特開 2022-33728 改変細胞、調製方法、及び構築物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022033728

(43)【公開日】2022-03-02

(54)【発明の名称】改変細胞、調製方法、及び構築物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/90 20060101AFI20220222BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20220222BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220222BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20220222BHJP

【ＦＩ】

C12N15/90 100Z

C12N15/85 Z ZNA

C12N15/90 104Z

C12N5/10

C12P21/02 C

【審査請求】有

【請求項の数】19

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021177200

(22)【出願日】2021-10-29

(62)【分割の表示】P 2019534282の分割

【原出願日】2017-12-19

(31)【優先権主張番号】62/436,714

(32)【優先日】2016-12-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】515269718

【氏名又は名称】ディベロップメント センター フォー バイオテクノロジー

【氏名又は名称原語表記】ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＣＥＮＴＥＲ ＦＯＲ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100093779

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 雅紀

(72)【発明者】

【氏名】チェン，シュアン－プー

(72)【発明者】

【氏名】ルー，シン－リン

(72)【発明者】

【氏名】リン，チエン－イー

(72)【発明者】

【氏名】ルー，シュエ－リン

(72)【発明者】

【氏名】チェン，タオ－ティエン

(57)【要約】      （修正有）

【課題】改変細胞、その調製方法、及び、外因性核酸分子を宿主細胞のゲノムにおける発現増強配列内の標的部位に挿入するための構築物を提供する。
【解決手段】本発明の改変細胞は、改変細胞のゲノムに挿入された外因性核酸分子を備える。改変細胞は外因性核酸分子を宿主細胞のゲノム内の発現増強配列内の標的部位に挿入するための構築物を宿主細胞に導入することを含むプロセスにより得られ、発現増強配列は特定の配列である。本発明の外因性核酸分子を含む改変細胞の調製方法は、外因性核酸分子を宿主細胞のゲノム内の発現増強配列内の標的部位に挿入するための構築物を宿主細胞に導入するステップを備え、発現増強配列は前記特定の配列である。本発明の構築物は、外因性核酸分子を宿主細胞のゲノムにおける発現増強配列内の標的部位に挿入するための構築物であって、発現増強配列は前記特定の配列である。
【選択図】図５

【特許請求の範囲】

【請求項1】

改変細胞であって、前記改変細胞のゲノムに挿入された外因性核酸分子を備え、前記改変細胞は前記外因性核酸分子を宿主細胞のゲノム内の発現増強配列内の標的部位に挿入するための構築物を前記宿主細胞に導入することを含むプロセスにより得られ、前記発現増強配列は配列番号７から１０から選択される配列である、改変細胞。

【請求項2】

前記構築物は第１のホモロジーアーム及び第２のホモロジーアームが側面に位置する前記外因性核酸分子を含む相同的組み換え構築物であり、前記第１のホモロジーアームは前記標的部位の上流の配列と相同であり、前記第２のホモロジーアームは前記標的部位の下流の配列と相同である、請求項１に記載の改変細胞。

【請求項3】

前記発現増強配列は配列番号８及び１０から選択される、請求項２に記載の改変細胞。

【請求項4】

前記宿主細胞はＣＨＯ細胞である、請求項１から３の何れか一項に記載の改変細胞。

【請求項5】

前記改変細胞は前記標的部位に前記外因性核酸分子を含む、請求項４に記載の改変細胞。

【請求項6】

前記改変細胞は前記標的部位外の部位に前記外因性核酸分子を含み、前記改変細胞は対照細胞と比較してより高レベルに前記外因性核酸分子を発現する、請求項４に記載の改変細胞。

【請求項7】

前記外因性核酸分子はポリペプチドをコード化する、請求項１から６の何れか一項に記載の改変細胞。

【請求項8】

外因性核酸分子を含む改変細胞の調整方法であって、前記外因性核酸分子を宿主細胞のゲノム内の発現増強配列内の標的部位に挿入するための構築物を前記宿主細胞に導入するステップを備え、前記発現増強配列は配列番号７から１０から選択される配列であり、それにより前記外因性核酸分子が前記宿主細胞内のゲノム部位に挿入されて前記改変細胞となる、調整方法。

