特開 2022-33740 頭頸部扁上皮がんおよびその他のがんに対する免疫療法で使用するための新規ペプチドおよびスキャフォールド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022033740

(43)【公開日】2022-03-02

(54)【発明の名称】頭頸部扁上皮がんおよびその他のがんに対する免疫療法で使用するための新規ペプチドおよびスキャフォールド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/115 20100101AFI20220222BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20220222BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20220222BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20220222BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220222BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220222BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20220222BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20220222BHJP

   C12Q 1/6874 20180101ALI20220222BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20220222BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20220222BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20220222BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20220222BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20220222BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220222BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220222BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220222BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220222BHJP

【ＦＩ】

C12N15/115 Z

C07K14/47 ZNA

C07K16/28

C07K14/725

C12N15/63 Z

C12N5/10

C12N5/0783

C12P21/02 Z

C12P21/02 C

C12Q1/6874 Z

A61K35/15 Z

A61K35/17 Z

A61K31/7088

A61K38/08

A61K38/10

A61K39/395 N

A61K48/00

A61P35/00

A61P35/02

【審査請求】有

【請求項の数】12

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021179862

(22)【出願日】2021-11-02

(62)【分割の表示】P 2019510628の分割

【原出願日】2017-08-24

(31)【優先権主張番号】102016115974.3

(32)【優先日】2016-08-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】DE

(31)【優先権主張番号】62/379,864

(32)【優先日】2016-08-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】506258073

【氏名又は名称】イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100174252

【弁理士】

【氏名又は名称】赤津 豪

(72)【発明者】

【氏名】メア，アンドレア

(72)【発明者】

【氏名】ヴァインシェンク，トニ

(72)【発明者】

【氏名】ヴィーベ，アニタ

(72)【発明者】

【氏名】ソング，コレット

(72)【発明者】

【氏名】スホール，オリバー

(72)【発明者】

【氏名】フリッチェ，イェンス

(72)【発明者】

【氏名】シン，ハープリート

(57)【要約】      （修正有）

【課題】がんの免疫療法において使用される、ペプチド、タンパク質、核酸、および細胞を提供する。
【解決手段】単独のまたはその他の腫瘍関連ペプチドと組み合わされた、腫瘍関連Ｔ細胞ペプチドエピトープを提供する。該腫瘍関連Ｔ細胞ペプチドエピトープは、例えば、抗腫瘍免疫応答を刺激し、または生体外でＴ細胞を刺激して患者に移入する、ワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たし得る。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子と結合しているペプチド、またはペプチドそれ自体もまた、抗体、可溶性Ｔ細胞受容体、およびその他の結合分子の標的になり得る。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１～配列番号９１、および配列番号１～配列番号９１と少なくとも８８％相同的なその変異配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチド、およびその薬学的に許容可能な塩であって；前記変異型が、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と結合し、および／またはＴ細胞を前記変異型ペプチドと交差反応させ；前記ペプチドが完全長ポリペプチドでない、ペプチド。

【請求項2】

前記ペプチドまたはその変異型が、８～１００、好ましくは８～３０、より好ましくは１～１６のアミノ酸の全長を有し、最も好ましくは前記ペプチドが、配列番号１～配列番号９１のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる、請求項１に記載のペプチドまたはその変異型。

【請求項3】

修飾されおよび／または非ペプチド結合を含み、または融合タンパク質の部分であり、特にＨＬＡ－ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸を含んでなる、請求項１または２に記載のペプチドまたはその変異型。

【請求項4】

ＭＨＣ分子と結合した際に、好ましくは請求項１または２のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型である、請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型を特異的に認識する、特に可溶性または膜結合抗体である、抗体。

【請求項5】

ＨＬＡリガンドと反応する好ましくは可溶性または膜結合性のＴ細胞受容体であって、前記リガンドが配列番号１～配列番号９１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８８％の同一性を有し、または前記アミノ酸配列が配列番号１～配列番号９１のいずれかからなる、Ｔ細胞受容体。

【請求項6】

前記Ｔ細胞受容体が可溶性分子として提供され、任意選択的に、免疫刺激ドメインまたは毒素などのさらなるエフェクター機能を保有する、請求項５に記載のＴ細胞受容体。

【請求項7】

請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型、好ましくはＭＨＣ分子と結合している請求項１～２のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型を特異的に認識する、アプタマー。

【請求項8】

請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型、請求項４に記載の抗体、請求項５または６に記載のＴＣＲ、または請求項７に記載のアプタマーをコードして、任意選択的に異種プロモーター配列に連結される、核酸、または前記核酸を発現する発現ベクター。

【請求項9】

請求項１～３に記載のペプチドまたは請求項８に記載の核酸または発現ベクターを含んでなり、好ましくは樹状細胞などの抗原提示細胞であり、またはＴ細胞またはＮＫ細胞である、組換え宿主細胞。

【請求項10】

医療で使用するための、請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型、請求項４に記載の抗体、請求項５または６に記載のＴＣＲ、請求項７に記載のアプタマー、請求項８に記載の核酸または発現ベクター、または請求項９に記載の宿主細胞。

【請求項11】

請求項８に記載の核酸または発現ベクターを発現する、請求項９に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記ペプチドまたはその変異型、前記抗体またはＴＣＲを前記宿主細胞またはその培養液から単離するステップとを含んでなる、請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異型、請求項４に記載の抗体または請求項５または６に記
載のＴＣＲを製造する方法。

【請求項12】

前記Ｔ細胞を抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり、適切な抗原提示細胞または抗原提示細胞を模倣する人工コンストラクトの表面に発現される抗原負荷ヒトクラスＩまたはＩＩ ＭＨＣ分子と生体外で接触させるステップを含んでなり、前記抗原が請求項１～２のいずれか一項に記載のペプチドである、活性化Ｔリンパ球を製造するインビトロ法。

【請求項13】

請求項１または２に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを提示する細胞を選択的に認識する、請求項１２に記載の方法によって製造される活性化Ｔリンパ球。

【請求項14】

ａ）配列番号１～配列番号９１からなる群から選択されるペプチド；
ｂ）ａ）に記載のペプチドおよび／またはペプチドＭＨＣ複合体と反応性のＴ細胞受容体；
ｃ）ａ）に記載のペプチドと、ＨＬＡ－ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端のアミノ酸１～８０とを含んでなる融合タンパク質；
ｄ）ａ）～ｃ）のいずれかをコードする核酸、または前記核酸を含んでなる発現ベクター；
ｅ）ｄ）の発現ベクターを含んでなる宿主細胞；
ｆ）Ｔ細胞を、抗原特異的様式でＴ細胞を活性化するのに十分な時間にわたり、適切な抗原提示細胞の表面に発現されるａ）に記載のペプチドと生体外で接触させるステップを含んでなる方法、ならびにこれらの活性化Ｔ細胞を自己または他の患者に移入する方法によって得られる、活性化Ｔリンパ球；
ｇ）ａ）に記載のペプチドおよび／またはペプチド－ＭＨＣ複合体および／またはａ）に記載のペプチドを提示する細胞と反応性であり、例えば、免疫活性化ドメインまたは毒素との融合によって潜在的に修飾される、抗体、または可溶性Ｔ細胞受容体；
ｈ）配列番号１～配列番号９１からなる群から選択されるペプチドを認識し、および／または配列番号１～配列番号９１からなる群から選択されるペプチドとＭＨＣ分子との複合体を認識する、アプタマー；
ｉ）ａ）～ｈ）のいずれかに記載のコンジュゲートされまたは標識されたペプチドまたはスキャフォールド
からなる群から選択される、少なくとも１つの活性成分と、薬学的に許容可能な担体、および任意選択的に、薬学的に許容可能な賦形剤および／または安定剤を含んでなる医薬組成物。

【請求項15】

ペプチド配列番号１～配列番号９１がそれに由来するタンパク質の過剰発現を示す、頭頸部扁上皮がん、急性骨髄性白血病、乳がん、胆管がん、脳がん、慢性リンパ球性白血病、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、胃がん、肝細胞がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞、小細胞肺がん、膀胱がん、子宮がん、およびその他の腫瘍の群から選択されるがんの診断および／または治療における、またはがんに対する薬剤を製造するための、請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチド、請求項４に記載の抗体、請求項５または６に記載のＴＣＲ、請求項１３に記載の活性化Ｔリンパ球、請求項８に記載の核酸または発現ベクター、または請求項９に記載の宿主細胞の使用。

【請求項16】

ａ）溶液中のまたは凍結乾燥形態の、請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチドまたは変異型、請求項４に記載の抗体、請求項５または６に記載のＴＣＲ、請求項１３に記載の活性化Ｔリンパ球、請求項８に記載の核酸または発現ベクター、または請求項９に記載の宿主細胞を含んでなる医薬組成物を含んでなる容器；
ｂ）任意選択的に、凍結乾燥製剤のための希釈剤または再構成溶液を含有する第２の容
器；
ｃ）任意選択的に、配列番号１～配列番号１５６、好ましくは配列番号１～９１から選択される、少なくとももう１つのペプチド、および
ｄ）任意選択的に、（ｉ）溶液の使用、または（ｉｉ）凍結乾燥製剤の再構成および／または使用のための取扱説明書
を含んでなるキット。

【請求項17】

ａ）前記個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を同定するステップと；
ｂ）ａ）で同定された前記ペプチドを、正常組織との比較で腫瘍における免疫原性および／または過剰提示について予備選別されたペプチド貯蔵庫と比較するステップと；
ｃ）少なくとも１つのペプチドを、前記患者において同定されたＴＵＭＡＰと一致する前記貯蔵庫から選択するステップと；
ｄ）ステップｃ）に基づいて、個別化ワクチンまたは化合物ベースのまたは細胞療法を製造および／または処方するステップと
を含んでなる、個々の患者のための化合物ベースのおよび／または細胞療法のための個別化抗がんワクチンを生産する方法。

【請求項18】

ａ１）前記腫瘍サンプルからの発現データを前記腫瘍サンプルの組織型に対応する正常組織サンプルからの発現データと比較して、前記腫瘍サンプルにおいて過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質を同定するステップと；
ａ２）前記発現データを、前記腫瘍サンプル中のＭＨＣクラスＩ／またはクラスＩＩ分子と結合しているＭＨＣリガンドの配列と相関させて、前記腫瘍によって過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質に由来するＭＨＣリガンドを同定するステップと
を含んでなる、前記ＴＵＭＡＰが同定される、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記貯蔵庫に含まれる前記ペプチドが、
ａａ．正常組織または組織群と比較して悪性組織で過剰発現される遺伝子を同定するステップを含んでなる、マイクロアレイまたは配列決定ベース発現プロファイリングなどの高度並列法によって、ゲノム規模メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）発現解析を実施するステップと；
ａｂ．ステップａａで検出された、選択的に発現されまたは過剰発現される遺伝子によってコードされる、ペプチドを選択するステップと；
ａｃ．健常ドナーまたは前記患者からのヒトＴ細胞を使用した生体外免疫原性アッセイを含んでなる、前記選択されたペプチドによる生体内Ｔ細胞応答の誘導を判定するステップ；または
ｂａ．ＨＬＡリガンドを前記腫瘍サンプルから質量分析を使用して同定するステップと；
ｂｂ．正常組織または組織群と比較して悪性組織で過剰発現される遺伝子を同定するステップを含んでなる、マイクロアレイまたは配列決定ベース発現プロファイリングなどの高度並列法によって、ゲノム規模メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）発現解析を実施するステップと；
ｂｃ．前記同定されたＨＬＡリガンドを前記遺伝子発現データと比較するステップと；
ｂｄ．ステップｂｃで検出された、選択的に発現されまたは過剰発現される遺伝子によってコードされる、ペプチドを選択するステップと；
ｂｅ．ステップｂｄから選択されたＴＵＭＡＰを腫瘍組織上で再検出し、健常組織上の検出欠如または希な検出が、ｍＲＮＡレベルにおける過剰発現の関連性を裏付けるステップと；
ｂｆ．健常ドナーまたは前記患者からのヒトＴ細胞を使用した生体外免疫原性アッセイを含んでなる、前記選択されたペプチドによる生体内Ｔ細胞応答の誘導を判定するステッ
プ
に基づいて同定される、請求項１７または１８に記載の方法。

【請求項20】

前記個々の患者からの正常な対応する組織と比較して前記腫瘍サンプルに特有の少なくとも１つの変異を同定するステップと、前記ワクチンに包含するために、または細胞療法を作成するために、前記変異に関連があるペプチドを選択するステップとをさらに含んでなる、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫療法において使用される、ペプチド、タンパク質、核酸、および細胞に関する。特に、本発明は、がんの免疫療法に関する。本発明は、単独のまたはその他の腫瘍関連ペプチドと組み合わされた、腫瘍関連Ｔ細胞ペプチドエピトープにさらに関し、それは、例えば、抗腫瘍免疫応答を刺激し、または生体外でＴ細胞を刺激して患者に移入する、ワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たし得る。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子と結合しているペプチド、またはペプチドそれ自体もまた、抗体、可溶性Ｔ細胞受容体、およびその他の結合分子の標的になり得る。

【0002】

本発明は、ヒト腫瘍細胞のＨＬＡクラスＩ分子に由来する、いくつかの新規ペプチド配列およびそれらの変異型に関し、それらは抗腫瘍免疫応答を引き起こすためのワクチン組成物中で、または薬理的／免疫学的活性化合物および細胞の開発のための標的として、使用され得る。

【背景技術】

【0003】

頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）は、疫学、病因、および治療において差異を有する異種性の腫瘍である（Ｅｃｏｎｏｍｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。これらの腫瘍は、それらが開始する領域によって分類される。それらとしては、口腔（口唇、舌の前３分の２、歯茎部、頬および口唇内層、口底、硬口蓋）、咽頭（鼻咽頭、軟口蓋を含む口腔咽頭、舌根、扁桃腺、下咽頭）、喉頭、副鼻腔および鼻腔、および唾液腺のがんが挙げられる（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２０１５）。

【0004】

ＨＮＳＣＣは世界で６番目に頻度の高い悪性腫瘍であり、世界中で診断された全がん症例の約６％を占める（Ｅｃｏｎｏｍｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＨＮＳＣＣは、発生率および解剖学的分布の幅広い地理的変動によって特徴付けられる（Ｖｉｇｎｅｓｗａｒａｎ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ、２０１４）。高リスク国は、南アジアおよび東南アジア（すなわち、インド、スリランカ、バングラデシュ、パキスタン）に位置する。これらの地域では、口腔の扁平上皮がん（ＯＳＣＣ）は、男性で最も頻度の高いがんであり、女性では３番目に頻度の高いがんである（Ｖｉｇｎｅｓｗａｒａｎ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，２０１４）。欧州では、ＯＳＣＣの高発生率が、フランス、ハンガリー、スロバキア、スロベニアの各地域で見られる。米国では、ＨＮＳＣＣは、男性における８番目に頻度の高いがんである。

【0005】

ＨＮＳＣＣの主要なリスク因子は、アルコールとタバコの使用である。その他のＨＮＳＣＣリスク因子としては、マテ茶の摂取が挙げられるが、保存または塩漬け食品の摂取、Ｂｅｔｅ Ｑｕｉｄの使用、木材粉塵、アスベスト、および合成繊維への職業的曝露、放射線被曝、発がん性タイプのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）またはエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）への感染、および祖先（特に鼻咽頭のＳＣＣでは中国人祖先）もまた挙げられる（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２０１５）。

【0006】

先進国ではＯＳＣＣと喉頭ＳＣＣが減少している一方で、中咽頭ＳＣＣの発生率は増加している。これはＳＣＣ（喫煙関連ＳＣＣではなくＨＰＶ関連ＳＣＣ）の生物学的駆動機構の変化に帰するとされる。ＨＰＶ関連中咽頭がんは、１９８８年から２００４年までに２２５％増加している（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２０１５）。ＨＰＶ陽性ＨＮＳＣＣは、異なる疾患実体に相当することもある。これらの腫瘍は、有意に改善された生存に関連する。

【0007】

発生率は性別に左右され、男性対女性の比率は２：１～４：１の範囲である（２０１４ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ＷＨＯ ｌｉｓｔ ｏｆ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ）。ＨＮＳＣＣ患者の５年全生存率は、４０～５０％である。（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，２０１４）。早期がん（Ｔ１、Ｔ２）の治癒率が７０～９５％である一方で（Ｎａｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ）、ＨＮＳＣＣ患者の大多数は、局所進行性疾患を有する（Ｂａｕｍｌ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

【0008】

早期ＨＮＳＣＣの治療は、外科手術または放射線のどちらかによる単独療法を伴う（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，２０１４）。進行がんは、化学療法と手術および／または放射線療法との併用によって治療される。

【0009】

化学療法としては、主にシスプラチン、またはドセタキセル、シスプラチン、フルオロウラシル（５－ＦＵ）またはシスプラチン、エピルビシン、ブレオマイシンまたはシスプラチン、５－ＦＵのようなシスプラチンを含有する合剤が挙げられる。イソトレチノイン（１３－シス－レチノイン酸）は、１年間毎日口腔ＳＣＣおよび喉頭ＳＣＣで使用され、二次腫瘍の発生率を低減させる（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，２０１５）。

【0010】

ＨＮＳＣＣは免疫抑制疾患と考えられ、免疫担当細胞の調節不全およびサイトカイン分泌の障害を特徴とする（Ｅｃｏｎｏｍｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。免疫療法ストラテジーは、ＨＰＶ陰性およびＨＰＶ陽性腫瘍の間で異なる。

【0011】

ＨＰＶ陽性腫瘍では、ウイルス腫瘍性タンパク質Ｅ６およびＥ７が優れた標的に相当するが、これは、それらが腫瘍細胞によって連続的に発現され、ＨＰＶ陽性がん細胞の形質転換状態を維持するために不可欠なためである。ＤＮＡワクチン、ペプチドワクチン、および樹状細胞（ＤＣ）が関与するワクチンをはじめとする、いくつかのワクチン接種療法が、ＨＰＶ陽性ＨＮＳＣＣにおいて、現在調査中であるさらに、進行中の第ＩＩ相臨床試験は、ＨＰＶ陽性腫瘍を有する患者におけるリンパ枯渇と、それに続くＴＩＬの自己由来注入の有効性を調査する（Ｅｃｏｎｏｍｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

【0012】

ＨＰＶ陰性腫瘍では、現在、いくつかの免疫療法ストラテジーが使用され、調査中である。キメラＩｇＧ１抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体セツキシマブは、再発性／転移性ＨＮＳＣＣのための標準的な第一選択治療として、化学療法と組み合わせてＦＤＡにより承認されている。パニツマブ、ニモツズマブ、およびザルツムマブをはじめとする抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体が、ＨＮＳＣＣにおいて評価されている。いくつかの免疫チェックポイント阻害剤が、ＨＮＳＣＣにおける使用に関する臨床試験において調査されている。それらとしては、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４）、トレメリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４）、ペンブロリズマブ（抗ＰＤ－１）、ニボルマブ（抗ＰＤ－１）、デュルバルマブ（抗ＰＤ１）、抗ＫＩＲ、ウレルマブ（抗ＣＤ１３７）、および抗ＬＡＧ－３抗体が挙げられる。

【0013】

ＨＮＳＣＣ患者を対象とした２つの臨床試験では、ｐ５３ペプチドまたはアポトーシス腫瘍細胞を負荷したＤＣの使用が評価された。免疫学的反応は満足できるものであり、副作用は許容可能であった。

【0014】

いくつかの研究が、養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）を用いて行われている。Ｔ細胞は、照射された自己由来腫瘍細胞またはＥＢＶのどちらかに対して誘導された。疾病抑制および全生存における結果は、有望であった（Ｅｃｏｎｏｍｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0015】

がんの治療に伴う重度の副作用および費用を考慮すると、がん全般、そして特に頭頸部扁上皮がんの治療に使用し得る要素を同定する必要がある。がん全般、特に、頭頸部扁上皮がんのバイオマーカーに相当する要素を同定し、がんのより良い診断、予後評価、および治療成功の予測をもたらす必要もある。

【0016】

がんの免疫療法は、がん細胞を特異的に標的化しながら副作用を最小化する選択肢に相当する。がん免疫療法は、腫瘍関連抗原の存在を利用する。

【0017】

腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の現行の分類は、次の主要群を含んでなる：
ａ）がん精巣抗原：Ｔ細胞によって認識され得る初めて同定されたＴＡＡはこのクラスに属し、元々はがん精巣（ＣＴ）抗原と称されたが、それは、そのメンバーが組織学的に異なるヒト腫瘍において発現し、正常組織では精巣の精母細胞／精原細胞のみに存在し、時として胎盤に存在するためであった。精巣の細胞は、クラスＩおよびＩＩ ＨＬＡ分子を発現しないので、これらの抗原は正常組織のＴ細胞によって認識され得ず、したがって免疫学的に腫瘍特異的と見なされる。ＣＴ抗原の周知の例は、ＭＡＧＥファミリーメンバーおよびＮＹ－ＥＳＯ－１である。
ｂ）分化抗原：これらのＴＡＡは、腫瘍と、それから腫瘍が生じる正常組織との間で共有される。既知の分化抗原のほとんどは、黒色腫および正常メラノサイトに見いだされる。これらのメラノサイト系関連タンパク質の多くは、メラニン生合成に関与し、したがって腫瘍特異的でないが、それでもなおがん免疫療法のために広く利用されている。例としては、黒色腫に対するチロシナーゼとＭｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、または前立腺がんに対するＰＳＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ｃ）過剰発現ＴＡＡ：広範に発現されるＴＡＡをエンコードする遺伝子は、組織学的に異なる型の腫瘍において検出され、多数の正常組織においても概してより低い発現レベルで検出されている。正常組織によってプロセスされて潜在的に提示されるエピトープの多くは、Ｔ細胞認識の閾値レベル未満であり得る一方で、腫瘍細胞におけるそれらの過剰発現は、以前確立された免疫寛容を破壊することにより、抗がん応答を始動し得る。このクラスのＴＡＡの顕著な例は、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、サバイビン、テロメラーゼまたはＷＴ１である。
ｄ）腫瘍特異的抗原：これらのユニークなＴＡＡは、正常な遺伝子（β－カテニン、ＣＤＫ４など）の変異から生じる。これらの分子変化のいくつかは、腫瘍性形質転換および／または進行に関連する。腫瘍特異的抗原は、通常、正常組織に対する自己免疫反応のリスクなしに、強力な免疫応答を誘導できる。他方、これらのＴＡＡは、ほとんどの場合、その上でそれらが同定されたまさにその腫瘍のみと関係があり、通常は、多くの個々の腫瘍間で共有されない。腫瘍特異的（関連）イソ型を有するタンパク質では、ペプチドの腫瘍特異性（または関連性）はまた、ペプチドが腫瘍（関連）エクソンに由来する場合に生じてもよい。
ｅ）異常な翻訳後修飾から生じるＴＡＡ：このようなＴＡＡは、特異的でなく腫瘍において過剰発現もされないタンパク質から生じてもよいが、それでもなお、腫瘍において主に活性である翻訳後プロセスによって腫瘍関連になる。このクラスの例は、腫瘍にＭＵＣ１のような新規エピトープをもたらす改変グリコシル化パターン、または腫瘍特異的であってもなくてもよい分解中のタンパク質スプライシングのような事象から生じる。
ｆ）オンコウイルスタンパク質：これらのＴＡＡはウイルスタンパク質であり、それらは発がん過程において重要な役割を果たしてもよく、外来性である（ヒト由来でない）ため、それらはＴ細胞応答を誘起し得る。このようなタンパク質の例は、子宮頸がんにおいて発現される、ヒト乳頭腫１６型ウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７である。

【0018】

Ｔ細胞ベースの免疫療法は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の分子によって提示される、腫瘍関連または腫瘍特異的タンパク質由来ペプチドエピトープを標的化する。腫瘍特異的Ｔリンパ球によって認識される抗原、すなわちそれらのエピトープは、酵素、受容体、転写因子などの全てのタンパク質クラスに由来する分子であり得て、それはそれぞれの腫瘍細胞において発現されて、同一起源の非改変細胞と比較して、通常、上方制御される。

【0019】

ＭＨＣ分子には、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの２つのクラスがある。ＭＨＣクラスＩ分子はα重鎖およびβ２ミクログロブリンから構成され、ＭＨＣクラスＩＩ分子はαおよびβ鎖から構成される。それらの三次元立体構造は、ペプチドとの非共有結合相互作用のために使用される結合溝をもたらす。

【0020】

ＭＨＣクラスＩ分子は、ほとんどの有核細胞上に見いだされる。それらは、主に、内因性タンパク質、欠陥リボソーム産物（ＤＲＩＰ）、およびより大型のペプチドのタンパク質切断から得られる、ペプチドを提示する。しかし、エンドソームコンパートメントまたは外因性起源に由来するペプチドもまた、ＭＨＣクラスＩ分子上に頻繁に見いだされる。この非古典的様式のクラスＩ提示は、文献中で交差提示と称される（Ｂｒｏｓｓａｒｔ ａｎｄ Ｂｅｖａｎ，１９９７；Ｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、大部分はプロフェショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）に見いだされ、例えば、エンドサイトーシス中にＡＰＣに取り込まれて引き続きプロセシングされる、外因性または膜貫通タンパク質のペプチドを主に提示する。

【0021】

ペプチドとＭＨＣクラスＩの複合体が、適切なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＣＤ８陽性Ｔ細胞によって認識される一方で、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の複合体は、適切なＴＣＲを有するＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞によって認識される。その結果、ＴＣＲ、ペプチド、およびＭＨＣは、化学量論的に１：１：１の量で存在することが良く知られている。

【0022】

ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞は、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞による、効果的な応答の誘導と維持する上で重要な役割を果たす。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来するＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープの同定は、抗腫瘍免疫応答を始動させる医薬品の開発に非常に重要である（Ｇｎｊａｔｉｃ ｅｔ ａｌ．，２００３）。腫瘍部位では、Ｔヘルパー細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）親和的サイトカイン環境を維持して（Ｍｏｒｔａｒａ ｅｔ ａｌ．，２００６）例えば、ＣＴＬ、ナチュラル、キラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、および顆粒球などのエフェクター細胞を引きつける（Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７）。

【0023】

炎症不在下では、ＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は、免疫系の細胞、特に、例えば、単球、単球由来細胞、マクロファージ、樹状細胞などのプロフェショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）に主に限定される。がん患者においては、腫瘍細胞がＭＨＣクラスＩＩ分子を発現することが判明している（Ｄｅｎｇｊｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００６）。伸長された（より長い）本発明のペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ活性エピトープとして作用し得る。

【0024】

ＭＨＣクラスＩＩエピトープによって活性化されたＴヘルパー細胞は、抗腫瘍免疫におけるＣＴＬのエフェクター機能を統合するのに重要な役割を果たす。ＴＨ１型のＴヘルパー細胞応答を始動するＴヘルパー細胞エピトープは、それらの細胞表面に腫瘍関連ペプチド／ＭＨＣ複合体を提示する腫瘍細胞に向けられた細胞傷害機能をはじめとする、ＣＤ８陽性キラーＴ細胞のエフェクター機能を支持する。このようにして腫瘍関連Ｔヘルパー細胞ペプチドエピトープは、単独で、またはその他の腫瘍関連ペプチドとの組み合わせで、抗腫瘍免疫応答を刺激するワクチン組成物の活性医薬品成分の役割を果たし得る。

【0025】

例えば、マウスなどの哺乳類動物モデルにおいて、ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の不在下であっても、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）の分泌による血管新生阻害を通じて腫瘍発現を阻害するには、ＣＤ４陽性Ｔ細胞で十分であることが示された（Ｂｅａｔｔｙ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ，２００１；Ｍｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ＣＤ４ Ｔ細胞が、直接抗腫瘍エフェクターであるという証拠がある（Ｂｒａｕｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

【0026】

ＨＬＡクラスＩＩ分子の構成的発現は、通常、免疫細胞に限定されるので、原発性腫瘍からクラスＩＩペプチドを直接単離する可能性があり得るとは、これまで考えられなかった。しかし、Ｄｅｎｇｊｅｌ ｅｔ ａｌ．は、いくつかのＭＨＣクラスＩＩエピトープを腫瘍から直接、成功裏に同定した（国際公開第２００７／０２８５７４号パンフレット、欧州特許第１７６００８８Ｂ１号明細書）。

【0027】

ＣＤ８およびＣＤ４依存性の双方のタイプの応答は、抗腫瘍効果に共同して相乗的に寄与するので、ＣＤ８＋Ｔ細胞（リガンド：ＭＨＣクラスＩ分子＋ペプチドエピトープ）、またはＣＤ４陽性Ｔヘルパー細胞（リガンド：ＭＨＣクラスＩＩ分子＋ペプチドエピトープ）のどちらかによって認識される、腫瘍関連抗原の同定および特性解析は、腫瘍ワクチンの開発にとって重要である。

【0028】

ＭＨＣクラスＩペプチドが、細胞性免疫応答を始動（惹起）するためには、それはまた、ＭＨＣ分子に結合しなくてはならない。この過程は、ＭＨＣ分子の対立遺伝子と、ペプチドのアミノ酸配列の特定の多型性とに依存する。ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドは、通常は８～１２アミノ酸残基長であり、通常は、ＭＨＣ分子の対応する結合溝と相互作用するそれらの配列中に、２つの保存残基（「アンカー」）を含有する。このようにして、各ＭＨＣ対立遺伝子は、どのペプチドが結合溝と特異的に結合し得るかを決定する、「結合モチーフ」を有する。

【0029】

ＭＨＣクラスＩ依存免疫反応においては、ペプチドは腫瘍細胞によって発現される特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合できるだけでなく、それらはまた、引き続いて特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞によって認識されなくてはならない。

【0030】

タンパク質が、Ｔリンパ球によって腫瘍特異的または腫瘍関連抗原として認識され、治療で利用されるためには、特定の必要条件が満たされなくてはならない。抗原は、主に腫瘍細胞によって発現され、健常組織によって発現されず、または比較的少量発現されるべきである。好ましい実施形態では、ペプチドは、健常組織と比較して、腫瘍細胞によって過剰提示されるべきである。それぞれの抗原は、ある種の腫瘍に存在するだけでなく、高い濃度（すなわち、それぞれのペプチド細胞当たりのコピー数）で存在することもさらに望ましい。腫瘍特異的および腫瘍関連抗原は、例えば、細胞周期調節またはアポトーシス抑制における機能のために、正常細胞から腫瘍細胞への形質転換に直接関与するタンパク質に由来することが多い。さらに、形質転換の直接原因となるタンパク質の下流標的が、上方制御されてもよく、したがって間接的に腫瘍関連であってもよい。このような間接的腫瘍関連抗原もまた、ワクチン接種アプローチの標的であってもよい（Ｓｉｎｇｈ－Ｊａｓｕｊａ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。このようなペプチド（「免疫原性ペプチド」）が、腫瘍関連抗原に由来して、生体外または生体内Ｔ細胞応答をもたらすことを確実にするためには、抗原のアミノ酸配列内にエピトープが存在することが必須である。

【0031】

基本的に、ＭＨＣ分子に結合できるあらゆるペプチドが、Ｔ細胞エピトープとして機能してもよい。生体外または生体内Ｔ細胞応答誘導のための必要条件は、対応するＴＣＲを有するＴ細胞の存在、およびこの特定のエピトープに対する免疫寛容の不在である。

【0032】

したがって、ＴＡＡは、腫瘍ワクチンをはじめとするが、これに限定されるものではない、Ｔ細胞ベースの治療法開発の出発点である。ＴＡＡを同定し特性決定する方法は、通常は、患者または健常人から単離され得るＴ細胞の使用に基づき、またはそれらは、腫瘍と正常組織との間の示差的転写プロファイル、またはペプチド発現パターンの生成に基づく。しかし、腫瘍組織またはヒト腫瘍細胞株において過剰発現され、またはこのような組織または細胞株において選択的に発現される遺伝子の同定は、免疫療法においてこれらの遺伝子から転写される抗原の使用に関する、正確な情報を提供しない。それは、これらの抗原のエピトープの個々の亜集団のみが、このような用途に適するためであり、その理由は、対応するＴＣＲを有するＴ細胞が存在しなくてはならず、この特定のエピトープに対する免疫寛容が不在または最小でなくてはならないからである。したがって本発明の非常に好ましい実施形態では、それに対する機能性および／または増殖性Ｔ細胞が見いだされる、過剰にまたは選択的に提示されるペプチドのみを選択することが、重要である。このような機能性Ｔ細胞は、特異的抗原による刺激時にクローン増殖され得て、エフェクター機能を果たすことができるＴ細胞（「エフェクターＴ細胞」）と定義される。

【0033】

本発明による特異的ＴＣＲ（例えば、可溶性ＴＣＲ）および抗体またはその他の結合分子（スキャフォールド）によってペプチドＭＨＣを標的化する場合、基礎となるペプチドの免疫原性は二次的である。これらの場合には、提示が決定要因である。

【課題を解決するための手段】

【0034】

本発明の第１の態様では、本発明は、配列番号１～配列番号９１、または配列番号１～配列番号９１と少なくとも７７％、好ましくは少なくとも８８％相同的な（好ましくは、少なくとも７７％または少なくとも８８％同一の）その変異配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドに関し、その中で前記変異型は、ＭＨＣと結合し、および／またはＴ細胞と前記ペプチドまたはその薬学的に許容可能な塩との交差反応を誘導し、その中で前記ペプチドは、基礎となる完全長ポリペプチドでない。

【0035】

本発明は、配列番号１～配列番号９１、または配列番号１～配列番号９１と少なくとも７７％、好ましくは少なくとも８８％相同的な（好ましくは少なくとも７７％または少なくとも８８％同一の）その変異型からなる群から選択される配列を含んでなる、本発明のペプチドにさらに関し、前記ペプチドまたはその変異型は、８～１００、好ましくは８～３０、最も好ましくは８～１４アミノ酸の全長を有する。

【0036】

続く表は、本発明によるペプチド、それらの各配列番号、およびそれらのペプチドの予測される起源（基礎）遺伝子を示す。表１および表２の全てのペプチドは、ＨＬＡ－Ａ^＊０２に結合する。表２のペプチドは、誤り率が高い、またはアルゴリズムを使用して計算された、ハイスループットスクリーニングの結果としての大きなリスト中で以前開示されているが、これまでがんとは全く関連付けられていなかった。表３のペプチドは、本発明のその他のペプチドとの組み合わせで有用であってもよい、追加的なペプチドである。表４およびＢのペプチドは、それぞれの基礎ポリペプチドの過剰発現または過剰提示を伴う様々なその他の悪性腫瘍の診断および／または治療においてさらに有用である。

【0037】

表1：本発明によるペプチド。
J = ホスホ-セリン

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0038】

表2：がん関連性が以前知られていない本発明による追加的なペプチド。

【表2】

【0039】

表3：例えば個別化がん治療で有用なペプチド。

【表3-1】

【表3-2】

【0040】

本発明は、さらに、例えば、急性骨髄性白血病、乳がん、胆管がん、脳がん、慢性リンパ球性白血病、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、胃がん、肝細胞がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞、小細胞肺がん、膀胱がん、および子宮がんなどの増殖性疾患の治療で使用するための本発明によるペプチドに一般に関する。

【0041】

特に好ましいのは、配列番号１～配列番号９１からなる群から選択される、本発明による単独のまたは組み合わされたペプチドである。より好ましいのは、配列番号１～配列番号３１（表１を参照されたい）からなる群から選択される単独のまたは組み合わせのペプチドと、頭頸部扁上皮がん、急性骨髄性白血病、乳がん、胆管がん、脳がん、慢性リンパ球性白血病、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、胃がん、肝細胞がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞、小細胞肺がん、膀胱がん、子宮がん、好ましくは頭頸部扁上皮がんの免疫療法におけるそれらの使用である。

【0042】

以下の表４に示されるように、本発明によるペプチドの多くは、その他の腫瘍型上にもまた見いだされ、したがって、その他の適応症のための免疫療法においても使用され得る。図１および実施例１もまた、参照されたい。

【0043】

表4A：本発明によるペプチド、およびその他の増殖性疾患、特にその他のがん性疾患における、それらの具体的使用。表は、選択されたペプチドについて、測定された腫瘍 サンプルの5%超で過剰提示されるか、または測定された腫瘍サンプルの5%超で3を超える腫瘍対正常組織の幾何学平均比で提示されるかのどちらかである、それらがその上で発見された追加的な腫瘍型を示す。過剰提示は、最大提示がある正常サンプルと比較して、より高い腫瘍サンプル上の提示と定義される。それに対する過剰提示が試験された正常組織は、脂肪組織、副腎、胆管、血液細胞、血管、骨髄、脳、食道、眼、胆嚢、心臓、腎臓、大腸、肝臓、肺、リンパ節、神経、膵臓、副甲状腺、腹膜、下垂体、胸膜、唾液腺、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、胸腺、甲状腺、気管、尿管、膀胱であった。

【表4A-1】

【表4A-2】

NSCLC= 非小細胞肺がん、SCLC= 小細胞肺がん、RCC= 腎臓がん、CRC= 結腸または直腸 がん、GC= 胃がん、HCC= 肝臓がん、PC= 膵臓がん、PrC= 前立腺がん、白血病、BRCA=乳がん、OC = 卵巣がん、NHL = 非ホジキンリンパ腫、AML = 急性骨髄性白血病、CLL = 慢性リンパ性白血病

