130A-T213A、S87D/R-S130A-H249N/R
、S87D/R-Q206L/Y-Y209W、S87D/R-Q206L/Y-T21
3A、87D/R-Q206L/Y-H249N/R、S87D/R-Y209W-T2
13A、S87D/R-Y209W-H249N/R、S87D/R-T213A-H2
49N/R、P129Q-S130A-Q206L/Y、P129Q-S130A-Y2
09W、P129Q-S130A-T213A、P129Q-S130A-H249N/
R、P129Q-Q206L/Y-Y209W、P129Q-Q206L/Y-T213
A、P129Q-Q206L/Y-H249N/R、P129Q-Y209W-T213
A、P129Q-Y209W-H249N/R、P129Q-T213A-H249N/
R、S130A-Q206L/Y-Y209W、S130A-Q206L/Y-T213
A、S130A-Q206L/Y-H249N/R、S130A-Y209W-T213
A、S130A-Y209W-H249N/R、S130A-T213A-H249N/
R、S130A-Y209W-H249N/R、Q206L/Y-Y209W-T213
A、Q206L/Y-Y209W-H249N/R、Q206L/Y-T213A-H2
49N/R、Y209W-T213A-H249N/Rおよびこれらの組み合わせから選
択される、2つ以上の位置でのアミノ酸置換の組み合わせを含む、単離されたスブチリシ
ン変異体を提供する;ここで、前記変異体はタンパク質分解活性を有しており、前記変異
体のアミノ酸配列は、(i)1、3、9、16、20、22、28、42、43、44、
56、76、77、99、100、101、103、104、108、116、118、
120、124、127、128、150、158、159、166、185、188、
194、204、212、217、218、222、232、235、243、245、
246、251、254、259、268および270、(ii)X1V、X3T/V、
X9G、X16T、X20E/R、X22L、X28T、X42I、X43R/S、X4
4V、X56P、X76D、X77D、X99N、X100S、X101F/G/H/T
/V、X103A/D/P、X104I、X108S、X116L/M、X118R/V
、X120R、X124M、X127T、X128L、X150T、X158E/T/V
、X159D、X166D/N、X185Y、X188D、X194D、X204D、X
212D、X217K、X218S、X222L/Q/S、X232V、X235T、X
243S、X245R、X246V、X251R、X254T、X259G、X268A
およびX270P/Tまたは(iii)A1V、S3T/V、S9G、A16T、G20
E/R、T22L、V28T、L42I、N43R/S、I44V、S56P、N76D
、N77D、S99N、G100S、S101F/G/H/T/V、S103A/D/P
、V104I、A108S、N116L/M、G118R/V、H120R、L124M
、G127T、S128L、V150T、A158E/T/V、G159D、S166D
/N、N185Y、S188D、A194D、N204D、S212D、L217K、N
218S、M222L/Q/S、A232V、K235T、N243S、Q245R、I
246V、K251R、A254T、S259G、V268AおよびA270P/Tから
選択される1つ以上の置換をさらに含み、さらに、前記変異体の各アミノ酸の位置は、配
列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyl
oliquefaciens)スブチリシンBPN’配列の、対応するアミノ酸位置にし
たがって番号付けされており、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミノ酸配列とのア
ラインメントにより決定されたものである。さらに他の実施形態は、S78N-Q206
L/Y、N18K/R-S78N、N18K/R-S87R、N18K/R-Q206L
/Y、S24F/P/R-S87R、S24F/P/R-Q206L/Y、S24F/P
/R-Q206L/Y、S24F/P/R-Y209W、S78N-S87D/R、S7
8N-P129Q、S78N-S130A、S78N-Y209W、S78N-H249
N/R、S78N-H249N/R、S87D/R-Q206L/Y、S87D/R-Y
209W、S87D/R-T213A、S87R-H249N/R、P129Q-Q20
6L/Y、P129Q-Y209W、P129Q-H249N/R、S130A-Q20
6L/Y、S130A-Y209W、S130A-H249N/R、Q206L/Y-Y
209W、Q206L/Y-T213A、Q206L/Y-H249N/R、Y209W
-T213A、Y209W-H249N/R、N18K/R-S24F/P/R-S78
N、N18K/R-S24F/P/R-S87D/R、N18K/R-S24F/P/R
-P129Q、N18K/R-S24F/P/R-S130A、N18K/R-S24F
/P/R-Q206L/Y、N18K/R-S24F/P/R-Y209W、N18K/
R-S78N-S87D/R、N18K/R-S78N-P129Q、N18K/R-S
78N-S130A、N18K/R-S78N-Q206L/Y、N18K/R-S78
N-Y209W、N18K/R-S78N-T213A、N18K/R-S78N-H2
49N/R、N18K/R-S87D/R-P129Q、N18K/R-S87D/R-
S130A、N18K/R-S87D/R-Q206L/Y、N18K/R-S87D/
R-Y209W、N18K/R-S87D/R-T213A、N18K/R-S87D/
R-H249、N18K/R-P129Q-S130A、N18K/R-P129Q-Q
206L/Y、N18K/R-P129Q-209、N18K/R-P129Q-T21
3A、N18K/R-P129Q-H249N/R、N18K/R-S130A-Q20
6L/Y、N18K/R-S130A-Y209W、N18K/R-S130A-T21
3A、N18K/R-S130A-H249N/R、N18K/R-Q206L/Y-Y
209W、N18K/R-Q206L/Y-T213A、N18K/R-Q206L/Y
-H249N/R、N18K/R-Y209W-T213A、N18K/R-Y209W
-H249N/R、N18K/R-T213A-H249N/R、S24F/P/R-S
78N-S87D/R、S24F/P/R-S78N-P129Q、S24F/P/R-
S78N-S130A、S24F/P/R-S78N-Q206L/Y、S24F/P/
R-S78N-Y209W、S24F/P/R-S78N-T213A、S24F/P/
R-S78N-H249N/R、S24F/P/R-S87D/R-P129Q、S24
F/P/R-S87D/R-S130A、S24F/P/R-S87D/R-Q206L
/Y、S24F/P/R-87D/R-Y209W、S24F/P/R-S87D/R-
T213A、S24F/P/R-S87D/R-H249、S24F/P/R-P129
Q-S130A、S24F/P/R-P129Q-Q206L/Y、S24F/P/R-
P129Q-Y209W、S24F/P/R-P129Q-T213A、S24F/P/
R-P129Q-H249N/R、S24F/P/R-S130A-Q206L/Y、S
24F/P/R-S130A-Y209W、S24F/P/R-S130A-T213A
、S24F/P/R-S130A-H249N/R、S24F/P/R-Q206L/Y
-Y209W、S24F/P/R-Q206L/Y-T213A、S24F/P/R-Q
206L/Y-H249N/R、S24F/P/R-Y209W-T213A、S24F
/P/R-Y209W-H249N/R、S78N-S87D/R-P129Q、S78
N-S87D/R-S130A、S78N-S87D/R-Q206L/Y、S78N-
S87D/R-Y209W、S78N-S87D/R-T213A、S78N-S87D
/R-H249N/R、S78N-P129Q-S130A、S78N-P129Q-Q
206L/Y、S78N-P129Q-Y209W、S78N-P129Q-T213A
、S78N-P129Q-H249N/R、S78N-S130A-Q206L/Y、S
78N-S130A-Y209W、S78N-S130A-T213A、S78N-S1
30A-T213A、S78N-S130A-H249N/R、S78N-Q206L/
Y-T213A、S78N-Q206L/Y-H249N/R、S78N-Y209W-
T213A、S78N-Y209W-H249N/R、S78N-T213A-H249
N/R、S87D/R-P129Q-S130A、S87D/R-P129Q-Q206
L/Y、S87D/R-P129Q-Y209W、S87D/R-P129Q-T213
A、S87D/R-P129Q-H249N/R、S87D/R-S130A-Q206
L/Y、S87D/R-S130A-Y209W、S87D/R-S130A-T213
A、S87D/R-S130A-H249N/R、S87D/R-Q206L/Y-Y2
09W、S87D/R-Q206L/Y-T213A、87D/R-Q206L/Y-H
249N/R、S87D/R-Y209W-T213A、S87D/R-Y209W-H
249N/R、S87D/R-T213A-H249N/R、P129Q-S130A-
Q206L/Y、P129Q-S130A-Y209W、P129Q-S130A-T2
13A、P129Q-S130A-H249N/R、P129Q-Q206L/Y-Y2
09W、P129Q-Q206L/Y-T213A、P129Q-Q206L/Y-H2
49N/R、P129Q-Y209W-T213A、P129Q-Y209W-H249
N/R、P129Q-T213A-H249N/R、S130A-Q206L/Y-Y2
09W、S130A-Q206L/Y-T213A、S130A-Q206L/Y-H2
49N/R、S130A-Y209W-T213A、S130A-Y209W-H249
N/R、S130A-T213A-H249N/R、S130A-Y209W-H249
N/R、Q206L/Y-Y209W-T213A、Q206L/Y-Y209W-H2
49N/R、Q206L/Y-T213A-H249N/R、Y209W-T213A-
H249N/Rから選択される、2つ以上の位置でのアミノ酸置換の組み合わせを含む、
単離されたスブチリシン変異体を提供する;ここで、前記変異体はタンパク質分解活性を
有しており、前記変異体のアミノ酸配列は、(i)3、28、43、76、99、100
、101、103、104、108、116、118、124、127、128、150
、158、159、166、188、194、212、217、222、232、235
、243、245、246および270、(ii)X3T/V、X28T、X43S、X
76D、X99N、X100S、X101F/G/V、X103A/D/P、X104I
、X108S、X116M、X118R、X124M、X127T、X128L、X15
0T、X158E/T、X159D、X166D、X188D、X194D、X212D
、X217K、X222Q/S、X232V、X235T、X243S、X245R、X
246VおよびX270Tまたは(iii)S3V/T、V28T、N43S、N76D
、S99N、G100S、S101F/G/V、S103A/D/P、V104I、A1
08S、N116M、G118R、L124M、G127T、S128L、V150T、
A158E/T、G159D、S166D、S188D、A194D、S212D、L2
17K、M222Q/S、A232V、K235T、N243S、Q245R、I246
VおよびA270Tから選択される1つ以上の置換をさらに含み、さらに、前記変異体の
各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエンス(Ba
cillus amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’配列の、対
応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ酸配列とBP
N’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたものである。またさらに他の実施
形態は、S78N-Q206L/Y、N18K/R-S78N、N18K/R-S87R
、N18K/R-Q206L/Y、S24F/P/R-S87R、S24F/P/R-Q
206L/Y、S24F/P/R-Q206L/Y、S24F/P/R-Y209W、S
78N-S87D/R、S78N-P129Q、S78N-S130A、S78N-Y2
09W、S78N-H249N/R、S78N-H249N/R、S87D/R-Q20
6L/Y、S87D/R-Y209W、S87D/R-T213A、S87R-H249
N/R、P129Q-Q206L/Y、P129Q-Y209W、P129Q-H249
N/R、S130A-Q206L/Y、S130A-Y209W、S130A-H249
N/R、Q206L/Y-Y209W、Q206L/Y-T213A、Q206L/Y-
H249N/R、Y209W-T213A、Y209W-H249N/R、N18K/R
-S24F/P/R-S78N、N18K/R-S24F/P/R-S87D/R、N1
8K/R-S24F/P/R-P129Q、N18K/R-S24F/P/R-S130
A、N18K/R-S24F/P/R-Q206L/Y、N18K/R-S24F/P/
R-Y209W、N18K/R-S78N-S87D/R、N18K/R-S78N-P
129Q、N18K/R-S78N-S130A、N18K/R-S78N-Q206L
/Y、N18K/R-S78N-Y209W、N18K/R-S78N-T213A、N
18K/R-S78N-H249N/R、N18K/R-S87D/R-P129Q、N
18K/R-S87D/R-S130A、N18K/R-S87D/R-Q206L/Y
、N18K/R-S87D/R-Y209W、N18K/R-S87D/R-T213A
、N18K/R-S87D/R-H249、N18K/R-P129Q-S130A、N
18K/R-P129Q-Q206L/Y、N18K/R-P129Q-209、N18
K/R-P129Q-T213A、N18K/R-P129Q-H249N/R、N18
K/R-S130A-Q206L/Y、N18K/R-S130A-Y209W、N18
K/R-S130A-T213A、N18K/R-S130A-H249N/R、N18
K/R-Q206L/Y-Y209W、N18K/R-Q206L/Y-T213A、N
18K/R-Q206L/Y-H249N/R、N18K/R-Y209W-T213A
、N18K/R-Y209W-H249N/R、N18K/R-T213A-H249N
/R、S24F/P/R-S78N-S87D/R、S24F/P/R-S78N-P1
29Q、S24F/P/R-S78N-S130A、S24F/P/R-S78N-Q2
06L/Y、S24F/P/R-S78N-Y209W、S24F/P/R-S78N-
T213A、S24F/P/R-S78N-H249N/R、S24F/P/R-S87
D/R-P129Q、S24F/P/R-S87D/R-S130A、S24F/P/R
-S87D/R-Q206L/Y、S24F/P/R-87D/R-Y209W、S24
F/P/R-S87D/R-T213A、S24F/P/R-S87D/R-H249、
S24F/P/R-P129Q-S130A、S24F/P/R-P129Q-Q206
L/Y、S24F/P/R-P129Q-Y209W、S24F/P/R-P129Q-
T213A、S24F/P/R-P129Q-H249N/R、S24F/P/R-S1
30A-Q206L/Y、S24F/P/R-S130A-Y209W、S24F/P/
R-S130A-T213A、S24F/P/R-S130A-H249N/R、S24
F/P/R-Q206L/Y-Y209W、S24F/P/R-Q206L/Y-T21
3A、S24F/P/R-Q206L/Y-H249N/R、S24F/P/R-Y20
9W-T213A、S24F/P/R-Y209W-H249N/R、S78N-S87
D/R-P129Q、S78N-S87D/R-S130A、S78N-S87D/R-
Q206L/Y、S78N-S87D/R-Y209W、S78N-S87D/R-T2
13A、S78N-S87D/R-H249N/R、S78N-P129Q-S130A
、S78N-P129Q-Q206L/Y、S78N-P129Q-Y209W、S78
N-P129Q-T213A、S78N-P129Q-H249N/R、S78N-S1
30A-Q206L/Y、S78N-S130A-Y209W、S78N-S130A-
T213A、S78N-S130A-T213A、S78N-S130A-H249N/
R、S78N-Q206L/Y-T213A、S78N-Q206L/Y-H249N/
R、S78N-Y209W-T213A、S78N-Y209W-H249N/R、S7
8N-T213A-H249N/R、S87D/R-P129Q-S130A、S87D
/R-P129Q-Q206L/Y、S87D/R-P129Q-Y209W、S87D
/R-P129Q-T213A、S87D/R-P129Q-H249N/R、S87D
/R-S130A-Q206L/Y、S87D/R-S130A-Y209W、S87D
/R-S130A-T213A、S87D/R-S130A-H249N/R、S87D
/R-Q206L/Y-Y209W、S87D/R-Q206L/Y-T213A、87
D/R-Q206L/Y-H249N/R、S87D/R-Y209W-T213A、S
87D/R-Y209W-H249N/R、S87D/R-T213A-H249N/R
、P129Q-S130A-Q206L/Y、P129Q-S130A-Y209W、P
129Q-S130A-T213A、P129Q-S130A-H249N/R、P12
9Q-Q206L/Y-Y209W、P129Q-Q206L/Y-T213A、P12
9Q-Q206L/Y-H249N/R、P129Q-Y209W-T213A、P12
9Q-Y209W-H249N/R、P129Q-T213A-H249N/R、S13
0A-Q206L/Y-Y209W、S130A-Q206L/Y-T213A、S13
0A-Q206L/Y-H249N/R、S130A-Y209W-T213A、S13
0A-Y209W-H249N/R、S130A-T213A-H249N/R、S13
0A-Y209W-H249N/R、Q206L/Y-Y209W-T213A、Q20
6L/Y-Y209W-H249N/R、Q206L/Y-T213A-H249N/R
、Y209W-T213A-H249N/Rおよびこれらの組み合わせから選択される、
2つ以上の位置でのアミノ酸置換の組み合わせを含む、単離されたスブチリシン変異体を
提供する;ここで、前記変異体はタンパク質分解活性を有しており、前記変異体のアミノ
酸配列は、(i)76、101、103、104、118、127、128、166およ
び222、(ii)X76D、X101F/G/V、X103A/D/P、X104I、
X118R、X127T、X128L、X166D/NおよびX222Q/Sまたは(i
ii)N76D、S101F/G/V、S103A/D/P、V104I、G118R、
G127T、S128L、S166D/NおよびM222Q/Sから選択される1つ以上
の置換をさらに含み、さらに、前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示される
バチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefac
iens)スブチリシンBPN’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けさ
れており、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより
決定されたものである。他の実施形態は、(i)3-8、3-40、3-78、3-87
、3-118、3-128、3-129、3-130、3-210、3-211、3-2
15、3-217、3-261、3-262、8-40、8-76、8-87、8-11
8、8-128、8-210、8-215、8-261、18-78、18-87、18
-118、18-206、24-87、24-206、24-209、24-213、2
4-222、40-76、40-87、40-118、40-128、40-210、4
0-215、40-217、40-261、76-210、76-211、76-213
、76-215、76-217、76-249、76-261、76-262、78-8
7、78-118、78-210、78-213、78-222、78-249、87-
206、87-209、87-213、87-215、87-217、87-222、8
7-249、87-261、118-206、118-209、118-210、118
-211、118-213、118-215、118-217、118-222、118
-249、118-261、118-262、128-209、128-210、128
-215、128-217、128-261、129-206、129-209、130
-206、130-209、206-213、206-249、209-213、209
-249、210-217、210-261、213-222、213-249、215
-261、222-249およびこれらの組み合わせ;(ii)3-76-118、18
-24-206、18-24-209、18-24-213、18-24-249、18
-87-209、18-118-209、18-206-209、18-209-213
、18-209-222、18-209-249、18-213-249、24-76-
78、24-76-87、24-76-118、24-76-209、24-76-22
2、24-76-249、24-78-87、24-78-118、24-78-206
、24-78-209、24-78-222、24-78-249、24-87-118
、24-87-209、24-87-222、24-87-249、24-118-20
9、24-118-222、24-118-249、24-206-209、24-20
6-249、24-209-213、24-209-222、24-209-249、2
4-213-249、24-222-249、76-78-118、76-78-87、
76-78-129、76-78-130、76-78-206、76-78-209、
76-78-222、76-78-249、76-87-118、76-87-206、
76-87-209、76-87-249、76-118-128、76-118-20
6、76-118-209、76-118-222、76-118-249、76-20
9-222、76-209-249、78-87-118、78-87-129、78-
87-130、78-87-206、78-87-209、78-87-222、78-
87-249、78-118-129、78-118-209、78-118-222、
78-118-249、78-129-130、78-209-222、78-209-
249、78-222-249、87-118-206、87-118-209、87-
118-249、87-206-209、87-209-222、87-209-249
、87-222-249、118-209-213、118-209-222、118-
209-249、118-222-249、206-209-249、209-213-
222、209-213-249、209-222-249およびこれらの組み合わせ;
(iii)X3V-X8V、X3V-X40E、X3V-X78G/N、X3V-X87
D、X3V-X118R、X3V-X128R、X3V-X129Q、X3V-X130
A、X3V-X210I、X3V-X211P、X3V-X215K、X3V-X217
K、X3V-X261I、X3V-X262Q、X8V-X40E、X8V-X76D、
X8V-X87D、X8V-X118R、X8V-X128R、X8V-X210I、X
8V-X215K、X8V-X261I、X18R-X78N、X18R-X87R、X
18R-X118R、X18R-X206L、X24R-S78N、X24R-X87D
/R、X24R-X206L/Y、X24R-X209W、X24R-X213A、X2
4R-X222Q、X40E-X76D、X40E-X87D/R、X40E-X118
R、X40E-X128R、X40E-X210I、X40E-X215K、X40E-
X217K、X40E-X261I、X76D-X87D、X76D-X128R、X7
6D-X206F/R/M/Y、X76D-X210I、X76D-X211P、X76
D-X213A、X76D-X215K、X76D-X217K、X76D-X249R
、X76D-X261I、X76D-X262Q、X78G-X206F/L/M/Y、
X78G-X210I、X78G-X261I、X78G/N-X87D/R、X78G
/N-X118R、X78G/N-X128L、X78G/N-X129Q、X78G/
N-X130A、X78N-X213A、X78N-X222Q、X78N-X249R
、X87D-X118R、X87D-X128L/R、X87D-X129Q、X87D
-X130A、X87D/R-X209W、X87D-X210I、X87D-X215
K、X87D-X217K、X87D/R-X222Q、X87D/R-X249R、X
87R-X206F/L/M/R/Y、X87R-X213A、X87D/R-X261
I、X118R-X128R、X118R-X206F/M/L/R/Y、X118R-
X209W、X118R-X210II、X118R-X211P、X118R-X21
3A、X118R-X215K、X118R-X217K、X118R-X222Q、X
118R-X249R、X118R-X261I、X118R-X262Q、X128L
-X206F/L/M/R/Y、X128L-X209W、X128R-P210I、X
128R-A215K、X128R-L217K、X128R-N261I、X129Q
-X206F/L/M/R/Y、X129Q-X209W、X130A-X206F/L
/M/R/Y、S130A-Y209W、X206L/Y-X213A、X206L/Y
-X222Q、X206L/Y-X249R、X209W-X213A、X209W-X
222Q、X209W-X249R、X210I-X217K、X210I-X261I
、X213A-X222Q、X213A-X249R、X215K-X261I、X22
2Q-X249Rおよびこれらの組み合わせ;(iv)X3V-X76D-X118R、
X18R-X24R-X206L/Y、X18R-X24R-X209W、X18R-X
24R-X213A、X18R-X24R-X249R、X18R-X87D/R-X2
09W、X18R-X118R-X209W、X18R-X206L/Y-X209W、
X18R-X206L/Y-X249R、X18R-X209W-X213A、X18R
-X209W-X222Q、X18R-X209W-X249R、X18R-X213A
-X249R、X24R-X76D-X78G/N、X24R-X76D-X87D/R
、X24R-X76D-X118R、X24R-X76D-X209W、X24R-X7
6D-X222Q、X24R-X76D-X249R、X24R-X78G/N-X87
D/R、X24R-X78G/N-X118R、X24R-X78G/N-X206L/
Y、X24R-X78G/N-X209W、X24R-X78G/N-X222Q、X2
4R-X78G/N-X249R、X24R-X87D/R-X118R、X24R-X
87D/R-X209W、X24R-X87D/R-X222Q、X24R-X87D/
R-X249R、X24R-X118R-X209W、X24R-X118R-X222
Q、X24R-X118R-X249R、X24R-X206L-X209W、X24R
-X206L/Y-X249R、X24R-X209W-X213A、X24R-X20
9W-X222Q、X24R-X209W-X249R、X24R-X213A-X24
9R、X24R-X222Q-X249R、X76D-X78G/N-X87D/R、X
76D-X78G/N-X118R、X76D-X78G/N-X129Q、X76D-
X78G/N-X130A、X76D-X78G/N-X206L、X76D-X78G
/N-X209W、X76D-X78G/N-X222Q、X76D-X78G/N-X
249R、X76D-X87D/R-X118R、X76D-X87D/R-X206L
/Y、X76D-X87D/R-X209W、X76D-X87D/R-X249R、X
76D-X118R-X128R、X76D-X118R-X206L/Y、X76D-
X118R-X209W、X76D-X118R-X222Q、X76D-X118R-
X249R、X76D-X209W-X222Q、X76D-X209W-X249R、
X78G/N-X87D/R-X118R、X78G/N-X87D/R-X129Q、
X78G/N-X87D/R-X130A、X78G/N-X87D/R-X206L/
Y、X78G/N-X87D/R-X209W、X78G/N-X87D/R-X222
Q、X78G/N-X87D/R-X249R、X78G/N-X118R-X129Q
、X78G/N-X118R-X209W、X78G/N-X118R-X222Q、X
78G/N-X118R-X249R、X78G/N-X129Q-X130A、X78
G/N-X209W-X222Q、X78G/N-X209W-X249R、X78G/
N-X222Q-X249R、X87D/R-X118R-X206L、X87D/R-
X118R-X209W、X87D/R-X118R-X249R、X87D/R-X2
06L/Y-X209W、X87D/R-X209W-X222Q、X87D/R-X2
09W-X249R、X87D/R-X222Q-X249R、X118R-X209W
-X213A、X118R-X209W-X222Q、X118R-X209W-X24
9R、X118R-X222Q-X249R、X206L-X209W-X249R、X
209W-X213A-X222Q、X209W-X213A-X249R、X209W
-X222Q-X249Rおよびこれらの組み合わせ;(v)S3V-I8V、S3V-
P40E、S3V-S78G/N、S3V-S87D、S3V-G118R、S3V-S
128R、S3V-P129Q、S3V-S130A、S3V-P210I、S3V-G
211P、S3V-A215K、S3V-L217K、S3V-N261I、S3V-L
262Q、I8V-P40E、I8V-N76D、I8V-S87D、I8V-G118
R、I8V-S128R、I8V-P210I、I8V-A215K、I8V-N261
I、N18R-S78N、N18R-S87R、N18R-G118R、N18R-Q2
06L、S24R-S78N、S24R-S87D/R、S24R-Q206L/Y、S
24R-Y209W、S24R-T213A、S24R-M222Q、P40E-N76
D、P40E-S87D/R、P40E-G118R、P40E-S128R、P40E
-P210I、P40E-A215K、P40E-L217K、P40E-N261I、
N76D-S87D、N76D-P210I、N76D-S128R、N76D-Q20
6F/R/M/Y、N76D-P210I、N76D-G211P、N76D-T213
A、N76D-A215K、N76D-L217K、N76D-H249R、N76D-
N261I、N76D-L262Q、S78G-Q206F/L/M/Y、S78G-P
210I、S78G-N261I、S78G/N-S87D/R、S78G/N-G11
8R、S78G/N-S128L、S78G/N-P129Q、S78G/N-S130
A、S78N-T213A、S78N-M222Q、S78N-H249R、S87D-
G118R、S87D-S128L/R、S87D-P129Q、S87D-S130A
、S87D/R-Y209W、S87D-P210I、S87D-A215K、S87D
-L217K、S87D/R-M222Q、S87D/R-H249R、S87R-Q2
06F/L/M/R/Y、S87R-T213A、S87D/R-N261I、G118
R-S128R、G118R-Q206L/R/Y、G118R-Y209W、G118
R-P210I、G118R-G211P、G118R-T213A、G118R-L2
17K、G118R-M222Q、G118R-H249R、G118R-N261I、
G118R-L262Q、S128L-Q206F/L/M/R/Y、S128L-Y2
09W、S128R-P210I、S128R-A215K、S128R-L217K、
S128R-N261I、P129Q-Q206F/L/M/R/Y、P129Q-Y2
09W、S130A-Q206F/L/M/R/Y、S130A-Y209W、Q206
L/Y-T213A、Q206L/Y-M222Q、Q206L/Y-H249R、Y2
09W-T213A、Y209W-M222Q、Y209W-H249R、P210I-
L217K、P210I-N261I、T213A-M222Q、T213A-H249
R、A215K-N261I、M222Q-H249Rおよびこれらの組み合わせ;また
は(vi)S3V-N76D-G118R、N18R-S24R-Q206L/Y、N1
8R-S24R-Y209W、N18R-S24R-T213A、N18R-S24R-
H249R、N18R-S87D/R-Y209W、N18R-G118R-Y209W
、N18R-Q206L/Y-Y209W、N18R-Q206L/Y-H249R、N
18R-Y209W-T213A、N18R-Y209W-M222Q、N18R-Y2
09W-H249R、N18R-T213A-H249R、S24R-N76D-S78
G/N、S24R-N76D-S87D/R、S24R-N76D-G118R、S24
R-N76D-Y209W、S24R-N76D-M222Q、S24R-N76D-H
249R、S24R-S78G/N-S87D/R、S24R-S78G/N-G118
R、S24R-S78G/N-Q206L、Y209WS24R-S78G/N-Y20
9W、S24R-S78G/N-M222Q、S24R-S78G/N-H249R、S
24R-S87D/R-G118R、S24R-S87D/R-Y209W、S24R-
S87D/R-M222Q、S24R-S87D/R-H249R、S24R-G118
R-Y209W、S24R-G118R-M222Q、S24R-G118R-H249
R、S24R-Q206L/Y-Y209W、S24R-Q206L/Y-H249R、
S24R-Y209W-T213A、S24R-Y209W-M222Q、S24R-Y
209W-H249R、S24R-T213A-H249R、S24R-M222Q-H
249R、N76D-S78G/N-S87D/R、N76D-S78G/N-G118
R、N76D-S78G/N-P129Q、N76D-S78G/N-S130A、N7
6D-S78G/N-Q206L、N76D-S78G/N-Y209W、N76D-S
78G/N-M222Q、N76D-S78G/N-H249R、N76D-S87D/
R-G118R、N76D-S87D/R-Q206L/Y、N76D-S87D/R-
Y209W、N76D-S87D/R-H249R、N76D-G118R-S128R
、N76D-G118R-Q206L/Y、N76D-G118R-Y209W、N76
D-G118R-M222Q、N76D-G118R-H249R、N76D-Y209
W-M222Q、N76D-Y209W-H249R、S78G/N-S87D/R-G
118R、S78G/N-S87D/R-P129Q、S78G/N-S87D/R-S
130A、S78G/N-S87D/R-Q206L/Y、S78G/N-S87D/R
-Y209W、S78G/N-S87D/R-M222Q、S78G/N-S87D/R
-H249R、S78G/N-G118R-P129Q、S78G/N-G118R-Y
209W、S78G/N-G118R-M222Q、S78G/N-G118R-H24
9R、S78G/N-P129Q-S130A、S78G/N-Y209W-M222Q
、S78G/N-Y209W-H249R、S78G/N-M222Q-H249R、S
87D/R-G118R-Q206L、S87D/R-G118R-Y209W、S87
D/R-G118R-H249R、S87D/R-Q206L/Y-Y209W、S87
D/R-Y209W-H249R、S87D/R-Y209W-M222Q、S87D/
R-M222Q-H249R、G118R-Y209W-T213A、G118R-Y2
09W-M222Q、G118R-Y209W-H249R、G118R-M222Q-
H249R、Q206L/Y-Y209W-H249R、Y209W-T213A-M2
22Q、Y209W-T213A-H249R、Y209W-M222Q-H249Rお
よびこれらの組み合わせから選択される、2つ以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を
含む、単離されたスブチリシン変異体を提供する;ここで、前記変異体の各アミノ酸の位
置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus
amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’配列の、対応するアミノ酸
位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミノ酸配
列とのアラインメントにより決定されたものである。さらに他の実施形態は、(i)3-
8、3-40、3-78、3-87、3-118、3-128、3-129、3-130
、3-210、3-211、3-215、3-217、3-261、3-262、8-4
0、8-76、8-87、8-118、8-128、8-210、8-215、8-26
1、18-78、18-87、18-118、18-206、24-87、24-206
、24-209、24-213、24-222、40-76、40-87、40-118
、40-128、40-210、40-215、40-217、40-261、76-2
10、76-211、76-213、76-215、76-217、76-249、76
-261、76-262、78-87、78-118、78-210、78-213、7
8-222、78-249、87-206、87-209、87-213、87-215
、87-217、87-222、87-249、87-261、118-206、118
-209、118-210、118-211、118-213、118-215、118
-217、118-222、118-249、118-261、118-262、128
-209、128-210、128-215、128-217、128-261、129
-206、129-209、130-206、130-209、206-213、206
-249、209-213、209-249、210-217、210-261、213
-222、213-249、215-261、222-249およびこれらの組み合わせ
;(ii)3-76-118、18-24-206、18-24-209、18-24-
213、18-24-249、18-87-209、18-118-209、18-20
6-209、18-209-213、18-209-222、18-209-249、1
8-213-249、24-76-78、24-76-87、24-76-118、24
-76-209、24-76-222、24-76-249、24-78-87、24-
78-118、24-78-206、24-78-209、24-78-222、24-
78-249、24-87-118、24-87-209、24-87-222、24-
87-249、24-118-209、24-118-222、24-118-249、
24-206-209、24-206-249、24-209-213、24-209-
222、24-209-249、24-213-249、24-222-249、76-
78-118、76-78-87、76-78-129、76-78-130、76-7
8-206、76-78-209、76-78-222、76-78-249、76-8
7-118、76-87-206、76-87-209、76-87-249、76-1
18-128、76-118-206、76-118-209、76-118-222、
76-118-249、76-209-222、76-209-249、78-87-1
18、78-87-129、78-87-130、78-87-206、78-87-2
09、78-87-222、78-87-249、78-118-129、78-118
-209、78-118-222、78-118-249、78-129-130、78
-209-222、78-209-249、78-222-249、87-118-20
6、87-118-209、87-118-249、87-206-209、87-20
9-222、87-209-249、87-222-249、118-209-213、
118-209-222、118-209-249、118-222-249、206-
209-249、209-213-222、209-213-249、209-222-
249およびこれらの組み合わせ;(iii)X3V-X8V、X3V-X40E、X3
V-X78G/N、X3V-X87D、X3V-X118R、X3V-X128R、X3
V-X129Q、X3V-X130A、X3V-X210I、X3V-X211P、X3
V-X215K、X3V-X217K、X3V-X261I、X3V-X262Q、X8
V-X40E、X8V-X76D、X8V-X87D、X8V-X118R、X8V-X
128R、X8V-X210I、X8V-X215K、X8V-X261I、X18R-
X78N、X18R-X87R、X18R-X118R、X18R-X206L、X24
R-S78N、X24R-X87D/R、X24R-X206L/Y、X24R-X20
9W、X24R-X213A、X24R-X222Q、X40E-X76D、X40E-
X87D/R、X40E-X118R、X40E-X128R、X40E-X210I、
X40E-X215K、X40E-X217K、X40E-X261I、X76D-X8
7D、X76D-X128R、X76D-X206F/R/M/Y、X76D-X210
I、X76D-X211P、X76D-X213A、X76D-X215K、X76D-
X217K、X76D-X249R、X76D-X261I、X76D-X262Q、X
78G-X206F/L/M/Y、X78G-X210I、X78G-X261I、X7
8G/N-X87D/R、X78G/N-X118R、X78G/N-X128L、X7
8G/N-X129Q、X78G/N-X130A、X78N-X213A、X78N-
X222Q、X78N-X249R、X87D-X118R、X87D-X128L/R
、X87D-X129Q、X87D-X130A、X87D/R-X209W、X87D
-X210I、X87D-X215K、X87D-X217K、X87D/R-X222
Q、X87D/R-X249R、X87R-X206F/L/M/R/Y、X87R-X
213A、X87D/R-X261I、X118R-X128R、X118R-X206
F/M/L/R/Y、X118R-X209W、X118R-X210II、X118R
-X211P、X118R-X213A、X118R-X215K、X118R-X21
7K、X118R-X222Q、X118R-X249R、X118R-X261I、X
118R-X262Q、X128L-X206F/L/M/R/Y、X128L-X20
9W、X128R-P210I、X128R-A215K、X128R-L217K、X
128R-N261I、X129Q-X206F/L/M/R/Y、X129Q-X20
9W、X130A-X206F/L/M/R/Y、S130A-Y209W、X206L
/Y-X213A、X206L/Y-X222Q、X206L/Y-X249R、X20
9W-X213A、X209W-X222Q、X209W-X249R、X210I-X
217K、X210I-X261I、X213A-X222Q、X213A-X249R
、X215K-X261I、X222Q-X249Rおよびこれらの組み合わせ;(iv
)X3V-X76D-X118R、X18R-X24R-X206L/Y、X18R-X
24R-X209W、X18R-X24R-X213A、X18R-X24R-X249
R、X18R-X87D/R-X209W、X18R-X118R-X209W、X18
R-X206L/Y-X209W、X18R-X206L/Y-X249R、X18R-
X209W-X213A、X18R-X209W-X222Q、X18R-X209W-
X249R、X18R-X213A-X249R、X24R-X76D-X78G/N、
X24R-X76D-X87D/R、X24R-X76D-X118R、X24R-X7
6D-X209W、X24R-X76D-X222Q、X24R-X76D-X249R
、X24R-X78G/N-X87D/R、X24R-X78G/N-X118R、X2
4R-X78G/N-X206L/Y、X24R-X78G/N-X209W、X24R
-X78G/N-X222Q、X24R-X78G/N-X249R、X24R-X87
D/R-X118R、X24R-X87D/R-X209W、X24R-X87D/R-
X222Q、X24R-X87D/R-X249R、X24R-X118R-X209W
、X24R-X118R-X222Q、X24R-X118R-X249R、X24R-
X206L-X209W、X24R-X206L/Y-X249R、X24R-X209
W-X213A、X24R-X209W-X222Q、X24R-X209W-X249
R、X24R-X213A-X249R、X24R-X222Q-X249R、X76D
-X78G/N-X87D/R、X76D-X78G/N-X118R、X76D-X7
8G/N-X129Q、X76D-X78G/N-X130A、X76D-X78G/N
-X206L、X76D-X78G/N-X209W、X76D-X78G/N-X22
2Q、X76D-X78G/N-X249R、X76D-X87D/R-X118R、X
76D-X87D/R-X206L/Y、X76D-X87D/R-X209W、X76
D-X87D/R-X249R、X76D-X118R-X128R、X76D-X11
8R-X206L/Y、X76D-X118R-X209W、X76D-X118R-X
222Q、X76D-X118R-X249R、X76D-X209W-X222Q、X
76D-X209W-X249R、X78G/N-X87D/R-X118R、X78G
/N-X87D/R-X129Q、X78G/N-X87D/R-X130A、X78G
/N-X87D/R-X206L/Y、X78G/N-X87D/R-X209W、X7
8G/N-X87D/R-X222Q、X78G/N-X87D/R-X249R、X7
8G/N-X118R-X129Q、X78G/N-X118R-X209W、X78G
/N-X118R-X222Q、X78G/N-X118R-X249R、X78G/N
-X129Q-X130A、X78G/N-X209W-X222Q、X78G/N-X
209W-X249R、X78G/N-X222Q-X249R、X87D/R-X11
8R-X206L、X87D/R-X118R-X209W、X87D/R-X118R
-X249R、X87D/R-X206L/Y-X209W、X87D/R-X209W
-X222Q、X87D/R-X209W-X249R、X87D/R-X222Q-X
249R、X118R-X209W-X213A、X118R-X209W-X222Q
、X118R-X209W-X249R、X118R-X222Q-X249R、X20
6L-X209W-X249R、X209W-X213A-X222Q、X209W-X
213A-X249R、X209W-X222Q-X249Rおよびこれらの組み合わせ
;(v)S3V-I8V、S3V-P40E、S3V-S78G/N、S3V-S87D
、S3V-G118R、S3V-S128R、S3V-P129Q、S3V-S130A
、S3V-P210I、S3V-G211P、S3V-A215K、S3V-L217K
、S3V-N261I、S3V-L262Q、I8V-P40E、I8V-N76D、I
8V-S87D、I8V-G118R、I8V-S128R、I8V-P210I、I8
V-A215K、I8V-N261I、N18R-S78N、N18R-S87R、N1
8R-G118R、N18R-Q206L、S24R-S78N、S24R-S87D/
R、S24R-Q206L/Y、S24R-Y209W、S24R-T213A、S24
R-M222Q、P40E-N76D、P40E-S87D/R、P40E-G118R
、P40E-S128R、P40E-P210I、P40E-A215K、P40E-L
217K、P40E-N261I、N76D-S87D、N76D-P210I、N76
D-S128R、N76D-Q206F/R/M/Y、N76D-P210I、N76D
-G211P、N76D-T213A、N76D-A215K、N76D-L217K、
N76D-H249R、N76D-N261I、N76D-L262Q、S78G-Q2
06F/L/M/Y、S78G-P210I、S78G-N261I、S78G/N-S
87D/R、S78G/N-G118R、S78G/N-S128L、S78G/N-P
129Q、S78G/N-S130A、S78N-T213A、S78N-M222Q、
S78N-H249R、S87D-G118R、S87D-S128L/R、S87D-
P129Q、S87D-S130A、S87D/R-Y209W、S87D-P210I
、S87D-A215K、S87D-L217K、S87D/R-M222Q、S87D
/R-H249R、S87R-Q206F/L/M/R/Y、S87R-T213A、S
87D/R-N261I、G118R-S128R、G118R-Q206L/R/Y、
G118R-Y209W、G118R-P210I、G118R-G211P、G118
R-T213A、G118R-L217K、G118R-M222Q、G118R-H2
49R、G118R-N261I、G118R-L262Q、S128L-Q206F/
L/M/R/Y、S128L-Y209W、S128R-P210I、S128R-A2
15K、S128R-L217K、S128R-N261I、P129Q-Q206F/
L/M/R/Y、P129Q-Y209W、S130A-Q206F/L/M/R/Y、
S130A-Y209W、Q206L/Y-T213A、Q206L/Y-M222Q、
Q206L/Y-H249R、Y209W-T213A、Y209W-M222Q、Y2
09W-H249R、P210I-L217K、P210I-N261I、T213A-
M222Q、T213A-H249R、A215K-N261I、M222Q-H249
Rおよびこれらの組み合わせ;または(vi)S3V-N76D-G118R、N18R
-S24R-Q206L/Y、N18R-S24R-Y209W、N18R-S24R-
T213A、N18R-S24R-H249R、N18R-S87D/R-Y209W、
N18R-G118R-Y209W、N18R-Q206L/Y-Y209W、N18R
-Q206L/Y-H249R、N18R-Y209W-T213A、N18R-Y20
9W-M222Q、N18R-Y209W-H249R、N18R-T213A-H24
9R、S24R-N76D-S78G/N、S24R-N76D-S87D/R、S24
R-N76D-G118R、S24R-N76D-Y209W、S24R-N76D-M
222Q、S24R-N76D-H249R、S24R-S78G/N-S87D/R、
S24R-S78G/N-G118R、S24R-S78G/N-Q206L、Y209
WS24R-S78G/N-Y209W、S24R-S78G/N-M222Q、S24
R-S78G/N-H249R、S24R-S87D/R-G118R、S24R-S8
7D/R-Y209W、S24R-S87D/R-M222Q、S24R-S87D/R
-H249R、S24R-G118R-Y209W、S24R-G118R-M222Q
、S24R-G118R-H249R、S24R-Q206L/Y-Y209W、S24
R-Q206L/Y-H249R、S24R-Y209W-T213A、S24R-Y2
09W-M222Q、S24R-Y209W-H249R、S24R-T213A-H2
49R、S24R-M222Q-H249R、N76D-S78G/N-S87D/R、
N76D-S78G/N-G118R、N76D-S78G/N-P129Q、N76D
-S78G/N-S130A、N76D-S78G/N-Q206L、N76D-S78
G/N-Y209W、N76D-S78G/N-M222Q、N76D-S78G/N-
H249R、N76D-S87D/R-G118R、N76D-S87D/R-Q206
L/Y、N76D-S87D/R-Y209W、N76D-S87D/R-H249R、
N76D-G118R-S128R、N76D-G118R-Q206L/Y、N76D
-G118R-Y209W、N76D-G118R-M222Q、N76D-G118R
-H249R、N76D-Y209W-M222Q、N76D-Y209W-H249R
、S78G/N-S87D/R-G118R、S78G/N-S87D/R-P129Q
、S78G/N-S87D/R-S130A、S78G/N-S87D/R-Q206L
/Y、S78G/N-S87D/R-Y209W、S78G/N-S87D/R-M22
2Q、S78G/N-S87D/R-H249R、S78G/N-G118R-P129
Q、S78G/N-G118R-Y209W、S78G/N-G118R-M222Q、
S78G/N-G118R-H249R、S78G/N-P129Q-S130A、S7
8G/N-Y209W-M222Q、S78G/N-Y209W-H249R、S78G
/N-M222Q-H249R、S87D/R-G118R-Q206L、S87D/R
-G118R-Y209W、S87D/R-G118R-H249R、S87D/R-Q
206L/Y-Y209W、S87D/R-Y209W-H249R、S87D/R-Y
209W-M222Q、S87D/R-M222Q-H249R、G118R-Y209
W-T213A、G118R-Y209W-M222Q、G118R-Y209W-H2
49R、G118R-M222Q-H249R、Q206L/Y-Y209W-H249
R、Y209W-T213A-M222Q、Y209W-T213A-H249R、Y2
09W-M222Q-H249Rおよびこれらの組み合わせから選択される、2つ以上の
置換を含むアミノ酸配列を含む、単離されたスブチリシン変異体を提供する;ここで、前
記変異体はタンパク質分解活性を有しており、前記変異体のアミノ酸配列は、(i)1、
3、8、9、16、20、22、28、42、43、44、56、76、77、82、8
8、89、99、100、101、103、104、108、116、118、120、
124、127、128、147、150、158、159、160、166、185、
188、194、204、210、211、212、215、216、217、218、
222、232、235、241、243、245、246、248、251、252、
254、256、259、261、262、268、270および271;(ii)X1
V、X3I/T/V、X8V、X9G、X16T、X20E/R、X22L/W、X28
T、X42I、X43R/S/Y、X44V、X56P、X76D、X77D、X82D
、X88S、X89H、X99N、X100S、X101F/G/H/Q/T/V、X1