【請求項9】

前記構築物は第１のホモロジーアーム及び第２のホモロジーアームが側面に位置する前記外因性核酸分子を含む相同的組み換え構築物であり、前記第１のホモロジーアームは前記標的部位の上流の配列と相同であり、前記第２のホモロジーアームは前記標的部位の下流の配列と相同である、請求項８に記載の調製方法。

【請求項10】

前記発現増強配列は配列番号８及び１０から選択される、請求項９に記載の調製方法。

【請求項11】

前記宿主細胞はＣＨＯ細胞である、請求項８から１０の何れか一項に記載の調製方法。

【請求項12】

前記導入するステップの後、対照細胞と比較してより高レベルに前記外因性核酸分子を発現する前記改変細胞を選択するステップを更に備える、請求項８から１１の何れか一項に記載の調製方法。

【請求項13】

前記外因性核酸分子はポリペプチドをコード化する、請求項８から１２の何れか一項に記載の調製方法。

【請求項14】

外因性核酸分子を宿主細胞のゲノムにおける発現増強配列内の標的部位に挿入するための構築物であって、前記発現増強配列は配列番号７から１０から選択される配列である、構築物。

【請求項15】

前記標的部位の上流の配列と相同である第１のホモロジーアームと、前記標的部位の下流の配列と相同である第２のホモロジーアームとを含む相同的組み換え構築物である、請求項１４に記載の構築物。

【請求項16】

前記発現増強配列は配列番号８及び１０から選択される、請求項１５に記載の構築物。

【請求項17】

前記宿主細胞はＣＨＯ細胞である、請求項１４から１６の何れか一項に記載の構築物。

【請求項18】

前記第１のホモロジーアーム及び前記第２のホモロジーアームが側面に位置する外因性核酸分子を更に備える、請求項１５から１７の何れか一項に記載の構築物。

【請求項19】

前記外因性核酸分子に操作可能に結合されたプロモータを更に備える、請求項１８に記載の構築物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は改変細胞、調製方法、及び構築物に関する。

【背景技術】

【0002】

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は通常、グリコシル化のような適切な翻訳後修飾部位を有する治療用タンパク質を生成するのに使用される。生産性の高い細胞を生成するための、従来のランダムインテグレーションによる細胞株開発（ＣＬＤ）方法は、多くの細胞の検査を必要とする、多大な時間を必要とし且つ労力を要するプロセスである。タンパク質発現のための細胞株の開発の基本的な目標は、何世代にもわたって高い生産性及び安定性を有するタンパク質を発現させることである。導入遺伝子の活性の安定した染色体領域への標的組み込み（ＴＩ）が、組み換えタンパク質の安定した発現のためには望ましい。理想的には、標的組み込みされた細胞株の発現力価及び安定性は、ほとんど組み込み部位に依存するはずである。よって、生産性の高いクローンのためにＴＩ－ＣＬＤ手法を使用して何百個もの細胞を検査することのみが必要になるであろう。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

本発明は改変細胞、調製方法、及び構築物を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0004】

１つの態様において、改変細胞が提供される。その細胞は改変細胞のゲノムに挿入された外因性核酸分子を備え、改変細胞は外因性核酸分子を宿主細胞のゲノム内の発現増強配列内の標的部位に挿入するための構築物を宿主細胞に導入することを含むプロセスにより得られ、発現増強配列は配列番号７から１０から選択される配列である。例えば、発現増強配列は配列番号１から１６から選択され得る。

【0005】

構築物は第１のホモロジーアーム及び第２のホモロジーアームが側面に位置する外因性核酸分子を含む相同的組み換え構築物であり、第１のホモロジーアームは標的部位の上流の配列と相同であり、第２のホモロジーアームは標的部位の下流の配列と相同である。

【0006】

宿主細胞はＣＨＯ細胞である。

【0007】

改変細胞は標的部位における外因性核酸分子を含むことが出来る。代替的又は付加的に、改変細胞は標的部位外の部位に外因性核酸分子を含み、改変細胞は対照細胞と比較してより高レベルに外因性核酸分子を発現する。