【0044】

表4B：本発明によるペプチド、およびその他の増殖性疾患、特にその他のがん性疾患における、それらの具体的使用。表は、選択されたペプチドについて、測定された腫瘍 サンプルの5%超で過剰提示されるか、または測定された腫瘍サンプルの5%超で3を超える腫瘍対正常組織の幾何学平均比で提示されるかのどちらかである、それらがその上で発見された追加的な腫瘍型を示す。過剰提示は、最大提示がある正常サンプルと比較して、より高い腫瘍サンプル上の提示と定義される。それに対する過剰提示が試験された正常組織は、脂肪組織、副腎、動脈、骨髄、脳、中枢神経、結腸、食道、眼、胆嚢、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、白血球 細胞、膵臓、副甲状腺、末梢神経、腹膜、下垂体、胸膜、直腸、唾液腺、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、胸腺、甲状腺、気管、尿管、膀胱、静脈であった。

【表4B】

NSCLC=非小細胞肺がん、HCC=肝臓がん、BRCA=乳がん、RCC=腎細胞がん、GC=胃がん、OC=卵巣がん。

【0045】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、胆嚢がんおよび／または胆管がんの併用療法のための、配列番号１、１０、１７、３７、４２、４８、５７、６１、６７、６９、７０、７２、７５、７６、７８、および８７のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0046】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、ＮＳＣＬＣの併用療法のための、配列番号２、２０、５０、６０、６１、６３、および６４のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0047】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、ＳＣＬＣの併用療法のための、配列番号２、１７、４５、５９、６１、６３、６７、８１、８３、８５、８９、および９１のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0048】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、食道がんの併用療法のための、配列番号２、３、４、６、７、８、９、１６、１９、２３、２７、３２、３９、４１、４２、４６、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５８、６０、６１、６２、７２、７５、８８、および９０のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0049】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、膀胱がんの併用療法のための配列番号３、４、７、８、１５、１６、１９、２０、２１、２４、２７、３１、３２、３９、４５、４６、４７、４８、５０、５１、５３、５６、５８、６０、６４、６９、７３、７４、７８、８１、８５、８６、８８、８９、および９０のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0050】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、ＢＲＣＡの併用療法のための、配列番号４、１６、１７、３９、４８、５０、５６、５７、５８、６２、７３、７５、７６、７９、および８９のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。、

【0051】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、黒色腫の併用療法のための、配列番号８、９、１１、１６、１７、３２、４３、４８、５６、５７、６５、６６、６７、７１、７３、８１、８２、８５、８７、８８、および８９のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0052】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、ＡＭＬの併用療法のための、配列番号１６、１７、２４、２９、４３、５７、６６、７０、７３、７６、７７、および８３のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0053】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、子宮がんの併用療法のための、配列番号１６、１７、１９、３１、４３、４６、４７、４８、４９、５１、５６、５７、５８、６６、６７、７２、７５、７６、７９、８３、８９、９０、および９１のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0054】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、脳がんの併用療法のための、配列番号１８、５８、６１、および８８のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0055】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、ＮＨＬの併用療法のための、配列番号３２、４３、４８、５９、６０、６１、６３、６６、７３、７６、７９、８３、８５、８６、８７、８９、９０、および９１のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0056】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、ＣＬＬの併用療法のための、配列番号４３、６１、６５、６６、７３、７６、７８、８９、９０、および９１のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0057】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、ＯＣの併用療法のための、配列番号４５、４７、５１、５６、６６、および６７のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0058】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、ＧＣの併用療法のための、配列番号４３、５０、８９、および６１のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0059】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、ＨＣＣの併用療法のための、配列番号１６、４３、４５、５７、６１、６５、６６、および７５のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0060】

したがって、本発明の別の態様は、好ましい一実施形態では、ＲＣＣの併用療法のための、配列番号４３、６１、６２、８７、８９、および９０のいずれか１つに記載の本発明によるペプチドの少なくとも１つの使用に関する。

【0061】

したがって、本発明の別の態様は、好ましくは、頭頸部扁上皮がん、急性骨髄性白血病、乳がん、胆管がん、脳がん、慢性リンパ球性白血病、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、胃がん、肝細胞がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞、小細胞肺がん、膀胱がん、および子宮がんの群から選択される増殖性疾患の併用治療のための、本発明によるペプチドの使用に関する。

【0062】

本発明は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩの分子に結合する能力を有し、または長さ変異型などの伸長形態では、ＭＨＣクラスＩＩに結合する能力を有する、本発明によるペプチドにさらに関する。

【0063】

本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは（それぞれ）配列番号１～配列番号９１に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる。

【0064】

本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは、修飾され、および／または非ペプチド結合を含む。

【0065】

本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、前記ペプチドは、特にＨＬＡ－ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸に融合した、または例えば樹状細胞に対して特異的な抗体などの抗体（またはその配列中）に融合した、融合タンパク質の一部である。

【0066】

本発明は、本発明によるペプチドをエンコードする核酸にさらに関する。本発明は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである、本発明による核酸にさらに関する。

【0067】

本発明は、本発明による核酸を発現でき、および／または発現する、発現ベクターにさらに関する。

【0068】

本発明は、疾患の治療においてそして医療において、特にがんの治療において使用するための本発明によるペプチド、本発明による核酸または本発明による発現ベクターにさらに関する。

【0069】

本発明は、本発明によるペプチドに対して、または前記本発明によるペプチドとＭＨＣの複合体に対して特異的な対抗と、それらを製造する方法とにさらに関する。

【0070】

本発明は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、特に、自己由来または同種異系Ｔ細胞に組み込まれた可溶性ＴＣＲ（ｓＴＣＲ）およびクローン化ＴＣＲ；これらを製造する方法；ならびに前記ＴＣＲを有するまたは前記ＴＣＲと交差反応する、ＮＫ細胞またはその他の細胞を製造する方法にさらに関する。

【0071】

抗体およびＴＣＲは、本発明によるペプチドの免疫療法用途の追加的な実施形態である。

【0072】

本発明は、前述のような本発明による核酸または発現ベクターを含んでなる、宿主細胞にさらに関する。本発明は、抗原提示細胞であり、好ましくは樹状細胞である、本発明による宿主細胞にさらに関する。

【0073】

本発明は、本発明による宿主細胞を培養するステップと、前記宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる、本発明によるペプチドを製造する方法にさらに関する。

【0074】

本発明は、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞または人工抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩまたはＩＩ ＭＨＣ分子上に抗原が負荷される、本発明による方法にさらに関する。

【0075】

本発明は、抗原提示細胞が、配列番号１～配列番号９１を含有する、好ましくは配列番号１～配列番号３１または変異アミノ酸配列を含有する、前記ペプチドを発現する能力がありまたは発現する、発現ベクターを含んでなる、本発明による方法にさらに関する。

【0076】

本発明は、本発明による方法によって製造される活性化Ｔ細胞にさらに関し、前記Ｔ細胞は、本発明によるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを発現する細胞を選択的に認識する。

【0077】

本発明は、本発明によって製造されるＴ細胞の有効数を患者に投与するステップを含んでなる、患者において、本発明による任意のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する標的細胞を死滅させる方法にさらに関する。

【0078】

本発明は、薬剤としてのまたは薬剤の製造における、記載される任意のペプチド、本発明による核酸、本発明による発現ベクター、本発明による細胞、本発明による活性化Ｔリンパ球、Ｔ細胞受容体または抗体またはその他のペプチド－および／またはペプチド－ＭＨＣ－結合分子の使用にさらに関する。好ましくは、前記薬剤は、がんに対して有効である。

【0079】

好ましくは、前記薬剤は、可溶性ＴＣＲまたは抗体に基づく、細胞療法、ワクチンまたはタンパク質である。

【0080】

本発明は、本発明による使用にさらに関し、前記がん細胞は、頭頸部扁上皮がん、急性骨髄性白血病、乳がん、胆管がん、脳がん、慢性リンパ球性白血病、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、胃がん、肝細胞がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞、小細胞肺がん、膀胱がん、子宮がん、好ましくは頭頸部扁上皮がん細胞である。

【0081】

本発明は、がん、好ましくは頭頸部扁上皮がんの診断で使用され得る、本明細書で「標的」と称される本発明によるペプチドに基づく、バイオマーカーにさらに関する。マーカーは、ペプチドそれ自体の過剰提示、または対応遺伝子の過剰発現であり得る。マーカーはまた、好ましくは免疫療法、最も好ましくはバイオマーカーによって同定されるのと同じ標的を標的化する免疫療法である、治療の成功確率を予測するために使用されてもよい。例えば、抗体または可溶性ＴＣＲを使用して腫瘍切片が染色され、ＭＨＣと複合体形成した目的ペプチドの存在が検出され得る。

【0082】

任意選択的に、抗体は、免疫刺激ドメインまたは毒素などのさらなるエフェクター機能を保有する。

【0083】

本発明はまた、がん治療の文脈における本発明の新規標的の使用に関する。

【0084】

ＡＬＯＸ１２Ｂは、最終皮膚分化および表皮バリア機能に関与する（Ｆｕｒｓｔｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｅｐｐ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＡＬＯＸ１２Ｂはがんにおいて増幅される免疫抑制因子である（Ｒｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。シスプラチンは（ｐ）－ＤｅｌｔａＮｐ６３αを誘導し、ＡＴＭリン酸化する。引き続いて、それは、ｌｅｔ７－５ｐを下方制御するｍｉＲ－１８５－５ｐを上方制御し、扁平上皮がんにおけるＡＬＯＸ１２Ｂ発現の調節がもたらされる（Ｒａｔｏｖｉｔｓｋｉ，２０１３）。ＡＬＯＸ１２Ｂは、乳がんおよび肺がんリスクに関連する（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）。

【0085】

ＡＮＫＲＤ１７ ｍＲＮＡレベルは、結腸直腸がんにおいて広範に下方制御されており、このプロテインＡを結腸直腸がん検出のための多標的アッセイパネルのための潜在的なマーカーにする（Ｉｏａｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。サイクリンＥ／ＣｄＫ２によるＡＮＫＲＤ１７のリン酸化を通じて、タンパク質は細胞周期調節に関与する。過剰発現がＳ期移行を促進するのに対し、発現の枯渇は、ＤＮＡ複製を阻害し、細胞周期進行を阻止し、腫瘍抑制因子ｐ５３およびｐ２１の発現を上方制御する（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９）。

【0086】

ＡＴＰ５Ｇ１は、胃がんにおいて酸化的リン酸化経路に富む（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。頭頸部扁上皮がんでは、ＡＴＰ５Ｇ１発現が減少する（Ｋｏｃ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。肝臓再生増強因子（ＡＬＲ）のノックアウトは、マウスにおいて脂肪性肝炎および肝細胞がんの発症を加速させる。さらに、ＡＴＰ５Ｇ１発現はＡＬＲノックダウンマウスにおいて減少する。（Ｇａｎｄｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。

【0087】

ＡＴＰ５Ｇ２は、低～中悪性度腫瘍と比べて、悪性度膀胱がん腫瘍においてより高度にメチル化される（Ｋｉｔｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＲＩＺ１は、その抑制によりＡＴＰ５Ｇ２発現が変化する腫瘍抑制因子である（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｂ）。ＡＴＰ５Ｇ２は、子宮内膜Ｉｓｈｉｋａｗａがん細胞株において、エストロゲンおよびプロゲステロン治療時に高度に発現される（Ｔａｍｍ－Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＡＴＰ５Ｇ２プロモーターは、原発性腎細胞がんにおいてメチル化される（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0088】

ＡＴＰ５Ｇ３は、胃がんにおいて酸化的リン酸化経路に富む（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＡＴＰ５Ｇ３は、腫瘍進行と負の相関があり細胞移動を抑制する、ＰＰＡＲα活性化によって、上方制御される（Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ｃｈａｎｇ，２０１６）。ＡＴＰ５Ｇ３は、放射線感受性遺伝子であってもよい（Ｔｓｕｊｉ ｅｔ ａｌ．，２００５）。

【0089】

ＢＴＢＤ１１は、ＢＴＢドメイン含有１１をコードし、染色体１２ｑ２３．３上に位置する（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＢＴＢＤ１１は、乳頭状甲状腺がんにおいて示差的に発現される（Ｑｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＢＴＢＤ１１は、ＴＧＦ－β標的遺伝子である（Ｓａｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＢＴＢＤ１１は、胃がんにおいて変異する（Ｌｅｉｓｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｌｅｉｓｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

【0090】

ＣＤ２７６の予後との関連は、肺腺がんを有する喫煙患者と非喫煙患者の間で異なる。高いＣＤ２７６発現は、喫煙に関連する（Ｉｎａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。ＣＤ２７６は、前立腺がんにおいて過剰メチル化される（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｂ）。ＣＤ２７６は、骨肉腫において下方制御されるｍｉＲ－１２４によって調節される。ＴＧＦ－β１は、ＳＭＡＤ ３および４シグナル伝達を通じてｍｉＲ－１５５を上方制御し、ＣＤ２７６蓄積を引き起こすＣＥＢＰＢ阻害によってｍｉＲ－１４３の減衰をもたらす。ＣＤ２７６は、結腸直腸がんにおいて下方制御されるｍｉＲ－１８７によって調節される（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｅ；Ｔｒｏｊａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６ａ）。ＣＤ２７６は、ＳＲＥＢＰ－１／ＦＡＳＮシグナル伝達に影響を及ぼすことによって、肺がんにおける異常脂質代謝を媒介する。可溶性ＣＤ２７６は、ＴＬＲ４／ＮＦ－κＢシグナル伝達を通じて膵臓がん浸潤および転移を媒介する（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６ａ；Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＣＤ２７６は、がん治療における有望な標的であってもよい、免疫チェックポイントである。それは腫瘍増殖中に標的化されて、新たに出現した腫瘍に免疫回避を提供する抗腫瘍免疫を抑制してもよい（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｕｈ，２０１４；Ｓｗａｔｌｅｒ ａｎｄ Ｋｏｚｌｏｗｓｋａ，２０１６；Ｊａｎａｋｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＣＤ２７６は最も高リスクの神経芽腫によって発現され、腫瘍血管系において過剰発現され、腫瘍の生存および浸潤性に重要な役割を果たす（Ｂｏｔｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＣＤ２７６のノックダウンは、化学療法感受性を高め転移能を低下させる。ＣＤ２７６のノックダウンは、アポトーシスマーカー発現およびＳＴＡＴ３リン酸化の増大をもたらす。アストラガロシドＩＶ治療は、非小細胞肺がん細胞においてＣＤ２７６を阻害することによって、細胞増殖を減少させ、シスプラチンに対する化学療法感受性を増加させる（Ｎｙｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＣＤ２７６は、食道がん、乳がん、胆嚢がん、前立腺がん、および卵巣がんにおいて過剰発現される。（Ｂａｒａｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｊａｎａｋｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｆａｕｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＣＤ２７６過剰発現は、低生存率、予後、および腫瘍グレードと相関する。ＣＤ２７６は、がんの浸潤および進行を促進する。しかし、ＣＤ２７６は、抗腫瘍効果もまた有してもよい。高いＣＤ２７６発現は、非小細胞肺がんにおけるリンパ節転移および進行したＴＮＭ病期の指標である（Ｙｉ ａｎｄ Ｃｈｅｎ，２００９；Ｌｏｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｎｙｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｆａｕｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４ａ；Ｙｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｂｅｎｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＣＤ２７６は、ナチュラルキラー細胞の細胞毒性を下方制御し、がん免疫回避を支持する（Ｂｏｔｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

【0091】

ＣＤＨ２３は、その遺伝子がカルシウム依存性細胞間接着糖タンパク質をコードする、カドヘリンスーパーファミリーのメンバーであるカドヘリン関連２３をコードする。コードされたタンパク質は、不動毛組織化および毛束形成に関与すると考えられている。遺伝子は、ヒト聴覚消失遺伝子座ＤＦＮＢ１２およびＵＳＨ１Ｄを含有する領域に位置する。アッシャー症候群１Ｄおよび非症候性常染色体劣性聴覚消失ＤＦＮＢ１２は、このカドヘリン様遺伝子の対立遺伝子変異によって引き起こされる。この遺伝子の上方制御はまた、乳がんにも関連することもある（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＴＭＰＲＳＳ３は、乳がんにおける芳しくない予後因子であり、ＣＤＨ２３と相互作用し得る（Ｒｕｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＣＤＨ２３は、ＥＲα発現乳がん細胞におけるレプチン治療時に上方制御される（Ｂｉｎａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＣＤＨ２３は乳がんにおいて上方制御され、早期転移に関与してもよい（Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｕ ａｎｄ Ｌｉｇｏｎ，２０１２）。ＣＤＨ２３の喪失は、膵臓がん細胞株で観察さ得る（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）。

【0092】

ＣＤＨ３は、発がん性シグナル伝達に関与して、インテグリン、受容体チロシンキナーゼ、小分子ＧＴＰアーゼ、ＥＭＴ転写因子、およびその他のカドヘリンファミリーメンバーを活性化する。ＣＤＨ３シグナル伝達は、浸潤および転移を誘導する（Ａｌｂｅｒｇａｒｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｐａｒｅｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｂｒｙａｎ、２０１５；Ｖｉｅｉｒａ ａｎｄ Ｐａｒｅｄｅｓ，２０１５）。ＣＤＨ３の発がん活性化は、胃の発がんに関与する（Ｒｅｓｅｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＣＤＨ３過剰発現は、乳がん、膀胱がん、卵巣がん、前立腺がん、子宮内膜がん、皮膚がん、胃がん、膵臓がん、および結腸がんを促進する（Ａｌｂｅｒｇａｒｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｐａｒｅｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｂｒｙａｎ ａｎｄ Ｔｓｅｌｅｐｉｓ，２０１０；Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｖｉｅｉｒａ ａｎｄ Ｐａｒｅｄｅｓ，２０１５）。ＣＤＨ３は、基底細胞様乳がんにおいて発現される基底上皮マーカーである。ＢＲＣＡ１がんは、ＣＤＨ３のような基底マーカーの発現によって特徴付けられ、高悪性度、高増殖性、ＥＲ陰性、およびＨＥＲ３陰性表現型を示す（Ｈｏｎｒａｄｏ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｐａｌａｃｉｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｒａｓｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｄｅｗａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＣＤＨ３は、黒色腫および口腔扁平上皮がんにおける腫瘍抑制因子である（Ｈａａｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｖｉｅｉｒａ ａｎｄ Ｐａｒｅｄｅｓ，２０１５）。ＣＤＨ３は、ＥＭＴマーカーとして使用されてもよい。腫瘍形成および進行中に、ＥカドヘリンからＮカドヘリンおよびＣＤＨ３発現への移行がある（Ｐｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｂｏｎｉｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｂｒｙａｎ ａｎｄ Ｔｓｅｌｅｐｉｓ，２０１０；Ｒｉｂｅｉｒｏ ａｎｄ Ｐａｒｅｄｅｓ，２０１４）。ＣＤＨ３とβカテニンの間の競合的相互作用は、胃がんにおける細胞間相互作用と転移の障害を引き起こす（Ｍｏｓｋｖｉｎａ ａｎｄ Ｍａｌ’ｋｏｖ，２０１０）。ＣＤＨ３は、結腸がんにおけるがん形成の初期マーカーでであってもよい（Ａｌｒａｗｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ＣＤＨ３の調節不全は、予後不良および悪性腫瘍増加のマーカーである（Ｋｎｕｄｓｅｎ ａｎｄ Ｗｈｅｅｌｏｃｋ，２００５）。

【0093】

ＣＬＣＡ２の過剰発現は、βカテニンおよびβカテニン活性化遺伝子を下方制御する（Ｒａｍｅｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＣＬＣＡ２は、これもまたｐ５３およびｐ６３によって誘導されるＥＶＡ１と強力に相互作用し、乳がんにおいてしばしば下方制御され、ＥＭＴを引き起こし、上皮分化に重要である。どちらのタンパク質も、Ｅ－カドヘリンと相互作用する（Ｒａｍｅｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。成人急性骨髄性白血病には、ＡＭＬ１－ＣＬＣＡ２とＲＵＮＸ１－ＣＬＣＡ２遺伝子融合産物がある（Ｇｉｇｕｅｒｅ ａｎｄ Ｈｅｂｅｒｔ，２０１０；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＣＬＣＡ２は、ＤＮＡ損傷時に、ｐ７３、ｐ５３、およびｐ６３によって誘導され、増殖阻害剤の役割を果たす（Ｗａｌｉａ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｒａｍｅｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＣＬＣＡ２発現は、肺腺がんを有する患者に由来する循環腫瘍細胞において上昇し、検出の増加は患者の生存期間短縮と関連する（Ｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＣＬＣＡ２は、腺がんと比較して肺の扁平上皮がんでより高く発現され、組織学的腫瘍グレードに関連する。ＣＬＣＡ２発現は、非小細胞肺がんおよび小細胞肺がんの検出のために使用されてもよい（Ｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｓｈｉｎｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＣＬＣＡ２のノックダウンは、上皮間葉転換、がん細胞移動、および浸潤を引き起こす。通常の条件下では、ＣＬＣＡ２は、ＦＡＫシグナル伝達経路の阻害を通じて、移動および浸潤を抑制すると考えられている。ＣＬＣＡ２は、β（４）インテグリンと関連して肺転移を仲介する（Ａｂｄｅｌ－Ｇｈａｎｙ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｗａｌｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｒａｍｅｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＣＬＣＡ２は、乳がんにおいてプロモーター過剰メチル化のために下方制御され、結腸直腸がんにおいて下方制御される。ＣＬＣＡ２は膀胱がんにおいて、および黒色腫の転移性形質転換中に示差的に発現される。マントル細胞リンパ腫において、ＣＬＣＡ２のコピー数の減少がある（Ｇｒｕｂｅｒ ａｎｄ Ｐａｕｌｉ，１９９９；Ｂｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｒｉｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｗａｌｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｍａｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｒａｍｅｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

【0094】

ＤＳＧ１は、角化嚢胞性歯原性腫瘍において過剰発現され、口腔上皮内腫瘍において高い発現率を示す（Ａｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｈｅｉｋｉｎｈｅｉｍｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、ＤＳＧ１発現は、棘融解性扁平上皮がんで消失し、軟骨肉腫、口腔扁平上皮がん、および肺がんでは下方制御される（Ｘｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｓａａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｇａｌｏｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｊｕｒｃｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＤＳＧ１発現はＧＲＨＬ１によって調節され、標準的な化学皮膚発がんプロトコルで処置されたＧＲＨＬ１－陰性マウスは、より少ない乳頭腫を発症するが、より多くの扁平上皮がんを発症する（Ｍｌａｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＲｈｏｄａおよびＧＥＦ Ｂｃｒの下流標的であるＤＳＧ１は、角化細胞分化マーカーである（Ｄｕｂａｓｈ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＫＬＫ５は、口腔扁平上皮がんにおける転移形成に関連することもあるＤＳＧ１を切断する。ＤＳＧ１レベルの低下は、膵臓がん浸潤に関与しているかもしれない（Ｒａｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。陰性ＤＳＧ１染色は、肛門がん特異的生存率の改善に関連し、陽性染色は、大きな腫瘍サイズおよびリンパ節転移に関連する。頭頸部扁上皮がんにおけるＤＳＧ１の喪失は、予後不良と関連がある（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｍｙｋｌｅｂｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＤＳＧ１に対する自己抗体が、腫瘍随伴性天疱瘡で検出され得る（Ｓｅｉｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，２００４）。

【0095】

食道扁平上皮がんにおけるＤＳＧ３発現は、組織学的グレードと高度に相関し、食道扁平上皮がんにおける生存に影響を与えることが示され、負のＤＳＧ３発現は、より芳しくない生存を示唆する。したがって、ＤＳＧ３は、食道扁平上皮がんの進行に関与してもよく、予後マーカーの役割を果たしてもよい（Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。原発性肺腫瘍では、より高いＤＳＧ３およびＤＳＧ２発現は、肺扁平上皮がんの診断と相関することが示された一方で、より低いＤＳＧ３発現は、より高い腫瘍グレードと有意に関連することが示された。したがって、ＤＳＧ３は、肺扁平上皮がんの潜在的な診断マーカーおよび肺がんの潜在的な分化マーカーの役割を果たしてもよい（Ｓａａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。高いＤＳＧ３発現は、低い全生存および低い腫瘍特異的生存に関連することが示されたため、ＤＳＧ３は、切除された膵管腺がんにおけるネガティブ予後バイオマーカーとして記載されている。したがって、ＤＳＧ３およびその下流シグナル伝達経路は、ＤＳＧ３発現膵管腺がんにおける可能な治療標的であってもよい（Ｏｒｍａｎｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。

【0096】

ＤＳＰの発現低下は乳がん、肺がん、子宮頸がんをはじめとするいくつかのがんの腫瘍進行と相関する（Ｓｃｈｍｉｔｔ－Ｇｒａｅｆｆ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２ｂ）。ＤＳＰの発現は、Ｗｎｔ／βカテニンシグナル伝達経路の阻害を通じて、肺がん細胞において、細胞増殖、足場非依存性増殖、移動、および浸潤を有意に抑制する。（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２ｂ）。

【0097】

ＤＳＴは、乳がん転移に関連してもよい（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ＤＳＴに対する自己抗体は、リンパ球性白血病および濾胞性リンパ腫において見いだされ得る（Ａｉｓａ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｔａｉｎｔｏｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＤＳＴは、鼻咽頭がんにおける６－１０Ｂ細胞（腫瘍形成性であるが転移能を欠く）と比較して、５－８Ｆ細胞（高い腫瘍形成能および転移能）において上方制御される（Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＤＳＴは、頭頸部扁上皮がんにおいて高度に発現される（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）。新生物に関連する腫瘍随伴性天疱瘡には、ＤＳＴに対する自己抗体がある（Ｙｏｎｇ ａｎｄ Ｔｅｙ，２０１３；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５；ＰｒｅｉｓｚａｎｄＫａｒｐａｔｉ、２００７；ＺｈｕａｎｄＺｈａｎｇ、２００７）。前立腺がんにおけるＤＳＴの発現は、進行と強く逆相関する（Ｖａｎａｊａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。抗ＤＳＴ自己抗体は、黒色腫診断のための有望なマーカーである（Ｓｈｉｍｂｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＤＳＴは、悪液質がん患者の尿中に見いだされ得る（Ｓｋｉｐｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＤＳＴは、腺がんおよび肺の扁平上皮がんにおいて示差的に発現される（ＭｃＤｏｎｉｅｌｓ－Ｓｉｌｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ＤＳＴは、浸潤性細胞増殖の開始と共に、明確に上方制御される（Ｈｅｒｏｌｄ－Ｍｅｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）。

【0098】

ＥＭＣ７は、ＥＲ膜タンパク質複合体サブユニット７をコードし、染色体１５ｑ１４に位置する（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＥＭＣ７は、がんにおける、新薬の開発につながる新規標的および診断バイオマーカーであってもよい（Ｄｅｌｇａｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＥＭＣ７は、ピンヤンマイシン耐性舌扁平上皮がん細胞株において下方制御される（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

【0099】

ＥＳＲＰ２は、上皮細胞型特異的スプライシング調節因子をコードする（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＥＳＲＰ２は、肺がんおよび乳がん細胞をはじめとする様々ながん型において、がん細胞の運動性を阻害する。ＥＳＲＰ２は浸潤性前線においてＴＧＦ－βによって下方制御され、上皮間葉転換関連転写因子の発現増加をもたらす（Ｇｅｍｍｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｉｓｈｉｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

【0100】

Ｆ２ＲＬ１のＰＨドメイン結合モチーフの変異は、乳房腫瘍増殖を減少させるのに十分である（Ｂａｒ－Ｓｈａｖｉｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。Ｆ２ＲＬ１は、胃がんにおいて過剰発現され、患者の全生存と逆相関する（Ｓｅｄｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。トリプターゼは、肥満細胞によって放出される血管新生のメディエータであり、Ｆ２ＲＬ１を活性化してがん細胞の増殖、浸潤、および転移をもたらす。（Ｍａｒｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ａｍｍｅｎｄｏｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。Ｆ２ＲＬ１は、がんにおいて、示差的に発現されて変異した遺伝子の影響を受ける（Ｄ’Ａｓｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。Ｆ２ＲＬ１は、がんの進行、浸潤、および転移に関与する（Ｗｏｊｔｕｋｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｃａｎｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｌｉｍａ ａｎｄ Ｍｏｎｔｅｉｒｏ、２０１３；Ｇｉｅｓｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。Ｆ２ＲＬ１は、腺がん、黒色腫、骨肉腫、膠芽細胞腫、髄膜腫、白血病、および扁平上皮がんにおいて発現される（Ｅｌｓｔｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，２０１０）。Ｆ２ＲＬ１は、ＴＧＦ－βＩ型受容体であるＡＬＫ５の発現を調節する。Ｆ２ＲＬ１は、ＭＡＰキナーゼを活性化する（Ｏｉｋｏｎｏｍｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｗｉｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。組織因子およびインテグリンの上方制御は、転移を促進するＦ２ＲＬ１シグナル伝達を媒介する（Ｋａｓｔｈｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｒｕｆ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｋｏｃａｔｕｒｋ ａｎｄ Ｖｅｒｓｔｅｅｇ，２０１２；Ｒｕｆ、２０１２；Ｋｏｃａｔｕｒｋ ａｎｄ Ｖｅｒｓｔｅｅｇ，２０１３）。トリプシンおよびＰＡＲ２は自己分泌ループを形成し、増殖、浸潤、および転移を促進する。トリプシン刺激は、上皮成長因子受容体のＭＭＰおよびＰＡＲ２依存性活性化を通じて、ＭＡＰＫ‐ＥＲＫ経路活性化をもたらしてもよい（Ｓｏｒｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，２００６）。

【0101】

ＦＡＭ１６０Ａ１は、配列類似性１６０メンバーＡ１を有するファミリーをコードし、染色体４ｑ３１．３上に位置する（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。前立腺がんでは、ＤＹ１３１がエストロゲン関連受容体βに結合すると、ＦＡＭ１６０Ａ１発現が変化する（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ）。前立腺がんには、ＮＦＫＢ－ＦＡＭ１６０Ａ１遺伝子融合産物がある（Ｔｅｌｅｓ、Ｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＦＡＭ１６０Ａ１は、良性腫瘍と比較して、卵巣がんにおいて上方制御される（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２ａ）。ＦＡＭ１６０Ａ１の欠失は、家族性および早発性乳がんに見いだされ得る（Ｋｒｅｐｉｓｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＦＡＭ１６０Ａ１は、結腸直腸がんにおいて下方制御される（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２ｂ）。

【0102】

ＦＡＮＣＥは、食道扁平上皮がんリスクに関連する（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＦＡＮＣＥの稀な下方制御が、頭頸部扁上皮がんで観察され得る（Ｗｒｅｅｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）。Ｃｈｋ１は、ＤＮＡ架橋時のＦＡＮＣＥのリン酸化を媒介する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７）。家族性結腸直腸がんは、ＦＡＮＣＥに対してヘテロ接合性遺伝子型を示す。ファンコニー貧血ＤＮＡ損傷の修復が、結腸直腸がんに対する遺伝的素因に関連することもあるインデル変異が、遺伝性食道扁平上皮がんに関与するかもしれない。ＦＡＮＣＥのミスセンス変異が、乳がんのある１家族に見いだされた（Ａｋｂａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｓｅａｌ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｅｓｔｅｂａｎ－Ｊｕｒａｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＦＡＮＣＥは、シスプラチン感受性の調節に関与する（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。

【0103】

ＦＡＴ１は、頭頸部の扁平上皮がんにおいて有意に変異し、子宮頸部腺がん、膀胱がん、早期Ｔ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病、フルダラビン難治性慢性リンパ球性白血病、神経膠芽腫、および結腸直腸がんにおいて頻繁に変異し、食道扁平上皮がんにおいて変異するとして記載された（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｍｅｓｓｉｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｍｏｕｎｔｚｉｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｃａｚｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＦＡＴ１は、口腔がんにおいて抑制され、浸潤乳がんにおいて優先的に下方制御されるとして記載された（Ｋａｔｏｈ，２０１２）。ＦＡＴ１は、ｐｒｅＢ急性リンパ芽球性白血病における予後不良に関連する白血病において、上方制御されるとして記載された（Ｋａｔｏｈ，２０１２）。ＦＡＴ１は、膵臓腺がんおよび肝細胞がんにおいて上方制御されることが示された（Ｖａｌｌｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｗｏｊｔａｌｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＦＡＴ１は、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達の活性化を通じて腫瘍増殖を抑制し、アクチン重合の誘導を通じて腫瘍移動を促進することが記載された（Ｋａｔｏｈ，２０１２）。ＦＡＴ１は、皮膚扁平上皮がんにおけるがん駆動機構遺伝子の候補であることが示された（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＦＡＴ１は、Ｗｎｔシグナル伝達および腫瘍発生に関連する腫瘍抑制因子として記載された（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【0104】

ＦＡＴ３は、アンドロゲン受容体のサイレンシング時にタキソール耐性卵巣がん細胞株において下方制御され、これらの細胞株において、タキソールに対する感作を増加させることが示された。したがって、ＦＡＴ３は、タキソール耐性に関連する候補遺伝子であってもよい（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ）。ＦＡＴ３は食道扁平上皮がんにおいて変異し、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の調節不全を生じることが示された（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＦＡＴ３は、早期Ｔ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病において、反復的に変異することが示された（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＦＡＴ３は、髄膜皮性髄膜腫に特有のシグネチャを有する遺伝子として記載され、したがって、この良性髄膜腫亜型における腫瘍形成に関連している（Ｆｅｖｒｅ－Ｍｏｎｔａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＦＡＴ３は、形成異常細胞からの肺がん発生時に抑制される、腫瘍抑制因子として記載された（Ｒｏｈｒｂｅｃｋ ａｎｄ Ｂｏｒｌａｋ，２００９）。

【0105】

ＦＨＡＤ１は、酸化的ストレス応答に関与するＮＦＥ２ノックダウン時に下方制御される（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＦＨＡＤ１のＣｐＧメチル化は、転移性致死性前立腺がんにおけるバイオマーカーとして使用されてもよい（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。ＦＨＡＤ１は、食道扁平上皮がんにおいて下方制御され、シスプラチンに対する化学療法抵抗性に寄与してもよい（Ｔｓｕｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＦＨＡＤ１は、乳がんにおける腫瘍抑制遺伝子であってもよい（Ｉｏｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

【0106】

Ｇ３ＢＰ１は、ＤＮＡ巻き戻し酵素の１つであるＧ３ＢＰストレス顆粒集合因子１をコードするが、これは部分的に巻き戻された３’－テール付加基質を好み、ＡＴＰ依存性様式で、部分的なＲＮＡ／ＤＮＡおよびＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖もまた巻き戻し得る（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。Ｇ３ＢＰ１は、ＨＥＲ２＋乳がんにおける薬剤応答のバイオマーカーとして使用されてもよい（Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。生体外および生体内において肺がんの進行および転移を阻害するｍｉＲ－１９３ａ－３ｐは、Ｇ３ＢＰ１を下方制御する（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。Ｇ３ＢＰ１は、レスベラトロールの直接的な標的である。Ｇ３ＢＰ１の枯渇は、レスベラトロール誘発性ｐ５３発現およびアポトーシスを減少させるＧ３ＢＰ１は、ｐ５３特異的デユビキチナーゼであるＵＳＰ１０と相互作用することにより、ｐ５３の負の調節因子である（Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。Ｇ３ＢＰ１は、ＭＹＣＮＯＳによってＭＹＣＮのプロモーター領域に動員され、その発現が調節される。Ｇ３ＢＰ１は、ＰＭＰ２２を負に調節して、乳がんの増殖を増加させる（Ｗｉｎｓｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｖａｄｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。Ｇ３ＢＰ１は、がん認識ペプチドとプロアポトーシスペプチドとからなる、二機能性ペプチドの標的であってもよい（Ｍｅｓｃｈｅｎｍｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。後期口腔扁平上皮がんは、Ｇ３ＢＰ１ノックダウンに感受性であり、アポトーシスの増加を引き起こす（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。Ｇ３ＢＰ１は、乳がん、口腔扁平上皮がん、結腸がん、膵臓がん、肝細胞がん、および胃がんにおいて上方制御され、芳しくない患者予後、腫瘍サイズ、血管浸潤、Ｔ分類、リンパ結節転移、ＴＮＭ期、および全生存期間短縮と相関する（Ｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｗｉｎｓｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｍｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｄｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。Ｙボックス結合タンパク質１は、Ｇ３ＢＰ１ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに結合して、ストレス顆粒構築のためのＧ３ＢＰ１ストレス顆粒成核剤の可用性を調節する。ＹＢ－１またはＧ３ＢＰ１のどちらかの下方制御は、ストレス顆粒形成および腫瘍浸潤の減少をもたらす（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ａｎｎｉｂａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｓｏｍａｓｅｋｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。Ｇ３ＢＰ１は、Ｈ＋－ＡＴＰアーゼの活性およびβ－Ｆ１－ＡＴＰアーゼｍＲＮＡの翻訳を制御する（Ｗｉｌｌｅｒｓ ａｎｄ Ｃｕｅｚｖａ，２０１１）。Ｇ３ＢＰ１は、電離放射線の前後で、前骨髄球性白血病核小体と共局在化する（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。緑茶の主要化合物である没食子酸エピガロカテキンは、Ｇ３ＢＰ１と結合することによって、肺腫瘍発生を抑制する。Ｇ３ＢＰ１発現は、ロバスタチンの影響を受ける（Ｋｌａｗｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｓｈｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。Ｇ３ＢＰ１は、Ｓｌｕｇを上方制御することによって、がん細胞の増殖、アポトーシス、運動性、移動、浸潤、および転移に関与する。Ｇ３ＢＰ１のノックダウンはＳｌｕｇ発現を減少させ、上皮マーカーＥ－カドヘリンを増加させる。乳がんにおけるＧ３ＢＰ１の上方制御は、Ｓｍａｄシグナル伝達経路を通じて上皮間葉転換を活性化する。Ｇ３ＢＰ１は、ＲａｓおよびＮＦ－κＢシグナル伝達、ユビキチンプロテアソーム経路、およびＲＮＡプロセシングに関与する（Ｆｒｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｄｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。肝細胞がんにおける強制Ｇ３ＢＰ１発現は、細胞移動を促進する（Ｄｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