03A/D/P、X104I、X108S、X116L/M、X118A/R/V、X1
20R、X124M、X127S/T、X128K/L/R、X147I、X150T、
X158E/T/V、X159D、X160Q、X166D/N、X185Y、X188
D、X194D/P、X204D、X210I/L、X211P、X212D、X215
K/V、X216Y、X217K、X218S、X222L/Q/S、X232V、X2
35T、X241K、X243S、X245R、X246V、X248D、X251R、
X252I、X254T、X256P、X259G、X261I/N、X262Q、X2
68A、X270P/TおよびX271D;または(iii)A1V、S3I/T/V、
I8V、S9G、A16T、G20E/R、T22L/W、V28T、L42I、N43
R/S/Y、I44V、S56P、N76D、N77D、L82D、A88S、E89H
、S99N、G100S、S101F/G/H/Q/T/V、S103A/D/P、V1
04I、A108S、N116L/M、G118A/R/V、H120R、L124M、
G127S/T、S128K/LR、V147I、V150T、A158E/T/V、G
159D、S160Q、S166D/N、N185Y、S188D、A194D/P、N
204D、P210I/L、G211P、S212D、A215K/V、S216Y、L
217K、N218S、M222L/Q/S、A232V、K235T、W241K、N
243S、Q245R、I246V、N248D、K251R、N252I、A254T
、S256P、S259G、N261I/N、L262Q、V268A、A270P/T
およびE271Dから選択される1つ以上の置換をさらに含み;前記変異体の各アミノ酸
の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillu
s amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’配列の、対応するアミ
ノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミノ
酸配列とのアラインメントにより決定されたものである。またさらに他の実施形態は(i
)3-8、3-40、3-78、3-87、3-118、3-128、3-129、3-
130、3-210、3-211、3-215、3-217、3-261、3-262、
8-40、8-76、8-87、8-118、8-128、8-210、8-215、8
-261、18-78、18-87、18-118、18-206、24-87、24-
206、24-209、24-213、24-222、40-76、40-87、40-
118、40-128、40-210、40-215、40-217、40-261、7
6-210、76-211、76-213、76-215、76-217、76-249
、76-261、76-262、78-87、78-118、78-210、78-21
3、78-222、78-249、87-206、87-209、87-213、87-
215、87-217、87-222、87-249、87-261、118-206、
118-209、118-210、118-211、118-213、118-215、
118-217、118-222、118-249、118-261、118-262、
128-209、128-210、128-215、128-217、128-261、
129-206、129-209、130-206、130-209、206-213、
206-249、209-213、209-249、210-217、210-261、
213-222、213-249、215-261、222-249およびこれらの組み
合わせ;(ii)3-76-118、18-24-206、18-24-209、18-
24-213、18-24-249、18-87-209、18-118-209、18
-206-209、18-209-213、18-209-222、18-209-24
9、18-213-249、24-76-78、24-76-87、24-76-118
、24-76-209、24-76-222、24-76-249、24-78-87、
24-78-118、24-78-206、24-78-209、24-78-222、
24-78-249、24-87-118、24-87-209、24-87-222、
24-87-249、24-118-209、24-118-222、24-118-2
49、24-206-209、24-206-249、24-209-213、24-2
09-222、24-209-249、24-213-249、24-222-249、
76-78-118、76-78-87、76-78-129、76-78-130、7
6-78-206、76-78-209、76-78-222、76-78-249、7
6-87-118、76-87-206、76-87-209、76-87-249、7
6-118-128、76-118-206、76-118-209、76-118-2
22、76-118-249、76-209-222、76-209-249、78-8
7-118、78-87-129、78-87-130、78-87-206、78-8
7-209、78-87-222、78-87-249、78-118-129、78-
118-209、78-118-222、78-118-249、78-129-130
、78-209-222、78-209-249、78-222-249、87-118
-206、87-118-209、87-118-249、87-206-209、87
-209-222、87-209-249、87-222-249、118-209-2
13、118-209-222、118-209-249、118-222-249、2
06-209-249、209-213-222、209-213-249、209-2
22-249およびこれらの組み合わせ;(iii)X3V-X8V、X3V-X40E
、X3V-X78G/N、X3V-X87D、X3V-X118R、X3V-X128R
、X3V-X129Q、X3V-X130A、X3V-X210I、X3V-X211P
、X3V-X215K、X3V-X217K、X3V-X261I、X3V-X262Q
、X8V-X40E、X8V-X76D、X8V-X87D、X8V-X118R、X8
V-X128R、X8V-X210I、X8V-X215K、X8V-X261I、X1
8R-X78N、X18R-X87R、X18R-X118R、X18R-X206L、
X24R-S78N、X24R-X87D/R、X24R-X206L/Y、X24R-
X209W、X24R-X213A、X24R-X222Q、X40E-X76D、X4
0E-X87D/R、X40E-X118R、X40E-X128R、X40E-X21
0I、X40E-X215K、X40E-X217K、X40E-X261I、X76D
-X87D、X76D-X128R、X76D-X206F/R/M/Y、X76D-X
210I、X76D-X211P、X76D-X213A、X76D-X215K、X7
6D-X217K、X76D-X249R、X76D-X261I、X76D-X262
Q、X78G-X206F/L/M/Y、X78G-X210I、X78G-X261I
、X78G/N-X87D/R、X78G/N-X118R、X78G/N-X128L
、X78G/N-X129Q、X78G/N-X130A、X78N-X213A、X7
8N-X222Q、X78N-X249R、X87D-X118R、X87D-X128
L/R、X87D-X129Q、X87D-X130A、X87D/R-X209W、X
87D-X210I、X87D-X215K、X87D-X217K、X87D/R-X
222Q、X87D/R-X249R、X87R-X206F/L/M/R/Y、X87
R-X213A、X87D/R-X261I、X118R-X128R、X118R-X
206F/M/L/R/Y、X118R-X209W、X118R-X210II、X1
18R-X211P、X118R-X213A、X118R-X215K、X118R-
X217K、X118R-X222Q、X118R-X249R、X118R-X261
I、X118R-X262Q、X128L-X206F/L/M/R/Y、X128L-
X209W、X128R-P210I、X128R-A215K、X128R-L217
K、X128R-N261I、X129Q-X206F/L/M/R/Y、X129Q-
X209W、X130A-X206F/L/M/R/Y、S130A-Y209W、X2
06L/Y-X213A、X206L/Y-X222Q、X206L/Y-X249R、
X209W-X213A、X209W-X222Q、X209W-X249R、X210
I-X217K、X210I-X261I、X213A-X222Q、X213A-X2
49R、X215K-X261I、X222Q-X249Rおよびこれらの組み合わせ;
(iv)X3V-X76D-X118R、X18R-X24R-X206L/Y、X18
R-X24R-X209W、X18R-X24R-X213A、X18R-X24R-X
249R、X18R-X87D/R-X209W、X18R-X118R-X209W、
X18R-X206L/Y-X209W、X18R-X206L/Y-X249R、X1
8R-X209W-X213A、X18R-X209W-X222Q、X18R-X20
9W-X249R、X18R-X213A-X249R、X24R-X76D-X78G
/N、X24R-X76D-X87D/R、X24R-X76D-X118R、X24R
-X76D-X209W、X24R-X76D-X222Q、X24R-X76D-X2
49R、X24R-X78G/N-X87D/R、X24R-X78G/N-X118R
、X24R-X78G/N-X206L/Y、X24R-X78G/N-X209W、X
24R-X78G/N-X222Q、X24R-X78G/N-X249R、X24R-
X87D/R-X118R、X24R-X87D/R-X209W、X24R-X87D
/R-X222Q、X24R-X87D/R-X249R、X24R-X118R-X2
09W、X24R-X118R-X222Q、X24R-X118R-X249R、X2
4R-X206L-X209W、X24R-X206L/Y-X249R、X24R-X
209W-X213A、X24R-X209W-X222Q、X24R-X209W-X
249R、X24R-X213A-X249R、X24R-X222Q-X249R、X
76D-X78G/N-X87D/R、X76D-X78G/N-X118R、X76D
-X78G/N-X129Q、X76D-X78G/N-X130A、X76D-X78
G/N-X206L、X76D-X78G/N-X209W、X76D-X78G/N-
X222Q、X76D-X78G/N-X249R、X76D-X87D/R-X118
R、X76D-X87D/R-X206L/Y、X76D-X87D/R-X209W、
X76D-X87D/R-X249R、X76D-X118R-X128R、X76D-
X118R-X206L/Y、X76D-X118R-X209W、X76D-X118
R-X222Q、X76D-X118R-X249R、X76D-X209W-X222
Q、X76D-X209W-X249R、X78G/N-X87D/R-X118R、X
78G/N-X87D/R-X129Q、X78G/N-X87D/R-X130A、X
78G/N-X87D/R-X206L/Y、X78G/N-X87D/R-X209W
、X78G/N-X87D/R-X222Q、X78G/N-X87D/R-X249R
、X78G/N-X118R-X129Q、X78G/N-X118R-X209W、X
78G/N-X118R-X222Q、X78G/N-X118R-X249R、X78
G/N-X129Q-X130A、X78G/N-X209W-X222Q、X78G/
N-X209W-X249R、X78G/N-X222Q-X249R、X87D/R-
X118R-X206L、X87D/R-X118R-X209W、X87D/R-X1
18R-X249R、X87D/R-X206L/Y-X209W、X87D/R-X2
09W-X222Q、X87D/R-X209W-X249R、X87D/R-X222
Q-X249R、X118R-X209W-X213A、X118R-X209W-X2
22Q、X118R-X209W-X249R、X118R-X222Q-X249R、
X206L-X209W-X249R、X209W-X213A-X222Q、X209
W-X213A-X249R、X209W-X222Q-X249Rおよびこれらの組み
合わせ;(v)S3V-I8V、S3V-P40E、S3V-S78G/N、S3V-S
87D、S3V-G118R、S3V-S128R、S3V-P129Q、S3V-S1
30A、S3V-P210I、S3V-G211P、S3V-A215K、S3V-L2
17K、S3V-N261I、S3V-L262Q、I8V-P40E、I8V-N76
D、I8V-S87D、I8V-G118R、I8V-S128R、I8V-P210I
、I8V-A215K、I8V-N261I、N18R-S78N、N18R-S87R
、N18R-G118R、N18R-Q206L、S24R-S78N、S24R-S8
7D/R、S24R-Q206L/Y、S24R-Y209W、S24R-T213A、
S24R-M222Q、P40E-N76D、P40E-S87D/R、P40E-G1
18R、P40E-S128R、P40E-P210I、P40E-A215K、P40
E-L217K、P40E-N261I、N76D-S87D、N76D-P210I、
N76D-S128R、N76D-Q206F/R/M/Y、N76D-P210I、N
76D-G211P、N76D-T213A、N76D-A215K、N76D-L21
7K、N76D-H249R、N76D-N261I、N76D-L262Q、S78G
-Q206F/L/M/Y、S78G-P210I、S78G-N261I、S78G/
N-S87D/R、S78G/N-G118R、S78G/N-S128L、S78G/
N-P129Q、S78G/N-S130A、S78N-T213A、S78N-M22
2Q、S78N-H249R、S87D-G118R、S87D-S128L/R、S8
7D-P129Q、S87D-S130A、S87D/R-Y209W、S87D-P2
10I、S87D-A215K、S87D-L217K、S87D/R-M222Q、S
87D/R-H249R、S87R-Q206F/L/M/R/Y、S87R-T213
A、S87D/R-N261I、G118R-S128R、G118R-Q206L/R
/Y、G118R-Y209W、G118R-P210I、G118R-G211P、G
118R-T213A、G118R-L217K、G118R-M222Q、G118R
-H249R、G118R-N261I、G118R-L262Q、S128L-Q20
6F/L/M/R/Y、S128L-Y209W、S128R-P210I、S128R
-A215K、S128R-L217K、S128R-N261I、P129Q-Q20
6F/L/M/R/Y、P129Q-Y209W、S130A-Q206F/L/M/R
/Y、S130A-Y209W、Q206L/Y-T213A、Q206L/Y-M22
2Q、Q206L/Y-H249R、Y209W-T213A、Y209W-M222Q
、Y209W-H249R、P210I-L217K、P210I-N261I、T21
3A-M222Q、T213A-H249R、A215K-N261I、M222Q-H
249Rおよびこれらの組み合わせ;または(vi)S3V-N76D-G118R、N
18R-S24R-Q206L/Y、N18R-S24R-Y209W、N18R-S2
4R-T213A、N18R-S24R-H249R、N18R-S87D/R-Y20
9W、N18R-G118R-Y209W、N18R-Q206L/Y-Y209W、N
18R-Q206L/Y-H249R、N18R-Y209W-T213A、N18R-
Y209W-M222Q、N18R-Y209W-H249R、N18R-T213A-
H249R、S24R-N76D-S78G/N、S24R-N76D-S87D/R、
S24R-N76D-G118R、S24R-N76D-Y209W、S24R-N76
D-M222Q、S24R-N76D-H249R、S24R-S78G/N-S87D
/R、S24R-S78G/N-G118R、S24R-S78G/N-Q206L、Y
209WS24R-S78G/N-Y209W、S24R-S78G/N-M222Q、
S24R-S78G/N-H249R、S24R-S87D/R-G118R、S24R
-S87D/R-Y209W、S24R-S87D/R-M222Q、S24R-S87
D/R-H249R、S24R-G118R-Y209W、S24R-G118R-M2
22Q、S24R-G118R-H249R、S24R-Q206L/Y-Y209W、
S24R-Q206L/Y-H249R、S24R-Y209W-T213A、S24R
-Y209W-M222Q、S24R-Y209W-H249R、S24R-T213A
-H249R、S24R-M222Q-H249R、N76D-S78G/N-S87D
/R、N76D-S78G/N-G118R、N76D-S78G/N-P129Q、N
76D-S78G/N-S130A、N76D-S78G/N-Q206L、N76D-
S78G/N-Y209W、N76D-S78G/N-M222Q、N76D-S78G
/N-H249R、N76D-S87D/R-G118R、N76D-S87D/R-Q
206L/Y、N76D-S87D/R-Y209W、N76D-S87D/R-H24
9R、N76D-G118R-S128R、N76D-G118R-Q206L/Y、N
76D-G118R-Y209W、N76D-G118R-M222Q、N76D-G1
18R-H249R、N76D-Y209W-M222Q、N76D-Y209W-H2
49R、S78G/N-S87D/R-G118R、S78G/N-S87D/R-P1
29Q、S78G/N-S87D/R-S130A、S78G/N-S87D/R-Q2
06L/Y、S78G/N-S87D/R-Y209W、S78G/N-S87D/R-
M222Q、S78G/N-S87D/R-H249R、S78G/N-G118R-P
129Q、S78G/N-G118R-Y209W、S78G/N-G118R-M22
2Q、S78G/N-G118R-H249R、S78G/N-P129Q-S130A
、S78G/N-Y209W-M222Q、S78G/N-Y209W-H249R、S
78G/N-M222Q-H249R、S87D/R-G118R-Q206L、S87
D/R-G118R-Y209W、S87D/R-G118R-H249R、S87D/
R-Q206L/Y-Y209W、S87D/R-Y209W-H249R、S87D/
R-Y209W-M222Q、S87D/R-M222Q-H249R、G118R-Y
209W-T213A、G118R-Y209W-M222Q、G118R-Y209W
-H249R、G118R-M222Q-H249R、Q206L/Y-Y209W-H
249R、Y209W-T213A-M222Q、Y209W-T213A-H249R
、Y209W-M222Q-H249Rおよびこれらの組み合わせから選択される、2つ
以上の置換を含むアミノ酸配列を含む、単離されたスブチリシン変異体を提供する;ここ
で、前記変異体はタンパク質分解活性を有しており、前記変異体のアミノ酸配列は、(i
)3、8、22、28、43、76、89、99、101、103、104、108、1
16、118、124、127、128、147、150、158、159、166、1
88、194、210、211、212、215、217、222、232、235、2
43、245、246、261、262、270および271;(ii)X3T/V、X
8V、X22W、X28T、X43S、X76D、X89H、X99N、X101F/G
/V、X103A/D/P、X104I、X108S、X116M、X118R、X12
4M、X127T、X128L、X147I、X150T、X158E/T、X159D
、X166D、X188D、X194D/P、X210I/L、X211P、X212D
、X215V、X217K、X222Q/S、X232V、X235T、X243S、X
245R、X246V、X261I、X262Q、X270TおよびX271D;または
(iii)S3T/V、I8V、T22W、V28T、N43S、N76D、E89H、
S99N、S101F/G/V、S103A/D/P、V104I、A108S、N11
6M、G118R、L124M、G127T、S128L、V147I、V150T、A
158E/T、G159D、S166D、S188D、A194D/P、P210I/L
、G211P、S212D、A215V、L217K、M222Q/S、A232V、K
235T、N243S、Q245R、I246V、N261I、L262Q、A270T
およびE271D;から選択される1つ以上の置換をさらに含み;前記変異体の各アミノ
酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacill
us amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’配列の、対応するア
ミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミ
ノ酸配列とのアラインメントにより決定されたものである。さらなる実施形態は、(i)
3-8、3-40、3-78、3-87、3-118、3-128、3-129、3-1
30、3-210、3-211、3-215、3-217、3-261、3-262、8
-40、8-76、8-87、8-118、8-128、8-210、8-215、8-
261、18-78、18-87、18-118、18-206、24-87、24-2
06、24-209、24-213、24-222、40-76、40-87、40-1
18、40-128、40-210、40-215、40-217、40-261、76
-210、76-211、76-213、76-215、76-217、76-249、
76-261、76-262、78-87、78-118、78-210、78-213
、78-222、78-249、87-206、87-209、87-213、87-2
15、87-217、87-222、87-249、87-261、118-206、1
18-209、118-210、118-211、118-213、118-215、1
18-217、118-222、118-249、118-261、118-262、1
28-209、128-210、128-215、128-217、128-261、1
29-206、129-209、130-206、130-209、206-213、2
06-249、209-213、209-249、210-217、210-261、2
13-222、213-249、215-261、222-249およびこれらの組み合
わせ;(ii)3-76-118、18-24-206、18-24-209、18-2
4-213、18-24-249、18-87-209、18-118-209、18-
206-209、18-209-213、18-209-222、18-209-249
、18-213-249、24-76-78、24-76-87、24-76-118、
24-76-209、24-76-222、24-76-249、24-78-87、2
4-78-118、24-78-206、24-78-209、24-78-222、2
4-78-249、24-87-118、24-87-209、24-87-222、2
4-87-249、24-118-209、24-118-222、24-118-24
9、24-206-209、24-206-249、24-209-213、24-20
9-222、24-209-249、24-213-249、24-222-249、7
6-78-118、76-78-87、76-78-129、76-78-130、76
-78-206、76-78-209、76-78-222、76-78-249、76
-87-118、76-87-206、76-87-209、76-87-249、76
-118-128、76-118-206、76-118-209、76-118-22
2、76-118-249、76-209-222、76-209-249、78-87
-118、78-87-129、78-87-130、78-87-206、78-87
-209、78-87-222、78-87-249、78-118-129、78-1
18-209、78-118-222、78-118-249、78-129-130、
78-209-222、78-209-249、78-222-249、87-118-
206、87-118-209、87-118-249、87-206-209、87-
209-222、87-209-249、87-222-249、118-209-21
3、118-209-222、118-209-249、118-222-249、20
6-209-249、209-213-222、209-213-249、209-22
2-249およびこれらの組み合わせ;(iii)X3V-X8V、X3V-X40E、
X3V-X78G/N、X3V-X87D、X3V-X118R、X3V-X128R、
X3V-X129Q、X3V-X130A、X3V-X210I、X3V-X211P、
X3V-X215K、X3V-X217K、X3V-X261I、X3V-X262Q、
X8V-X40E、X8V-X76D、X8V-X87D、X8V-X118R、X8V
-X128R、X8V-X210I、X8V-X215K、X8V-X261I、X18
R-X78N、X18R-X87R、X18R-X118R、X18R-X206L、X
24R-S78N、X24R-X87D/R、X24R-X206L/Y、X24R-X
209W、X24R-X213A、X24R-X222Q、X40E-X76D、X40
E-X87D/R、X40E-X118R、X40E-X128R、X40E-X210
I、X40E-X215K、X40E-X217K、X40E-X261I、X76D-
X87D、X76D-X128R、X76D-X206F/R/M/Y、X76D-X2
10I、X76D-X211P、X76D-X213A、X76D-X215K、X76
D-X217K、X76D-X249R、X76D-X261I、X76D-X262Q
、X78G-X206F/L/M/Y、X78G-X210I、X78G-X261I、
X78G/N-X87D/R、X78G/N-X118R、X78G/N-X128L、
X78G/N-X129Q、X78G/N-X130A、X78N-X213A、X78
N-X222Q、X78N-X249R、X87D-X118R、X87D-X128L
/R、X87D-X129Q、X87D-X130A、X87D/R-X209W、X8
7D-X210I、X87D-X215K、X87D-X217K、X87D/R-X2
22Q、X87D/R-X249R、X87R-X206F/L/M/R/Y、X87R
-X213A、X87D/R-X261I、X118R-X128R、X118R-X2
06F/M/L/R/Y、X118R-X209W、X118R-X210II、X11
8R-X211P、X118R-X213A、X118R-X215K、X118R-X
217K、X118R-X222Q、X118R-X249R、X118R-X261I
、X118R-X262Q、X128L-X206F/L/M/R/Y、X128L-X
209W、X128R-P210I、X128R-A215K、X128R-L217K
、X128R-N261I、X129Q-X206F/L/M/R/Y、X129Q-X
209W、X130A-X206F/L/M/R/Y、S130A-Y209W、X20
6L/Y-X213A、X206L/Y-X222Q、X206L/Y-X249R、X
209W-X213A、X209W-X222Q、X209W-X249R、X210I
-X217K、X210I-X261I、X213A-X222Q、X213A-X24
9R、X215K-X261I、X222Q-X249Rおよびこれらの組み合わせ;(
iv)X3V-X76D-X118R、X18R-X24R-X206L/Y、X18R
-X24R-X209W、X18R-X24R-X213A、X18R-X24R-X2
49R、X18R-X87D/R-X209W、X18R-X118R-X209W、X
18R-X206L/Y-X209W、X18R-X206L/Y-X249R、X18
R-X209W-X213A、X18R-X209W-X222Q、X18R-X209
W-X249R、X18R-X213A-X249R、X24R-X76D-X78G/
N、X24R-X76D-X87D/R、X24R-X76D-X118R、X24R-
X76D-X209W、X24R-X76D-X222Q、X24R-X76D-X24
9R、X24R-X78G/N-X87D/R、X24R-X78G/N-X118R、
X24R-X78G/N-X206L/Y、X24R-X78G/N-X209W、X2
4R-X78G/N-X222Q、X24R-X78G/N-X249R、X24R-X
87D/R-X118R、X24R-X87D/R-X209W、X24R-X87D/
R-X222Q、X24R-X87D/R-X249R、X24R-X118R-X20
9W、X24R-X118R-X222Q、X24R-X118R-X249R、X24
R-X206L-X209W、X24R-X206L/Y-X249R、X24R-X2
09W-X213A、X24R-X209W-X222Q、X24R-X209W-X2
49R、X24R-X213A-X249R、X24R-X222Q-X249R、X7
6D-X78G/N-X87D/R、X76D-X78G/N-X118R、X76D-
X78G/N-X129Q、X76D-X78G/N-X130A、X76D-X78G
/N-X206L、X76D-X78G/N-X209W、X76D-X78G/N-X
222Q、X76D-X78G/N-X249R、X76D-X87D/R-X118R
、X76D-X87D/R-X206L/Y、X76D-X87D/R-X209W、X
76D-X87D/R-X249R、X76D-X118R-X128R、X76D-X
118R-X206L/Y、X76D-X118R-X209W、X76D-X118R
-X222Q、X76D-X118R-X249R、X76D-X209W-X222Q
、X76D-X209W-X249R、X78G/N-X87D/R-X118R、X7
8G/N-X87D/R-X129Q、X78G/N-X87D/R-X130A、X7
8G/N-X87D/R-X206L/Y、X78G/N-X87D/R-X209W、
X78G/N-X87D/R-X222Q、X78G/N-X87D/R-X249R、
X78G/N-X118R-X129Q、X78G/N-X118R-X209W、X7
8G/N-X118R-X222Q、X78G/N-X118R-X249R、X78G
/N-X129Q-X130A、X78G/N-X209W-X222Q、X78G/N
-X209W-X249R、X78G/N-X222Q-X249R、X87D/R-X
118R-X206L、X87D/R-X118R-X209W、X87D/R-X11
8R-X249R、X87D/R-X206L/Y-X209W、X87D/R-X20
9W-X222Q、X87D/R-X209W-X249R、X87D/R-X222Q
-X249R、X118R-X209W-X213A、X118R-X209W-X22
2Q、X118R-X209W-X249R、X118R-X222Q-X249R、X
206L-X209W-X249R、X209W-X213A-X222Q、X209W
-X213A-X249R、X209W-X222Q-X249Rおよびこれらの組み合
わせ;(v)S3V-I8V、S3V-P40E、S3V-S78G/N、S3V-S8
7D、S3V-G118R、S3V-S128R、S3V-P129Q、S3V-S13
0A、S3V-P210I、S3V-G211P、S3V-A215K、S3V-L21
7K、S3V-N261I、S3V-L262Q、I8V-P40E、I8V-N76D
、I8V-S87D、I8V-G118R、I8V-S128R、I8V-P210I、
I8V-A215K、I8V-N261I、N18R-S78N、N18R-S87R、
N18R-G118R、N18R-Q206L、S24R-S78N、S24R-S87
D/R、S24R-Q206L/Y、S24R-Y209W、S24R-T213A、S
24R-M222Q、P40E-N76D、P40E-S87D/R、P40E-G11
8R、P40E-S128R、P40E-P210I、P40E-A215K、P40E
-L217K、P40E-N261I、N76D-S87D、N76D-P210I、N
76D-S128R、N76D-Q206F/R/M/Y、N76D-P210I、N7
6D-G211P、N76D-T213A、N76D-A215K、N76D-L217
K、N76D-H249R、N76D-N261I、N76D-L262Q、S78G-
Q206F/L/M/Y、S78G-P210I、S78G-N261I、S78G/N
-S87D/R、S78G/N-G118R、S78G/N-S128L、S78G/N
-P129Q、S78G/N-S130A、S78N-T213A、S78N-M222
Q、S78N-H249R、S87D-G118R、S87D-S128L/R、S87
D-P129Q、S87D-S130A、S87D/R-Y209W、S87D-P21
0I、S87D-A215K、S87D-L217K、S87D/R-M222Q、S8
7D/R-H249R、S87R-Q206F/L/M/R/Y、S87R-T213A
、S87D/R-N261I、G118R-S128R、G118R-Q206L/R/
Y、G118R-Y209W、G118R-P210I、G118R-G211P、G1
18R-T213A、G118R-L217K、G118R-M222Q、G118R-
H249R、G118R-N261I、G118R-L262Q、S128L-Q206
F/L/M/R/Y、S128L-Y209W、S128R-P210I、S128R-
A215K、S128R-L217K、S128R-N261I、P129Q-Q206
F/L/M/R/Y、P129Q-Y209W、S130A-Q206F/L/M/R/
Y、S130A-Y209W、Q206L/Y-T213A、Q206L/Y-M222
Q、Q206L/Y-H249R、Y209W-T213A、Y209W-M222Q、
Y209W-H249R、P210I-L217K、P210I-N261I、T213
A-M222Q、T213A-H249R、A215K-N261I、M222Q-H2
49Rおよびこれらの組み合わせ;または(vi)S3V-N76D-G118R、N1
8R-S24R-Q206L/Y、N18R-S24R-Y209W、N18R-S24
R-T213A、N18R-S24R-H249R、N18R-S87D/R-Y209
W、N18R-G118R-Y209W、N18R-Q206L/Y-Y209W、N1
8R-Q206L/Y-H249R、N18R-Y209W-T213A、N18R-Y
209W-M222Q、N18R-Y209W-H249R、N18R-T213A-H
249R、S24R-N76D-S78G/N、S24R-N76D-S87D/R、S
24R-N76D-G118R、S24R-N76D-Y209W、S24R-N76D
-M222Q、S24R-N76D-H249R、S24R-S78G/N-S87D/
R、S24R-S78G/N-G118R、S24R-S78G/N-Q206L、Y2
09WS24R-S78G/N-Y209W、S24R-S78G/N-M222Q、S
24R-S78G/N-H249R、S24R-S87D/R-G118R、S24R-
S87D/R-Y209W、S24R-S87D/R-M222Q、S24R-S87D
/R-H249R、S24R-G118R-Y209W、S24R-G118R-M22
2Q、S24R-G118R-H249R、S24R-Q206L/Y-Y209W、S
24R-Q206L/Y-H249R、S24R-Y209W-T213A、S24R-
Y209W-M222Q、S24R-Y209W-H249R、S24R-T213A-
H249R、S24R-M222Q-H249R、N76D-S78G/N-S87D/
R、N76D-S78G/N-G118R、N76D-S78G/N-P129Q、N7
6D-S78G/N-S130A、N76D-S78G/N-Q206L、N76D-S
78G/N-Y209W、N76D-S78G/N-M222Q、N76D-S78G/
N-H249R、N76D-S87D/R-G118R、N76D-S87D/R-Q2
06L/Y、N76D-S87D/R-Y209W、N76D-S87D/R-H249
R、N76D-G118R-S128R、N76D-G118R-Q206L/Y、N7
6D-G118R-Y209W、N76D-G118R-M222Q、N76D-G11
8R-H249R、N76D-Y209W-M222Q、N76D-Y209W-H24
9R、S78G/N-S87D/R-G118R、S78G/N-S87D/R-P12
9Q、S78G/N-S87D/R-S130A、S78G/N-S87D/R-Q20
6L/Y、S78G/N-S87D/R-Y209W、S78G/N-S87D/R-M
222Q、S78G/N-S87D/R-H249R、S78G/N-G118R-P1
29Q、S78G/N-G118R-Y209W、S78G/N-G118R-M222
Q、S78G/N-G118R-H249R、S78G/N-P129Q-S130A、
S78G/N-Y209W-M222Q、S78G/N-Y209W-H249R、S7
8G/N-M222Q-H249R、S87D/R-G118R-Q206L、S87D
/R-G118R-Y209W、S87D/R-G118R-H249R、S87D/R
-Q206L/Y-Y209W、S87D/R-Y209W-H249R、S87D/R
-Y209W-M222Q、S87D/R-M222Q-H249R、G118R-Y2
09W-T213A、G118R-Y209W-M222Q、G118R-Y209W-
H249R、G118R-M222Q-H249R、Q206L/Y-Y209W-H2
49R、Y209W-T213A-M222Q、Y209W-T213A-H249R、
Y209W-M222Q-H249Rおよびこれらの組み合わせから選択される、2つ以
上の置換を含むアミノ酸配列を含む、単離されたスブチリシン変異体を提供する;ここで
、前記変異体はタンパク質分解活性を有しており、前記変異体のアミノ酸配列は、(i)
1、3、8、9、16、20、22、28、42、43、44、56、76、77、82
、88、100、101、103、104、108、116、118、120、124、
127、128、147、150、158、159、160、166、185、194、
204、210、211、212、215、216、217、218、222、232、
241、245、248、251、252、254、256、259、261、262、
268、270、271;(ii)X1V、X3I/V、X8V、X9G、X16T、X
20E/R、X22L/W、X28T、X42I、X43R/Y、X44V、X56P、
X76D、X77D、X82D、X88S、X100S、X101G/H/Q/T/V、
X103A、X104I、X108S、X116L/M、X118A/R/V、X120
R、X124M、X127S/T、X128K/L/R、X147I、X150T、X1
58E/V、X160Q、X166D/N、X185Y、X194D/P、X204D、
X210I、X211P、X212D、X215K/V、X216Y、X217K、X2
18S、X222Q/S、X232V、X241K、X245R、X248D、X251
R、X252I、X254T、X256P、X259G、X261I、X262Q、X2
68A、X270PおよびX271D;または(iii)A1V、S3I/V、I8V、
S9G、A16T、G20E/R、T22L/W、V28T、L42I、N43R/Y、
I44V、S56P、N76D、N77D、L82D、A88S、G100S、S101
G/H/Q/T/V、S103A、V104I、A108S、N116L/M、G118
A/R/V、H120R、L124M、G127S/T、S128K/LR、V147I
、V150T、A158E/V、S160Q、S166D/N、N185Y、A194D
/P、N204D、P210I、G211P、S212D、A215K/V、S216Y
、L217K、N218S、M222Q/S、A232V、W241K、Q245R、N
248D、K251R、N252I、A254T、S256P、S259G、N261I
、L262Q、V268A、A270PおよびE271Dから選択される1つ以上の置換
をさらに含み;前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミ
ロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブ
チリシンBPN’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これ
は変異体アミノ酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたもの
である。さらに他の実施形態は、(i)3-8、3-40、3-78、3-87、3-1
18、3-128、3-129、3-130、3-210、3-211、3-215、3
-217、3-261、3-262、8-40、8-76、8-87、8-118、8-
128、8-210、8-215、8-261、18-78、18-87、18-118
、18-206、24-87、24-206、24-209、24-213、24-22
2、40-76、40-87、40-118、40-128、40-210、40-21
5、40-217、40-261、76-210、76-211、76-213、76-
215、76-217、76-249、76-261、76-262、78-87、78
-118、78-210、78-213、78-222、78-249、87-206、
87-209、87-213、87-215、87-217、87-222、87-24
9、87-261、118-206、118-209、118-210、118-211
、118-213、118-215、118-217、118-222、118-249
、118-261、118-262、128-209、128-210、128-215
、128-217、128-261、129-206、129-209、130-206
、130-209、206-213、206-249、209-213、209-249
、210-217、210-261、213-222、213-249、215-261
、222-249およびこれらの組み合わせ;(ii)3-76-118、18-24-
206、18-24-209、18-24-213、18-24-249、18-87-
209、18-118-209、18-206-209、18-209-213、18-
209-222、18-209-249、18-213-249、24-76-78、2
4-76-87、24-76-118、24-76-209、24-76-222、24
-76-249、24-78-87、24-78-118、24-78-206、24-
78-209、24-78-222、24-78-249、24-87-118、24-
87-209、24-87-222、24-87-249、24-118-209、24
-118-222、24-118-249、24-206-209、24-206-24
9、24-209-213、24-209-222、24-209-249、24-21
3-249、24-222-249、76-78-118、76-78-87、76-7
8-129、76-78-130、76-78-206、76-78-209、76-7
8-222、76-78-249、76-87-118、76-87-206、76-8
7-209、76-87-249、76-118-128、76-118-206、76
-118-209、76-118-222、76-118-249、76-209-22
2、76-209-249、78-87-118、78-87-129、78-87-1
30、78-87-206、78-87-209、78-87-222、78-87-2
49、78-118-129、78-118-209、78-118-222、78-1
18-249、78-129-130、78-209-222、78-209-249、
78-222-249、87-118-206、87-118-209、87-118-
249、87-206-209、87-209-222、87-209-249、87-
222-249、118-209-213、118-209-222、118-209-
249、118-222-249、206-209-249、209-213-222、
209-213-249、209-222-249およびこれらの組み合わせ;(iii
)X3V-X8V、X3V-X40E、X3V-X78G/N、X3V-X87D、X3
V-X118R、X3V-X128R、X3V-X129Q、X3V-X130A、X3
V-X210I、X3V-X211P、X3V-X215K、X3V-X217K、X3
V-X261I、X3V-X262Q、X8V-X40E、X8V-X76D、X8V-
X87D、X8V-X118R、X8V-X128R、X8V-X210I、X8V-X
215K、X8V-X261I、X18R-X78N、X18R-X87R、X18R-
X118R、X18R-X206L、X24R-S78N、X24R-X87D/R、X
24R-X206L/Y、X24R-X209W、X24R-X213A、X24R-X
222Q、X40E-X76D、X40E-X87D/R、X40E-X118R、X4
0E-X128R、X40E-X210I、X40E-X215K、X40E-X217
K、X40E-X261I、X76D-X87D、X76D-X128R、X76D-X
206F/R/M/Y、X76D-X210I、X76D-X211P、X76D-X2
13A、X76D-X215K、X76D-X217K、X76D-X249R、X76
D-X261I、X76D-X262Q、X78G-X206F/L/M/Y、X78G
-X210I、X78G-X261I、X78G/N-X87D/R、X78G/N-X
118R、X78G/N-X128L、X78G/N-X129Q、X78G/N-X1
30A、X78N-X213A、X78N-X222Q、X78N-X249R、X87
D-X118R、X87D-X128L/R、X87D-X129Q、X87D-X13
0A、X87D/R-X209W、X87D-X210I、X87D-X215K、X8
7D-X217K、X87D/R-X222Q、X87D/R-X249R、X87R-
X206F/L/M/R/Y、X87R-X213A、X87D/R-X261I、X1
18R-X128R、X118R-X206F/M/L/R/Y、X118R-X209
W、X118R-X210II、X118R-X211P、X118R-X213A、X
118R-X215K、X118R-X217K、X118R-X222Q、X118R
-X249R、X118R-X261I、X118R-X262Q、X128L-X20
6F/L/M/R/Y、X128L-X209W、X128R-P210I、X128R
-A215K、X128R-L217K、X128R-N261I、X129Q-X20
6F/L/M/R/Y、X129Q-X209W、X130A-X206F/L/M/R
/Y、S130A-Y209W、X206L/Y-X213A、X206L/Y-X22
2Q、X206L/Y-X249R、X209W-X213A、X209W-X222Q
、X209W-X249R、X210I-X217K、X210I-X261I、X21
3A-X222Q、X213A-X249R、X215K-X261I、X222Q-X
249Rおよびこれらの組み合わせ;(iv)X3V-X76D-X118R、X18R
-X24R-X206L/Y、X18R-X24R-X209W、X18R-X24R-
X213A、X18R-X24R-X249R、X18R-X87D/R-X209W、
X18R-X118R-X209W、X18R-X206L/Y-X209W、X18R
-X206L/Y-X249R、X18R-X209W-X213A、X18R-X20
9W-X222Q、X18R-X209W-X249R、X18R-X213A-X24
9R、X24R-X76D-X78G/N、X24R-X76D-X87D/R、X24
R-X76D-X118R、X24R-X76D-X209W、X24R-X76D-X
222Q、X24R-X76D-X249R、X24R-X78G/N-X87D/R、
X24R-X78G/N-X118R、X24R-X78G/N-X206L/Y、X2
4R-X78G/N-X209W、X24R-X78G/N-X222Q、X24R-X
78G/N-X249R、X24R-X87D/R-X118R、X24R-X87D/
R-X209W、X24R-X87D/R-X222Q、X24R-X87D/R-X2
49R、X24R-X118R-X209W、X24R-X118R-X222Q、X2
4R-X118R-X249R、X24R-X206L-X209W、X24R-X20
6L/Y-X249R、X24R-X209W-X213A、X24R-X209W-X
222Q、X24R-X209W-X249R、X24R-X213A-X249R、X
24R-X222Q-X249R、X76D-X78G/N-X87D/R、X76D-
X78G/N-X118R、X76D-X78G/N-X129Q、X76D-X78G
/N-X130A、X76D-X78G/N-X206L、X76D-X78G/N-X
209W、X76D-X78G/N-X222Q、X76D-X78G/N-X249R
、X76D-X87D/R-X118R、X76D-X87D/R-X206L/Y、X
76D-X87D/R-X209W、X76D-X87D/R-X249R、X76D-
X118R-X128R、X76D-X118R-X206L/Y、X76D-X118
R-X209W、X76D-X118R-X222Q、X76D-X118R-X249
R、X76D-X209W-X222Q、X76D-X209W-X249R、X78G
/N-X87D/R-X118R、X78G/N-X87D/R-X129Q、X78G
/N-X87D/R-X130A、X78G/N-X87D/R-X206L/Y、X7
8G/N-X87D/R-X209W、X78G/N-X87D/R-X222Q、X7
8G/N-X87D/R-X249R、X78G/N-X118R-X129Q、X78
G/N-X118R-X209W、X78G/N-X118R-X222Q、X78G/
N-X118R-X249R、X78G/N-X129Q-X130A、X78G/N-
X209W-X222Q、X78G/N-X209W-X249R、X78G/N-X2
22Q-X249R、X87D/R-X118R-X206L、X87D/R-X118
R-X209W、X87D/R-X118R-X249R、X87D/R-X206L/
Y-X209W、X87D/R-X209W-X222Q、X87D/R-X209W-
X249R、X87D/R-X222Q-X249R、X118R-X209W-X21
3A、X118R-X209W-X222Q、X118R-X209W-X249R、X
118R-X222Q-X249R、X206L-X209W-X249R、X209W
-X213A-X222Q、X209W-X213A-X249R、X209W-X22
2Q-X249Rおよびこれらの組み合わせ;(v)S3V-I8V、S3V-P40E
、S3V-S78G/N、S3V-S87D、S3V-G118R、S3V-S128R
、S3V-P129Q、S3V-S130A、S3V-P210I、S3V-G211P
、S3V-A215K、S3V-L217K、S3V-N261I、S3V-L262Q
、I8V-P40E、I8V-N76D、I8V-S87D、I8V-G118R、I8
V-S128R、I8V-P210I、I8V-A215K、I8V-N261I、N1
8R-S78N、N18R-S87R、N18R-G118R、N18R-Q206L、
S24R-S78N、S24R-S87D/R、S24R-Q206L/Y、S24R-
Y209W、S24R-T213A、S24R-M222Q、P40E-N76D、P4
0E-S87D/R、P40E-G118R、P40E-S128R、P40E-P21
0I、P40E-A215K、P40E-L217K、P40E-N261I、N76D
-S87D、N76D-P210I、N76D-S128R、N76D-Q206F/R
/M/Y、N76D-P210I、N76D-G211P、N76D-T213A、N7
6D-A215K、N76D-L217K、N76D-H249R、N76D-N261
I、N76D-L262Q、S78G-Q206F/L/M/Y、S78G-P210I
、S78G-N261I、S78G/N-S87D/R、S78G/N-G118R、S
78G/N-S128L、S78G/N-P129Q、S78G/N-S130A、S7
8N-T213A、S78N-M222Q、S78N-H249R、S87D-G118
R、S87D-S128L/R、S87D-P129Q、S87D-S130A、S87
D/R-Y209W、S87D-P210I、S87D-A215K、S87D-L21
7K、S87D/R-M222Q、S87D/R-H249R、S87R-Q206F/
L/M/R/Y、S87R-T213A、S87D/R-N261I、G118R-S1
28R、G118R-Q206L/R/Y、G118R-Y209W、G118R-P2
10I、G118R-G211P、G118R-T213A、G118R-L217K、
G118R-M222Q、G118R-H249R、G118R-N261I、G118
R-L262Q、S128L-Q206F/L/M/R/Y、S128L-Y209W、
S128R-P210I、S128R-A215K、S128R-L217K、S128
R-N261I、P129Q-Q206F/L/M/R/Y、P129Q-Y209W、
S130A-Q206F/L/M/R/Y、S130A-Y209W、Q206L/Y-
T213A、Q206L/Y-M222Q、Q206L/Y-H249R、Y209W-
T213A、Y209W-M222Q、Y209W-H249R、P210I-L217
K、P210I-N261I、T213A-M222Q、T213A-H249R、A2
15K-N261I、M222Q-H249Rおよびこれらの組み合わせ;または(vi
)S3V-N76D-G118R、N18R-S24R-Q206L/Y、N18R-S
24R-Y209W、N18R-S24R-T213A、N18R-S24R-H249
R、N18R-S87D/R-Y209W、N18R-G118R-Y209W、N18
R-Q206L/Y-Y209W、N18R-Q206L/Y-H249R、N18R-
Y209W-T213A、N18R-Y209W-M222Q、N18R-Y209W-
H249R、N18R-T213A-H249R、S24R-N76D-S78G/N、
S24R-N76D-S87D/R、S24R-N76D-G118R、S24R-N7
6D-Y209W、S24R-N76D-M222Q、S24R-N76D-H249R
、S24R-S78G/N-S87D/R、S24R-S78G/N-G118R、S2
4R-S78G/N-Q206L、Y209WS24R-S78G/N-Y209W、S
24R-S78G/N-M222Q、S24R-S78G/N-H249R、S24R-