【0008】

ある実施形態では、外因性核酸はポリペプチドをコード化し得る。

【0009】

他の態様では、外因性核酸分子を含む改変細胞の調製方法が記載される。その方法は外因性核酸分子を宿主細胞のゲノム内の発現増強配列内の標的部位に挿入するための構築物を宿主細胞に導入するステップを備え、発現増強配列は配列番号７から１０から選択される配列であり、それにより外因性核酸分子が宿主細胞内のゲノム部位に挿入されて改変細胞となる。

【0010】

ある実施形態では、外因性核酸はポリペプチドをコード化し得る。

【0011】

構築物は第１のホモロジーアーム及び第２のホモロジーアームが側面に位置する外因性核酸分子を含む相同的組み換え構築物であり、第１のホモロジーアームは標的部位の上流の配列と相同であり、第２のホモロジーアームは標的部位の下流の配列と相同である。

【0012】

宿主細胞はＣＨＯ細胞である。

【0013】

ある実施形態では、その方法は上記の導入するステップの後、対照細胞と比較してより高レベルに外因性核酸分子を発現する改変細胞を選択するステップを更に備え得る。

【0014】

更に他の態様では、外因性核酸分子を宿主細胞のゲノムにおける発現増強配列内の標的部位に挿入するための構築物が記載され、その発現増強配列は配列番号１又は２である配列を含む。

【0015】

例えば、構築物は標的部位の上流の配列と相同である第１のホモロジーアームと、標的部位の下流の配列と相同である第２のホモロジーアームとを含む相同的組み換え構築物であり得る。

【0016】

ある実施形態では、その構築物は第１のホモロジーアーム及び第２のホモロジーアームが側面に位置する外因性核酸分子を更に備える。

【0017】

その構築物は外因性核酸分子に操作可能に結合されたプロモータを更に備え得る。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】図１は配列番号７の１００１から５５３７位を含む配列である。ランダムインテグレーションされたクローンにおいて、２つの黒いボックス（白抜き文字、以下同じ）間の配列が削除され、ハーセプチン遺伝子を有するｐＣＨＯ１．０ベクターがその間に挿入された。２つのＰＡＭ配列が四角で囲まれ、２つのＣＲＩＳＰＲ標的配列がグレーで強調されている。遺伝子の標的組み込みに使用される２つのホモロジーアームが太字のフォントで示されている。下線のある配列はプライマー配列である。

【図2】図２は配列番号９の１１００位から５２０８位を含む配列である。黒いボックスは、ランダムインテグレーションされたクローンにおけるハーセプチン遺伝子の組み込み部位を示す。ＰＡＭ配列は四角で囲まれている。遺伝子の標的組み込みに使用される２つのホモロジーアームが太字のフォントで示されている。下線のある配列はプライマー配列である。

【図3】図３はＣＨＯ－Ｓ細胞内のＴｅｎｍ３部位に挿入されたハーセプチン遺伝子の発現（ｍｇ／Ｌ／コピー）を示すグラフである。グラフは以下の表２に示されるデータに基づく。

【図4】図４はＤＸＢ１１細胞内のＴｅｎｍ３部位で挿入されたハーセプチン遺伝子の発現（ｍｇ／Ｌ／コピー）を示す。グラフは以下の表３に示されるデータに基づく。１０Ｐ、５０Ｐ及び１００Ｐの各々は細胞を選択するのに使用されるピューロマイシン及びＭＴＸの濃度を示す。１０Ｐは１０μｇ／ｍｌのピューロマイシン及び１００ｎＭのＭＴＸであり、５０Ｐは５０μｇ／ｍｌのピューロマイシン及び５００ｎＭのＭＴＸであり、１００Ｐは１００μｇ／ｍｌのピューロマイシン及び１０００ｎＭのＭＴＸである。

【図5】図５はＴｅｎｍ３部位で挿入されたハーセプチン遺伝子を有するＤＸＢ１１細胞の個々のクローンの発現力価（ｍｇ／Ｌ）を示すグラフである。

【図6】図６はＳｉｖａ１部位で挿入されたハーセプチン遺伝子を有するＤＸＢ１１細胞の個々のクローンの発現力価（ｍｇ／Ｌ）を示すグラフである。

【図7】図７はＳｉｖａ１部位で挿入されたハーセプチン遺伝子を有するＤＸＢ１１細胞の個々のクローンの特定生産性（ＱＰ；ｍｇ／１０６セル／日）を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0019】