【0107】

ＧＡＲ１は、ｐ５３を活性化できる（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＧＡＲ１は、テロメラーゼ複合体に関与する（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｒａｓｈｉｄ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｐｉｇｕｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｌｏｗ ａｎｄ Ｔｅｒｇａｏｎｋａｒ，２０１３；Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＧＡＲ１は、細胞生存に重要である（Ｌｕｂｂｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。

【0108】

ＩＴＧＢ４は、前立腺がん、胃がん、乳がん、口腔扁平上皮がん、および卵巣がんに関連しており、膵管腺がんにおいて上方制御されることが示された（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｘｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｚｕｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｍａｓｕｇｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＩＴＧＢ４（ＣＤ１０４とも称される）は、α６サブユニットと結合する傾向があり、食道扁平上皮がん、膀胱がん、および卵巣がんなどのいくつかの浸潤性がんの生物学において、中心的役割を果たす可能性が高い（Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｐｅｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＩＴＧＢ４の一塩基多型は、腫瘍の攻撃性および生存に影響を与えるようであり、乳がん患者にとって予後的重要性を有してもよい（Ｂｒｅｎｄｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００８）。

【0109】

ＫＤＭ５Ｂは、ヒストンＨ３のリジン４を脱メチル化することによって特定の腫瘍抑制遺伝子を抑制できる、リジン特異的ヒストンデメチラーゼである、タンパク質ＪＡＲＩＤ１Ｂをコードする（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。エピジェネティック因子として、ＫＤＭ５Ｂは、ｐ５３発現を抑制することによって、ヒトＯＳＣＣ、頭頸部扁上皮がん（ＨＮＳＣＣ）、乳がん、および肺がんの増殖、移動、および浸潤を支持する（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ；Ｚｈａｏ ａｎｄ Ｌｉｕ，２０１５；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。また、ＪＡＲＩＤ１Ｂとして知られているＫＤＭ５Ｂは、ＰＴＥＮ／ＡＫＴシグナル伝達を通じて、様々な腫瘍型における上皮間葉転換を転移を促進する（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ）。

【0110】

ＫＬＨＬ２１は肝細胞がんにおいて上方制御され、生物臨床マーカーとして使用されてもよい（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＫＬＨＬ２１は、ＩＫＫβの負の調節因子である。ＫＬＨＬ２１発現は、マクロファージにおいて炎症促進性刺激時に下方制御される。ＫＬＨＬ２１の過剰発現は、ＩＫＫβ活性化およびＩκＢα分解を阻害する（Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＫＬＨＬ２１は、２つの異なる実体である胞状軟部肉腫および腎細胞がんに見られる、異常な遺伝子融合転写因子ＡＳＰＳＣＲ１－ＴＦＥ３によって過剰発現される（Ｋｏｂｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＫＬＨＬ２１は、がんに関与してもよい（Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＫＬＨＬ２１は細胞質分裂に必要であり、分裂後期において染色体から紡錘体中間帯への染色体パッセンジャー複合体の移行を調節する。それはＣｕｌｌｉｎ３ベースのＥ３ユビキチンリガーゼと相互作用して、ＡｕｒｏｒａＢに直接結合し、そのユビキチン化を引き起こす（Ｍａｅｒｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＫＬＨＬ２１は、ＩＫＫβの標的化を通じて、ＴＮＦα－活性化ＮＦ－κＢシグナル伝達を負に調節する（Ｍｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

【0111】

ＫＬＫ６は、セリンプロテアーゼのペプチダーゼＳ１ファミリーのカリクレインサブファミリーのメンバーである、カリクレイン関連ペプチダーゼ６をコードする。ますます多くの証拠が、多数のカリクレインが発がんに関与することを示唆し、いくつかは新規がんおよびその他の疾患のバイオマーカーとしての可能性を有する。このプロテアーゼの発現はステロイドホルモンによって調節され、複数のヒトがんにおいて、および乾癬患者由来の血清において上昇してもよい。コードされプロテアーゼは、アミロイド前駆体タンパク質およびα－シヌクレインの切断に関与してもよく、したがってそれぞれ、アルツハイマー病およびパーキンソン病におけるこのプロテアーゼの関与が示唆される。この遺伝子は、染色体１９上の遺伝子クラスターに位置する（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＫＬＫ６はｐ５３によって誘導され、その発現は胃がんにおけるオートファジーおよび薬剤耐性を増加させた（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＫＬＫ６の下方制御は、良性乳腺腫の浸潤性と関連があるＧＮＡ１３発現の増加に関連する（Ｔｅｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＫＬＫ６は、細胞周期、ＭＹＣ、ＭＡＰＫ、およびその他のシグナル伝達経路に影響を及ぼしてもよい、いくつかのｍｉＲＮＡを上方および下方制御できる（Ｓｉｄｉｒｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＫＬＫ６は、転移性結腸直腸がんにおけるパニツムマブ耐性と関連があるセットに属する（Ｂａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＫＬＫ６のは、脊髄損傷に続く軸索成長、腫瘍細胞転移、およびパーキンソン病のようなαシヌクレイン凝集病態の調節に関連する（Ｘｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＫＬＫ６は、高度浸潤性ＰＣ３前立腺がんおよび卵巣がんにおいて過剰発現され、子宮頸の前がん状態において脱調節される（Ｔａｍｉｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｈｗａｎｇ ａｎｄ Ｌｉｎｄｈｏｌｍ，２０１５）。ＫＬＫ６は、肝細胞がん、乳がん、結腸がん、胃腸がん、および星状細胞腫などの様々な実体において、バイオマーカーとして使用されてもよい（Ｖａｋｒａｋｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ；Ｇｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｓｃｈｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｄｒｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｍａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＫＬＫ６は進行した漿液性卵巣がんにおける全生存に関連し、その発現は他の臨床パラメータと関連があるかもしれない（Ｋｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｄｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６ａ；Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ａｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

【0112】

頭頸部扁上皮がんにおけるその発現が細胞周期進行に関連するＣＤ３４のノックダウンは、ＫＲＴ１発現を上方制御する（Ｅｔｔｌ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＫＲＴ１は、プラチコジンＤ処理時にＨｅｐＧ２細胞において下方制御される（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ）。Ｂｏｗｅｎｓ病表在性浸潤がんに由来する明細胞焦点の免疫組織化学染色は、ＫＲＴ１に対して陰性である（Ｍｉｓａｇｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ｍｉＲ－９４４は、ｐ５３の上方制御ｐ５３およびＥＲＫシグナル伝達の障害によって、ＫＲＴ１発現を誘導する（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＫＲＴ１発現は、扁平上皮がんの初期および後期において上方制御される（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ）。核分解は、ＫＲＴ１発現を下方制御する（Ｎａｅｅｍ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＫＲＴ１発現は、分化状態のマーカーであってもよい。ＮＭＰ－５２およびＡＦＰ発現と組み合わせて、それは肝細胞がんを検出するために使用されてもよい（Ａｔｔａｌｌａｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｂｒｕｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。ＫＲＴ１はドコサヘキサエン酸処理時に上方制御され、これは乳がん浸潤を軽減することが知られている（Ｂｌａｎｃｋａｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。爪甲がんに由来する増殖中の好塩基球細胞は、ＫＲＴ１を発現できなかった（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ）。 ＫＲＴ１の上方制御は、Ｎｏｔｃｈ１受容体刺激に間接的に関連する（Ｖｌｉｅｔ－Ｇｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。Ｓ１００Ａ７は、ＫＲＴ１を下方制御する（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＫＲＴ１の発現は、口腔扁平上皮がんにおけるｐ２１およびｈｓｐ７０発現に関連する。ＫＲＴ１の欠如は、細胞増殖を抑制し分化を促進する転写因子であるＫｌｆ４の欠如と相関する（Ｐａｐａｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｆｒｏｈｗｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

【0113】

ＫＲＴ１３は、ケラチン遺伝子ファミリーのメンバーであるケラチン１３をコードする。ビタミンＤは、ＫＲＴ１３発現を変化させる（Ｎａｒａｙａｎａｎ，２００６）。ＣＫ１３の免疫染色は、粘液性類表皮腫の類表皮成分では陽性であり、顎下腺で発生する小管腺腫および腫瘍崩壊性がんでは陰性である（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｍａｔｓｕｚａｋａ ｅｔ ａｌ．，２００４；ｄｏＰｒａｄｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）。α６β４インテグリンの異常な発現は、皮膚の扁平上皮がんの発生における初期の事象であるＫＲＴ１３を上方制御する（Ｔｅｎｎｅｎｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。ＫＲＴ１３は、子宮頸部上皮内新生物のバイオマーカーとして使用されてもよい。ＫＲＴ１３の喪失は、移行性尿路上皮細胞がんにおける腫瘍のグレードおよび病期のマーカーである。ＫＲＴ１３発現は、皮膚がん進行のマーカーである（Ｓｌａｇａ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｓｏｕｔｈｇａｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｄｕｇｇａｎ、２００２；Ｂａａｋ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ＫＲＴ１３発現は、口腔がん幹細胞および口腔扁平上皮がんにおいて下方制御される（Ｍｏｒｇａｎ ａｎｄ Ｓｕ，１９９４；Ｓｉｎｈａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【0114】

ＫＲＴ１４は、食道、肺、喉頭、子宮子宮頸部などの様々な扁平上皮がんにおいて、ならびに腺腫様歯原性腫瘍において、高度に発現された。しかし、それは、膀胱の小細胞がんには存在せず、肺腺がん、胃腺がん、結腸直腸腺がん、肝細胞がん、膵管腺がん、乳腺浸潤性管腺がん、甲状腺乳頭がん、および子宮類内膜腺がんでは弱かった（Ｘｕｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｔｅｒａｄａ、２０１２；Ｖａｓｃａ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｈａｍｍａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｓｈｒｕｔｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。膀胱がんでは、ＫＲＴ１４発現は、低生存率と強く関連していた（Ｖｏｌｋｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

【0115】

ＭＣＦ－７乳がん細胞のエタノールへの長期曝露は、悪性腫瘍関連遺伝子であるＫＲＴ１５を上方制御する（Ｇｅｌｆａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。浸潤性増殖を伴う基底細胞がんは、ＫＲＴ１５の負の発現を示す（Ｚｉａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＫＲＴ１５は、汗腺腺腫と円柱腫を識別するために使用されてもよい（Ｓｅｌｌｈｅｙｅｒ，２０１５）。ＫＲＴ１５は、膀胱発がんにおいて逐次上方制御される（Ｃｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。皮膚がんにおいて下方制御されるＳＩＲＴ２は、上皮性幹細胞マーカーであるＫＲＴ１５発現を阻害する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４ｂ）。ＫＲＴ１５は、毛嚢幹細胞マーカーである（Ｂｏｎｇｉｏｖａｎｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｋｏｂａ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｎａｒｉｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＫＲＴ１５は、良性のものと比較して、悪性眼表面扁平上皮新生物でより強く発現される、未分化基底細胞マーカーである（Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。球状体選択された表皮扁平上皮がんは、豊富なＫＲＴ１５発現を有する（Ａｄｈｉｋａｒｙ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＫＲＴ１５は、尿路上皮がん腫において上方制御される（Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。頭頸部腫瘍に関連する光線性角化症のＫＲＴ１５染色は症例の７％で陽性であり、腺様嚢胞がんでは３６％が陽性である。染色は、限局性強皮症形態基底細胞がんおよび小嚢胞性付属器がんと比較して、線維形成性毛包上皮腫においてより高い（Ｓａｂｅｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔａ ａｎｄ Ｎｏｒｔｈ，２０１５；Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｓｏｌｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＫＲＴ１５の上方制御は、非小細胞肺がんの全生存に影響を及ぼし、ＮＳＣＬＣの鑑別診断のためのマーカーとして使用されてもよい（Ｇｏｍｅｚ－Ｍｏｒａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｂｏｙｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＫＲＴ１５は、ｐ５３およびＥＲによって調節される（Ｌｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

【0116】

ＫＲＴ１６の過剰発現は、基底細胞様乳がん細胞株ならびに上皮内がんにおいて見いだされた。その他の研究者らは、非再発性エナメル上皮腫と再発性エナメル上皮腫との間で、ＫＲＴ１６の免疫組織化学的発現に有意差を見いださなかった（Ｊｏｏｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｉｄａ－Ｙｏｎｅｍｏｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｓａｆａｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。さらに、コンピュータでの分析は、転移性乳がんにおけるＫＲＴ１６発現とより短い無再発生存期間との間の相関を示した（Ｊｏｏｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

【0117】

ＫＲＴ５は、若年女性の乳がんにおいて上方制御されることが示された（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＫＲＴ５は、若年女性における乳がんの芳しくない無病生存期間と、ホルモン受容体陽性乳がんを有する閉経前の患者における好ましくない臨床転帰とに、関連することが示された（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＫＲＴ５は、乳がん細胞株ＨＣＣ１９３７およびＴ４７Ｄにおいて、腫瘍抑制因子ＢＲＣＡ１によって調節されることが示された（Ｇｏｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＫＲＴ５は、悪性胸膜中皮腫において脱調節されることが示された（Ｍｅｌａｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＫＲＴ５は、悪性中皮腫の診断中皮マーカーとして記載された（Ａｒｉｆ ａｎｄ Ｈｕｓａｉｎ，２０１５）。ＫＲＴ５は、子宮内膜がんの進行と相関することが示された（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＫＲＴ５は、疣状がんを有する患者の浸潤腫瘍領域において変異し、下方制御されることが示された（Ｓｃｈｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＫＲＴ５は、正常組織サンプルと比較して、結腸直腸がん生検で示差的に発現される４タンパク質パネルの一部であることが示された（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２ａ）。４タンパク質パネルのＫＲＴ５およびその他の３タンパク質は、結腸直腸がんの治療のための新規マーカーおよび潜在的標的として記載された（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２ａ）。ＫＲＴ５は、基底細胞がんに関連しているとして記載された（Ｄｅｐｉａｎｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＫＲＴ５は、尿路上皮がん幹細胞を同定するための候補として記載された（Ｈａｔｉｎａ ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｚ，２０１２）。

【0118】

ＫＲＴ６Ａは、手術に続いて補助化学療法を受けたトリプルネガティブ乳がん患者における無遠隔転移生存期間を予測するための予後モデルとして使用され得る、７遺伝子シグネチャの一部として記載された（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ）。ＫＲＴ６Ａは、コブウシ（Ｂｏｓ ｉｎｄｉｃｕｓ）の角がんにおいて、および胃がんにおいて上方制御されることが示された（Ｅｌ－Ｒｉｆａｉ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｋｏｒｉｎｇａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＫＲＴ６Ａは、骨外性粘液性軟骨肉腫の形態学的および免疫組織化学的特徴を有する外陰部肉腫の２症例において、下方制御されることが示された（Ｄｏｔｌｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＫＲＴ６Ａ発現は、口腔扁平上皮がんにおいて発現が変化することが示された（Ｃｈａｎｔｈａｍｍａｃｈａｔ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＫＲＴ６Ａは、プロトオンコジーンＳｒｃキナーゼ活性の負の調節、および創傷修復中の皮膚ケラチノサイトの移動性と関連することが示された。これはがんなどの関連する状況において、重要であってもよい（Ｒｏｔｔｙ ａｎｄ Ｃｏｕｌｏｍｂｅ，２０１２）。ＫＲＴ６Ａは、ヒトの正常様乳がんに類似する特有の乳房腫瘍モデルを生じさせ得る、乳房の二分化能前駆細胞を特徴付けることが示された（Ｂｕ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＫＲＴ６Ａは、肺の腺がんと扁平上皮がんを識別するために使用され得る、２５遺伝子転写ネットワークシグネチャの重要な部分として記載された（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0119】

ＫＲＴ６Ｂは、食道がん細胞株ＫＹＳＥ１７０において下方制御される遺伝子の候補であることが示された（Ｋａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ＫＲＴ６Ｂは、腎細胞がん、散発性角化嚢胞性歯原性腫瘍、およびコブウシ（Ｂｏｓ ｉｎｄｉｃｕｓ）の角がんにおいて上方制御されることが示された（Ｋｏｒｉｎｇａ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｈｅｉｋｉｎｈｅｉｍｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＫＲＴ６Ｂ機能喪失は、生体外で、ｎｏｔｃｈ１の発現を阻害し、腎細胞がん細胞死を誘導することが示された。したがって、ＫＲＴ６Ｂのｎｏｔｃｈ１との相互作用は、腎細胞がんの進行に寄与すると記載された（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＫＲＴ６Ｂは、細胞株ＨＣＣ１１８７およびＨＣＣ７０において基底細胞様腫瘍関連ＧＡＢＲＰの発現減少時に、その発現が減少する基底細胞様乳がん関連サイトケラチンとして記載された（Ｓｉｚｅｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＥＲＫ１／２の選択的阻害もまた、ＫＲＴ６Ｂなどの基底細胞様サイトケラチンの発現減少、および基底細胞様乳がんにおける移動の減少をもたらすことが示された（Ｓｉｚｅｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。したがって、ＧＡＢＲＰ－ＥＲＫ１／２－サイトケラチン軸は、基底細胞様乳がんの移動性表現型の維持に関与する（Ｓｉｚｅｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＫＲＴ６Ｂは、プロトオンコジーンＳｒｃキナーゼ活性の負の調節、および創傷修復中の皮膚ケラチノサイトの移動性と関連することが示された。これはがんなどの関連する状況において、重要であってもよい（Ｒｏｔｔｙ ａｎｄ Ｃｏｕｌｏｍｂｅ，２０１２）。ＫＲＴ６Ｂは、肺の腺がんと扁平上皮がんを識別するために使用され得る、２５遺伝子転写ネットワークシグネチャの重要な部分として記載された（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＫＲＴ６Ｂは、ヒト不死化口腔上皮細胞のベンゾ（ａ）ピレン誘導腫瘍発生中に、示差的に発現されることが示された（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）。

【0120】

ＫＲＴ６Ｃは、肺の腺がんと扁平上皮がんを識別するために使用され得る、２５遺伝子転写ネットワークシグネチャの重要な部分として記載された（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0121】

ＫＲＴ７５は、第１２染色体の長腕上にクラスター化したＩＩ型ケラチンファミリーのメンバーである、ケラチ７５をコードする。コードされたタンパク質は、毛髪および爪形成において重要な役割を果たす。この遺伝子の変異は、毛髪障害である、須毛部仮性毛包炎（ＰＦＢ）および成長期脱毛症候群（ＬＡＨＳ）と関連付けられている（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＫＲＴ７５は、親細胞株と比較して、生体内継代および再誘導前立腺細胞株において下方制御される（Ｓｉｖａｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＫＲＴ７５は、爪腫瘍（ｏｎｙｃｈｏｍａｔｒｉｃｏｍａ）において発現され、それは爪床および爪峡部への分化を示唆していてもよい（Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＫＲＴ７５は、２１Ｔ乳房細胞において下方制御される（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＫＲＴ７５発現は、プロテアソーム阻害剤とデキサメタゾンにより変化され得る（Ｋｉｎｙａｍｕ ｅｔ ａｌ．，２００８）。

【0122】

ＬＡＰ３の阻害は、ファスシンおよびＭＭＰ－２／９の下方制御を通じて、卵巣がん細胞株ＥＳ－２における浸潤抑制をもたらすことが示された。したがって、ＬＡＰ３は、潜在的な抗転移治療標的として機能してもよい（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５ｂ）。ＬＡＰ３の高発現は、神経膠腫患者の悪性度および予後不良と相関することが示された（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＬＡＰ３は、細胞増殖、移動、および浸潤を調節することによって神経膠腫進行を促進することが示され、したがって新たな予後因子かもしれない（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＬＡＰ３をはじめとするアミノ酸代謝に関与する遺伝子のフレームシフト変異は、マイクロサテライト高不安定性胃がんおよび結腸直腸がんにおいて検出された（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＬＡＰ３は、肝細胞がん、食道扁平上皮がん、および前立腺がんにおいて上方制御されることが示された（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４ａ；Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＬＡＰ３は、細胞周期のＧ１／Ｓチェックポイントおよび進行した細胞移動を調節することによって、肝細胞がん細胞増殖を促進することが示された（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＬＡＰ３の発現は、肝細胞がんの予後および悪性進行と相関することがさらに示された（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。食道扁平上皮がん細胞株ＥＣＡ１０９におけるＬＡＰ３のサイレンシングは、細胞増殖およびコロニー形成を低減することが示された一方で、ＬＡＰ３ノックダウンは、細胞周期停止をもたらした（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４ａ）。食道扁平上皮がん細胞株ＴＥ１におけるＬＡＰ３の過剰発現は、細胞増殖および浸潤性を支援することが示された（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４ａ）。したがって、ＬＡＰ３は、食道扁平上皮がんの悪性進行における役割を果たすことが示された（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４ａ）。

【0123】

高レベルのＬＧＡＬＳ７は、がんの浸潤性、増殖、および転移の増加を伴う、乳がんにおける侵襲性表現型に関連する（Ｇｒｏｓｓｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＬＧＡＬＳ７が、結腸直腸がん患者の血清中で示差的に発現されるのに対して、ＣＲＣ腫瘍の免疫組織化学染色は、ＬＧＡＬＳ７について陰性である（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＬＧＡＬＳ７は、前立腺がん、子宮頸がん、および外陰扁平上皮がんにおいて下方制御され、進行した臨床病期、低分化、および局所リンパ節転移と相関する。再発現は、アポトーシスの増加をもたらす。プロモーターメチル化の増加は、ＶＳＣＣにおける進行した臨床病期、低分化、および局所リンパ節転移に関連する（Ｌａｂｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｈｉｇａｒｅｄａ－Ａｌｍａｒａｚ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。細胞質発現ＬＧＡＬＳ７はｐ５３を阻害し、乳がんにおける化学療法抵抗性を増加させる（Ｇｒｏｓｓｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＬＧＡＬＳ７は正常な卵巣組織では発現されず、上皮性卵巣がんで発現される。発現は、高悪性度および転移性腫瘍においてより高頻であり、全生存期間と相関する。ＬＧＡＬＳ７発現は、変異体ｐ５３によって誘導される（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｌａｂｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＬＧＡＬＳ７は、転移性皮膚黒色腫のバイオマーカーとして使用されてもよい。これは、頭頸部扁平上皮がんおよび基底細胞がんにおける臨床パラメータとも相関する（Ｔｉｍａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｃａｄａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＬＧＡＬＳ７は、乳がん発生率に関連する（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）。ＬＧＡＬＳ７発現はｐ５３によって誘導され得て、アポトーシス促進性に作用できる（Ｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．，２００４）。

【0124】

ＬＧＡＬＳ７Ｂは、ＨＥＲ２陽性乳がんの侵襲性を増強する（Ｇｒｏｓｓｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＬＧＡＬＳ７Ｂは、アポトーシス、組織形態形成、代謝、輸送、ケモカイン活性、および免疫応答に関与する分子を調節する（Ｈｉｇａｒｅｄａ－Ａｌｍａｒａｚ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＬＧＡＬＳ７Ｂは、子宮頸がんにおいて下方制御される。低いＧａｌ－１発現に伴う高いＬＧＡＬＳ７Ｂ発現は、予後の改善と関連がある（Ｈｉｇａｒｅｄａ－Ａｌｍａｒａｚ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＬＧＡＬＳ７Ｂは、外陰扁平上皮がんにおいて過剰メチル化される（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。前立腺がんにおけるＬＧＡＬＳ７Ｂの再発現は、エトポシドおよびシスプラチンに対する化学感受性を増強する（Ｌａｂｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＬＧＡＬＳ７Ｂは、外陰扁平上皮がん、前立腺がん、および結腸直腸がんにおいて下方制御される。ＬＧＡＬＳ７Ｂの下方制御は、進行した臨床病期、低い腫瘍分化、および局所リンパ節転移に関連する（Ｌａｂｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。細胞質ゾルＬＧＡＬＳ７Ｂはｄｏｘ誘発性ＰＡＲＰ－１切断を阻害し、乳がんにおけるｐ５３活性化の抑制と、ｐ２１およびＣＤＫＮ１Ａ発現の減少をもたらす（Ｇｒｏｓｓｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＬＧＡＬＳ７Ｂはアポトーシスを上方制御し、ＩＬ－２およびＩＦＮ－γ発現を阻害する（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＬＧＡＬＳ７Ｂは卵巣がんで過剰発現され、高齢、高死亡率、腫瘍体積の増加、および低生存率に関連する（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｌａｂｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＬＧＡＬＳ７Ｂの免疫組織化学的染色は、唾液腺腫瘍タイプを識別するために使用されてもよい（Ｒｅｍｍｅｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＬＧＡＬＳ７Ｂは、頭頸部基底細胞がんにおいて下方制御される。頭頸部扁上皮がんでは、ＬＧＡＬＳ７Ｂは異なる発現パターンを示し、異なる発現レベルは角質化および分化と相関する（Ｃａｄａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。

【0125】

ＭＡＬＬは、肺がんサブタイプを分類するために使用されてもよい（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＭＡＬＬは、前立腺がんにおける転移抑制遺伝子であってもよい（Ｙｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＭＡＬＬ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現は、結腸がん患者では低下し、血管浸潤、疾患再発、および転移または死亡に関連する。ＭＡＬＬの喪失は、全生存期間および無病生存期間の減少に関連する。ＭＡＬＬの過剰発現は細胞増殖を抑制し、細胞株における移動を阻害する（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００８ａ；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｃ）。ＭＡＬＬは、前立腺がん細胞株によって分泌されるプロスタソーム上に見いだされ得て、そこでカベオリン－１と相互作用する（Ｌｌｏｒｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ＭＡＬＬは、非小細胞肺がんおよび頸部扁平上皮細胞がんにおいて、下方制御される。それは、神経膠腫細胞において示差的に発現される（Ａｉ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｈａｔｔａ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｋｅｔｔｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）。

【0126】

ＭＣＭ４の発現は、食道がんをはじめとするいくつかの実体における、生存率低下およびがん進行と相関する膜貫通糖タンパク質である、上方制御された炭酸脱水酵素ＩＸに関連している（Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。Ｈａｓ－ｍｉＲ－６１５－３ｐは、ＭＣＭ４を調節することにより、鼻咽頭がんに関与してもよい（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＭＣＭ４は、膀胱がんの発生において役割を果たすかもしれない（Ｚｅｋｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ｐ５３の機能獲得型変異は、乳がんにおけるＭＣＭ４の発現を増加させる（Ｐｏｌｏｔｓｋａｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ヘリカーゼ活性の低下を示すヒト皮膚がんにおいて、ＭＣＭ４の変異がある（Ｉｓｈｉｍｉ ａｎｄ Ｉｒｉｅ，２０１５）。ＭＣＭ４の過剰発現単独では、乳がんにおけるより短い生存と弱く関連するだけである。ＭＣＭ複合体の６つの部分全ての過剰発現は、より短い生存と強く関連している（Ｋｗｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＭＣＭ４は、肺腺がんおよび喉頭扁平上皮がんにおいて示差的に発現される（Ｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４ｂ）。ＭＣＭ４は、子宮頸がんにおいて有意に過剰発現される（Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＭＣＭ４は、結腸直腸がんのバイオマーカーとして使用されてもよい（Ｆｉｊｎｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

【0127】

アンチザイム阻害剤は、ＯＤＣ１のユビキチン非依存性分解を阻害してポリアミン形成の加速をもたらし、それは胃がん、乳がん、肝細胞がん、および食道扁平上皮がんの発症を引き起こす（Ｑｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ピロキシカムは、非黒色腫皮膚発がんに関与するＯＤＣ１依存性ポリアミン産生を阻害する（Ｃａｍｐｉｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＯＤＣ１は、細胞分裂調節、分化、熟成、およびアポトーシスに重要なプトレシンを調節する（Ｒａｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｚｄｒｏｊｅｗｉｃｚ ａｎｄ Ｌａｃｈｏｗｓｋｉ，２０１４）。ＯＤＣ１は、ＭｙｃおよびＭＹＣＮ標的遺伝子であり、高いＯＤＣ１発現は、神経芽腫における無再発生存率の低下に関連する（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ－Ｔａｇｏ、２０１２；Ｓａｌｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ブロッキングＯＤＣ１は、結腸直腸がんの化学予防に使用されてもよい（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

【0128】

ＰＡＲＰ９（ＡＲＴＤ９としても知られている）は、ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼファミリーメンバー９をコードし、染色体３ｑ２１．１上に位置する（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。ＤＴＸ３ＬはＡＲＴＤ８およびＰＡＲＰ９と複合体形成し、腫瘍抑制因子ＩＲＦ１を阻害することによって、転移性前立腺がん細胞の増殖、化学療法抵抗性、および生存を促進する（Ｂａｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＰＡＲＰ９は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫におけるＩＦＮ－γ－ＳＴＡＴ１－ＩＲＦ１－ｐ５３シグナル伝達を阻害し、プロトオンコジーンＩＲＦ２およびＢＣＬ－６の発現を活性化する。これは、ＤＬＢＣＬの増殖、生存、および化学療法抵抗性をもたらす（Ｃａｍｉｃｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＰＡＲＰ９発現は、ＩＦＮ－γ誘導性である（Ｊｕｓｚｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ＰＡＲＰ９は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫における薬物標的であってもよい。ＰＡＲＰ９は、高リスクの化学療法抵抗性ＤＬＢＣＬにおける発がん性生存因子である（Ｂａｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ａｇｕｉａｒ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｃａｍｉｃｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。

【0129】

ＰＫＰ１は、前立腺がんおよび食道腺がんにおいて下方制御されることが示された（Ｋａｚ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。非新生物、前立腺ＢＰＨ－１細胞株におけるＰＫＰ１のノックダウンは、アポトーシスの減少および前立腺がん関連ＳＰＯＣＫ１遺伝子などの遺伝子の示差的発現の低下をもたらした（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。集合的に、ＰＫＰ１およびＳＰＯＣＫ１の変化した発現は、前立腺がんにおける頻繁かつ重大な事象であり、ＰＫＰ１は、腫瘍抑制機能を有することが示唆される（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＰＫＰ１の発現低下は、口腔扁平上皮がんにおける遠隔転移の発生までのより短い時間に、有意に関連することが示された（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。プロモーターメチル化を通じたＰＫＰ１の喪失は、バレット食道がんから食道腺がんへの進行に関連することが記載された（Ｋａｚ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＰＫＰ１は、非小細胞肺がんにおいて上方制御されることが示され、扁平上皮がんサンプルを識別するための良好なマーカーであってもよい（Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｐａｌｅｎｃｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＰＫＰ１は、高分化型の脂肪肉腫細胞株ＧＯＴ３において上方制御されることが示された（Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）。ＰＫＰ１の発現低下は、頭頸部扁上皮がん細胞における運動性の増加を促進することが記載された（Ｓｏｂｏｌｉｋ－Ｄｅｌｍａｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＰＫＰ１喪失は、子宮頸部発がんに関連することが示された（Ｓｃｈｍｉｔｔ－Ｇｒａｅｆｆ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＰＫＰ１は、口腔咽頭の扁平上皮がんを有する患者における局所再発または転移ならびに低生存率に関連することが示された（Ｐａｐａｇｅｒａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）。

【0130】

ＰＬＥＣは、結腸直腸腺がん、頭頸部扁平上皮がん、および膵臓がんにおいて過剰発現される（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｋａｔａｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｂａｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0131】

ペリプラキンは、Ｔ２４ＣＤＤＰＲ膀胱がん細胞において減少する（Ｔａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＰＰＬ染色は、健常組織と比較して膀胱がんでより低いＰＰＬの喪失は、病理学的病期と生存と関連がある（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＰＰＬは、上皮様腫瘍細胞と相関する（Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＥＶＰＬ、ペリプラキン、およびインボルクリン陰性マウスは、皮膚がん耐性表現型を示す（Ｃｉｐｏｌａｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｎａｔｓｕｇａ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｎａｔｓｕｇａ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＰＰＬは、トリプルネガティブ乳がんにおいて高度に発現される（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ペリプラキンは過剰メチル化のために、食道扁平上皮がんにおいて下方制御される。ＥＳＣＣにおけるＰＰＬノックダウンは、細胞運動および付着の減少に関連する（Ｏｔｓｕｂｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｔｏｎｏｉｋｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。腫瘍随伴性天疱瘡は、ＰＰＬに対する自己抗体を示す（Ｙｏｎｇ ａｎｄ Ｔｅｙ，２０１３；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｐｒｏｂｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

【0132】

ＰＲＫＤＣは、子宮内膜症関連卵巣がんおよび乳がんにおいて、頻繁に変異する遺伝子である（Ｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｗｈｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＰＲＫＤＣは、結腸直腸がん中の正常組織と比較して、がん組織において上方制御される。高いＰＲＫＤＣ発現を有する患者は、より芳しくない全生存期間を示す（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

【0133】

ＰＲＮＰは、膜グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型糖タンパク質をコードするが、これはロッド様構造に凝集する傾向があり、５つのタンデムオクタペプチド反復配列の非常に不安定な領域を含有する。この遺伝子の反復領域における変異ならびに他の箇所における変異は、様々なプリオン病と関連付けられている。この遺伝子について、より小さな構造的に無関係のタンパク質であるＡｌｔＰｒｐをコードする、重複するオープンリーディングフレームが見いだされている（ＲｅｆＳｅｑ，２００２）。その生理学的役割は完全には定義されていないが、ＰＲＮＰは、神経幹細胞の自己再生、多分化能遺伝子発現、増殖、および分化に関与する。ＰＮＲＰは、神経膠芽腫、乳がん、前立腺がんおよび結腸直腸がんなどのヒト腫瘍において役割を果たす（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６ｂ；Ｃｏｒｓａｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。結腸直腸がんでは、ＰＲＮＰが上皮間葉転換に寄与することが示されている（Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＭＧｒ１－Ａｇ／３７ＬＲＰと組み合わされたＰＮＲＰの過剰発現は、胃がんにおける予後不良を予測する（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＰＮＲＰ発現は、細胞の酸化還元状態に関連しており、抗酸化防御に関与していてもよい。サイレンシングＰＮＲＰは、乳がんおよび結腸がんにおいて、がん細胞を抗がん剤に感作させることが示されている（Ｓａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｍｅｓｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ；Ｙｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。

【0134】

ＰＲＯＭ２は、肺腺がんにおいて特異的に上方制御される（Ｂａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＰＲＯＭ２は、弾性線維腫およびヒト前立腺がんにおいて発現される。ＰＲＯＭ２は、低悪性度前立腺がんにおいてより高度に発現され、高悪性度前立腺がんにおいてより低く発現される（Ｙａｍａｚａｋｉ、２００７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ＰＲＯＭ２は、結腸がんにおいて下方制御される（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＰＲＯＭ２発現は、色素嫌性腎細胞がんおよびオンコサイトーマの間で異なるために使用されてもよい（Ｒｏｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。