S87D/R-G118R、S24R-S87D/R-Y209W、S24R-S87D
/R-M222Q、S24R-S87D/R-H249R、S24R-G118R-Y2
09W、S24R-G118R-M222Q、S24R-G118R-H249R、S2
4R-Q206L/Y-Y209W、S24R-Q206L/Y-H249R、S24R
-Y209W-T213A、S24R-Y209W-M222Q、S24R-Y209W
-H249R、S24R-T213A-H249R、S24R-M222Q-H249R
、N76D-S78G/N-S87D/R、N76D-S78G/N-G118R、N7
6D-S78G/N-P129Q、N76D-S78G/N-S130A、N76D-S
78G/N-Q206L、N76D-S78G/N-Y209W、N76D-S78G/
N-M222Q、N76D-S78G/N-H249R、N76D-S87D/R-G1
18R、N76D-S87D/R-Q206L/Y、N76D-S87D/R-Y209
W、N76D-S87D/R-H249R、N76D-G118R-S128R、N76
D-G118R-Q206L/Y、N76D-G118R-Y209W、N76D-G1
18R-M222Q、N76D-G118R-H249R、N76D-Y209W-M2
22Q、N76D-Y209W-H249R、S78G/N-S87D/R-G118R
、S78G/N-S87D/R-P129Q、S78G/N-S87D/R-S130A
、S78G/N-S87D/R-Q206L/Y、S78G/N-S87D/R-Y20
9W、S78G/N-S87D/R-M222Q、S78G/N-S87D/R-H24
9R、S78G/N-G118R-P129Q、S78G/N-G118R-Y209W
、S78G/N-G118R-M222Q、S78G/N-G118R-H249R、S
78G/N-P129Q-S130A、S78G/N-Y209W-M222Q、S78
G/N-Y209W-H249R、S78G/N-M222Q-H249R、S87D/
R-G118R-Q206L、S87D/R-G118R-Y209W、S87D/R-
G118R-H249R、S87D/R-Q206L/Y-Y209W、S87D/R-
Y209W-H249R、S87D/R-Y209W-M222Q、S87D/R-M2
22Q-H249R、G118R-Y209W-T213A、G118R-Y209W-
M222Q、G118R-Y209W-H249R、G118R-M222Q-H249
R、Q206L/Y-Y209W-H249R、Y209W-T213A-M222Q、
Y209W-T213A-H249R、Y209W-M222Q-H249Rおよびこれ
らの組み合わせから選択される、2つ以上の置換を含むアミノ酸配列を含む、単離された
スブチリシン変異体を提供する;ここで、Xは任意のアミノ酸であり、前記変異体はタン
パク質分解活性を有しており、前記変異体のアミノ酸配列は、(i)3、76、101、
103、104、118、127、128、166、210、217、222および26
1;(ii)X3VX76D、X101F/G/V、X103A/D/P、X104I、
X118R、X127T、X128L/R、X166D/N、X210I、X217K、
X222Q/SおよびX261I;または(ii)S3V、N76D、S101F/G/
V、S103A/D/P、V104I、G118R、G127T、S128L/R、S1
66D/N、P210I、L217K、M222Q/SおよびN261Iから選択される
1つ以上の置換をさらに含む;前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示される
バチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefac
iens)スブチリシンBPN’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けさ
れており、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより
決定されたものである。
【0070】
さらに他の実施形態は、76、87、118、128、129および130;X76D
、X87D/R/T、X118A/R/V、X128K/L/R、X129Q/Rおよび
X130A/Q;またはN76D、S87D/R/T、G118A/R/V、S128K
/L/R、P129Q/RおよびS130A/Qから選択される、1、2、3、4、5ま
たは6つの位置での置換と、(i)1、3、8、9、16、18、20、22、24、2
8、40、42、43、44、56、77、78、82、88、89、99、100、1
01、103、104、108、116、120、124、127、147、150、1
58、159、160、166、185、188、194、204、206、209、2
10、211、212、213、215、216、217、218、222、232、2
35、241、243、245、246、248、249、251、252、254、2
56、259、261、262、268、270および271;(ii)X1V、X3I
/T/V、X8V、X9G、X16T、X18K/R、X20E/R、X22L/W、X
24F/L/P/R、X28T、X40E、X42I、X43R/S/Y、X44V、X
56P、X77D、X78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/
T/V/W/Y、X82D、X88S、X89H、X99N、X100S、X101F/
G/H/Q/T/V、X103A/D/P、X104I、X108S、X116L/M、
X120R、X124M、X127S/T、X147I、X150T、X158E/T/
V、X159D、X160Q、X166D/N、X185Y、X188D、X194D/
P、X204D、X206A/D/F/G/H/L/M/N/P/R/S/Y、X209
W、X210I、X211P、X212D、X213A、X215K/V、X216Y、
X217K、X218S、X222L/Q/S、X232V、X235T、X241K、
X243S、X245R、X246V、X248D、X249N/R、X251R、X2
52I、X254T、X256P、X259G、X261I、X262Q、X268A、
X270P/TおよびX271D;または(iii)A1V、S3I/T/V、I8V、
S9G、A16T、N18K/R、G20E/R、T22L/W、S24F/L/P/R
、V28T、P40E、L42I、N43R/S、I44V、S56P、N77D、S7
8A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/T/V/W/Y、L82
D、A88S、E89H、S99N、G100S、S101F/G/H/Q/T/V、S
103A/D/P、V104I、A108S、N116L/M、H120R、L124M
、G127S/T、V147I、V150T、A158E/T/V、G159D、S16
0Q、S166D/N、N185Y、S188D、A194D/P、N204D、Q20
6A/D/F/G/H/L/M/N/P/R/S/Y、Y209W、P210I、G21
1P、S212D、T213A、A215K/V、S216Y、L217K、N218S
、M222L/Q/S、A232V、K235T、W241K、N243S、Q245R
、I246V、N248D、H249N/R、K251R、N252I、A254T、S
256P、S259G、N261I、L262Q、V268A、A270P/TおよびE
271Dから選択される、1つ以上の位置での1つ以上の置換とを組み合わせて含むアミ
ノ酸配列を含む、単離されたスブチリシン変異体を提供する;ここで、Xは任意のアミノ
酸であり、前記変異体はタンパク質分解活性を有しており、さらに、前記変異体の各アミ
ノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacil
lus amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’配列の、対応する
アミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ酸配列とBPN’ア
ミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたものである。またさらに他の実施形態は
、76、87、118、128、129、および130;X76D、X87D/R、X1
18R/V、X128L、X129QおよびX130A;またはN76D、S87D/R
、G118R/V、S128L、P129QおよびS130Aから選択される、2、3、
4、5または6つの位置での置換と、(i)1、3、9、16、18、20、22、24
、28、42、43、44、56、77、78、99、100、101、103、104
、108、116、120、124、127、150、158、159、166、185
、188、194、204、206、209、212、213、217、218、222
、232、235、243、245、246、249、251、254、259、268
および270;(ii)X1V、X3T/V、X9G、X16T、X18K/R、X20
E/R、X22L、X24F/P/R、X28T、X42I、X43R/S、X44V、
X56P、X77D、X78N、X99N、X100S、X101F/G/H/T/V、
X103A/D/P、X104I、X108S、X116L/M、X120R、X124
M、X127T、X150T、X158E/T/V、X159D、X166D/N、X1
85Y、X188D、X194D、X204D、X206L/Y、X209W、X212
D、X213A、X217K、X218S、X222L/Q/S、X232V、X235
T、X243S、X245R、X246V、X249N/R、X251R、X254T、
X259G、X268AおよびX270P/T;または(iii)A1V、S3T/V、
S9G、A16T、N18K/R、G20E/R、T22L、S24F/P/R、V28
T、L42I、N43R/S、I44V、S56P、N77D、S78N、S99N、G
100S、S101F/G/H/T/V、S103A/D/P、V104I、A108S
、N116L/M、H120R、L124M、G127T、V150T、A158E/T
/V、G159D、S166D/N、N185Y、S188D、A194D、N204D
、Q206L/Y、Y209W、S212D、T213A、L217K、N218S、M
222L/Q/S、A232V、K235T、N243S、Q245R、I246V、H
249N/R、K251R、A254T、S259G、V268AおよびA270P/T
から選択される、1つ以上の位置での1つ以上の置換とを組み合わせて含むアミノ酸配列
を含む、単離されたスブチリシン変異体を提供する;ここで、Xは任意のアミノ酸であり
、前記変異体はタンパク質分解活性を有しており;さらに、前記変異体の各アミノ酸の位
置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus
amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’配列の、対応するアミノ酸
位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミノ酸配
列とのアラインメントにより決定されたものである。さらに他の実施形態は、76、87
、118、128、129および130;X76D、X87D/R/T、X118A/R
/V、X128K/L/R、X129Q/RおよびX130A/Q;またはN76D、S
87D/R/T、G118A/R/V、S128K/L/R、P129Q/RおよびS1
30A/Qから選択される、1、2、3、4、5または6つの位置での置換と、(i)3
、18、24、40、78、101、103、104、127、166、206、209
、210、211、213、217、222、249、261および262;(ii)X
3V、X18R、X24R、X40E、X78G/N、X101F/G/V、X103A
/D/P、X104I、X127T、X166D/N、X206L/R/Y、X209W
、X210I、X211P、X213A、X217K、X222Q/S、X249N/R
、X261IおよびX262Q;または(iii)S3V、N18R、S24R、P40
E、S78G/N、G127T、S166D/N、Q206L/R/Y、Y209W、P
210I、G211P、T213A、L217K、M222Q/S、H249N/R、N
261IおよびL262Q;から選択される、1つ以上の位置での1つ以上の置換とを組
み合わせて含むアミノ酸配列を含む、単離されたスブチリシン変異体を提供する;ここで
、Xは任意のアミノ酸であり、前記変異体はタンパク質分解活性を有しており;さらに、
前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシ
エンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシンBPN
’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ
酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたものである。またさ
らに他の実施形態は、76、87、118、128、129および130;X76D、X
87D/R、X118R/V、X128L、X129QおよびX130A;またはN76
D、S87D/R、G118R/V、S128L、P129QおよびS130Aから選択
される、2、3、4、5または6つの位置での置換と、(i)18、24、78、101
、103、104、127、166、206、209、213、222および249;(
ii)X18R、X24R、X78N、X101F/G/V、X103A/D/P、X1
04I、X127T、X166D/N、X206L/Y、X209W、X213A、X2
22Q/SおよびX249N/R;または(iii)N18R、S24R、S78N、S
166D/N、Q206L、Y209W、T213A、M222Q/SおよびH249N
/Rから選択される、1つ以上の位置での1つ以上の置換とを組み合わせて含むアミノ酸
配列を含む、単離されたスブチリシン変異体を提供する;ここで、Xは任意のアミノ酸で
あり、前記変異体はタンパク質分解活性を有しており;さらに、前記変異体の各アミノ酸
の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillu
s amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’配列の、対応するアミ
ノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミノ
酸配列とのアラインメントにより決定されたものである。またさらに他の実施形態は、7
6、87、118、128、129および130;X76D、X87R、X118R、X
128L、X129QおよびX130A;またはN76D、S87R、G118R、S1
28L、P129QおよびS130Aの各位置での置換と、(i)3、8、18、22、
24、28、40、43、78、89、99、101、103、104、108、116
、124、127、147、150、158、159、166、188、194、206
、209、210、211、212、213、215、217、222、232、235
、243、245、246、249、261、262、270および271;(ii)X
3T/V、X8V、X18R、X22W、X24R、X28T、X40E、X43S、X
78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/T/V/W/Y、X8
9H、X99N、X101F/G/V、X103A/D/P、X104I、X108S、
X116M、X124M、X127T、X147I、X150T、X158E/T、X1
59D、X166D、X188D、X194D/P、X206A/D/F/G/H/LM
/N/P/R/S/Y、X209W、X210I/L、X211P、X212D、X21
3A、X215V、X217K、X222Q/S、X232V、X235T、X243S
、X245R、X246V、X249N/R、X261I、X262Q、X270Tおよ
びX271D;または(iii)S3T/V、I8V、N18R、T22W、S24R、
V28T、P40E、N43S、S78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/N/
P/Q/R/T/V/W/Y、E89H、S99N、S101F/G/V、S103A/
D/P、V104I、A108S、N116M、L124M、G127T、V147I、
V150T、A158E/T、G159D、S166D、S188D、A194D/P、
Q206A/D/F/G/H/L/M/N/P/R/S/Y、Y209W、P210I/
L、G211P、S212D、T213A、A215V、L217K、M222Q/S、
A232V、K235T、N243S、Q245R、I246V、H249N/R、N2
61I、L262Q、A270TおよびE271Dから選択される、1つ以上の位置での
1つ以上の置換とを組み合わせて含むアミノ酸配列を含む、単離されたスブチリシン変異
体を提供する;ここで、Xは任意のアミノ酸であり、前記変異体はタンパク質分解活性を
有しており;さらに、前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス
・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens
)スブチリシンBPN’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており
、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定され
たものである。なおさらなる他の実施形態は、76、87、118、128、129およ
び130;X76D、X87R、X118R、X128L、X129QおよびX130A
;またはN76D、S87R、G118R、S128L、P129QおよびS130Aの
各位置での置換と、(i)3、18、24、28、43、78、99、100、101、
103、104、108、116、124、127、150、158、159、166、
188、194、206、209、212、213、217、222、232、235、
243、245、246、249および270;(ii)X3T/V、X18R、X24
R、X28T、X43S、X78N、X99N、X100S、X101F/G/V、X1
03A/D/P、X104I、X108S、X116M、X124M、X127T、X1
50T、X158E/T、X159D、X166D、X188D、X194D、X206
L、X209W、X212D、X213A、X217K、X222Q/S、X232V、
X235T、X243S、X245R、X246V、X249N/RおよびX270T;
または(iii)S3V/T、N18R、S24R、V28T、N43S、S78N、S
99N、G100S、S101F/G/V、S103A/D/P、V104I、A108
S、N116M、L124M、G127T、V150T、A158E/T、G159D、
S166D、S188D、A194D、Q206L、Y209W、S212D、T213
A、L217K、M222Q/S、A232V、K235T、N243S、Q245R、
I246V、H249N/RおよびA270Tから選択される、1つ以上の位置での1つ
以上の置換とを組み合わせて含むアミノ酸配列を含む、単離されたスブチリシン変異体を
提供する;ここで、Xは任意のアミノ酸であり、前記変異体はタンパク質分解活性を有し
ており;さらに、前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・ア
ミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)ス
ブチリシンBPN’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、こ
れは変異体アミノ酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたも
のである。なおさらなる他の実施形態は、76、87、118、128、129および1
30;X76D、X87R、X118R、X128L、X129QおよびX130A;ま
たはN76D、S87R、G118R、S128L、P129QおよびS130Aの各位
置での置換と、(i)3、18、24、78、206および249;(ii)X3V、X
18R、X24R、X78G/N、X206L/R/YおよびX249N/R;または(
iii)S3V、N18R、S24R、S78G/N、Q206L/R/YおよびH24
9N/Rから選択される、1つ以上の位置での1つ以上の置換とを組み合わせて含むアミ
ノ酸配列を含む、単離されたスブチリシン変異体を提供する;ここで、Xは任意のアミノ
酸であり、前記変異体はタンパク質分解活性を有しており;さらに、前記変異体の各アミ
ノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacil
lus amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’配列の、対応する
アミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ酸配列とBPN’ア
ミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたものである。さらに他の実施形態は、7
6、87、118、128、129および130;X76N、X87R、X118R、X
128L、X129QおよびX130A;またはN76D、S87D/R、G118R、
S128L、P129QおよびS130Aの各位置での置換と、(i)18、24、78
、206および249;(ii)X18R、X24R、X78N、X206LおよびX2
49N/Rまたは(iii)N18R、S24R、S78N、Q206LおよびH249
N/Rから選択される、1つ以上の位置での1つ以上の置換とを組み合わせて含むアミノ
酸配列を含む、単離されたスブチリシン変異体を提供する;ここで、Xは任意のアミノ酸
であり、前記変異体はタンパク質分解活性を有しており;さらに、前記変異体の各アミノ
酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacill
us amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’配列の、対応するア
ミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミ
ノ酸配列とのアラインメントにより決定されたものである。
【0071】
他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、(i)3-8
、3-40、3-78、3-87、3-118、3-128、3-129、3-130、
3-210、3-211、3-215、3-217、3-261、3-262、8-40
、8-76、8-87、8-118、8-128、8-210、8-215、8-261
、18-78、18-87、18-118、18-206、24-87、24-206、
24-209、24-213、24-222、40-76、40-87、40-118、
40-128、40-210、40-215、40-217、40-261、76-21
0、76-211、76-213、76-215、76-217、76-249、76-
261、76-262、78-87、78-118、78-210、78-213、78
-222、78-249、87-206、87-209、87-213、87-215、
87-217、87-222、87-249、87-261、118-206、118-
209、118-210、118-211、118-213、118-215、118-
217、118-222、118-249、118-261、118-262、128-
209、128-210、128-215、128-217、128-261、129-
206、129-209、130-206、130-209、206-213、206-
249、209-213、209-249、210-217、210-261、213-
222、213-249、215-261、222-249およびこれらの組み合わせ;
(ii)3-76-118、18-24-206、18-24-209、18-24-2
13、18-24-249、18-87-209、18-118-209、18-206
-209、18-209-213、18-209-222、18-209-249、18
-213-249、24-76-78、24-76-87、24-76-118、24-
76-209、24-76-222、24-76-249、24-78-87、24-7
8-118、24-78-206、24-78-209、24-78-222、24-7
8-249、24-87-118、24-87-209、24-87-222、24-8
7-249、24-118-209、24-118-222、24-118-249、2
4-206-209、24-206-249、24-209-213、24-209-2
22、24-209-249、24-213-249、24-222-249、76-7
8-118、76-78-87、76-78-129、76-78-130、76-78
-206、76-78-209、76-78-222、76-78-249、76-87
-118、76-87-206、76-87-209、76-87-249、76-11
8-128、76-118-206、76-118-209、76-118-222、7
6-118-249、76-209-222、76-209-249、78-87-11
8、78-87-129、78-87-130、78-87-206、78-87-20
9、78-87-222、78-87-249、78-118-129、78-118-
209、78-118-222、78-118-249、78-129-130、78-
209-222、78-209-249、78-222-249、87-118-206
、87-118-209、87-118-249、87-206-209、87-209
-222、87-209-249、87-222-249、118-209-213、1
18-209-222、118-209-249、118-222-249、206-2
09-249、209-213-222、209-213-249、209-222-2
49およびこれらの組み合わせ;(iii)X3V-X8V、X3V-X40E、X3V
-X78G/N、X3V-X87D、X3V-X118R、X3V-X128R、X3V
-X129Q、X3V-X130A、X3V-X210I、X3V-X211P、X3V
-X215K、X3V-X217K、X3V-X261I、X3V-X262Q、X8V
-X40E、X8V-X76D、X8V-X87D、X8V-X118R、X8V-X1
28R、X8V-X210I、X8V-X215K、X8V-X261I、X18R-X
78N、X18R-X87R、X18R-X118R、X18R-X206L、X24R
-S78N、X24R-X87D/R、X24R-X206L/Y、X24R-X209
W、X24R-X213A、X24R-X222Q、X40E-X76D、X40E-X
87D/R、X40E-X118R、X40E-X128R、X40E-X210I、X
40E-X215K、X40E-X217K、X40E-X261I、X76D-X87
D、X76D-X128R、X76D-X206F/R/M/Y、X76D-X210I
、X76D-X211P、X76D-X213A、X76D-X215K、X76D-X
217K、X76D-X249R、X76D-X261I、X76D-X262Q、X7
8G-X206F/L/M/Y、X78G-X210I、X78G-X261I、X78
G/N-X87D/R、X78G/N-X118R、X78G/N-X128L、X78
G/N-X129Q、X78G/N-X130A、X78N-X213A、X78N-X
222Q、X78N-X249R、X87D-X118R、X87D-X128L/R、
X87D-X129Q、X87D-X130A、X87D/R-X209W、X87D-
X210I、X87D-X215K、X87D-X217K、X87D/R-X222Q
、X87D/R-X249R、X87R-X206F/L/M/R/Y、X87R-X2
13A、X87D/R-X261I、X118R-X128R、X118R-X206F
/M/L/R/Y、X118R-X209W、X118R-X210II、X118R-
X211P、X118R-X213A、X118R-X215K、X118R-X217
K、X118R-X222Q、X118R-X249R、X118R-X261I、X1
18R-X262Q、X128L-X206F/L/M/R/Y、X128L-X209
W、X128R-P210I、X128R-A215K、X128R-L217K、X1
28R-N261I、X129Q-X206F/L/M/R/Y、X129Q-X209
W、X130A-X206F/L/M/R/Y、S130A-Y209W、X206L/
Y-X213A、X206L/Y-X222Q、X206L/Y-X249R、X209
W-X213A、X209W-X222Q、X209W-X249R、X210I-X2
17K、X210I-X261I、X213A-X222Q、X213A-X249R、
X215K-X261I、X222Q-X249Rおよびこれらの組み合わせ;(iv)
X3V-X76D-X118R、X18R-X24R-X206L/Y、X18R-X2
4R-X209W、X18R-X24R-X213A、X18R-X24R-X249R
、X18R-X87D/R-X209W、X18R-X118R-X209W、X18R
-X206L/Y-X209W、X18R-X206L/Y-X249R、X18R-X
209W-X213A、X18R-X209W-X222Q、X18R-X209W-X
249R、X18R-X213A-X249R、X24R-X76D-X78G/N、X
24R-X76D-X87D/R、X24R-X76D-X118R、X24R-X76
D-X209W、X24R-X76D-X222Q、X24R-X76D-X249R、
X24R-X78G/N-X87D/R、X24R-X78G/N-X118R、X24
R-X78G/N-X206L/Y、X24R-X78G/N-X209W、X24R-
X78G/N-X222Q、X24R-X78G/N-X249R、X24R-X87D
/R-X118R、X24R-X87D/R-X209W、X24R-X87D/R-X
222Q、X24R-X87D/R-X249R、X24R-X118R-X209W、
X24R-X118R-X222Q、X24R-X118R-X249R、X24R-X
206L-X209W、X24R-X206L/Y-X249R、X24R-X209W
-X213A、X24R-X209W-X222Q、X24R-X209W-X249R
、X24R-X213A-X249R、X24R-X222Q-X249R、X76D-
X78G/N-X87D/R、X76D-X78G/N-X118R、X76D-X78
G/N-X129Q、X76D-X78G/N-X130A、X76D-X78G/N-
X206L、X76D-X78G/N-X209W、X76D-X78G/N-X222
Q、X76D-X78G/N-X249R、X76D-X87D/R-X118R、X7
6D-X87D/R-X206L/Y、X76D-X87D/R-X209W、X76D
-X87D/R-X249R、X76D-X118R-X128R、X76D-X118
R-X206L/Y、X76D-X118R-X209W、X76D-X118R-X2
22Q、X76D-X118R-X249R、X76D-X209W-X222Q、X7
6D-X209W-X249R、X78G/N-X87D/R-X118R、X78G/
N-X87D/R-X129Q、X78G/N-X87D/R-X130A、X78G/
N-X87D/R-X206L/Y、X78G/N-X87D/R-X209W、X78
G/N-X87D/R-X222Q、X78G/N-X87D/R-X249R、X78
G/N-X118R-X129Q、X78G/N-X118R-X209W、X78G/
N-X118R-X222Q、X78G/N-X118R-X249R、X78G/N-
X129Q-X130A、X78G/N-X209W-X222Q、X78G/N-X2
09W-X249R、X78G/N-X222Q-X249R、X87D/R-X118
R-X206L、X87D/R-X118R-X209W、X87D/R-X118R-
X249R、X87D/R-X206L/Y-X209W、X87D/R-X209W-
X222Q、X87D/R-X209W-X249R、X87D/R-X222Q-X2
49R、X118R-X209W-X213A、X118R-X209W-X222Q、
X118R-X209W-X249R、X118R-X222Q-X249R、X206
L-X209W-X249R、X209W-X213A-X222Q、X209W-X2
13A-X249R、X209W-X222Q-X249Rおよびこれらの組み合わせ;
または(v)S3V-I8V、S3V-P40E、S3V-S78G/N、S3V-S8
7D、S3V-G118R、S3V-S128R、S3V-P129Q、S3V-S13
0A、S3V-P210I、S3V-G211P、S3V-A215K、S3V-L21
7K、S3V-N261I、S3V-L262Q、I8V-P40E、I8V-N76D
、I8V-S87D、I8V-G118R、I8V-S128R、I8V-P210I、
I8V-A215K、I8V-N261I、N18R-S78N、N18R-S87R、
N18R-G118R、N18R-Q206L、S24R-S78N、S24R-S87
D/R、S24R-Q206L/Y、S24R-Y209W、S24R-T213A、S
24R-M222Q、P40E-N76D、P40E-S87D/R、P40E-G11
8R、P40E-S128R、P40E-P210I、P40E-A215K、P40E
-L217K、P40E-N261I、N76D-S87D、N76D-P210I、N
76D-S128R、N76D-Q206F/R/M/Y、N76D-P210I、N7
6D-G211P、N76D-T213A、N76D-A215K、N76D-L217
K、N76D-H249R、N76D-N261I、N76D-L262Q、S78G-
Q206F/L/M/Y、S78G-P210I、S78G-N261I、S78G/N
-S87D/R、S78G/N-G118R、S78G/N-S128L、S78G/N
-P129Q、S78G/N-S130A、S78N-T213A、S78N-M222
Q、S78N-H249R、S87D-G118R、S87D-S128L/R、S87
D-P129Q、S87D-S130A、S87D/R-Y209W、S87D-P21
0I、S87D-A215K、S87D-L217K、S87D/R-M222Q、S8
7D/R-H249R、S87R-Q206F/L/M/R/Y、S87R-T213A
、S87D/R-N261I、G118R-S128R、G118R-Q206L/R/
Y、G118R-Y209W、G118R-P210I、G118R-G211P、G1
18R-T213A、G118R-L217K、G118R-M222Q、G118R-
H249R、G118R-N261I、G118R-L262Q、S128L-Q206
F/L/M/R/Y、S128L-Y209W、S128R-P210I、S128R-
A215K、S128R-L217K、S128R-N261I、P129Q-Q206
F/L/M/R/Y、P129Q-Y209W、S130A-Q206F/L/M/R/
Y、S130A-Y209W、Q206L/Y-T213A、Q206L/Y-M222
Q、Q206L/Y-H249R、Y209W-T213A、Y209W-M222Q、
Y209W-H249R、P210I-L217K、P210I-N261I、T213
A-M222Q、T213A-H249R、A215K-N261I、M222Q-H2
49Rおよびこれらの組み合わせ;または(vi)S3V-N76D-G118R、N1
8R-S24R-Q206L/Y、N18R-S24R-Y209W、N18R-S24
R-T213A、N18R-S24R-H249R、N18R-S87D/R-Y209
W、N18R-G118R-Y209W、N18R-Q206L/Y-Y209W、N1
8R-Q206L/Y-H249R、N18R-Y209W-T213A、N18R-Y
209W-M222Q、N18R-Y209W-H249R、N18R-T213A-H
249R、S24R-N76D-S78G/N、S24R-N76D-S87D/R、S
24R-N76D-G118R、S24R-N76D-Y209W、S24R-N76D
-M222Q、S24R-N76D-H249R、S24R-S78G/N-S87D/
R、S24R-S78G/N-G118R、S24R-S78G/N-Q206L、Y2
09WS24R-S78G/N-Y209W、S24R-S78G/N-M222Q、S
24R-S78G/N-H249R、S24R-S87D/R-G118R、S24R-
S87D/R-Y209W、S24R-S87D/R-M222Q、S24R-S87D
/R-H249R、S24R-G118R-Y209W、S24R-G118R-M22
2Q、S24R-G118R-H249R、S24R-Q206L/Y-Y209W、S
24R-Q206L/Y-H249R、S24R-Y209W-T213A、S24R-
Y209W-M222Q、S24R-Y209W-H249R、S24R-T213A-
H249R、S24R-M222Q-H249R、N76D-S78G/N-S87D/
R、N76D-S78G/N-G118R、N76D-S78G/N-P129Q、N7
6D-S78G/N-S130A、N76D-S78G/N-Q206L、N76D-S
78G/N-Y209W、N76D-S78G/N-M222Q、N76D-S78G/
N-H249R、N76D-S87D/R-G118R、N76D-S87D/R-Q2
06L/Y、N76D-S87D/R-Y209W、N76D-S87D/R-H249
R、N76D-G118R-S128R、N76D-G118R-Q206L/Y、N7
6D-G118R-Y209W、N76D-G118R-M222Q、N76D-G11
8R-H249R、N76D-Y209W-M222Q、N76D-Y209W-H24
9R、S78G/N-S87D/R-G118R、S78G/N-S87D/R-P12
9Q、S78G/N-S87D/R-S130A、S78G/N-S87D/R-Q20
6L/Y、S78G/N-S87D/R-Y209W、S78G/N-S87D/R-M
222Q、S78G/N-S87D/R-H249R、S78G/N-G118R-P1
29Q、S78G/N-G118R-Y209W、S78G/N-G118R-M222
Q、S78G/N-G118R-H249R、S78G/N-P129Q-S130A、
S78G/N-Y209W-M222Q、S78G/N-Y209W-H249R、S7
8G/N-M222Q-H249R、S87D/R-G118R-Q206L、S87D
/R-G118R-Y209W、S87D/R-G118R-H249R、S87D/R
-Q206L/Y-Y209W、S87D/R-Y209W-H249R、S87D/R
-Y209W-M222Q、S87D/R-M222Q-H249R、G118R-Y2
09W-T213A、G118R-Y209W-M222Q、G118R-Y209W-
H249R、G118R-M222Q-H249R、Q206L/Y-Y209W-H2
49R、Y209W-T213A-M222Q、Y209W-T213A-H249R、
Y209W-M222Q-H249Rおよびこれらの組み合わせから選択される2つ以上
の位置での置換をさらに含む。
【0072】
さらに他の実施形態は、(i)S3V-S78N、N18R-G20R、N18R-S
24R、N18R-N43R、N18R-R45T、N18R-H249R、G20R-
N43R、G20R-R45T、G20R-H249R、T22L-S24F、T22L
-S78N、T22L-S166D、T22L-T213A、S24R/F-S78N、
S24R-N43R、S24R-Y209W、S24F-S166D、S24R/F-T
213A、S24R-H249R、S24R-M222Q、N43R-Y209W、N4
3R-H249R、N43R-R45T、R45T-H249R、S78G/N-Q20
6Y/F、S78N-S166D、S78N-T213A、S101A-S188D、S
101A-P210I、S101A-A232V、S103A-S188D、S103A
-P210I、S103A-A232V、V104I-S188D、V104I-P21
0I、V104I-A232V、S166D-T213A、S188D-P210I、S
188D-A232V、S188D-Q245R、P210I-A232V、A232V
-Q245R、Q206Y-T213A、Q206L/Y-M222Q、Q206L-H
249R、M222Q-H249R、Y209W-M222Q、T213A-H249R
、Y209W-H249Rおよびこれらの組み合わせ;(ii)S3V-S78N-S8
7R、S3V-S78N-G118R、N18R-S24R-N76D、N18R-N7
6D-H249R、S24R-N43R-N76D、S24R-N76D-H249R、
S24F-S78N-G118R、S24F-G118R-S166D、S78N-G1
18R-S166D、T22L-S24F-G118R、T22L-S78N-G118
R、T22L-G118R-S166D、T22L-G118R-T213A、S24F
-G118R-T213A、S78N-G118R-T213A、N18R-G20R-
N76D、N18R-N43R-N76D、N18R-R45T-N76D、G20R-
N76D-H249R、G20R-N43R-N76D、G20R-R45T-N76D
、S24R-Y209W-G118R、S24R-G118R-M222Q、S24R-
G118R-H249R、N43R-G118R-Y209W、N43R-R45T-N
76D、N43R-N76D-H249R、R45T-N76D-H249R、N76D
-S101A-S188D、N76D-S101A-P210I、N76D-S101A
-A232V、N76D-S103A-S188D、N76D-S103A-P210I
、N76D-S103A-A232V、N76D-V104I-S188D、N76D-
V104I-P210I、N76D-V104I-A232V、N76D-S188D-
P210I、N76D-S188D-A232V、N76D-P210I-A232V、
N76D-Q206Y-T213A、N76D-S24R-Q206Y、N76D-S2
4R-M222Q、N76D-Q206Y-M222Q、N76D-T213A-H24
9R、N76D-T213A-M222Q、N76D-M222Q-H249R、N76
D-S78N-S87R、N76D-S78N-G118R、N76D-S78N-S1
28L、N76D-S78N-P129Q、N76D-S78N-S130A、N76D
-S87R-Q206L、N76D-G118R-Q206L、N76D-S128L-
Q206L、N76D-P129Q-Q206L、N76D-S130A-Q206L、
N76D-Q206L-H249R、S78G-S87R-Q206Y/F、S78G-
G118R-Q206Y/F、S78N-G118R-Y209W、S78N-S87D
-G118R、S78N-S87D-Q206Y、S87D-Y209W-G118R、
S87D-G118R-M222Q、S87D-G118R-H249R、G118R-
Q206L-M222Q、G118R-Y209W-M222Q、G118R-M222
Q-H249R、Y209W-G118R-M222Q、Y209W-G118R-H2
49Rおよびこれらの組み合わせ;または(iii)S3V-S78N-S87R-G1
18R、S3V-N76D-S78N-G118R-P129Q、N18R-S24R-
N76D-H249R-N18R-S24R-N76D-S78N-Q206L、S24
F-S78N-G118R-S166D、S24R-N76D-S78N-Q206L-
H249R、S24R-S78N-G118R-Q206L-M222Q、S24R-N
43R-G118R-Y209W、T22L-S24F-S78N-G118R-S16
6D-T213A、N18R-G20R-N43R-R45T-N76D-H249R、
N76D-S101A-S103A-V104I-S188D-P210I-A232V
-Q245R、G20R-S24R-N43R-N76D、N76D-S78N-S87
R-G118R-S128L-P129Q-S130A、N76D-S87R-G118
R-S128L-P129Q-S130A-Q206L、N76D-S78N-S87R
-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L、S24R-N76D
-S87R-Q206Y-T213A-M222Q-H249R、S24R-N76D-
S78N-S87D-G118R-Y209W-M222Q-H249R、N76D-S
78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Y209W、N
76D-S78N-S87D-Q206YおよびS78G-S87R-G118R-Q2
06Y/Fから選択される、2つ以上の位置での置換を含むアミノ酸配列を含む、単離さ
れたスブチリシン変異体に関する;ここで、前記2つ以上の位置での置換は、76、87
、118、128、129および130;X76D、X87R、X118R、X128L
、X129QおよびX130A;またはN76D、S87R、G118R、S128L、
P129QおよびS130Aから選択される1つ以上の置換とさらに組み合わされ;Xは
任意のアミノ酸であり、前記変異体はタンパク質分解活性を有しており;さらに、前記変
異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエンス
(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’配列
の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ酸配列
とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたものである。
【0073】
さらに他の実施形態は、(i)N18R-G20R、N18R-S24R、N18R-
N43R、N18R-R45T、N18R-H249R、G20R-N43R、G20R
-R45T、G20R-H249R、T22L-S24F、T22L-S78N、T22
L-S166D、T22L-T213A、S24R/F-S78N、S24R-Y209
W、S24F-S166D、S24R/F-T213A、S24R-H249R、S24
R-M222Q、N43R-H249R、N43R-R45T、R45T-H249R、
S78N-S166D、S78N-Q206L、S78N-Y209W、S78N-T2
13A、S101A-S188D、S101A-P210I、S101A-A232V、
S103A-S188D、S103A-P210I、S103A-A232V、V104
I-S188D、V104I-P210I、V104I-A232V、S166D-T2
13A、S188D-P210I、S188D-A232V、S188D-Q245R、
P210I-A232V、A232V-Q245R、Q206Y-T213A、Q206
Y-M222Q、M222Q-H249R、Y209W-M222Q、T213A-H2
49R、Y209W-H249Rおよびこれらの組み合わせ;または(ii)N18R-
S24R-N76D、N18R-N76D-H249R、S24R-N76D-H249
R、S24F-S78N-G118R、S24F-G118R-S166D、S78N-
G118R-S166D、T22L-S24F-G118R、T22L-S78N-G1
18R、T22L-G118R-S166D、T22L-G118R-T213A、S2
4F-G118R-T213A、S78N-G118R-T213A、N18R-G20
R-N76D、N18R-N43R-N76D、N18R-R45T-N76D、G20
R-N76D-H249R、G20R-N43R-N76D、G20R-R45T-N7
6D、N43R-R45T-N76D、N43R-N76D-H249R、R45T-N
76D-H249R、N76D-S101A-S188D、N76D-S101A-P2
10I、N76D-S101A-A232V、N76D-S103A-S188D、N7
6D-S103A-P210I、N76D-S103A-A232V、N76D-V10
4I-S188D、N76D-V104I-P210I、N76D-V104I-A23
2V、N76D-S188D-P210I、N76D-S188D-A232V、N76
D-P210I-A232V、N76D-Q206Y-T213A、N76D-S24R
-Q206Y、N76D-S24R-M222Q、N76D-Q206Y-M222Q、
N76D-T213A-H249R、N76D-T213A-M222Q、N76D-M
222Q-H249R、N76D-S78N-S87R、N76D-S78N-G118
R、N76D-S78N-S128L、N76D-S78N-P129Q、N76D-S
78N-S130A、N76D-S87R-Q206L、N76D-G118R-Q20
6L、N76D-S128L-Q206L、N76D-P129Q-Q206L、N76
D-S130A-Q206L、S24R-Y209W-G118R、S24R-G118
R-M222Q、S24R-G118R-H249R、Y209W-G118R-M22
2Q、Y209W-G118R-H249R、S78N-S87D-G118R、S87
D-Y209W-G118R、S87D-G118R-M222Q、S87D-G118
R-H249R、G118R-Y209W-M222Q、G118R-M222Q-H2
49Rおよびこれらの組み合わせから選択される、2つ以上の位置での置換を含むアミノ
酸配列を含む、単離されたスブチリシン変異体に関する;ここで、前記2つ以上の位置で
の置換は、76、87、118、128、129および130;X76N、X87R、X
118R、X128L、X129QおよびX130A、またはN76D、S87D/R、
G118R、S128L、P129QおよびS130Aの各位置での1つ以上の置換とさ
らに組み合わされ;Xは任意のアミノ酸であり、前記変異体はタンパク質分解活性を有し
ており;さらに、前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・ア
ミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)ス
ブチリシンBPN’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、こ
れは変異体アミノ酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたも
のである。
【0074】
さらなる実施形態は、S3V-N76D、S24R-N76D、S24R-G118R
、S24R-H249R、N76D-S78G、N76D-S78N、N76D-Q20
6L、N76D-Y209W、N76D-M222Q、S78N-Q206L、S78N
-Y209W、N76D-S78N-Y209W、N76D-S78N-Q206L、N
76D-Q206L-Y209Wおよびこれらの組み合わせから選択される、2つ以上の
置換を含むアミノ酸配列を含む、単離されたスブチリシン変異体に関する;ここで、前記
2つ以上の位置での置換は、(i)A1V、S3I/T/V、I8V、S9G、A16T
、N18K/R、G20E/R、T22L/W、S24F/L/P/R、V28T、P4
0E、L42I、N43R/S、I44V、S56P、N77D、S78A/C/E/F
/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/T/V/W/Y、L82D、A88S、E
89H、S99N、G100S、S101F/G/H/Q/T/V、S103A/D/P
、V104I、A108S、N116L/M、H120R、L124M、G127S/T
、V147I、V150T、A158E/T/V、G159D、S160Q、S166D
/N、N185Y、S188D、A194D/P、N204D、Q206A/D/F/G
/H/L/M/N/P/R/S/Y、Y209W、P210I、G211P、S212D
、T213A、A215K/V、S216Y、L217K、N218S、M222L/Q
/S、A232V、K235T、W241K、N243S、Q245R、I246V、N
248D、H249N/R、K251R、N252I、A254T、S256P、S25
9G、N261I、L262Q、V268A、A270P/TおよびE271D;(ii
)S3T/V、I8V、N18R、T22W、S24R、V28T、P40E、N43S
、S78A/C/E/F/G/H/I/K/L/M/N/P/Q/R/T/V/W/Y、
E89H、S99N、S101F/G/V、S103A/D/P、V104I、A108
S、N116M、L124M、G127T、V147I、V150T、A158E/T、
G159D、S166D、S188D、A194D/P、Q206A/D/F/G/H/
L/M/N/P/R/S/Y、Y209W、P210I/L、G211P、S212D、
T213A、A215V、L217K、M222Q/S、A232V、K235T、N2
43S、Q245R、I246V、H249N/R、N261I、L262Q、A270
TおよびE271D;(iii)S3V、I8V、S24R、P40E、N76D、S7
8G/N、S87D/R、G118R、S128L/R、P129Q、S130A、Q2
06F/L/M/Y、Y209W、P210I、T213A、A215K、L217K、
M222Q、H249RおよびN261I;(iv)I8V、P40E、S87D/R、
S128L/R、P129Q、S130A、P210I、T213A、A215K、L2
17KおよびN261I;(v)S3V、N18R、S24R、P40E、S78G/N
、G127T、S166D/N、Q206L/R/Y、Y209W、P210I、G21
1P、T213A、L217K、M222Q/S、H249N/R、N261IおよびL
262Q;または(vi)S3V、N18R、S24R、S78G/N、Q206L/R
/YおよびH249N/Rから選択される1つ以上の置換とさらに組み合わされ;前記変
異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエンス
(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’配列
の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ酸配列
とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されたものである。