ＣＨＯ細胞における所定のゲノム配列内の、部位（すなわち標的部位）に挿入された遺伝子が、発現が増強されたことを示すことが予想外に発見された。更に、遺伝子を、これらのゲノム配列のうちの１つに特定的に挿入するように設計された相同的組み換え構築物を介して標的外のゲノム部位に挿入された遺伝子も、発現の増加したことを示すことが発見された。従って、これらのゲノム配列は、発現増強配列である。

【0020】

本明細書で使用される、「挿入部位」、「ゲノム部位」及び「標的部位」の「部位」という用語は、１つ又は複数のヌクレオチド（例えば１から５００のヌクレオチド）を含む領域を指す。

【0021】

「外因性核酸分子」という用語は、核酸分子にとって自然な部位ではない細胞内の部位に位置する核酸分子を指す。例えば、核酸分子は異なる部位の細胞内に自然に存在しても良い。或いは、核酸分子は異なる細胞から生じても良い。

【0022】

特に断りのない限り、本明細書で言及されるＣＨＯゲノムはチャイニーズハムスターの２０１３年アセンブリを指す（Ｃ＿ｇｒｉｓｅｕｓ＿ｖ１．０／ｃｒｉＧｒｉ１）。

【0023】

発現増強配列は、配列番号１から１６から選択される配列、又はその断片（例えば１００から２０００、１５０から１５００、２００から２０００、１００から５００、２５０から５００、２００から７５０、５００から１０００、５００から１５００、８００から１５００、１０００から１５００又は１０００から２０００ヌクレオチド）と少なくとも８０％（例えば８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％）同じ配列から選択され得る。
外因性の核酸分子を挿入するための標的部位は、発現増強配列内、又はその近く（例えば５００ヌクレオチド上流又は下流以内）のどこに配置されても良い。
ある実施形態では、標的部位は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３又は１５内の１から５００位、２００から５００位、５０から１０００位、１００から１０００位、２００から１０００位、３００から１０００位、４００から１０００位、５００から１０００位、１００から２０００位、５００から２０００位、７００から２０００位、１０００から２０００位、５００から３０００位、１０００から３０００位、１５００から３０００位、２０００から３０００位、２５００から３０００位、５００から４０００位、１０００から４０００位、２０００から４０００位、１５００から５０００位、２５００から５０００位、３５００から５０００位、４５００から５０００位、２０００から６０００位、３０００から６０００位、４５００から６０００位、５０００から６０００位又は５５００から６０００位内である。

【0024】

これらの発現増強配列は、改変細胞のゲノムに挿入された１つ又は複数の外因性核酸分子を高度に発現する改変細胞を生成するために使用され得る。ある実施形態では、改変細胞は外因性核酸をＣＨＯ細胞のゲノムに組み込むことにより生成される。改変細胞は対照細胞と比較して外因性核酸分子の高度な（例えば１倍以上）発現レベルを示す。

【0025】

「対照細胞」はランダムインテグレーションにより異なる部位に挿入された同じ核酸分子を含む細胞であっても良い。例えば、対照細胞は核酸分子を含むｐＣＨＯ１．０ベクターをＣＨＯ宿主細胞のゲノムにランダムインテグレーションすることにより生成され得る。
ＣＨＯ共同体（Ｔｈｅ ＣＨＯ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、以下同じ）はまた様々な潜在的ゲノム部位を特定した。対照細胞は核酸分子をこれらの部位の１つに特異的に挿入することにより生成され得る。発現レベルはｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルで計測され得る。改変細胞又は対照細胞は、挿入された核酸分子の１つ以上のコピーを含み得るため、比較はコピー当たりの発現レベルを決定することにより正常化され得る。

【0026】

発現増強配列の１つ内、又はその近くの標的部位が核酸分子の発現を高めるか否かは、業界の熟練者により決定され得る。発現増強配列内、又はその近くの標的部位の詳細な位置は、その部位が発言を増強可能であり、且つ核酸分子の安定した組み込みを可能にする限り重大ではない。部位の選択は、遺伝子を挿入するのに使用されるゲノム編集技術にも依存する。