【0135】

ＲＩＰＫ４は、皮膚の扁平上皮がんにおいて下方制御されることが示された（Ｐｏｌｉｇｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＲＩＰＫ４は、舌状扁平上皮がん細胞株Ｔｃａ－８１１３における移動および浸潤、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の生存率、および子宮頸部扁平上皮がんにおける全生存期間ならびに無病生存期間、進行、および予後不良に関連している（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４ｃ；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００８ｂ）。ＲＩＰＫ４は、家族性膵臓がんに関連している（Ｌｕｃｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＲＩＰＫ４は、子宮頸部扁平上皮がんの潜在的な診断バイオマーカーおよび独立予後バイオマーカーであり、舌がんの予後および治療のためのバイオマーカーであり得る（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４ｃ；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。

【0136】

ＲＮＡＳＥ７発現は、皮膚がんにおいて徐々に減少する（Ｓｃｏｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＲＮＡＳＥ７発現は、いくつかの白血病誘発性タンパク質チロシンキナーゼによって影響を受ける（Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．，２００８）。

【0137】

ＲＰＬ８発現は、ＭＹＣ誘発性核抗原および核小体性タンパク質６６によって影響され得る（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＲＰＬ８は、骨肉腫に関与してもよい（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ；Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ，２０１３）。ＲＰＬ８は、ＭＹＣによって活性化されるＮＯ－６６によって調節される（Ｇｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＲＰＬ８の変異は、Ｄｉａｍｏｎｄ－Ｂｌａｃｋｆａｎ貧血と関連がある（Ｇａｚｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＲＰＬ８発現は、化学療法応答と関連があってもよい（Ｓａｌａｓ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＲＰＬ８は、肝細胞がんにおいて調節不全である（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＲＰＬ８のＭＨＣＩＩ依存性発現は、黒色腫に見いだされ得る（Ｓｗｏｂｏｄａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。

【0138】

ＳＥＲＰＩＮＢ５は、乳がん、肺がん、頭頸部がん、口腔がん、前立腺がんなどの多数のがん型の診断のための有益な分子マーカー、および予測因子の双方である。（Ｍａｒｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｌｏｎａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｓａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｓｈｅｎｇ、２００４）。ＳＥＲＰＩＮＢ５はＨＤＡＣ１活性の内因性調節因子の役割を果たし、ｐ５３腫瘍抑制因子経路と相互作用する（Ｍａａｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｋａｐｌｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

【0139】

ＳＬＣ２５Ａ３は、慢性骨髄性白血病において脱調節される（Ｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＳＬＣ２５Ａ３の枯渇は、ＢＡＸのストレス誘発性ミトコンドリア標的化を無効にする（Ｂｕｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。

【0140】

ＳＬＣ６Ａ１１発現は、パクリタキセルで治療されたがん患者において観察され得る現象である、パクリタキセル誘発性神経障害性疼痛を有するラットにおいて減少する（Ｙａｄａｖ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＡＬＡおよびそのメチルエステルＭＡＬは、皮膚がんの光線力学療法で使用されるプロドラッグである。それらの取り込みは、ＳＬＣ６Ａ１１によって媒介される（Ｎｏｖａｋ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｓｃｈｕｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｂａｇｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。バルプロ酸ナトリウムによる神経膠腫細胞の長期治療は、ＳＬＣ６Ａ１１ ｍＲＮＡ発現を減少させる（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２００３）。

【0141】

ＳＬＣ６Ａ１５は、過剰メチル化され、それによって結腸直腸がんにおいて下方制御され、大便に基づくアッセイのための候補バイオマーカーでであってもよい（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。

【0142】

ＳＬＣ７Ａ１は、急性骨髄性白血病芽球において構成的に発現される。これらの芽球はアルギニン再利用経路酵素の欠乏を示し、アルギニン蓄積および細胞増殖および生存をもたらす（Ｍｕｓｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＳＬＣ７Ａ１は結腸直腸がんにおいて過剰発現され、アルギニン蓄積および細胞増殖をもたらす、。第１３染色体遺伝子の過剰発現は、ＣＲＣにおいて極めて一般的である（Ｃａｍｐｓ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＳＬＣ７Ａ１は、マクロファージ分化のためのマーカーとして使用されてもよい。その発現は、ＴＨＰ１単球分化の誘導中に増加する（Ｂａｒｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＭＣＦ－７乳がん細胞株の増殖は、Ｌ－アルギニンに依存する。それはＳＬＣ７Ａ１を発現し、ＳＬＣ７Ａ１のノックダウンは、アルギニン取り込みの低下、細胞生存の低下、およびアポトーシスの増加をもたらす（Ａｂｄｅｌｍａｇｉｄ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＳＬＣ７Ａ１の発現は、多くのがんで発現されるヘムオキシゲナーゼ－１の発現と強く相関し、腫瘍の増殖と生存を促進する（Ｔａｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＳＬＣ７Ａ１は、肝細胞がんにおいて下方制御される肝臓特異的ｍｉＲ－１２２の直接の標的である。ｍｉＲ－１２２の下方制御は、ＳＬＣ７Ａ１上方制御および細胞内アルギニンレベル増大をもたらす。この経路はまた、結腸直腸がん由来の肝転移の重要な機序である（Ｋｅｄｄｅ ａｎｄ Ａｇａｍｉ，２００８；Ｉｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｋｉｓｈｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。タンパク質キナーゼＣの活性化は、ＳＬＣ７Ａ１内部移行をもたらす。ストレスは、ＳＬＣ７Ａ１の示差的発現をもたらす（Ｋａｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｒｏｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。

【0143】

ＳＵＤＳ３の喪失は、細胞形態の変化と細胞移動の増加をもたらす（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＳＵＤＳ３は、胸腺細胞分化に関与する（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＳＵＤＳ３は、抗腫瘍効果を有してもよい（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＵＳＰ１７はＳＵＤＳ３を脱ユビキチン化し、がんのＳＵＤＳ３関連ＨＤＡＣ活性を変化させる（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＳＵＤＳ３は、有糸分裂に関与する（Ｐｏｎｄｕｇｕｌａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＳＵＤＳ３は、乳がんで発現される（Ｓｉｌｖｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ＳＵＤＳ３は染色体分離を制御し、ｐ５３と相互作用し得る（Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．，２００６）。

【0144】

ＴＥＮＭ２は、月経開始年齢に関与するかもしれない。早期ＡＡＭは、ＩＩ型糖尿病、乳がんおよび卵巣がん、および心血管疾患に関連し、後期ＡＡＭは、低骨塩密度および心理学的障害に関連する（Ｙｅｒｍａｃｈｅｎｋｏ ａｎｄ Ｄｖｏｒｎｙｋ，２０１６）。高度に汚染された地域に住む肺がん患者には、ＤＯＣＫ２－ＴＥＮＭ２遺伝子融合転写物がある（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１５ａ）。ＴＥＮＭ２は、大多数の悪性中皮腫細胞で発現される（Ｚｉｅｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＴＥＮＭ２は、食道扁平上皮がんにおいて下方制御されてもよい（Ｋａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。

【0145】

ＩＩ期の結腸がんにおけるＴＧＭ５の局所的欠失が、この実体の駆動機構であってもよい（Ｂｒｏｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。非小細胞肺がんに現れるＴＧＭ５変異は、喫煙者と非喫煙者の間で差を示さない（ＹｏｎｇｊｕｎＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｂｒｏｄｅｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｒａｆｎａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。前立腺がんにおけるＴＧＦＢＲ３の喪失もまた、ＴＧＭ５を下方制御する（Ｓｈａｒｉｆｉ ｅｔ ａｌ．，２００７）。

【0146】

ＸＩＲＰ１は、基底細胞様乳がんの転移において変異する（Ｈｏａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＸＩＲＰ１プロモーターモチーフ遺伝子シグネチャは、ＥＲ＋ＨＥＲ２－乳がんと比較して、トリプルネガティブ乳がんに豊富である（Ｗｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ＸＩＲＰ１はビタミンＣ治療時に上方制御され、それはがんの細胞増殖もまた減少させる（Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｎａｇａｐｐａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＸＩＲＰ１は頭頸部扁上皮がんにおいて変異し、腫瘍抑制遺伝子であってもよい（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＸＩＲＰ１は、酸化的ストレス関連遺伝子である（Ｂａｌｕｃｈａｍｙ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

【0147】

ＺＢＥＤ６はＩＧＦ２の転写リプレッサーであり、それは結腸直腸がんにおいて過剰発現され、細胞増殖を促進する。６ＺＢＥＤ６のノックダウンは細胞周期に影響を及ぼし、ＲＫＯ細胞株における細胞増殖の増強と、ＨＣＴ１１６細胞における細胞増殖の減少をもたらす。ＺＢＥＤ６は、全て結腸直腸発がんに関与する、Ｗｎｔ、Ｈｉｐｐｏ、ＴＧＦ－β、ＥＧＦＲ、およびＰＩ３Ｋシグナル伝達に関与する、いくつかの遺伝子の転写リプレッサーである（Ｍａｒｋｌｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，２００９；Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ａｋｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。

【発明を実施するための形態】

【0148】

免疫応答の刺激は、宿主免疫系によって外来性として認識された抗原の存在に依存する。腫瘍関連抗原の存在の発見は、宿主の免疫系を用いて腫瘍増殖に介入する可能性を高めた。免疫系の体液性および細胞性アームの双方を活用する様々な機構が、がん免疫療法のために目下探求されている。

【0149】

細胞性免疫応答の特異的要素は、腫瘍細胞を特異的に認識して破壊できる。腫瘍浸潤性細胞集団からの、または末梢血からのＴ細胞の単離は、がんに対する自然免疫防御において、このような細胞が重要な役割を果たすことを示唆する。特に、細胞質ゾル内に位置するタンパク質または欠陥リボソーム産物（ＤＲＩＰＳ）に由来する、通常は８～１０アミノ酸残基の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）保有ペプチドのクラスＩ分子を認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞が、この応答において重要な役割を果たす。ヒトのＭＨＣ分子はまた、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも称される。

【0150】

「Ｔ細胞応答」という用語は、生体外または生体内でペプチドによって誘導される、エフェクター機能の特異的増殖および活性化を意味する。ＭＨＣクラスＩ拘束性細胞傷害性Ｔ細胞では、エフェクター機能は、ペプチドパルスされた、ペプチド前駆体パルスされた、または天然にペプチドを提示する、標的細胞の溶解；好ましくはペプチドによって誘導されるインターフェロン－γ、ＴＮＦ－α、またはＩＬ－２であるサイトカインの分泌；好ましくはペプチドによって誘導されるグランザイムまたはパーフォリンであるエフェクター分子の分泌；または脱顆粒であってもよい。

【0151】

「ペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結される、一連のアミノ酸残基を命名するために、本明細書で使用される。ペプチドは、好ましくは９アミノ酸長であるが、８アミノ酸長程度に短くあり得て、１０、１１、１２、１３または１４以上に長くあり得て、ＭＨＣクラスＩＩペプチド（本発明のペプチドの伸長された変異型）の場合、それらは１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸長以上に長くあり得る。

【0152】

さらに「ペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結される、一連のアミノ酸残基の塩を含むものとする。好ましくは、塩は、例えば、塩化物塩または酢酸塩（トリフルオロ酢酸塩）などの、ペプチドの薬学的に許容可能な塩である。ペプチドは生体内で塩ではないので、本発明によるペプチドの塩は、それらの生体内の状態がペプチドと実質的に異なることに留意すべきである。

【0153】

「ペプチド」という用語は、「オリゴペプチド」もまた含むものとする。「オリゴペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結される、一連のアミノ酸残基を命名するために、本明細書で使用される。オリゴペプチドの長さは、その中で正しいエピトープまたはエピトープ群が保持されれば、本発明にとって重要でない。オリゴペプチドは、典型的に、約３０アミノ酸残基長未満であり、約１５アミノ酸長を超える。

【0154】

「ポリペプチド」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに連結される、一連のアミノ酸残基を指す。正しいエピトープが保持されれば、ポリペプチドの長さは本発明にとって重要でない。ペプチドまたはオリゴペプチドという用語とは対照的に、ポリペプチドという用語は、約３０を超えるアミノ酸残基を含有する分子を指すことが意図される。

【0155】

ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質またはこのような分子をコードするポリヌクレオチドは、免疫応答を誘導できれば「免疫原性」である（したがって本発明における「免疫原」である）。本発明では、免疫原性は、より具体的には、Ｔ細胞応答を誘導する能力と定義される。したがって「免疫原」は、免疫応答を誘導できる分子であり、本発明では、Ｔ細胞応答を誘導できる分子である。別の態様では、免疫原は、それに対する特異的抗体またはＴＣＲを生じさせるのに使用される、ペプチド、ペプチドとＭＨＣの複合体、オリゴペプチド、および／またはタンパク質であり得る。

【0156】

クラスＩ Ｔ細胞「エピトープ」は、クラスＩ ＭＨＣ受容体に結合している短いペプチドを必要とし、三成分複合体（ＭＨＣクラスＩα鎖、β－２－ミクログロブリン、およびペプチド）を形成し、それは、適切な親和性でＭＨＣ／ペプチド複合体に結合する適合Ｔ細胞受容体を保有するＴ細胞によって、認識され得る。ＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドは、典型的に８～１４アミノ酸長であり、最も典型的には９アミノ酸長である。

【0157】

ヒトにおいては、ＭＨＣクラスＩ分子（ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ともまた称されるヒトのＭＨＣ分子）をコードする、３つの異なる遺伝子座、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃがある。ＨＬＡ－Ａ^＊０１、ＨＬＡ－Ａ^＊０２、およびＨＬＡ－Ｂ^＊０７は、これらの遺伝子座から発現され得る、異なるＭＨＣクラスＩ対立遺伝子の例である。

【0158】

表5：HLA-A*02およびHLA-A*24の発現頻度F、および最も高頻度のHLA-DR血清型。頻度は、ハーディ・ワインベルグの式F=1 - (1-Gf)2を用いて、Mori et al. (Mori et al., 1997)から適応された米国人集団内のハプロタイプ頻度Gfから推定された。連鎖不均衡のために、A*02またはA*24と特定のHLA-DR対立遺伝子との組み合わせは、それらの単一頻度から予測されるよりも、豊富でありまたは低頻度であるかもしれない。詳細については、Chanock et al. (Chanock et al, 2004)を参照されたい。

【表5-1】

【表5-2】

【0159】

本発明のペプチドは、好ましくは、本明細書に記載される本発明のワクチンに包含される場合、Ａ^＊０２に結合する。ワクチンはまた、汎結合ＭＨＣクラスＩＩペプチドを含んでもよい。したがって、本発明のワクチンを使用して、Ａ^＊０２陽性の患者においてがんを治療し得る一方で、これらのペプチドの汎結合特性のために、ＭＨＣクラスＩＩアロタイプを選択する必要はない。

【0160】

本発明のＡ^＊０２ペプチドが、例えばＡ^＊２４などの別の対立遺伝子に結合するペプチドと組み合わされた場合、ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子のいずれか単独による対処と比較して、任意の患者集団のより高い割合を治療し得る。大多数の集団では、対立遺伝子のいずれか単独によって、５０％未満の患者が対処され得た一方で、ＨＬＡ－Ａ^＊２４およびＨＬＡ－Ａ^＊０２エピトープを含んでなるワクチンは、任意の妥当な集団で、少なくとも６０％の患者を治療し得る。具体的には、以下の様々な地域において、これらの対立遺伝子の少なくとも１つが、以下の百分率の患者で陽性である：米国６１％、西欧６２％、中国７５％、韓国７７％、日本８６％（ｗｗｗ．ａｌｌｅｌｅｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ．ｎｅｔから計算された）。

【0161】

好ましい実施形態では、「ヌクレオチド配列」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのヘテロ重合体を指す。

【0162】

特定のペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、天然起源であってもよく、またはそれらは合成的に構築されてもよい。一般に、本発明のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質をエンコードするＤＮＡ断片は、ｃＤＮＡフラグメントと短いオリゴヌクレオチドリンカーから構築され、またはひと続きのオリゴヌクレオチドから構築されて、微生物またはウイルスオペロンに由来する調節因子を含んでなる、組換え転写単位で発現できる合成遺伝子が提供される。

【0163】

本明細書の用法では「ペプチドをコーディング（またはコード）するヌクレオチド」という用語は、配列が、例えば、ＴＣＲの生産に有用な樹状細胞または別の細胞株によって発現される生体系と適合性である、人工（人造）開始および停止コドンを含むペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を指す。

【0164】

本明細書の用法では、核酸配列への言及は、一本鎖および二本鎖の核酸の双方を含む。したがって、例えば、特異的配列は、文脈上明らかに別の意味が示唆されない限り、このような配列の一本鎖ＤＮＡ、このような配列とその補体との二本鎖（二本鎖ＤＮＡ）、およびこのような配列の補体を指す。

【0165】

「コード領域」という用語は、その天然ゲノム環境内で、遺伝子の発現産物を天然にまたは正常にコードする遺伝子の部分、すなわち、遺伝子の天然発現産物を生体内でコードする領域を指す。

【0166】

コード領域は、非変異（「正常」）、変異または改変遺伝子に由来し得て、またはＤＮＡ合成技術の当業者に周知の方法を使用して実験室で完全に合成された、ＤＮＡ配列または遺伝子にさえ由来し得る。

【0167】

「発現産物」という用語は、遺伝子の、そして遺伝コード縮重に起因する同等物をコードし、したがって同一アミノ酸をコードする任意の核酸配列の、天然翻訳産物である、ポリペプチドまたはタンパク質を意味する。

【0168】

コード配列に言及する場合、「断片」という用語は、その発現産物が、完全コード領域の発現産物と本質的に同一の生物学的機能または活性を保つ、完全未満のコード領域を含んでなるＤＮＡの部分を意味する。

【0169】

「ＤＮＡセグメント」という用語は、別々の断片の形態の、またはより大型のＤＮＡコンストラクトの構成要素としての、ＤＮＡポリマーを指し、それは、実質的に純粋な、すなわち、混入内因性物質を含まない形態で、例えばクローニングベクターを使用した標準生化学的方法によって、セグメントおよびその構成ヌクレオチド配列が、同定、操作、および回収できる量または濃度で、少なくとも１回単離されたＤＮＡに由来する。このようなセグメントは、典型的に真核生物遺伝子内に存在する内部非翻訳配列またはイントロンによって中断されていない、読み取り枠の形態で提供される。非翻訳ＤＮＡ配列は、それがコード領域の操作または発現を妨げない、読み取り枠下流に存在してもよい。

【0170】

「プライマー」という用語は、短い核酸配列を意味し、それはＤＮＡの１本鎖と対合し得て、ＤＮＡポリメラーゼがそこでデオキシリボヌクレオチド鎖合成を開始する、遊離３’－ＯＨ末端を提供する。

【0171】

「プロモーター」という用語は、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼ結合に関与する、ＤＮＡの領域を意味する。

【0172】

「単離」という用語は、物質が、その元の環境（例えば、それが天然起源であれば天然環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然システムで共存する物質の一部または全部から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得て、および／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり得るが、このようなベクターまたは組成物がその天然環境の一部でないと言う意味では、なおも単離されている。

【0173】

本発明によって開示されるポリヌクレオチド、および組換えまたは免疫原性ポリペプチドは、「精製」形態であってもよい。「精製」という用語は、完全に純粋である必要はなく；むしろ、それは相対的定義であることが意図され、これらの用語が当業者によって理解されるように、高度に精製された調製物、または部分的にのみ精製された調製物を含み得る。例えば、ｃＤＮＡライブラリーから単離された個々のクローンは、電気泳動的に均一に、従来法で精製されている。少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、より好ましくは４または５桁までの、出発原料または天然物質の精製が明示的に検討される。さらに、重量基準で、好ましくは９９．９９９％、または少なくとも９９．９９％または９９．９％；さらに望ましくは９９％以上の純度を有する、特許請求されるポリペプチドが明示的に包含される。

【0174】

本発明によって開示される核酸およびポリペプチド発現産物、ならびにこのような核酸および／またはこのようなポリペプチドを含有する発現ベクターは、「富化形態」であってもよい。本明細書の用法では、「富化」という用語は、物質濃度が、（例えば）その天然濃度の少なくとも約２、５、１０、１００、または１０００倍であることを意味し、有利には重量基準で０．０１％、好ましくは重量基準で少なくとも約０．１％である。重量基準で約０．５％、１％、５％、１０％、および２０％の富化調製物もまた、検討される。本発明を構成する、配列、コンストラクト、ベクター、クローン、およびその他の物質は、有利には、富化または単離形態であり得る。「活性断片」という用語は、通常は、単独で、または任意選択的に適切なアジュバントと共に、またはベクター中で、例えば、ウサギまたはマウスなどのそしてまたヒトをはじめとする哺乳類などの動物に投与されると免疫応答を生じる（すなわち、免疫原性を有する）ペプチド、ポリペプチドまたは核酸配列の断片を意味し、このような免疫応答は、ヒトなどのレシピエント動物内でＴ細胞応答を刺激する形態を取る。代案としては、「活性断片」はまた、生体外Ｔ細胞応答を誘導するのに使用されてもよい。

【0175】

本明細書の用法では、ポリペプチドとの関連で使用される場合、「部分」、「セグメント」、および「断片」という用語は、アミノ酸残基などの連続する残基の配列を指し、その配列はより大型の配列のサブセットを形成する。例えば、ポリペプチドが、トリプシンまたはキモトリプシンなどの一般的エンドペプチダーゼのいずれかによって処理されれば、このような処理から得られるオリゴペプチドは、出発ポリペプチドの部分、セグメントまたは断片に相当するであろう。ポリヌクレオチドに関して使用される場合、これらの用語は、いずれかのエンドヌクレアーゼによる前記ポリヌクレオチドの処理によって生じる生成物を指す。

【0176】

本発明によると、配列に言及する場合、「同一性百分率」または「パーセント同一」という用語は、比較される配列（「比較配列」）と、記載されまたは特許請求される配列（「参照配列」）とのアライメント後に、配列が、特許請求されまたは記載される配列と比較されることを意味する。次に同一性百分率は、次式に従って判定される：
同一性百分率＝１００［１－（Ｃ／Ｒ）］
式中、Ｃは、参照配列と比較される配列との間のアライメント長にわたる、参照配列と比較配列の間の差異の数であり、
（ｉ）比較配列中に対応する整列塩基またはアミノ酸を有しない、参照配列中の各塩基またはアミノ酸、および
（ｉｉ）参照配列中の各ギャップ、および
（ｉｉｉ）比較配列中の整列塩基またはアミノ酸と異なる、参照配列中の各整列塩基またはアミノ酸が差異を構成して、
（ｉｉｉｉ）アライメントは、整合配列の１位から開始しなくてはならず；
Ｒは、比較配列とのアライメント長にわたる参照配列中の塩基またはアミノ酸の数であり、参照配列中に生じる任意のギャップもまた、塩基またはアミノ酸として数えられる。

【0177】

比較配列と、それに対して同一性百分率が上のように計算される参照配列との間に、特定の最小同一性百分率とほぼ同じまたはそれを上回るアライメントが存在すれば、その中に、上記のように計算された同一性百分率が特定の同一性百分率未満であるアライメントが存在したとしても、比較配列は、参照配列との特定の最小同一性百分率を有する。

【0178】

したがって上述したように、本発明は、配列番号１～配列番号９１、または配列番号１～配列番号９１と８８％相同的であるその変異型、またはＴ細胞を前記ペプチドと交差反応させるその変異型からなる群から選択される配列を含んでなる、ペプチドを提供する。本発明のペプチドは、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子または前記ペプチドの伸長バージョンをクラスＩＩに結合する能力を有する。

【0179】

本発明では、「相同的」という用語は、２つのアミノ酸配列、すなわちペプチドまたはポリペプチド配列の配列間の同一性の程度を指す（上の同一性百分率を参照されたい）。前述の「相同性」は、比較される配列にわたり、最適条件下でアライメントされた２つの配列を比較することで判定される。このような配列相同性は、例えばＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用してアライメントを作成することで、計算され得る。一般に利用できる配列解析ソフトウェア、より具体的には、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸまたはその他のツールが、公共データベースによって提供される。

【0180】

当業者は、特定のペプチドの変異型によって誘導されるＴ細胞が、ペプチドそれ自体と交差反応できるかどうかを評価できるであろう（Ａｐｐａｙ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｃｏｌｏｍｂｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｆｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｚａｒｅｍｂａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。

【0181】

所与のアミノ酸配列の「変異型」によって、本発明者らは、ペプチドが、配列番号１～配列番号９１からなる所与のアミノ酸配列からなるペプチドと実質的に同様に、ＨＬＡ分子となおも結合できるように、（例えば、それらを別の天然アミノ酸残基の側鎖で、またはその他の側鎖で置換することにより）例えば、アミノ酸の１つまたは２つの残基の側鎖が変化することを意味する。例えば、ペプチドは、それがＨＬＡ－Ａ^＊０２または－ＤＲなどの適切なＭＨＣ分子の結合溝と相互作用して結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持するように修飾されてもよく、このようにしてそれは、活性化Ｔ細胞のＴＣＲに結合する能力を改善せずとも、少なくとも維持する。

【0182】

これらのＴ細胞は、引き続いて細胞と交差反応して、本発明の態様で定義される同族ペプチドの天然アミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する細胞を殺滅し得る。学術文献およびデータベース（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｇｏｄｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）から演繹され得るように、ＨＬＡ結合ペプチドの特定の位置は、典型的にアンカー残基であり、結合溝を構成するポリペプチド鎖の極性、電気物理的、疎水性、および空間特性によって画定されるＨＬＡ受容体の結合モチーフと適合する、コア配列を形成する。したがって、当業者は、既知のアンカー残基を保つことで、配列番号１～配列番号９１に記載されるアミノ酸配列を修飾でき、このような変異型がＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力を維持するかどうかを判定できるであろう。本発明の変異型は、活性化Ｔ細胞のＴＣＲに結合する能力を維持し、それは引き続いて、本発明の態様で定義されるような同族ペプチドの天然アミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する細胞と交差反応して、それを殺滅し得る。

【0183】

本明細書で開示される元の（未修飾）ペプチドは、特に明記されない場合は、ペプチド鎖内の異なる、おそらくは選択的な部位における、１つまたは複数の残基の置換によって修飾され得る。好ましくはこれらの置換は、アミノ酸鎖の末端に位置する。このような置換は、保存的性質であってもよく、例えば、疎水性アミノ酸が別の疎水性アミノ酸によって置換されるなど、構造および特徴の類似したアミノ酸によってアミノ酸が置換される。さらにより保存的な置換は、ロイシンのイソロイシンによる置換などの、同一または類似サイズおよび化学的性質のアミノ酸の置換である。天然起源相同タンパク質ファミリーの配列多様性の研究では、特定のアミノ酸置換は、他よりも耐容されることが多く、これらは、元のアミノ酸とその置換物との間のサイズ、電荷、極性、および疎水性の類似性との相関を示すことが多く、これが「保存的置換」の定義の基礎である。

【0184】

保存的置換は、本明細書では、以下の５つのグループの１つの中の交換として定義される：グループ１－小型脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；グループ２－極性の負に帯電した残基とそれらのアミド（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）；グループ３－極性の正に帯電した残基（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；グループ４－大型脂肪族非極性残基（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ）；およびグループ５－大型芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）。

【0185】

より保存的でない置換は、アラニンのイソロイシン残基による置換などの、類似した特徴を有するが、サイズがいくらか異なる別のアミノ酸による置換を伴うかもしれない。高度に非保存的な置換は、極性アミノ酸の、または塩基性アミノ酸の酸性アミノ酸による置換を伴うかもしれない。しかし化学効果は完全に予測可能でなく、過激な置換は単純な化学的原理からは予測できない偶然の効果を生じさせる可能性があるので、このような「過激な」置換は、潜在的に無効であるとして却下され得ない。

【0186】

もちろんこのような置換には、通常のＬ－アミノ酸以外の構造体が関与してもよい。したがってＤ－アミノ酸が、本発明の抗原性ペプチドに通常見いだされるＬ－アミノ酸を置換するかもしれず、依然として本明細書の開示に包含される。さらに、非標準アミノ酸（すなわち、一般的な天然タンパク質新生アミノ酸以外）もまた置換目的で使用して、本発明による免疫原および免疫原性ポリペプチドが製造されてもよい

【0187】

２つ以上の位置における置換が、以下に定義されるように実質的に同等のまたはそれを超える抗原活性のあるペプチドをもたらすことが判明した場合、これらの置換の組み合わせを試験して、置換の組み合わせが、ペプチドの抗原性に相加または相乗効果をもたらすかどうかが判定される。最大でも、ペプチド内の４つを超える位置が、同時に置換されることはない。

【0188】

本明細書で示されるようなアミノ酸配列から本質的になるペプチドは、非修飾ペプチドと比較すると、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力が実質的に変化したり悪影響を受けたりすることなく交換される、１つまたは２つの非アンカーアミノ酸を有し得る（アンカーモチーフについては下記を参照されたい）。別の実施形態では、本明細書で示されるようなアミノ酸配列から本質的になるペプチドにおいては、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力が非修飾ペプチドと比較して実質的に変化したり悪影響を受けることなく、１つまたは２つのアミノ酸が、それらの保存的交換パートナー（以下を参照されたい）で交換され得る。

【0189】

Ｔ細胞受容体との相互作用に実質的に寄与しないアミノ酸残基は、その組み込みが、Ｔ細胞反応性に実質的に影響を及ぼさず、関連ＭＨＣとの結合を排除しない、その他のアミノ酸での置換によって修飾され得る。したがって与えられた但し書きを除いて、本発明のペプチドは、与えられたようなアミノ酸配列またはそれらの部分または変異型を含む、任意のペプチド（本発明者らは、その用語にオリゴペプチドまたはポリペプチドを含める）であってもよい。

【0190】

表6：配列番号4、6、および10に記載のペプチドの変異型およびモチーフ

【表6-1】

【表6-2】

【表6-3】

【0191】

より長い（伸長された）ペプチドもまた、適切であってもよい。ＭＨＣクラスＩエピトープは、通常は８～１１アミノ酸長であるが、実際のエピトープを含むより長いペプチドまたはタンパク質から、ペプチドプロセッシングによって作製することが可能である。実際のエピトープ側面に位置する残基は、プロセッシング中に実際のエピトープを曝露させるのに必要なタンパク質分解切断に、実質的に影響を及ぼさない残基であることが好ましい。

【0192】

本発明のペプチドは、最大４個のアミノ酸で伸長し得て、すなわち４：０～０：４の間のあらゆる組み合わせで、どちらかの末端に１、２、３または４個のアミノ酸を付加し得る。本発明による伸長の組み合わせは、表７にある。

【0193】

表7：本発明のペプチドの伸長（延長）の組み合わせ

【表7】

【0194】

伸長／延長のためのアミノ酸は、元のタンパク質配列のペプチドまたは任意のその他のアミノ酸であり得る。伸長を利用して、ペプチドの安定性または溶解度を高め得る。

【0195】

したがって本発明のエピトープは、天然起源腫瘍関連または腫瘍特異的エピトープと同一であってもよく、またはそれらが実質的に同一の抗原活性を有しさえすれば、４つ以下の残基が参照ペプチドと異なるエピトープを含んでもよい。

【0196】

代案の実施形態では、ペプチドは、４つを超えるアミノ酸で、好ましくは最大３０アミノ酸の全長まで、片側または両側で伸長される。これは、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドをもたらしてもよい。ＭＨＣクラスＩＩへの結合は、当該技術分野で公知の方法によって試験される得る。

【0197】

したがって、本発明は、ＭＨＣクラスＩエピトープのペプチドおよび変異型を提供し、ペプチドまたは変異型は、８～１００、９～１００、１０～１００、１１～１００、１２～１００、好ましくは８～３０，～９～３０、１０～３０、１１～３０、１２～３０、最も好ましくは８～１４、９～１４、１０～１４、１１～１４、１２～１４の全長を有する。本発明は、ＭＨＣクラスＩエピトープのペプチドおよび変異型をさらに提供し、ペプチドまたは変異型は、すなわち８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のアミノ酸の全長を有し、伸長されたクラスＩＩ結合ペプチドの場合、長さはまた、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２個のアミノ酸であり得る。

【0198】

もちろん、本発明によるペプチドまたは変異型は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩの分子に結合する能力を有する。ペプチドまたは変異型のＭＨＣ複合体への結合は、当該技術分野で既知の方法によって試験されてもよい。

【0199】

好ましくは、本発明によるペプチドに特異的なＴ細胞を置換ペプチドについて試験する場合、置換ペプチドが背景に対して最大溶解増加の半分を達成するペプチド濃度は、約１ｍＭ以下、好ましくは約１μＭ以下、より好ましくは約１ｎＭ以下、さらにより好ましくは約１００ｐＭ以下、最も好ましくは約１０ｐＭ以下である。置換ペプチドが、２人以上、少なくとも２人、より好ましくは３人の個人からのＴ細胞によって認識されることもまた好ましい。

【0200】

本発明の特に好ましい実施形態では、ペプチドは、配列番号に１～配列番号９１に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる。

【0201】

「から本質的になる」は、本発明によるペプチドが、配列番号１～配列番号９１のいずれかに記載の配列またはその変異型に加えて、ＭＨＣ分子エピトープのエピトープとして機能するペプチドの一部を必ずしも構成しない、追加的なＮおよび／またはＣ末端に位置するアミノ酸の一連の配列を含有することを意味するものとする。

【0202】

それでもなお、これらの一連の配列は、本発明によるペプチドの細胞への効率的な導入を提供するのに重要であり得る。本発明の一実施形態では、ペプチドは、例えば、ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ００４９７に由来する、ＨＬＡ－ＤＲ抗原関連不変鎖（ｐ３３、以下の「Ｉｉ」）の８０個のＮ末端アミノ酸を含んでなる、融合タンパク質の一部である。その他の融合物においては、本発明のペプチドは、本明細書に記載されるような抗体、またはその機能的部分に、特に抗体の配列に、前記抗体によって特異的に標的化されるように融合し得て、または例えば、本明細書に記載されるような樹状細胞に対して特異的な抗体に、またはその中に融合し得る。

【0203】

さらにペプチドまたは変異型は、より強力な免疫応答を引き起こすために、安定性および／またはＭＨＣ分子への結合を改善するようにさらに修飾されてもよい。ペプチド配列のこのような最適化方法は当該技術分野で周知であり、例えば、逆ペプチド結合または非ペプチド結合の導入が挙げられる。

【0204】

逆ペプチド結合においては、アミノ酸残基はペプチド（－ＣＯ－ＮＨ－）結合によって連結せず、ペプチド結合が逆転している。このようなレトロ－インベルソペプチド模倣剤は、例えば、参照により本明細書に援用される、Ｍｅｚｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ（１９９７）（Ｍｅｚｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７）に記載されるものなどの当該技術分野で既知の方法を使用して製造されてもよい。このアプローチは、側鎖の方向でなく主鎖に関与する変化を含有する、擬ペプチドの生成を伴う。Ｍｅｚｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｚｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７）は、ＭＨＣ結合およびＴヘルパー細胞応答のために、これらの擬ペプチドが有用であることを示す。ＣＯ－ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ－ＣＯ結合を含有するレトロインバースペプチドは、タンパク質分解に対してはるかにより高い抵抗性がある。

【0205】

非ペプチド結合は、例えば、－ＣＨ_２－ＮＨ、－ＣＨ_２Ｓ－、－ＣＨ_２ＣＨ_２－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＯＣＨ_２－、－ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２－、および－ＣＨ_２ＳＯ－である。米国特許第４，８９７，４４５号明細書は、標準手順によって合成されるポリペプチド、およびＮａＣＮＢＨ_３の存在下でアミノアルデヒドとアミノ酸を反応させることで合成される非ペプチド結合が関与する、ポリペプチド鎖中の非ペプチド結合（－ＣＨ_２－ＮＨ）を固相合成する方法を提供する。

【0206】

上述の配列を含んでなるペプチドは、それらのアミノおよび／またはカルボキシ末端に存在する追加的な化学基と共に合成して、ペプチドの安定性、生物学的利用能、および／または親和性を高めてもよい。例えば、カルボベンゾキシル、ダンシル、またはｔ－ブチルオキシカルボニル基などの疎水性基が、ペプチドのアミノ末端に付加されてもよい。同様に、アセチル基または９－フルオレニルメトキシ－カルボニル基が、ペプチドのアミノ末端に配置されてもよい。さらに、疎水性基、ｔ－ブチルオキシカルボニル、またはアミド基が、ペプチドのカルボキシ末端に付加されてもよい。

【0207】

さらに、本発明のペプチドは、それらの立体配置を改変するように合成されてもよい。例えば、通常のＬ異性体でなく、ペプチドの１つまたは複数のアミノ酸残基のＤ異性体が使用されてもよい。なおもさらに、本発明のペプチドのアミノ酸残基の少なくとも１つは、周知の非天然起源アミノ酸残基の１つで置換されてもよい。これらのような変化は、本発明のペプチドの安定性、生物学的利用能および／または結合作用の増加に役立ってもよい。