【0075】
またさらに他の実施形態は、N18R-S87R-G118R-S166N-N204
D-Q206L-Y209W;N18R-S24R-L42I-G118R-Y209W
-T213A-M222Q-H249R;N18R-S24R-Y209W-T213A
-H249R;N18R-S24R-S87R-G118R-S128L-P129Q-
S130A-Q206Y-Y209W-T213A-H249R;S24R-S87D-
G118R-Y209W-T213A-H249R;S9G-N18R-S24R-N7
6D-G118R-S166N-Q206L-H249R;N18R-G118R-Q2
06L-Y209W-T213A-M222Q-H249R;S24R-S87R-S1
66N;N18R-S24R-S87R-Q206L-Y209W-T213A;N18
R-S24R-G118R-A158V-Y209W;N18R-S24R-S87D-
Q206L-Y209W-M222Q-H249R;N18R-S24R-S87R-G
127T;S24R-S166N-Y209W-T213A;N76D-S78N-G1
18R-Y209W-H249R;N18R-N76D-S78N-S87R-Q206
L-Y209W-H249R-S259G;N18R-S24R-S87D-N185Y
-Q206L-Y209W-T213A-M222Q-H249R;S24R-G118
R-G127T-Y209W;A1V-N18R-S24R-S56P-G127T-Q
206L-Y209W;S87R-Y209W;N18R-S87D-Y209W-M2
22Q-H249R;N18R-S24R-G118R-S128L-P129Q-S1
30A-S166D-Y209W-T213A;S87D-S166D-T213A-H
249R;N18R-S24P-S87D-S166N-Q206L-Y209W-M2
22Q-H249R;N76D-S166N-Y209W-T213A-H249R;S
24R-Q206L-Y209W-T213A-M222Q-H249R;N18R-G
118R-Q206L-Y209W;N18R-S24R-S166D-Q206Y-H
249R-A254T;N18R-S24R-S78N-Q206L-Y209W-T2
13A-M222Q-H249R;N18R-S24R-G118R-G127T-Y2
09W;S24R-N76D-G118R-S166N-Q206L-Y209W;S2
4R-N76D-S87R-Y209W-T213A-M222Q-H249R;N18
K-S87R-Y209W-T213A-M222Q-H249R;N18R-S24R
-S87R-Y209W;N18R-S78N-G118R-Y209W-T213A-
M222Q-H249R-A270P;N18R-S166N-Y209W-T213A
-M222Q;N76D-S78N-S87R-S103P-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206L-N243S;N76D-S78N-S
87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;
N18R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S1
30A-Q206L;N18R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128
L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;N18R-S24R-N76D
-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L
-H249N;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-S99N-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-A158T-Q206L-I246V-H
249R;S24R-N76D-S78N-S128L-P129Q-S130A-Q2
06L-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S128L-P129
Q-S130A-Q206L-H249R;N76D-S78N-G118R-Q206
L-H249R;N18R-I44V-N76D-S78N-S87R-S128L-P
129Q-S130A-Q206L-H249R;N18R-N76D-S78N-S8
7R-Q206L-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-
S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-G118R-
Q206L;A16T-N18R-S24R-N76D-S78N-G118R-S12
8L-P129Q-S130A-Q206L;N18R-S24R-N76D-S78N
-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-K235
T;S24R-N76D-S78N-Q206L-H249R;S24R-N76D-S
78N-S87R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N18R-N7
6D-S78N-S87R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N18
R-S24R-N76D-S78N-S128L-P129Q-S130A;S24R-
N76D-S78N-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R
-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-A270T;N18
R-S24R-N76D-S78N-G118R-S128L-P129Q-S130A
-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-M222Q-H249R;N
76D-S78N-S87R-Q206L-H249R;N18R-N76D-S78N
-Q206L-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-G118R-Q
206L-K251R;N76D-S78N-Q206L-H249R;N18R-S2
4R-N76D-S78N-S87R-Q206L;N18R-S24R-N76D-S
78N-G118R-S128L-P129Q-S130A;N76D-S78N-H1
20R-Q206L-H249R;N18R-N76D-S78N-S87R-S128
L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;N18R-G20E-N76D
-S78N-G118R-H249R;S24R-N76D-S78N-G118R-S
128L-P129Q-S130A;N76D-S78N-G118R-S128L-P
129Q-S130A-Q206L-H249R;S24R-N76D-S78N-G1
18R-Q206L;N18R-N76D-S78N-S128L-P129Q-S13
0A-Q206L-V268A;N18R-N76D-S78N-S87R-Q206L
-N218S-M222Q-H249R;N18R-S24R-N76D-S87R-G
118R-S128L-P129Q-S130A-H249R;N76D-S78N-S
87R-G118R-S128L-P129Q-S130A;N18R-S24R-N7
6D-S78N-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-G
118R-S128L-P129Q-S130A-H249R;N18R-S24R-N
76D-S78N-S87R-H249R;N76D-S87R-G118R-S128
L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R
-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N18R-S24R-N76D-
S78N-Q206L-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S87
R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;N7
6D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-M22
2Q;S24R-N76D-S87R-Q206Y-T213A-M222Q-H249
R;S24R-N76D-S78N-S87D-G118R-Y209W-M222Q-
H249R;S87D-Q206L-Y209W-T213A-H249R;S24R-
N76D-S78N-S87R-G118R-Q206L-M222Q;S24R-N7
6D-S78N-Q206L-M222Q;N76D-S78N-S87R-G118R
-S128L-P129Q-Q206L-M222Q;N76D-S78N-S87R-
G118R-P129Q-Q206L-M222Q;N76D-S78N-S87R-G
118R-S130A-Q206L-M222Q;N76D-S78N-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-Q206L;N76D-S78N-S87R-G11
8R-S128L-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118
R-S128L-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-P129Q
-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S130A-Q206L;
N76D-S78N-S87R-G118R-Q206L-M222Q;N76D-S7
8N-S87R-G118R-Q206L;S24R-N76D-S78N-S87R-
G118R-Y209W-M222Q;S24R-N43R-N76D-S78N-S8
7R-G118R-Y209W-M222Q;G20R-S24R-N43R-N76D
-S78N-S87R-G118R-Y209W-M222Q;G20R-N43R-N
76D-S78N-S87R-G118R-Y209W-M222Q;S24R-N76
D-S78N-S87R-G118R-Q206L-Y209W-T213A-M222
Q;S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-Q206L-T213A-
M222Q;S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-Y209W-T2
13A-M222Q;S24R-N76D-S78N-S87R-N116L-G118
R-Y209W-M222Q;G20R-S24R-N43R-N76D-S78N-S
87R-N116L-G118R-Y209W-M222Q;N18R-N76D-S8
7R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-Y209W-H249R;N
18R-S87D-S166N-Q206L-Y209W;N18R-S24R-N76
D-S78N-S87R-G118R-G127T-Y209W-T213A;N18R
-S24R-S166D-Q206Y-H249R;S24R-S78N-S87R-S
166D-Q206L-Y209W-H249R;S3V-N76D-S78N-S87
R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78
N-S87R-S101V-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6L;N76D-S78N-S87R-G118R-G127T-S128L-P129
Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-S101G-S103A
-V104I-G118R-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-
G127T-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-G127T-P
129Q-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-G127T-P1
29Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-S101G-S10
3A-V104I-G118R-G127T-P129R-Q206L;N76D-S7
8N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-S2
12D;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S13
0A-S166D-Q206L;S3V-N76D-S78N-S87R-S101G-
S103A-V104I-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206
L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A
-Q206L-T213A;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206L-A232V-Q245R;N76D-S78N-
S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-G159D-S188D
-Q206L-A232V-Q245R;S3V-S24R-N76D-S78N-S8
7D-G118R-Y209W-M222Q-H249R;S24R-N76D-S78
N-S87D-S101V-G118R-Y209W-M222Q-H249R;S24
R-N76D-S78N-S87D-S101G-S103A-V104I-G118R
-Y209W-M222Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-G
118R-Y209W-M222Q-H249R-S212D;S3V-S24R-N7
6D-S78N-S87D-S101G-S103A-V104I-G118R-Y20
9W-M222Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-S101G
-S103A-V104I-G118R-G127T-Y209W-T213A-M22
2Q-H249R;S024R-N074D-S76N-S085D-S099G-S1
01A-V102I-G116R-Y203W-M216Q-A226V-Q239R-
H243R;S24R-N76D-S78N-S87D-S101G-S103A-V1
04I-G118R-Y209W-H249R;S3V-S24R-N76D-S78N
-S87D-S101G-S103A-V104I-G118R-Y209W-H249
R;S24R-N76D-S78N-S87D-S101G-S103A-V104I-
G118R-G127T-Y209W-T213A-H249R;S24R-N76D-
S78N-S87D-S101T-G118R-Y209W-M222Q-H249R;
S24R-N76D-S78N-S87D-S101H-G118R-Y209W-M2
22Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-G118R-P129
Q-Y209W-M222Q-H249R;N76D-S78N-S87D-G118R
-S128L-P129Q-S130A-Q206L;S24R-N76D-S78N-
S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249R
;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-Q206L;S24R-N76D-S78N-S87R-G118
R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;S24R-N76D-S78N
-S87D-G118R-Y209W-H249R;S24R-N76D-S78N-S
87R-G118R-Y209W-M222Q-H249R;N76D-S78N-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Y209W;N76D-S7
8N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-Y2
09W;N76D-S87R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-Y2
09W-H249R;N76D-S87R-S128L-P129Q-S130A-Q2
06L-Y209W;S24R-N76D-S78N-S87D-G118R-Y209
W-M222S-H249R;N76D-S78N-S87D-G118R-Y209W
-H249R;N76D-S78N-S87D-G118R-Y209W-M222S-
H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-G118R-M222Q-H2
49R;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S13
0A-Q206L-M222S;S3T-N76D-S78N-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-Q206L;V28T-N76D-S78N-S
87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S
78N-S87R-A108S-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q
206L;N76D-S78N-S87R-N116M-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-L12
4M-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87
R-G118R-S128L-P129Q-S130A-V150T-Q206L;N7
6D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-A19
4D-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129
Q-S130A-A158E-Q206L;V28T-N76D-S78N-S87R-
S101F-G118R-S128L-P129Q-S130A-A194D-Q206
L;S24R-V28T-N43S-N76D-S78N-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-A158E-Q206L;S24R-V28T-N7
6D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-A19
4D-Q206L;S24R-N76D-S78N-S87D-G118R-S128L
-P129Q-S130A-Q206L-T213A;S24R-V28T-N76D-
S78N-S87D-S101V-A108S-G118R-S128L-P129Q-
S130A-Q206L;S24R-V28T-N76D-S78N-S87D-S10
1V-N116M-G118R-S128L-P129Q-S130A-A158E-Q
206L;S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P12
9Q-S130A-Q206L-T213A;N76D-S78N-S87R-S103
D-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;S24R-V28
T-N76D-S78N-S87R-S101V-A108S-G118R-S128L
-P129Q-S130A-Q206L-T213A-L217K;S24R-N76D
-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L
-L217K;S3V-S24R-N76D-S78N-S87R-G100S-S10
1V-G118R-Q206L-L217K;N76D-N77D-S78N-S87R
-G118R-Q206L-T213A;S24R-N76D-S78N-S87D-G
100S-S101V-N116M-G118R-L124M-S128L-P129Q
-S130A-A194D-Q206L;およびS24R-V28T-N76D-S78
N-S87R-G118V-S128L-P129Q-S130A-Q206L-T21
3A-L217Kから選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む、単離されたスブチリ
シン変異体に関する;ここで、前記変異体はタンパク質分解活性を有しており、前記変異
体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエンス(
Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’配列の
、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ酸配列と
BPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されるものである。さらに他の実施
形態は、N18R-S87R-G118R-S166N-N204D-Q206L-Y2
09W;N18R-S24R-L42I-G118R-Y209W-T213A-M22
2Q-H249R;N18R-S24R-Y209W-T213A-H249R;N18
R-S24R-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206
Y-Y209W-T213A-H249R;S24R-S87D-G118R-Y209
W-T213A-H249R;S9G-N18R-S24R-N76D-G118R-S
166N-Q206L-H249R;N18R-G118R-Q206L-Y209W-
T213A-M222Q-H249R;S24R-S87R-S166N;N18R-S
24R-S87R-Q206L-Y209W-T213A;N18R-S24R-G11
8R-A158V-Y209W;N18R-S24R-S87D-Q206L-Y209
W-M222Q-H249R;N18R-S24R-S87R-G127T;S24R-
S166N-Y209W-T213A;N76D-S78N-G118R-Y209W-
H249R;N18R-N76D-S78N-S87R-Q206L-Y209W-H2
49R-S259G;N18R-S24R-S87D-N185Y-Q206L-Y20
9W-T213A-M222Q-H249R;S24R-G118R-G127T-Y2
09W;A1V-N18R-S24R-S56P-G127T-Q206L-Y209W
;S87R-Y209W;N18R-S87D-Y209W-M222Q-H249R;
N18R-S24R-G118R-S128L-P129Q-S130A-S166D-
Y209W-T213A;S87D-S166D-T213A-H249R;N18R-
S24P-S87D-S166N-Q206L-Y209W-M222Q-H249R;
N76D-S166N-Y209W-T213A-H249R;S24R-Q206L-
Y209W-T213A-M222Q-H249R;N18R-G118R-Q206L
-Y209W;N18R-S24R-S166D-Q206Y-H249R-A254T
;N18R-S24R-S78N-Q206L-Y209W-T213A-M222Q-
H249R;N18R-S24R-G118R-G127T-Y209W;S24R-N
76D-G118R-S166N-Q206L-Y209W;S24R-N76D-S8
7R-Y209W-T213A-M222Q-H249R;N18K-S87R-Y20
9W-T213A-M222Q-H249R;N18R-S24R-S87R-Y209
W;N18R-S78N-G118R-Y209W-T213A-M222Q-H249
R-A270P;N18R-S166N-Y209W-T213A-M222Q;N76
D-S78N-S87R-S103P-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206L-N243S;N76D-S78N-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;N18R-N76D-
S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;
N18R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S1
30A-Q206L-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R
-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249N;N18
R-S24R-N76D-S78N-S87R-S99N-G118R-S128L-P
129Q-S130A-A158T-Q206L-I246V-H249R;S24R-
N76D-S78N-S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;
N18R-S24R-N76D-S78N-S128L-P129Q-S130A-Q2
06L-H249R;N76D-S78N-G118R-Q206L-H249R;N1
8R-I44V-N76D-S78N-S87R-S128L-P129Q-S130A
-Q206L-H249R;N18R-N76D-S78N-S87R-Q206L-H
249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-S128L-P129
Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-G118R-Q206L;A16T
-N18R-S24R-N76D-S78N-G118R-S128L-P129Q-S
130A-Q206L;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-G118
R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-K235T;S24R-N76
D-S78N-Q206L-H249R;S24R-N76D-S78N-S87R-S
128L-P129Q-S130A-Q206L;N18R-N76D-S78N-S8
7R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N18R-S24R-N76
D-S78N-S128L-P129Q-S130A;S24R-N76D-S78N-
H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S12
8L-P129Q-S130A-Q206L-A270T;N18R-S24R-N76
D-S78N-G118R-S128L-P129Q-S130A-H249R;N18
R-S24R-N76D-S78N-M222Q-H249R;N76D-S78N-S
87R-Q206L-H249R;N18R-N76D-S78N-Q206L-H24
9R;N18R-S24R-N76D-S78N-G118R-Q206L-K251R
;N76D-S78N-Q206L-H249R;N18R-S24R-N76D-S7
8N-S87R-Q206L;N18R-S24R-N76D-S78N-G118R-
S128L-P129Q-S130A;N76D-S78N-H120R-Q206L-
H249R;N18R-N76D-S78N-S87R-S128L-P129Q-S1
30A-Q206L-H249R;N18R-G20E-N76D-S78N-G118
R-H249R;S24R-N76D-S78N-G118R-S128L-P129Q
-S130A;N76D-S78N-G118R-S128L-P129Q-S130A
-Q206L-H249R;S24R-N76D-S78N-G118R-Q206L;
N18R-N76D-S78N-S128L-P129Q-S130A-Q206L-V
268A;N18R-N76D-S78N-S87R-Q206L-N218S-M22
2Q-H249R;N18R-S24R-N76D-S87R-G118R-S128L
-P129Q-S130A-H249R;N76D-S78N-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A;N18R-S24R-N76D-S78N-H2
49R;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L
-P129Q-S130A-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S
87R-H249R;N76D-S87R-G118R-S128L-P129Q-S1
30A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P12
9Q-S130A-Q206L;N18R-S24R-N76D-S78N-Q206L
-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;N76D-S78N-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-M222Q;S24R-N7
6D-S87R-Q206Y-T213A-M222Q-H249R;S24R-N76
D-S78N-S87D-G118R-Y209W-M222Q-H249R;S87D
-Q206L-Y209W-T213A-H249R;S24R-N76D-S78N-
S87R-G118R-Q206L-M222Q;S24R-N76D-S78N-Q2
06L-M222Q;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P12
9Q-Q206L-M222Q;N76D-S78N-S87R-G118R-P129
Q-Q206L-M222Q;N76D-S78N-S87R-G118R-S130A
-Q206L-M222Q;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-
P129Q-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-S
130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-Q2
06L;N76D-S78N-S87R-G118R-P129Q-Q206L;N76
D-S78N-S87R-G118R-S130A-Q206L;N76D-S78N-
S87R-G118R-Q206L-M222Q;N76D-S78N-S87R-G1
18R-Q206L;S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-Y209
W-M222Q;S24R-N43R-N76D-S78N-S87R-G118R-Y
209W-M222Q;G20R-S24R-N43R-N76D-S78N-S87R
-G118R-Y209W-M222Q;G20R-N43R-N76D-S78N-S
87R-G118R-Y209W-M222Q;S24R-N76D-S78N-S87
R-G118R-Q206L-Y209W-T213A-M222Q;S24R-N76
D-S78N-S87R-G118R-Q206L-T213A-M222Q;S24R
-N76D-S78N-S87R-G118R-Y209W-T213A-M222Q;
S24R-N76D-S78N-S87R-N116L-G118R-Y209W-M2
22Q;G20R-S24R-N43R-N76D-S78N-S87R-N116L-
G118R-Y209W-M222Q;N18R-N76D-S87R-S128L-P
129Q-S130A-Q206L-Y209W-H249R;N18R-S87D-S
166N-Q206L-Y209W;N18R-S24R-N76D-S78N-S87
R-G118R-G127T-Y209W-T213A;N18R-S24R-S166
D-Q206Y-H249R;S24R-S78N-S87R-S166D-Q206L
-Y209W-H249R;S3V-N76D-S78N-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-S10
1V-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S7
8N-S87R-G118R-G127T-S128L-P129Q-S130A-Q2
06L;N76D-S78N-S87R-S101G-S103A-V104I-G11
8R-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-G127T-Q206
L;N76D-S78N-S87R-G118R-G127T-P129Q-Q206L
;N76D-S78N-S87R-G118R-G127T-P129Q-S130A-
Q206L;N76D-S78N-S87R-S101G-S103A-V104I-G
118R-G127T-P129R-Q206L;N76D-S78N-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-S212D;N76D-S
78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-S166D-Q
206L;S3V-N76D-S78N-S87R-S101G-S103A-V104
I-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78
N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-T21
3A;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206L-A232V-Q245R;N76D-S78N-S87R-G118R
-S128L-P129Q-S130A-G159D-S188D-Q206L-A23
2V-Q245R;S3V-S24R-N76D-S78N-S87D-G118R-Y
209W-M222Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-S10
1V-G118R-Y209W-M222Q-H249R;S24R-N76D-S78
N-S87D-S101G-S103A-V104I-G118R-Y209W-M22
2Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-G118R-Y209W
-M222Q-H249R-S212D;S3V-S24R-N76D-S78N-S8
7D-S101G-S103A-V104I-G118R-Y209W-M222Q-H
249R;S24R-N76D-S78N-S87D-S101G-S103A-V10
4I-G118R-G127T-Y209W-T213A-M222Q-H249R;S
024R-N074D-S76N-S085D-S099G-S101A-V102I-
G116R-Y203W-M216Q-A226V-Q239R-H243R;S24R
-N76D-S78N-S87D-S101G-S103A-V104I-G118R-
Y209W-H249R;S3V-S24R-N76D-S78N-S87D-S101
G-S103A-V104I-G118R-Y209W-H249R;S24R-N76
D-S78N-S87D-S101G-S103A-V104I-G118R-G127
T-Y209W-T213A-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-
S101T-G118R-Y209W-M222Q-H249R;S24R-N76D-
S78N-S87D-S101H-G118R-Y209W-M222Q-H249R;
S24R-N76D-S78N-S87D-G118R-P129Q-Y209W-M2
22Q-H249R;N76D-S78N-S87D-G118R-S128L-P12
9Q-S130A-Q206L;S24R-N76D-S78N-S87R-G118R
-S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;N18R-S24R
-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-
Q206L;S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-Q206L;S24R-N76D-S78N-S87D-G118
R-Y209W-H249R;S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-
Y209W-M222Q-H249R;N76D-S78N-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Y209W;N76D-S78N-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-Y209W;N76D-S
87R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-Y209W-H249R;
N76D-S87R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-Y209W;
S24R-N76D-S78N-S87D-G118R-Y209W-M222S-H2
49R;N76D-S78N-S87D-G118R-Y209W-H249R;N76
D-S78N-S87D-G118R-Y209W-M222S-H249R;S24R
-N76D-S78N-S87D-G118R-M222Q-H249R;N76D-S
78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-M
222S;S3T-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129
Q-S130A-Q206L;V28T-N76D-S78N-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-A
108S-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-
S78N-S87R-N116M-G118R-S128L-P129Q-S130A-
Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-L124M-S128L-P
129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-V150T-Q206L;N76D-S78N-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-A194D-Q206L;N
76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-A1
58E-Q206L;V28T-N76D-S78N-S87R-S101F-G118
R-S128L-P129Q-S130A-A194D-Q206L;S24R-V28
T-N43S-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-
S130A-A158E-Q206L;S24R-V28T-N76D-S78N-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-A194D-Q206L;S
24R-N76D-S78N-S87D-G118R-S128L-P129Q-S13
0A-Q206L-T213A;S24R-V28T-N76D-S78N-S87D-
S101V-A108S-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206
L;S24R-V28T-N76D-S78N-S87D-S101V-N116M-G
118R-S128L-P129Q-S130A-A158E-Q206L;S24R-
N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q
206L-T213A;N76D-S78N-S87R-S103D-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-Q206L;S24R-V28T-N76D-S78
N-S87R-S101V-A108S-G118R-S128L-P129Q-S13
0A-Q206L-T213A-L217K;S24R-N76D-S78N-S87R
-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-L217K;S3V
-S24R-N76D-S78N-S87R-G100S-S101V-G118R-Q
206L-L217K;N76D-N77D-S78N-S87R-G118R-Q20
6L-T213A;S24R-N76D-S78N-S87D-G100S-S101V
-N116M-G118R-L124M-S128L-P129Q-S130A-A19
4D-Q206L;S24R-V28T-N76D-S78N-S87R-G118V-
S128L-P129Q-S130A-Q206L-T213A-L217K;S3V-
N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A;S
3V-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Y209W;N76D-S78G-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206F;N76D-S78G-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206Y;S3V-N76D-S78G-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;S3V-N76D-S78G
-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;S3V-
N76D-S78G-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q
206Y;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S1
30A-Q206F;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P12
9Q-S130A-Q206M;N76D-S78N-S87R-G118R-S128
L-P129Q-S130A-Q206Y;S3V-N76D-S78N-S87R-G
118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;S3V-N76D-S7
8N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;S3
V-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A
-Q206Y;P40E-N76D-S87R-G118R-S128L-P129Q-
S130A;I8V-P40E-N76D-S87R-G118R-S128L-P12
9Q-S130A;P40E-N76D-S87R-G118R-S128L-P129
Q-S130A-P210I;P40E-N76D-S87R-G118R-S128L
-P129Q-S130A-G211P;P40E-N76D-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-N261I;N76D-S78N-S87R-G
118R-S128L-P129Q-S130A-P210I;N76D-S78N-S
87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Y209W-L262Q;
N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-P
210I-L262Q;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-V147I-A194P-A215V-E271D;T22W-N
76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-V1
47I-A194P-A215V;T22W-N76D-S78N-S87R-G118
R-S128L-P129Q-S130A-V147I-A215V-E271D;N7
6D-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-L217K;N7
6D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-L21
7K;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-V150T;N76D-S78G-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-P210L;N76D-S87R-E89H-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206Y;S3V-N76D-S87R-E89H-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-P210L;N76D-S78Q-S87
R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78
T-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;N76
D-S78V-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206
D;N76D-S78W-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A
-Q206D;N76D-S78Y-S87R-G118R-S128L-P129Q-
S130A-Q206D;N76D-S78A-S87R-G118R-S128L-P
129Q-S130A-Q206F;N76D-S78C-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78E-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78F-S87
R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78
H-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76
D-S78K-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206
F;N76D-S78L-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A
-Q206F;N76D-S78M-S87R-G118R-S128L-P129Q-
S130A-Q206F;N76D-S78Q-S87R-G118R-S128L-P
129Q-S130A-Q206F;N76D-S78T-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78W-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78Y-S87
R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78
C-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206G;N76
D-S78M-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206
G;N76D-S78C-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A
-Q206H;N76D-S78E-S87R-G118R-S128L-P129Q-
S130A-Q206H;N76D-S78F-S87R-G118R-S128L-P
129Q-S130A-Q206H;N76D-S78G-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-Q206H;N76D-S78H-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206H;N76D-S78L-S87
R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206H;N76D-S78
T-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206H;N76
D-S78V-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206
H;N76D-S78A-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A
-Q206M;N76D-S78C-S87R-G118R-S128L-P129Q-
S130A-Q206M;N76D-S78E-S87R-G118R-S128L-P
129Q-S130A-Q206M;N76D-S78F-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78G-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78I-S87
R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78
K-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76
D-S78L-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206
M;N76D-S78M-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A
-Q206M;N76D-S78Q-S87R-G118R-S128L-P129Q-
S130A-Q206M;N76D-S78R-S87R-G118R-S128L-P
129Q-S130A-Q206M;N76D-S78T-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78V-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78Y-S87
R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78
A-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206N;N76
D-S78C-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206
N;N76D-S78E-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A
-Q206N;N76D-S78G-S87R-G118R-S128L-P129Q-
S130A-Q206N;N76D-S78H-S87R-G118R-S128L-P
129Q-S130A-Q206N;N76D-S78I-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-Q206N;N76D-S78L-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206N;N76D-S78M-S87
R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206N;N76D-S78
Q-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206N;N76
D-S78R-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206
P;N76D-S78W-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A
-Q206P;N76D-S78A-S87R-G118R-S128L-P129Q-
S130A-Q206R;N76D-S78C-S87R-G118R-S128L-P
129Q-S130A-Q206R;N76D-S78E-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78F-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78G-S87
R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78
H-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76
D-S78I-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206
R;N76D-S78L-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A
-Q206R;N76D-S78M-S87R-G118R-S128L-P129Q-
S130A-Q206R;N76D-S78P-S87R-G118R-S128L-P
129Q-S130A-Q206R;N76D-S78Q-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78R-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78T-S87
