特開 2022-38293 冷凍幹細胞改質方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022038293

(43)【公開日】2022-03-10

(54)【発明の名称】冷凍幹細胞改質方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0775 20100101AFI20220303BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20220303BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0775

C12M1/00 A

【審査請求】未請求

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2020142717

(22)【出願日】2020-08-26

(71)【出願人】

【識別番号】519092200

【氏名又は名称】グラドコフ・アレクセイ

(71)【出願人】

【識別番号】519092211

【氏名又は名称】グラドコワ・ニナ

(74)【代理人】

【識別番号】100108442

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 義孝

(72)【発明者】

【氏名】グラドコフ・アレクセイ

(72)【発明者】

【氏名】グラドコワ・ニナ

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA08

4B029BB11

4B029CC01

4B029GA02

4B065AA93X

4B065BC03

4B065BD09

4B065BD15

4B065BD50

4B065CA44

(57)【要約】      （修正有）

【課題】冷凍保存された間葉系幹細胞を、十分な活性を有する活性化間葉系幹細胞に改質することができる、冷凍幹細胞改質方法の提供。
【解決手段】間葉系幹細胞を凍結保護剤とともに所定温度で冷凍保存し、冷凍保存した間葉系幹細胞を使用する場合、冷凍保存容器４３を３５～３７℃の温水中に２～３分浸水させて間葉系幹細胞３５を２～３℃の温度に解凍し、解凍された間葉系幹細胞及び凍結保護剤４４を収容した冷凍保存容器に洗浄液４６を注入し、洗浄液によって間葉系幹細胞から凍結保護剤を除去するとともに、凍結保護剤を除去した後の間葉系幹細胞、凍結保護剤、洗浄液を層状に遠心分離し、遠心分離した後の冷凍保存容器の最下層に位置する間葉系幹細胞を抽出し、抽出した間葉系幹細胞を収容した第１培養容器に培養液を注入し、間葉系幹細胞を第１培養容器において３６～３７℃で２４時間培養し、間葉系幹細胞を活性化させて活性化間葉系幹細胞に改質させる。
【選択図】図１２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

所定温度に冷凍された間葉系幹細胞を活性化させて活性化間葉系幹細胞に改質させる冷凍幹細胞改質方法において、
前記冷凍幹細胞改質方法が、ドナーから採取した骨髄液を培養することから作られた間葉系幹細胞を所定容積の冷凍保存容器に収容するとともに、前記間葉系幹細胞を収容した前記冷凍保存容器に凍結保護剤を注入し、前記冷凍保存容器に収容した間葉系幹細胞を使用するまでの間、該冷凍保存容器に収容した該間葉系幹細胞を前記凍結保護剤とともに所定温度で冷凍保存する冷凍保存工程と、
前記冷凍保存工程によって冷凍保存した前記間葉系幹細胞を使用する場合、冷凍保存された前記間葉系幹細胞及び前記凍結保護剤を収容した前記冷凍保存容器を３５～３７℃に保持された温水中に２～３分浸水させて該間葉系幹細胞を２～３℃の温度に解凍する幹細胞解凍工程と、
前記幹細胞解凍工程によって冷凍状態から解凍された前記間葉系幹細胞及び前記凍結保護剤を収容した前記冷凍保存容器に洗浄液を注入し、前記洗浄液を注入した前記冷凍保存容器を攪拌して該洗浄液によって該冷凍保存容器内の間葉系幹細胞から凍結保護剤を除去する撹拌除去工程と、
前記撹拌除去工程によって間葉系幹細胞から凍結保護剤を除去した後の前記冷凍保存容器を遠心分離器に設置し、前記冷凍保存容器内の前記間葉系幹細胞、前記凍結保護剤、前記洗浄液を層状に遠心分離し、前記遠心分離した後の前記冷凍保存容器の最下層に位置する間葉系幹細胞を抽出する間葉系幹細胞抽出工程と、
前記間葉系幹細胞抽出工程によって抽出した間葉系幹細胞を所定容量かつ所定面積の底面を有する第１培養容器に収容するとともに、前記間葉系幹細胞を収容した前記第１培養容器に所定の培養液を注入し、前記間葉系幹細胞を前記第１培養容器において３６～３７℃で２４時間培養し、該第１培養容器内の該間葉系幹細胞を活性化させて前記活性化間葉系幹細胞に改質させる幹細胞活性化工程とを有することを特徴とする冷凍幹細胞改質方法。

【請求項2】

前記冷凍幹細胞改質方法が、前記活性化させた活性化間葉系幹細胞を前記第１培養容器から抽出した後、該活性化間葉系幹細胞を抽出後１８～２０時間以内に使用する場合、抽出した活性化間葉系幹細胞を２０～２１℃に保持した状態で前記１８～２０時間以内に該活性化間葉系幹細胞の使用箇所まで搬送する幹細胞搬送工程を含む請求項１に記載の冷凍幹細胞改質方法。

【請求項3】

前記幹細胞活性化工程が、前記ドナーから採取した骨髄液を培養する培養過程において生成された培養生成液を前記第１培養容器に注入し、前記培養液及び前記培養生成液を利用して前記間葉系幹細胞を前記第１培養容器において３５～３７℃の温度で２４時間培養する請求項１又は請求項２に記載の冷凍幹細胞改質方法。

【請求項4】

前記幹細胞活性化工程が、前記第１培養容器を２～５度の角度に傾斜させた状態で該第１培養容器を３５～３７℃の温度で２４時間静的に放置する請求項１ないし請求項３いずれかに記載の冷凍幹細胞改質方法。

【請求項5】

前記幹細胞活性化工程が、前記第１培養容器を一方向へ２～５度の角度に傾斜させた状態で該第１培養容器を３５～３７℃の温度で１２時間静的に放置し、前記一方向へ傾斜させた前記第１培養容器を該一方向と反対の他方向へ２～５度の角度に傾斜させた状態で該第１培養容器を３５～３７℃の温度で１２時間静的に放置する請求項４に記載の冷凍幹細胞改質方法。

【請求項6】

前記凍結保護剤が、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)とエチレングリコール(ＥＧ)とのうちの少なくとも該ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)であり、前記洗浄液が、ダルベッコりん酸緩衝生理食塩水（Ｄ－ＰＢＳ）又はりん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である請求項１ないし請求項５いずれかに記載の冷凍幹細胞改質方法。

【請求項7】

前記間葉系幹細胞が、前記ドナーから採取した骨髄液を層状に分離し、層状に分離させた前記骨髄液のうちの中間層に位置する中間層骨髄液を抽出し、所定容量かつ所定面積の底面を有する第２培養容器に前記中間層骨髄液と所定の培養液とを注入して該中間層骨髄液に含まれる第１間葉系幹細胞を前記第２培養容器の底面に定着させる幹細胞第１定着工程と、前記幹細胞第１定着工程によって前記第１間葉系幹細胞を前記第２培養容器の底面に定着させた後、前記第２培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を該第２培養容器に注入して前記第１間葉系幹細胞を培養し、前記第２培養容器の底面面積に対する前記第１間葉系幹細胞の総平面面積が第１目標割合に達するまで該第１間葉系幹細胞を増殖させる幹細胞第１培養工程と、前記幹細胞第１培養工程によって増殖させた前記第１間葉系幹細胞及び前記培養液を収容した第２培養容器を遠心分離器に設置し、前記第２培養容器内の前記第１間葉系幹細胞、前記培養液を層状に遠心分離し、前記遠心分離した後の前記第２培養容器の最下層に位置する第２間葉系幹細胞を抽出する第２間葉系幹細胞第１抽出工程と、所定容量かつ所定面積の底面を有して前記第２培養容器よりも大きい容量の第３培養容器に前記第２間葉系幹細胞第１抽出工程によって抽出した第２間葉系幹細胞を収容しつつ、前記第３培養容器にあらたな培養液を注入し、前記第２間葉系幹細胞を前記第３培養容器の底面に定着させる幹細胞第２定着工程と、前記幹細胞第２定着工程によって前記第２間葉系幹細胞を前記第３培養容器の底面に定着させた後、前記第３培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を該第３培養容器に注入して前記第２間葉系幹細胞を培養し、前記第３培養容器の底面面積に対する前記第２間葉系幹細胞の総平面面積が第２目標割合に達するまで該第２幹細胞を増殖させる幹細胞第２培養工程と、前記幹細胞第２培養工程によって培養された前記第２間葉系幹細胞を含む前記第３培養容器を遠心分離器に設置し、前記第３培養容器内の前記第２間葉系幹細胞、前記培養液を層状に遠心分離し、前記遠心分離した後の前記第３培養容器の最下層に位置する第２間葉系幹細胞を抽出する第２間葉系幹細胞第２抽出工程とを有する間葉系幹細胞培養方法によって作られている請求項１ないし請求項６いずれかに記載の冷凍幹細胞改質方法。

【請求項8】

前記冷凍保存工程が、前記第２間葉系幹細胞第２抽出工程によって抽出された直後の前記第２間葉系幹細胞を前記冷凍保存容器に収容し、該冷凍保存容器に収容した該間葉系幹細胞を前記凍結保護剤とともに直ちに冷凍保存する請求項７に記載の冷凍幹細胞改質方法。

【請求項9】

前記培養生成液が、前記第２培養容器又は前記第３培養容器から培養後の間葉系幹細胞を抽出した後に残った培養液であり、前記間葉系幹細胞の培養過程において該間葉系幹細胞から分泌された所定の代謝物質を含む請求項３ないし請求項８いずれかに記載の冷凍幹細胞改質方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、所定温度に冷凍された間葉系幹細胞を活性化させて活性化間葉系幹細胞に改質させる冷凍幹細胞改質方法に関する。

【背景技術】

【0002】

プロナーゼ溶液を用いて幹細胞を剥離する剥離工程と、剥離した幹細胞を幹細胞保存媒体中で緩慢凍結させる凍結工程とを備え、幹細胞保存媒体が、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)とエチレングリコール(ＥＧ)を含有する媒体、或いは、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)と、培地（culture medium）もしくはアルブミン溶液とを含む媒体である幹細胞保存方法が開示されている（特許文献１参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】国際公開ＷＯ２０１３／１８７０７７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

各種の幹細胞は、各種の疾患（心血管疾患や中枢神経系疾患等）の治療や再生医療における再生、美容等の非治療的用途に利用される。培養した幹細胞を冷凍保存する場合、所定の収容容器に幹細胞を収容しつつ、その収容容器にジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)やヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)、エチレングリコール(ＥＧ)等の冷凍時の細胞破壊を防ぐ凍結保護剤が注入される。冷凍保存された冷凍幹細胞を使用する場合、その冷凍幹細胞を解凍する必要があるが、解凍時に凍結保護剤が除去されることはなく、凍結保護剤とともに解凍された幹細胞がそのまま使用される。