【0208】

同様に、本発明のペプチドまたは変異型は、ペプチド合成の前または後のどちらかに、特定のアミノ酸を反応させることで化学的に修飾されてもよい。このような修飾の例は、当該技術分野で周知であり、例えば、参照により本明細書に援用される、Ｒ．Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，３ｒｄ ｅｄ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２００４（Ｌｕｎｄｂｌａｄ，２００４）に要約される。アミノ酸の化学修飾としては、これに限定されるものではないが、アシル化、アミジン化、リジンのピリドキシル化、還元アルキル化、２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化、システインのシステイン酸への過ギ酸酸化によるカルボキシル基のアミド修飾およびスルフヒドリル修飾、水銀誘導体形成、その他のチオール化合物との混合ジスルフィド形成、マレイミドとの反応、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化、およびアルカリ性ｐＨでのシアネートによるカルバモイル化による修飾が挙げられるが、これに限定されるものではない。この点において、当業者は、タンパク質の化学修飾に関するより詳細な手順について、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｅｄｓ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ ＮＹ １９９５－２０００）（Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）の第１５章を参照されたい。

【0209】

簡単に述べると、例えば、タンパク質中のアルギニル残基の修飾は、付加体を形成するためのフェニルグリオキサール、２，３－ブタンジオン、および１，２－シクロヘキサンジオンなどの隣接するジカルボニル化合物の反応に基づくことが多い。別の例は、メチルグリオキサールとアルギニン残基の反応である。システインは、リジンおよびヒスチジンなどのその他の求核性部位の同時の修飾なしに修飾され得る。その結果、システイン修飾のために多数の試薬が利用可能である。Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈなどの会社のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）が、特定の試薬に関する情報を提供する。

【0210】

タンパク質中のジスルフィド結合の選択的還元もまた、一般的である。ジスルフィド結合は、生物医薬品の加熱処理中に形成されて酸化され得る。ウッドワード試薬Ｋを使用して、特定のグルタミン酸残基が修飾されてもよい。Ｎ－（３－（ジメチルアミノ）プロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミドを利用して、リジン残基とグルタミン酸残基との間に分子内架橋が形成され得る。例えば、ジエチルピロ炭酸は、タンパク質中のヒスチジル残基修飾のための試薬である。ヒスチジンはまた、４－ヒドロキシ－２－ノネナールを使用して修飾され得る。リジン残基およびその他のα－アミノ基の反応物は、例えば、ペプチドの表面への結合またはタンパク質／ペプチド架橋で有用である。リジンはポリ（エチレン）グリコールの付着部位であり、タンパク質のグリコシル化の主要な修飾部位である。タンパク質中のメチオニン残基は、例えば、ヨードアセトアミド、ブロモエチルアミン、およびクロラミンＴによって修飾され得る。

【0211】

テトラニトロメタンおよびＮ－アセチルイミダゾールを使用して、チロシル残基が修飾され得る。ジチロシンの形成を通じた架橋は、過酸化水素／銅イオンによって達成され得る。

【0212】

トリプトファンの修飾に関する最近の研究では、Ｎ－ブロモサクシニミド、臭化２－ヒドロキシ－５－ニトロベンジルまたは３－ブロモ－３－メチル－２－（２－ニトロフェニルメルカプト）－３Ｈ－インドール（ＢＰＮＳ－スカトール）が使用されている。

【0213】

ＰＥＧによる治療用タンパク質およびペプチドの成功裏の修飾が、循環半減期の延長に関連することが多い一方で、タンパク質と、グルタルアルデヒド、ポリエチレングリコールジアクリレート、およびホルムアルデヒドとの架橋は、ハイドロゲル調製のために使用される。免疫療法のためのアレルゲンの化学修飾は、カリウムシアネートでのカルバミル化によって達成されることが多い。

【0214】

本発明の別の実施形態は、非天然ペプチドに関し、前記ペプチドは、配列番号１～配列番号１５６に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になり、薬学的に許容可能な塩として合成的に生産される（例えば、合成される）。ペプチドを合成的に生産する方法は、当該技術分野で周知である。生体内で産生されるペプチドは塩でないため、本発明によるペプチドの塩は、ペプチドの生体内での状態と実質的に異なる。ペプチドの非天然塩形態は、特に、ペプチドを含んでなる医薬組成物、例えば、本明細書で開示されるペプチドワクチンなどの文脈で、ペプチドの溶解性を媒介する。治療される対象にペプチドを効率的に提供するためには、ペプチドの十分で少なくとも実質的な溶解性が必要である。好ましくは、塩は、ペプチドの薬学的に許容可能な塩である。本発明によるこれらの塩としては、ア二オンとしてのＰＯ_４ ^３－、ＳＯ_４ ^２－、ＣＨ_３ＣＯＯ^－、Ｃｌ^－、Ｂｒ^－、ＮＯ_３ ^－、ＣｌＯ_４ ^－、Ｉ^－、ＳＣＮ^－、およびカチオンとしてのＮＨ_４ ^＋、Ｒｂ^＋、Ｋ^＋、Ｎａ^＋、Ｃｓ^＋、Ｌｉ^＋、Ｚｎ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｃｕ^２＋、およびＢａ^２＋を含んでなるホフマイスター系列の塩類などのアルカリ塩およびアルカリ土類塩類が挙げられる。特に塩類は、（ＮＨ_４）_３ＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、（ＮＨ_４）Ｈ_２ＰＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＮＨ_４ＣＨ_３ＣＯＯ、ＮＨ_４Ｃｌ、ＮＨ_４Ｂｒ、ＮＨ_４ＮＯ_３、ＮＨ_４ＣＩＯ_４、ＮＨ_４Ｉ、ＮＨ_４ＳＣＮ、Ｒｂ_３ＰＯ_４、Ｒｂ_２ＨＰＯ_４、ＲｂＨ_２ＰＯ_４、Ｒｂ_２ＳＯ_４、Ｒｂ_４ＣＨ_３ＣＯＯ、Ｒｂ_４Ｃｌ、Ｒｂ_４Ｂｒ、Ｒｂ_４ＮＯ_３、Ｒｂ_４ＣＩＯ_４、Ｒｂ_４Ｉ、Ｒｂ_４ＳＣＮ、Ｋ_３ＰＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、ＫＣＨ_３ＣＯＯ、ＫＣｌ、ＫＢｒ、ＫＮＯ_３、ＫＣｌＯ_４、ＫＩ、ＫＳＣＮ、Ｎａ_３ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ＮａＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＳＯ_４、ＮａＣＨ_３ＣＯＯ、ＮａＣｌ、ＮａＢｒ、ＮａＮＯ_３、ＮａＣＩＯ_４、ＮａＩ、ＮａＳＣＮ、ＺｎＣＩ_２Ｃｓ_３ＰＯ_４、Ｃｓ_２ＨＰＯ_４、ＣｓＨ_２ＰＯ_４、Ｃｓ_２ＳＯ_４、ＣｓＣＨ_３ＣＯＯ、ＣｓＣｌ、ＣｓＢｒ、ＣｓＮＯ_３、ＣｓＣＩＯ_４、ＣｓＩ、ＣｓＳＣＮ、Ｌｉ_３ＰＯ_４、Ｌｉ_２ＨＰＯ_４、ＬｉＨ_２ＰＯ_４、Ｌｉ_２ＳＯ_４、ＬｉＣＨ_３ＣＯＯ、ＬｉＣｌ、ＬｉＢｒ、ＬｉＮＯ_３、ＬｉＣｌＯ_４、ＬｉＩ、ＬｉＳＣＮ、Ｃｕ_２ＳＯ_４、Ｍｇ_３（ＰＯ_４）_２、Ｍｇ_２ＨＰＯ_４、Ｍｇ（Ｈ_２ＰＯ_４）_２、Ｍｇ_２ＳＯ_４、Ｍｇ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_２、ＭｇＣｌ_２、ＭｇＢｒ_２、Ｍｇ（ＮＯ_３）_２、Ｍｇ（ＣｌＯ_４）_２、ＭｇＩ_２、Ｍｇ（ＳＣＮ）_２、ＭｎＣｌ_２、Ｃａ_３（ＰＯ_４）、、Ｃａ_２ＨＰＯ_４、Ｃａ（Ｈ_２ＰＯ_４）_２、ＣａＳＯ_４、Ｃａ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_２、ＣａＣｌ_２、ＣａＢｒ_２、Ｃａ（ＮＯ_３）_２、Ｃａ（ＣｌＯ_４）_２、ＣａＩ_２、Ｃａ（ＳＣＮ）_２、Ｂａ_３（ＰＯ_４）_２、Ｂａ_２ＨＰＯ_４、Ｂａ（Ｈ_２ＰＯ_４）_２、ＢａＳＯ_４、Ｂａ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_２、ＢａＣｌ_２、ＢａＢｒ_２、Ｂａ（ＮＯ_３）_２、Ｂａ（ＣｌＯ_４）_２、ＢａＩ_２、およびＢａ（ＳＣＮ）_２から選択される。特に好ましいのは、例えば、塩化物塩または酢酸塩（トリフルオロ酢酸塩）などのＮＨ酢酸塩、ＭｇＣｌ_２、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、およびＣａＣｌ_２である。

【0215】

ペプチドが修飾されまたは非ペプチド結合を含む、ペプチドまたは変異型は、本発明の好ましい実施形態である。一般に、ペプチドおよび変異型（少なくともアミノ酸残基間にペプチド結合を含有するもの）は、Ｌｕｋａｓ ｅｔ ａｌ．（Ｌｕｋａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８１）によって、そしてその中で引用される参考文献によって開示される、Ｆｍｏｃ－ポリアミド様式の固相ペプチド合成によって合成されてもよい。一時的なＮ－アミノ基保護は、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基によってもたらされる。この高度に塩基不安定性の保護基の反復性切断は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンを使用して実施される。側鎖官能基は、それらのブチルエーテル（セリン、スレオニン、およびチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸およびアスパラギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル誘導体（リジンおよびヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システインの場合）、および４－メトキシ－２，３，６－トリメチルベンゼンスルホニル誘導体（アルギニンの場合）として保護されてもよい。グルタミンまたはアスパラギンがＣ末端残基である場合、側鎖アミド官能基を保護するために、４，４’－ジメトキシベンズヒドリル基が活用される。固相担体は、ジメチルアクリルアミド（主鎖単量体）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（架橋剤）、およびアクリロイルサルコシンメチルエステル（機能化因子）の３つの単量体から構成される、ポリジメチル－アクリルアミドポリマーをベースとする。使用されるペプチド－対－樹脂の切断可能な結合因子は、酸不安定性４－ヒドロキシメチル－フェノキシ酢酸誘導体である。逆転Ｎ，Ｎ－ジシクロヘキシル－カルボジイミド／１ヒドロキシベンゾトリアゾール媒介共役手順を使用して付加されるアスパラギンおよびグルタミンを除いて、全てのアミノ酸誘導体は、それらのあらかじめ形成された対称的な無水物誘導体として付加される。全ての共役および脱保護反応は、ニンヒドリン、トリニトロベンゼンスルホン酸またはイサチン試験手順を使用してモニターされる。合成完了時に、ペプチドは樹脂担体から切断され、同時に、５０％スカベンジャー混合物を含有する９５％トリフルオロ酢酸での処理によって、側鎖保護基が除去される。一般に使用されるスカベンジャーとしては、エタンジチオール、フェノール、アニソール、および水が挙げられ、正確な選択は、合成されるペプチドの構成アミノ酸に左右される。ペプチドの合成のための固相法と溶液相法の組み合わせもまた、可能である（例えば、（Ｂｒｕｃｋｄｏｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４）、およびその中で引用される参考文献を参照されたい）。

【0216】

トリフルオロ酢酸は、真空蒸発によって除去され、引き続くジエチルエーテルを用いた磨砕は、粗製ペプチドをもたらす。存在するあらゆるスカベンジャーは、単純な抽出手順によって除去され、それは水相の凍結乾燥時に、スカベンジャーを含まない粗製ペプチドを与える。ペプチド合成のための試薬は、通常、例えば、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（英国ノッティンガム）から入手できる。

【0217】

精製は、再結晶化、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および（通常は）例えば、アセトニトリル／水勾配分離を使用した逆相高速液体クロマトグラフィーなどの技術の任意の１つまたは組み合わせによって実施されてもよい。

【0218】

ペプチドの分析は、薄層クロマトグラフィー、電気泳動法、特にキャピラリー電気泳動法、固相抽出（ＣＳＰＥ）、逆相高速液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析を使用して、高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分光分析によって、ならびにＭＡＬＤＩおよびＥＳＩ－Ｑ－ＴＯＦ質量分光分析によって、実施されてもよい。

【0219】

過剰提示ペプチドを選択するために、中央値サンプル提示ならびに反復試験変動を示す、提示プロファイルが計算される。プロファイルは、目的腫瘍実体のサンプルを正常なサンプルのベースラインに並置させる。次に、線形混合効果モデルのｐ値を計算し（Ｐｉｎｈｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、偽発見率によって複数試験について補正することで（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ ａｎｄ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，１９９５）、これらの各プロファイルが過剰提示スコアに統合され得る（実施例１、図１参照）。

【0220】

質量分析によるＨＬＡリガンドの同定と相対的定量化のために、衝撃凍結サンプルからのＨＬＡ分子が精製されて、ＨＬＡ関連ペプチドが単離された。単離ペプチドを分離して、オンラインナノエレクトロスプレーイオン化（ｎａｎｏＥＳＩ）液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）実験によって配列を同定した。その結果生じたペプチド配列は、頭頸部扁上皮がんサンプル（Ｎ＝１７Ａ^＊０２陽性サンプル）から記録された天然腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）の断片化パターンと、同一配列の対応する合成標準ペプチドの断片化パターンとの比較によって、確認された。ペプチドは、原発性腫瘍のＨＬＡ分子のリガンドとして直接、同定されたので、これらの結果は、１４人の頭頸部扁上皮がんがん患者から入手された原発性がん組織上における、同定されたペプチドの天然プロセッシングおよび提示の直接的証拠を提供する。

【0221】

発見パイプラインＸＰＲＥＳＩＤＥＮＴ（登録商標）ｖ２．１（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第２０１３－００９６０１６号明細書を参照されたい）は、いくつかの異なる非がん性組織および臓器と比較した、がん組織上のＨＬＡ拘束性ペプチドレベルの直接相対定量化に基づく、妥当な過剰提示ペプチドワクチン候補の同定と選択ができるようにする。これは、独自仕様のデータ解析パイプラインで処理された獲得ＬＣ－ＭＳデータを使用して、配列同定のためのアルゴリズム、スペクトルクラスタリング、イオン計数、滞留時間アライメント、電荷状態のデコンボリューション、および正規化を組み合わせる、無標識示差定量化の開発によって達成された。

【0222】

各ペプチドおよびサンプルの誤差推定値を含む、提示レベルが確立された。腫瘍組織上で排他的に提示されるペプチド、および腫瘍において過剰提示されるペプチドが、非がん性の組織および臓器との比較で同定されている。

【0223】

頭頸部扁上皮がん組織サンプル由来のＨＬＡ－ペプチド複合体は精製され、ＨＬＡ関連ペプチドは、単離されＬＣ－ＭＳによって分析された（実施例を参照されたい）。本出願に含まれる全てのＴＵＭＡＰは、原発性頭頸部扁上皮がんサンプル上でこのアプローチによって同定され、原発性頭頸部扁上皮がんにおけるそれらの提示が確認された。

【0224】

複数の頭頸部扁上皮がんおよび正常組織上で同定されたＴＵＭＡＰは、非標識ＬＣ－ＭＳデータのイオン計数を用いて定量化された。方法は、ペプチドのＬＣ－ＭＳシグナル面積が、サンプル中のその存在量と相関すると仮定する。様々なＬＣ－ＭＳ実験におけるペプチドの全ての定量的シグナルは、中心傾向に基づいて正規化され、サンプル当たりで平均化されて、提示プロファイルと称される棒グラフにマージされた。提示プロファイルは、タンパク質データベース検索、スペクトルクラスタリング、電荷状態デコンボリューション（除電）、および滞留時間アライメントおよび正規化のような、異なる解析法を統合する。

【0225】

ペプチドの過剰提示に加えて、基礎となる遺伝子のｍＲＮＡ発現が試験された。ｍＲＮＡデータは、正常組織およびがん組織のＲＮＡＳｅｑ分析を通して得られた（実施例２、図２参照）。正常組織データのさらなる出典は、約３０００の正常組織サンプル（Ｌｏｎｓｄａｌｅ，２０１３）に由来する、公的に利用可能なＲＮＡ発現データのデータベースであった。それがコードするｍＲＮＡが、がん組織では高度に発現されるが、生命維持に必要な正常組織では非常に低いかまたは存在しない、タンパク質に由来するペプチドが、好ましくは本発明に包含される。

【0226】

本発明は、本発明のペプチドを過剰にまたは排他的に提示する、がん／腫瘍、好ましくは頭頸部扁上皮がんの治療に有用なペプチドを提供する。これらのペプチドは、質量分析によって、原発性ヒト頭頸部扁上皮がんサンプル上で、ＨＬＡ分子によって天然に提示されることが示された。

【0227】

それにペプチドが由来する起源遺伝子／タンパク質（「完全長タンパク質」または「基礎タンパク質」とも称される）の多くは、正常組織と比較してがんにおいて高度に過剰発現されることが示されて、起源遺伝子の高度な腫瘍関連性が実証され、「正常組織」は、本発明との関連で、健常［主要適応症の正常組織を挿入する］細胞またはその他の正常組織細胞のどちらかを意味するものとする（実施例２を参照されたい）。さらに、ペプチド自体は、腫瘍組織上では強く過剰提示されるが、正常組織上では過剰提示されず、「腫瘍組織」は、本発明との関連で、頭頸部扁上皮がんに罹患している患者に由来するサンプルを意味するものとする（実施例１を参照されたい）。

【0228】

ＨＬＡ結合ペプチドは、免疫系、特にＴリンパ球によって認識され得る。Ｔ細胞は、例えば、誘導ペプチドを提示する頭頸部扁上皮がん細胞などの、認識されたＨＬＡ／ペプチド複合体を提示する細胞を破壊し得る。

【0229】

本発明のペプチドは、Ｔ細胞応答を刺激でき、および／または過剰提示されることが示されおり、したがって本発明に従って、抗体および／または可溶性ＴＣＲなどのＴＣＲの製造のために使用され得る（実施例３、実施例４を参照されたい）。さらに、ペプチドは、それぞれのＭＨＣと複合体化した場合に、本発明による抗体および／またはＴＣＲ、特にＴＣＲ製造のためにも使用され得る。それぞれの方法は当業者に良く知られており、それぞれの参考文献にもまた見られる。したがって本発明のペプチドは、それによって腫瘍細胞が破壊され得る、患者における免疫応答を生じさせるのに有用である。患者における免疫応答は、理想的には免疫原性を増強する薬剤（すなわちアジュバント）との組み合わせで、記載されるペプチド、または適切な前駆体（例えば伸長ペプチド、タンパク質、またはこれらのペプチドをコードする核酸）を患者に直接投与することで、誘導され得る。本発明の標的ペプチドは、正常組織上では同等のコピー数で提示されないので、このような治療的ワクチン接種から生じる免疫応答は、腫瘍細胞に対して高度に特異的であることが予測され得て、患者の正常細胞に対する望まれない自己免疫反応のリスクを防止する。

【0230】

本明細書は、α鎖およびβ鎖（「α／βＴＣＲ」）を含んでなるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）にさらに関する。ＭＨＣ分子によって提示されるとＴＣＲおよび抗体に結合できる、発明のペプチドもまた提供される。本明細書はまた、本明細書のＴＣＲおよびペプチドを発現するための核酸、ベクター、および宿主細胞；そしてそれを使用する方法にも関する。

【0231】

「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲと略記される）という用語は、αポリペプチド鎖（α鎖）およびβポリペプチド鎖（β鎖）を含んでなるヘテロ二量体分子を指し、ヘテロ二量体受容体は、ＨＬＡ分子によって提示されるペプチド抗原と結合できる。本用語は、いわゆるγ／δＴＣＲもまた含む。

【0232】

一実施形態では、本明細書は、本明細書に記載されるようなＴＣＲを製造する方法を提供し、方法は、ＴＣＲの発現を促進するのに適した条件下でＴＣＲを発現できる、宿主細胞を培養するステップを含んでなる。

【0233】

別の態様における説明は、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞または人工抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩまたはＩＩ ＭＨＣ分子上に抗原が負荷され、または抗原／クラスＩまたはＩＩ ＭＨＣ複合体モノマーを四量体化することで、クラスＩまたはＩＩ ＭＨＣ四量体上に抗原が負荷される、本明細書に記載の方法に関する。

【0234】

α／βＴＣＲのαおよびβ鎖、そしてγ／δＴＣＲのγおよびδ鎖は、一般にそれぞれ２つの「ドメイン」、すなわち可変および定常ドメインを有すると見なされる。可変ドメインは、可変領域（Ｖ）と接合領域（Ｊ）の連結からなる。可変ドメインはまた、リーダー領域（Ｌ）を含んでもよい。βおよびδ鎖はまた、多様性領域（Ｄ）を含んでもよい。αおよびβ定常ドメインはまた、αおよびβ鎖を細胞膜に固着させるＣ末端膜貫通（ＴＭ）ドメインを含んでもよい。

【0235】

γ／δＴＣＲに関して、「ＴＣＲγ可変ドメイン」という用語は、本明細書の用法ではリーダー領域（Ｌ）のないＴＣＲγＶ（ＴＲＧＶ）領域とＴＣＲγＪ（ＴＲＧＪ）領域との連結を指し、ＴＣＲγ定常ドメインという用語は、細胞外ＴＲＧＣ領域を指し、またはＣ末端切断型ＴＲＧＣ配列を指す同様に、「ＴＣＲδ可変ドメイン」という用語は、リーダー領域（Ｌ）のないＴＣＲδＶ（ＴＲＤＶ）領域とＴＣＲδＤ／Ｊ（ＴＲＤＤ／ＴＲＤＪ）領域との連結を指し、「ＴＣＲδ定常ドメイン」という用語は、細胞外ＴＲＤＣ領域を指し、またはＣ末端切断型ＴＲＤＣ配列を指す。

【0236】

本明細書のＴＣＲは、好ましくは、約１μＭ以下、約００１μＭ以下、約２５μＭ以下、または約１０μＭ以下の結合親和性（ＫＤ）で、発明のペプチド－ＨＬＡ分子複合体に結合する。より好ましいのは、約１μＭ以下、約１００ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下の結合親和性を有する、高親和性ＴＣＲである。本発明のＴＣＲの好ましい結合親和性範囲の非限定的例としては、約１ｎＭ～約１０ｎＭ；約１０ｎＭ～約２０ｎＭ；約２０ｎＭ～約３０ｎＭ；約３０ｎＭ～約４０ｎＭ；約４０ｎＭ～約５０ｎＭ；約５０ｎＭ～約６０ｎＭ；約６０ｎＭ～約７０ｎＭ；約７０ｎＭ～約８０ｎＭ；約８０ｎＭ～約９０ｎＭ；および約９０ｎＭ～約１００ｎＭが挙げられる。

【0237】

本明細書の用法では、本明細書のＴＣＲとの関連で、「特異的結合」およびそれらの文法的変種は、ペプチド－ＨＬＡ分子複合体に対して、１００μＭ以下の結合親和性（ＫＤ）を有するＴＣＲを意味するために使用される。

【0238】

本明細書のα／βヘテロ二量体ＴＣＲは、それらの定常ドメインの間に導入された、ジスルフィド結合を有してもよい。このタイプの好ましいＴＣＲとしては、ＴＲＡＣ定常ドメイン配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列とを有するものが挙げられるが、ただし、ＴＲＡＣのＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のＳｅｒ５７は、システイン残基によって置換されており、前記システインは、ＴＣＲのＴＲＡＣ定常ドメイン配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列との間に、ジスルフィド結合を形成する。

【0239】

上述の導入された鎖間結合の存在下または不在下で、本明細書のα／βヘテロ二量体ＴＣＲは、ＴＲＡＣ定常ドメイン配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列とを有してもよく、ＴＣＲのＴＲＡＣ定常ドメイン配列と、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列とが、ＴＲＡＣのエクソン２のＣｙｓ４と、ＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２のエクソン２のＣｙｓ２との間の天然ジスルフィド結合によって連結されてもよい。

【0240】

本明細書のＴＣＲは、放射性核種、フルオロフォア、およびビオチンからなる群から選択される、検出可能な標識を含んでなってもよい。本明細書のＴＣＲは、放射性核種、化学療法剤、または毒素などの治療的活性薬剤にコンジュゲートされてもよい。

【0241】

一実施形態では、α鎖に少なくとも１つの変異を有し、および／またはβ鎖に少なくとも１つの変異を有する本明細書のＴＣＲは、非変異ＴＣＲと比較して修飾されたグリコシル化を有する。

【0242】

一実施形態では、ＴＣＲα鎖および／またはＴＣＲβ鎖に少なくとも１つの変異を含んでなるＴＣＲは、ペプチド－ＨＬＡ分子複合体に対して、非変異ＴＣＲα鎖および／または非変異ＴＣＲβ鎖を含んでなるＴＣＲの少なくとも２倍の結合親和性および／または結合半減期を有する。腫瘍特異的ＴＣＲの親和性増強とその利用は、最適ＴＣＲ親和性のウィンドウの存在に依存する。このようなウィンドウの存在は、ＨＬＡ－Ａ２拘束性病原体に対して特異的なＴＣＲが、ＨＬＡ－Ａ２拘束性腫瘍関連自己抗原に対して特異的なＴＣＲと比較して、一般に約１０分の１のＫＤ値を有するという観察に基づく。腫瘍抗原は免疫原性である可能性を有するが、腫瘍は個人自身の細胞から生じるので、改変された翻訳プロセッシングのある変異タンパク質またはタンパク質のみが、免疫系によって異質と見なされることが今や知られている。上方制御されまたは過剰発現される抗原（いわゆる自己抗原）は、腫瘍に対する機能性免疫応答を必ずしも誘導しない。これらの抗原に対して高度に反応性のＴＣＲを発現するＴ細胞は、中枢性免疫寛容として知られている過程、すなわち自己抗原に対する低親和性ＴＣＲを有するＴ細胞のみが残留する過程によって、胸腺において負選択される。したがって、本発明のペプチドに対する本明細書のＴＣＲまたは変異型の親和性は、当該技術分野で周知の方法によって増大され得る。

【0243】

本明細書は、本明細書によるＴＣＲを同定し単離する方法にさらに関し、前記方法は、ＨＬＡ－Ａ^＊０２陰性健常ドナーに由来するＰＢＭＣをＡ２／ペプチドモノマーと共にインキュベートするステップと、ＰＢＭＣを四量体フィコエリトリン（ＰＥ）と共にインキュベートするステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）－Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。

【0244】

本明細書は、本明細書に従ってＴＣＲを同定し単離する方法にさらに関し、前記方法は、そのＴ細胞がマウスＴＣＲ欠損を補償する多様なヒトＴＣＲレパートリーを発現する、全ヒトＴＣＲαβ遺伝子遺伝子座（１．１および０．７Ｍｂ）を有する遺伝子組換えマウスを得るステップと、マウスをペプチドで免疫化するステップと、四量体フィコエリトリン（ＰＥ）を有する遺伝子組換えマウスから得られたＰＢＭＣをインキュベートするステップと、高結合活性Ｔ細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）Ｃａｌｉｂｕｒ分析によって単離するステップとを含んでなる。

【0245】

一態様では、本明細書のＴＣＲを発現するＴ細胞を得るために、本明細書のＴＣＲ－αおよび／またはＴＣＲ－β鎖をコードする核酸が、γレトロウイルスまたはレンチウイルスなどの発現ベクターにクローン化される。組換えウイルスを生成し、次に、抗原特異性および機能的結合活性などの機能について試験する。次に、最終生成物のアリコートを使用して、標的Ｔ細胞集団（一般に患者のＰＢＭＣから精製される）を形質導入し、それを患者への輸液前に増殖させる。

【0246】

別の態様では、本明細書のＴＣＲを発現するＴ細胞を得るために、例えば、生体外転写システムなどの当該技術分野で公知の技術によって、ＴＣＲ ＲＮＡが合成される。次に生体外で合成されたＴＣＲ ＲＮＡは、健常ドナーから得られた原発性ＣＤ８＋Ｔ細胞内に電気穿孔によって導入され、腫瘍特異的ＴＣＲ－αおよび／またはＴＣＲ－β鎖が再発現される。

【0247】

発現を増加させるために、本明細書のＴＣＲをコードする核酸は、レトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）Ｕ３、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、β－アクチン、ユビキチン、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）／ＣＤ４３複合プロモーター、伸長因子（ＥＦ）－１ａ、および脾臓フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーターなどの強力なプロモーターと作動可能に連結されてもよい。好ましい実施形態では、プロモーターは、発現される核酸に対して異種である。

【0248】

強力なプロモーターに加えて、本明細書のＴＣＲ発現カセットは、レンチウイルスコンストラクトの核転座を促進する、中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）（Ｆｏｌｌｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ．，２０００）、およびＲＮＡ安定性を増大させることで導入遺伝子発現のレベルを高める、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ｗＰＲＥ）（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９）をはじめとする導入遺伝子発現を高め得る追加的な要素を含有してもよい。

【0249】

本発明のＴＣＲのαおよびβ鎖は、別々のベクターにある核酸によってコードされてもよく、または同一ベクターにあるポリヌクレオチドによってコードされてもよい。

【0250】

高レベルのＴＣＲ表面発現の達成には、導入されたＴＣＲのＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－β鎖の双方を高レベルで転写する必要がある。これを行うために、本明細書のＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－β鎖は、この障害を克服できることが示されている、単一ベクター内のバイシストロニックコンストラクトにクローン化されてもよい。ＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－β鎖は、翻訳中に２つのタンパク質に分かれて等モル比のＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－β鎖の生成を確実にする単一転写物から生じるので、ＴＣＲ－α鎖とＴＣＲ－β鎖との間のウイルス配列内リボソーム進入部位の使用は、双方の鎖の協調発現をもたらす（Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．２００９）。

【0251】

本明細書のＴＣＲをコードする核酸はコドン最適化されて、宿主細胞からの発現が増加されてもよい。遺伝コードの重複は、いくつかのアミノ酸が２つ以上のコドンによってコードされるようにするが、特定のコドンは、適合ｔＲＮＡの相対可用性ならびにその他の要因のために、他のものよりも「最適」でない（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）。各アミノ酸が、哺乳類遺伝子発現のための最適コドンによってコードされるように、ＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－β遺伝子配列を修飾すること、ならびにｍＲＮＡ不安定モチーフまたは潜在的なスプライス部位を除去することは、ＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－β遺伝子発現を有意に高めることが示されている（Ｓｃｈｏｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）。

【0252】

さらに、導入ＴＣＲ鎖と内因性ＴＣＲ鎖との間の誤対合は、重大な自己免疫リスクをもたらす特異性の獲得を引き起こすこともある。例えば、混合ＴＣＲ二量体の形成は、適切に対合するＴＣＲ複合体を形成するために利用できるＣＤ３分子の数を減少させてもよく、ひいては導入ＴＣＲを発現する細胞の機能的結合活性を有意に低下させ得る（Ｋｕｂａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００７）。

【0253】

誤対合を減少させるために、本明細書の導入ＴＣＲ鎖のＣ末端領域は、鎖間親和性を高める一方で、導入鎖が内因性ＴＣＲと対形成する能力を低下させるために、修飾されてもよい。これらのストラテジーとしては、ヒトＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－βのＣ末端領域をそれらのマウス対応物（マウス化Ｃ末端領域）で置換すること；導入ＴＣＲのＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－β鎖の双方に第２のシステイン残基を導入することによって、Ｃ末端領域に第２の鎖間ジスルフィド結合を生成すること（システイン修飾）；ＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－β鎖のＣ末端領域内の相互作用残基を交換すること（「ノブ・イン・ホール」）；そしてＴＣＲ－αおよびＴＣＲ－β鎖の可変領域をＣＤ３ζに直接融合させる（ＣＤ３ζ融合）ことが挙げられる。（Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．２００９）。

【0254】

一実施形態では、宿主細胞は、本細書のＴＣＲを発現するように遺伝子操作される。好ましい実施形態では、宿主細胞は、ヒトＴ細胞またはＴ細胞前駆体である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、がん患者から得られる。その他の実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、健常ドナーから得られる。本明細書の宿主細胞は、治療される患者に関して、同種異系または自己由来であり得る。一実施形態では、宿主は、α／βＴＣＲを発現するように形質転換されたγ／δＴ細胞である。

【0255】

「医薬組成物」は、医学的状況においてヒトへの投与に適する組成物である。好ましくは、医薬組成物は無菌であり、ＧＭＰガイドラインに準拠して製造される。

【0256】

医薬組成物は、遊離形態または薬学的に許容可能な塩の形態のどちらかのペプチドを含んでなる（上記もまた参照されたい）。一態様では、本明細書に記載のペプチドは、薬学的に許容可能な塩の形態である。別の態様では、医薬品塩の形態のペプチドは、結晶形態である。

【0257】

一態様では、本明細書に記載の薬学的に許容可能な塩は、製薬用途のために許容される範囲内の毒性プロファイル有する塩を指す。

【0258】

本明細書の用法では、「薬学的に許容可能な塩類」は、開示されたペプチドの誘導体を指し、ペプチドは、薬剤の酸性塩または塩基性塩を生成することで修飾される。例えば、適切な酸との反応を伴って、遊離塩基（典型的には中性形態の薬物が中性の－ＮＨ２基を有する）から酸性塩が調製される。酸性塩を調製するための適切な酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸などの有機酸、ならびに例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸リン酸などの無機酸の双方が挙げられる。逆に、ペプチド上に存在してもよい酸部分の塩基性塩の調製物は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、トリメチルアミンなどの薬学的に許容可能な塩基を使用して調製される。

【0259】

一態様では、薬学的に許容される塩は、本明細書に記載のペプチドの溶解性および／または安定性を高めてもよい。別の態様では、本明細書に記載の医薬品塩は、例えば、適切な酸または塩基を本明細書に記載されるようなペプチドまたは複合体形成と反応させることによって、対応する担体ペプチドまたは複合体から従来の手段によって調製されてもよい。別の態様では、薬学的に許容される塩は、結晶形態または半結晶形態である。さらに別の態様では、薬学的に許容可能な塩としては、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ Ｂｙ Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ ２００２）、およびＬ．Ｄ．Ｂｉｇｈｌｅｙ，Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，Ｄ．Ｃ．Ｍｏｎｋｈｏｕｓｅ，ｉｎ”Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”．Ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ ａｎｄ Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，Ｖｏｌ．１３，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｅｌ，Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ １９９５，ｐｐ．４５３－４９９に記載されるものが挙げられ、これらの参考文献のそれぞれは、その内容全が参照により本明細書に援用される。

【0260】

本発明のペプチドの薬学的に許容可能な塩形態は、天然の（裸の）ペプチド、すなわち、薬学的に許容可能な塩の形態でなく、または別の様式で修飾されていないペプチドよりも安定性が増大している。本明細書の用法では、安定性の増加は、以下の測定可能な減少または低下を含む：脱アミド、酸化、加水分解、ジスルフィド交換、ラセミ化、および加水分解。安定性は、完成品としての、または製造手順中もしくは貯蔵中のペプチド上で評価され得る。好ましくは、薬学的に許容可能な塩の形態ペプチドは、少なくとも１週間、好ましくは少なくとも１ヶ月間、より好ましくは少なくとも３ヶ月間、最も好ましくは少なくとも６ヶ月間などの商業的に妥当な期間にわたる、約０°Ｃ～約６０°Ｃなどの商業的に妥当な温度における貯蔵を可能にする、十分な生体外安定性を有する。安定性は。例えば高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの当業者に知られている任意の生理化学的特性決定技術を用いて測定され得る。

【0261】

さらに、ペプチド塩の安定性は、血漿中における（アミノペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、およびシンテターゼなどによる）酵素的分解が少ないこと、および／または天然ペプチドと比較して改善された生体内半減期を有することで判定され得る。ＭＨＣＩ抗原提示のために生成された天然の９量体ペプチドの細胞内半減期は、それらがシャペロンまたはＭＨＣＩ分子などの別の分子によって結合されていない限り、ほんの数秒であることが解明されている。Ｒｅｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００４；２０：４９５－５０６。

【0262】

さらに、本発明のペプチドの薬学的に許容可能な塩は、水性溶液中で改善された溶解性および安定性を示すＢｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９７７；６６（１）：１－１９。好ましくは、水溶液中の薬学的に許容可能な塩の形態のペプチドは、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、より好ましくは少なくとも７日間にわたり安定している。