R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78
V-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76
D-S78C-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206
S;N76D-S78E-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A
-Q206S;N76D-S78H-S87R-G118R-S128L-P129Q-
S130A-Q206S;N76D-S78M-S87R-G118R-S128L-P
129Q-S130A-Q206S;N76D-S78W-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-Q206S;N76D-S78C-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S78E-S87
R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S78
H-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;N76
D-S78I-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206
Y;N76D-S78K-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A
-Q206Y;N76D-S78L-S87R-G118R-S128L-P129Q-
S130A-Q206Y;N76D-S78M-S87R-G118R-S128L-P
129Q-S130A-Q206Y;N76D-S78Q-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S78R-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S78T-S87
R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S78
W-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;N76
D-S78Y-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206
Y;N76D-S78H-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A
-Q206A;N76D-S78H-S87R-G118R-S128L-P129Q-
S130A-Q206D;N76D-S78I-S87R-G118R-S128L-P
129Q-S130A-Q206D;N76D-S78L-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78P-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78C-S87
R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206A;N76D-S78
Q-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206A;N76
D-S78A-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206
D;N76D-S78C-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A
-Q206D;N76D-S78E-S87R-G118R-S128L-P129Q-
S130A-Q206D;N76D-S78G-S87R-G118R-S128L-P
129Q-S130A-Q206D;N76D-S78M-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78M-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206H;N76D-S78A-S87
R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206H;N76D-S78
H-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;S3V
-S24R-N76D-S78N-S87D-G118R-Y209W-H249R;S
3V-N76D-S78N-S87D-G118R-Y209W-H249R;S3I-
N43Y-L82D-G127S-S216Y-L217K-S256P;G127S-
S216Y;S3V-I8V-P40E-N76D-S87D-G118R-S128R
-A215K-N261I;S3V-I8V-P40E-N76D-G118R-S12
8R-P210I-N261I;S3V-P40E-N76D-S87D-G118R-
S128R-P210I-L217K;S3V-N76D-G118R-S128R;S
3V-N76D-S87D-G118R-S128R;S3V-N76D-G118R-
S128R-P210I;S3V-N76D-G118R-S128R-N261I;S
3V-P40E-N76D-G118R;S3V-P40E-N76D-G118R-S
128R;S3V-I8V-P40E-N76D-G118R-S128R;S3V-P
40E-N76D-S87D-G118R-S128R;S3V-P40E-N76D-
G118R-S128R-S160Q;S3V-P40E-N76D-G118R-S1
28R-P210I;S3V-P40E-N76D-G118R-S128R-G211
P;S3V-P40E-N76D-G118R-S128R-A215K;S3V-P4
0E-N76D-G118R-S128R-L217K;S3V-P40E-N76D-
G118R-S128R-N261I;S3V-P40E-N76D-G118R-S1
28R-L262Q;S3V-I8V-P40E-N76D-G118R;S3V-P4
0E-N76D-S87D-G118R;S3V-P40E-N76D-G118R-S
160Q;S3V-P40E-N76D-G118R-Q206Y;S3V-P40E-
N76D-G118R-P210I;S3V-P40E-N76D-G118R-G21
1P;S3V-P40E-N76D-G118R-A215;S3V-P40E-N76
D-G118R-L217K;S3V-P40E-N76D-G118R-N261I;
S3V-P40E-N76D-G118R-L262Q;S3V-N76D-G118R
-S128R-G211P;S3V-N76D-G118R-S128R-L262Q;
T22W-N76D-S78N-S87R-G118R-S128R-P129Q-S1
30A-V147I-A194P-A215V-E271D;N76D-S78N-S8
7R-G118R-S128R-P129Q-S130A;N76D-S78N-S87
R-G118R-S128R-P129Q-S130A-V147I-A194P-A2
15V;N76D-S78N-S87R-G118R-S128R-P129Q-S13
0A-V147I-A194P-E271D;T22W-N76D-S78N-S87R
-G118R-S128R-P129Q-S130A-A215V-E271D;T22
W-N76D-S78N-S87R-G118R-S128R-P129Q-S130A
-A194P-E271D;P40E-N76D-S78G-G118R-S128R-
Q206Y-L262Q;S3V-P40E-N76D-G118R-G211P-L2
17K-N261I;I8V-P40E-N76D-S78G-G118R-Q206Y
-L217K;S3V-I8V-N76D-S78G-S87D-G118R-P210
I-A215K-N252I;S3V-P40E-N76D-G118R-S160Q-
P210I-L217K-N261I;I8V-N76D-S78G-G118R-S1
60Q-Q206Y-N252I-N261I;I8V-P40E-N76D-G118
R-P210I-A215K-N261I;I8V-P40E-N76D-S78G-G
118R-Q206Y-P210I-A215K-N261I;S3V-N76D-G1
18R-S160Q-G211P-A215V-L262Q;S3V-N76D-S87
D-G118R-S128R-P210I-G211P-N261I-L262Q;S3
V-P40E-N76D-G118R-Q206Y-P210I-G211P-A215
K-N261I;I8V-P40E-N76D-S78G-G118R-G211P-L
217K-N252I-N261I;S3V-P40E-N76D-S87D-G118
R-S128R-P210I-L217K-N261I;S3V-P40E-N76D-
G118R-S160Q-P210I-W241K-L262Q;I8V-N76D-S
78G-G118R-P210I-A215V-N261I;N76D-S78G-S8
7D-G118R-P210I-A215V-L217K-N261I-L262Q;S
3V-P40E-N76D-S78G-G118R-Q206Y-L217K;S3V-
P40E-N76D-S78G-G118R-S128L-P129Q-S130A-L
217K;S3V-P40E-N76D-S78G-G118R-S128L-P129
Q-S130A-Q206Y-P210I-A215V-L217K;N76D-S78
N-S87D-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;S3V
-P40E-N76D-S78G-G118R-S128L-P129Q-S130A-
A215K-N261I;S3V-N76D-S87D-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-P210I-L217K;N76D-S87R-G118R-S1
28K-V150T-L217K;N76D-S78N-S87R-G118R-S12
8K-V150T-L217K;N76D-S78N-S87R-G118R-S128
K-V150T;S3V-N76D-S78G-S87D-G118A-S166N-A
194P-Q206M-P210I-N218S-N248D-N261I-L262Q
;S3V-N76D-S78G-S87T-S101Q-G118A-S130Q-S1
66N-A194P-P210I-N218S-N248D-S256P-N261I;
S3V-N76D-S78G-S87D-S101Q-G118A-Q206M-P21
0I-L217K-N218S-M222Q-N248D-S256P;およびS24L
-N76D-S78N-S87D-A88S-G118R-Q206Y-Y209W-H
249Rから選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む、単離されたスブチリシン変異
体に関する;ここで、前記変異体はタンパク質分解活性を有し、前記変異体の各アミノ酸
の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillu
s amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’配列の、対応するアミ
ノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミノ
酸配列とのアラインメントにより決定されるものである。
【0076】
またさらに他の実施形態は、N76D-S78N-S87R-S103P-G118R
-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-
G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-N243S;N76D
-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L
-H249R;N18R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P
129Q-S130A-Q206L;N18R-N76D-S78N-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;N18R-S2
4R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206L-H249N;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-S
99N-G118R-S128L-P129Q-S130A-A158T-Q206L-
I246V-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-K235T;N18R-S2
4R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206L-A270T;N18R-S24R-N76D-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-H249R;N76D-S78N-S87R-G
118R-S128L-P129Q-S130A;N18R-S24R-N76D-S7
8N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-H249R;N7
6D-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N7
6D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6L;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206L-H249R;N76D-S78N-S87R-G
118R-S128L-P129Q-S130A-M222Q;S3V-N76D-S7
8N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N7
6D-S78N-S87R-S101V-G118R-S128L-P129Q-S13
0A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-G127T-S128
L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R
-S128L-P129Q-S130A-Q206L-S212D;N76D-S78N
-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-S166D-Q206
L;S3V-N76D-S78N-S87R-S101G-S103A-V104I-G
118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S
87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-T213A;
N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q
206L-A232V-Q245R;N76D-S78N-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-G159D-S188D-Q206L-A232V-
Q245R;S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-Q206L-H249R;N18R-S24R-N76D-S78
N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;S24
R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A
-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-
S130A-Y209W;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P
129Q-S130A-Q206L-Y209W;N76D-S78N-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-M222S;S3T-N7
6D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6L;V28T-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-A108S-G118R-
S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-N
116M-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-
S78N-S87R-G118R-L124M-S128L-P129Q-S130A-
Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S
130A-V150T-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-A194D-Q206L;N76D-S78N-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-A158E-Q206L;V
28T-N76D-S78N-S87R-S101F-G118R-S128L-P12
9Q-S130A-A194D-Q206L;S24R-V28T-N43S-N76D
-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-A158E
-Q206L;S24R-V28T-N76D-S78N-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-A194D-Q206L;S24R-N76D-S7
8N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-T2
13A;N76D-S78N-S87R-S103D-G118R-S128L-P12
9Q-S130A-Q206L;S24R-V28T-N76D-S78N-S87R-
S101V-A108S-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206
L-T213A-L217K;およびS24R-N76D-S78N-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-L217Kから選択されるア
ミノ酸置換の組み合わせを含む、単離されたスブチリシン変異体に関する;ここで、前記
変異体はタンパク質分解活性を有し、前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示
されるバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amylolique
faciens)スブチリシンBPN’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号
付けされており、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメント
により決定されるものである。なおさらなる他の実施形態は、N76D-S78N-S8
7R-S103P-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N
76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q2
06L-N243S;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P12
9Q-S130A-Q206L-H249R;N18R-N76D-S78N-S87R
-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N18R-N76D
-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L
-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-Q206L-H249N;N18R-S24R-N7
6D-S78N-S87R-S99N-G118R-S128L-P129Q-S130
A-A158T-Q206L-I246V-H249R;N18R-S24R-N76D
-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L
-K235T;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-Q206L-A270T;N18R-S24R-N7
6D-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-H249R;N7
6D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A;N18
R-S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-
S130A-H249R;N76D-S87R-G118R-S128L-P129Q-
S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P
129Q-S130A-Q206L;N18R-S24R-N76D-S78N-S87
R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;N7
6D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-M22
2Q;S3V-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-
S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-S101V-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G1
18R-G127T-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S
78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-S
212D;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S1
30A-S166D-Q206L;S3V-N76D-S78N-S87R-S101G
-S103A-V104I-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206L-T213A;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L
-P129Q-S130A-Q206L-A232V-Q245R;N76D-S78N
-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-G159D-S188
D-Q206L-A232V-Q245R;S24R-N76D-S78N-S87R-
G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;N18R
-S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S
130A-Q206L;S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S12
8L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118
R-S128L-P129Q-S130A-Y209W;N76D-S78N-S87R
-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-Y209W;N76
D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206
L-M222S;S3T-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P
129Q-S130A-Q206L;V28T-N76D-S78N-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87
R-A108S-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N7
6D-S78N-S87R-N116M-G118R-S128L-P129Q-S13
0A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-L124M-S128
L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R
-S128L-P129Q-S130A-V150T-Q206L;N76D-S78N
-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-A194D-Q206
L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A
-A158E-Q206L;V28T-N76D-S78N-S87R-S101F-G
118R-S128L-P129Q-S130A-A194D-Q206L;S24R-
V28T-N43S-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P12
9Q-S130A-A158E-Q206L;S24R-V28T-N76D-S78N
-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-A194D-Q206
L;S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-
S130A-Q206L-T213A;N76D-S78N-S87R-S103D-G
118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;S24R-V28T-N
76D-S78N-S87R-S101V-A108S-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-Q206L-T213A-L217K;S24R-N76D-S7
8N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-L2
17K;S3V-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A;S3V-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P1
29Q-S130A-Y209W;N76D-S78G-S87R-G118R-S12
8L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78G-S87R-G118
R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;S3V-N76D-S78G-
S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;S3V-N
76D-S78G-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q2
06M;S3V-N76D-S78G-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P
129Q-S130A-Q206F;N76D-S78N-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78N-S87R-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;S3V-N76D-S78N
-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;S3V-
N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q
206M;S3V-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129
Q-S130A-Q206Y;P40E-N76D-S87R-G118R-S128L
-P129Q-S130A;I8V-P40E-N76D-S87R-G118R-S1
28L-P129Q-S130A;P40E-N76D-S87R-G118R-S12
8L-P129Q-S130A-P210I;P40E-N76D-S87R-G118
R-S128L-P129Q-S130A-G211P;P40E-N76D-S87R
-G118R-S128L-P129Q-S130A-N261I;N76D-S78N
-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-P210I;N76D
-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Y209W
-L262Q;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-
S130A-P210I-L262Q;N76D-S78N-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-V147I-A194P-A215V-E271D
;T22W-N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S
130A-V147I-A194P-A215V;T22W-N76D-S78N-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-V147I-A215V-E
271D;N76D-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-L
217K;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S1
30A-L217K;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P12
9Q-S130A-V150T;N76D-S78G-S87R-G118R-S128
L-P129Q-S130A-P210L;N76D-S87R-E89H-G118R
-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;S3V-N76D-S87R-E
89H-G118R-S128L-P129Q-S130A-P210L;N76D-S
78Q-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;N
76D-S78T-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q2
06D;N76D-S78V-S87R-G118R-S128L-P129Q-S13
0A-Q206D;N76D-S78W-S87R-G118R-S128L-P129
Q-S130A-Q206D;N76D-S78Y-S87R-G118R-S128L
-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78A-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78C-S87R-G
118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78E-S
87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S
78F-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N
76D-S78H-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q2
06F;N76D-S78K-S87R-G118R-S128L-P129Q-S13
0A-Q206F;N76D-S78L-S87R-G118R-S128L-P129
Q-S130A-Q206F;N76D-S78M-S87R-G118R-S128L
-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78Q-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78T-S87R-G
118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S78W-S
87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N76D-S
78Y-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206F;N
76D-S78C-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q2
06G;N76D-S78M-S87R-G118R-S128L-P129Q-S13
0A-Q206G;N76D-S78C-S87R-G118R-S128L-P129
Q-S130A-Q206H;N76D-S78E-S87R-G118R-S128L
-P129Q-S130A-Q206H;N76D-S78F-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-Q206H;N76D-S78G-S87R-G
118R-S128L-P129Q-S130A-Q206H;N76D-S78H-S
87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206H;N76D-S
78L-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206H;N
76D-S78T-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q2
06H;N76D-S78V-S87R-G118R-S128L-P129Q-S13
0A-Q206H;N76D-S78A-S87R-G118R-S128L-P129
Q-S130A-Q206M;N76D-S78C-S87R-G118R-S128L
-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78E-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78F-S87R-G
118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78G-S
87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S
78I-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N
76D-S78K-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q2
06M;N76D-S78L-S87R-G118R-S128L-P129Q-S13
0A-Q206M;N76D-S78M-S87R-G118R-S128L-P129
Q-S130A-Q206M;N76D-S78Q-S87R-G118R-S128L
-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78R-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78T-S87R-G
118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S78V-S
87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N76D-S
78Y-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206M;N
76D-S78A-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q2
06N;N76D-S78C-S87R-G118R-S128L-P129Q-S13
0A-Q206N;N76D-S78E-S87R-G118R-S128L-P129
Q-S130A-Q206N;N76D-S78G-S87R-G118R-S128L
-P129Q-S130A-Q206N;N76D-S78H-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-Q206N;N76D-S78I-S87R-G
118R-S128L-P129Q-S130A-Q206N;N76D-S78L-S
87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206N;N76D-S
78M-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206N;N
76D-S78Q-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q2
06N;N76D-S78R-S87R-G118R-S128L-P129Q-S13
0A-Q206P;N76D-S78W-S87R-G118R-S128L-P129
Q-S130A-Q206P;N76D-S78A-S87R-G118R-S128L
-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78C-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78E-S87R-G
118R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78F-S
87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S
78G-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N
76D-S78H-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q2
06R;N76D-S78I-S87R-G118R-S128L-P129Q-S13
0A-Q206R;N76D-S78L-S87R-G118R-S128L-P129
Q-S130A-Q206R;N76D-S78M-S87R-G118R-S128L
-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78P-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78Q-S87R-G
118R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S78R-S
87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N76D-S
78T-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206R;N
76D-S78V-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q2
06R;N76D-S78C-S87R-G118R-S128L-P129Q-S13
0A-Q206S;N76D-S78E-S87R-G118R-S128L-P129
Q-S130A-Q206S;N76D-S78H-S87R-G118R-S128L
-P129Q-S130A-Q206S;N76D-S78M-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-Q206S;N76D-S78W-S87R-G
118R-S128L-P129Q-S130A-Q206S;N76D-S78C-S
87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S
78E-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;N
76D-S78H-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q2
06Y;N76D-S78I-S87R-G118R-S128L-P129Q-S13
0A-Q206Y;N76D-S78K-S87R-G118R-S128L-P129
Q-S130A-Q206Y;N76D-S78L-S87R-G118R-S128L
-P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S78M-S87R-G118R-
S128L-P129Q-S130A-Q206;N76D-S78Q-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S78R-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;N76D-S7
8T-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;N7
6D-S78W-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6Y;N76D-S78Y-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206Y;N76D-S78H-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206A;N76D-S78H-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78I-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78L-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78P-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S7
8C-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206A;N7
6D-S78Q-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6A;N76D-S78A-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130
A-Q206D;N76D-S78C-S87R-G118R-S128L-P129Q
-S130A-Q206D;N76D-S78E-S87R-G118R-S128L-
P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78G-S87R-G118R-S
128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78M-S87R-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206D;N76D-S78M-S8
7R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206H;N76D-S7
8A-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206H;およ
びN76D-S78H-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-
Q206Mから選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む、単離されたスブチリシン変
異体に関する;ここで、前記変異体はタンパク質分解活性を有し、前記変異体の各アミノ
酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacill
us amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’配列の、対応するア
ミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミ
ノ酸配列とのアラインメントにより決定されるものである。
【0077】
他の実施形態は、N18R-S24R-N76D-S78N-H249R;N18R-
S24R-N76D-S78N-S87R-H249R;N18R-S24R-N76D
-S78N-Q206L-H249R;S24F-S78N-G118R-S166D;
T22L-S24F-S78N-G118R-S166D-T213A;S24R-N7
6D-S87R-Q206Y-T213A-M222Q-H249R;S24R-N76
D-S78N-S87D-G118R-Y209W-M222Q-H249R;S87D
-Q206L-Y209W-T213A-H249R;S24R-N76D-S78N-
S87R-G118R-Q206L-M222Q;S24R-N76D-S78N-Q2
06L-M222Q;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P12
9Q-Q206L-M222Q;N76D-S78N-S87R-G118R-P129
Q-Q206L-M222Q;N76D-S78N-S87R-G118R-S130A
-Q206L-M222Q;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-
P129Q-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-S
130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-Q2
06L;N76D-S78N-S87R-G118R-P129Q-Q206L;N76
D-S78N-S87R-G118R-S130A-Q206L;N76D-S78N-
S87R-G118R-Q206L-M222Q;N76D-S78N-S87R-G1
18R-Q206L;S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-Y209
W-M222Q;S24R-N43R-N76D-S78N-S87R-G118R-Y
209W-M222Q;G20R-S24R-N43R-N76D-S78N-S87R
-G118R-Y209W-M222Q;G20R-N43R-N76D-S78N-S
87R-G118R-Y209W-M222Q;S24R-N76D-S78N-S87
R-G118R-Q206L-Y209W-T213A-M222Q;S24R-N76
D-S78N-S87R-G118R-Q206L-T213A-M222Q;S24R
-N76D-S78N-S87R-G118R-Y209W-T213A-M222Q;
S24R-N76D-S78N-S87R-N116L-G118R-Y209W-M2
22Q;G20R-S24R-N43R-N76D-S78N-S87R-N116L-
G118R-Y209W-M222Q;N18R-N76D-S87R-S128L-P
129Q-S130A-Q206L-Y209W-H249R;N18R-S87D-S
166N-Q206L-Y209W;N18R-S24R-N76D-S78N-S87
R-G118R-G127T-Y209W-T213A;N18R-S24R-S166
D-Q206Y-H249R;S24R-S78N-S87R-S166D-Q206L
-Y209W-H249R;N76D-S78N-S87R-S101G-S103A-
V104I-G118R-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-G
127T-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-G127T-P1
29Q-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-G127T-P12
9Q-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-S101G-S103
A-V104I-G118R-G127T-P129R-Q206L;S3V-S24R
-N76D-S78N-S87D-G118R-Y209W-M222Q-H249R;
S24R-N76D-S78N-S87D-S101V-G118R-Y209W-M2
22Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-S101G-S103
A-V104I-G118R-Y209W-M222Q-H249R;S24R-N76
D-S78N-S87D-G118R-Y209W-S212D-M222Q-H249
R;S3V-S24R-N76D-S78N-S87D-S101G-S103A-V1
04I-G118R-Y209W-M222Q-H249R;S24R-N76D-S7
8N-S87D-S101G-S103A-V104I-G118R-G127T-Y2
09W-T213A-M222Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S87
D-S101G-S103A-V104I-G118R-Y209W-M222Q-A2
32V-Q245R-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-S101
G-S103A-V104I-G118R-Y209W-H249R;S3V-S24R
-N76D-S78N-S87D-S101G-S103A-V104I-G118R-
Y209W-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-S101G-S1
03A-V104I-G118R-G127T-Y209W-T213A-H249R;
S24R-N76D-S78N-S87D-S101T-G118R-Y209W-M2
22Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-S101H-G118
R-Y209W-M222Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-
G118R-P129Q-Y209W-M222Q-H249R;N76D-S78N-
S87D-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;S24R-
N76D-S78N-S87D-G118R-Y209W-H249R;S24R-N7
6D-S78N-S87R-G118R-Y209W-M222Q-H249R;N76
D-S87R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-Y209W-H24
9R;N76D-S87R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-Y20
9W;S24R-N76D-S78N-S87D-G118R-Y209W-M222S
-H249R;N76D-S78N-S87D-G118R-Y209W-H249R;
N76D-S78N-S87D-G118R-Y209W-M222S-H249R;S
24R-N76D-S78N-S87D-G118R-M222Q-H249R;S24
R-N76D-S78N-S87D-G118R-S128L-P129Q-S130A
-Q206L-T213A;S24R-V28T-N76D-S78N-S87D-S1
01V-A108S-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;
S24R-V28T-N76D-S78N-S87D-S101V-N116M-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-A158E-Q206L;S3V-S24
R-N76D-S78N-S87R-G100S-S101V-G118R-Q206L
-L217K;N76D-N77D-S78N-S87R-G118R-Q206L-T
213A;S24R-N76D-S78N-S87D-G100S-S101V-N11
6M-G118R-L124M-S128L-P129Q-S130A-A194D-Q
206L;S24R-V28T-N76D-S78N-S87R-G118V-S128
L-P129Q-S130A-Q206L-T213A-L217K;S3V-S24R
-N76D-S78N-S87D-G118R-Y209W-H249R;S3V-N7
6D-S78N-S87D-G118R-Y209W-H249R;S3I-N43Y-
L82D-G127S-S216Y-L217K-S256P;G127S-S216Y
;S3V-I8V-P40E-N76D-S87D-G118R-S128R-A215
K-N261I;S3V-I8V-P40E-N76D-G118R-S128R-P2
10I-N261I;S3V-P40E-N76D-S87D-G118R-S128R
-P210I-L217K;S3V-N76D-G118R-S128R;S3V-N7
6D-S87D-G118R-S128R;S3V-N76D-G118R-S128R
-P210I;S3V-N76D-G118R-S128R-N261I;S3V-P4
0E-N76D-G118R;S3V-P40E-N76D-G118R-S128R;
S3V-I8V-P40E-N76D-G118R-S128R;S3V-P40E-N
76D-S87D-G118R-S128R;S3V-P40E-N76D-G118R
-S128R-S160Q;S3V-P40E-N76D-G118R-S128R-P
210I;S3V-P40E-N76D-G118R-S128R-G211P;S3V
-P40E-N76D-G118R-S128R-A215K;S3V-P40E-N7
6D-G118R-S128R-L217K;S3V-P40E-N76D-G118R
-S128R-N261I;S3V-P40E-N76D-G118R-S128R-L
262Q;S3V-I8V-P40E-N76D-G118R;S3V-P40E-N7