【0027】

本明細書に記載される改変細胞は、宿主細胞のゲノムにおいて発現増強配列内の標的部位に外因性核酸分子を挿入する構造体を宿主細胞へ導入することを含むプロセスにより得られる。

【0028】

方法及び構造体は、発現増強配列の１つ内に核酸分子を特異的に挿入するのに使用され得るにも拘わらず、部位外への挿入がなお起こり得る。その様な部位外への挿入を含む改変細胞もまた挿入された核酸分子の発現増加を示すことが分かった。理論に制約されることを意図することなく、そのような部位外への挿入は、発現増強配列から派生する相同的組み換え構築物におけるホモロジーアーム（又はその断片）を運搬するものと考えられている。従って、本明細書に記載された改変細胞は、発現増強配列の１つの内の標的部位、又は異なる部位に挿入される外因性核酸分子を有しても良い。

【0029】

様々な方法が、ゲノム部位で外因性核酸分子を挿入するのに使用され得る。その様な方法には、相同組み換え修復、非相同末端結合、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を基礎とする方法、ＴＡＬＥＮ（転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ）を基礎とする方法、及びＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し）／Ｃａｓ９法が含まれる。

【0030】

本明細書に記載された発現増強配列の１つの内、又はその近くの標的部位に外因性核酸分子を挿入するための相同的組み換え（ＨＲ）構築物が設計され得る。その構築物は標的部位の上流の配列と相同の第１のホモロジーアームと、標的部位の下流の配列と相同の第２のホモロジーアームを含む。
各ホモロジーアームは、例えば２００から１５００のヌクレオチド（例として２００から２５０、２００から４００、２５０から５００、３００から５００、４００から６００、４５０から６５０、５００から８００、５５０から７５０、６５０から９００、８００から１０００、９５０から１２００又は１０００から１５００ヌクレオチド）を含み得る。
ＨＲ構築物は更に、ゲノムに挿入される遺伝子が構築物内に結合されるように、２つのホモロジーアームの間に多数のクローニング部位を含み得る。或いは、２つの相同的配列が側面に位置する遺伝子を含むＨＲ構築物は、ＰＣＲ等の業界に知られた技術を使用して構築され得る。

【0031】

ＨＲ構築物は、ＴＡＬＥＮ法又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法において使用され得、それにより核酸分子が細胞のゲノムに挿入される。
標的部位は、使用されるゲノム編集方法に応じて選択されても良い。ＴＡＬＥＮ法及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法は両方とも、標的部位においてゲノム内に二本鎖ＤＮＡの切断を導入することにより機能する。選択された部位に基づき、標的部位において挿入される核酸分子を含むＨＲ構築物が設計且つ構築され得る。

【0032】

ＴＡＬＥＮ法は、転写活性化様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質の人工のＤＮＡ結合ドメイン及び制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインを含むキメラヌクレアーゼを利用する。ＴＡＬＥタンパク質によるＤＮＡ認識のコードが解明されると、任意のＤＮＡ配列の認識のための人工のＤＮＡ結合ドメインが設計され得る。部位外の効果を最小限にするため、ＴＡＬＥＮ法は各々が二本鎖ＤＮＡの切断部位の何れかの側の配列を認識する一対のキメラヌクレアーゼを使用できる。熟練者は、選択された部位に向けられたＴＡＬＥＮ構築物を設計することが出来るであろう。

【0033】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法は標的部位に特有のｇＲＮＡ及びエンドヌクレアーゼＣａｓ９を必要とする。標的部位はゲノムの残りと比較して特有なものであり、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）のすぐ上流にある任意の配列（約２０ヌクレオチド）であっても良い。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合物を標的部位に結合すると、Ｃａｓ９はＤＮＡを切断する。配列番号７内の例示的な２つのＰＡＭが図１に示され、配列番号９内の例示的なＰＡＭが図２に示される。熟練者は、標的部位に向けられたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構築物を設計できるであろう。