【0263】

特に好ましい一実施形態では、医薬組成物は、酢酸（酢酸塩）、トリフルオロ酢酸または塩酸（塩化物）の塩としてのペプチドを含んでなる。

【0264】

好ましくは、本発明の薬剤は、ワクチンなどの免疫療法剤である。それは、患者に直接、罹患臓器に、または全身的に、ｉ．ｄ．、ｉ．ｍ．、ｓ．ｃ．、ｉ．ｐ．、およびｉ．ｖ．投与され、または生体外で患者またはヒト細胞株に由来する細胞に適用されて、それが引き続いて患者に投与され、または生体外で使用されて患者に由来する免疫細胞の亜集団が選択され、次にそれが患者に再投与されてもよい。核酸が、生体外で細胞に投与される場合、インターロイキン２などの免疫刺激サイトカインを同時発現させるように、細胞を形質移入することが有用であってもよい。ペプチドは、実質的に純粋であり、または免疫刺激アジュバント（下記参照）と組み合わされ、または免疫賦活性サイトカインと組み合わせて使用され、または例えば、リポソームなどの適切な送達系によって投与されてもよい。ペプチドはまた、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）またはマンナンなどの適切な担体に共役されてもよい（国際公開第９５／１８１４５号パンフレットおよび（Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３）を参照されたい）。ペプチドはまた、標識されてもよく、融合タンパク質であってもよく、またはハイブリッド分子であってもよい。その配列が本発明に記載されるペプチドは、ＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞を刺激することが予測される。しかし、ＣＤ８ Ｔ細胞の刺激は、ＣＤ４ Ｔヘルパー細胞によって提供される援助の存在下で、より効率的である。したがって、ＣＤ８ Ｔ細胞を刺激するＭＨＣクラスＩエピトープでは、ハイブリッド分子の融合パートナーまたはセクションは、適切にはＣＤ４陽性Ｔ細胞を刺激するエピトープを提供する。ＣＤ４およびＣＤ８刺激エピトープは、当該技術分野で周知であり、本発明で同定されたものが挙げられる。

【0265】

一態様では、ワクチンは、配列番号１～配列番号９１に記載されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドと、少なくとも１つの追加的なペプチド、好ましくは２～５０、より好ましくは２～２５、なおもより好ましくは２～２０、最も好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８個のペプチドとを含んでなる。ペプチドは、１つまたは複数の特異的ＴＡＡから誘導されてもよく、ＭＨＣクラスＩ分子に結合してもよい。

【0266】

本発明のさらなる態様は、本発明のペプチドまたはペプチド変異型をエンコードする核酸（例えばポリヌクレオチド）を提供する。ポリヌクレオチドは、それがペプチドをコードしさえすれば、例えば、一本鎖および／または二本鎖のいずれかのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせであってもよく、または例えばホスホロチオエート主鎖を有するポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドの未変性または安定化形態であってもよく、それはイントロンを含有してもまたはしなくてもよい。もちろん、天然起源ペプチド結合によって連結する天然アミノ酸残基を含有するペプチドのみが、ポリヌクレオチドによってエンコードされ得る。本発明のなおもさらなる態様は、本発明によるポリペプチドを発現できる発現ベクターを提供する。

【0267】

例えば相補的付着端を通じて、ポリヌクレオチド、特にＤＮＡをベクターに連結する、多様な方法が開発されている。例えば、ベクターＤＮＡに挿入されるＤＮＡセグメントに、相補的ホモポリマー配列が付加され得る。次に、相補的ホモポリマー尾部間の水素結合によって、ベクターおよびＤＮＡセグメントが連結されて、組換えＤＮＡ分子が形成する。

【0268】

１つまたは複数の制限部位を含有する合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターに連結する代替え方法を提供する。多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーは、米国コネチカット州ニューヘイブンのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．をはじめとするいくつかの供給元から商業的に入手できる。

【0269】

本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを修飾する望ましい方法は、Ｓａｉｋｉ ＲＫ，ｅｔ ａｌ．（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８）で開示されるようなポリメラーゼ連鎖反応を用いる。この方法は、例えば、適切な制限部位を遺伝子操作することで、ＤＮＡを適切なベクターに導入するために使用されてもよく、またはそれは、当該技術分野で既知のその他の有用な様式でＤＮＡを修飾するために使用されてもよい。ウイルスベクターを使用するのであれば、ポックスウイルスまたはアデノウイルスベクターが好ましい。

【0270】

次にＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）を適切な宿主において発現させ、本発明のペプチドまたは変異型を含んでなるポリペプチドが製造されてもよい。このようにして、本明細書に含まれる教示を考慮して適切に修正された既知の技術に従って、本発明のペプチドまたは変異型をコードするＤＮＡを使用して、発現ベクターが構築されてもよく、次にそれを使用して、本発明のポリペプチドの発現および製造のために、適切な宿主細胞が形質転換される。このような技術としては、例えば、米国特許第４，４４０，８５９号明細書、米国特許第４，５３０，９０１号明細書、米国特許第４，５８２，８００号明細書、米国特許第４，６７７，０６３号明細書、米国特許第４，６７８，７５１号明細書、米国特許第４，７０４，３６２号明細書、米国特許第４，７１０，４６３号明細書、米国特許第４，７５７，００６号明細書、米国特許第４，７６６，０７５号明細書、および米国特許第４，８１０，６４８号明細書で開示されるものが挙げられる。

【0271】

本発明の化合物を構成するポリペプチドをエンコードするＤＮＡ（またはレトロウイルスベクターの場合はＲＮＡ）は、適切な宿主への導入のために、多種多様なその他のＤＮＡ配列に連結されてもよい。コンパニオンＤＮＡは、宿主の性質、ＤＮＡの宿主への導入様式、およびエピソームの維持または組み込みが所望されるかどうかに左右される。

【0272】

一般に、ＤＮＡは、発現のための適切な方向および正しい読み枠で、プラスミドなどの発現ベクターに挿入される。必要ならば、ＤＮＡは、所望の宿主によって認識される適切な転写および翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結されてもよいが、このような制御は、一般に発現ベクター中で利用できる。次に、標準的な技術を通じて、ベクターが宿主に導入される。一般に、全ての宿主がベクターによって形質転換されるわけではない。したがって、形質転換された宿主細胞を選択することが必要になる。一選択技術は、抗生物質耐性などの形質転換細胞内で選択可能な形質をコードする、任意の必要な制御因子を有するＤＮＡ配列を発現ベクター内に組み込むことを伴う。

【0273】

代案としては、このような選択可能な形質の遺伝子は、所望の宿主細胞を同時形質転換するのに使用される、別のベクター上にあり得る。

【0274】

次に、本明細書で開示される教示を考慮して、当業者に知られている適切な条件下で十分な時間にわたり、本発明の組換えＤＮＡによって形質転換された宿主細胞が培養されてポリペプチドが発現され、次にそれが回収され得る。

【0275】

細菌（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌（例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物細胞、動物細胞、および昆虫細胞をはじめとする多数の発現系が知られている。好ましくは、発現系は、ＡＴＣＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手できるＣＨＯ細胞などの哺乳類細胞であり得る。

【0276】

構成的発現のための典型的な哺乳類細胞ベクタープラスミドは、適切なポリＡ尾部を有するＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーター、およびネオマイシンなどの耐性マーカーを含んでなる。一例は、米国ニュージャージー州ピスカタウェイのＰｈａｒｍａｃｉａから入手できるｐＳＶＬである。誘導性哺乳類発現ベクターの一例であるｐＭＳＧもまた、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手できる。有用な酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３－４０６およびｐＲＳ４１３－４１６であり、通常、米国郵便番号９２０３７カリフォルニア州ラホヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手できる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、およびｐＲＳ４０６は、酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母の選択可能なマーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、およびＵＲＡ３が組み込まれている。プラスミドｐＲＳ４１３－４１６は、酵母セントロメアプラスミド（Ｙｃｐｓ）である。ＣＭＶプロモーターベースのベクター（例えばＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）は、一過性または安定性発現、細胞質内発現または分泌、およびＦＲＡＧ、３ｘＦＬＡＧ、ｃ－ｍｙｃまたはＭＡＴの様々な組み合わせでのＮ末端またはＣ末端標識付けを提供する。これらの融合タンパク質は、組換えタンパク質を検出、精製、および分析できるようにする。二重標識融合物は、検出に融通性を与える。

【0277】

強力なヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター調節領域は、ＣＯＳ細胞内で、構成タンパク質発現レベルを１ｍｇ／Ｌ程度の高さに駆動する。効力がより低い細胞株では、タンパク質レベルは、典型的に約０．１ｍｇ／Ｌである。ＳＶ４０複製起点の存在は、ＳＶ４０複製許容ＣＯＳ細胞内で高レベルのＤＮＡ複製をもたらす。ＣＭＶベクターは、例えば、細菌細胞内のｐＭＢ１（ｐＢＲ３２２の誘導体）複製起点、細菌におけるアンピシリン耐性選択のためのｂ－ラクタマーゼ遺伝子、ｈＧＨポリＡ、およびｆ１起点を含有し得る。プレプロトリプシンリーダー（ＰＰＴ）配列を含有するベクターは、抗ＦＲＡＧ抗体、樹脂、およびプレートを使用した精製のために、培養液中へのＦＲＡＧ融合タンパク質分泌を誘導し得る。多様な宿主細胞と共に使用するためのその他のベクターおよび発現系が、当該技術分野で周知である。

【0278】

別の実施形態では、本発明の２つ以上のペプチドまたはペプチド変異型がコードされ、したがって順次発現される（「数珠玉構造」コンストラクトに類似する）。その際に、ペプチドまたはペプチド変異型は、例えばＬＬＬＬＬＬなどの一続きのリンカーアミノ酸によって、共に連結または融合されてもよく、またはそれらの間のいかなる追加的なペプチドもなしに連結されてもよい。これらのコンストラクトはまた、がん療法のために使用され得て、ＭＨＣ ＩとＭＨＣ ＩＩの双方が関与する免疫応答を誘導してもよい。

【0279】

本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドベクターコンストラクトで形質転換された宿主細胞にも関する。宿主細胞は、原核または真核生物のどちらかであり得る。細菌細胞は、いくつかの状況では、好ましい原核宿主細胞であってもよく、典型的には、例えば、米国メリーランド州ベセスダのＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，から入手できる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５株、および米国メリーランド州ロックビルの米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手できるＲＲ１（ＡＴＣＣ番号３１３４３）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。好ましい真核宿主細胞としては、酵母、昆虫、および哺乳類細胞、好ましくはマウス、ラット、サルまたはヒトの線維芽細胞株および結腸細胞株に由来するものなどの脊椎動物細胞が挙げられる。酵母宿主細胞としては、米国郵便番号９２０３７カリフォルニア州ラホヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓから一般に入手できる、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００、およびＹＰＨ５０１が挙げられる。好ましい哺乳類宿主細胞としては、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手できるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手できるＮＩＨ Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５０として入手できるサル腎臓由来ＣＯＳ－１細胞、およびヒト胎児由来腎細胞である２９３細胞が挙げられる。好ましい昆虫細胞は、バキュロウイルス発現ベクターで形質移入され得るＳｆ９細胞である。発現のための適切な宿主細胞の選択に関する概説は、例えば、Ｐａｕｌｉｎａ ＢａｌｂａｓおよびＡｒｇｅｌｉａ Ｌｏｒｅｎｃｅの教科書、”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｒｅｖｉｅｗｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”Ｐａｒｔ Ｏｎｅ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ ９７８－１－５８８２９－２６２－９、および当業者に知られているその他の文献にある。

【0280】

本発明のＤＮＡコンストラクトによる適切な細胞宿主の形質転換は、典型的に使用されるベクターのタイプに左右される周知の方法によって達成される。原核宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７２）および（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２）を参照されたい。酵母細胞の形質転換は、Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｓｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６）に記載される。Ｂｅｇｇｓ（Ｂｅｇｇｓ，１９７８）の方法もまた有用である。脊椎動物細胞に関しては、このような細胞を形質移入するのに有用な、例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ－デキストランまたはリポソーム製剤などの試薬が、米国郵便番号２０８７７メリーランド州ゲイザースバーグのＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，から入手できる。電気穿孔もまた、細胞を形質転換および／または形質移入するのに有用であり、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、および脊椎動物細胞を形質転換する技術分野で周知である。

【0281】

成功裏に形質転換された細胞、すなわち本発明のＤＮＡコンストラクトを含有する細胞は、ＰＣＲなどの周知の技術によって同定され得る。代案としては、抗体を使用して、上清中のタンパク質の存在が検出され得る。

【0282】

例えば、細菌、酵母、および昆虫細胞などの本発明の特定の宿主細胞は、本発明のペプチドの調製において有用であることが理解されるであろう。しかしその他の宿主細胞が、特定の治療法において有用であってもよい。例えば、樹状細胞などの抗原提示細胞は、それらが適切なＭＨＣ分子中に負荷されてもよいように、本発明のペプチドを発現するために有用に使用されてもよい。したがって、本発明は、本発明による核酸または発現ベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。

【0283】

好ましい実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞または抗原提示細胞である。前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）を含有する組換え融合タンパク質が負荷されたＡＰＣは、無症候性または微小症候性転移性ＨＲＰＣを治療するために、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって２０１０年４月２０日に認可された（シプロイセルＴ）（Ｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｓｍａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００６）。

【0284】

本発明のさらなる態様は、宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる、ペプチドまたはその変異型を製造する方法を提供する。

【0285】

別の実施形態では、本発明のペプチド、核酸または発現ベクターは、医療において使用される。例えば、ペプチドまたはその変異型は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、筋肉内（ｉ．ｍ．）注射のために調合されてもよい。ペプチド注射の好ましい方法としては、ｓ．ｃ、ｉ．ｄ、ｉ．ｐ、ｉ．ｍ、およびｉ．ｖ．が挙げられる。ＤＮＡ注射の好ましい方法としては、ｉ．ｄ、ｉ．ｍ、ｓ．ｃ、ｉ．ｐ、およびｉ．ｖ．が挙げられる。例えば、５０μｇ～１．５ｍｇ、好ましくは１２５μｇ～５００μｇのペプチドまたはＤＮＡの用量が投与されてもよく、それぞれのペプチドまたはＤＮＡに左右される。この範囲の用量は、以前の治験で成功裏に使用された（Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

【0286】

活性ワクチン接種のために使用されるポリヌクレオチドは、実質的に純粋であってもよく、または適切なベクターまたは送達系に含有されてもよい。核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせであってもよい。このような核酸をデザインして導入する方法は、当該技術分野で周知である。概説は、例えば、Ｔｅｕｆｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｔｅｕｆｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００５）によって提供される。ポリヌクレオチドワクチンは調製が容易であるが、免疫応答誘導におけるこれらのベクターの作用機序は、完全には分かっていない。適切なベクターおよび送達系としては、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、または２つ以上のウイルスの構成要素を含有するハイブリッドベースのシステムなどのウイルスＤＮＡおよび／またはＲＮＡが挙げられる。非ウイルス送達系としては、カチオン性脂質およびカチオン性ポリマーが挙げられ、ＤＮＡ送達技術分野において周知である。「遺伝子銃」などを介した、物理的送達もまた使用されてもよい。核酸によってコードされるペプチド（単数）またはペプチド（複数）は、例えば、上述のように、それぞれの逆ＣＤＲのＴ細胞を刺激する、エピトープとの融合タンパク質であってもよい。

【0287】

本発明の薬剤は、１つまたは複数のアジュバントもまた含んでもよい。アジュバントは、免疫応答（例えば、ＣＤ８陽性Ｔ細胞およびヘルパーＴ（ＴＨ）細胞によって媒介される抗原に対する免疫応答を非特異的に促進または増強する物質であり、したがって本発明の薬剤中で有用であると見なされる。適切なアジュバントとしては、１０１８ ＩＳＳ、アルミニウム塩、ＡＭＰＬＩＶＡＸ（登録商標）、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、フラジェリンまたはフラジェリン由来ＴＬＲ５リガンド、ＦＬＴ３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド（ＡＬＤＡＲＡ（登録商標））、レシキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＬ－２やＬ－１３やＩＬ－２１などのインターロイキン、インターフェロン－αまたは－βまたはそれらのＰＥＧ化誘導体、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＩＳＣＯＭ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ（登録商標）、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＡＬＰ２、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、モンタニドＩＭＳ１３１２、モンタニドＩＳＡ２０６、モンタニドＩＳＡ５０Ｖ、モンタニドＩＳＡ－５１、油中水型および水中油型エマルション、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＯｓｐＡ、ＰｅｐＴｅｌ（登録商標）ベクター系、ポリ（ラクチドコグリコリド）［ＰＬＧ］ベースおよびデキストラン微粒子、タラクトフェリンＳＲＬ１７２、ビロソームおよびその他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、β－グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、サポニンに由来するＡｑｕｉｌａ’ｓ ＱＳ２１ ｓｔｉｍｕｌｏｎ、マイコバクテリア抽出物および合成細菌細胞壁模倣体、およびＲｉｂｉ’ｓ ＤｅｔｏｘまたはＱｕｉｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓなどのその他の独自仕様の補助剤が挙げられるが、これに限定されるものではない。フロイントまたはＧＭ－ＣＳＦなどのアジュバントが好ましい。樹状細胞およびそれらの調製物に対して特異的な、いくつかの免疫学的アジュバント（例えばＭＦ５９）が、以前記載されている（Ａｌｌｉｓｏｎ ａｎｄ Ｋｒｕｍｍｅｌ，１９９５）。サイトカインもまた使用されてもよい。数種のサイトカインは、樹状細胞のリンパ組織（例えばＴＮＦ－）への移動に影響を与えること、Ｔリンパ球（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１、およびＩＬ－４）のための効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟を加速すること（その内容全体が参照により本明細書に具体的に援用される、米国特許第５，８４９，５８９号明細書）、および免疫増強剤（例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２３、ＩＬ－７、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β）として作用することと、直接関連付けられている（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。

【0288】

ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドもまた、ワクチン環境において、アジュバント効果を増強することが報告されている。理論により拘束されることなく、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、主にＴＬＲ９を通じた、内在的（非適応性）免疫系の活性化によって作用する。ＣｐＧ誘導性ＴＬＲ９活性化は、ペプチドまたはタンパク質抗原、生きたまたは死滅ウイルス、樹状細胞ワクチン、自己細胞ワクチン、そして予防的および治療的ワクチンの双方における多糖コンジュゲートをはじめとする多種多様な抗原に対する、抗原特異的体液性および細胞性応答を増強する。より重要なことには、それは樹状細胞の成熟と分化を増強し、ＣＤ４ Ｔ細胞援助の不在下であってさえも、ＴＨ１細胞の活性化の促進、および強力な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）生成をもたらす。ＴＬＲ９刺激によって誘導されるＴＨ１バイアスは、通常はＴＨ２バイアスを促進するミョウバンまたは不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）などのワクチンアジュバント存在下であってさえも、維持される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、その他のアジュバントと調合されまたは同時投与された際に、または微粒子、ナノ粒子、脂質エマルションなどの配合物または類似配合物中で、なおもより高いアジュバント活性を示し、それは、抗原が比較的弱い場合、強力な応答を誘導するのに特に必要である。それらは免疫応答もまた加速し、いくつかの実験では、ＣｐＧなしのワクチン総量と同等の抗体応答で、抗原用量のほぼ２桁分の低減を可能にする（Ｋｒｉｅｇ，２００６）。米国特許第６，４０６，７０５Ｂ１号明細書は、抗原特異的免疫応答を誘導するためのＣｐＧオリゴヌクレオチド、非核酸アジュバント、および抗原の併用を記載する。ＣｐＧ ＴＬＲ９拮抗薬は、本発明の医薬組成物の好ましい構成要素である、Ｍｏｌｏｇｅｎ（独国ベルリン）製のｄＳＬＩＭ（二重ステムループ免疫調節剤）である。ＲＮＡ結合ＴＬＲ７、ＴＬＲ８および／またはＴＬＲ９などのその他のＴＬＲ結合分子もまた、使用されてもよい。

【0289】

有用なアジュバントその他の例としては、化学修飾ＣｐＧ（例えば、ＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）；ポリ（Ｉ：Ｃ）などのｄｓＲＮＡアナログおよびそれらの誘導体（例えばＡｍｐｌｉＧｅｎ（登録商標）、Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）、ポリ（ＩＣＬＣ）、ポリ（ＩＣ－Ｒ）、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）、非ＣｐＧ細菌ＤＮＡまたはＲＮＡ；ならびにシクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ（登録商標）、セレブレックス、ＮＣＸ－４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフェニブ、テモゾロマイド、テムシロリムス、ＸＬ－９９９、ＣＰ－５４７６３２、パゾパニブ、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、抗ＣＴＬＡ４などの免疫活性小型分子および抗体；免疫系の重要な構造体を標的にするその他の抗体（例えば、抗ＣＤ４０、抗ＴＧＦβ、抗ＴＮＦα受容体）；ＳＣ５８１７５が挙げられるが、これに限定されるものではなく、これらは治療的におよび／またはアジュバントとして作用してもよい。本発明の文脈で有用なアジュバントおよび添加剤の量と濃度は、過度の実験を実施することなく、当業者によって容易に判定され得る。

【0290】

好ましいアジュバントは、抗ＣＤ４０、イミキモド、レシキモド、ＧＭ－ＣＳＦ、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、インターフェロンα、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび誘導体、ポリ（Ｉ：Ｃ）および誘導体、ＲＮＡ、シルデナフィル、およびＰＬＧまたはビロソーム微粒子調合物である。

【0291】

本発明による薬剤組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、サルグラモスチム）、シクロホスファミド、イミキモド、レシキモド、およびインターフェロンαなどのコロニー刺激因子からなる群から選択される。

【0292】

本発明による医薬組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、サルグラモスチム）、シクロホスファミド、イミキモド、およびレシキモドなどのコロニー刺激因子からなる群から選択される。本発明による薬剤組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、シクロホスファミド、イミキモドまたはレシキモドである。なおもより好ましいアジュバントは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＭＳ １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ２０、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ－５１、ｐｏｌｙ－ＩＣＬＣ（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標））、および抗ＣＤ４０ｍＡＢまたはそれらの組み合わせである。

【0293】

この組成物は、皮下、皮内、筋肉内などの非経口投与、または経口投与のために使用される。このためには、ペプチドおよび任意選択的にその他の分子が、薬学的に許容可能な、好ましくは水性担体に溶解され、または懸濁される。さらに組成物は、緩衝液、結合剤、ブラスチング剤、希釈剤、香料、潤滑剤などの賦形剤を含有し得る。ペプチドはまた、サイトカインなどの免疫刺激物質と共に投与され得る。このような組成物中で使用され得る賦形剤の詳細な一覧は、例えば、Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（Ｋｉｂｂｅ，２０００）から採用され得る。組成物は、腺腫様またはがん性疾患の阻止、予防法および／または治療法のために使用され得る。例示的調合物は、例えば、欧州特許第２１１２２５３号明細書にある。

【0294】

一態様では、本明細書に記載のペプチドまたは別の分子は、水性担体と組み合わされてもよい。一態様では、水性担体は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、硫酸プロタミンなどの塩または電解質、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二カルシウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピロリドン酢酸ビニル、セルロースベースの物質（例えば、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸コハク酸メチルセルロースヒドロキシプロピル、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）、デンプン、乳糖一水和物、マンニトール、トレハロースラウリル硫酸ナトリウム、およびクロスカルメロースナトリウム、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレン－ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂から選択される。

【0295】

一態様では、水性担体は、本明細書に記載の成分などの非水担体成分と合わさった水などの複数の成分を含有する。別の態様では、水性担体は、本明細書に記載のペプチドまたはその他の分子と組み合わされると、例えば、改善された溶解性、有効性、および／または改善された免疫療法などの改善された特性を与えることができる。さらに組成物は、緩衝液、結合剤、ブラスチング剤、希釈剤、香料、潤滑剤などの賦形剤を含有し得る。「薬学的に許容可能な希釈剤」としては、例えば、生理学的適合性である、溶剤、増量剤、安定剤、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に許容可能な希釈剤の例としては、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１つまたは複数ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。多くの場合、例えば、トレハロースおよびスクロースなどの糖、マンニトールやソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムなどの１つまたは複数の等張剤を組成物に含めることが好ましい。湿潤剤または少量の湿潤剤または乳化剤、保存料または緩衝剤などの補助剤のような薬学的に許容可能な物質もまた本発明の範囲内である。さらに組成物は、緩衝液、結合剤、ブラスチング剤、希釈剤、香料、および潤滑剤などの賦形剤を含有し得る。

【0296】

本発明によるワクチンによって引き起こされる免疫応答は、異なる細胞分裂期および異なる発生段階のがんを攻撃することを理解することが重要である。さらに、異なるがん関連シグナル伝達経路が攻撃される。これは、１つまたは少数の標的のみに対処して、攻撃に対する腫瘍の容易な適応（腫瘍エスケープ）を引き起こすこともある、ワクチンに優る利点である。さらに個々の腫瘍の全てが、同一パターンの抗原を発現するとは限らない。したがって、いくつかの腫瘍関連ペプチドの組み合わせによって、ありとあらゆる腫瘍が標的の少なくとも一部を有することが確実になる。組成物は、それぞれの腫瘍が抗原のいくつかを発現することを予期して設計され、腫瘍の増殖と維持に必要ないくつかの独立した経路をカバーする。したがって、ワクチンは、より大きな患者集団のために、容易に「出来合」で使用され得る。これは、ワクチンで治療される患者の予備選択が、ＨＬＡタイピングに限定され得て、抗原発現に関する任意の追加的なバイオマーカーアセスメントを必要としないことを意味するが、いくつかの標的が誘導免疫応答によって同時に攻撃されることはなおも確実であり、これは有効性にとって重要である（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。

【0297】

本明細書の用法では、「スキャフォールド」という用語は、（例えば、抗原性）決定因子に特異的に結合する分子を指す。一実施形態では、スキャフォールドはまた、それが付着する実体（例えば、（第２の）抗原結合部分）を例えば、抗原決定基（例えば本出願書に記載のペプチドとＭＨＣの複合体）を有する特異的腫瘍細胞または腫瘍間質などの型標的部位に誘導できる。別の実施形態では、スキャフォールドは、例えば、Ｔ細胞受容体複合体抗原などのその標的抗原を通じて、シグナル伝達を活性化できる。スキャフォールドとしては、抗体およびそれらのフラグメント、抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域を含んでなる抗体の抗原結合ドメイン、少なくとも１つのアンキリンリピートモチーフと単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子とを含んでなる結合タンパク質、アプタマー、（可溶性）ＴＣＲ、および同種または自己由来Ｔ細胞などの（改変）細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。分子が標的に結合するスキャフォールドであるかどうかを評価するために、結合アッセイが実施され得る。

【0298】

「特異的」結合は、特異的標的を保有する細胞を殺滅できる活性分子を装備したスキャフォールドが、特異的標的は有しないが別のペプチド－ＭＨＣ複合体を提示する別の細胞を殺滅できない程度に、スキャフォールドがその他の天然ペプチド－ＭＨＣ－複合体よりもさらに良好に、目的ペプチド－ＭＨＣ－複合体に結合することを意味する。交差反応性ペプチド－ＭＨＣのペプチドが天然に存在せず、すなわち、ヒトＨＬＡ－ペプチドームに由来しない場合、その他のペプチド－ＭＨＣ複合体への結合は無関係である。標的細胞死滅を評価する試験は、当該技術分野で周知である。それらは、非改変ペプチド－ＭＨＣ提示を有する標的細胞（初代細胞または細胞株）、または天然に存在するペプチド－ＭＨＣレベルに達するようにペプチドを負荷された細胞を使用して、実施されるべきである。

【0299】

各スキャフォールドは標識を含んでなり得て、それは、標識によって提供されるシグナルの存在または不在を判定することで、結合スキャフォールドが検出され得ることを提供する。例えば、スキャフォールドは、蛍光染料または任意のその他の適用可能な細胞マーカー分子で標識され得る。このようなマーカー分子は、当該技術分野で周知である。例えば、蛍光染料によって提供される蛍光標識は、蛍光またはレーザー走査顕微鏡またはフローサイトメトリーによる、結合アプタマーの視覚化を提供し得る。

【0300】

各スキャフォールドは、例えば、ＩＬ－２１、抗－ＣＤ３、および抗－ＣＤ２８などの第２の活性分子にコンジュゲートされ得る。

【0301】

ポリペプチドスキャフォールドに関するさらなる情報については、例えば国際公開第２０１４／０７１９７８Ａ１号パンフレットの背景セクション、およびその中で引用される参考文献を参照されたい。

【0302】

本発明は、アプタマーにさらに関する。アプタマー（例えば、国際公開第２０１４／１９１３５９号パンフレット、およびその中で引用される文献を参照されたい）は、短い一本鎖核酸分子であり、それは、所定の三次元構造に折り畳まれて、特異的標的構造体を認識し得る。それらは、標的療法を開発するための適切な代案のようであった。アプタマーは、高い親和性および特異性で、多様な複合体標的と選択的に結合することが示されている。

【0303】

細胞表面に位置する分子を認識するアプタマーは、過去１０年内に同定されており、診断および治療的アプローチを開発する手段を提供する。アプタマーは、毒性および免疫原性がほぼ皆無であることが示されているので、それらは生物医学的用途のための有望な候補である。確かに、例えば、前立腺特異的膜抗原認識アプタマーなどのアプタマーは、標的療法のために成功裏に用いられており、異種移植片生体内モデルにおいて機能できることが示されている。さらに、特異的腫瘍細胞株を認識するアプタマーが同定されている。

【0304】

ＤＮＡアプタマーは、様々ながん細胞、特に固形腫瘍に由来するものに対して広域スペクトル認識特性を示す一方で、非腫瘍発生性および主要健常細胞を認識しないように選択され得る。同定されたアプタマーが、特異的腫瘍サブタイプを認識するだけでなく、むしろ一連の腫瘍と相互作用する場合、これは、アプタマーをいわゆる広域スペクトル診断薬および治療薬として応用可能にする。

【0305】

さらに、フローサイトメトリーによる細胞結合挙動の調査は、アプタマーがナノモル濃度範囲内の非常に良好な見かけの親和性を見せたことを示した。

【0306】

アプタマーは、診断および治療目的で有用である。さらに、アプタマーの一部は腫瘍細胞に取り込まれ、したがって腫瘍細胞内へのｓｉＲＮＡなどの抗がん剤の標的化送達のための分子ビヒクルとして、機能し得ることが示され得た。

【0307】

アプタマーは、細胞ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）技術を使用して、細胞および組織などの複合体標的に対して、および本発明による配列番号１～配列番号９１のいずれかに記載の配列とＭＨＣ分子とを含んでなり、好ましくはそれからなるペプチド複合体などに対して、選択され得る。

【0308】

本発明のペプチドを使用して、ＭＨＣ／ペプチド複合体に対する特異的抗体が生成され、開発され得る。これらは、毒素または放射性物質を患部組織に標的化する治療法のために、使用され得る。これらの抗体の別の用途は、ＰＥＴなどのイメージング目的の放射性核種の患部組織への標的化であり得る。この用途は、小規模な転移の検出、または病的組織の大きさと正確な位置確認の判定を助け得る。

【0309】

したがってＨＬＡ拘束性抗原と複合体化した、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する、組換え抗体を製造する方法を提供することが、本発明のさらなる態様であり、方法は、前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩを発現する細胞を含んでなる遺伝子操作された非ヒト哺乳類を、前記ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化した可溶性形態のＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子によって免疫化するステップと；ｍＲＮＡ分子を前記非ヒト哺乳類の抗体産生細胞から単離するステップと；前記ｍＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質分子を提示する、ファージディスプレイライブラリーを作成するステップと；少なくとも１つのファージを前記ファージディスプレイライブラリーから単離するステップとを含んでなり、前記少なくとも１つのファージは、前記ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化した前記ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する、前記抗体を提示する。ＨＬＡ拘束性抗原と複合体化したヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩと特異的に結合する抗体を提供することも、本発明のさらなる態様であり、その中で抗体は、好ましくは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体および／またはキメラ抗体である。

【0310】

このような抗体および一本鎖クラスＩ主要組織適合性複合体を生産するそれぞれの方法、ならびにこれらの抗体を生産するためのその他のツールは、本発明の目的で、その内容全体が参照により全て明示的に援用される、国際公開第０３／０６８２０１号パンフレット、国際公開第２００４／０８４７９８号パンフレット、国際公開第０１／７２７６８号パンフレット、国際公開第０３／０７０７５２号パンフレット、および文献（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３ａ；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３ｂ；Ｄｅｎｋｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）で開示される。

【0311】

好ましくは、抗体は、２０ナノモル濃度未満、好ましくは１０ナノモル濃度未満の結合親和性で複合体に結合し、それは本発明の文脈で「特異的」とも見なされる。

【0312】

本発明は、配列番号１～配列番号９１からなる群から選択される配列、または配列番号１～配列番号９１と少なくとも８８％相同的な（好ましくは同一の）その変異型を含んでなるペプチド、またはＴ細胞を前記ペプチドと交差反応させるその変異型に関し、前記ペプチドは、基礎となる完全長ポリペプチドでない。

【0313】

本発明は、配列番号１～配列番号９１からなる群から選択される配列、または、配列番号１～配列番号９１と少なくとも８８％相同的な（好ましくは同一の）その変異型を含んでなるペプチドにさらに関し、前記ペプチドまたは変異型は、８～１００、好ましくは８～３０、最も好ましくは８～１４アミノ酸の全長を有する。

【0314】

本発明は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩの分子に結合する能力を有する、本発明によるペプチドにさらに関する。

【0315】

本発明は、ペプチドが、配列番号１～配列番号９１に記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる、本発明によるペプチドにさらに関する。

【0316】

本発明は、ペプチドが（化学的に）修飾された、および／または非ペプチド結合を含む、本発明によるペプチドにさらに関する。

【0317】

本発明は、本発明によるペプチドにさらに関し、ペプチドは、融合タンパク質の一部であり、特にＨＬＡ－ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸を含んでなり、またはペプチドは、例えば樹状細胞特異的抗体などの抗体に（またその中に）融合する。

【0318】

本発明は、本発明によるペプチドをエンコードする核酸にさらに関するが、ただしペプチドは完全（完全長）ヒトタンパク質でない。

【0319】

本発明は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせである、本発明による核酸にさらに関する。

【0320】

本発明は、本発明による核酸を発現できる、発現ベクターにさらに関する。

【0321】

本発明は、医療、特に頭頸部扁上皮がんの治療で使用するための本発明によるペプチド、本発明による核酸、本発明による発現ベクターにさらに関する。

【0322】

本発明は、本発明による核酸または本発明による発現ベクターを含んでなる、宿主細胞にさらに関する。

【0323】

本発明は、抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞である、本発明による宿主細胞にさらに関する。

【0324】

本発明は、本発明による宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞および／またはその培養液からペプチドを単離するステップとを含んでなる、本発明によるペプチドを製造する方法にさらに関する。

【0325】

本発明は、十分な量の抗原を抗原提示細胞に接触させることで、適切な抗原提示細胞の表面に発現されるクラスＩまたはＩＩ ＭＨＣ分子上に、抗原が負荷される、本発明による方法にさらに関する。

【0326】

本発明は、抗原提示細胞が、配列番号１～配列番号９１または前記異アミノ酸配列を含有する、前記ペプチドを発現できる、発現ベクターを含んでなる、本発明による方法にさらに関する。

【0327】

本発明は、本発明による方法によって製造される活性化Ｔ細胞にさらに関し、前記Ｔ細胞は、本発明によるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する。

【0328】

本発明は、本発明によるＴ細胞の有効数を患者に投与するステップを含んでなる、患者において、本発明による任意のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する標的細胞を死滅させる方法にさらに関する。

【0329】

本発明は、記載される任意のペプチド、本発明による核酸、本発明による発現ベクター、本発明による細胞、または本発明による活性化細胞傷害性Ｔリンパ球の、薬剤としての、または薬剤の製造における、使用にさらに関する。本発明は、薬剤ががんに対して有効である、本発明による使用にさらに関する。

【0330】

本発明は、薬剤がワクチンである、本発明による使用にさらに関する。本発明は、薬剤ががんに対して有効である、本発明による使用にさらに関する。

【0331】

本発明は、前記がん細胞が、頭頸部扁上皮がん細胞、または急性骨髄性白血病、乳がん、胆管がん、脳がん、慢性リンパ球性白血病、結腸直腸がん、食道がん、胆嚢がん、胃がん、肝細胞がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞、小細胞肺がん、膀胱がん、および子宮がんなどのその他の固形腫瘍または血液学的腫瘍細胞などである、本発明による使用にさらに関する。

【0332】

本発明は、頭頸部扁上皮がんの診断および／または予後診断において使用され得る、本明細書で「標的」と称される、本発明によるペプチドベースの特定の標識タンパク質およびバイオマーカーにさらに関する。本発明はまた、がん治療のためのこれらの新規標的の使用に関する。

【0333】

「抗体（単数）」または「抗体（複数）」という用語は、本明細書では広義に使用され、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の双方を含む。無処理または「完全」免疫グロブリン分子に加えて、「抗体」という用語には、本発明による所望の特性（例えば、頭頸部扁上皮がんマーカー（ポリ）ペプチドの特異的結合、がんマーカー遺伝子を増大レベルで発現する頭頸部扁上皮がん細胞への毒素の送達、および／または頭頸部扁上皮がんマーカーポリペプチドの活性阻害）のいずれかを示しさえすれば、フラグメント（例えば、ＣＤＲ、Ｆｖ、Ｆａｂ、およびＦｃフラグメント）、またはこれらの免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子ヒト化バージョンのポリマーもまた含まれる。