6D-S87D-G118R;S3V-P40E-N76D-G118R-S160Q;
S3V-P40E-N76D-G118R-Q206Y;S3V-P40E-N76D-
G118R-P210I;S3V-P40E-N76D-G118R-G211P;S3
V-P40E-N76D-G118R-A215K;S3V-P40E-N76D-G1
18R-L217K;S3V-P40E-N76D-G118R-N261I;S3V-
P40E-N76D-G118R-L262Q;S3V-N76D-G118R-S12
8R-G211P;S3V-N76D-G118R-S128R-L262Q;T22W
-N76D-S78N-S87R-G118R-S128R-P129Q-S130A-
V147I-A194P-A215V-E271D;N76D-S78N-S87R-G
118R-S128R-P129Q-S130A;N76D-S78N-S87R-G1
18R-S128R-P129Q-S130A-V147I-A194P-A215V;
N76D-S78N-S87R-G118R-S128R-P129Q-S130A-V
147I-A194P-E271D;T22W-N76D-S78N-S87R-G11
8R-S128R-P129Q-S130A-A215V-E271D;T22W-N7
6D-S78N-S87R-G118R-S128R-P129Q-S130A-A19
4P-E271D;P40E-N76D-S78G-G118R-S128R-Q206
Y-L262Q;S3V-P40E-N76D-G118R-G211P-L217K-
N261I;I8V-P40E-N76D-S78G-G118R-Q206Y-L21
7K;S3V-I8V-N76D-S78G-S87D-G118R-P210I-A2
15K-N252I;S3V-P40E-N76D-G118R-S160Q-P210
I-L217K-N261I;I8V-N76D-S78G-G118R-S160Q-
Q206Y-N252I-N261I;I8V-P40E-N76D-G118R-P2
10I-A215K-N261I;I8V-P40E-N76D-S78G-G118R
-Q206Y-P210I-A215K-N261I;S3V-N76D-G118R-
S160Q-G211P-A215V-L262Q;S3V-N76D-S87D-G1
18R-S128R-P210I-G211P-N261I-L262Q;S3V-P4
0E-N76D-G118R-Q206Y-P210I-G211P-A215K-N2
61I;I8V-P40E-N76D-S78G-G118R-G211P-L217K
-N252I-N261I;S3V-P40E-N76D-S87D-G118R-S1
28R-P210I-L217K-N261I;S3V-P40E-N76D-G118
R-S160Q-P210I-W241K-L262Q;I8V-N76D-S78G-
G118R-P210I-A215V-N261I;N76D-S78G-S87D-G
118R-P210I-A215V-L217K-N261I-L262Q;S3V-P
40E-N76D-S78G-G118R-Q206Y-L217K;S3V-P40E
-N76D-S78G-G118R-S128L-P129Q-S130A-L217K
;S3V-P40E-N76D-S78G-G118R-S128L-P129Q-S1
30A-Q206Y-P210I-A215V-L217K;N76D-S78N-S8
7D-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;S3V-P40
E-N76D-S78G-G118R-S128L-P129Q-S130A-A215
K-N261I;S3V-N76D-S87D-G118R-S128L-P129Q-
S130A-P210I-L217K;N76D-S87R-G118R-S128K-
V150T-L217K;N76D-S78N-S87R-G118R-S128K-V
150T-L217K;N76D-S78N-S87R-G118R-S128K-V1
50T;S3V-N76D-S78G-S87D-G118A-S166N-A194P
-Q206M-P210I-N218S-N248D-N261I-L262Q;S3V
-N76D-S78G-S87T-S101Q-G118A-S130Q-S166N-
A194P-P210I-N218S-N248D-S256P-N261I;S3V-
N76D-S78G-S87D-S101Q-G118A-Q206M-P210I-L
217K-N218S-M222Q-N248D-S256P;S24L-N76D-S
78N-S87D-A88S-G118R-Q206Y-Y209W-H249R;N1
8R-S87R-G118R-S166N-N204D-Q206L-Y209W;N1
8R-S24R-L42I-G118R-Y209W-T213A-M222Q-H24
9R;N18R-S24R-Y209W-T213A-H249R;N18R-S24R
-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y-Y209
W-T213A-H249R;S24R-S87D-G118R-Y209W-T213
A-H249R;S9G-N18R-S24R-N76D-G118R-S166N-Q
206L-H249R;N18R-G118R-Q206L-Y209W-T213A-
M222Q-H249R;S24R-S87R-S166N;N18R-S24R-S8
7R-Q206L-Y209W-T213A;N18R-S24R-G118R-A15
8V-Y209W;N18R-S24R-S87D-Q206L-Y209W-M222
Q-H249R;N18R-S24R-S87R-G127T;S24R-S166N-
Y209W-T213A;N76D-S78N-G118R-Y209W-H249R;
N18R-N76D-S78N-S87R-Q206L-Y209W-H249R-S2
59G;N18R-S24R-S87D-N185Y-Q206L-Y209W-T21
3A-M222Q-H249R;S24R-G118R-G127T-Y209W;A1
V-N18R-S24R-S56P-G127T-Q206L-Y209W;S87R-
Y209W;N18R-S87D-Y209W-M222Q-H249R;N18R-S
24R-G118R-S128L-P129Q-S130A-S166D-Y209W-
T213A;S87D-S166D-T213A-H249R;N18R-S24P-S
87D-S166N-Q206L-Y209W-M222Q-H249R;N76D-S
166N-Y209W-T213A-H249R;S24R-Q206L-Y209W-
T213A-M222Q-H249R;N18R-G118R-Q206L-Y209W
N18R-S24R-S166D-Q206Y-H249R-A254T;N18R-S
24R-S78N-Q206L-Y209W-T213A-M222Q-H249R;N
18R-S24R-G118R-G127T-Y209W;S24R-N76D-G11
8R-S166N-Q206L-Y209W;S24R-N76D-S87R-Y209
W-T213A-M222Q-H249R;N18K-S87R-Y209W-T213
A-M222Q-H249R;N18R-S24R-S87R-Y209W;N18R-
S78N-G118R-Y209W-T213A-M222Q-H249R-A270P
;N18R-S166N-Y209W-T213A-M222Q;S24R-N76D-
S78N-S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;N18R-
S24R-N76D-S78N-S128L-P129Q-S130A-Q206L-H
249R;N76D-S78N-G118R-Q206L-H249R;N18R-I4
4V-N76D-S78N-S87R-S128L-P129Q-S130A-Q206
L-H249R;N18R-N76D-S78N-S87R-Q206L-H249R;
N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-S128L-P129Q-S13
0A-Q206L;N76D-S78N-G118R-Q206L;A16T-N18R
-S24R-N76D-S78N-G118R-S128L-P129Q-S130A-
Q206L;S24R-N76D-S78N-Q206L-H249R;S24R-N7
6D-S78N-S87R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N18
R-N76D-S78N-S87R-S128L-P129Q-S130A-Q206L
;N18R-S24R-N76D-S78N-S128L-P129Q-S130A;S
24R-N76D-S78N-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-
G118R-S128L-P129Q-S130A-H249R;N18R-S24R-
N76D-S78N-M222Q-H249R;N76D-S78N-S87R-Q20
6L-H249R;N18R-N76D-S78N-Q206L-H249R;N18R
-S24R-N76D-S78N-G118R-Q206L-K251R;N76D-S
78N-Q206L-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R
-Q206L;N18R-S24R-N76D-S78N-G118R-S128L-P
129Q-S130A;N76D-S78N-H120R-Q206L-H249R;N
18R-N76D-S78N-S87R-S128L-P129Q-S130A-Q20
6L-H249R;N18R-G20E-N76D-S78N-G118R-H249R
;S24R-N76D-S78N-G118R-S128L-P129Q-S130A;
N76D-S78N-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-
H249R;S24R-N76D-S78N-G118R-Q206L;N18R-N7
6D-S78N-S128L-P129Q-S130A-Q206L-V268A;およ
びN18R-N76D-S78N-S87R-Q206L-N218S-M222Q-H
249Rから選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む、単離されたスブチリシン変異
体に関する;ここで、前記変異体はタンパク質分解活性を有し、前記変異体の各アミノ酸
の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillu
s amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’配列の、対応するアミ
ノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミノ
酸配列とのアラインメントにより決定されるものである。さらなる実施形態は、N18R
-S24R-N76D-S78N-H249R;N18R-S24R-N76D-S78
N-S87R-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-Q206L-H
249R;S24F-S78N-G118R-S166D;T22L-S24F-S78
N-G118R-S166D-T213A;S24R-N76D-S87R-Q206Y
-T213A-M222Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-G
118R-Y209W-M222Q-H249R;S87D-Q206L-Y209W-
T213A-H249R;S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-Q2
06L-M222Q;S24R-N76D-S78N-Q206L-M222Q;N76
D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-Q206L-M222
Q;N76D-S78N-S87R-G118R-P129Q-Q206L-M222Q
;N76D-S78N-S87R-G118R-S130A-Q206L-M222Q;
N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-Q206L;N
76D-S78N-S87R-G118R-S128L-S130A-Q206L;N7
6D-S78N-S87R-G118R-S128L-Q206L;N76D-S78N
-S87R-G118R-P129Q-Q206L;N76D-S78N-S87R-G
118R-S130A-Q206L;N76D-S78N-S87R-G118R-Q2
06L-M222Q;N76D-S78N-S87R-G118R-Q206L;S24
R-N76D-S78N-S87R-G118R-Y209W-M222Q;S24R-
N43R-N76D-S78N-S87R-G118R-Y209W-M222Q;G2
0R-S24R-N43R-N76D-S78N-S87R-G118R-Y209W-
M222Q;G20R-N43R-N76D-S78N-S87R-G118R-Y20
9W-M222Q;S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-Q206L
-Y209W-T213A-M222Q;S24R-N76D-S78N-S87R-G
118R-Q206L-T213A-M222Q;S24R-N76D-S78N-S8
7R-G118R-Y209W-T213A-M222Q;S24R-N76D-S78
N-S87R-N116L-G118R-Y209W-M222Q;G20R-S24R
-N43R-N76D-S78N-S87R-N116L-G118R-Y209W-M
222Q;N18R-N76D-S87R-S128L-P129Q-S130A-Q2
06L-Y209W-H249R;N18R-S87D-S166N-Q206L-Y2
09W;N18R-S24R-N76D-S78N-S87R-G118R-G127T
-Y209W-T213A;N18R-S24R-S166D-Q206Y-H249R
;S24R-S78N-S87R-S166D-Q206L-Y209W-H249R;
N76D-S78N-S87R-S101G-S103A-V104I-G118R-Q
206L;N76D-S78N-S87R-G118R-G127T-Q206L;N7
6D-S78N-S87R-G118R-G127T-P129Q-Q206L;N76
D-S78N-S87R-G118R-G127T-P129Q-S130A-Q206
L;N76D-S78N-S87R-S101G-S103A-V104I-G118R
-G127T-P129R-Q206L;S3V-S24R-N76D-S78N-S8
7D-G118R-Y209W-M222Q-H249R;S24R-N76D-S78
N-S87D-S101V-G118R-Y209W-M222Q-H249R;S24
R-N76D-S78N-S87D-S101G-S103A-V104I-G118R
-Y209W-M222Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-G
118R-Y209W-S212D-M222Q-H249R;S3V-S24R-N7
6D-S78N-S87D-S101G-S103A-V104I-G118R-Y20
9W-M222Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-S101G
-S103A-V104I-G118R-G127T-Y209W-T213A-M22
2Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-S101G-S103A
-V104I-G118R-Y209W-M222Q-A232V-Q245R-H24
9R;S24R-N76D-S78N-S87D-S101G-S103A-V104I
-G118R-Y209W-H249R;S3V-S24R-N76D-S78N-S8
7D-S101G-S103A-V104I-G118R-Y209W-H249R;S
24R-N76D-S78N-S87D-S101G-S103A-V104I-G11
8R-G127T-Y209W-T213A-H249R;S24R-N76D-S78
N-S87D-S101T-G118R-Y209W-M222Q-H249R;S24
R-N76D-S78N-S87D-S101H-G118R-Y209W-M222Q
-H249R;S24R-N76D-S78N-S87D-G118R-P129Q-Y
209W-M222Q-H249R;N76D-S78N-S87D-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-Q206L;S24R-N76D-S78N-S87
D-G118R-Y209W-H249R;S24R-N76D-S78N-S87R-
G118R-Y209W-M222Q-H249R;N76D-S87R-S128L-
P129Q-S130A-Q206L-Y209W-H249R;N76D-S87R-
S128L-P129Q-S130A-Q206L-Y209W;S24R-N76D-
S78N-S87D-G118R-Y209W-M222S-H249R;N76D-S
78N-S87D-G118R-Y209W-H249R;N76D-S78N-S87
D-G118R-Y209W-M222S-H249R;S24R-N76D-S78N
-S87D-G118R-M222Q-H249R;S24R-N76D-S78N-S
87D-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206L-T213A;
S24R-V28T-N76D-S78N-S87D-S101V-A108S-G11
8R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;S24R-V28T-N76
D-S78N-S87D-S101V-N116M-G118R-S128L-P129
Q-S130A-A158E-Q206L;S3V-S24R-N76D-S78N-S
87R-G100S-S101V-G118R-Q206L-L217K;N76D-N
77D-S78N-S87R-G118R-Q206L-T213A;S24R-N76
D-S78N-S87D-G100S-S101V-N116M-G118R-L124
M-S128L-P129Q-S130A-A194D-Q206L;S24R-V28
T-N76D-S78N-S87R-G118V-S128L-P129Q-S130A
-Q206L-T213A-L217K;N18R-S87R-G118R-S166N
-N204D-Q206L-Y209W;N18R-S24R-L42I-G118R-
Y209W-T213A-M222Q-H249R;N18R-S24R-Y209W-
T213A-H249R;N18R-S24R-S87R-G118R-S128L-P
129Q-S130A-Q206Y-Y209W-T213A-H249R;S24R-
S87D-G118R-Y209W-T213A-H249R;S9G-N18R-S2
4R-N76D-G118R-S166N-Q206L-H249R;N18R-G11
8R-Q206L-Y209W-T213A-M222Q-H249R;S24R-S8
7R-S166N;N18R-S24R-S87R-Q206L-Y209W-T213
A;N18R-S24R-G118R-A158V-Y209W;N18R-S24R-
S87D-Q206L-Y209W-M222Q-H249R;N18R-S24R-S
87R-G127T;S24R-S166N-Y209W-T213A;N76D-S7
8N-G118R-Y209W-H249R;N18R-N76D-S78N-S87R
-Q206L-Y209W-H249R-S259G;N18R-S24R-S87D-
N185Y-Q206L-Y209W-T213A-M222Q-H249R;S24R
-G118R-G127T-Y209W;A1V-N18R-S24R-S56P-G1
27T-Q206L-Y209W;S87R-Y209W;N18R-S87D-Y20
9W-M222Q-H249R;N18R-S24R-G118R-S128L-P12
9Q-S130A-S166D-Y209W-T213A;S87D-S166D-T2
13A-H249R;N18R-S24P-S87D-S166N-Q206L-Y20
9W-M222Q-H249R;N76D-S166N-Y209W-T213A-H2
49R;S24R-Q206L-Y209W-T213A-M222Q-H249R;N
18R-G118R-Q206L-Y209W;N18R-S24R-S166D-Q2
06Y-H249R-A254T;N18R-S24R-S78N-Q206L-Y20
9W-T213A-M222Q-H249R;N18R-S24R-G118R-G12
7T-Y209W;S24R-N76D-G118R-S166N-Q206L-Y20
9W;S24R-N76D-S87R-Y209W-T213A-M222Q-H249
R;N18K-S87R-Y209W-T213A-M222Q-H249R;N18R
-S24R-S87R-Y209W;N18R-S78N-G118R-Y209W-T
213A-M222Q-H249R-A270P;N18R-S166N-Y209W-
T213A-M222Q;S24R-N76D-S78N-S128L-P129Q-S
130A-Q206L-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-S12
8L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;N76D-S78N-G11
8R-Q206L-H249R;N18R-I44V-N76D-S78N-S87R-
S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;N18R-N76D-
S78N-S87R-Q206L-H249R;N18R-S24R-N76D-S78
N-S87R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;N76D-S78N
-G118R-Q206L;A16T-N18R-S24R-N76D-S78N-G1
18R-S128L-P129Q-S130A-Q206L;S24R-N76D-S7
8N-Q206L-H249R;S24R-N76D-S78N-S87R-S128L
-P129Q-S130A-Q206L;N18R-N76D-S78N-S87R-S
128L-P129Q-S130A-Q206L;N18R-S24R-N76D-S7
8N-S128L-P129Q-S130A;S24R-N76D-S78N-H249
R;N18R-S24R-N76D-S78N-G118R-S128L-P129Q-
S130A-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-M222Q-H2
49R;N76D-S78N-S87R-Q206L-H249R;N18R-N76D
-S78N-Q206L-H249R;N18R-S24R-N76D-S78N-G1
18R-Q206L-K251R;N76D-S78N-Q206L-H249R;N1
8R-S24R-N76D-S78N-S87R-Q206L;N18R-S24R-N
76D-S78N-G118R-S128L-P129Q-S130A;N76D-S7
8N-H120R-Q206L-H249R;N18R-N76D-S78N-S87R
-S128L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;N18R-G20E
-N76D-S78N-G118R-H249R;S24R-N76D-S78N-G1
18R-S128L-P129Q-S130A;N76D-S78N-G118R-S1
28L-P129Q-S130A-Q206L-H249R;S24R-N76D-S7
8N-G118R-Q206L;N18R-N76D-S78N-S128L-P129
Q-S130A-Q206L-V268A;およびN18R-N76D-S78N-S8
7R-Q206L-N218S-M222Q-H249Rから選択されるアミノ酸置換の
組み合わせを含む、単離されたスブチリシン変異体に関する;ここで、前記変異体はタン
パク質分解活性を有し、前記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチル
ス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefacien
s)スブチリシンBPN’配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされてお
り、これは変異体アミノ酸配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定さ
れるものである。
【0078】
他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、V4I、S9
R、A15T、K27R、*36D、V68A、*97E、A98S、S99A/D/E
/G/V、G100A、S101D/E/M/R、V104Y/N、S106A、H12
0D/N、N123S、G160D、Y167A、R170S、G195E、V199M
、V205I、L217D、N218D、K235L、Q236H、N252K、T27
4A、および99位と100位の間に挿入されたDから選択される1つ以上の置換、挿入
および/または欠失をさらに含む;ここで、前記変異体はタンパク質分解活性を有し、前
記変異体の各アミノ酸の位置は、配列番号2で示されるバチルス・アミロリクエファシエ
ンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’
配列の、対応するアミノ酸位置にしたがって番号付けされており、これは変異体アミノ酸
配列とBPN’アミノ酸配列とのアラインメントにより決定されるものである。
【0079】
さらなる実施形態は、1種以上の単離された、組換えの、実質的に純粋な、かつ/また
は天然に存在しないスブチリシン変異体に関する。さらに他の実施形態では、本明細書に
記載の1種以上のスブチリシン変異体は、酵素活性を有する。さらに他の実施形態では、
本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、タンパク質分解活性を有する。一実
施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、配列番号1、配列番号
2または配列番号14に対して、少なくとも70、75、80、85、90、91、92
、93、94、95、96、97、98、99%以下のアミノ酸配列同一性を有する。ま
たさらに他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、配列番
号1または配列番号2に対して、少なくとも70、75、80、85、90、91、92
、93、94、95、96、97、98または99%のアミノ酸配列同一性を有する。さ
らに他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、配列番号1
に対して、少なくとも70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、
96、97、98、99、または100%未満のアミノ酸配列同一性を有する。またさら
に他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、配列番号2に
対して、少なくとも70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、9
6、97、98、99%または100%未満のアミノ酸配列同一性を有する。なおさらな
る他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、配列番号2に
対して、少なくとも70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、9
6、97、98または99%のアミノ酸配列同一性を有する。さらなる実施形態では、本
明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、配列番号14に対して、少なくとも7
0、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99
%または100%未満のアミノ酸配列同一性を有する 一実施形態では、本明細書に記載
の1種以上のスブチリシン変異体は、配列番号1、配列番号2または配列番号14に対し
て、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、
99%または100%未満のアミノ酸配列同一性を有する。他の実施形態では、本明細書
に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、配列番号1または配列番号2に対して、少な
くとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%ま
たは100%未満のアミノ酸配列同一性を有する。さらに他の実施形態では、本明細書に
記載の1種以上のスブチリシン変異体は、配列番号1に対して、少なくとも80、85、
90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%または100%未満の
アミノ酸配列同一性を有する。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上のス
ブチリシン変異体は、配列番号2に対して、少なくとも80、85、90、91、92、
93、94、95、96、97、98、99%または100%未満のアミノ酸配列同一性
を有する。またさらに他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異
体は、配列番号14に対して、少なくとも80、85、90、91、92、93、94、
95、96、97、98、99%または100%未満のアミノ酸配列同一性を有する。な
おさらに他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、配列番
号1、配列番号2または配列番号14に対して、少なくとも90、91、92、93、9
4、95、96、97、98、99%または100%未満のアミノ酸配列同一性を有する
。またさらに他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、配
列番号1または配列番号2に対して、少なくとも90、91、92、93、94、95、
96、97、98、99%または100%未満のアミノ酸配列同一性を有する。さらに他
の実施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、配列番号1に対し
て、少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%または
100%未満のアミノ酸配列同一性を有する。なおさらなる実施形態では、本明細書に記
載の1種以上のスブチリシン変異体は、配列番号2に対して、少なくとも90、91、9
2、93、94、95、96、97、98、99%または100%未満のアミノ酸配列同
一性を有する。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異
体は、配列番号14に対して、少なくとも90、91、92、93、94、95、96、
97、98、99%または100%未満のアミノ酸配列同一性を有する。
【0080】
他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、親プロテアー
ゼまたはベンチマークプロテアーゼと比較して1つ以上の改善された特性を有し、この改
善された特性は、改善されたプロテアーゼ活性、洗剤における改善された洗浄性能、およ
び洗剤における改善された熱安定性から選択される。一実施形態では、本明細書に記載の
1種以上のスブチリシン変異体は、配列番号1、配列番号2、および/または配列番号1
4と比較して1つ以上の改善された特性を有し、この改善された特性は、改善されたプロ
テアーゼ活性、洗剤における改善された洗浄性能、および洗剤における改善された熱安定
性から選択される。さらなる実施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変
異体は、配列番号1および/または配列番号2と比較して1つ以上の改善された特性を有
し、この改善された特性は、改善されたプロテアーゼ活性、洗剤における改善された洗浄
性能、および洗剤における改善された熱安定性から選択される。さらに他の実施形態では
、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、配列番号1と比較して1つ以上の
改善された特性を有し、この改善された特性は、改善されたプロテアーゼ活性、洗剤にお
ける改善された洗浄性能、および洗剤における改善された熱安定性から選択される。さら
に他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、配列番号2と
比較して1つ以上の改善された特性を有し、この改善された特性は、改善されたプロテア
ーゼ活性、洗剤における改善された洗浄性能、および洗剤における改善された熱安定性か
ら選択される。なおさらなる他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリシ
ン変異体は、配列番号14と比較して1つ以上の改善された特性を有し、この改善された
特性は、改善されたプロテアーゼ活性、洗剤における改善された洗浄性能、および洗剤に
おける改善された熱安定性から選択される。
【0081】
一実施形態では、本明細書に記載のスブチリシン変異体は、親またはベンチマークプロ
テアーゼと比較して、より長い洗浄期間を通してより安定である。他の実施形態では、本
明細書に記載のスブチリシン変異体は、親またはベンチマークプロテアーゼと比較して、
短時間低温洗浄サイクルまたは長時間高温洗浄サイクルを通してより安定である。一実施
形態では、1つ以上の改善された特性は、(i)改善されたプロテアーゼ活性であり、前
記変異体は脱脂乳基質に対してPI>1を有し、(ii)改善された洗浄性能であり、前
記変異体は卵黄見本洗浄PI>1を有し、(iii)改善された熱安定性であり、前記変
異体は安定性PI>1を有し、(iv)改善された熱安定性であり、前記変異体は、任意
選択により、50℃、59℃、および/または61℃で測定した場合、残留活性≧10%
を有する。なおさらなる実施形態では、1つ以上の改善された特性は(i)改善されたプ
ロテアーゼ活性であり、前記変異体は脱脂乳基質に対してPI>1を有し;(ii)改善
された洗浄性能であり、前記変異体は卵黄見本洗浄PI>1を有し;かつ/または(ii
i)改善された熱安定性であり、前記変異体は、安定性PI≧1を有する。さらに他の実
施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、改善されたプロテアー
ゼ活性を有し、前記変異体は、脱脂乳基質に対してPI>1を有する。またさらに他の実
施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、改善された洗浄性能を
有し、前記変異体は、卵黄見本洗浄P1>1を有する。他の実施形態では、本明細書に記
載の1種以上のスブチリシン変異体は改善された熱安定性を有し、前記変異体は、安定性
PI>1を有する。さらなる実施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変
異体は改善された熱安定性を有し、前記変異体は、任意選択により、50℃、59℃、お
よび/または61℃で測定した場合、残留活性≧10%を有する。他の実施形態では、本
明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、改善されたプロテアーゼ活性を有し、
前記変異体は脱脂乳基質に対してPI>1を有し、前記PIは実施例1のプロテアーゼ活
性アッセイにより測定される。さらなる実施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブ
チリシン変異体は、改善された洗浄性能を有し、前記変異体は卵黄見本洗浄PI>1を有
し、前記PIは、実施例1の洗剤アッセイでの洗浄性能により測定される。さらに他の実
施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、改善された熱安定性を
有し、前記変異体は安定性PI>1を有し、前記PIは、実施例1の洗剤アッセイでの熱
安定性により測定される。なおさらなる他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上の
スブチリシン変異体は、改善された熱安定性を有し、前記変異体は、実施例1に記載の洗
濯用洗剤アッセイで50℃、59℃、および/または61℃で測定した場合、前残留活性
≧10%を有する。
【0082】
一実施形態は、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体をコードするポリヌク
レオチド配列を含む、1つ以上の単離された、天然に存在しない、かつ/または組換えら
れた核酸配列に関する。この本明細書に記載の1種以上の核酸配列は、任意の好適な合成
、操作、および/もしくは単離法、またはそれらの組み合わせを使用することによって生
成することができる。
【0083】
例えば、この本明細書に記載の1種以上のポリヌクレオチド配列は、標準的な核酸合成
法、例えば、固相合成法などを用いて生成し得る。このような技術では、通常、最大50
以上のヌクレオチド塩基の断片が合成され、次いで結合されて(例えば、酵素もしくは化
学ライゲーション法、またはポリメラーゼ媒介組換え法によって)、本質的に全ての望ま
しい連続核酸配列が形成される。本明細書に記載の核酸の合成はまた、例えば、Beau
cage et al.,Tetrahedron Letters 22:1859-
69(1981)に記載された、例えば古典的なホスホロアミダイト法、または、例えば
、自動合成法において典型的に実施されているMatthes et al.,EMBO
J.3:801-05(1984)に記載の方法を使用する、化学合成によって促進(
あるいは達成)することができる。本明細書に記載の核酸はまた、自動DNA合成装置を
使用することによって生成することができる。カスタマイズされた核酸は、Midlan
d Certified Reagent Co. (mcrc@oligos.com
)、Great American Gene Co.(genco.com)、Ope
ron Technologies Inc.(Alameda,Calif.)および
DNA2.0(Menlo Park,CA)などの種々の商業的供給源に注文すること
ができる。核酸を合成するための他の技術、および関連する原理は、例えば、Itaku
ra et al.,Annu.Rev.Biochem.,53:323(1984)
およびItakura et al.,Science 198:1056(1984)
に記載されている。
【0084】
例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、逆転写およびcDNA産生、
ならびにポリメラーゼ連鎖反応(例えば、PCR)を含む組換えDNA技術は、本明細書
に記載の1種以上の核酸配列を改変するために使用することができる。有用な組換えDN
A技術の手法およびそれに関連する原理は、Sambrook et al.(1989
),「Molecular Cloning:A Laboratory Manual
」,Cold Spring Harbor Press,and third edi
tion thereof(2001);;Ausubel et al.(1994-
1999),「Current Protocols in Molecular Bi
ology」,Wiley Interscience Publishers;および
Berger and Kimmel,「Guide to Molecular Cl
oning Techniques」,Methods in Enzymol.,Vo
l.152,Acad.Press,Inc.に記載されている。
【0085】
本明細書に記載のヌクレオチドはまた、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異
体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズし得るか、またはポリヌクレオチドを
PCR増幅し得る、1種以上のオリゴヌクレオチドプローブを使用して、cDNAライブ
ラリー(当該技術分野で一般に使用される変異誘発技術を使用して作製され、本明細書に
記載されるものを含む)をスクリーニングすることによっても得ることができる。cDN
Aクローンをスクリーニングし単離する手順、およびPCR増幅手順は、当業者によく知
られており、例えば、Berger,Sambrook,and Ausubel(前出
)に記載されている。本明細書に記載の核酸配列はまた、天然に存在するポリヌクレオチ
ド骨格(例えば、親プロテアーゼをコードするもの)を、例えば、既知の変異誘発手順で
改変することにより得ることができる。
【0086】
本明細書に記載の1種以上の単離された核酸配列、天然に存在しない核酸配列、および
/または組換え核酸配列は、典型的にはプラスミド発現ベクターの発現を介して、本明細
書に記載の1種以上のスブチリシン変異体の組換え産生(例えば、発現)を行うのに有用
である。したがって、さらなる実施形態は、1種以上の:本明細書に記載の1種以上のポ
リヌクレオチドを含む単離または組換えベクター;本明細書に記載の1種以上のポリヌク
レオチドを含む単離または組換え発現ベクターまたは発現カセット;本明細書に記載の1
種以上のポリヌクレオチドを含む単離された、実質的に純粋な、または組換えDNA構築
物;本明細書に記載の1種以上のポリヌクレオチドを含む単離または組換え細胞;本明細
書に記載の1種以上のポリヌクレオチドを含む細胞を含む細胞培養物;本明細書に記載の
1種以上のポリヌクレオチドを含む細胞培養物;および/または1種以上のベクター、ポ
リヌクレオチド配列、発現ベクター、発現カセット、DNA構築物、細胞、細胞培養物、
またはこれらの任意の組み合わせもしくは混合物を含む組成物に関する。
【0087】
他の実施形態は、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体をコードするポリヌ
クレオチド配列を含む、1種以上の単離された、天然に存在しない、かつ/または組換え
られた核酸配列を含む発現ベクターに関する。さらなる実施形態は、本明細書に記載の1
種以上のスブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む1種以上の核酸配
列を含む発現ベクターに関する。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上の
ポリヌクレオチド配列は、効率的な遺伝子発現のために必要とされる1種以上の核酸セグ
メントに作動可能に連結されている(例えば、プロモーターが本明細書に記載の1種以上
のスブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される)。ベクタ
ーは、転写ターミネーター、および/または選択遺伝子、例えば、抗菌剤含有培地での増
殖によってプラスミド感染宿主細胞の連続的な培養維持を可能にする抗生物質抵抗性遺伝
子を含み得る。
【0088】
発現ベクターは、プラスミド由来であってもウイルスDNA由来であってもよく、また
は代替の実施形態では、その両方のエレメントを含む。Harwood and Cut
ting(eds.),「Molecular Biological Methods
for Bacillus」,John Wiley & Sons(1990)は、
限定はされないが、例えば、pXX、pC194、pJH101、pE194、およびp
HP13、ならびにB・スブチリス(B.subtilis)に好適な複製プラスミドを
含むベクターの例を記載している。ベクターの例は、さらに、例えば、Perego,M
.,「Integrational Vectors for Genetic Man
ipulations in Bacillus subtilis」(1993)およ
びA.L.Sonenshein,J.A.Hoch,and R.Losick(ed
.),「Bacillus subtilis and other Gram-pos
itive bacteria: biochemistry、physiology
and molecular genetics」,American Society
for Microbiologyにも記載されている。
【0089】
さらに他の実施形態は、本明細書に記載の1種以上のポリヌクレオチドを含む1種以上
のベクター(例えば、発現ベクターまたはDNA構築物)を含む、1種以上の組換え細胞
に関する。いくつかのこのような組換え細胞は、1種以上のベクターで形質転換またはト
ランスフェクトされている。そのような細胞は、通常、宿主細胞と呼ばれる。いくつかの
このような細胞は、細菌細胞、例えば、限定はされないが、例えば、B・スブチリス(B
.subtilis)細胞などの、バチルス属(Bacillus)の菌種の細胞を含む
。さらなる実施形態は、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体を含む組換え細
胞に関する。
【0090】
細胞が、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体を発現および産生するために
、1種以上のスブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチドの1つ以上のコピーを含
む1種以上の発現ベクターが、スブチリシンの発現に好適な条件下で細胞に形質転換され
る。一実施形態では、本明細書に記載の1種以上のポリヌクレオチド配列(およびベクタ
ーに含まれる他の配列)が宿主細胞のゲノムに組み込まれる。他の実施形態では、本明細
書に記載の1種以上のポリヌクレオチド配列を含む1種以上のプラスミドベクターは、細
胞内の自律染色体外エレメントのままである。さらなる実施形態では、1種以上のスブチ
リシン変異体をコードするポリヌクレオチド構築物は、スブチリシン変異体をコードする
ポリヌクレオチドの細菌染色体への組込みおよび任意選択により増幅を可能にする組込み
ベクター上に存在する。
【0091】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の1種以上のポリヌクレオチドの転写は、選
択された前駆体プロテアーゼのための野生型プロモーターであるプロモーターによってな
される。一部の他の実施形態では、プロモーターは、前駆体プロテアーゼに対し異種であ
るが、宿主細胞内では機能的である。細菌宿主細胞での使用に好適なプロモーターの例と
しては、限定はされないが、例えば、amyE、amyQ、amyL、pstS、sac
B、pSPAC、pAprE、pVeg、およびpHpaII;ならびにB・ステアロサ
ーモフィルス(B.stearothermophilus)マルトジェニックアミラー
ゼ遺伝子、B・アミロリクエファシエンス(B.amyloliquefaciens)
(BAN)アミラーゼ遺伝子、B・スブチリス(B.subtilis)アルカリプロテ
アーゼ遺伝子、B・クラウジ(B.clausii)アルカリプロテアーゼ遺伝子、B・
プミルス(B.pumilis)キシロシダーゼ遺伝子、B・チューリンギエンシス(B
.thuringiensis)cryIIIA、およびB・リケニフォルミス(B.l
icheniformis)アルファアミラーゼ遺伝子のプロモーターが挙げられる。さ
らなるプロモーターとして、限定はされないが、A4、ファージラムダPRまたはPL、
およびE・コリ(E.coli)lac、trpまたはtacが挙げられる。
【0092】
本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、細菌および真菌などの好適なグラ
ム陽性菌の宿主細胞で産生することができる。いくつかの実施形態では、宿主菌株は、組
換え菌株であり、目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、その宿主に導入さ
れている。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン
変異体は、真菌および/または細菌起源の宿主細胞で産生される。いくつかの実施形態で
は、宿主細胞は、バチルス属(Bacillus)の菌種、ストレプトミケス属(Str
eptomyces)の菌種、エシェリキア属(Escherichia)の菌種、また
はアスペルギルス属(Aspergillus)の菌種である。いくつかの実施形態にお
いて、1種以上のスブチリシン変異体は、バチルス属(Bacillus)の菌種の宿主
細胞によって産生される。バチルス属(Bacillus)の菌種の宿主細胞の例として
は、限定はされないが、例えば、B・リケニフォルミス(B.licheniformi
s)、B・レントゥス(B.lentus)、B・スブチリス(B.subtilis)
、B・アミロリクエファシエンス(B.amyloliquefaciens)、B・レ
ントゥス(B.lentus)、B・ブレビス(B.brevis)、B・ステアロテル
モフィルス(B.stearothermophilus)、B・アルカロフィルス(B
.alkalophilus)、B・コアギュランス(B.coagulans)、B・
シルキュランス(B.circulans)、B・プミリス(B.pumilis)、B
・チューリンギエンシス(B.thuringiensis)、B・クラウジ(B.cl
ausii)、およびB・メガテリウム(B.megaterium)が挙げられる。本
明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体を産生するために使用することができるバ
チルス属(Bacillus)の宿主菌株は、米国特許第5,264,366号明細書お
よび同第4,760,025号明細書(RE34,606)に記載されている。
【0093】
いくつかの実施形態では、B・スブチリス(B.subtilis)宿主細胞は、本明
細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体を産生するために使用される。多くのB・ス
ブチリス(B.subtilis)株が知られており、例えば、限定はされないが、1A
6(ATCC39085)、168(1A01)、SB19、W23、Ts85、B63
7、PB1753~PB1758、PB3360、JH642、1A243(ATCC3
9,087)、ATCC21332、ATCC6051、MI113、DE100(AT
CC39,094)、GX4931、PBT110、およびPEP211株が挙げられる
。例えば、Hoch et al.,Genetics 73:215-228(197
3);Palva et al.,Gene 19:81-87(1982);Fahn
estock and Fischer,J.Bacteriol.,165:796-
804(1986);およびWang et al.,Gene 69:39-47(1
988))を参照されたい。また米国特許第4,450,235号明細書および同第4,
302,544号明細書ならびに欧州特許第0134048号明細書も参照されたい)。
【0094】
いくつかの実施形態では、バチルス属(Bacillus)宿主細胞は、次の遺伝子、
degU、degS、degR、およびdegQの1つ以上に変異または欠失を含むバチ
ルス属(Bacillus)の菌種である。一実施形態では、変異はdegU遺伝子にあ
り、他の実施形態では、変異はdegU(Hy)32である。例えば、Msadek e
t al.,J.Bacteriol.172:824-834(1990)およびOl
mos et al.,Mol.Gen.Genet.253:562-567(199
7)を参照されたい。いくつかの実施形態では、バチルス属(Bacillus)宿主は
scoC4(例えば、Caldwell et al.,J. Bacteriol.1
83:7329-7340(2001)を参照されたい);spoIIE(例えば、Ar
igoni et al.,Mol.Microbiol.31:1407-1415(
1999)を参照されたい);および/またはoppAもしくはoppオペロンの他の遺
伝子(例えば、Perego et al.,Mol.Microbiol.5:173
-185(1991)を参照されたい)に変異または欠失を含む。いくつかの実施形態で
は、これらの変異は単独で発生するが、他の実施形態では、変異の組み合わせが存在する
。さらに、内因性プロテアーゼ遺伝子の変異および/または欠失を含むバチルス属(Ba
cillus)の菌種の宿主細胞も使用される。
【0095】
本明細書に記載の、1種以上の核酸またはポリヌクレオチド配列をバチルス属(Bac
illus)細胞に導入するための好適な方法は、例えば、Ferrari et al
.,「Genetics」,in Harwood et al.(ed.),Baci
llus,Plenum Publishing Corp.(1989);Saund
ers et al.,J.Bacteriol.,157:718-726(1984
);Hoch et al.,J.Bacteriol.,93:1925-1937(
1967);Mann et al.,Current Microbiol.,13:
131-135(1986);and Holubova,Folia,Microbi
ol.,30:97(1985);Chang et al.,Mol.Gen.Gen
et.,168:11-115(1979);Vorobjeva et al.,FE
MS Microbiol.Lett.,7:261-263(1980);Smith
et al.,Appl.Env.Microbiol.,51:634(1986)
;Fisher et al.,Arch.Microbiol.,139:213-2
17(1981);およびMcDonald,J.,Gen.Microbiol.,1
30:203(1984)に記載されている。このような好適な方法としては、例えば、
プロトプラスト形質転換および会合、形質導入、ならびにプロトプラスト融合が挙げられ
る。例えば、本明細書に記載のスブチリシンをコードする核酸を含む、DNA構築物また
はベクターを宿主細胞に導入するために、形質転換法を使用することができる。形質転換
法の例として、部分的に相同な常在性プラスミドを保有するコンピテント細胞によるドナ
ープラスミドの取り込みを含む、プラスミドマーカーレスキュー形質転換が挙げられる。
このような方法は、例えば、Contente et al.,Plasmid 2:5
55-571(1979);Haima et al.,Mol.Gen.Genet.