【0034】

挿入される外因性核酸は、改変細胞内で機能的なプロモータに、操作可能に結合されたポリペプチドをコード化する配列を含み得る。プロモータ配列はコード化配列に対して内因性であり得る。ある実施形態では、コード化配列は異種プロモータ配列に操作可能に結合される。
外因性核酸分子の発現は業界に知られた技術を使用して更に最適化され得る。例えば、発現は、核酸分子を強いプロモータ及び／又は１つ又は複数の転写エンハンサーエレメントに結合させることにより更に高められ得る。

【0035】

外因性核酸分子の細胞のゲノムへの組み込みは、業界に知られた方法を使用して検証され得る。改変細胞は、適切な条件の下で培養され、核酸分子を発現させ得る。改変細胞が発現が増強されていることを示すか否かは、ＥＬＩＳＡ又はＲＴ‐ＰＣＲ等の、業界に知られた方法を使用して決定され得る。

【0036】

更に、発現増強配列は、自然のゲノム遺伝子座にあろうと他の遺伝子座にあろうと発現増強効果を発揮できるため、それらは一時的な遺伝子の発現のための発現ベクターに含まれ得る。例えば、発現ベクターは遺伝子と、１つ又は複数の発現増強配列とを含み得る。１つ以上の発現増強配列が含まれる場合、それらは間にスペーサーを設け又は設けずに縦一列に配置され得る。ベクターは、一時的に遺伝子を発現させるため、宿主細胞に導入され得る。

【0037】

業界に知られた様々な宿主細胞が、本明細書に記載された改変細胞を発生させるために使用され得る。その様な宿主細胞は、任意の哺乳類細胞を含み得る。好ましくは、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。

【0038】

本明細書に記載された改変細胞は、様々な商業的及び実験的な応用に使用され得る。特に細胞は、治療用タンパク質を生成するのに使用され得る。

【0039】

１つ又は複数の実施形態の詳細が、添付の図面及び以下の説明において述べられる。実施形態の他の特徴、目的及び利点は、明細書及び図面、並びに請求項により明らかになるであろう。なお、以下の具体的な実施例は、単に例示的なものとして解釈されるべきであり、如何なる方法であれ、本明細書の残りの部分を制限しない。当業者は更なる詳細説明を必要とせずに、本明細書の記載に基づき、本開示を最大限に利用可能であると考えられる。

【0040】

（実施例）
本発明の発明者らは、ハーセプチン遺伝子を含むｐＣＨＯ１．０ベクターのＣＨＯ－Ｓ宿主細胞のゲノムへのランダムインテグレーションにより、２つのＣＨＯ細胞株、３Ｃ８及び３Ｇ７を事前に作製した。３Ｃ８及び３Ｇ７はそれぞれ１２個及び５個の遺伝子のコピーを含み、３ｇ／Ｌ及び２．５ｇ／Ｌの遺伝子産物を生成する。
これらの２つの細胞株の組み込み部位を分析した。以下の表１を参照されたい。Ｓｒｘｎ１、Ａｄｈ５、Ａｓｐｈｄ／Ｊｏｓｄ２、Ｔｅｎｍ３、Ｓｉｖａ１、Ｓｙｎｅ１、Ｓｍａｒｃｃ１及びＲｓｇ１９の部位が、それぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２，１４及び１６内に配置された。

【0041】

【表1】

【0042】

３Ｃ８細胞株のＴｅｎｍ３組み込み部位を図１に示す。３Ｃ８細胞株において、２つの黒いボックス間の配列が削除され、ハーセプチン遺伝子を有するｐＣＨＯ１．０ベクターがその間に挿入された。
３Ｇ７細胞株におけるＳｉｖａ１内の組み込み部位を図２に示す。

【0043】

本発明の発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ法を使用して、ハーセプチン遺伝子をＣＨＯ宿主細胞のゲノムに挿入することにより、Ｔｅｎｍ３組み込み部位を検査した。
図１を参照すると、使用された２つのＣＲＩＳＰＲ標的配列がグレーで強調され、ＰＡＭが四角で囲まれている。ハーセプチン遺伝子を組み込むために使用された上流及び下流の相同配列を図１において太字のフォントで示されている。

【0044】

ＣＲＩＳＰＲベクター及び相同組み換え用ドナーベクターがＣＨＯ－Ｓ及びＤＸＢ１１宿主細胞に導入された。細胞は分類され、トランスフェクション後に４８時間回復された。異なる濃度のピューロマイシン（１０、５０又は１００μｇ／ｍｌ）及びＭＴＸ（１００、５００又は１０００ｎＭ）が、組み込まれた遺伝子を含む細胞を選択するために使用された。
以下の表２及び３を参照されたい。ＦＡＣＳ又は制限された希釈物が単一の細胞を選択して単一の細胞培養を確立するために使用された。ハーセプチン遺伝子の予め選択された部位への組み込みはＴ７Ｅ１アッセイ及びジャンクションＰＣＲアッセイを使用して検証された。

【0045】

ピューロマイシン及びＭＴＸにより選択された、プールされたＣＨＯ細胞における、挿入されたハーセプチン遺伝子の発現がＥＬＩＳＡを使用して分析された。本発明の発明者らは、遺伝子を、予めＣＨＯ共同体により特定された、３つの活性のある組み込み部位のそれぞれに挿入することにより、３つの対照群を生成した（対照群１、対照群２、対照群３）。Ｔｅｎｍ３組み込み部位の中に挿入された遺伝子１コピー当たりの発現力価（ｍｇ／Ｌ／コピー）は、３つの対照群より大いに高かった。表２、表３、図３及び図４を参照のこと。

【0046】

【表2】

【0047】

【表3】

【0048】

本発明の発明者らは、６日間のバッチ培養においてＤＸＢ１１細胞から派生した単一のクローンを検査し、それらが挿入された遺伝子の増強発現を示すことを発見した。図５を参照のこと。特に、クローンＤＸＢ１１－１Ｅ８、ＤＸＢ１１－１Ｅ２及びＤＸＢ１１－１Ｇ５は増強発現を失わずに６０世代にわたって培養出来た。

【0049】

本発明の発明者らは又、ＣＲＩＳＰＲ法を使用して、ハーセプチン遺伝子をＤＸＢ１１宿主細胞内のＳｉｖａ１、Ｓｙｎｅ１、Ｓｍａｒｃｃ１及びＲｇｓ１９部位に挿入して、改変細胞を生成した。ＭＴＸ無しの７５０μｇ／ｍｌのジェネティシンが、望ましい挿入がされた細胞を選択するために使用された。この条件により、挿入のコピー数が少ない細胞が選択された。
少ないコピー数に拘わらず、これらの改変細胞も、ランダムインテグレーション（力価＝約８０ｍｇ／Ｌ）により生成された細胞と比較して、遺伝子の発現の増加を示した。表４を参照のこと。特に、Ｓｉｖａ１部位を標的にすることにより生成された選択された細胞プールは、２３５ｍｇ／Ｌ／コピーの力価を有していた。
図２は遺伝子をＳｉｖａ１部位に挿入するのに使用されるＰＡＭ配列と２つのホモロジーアームを示す。

【0050】

【表4】

【0051】

Ｓｉｖａ１プールからの個々のクローンも検査された。図６及び図７に示されるように、これらのクローンは全てハーセプチン遺伝子の増加した発現を示した。分析から示されたことは、これらのクローンのうち、標的外の挿入を有するものや、多数の挿入のコピーを有するものもあったが、多くは標的内の挿入の１つのコピーのみを有していたことである。

【0052】

（他の実施例）
本明細書に記載された特徴の全ては、任意の組み合わせで組み合わされても良い。本明細書に記載された各特徴は、同一、同等、又は同様の目的を果たす他の特徴と置換されても良い。従って、明示的に別段の定めをした場合を除き、本明細書に記載された各特徴は、包括的な一連の同一又は同様の特徴の例示に過ぎない。

【0053】

上記の説明から、当業者は記載された実施形態の本質的特徴を容易に確認でき、その精神及び範囲から逸脱せずに実施形態に様々な変更及び修正を付加し、それを様々な用途及び状況に適用することができる。よって、それらの他の実施形態も請求項の範囲内である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】