【0005】

冷凍幹細胞を解凍する際に凍結保護剤を除去しない場合、冷凍幹細胞をのうちの約５０％以上が死滅するとともに、幹細胞を十分に活性化させることができない。生存する幹細胞が減少し、幹細胞を十分に活性化させることができない場合、幹細胞による各種の疾患に対する治療の効果や再生医療における再生の効果、美容等の非治療的用途における効果が低下し、所望の効果が得られない場合がある。又、凍結保護剤を含有した状態の幹細胞を人体に投与する場合、凍結保護剤による悪影響が懸念される。

【0006】

本発明の目的は、冷凍保存された間葉系幹細胞を解凍する場合、凍結保護剤を除去しつつ、大部分の間葉系幹細胞を生存させることができ、冷凍保存された間葉系幹細胞を十分な活性を有する活性化間葉系幹細胞に改質することができる冷凍幹細胞改質方法を提供することにある。本発明の他の目的は、冷凍保存された間葉系幹細胞を解凍する際に、各種の疾患に対する治療や再生医療における再生、美容等の非治療的用途における十分かつ高い効果を備え、所望の効果を得ることが可能な間葉系幹細胞を作ることができる冷凍幹細胞改質方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

前記課題を解決するための本発明の前提は、所定温度に冷凍された間葉系幹細胞を活性化させて活性化間葉系幹細胞に改質させる冷凍幹細胞改質方法である。

【0008】

前記前提における本発明の特徴は、冷凍幹細胞改質方法が、ドナーから採取した骨髄液を培養することから作られた間葉系幹細胞を所定容積の冷凍保存容器に収容するとともに、間葉系幹細胞を収容した冷凍保存容器に凍結保護剤を注入し、冷凍保存容器に収容した間葉系幹細胞を使用するまでの間、冷凍保存容器に収容した間葉系幹細胞を凍結保護剤とともに所定温度で冷凍保存する冷凍保存工程と、冷凍保存工程によって冷凍保存した間葉系幹細胞を使用する場合、冷凍保存された間葉系幹細胞及び凍結保護剤を収容した冷凍保存容器を３５～３７℃に保持された温水中に２～３分浸水させて間葉系幹細胞を２～３℃の温度に解凍する幹細胞解凍工程と、幹細胞解凍工程によって冷凍状態から解凍された間葉系幹細胞及び凍結保護剤を収容した冷凍保存容器に洗浄液を注入し、洗浄液を注入した冷凍保存容器を攪拌して洗浄液によって冷凍保存容器内の間葉系幹細胞から凍結保護剤を除去する撹拌除去工程と、撹拌除去工程によって間葉系幹細胞から凍結保護剤を除去した後の冷凍保存容器を遠心分離器に設置し、冷凍保存容器内の間葉系幹細胞、凍結保護剤、洗浄液を層状に遠心分離し、遠心分離した後の冷凍保存容器の最下層に位置する間葉系幹細胞を抽出する間葉系幹細胞抽出工程と、間葉系幹細胞抽出工程によって抽出した間葉系幹細胞を所定容量かつ所定面積の底面を有する第１培養容器に収容するとともに、間葉系幹細胞を収容した第１培養容器に所定の培養液を注入し、間葉系幹細胞を第１培養容器において３６～３７℃で２４時間培養し、第１培養容器内の間葉系幹細胞を活性化させて活性化間葉系幹細胞に改質させる幹細胞活性化工程とを有することにある。

【0009】

本発明の一例としては、冷凍幹細胞改質方法が、活性化させた活性化間葉系幹細胞を第１培養容器から抽出した後、活性化間葉系幹細胞を抽出後１８～２０時間以内に使用する場合、抽出した活性化間葉系幹細胞を２０～２１℃に保持した状態で１８～２０時間以内に活性化間葉系幹細胞の使用箇所まで搬送する幹細胞搬送工程を含む。

【0010】

本発明の他の一例としては、幹細胞活性化工程が、ドナーから採取した骨髄液を培養する培養過程において生成された培養生成液を第１培養容器に注入し、培養液及び培養生成液を利用して間葉系幹細胞を第１培養容器において３５～３７℃の温度で２４時間培養する。

【0011】

本発明の他の一例としては、幹細胞活性化工程が、第１培養容器を２～５度の角度に傾斜させた状態で第１培養容器を３５～３７℃の温度で２４時間静的に放置する。

【0012】

本発明の他の一例としては、幹細胞活性化工程が、第１培養容器を一方向へ２～５度の角度に傾斜させた状態で第１培養容器を３５～３７℃の温度で１２時間静的に放置し、一方向へ傾斜させた第１培養容器を一方向と反対の他方向へ２～５度の角度に傾斜させた状態で第１培養容器を３５～３７℃の温度で１２時間静的に放置する。

【0013】

本発明の他の一例としては、凍結保護剤が、ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)とエチレングリコール(ＥＧ)とのうちの少なくとも該ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)であり、洗浄液が、ダルベッコりん酸緩衝生理食塩水（Ｄ－ＰＢＳ）又はりん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。

【0014】

本発明の他の一例としては、間葉系幹細胞が、ドナーから採取した骨髄液を層状に分離し、層状に分離させた骨髄液のうちの中間層に位置する中間層骨髄液を抽出し、所定容量かつ所定面積の底面を有する第２培養容器に中間層骨髄液と所定の培養液とを注入して中間層骨髄液に含まれる第１間葉系幹細胞を第２培養容器の底面に定着させる幹細胞第１定着工程と、幹細胞第１定着工程によって第１間葉系幹細胞を第２培養容器の底面に定着させた後、第２培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第２培養容器に注入して第１間葉系幹細胞を培養し、第２培養容器の底面面積に対する第１間葉系幹細胞の総平面面積が第１目標割合に達するまで第１間葉系幹細胞を増殖させる幹細胞第１培養工程と、幹細胞第１培養工程によって増殖させた第１間葉系幹細胞及び培養液を収容した第２培養容器を遠心分離器に設置し、第２培養容器内の第１間葉系幹細胞、培養液を層状に遠心分離し、遠心分離した後の第２培養容器の最下層に位置する第２間葉系幹細胞を抽出する第２間葉系幹細胞第１抽出工程と、所定容量かつ所定面積の底面を有して第２培養容器よりも大きい容量の第３培養容器に第２間葉系幹細胞第１抽出工程によって抽出した第２間葉系幹細胞を収容しつつ、第３培養容器にあらたな培養液を注入し、第２間葉系幹細胞を第３培養容器の底面に定着させる幹細胞第２定着工程と、幹細胞第２定着工程によって第２間葉系幹細胞を第３培養容器の底面に定着させた後、第３培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第３培養容器に注入して第２間葉系幹細胞を培養し、第３培養容器の底面面積に対する第２間葉系幹細胞の総平面面積が第２目標割合に達するまで第２幹細胞を増殖させる幹細胞第２培養工程と、幹細胞第２培養工程によって培養された第２間葉系幹細胞を含む第３培養容器を遠心分離器に設置し、第３培養容器内の第２間葉系幹細胞、培養液を層状に遠心分離し、遠心分離した後の第３培養容器の最下層に位置する第２間葉系幹細胞を抽出する第２間葉系幹細胞第２抽出工程とを有する間葉系幹細胞培養方法によって作られている。

【0015】

本発明の他の一例としては、冷凍保存工程が、第２間葉系幹細胞第２抽出工程によって抽出された直後の第２間葉系幹細胞を冷凍保存容器に収容し、冷凍保存容器に収容した間葉系幹細胞を凍結保護剤とともに直ちに冷凍保存する。

【0016】

本発明の他の一例としては、培養生成液が、第２培養容器又は第３培養容器から培養後の間葉系幹細胞を抽出した後に残った培養液であり、間葉系幹細胞の培養過程において間葉系幹細胞から分泌された所定の代謝物質を含む。

【発明の効果】

【0017】

本発明に係る冷凍幹細胞改質方法によれば、冷凍状態から解凍された間葉系幹細胞及び凍結保護剤を収容した冷凍保存容器に洗浄液を注入し、洗浄液を注入した冷凍保存容器を攪拌して洗浄液によって冷凍保存容器内の間葉系幹細胞から凍結保護剤を除去し、冷凍保存容器内の間葉系幹細胞、凍結保護剤、洗浄液を層状に遠心分離し、遠心分離した後の冷凍保存容器の最下層に位置する間葉系幹細胞を抽出するから、冷凍保存された間葉系幹細胞を解凍する際に洗浄液を利用して凍結保護剤を除去することができるとともに、冷凍状態から解凍された間葉系幹細胞の大部分（７０～９０％）を生存させることができる。冷凍幹細胞改質方法は、冷凍状態から解凍された間葉系幹細胞を所定容量かつ所定面積の底面を有する第１培養容器に収容するとともに、間葉系幹細胞を収容した第１培養容器に所定の培養液を注入し、間葉系幹細胞を第１培養容器において３５～３７℃で２４時間培養し、第１培養容器内の間葉系幹細胞を活性化させるから、冷凍保存された間葉系幹細胞を解凍する際に、解凍された間葉系幹細胞を十分な活性を有する活性化間葉系幹細胞に改質することができる。冷凍幹細胞改質方法は、各種疾患（心血管疾患や中枢神経系疾患等）の治療や再生医療における再生、美容等の非治療的用途における十分かつ高い効果を有する活性化間葉系幹細胞を作ることができ、所望の効果を得ることが可能な活性化間葉系幹細胞を作ることができる。冷凍幹細胞改質方法は、各種疾患の治療に好適かつタイムリーに使用することが可能な活性化間葉系幹細胞を作ることができ、各種組織や各種臓器を再生に好適かつタイムリーに使用することが可能な活性化間葉系幹細胞を作ることができるとともに、美容等の非治療的用途に好適かつタイムリーに使用することが可能な活性化間葉系幹細胞を作ることができる。冷凍幹細胞改質方法は、解凍された活性化間葉系幹細胞に凍結保護剤が含まれていないから、冷凍幹細胞改質方法によって作られた活性化間葉系幹細胞を人体に投与下としても、人体に悪影響を与えることはない。