223:185-191(1990);Weinrauch et al.,J.Bac
teriol.154:1077-1087(1983);およびWeinrauch
et al.,J.Bacteriol.169:1205-1211(1987)に記
載されている。
【0096】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載のスブチリシン変異体をコード
する核酸を含むDNA構築物またはベクターで直接形質転換される(すなわち、宿主細胞
に導入する前に、DNA構築物またはベクターを増幅するため、または他の処理をするた
めに中間細胞は使用されない)。本明細書に記載のDNA構築物またはベクターの宿主細
胞への導入には、核酸配列をプラスミドまたはベクターに導入せずに宿主細胞に導入する
ための当該技術分野で知られた物理的および化学的方法が含まれる。このような方法とし
ては、限定はされないが、例えば、塩化カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、裸の
DNA、およびリポソームが挙げられる。さらなる実施形態では、DNA構築物またはベ
クターをプラスミドに挿入せずに、プラスミドと共に同時形質転換する。さらなる実施形
態では、当該技術分野で知られた方法で、選択マーカーを改変したバチルス属(Baci
llus)の菌株から欠失させる(例えば、Stahl et al.,J.Bacte
riol.158:411-418(1984);およびPalmeros et al
.,Gene247:255-264(2000)を参照されたい)。
【0097】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の1種以上の形質転換細胞は、本明細書に記
載の1種以上のスブチリシン変異体の発現を可能にする培養条件下、従来の栄養培地中で
培養される。さらなる実施形態では、宿主細胞によって発現された1種以上のスブチリシ
ン変異体は、細胞培養物から回収される。他の実施形態は、本明細書に記載のスブチリシ
ン変異体をコードする核酸を含む組換え発現ベクターを含む培養培地中、前記スブチリシ
ン変異体を産生するのに好適な条件下で、組換え宿主細胞を培養する工程、および培養培
地から前記変異体を回収する工程を含む、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異
体を産生する方法に関する。温度、pHなどの、本明細書に記載の1種以上の変異体を産
生するための好適な培養条件は、当業者に知られている。培養条件の例は、例えば、Ho
pwood(2000)「Practical Streptomyces Genet
ics」,John Innes Foundation,Norwich UK;およ
びHardwood et al,「Molecular Biological Me
thods for Bacillus」,John Wiley(1990)に記載さ
れている。他の実施形態は、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体または核酸
配列を含む1つ以上の培養物(例えば、細胞培養物)を提供する。
【0098】
細胞を培養するために使用される培地は、適切な補給物を含有する最小培地もしくは天
然培地などの宿主細胞を増殖させるために好適な任意の従来型培地を含み得る。好適な培
地は商業的供給業者から入手可能である、または(例えば、American Type
Culture Collectionのカタログ中の)公開された製法にしたがって
調製することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリ
シン変異体は培養培地に分泌される。他の実施形態では、スブチリシン変異体は、限定は
されないが、例えば、遠心分離または濾過による培地からの細胞の分離;塩(例えば、硫
酸アンモニウム)による上清または濾液のタンパク様成分の沈殿、およびクロマトグラフ
ィー精製(例えば、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティなど)を含む従来の方法によっ
て細胞培養物から回収される。
【0099】
さらなる実施形態では、本明細書に記載のベクターまたはDNA構築物は、スブチリシ
ン変異体の精製を容易にする精製促進ドメインをコードする核酸配列をさらに含み得る(
例えば、Kroll,D.J. et al.,DNA Cell Biol.,12:
441-53(1993)を参照されたい)。そのような精製促進ドメインとしては、限
定はされないが、例えば、固定化金属による精製を可能にするヒスチジン-トリプトファ
ンモジュールなどの金属キレートペプチド(Porath J.,Protein Ex
pr.Purif.,3:263-281(1992))、固定化免疫グロブリンによる
精製を可能にするタンパク質Aドメイン、FLAGSエクステンション/アフィニティ精
製システム(Immunex Corp.,Seattle,WA)において使用される
ドメインが挙げられる。精製ドメインと異種タンパク質との間の、XA因子またはエンテ
ロキナーゼなどの開裂可能なリンカー配列(Invitrogen,San Diego
,CA)の包含もまた、精製を促進するために利用される。
【0100】
一実施形態では、1種以上のスブチリシン変異体は、例えば、限定はされないが、皿類
製品、食器具製品、布帛、および硬質表面を有する製品(例えば、テーブル、テーブルト
ップ、壁、家具製品、床、および天井の硬質表面)の洗浄などの洗浄用途に有用である。
他の実施形態は、組成物が自動食器洗浄用組成物ではないことを条件として、本明細書に
記載の1種以上のスブチリシン変異体を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、
組成物が自動食器洗浄用組成物ではないことを条件として、組成物は洗浄用組成物である
。他の実施形態では、組成物が自動食器洗浄用組成物ではないことを条件として、組成物
は洗剤組成物である。さらに他の実施形態では、組成物は、洗濯用洗剤組成物、自動食器
洗浄用組成物、手洗い(手作業)による食器洗浄用洗剤組成物、硬質表面洗浄用組成物、
眼鏡洗浄用組成物、およびパーソナルケア組成物から選択される。さらに他の実施形態で
は、組成物は、洗濯用洗剤組成物、自動食器洗浄用組成物、または手洗い(手作業)によ
る食器洗浄用洗剤組成物である。またさらに他の実施形態では、組成物は、洗濯用洗剤組
成物または手洗い(手作業)による食器洗浄用洗剤組成物である。いくつかの実施形態で
は、組成物は、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体と、賦形剤、補助材料お
よび/または追加の酵素の1種以上とを含む。
【0101】
洗濯用洗剤組成物の例としては、限定はされないが、例えば、液体および粉末洗濯用洗
剤組成物が挙げられる。硬質表面洗浄用組成物の例としては、限定はされないが、例えば
、非皿類製品、非食器具製品、テーブル、テーブルトップ、家具製品、壁、床、および天
井の硬質表面を洗浄するために使用する組成物が挙げられる。硬質表面洗浄用組成物の例
は、例えば、米国特許第6,610,642号明細書、同第6,376,450号明細書
、および同第6,376,450号明細書に記載されている。パーソナルケア組成物の例
としては、限定はされないが、義歯、歯、毛髪、コンタクトレンズ、および皮膚を洗浄す
るために使用する組成物が挙げられる。このような口腔ケア組成物の成分の例は、例えば
、米国特許第6,376,450号明細書に記載されるものが挙げられる。
【0102】
特段の記載がない限り、本明細書に提示される全ての成分または組成物のレベルは、そ
の成分または組成物の活性レベルを基準に調整され、市販の供給源に存在し得る不純物、
例えば、残存溶媒または副生物を含まない。酵素成分の重量は、全活性タンパク質量を基
準とする。特に記載がない限り、全てのパーセンテージおよび比率は重量によって計算さ
れる。特に記載がない限り、全てのパーセンテージおよび比率は、全組成物に基づいて計
算される。
【0103】
補助材料の例としては、限定はされないが、1種以上の、アルカリ源、防色剤および/
または防食剤、抗ケーキング剤、抗酸化剤、再付着防止剤、抗収縮剤、抗皺剤、漂白剤、
漂白活性化剤、漂白増強剤、漂白触媒、ブルーイング剤、光沢剤、ビルダー、担体、触媒
材料、キレート剤、粘土汚れ除去剤、着色剤、カラースペックル、付着助剤、分散剤、染
料、染料移行抑制剤、酵素活性剤、酵素安定剤、布帛コンディショナー、布帛柔軟剤、充
填剤、蛍光剤、防カビ剤、殺菌剤、過酸化水素、加水分解性界面活性剤、ヒドロトロープ
、ライムソープ分散剤、マスキング剤、光学的光沢剤、有機高分子化合物、香料、pH調
節剤、光活性化剤、顔料、高分子分散剤、保存剤、加工助剤、リンス剤、シルバーケア、
汚れ除去ポリマー、汚れ懸濁剤、溶解剤、溶剤、過酸化水素源、構造弾性付与剤、泡抑制
剤ならびに界面活性剤が挙げられる。補助材料の例は、例えば、米国特許第6,610,
642号明細書、同第6,605,458号明細書、同第6,326,348号明細書、
同第6,306,812号明細書、同第5,705,464号明細書、同第5,710,
115号明細書、同第5,698,504号明細書、同第5,695,679号明細書、
同第5,686,014号明細書、同第5,646,101号明細書、および同第5,5
76,282号明細書に記載されている。補助材料が本明細書に記載のスブチリシン変異
体と適合しない場合、2つの成分の組み合わせが適切となるまで、補助材料とスブチリシ
ン変異体を分離した状態に保つ(すなわち、互いに接触しない)好適な方法が用いられる
。分離方法の例としては、限定はされないが、例えば、ゲルキャップ、カプセル化、タブ
レット、および物理的分離が挙げられる。
【0104】
粒状組成物用の充填剤または担体の例としては、限定はされないが、例えば、各種の硫
酸塩、炭酸塩およびケイ酸塩;タルク;ならびにクレーが挙げられる。液体組成物用の充
填剤または担体の例としては、限定はされないが、例えば、水、またはポリオールおよび
ジオールなどの低分子量の第1級および第2級アルコール(例えば、メタノール、エタノ
ール、プロパノールおよびイソプロパノール)が挙げられる。いくつかの実施形態では、
組成物は、そのような充填剤または担体を約5%~約90%含有する。そのような組成物
に酸性充填剤を含有させ、洗浄方法または洗浄用途で生じる溶液のpHを低下させること
ができる。
【0105】
他の一実施形態では、本明細書に記載の1種以上の組成物は、ゲル、タブレット、粉末
、粒状、固体、液体、単位剤形、およびこれらの組み合わせの形態を有する。いくつかの
実施形態では、本明細書に記載の洗浄用組成物は、単位剤形を有する。他の実施形態では
、単位剤形はタブレット、カプセル、サッシェ、パウチ、および多区画パウチから選択さ
れる。いくつかの実施形態では、単位剤形は、多区画パウチ(または他の単位剤形)内の
成分の放出が制御されるように設計されている。好適な単位剤形および放出制御剤形は、
例えば、欧州特許第2100949号明細書;国際公開第02/102955号パンフレ
ット;米国特許第4,765,916号明細書;米国特許第4,972,017号明細書
および国際公開第04/111178号パンフレットに記載されている。いくつかの実施
形態では、単位剤形は、水溶性のフィルムまたはパウチに含有されたタブレットまたは粉
末である。
【0106】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体は、低温で
清浄にする。他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上の組成物は、低温で清浄にす
る。他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上の組成物は、タンパク質性の染みの除
去が必要な表面の洗浄に有用なまたは有効なものとして、本明細書に記載の1種以上のス
ブチリシン変異体を有効量含む。
【0107】
一実施形態では、本明細書に記載の1種以上の洗浄用組成物は、本明細書に記載の1種
以上のスブチリシン変異体の有効量を、単独でまたは1種以上の追加の酵素と組み合わせ
て含む。通常、洗浄用組成物は、1種以上のプロテアーゼを少なくとも約0.0001~
約20重量%、約0.0001~約10重量%、約0.0001~約1重量%、約0.0
01~約1重量%、または約0.01~約0.1重量%含む。他の実施形態では、本明細
書に記載の1種以上の洗浄用組成物は、組成物1グラム当たり、1種以上のプロテアーゼ
を約0.01~約10mg、約0.01~約5mg、約0.01~約2mg、約0.01
~約1mg、約0.5~約10mg、約0.5~約5mg、約0.5~約4mg、約0.
5~約4mg、約0.5~約3mg、約0.5~約2mg、約0.5~約1mg、約0.
1~約10mg、約0.1~約5mg、約0.1~約4mg、約0.1~約3mg、約0
.1~約2mg、約0.1~約2mg、約0.1~約1mgまたは約0.1~約0.5m
g含む。
【0108】
本明細書に記載の洗浄用組成物は、水性条件で使用される場合、洗浄水が約5.0~約
11.5、または約7.5~約10.5のpHを有するように調合することができる。液
体組成物は、通常、約3.0~約9.0または約3.0~約5.0の原液pHを有するよ
うに調合される。粒状の洗濯用組成物は、通常、約9~約11のpHを有するように調合
される。手洗いによる食器洗浄用洗剤組成物は、通常、約8~約11.5のpH(例えば
、限定はされないが、約8~約10、約9~約11.5、および約9.5~約11.5の
pH範囲)を有するように調合される。pHを推奨使用レベルに制御する手法としては、
例えば、緩衝液、アルカリ、および酸の使用が挙げられる。約3~約5の原液pHを有す
る洗浄用組成物は、通常、そのようなpH環境で加水分解する界面活性剤を含まない。低
pH組成物は、通常、十分な量のpH調整剤(例えば、水酸化ナトリウム、モノエタノー
ルアミン、または塩酸)と1種以上の酸安定酵素とを含む。
【0109】
界面活性剤および/または界面活性剤系の例としては、限定はされないが、非イオン性
界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、両性イオ
ン性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、およびこれらの混合物が挙げられる。低
pH洗浄用組成物(例えば、約3~約5の原液のpH)は、通常、アルキルエトキシル化
硫酸塩を含まない。そのような界面活性剤はそのような組成物によって加水分解され得る
と考えられるからである。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、洗浄用組成物の約0
.1重量%~約60重量%の量で存在するが、代替の実施形態では、その量は約1重量%
~約50重量%であり、さらに他の実施形態では、その量は約5重量%~約40重量%で
ある。
【0110】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスブチリシン変異体は、保存中に、洗浄用
組成物中の他の成分からそれを保護するためにカプセル化される。いくつかの実施形態で
は、カプセル化材料は、本明細書に記載のスブチリシン変異体のための触媒の少なくとも
一部をカプセル化する。通常、カプセル化材料は水溶性および/または水分散性である。
いくつかの実施形態では、カプセル化材料は、0℃以上のガラス転移温度(Tg)を有す
る。カプセル化材の例としては、限定はされないが、炭水化物、天然または合成ガム、キ
チン、キトサン、セルロースおよびセルロース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、
ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィンワックス、ならびにこれら
の組み合わせが挙げられる。カプセル化材が炭水化物である場合、通常、単糖類、オリゴ
糖類、多糖類、およびこれらの組み合わせから選択される。いくつかの典型的な実施形態
では、カプセル化材料はデンプンである(例えば、欧州特許第0922499号明細書;
米国特許第4,977,252号明細書;同第5,354,559号明細書、および同第
5,935,826号明細書を参照されたい)。いくつかの実施形態では、カプセル化材
料は、熱可塑性プラスチック、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ポリアクリロニ
トリル、ポリメタクリロニトリル、およびそれらの混合物などのプラスチックから作製さ
れたマイクロスフィアである。市販のマイクロスフィアの例としては、限定はされないが
、EXPANCEL(登録商標)(Akzo Nobel Chemicals Int
ernational、B.V.)、PM6545、PM6550、PM7220、PM
7228、およびEXTENDOSPHERES(登録商標)(Sphere One
Inc.)、ならびにLUXSIL(登録商標)、Q-CEL(登録商標)、およびSP
HERICEL(登録商標)(Potters Industries LLC)が挙げ
られる。
【0111】
さらなる実施形態は、洗浄を必要とする製品または表面を洗浄する方法に関し、この方
法は、製品または表面を本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体または1種以上
の組成物と接触させる工程を含む。さらに他の実施形態では、洗浄方法は低温または低p
Hで実施される。またさらに他の実施形態では、洗浄を必要とする製品または表面が洗浄
される。このような方法のいくつかは、製品、または表面を水で濯ぐ工程をさらに含む。
いくつかの実施形態では、洗浄されるべき製品または物体は皿類製品(例えば、皿、プレ
ート、カップ、またはボウル)または食器具製品(例えば、皿、カトラリー、ナイフ、フ
ォーク、スプーン、箸、ガラス製品、ピッチャー、ソースボート、および飲用容器)であ
る。
【0112】
さらに他の実施形態は、洗浄が必要な製品または表面を、本明細書に記載の1種以上の
スブチリシン変異体または1種以上の成分と接触させる工程を含む冷水洗浄方法であって
、前記製品または表面は約10℃~約40℃の温度で洗浄され、かつ前記製品または表面
は清浄にされる方法に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の「冷水洗浄」
は、約10℃~約40℃、または約20℃~約30℃、または約15℃~約25℃、なら
びに約15℃~約35℃の範囲内の他の全ての組み合わせ、および10℃~40℃の全範
囲の温度を使用する。またさらに他の実施形態は、洗浄を必要とする製品または表面を洗
浄する方法に関し、この方法は製品または表面を、本明細書に記載の1種以上のスブチリ
シン変異体または1種以上の組成物および水と接触させる工程を含み、前記水は、1~1
9gpg、1~7gpg;および7~19gpgから選択される硬度を有する。場合によ
っては、所望するなら、特に追加の洗浄または洗濯を所望する場合、この方法を1回以上
繰り返すことができる。例えば、場合によっては、この方法は、任意選択により、製品ま
たは表面を本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体または組成物と、製品または
表面を所望の程度まで洗浄または洗濯するのに十分な、または有効な期間に亘って接触し
た状態に維持する工程をさらに含む。本発明の目的のためには、「洗濯」は、限定はされ
ないが、例えば、こすり洗いおよび機械的な撹拌を含む。
【0113】
さらなる実施形態は、洗濯物または布帛製品を洗濯機で洗浄する方法に関し、この方法
は、洗濯機を用意する工程、洗濯物または布帛製品を洗浄するのに十分な量の、本明細書
に記載の1種以上のスブチリシン変異体を含む洗濯用洗剤組成物を洗濯機に(例えば、適
切な、または設けられた洗剤区画またはディスペンサーに組成物を入れることによって)
入れる工程、洗濯物または布帛製品を洗濯機に入れる工程、および(例えば、製造者の使
用説明書にしたがって)洗濯機を操作して洗濯物または布帛製品を洗浄する工程を含む。
【0114】
地理が相異すると、水の硬度も異なる。水の硬度は、通常、Ca2+/Mg2+混合物
の1ガロン当たりのグレイン(「gpg」)を単位として記載される。硬度は、水中のカ
ルシウム(Ca2+)とマグネシウム(Mg2+)の量の尺度である。United S
tatesにおける水の殆どは硬水であるが、硬度は異なっている。中硬水(60~12
0ppm)~硬水(121~181ppm)は、60~181ppm(ppmは、ppm
を17.1で割ることによって1U.S.ガロン当たりのグレインに変換することができ
る)の硬度ミネラルを有する。
【0115】
【0116】
ヨーロッパの水硬度は、一般に、Ca2+/Mg2+混合物として約10.5(例えば
、約10.5~約20.0)gpg(Caの<15772+/Mg2++の混合物として
、例えば、約15gpg)より高い。北米の水の硬度は、一般に、日本の水の硬度よりも
高く、欧州の水の硬度よりも低い。例えば、北米の水の硬度は、一般に、約3~約10g
pg、約3~約8gpg、または約6gpgである。日本の水硬度は、通常、約4gpg
未満(例えば、Ca2+/Mg2+の混合物として約3gpg)である。
【0117】
またさらに他の実施形態は、組成物の約0.00001重量%~約10重量%の本明細
書に記載の1種以上のスブチリシン変異体と、組成物の約99.999重量%~約90.
0重量%の1種以上の補助材料とを含む組成物に関する。他の実施形態では、洗浄用組成
物は、組成物の約0.0001重量%~約10重量%、約0.001重量%~約5重量%
、約0.001重量%~約2重量%または約0.005重量%~約0.5重量%の1種以
上のスブチリシン変異体と、組成物の約99.9999重量%~約90.0重量%、約9
9.999重量%~約98重量%、約99.995重量%~約99.5重量%の1種以上
の補助材料とを含む。
【0118】
他の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載の1種以上のスブチリ
シン変異体と1種以上の追加の酵素を含む。1種以上の追加の酵素は、ヘミセルラーゼ、
セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、追加のプロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホ
リパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクテートリアーゼ、マンナナー
ゼ、ケラチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲ
ナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、β-グルカナーゼ
、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ
、メタロプロテアーゼ、およびこれらの混合物から選択される。いくつかの実施形態では
、本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体と、追加
のプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、マンナナーゼ、セルラーゼおよびアミラーゼか
ら選択される1種以上の追加の酵素とを含む。
【0119】
他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上の組成物は、本明細書に記載の1種以上
のスブチリシン変異体と1種以上の追加のプロテアーゼとを含む。一実施形態では、追加
のプロテアーゼはセリンプロテアーゼである。他の実施形態では、追加のプロテアーゼは
、アルカリ微生物プロテアーゼまたはトリプシン様プロテアーゼである。アルカリプロテ
アーゼの例としては、例えば、バチルス属(Bacillus)に由来するスブチリシン
(例えば、B・レントゥス(B.lentus)スブチリシン(すなわち、GG36)、
B・アミロリクエファシエンス(B.amyloliquefaciens)スブチリシ
ン(すなわち、BPN’)、スブチリシンカールスバーグ、スブチリシン309、スブチ
リシン147、PB92およびスブチリシン1680)が挙げられる。追加のプロテアー
ゼの例としては、限定はされないが、例えば、市販のプロテアーゼである、MAXATA
SE、MAXACAL、MAXAPEM、OPTICLEAN(登録商標)、OPTIM
ASE(登録商標)、PROPERASE(登録商標)、PURAFECT(登録商標)
、PURAFECT(登録商標)OXP、PURAMAX(登録商標)、EXCELLA
SE(登録商標)、PREFERENZ(商標)プロテアーゼ(例えば、P100、P1
10、P280)、EFFECTENZ(商標)プロテアーゼ(例えば、P1000、P
1050、P2000)、EXCELLENZ(商標)プロテアーゼ(例えばP1000
)、ULTIMASE(登録商標)およびPURAFAST(Danisco US);
ALCALASE(登録商標)、ALCALASE(登録商標)<ULTRA、BLAZ
E(登録商標)、BLAZE(登録商標)EVITY(登録商標)、BLAZE(登録商
標)EVITY(登録商標)16L、CORONASE(登録商標)、SAVINASE
(登録商標)、SAVINASE(登録商標)ULTRA、SAVINASE(登録商標
)EVITY(登録商標)、SAVINASE(登録商標)EVERIS(登録商標)、
PRIMASE、DURAZYM、POLARZYME(登録商標)、OVOZYME(
登録商標)、KANNASE(登録商標)、LIQUANASE(登録商標)、EVER
IS(登録商標)、NEUTRASE(登録商標)、PROGRESS UNO(登録商
標)、RELASE(登録商標)およびESPERASE(登録商標)(Novozym
es);BLAP(商標)およびBLAP(商標)変異体(Henkel);LAVER
GY(商標)PRO 104L(BASF)、並びにKAP(登録商標)(B・アルカロ
フィラス(B.alkalophilus)スブチリシン(花王株式会社))が挙げられ
る。追加のプロテアーゼの例としてはまた、限定はされないが、例えば、国際公開第95
/23221号パンフレット、同第92/21760号パンフレット、同第200801
0925号パンフレット、同第20100566356号パンフレット、同第20110
72099号パンフレット、同第201113022号パンフレット、同第201114
0364号パンフレット、同第2012151534号パンフレット、同第201503
8792号パンフレット、同第2015089441号パンフレット、同第201508
9447号パンフレット、同第2015143360号パンフレット、同第201600
1449号パンフレット、同第2016001450号パンフレット、同第201606
1438号パンフレット、同第2016069544号パンフレット、同第201606
9548号パンフレット、同第2016069552号パンフレット、同第201606
9557号パンフレット、同第2016069563号パンフレット、同第201606
9569号パンフレット、同第2016087617号パンフレット、同第201608
7619号パンフレット、同第2016145428号パンフレット、同第201617
4234号パンフレット、同第2016183509号パンフレット、同第201620
2835号パンフレット、同第2016205755号パンフレット、米国特許出願公開
第2008/0090747号明細書、米国特許第5、801、039号明細書、同第5
、340、735号明細書、同第5、500、364号明細書、同第5、855、625
号明細書、RE34、606、同第5、955、340号明細書、同第5、700、67
6号明細書、同第6、312、936号明細書、同第6、482、628号明細書、同第
8530219号明細書;米国仮特許出願第62/331282号明細書、同第62/3
43618号明細書、同第62/351649号明細書、同第62/437171号明細
書、同第62/437174号明細書および同第62/437509号明細書;およびP
CT出願のPCT/CN2017/076749号明細書に記載されているもの、ならび
に国際公開第2007/044993号パンフレット、同第2009/058303号パ
ンフレット、同第2009/058661号パンフレット、同第2014/071410
号パンフレット、同第2014/194032号パンフレット、同第2014/1940
34号パンフレット、同第2014/194054号パンフレットおよび同第2014/
194117号パンフレットに記載されているメタロプロテアーゼが挙げられる。追加の
プロテアーゼの例としては、限定さはされないが、(例えば、ブタまたはウシ起源の)ト
リプシン、および国際公開第89/06270号パンフレットに記載されるフザリウム属
(Fusarium)プロテアーゼが挙げられる。
【0120】
他の一実施形態は、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体と1種以上のリパ
ーゼとを含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の約0.00
001重量%~約10重量%、約0.0001重量%~約10重量%、約0.001重量
%~約5重量%、約0.001重量%~約2重量%、または約0.005重量%~約0.
5重量%のリパーゼを含む。リパーゼの一例は、化学的にまたは遺伝子操作により改変さ
れた変異体であり得る。リパーゼの例としては、限定はされないが、例えば、細菌または
真菌起源のもの、例えば、H・ラヌギノーサ(H.lanuginosa)リパーゼ(例
えば、欧州特許第258068号明細書および同第305216号明細書を参照されたい
)、T・ラヌギノサス(T.lanuginosus)リパーゼ(例えば、国際公開第2
014/059360号パンフレットおよび同第2015/010009号パンフレット
を参照されたい)、リゾムコール・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)リ
パーゼ(例えば、欧州特許第238023号明細書を参照されたい)、カンジダ属(Ca
ndida)リパーゼ、例えばC・アンタークティカ(C.antarctica)リパ
ーゼ(例えば、C.アンタークティカ(C.antarctica)リパーゼAまたはB
)(例えば、欧州特許第214761号明細書を参照されたい)、シュードモナス属(P
seudomonas)リパーゼ、例えば、P・アルカリゲネス(P.alcalige
nes)リパーゼおよびP・シュードアルカリゲネス(P.pseudoalcalig
enes)リパーゼ(例えば、欧州特許第218272号明細書を参照されたい)、P・
セパシア(P.cepacia)リパーゼ(例えば、欧州特許第331376号明細書を
参照されたい)、P・スタツェリ(P.stutzeri)リパーゼ(例えば、英国特許
第1,372,034号明細書を参照されたい)、P・フルオレセンス(P.fluor
escens)リパーゼ、バチルス属(Bacillus)リパーゼ(例えば、B・スブ
リチス(B.subtilis)リパーゼ(Dartois et al.,Bioch
em.Biophys.Acta 1131:253-260(1993))、B・ステ
アロサーモフィルス(B.stearothermophilus)リパーゼ(例えば、
特開昭64-744992号公報を参照されたい)、およびB・プミルス(B.pumi
lus)リパーゼ(例えば、国際公開第91/16422号パンフレットを参照されたい
))が挙げられる。クチナーゼなどの他の脂肪分解酵素もまた、本明細書に記載の1種以
上の組成物に用いることができ、限定はされないが、例えば、シュードモナス・メンドシ
ナ(Pseudomonas mendocina)に由来するクチナーゼ(国際公開第
88/09367号パンフレットを参照されたい)および/またはフザリウム・ソラニ・
ピシ(Fusarium solani pisi)に由来するクチナーゼ(国際公開第
90/09446号パンフレットを参照されたい)が挙げられる。市販リパーゼの例とし
ては、限定はされないが、M1 LIPASE、LUMA FASTおよびLIPOMA
X(Genencor);LIPEX(登録商標)、LIPOCLEAN(登録商標)、
LIPOLASE(登録商標)およびLIPOLASE(登録商標)ULTRA(Nov
ozymes);ならびにLIPASE P(Amano Pharmaceutica
l Co.Ltd)が挙げられる。
【0121】
さらに他の実施形態は、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体と、1種以上
のアミラーゼとを含む組成物に関する。一実施形態では、組成物は、組成物の約0.00
001重量%~約10重量%、約0.0001重量%~約10重量%、約0.001重量
%~約5重量%、約0.001重量%~約2重量%、または約0.005重量%~約0.
5重量%のアミラーゼを含む。アルカリ性溶液中での使用に好適なアミラーゼ(例えば、
アルファおよび/またはベータ)は、そのような組成物に含めるのに有用であり得る。ア
ミラーゼの一例は、化学的にまたは遺伝子操作により改変された変異体であり得る。アミ
ラーゼの例としては、限定はされないが、細菌または真菌起源のもの、例えば、英国特許
第1,296,839号明細書、国際公開第91/00353号パンフレット、同第94
/02597号パンフレット、同第94/183314号パンフレット、同第95/10
603号パンフレット、同第95/26397号パンフレット、同第95/35382号
パンフレット、同第96/05295号パンフレット、同第96/23873号パンフレ
ット、同第96/23874号パンフレット、同第96/30481号パンフレット、同
第97/10342号パンフレット、同第97/41213号パンフレット、同第97/
43424号パンフレット、同第98/13481号パンフレット、同第98/2607
8号パンフレット、同第99/02702号パンフレット、同第99/09183号パン
フレット、同第99/19467号パンフレット、同第99/23211号パンフレット
、同第99/29876号パンフレット、同第99/42567号パンフレット、同第9
9/43793号パンフレット、同第99/43794号パンフレット、同第99/46
399号パンフレット、同第00/29560号パンフレット、同第00/60058号
パンフレット、同第00/60059号パンフレット、同第00/60060号パンフレ
ット、同第01/14532号パンフレット、同第01/34784号パンフレット、同
第01/64852号パンフレット、同第01/66712号パンフレット、同第01/
88107号パンフレット、同第01/96537号パンフレット、同第02/0927
97号パンフレット、同第02/10355号パンフレット、同第02/31124号パ
ンフレット、同第2004055178号パンフレット、同第2004113551号パ
ンフレット、同第2005001064号パンフレット、同第2005003311号パ
ンフレット、同第2005018336号パンフレット、同第2005019443号パ
ンフレット、同第2005066338号パンフレット、同第2006002643号パ
ンフレット、同第2006012899号パンフレット、同第2006012902号パ
ンフレット、同第2006031554号パンフレット、同第2006063594号パ
ンフレット、同第2006066594号パンフレット、同第2006066596号パ
ンフレット、同第2006136161号パンフレット、同第2008000825号パ
ンフレット、同第2008088493号パンフレット、同第2008092919号パ
ンフレット、同第2008101894号パンフレット、同第2008112459号パ
ンフレット、同第2009061380号パンフレット、同第2009061381号パ
ンフレット、同第2009100102号パンフレット、同第2009140504号パ
ンフレット、同第2009149419号パンフレット、同第2010059413号パ
ンフレット、同第2010088447号パンフレット、同第2010091221号パ
ンフレット、同第2010104675号パンフレット、同第2010115021号パ
ンフレット、同第2010115028号パンフレット、同第2010117511号パ
ンフレット、同第2011076123号パンフレット、同第2011076897号パ
ンフレット、同第2011080352号パンフレット、同第2011080353号パ
ンフレット、同第2011080354号パンフレット、同第2011082425号パ
ンフレット、同第2011082429号パンフレット、同第2011087836号パ
ンフレット、同第2011098531号パンフレット、同第2013063460号パ
ンフレット、同第2013184577号パンフレット、同第2014099523号パ
ンフレット、同第2014164777号パンフレットおよび同第2015077126
号パンフレットに記載されるアミラーゼが挙げられる。市販アミラーゼの例としては、限
定はされないが、AMPLIFY(登録商標)、AMPLIFY PRIME(登録商標
)、BAN DURAMYL(登録商標)、TERMAMYL(登録商標)、TERMA
MYL(登録商標)ULTRA、FUNGAMYL(登録商標)、STAINZYME(
登録商標)、STAINZYME(登録商標)PLUS、STAINZYME(登録商標
)ULTRA、およびSTAINZYME(登録商標)EVITY(登録商標)(Nov
ozymes);EFFECTENZ(商標)</2S 1000、POWERASE(
登録商標)、PREFERENZ(商標)</2S 100、PREFERENZ(商標
)</2S 110、EXCELLENZ(商標)</2S 2000、RAPIDAS
E(登録商標)およびMAXAMYL(登録商標)P(Danisco US)が挙げら
れる。
【0122】
また、さらに他の一実施形態は、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体と、
1種以上のセルラーゼとを含む組成物に関する。一実施形態では、組成物は、組成物の約
0.00001重量%~約10重量%、約0.0001重量%~約10重量%、約0.0
01重量%~約5重量%、約0.001重量%~約2重量%、または約0.005重量%
~約0.5重量%のセルラーゼを含む。好適なセルラーゼであれば、本明細書に記載の組
成物に使用し得る。セルラーゼの一例は、化学的にまたは遺伝子操作により改変された変
異体であり得る。セルラーゼの例としては、限定はされないが、例えば、国際公開第20
05054475号パンフレット、国際公開第2005056787号パンフレット、米
国特許第7,449,318号明細書、米国特許第7,833,773号明細書、米国特
許第4,435,307号明細書;欧州特許第0495257号明細書;米国仮特許出願
第62/435340号明細書;およびPCT出願のPCT/US16/67223号明
細書に記載されているような、細菌または真菌起源のものが挙げられる。市販のセルラー
ゼの例としては、CELLUCLEAN(登録商標)、CELLUZYME(登録商標)
、CAREZYME(登録商標)、CAREZYME(登録商標)PREMIUM、EN
DOLASE(登録商標)RENOZYMEおよび<23(登録商標)(Novozym
es);REVITALENZ(登録商標)100、REVITALENZ(登録商標)
200/220およびREVITALENZ(登録商標)2000(Danisco U
S);ならびにKAC-500(B)(花王株式会社)が挙げられるが、これらに限定さ
れない。いくつかの実施形態では、セルラーゼは、成熟野生型または変異体セルラーゼの
一部または断片として含まれ、N末端の一部は欠失している(例えば、米国特許第5,8
74,276号を参照されたい)。
【0123】
またさらに他の実施形態は、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体と、1種
以上のマンナナーゼとを含む組成物に関する。一実施形態では、組成物は、組成物の約0
.00001重量%~約10重量%、約0.0001重量%~約10重量%、約0.00
1重量%~約5重量%、約0.001重量%~約2重量%、または約0.005重量%~
約0.5重量%のマンナナーゼを含む。マンナナーゼの一例は、化学的にまたは遺伝子操
作により改変された変異体であり得る。マンナナーゼの例としては、限定はされないが、
例えば、国際公開第2016007929号パンフレット;米国特許第6566114号
明細書、同第6602842号明細書、および同第6440991号明細書;ならびに国
際出願PCT/US2016/060850号明細書および同PCT/US2016/0
60844号明細書に記載されているような、細菌または真菌起源のものが挙げられる。
市販のマンナナーゼの例としては、限定はされないが、MANNAWAY(登録商標)(
Novozymes)、ならびにEFFECTENZ(商標)M 1000、PREFE
RENZ(登録商標)M 100、MANNASTAR(登録商標)およびPURABR
ITE(Danisco US)が挙げられる。
【0124】
なおさらなる他の実施形態は、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体と、1
種以上のペルオキシダーゼおよび/またはペルオキシダーゼとを含む組成物に関する。一
実施形態では、組成物は、組成物の約0.00001重量%~約10重量%、約0.00
01重量%~約10重量%、約0.001重量%~約5重量%、約0.001重量%~約
2重量%、または約0.005重量%~約0.5重量%のペルオキシダーゼまたはオキシ
ダーゼを含む。ペルオキシダーゼは、過酸化水素またはその供給源(例えば、過炭酸塩、
過ホウ酸塩または過硫酸塩)と組み合わせて使用してもよく、またオキシダーゼは、酸素
と組み合わせて使用してもよい。ペルオキシダーゼおよびオキシダーゼは、「漂白液」用
に(すなわち、洗浄液中で布帛を一緒に洗う際に、1つの染色した布帛から他の布帛に織
物染料が移行するのを防止するために)、単独で、または増強剤と共に使用される(例え
ば、国際公開第94/12621号パンフレットおよび同第95/01426号パンフレ
ットを参照されたい)。ペルオキシダーゼおよび/またはオキシダーゼの一例は、化学的
にまたは遺伝子操作により改変された変異体であり得る。ペルオキシダーゼ/オキシダー
ゼの例としては、限定はされないが、植物、細菌または真菌起源のものが挙げられる。
【0125】
他の実施形態は、本明細書に記載の1種以上のスブチリシン変異体と、例えば、国際公
開第2005056782号パンフレット、同第2007106293号パンフレット、
同第2008063400号パンフレット、同第2008106214号パンフレットお
よび同第2008106215号パンフレットに記載されているような、1種以上1種以
上のペルヒドロラーゼとを含む組成物に関する。
【0126】
さらに他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上の組成物に含有される、本明細書
に記載の1種以上のスブチリシン変異体、および1種以上の追加の酵素は、それぞれ独立
して、約10%までの範囲であり、洗浄用組成物の残りは、1種以上の補助材料である。
【0127】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の1種以上の組成物は、洗剤添加剤として使
用され、前記添加剤は、固体または液体形態である。このような添加剤製品は、従来の洗
剤組成物の性能を補い、かつ/または増進することを目的としており、洗浄工程の任意の
段階で添加することができる。いくつかの実施形態では、洗濯用洗剤組成物の密度は、2
0℃の測定で、約400~約1200g/リットルの範囲であり、一方、他の実施形態で
は、約500~約950g/リットルの範囲である。
【0128】
他の実施形態は、本明細書に記載の1種以上の組成物に関し、前記組成物は、着色布帛
の洗濯で使用されるか、または洗浄能力を通じて柔軟性を提供する、コンパクトな粒状布
帛洗浄用組成物であるか、または強力液体(HDL)布帛洗浄用組成物である。布帛洗浄
用組成物の例は、米国特許第6,610,642号明細書および同第6,376,450
号明細書に記載されている。ヨーロッパまたは日本の洗浄条件で使用される粒状洗濯用洗
剤組成物の例は、米国特許第6,610,642号明細書に記載がある。洗浄用組成物の
他の例は、例えば、米国特許第6,376,445号明細書;同第6,294,514号
明細書;同第5,929,022号明細書;同第5,879,584号明細書;同第5,
691,297号明細書;同第5,565,145号明細書;同第5,574,005号
明細書;同第5,569,645号明細書;同第5,565,422号明細書;同第5,
516,448号明細書;同第5,489,392号明細書;および同第5,486,3