【0334】

可能な場合は常に、本発明の抗体は、商業的供給元から購入されてもよい。また本発明の抗体は、周知の方法を使用して生成されてもよい。当業者は、完全長頭頸部扁上皮がんマーカーポリペプチドまたはその断片のいずれかが、本発明の抗体を生成するために使用されてもよいことを理解するであろう。本発明の抗体を製造するために使用されるポリペプチドは、天然原料から部分的にまたは完全に精製されてもよく、または組換えＤＮＡ技術を使用して製造されてもよい。

【0335】

例えば、配列番号１～配列番号９１ポリペプチドに記載のペプチドなどの本発明によるペプチドをコードするｃＤＮＡ、またはその変異型またはフラグメントが、原核細胞（例えば、細菌）または真核細胞（例えば、酵母、昆虫、または哺乳類細胞）で発現され得て、その後、組換えタンパク質が精製されて、本発明による抗体を生成するために使用される、頭頸部扁上皮がんマーカーポリペプチドに特異的に結合する、モノクローナルまたはポリクローナル抗体製剤を生成するために使用され得る。

【0336】

当業者は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の２つ以上の異なるセットの作製が、その目的の用途（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的検査、生体内イメージング、免疫毒素療法）に必要な特異性および親和性を有する抗体を得る可能性を最大化することを理解するであろう。抗体は、それに対して抗体が使用される目的に従って、既知の方法によりそれらの所望の活性について試験される（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的検査、免疫療法など；抗体の作製および試験のさらなるガイダンスについては、例えば、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，２０１４（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，２０１４）を参照されたい）。例えば、抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイ、またはウエスタンブロット、ホルマリン固定がんまたは冷凍組織切片の免疫組織化学染色で試験されてもよい。それらの最初の生体外特性解析後、治療または生体内診断用途を意図した抗体が、既知の臨床試験法によって試験される。

【0337】

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書の用法では、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る可能な自然発生変異を除いて同一である。本明細書では、「モノクローナル抗体」は、それらが所望の拮抗活性を示しさえすれば、その中で重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来しまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同的である一方、鎖の残部は、別の種に由来しまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同的である、「キメラ」抗体、ならびにこのような抗体の断片を特に含む（その内容全体が本明細書に援用される、米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。

【0338】

本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を使用して調製されてもよい。ハイブリドーマ法においては、マウスまたはその他の適切な宿主動物が免疫剤によって典型的に免疫化されて、免疫剤と特異的に結合する抗体を産生するまたは産生できるリンパ球を生じさせる。代案としては、リンパ球は、生体外で免疫化されてもよい。

【0339】

モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されるものなどの組換えＤＮＡ法によって生産されるものであってもよい。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して、容易に単離および配列決定され得る（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合できる、オリゴヌクレオチドプローブの使用によって）。

【0340】

インビトロ法もまた、一価の抗体を調製するのに適する。抗体断片、特にＦａｂ断片を作製するための抗体の消化は、当該技術分野で既知の通例の技術を使用して達成され得る。例えば、消化は、パパインを使用して実施され得る。パパイン消化の例は、国際公開第９４／２９３４８号パンフレットおよび米国特許第４，３４２，５６６号明細書に記載される。抗体のパパイン消化は、それぞれ単一抗原結合部位を有するＦａｂ断片と称される２つの同一の抗原結合断片と、残りのＦｃ断片とを典型的に生じる。ペプシン処理は、Ｆ（ａｂ’）２断片およびｐＦｃ’断片をもたらす。

【0341】

抗体断片は、その他の配列に付着するかどうかに関わりなく、断片の活性が非修飾抗体または抗体断片と比較して顕著に変化せずまたは損なわれないという条件で、特定領域または特定アミノ酸残基の挿入、欠失、置換、またはその他の選択された修飾もまた含み得る。これらの修飾は、ジスルフィド結合できるアミノ酸の除去／付加、そのバイオ寿命増大、その分泌特性改変などのいくつかの追加的な特性を提供し得る。いずれにしても、抗体断片は、結合活性、結合領域における結合調節などの生理活性特性を有しなくてはならない。抗体の機能性または活性領域は、タンパク質の特定領域の変異誘発と、それに続く発現と、発現したポリペプチドの試験によって同定されてもよい。このような方法は、当該技術分野の熟練した実務家には容易に分かり、抗体断片をエンコードする核酸の部位特異的変異誘発を含み得る。

【0342】

本発明の抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体をさらに含んでなってもよい。非ヒト（例えばマウス）抗体などのヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはその他の抗原結合部分配列など）である。ヒト化抗体としては、その中でレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト生物種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が挙げられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体または移入ＣＤＲまたはフレームワーク配列のどちらにも見いだされない、残基を含んでなってもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つおよび典型的に２つの可変領域の実質的に全てを含んでなり、その中ではＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン共通配列のものである。ヒト化抗体は、至適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部もまた含んでなる。

【0343】

非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野で周知である。通常、ヒト化抗体は、非ヒト起源から導入された、１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入」残基と称され、それは典型的に「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、齧歯類ＣＤＲ（複数）またはＣＤＲ（単数）配列を対応するヒト抗体配列によって置換することで、基本的に実施され得る。したがって、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）であり、その中では実質的に完全でないヒト可変ドメインが、非ヒト生物種からの対応する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は典型的にヒト抗体であり、その中ではいくつかのＣＤＲ残基と、おそらくはいくつかのＦＲ残基とが、齧歯類抗体中の類似部位からの残基によって置換される。

【0344】

免疫化に際して、内因性免疫グロブリン生成不在下で、ヒト抗体の完全レパートリーを産生できる遺伝子組換え動物（例えばマウス）を用い得る。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異マウスにおける、抗体重鎖連結領域遺伝子のホモ接合型欠失が、内因性抗体生成の完全阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖細胞系変異マウスにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの転写は、抗原チャレンジに際してヒト抗体の産生をもたらす。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー中でも産生され得る。

【0345】

本発明の抗体は、好ましくは薬学的に許容可能な担体中で、対象に投与される。典型的に、製剤中で適当量の薬理的に許容可能な塩が使用されて、製剤を等張にする。薬理的に許容可能な担体の例としては、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、好ましくは約５～約８、より好ましくは約７～約７．５である。さらなる担体としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス徐放性製剤が挙げられ、そのマトリックスは、例えば、フィルム、リポソームまたは微粒子などの造形品の形態である。当業者には、例えば、投与される抗体の投与経路と濃度次第で、特定の担体がより好ましくあってもよいことが明らかであろう。

【0346】

抗体は、注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内）によって、またはその有効形態での血流への送達を確実にする輸液などのその他の方法によって、対象、患者、または細胞に投与され得る。抗体はまた、腫瘍内または腫瘍周囲経路によって投与されて、局所性ならびに全身性の治療効果を発揮してもよい。局所注射または静脈注射が好ましい。

【0347】

抗体を投与するための有効投与量およびスケジュールは、経験的に判定されてもよく、このような判定をすることは、当該技術分野の技術範囲内である。当業者は、投与しなくてはならない抗体用量が、例えば、抗体を投与される対象、投与経路、使用される特定の抗体型、および投与されるその他の薬剤次第で変動することを理解するであろう。単独使用される抗体の典型的な１日量は、上述の要素次第で、１日当たり約１（μｇ／ｋｇ～最大１００ｍｇ／ｋｇ体重またはそれ以上の範囲に及ぶかもしれない。抗体の投与に続いて、好ましくは頭頸部扁上皮がんの治療のために、治療用抗体の有効性が、熟練した実務家に良く知られている様々な様式で評価され得る。例えば、標準腫瘍イメージング技術を使用して、治療を受ける対象におけるがんの大きさ、数、および／または分布がモニターされてもよい。抗体投与不在下で起こるであろう疾患経過と比較して、腫瘍成長を停止させ、腫瘍収縮をもたらし、および／または新規腫瘍の発生を予防する、治療的に投与された抗体は、がん治療のための有効な抗体である。

【0348】

特異的ペプチド－ＭＨＣ複合体を認識する可溶性Ｔ細胞受容体（ｓＴＣＲ）を製造する方法を提供することもまた、本発明のさらなる態様である。このような可溶性Ｔ細胞受容体は、特異的Ｔ細胞クローンから生成され得て、それらの親和性は、相補性決定領域を標的化する変異誘発によって増加され得る。Ｔ細胞受容体の選択目的で、ファージディスプレイが利用され得る（米国特許第２０１０／０１１３３００号明細書、（Ｌｉｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０１２））。ファージディスプレイ中に、そして薬剤として実用する際に、Ｔ細胞受容体を安定化させる目的で、例えば、非天然ジスルフィド結合、その他の共有結合（一本鎖Ｔ細胞受容体）、または二量体化ドメインによって、αおよびβ鎖を連結させ得る（Ｂｏｕｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｃａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｗｉｌｌｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。Ｔ細胞受容体は、標的細胞上で特定機能を発揮させるために、毒素、薬剤、サイトカイン（例えば、米国特許第２０１３／０１１５１９１号明細書を参照されたい）、および抗ＣＤ３ドメインのようなエフェクター細胞動員ドメインなどに、連結させ得る。さらにそれは、養子免疫伝達のために使用されるＴ細胞において発現され得た。さらなる情報は、国際公開第２００４／０３３６８５Ａ１号パンフレットおよび国際公開第２００４／０７４３２２Ａ１号パンフレットにある。ＴＣＲの組み合わせは、国際公開第２０１２／０５６４０７Ａ１号パンフレットに記載される。さらなる製造法は、国際公開第２０１３／０５７５８６Ａ１号パンフレットで開示される。

【0349】

さらに本発明のペプチドおよび／またはＴＣＲまたは抗体またはその他の結合分子を使用して、病理学者の生検サンプルに基づくがん診断を確認し得る。

【0350】

抗体またはＴＣＲはまた、生体内診断アッセイのために使用されてもよい。通常、抗体は、腫瘍が位置確認され得るように、免疫シンチグラフィーを使用して、放射性ヌクレオチド（^１１１Ｉｎ、^９９Ｔｃ、^１４Ｃ、^１３１Ｉ、^３Ｈ、^３２Ｐまたは^３５Ｓなど）で標識される。一実施形態では、抗体またはそれらの断片は、上述のタンパク質からなる群から選択されるタンパク質の２つ以上の標的の細胞外ドメインに結合し、親和性（Ｋｄ）は１×１０μＭ未満である。

【0351】

診断用の抗体は、様々なイメージング法による検出に適するプローブで標識されてもよい。プローブの検出方法としては、蛍光、光学、共焦点および電子顕微鏡検査；磁気共鳴画像法および分光法；蛍光透視法、コンピュータ断層撮影および陽電子放射型断層撮影法が挙げられるが、これに限定されるものではない。適切なプローブとしては、フルオレセイン、ローダミン、エオジンおよびその他のフルオロフォア、放射性同位体、金、ガドリニウムおよびその他のランタニド、常磁性鉄、フッ素１８およびその他の陽電子放出放射性核種が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、プローブは二官能価または多官能価であってもよく、列挙される方法の２つ以上によって検出可能であってもよい。これらの抗体は、前記プローブで直接または間接的に標識されてもよい。特に十分に技術分野で承認されている、プローブの抗体への付着としては、プローブの共有結合、プローブの抗体への組み込み、およびプローブ結合のためのキレート化合物の共有結合が挙げられる。免疫組織化学的検査では、疾患組織サンプルは、新鮮または冷凍であってもよく、またはパラフィン包埋されてホルマリンなどの保存料で固定されてもよい。サンプルを含有する固定または包埋切片は、標識一次抗体および二次抗体と接触されて、抗体を使用して原位置タンパク質発現が検出される。

【0352】

本発明の別の態様は、活性化Ｔ細胞を製造するインビトロ法を含み、方法は、生体外Ｔ細胞を、適切な抗原提示細胞の表面に発現される抗原負荷ヒトＭＨＣ分子に、Ｔ細胞を抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり接触させるステップを含んでなり、抗原は本発明によるペプチドである。好ましくは、抗原提示細胞と共に、十分な量の抗原が使用される。

【0353】

好ましくは、哺乳類細胞は、ＴＡＰペプチド輸送体のレベルまたは機能が皆無でありまたは低下している。ＴＡＰペプチド輸送体が欠如している適切な細胞としては、Ｔ２、ＲＭＡ－Ｓ、およびショウジョウバエ細胞が挙げられる。ＴＡＰは、抗原プロセシングに関連する輸送体である。

【0354】

ヒトペプチド負荷欠乏細胞系Ｔ２は、カタログ番号ＣＲＬ１９９２の下に、米国郵便番号２０８５２メリーランド州ロックビル市パークロウンドライブ１２３０１番地の米国微生物系統保存機関から入手でき；ショウジョウバエ細胞株Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ株２は、カタログ番号ＣＲＬ１９８６３の下にＡＴＣＣから入手でき；マウスＲＭＡ－Ｓ細胞株は、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ ａｎｄ Ｋａｒｒｅ，１９８５）に記載される。

【0355】

好ましくは、移入前に、宿主細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子を実質的に発現しない。刺激因子細胞が、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ－１、およびＬＦＡ３のいずれかなどのＴ細胞のための共刺激シグナルを提供するのに重要な分子を発現することもまた好ましい。多数のＭＨＣクラスＩ分子および共刺激因子分子の核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬデータベースから公的に入手可能である。

【0356】

ＭＨＣクラスＩエピトープが抗原として使用される場合、Ｔ細胞はＣＤ８陽性Ｔ細胞である。

【0357】

抗原提示細胞が、このようなエピトープを発現するために形質移入される場合、好ましくは、細胞は、配列番号１～配列番号９１、またはその変異アミノ酸配列を含有するペプチドを発現する能力がある発現ベクターを含んでなる。

【0358】

生体外でＴ細胞を製造するために、その他のいくつかの方法が使用されてもよい。例えば、自己由来腫瘍浸潤性リンパ球が、ＣＴＬを生成するために使用され得る。Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）は、Ｔ細胞の調製において、自己由来末梢血リンパ球（ＰＬＢ）を利用した。さらに、樹状細胞をペプチドまたはポリペプチドでパルス処理する、または組換えウイルスで感染させることによる、自己由来Ｔ細胞の製造も可能である。Ｂ細胞もまた、自己由来Ｔ細胞の製造において使用され得る。さらに、ペプチドまたはポリペプチドでパルス処理された、または組換えウイルスで感染されたマクロファージが、自己ＣＴＬの調製において使用されてもよい。Ｓ．Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）は、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を使用したＴ細胞の生体外プライミングを記載し、それはまた、選択されたペプチドに対するＴ細胞を製造するための適切な方法でもある。本発明では、ビオチン：ストレプトアビジン生化学によって、あらかじめ形成されたＭＨＣ：ペプチド複合体を表面ポリスチレン粒子（ミクロビーズ）に共役することで、ａＡＰＣが生成された。このシステムは、ａＡＰＣ上のＭＨＣ密度の正確な調節を可能にし、それは、血液サンプルから高効率で、高または低結合活性の抗原特異的Ｔ細胞応答を選択的に引き起こすことを可能にする。ＭＨＣ：ペプチド複合体の他に、ａＡＰＣは、それらの表面に共役する、抗ＣＤ２８抗体のような共刺激活性を有するその他のタンパク質を保有すべきである。さらに、このようなａＡＰＣベースのシステムは、例えばサイトカイン様インターロイキン１２などの適切な可溶性因子の付加を要することが多い。

【0359】

同種異系細胞はまた、Ｔ細胞の調製において使用されてもよく、方法は、参照により本明細書に援用される、国際公開第９７／２６３２８号パンフレットで詳述される。例えば、ショウジョウバエ細胞およびＴ２細胞に加えて、その他の細胞を使用して、ＣＨＯ細胞、バキュロウイルス感染昆虫細胞、細菌、酵母、およびワクシニア感染標的細胞などの抗原が提示されてもよい。さらに植物ウイルスが使用されてもよい（例えば、外来性ペプチド提示のための高収率システムとしてのササゲモザイクウイルス開発を記載するＰｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．（Ｐｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９４を参照されたい）。

【0360】

本発明のペプチドに向けられた活性化Ｔ細胞は、治療法において有用である。したがって、本発明のさらなる態様は、前述の本発明の方法によって入手可能な活性化Ｔ細胞を提供する。

【0361】

上記方法によって製造される活性化Ｔ細胞は、配列番号１～配列番号９１のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する細胞を選択的に認識する。

【0362】

好ましくは、Ｔ細胞は、そのＴＣＲを通じた、ＨＬＡ／ペプチド複合体（例えば結合）との相互作用によって、細胞を認識する。Ｔ細胞は、その標的細胞が、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する患者において、標的細胞を死滅させる方法で有用であり、患者には有効数の活性化Ｔ細胞が投与される。患者に投与されるＴ細胞は、患者に由来して、上述のように活性化されてもよい（すなわち、それらは自己Ｔ細胞である）。代案としては、Ｔ細胞は、患者でなく別の個人に由来する。もちろん、個人が健常人であれば、それが好ましい。「健常人」によって、本発明者らは、個人が概して健康良好であり、好ましくは有能な免疫系を有して、より好ましくは容易に検査され検出され得るいかなる疾患にも罹患していないことを意味する。

【0363】

生体内で、本発明によるＣＤ８陽性Ｔ細胞の標的細胞は、（時にＭＨＣクラスＩＩを発現する）腫瘍細胞であり得て、および／または（時にＭＨＣクラスＩＩもまた発現する；（Ｄｅｎｇｊｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００６））腫瘍（腫瘍細胞）周囲の間質細胞であり得る。

【0364】

本発明のＴ細胞は、治療用組成物の活性成分として使用されてもよい。したがって、本発明は、その標的細胞が、本発明のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを異常に発現する患者において、標的細胞を死滅させる方法もまた提供し、方法は、上で定義されるようなＴ細胞の有効数を患者に投与するステップを含んでなる。

【0365】

「異常に発現される」によって、本発明者らは、正常組織における発現レベルと比較して、ポリペプチドが過剰発現されること、または腫瘍がそれに由来する組織においては遺伝子がサイレントであるが、腫瘍においてはそれが発現されることもまた意味する。「過剰発現」によって、本発明者らは、ポリペプチドが、正常組織に存在するレベルの少なくとも１．２倍のレベルで；好ましくは正常組織に存在するレベルの少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍または１０倍のレベルで存在することを意味する。

【0366】

Ｔ細胞は、例えば上で記載されるものなどの当該技術分野で公知の方法によって得られてもよい。

【0367】

Ｔ細胞のこのいわゆる養子免疫伝達のためのプロトコルは、当該技術分野で周知である。レビューは、Ｇａｔｔｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．およびＭｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６）にある。

【0368】

本発明の別の態様は、その核酸がクローン化されて、好ましくはＴ細胞である宿主細胞に導入されるＴ細胞受容体を生成するための、ＭＨＣと複合体形成するペプチドの使用を含む。次に、この遺伝子操作Ｔ細胞は、がん治療のために患者に移入され得る。

【0369】

本発明の任意の分子、すなわちペプチド、核酸、抗体、発現ベクター、細胞、活性化Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体またはそれをエンコードする核酸は、免疫応答を逃れた細胞によって特徴付けられる障害の治療に有用である。したがって本発明の任意の分子は、薬剤として、または薬剤の製造において使用されてもよい。分子は、単独で、または本発明のその他の分子または既知の分子との組み合わせで、使用されてもよい。

【0370】

本発明は、
（ａ）溶液中のまたは凍結乾燥形態の上述の医薬組成物を含有する容器；
（ｂ）任意選択的に、凍結乾燥製剤のための希釈剤または再構成溶液を含有する第２の容器；
（ｃ）任意選択的に、（ｉ）溶液の使用、または（ｉｉ）凍結乾燥製剤の再構成および／または使用のための取扱説明書
を含んでなるキットをさらに目的とする。

【0371】

キットは、（ｉｉｉ）緩衝液、（ｉｖ）希釈剤、（ｖ）濾過、（ｖｉ）針、または（ｖ）シリンジの１つまたは複数をさらに含んでなってもよい。容器は、好ましくは、ボトル、バイアル、シリンジまたは試験管であり；それは、多回使用容器であってもよい。医薬組成物は、好ましくは凍結乾燥される。

【0372】

本発明のキットは、好ましくは、適切な容器内の本発明の凍結乾燥製剤と、その再構成および／または使用のための取扱説明書とを含んでなる。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル（例えば二重チャンバーバイアル）、シリンジ（二重チャンバーシリンジなど）、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成されてもよい。好ましくは、キットおよび／または容器は、容器上の、または容器に付随する、取扱説明を含み、それは再構成および／または使用上の指示を示す。例えば、ラベルは、凍結乾燥製剤が、上述されるようなペプチド濃度に再構成されることを表示してもよい。ラベルは、製剤が皮下投与に有用であり、または皮下投与用であることをさらに表示してもよい。

【0373】

製剤を収容する容器は、多回使用バイアルであってもよく、それは再構成製剤の反復投与（例えば２～６回の投与）を可能にする。キットは、適切な希釈剤（例えば炭酸水素ナトリウム溶液）を含んでなる、第２の容器をさらに含んでなってもよい。

【0374】

希釈剤と凍結乾燥製剤の混合時に、再構成製剤中の最終ペプチド濃度は、好ましくは少なくとも０．１５ｍｇ／ｍＬ／ペプチド（＝７５μｇ）であり、好ましくは３ｍｇ／ｍＬ／ペプチド（＝１５００μｇ）以下である。キットは、その他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および取扱説明が掲載されるパッケージインサートをはじめとする商業的および使用者観点から望ましい、その他の物品をさらに含んでもよい。

【0375】

本発明のキットは、その他の構成要素（例えば、その他の化合物またはこれらのその他の化合物の医薬組成物）が添加されたまたは添加されない、本発明による医薬組成物製剤を含有する単回容器を有してもよく、または各構成要素のための別個の容器を有してもよい。

【0376】

好ましくは、本発明のキットは、第２の化合物（アジュバント（例えばＧＭ－ＣＳＦ）、化学療法剤、天然物、ホルモンまたは拮抗薬、抗血管新生因子または阻害剤、アポトーシス誘導剤またはキレート剤など）またはその医薬組成物の同時投与と合わせて使用するためにパッケージされた、本発明の製剤を含む。キットの構成要素は、あらかじめ混合されてもよく、または各構成要素は、患者への投与前に別個の異なる容器内にあってもよい。キットの構成要素は、１つまたは複数の液体溶液、好ましくは水溶液、より好ましくは無菌水溶液中で、提供されてもよい。またキットの構成要素は、固体として提供されてもよく、それは、好ましくは別の異なる容器内に提供される、適切な溶媒の添加によって液体に変換されてもよい。

【0377】

治療用キットの容器は、バイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または固体または液体を封入するその他のあらゆる手段であってもよい。通常、２つ以上の構成要素がある場合、キットは、第２のバイアルまたはその他の容器を含有して、別々の投薬を可能にする。キットは、薬学的に許容可能な液体のための別の容器もまた、含有してもよい。好ましくは、治療用キットは、装置（例えば、１本または複数本の針、シリンジ、点眼器、ピペットなど）を含有して、本キットの構成要素である本発明の作用物質の投与を可能にする。

【0378】

本製剤は、経口（腸内）、経鼻、眼、皮下、皮内、筋肉内、静脈内または経皮などの任意の許容可能な手段によるペプチド投与に適するものである。好ましくは、投与はｓ．ｃ．であり、最も好ましくはｉ．ｄ．投与であり、輸液ポンプによってもよい。

【0379】

本発明のペプチドは、頭頸部扁上皮がんから単離されたので、本発明の薬剤は、好ましくは頭頸部扁上皮がんを治療するために用いられる。

【0380】

本発明は、プレスクリーニングＴＵＭＡＰの貯蔵庫から選択される少なくとも１つのペプチドを含んでなる医薬組成物を製造するステップを含んでなる、個々の患者のための個別化薬剤を製造する方法にさらに関し、医薬組成物中で使用される少なくとも１つのペプチドは、個々の患者における適切さについて選択される。一実施形態では、医薬組成物はワクチンである。方法はまた、ＴＣＲ単離などの下流用途、または可溶性抗体、およびその他の治療選択肢のためのＴ細胞クローンを製造するためにも適応され得る。

【0381】

「個別化医薬品」は、積極的個別化がんワクチンおよび自己由来患者組織を使用した養子細胞療法をはじめとするこのような個々の患者の治療のためにのみ使用される、一個人の患者のために特に調整された治療法を意味するものとする。

【0382】

本明細書の用法では、「貯蔵庫」という用語は、特定の腫瘍型における免疫原性および／または過剰提示について予備スクリーニングされている、一群のまたは一組のペプチドを指すものとする。「貯蔵庫」という用語は、ワクチンに含まれる特定のペプチドが、予備製造されて物理的設備内で貯蔵されることを暗示することは意図されないが、その可能性も検討される。ペプチドは、製造される各個別化ワクチンのために新規に製造されてもよく、または予備製造されて貯蔵されてもよいことが、明示的に検討される。貯蔵庫（例えば、データベースの形態）は、多様なＨＬＡ－ＡＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を有する頭頸部扁上皮がん患者の腫瘍組織において高度に過剰発現される、腫瘍関連ペプチドから構成される。それは、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩペプチドまたは伸長ＭＨＣクラスＩペプチドを含有してもよい。いくつかの頭頸部扁上皮がん組織から収集された腫瘍関連ペプチドに加えて、貯蔵庫は、ＨＬＡ－Ａ^＊０２およびＨＬＡ－Ａ^＊２４マーカーペプチドを含有してもよい。これらのペプチドは、ＴＵＭＡＰによって誘導されるＴ細胞免疫の規模を定量的に比較できるようにし、したがって抗腫瘍応答を引き起こすワクチンの能力について、重要な結論が導かれるようにする。第２に、それらは、患者において、「自己」抗原に由来するＴＵＭＡＰに対するいかなるワクチン誘導Ｔ細胞応答も観察されない症例において、「非自己」抗原に由来する重要な陽性対照ペプチドとして機能する。第３に、それは、患者の免疫能力状態に関する結論が導かれるようにしてもよい。

【0383】

貯蔵庫のためのＴＵＭＡＰは、遺伝子発現解析、質量分析、およびＴ細胞免疫学（ＸＰｒｅｓｉｄｅｎｔ（登録商標））を組み合わせた、統合ゲノム機能解析アプローチを使用して同定される。アプローチは、高い割合の腫瘍上に真に存在するが、正常組織上では発現されず、または最小限にのみ発現されるＴＵＭＡＰだけが、さらなる分析のために選択されることを保証する。最初のペプチド選択のために、患者由来の頭頸部扁上皮がんサンプルおよび健常ドナー由来の血液が段階的なアプローチで分析された：
１．悪性物質からのＨＬＡリガンドは、質量分析法によって同定された
２．ゲノム規模メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）発現解析を使用して、一連の正常器官および組織と比較して悪性組織（頭頸部扁上皮がん）中の遺伝子過剰発現が同定された
３．同定されたＨＬＡリガンドは、遺伝子発現データと比較された。好ましくは、ステップ２で検出されたような選択的に発現されまたは過剰発現される遺伝子によってコードされる、腫瘍組織上で過剰提示されまたは選択的に提示されるペプチドが、多重ペプチドワクチンのための適切なＴＵＭＡＰ候補と見なされた。
４．同定されたペプチドのＴＵＭＡＰとしての妥当性を支持する追加的な証拠を同定するために、文献調査が実施された
５．ｍＲＮＡレベルでの過剰発現の関連性は、ステップ３からの選択されたＴＵＭＡＰの腫瘍組織上における再検出と、健常組織における検出の欠如（または稀な）検出によって確認された。
６．選択されたペプチドによる生体内Ｔ細胞応答の誘導が可能かどうかを評価するために、健常ドナーならびに頭頸部扁上皮がん患者からのヒトＴ細胞を使用して、生体外免疫原性アッセイが実施された。

【0384】

一態様では、貯蔵庫に含める前に、免疫原性についてペプチドが予備スクリーニングされる。制限を意図しない一例として、貯蔵庫に包含されるペプチドの免疫原性は、ペプチド／ＭＨＣ複合体および抗ＣＤ２８抗体が負荷された人工抗原提示細胞による、健常ドナーからのＣＤ８＋Ｔ細胞の反復刺激を通じた、生体外Ｔ細胞プライミングを含んでなる方法によって判定される。

【0385】

この方法は、稀ながんに、そして稀な発現プロファイルを有する患者にとって、好ましい。一定組成を有する多重ペプチド混合物とは対照的に、現在開発されている貯蔵庫は、腫瘍における抗原の実際の発現とワクチンとの顕著により高いマッチングを可能にする。多標的アプローチでは、各患者のために、選択された単一のまたは組み合わされた数種の「既製」ペプチドが利用される。理論上は、例えば５０個の抗原性ペプチドのライブラリーからの５個の異なる抗原性ペプチドの選択に基づくアプローチは、それだけでおよそ１７００万個の可能な医薬品（ＤＰ）組成物をもたらす。

【0386】

一態様では、ペプチドは、本明細書に記載される、または以下のような本発明による方法に基づく、個々の患者に対するそれらの適切さに基づいて、ワクチンへの包含のために選択される。

【0387】

ＨＬＡ表現型、トランスクリプトミクスおよびペプチドミクスデータが、患者の腫瘍材料および血液サンプルから収集されて、「貯蔵庫」および患者に特有の（すなわち変異）ＴＵＭＡＰを含有する、各患者に対して最も適切なペプチドが同定される。患者の腫瘍において選択的にまたは過剰発現されて、可能であれば、患者の個々のＰＢＭＣと共に試験すると、強力な生体外免疫原性を示すペプチドが選択される。

【0388】

好ましくは、ワクチンに含まれるペプチドは、（ａ）個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を同定するステップと；（ｂ）（ａ）で同定されたペプチドを上述のペプチド貯蔵庫（データベース）と比較するステップと；（ｃ）少なくとも１つのペプチドを患者において同定された腫瘍関連ペプチドに関連がある貯蔵庫（データベース）から選択するステップとを含んでなる方法によって同定される。例えば、腫瘍サンプルによって提示されるＴＵＭＡＰは、（ａ１）前記腫瘍サンプルからの発現データを前記腫瘍サンプルの組織型に対応する正常組織サンプルからの発現データと比較して、前記腫瘍サンプルにおいて過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質を同定するステップと；（ａ２）前記発現データを、前記腫瘍サンプル中のＭＨＣクラスＩ／またはクラスＩＩ分子と結合しているＭＨＣリガンドの配列と相関させて、前記腫瘍によって過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質に由来するＭＨＣリガンドを同定するステップとによって同定される。好ましくは、ＭＨＣリガンドの配列は、腫瘍サンプルから単離されたＭＨＣ分子から結合ペプチドを溶出させて、溶出したリガンドを配列決定することで同定される。好ましくは、腫瘍サンプルおよび正常組織は、同一患者から入手される。

【0389】

貯蔵庫（データベース）モデルを使用してペプチドを選択するのに加えて、またはその代案として、ＴＵＭＡＰを患者において新規に同定し、次に、ワクチンに含めてもよい。一例として、（ａ１）前記腫瘍サンプルからの発現データを前記腫瘍サンプルの組織型に対応する正常組織サンプルからの発現データと比較して、前記腫瘍サンプルにおいて過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質を同定するステップと；（ａ２）前記発現データを、前記腫瘍サンプル中のＭＨＣクラスＩ／またはクラスＩＩ分子と結合しているＭＨＣリガンドの配列と相関させて、前記腫瘍によって過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質に由来するＭＨＣリガンドを同定するステップとによって、候補ＴＵＭＡＰが患者において同定されてもよい。別の実施例として、個々の患者からの正常な対応組織と比較して、腫瘍サンプルに特有の変異を含有するタンパク質が同定されてもよく、特異的に変異を標的とするＴＵＭＡＰが同定され得る。例えば、腫瘍のゲノム、および対応する正常組織のゲノムは、全ゲノム配列決定によって配列決定され得る。遺伝子のタンパク質コード領域における非同義の変異を発見するために、ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡが腫瘍組織から抽出され、正常な非変異ゲノム生殖細胞系ＤＮＡが末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から抽出される。適用されたＮＧＳアプローチは、タンパク質コード領域の再配列決定（エクソーム再配列決定）に限定される。この目的で、供給業者が提供する標的富化キットを使用して、ヒトサンプルからのエクソンＤＮＡが捕捉され、例えばＨｉＳｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）による配列決定がそれに続く。それに加えて、遺伝子発現の直接定量化と、変異遺伝子が患者の腫瘍において発現されることの妥当性評価とのために、腫瘍ｍＲＮＡが配列決定される。結果として得られる数百万の配列読み取りは、ソフトウェアアルゴリズムを通じて処理される。出力一覧は、変異および遺伝子発現を含有する。ＰＢＭＣ由来生殖細胞系の多様性と比較することで腫瘍特異的体細胞変異が判定され、優先順位がつけられる。次に、新規に同定されたペプチドは、貯蔵庫について上述した免疫原性について試験され得て、適切な免疫原性を保持する候補ＴＵＭＡＰが、ワクチンへの包含のために選択される。

【0390】

例示的一実施形態では、ワクチンに包含されるペプチドは、（ａ）個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を上述の方法によって同定するステップと；（ｂ）ａ）で同定されたペプチドを対応する正常組織との比較で腫瘍における免疫原性および過剰提示について予備選別されたペプチドの貯蔵庫と比較するステップと；（ｃ）患者において同定された腫瘍関連ペプチドと関連がある、貯蔵庫からの少なくとも１つのペプチドを選択するステップと（ｄ）任意選択的に、（ａ）で新規に同定された少なくとも１つのペプチドを選択して、その免疫原性を確認するステップとによって同定される。

【0391】

例示的一実施形態では、ワクチンに包含されるペプチドは、（ａ）個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を同定するステップと；（ｂ）（ａ）で新規に同定された少なくとも１つのペプチドを選択して、その免疫原性を確認するステップとによって同定される。

【0392】

ひとたび個別化ペプチドベースのワクチンのためのペプチドを選択したら、ワクチンを製造する。ワクチンは、好ましくは、約３３％ＤＭＳＯなどの２０～４０％ＤＭＳＯ、好ましくは約３０～３５％ＤＭＳＯに溶解された、個々のペプチドからなる液体製剤である。

【0393】

製品に包含される各ペプチドをＤＭＳＯに溶解する。単一ペプチド溶液の濃度は、製品に包含されるペプチド数に応じて選択しなくてはならない。単一ペプチドＤＭＳＯ溶液を等量で混合し、ペプチド当たり約２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、製品に包含される全てのペプチドを含有する溶液を得る。次に、混合溶液を注射用水で１：３に希釈して、３３％ＤＭＳＯ中でペプチド当たり０．８２６ｍｇ／ｍｌの濃度を得る。希釈溶液を０．２２μｍの無菌フィルターを通して濾過する。最終バルク溶液を得る。

【0394】

最終バルク溶液をバイアルに充填して、使用時まで－２０℃で保存する。１本のバイアルは、０．５７８ｍｇの各ペプチドを含有する７００μＬの溶液を含有する。このうち、５００μＬ（ペプチド当たりおよそ４００μｇ）を皮内注射のために適用する。

【0395】

がんを治療するために有用であるのに加えて、本発明のペプチドは、診断法としてもまた有用である。ペプチドは頭頸部扁上皮がん細胞から生成されたので、そしてこれらのペプチドは正常組織には存在せずまたはより低レベルで存在すると判定されたので、これらのペプチドを利用してがんの存在を診断し得る。

【0396】

特許請求されるペプチドの血液サンプル中の組織生検上の存在は、がん診断において病理学者を補佐し得る。抗体、質量分析法またはその他の当該技術分野で公知の方法の手段による特定のペプチドの検出は、組織サンプルが悪性、または炎症性または概して病的ことを病理学者に告げ得て、または頭頸部扁上皮がんのためのバイオマーカーとして利用され得る。ペプチド基の存在は、病的組織の分類または下位分類を可能にし得る。

【0397】

患部組織検体上のペプチドの検出は、特にＴリンパ球が作用機序に関与することが知られておりまたは予測される場合に、免疫系が関与する治療法の利点を判定できるようにする。ＭＨＣ発現の喪失は、それによって感染悪性細胞が免疫監視を逃れる、十分に説明された機序である。したがってペプチドの存在は、この機序が、分析した細胞によって活用されていないことを示す。

【0398】

本発明のペプチドは、ペプチドまたはＭＨＣ分子と複合体化したペプチドに対するＴ細胞応答または抗体応答などの、これらのペプチドに対するリンパ球応答を分析するのに使用されるかもしれない。これらのリンパ球応答は、さらなる治療段階を決定するための予後マーカーとして使用され得る。これらの応答はまた、例えば、タンパク質、核酸、自己材料のワクチン接種や、リンパ球の養子免疫伝達などの異なる手段によるリンパ球応答の誘導を目指す、免疫療法アプローチにおける代理応答マーカーとして使用され得る。遺伝子治療の設定では、副作用の評価において、ペプチドに対するリンパ球応答が考慮され得る。リンパ球応答のモニタリングはまた、例えば移植片対宿主病および宿主対移植片病の検出など、移植治療の経過観察検査のための有益な手段かもしれない。

【0399】

本発明をここで、その好ましい実施形態を描写する以下の実施例において、添付図面を参照して説明するが、それでもなお、それらには限定されないものとする。本発明の目的で、本明細書で引用される全ての参考文献は、その内容全体が参照により援用される。

【図面の簡単な説明】

【0400】

【図1A】図１Ａ－１Ｄは、正常組織（白色バー）および頭頸部扁上皮がん（黒色バー）における、様々なペプチドの過剰提示を示す。遺伝子記号：ＫＲＴ６Ｃ、ＫＲＴ６Ａ、ＫＲＴ６Ｂ、ペプチド：ＧＬＡＧＧＦＧＧＰＧＦＰＶ（配列番号１）；組織左から右へ：６脂肪組織、８副腎、１胆管、２４血液細胞、１５血管、１０骨髄、１５脳、７乳房、１１食道、２眼、６胆嚢、１６心臓、１７腎臓、２７大腸、２４肝臓、４９肺、７リンパ節、１２神経、５卵巣、１５膵臓、６副甲状腺腺、３腹膜、７脳下垂体、１０胎盤、３胸膜、１１前立腺、９骨格筋、１１皮膚、１６小腸、１３脾臓、９胃、８精巣、３胸腺、８甲状腺、１８気管、７尿管、８膀胱、６子宮、１２頭頸部、１７ＨＮＳＣＣ。

【図1B】遺伝子記号：ＫＲＴ６Ｃ、ＫＲＴ６Ａ、ＫＲＴ６Ｂ、ペプチド：ＳＬＹＧＬＧＧＳＫＲＩＳＩ（配列番号３）；組織左から右へ：６脂肪組織、８副腎、１胆管、２４血液細胞、１５血管、１０骨髄、１５脳、７乳房、１１食道、２眼、６胆嚢、１６心臓、１７腎臓、２７大腸、２４肝臓、４９肺、７リンパ節、１２神経、５卵巣、１５膵臓、６副甲状腺腺、３腹膜、７脳下垂体、１０胎盤、３胸膜、１１前立腺、９骨格筋、１１皮膚、１６小腸、１３脾臓、９胃、８精巣、３胸腺、８甲状腺、１８気管、７尿管、８膀胱、６子宮、１２頭頸部、１７ＨＮＳＣＣ。

【図1C】遺伝子記号：ＫＲＴ５、ペプチド：ＳＴＡＳＡＩＴＰＳＶ（配列番号９）；組織左から右へ：６脂肪組織、８副腎、１胆管、２４血液細胞、１５血管、１０骨髄、１５脳、７乳房、１１食道、２眼、６胆嚢、１６心臓、１７腎臓、２７大腸、２４肝臓、４９肺、７リンパ節、１２神経、５卵巣、１５膵臓、６副甲状腺腺、３腹膜、７脳下垂体、１０胎盤、３胸膜、１１前立腺、９骨格筋、１１皮膚、１６小腸、１３脾臓、９胃、８精巣、３胸腺、８甲状腺、１８気管、７尿管、８膀胱、６子宮、１２頭頸部、１７ＨＮＳＣＣ。

【図1D】遺伝子記号：ＳＬＣ２５Ａ３、ペプチド：ＦＶＡＧＹＩＡＧＶ（配列番号６１）；組織左から右へ：３細胞株（２腎臓、１膵臓）、７正常組織（１副腎、１結腸、２リンパ節、１胎盤、２脾臓）、３６がん組織（５白血病、３脳がん、２乳がん、１食道がん、１胆嚢がん、５頭頸部がん、１腎臓がん、１肝臓がん、８肺がん、４リンパ節がん、３卵巣がん、２胃がん）。

【図1E】図１Ｅ－１Ｑは、異なるがん組織における様々なペプチドの過剰提示を示す（黒点）。上部：技術的反復測定値からの中央値ＭＳシグナル強度は、その上でペプチドが検出された、単一のＨＬＡ－Ａ^＊０２陽性正常（灰色点）および腫瘍サンプル（黒色点）の点としてプロットされた。腫瘍および正常サンプルは、起源臓器によってグループ分けされ、箱ひげ図は、複数サンプルにわたって正規化されたシグナル強度の中央値、２５および７５パーセンタイル数（箱）、および最小および最大（ひげ）に相当する。正常臓器は、リスクカテゴリーによって順序付けられる。（血液細胞、血管、脳、肝臓、肺：高リスク、灰色点；生殖器、乳房、前立腺：低リスク、灰色点；全てのその他の臓器：中リスク；灰色点）。下部：各臓器中の相対ペプチド検出頻度が、棒グラフとして示される。パネル下の数値は、各臓器（Ｎ＝５２６個の正常サンプル、Ｎ＝５６２個の腫瘍サンプル）について分析された、サンプル総数当たりのペプチドが検出されたサンプル数を示す。ペプチドがサンプル上で検出されたが、技術的理由で定量化され得なかった場合、サンプルは、この検出頻度表示に含まれるが、図の上部に点は示されない。組織（左から右へ）：正常サンプル：血液細胞；ｂｌｏｏｄｖｅｓｓ（血管）；脳；心臓；肝臓；肺；脂肪（脂肪組織）；ａｄｒｅｎ．ｇｌ．（副腎）；胆管；膀胱；ＢＭ（骨髄）；軟骨；ｅｓｏｐｈ（食道）；眼；ｇａｌｌｂ（胆嚢）；頭頸部；腎臓；ａｒｇｅ＿ｉｎｔ（大腸）；ＬＮ（リンパ節）；神経；膵臓；ｐａｒａｔｈｙｒ（副甲状腺）；ｐｅｒｉｔ（腹膜）；ｐｉｔｕｉｔ（下垂体）；胸膜；ｓｋｅｌ．ｍｕｓ（骨格筋）；皮膚；ｓｍａｌｌ＿ｉｎｔ（小腸）；脾臓；胃；甲状腺；気管；尿管；乳房；卵巣；胎盤；前立腺；精巣；胸腺；子宮。腫瘍サンプル：ＡＭＬ：急性骨髄性白血病；ＢＲＣＡ：乳がん；ＣＣＣ：胆管細胞がん；ＣＬＬ：慢性リンパ球性白血病；ＣＲＣ：結腸直腸がん；ＧＢＣ：胆嚢がん；ＧＢＭ：神経膠芽腫；ＧＣ：胃がん；ＧＥＪＣ：胃心臓食道、がん；ＨＣＣ：肝細胞がん；ＨＮＳＣＣ：頭頸部がん；ＭＥＬ：黒色腫；ＮＨＬ：非ホジキンリンパ腫；ＮＳＣＬＣ：非小細胞肺がん；ＯＣ：卵巣がん；ＯＳＣＡＲ：食道がん；ＰＡＣＡ：膵臓がん；ＰＲＣＡ：前立腺がん；ＲＣＣ：腎細胞がん；ＳＣＬＣ：小細胞肺がん；ＵＢＣ：尿膀胱がん；ＵＥＣ：子宮および子宮内膜がん。遺伝子記号：ＫＲＴ６Ｃ、ＫＲＴ６Ａ、ＫＲＴ１、ＫＲＴ６Ｂ、ＫＲＴ７５、ＫＲＴ５、ペプチド：ＰＶＣＰＰＧＧＩＱＥＶ（配列番号２）

【図1F】遺伝子記号：ＰＫＰ１、ペプチド：ＳＭＬＮＮＩＩＮＬ（配列番号１５）

【図1G】遺伝子記号：ＰＲＫＤＣ、ペプチド：ＧＬＩＥＷＬＥＮＴＶ（配列番号４５）

【図1H】遺伝子記号：ＡＴＰ５Ｇ２、ＡＴＰ５Ｇ１、ＡＴＰ５Ｇ３、ペプチド：ＡＩＬＧＦＡＬＳＥＡ（配列番号５７）

【図1I】遺伝子記号：ＩＴＧＢ４、ペプチド：ＳＬＳＤＩＱＰＣＬ（配列番号５８）

【図1J】遺伝子記号：ＫＲＴ５、ペプチド：ＡＬＭＤＥＩＮＦＭＫＭ（配列番号６３）

【図1K】遺伝子記号：ＥＳＲＰ２、ペプチド：ＡＬＡＳＡＰＴＳＶ（配列番号７５）

【図1L】遺伝子記号：ＰＡＲＰ９、ペプチド：ＩＬＦＤＥＶＬＴＦＡ（配列番号７６）

【図1M】遺伝子記号：ＭＣＭ４、ペプチド：ＱＬＬＱＹＶＹＮＬ（配列番号８３）

【図1N】遺伝子記号：ＦＨＡＤ１、ペプチド：ＱＬＩＥＫＩＴＱＶ（配列番号８５）

【図1O】遺伝子記号：ＰＬＥＣ、ペプチド：ＡＬＰＥＰＳＰＡＡ（配列番号８７）

【図1P】遺伝子記号：Ｇ３ＢＰ１、ペプチド：ＴＬＮＤＧＶＶＶＱＶ（配列番号９０）

【図1Q】遺伝子記号：ＯＤＣ１、ペプチド：ＭＬＦＥＮＭＧＡＹＴＶ（配列番号９１）。

【図2A】図２Ａ－Ｃは、正常組織（白色バー）および１５頭頸部扁上皮がんサンプル（黒色バー）のパネルにおいて、頭頸部扁上皮がんで高度に過剰発現されまたは排他的に発現される、本発明の起源遺伝子の例示的発現プロファイルを示す。遺伝子記号：ＰＧＬＹＲＰ４、ペプチド：ＡＩＹＥＧＶＧＷＮＶ（配列番号３３）

【図2B】遺伝子記号：ＰＡＰＬ、ペプチド：ＫＬＬＰＧＶＱＹＶ（配列番号３８）；図２Ｃ）遺伝子記号：ＬＧＡＬＳ７、ＬＧＡＬＳ７Ｂ、ペプチド：ＲＬＶＥＶＧＧＤＶＱＬ（配列番号５３）。

【図2C】遺伝子記号：ＬＧＡＬＳ７、ＬＧＡＬＳ７Ｂ、ペプチド：ＲＬＶＥＶＧＧＤＶＱＬ（配列番号５３）。

【図3】ペプチド特異的多量体染色後における、例示的免疫原性データ：フローサイトメトリー結果を示す。

【図4-1】健常ＨＬＡ－Ａ^＊０２＋ドナーのペプチド特異的生体外ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の例示的結果を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、それぞれ配列番号１７ペプチド（Ａ、左側パネル）、配列番号２８ペプチド（Ｂ、左側パネル）、および配列番号２９ペプチド（Ｃ、左側パネル）と複合体形成する、抗ＣＤ２８ｍＡｂおよびＨＬＡ－Ａ^＊０２で被覆された、人工ＡＰＣを用いてプライミングされた。３サイクルの刺激後、ペプチド反応性細胞の検出が、Ａ^＊０２／配列番号１７（Ａ）、Ａ^＊０２／配列番号２８（Ｂ）またはＡ^＊０２／配列番号２９（Ｃ）を用いた２Ｄ多量体染色によって実施された。右パネル（Ａ、Ｂ、およびＣ）は、無関係のＡ^＊０２／ペプチド複合体で刺激された細胞の対照染色を示す。生存一重細胞は、ＣＤ８＋リンパ球についてゲートされた。ブーリアンゲートは、異なるペプチドに対して特異的な多量体によって検出された、擬陽性事象の排除を助けた。ＣＤ８＋リンパ球の中の特異的多量体＋細胞の頻度が示される。

【図4-2】同上

【実施例0401】

実施例１
細胞表面に提示される腫瘍関連ペプチドの同定および定量化
組織サンプル
患者の腫瘍組織は、Ａｓｔｅｒａｎｄ（米国ミシガン州デトロイト；英国ハートフォードシャー州ロイストン）；Ｇｅｎｅｔｉｃｉｓｔ Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州グレンデール）から入手された。正常組織は、Ａｓｔｅｒａｎｄ（米国ミシガン州デトロイト；英国ハートフォードシャー州ロイストン）；Ｂｉｏ－Ｏｐｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州ブレア）；ＢｉｏＳｅｒｖｅ（米国メリーランド州ベルツビル）；Ｃａｐｉｔａｌ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．（米国メリーランド州ロックビル）；Ｇｅｎｅｔｉｃｉｓｔ Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州グレンデール）；京都府立医科大学（ＫＰＵＭ）（日本国京都）；ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州カルバーシティ）；Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ（英国グラスゴー）；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｇｅｎｅｖａ（スイス国ジュネーブ）；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（独国ハイデルベルク）；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｔｕｂｉｎｇｅｎ（独国チュービンゲン）から入手された。全ての患者の告知に基づく同意書は、外科手術または検死解剖前に得られた。組織は切除の直後に衝撃凍結されて、ＴＵＭＡＰの単離まで－７０℃未満で保存された。

【0402】

組織サンプルからのＨＬＡペプチドの単離
衝撃凍結組織サンプルからのＨＬＡペプチド貯留は、わずかに修正されたプロトコル（Ｆａｌｋ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｓｅｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９）に従って、ＨＬＡ－Ａ^＊０２－特異的抗体ＢＢ７．２、ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ特異的抗体Ｗ６／３２、ＣＮＢｒ活性化セファロース、酸処理、および限外濾過を使用して、免疫沈殿によって固形組織から得られた。

【0403】

質量分析
得られたＨＬＡペプチド貯留は、逆相クロマトグラフィー（ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬ Ｃ ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｔｅｒｓ）によってそれらの疎水性に従って分離し、ＥＳＩ源を装着したＬＴＱ－ｖｅｌｏｓおよびｆｕｓｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ質量分光計（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）内で溶出ペプチドを分析した。ペプチド貯留は、毎分４００ｎＬの流速を適用して、１．７μｍ Ｃ１８逆相材料（Ｗａｔｅｒｓ）で充填された分析用融合シリカマイクロキャピラリーカラム（７５μｍ内径×２５０ｍｍ）上に直接挿入した。引き続いて、毎分３００ｎＬの流速で１０％から３３％へのＢの二段階１８０分間二成分勾配を用いて、ペプチドを分離した。勾配は、溶媒Ａ（水中の０．１％ギ酸）および溶媒Ｂ（アセトニトリル中の０．１％ギ酸）から構成された。ｎａｎｏＥＳＩ源への導入には、金被覆ガラス毛管（ＰｉｃｏＴｉｐ，Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）を使用した。ＬＴＱ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分光計は、ＴＯＰ５ストラテジーを使用してデータ依存モードで操作した。手短に述べると、Ｏｒｂｉｔｒａｐ（Ｒ＝３００００）内の高質量精度の完全スキャンでスキャンサイクルを開始し、これもまたＯｒｂｉｔｒａｐ（Ｒ＝７５００）内の５種の最も豊富な前駆イオンのＭＳ／ＭＳスキャンがそれに続き、以前選択されたイオンは動的に排除された。タンデム質量スペクトルは、ＳＥＱＵＥＳＴおよび追加的な手動調節によって解釈した。同定されたペプチド配列は、生成された天然ペプチド断片化パターンと、配列が同一の合成参照ペプチドの断片化パターンとの比較によって確認した。

【0404】

イオン計数によって、すなわちＬＣ－ＭＳ特性の抽出と解析によって、無標識相対ＬＣ－ＭＳ定量化を実施した（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７）。この方法は、ペプチドのＬＣ－ＭＳシグナル面積がサンプル中のその存在量と相関すると仮定する。抽出された特性は、電荷状態デコンボリューションと滞留時間アライメントによってさらに処理した（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｓｔｕｒｍ ｅｔ ａｌ．，２００８）。最終的に、全てのＬＣ－ＭＳ特性を配列同定結果と相互参照して、異なるサンプルの定量的データと、組織からペプチドへの提示プロファイルとを組み合わせた。定量的データは、技術的および生物学的反復試験内の変動を考慮した中心傾向に従って、二段法で正規化された。このようにして、それぞれの同定されたペプチドが定量的データに関連付けられ得て、サンプルと組織との間の相対定量化ができるようになる。さらに、ペプチド候補について得られた全ての定量的データを手動で検査し、データ整合性を保証して自動解析の確度を確認した。各ペプチドについて提示プロファイルを計算し、平均サンプル提示ならびに反復試験変動を示した。プロファイルは、頭頸部扁上皮がんサンプルを正常組織サンプルのベースラインに並置する。例示的過剰提示ペプチドの提示プロファイルは、図１に示される。代表的ペプチドの提示スコアは、表８に示される。

【0405】

表8：提示スコア
表は、正常組織パネルと比較して腫瘍上で非常に高度に過剰提示され(+++)、正常組織パネルと比較して腫瘍上で高度に過剰提示され(++)、正常組織パネルと比較して腫瘍上で過剰提示される(+)、ペプチドを列挙する。腫瘍との比較に適切であると見なされた正常組織のパネルは、脂肪組織、副腎、胆管、血液細胞、血管、骨髄、脳、食道、眼、胆嚢、頭頸部、心臓、腎臓、大腸、肝臓、肺、リンパ節、神経、膵臓、副甲状腺、腹膜、下垂体、胸膜、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、胸腺、甲状腺、気管、尿管、膀胱からなった。

【表8-1】

【表8-2】

【0406】

実施例２
本発明のペプチドをコードする遺伝子発現プロファイリング
正常細胞と比較した腫瘍細胞上のペプチドの過剰提示または特異的提示は、免疫療法におけるその有用性にとって十分であり、いくつかのペプチドは、それらの起源タンパク質が正常組織にもまた存在するにもかかわらず、腫瘍特異的である。それでもなお、ｍＲＮＡ発現プロファイリングは、免疫療法のためのペプチド標的の選択において、安全性のレベルを高めることができる。特に、アフィニティ成熟ＴＣＲなどの安全性リスクが高い治療選択肢では、理想的な標的ペプチドは、腫瘍に特有で正常組織上には見いだされないタンパク質に由来する。

【0407】

ＲＮＡ起源および調製
外科的に除去された組織標本は、告知に基づく同意書が各患者から入手された後に、上述の通り提供された（実施例１を参照されたい）。腫瘍組織標本が手術直後にスナップ凍結され、その後、液体窒素下で乳鉢と乳棒を用いて均質化された。ＴＲＩ試薬（独国ダルムシュタットのＡｍｂｉｏｎ）を使用して、これらのサンプルから全ＲＮＡが調製され、ＲＮｅａｓｙ（独国ヒルデンのＱＩＡＧＥＮ）による精製がそれに続き；どちらの方法も製造業者のプロトコルに従って実施された。

【0408】

ＲＮＡＳｅｑ実験のための健常ヒト組織からの全ＲＮＡは、Ａｓｔｅｒａｎｄ（デトロイト、ＭＩ、ＵＳＡ＆ロイストン、ハートフォードシャー州、ＵＫ）；ＢｉｏＣａｔ ＧｍｂＨ（独国ハイデルベルク）；ＢｉｏＳｅｒｖｅ（米国メリーランド州ベルツビル）；Ｃａｐｉｔａｌ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．（米国メリーランド州ロックビル）；Ｇｅｎｅｔｉｃｉｓｔ Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州グレンデール）；Ｉｓｔｉｔｕｔｏ Ｎａｚｉｏｎａｌｅ Ｔｕｍｏｒｉ”Ｐａｓｃａｌｅ”（イタリア国ナポリ）；ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州カルバーシティ）；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（独国ハイデルベルク）から入手された。ＲＮＡＳｅｑ実験のための腫瘍組織からの全ＲＮＡは、Ａｓｔｅｒａｎｄ（米国ミシガン州デトロイト；英国ハートフォードシャー州ロイストン）；ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州カルバーシティ）から入手された。

【0409】

全てのＲＮＡサンプルの品質および量は、ＲＮＡ ６０００ Ｐｉｃｏ ＬａｂＣｈｉｐキット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（独国バルトブロンのＡｇｉｌｅｎｔ）上で評価した。

【0410】

ＲＮＡＳｅｑ実験
腫瘍および正常組織ＲＮＡサンプルの遺伝子発現解析は、ＣｅＧａＴ（独国チュービンゲン）によって、次世代配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）によって実施された。簡単に述べると、配列決定ライブラリーは、ＲＮＡ断片化、ｃＤＮＡ転換、および配列決定アダプターの付加を含む、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ｖ４試薬キットを使用して、販売業者（米国カリフォルニア州サンディエゴのＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．）のプロトコルに従って作成される。複数のサンプルに由来するライブラリーは等モル混合され、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００配列決定装置上で、製造会社の使用説明書に従って配列決定され、５０ｂｐのシングルエンドリードが生成される。処理された読み取りは、ＳＴＡＲソフトウェアを使用して、ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８）にマッピングされる。発現データは、ｅｎｓｅｍｂｌ配列データベース（Ｅｎｓｅｍｂｌ７７）の注釈に基づいて、ＲＰＫＭ（１００万個のマッピングされた読み取り当たりキロベース当たり読み取り、ソフトウェアＣｕｆｆｌｉｎｋｓによって作成される）として転写物レベルで、そしてエクソンレベルで（全読み取り、ソフトウェアＢｅｄｔｏｏｌｓによって作成される）提供される。エクソン読み取りは、エクソン長さおよびアライメントサイズについて正規化されて、ＲＰＫＭ値が得られる。

【0411】

頭頸部扁上皮がんにおいて高度に過剰発現されるまたは排他的に発現される本発明の起源遺伝子の例示的発現プロファイルは、図２に示される。さらなる例示的遺伝子の発現スコアは、表９に示される。

【0412】

表 9：発現スコア。表は、正常組織パネルと比較して腫瘍において非常に高度に過剰発現され(+++)、正常組織パネルと比較して腫瘍において高度に過剰発現され(++)、正常組織パネルと比較して腫瘍において過剰発現される(+)、遺伝子に由来するペプチドを列挙する。スコアのベースラインは、脂肪組織、副腎、動脈、胆管、血液細胞、骨髄、脳、軟骨、結腸、食道、眼、胆嚢、頭頸部および唾液腺、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、膵臓、副甲状腺、末梢神経、腹膜、下垂体、胸膜、直腸、骨格筋、皮膚、小腸、脾臓、胃、甲状腺、気管、尿管、膀胱、および 静脈 の関連正常組織の測定値から計算された。同一組織型のいくつかのサンプル発現データが利用できる場合、全ての各サンプルの算術平均が、計算のために使用された。

【表9】

【0413】

実施例３
ＭＨＣクラスＩ提示ペプチドの生体外免疫原性
本発明のＴＵＭＡＰの免疫原性に関する情報を得るために、本発明者らは、ペプチド／ＭＨＣ複合体および抗ＣＤ２８抗体を負荷した人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）によるＣＤ８＋Ｔ細胞の反復刺激に基づく、生体外Ｔ細胞プライミングアッセイを用いて研究を実施した。このようにして、本発明者らは、本発明のＨＬＡ－Ａ^＊０２０１拘束性ＴＵＭＡＰの免疫原性を示し得て、これらのペプチドが、それに対するＣＤ８＋前駆Ｔ細胞がヒトに存在する、Ｔ細胞エピトープであることを実証した（表１０）。

【0414】

ＣＤ８＋Ｔ細胞の生体外プライミング
ペプチドＭＨＣ複合体（ｐＭＨＣ）および抗ＣＤ２８抗体を負荷した、人工抗原提示細胞による生体外刺激を実施するために、本発明者らは、最初に、告知に基づく同意後に、独国のＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｃｌｉｎｉｃｓ Ｍａｎｎｈｅｉｍから得られた健常ドナーのＣＤ８ミクロビーズ（独国ベルギッシュ・グラートバッハのＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用した正の選択を通じて、新鮮ＨＬＡ－Ａ^＊０２白血球除去生成物からＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。

【0415】

ＰＢＭＣおよび単離ＣＤ８＋リンパ球またはＰＢＭＣは、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清（独国アイデンバッハのＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（独国ケルンのＣａｍｂｒｅｘ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（独国オーバードルラのＣＣ Ｐｒｏ）、２０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ）を添加した、ＲＰＭＩ－Ｇｌｕｔａｍａｘ（独国カールスルーエのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなるＴ細胞培地（ＴＣＭ）中で、使用時まで培養した。２．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（独国ハイデルベルクのＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）および１０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２（独国ニュルンベルクのＮｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ）もまた、この段階でＴＣＭに添加した。

【0416】

ｐＭＨＣ／抗ＣＤ２８被覆ビーズの生成、Ｔ細胞刺激、および読み取りは、高度に定義された生体外システム内で、刺激条件当たり４種の異なるｐＭＨＣ分子と、読み取り条件当たり８種の異なるｐＭＨＣ分子を使用して実施した。

【0417】

製造会社（独国ボンのＰｅｒｂｉｏ）が推奨する通りにスルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドビオチンを使用して、精製共刺激マウスＩｇＧ２ａ抗ヒトＣＤ２８ Ａｂ９．３（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８７）を化学的にビオチン化した。使用されたビーズは、直径５．６μｍのストレプトアビジン被覆ポリスチレン粒子（米国イリノイ州のＢａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）であった。

【0418】

陽性および陰性対照刺激のために使用されたｐＭＨＣは、それぞれ、Ａ^＊０２０１／ＭＬＡ－００１（修飾Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１に由来するペプチドＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号１５７））およびＡ^＊０２０１／ＤＤＸ５－００１（ＤＤＸ５に由来するＹＬＬＰＡＩＶＨＩ、配列番号１５８）であった。

【0419】

４×１２．５ｎｇの異なるビオチンｐＭＨＣの存在下で、８００，０００個のビーズ／２００μｌを９６ウェルプレート内で被覆し、洗浄して、引き続いて２００μｌの容量中で６００ｎｇのビオチン抗ＣＤ２８を添加した。５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を添加した２００μｌのＴＣＭ中で、１×１０６のＣＤ８＋Ｔ細胞を２ｘ１０^５個の洗浄被覆ビーズと、３７℃で３日間にわたり共インキュベートすることで、９６ウェルプレート内で刺激を開始した。次に８０Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を添加した新鮮ＴＣＭで培地の半分を交換し、３７℃で４日間にわたり培養を継続した。この刺激サイクルを合計３回実施した。条件当たり８種の異なるｐＭＨＣ分子を使用したｐＭＨＣ多量体読み取りでは、５種の異なる蛍光色素への共役を包含するわずかな修正を加えて、以前記載されたような（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）二次元コンビナトリアルコーディングアプローチを使用した。最後に、Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ近赤外染料（独国カールスルーエのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ８－ＦＩＴＣ抗体クローンＳＫ１（独国ハイデルベルクのＢＤ）、および蛍光性ｐＭＨＣ多量体による細胞の染色によって多量体解析を実施した。解析では、適切なレーザーおよびフィルターを装着したＢＤ ＬＳＲＩＩ ＳＯＲＰ血球計数器を使用した。ペプチド特異的細胞を全ＣＤ８＋細胞の百分率として計算した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（米国オレゴン州のＴｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用して、多量体解析の評価を実施した。陰性対照刺激と比較することで、特異的多量体＋ＣＤ８＋リンパ球の生体外初回刺激を検出した。１人の健常ドナーの少なくとも１つの評価可能生体外刺激ウェルが、生体外刺激後に、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞株を含有することが判明したら、所与の抗原の免疫原性が検出された（すなわちこのウェルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞内に少なくとも１％の特異的多量体＋を含有し、特異的多量体＋細胞の百分率は、陰性対照刺激の中央値の少なくとも１０倍であった）。

【0420】

頭頸部扁上皮がんペプチドに対する生体外免疫原性
ＨＬＡクラスＩペプチドを試験するために、ペプチド特異的Ｔ細胞株の生成によって生体外免疫原性が実証され得た。本発明の２種のペプチドの、ＴＵＭＡＰ特異的多量体染色後の例示的フローサイトメトリー結果は、対応する陰性対照と共に図３に示される。本発明の３種のペプチドの、ＴＵＭＡＰ特異的多量体染色後の追加的な例示的フローサイトメトリー結果は、対応する陰性対照と共に図４に示される。本発明からの１７種のペプチドの結果は、表１０Ａに要約される。本発明からの１７種のペプチドのさらなる結果は、表１０Ｂに要約される。

【0421】

表10A：本発明のHLAクラスIペプチドの生体外免疫原性
出願人によって実施された本発明のペプチドの生体外免疫原性実験の例示的結果。<20 % = +; 20 % - 49 % = ++; 50 % - 69 %= +++; >= 70 % = ++++

【表10A】

【0422】

表10B：本発明のHLAクラスIペプチドの生体外免疫原性
出願人によって実施された、本発明のHLA-A*02拘束性ペプチドについての生体外免疫原性実験の代表的結果である。生体外免疫原性実験の結果が示される。陽性ウェルおよびドナーの百分率(評価可能内の)は、示されるように要約される <20 % = +; 20 % - 49 % = ++; 50 % - 69 %= +++; >= 70 %= ++++

【表10B】

【0423】

実施例４
ペプチドの合成
Ｆｍｏｃストラテジーを使用した標準的な十分に確立された固相ペプチド合成を使用して、全てのペプチドを合成した。個々のペプチドのアイデンティティーおよび純度は、質量分析および分析用ＲＰ－ＨＰＬＣによって判定された。ペプチドは、純度＞５０％の白色から灰白色の凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｓ）（トリフルオロ酢酸塩）として得られた。全てのＴＵＭＡＰは、好ましくはトリフルオロ酢酸塩または酢酸塩として投与され、その他の塩形態もまた可能である。

【0424】

実施例５
ＭＨＣ結合アッセイ
本発明によるＴ細胞ベースの治療法のための候補ペプチドを、それらのＭＨＣ結合能力（親和性）についてさらに試験した。個々のペプチド－ＭＨＣ複合体は、ＵＶリガンド交換によって生成され、ＵＶ感受性ペプチドはＵＶ照射時に切断されて、分析される目的ペプチドで交換された。ペプチド受容性ＭＨＣ分子と効果的に結合して安定化し得るペプチド候補のみが、ＭＨＣ複合体の分離を防止する。交換反応の収率を判定するために、安定化ＭＨＣ複合体の軽鎖（β２ｍ）の検出に基づくＥＬＩＳＡを実施した。アッセイは、Ｒｏｄｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．（Ｒｏｄｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，２００６）に一般的に記載されるようにして実施した。

【0425】

９６ウェルＭＡＸＩＳｏｒｐプレート（ＮＵＮＣ）をＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌストレプトアビジンにより室温で一晩被覆して４回洗浄し、ブロック緩衝液を含有する２％ＢＳＡ中で３７℃で１時間ブロックした。再折りたたみされたＨＬＡ－Ａ^＊０２０１０２：０１／ＭＬＡ－００１単量体が、１５～５００ｎｇ／ｍｌの範囲をカバーする標準物質の役割を果たした。ＵＶ交換反応のペプチド－ＭＨＣ単量体をブロック緩衝液で１００倍に希釈した。サンプルを３７℃で１時間インキュベートして４回洗浄し、２μｇ／ｍｌのＨＲＰ共役結合抗β２ｍと共に３７℃で１時間インキュベートして再度洗浄し、ＮＨ_２ＳＯ_４で停止させたＴＭＢ溶液で検出した。吸収は、４５０ｎｍで測定された。抗体またはそれらのフラグメント、および／またはＴ細胞受容体またはそれらのフラグメントの生成および製造のためには、高い交換収率（好ましくは５０％より高い、最も好ましくは７５％より高い）を示す候補ペプチドが、ＭＨＣ分子に対する十分な結合活性を示してＭＨＣ複合体の分離を防止することから、一般に好ましい。

【0426】

表11：MHCクラスI結合スコア。HLAクラスI拘束性ペプチドとHLA-A*02:01との結合は、ペプチド交換収率によって変動した： >10% = +; >20% = ++; >50 = +++; > 75% = ++++

【表11-1】

【表11-2】

【表11-3】

【0427】

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【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図1I】

【図1J】

【図1K】

【図1L】

【図1M】

【図1N】

【図1O】

【図1P】

【図1Q】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【配列表】

2022033740000001.app

【手続補正書】

【提出日】2021-11-04

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

配列番号１、配列番号３、配列番号２、及び配列番号４～９１のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、３０アミノ酸までの長さを有するペプチド、またはその薬学的に許容可能な塩。

【請求項2】

主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と結合した際に、請求項１に記載のペプチドを特異的に認識する抗体、又は、前記抗体であって可溶性若しくは膜結合性の抗体。

【請求項3】

ＨＬＡリガンドと反応するＴ細胞受容体であって、前記リガンドが配列番号１、配列番号３、配列番号２、及び配列番号４～９１のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する、若しくは前記アミノ酸配列からなる、Ｔ細胞受容体、又は、前記Ｔ細胞受容体であって、可溶性若しくは膜結合性のＴ細胞受容体。

【請求項4】

前記Ｔ細胞受容体が可溶性分子として提供される請求項３に記載のＴ細胞受容体、前記Ｔ細胞受容体であって、さらなるエフェクター機能を保有するＴ細胞受容体、又は前記Ｔ細胞受容体であって、前記エフェクター機能が免疫刺激ドメイン若しくは毒素であるＴ細胞受容体。

【請求項5】

請求項１に記載のペプチドを含んでなる組換え宿主細胞、又は、前記組換え宿主細胞であって、抗原提示細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、及びＮＫ細胞からなる群から選ばれるいずれかである組換え宿主細胞。

【請求項6】

医療で使用するための、請求項１に記載のペプチド若しくはその変異型、請求項２に記載の抗体、請求項３若しくは４に記載のＴ細胞受容体、又は請求項５に記載の組換え宿主細胞。

【請求項7】

核酸又は発現ベクターを発現する請求項５に記載の組換え宿主細胞を培養するステップと、前記ペプチド又はその変異型、前記抗体又はＴ細胞受容体を、前記宿主細胞又はその培養液から単離するステップとを含んでなる、請求項１に記載のペプチド若しくはその変異型、請求項２に記載の抗体、又は請求項３若しくは４に記載のＴ細胞受容体を製造する方法。

【請求項8】

Ｔ細胞を適切な抗原提示細胞又は抗原提示細胞を模倣する人工コンストラクトの表面に発現される抗原負荷ヒトクラスＩまたはＩＩ ＭＨＣ分子と生体外で接触させるステップを含んでなり、前記抗原が請求項１に記載のペプチドである、活性化Ｔリンパ球を製造するインビトロ法。

【請求項9】

請求項１に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを提示する細胞を選択的に認識する活性化Ｔリンパ球。

【請求項10】

ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号２、及び配列番号４～９１のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むペプチド；
ｂ）ａ）に記載のペプチドおよび／またはペプチドＭＨＣ複合体と反応性のＴ細胞受容体；
ｃ）ａ）またはｂ）をコードする核酸、または前記核酸を含んでなる発現ベクター；
ｄ）ｃ）の発現ベクターを含んでなる宿主細胞；
ｅ）Ｔ細胞を、抗原特異的様式で前記Ｔ細胞を活性化するのに十分な時間にわたり、適切な抗原提示細胞の表面に発現されるａ）に記載のペプチドと生体外で接触させるステップを含んでなる方法、ならびにこれらの活性化Ｔ細胞を自己または他の患者に移入する方法によって得られる、活性化Ｔリンパ球；
ｆ）ａ）に記載のペプチドおよび／またはペプチド－ＭＨＣ複合体および／またはａ）に記載のペプチドを提示する細胞と反応性である、抗体、または可溶性Ｔ細胞受容体；
ｇ）ａ）に記載の、コンジュゲートされ、または標識されたペプチド；
からなる群から選択される、少なくとも１つの活性成分を含んでなる医薬組成物、又は前記医薬組成物であって、薬学的に許容可能な担体、薬学的に許容可能な賦形剤、及び／若しくは安定剤を含んでなる医薬組成物。

【請求項11】

配列番号１、配列番号３、配列番号２、及び配列番号４～９１のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むペプチドがそれに由来するタンパク質の過剰発現を示す、頭頸部扁上皮がん、急性骨髄性白血病、乳がん、胆管がん、脳がん、慢性リンパ球性白血病、結腸 直腸がん、食道がん、胆嚢がん、胃がん、肝細胞がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞、小細胞肺がん、膀胱がん、子宮がん、およびその他の腫瘍の群から選択されるがんの治療用の薬剤を製造するための、請求項１に記載のペプチド、請求項２に記載の抗体、請求項３若しくは４に記載のＴ細胞受容体、又は請求項９に記載の活性化Ｔリンパ球の使用。

【請求項12】

ａ）溶液中のまたは凍結乾燥形態の、請求項１に記載のペプチド若しくは変異型、請求項２に記載の抗体、請求項３若しくは４に記載のＴ細胞受容体、又は請求項９に記載の活性化Ｔリンパ球を含んでなる医薬組成物を含んでなる容器；
を含み、さらに、
ｂ）凍結乾燥製剤のための希釈剤または再構成溶液を含有する第２の容器；
ｃ）配列番号１～配列番号９１から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとももう１つのペプチド；
ｄ）（ｉ）溶液の使用のための取扱説明書、又は（ｉｉ）凍結乾燥製剤の再構成及び／若しくは使用のための取扱説明書；
のいずれかを含んでなるキット。