【0018】

活性化させた活性化間葉系幹細胞を第１培養容器から抽出した後、活性化間葉系幹細胞を抽出後１８～２０時間以内に使用する場合、抽出した活性化間葉系幹細胞を２０～２１℃に保持した状態で１８～２０時間以内に活性化間葉系幹細胞の使用箇所まで搬送する幹細胞搬送工程を含む冷凍幹細胞改質方法は、活性化間葉系幹細胞を２０～２１℃に保持した状態で１８～２０時間以内に活性化間葉系幹細胞の使用箇所まで搬送することで、活性化間葉系幹細胞の活性が失われず、その活性化間葉系幹細胞を各種疾患（心血管疾患や中枢神経系疾患等）の治療に利用することができ、その活性化間葉系幹細胞を再生医療における再生に利用することができるとともに、その活性化間葉系幹細胞を美容等の非治療的用途に利用することができる。

【0019】

幹細胞活性化工程において、ドナーから採取した骨髄液を培養する培養過程において生成された培養生成液を第１培養容器に注入し、培養液及び培養生成液を利用して間葉系幹細胞を第１培養容器において３５～３７℃の温度で２４時間培養する冷凍幹細胞改質方法は、冷凍保存前の間葉系幹細胞の培養過程において生成された培養生成液を利用することによって第１培養容器において間葉系幹細胞の活性化が確実に促進されるから、培養生成液を利用して解凍後の間葉系幹細胞を２４時間で活性化させることができ、十分な活性を有する活性化間葉系幹細胞を効率よく製造することができるとともに、凍結保護剤を除去した間葉系幹細胞を速やかに利用することができる。

【0020】

幹細胞活性化工程において、第１培養容器を２～５度の角度に傾斜させた状態で第１培養容器を３５～３７℃の温度で２４時間静的に放置する冷凍幹細胞改質方法は、第１培養容器を２～５度の角度に傾斜させることで、第１培養容器内において解凍後の間葉系幹細胞、培養液（及び培養生成液）が第１培養容器の一方に偏り、第１培養容器の一方において間葉系幹細胞、培養液（及び培養生成液）の圧力が大きくなるとともに間葉系幹細胞が第１培養容器の一方に集中し、それによって間葉系幹細胞どうしの活性を高めることができ、解凍された間葉系幹細胞を十分な活性を有する活性化間葉系幹細胞に改質することができる。

【0021】

幹細胞活性化工程において、第１培養容器を一方向へ２～５度の角度に傾斜させた状態で第１培養容器を３５～３７℃の温度で１２時間静的に放置し、一方向へ傾斜させた第１培養容器を一方向と反対の他方向へ２～５度の角度に傾斜させた状態で第１培養容器を３５～３７℃の温度で１２時間静的に放置する冷凍幹細胞改質方法は、第１培養容器を一方向へ２～５度の角度に傾斜させ、更に、一方向へ傾斜させた第１培養容器を一方向と反対の他方向へ２～５度の角度に傾斜させることで、第１培養容器内において解凍後の間葉系幹細胞、培養液（及び培養生成液）が第１培養容器の一方又は他方へ偏り、第１培養容器の一方又は他方において間葉系幹細胞、培養液（及び培養生成液）の圧力が大きくなるとともに間葉系幹細胞が第１培養容器の一方又は他方へ満遍なく集中し、それによって間葉系幹細胞どうしの活性を高めることができ、解凍された間葉系幹細胞を十分な活性を有する活性化間葉系幹細胞に改質することができる。

【0022】

凍結保護剤がヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)とエチレングリコール(ＥＧ)とのうちの少なくともジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)であり、洗浄液がダルベッコりん酸緩衝生理食塩水（Ｄ－ＰＢＳ）又はりん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である冷凍幹細胞改質方法は、冷凍状態から解凍された間葉系幹細胞及び凍結保護剤を収容した冷凍保存容器に洗浄液（ダルベッコりん酸緩衝生理食塩水（Ｄ－ＰＢＳ）又はりん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））を注入し、洗浄液を注入した冷凍保存容器を攪拌して洗浄液によって冷凍保存容器内の間葉系幹細胞から凍結保護剤（ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)とエチレングリコール(ＥＧ)とのうちの少なくともジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)）を除去し、冷凍保存容器内の間葉系幹細胞、凍結保護剤、洗浄液を層状に遠心分離し、遠心分離した後の冷凍保存容器の最下層に位置する間葉系幹細胞を抽出するから、冷凍保存された間葉系幹細胞を解凍する際に洗浄液（ダルベッコりん酸緩衝生理食塩水（Ｄ－ＰＢＳ）又はりん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））を利用して凍結保護剤（ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)とエチレングリコール(ＥＧ)とのうちの少なくともジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)）を確実に除去することができ、解凍において大部分（７０～９０％）の間葉系幹細胞を生存させることができるとともに、解凍された間葉系幹細胞を十分な活性を有する活性化間葉系幹細胞に改質することができる。

【0023】

間葉系幹細胞が、ドナーから採取した骨髄液を層状に分離し、層状に分離させた骨髄液のうちの中間層に位置する中間層骨髄液を抽出し、所定容量かつ所定面積の底面を有する第２培養容器に中間層骨髄液と所定の培養液とを注入して中間層骨髄液に含まれる第１間葉系幹細胞を第２培養容器の底面に定着させる幹細胞第１定着工程と、幹細胞第１定着工程によって第１間葉系幹細胞を第２培養容器の底面に定着させた後、第２培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第２培養容器に注入して第１間葉系幹細胞を培養し、第２培養容器の底面面積に対する第１間葉系幹細胞の総平面面積が第１目標割合に達するまで第１間葉系幹細胞を増殖させる幹細胞第１培養工程と、幹細胞第１培養工程によって増殖させた第１間葉系幹細胞及び培養液を収容した第２培養容器を遠心分離器に設置し、第２培養容器内の第１間葉系幹細胞、培養液を層状に遠心分離し、遠心分離した後の第２培養容器の最下層に位置する第２間葉系幹細胞を抽出する第２間葉系幹細胞第１抽出工程と、所定容量かつ所定面積の底面を有して第２培養容器よりも大きい容量の第３培養容器に第２間葉系幹細胞第１抽出工程によって抽出した第２間葉系幹細胞を収容しつつ、第３培養容器にあらたな培養液を注入し、第２間葉系幹細胞を第３培養容器の底面に定着させる幹細胞第２定着工程と、幹細胞第２定着工程によって第２間葉系幹細胞を第３培養容器の底面に定着させた後、第３培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第３培養容器に注入して第２間葉系幹細胞を培養し、第３培養容器の底面面積に対する第２間葉系幹細胞の総平面面積が第２目標割合に達するまで第２幹細胞を増殖させる幹細胞第２培養工程と、幹細胞第２培養工程によって培養された第２間葉系幹細胞を含む第３培養容器を遠心分離器に設置し、第３培養容器内の第２間葉系幹細胞、培養液を層状に遠心分離し、遠心分離した後の第３培養容器の最下層に位置する第２間葉系幹細胞を抽出する第２間葉系幹細胞第２抽出工程とを有する間葉系幹細胞培養方法によって作られている冷凍幹細胞改質方法は、第１間葉系幹細胞を第２培養容器の底面に定着させた後、培養液を第２培養容器から排出しつつ、あらたな培養液を第２培養容器に注入し、第２培養容器の底面に定着させた第１間葉系幹細胞をあらたな培養液を利用して培養し、第２培養容器において増殖させた第２間葉系幹細胞を第３培養容器に収容し、第２間葉系幹細胞を第３培養容器の底面に定着させた後、培養液を第３培養容器から排出しつつ、あらたな培養液を第３培養容器に注入し、第３培養容器の底面に定着させた第２間葉系幹細胞をあらたな培養液を利用して培養し、第３培養容器において第２間葉系幹細胞を増殖させるから、間葉系幹細胞を効率よく確実に増殖させることができ、十分な活性を有する間葉系幹細胞を効率よく作ることができる。

【0024】

冷凍保存工程において、第２間葉系幹細胞第２抽出工程によって抽出された直後の第２間葉系幹細胞を冷凍保存容器に収容し、冷凍保存容器に収容した間葉系幹細胞を凍結保護剤とともに直ちに冷凍保存する冷凍幹細胞改質方法は、間葉系幹細胞培養方法によって作られた十分な活性を有する間葉系幹細胞を直ちに冷凍保存するから、冷凍保存容器に収容された間葉系幹細胞の大部分を生きたまま冷凍保存することができ、間葉系幹細胞培養方法によって作られた間葉系幹細胞を長期間保存することができる。

【0025】

培養生成液が第２培養容器又は第３培養容器から培養後の間葉系幹細胞を抽出した後に残った培養液であり、間葉系幹細胞の培養過程において間葉系幹細胞から分泌された所定の代謝物質を含む冷凍幹細胞改質方法は、間葉系幹細胞の培養過程において間葉系幹細胞から分泌された所定の代謝物質を含むから、間葉系幹細胞自体の代謝物質がトリガーとなり、間葉系幹細胞が速やかに活性を開始するとともに、その培養生成液を利用して間葉系幹細胞を速やかに活性化させることができ、活性化間葉系幹細胞を短時間に効率よく作ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】一例として示す冷凍幹細胞改質システムの概略構成図。

【図2】間葉系幹細胞培養方法における骨髄液分離工程の一例を示す説明図

【図3】図２から続く骨髄液分離工程の説明図。

【図4】形状変形第１観察工程の一例を示す説明図。

【図5】第１扁平培養容器（第２培養容器）の側面図。

【図6】間葉系幹細胞培養方法における第２間葉系幹細胞第１抽出工程の一例を示す説明図。

【図7】間葉系幹細胞培養方法における形状変形第２観察工程の一例を示す説明図。

【図8】第２扁平培養容器（第３培養容器）の側面図。

【図9】冷凍幹細胞改質方法における冷凍保存工程の一例を示す説明図。

【図10】冷凍幹細胞改質方法における幹細胞解凍工程の一例を示す説明図。

【図11】冷凍幹細胞改質方法における撹拌除去工程の一例を示す説明図。

【図12】冷凍幹細胞改質方法における間葉系幹細胞抽出工程の一例を示す説明図。

【図13】冷凍幹細胞改質方法における幹細胞活性化工程の一例を示す説明図。

【図14】第３扁平培養容器（第１培養容器）の側面図。

【図15】第２間葉系幹細胞の平面形状の一例を示す部分拡大図。

【図16】第２間葉系幹細胞の平面形状の他の一例を示す部分拡大図。

【図17】冷凍幹細胞改質方法における幹細胞搬送工程の一例を示す説明図。

【発明を実施するための形態】

【0027】

一例として示す冷凍幹細胞改質システム１０の概略構成図である図１等の添付の図面を参照し、本発明に係る冷凍幹細胞改質方法の詳細を説明すると、以下のとおりである。尚、図２は、間葉系幹細胞培養方法における骨髄液分離工程の一例を示す説明図であり、図３は、図２から続く骨髄液分離工程の説明図である。図４は、形状変形第１観察工程の一例を示す説明図であり、図５は、第１扁平培養容器（第２培養容器）の側面図である。

【0028】

冷凍幹細胞改質システム１０は、幹細胞培養方法によって特定種類の単一種間葉系幹細胞を培養（製造）し、冷凍保存された単一種の間葉系幹細胞を冷凍幹細胞改質方法によって活性化間葉系幹細胞に改質する。幹細胞培養方法は、複数のドナー（人）から採取した第１骨髄液を利用し、幹細胞第１定着工程、幹細胞第１培養工程、第２間葉系幹細胞第１抽出工程、幹細胞第２定着工程、幹細胞第２培養工程、第２間葉系幹細胞第２抽出工程を実施することにより、第１骨髄液に含まれる複数種類の間葉系幹細胞の中から特定種類の単一種間葉系幹細胞を培養（製造）する。

【0029】

冷凍幹細胞改質システム１０は、管理サーバ１１、管理サーバ１１にインターフェイス（無線または有線）を介して接続されたＩＣタグリーダ／ライタ１２、管理サーバ１１にインターフェイス（無線または有線）を介して接続された電子顕微鏡１３、管理サーバ１１にインターフェイス（無線または有線）を介して接続された冷蔵庫１４又は冷凍庫１４から形成されている。電子顕微鏡１３は、撮像素子によって被写体の拡大画像を撮影する画像撮影機能を有するとともに、その拡大画像を管理サーバ１１に送信する画像送信機能を有する。

【0030】

管理サーバ１１は、中央処理部（ＣＰＵ又はＭＰＵ、仮想ＣＰＵ又は仮想ＭＰＵ）とメモリ（メインメモリ及びキャッシュメモリ、仮想メインメモリ及び仮想キャッシュメモリ）とを備えた物理的なコンピュータ又はクラウドコンピューティングであり、大容量記憶領域又は大容量仮想記憶領域を内蔵している。クラウドとしては、Infrastructure as a Service（IaaS）、Platform as a Service（PaaS）、Software as a Service（SaaS）を利用することができる。管理サーバ１１には、キーボード１５やマウス１６等の入力装置、ディスプレイ１７やプリンタ（図示せず）等の出力装置がインターフェイス（無線または有線）を介して接続されている。

【0031】

冷凍幹細胞改質システム１０では、各種のドナーデータ（ドナー特定情報）がＩＣタグ１８（ＩＣチップ）を利用して管理され、間葉系幹細胞に関する幹細胞データがＩＣタグ１８を利用して管理される。ドナーデータには、ドナーの氏名、住所、電話番号、生年月日、性別、血液型、身長、体重、メールアドレス等があり、幹細胞データには、幹細胞特定情報、幹細胞製造年月日、培養生成液製造年月日、培養生成液特定情報等がある。幹細胞第１定着工程では、担当者（医師や看護師、研究者、バイオ技術者等）がドナーから第１骨髄液を２～３ｃｃ（２～３ｍｌ）採取する。担当者は、第１骨髄液の採取と同時に、管理サーバ１１において冷凍幹細胞改質システム１０を起動し、キーボード１５やマウス１６等の入力装置を利用してドナーデータや幹細胞データを管理サーバ１１に適宜入力する。

【0032】

管理サーバ１１は、ドナーデータが入力される度毎（ドナーから第１骨髄液を採取する度毎）に各ドナーを特定するユニークなドナー識別子を生成する。管理サーバ１１は、入力されたドナーデータや幹細胞データをＩＣタグリーダ／ライタ１２を利用してＩＣタグ１８に書き込む。管理サーバ１１は、ドナーデータ及び幹細胞データをドナー識別子及びＩＣタグ１８のＩＣタグ特定情報（ＩＣタグ識別子）に関連付けた状態で大容量記憶領域又は大容量仮想記憶領域に格納（記憶）する（ドナーデータ記憶工程）。

【0033】

ドナーから採取された第１骨髄液１９は、図２に示すように、上下方向へ長いガラス試験管２０（分離容器）内に注入（収容）される。尚、２～３ｃｃの第１骨髄液１９には、０．５～１ｍｌ（約５×１０^７（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ））の複数種類の間葉系幹細胞が含まれる。ガラス試験管２０の外周面には、ＩＣタグ１８が貼付されている。尚、管理サーバ１１は、ＩＣタグ１８に書き込まれたドナーデータや幹細胞データがＩＣタグリーダ／ライタ１２によって読み取られた場合、そのドナーデータや幹細胞データをディスプレイ１７に表示する。第１骨髄液１９を注入したガラス試験管２０は、試験管立て（図示せず）にセットされ、試験管立てとともに恒温槽（図示せず）の内部に収容される。

【0034】

第１骨髄液１９を注入したガラス試験管２０は、恒温槽において所定時間（約２時間）静的に放置（動かすことなく静かに放置）される。恒温槽内の温度は、体温と略同一の約３５～３７℃に保持されている。ガラス試験管２０を恒温槽に所定時間（約２時間）静的に放置することで、図３に示すように、ガラス試験管２０に注入された第１骨髄液１９がガラス試験管２０内において上下方向へ何層か（３層）の層状に分離する（骨髄液分離工程）。第１骨髄液１９を層状に分離させた後、恒温槽の内部から試験管立てを取り出し、試験管立てからガラス試験管２０を引き抜き、層状に分離した第１骨髄液１９の特定の層（３層（層状）に分離した中間層（第２層））に存在する第２骨髄液２１（中間層骨髄液）を注射器（図示せず）又はピペット（図示せず）を利用して抽出（吸引）する（骨髄液抽出工程）。

【0035】

第１骨髄液１９から中間層に位置する特定の第２骨髄液２１（中間層骨髄液）を抽出した後、第２骨髄液２１及び培養液２６を第１扁平培養容器２２（第２培養容器）（細胞培養容器）に注入（収容）し、培養容器２２を体温と略同一の温度（約３５～３７℃）に保持しつつ、１２～２４時間静的に放置（動かすことなく静かに放置）し、１２～２４時間の間において約１～２時間間隔で培養容器２２内の第２骨髄液２１に含まれる第１間葉系幹細胞２１の初期平面形状からの変形をディスプレイ１７（電子顕微鏡）で観察し、第１間葉系幹細胞２１が第１扁平培養容器２２の底面２３に定着したか否かを判断する（形状変形第１観察工程）。第１扁平培養容器２２の底面２３（底壁外面）には、ドナーデータや幹細胞データが書き込まれたＩＣタグ１８が取り付けられている。

【0036】

第１扁平培養容器２２（第２培養容器）は、透明なガラス又は透明なプラスチックから作られ、小容量かつ所定面積の底面２３を有する平面形状が略正四角形の扁平な容器である。第１扁平培養容器２２の注入口２４は、蓋２５によって水密に閉塞されている。第１扁平培養容器２２は、その容量が約２０～３０ｃｃ（好ましくは、２５ｃｃ）であり、その底面２３の面積が約２５～３６ｍｍ^２であるとともに、その一辺の長さが５～６ｍｍである。尚、第１扁平培養容器２２として小容量かつ所定面積の底面を有する平面形状が円形や楕円形の扁平な容器を使用することもできる。

【0037】

担当者は、注入口２４から蓋２５を取り外し、注射器又はピペットに吸引された第２骨髄液２１を第１扁平培養容器２２の注入口２４から培養容器２２の内部に注入（収容）するとともに、培養液２６を培養容器２２の内部に注入（収容）し、蓋２５によって注入口２４を閉塞する。培養液２６には、ペニシリン（約１００Ｕ／ｍｌ）、アムホテリシン（約１００ｎｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（約１００ｍｋｇ／ｍｌ）、Ｌ－グルタミン（約２～４ｍｌ）、２０％ウシ胎児血清を添加したミネラル塩溶液およびアミノ酸が含まれる。

【0038】

尚、培養液２６には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｇｒａｓｇｏｗ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）、ＲＰＭＩ６４０等を使用することもできる。培養液２６には、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレニウム、２－メルカプトエタノール、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラチン酸、グリシン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン等を添加することもできる。第１扁平培養容器２２に注入された第２骨髄液２１に含まれる第１間葉系幹細胞２１は、時間の経過とともに第１扁平培養容器２２の底面２３に定着しつつ、培養液２６によって培養され、培養容器２２の底面２３において次第に増殖（分化）してコロニーを形成する。

【0039】

第２骨髄液２１及び培養液２６を第１扁平培養容器２２に注入した後、培養容器２２を電子顕微鏡１３の試料ホルダ２７に設置（セット）する。電子顕微鏡１３の試料ホルダ２７の上面２８と第１扁平培養容器２２の底部２９との間にスペーサー３０を介在させ、培養容器２２の底部２９をスペーサー３０によって持ち上げた状態に保持し、培養容器２２の底部２９が上となり培養容器２２の頂部３１（注入口２４）が下となるように、培養容器２２を所定角度に傾斜させた状態に保持する。尚、第１扁平培養容器２２の頂部３１をスペーサー３０によって持ち上げた状態に保持し、培養容器２２の頂部３１が上となり培養容器２２の底部２９が下となるように、培養容器２２を所定角度に傾斜させた状態に保持してもよい。試料ホルダ２７の上面２８に対する第１扁平培養容器２２の傾斜角度α１は、２～５°の範囲にあり、好ましくは、２～３°の範囲にある。

【0040】

試料ホルダ２７の上面２８に対して第１扁平培養容器２２を前記傾斜角度で傾斜させることで、培養容器２２内において第２骨髄液２１（又は第１間葉系幹細胞２１）及び培養液２６が培養容器２２の頂部３１の側（又は底部２９の側）に偏り、培養容器２２の頂部３１の側（又は底部２９の側）において第２骨髄液２１（又は第１間葉系幹細胞２１）と培養液２６との水圧が大きくなって第２骨髄液２１（又は第１間葉系幹細胞２１）が培養容器２２の頂部３１の側に集中し、それによって第１間葉系幹細胞２１どうしの活性が高まり、培養容器２２の底面２３において第１間葉系幹細胞２１を容易かつ迅速に定着（又は増殖（分化））させることができる。

【0041】

電子顕微鏡１３は、第１扁平培養容器２２に注入された第２骨髄液２１に含まれる第１間葉系幹細胞２１の平面形状の拡大画像を約１～２時間間隔で撮影し、撮影した第１間葉系幹細胞２１の平面形状の拡大画像を約１～２時間間隔で管理サーバ１１に送信する。管理サーバ１１は、電子顕微鏡１３から送信された第１間葉系幹細胞２１の平面形状の拡大画像と撮影時間とをＩＣタグ特定情報（ＩＣタグ識別子）及びドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に格納（記憶）する。管理サーバ１１は、電子顕微鏡１３から送信された第１間葉系幹細胞２１の平面形状の拡大画像と撮影時間とをディスプレイ１７に出力（表示）する。担当者（医師や看護師、研究者、バイオ技術者等）は、ディスプレイ１７に表示された第１間葉系幹細胞２１の平面形状の拡大画像を１２～２４時間の間において約１～２時間間隔で確認（視認）し、第２骨髄液２１に含まれる第１間葉系幹細胞２１の平面形状の変化を観察する。

【0042】

図示はしていないが、第１間葉系幹細胞２１の初期平面形状は略円形であり、第１間葉系幹細胞２１の平面形状が略円形の場合、第１間葉系幹細胞２１が第１扁平培養容器２２の底面２３（底壁内面）に定着しておらず、第１間葉系幹細胞２１が増殖（分化）を開始していない。第１間葉系幹細胞２１の変形後の平面形状は定着前の略円形を核として第１間葉系幹細胞２１が一方向（所定方向）へ不定形に伸張（拡張）した扁平形状であり、第１間葉系幹細胞２１が第１扁平培養容器２２の底面２３（底壁内面）に定着し、第１間葉系幹細胞２１が増殖（分化）を開始している。

【0043】

形状変形第１観察工程における観察の結果、ディスプレイ１７に出力（表示）された第１間葉系幹細胞２１の平面形状が略円形から略円形を核として不定形の扁平形状に変形した場合、第１間葉系幹細胞２１が第１扁平培養容器２２の底面２３に定着したと判断する（幹細胞第１定着工程）。形状変形第１観察工程における観察の結果、第１間葉系幹細胞２１が略円形（初期平面形状）から略円形を核として不定形の扁平形状に変形し、第１間葉系幹細胞２１の第１扁平培養容器２２（第１培養容器）の底面２３への定着を確認した後、総平面面積第１観察工程が行われる。

【0044】

担当者は、第１扁平培養容器２２内に注入されている培養液２６を培養容器２２から排出し、培養容器２２内にあらたな培養液２６を注入（収容）する。次に、第１扁平培養容器２２を体温と略同一の温度（約３５～３７℃）で３６～４８時間静的に放置（動かすことなく静かに放置）して第１間葉系幹細胞２１を培養しつつ、３６～４８時間の間において約１～２時間間隔で培養容器２２の底面２３に定着した第１間葉系幹細胞２１の培養容器２２の底面面積に対する総平面面積をディスプレイ１７（電子顕微鏡１３）で観察し、第１間葉系幹細胞２１の総平面面積が培養容器２２の底面面積に対して第１目標割合に達したか否かを判断する（総平面面積第１観察工程）。第１扁平培養容器２２の底面面積に対する第１間葉系幹細胞２１の総平面面積の第１目標割合は、７０～８０％（７０～８０％コンフルエント）である。

【0045】

総平面面積第１観察工程では、第１扁平培養容器２２に注入した培養液２６を培養容器２２から排出し、あらたな培養液２６を培養容器２２に注入（収容）し、あらたな培養液２６を注入した第１扁平培養容器２２を電子顕微鏡１３の試料ホルダ２７に設置（セット）する。電子顕微鏡１３の試料ホルダ２７の上面２８と第１扁平培養容器２２の底部２９との間にスペーサー３０を介在させ、培養容器２２の底部２９をスペーサー３０によって持ち上げた状態に保持し、培養容器２２の底部２９が上となり培養容器２２の頂部３１（注入口２４）が下となるように、培養容器２２を所定角度に傾斜させた状態に保持する（図６参照）。試料ホルダ２７の上面２８に対する第１扁平培養容器２２の傾斜角度α１は、２～５°の範囲にあり、好ましくは、２～３°の範囲にある。

【0046】

電子顕微鏡１３は、第１扁平培養容器２２内の第１間葉系幹細胞２１の平面形状の拡大画像を約１～２時間間隔で撮影し、撮影した第１間葉系幹細胞２１の平面形状の拡大画像を約１～２時間間隔で管理サーバ１１に送信する。管理サーバ１１は、電子顕微鏡１３から送信された第１間葉系幹細胞２１の平面形状の拡大画像と撮影時間とをＩＣタグ特定情報（ＩＣタグ識別子）及びドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に格納（記憶）する。管理サーバ１１は、電子顕微鏡１３から送信された第１間葉系幹細胞２１の平面形状の拡大画像と撮影時間とをディスプレイ１７に出力（表示）する。

【0047】

担当者（医師や看護師、研究者、バイオ技術者等）は、ディスプレイ１７に表示された第１間葉系幹細胞２１の平面形状の拡大画像を３６～４８時間の間において約１～２時間間隔で確認（視認）し、第１扁平培養容器２２の底面２３に定着した第１間葉系幹細胞２１の培養容器２２の底面面積に対する総平面面積を観察しつつ、第１間葉系幹細胞２１の総平面面積が第１扁平培養容器２２の底面面積に対して第１目標割合（７０～８０％コンフルエント）に達したか否かを判断する。

【0048】

第１間葉系幹細胞２１は、第１扁平培養容器２２の底面２３（底壁内面）において増殖してコロニーを形成する（幹細胞第１培養工程）。第１間葉系幹細胞２１がコロニーを形成し、総平面面積第１観察工程における観察の結果、第１間葉系幹細胞２１の平面形状が拡張し、ディスプレイ１７に表示された第１間葉系幹細胞２１の第１扁平培養容器２２の底面面積に対する総平面面積が第１目標割合（７０～８０％コンフルエント）に達した場合、培養容器２２から第１間葉系幹細胞２１を抽出する。

【0049】

第１扁平培養容器２２に注入されている総平面面積第１観察工程時の培養液２６（第１培養生成液３２）を第１扁平培養容器２２から排出し、培養容器２２をりん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、トリプシン液を培養容器２２内に注入する。第１扁平培養容器２２にトリプシン液を注入すると、培養容器２２の底面２３に定着した第１間葉系幹細胞２１がトリプシン液によって底面２３から剥離し、トリプシン液の水面に浮上する。担当者は、浮上した第１間葉系幹細胞２１をピペットを利用して吸引する。

【0050】

尚、第１扁平培養容器２２（第２培養容器）から排出された培養液２６は、培養容器２２から第１間葉系幹細胞２１を抽出した後に残った培養液２６であり、第１間葉系幹細胞２１の培養過程において第１間葉系幹細胞２１から分泌された所定の代謝物質を含む第１培養生成液３２（培養生成液）に変化している。代謝物質を含む第１培養生成液３２は、活性が低下した間葉系幹細胞を活性化させる。第１培養生成液３２は、ＩＣタグ１８が取り付けられた後記する冷凍保存容器４３に注入されて急速冷凍機（図示せず）によって急速冷凍された後、冷凍保存容器４３に収容された状態で冷蔵庫１４又は冷凍庫１４において所定期間、所定温度（０～５℃のチルド保存又は０℃以下の冷凍保存）で保存される。

【0051】

図６は、間葉系幹細胞培養方法における第２間葉系幹細胞第１抽出工程の一例を示す説明図であり、図７は、間葉系幹細胞培養方法における形状変形第２観察工程の一例を示す説明図であり、図８は、第２扁平培養容器３３（第３培養容器）の側面図である。担当者（医師や看護師、研究者、バイオ技術者等）は、第１扁平培養容器２２から第１間葉系幹細胞２１を抽出した後、第１間葉系幹細胞２１をガラス試験管３４に注入（収容）し、ガラス試験管３４を遠心分離器（図示せず）に設置（セット）する。第１間葉系幹細胞２１を遠心分離器によって所定時間遠心分離した後、ガラス試験管３４を遠心分離器から取り出す。ガラス試験管３４内の第１間葉系幹細胞２１は、遠心分離器によって上下方向へ２層の層状に遠心分離される。

【0052】

第１間葉系幹細胞２１を層状に分離させた後、図６に示すように、層状に分離した第１間葉系幹細胞２１から下層（最下層）に位置する第２間葉系幹細胞３５を注射器（図示せず）又はピペット（図示せず）を利用して抽出（吸引）する抽出する（第２間葉系幹細胞第１抽出工程）。不要な幹細胞を含む第１間葉系幹細胞２１を遠心分離器で遠心分離して上下方向へ層状に分離させ、層状に遠心分離した第１間葉系幹細胞２１のうちの下層（最下層）に位置する第２間葉系幹細胞３５を抽出することで、第１間葉系幹細胞２１から特定の第２間葉系幹細胞３５を確実に抽出することができ、第１間葉系幹細胞２１から不要な間葉系幹細胞を除去することができる。

【0053】

第１間葉系幹細胞２１から下層（最下層）に位置する特定の第２間葉系幹細胞３５を抽出した後、形状変形第２観察工程が行われる。形状変形第２観察工程では、第２間葉系幹細胞３５及び培養液３６を第２扁平培養容器３３（第３培養容器）（細胞培養容器）に注入（収容）し、培養容器３３を体温と略同一の温度（約３５～３７℃）で３６～４８時間静的に放置（動かすことなく静かに放置）しつつ、３６～４８時間の間において約１～２時間間隔で培養容器３３内の第２間葉系幹細胞３５（間葉系幹細胞）の初期平面形状からの変形をディスプレイ１７（電子顕微鏡）で観察し、第２間葉系幹細胞３５が培養容器３３の底面３７に定着したか否かを判断する（形状変形第２観察工程）。第２扁平培養容器３３の底面３７（底壁外面）には、ドナーデータや幹細胞データが書き込まれたＩＣタグ１８が取り付けられている。

【0054】

第２扁平培養容器３３（第３培養容器）は、透明なガラス又は透明なプラスチックから作られ、小容量かつ所定面積の底面を有する平面形状が略正四角形の扁平な容器であり、その容積が第１扁平培養容器２２（第２培養容器）のそれよりも大きい。第２扁平培養容器３３の注入口３８は、蓋３９によって水密に閉塞されている。第２扁平培養容器３３は、その容量が約４０～６０ｃｃ（好ましくは、５０ｃｃ）であり、その底面面積が約５０～７２ｍｍ^２であるともに、その一辺の長さが約７～８．５ｍｍである。尚、第２扁平培養容器３３として小容量かつ所定面積の底面を有する平面形状が円形や楕円形の扁平な容器を使用することもできる。第２扁平培養容器３３に注入された第２間葉系幹細胞３５は、時間の経過とともに培養容器３３の底面３７に定着しつつ、培養液３６によって培養され、培養容器３３の底面３７において次第に増殖（分化）してコロニーを形成する。

【0055】

担当者は、注入口３８から蓋３９を取り外し、注射器又はピペットに吸引された第２間葉系幹細胞３５を第２扁平培養容器３３の注入口３８から培養容器３３の内部に注入（収容）するとともに、培養液３６を培養容器３３の内部に注入（収容）し、蓋３９によって注入口３８を閉塞する。培養液３６は、形状変形第１観察工程において注入されたそれと同一である。担当者は、第２間葉系幹細胞３５及び培養液３６を第２扁平培養容器３３に注入した後、培養容器３３を電子顕微鏡１３の試料ホルダ２７に設置（セット）する。

【0056】

電子顕微鏡１３の試料ホルダ２７の上面２８と第２扁平培養容器３３の底部４０との間にスペーサー３０を介在させ、培養容器３３の底部４０をスペーサー３０によって持ち上げた状態に保持し、培養容器３３の底部４０が上となり培養容器３３の頂部４１（注入口３８）が下となるように、培養容器３３を所定角度に傾斜させた状態に保持する。又、電子顕微鏡１３の試料ホルダ２７の上面２８と第２扁平培養容器３３の頂部４１との間にスペーサー３０を介在させ、培養容器３３の頂部４１をスペーサー３０によって持ち上げた状態に保持し、培養容器３３の頂部４１が上となり培養容器３３の底部４０が下となるように、培養容器３３を所定角度に傾斜させた状態に保持してもよい。試料ホルダ２７の上面２８に対する第２扁平培養容器３３の傾斜角度α２は、２～５°の範囲にあり、好ましくは、２～３°の範囲にある。

【0057】

試料ホルダ２７の上面２８に対して第２扁平培養容器３３を前記傾斜角度で傾斜させることで、培養容器３３内において第２間葉系幹細胞３５及び培養液３６が培養容器３３の頂部４１の側（又は底部４０の側）に偏り、培養容器３３の頂部４１の側（又は底部４０の側）において第２間葉系幹細胞３５と培養液３６との水圧が大きくなって第２間葉系幹細胞３５が培養容器３３の頂部４１の側（又は底部４０の側）に集中し、それによって第２間葉系幹細胞３５どうしの活性が高まり、培養容器３３の底面３７において第２間葉系幹細胞３５を容易かつ迅速に定着（又は増殖（分化））させることができる。

【0058】

電子顕微鏡１３は、第２扁平培養容器３３に注入された第２間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像を約１～２時間間隔で撮影し、撮影した第２間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像を約１～２時間間隔で管理サーバ１１に送信する。管理サーバ１１は、電子顕微鏡１３から送信された第２間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像と撮影時間とをＩＣタグ特定情報（ＩＣタグ識別子）及びドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に格納（記憶）する。管理サーバ１１は、電子顕微鏡１３から送信された第２間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像と撮影時間とをディスプレイ１７に表示する。担当者は、ディスプレイ１７に表示された第２間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像を３６～４８時間の間において約１～２時間間隔で確認（視認）し、第２間葉系幹細胞３５の平面形状の変化を観察する。

【0059】

第２間葉系幹細胞３５の初期平面形状は略円形であり、第２間葉系幹細胞３５の平面形状が略円形の場合、第２間葉系幹細胞３５が第２扁平培養容器３３の底面３７（底壁内面）に定着しておらず、第２間葉系幹細胞３５が増殖（分化）を開始していない。第２間葉系幹細胞３５の変形後の平面形状は定着前の略円形を核として第２間葉系幹細胞３５が一方向へ不定形に伸張した扁平形状であり、第２間葉系幹細胞３５が第２扁平培養容器３３の底面３７（底壁内面）に定着し、第２間葉系幹細胞３５が増殖（分化）を開始している。

【0060】

形状変形第２観察工程における観察の結果、ディスプレイ１７に表示された第２間葉系幹細胞３５の平面形状が略円形から略円形を核として不定形の扁平形状に変形した場合、第２間葉系幹細胞３５が第２扁平培養容器３３の底面３７に定着したと判断する（幹細胞第２定着工程）。形状変形第２観察工程における観察の結果、第２間葉系幹細胞３５が略円形（初期平面形状）から略円形を核として不定形の扁平形状に変形し、第２間葉系幹細胞３５の第２扁平培養容器３３（第３培養容器）の底面３７への定着を確認した後、総平面面積第２観察工程が行われる。

【0061】

第２扁平培養容器３３内に注入されている培養液３６を培養容器３３から排出し、培養容器３３にあらたな培養液３６を注入（収容）する。次に、第２扁平培養容器３３を体温と略同一の温度（約３５～３７℃）で３６～４８時間静的に放置（動かすことなく静かに放置）して第２間葉系幹細胞３５を培養しつつ、３６～４８時間の間において約１～２時間間隔で培養容器３３の底面３７に定着した第２間葉系幹細胞３５の培養容器３３の底面面積に対する総平面面積をディスプレイ１７（電子顕微鏡）で観察し、第２間葉系幹細胞３５の総平面面積が第２扁平培養容器３３の底面面積に対して第２目標割合に達したか否かを判断する（総平面面積第２観察工程）。第２扁平培養容器３３の底面面積に対する第２間葉系幹細胞３５の総平面面積の第２目標割合は、８８～９２％（８８～９２％コンフルエント）である。

【0062】

総平面面積第２観察工程では、第２扁平培養容器３３に注入した培養液３６を培養容器３３から排出し、あらたな培養液３６を培養容器３３に注入（収容）し、あらたな培養液３６を注入した培養容器３３を電子顕微鏡１３の試料ホルダ２７に設置（セット）する。電子顕微鏡１３の試料ホルダ２７の上面２８と第２扁平培養容器３３の底部４０との間にスペーサー３０を介在させ、培養容器３３の底部４０をスペーサー３０によって持ち上げた状態に保持し、培養容器３３の底部４０が上となり培養容器３３の頂部４１（注入口３８）が下となるように、第２扁平培養容器３３を所定角度に傾斜させた状態に保持する（図８参照）。試料ホルダ２７の上面２８に対する第２扁平培養容器３３の傾斜角度α１は、２～５°の範囲にあり、好ましくは、２～３°の範囲にある。

【0063】

電子顕微鏡１３は、第２扁平培養容器３３内の第２間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像を約１～２時間間隔で撮影し、撮影した第２間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像を約１～２時間間隔で管理サーバ１１に送信する。管理サーバ１１は、電子顕微鏡１３から送信された第２間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像と撮影時間とをＩＣタグ特定情報（ＩＣタグ識別子）及びドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に格納（記憶）する。管理サーバ１１は、電子顕微鏡１３から送信された第２間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像と撮影時間とをディスプレイ１７に出力（表示）する。

【0064】

担当者（医師や看護師、研究者、バイオ技術者等）は、ディスプレイ１７に表示された第２間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像を３６～４８時間の間において約１～２時間間隔で確認（視認）し、第２扁平培養容器３３の底面３７に定着した第２間葉系幹細胞３５の培養容器３３の底面面積に対する総平面面積を観察しつつ、第２間葉系幹細胞３５の総平面面積が培養容器３３の底面面積に対して第２目標割合（７０～８０％コンフルエント）に達したか否かを判断する。

【0065】

第２間葉系幹細胞３５は、第２扁平培養容器３３の底面３７（底壁内面）において増殖してコロニーを形成する（幹細胞第２培養工程）。第２間葉系幹細胞３５がコロニーを形成し、第２間葉系幹細胞３５の平面形状が拡張し、総平面面積第２観察工程における観察の結果、ディスプレイ１７に表示された第２間葉系幹細胞３５の第２扁平培養容器３３の底面面積に対する総平面面積が第２目標割合（７０～８０％コンフルエント）に達した場合、培養容器３３から第２間葉系幹細胞を抽出する。

【0066】

第２扁平培養容器３３に注入されている総平面面積第２観察工程時の培養液３６を培養容器３３から排出し、培養容器３３をりん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、トリプシン液を培養容器３３内に注入する。第２扁平培養容器３３にトリプシン液を注入すると、培養容器３３の底面３７に定着した第２間葉系幹細胞３５がトリプシン液によって底面３７から剥離し、トリプシン液の水面に浮上する。担当者は、浮上した第２間葉系幹細胞３５をピペットを利用して吸引する（第２間葉系幹細胞第２抽出工程）。

【0067】

尚、第２扁平培養容器３３（第３培養容器）から排出された培養液３６は、培養容器３３から第２間葉系幹細胞３５を抽出した後に残った培養液３６であり、第２間葉系幹細胞３５の培養過程において第２間葉系幹細胞３５から分泌された所定の代謝物質を含む第２培養生成液４２（培養生成液）に変化している。代謝物質を含む第２培養生成液４２は、活性が低下した間葉系幹細胞を活性化させる。第２培養生成液４２は、ＩＣタグ１８が取り付けられた冷凍保存容器４３に注入されて急速冷凍機によって急速冷凍された後、冷凍保存容器４３に収容された状態で冷蔵庫１４又は冷凍庫１４において所定期間、所定温度（０～５℃のチルド保存又は０℃以下の冷凍保存）で保存される。

【0068】

冷凍幹細胞改質方法は、第１間葉系幹細胞２１を第１扁平培養容器２２（第２培養容器）の底面２３に定着させた後、培養液２６を培養容器２２から排出しつつ、あらたな培養液２６を培養容器２２に注入し、培養容器２２の底面２３に定着させた第１間葉系幹細胞２１をあらたな培養液２６を利用して培養し、培養容器２２において増殖させた第２間葉系幹細胞３５及び培養液３６を第２扁平培養容器３３（第３培養容器）に収容し、第２間葉系幹細胞３５を培養容器３３の底面３７に定着させた後、培養液３６を培養容器３３から排出しつつ、あらたな培養液３６を培養容器３３に注入し、培養容器３３の底面３７に定着させた第２間葉系幹細胞３５をあらたな培養液３６を利用して培養し、培養容器３３において第２間葉系幹細胞３５を増殖させるから、間葉系幹細胞３５を効率よく確実に増殖させることができ、十分な活性を有する間葉系幹細胞３５を効率よく作ることができる。

【0069】

図９は、冷凍幹細胞改質方法における冷凍保存工程の一例を示す説明図であり、図１０は、冷凍幹細胞改質方法における幹細胞解凍工程の一例を示す説明図である。図１１は、冷凍幹細胞改質方法における撹拌除去工程の一例を示す説明図であり、図１２は、冷凍幹細胞改質方法における間葉系幹細胞抽出工程の一例を示す説明図である。図１３は、冷凍幹細胞改質方法における幹細胞活性化工程の一例を示す説明図であり、図１４は、第３扁平培養容器（第１培養容器）の側面図である。図１５は、第２間葉系幹細胞３５の平面形状の一例を示す部分拡大図であり、図１６は、第２間葉系幹細胞３５の平面形状の他の一例を示す部分拡大図である。図１７は、冷凍幹細胞改質方法における幹細胞搬送工程の一例を示す説明図である。図１５，１６は、電子顕微鏡１３によって撮影された第２間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像を示す。

【0070】

冷凍幹細胞改質方法は、幹細胞培養方法によって培養した第２間葉系幹細胞３５（間葉系幹細胞）を冷凍保存工程を実施することによって冷凍保存し、冷凍保存した後の第２間葉系幹細胞３５（間葉系幹細胞）を幹細胞解凍工程、撹拌除去工程、間葉系幹細胞抽出工程、幹細胞活性化工程、幹細胞搬送工程を実施することによって活性化間葉系幹細胞５５に改質する。

【0071】

担当者（医師や看護師、研究者等）は、第２間葉系幹細胞３５（培養された間葉系幹細胞）をピペットから所定容積の冷凍保存容器４３に注入（収容）する。冷凍保存容器４３に注入された第２間葉系幹細胞３５は、不要な間葉系幹細胞が除去された活性を有する培養対象の特定種類（略単一種）のピュアな間葉系幹細胞である。冷凍保存容器４３の外周面には、ドナーデータや幹細胞データが格納されたＩＣタグ１８が取り付けられている。

【0072】

冷凍保存容器４３には、凍結保護剤４４（ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)とエチレングリコール(ＥＧ)とのうちの少なくともジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)）が注入される。第２間葉系幹細胞３５及び凍結保護剤４４を収容した冷凍保存容器４３は、急速冷凍機（図示せず）によって急速冷凍する。急速冷凍された第２間葉系幹細胞３５は、それが使用されるまでの間、図９に示すように、冷凍保存容器４３に収容された状態で冷蔵庫１４又は冷凍庫１４において所定期間、所定温度（０～５℃のチルド保存又は０℃以下の冷凍保存）で保存される（冷凍保存工程）。

【0073】

冷蔵庫１４又は冷凍庫１４で冷凍保存された第２間葉系幹細胞３５を使用する場合（冷凍保存工程によって冷凍保存した間葉系幹細胞３５を使用する場合）、図１０に示すように、温度コントロールが可能な所定容積の保温容器４５（恒温槽）を用意し、その保温容器４５の温水中に冷凍保存容器４３を２～３分間漬け（浸水させ）、第２間葉系幹細胞３５を２～３℃の温度に解凍する（幹細胞解凍工程）。保温容器４５では、温水の温度が３５～３７℃に保持される。尚、第１培養生成液３２及び第２培養生成液４２を収容した冷凍保存容器４３を保温容器４５の温水中に２～３分間漬け（浸水させ）、第１及び第２培養生成液３２，４２を２～３℃の温度に解凍する。

【0074】

次に、保温容器４５から冷凍保存容器４３を取り出し、冷凍状態から解凍された第２間葉系幹細胞３５及び凍結保護剤４４を収容した冷凍保存容器４３に洗浄液４６（ダルベッコりん酸緩衝生理食塩水（Ｄ－ＰＢＳ）又はりん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））を注入する。冷凍保存容器４３に洗浄液４６を注入した後、図１１に示すように、洗浄液４６を注入した冷凍保存容器４３を左右に振って冷凍保存容器４３を攪拌し、洗浄液４６（ダルベッコりん酸緩衝生理食塩水（Ｄ－ＰＢＳ）又はりん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））によって冷凍保存容器４３内の第２間葉系幹細胞３５から凍結保護剤４４を除去（分離）する（撹拌除去工程）。

【0075】

担当者（医師や看護師、研究者等）は、撹拌除去工程によって第２間葉系幹細胞３５から凍結保護剤４４を除去（分離）した後、第２間葉系幹細胞３５と間葉系幹細胞３５から分離された凍結保護剤４４と洗浄液４６とを含む混合液を収容した冷凍保存容器４３を遠心分離器４７に設置（セット）する。混合液を遠心分離器４７によって所定時間遠心分離し、冷凍保存容器４３内の第２間葉系幹細胞３５、凍結保護剤４４、洗浄液４６を層状に遠心分離する。冷凍保存容器４３内の混合液は、上下方向へ２層の層状に遠心分離される。

【0076】

担当者は、混合液を２層の層状に分離させた後、図１２に示すように、層状に分離した混合液から下層（最下層）に位置する第２間葉系幹細胞３５を注射器（図示せず）又はピペット（図示せず）を利用して抽出（吸引）する抽出する（間葉系幹細胞抽出工程）。間葉系幹細胞抽出工程によって抽出された第２間葉系幹細胞３５は、その冷凍時に注入された凍結保護剤４４（ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)とエチレングリコール(ＥＧ)とのうちの少なくともジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)）が除去（分離）されている。

【0077】

混合液から下層（最下層）に位置する特定の第２間葉系幹細胞３５を抽出した後、幹細胞活性化工程が行われる。幹細胞活性化工程では、洗浄後の第２間葉系幹細胞３５と培養液４８と第１培養生成液３２及び／又は第２培養生成液４２とを第３扁平培養容器４９（第１培養容器）に注入（収容）する。第３扁平培養容器４９に注入される第１培養生成液３２は、解凍された第２間葉系幹細胞３５（間葉系幹細胞）の元となる第１間葉系幹細胞２１の培養過程において第１間葉系幹細胞２１から分泌された所定の代謝物質を含む培養生成液であり、第３扁平培養容器４９に注入される第２培養生成液４２は、解凍された第２間葉系幹細胞３５（間葉系幹細胞）の培養過程において第２間葉系幹細胞３５から分泌された所定の代謝物質を含む培養生成液である。尚、第３扁平培養容器４９に注入する培養生成液３２，４２の注入割合は、培養容器４９に注入する培養液４８の総注入量を１００％としたときに５～１５％、好ましくは、８～１２％、より好ましくは、１０％である。

【0078】

第３扁平培養容器４９（第１培養容器）は、透明なガラス又は透明なプラスチックから作られ、小容量かつ所定面積の底面を有する平面形状が略正四角形の扁平な容器である。第３扁平培養容器４９の注入口５０は、蓋５１によって水密に閉塞されている。第３扁平培養容器４９は、その容量が約２０～３０ｃｃ（好ましくは、２５ｃｃ）であり、その底面面積が約２５～３６ｍｍ^２であるとともに、その一辺の長さが５～６ｍｍである。尚、第３扁平培養容器４９として小容量かつ所定面積の底面を有する平面形状が円形や楕円形の扁平な容器を使用することもできる。第３扁平培養容器４９の底面５２（底壁外面）には、ドナーデータや幹細胞データが書き込まれたＩＣタグ１８が取り付けられている。

【0079】

洗浄後の第２間葉系幹細胞３５、培養液４８、第１培養生成液３２及び／又は第２培養生成液４２を収容した後、第３扁平培養容器４９を電子顕微鏡１３の試料ホルダ２７に設置（セット）する。電子顕微鏡１３の試料ホルダ２７の上面２８と第３扁平培養容器４９の底部５３との間にスペーサー３０を介在させ、培養容器４９の底部５３をスペーサー３０によって持ち上げた状態に保持し、培養容器４９の底部５３が上となり培養容器４９の頂部５４（注入口５０）が下となるように、培養容器４９を所定角度に傾斜させた（一方向へ傾斜させた）状態に保持する。尚、第３扁平培養容器４９の頂部５４をスペーサー３０によって持ち上げた状態に保持し、培養容器４９の頂部５４が上となり培養容器４９の底部５３が下となるように、培養容器４９を所定角度に傾斜させた（一方向へ傾斜させた）状態に保持してもよい。試料ホルダ２７の上面２８に対する第３扁平培養容器４９の一方向への傾斜角度α３は、２～５°の範囲にあり、好ましくは、２～３°の範囲にある。

【0080】

第３扁平培養容器４９を電子顕微鏡１３の試料ホルダ２７に傾斜させた状態で設置（セット）した後、第２間葉系幹細胞３５、培養液４８、第１培養生成液３２及び／又は第２培養生成液４２を収容した第３扁平培養容器４９を体温と略同一の温度（約３５～３７℃）で２４時間静的に放置（動かすことなく静かに放置）し、第２間葉系幹細胞３５（間葉系幹細胞）を第３扁平培養容器４９（第１培養容器）において３６～３７℃で２４時間培養する。

【0081】

第３扁平培養容器４９を電子顕微鏡１３の試料ホルダ２７に設置（セット）した後、１２時間経過した場合、電子顕微鏡１３の試料ホルダ２７の上面２８と培養容器４９の底部５３との間に介在させたスペーサー３０を取り外し、そのスペーサー３０を電子顕微鏡１３の試料ホルダ２７の上面２８と培養容器４９の頂部５４との間に介在させ、培養容器４９の頂部５４をスペーサー３０によって持ち上げた状態に保持し、培養容器４９の頂部５４が上となり培養容器４９の底部５３が下となるように、培養容器４９を所定角度に傾斜させた（他方向へ傾斜させた）状態に保持する。尚、最初に第３扁平培養容器４９の頂部５４が上となり培養容器４９の底部５３が下となるように傾斜させた場合、スペーサー３０を電子顕微鏡１３の試料ホルダ２７の上面２８と培養容器４９の底部５３との間に介在させ、培養容器４９の底部５３をスペーサー３０によって持ち上げた状態に保持し、培養容器４９の底部５３が上となり培養容器４９の頂部５４が下となるように、培養容器４９を所定角度に傾斜させた（他方向へ傾斜させた）状態に保持する。

【0082】

試料ホルダ２７の上面２８に対する第３扁平培養容器４９の他方向への傾斜角度α３は、２～５°の範囲にあり、好ましくは、２～３°の範囲にある。尚、第３扁平培養容器４９を一方向（又は他方向）へ継続して傾斜させた状態で体温と略同一の温度（約３５～３７℃）で２４時間静的に放置（動かすことなく静かに放置）し、第２間葉系幹細胞３５（間葉系幹細胞）を第３扁平培養容器４９（第１培養容器）において３６～３７℃で２４時間培養する場合もある。

【0083】

試料ホルダ２７の上面２８に対して第３扁平培養容器４９を前記傾斜角度で一方向及び他方向へ傾斜させることで、培養容器４９内において第２間葉系幹細胞３５（間葉系幹細胞）、培養液４８、培養生成液３２，４２が培養容器４９の頂部５４の側（又は底部５３の側）に偏り、培養容器４９の頂部５４の側（又は底部５３の側）において第２間葉系幹細胞３５、培養液４８、培養生成液３２，４２の水圧が大きくなって第２間葉系幹細胞３５が培養容器４９の頂部５４の側（又は底部５３の側）に集中し、それによって第２間葉系幹細胞３５どうしの活性が高まり、培養容器４９の底面５２において第２間葉系幹細胞３５を容易かつ迅速に活性化（定着）させることができる。

【0084】

電子顕微鏡１３は、第３扁平培養容器４９に注入された第２間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像を約１～２時間間隔で撮影し、撮影した第２間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像を約１～２時間間隔で管理サーバ１１に送信する。管理サーバ１１は、電子顕微鏡１３から送信された第２間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像と撮影時間とをＩＣタグ特定情報（ＩＣタグ識別子）及びドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に格納（記憶）する。管理サーバ１１は、電子顕微鏡１３から送信された第２間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像と撮影時間とをディスプレイ１７に出力（表示）する。担当者（医師や看護師、研究者、バイオ技術者等）は、ディスプレイ１７に表示された第２間葉系幹細胞３５の平面形状の拡大画像を１２～２４時間の間において約１～２時間間隔で確認（視認）し、第２間葉系幹細胞３５の平面形状の変化を観察し、第２間葉系幹細胞３５が活性化したか（第３扁平培養容器４９の底面５２に定着したか）否かを判断する（形状変形第３観察工程）。

【0085】

解凍後の第２間葉系幹細胞３５の平面形状は略円形であり、第２間葉系幹細胞３５の平面形状が略円形の場合、第２間葉系幹細胞３５が活性化しておらず（第３扁平培養容器４９の底面５２（底壁内面）に定着しておらず）、第２間葉系幹細胞３５が活性化を開始していない。第２間葉系幹細胞３５の変形後の平面形状は定着前の略円形を核として第２間葉系幹細胞３５が一方向（所定方向）へ不定形に伸張（拡張）した扁平形状であり、第２間葉系幹細胞３５が第３扁平培養容器４９の底面５２（底壁内面）に定着し、第２間葉系幹細胞３５が活性化し、培養容器内４９（第１培養容器内）の第２間葉系幹細胞３５（間葉系幹細胞）が活性化間葉系幹細胞に改質している。

【0086】

担当者は、形状変形第３観察工程における観察の結果、図１４に示すように、ディスプレイ１７に表示された第２間葉系幹細胞３５の平面形状が略円形のまま観察される場合、第２間葉系幹細胞３５が第３扁平培養容器４９の底面５２（底壁内面）に定着していないと判断し、第２間葉系幹細胞３５の平面形状の変化を約１～２時間間隔で継続して観察する。担当者は、形状変形第３観察工程における観察の結果、図１５に示すように、ディスプレイ１７に出力（表示）された第２間葉系幹細胞３５の平面形状が略円形から略円形を核として不定形の扁平形状に変形した場合、第２間葉系幹細胞３５が活性化し（第３扁平培養容器の底面に定着し）、第２間葉系幹細胞３５が活性化間葉系幹細胞５５に改質したと判断する（幹細胞活性化工程）。

【0087】

第２間葉系幹細胞３５が活性化間葉系幹細胞５５に改質したと判断した後、第３扁平培養容器４９に注入されている培養液４８及び培養生成液３２，４２を培養容器４９から排出し、培養容器４９をりん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、トリプシン液を培養容器４９内に注入する。第３扁平培養容器４９にトリプシン液を注入すると、培養容器４９の底面５２に定着した活性化間葉系幹細胞５５がトリプシン液によって底面５２から剥離し、トリプシン液の水面に浮上する。担当者は、浮上した活性化間葉系幹細胞５５をピペットを利用して吸引し、その活性化間葉系幹細胞５５を第３扁平培養容器４９（第１培養容器）から抽出し、その活性化間葉系幹細胞５５を保存容器５６に収容する。

【0088】

活性化間葉系幹細胞５５を抽出後１８～２０時間以内に使用する場合、担当者は、図１７に示すように、活性化間葉系幹細胞５５を収容した保存容器５６を持ち運び可能な恒温ケース５７に収容し、恒温ケース５７内の温度を２０～２１℃に保持し、抽出した活性化間葉系幹細胞５５を２０～２１℃に保持した状態で、１８～２０時間以内に活性化間葉系幹細胞５５の使用箇所まで搬送する（幹細胞搬送工程）。使用箇所まで搬送された活性化間葉系幹細胞５５は、恒温ケース５７から取り出され、各種の疾患（心血管疾患や中枢神経系疾患等）の治療や再生医療における再生、美容等の非治療的用途に使用される。

【0089】

冷凍幹細胞改質方法（冷凍幹細胞改質システム１０）は、冷凍状態から解凍された第２間葉系幹細胞３５（間葉系幹細胞）及び凍結保護剤４４（ヒドロキシエチルスターチ(ＨＥＳ)とジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)とエチレングリコール(ＥＧ)とのうちの少なくともジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)）を収容した冷凍保存容器４３に洗浄液４６（ダルベッコりん酸緩衝生理食塩水（Ｄ－ＰＢＳ）又はりん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））を注入し、洗浄液４６を注入した冷凍保存容器４３を攪拌して洗浄液４６によって冷凍保存容器４３内の第２間葉系幹細胞３５から凍結保護剤４４を除去（分離）し、冷凍保存容器４３内の第２間葉系幹細胞３５、凍結保護剤４４、洗浄液４６を層状に遠心分離し、遠心分離した後の冷凍保存容器４３の最下層に位置する第２間葉系幹細胞３５を抽出するから、冷凍保存された第２間葉系幹細胞３５を解凍する際に洗浄液４６を利用して凍結保護剤４４を除去することができるとともに、冷凍状態から解凍された第２間葉系幹細胞３５の大部分（７０～９０％）を生存させることができる。

【0090】

冷凍幹細胞改質方法（冷凍幹細胞改質システム１０）は、冷凍状態から解凍された第２間葉系幹細胞３５（間葉系幹細胞）を所定容量かつ所定面積の底面を有する第３扁平培養容器４９（第１培養容器）に収容するとともに、第２間葉系幹細胞３５を収容した培養容器４９に所定の培養液４８及び培養生成液３２，４２を注入し、第２間葉系幹細胞３５を培養容器４９において３５～３７℃で２４時間培養し、培養容器４９内の第２間葉系幹細胞３５を活性化させるから、冷凍保存された第２間葉系幹細胞３５を解凍する際に、解凍された第２間葉系幹細胞３５を十分な活性を有する活性化間葉系幹細胞５５に改質することができる。

【0091】

冷凍幹細胞改質方法（冷凍幹細胞改質システム１０）は、各種疾患（心血管疾患や中枢神経系疾患等）の治療や再生医療における再生、美容等の非治療的用途における十分かつ高い効果を有する活性化間葉系幹細胞５５を作ることができ、所望の効果を得ることが可能な活性化間葉系幹細胞５５を作ることができる。冷凍幹細胞改質方法（冷凍幹細胞改質システム１０）は、各種疾患の治療に好適かつタイムリーに使用することが可能な活性化間葉系幹細胞５５を作ることができ、各種組織や各種臓器を再生に好適かつタイムリーに使用することが可能な活性化間葉系幹細胞５５を作ることができるとともに、美容等の非治療的用途に好適かつタイムリーに使用することが可能な活性化間葉系幹細胞５５を作ることができる。冷凍幹細胞改質方法（冷凍幹細胞改質システム１０）は、活性化された活性化間葉系幹細胞５５に凍結保護剤４４が含まれていないから、冷凍幹細胞改質方法によって作られた活性化間葉系幹細胞５５を人体に投与下としても、人体に悪影響を与えることはない。

【0092】

冷凍幹細胞改質方法（冷凍幹細胞改質システム１０）は、培養生成液３２，４２が第１扁平培養容器２２（第２培養容器）又は第２扁平培養容器３３（第３培養容器）から培養後の第１及び第２間葉系幹細胞２１，３５（間葉系幹細胞）を抽出した後に残った培養液であり、間葉系幹細胞２１，３５の培養過程において間葉系幹細胞２１，３５から分泌された所定の代謝物質を含むから、間葉系幹細胞２１，３５自体の代謝物質がトリガーとなり、第２間葉系幹細胞３５が速やかに活性を開始するとともに、その培養生成液３２，４２を利用して第２間葉系幹細胞３５を速やかに培養することができ、活性化間葉系幹細胞５５を短時間に効率よく作ることができる。

【0093】

冷凍幹細胞改質方法（冷凍幹細胞改質システム１０）は、活性化間葉系幹細胞５５を抽出後１８～２０時間以内に使用する場合、活性化間葉系幹細胞５５を２０～２１℃に保持した状態で１８～２０時間以内に活性化間葉系幹細胞５５の使用箇所まで搬送することで、活性化間葉系幹細胞５５の活性が失われず、その活性化間葉系幹細胞５５を各種疾患（心血管疾患や中枢神経系疾患等）の治療に利用することができ、その活性化間葉系幹細胞５５を再生医療における再生に利用することができるとともに、その活性化間葉系幹細胞５５を美容等の非治療的用途に利用することができる。

【符号の説明】

【0094】

１０ 冷凍幹細胞改質システム
１１ 管理サーバ
１２ ＩＣタグリーダ／ライタ
１３ 電子顕微鏡
１４ 冷蔵庫又は冷凍庫
１５ キーボード
１６ マウス
１７ ディスプレイ
１８ ＩＣタグ
１９ 第１骨髄液
２０ ガラス試験管
２１ 第２骨髄液（第１間葉系幹細胞）
２２ 第１扁平培養容器（第２培養容器）
２３ 底面
２４ 注入口
２５ 蓋
２６ 培養液
２７ 試料ホルダ
２８ 上面
２９ 底部
３０ スぺーサー
３１ 頂部
３２ 第１培養生成液
３３ 第２扁平培養容器（第３培養容器）
３４ ガラス試験管
３５ 第２間葉系幹細胞
３６ 培養液
３７ 底面
３８ 注入口
３９ 蓋
４０ 底部
４１ 頂部
４２ 第２培養生成液
４３ 冷凍保存容器
４４ 凍結保護剤
４５ 保温容器
４６ 洗浄剤
４７ 遠心分離器
４８ 培養液
４９ 第３扁平培養容器（第１培養容器）
５０ 注入口
５１ 蓋
５２ 底面
５３ 底部
５４ 頂部
５５ 活性化間葉系幹細胞
５６ 保存容器
５７ 恒温ケース

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】