03号明細書;同第4,968,451号明細書;同第4,597,898号明細書;同
第4,561,998号明細書;同第4,550,862号明細書;同第4,537,7
06号明細書;同第4,515,707号明細書;および同第4,515,705号明細
書に記載されている。
【0129】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の1種以上の組成物は、1種以上の洗剤ビル
ダーまたはビルダー系を含む。一実施形態では、組成物は、組成物の約1重量%、約3重
量%~約60重量%、または約5重量%~約40重量%のビルダーを含む。ビルダーの例
としては、限定はされないが、例えば、アルカリ金属、ポリリン酸のアンモニウム塩およ
びアルカノールアンモニウム塩;アルカリ金属ケイ酸塩;アルカリ土類およびアルカリ金
属炭酸塩;アルミノケイ酸塩;ポリカルボキシレート化合物;エーテルヒドロキシポリカ
ルボキシレート;マレイン酸無水物とエチレンもしくはビニルメチルエーテル、1,3,
5-トリヒドロキシベンゼン-2,4,6-トリスルホン酸およびカルボキシメチルオキ
シコハク酸とのコポリマー;各種アルカリ金属;例えばエチレンジアミン四酢酸およびニ
トリロ三酢酸などのポリ酢酸、ならびにポリカルボキシレート、例えばメリット酸、コハ
ク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン1,3,5-トリカルボ
ン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸のアンモニウム塩および置換アンモニウム塩;お
よびそれらの可溶塩が挙げられる。いくつかのそのような組成物では、ビルダーは、水溶
性硬度イオン錯体(例えば、封鎖性ビルダー)、例えば、クエン酸塩およびポリリン酸塩
(例えば、トリポリリン酸ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウム六水和物、トリポリリ
ン酸カリウム、およびトリポリリン酸ナトリウムとトリポリリン酸カリウムの混合物)を
形成する。ビルダーの例は、例えば、欧州特許第2100949号明細書に記載されてい
る。
【0130】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の1種以上の組成物は、1種以上のキレート
剤を含む。一実施形態では、組成物は、組成物の約0.1重量%~約15重量%または約
3重量%~約10重量%のキレート剤を含む。キレート剤の例としては、限定はされない
が、例えば、銅、鉄、マンガン、およびそれらの混合物が挙げられる。
【0131】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の1種以上の組成物は、1種以上の付着助剤
を含む。付着助剤の例としては、限定されないが、例えば、ポリエチレングリコール;ポ
リプロピレングリコール;ポリ炭酸塩;例えば、ポリテレフタル酸などの防汚ポリマー;
例えば、カオリナイト、モンモリロナイト、アタパルジャイト、イライト、ベントナイト
、ハロイサイトなどのクレー、およびこれらの混合物が挙げられる。
【0132】
他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上の組成物は、1種以上の再付着防止剤ま
たは非イオン性界面活性剤(汚れの再付着を防止することができる)を含む(例えば、欧
州特許第2100949号明細書を参照されたい)。
【0133】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の1種以上の組成物は、1種以上の染料移行
抑制剤を含む。ポリマー性染料移行抑制剤の例としては、限定されないが、ポリビニルピ
ロリドンポリマー、ポリアミンN-オキシドポリマー、N-ビニルピロリドンとN-ビニ
ルイミダゾールとのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン、ポリビニルイミダゾール、
およびこれらの混合物が挙げられる。一実施形態では、組成物は、組成物の約0.000
1重量%~約10重量%、約0.01重量%~約5重量%、または約0.1重量%~約3
重量%の染料移行抑制剤を含む。
【0134】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の1種以上の組成物は、1種以上のケイ酸塩
を含む。ケイ酸塩の例としては、限定はされないが、ケイ酸ナトリウム、例えば、二ケイ
酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、および結晶性フィロケイ酸塩が挙げられる。いく
つかの実施形態では、ケイ酸塩は、組成物の約1重量%~約20重量%、または約5重量
%~約15重量%の量で存在する。
【0135】
いくつかのさらなる実施形態では、本明細書に記載の1種以上の組成物は、1種以上の
分散剤を含む。水溶性有機物質としては、限定はされないが、例えば、ホモポリマー酸も
しくはコポリマー酸またはそれらの塩が挙げられ、それらにおいては、ポリカルボン酸は
、2個以下の炭素原子で相互に分離された、少なくとも2つのカルボキシル基を含む。
【0136】
いくつかのさらなる実施形態では、本明細書に記載の1種以上の組成物は、1種以上の
酵素安定剤を含む。いくつかの実施形態では、酵素安定剤は、カルシウムおよび/または
マグネシウムイオンの水溶性供給源である。いくつかの実施形態では、酵素安定剤として
、オリゴ糖、多糖、および無機二価金属塩、例えばカルシウム塩などのアルカリ土類金属
塩を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される酵素は、最終組成物中に、亜
鉛(II)、カルシウム(II)および/またはマグネシウム(II)イオンの水溶性供
給源が存在し、酵素にそのようなイオンを供給することにより安定化されるが、他の金属
イオン(例えば、バリウム(II)、スカンジウム(II)、鉄(II)、マンガン(I
I)、アルミニウム(III)、スズ(II)、コバルト(II)、銅(II)、ニッケ
ル(II)およびオキソバナジウム(IV))も同様である。塩化物および硫酸塩もまた
本発明のいくつかの実施例で使用される。オリゴ糖および多糖(例えば、デキストリン)
は、例えば、国際公開07/145964号パンフレットに記載されている。いくつかの
実施形態では、ホウ素含有化合物(例えば、ホウ酸塩、4-ホルミルフェニルボロン酸)
および/またはトリペプチドアルデヒドなどの可逆的プロテアーゼ阻害剤もまた使用され
る。
【0137】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の1種以上の組成物は、1種以上の漂白剤、
漂白活性化剤、および/または漂白触媒を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記
載の1種以上の組成物は、1種以上の無機および/または有機漂白化合物を含む。無機漂
白剤の例としては、限定はされないが、過水和物塩、例えば、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過
リン酸塩、過硫酸塩、および過ケイ酸塩が挙げられる。いくつかの実施形態では、無機過
水和物塩は、アルカリ金属塩である。いくつかの実施形態では、無機過水和物塩は、追加
の保護なしの結晶性の固体として含まれるが、他のいくつかの実施形態では、塩が被覆さ
れる。漂白活性化剤は、典型的には、60℃以下の温度の洗浄過程で、漂白作用を増大さ
せる有機過酸前駆体である。漂白活性化剤の例としては、過加水分解条件下で、約1~約
10個の炭素原子もしくは約2~約4個の炭素原子を有する脂肪族ペルオキシカルボン酸
、および/または任意選択により置換された過安息香酸を与える化合物が挙げられる。漂
白活性化剤の例は、例えば、欧州特許第2100949号明細書に記載されている)。漂
白触媒の例としては、限定はされないが、マンガントリアザシクロノナンおよび関連錯体
、ならびにコバルト、銅、マンガン、および鉄錯体が挙げられる。漂白触媒のさらなる例
は、例えば、米国特許第4,246,612号明細書;同第5,227,084号明細書
;同第4,810,410号明細書;国際公開第99/06521号パンフレット;およ
び欧州特許第2100949号明細書に記載されている。
【0138】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の1種以上の組成物は、1種以上の触媒金属
錯体を含む。いくつかの実施形態では、金属含有漂白触媒が使用される。いくつかの実施
形態では、金属漂白触媒は、所定の漂白触媒活性の遷移金属カチオン(例えば、銅、鉄、
チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン、またはマンガンのカチオン)、漂白触
媒活性を殆どまたは全く有しない補助金属カチオン(例えば、亜鉛またはアルミニウムカ
チオン)、ならびに触媒および補助金属カチオンに対して所定の安定性定数を有する封鎖
剤、特にエチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四(メチレンホスホン酸)、および
これらの水溶性塩を含む触媒系を含む(例えば、米国特許第4,430,243号明細書
を参照されたい)。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の1種以上の組成物は、マ
ンガン化合物によって触媒される。そのような化合物および使用量は、例えば、米国特許
第5,576,282号明細書に記載されている。さらなる実施形態では、コバルト漂白
触媒が使用され、本明細書に記載の1種以上の組成物に含まれる。各種コバルト漂白触媒
が、例えば、米国特許第5,597,936号明細書および米国特許第5,595,96
7号明細書に記載されている。
【0139】
いくつかのさらなる実施形態では、本明細書に記載の1種以上の組成物は、大多環状の
剛性配位子(MRL)の遷移金属錯体を含む。実際問題として、限定としてではなく、い
くつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および洗浄プロセスは、洗浄液中に少な
くとも1億分の1のオーダーで、約0.005ppm~約25ppm、約0.05ppm
~約10ppm、または約0.1ppm~約5ppmの活性MRLを提供するように調節
される。
【0140】
MRLの例としては、限定はされないが、架橋されている特別の超剛性配位子、例えば
、5,12-ジエチル-1,5,8,12-テトラアザビシクロ[6.6.2]ヘキサデ
カンが挙げられる。金属MRLの例は、例えば、国際公開第2000/32601号パン
フレットおよび米国特許第6,225,464号明細書に記載されている。
【0141】
他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上の組成物が1種以上の金属ケア剤を含む
。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物の約0.1重量%~約5重量%の金属ケア
剤を含む。金属ケア剤の例としては、例えば、アルミニウム、ステンレス鋼、および非鉄
金属(例えば、銀および銅)が挙げられる。金属ケア剤のさらなる例としては、例えば、
欧州特許第2100949号明細書、国際公開第94/26860号パンフレット、およ
び同第94/26859号パンフレットに記載されている。いくつかの組成物では、金属
ケア剤は亜鉛塩である。
【0142】
他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上の組成物は、リン酸塩および/またはホ
ウ素を含む。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の1種以上の組成物は、リン酸塩
またはホウ素を含まない。
【実施例0143】
実施例1
方法
性能指数
酵素の性能指数(PI)は、同じタンパク質濃度で、変異体の性能(測定値)を親酵素
のそれ(理論値または測定値)と比較する。親酵素の理論濃度は、親酵素の標準曲線のラ
ングミュアフィットから抽出されたパラメーターを用いて計算することができる。1より
も大きいPI(PI>1)は、親またはベンチマークプロテアーゼ(分析された各データ
セット毎に定義される)と比較して、変異体により性能が改善されたことを示し、PIが
1(PI=1)は、親と同じ性能の変異体であることを示し、1未満のPI(PI<1)
は、親よりも性能が劣る変異体であることを示す。
【0144】
タンパク質の精製
試料を、25mMのMES、pH5.4、1mMのCaCl2緩衝液で一晩透析し、同
じ緩衝液で平衡化した30mLのSource 15Sカラム(GE Healthca
re)にロードした。0~150mM NaClの勾配で運転し、画分を集めた。標的タ
ンパク質を含む画分をプールし、濃縮し、40%プロピレングリコールと共に製剤化し、
滅菌濾過した。
【0145】
タンパク質測定のためのHPLCアッセイ
高分解能濃度測定のために、タンパク質試料に対して高速液体クロマトグラフィー(H
PLC)を適用した。タンパク質の定量に、Agilent 300SB-C8カラムを
備えたAgilent 1100 HPLCを使用した。水中0.1%トリフルオロ酢酸
(TFA)およびアセトニトリル中0.1%TFAの勾配を使用して、カラムからサンプ
ルを溶出させた。220nmで吸光度を測定し、ChemStationソフトウェア(
Agilent Technologies、USA)を用いてピークを積分した。JV
0001と名付けられた精製GG36プロテアーゼ変異体(配列番号14)の標準曲線に
基づいて、試料のタンパク質濃度を算出した。
【0146】
プロテアーゼ活性アッセイ
GG36野生型(「WT」)(配列番号1)(「親」)およびその変異体のプロテアー
ゼ活性を、ジメチルカゼイン(DMC)または脱脂乳基質の加水分解を測定することによ
って、またはN-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe p-ニトロアニリド(
suc-AAPF-pNA)発色基質の加水分解を測定することによって試験した。
【0147】
DMC試験に使用した試薬溶液は:100mM炭酸ナトリウムバッファーpH9.5中
に2.5w/v%のDMC(Sigma C-9801)、試薬A中に0.075%のT
NBSA(Thermo Scientific)であった。試薬A: 15mLの4N
NaOH中に45.4gのNa2B4O7.10H20を加え、脱イオン水で最終容量
を1000mLにしたもの。3分間の加水分解中に線形応答が得られるよう、プロテアー
ゼ上清を希釈溶液:10mM NaCl、0.1mM CaCl2、0.005% Tw
een-80で所望の濃度に希釈した。384ウェルマイクロタイタープレート(MTP
)に27μlのDMC基質を充填し、続いて、試薬A中の27μlのTNBSAを添加し
た。その後、6μLの5μl希釈プロテアーゼ上清をゆっくりと混合しながら加えた。S
pectraMaxプレートリーダーを動力学モードで使用して、405nmで3分間、
室温で活性を測定した。各試料の読み取り値から、熱的に不活性化下プロテアーゼを含有
するブランクの吸収を減じた。プロテアーゼ活性はmOD/minで表した。
【0148】
脱脂乳アッセイに使用した試薬溶液は、10gpgの硬度を有する、100mMトリス
、0.005%Tween-80、pH8.6中に、40mg/mLのBD Difco
脱脂乳粉末を加えたものであった。溶液を使用前に1時間平衡化した。SpectraM
axプレートリーダーを動力学モードで使用して、650nmで3分間、室温で活性を測
定した。活性はmOD/minで表した。
【0149】
プロテアーゼ活性を、N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe p-ニトロ
アニリド(suc-AAPF-pNA、Sigma:S-7388)発色基質の加水分解
を測定することによって試験した。使用した試薬溶液は:100mMトリス-HCl p
H8.6、0.005%Tween(登録商標)-80(トリス緩衝液)およびDMSO
中の160mM suc-AAPF-pNA(suc-AAPF-pNAストック溶液)
であった。酵素上清を、希釈溶液(10mM塩化ナトリウム、0.1mM塩化カルシウム
、0.005%Tween(登録商標)-80および0.02%アジ化ナトリウム)を用
いて希釈した。作業用基質溶液を調製するために、1mLのsuc-AAPF-pNAス
トック溶液を100mLのトリス緩衝液に添加し混合した。1mg/mLのsuc-AA
PF-pNA作業用溶液を50μL/ウェルで384ウェルのマイクロタイタープレート
(MTP)に充填し、希釈した酵素上清のアリコート(5μL/ウェル)を、ゆっくり混
合しながらこのMTPのウェルに加えた。SpectraMax分光光度計プレートリー
ダーを動力学モードで使用して、405nmで3分間、室温で吸光度を読み取ることによ
り活性を測定した。各試料の読み取り値から、熱的に不活性化したプロテアーゼを含有す
るブランクの吸光度を減じた。プロテアーゼ活性をmOD/minで表し、プロテアーゼ
希釈物を標的にして、ブランク補正した非ストレスプロテアーゼ活性を5~300mOD
/minの範囲で得た。
【0150】
ADW洗剤の洗浄性能
ディッシュベースの用途の読みとして、PAS-38マイクロスワッチ(Center
for Testmaterials BV,Vlaardingen,Nether
landsから購入した、カーボンブラック染料でエージングし、着色したポリアクリル
布帛上の卵黄)を使用して、GG36変異体の洗浄性能を親と比較して試験した。(MT
Pに適合するように)事前にパンチされ、濯がれ、充填されたスワッチを含むMTP(C
orning 3641)が、Center for Testmaterials B
Vで調製された。10mM CAPSを用いてpHを11に調節した組成物A(本明細書
の下記表1に示す)を用い、自動食器洗浄(ADW)適用条件下でGG36変異体の洗浄
性能を評価した。180μlの10mM CAPS緩衝液(pH11)を、PAS38マ
イクロスワッチを含むMTPに添加することによって、PAS38スワッチを調製した。
MTPに封をし、iEMSインキュベータ内において、60℃、振盪速度1100rpm
で30分間インキュベートした。インキュベーション後、性能アッセイで使用する前に、
緩衝液を除去し、プレートを空気乾燥した。50℃で試験するために、酵素を添加する前
に、水硬度19gpg(超硬水条件を表す)の組成物AをMTPに充填した。酵素を添加
する前に、水硬度7gpg(中硬水条件を表す)の組成物Aおよび組成物Bを20℃でM
TPに充填した(中程度の水の条件を表す)。水の硬度は、15,000gpg(Ca:
Mg=3:1、すなわち1.924M CaCl2および0.641M MgCl2)の
ストック溶液を用いて調節した。洗浄条件については、洗浄試験のために、組成物Aを3
.95g/Lの最終濃度に希釈し、組成物Bを1mL/Lの最終濃度に希釈した。
【0151】
アッセイのために、5~10uL(10~20ppm)の希釈酵素溶液を各ウェルに添
加した。MTPを密封し、次いでIEMSシェーカー中、20℃または50℃で30分間
インキュベートした。インキュベーション後、160μlの上清を新たなMTP(Cos
tar 9017)に移し、SpectraMaxプレートリーダーを用いて405nm
で吸光度を測定した。各試料の値からブランクの対照(無酵素)の値を減じて吸光度結果
(以下、「ブランク減算吸光度」)を得た。各条件について、各酵素のブランク減算吸光
度を親も含めて、同じ濃度の親の予測吸光度値で割ることによって比を決定する。この値
は、ラングミュアフィットにフィットさせた、精製した親の標準曲線から決定する。各酵
素について上で算出した比を、親について算出した上記の比で割ることによりPIを算出
した。
【0152】
【0153】
ADW洗剤の熱安定性
酵素の安定性を測定するために、所望の水硬度(1または19gpg)で、最終濃度が
3.95g/Lとなるように脱イオン水に溶解した組成物Aと、GG36変異体のアリコ
ートとを、所望の酵素濃度に到達するように添加した。続いて、上に記載したDMCプロ
テアーゼ活性アッセイにより、加熱インキュベーション工程の前後でプロテアーゼのタン
パク質分解活性を測定した。加熱インキュベーション工程の温度および時間は、参照用プ
ロテアーゼの残留活性が約30%になるように選択した。測定は、(a)48℃から57
℃の範囲のストレス温度にある軟水(1gpg)、および(b)56℃から71℃の範囲
のストレス温度にある硬水(19gpg)で行った。%残留活性は、非ストレス活性に対
するストレス活性の比をとり、100を乗ずることによって算出した。安定性PIを、G
G36変異体の残留活性を親の残留活性で除すことによって得た。変異体の安定性が増加
するにつれて、親とますます安定になる変異体との間の安定性の大きな差のために、%残
留活性を測定するための対照として親を使用することができなくなった。他の変異体と同
様の%残留活性にストレスをかけることができるJV0009を、新しい対照変異体とし
て選択し、その後、親の代わりに使用して、これらの変異体のPIを算出した。JV00
09で算出されたPIを親に対するものに変換するために、JV0009および親の半減
期を1および19gpgで決定した。半減期は、異なる時点での残りのDMC活性を測定
し、その後、時点対残りの活性を単一の指数関数的減衰関数にフィッテイングすることに
より決定した。各水硬度で算出された半減期の比を用いて、JV0009に関して計算さ
れたPIを親に関するPIに変換した。表4に示すPIは、この方法でJV0009から
親に変換したものである。
【0154】
洗濯洗剤の洗浄性能
洗濯用途のための読み取りとして、EMPA-116マイクロスワッチ(Center
for Testmaterials BV,Vlaardingen,Nether
landsから購入した、血液/ミルク/インクが付いたコットン)を用い、JV000
1に対するGG36変異体の洗浄性能を試験した。アッセイは、2016年に地元のスー
パーマーケットから購入した市販の強力液体洗濯(HDL)洗剤TIDE(登録商標)(
Original scent、Procter and Gamble)を用いて行っ
た。
【0155】
バックグラウンド酵素活性を無くすために、洗剤を95℃の水浴中で4時間インキュベ
ートすることにより、この市販の洗剤中に存在する酵素を不活化した。加熱インキュベー
ション後、上記のAAPF活性アッセイにより、残存するバックグラウンドプロテアーゼ
活性について洗剤を試験したところ、4時間の加熱インキュベーション後にプロテアーゼ
活性は検出されず、バックグラウンド活性の不活性化が示された。
【0156】
MTPプレート(非結合型平底透明ポリスチレン96ウェルプレート、Corning
3641)中の、予めパンチした(MTPに適合するように)スワッチは、Center
for Testmaterials BV、Vlaardingen、Nether
landsにより調製された。180μLの脱イオン水を各スワッチ含有ウェルに加え、
プレートを25℃で15分間、1150rpmで振盪することによって(例えば、iEM
Sインキュベータ/シェーカー(Thermo Fisher Scientific,
Waltham,MA)中で)、これらのマイクロスワッチ含有プレートを予め濯いだ。
濯ぎ水を除去し、次いでプレート中でスワッチを一晩空気乾燥した。
【0157】
このアッセイでは、Bradford法により、Bio-Rad Protein A
ssay Dye Reagent Concentrate(カタログ番号500-0
006,Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)を使用
し、製造業者の使用説明書にしたがって、酵素上清中のタンパク質濃度を測定した。簡潔
に記せば、試薬濃縮物を脱イオン水で作業濃度に希釈し(水対濃縮物比4:1(v/v)
)、希釈した酵素上清のアリコートを、マイクロタイタープレート(例えば、非結合型平
底透明ポリスチレンプレート、Corning3641)の各ウェル中で作業試薬と混合
した(試料対試薬比1:20(v/v))。プレートを室温で10分間インキュベートし
、595nmで吸光度をプレートリーダー分光光度計(例えば、SpectraMax
Plus384、Molecular Devices、Sunnyvale、CA)で
測定した。試料中のタンパク質濃度は、精製したJV0001プロテアーゼの標準曲線に
基づいて決定した。
【0158】
酵素変異体の洗浄性能を試験するために、熱不活化TIDE(登録商標)洗剤の溶液(
最終洗剤濃度0.78g/L、pH8.2および水硬度6gpgの5mM HEPES緩
衝液を使用して希釈)を予め充填したマイクロウォッチ含有MTPに、酵素上清のアリコ
ートを添加して、0.5~2.5ppmの最終酵素濃度で、1ウェル当たり180μLの
最終容量に到達させた。MTPを密封し、次いで、iEMSインキュベータ/シェーカー
(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)中、2
5℃で、1150rpmで撹拌しながら、30分間インキュベートした。インキュベーシ
ョン後、100μLの洗浄液上清を新たなMTP(例えば、中結合型平底透明ポリスチレ
ンプレート、Corning9017)に移し、プレートリーダー分光光度計(例えば、
SpectraMax Plus384、Molecular Devices、Sun
nyvale、CA)により600nmで吸光度を測定した。ブランク対照(酵素なし)
の吸光度の値を各試料の吸光度の値から減じて、ブランクを減算した吸光度結果(以下、
「ブランク減算吸光度」)を得た。各条件について、各酵素のブランク減算吸光度をJV
0001プロテアーゼを含めて、同じ濃度でのJV0001プロテアーゼの予測吸光度値
で割ることによって比を決定する。この予測吸収値は、ラングミュアフィットにフィット
させた、精製したJV0001プロテアーゼの標準曲線から決定する。各酵素について上
で計算した比を、JV0001プロテアーゼについて算出した上記の比で割ることにより
、性能指数(PI)を計算した。
【0159】
洗濯洗剤の熱安定性
GG36変異体のプロテアーゼ安定性を、2016年に地元のスーパーマーケットから
購入した市販の強力液体洗濯(HDL)洗剤TIDE(登録商標)(Original
scent、Procter and Gamble)を使用して、ストレス条件下でイ
ンキュベートした後、試料の残留活性を測定することによって評価した。バックグラウン
ド酵素活性を無くすために、この市販の洗剤中に存在する酵素を、「洗濯洗剤の洗浄性能
」(洗剤を95℃の水浴中で4時間インキュベートし、AAPF活性アッセイによりバッ
クグラウンドプロテアーゼ活性の不在を実証する)の下で上記のプロトコルを用いて不活
化した。
【0160】
熱不活化洗剤を脱イオン水で10w/w%に希釈し、GG36変異体のアリコートを添
加して所望の酵素濃度にした。続いて、上記のAAPFプロテアーゼ活性アッセイにより
、加熱インキュベーション工程の前後でプロテアーゼのタンパク質分解活性を測定した。
GG36、JV0001、およびJV0009を対照として使用し、対照の1つが30~
60%の残留活性を示すようにインキュベーション条件を選択した。加熱インキュベーシ
ョン工程は、50℃~61℃の範囲のストレス温度で5分間行った。
【0161】
AAPF活性アッセイを行う前に、プロテアーゼ-洗剤試料を希釈溶液(10mM塩化
ナトリウム、0.1mM塩化カルシウム、0.005%Tween80および0.02%
アジ化ナトリウム)で10倍に希釈した。非ストレス活性値およびストレス活性値を3回
測定した。ブランク減算ストレス活性をブランク減算非ストレス活性で除すことにより、
各反復での残存活性を計算した。続いて、これらの3回の残留活性測定値を平均し、10
0を乗じて、それらを%残留活性として表した。
【0162】
実施例2
GG36プロテアーゼ変異体のクローニングおよび発現
従来の分子生物学的手法を用いて、GG36変異体を生成するDNA操作を行った(例
えば、Sambrook et al,Molecular Cloning:Cold
Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい)。
異なる変異体を生成するために、GG36WTの配列に複数のアミノ酸改変を導入した人
工DNA配列を生成した。GG36WT遺伝子のヌクレオチド配列を、配列番号3に示す
。配列番号4に示すB・スブチリス(B.subtilis)aprEプロモーター、お
よび配列番号5に示すB・スブチリス(B.subtilis)aprEシグナルペプチ
ドを含むDNAカセットを合成した。当該技術分野において知られている技術を用いて、
PCR断片を、Gibson Assemblyを用いてアセンブルして、最終の発現カ
セットを作製した。配列番号5によってコードされるB・スブチリス(B.subtil
is)由来のaprEシグナルペプチドのアミノ酸配列を、配列番号6として示す。
【0163】
上記のGG36変異体および他のエレメントを組み込んだ発現カセットを、好適なB・
スブチリス(B.subtilis)株の染色体に組み込むか、またはpSB複製シャト
ルベクターにクローニングし(Babe LM,Yoast S,Dreyer M a
nd Schmidt BF,「Heterologous expression o
f human granzyme K in Bacillus subtilis
and characterization of its hydrolytic a
ctivity in vitro」,Biotechnol Appl Bioche
m.,27,Pt 2,117-24,1998)、好適なB・スブチリス(B.sub
tilis)株に形質転換した。pSBベクターはpBNpptに由来し、これは、ap
rE遺伝子断片をプラスミドpBN3にクローニングすることによって構築した。プラス
ミドpBN3は、プラスミドpBN2からアンピシリン遺伝子中のPstI部位を除去す
ることにより構築した。プラスミドpBN2は、pUC18からの多重クローニング部位
を有する、pBR322およびpUB110のハイブリッドプラスミドであった。B・ス
ブチリス(B.subtilis)発現カセット(配列番号7で示す)およびGG36遺
伝子(配列番号3で示す)を含むDNA断片を、表2に示すプライマーを使用し、PCR
により増幅した。
【0164】
【0165】
当該技術分野において知られている技術を使用し、Gibson Assembly(
SGI DNA Cat# GA1100-10)を用いてPCR断片をアセンブルし、
最終発現カセットを作製した。B・スブチリス(B.subtilis)細胞を形質転換
して、5μg/mlクロラムフェニコールを補った、アガーで固めたLB上で増殖させた
。
【0166】
生化学的特徴付け用にGG36変異体サンプルを作製するために、形質転換したB・ス
ブチリス(B.subtilis)細胞の選択的増殖を、96ウェルMTP中で32℃に
て96時間、各ウェル内の培地(主要な窒素源としての尿素、主要な炭素源としてのグル
コースを有し、ロバストな細胞増殖のために1%ソイトンを補った、MOPSバッファに
基づく半規定富化培地)中で実行した。培養物を、3600rpmにて45分間の遠心分
離によって収穫して、Millipore真空系を用いてMultiscreen(登録
商標)フィルタプレート(EMD Millipore,MA,USA)により濾過した
。濾過した培養液の上清を、以下に記載するアッセイに用いた。
【0167】
生成したGG36プロテアーゼ変異体を表3および4に示す(BPN’の番号付けを使
用して、GG36に対する変異を記載)。
【0168】
【0169】
【0170】
【0171】
【0172】
【0173】
【0174】
【0175】
【0176】
【0177】
実施例3
GG36プロテアーゼ変異体のADW洗浄性能および安定性
上記の実施例2に記載のように作製したGG36変異体を、MTPアッセイ(実施例1
に記載の通り)でスクリーニングし、それらの洗浄性能および安定性を親と比較した。結
果を表5および6に示す。洗浄性能は、pH11の組成物AおよびPAS38卵黄汚れス
ワッチを用い、19gpgおよび50℃で測定した。洗浄性能は、pH11の組成物Aお
よびBならびにPAS38卵黄汚れスワッチを用い、7gpgおよび20℃で測定した。
酵素安定性は、19gpgおよび56~71℃の範囲の温度、または1gpgおよび48
~57℃の範囲の温度で、ストレス後のDMC加水分解により測定した。基質として脱脂
乳を用いて比活性を測定した。表全体を通して使用されている頭字語「ND」は、値が決
定されなかったか、得られた値が低すぎて、その値に信頼を置けないために結果が省略さ
れたかのいずれかを意味する。
【0178】
【0179】
【0180】
【0181】
【0182】
【0183】
【0184】
【0185】
【0186】
【0187】
実施例4
GG36プロテアーゼ変異体の洗濯洗浄性能および安定性
上記実施例2に記載のように作製したGG36変異体を、MTPアッセイ(実施例1に
記載の通り)でスクリーニングし、それらの洗浄性能および安定性を親と比較した。結果
を表7および8に示す。洗浄性能は、液体洗剤TIDE(登録商標)(Original
scent,Procter and Gamble)およびEMPA-116マイク
ロスワッチ(血液/ミルク/インクが付いたコットン)を用い、25℃で測定した。10
%TIDE(登録商標)液体洗剤中の酵素の熱安定性を、表7および8に記載した温度(
すなわち、50℃、59℃および/または61℃)で5分間のストレスインキュベーショ
ンの前後に、AAPF-pNA加水分解により測定した。表全体を通して使用される頭字
語「ND」は、「測定せず」を意味する。表7および8において、洗浄は親と比較したP
Iとして記載し、安定性はストレス後の残留活性率として記載している。
【0188】
【0189】
【0190】
【0191】
【0192】
実施例5
自動食器洗浄用組成物中のプロテアーゼ変異体の自動食器洗浄性能評価
試験A
14.69gの組成物Cおよび2.13gの組成物Bを含む1用量の洗剤組成物(組成
物D)を、各自動食器洗浄機の各サイクルのディスペンサー引出しの開口部に加えた。
【0193】
表9に記載のADW組成物を試験した。プロテアーゼを表9の組成物に添加する場合、
プロテアーゼは洗剤1用量当たりの活性酵素のmgとして加えた。試験したプロテアーゼ
には、JV0001、JV0008、JV0009、JV0024、およびJV0025
が含まれる。
【0194】
【0195】
試験用汚れ
Egg Yolk(DM22)およびEgg Yolk Milk(DM32)で汚し
た6.5cm×10cmのメラミンタイルの2種類の試験用汚れを使用した。これらは全
てCentre for Testmaterials(Vlaardingen,Th
e Netherlands)から提供された。
【0196】
洗浄試験手順
【0197】
【0198】
北米の自動食器洗浄機に、組成物Cを3866ppmで投入し、組成物Bを553pp
mで投入した。それぞれの汚れのタイプについて、2枚のタイルを各自動食器洗浄機に入
れた。4回の外部反復試験を実施し、表9に示す各ADW組成物の、それぞれの汚れに対
する平均汚れ除去性能を算出した(表9の各組成物について合計8回の反復)。例Aの組
成物(プロテアーゼ酵素を含まない)の洗浄性能を、デルタSRI値を計算するための各
試験の参照とした。汚れを画像解析により分析し、その結果を、汚れ除去のパーセンテー
ジとして、すなわち、参照例組成物A処理では汚れ除去指数(SRI)として、また例組
成物B(デルタB)、C(デルタC)、D(デルタD)、E(デルタE)、およびF(デ
ルタF)の各処理では参照例組成物A処理に対するSRIの変化として計算し、以下に示
した。全ての対比較に対する全体のエラー割合を0.05に制御するために、テユーキー
のHSD多重比較手順を使用する。汚れ除去指数(SRI)は、0=全く除去せず、10
0=完全除去と定義する。
【0199】
性能指数はまた、(例C、例D、例Eおよび例F組成物のそれぞれの性能-例A組成物
の性能)/(比較例B組成物の性能-例A組成物の性能)を計算することにより測定した
。
【0200】
【0201】
【0202】
例A(プロテアーゼを含まない)の組成物で洗浄した試料と、例B(JV0001を含
有)、C、D、EおよびF(それぞれJV0008、JV0009、JV0024、およ
びJV0025を含む)との比較により、表11は、JV0008、JV0009、JV
0024、およびJV0025が汚れ除去性能を改善させたことを示している。
【0203】
例Aを参照(プロテアーゼ酵素を含まない)とした、例B(JV0001を含む)の組
成物で洗浄した試料と、例C、D、E、およびF(それぞれJV0008、JV0009
、JV0024、およびJV0025を含む)との比較により、表12は、JV0008
、JV0009、JV0024、およびJV0025がJV0001よりも高いレベルの
汚れ除去を達成することを示している。
【0204】
試験B
14.69gの組成物Cおよび2.13gの組成物Bを含む1用量の洗剤組成物(組成
物D)を、各自動食器洗浄機の各サイクルのディスペンサー引出しの開口部に加えた。
【0205】
表13に記載のADW組成物を試験した。プロテアーゼを表13の組成物に添加する場
合、プロテアーゼは洗剤1用量当たりの活性酵素のmgとして加えた。試験したプロテア
ーゼには、JV0001およびJV0148が含まれる。
【0206】
【0207】
試験用汚れ
Egg Yolk(DM22)およびEgg Yolk Milk(DM32)で汚し
た6.5cm×10cmのメラミンタイルの2種の試験用汚れを使用した。これらは全て
Centre for Testmaterials(Vlaardingen,The
Netherlands)から提供された。
【0208】
洗浄試験手順
【0209】
【0210】
北米の自動食器洗浄機に、組成物Cを3866ppmで投入し、組成物Bを553pp
mで投入した。それぞれの汚れのタイプについて、2枚のタイルを各ADW機に入れた。
4回の外部反復試験を実施し、各例組成物の、それぞれの汚れに対する平均汚れ除去性能
を算出した(各例組成物について合計8回の反復)。例Aの組成物(プロテアーゼ酵素を
含まない)の洗浄性能を、デルタSRI値を計算するための各試験の参照とした。汚れを
画像解析により分析し、その結果を、汚れ除去のパーセンテージとして、すなわち、参照
例A組成物では汚れ除去指数(SRI)として、また例組成物B(デルタB)、C(デル
タC)、D(デルタD)、E(デルタE)、およびF(デルタF)の各処理では参照例組
成物A処理に対するSRIの変化として計算し、以下に示した。全ての対比較に対する全
体のエラー割合を0.05に制御するために、テユーキーのHSD多重比較手順を使用す
る。汚れ除去指数(SRI)は、0=全く除去せず、100=完全除去と定義する。
【0211】
【0212】
例A(プロテアーゼを含まない)の組成物で洗浄した試料と、例B(JV0001を含
む)およびC(JV0148を含む)との比較により、表15は、JV0148が汚れ除
去性能を改善させたことを示している。
【0213】
例Aを参照(プロテアーゼ酵素を含まない)とした、例B(JV0001を含む)の組
成物で洗浄した試料と、例C(JV0148を含む)との比較により、JV0148がJ
V0001よりはるかに高いレベルの汚れ除去を達成したことが明らかである。
【0214】
試験C
14.69gの組成物Cおよび2.13gの組成物Bを含む1用量の洗剤組成物(組成
物D)を、各自動食器洗浄機の各サイクルのディスペンサー引出しの開口部に加えた。
【0215】
表16に記載のADW組成物を試験した。プロテアーゼを表16の組成物に添加する場
合、プロテアーゼは洗剤1用量当たりの活性酵素のmgとして加えた。JV124は、試
験したプロテアーゼである。
【0216】
【0217】
試験用汚れ
Egg Yolk(DM22)およびEgg Yolk Milk(DM32)で汚し
た6.5cm×10cmのメラミンタイルの2種の試験用汚れを使用した。これらは全て
Centre for Testmaterials(Vlaardingen,The
Netherlands)から提供された。
【0218】
洗浄試験手順
【0219】
【0220】
北米の自動食器洗浄機に、組成物Cを3866ppmで投入し、組成物Bを553pp
mで投入した。それぞれの汚れのタイプについて、2枚のタイルを各ADW機に入れた。
4回の外部反復試験を実施し、各例組成物の、それぞれの汚れに対する平均汚れ除去性能
を計算した(各例組成物について合計8回の反復)。比較例Aの組成物の洗浄性能を、デ
ルタSRI値を計算するための各試験の参照とした。汚れを画像解析により分析し、その
結果を、汚れ除去のパーセンテージとして、すなわち、比較例A組成物では汚れ除去指数
(SRI)として、また例組成物B(デルタB)の処理では比較例組成物A処理に対する
SRIの変化として計算し、以下に示した。全ての対比較に対する全体のエラー割合を0
.05に制御するために、テユーキーのHSD多重比較手順を使用する。汚れ除去指数(
SRI)は、0=全く除去せず、100=完全除去と定義する。
【0221】
【0222】
比較例Aの組成物で洗浄した試料と例B(JV104を含む)との比較により、表15
は、JV0104が汚れ除去性能を改善させたことを示している。
前記アミノ酸置換の組み合わせが、X18K/R-X78N-X206Y、X24F/L/P-X78N-X206Y、X78N-X87D/R-X206Y、X78N-X129Q-X206Y、X78N-X130A-X206Y、X78N-X206Y-X209W、X78N-X206Y-X213A、およびX78N-X206Y-X249N/Rからなる群から選択される、請求項1に記載のスブチリシン変異体。
前記アミノ酸置換の組み合わせが、S78N-Q206Y、N18K/R-S78N-Q206Y、S24F/L/P-S78N-Q206Y、S24F/L/P/R-S78N-Q206Y、S78NS87D/R-Q206Y、S78N-P129Q-Q206Y、S78N-S130A-Q206Y、S78N-Q206Y-T213A、およびS78N-Q206Y-H249N/Rからなる群から選択される、請求項1に記載のスブチリシン変異体。
前記アミノ酸置換の組み合わせが、S78N-S87D-Q206YおよびN76D-S78N-S87D-Q206Yから選択され、(a)76、87、118、128、129、および130;(b)X76D、X87R、X118R、X128L、X129Q、およびX130A;又は(c)N76D、S87R、G118R、S128L、P129Q、およびS130Aから選択される1以上のアミノ酸置換をさらに含む、請求項1に記載のスブチリシン変異体。
前記アミノ酸置換の組み合わせが、N76D-S78N-S87R-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;S3V-N76D-S78N-S87R-G118R-S128LP129Q-S130A-Q206Y;N76D-S78N-S87D-G118R-S128L-P129Q-S130A-Q206Y;およびS24L-N76DS78N-S87D-A88S-G118R-Q206Y-Y209W-H249Rからなる群から選択される、請求項1~5のいずれか一項に記載のスブチリシン変異体。
前記変異体は、配列番号1または14に対してと少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%未満のアミノ酸配列同一性を有する、請求項1~6のいずれか一項に記載のスブチリシン変異体。
請求項1~8のいずれか一項に記載の1種以上のスブチリシン変異体を含む組成物であって、前記組成物は自動食器洗浄用組成物ではないことを条件とし、任意選択で、(i)前記組成物は洗剤組成物であり;(ii)前記組成物は洗濯用洗剤組成物または手洗いによる食器洗浄用洗剤組成物であり;または(iii)前記組成物は、ゲル、タブレット、粉末、固体、顆粒、単位剤形およびこれらの組み合わせから選択される、組成物。
前記組成物は、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクテートリアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、β-グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、およびラッカーゼから選択される1つ以上の追加の酵素をさらに含む、請求項9に記載の組成物。
洗浄を必要とする製品または表面を洗浄する方法であって、前記製品または表面を、請求項1~8のいずれか一項に記載のスブチリシン変異体、または請求項9または10に記載の組成物と接触させる工程を含む方法。
1つ以上の請求項12に記載の核酸を含む発現ベクターまたはカセットであって、任意選択で、前記1つ以上の核酸はプロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクターまたはカセット。