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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022038980
(43)【公開日】2022-03-10
(54)【発明の名称】発毛促進剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/37 20060101AFI20220303BHJP
A61P 17/14 20060101ALI20220303BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220303BHJP
A61Q 7/00 20060101ALI20220303BHJP
A61Q 5/02 20060101ALI20220303BHJP
A61K 8/49 20060101ALI20220303BHJP
【ＦＩ】
A61K31/37
A61P17/14
A61P43/00 107
A61P43/00 111
A61Q7/00
A61Q5/02
A61K8/49
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020143735
(22)【出願日】2020-08-27
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 刊行物１：Ｃｏｎｇｒｅｓｓ Ｃｈａｉｒｐｅｒｓｏｎｓ：Ｓｈｕｊｉ Ａｋａｉ，Ｙａｓｕｙｕｋｉ Ｋｉｔａ ２７ｔｈ ＩＳＨＣ Ｓｅｃｒｅｔａｒｉａｔ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏｓａｋａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｏｋ ｏｆ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，２７▲ｔｈ▼ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，ｐ．５６３ 令和１年８月２８日 刊行物２：一般社団法人 日本生薬学会、日本本生薬学会第６６回年会 東京２０１９ 講演要旨集 第１８３頁、令和１年８月３１日 刊行物３：公益法人日本薬学会 ｈｔｔｐｓ：／／ｃｏｎｆｉｔ．ａｔｌａｓ．ｊｐ／ｇｕｉｄｅ／ｅｖｅｎｔ／ｐｈａｒｍ１４０／ｓｕｂｊｅｃｔ／２Ｙ１４－２４－０８／ａｄｖａｎｃｅｄ 令和２年３月５日
(71)【出願人】
【識別番号】592101002
【氏名又は名称】株式会社加美乃素本舗
(71)【出願人】
【識別番号】000125347
【氏名又は名称】学校法人近畿大学
(74)【代理人】
【識別番号】110001999
【氏名又は名称】特許業務法人はなぶさ特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】萬瀬 貴昭
(72)【発明者】
【氏名】柳田 満廣
(72)【発明者】
【氏名】中村 翔
(72)【発明者】
【氏名】森川 敏生
【テーマコード（参考）】
4C083
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C083AB332
4C083AC102
4C083AC122
4C083AC302
4C083AC472
4C083AC532
4C083AC642
4C083AC712
4C083AC782
4C083AC841
4C083AC842
4C083AD512
4C083AD532
4C086AA01
4C086AA02
4C086CA01
4C086GA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA92
4C086ZB22
4C086ZC41
(57)【要約】
【課題】男性ホルモンの活性化に影響を与えることがなく、優れたＶＥＧＦ産生促進効果およびβ―カテニン産生促進効果を有する発毛促進剤を提供する。
【解決手段】本発明の発毛促進剤は、下記の化学式１で表される化合物を有効成分とする。
【化１】
（式中のＲ１～Ｒ４は、各々独立に、水素原子、水酸基またはメトキシ基を示す）
【選択図】なし
【解決手段】本発明の発毛促進剤は、下記の化学式１で表される化合物を有効成分とする。
【化１】
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の化学式１で表される化合物を有効成分とする発毛促進剤。
（式中のＲ１～Ｒ４は、各々独立に、水素原子、水酸基またはメトキシ基を示す）
【化1】
【請求項2】
化学式１で表される化合物からなる毛乳頭細胞増殖促進剤。
【請求項3】
化学式１で表される化合物からなるＶＥＧＦ産生促進剤。
【請求項4】
化学式１で表される化合物からなるβ―カテニン産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、発毛促進剤に関する。より詳細には、男性ホルモンの活性化に影響を与えることなく、毛乳頭細胞増殖作用、ＶＥＧＦ産生促進作用、β―カテニン産生促進作用により、優れた脱毛予防効果、育毛・養毛効果、かゆみの抑制効果及び髪質改善効果を持つ、化粧品、医薬部外品、医薬品等の発毛促進組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
毛髪の質や量には個人差があり、生まれつき、または若いときから、毛髪の本数が少ない、毛髪が細いなどの理由で外見上髪が薄い場合がある。また、加齢とともに、毛髪が細くなったり、早期に抜け易くなったりして、年齢が上がると髪が薄くなる場合がある。さらに、ストレスや薬剤の副作用などの医学的な原因により、頭髪全体又は一部の髪が抜けたり、細くなったり、発毛が低減したりすることもある。
毛髪は、成長期、退行期および休止期からなる毛周期（ヘアサイクル）に従い、生えかわっている。この毛周期（ヘアサイクル）のうち、成長期において髪は成長する。しかしながら、この成長期が短くなることにより薄毛となる。薄毛を改善するためには、この短くなった成長期をもとに戻し、毛周期（ヘアサイクル）を正常な状態とすることが重要である。
毛髪は、成長期、退行期および休止期からなる毛周期（ヘアサイクル）に従い、生えかわっている。この毛周期（ヘアサイクル）のうち、成長期において髪は成長する。しかしながら、この成長期が短くなることにより薄毛となる。薄毛を改善するためには、この短くなった成長期をもとに戻し、毛周期（ヘアサイクル）を正常な状態とすることが重要である。
【0003】
毛周期（ヘアサイクル）の成長期において毛乳頭細胞の増殖及び分化が促進されることが知られている（非特許文献１～４）。さらにこの成長を誘導／延長させる生体内因子として、毛乳頭細胞等から分泌されるサイトカインある。このサイトカインとして、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－７）、血管内皮細胞（ＶＥＧＦ）等が知られている（非特許文献５～８）。さらに、毛乳頭細胞の増殖およびサイトカインの分泌におけるメカニズムの一つとして細胞内のβ―カテニンの量の増加がある（非特許文献９～１１）。
また、近年、フェナステリドに代表されるように男性ホルモンの活性化を抑制する発毛成分が利用されているが、副作用があるとともに、その適用疾患は男性型脱毛症に限定され、その適応者も男性となっている（非特許文文献１２）。
特許文献１には、アロエエキスが血管内皮細胞増殖因子の産生を促進することから、育毛効果に優れていることが開示されている。特許文献２には、アスコルビン酸リン酸Ｍｇがβ―カテニンの産生の産生を促進することから、育毛効果に優れていることが開示されている。非特許文献１３には、フェニルプロパノイド成分であるシナピン酸の毛乳頭細胞増殖促進効果およびＶＥＧＦの産生促進効果が報告されている。
また、非特許文献１４には、エンメイソウの主成分のひとつであるエンメインのエンメイソウからの精製方法が報告されており、非特許文献１５にはエンメイソウの化学合成法が報告されている。
また、近年、フェナステリドに代表されるように男性ホルモンの活性化を抑制する発毛成分が利用されているが、副作用があるとともに、その適用疾患は男性型脱毛症に限定され、その適応者も男性となっている（非特許文文献１２）。
特許文献１には、アロエエキスが血管内皮細胞増殖因子の産生を促進することから、育毛効果に優れていることが開示されている。特許文献２には、アスコルビン酸リン酸Ｍｇがβ―カテニンの産生の産生を促進することから、育毛効果に優れていることが開示されている。非特許文献１３には、フェニルプロパノイド成分であるシナピン酸の毛乳頭細胞増殖促進効果およびＶＥＧＦの産生促進効果が報告されている。
また、非特許文献１４には、エンメイソウの主成分のひとつであるエンメインのエンメイソウからの精製方法が報告されており、非特許文献１５にはエンメイソウの化学合成法が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特許５７０３３４０号公報
【特許文献2】特許６５６３１７５号公報
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｂｕｆｆｏｌｉ Ｂ，Ｒｉｎａｌｄｉ Ｆ，Ｌａｂａｎｃａ Ｍ，Ｓｏｒｂｅｌｉｎｉ Ｅ，Ｔｒｉｎｋ Ａ，Ｇｕｒａｎｚｉｒｏｌｉ Ｅ，Ｒｅｚｚａｎ Ｒ，Ｒｏｄｅｌｌａ ＬＦ（２０１４） Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｈａｉｒ：ｆｒｏｍ ａｎａｔｏｍｙ ｔｏ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｉｎｔ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ５３：３３１－３４１
【非特許文献2】Ａｌｏｎｓｏ Ｌ，Ｆｕｃｈｓ Ｅ（２００６） Ｔｈｅ ｈａｉｒ ｃｙｃｌｅ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １１９：３９１－３９３
【非特許文献3】Ｌｉｎ ＣＭ，Ｌｉ Ｙ，Ｊｉ ＹＣ，Ｋｅｎｇ Ｈ，Ｃａｉ ＸＮ，Ｚｈａｎｇ ＪＫ（２００８） Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｈａｉｒ ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ ｃｅｌｌｓ：ａ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ？．Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ ３００：５３１－５３５
【非特許文献4】Ｅｌｌｉｏｔｔ Ｋ，Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ ＴＪ，Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＡＧ（１９９９） Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ ｖｏｌｕｍｅ ａｒｅ ｄｕｅ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｖｏｌｕｍｅ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｓｉｚｅ ａｎｄ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １１３：８７３－８７７
【非特許文献5】Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ＭＪ，Ｈａｍａｄａ Ｋ，Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＡＧ，Ｒａｎｄａｌｌ ＶＡ（１９９８） Ａｎｄｒｏｇｅｎ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｂｅａｒｄ Ｄｅｒｍａｌ Ｐａｐｉｌｌａ Ｃｅｌｌｓ Ｓｅｃｒｅｔｅ Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ｓ） ｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎ Ｕｎｌｉｋｅ Ｓｃａｌｐ Ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １１１（５）：７２７－７３２
【非特許文献6】Ｍｏｒｇａｎ ＡＭ（２０１４） Ｔｈｅ Ｄｅｒｍａｌ Ｐａｐｉｌｌａ：Ａｎ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｎｉｃｈｅ ｆｏｒ Ｅｐｏｔｈｅｌｉａｌ Ｓｔｅｍ ａｎｄ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈａｉｒ Ｆｏｌｌｉｃｌｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ． Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ ４：１－１４
【非特許文献7】Ｌａｃｈｇａｒ Ｓ，Ｍｏｕｋａｄｉｒｉ Ｈ，Ｊｏｎｃａ Ｆ，Ｃｈａｒｖｅｒｏｎ Ｍ，Ｂｏｕｈａｄｄｉｏｕｉ Ｎ，Ｇａｌｌ Ｙ，Ｂｏｎａｆｅ ＪＬ， Ｐｌoｕｅｔ Ｊ（１９９６） Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｉｓ ａｎ Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｈａｉｒ Ｄｅｒｍａｌ Ｐａｐｉｌｌａ Ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ １０６：１７－２３
【非特許文献8】Ｇｕｏ Ｌ，Ｄｅｇｅｎｓｔｅｉｎ Ｌ，Ｆｕｃｈｓ Ｅ（１９９６） Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｈａｉｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｕｔ ｎｏｔ ｆｏｒ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １０：１６５－１７５
【非特許文献9】Ｚｈｏｕ Ｌ，Ｙａｎｇ Ｋ，Ｘｕ Ｍ，Ａｎｄｌ Ｔ，Ｍｉｌｌａｒ ＳＥ，Ｂｏｙｃｅ Ｓ，Ｚｈａｎｇ Ｙ（２０１６） Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ β－ｃａｔｅｎｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ＣＤ１３３－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ ｃｅｌｌｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｈａｉｒ ｉｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ． Ｔｈｅ ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０８：２８２３－２８３５
【非特許文献10】Ｈｅｒｍａｎ Ａ，Ｈｅｒｍａｎ ＡＰ（２０１６） Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｒｂｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｖｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｈａｉｒ ｌｏｓｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ １１４：１８－２５
【非特許文献11】Ｃｌｉｆｆｏｒｄ ＲＬ，Ｄｅａｃｏｎ Ｋ，Ｋｎｏｘ ＡＪ（１９９５） Ｎｏｖｅｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ） ｂｙ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ β１．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８３（５１）：７８５－７８９
【非特許文献12】Ｋａｕｆｍａｎ ＫＤ，Ｏｌｓｅｎ ＥＡ，Ｗｈｉｔｉｎｇ Ｄ，Ｓａｖｉｎ Ｒ，ＤｅＶｉｌｌｅｚ Ｒ，Ｂｅｒｇｆｅｌｄ Ｗ，Ｐｒｉｃｅ Ｖ Ｈ，ｖａｎ Ｎｅｓｔｅ Ｄ，Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｊ Ｌ，Ｈｏｒｄｉｎｓｋｙ Ｍ，Ｓｈａｐｉｒｅ Ｊ，Ｂｉｎｋｏｗｉｔｓ Ｂ，Ｇｏｍｌｅｙ Ｇ Ｊ（１９９８） Ｔｈｅ Ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ Ｍａｌｅ Ｐａｔｔｅｒｎ Ｈａｉｒ Ｌｏｓｓ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ， Ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅｎ ｗｉｔｈ ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｏｐｅｃｉａ．Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ３９：５７８－５８９
【非特許文献13】Ｗｏｏ Ｈ，Ｌｅｅ Ｓ，Ｋｉｍ Ｓ，Ｐａｒｋ Ｄ，Ｊｕｎｇ Ｅ（２０１７） Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｉｎａｐｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ｈａｉｒ ｇｒｏｗｔｈ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ａｋｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ ３０９：３８１－３８８
【非特許文献14】Ｉｋｅｄａ Ｔ，Ｋａｎａｔｏｍｏ Ｓ（１９８５） Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｂｉｔｔｅｒ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｄ ｉｓｏｄｏｎ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐｕｓ．Ｉ．ＹＫＵＧＡＫＵＺＡＳＳＩ ７８：１１２８－１１３２
【非特許文献15】Ｐａｎ Ｓ，Ｃｈｅｎ Ｓ，Ｄｏｎｇ Ｇ（２０１８） Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ Ｔｏｔａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ ｏｆ Ｅｎｍｅｉｎ－Ｔｙｐｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ： （－）－Ｅｎｍｅｉｎ， （－）－Ｉｓｏｄｏｃａｒｐｉｎ， ａｎｄ （－）－ＳｃｕｌｐｏｎｉｎＲ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ５７ （２１）：６３３３－６３３６
【非特許文献16】Ｗｏｏ Ｈ，Ｌｅｅ Ｓ，Ｋｉｍ Ｓ，Ｐａｒｋ Ｄ，Ｊｕｎｇ Ｅ（２０１７） Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｉｎａｐｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ｈａｉｒ ｇｒｏｗｔｈ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ Ａｋｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ ３０９：３８１－３８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
近年、フェナステリドに代表されるように男性ホルモンの活性化を抑制する発毛成分が利用されているが、副作用のおそれがあるとともに、非特許文文献１２に示されるように、その適用疾患は男性型脱毛症に限定され、その適応者も男性となっている。
そこで、男性ホルモンの活性化に作用しないことにより副作用の懸念も少なく、男女問わず使用でき、より優れた育毛効果を示す発毛促進剤を得るために、毛乳頭細胞増殖促進効果、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）産生促進効果、β―カテニン産生促進効果の高い成分が求められている。
そこで、男性ホルモンの活性化に作用しないことにより副作用の懸念も少なく、男女問わず使用でき、より優れた育毛効果を示す発毛促進剤を得るために、毛乳頭細胞増殖促進効果、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）産生促進効果、β―カテニン産生促進効果の高い成分が求められている。
【0007】
本発明は、男性ホルモンの活性化に影響を与えることなく、優れた毛乳頭細胞増殖促進効果、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）産生促進効果、β―カテニン産生促進効果を有する発毛促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、以下の本発明を完成させた。
１．下記の化学式１で表される化合物を有効成分とする発毛促進剤。
（式中のＲ１～Ｒ４は、各々独立に、水素原子、水酸基またはメトキシ基を示す）
２．化学式１で表される化合物からなる毛乳頭細胞増殖促進剤。
３．化学式１で表される化合物からなるＶＥＧＦ産生促進剤。
４．化学式１で表される化合物からなるβ―カテニン産生促進剤。
１．下記の化学式１で表される化合物を有効成分とする発毛促進剤。
【化1】
２．化学式１で表される化合物からなる毛乳頭細胞増殖促進剤。
３．化学式１で表される化合物からなるＶＥＧＦ産生促進剤。
４．化学式１で表される化合物からなるβ―カテニン産生促進剤。
【発明の効果】
【0009】
本発明により、副作用の懸念も少なく、男女問わず使用でき、男性ホルモンの活性化に影響を与えることなく、優れた毛乳頭細胞増殖促進効果、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）産生促進効果、β―カテニン産生促進効果を有する発毛促進剤の提供ができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
化学式１で示される化合物には、エンメイソウ（延命草）等から抽出される成分である、エンメイン、イソドカルピン、ノドシン、シェリンＣなどが挙げられる。
本明細書において「発毛」の用語は、毛包内で毛の新たな発生を促す、あるいは毛の発育・成長を促すように有利にはたらく効果を包含する。なお、ここで毛とは、ヒトを含む動物における身体に生える任意の毛を意味し、例えば、毛髪（頭髪）、眉毛、睫毛、口髭、顎鬚、胸毛、背部毛などあらゆる体毛を意味し、主には、毛髪、眉毛、又は睫毛を意味する。
化学式１で示される化合物には、エンメイソウ（延命草）等から抽出される成分である、エンメイン、イソドカルピン、ノドシン、シェリンＣなどが挙げられる。
本明細書において「発毛」の用語は、毛包内で毛の新たな発生を促す、あるいは毛の発育・成長を促すように有利にはたらく効果を包含する。なお、ここで毛とは、ヒトを含む動物における身体に生える任意の毛を意味し、例えば、毛髪（頭髪）、眉毛、睫毛、口髭、顎鬚、胸毛、背部毛などあらゆる体毛を意味し、主には、毛髪、眉毛、又は睫毛を意味する。
【0012】
エンメイソウ（延命草）としては、シソ科のヒキオコシ Ｉｓｏｄｏｎ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ，Ｒａｂｄｏｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、クロバナヒキオコシＩｓｏｄｏｎ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐｕｓ（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐｕｓ，Ｒａｂｄｏｓｉａ，ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）およびカメバヒキオコシ Ｉｓｏｄｏｎ ｕｍｂｒｏｓｕｓ（ｌｅｕｃａｎｔｈｕｓ
ｋａｍｅｂａ，Ｉｓｏｄｏｎ ｋａｍｅｂａ，Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ ｋａｍｅｂａ）が挙げられ、これらの地上部（葉、茎等）を主に利用する。これらのなかでもクロバナヒキオコシが好ましく、使用する部位としては葉部が好ましい。また、本発明で用いるエンメイソウ抽出物とは、かかる地上部等を乾燥し又は乾燥することなく粉砕あるいは裁断した後、常温又は加温下に、溶剤により抽出するか又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出することにより得られる各種溶媒抽出液、その希釈液、その濃縮液、あるいはその乾燥粉末である。
ここで、エンメイソウの抽出に使用される溶媒は特に限定されず、例えば、水、メチルアルコール、エチルアルコール等の低級アルコール、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール等の液状多価アルコール、酢酸エチル等の低級アルキルエステル、ヘプタン、ヘキサン等の炭化水素、ジエチルエーテル、アセトン等の公知の溶媒が挙げられ、これらの溶媒は、１種ないし２種以上を組み合わせて用いることができる。これらの中でも水およびエタノール水溶液が好ましく、７０％エタノール溶液が特に好ましい。
なお、エンメイソウの抽出は常法で行い、得られたエンメイソウ抽出液はそのまま用いてもよいが、さらに必要により精製、濃縮、濾過等の処理したものを用いることができる。
ｋａｍｅｂａ，Ｉｓｏｄｏｎ ｋａｍｅｂａ，Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ ｋａｍｅｂａ）が挙げられ、これらの地上部（葉、茎等）を主に利用する。これらのなかでもクロバナヒキオコシが好ましく、使用する部位としては葉部が好ましい。また、本発明で用いるエンメイソウ抽出物とは、かかる地上部等を乾燥し又は乾燥することなく粉砕あるいは裁断した後、常温又は加温下に、溶剤により抽出するか又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出することにより得られる各種溶媒抽出液、その希釈液、その濃縮液、あるいはその乾燥粉末である。
ここで、エンメイソウの抽出に使用される溶媒は特に限定されず、例えば、水、メチルアルコール、エチルアルコール等の低級アルコール、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール等の液状多価アルコール、酢酸エチル等の低級アルキルエステル、ヘプタン、ヘキサン等の炭化水素、ジエチルエーテル、アセトン等の公知の溶媒が挙げられ、これらの溶媒は、１種ないし２種以上を組み合わせて用いることができる。これらの中でも水およびエタノール水溶液が好ましく、７０％エタノール溶液が特に好ましい。
なお、エンメイソウの抽出は常法で行い、得られたエンメイソウ抽出液はそのまま用いてもよいが、さらに必要により精製、濃縮、濾過等の処理したものを用いることができる。
【0013】
本発明の発毛促進剤は、化学式１で示される化合物を有効成分とするものであり、優れた発毛促進効果を有し、かつ安全性も高いので、剤型としては錠剤、カプセル剤、散剤、内服液、細粒剤、顆粒剤等の経口投与剤の形態となすことができ、また、適当な基材、薬剤などと混合した皮膚外用剤や頭髪化粧料等の外用形態とすることができる。具体的には、ローション、乳液、軟膏、クリーム、ジェル、オイル、パック、シャンプー、リンス、トリートメント、ヘアートニック、ヘアーリキッド等の形態をとることができる。さらに上記のような外用剤の他にも、例えば、石けん、入浴剤といったものに配合してもよい。また、本発明においてエンメイソウ抽出物を処理したものとしては、例えば、エンメイソウの地上部からの抽出物を酢酸エチルと水にて液―液分配し、得られた酢酸エチル可溶部を活性炭に吸着させ、その後、活性炭を適当な溶媒にて再度抽出した活性炭吸着エキス等が挙げられる。
【0014】
さらに本発明の発毛促進剤は、下記一般式（１）、
（式中のＲ１～Ｒ４は、各々独立に、水素原子、水酸基またはメトキシ基を示す）で表される骨格を有する化合物を有効成分とするものである。
【化2】
【0015】
上記一般式（１）の化合物には、エンメイン、イソドカルピン、ノドシン、シェリンＣなどが挙げられ、植物からの抽出、単離、または既知の方法による合成により得ることができる。特に、前記の方法によりエンメイソウの地上部からエンメイソウ抽出物を得た後、精製処理をすることにより、好適に得ることができる。
精製処理は、例えば、クロマトグラフ法、イオン交換樹脂、活性炭を使用する溶離法、溶媒による分配抽出、再結晶法等を単独、又は組み合わせて採用することができる。クロマトグラフ法としては、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、遠心液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を挙げることができ、これらのいずれか、又はそれらを組み合わせで行う方法が挙げられる。この際の担体、溶出溶媒等の精製条件は、各種クロマトグラフィーに対応して適宣選択することができる。
精製処理は、例えば、クロマトグラフ法、イオン交換樹脂、活性炭を使用する溶離法、溶媒による分配抽出、再結晶法等を単独、又は組み合わせて採用することができる。クロマトグラフ法としては、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、遠心液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を挙げることができ、これらのいずれか、又はそれらを組み合わせで行う方法が挙げられる。この際の担体、溶出溶媒等の精製条件は、各種クロマトグラフィーに対応して適宣選択することができる。
【0016】
また、本発明においては、上記一般式中のＲ１が水酸基、Ｒ２が水素、Ｒ３が水素、Ｒ４が水酸基である下記式で表されるエンメイン（ｅｎｍｅｉｎ）であることが好ましい。
【化3】
【0017】
エンメインは、エンメイソウ抽出物から定法により単離することも可能である。また、非特許文献１３の方法等により精製することもできるし、非特許文献１４の方法等により合成することもできる。
【0018】
本発明において、エンメイソウ抽出液の配合量は、添加形態および投与形態によっても異なるが、外用剤の場合には、全組成物中０．０００１～９０質量％配合することが好ましく、０．００１～５０質量％配合することがより好ましく、０．０００１～１０質量％配合することがさらにより好ましい。また、経口投与剤の場合には、成人一日あたり、０．００１から１００ｇになるようにするのが好ましい。
【0019】
また、本発明の発毛促進剤は、男性ホルモンの活性化に影響を与えることなく毛乳頭細胞増殖促進効果、ＶＥＧＦ遺伝子発現促進効果、ＶＥＧＦタンパク産生促進効果およびβ―カテニンタンパク発現促進効果を併せ持つ。
【0020】
また、本発明の発毛促進剤には、さらに必要に応じて、本発明の効果を損なわない範囲で、化粧品や医薬品等に一般的に用いられている保湿剤、油性成分、界面活性剤、ビタミン類、タンパク分解酵素、増粘剤、防腐剤、紛体、酸化防止剤、紫外線吸収剤、乳化剤、アルコール類、色素、水溶性成分、脂肪酸類、香料、キレート剤、ｐＨ調整剤、精製水等の添加成分を配合することができる。
【0021】
保湿剤としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、１，３－ブチレングリコール等の多価アルコール、ソルビット、マンニット等の糖アルコール、ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、冬虫夏草エキス、延命草エキス、オオムギエキス、ブドウエキス、チューベロースポリサッカライド、桔梗エキス、ヨクイニンエキス、オトギリソウエキス、オーツ麦エキス等が挙げられる。
【0022】
油性成分としては、例えばユーカリ油、サフラワー油、月見草油、ホホバ油等の植物油、不飽和脂肪酸アルキルエステル（オレイン酸エチル、リノール酸イソプロピル等）、リノレイン酸エステル、ミリスチン酸メチル、ミリスチン酸イソプロピル等のエステル油、多価アルコール脂肪酸エステル（トリ－２エチルヘキサン酸グリセリン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン酸等の多価アルコール脂肪酸エステル等のエステル類、精油類、シリコーン油類などが挙げられる。
【0023】
界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレート等）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油モノ又はイソステアレート、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル（モノミリスチン酸デカグリセリン、モノミリスチン酸ペンタグリセリン等の非イオン性界面活性剤、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸カリウム等の高級アルキル硫酸エステル塩、ＰＯＥ－ラウリル硫酸トリエタノールアミン、ＰＯＥ－ラウリル硫酸ナトリウム等のアルキルエーテル硫酸エステル塩、ラウロイルサルコシンナトリウム等のＮ－アシルサルコシン酸、Ｎ－ミリストイル－Ｎ－メチルタウリンナトリウム、ヤシ油脂肪酸メチルタウリッドナトリウム、ラウリルメチルタウリッドナトリウム等の高級脂肪酸アミドスルホン酸塩、ＰＯＥオレイルエーテルリン酸ナトリウム、ＰＯＥステアリルエーテルリン酸等のリン酸エステル塩、ジ－２－エチルヘキシルスルホコハク酸ナトリウム、モノラウロイルモノエタノールアミドポリオキシエチレンスルホコハク酸ナトリウム、ラウリルポリプロピレングリコールスルホコハク酸ナトリウム等のスルホコハク酸塩、リニアドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、リニアドデシルベンゼンスルホン酸トリエタノールアミン、ドデシルベンゼンスルホン酸等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、Ｎ－ラウロイルグルタミン酸モノナトリウム、Ｎ－ステアロイルグルタミン酸ジナトリウム、Ｎ－ミリストイル－Ｌ－グルタミン酸モノナトリウム等のＮ－アシルグルタミン酸塩、
硬化ヤシ油脂肪酸グリセリン硫酸ナトリウム等の高級脂肪酸エステル硫酸エステル塩、ＰＯＥ－アルキルエーテルカルボン酸、ＰＯＥ－アルキルアリルエーテルカルボン酸塩、α－オレフィンスルホン酸塩、高級脂肪酸エステルスルホン酸塩、二級アルコール硫酸エステル塩、高級脂肪酸アルキロールアミド硫酸エステル塩、ラウロイルモノエタノールアミドコハク酸ナトリウム、Ｎ－パルミトイルアスパラギン酸ジトリエタノールアミン、カゼインナトリウム等のアニオン界面活性剤、第四級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤、塩化ポリ（Ｎ，Ｎ’－ジメチル－３，５－メチレンピペリジニウム）、アルキルイソキノリニウム塩、ジアルキルモリホニウム塩、ＰＯＥ－アルキルアミン、アルキルアミン塩、ポリアミン脂肪酸誘導体、アミルアルコール脂肪酸誘導体、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等が挙げられる。第四級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤としては、例えば、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ベヘニルトリメチルアンモニウム、臭化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化ラウリルベンジルジメチルアンモニウム等のカチオン界面活性剤、第四級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤、塩化ポリ（Ｎ，Ｎ’－ジメチル－３，５－メチレンピペリジニウム）、アルキルイソキノリニウム塩、ジアルキルモリホニウム塩、ＰＯＥ－アルキルアミン、アルキルアミン塩、ポリアミン脂肪酸誘導体、アミルアルコール脂肪酸誘導体、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等が挙げられる。第四級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤としては、例えば、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ベヘニルトリメチルアンモニウム、臭化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化ラウリルベンジルジメチルアンモニウム等のカチオン界面活性剤、２－ウンデシル－Ｎ，Ｎ，Ｎ－（ヒドロキシエチルカルボキシメチル）－２－イミダゾリンナトリウム等のイミダゾリン系両性界面活性剤、２－ヘプタデシル－Ｎ－カルボキシメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等のベタイン系界面活性剤等の両性界面活性剤が挙げられる。
硬化ヤシ油脂肪酸グリセリン硫酸ナトリウム等の高級脂肪酸エステル硫酸エステル塩、ＰＯＥ－アルキルエーテルカルボン酸、ＰＯＥ－アルキルアリルエーテルカルボン酸塩、α－オレフィンスルホン酸塩、高級脂肪酸エステルスルホン酸塩、二級アルコール硫酸エステル塩、高級脂肪酸アルキロールアミド硫酸エステル塩、ラウロイルモノエタノールアミドコハク酸ナトリウム、Ｎ－パルミトイルアスパラギン酸ジトリエタノールアミン、カゼインナトリウム等のアニオン界面活性剤、第四級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤、塩化ポリ（Ｎ，Ｎ’－ジメチル－３，５－メチレンピペリジニウム）、アルキルイソキノリニウム塩、ジアルキルモリホニウム塩、ＰＯＥ－アルキルアミン、アルキルアミン塩、ポリアミン脂肪酸誘導体、アミルアルコール脂肪酸誘導体、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等が挙げられる。第四級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤としては、例えば、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ベヘニルトリメチルアンモニウム、臭化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化ラウリルベンジルジメチルアンモニウム等のカチオン界面活性剤、第四級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤、塩化ポリ（Ｎ，Ｎ’－ジメチル－３，５－メチレンピペリジニウム）、アルキルイソキノリニウム塩、ジアルキルモリホニウム塩、ＰＯＥ－アルキルアミン、アルキルアミン塩、ポリアミン脂肪酸誘導体、アミルアルコール脂肪酸誘導体、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等が挙げられる。第四級アンモニウム塩型カチオン性界面活性剤としては、例えば、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ベヘニルトリメチルアンモニウム、臭化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化ラウリルベンジルジメチルアンモニウム等のカチオン界面活性剤、２－ウンデシル－Ｎ，Ｎ，Ｎ－（ヒドロキシエチルカルボキシメチル）－２－イミダゾリンナトリウム等のイミダゾリン系両性界面活性剤、２－ヘプタデシル－Ｎ－カルボキシメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等のベタイン系界面活性剤等の両性界面活性剤が挙げられる。
【実施例0024】
以下に実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【0025】
（実施例１）
実施例１は、エンメイソウから抽出物を抽出した実施例である。
１）エンメイソウの地上部の刻み３ｋｇ（日本産、三国（株）社製）を７０％エタノール溶液による抽出を３回繰り返し行い、７０％エタノール溶液抽出液を得た。得られたメタノール抽出液を減圧下溶媒留去して７０％エタノール溶液抽出エキスを得た。
２）７０％エタノール溶液抽出エキスについて、酢酸エチル／水にて分液を行い、酢酸エチル層を得た。
３）酢酸エチル層について、溶媒を留去し、さらに順相および逆相カラムクロマトグラフィー、次いでＨＰＬＣにて精製を行い、化合物１～２０（不図示）を得た。
実施例１は、エンメイソウから抽出物を抽出した実施例である。
１）エンメイソウの地上部の刻み３ｋｇ（日本産、三国（株）社製）を７０％エタノール溶液による抽出を３回繰り返し行い、７０％エタノール溶液抽出液を得た。得られたメタノール抽出液を減圧下溶媒留去して７０％エタノール溶液抽出エキスを得た。
２）７０％エタノール溶液抽出エキスについて、酢酸エチル／水にて分液を行い、酢酸エチル層を得た。
３）酢酸エチル層について、溶媒を留去し、さらに順相および逆相カラムクロマトグラフィー、次いでＨＰＬＣにて精製を行い、化合物１～２０（不図示）を得た。
【0026】
（実施例２）
実施例２は、実施例１で得た７０％エタノール溶液抽出エキス、酢酸エチル層および単離した４種類のエントカウラン型ジテルペノイド（化合物１～４）について、毛乳頭細胞増殖促進作用試験を行った実施例である。
まず、正常ヒト毛乳頭細胞（タカラバイオ（株）社製）をウシ胎児結成（ＦＢＳ）（１０％）、ペニシリンＧ（１００ｕｎｉｔｓ/ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００μｇ/ｍＬ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。
このように培養された細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（０.０５％濃度）によりトリプシン処理した。処理後の細胞を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）不含ＤＭＥＭ培地を用いて
、１．０×１０５細胞／ｍＬの濃度に希釈した。希釈された細胞を、９６ウエルのマイクロプレートに、１００μＬ／ウエルで播種し、１日間培養した。
実施例２は、実施例１で得た７０％エタノール溶液抽出エキス、酢酸エチル層および単離した４種類のエントカウラン型ジテルペノイド（化合物１～４）について、毛乳頭細胞増殖促進作用試験を行った実施例である。
まず、正常ヒト毛乳頭細胞（タカラバイオ（株）社製）をウシ胎児結成（ＦＢＳ）（１０％）、ペニシリンＧ（１００ｕｎｉｔｓ/ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００μｇ/ｍＬ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。
このように培養された細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（０.０５％濃度）によりトリプシン処理した。処理後の細胞を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）不含ＤＭＥＭ培地を用いて
、１．０×１０５細胞／ｍＬの濃度に希釈した。希釈された細胞を、９６ウエルのマイクロプレートに、１００μＬ／ウエルで播種し、１日間培養した。
【0027】
被験試料としての化合物１～４を、所定の濃度でＦＢＳ不含ＤＭＥＭに溶解した。濃度は、５μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、２０μｍｏｌ／Ｌ、４０μｍｏｌ／Ｌのそれぞれとした。
溶解された各被験試料を、上記の細胞を播種した９６ウエルマイクロプレートの各ウエルに１００μＬ／ウエルの量で添加し、さらに４日間培養した。毛乳頭細胞増殖効果は、ＷＳＴ-８アッセイを用いて測定した。即ち、培養後、各ウエルにＷＳＴ-８溶液（株式会社同仁化学研究所社製）を加え、３７℃、５％ＣＯ２下で１時間培養を行い、細胞増殖の指標としてＯ.Ｄ.値（４５０－６５５ｎｍ）の測定を行った。毛乳頭細胞増殖促進率（％）は、以下の式（１）により算出した。
毛乳頭細胞増殖率（％） ＝ Ａ１ ／ Ｂ１ × １００ ・・・式（１）
Ａ１：被験試料添加時のＯ.Ｄ．４５０－６５０値
Ｂ１：被験試料無添加時（コントロール）のＯ.Ｄ．４５０－６５０値
溶解された各被験試料を、上記の細胞を播種した９６ウエルマイクロプレートの各ウエルに１００μＬ／ウエルの量で添加し、さらに４日間培養した。毛乳頭細胞増殖効果は、ＷＳＴ-８アッセイを用いて測定した。即ち、培養後、各ウエルにＷＳＴ-８溶液（株式会社同仁化学研究所社製）を加え、３７℃、５％ＣＯ２下で１時間培養を行い、細胞増殖の指標としてＯ.Ｄ.値（４５０－６５５ｎｍ）の測定を行った。毛乳頭細胞増殖促進率（％）は、以下の式（１）により算出した。
毛乳頭細胞増殖率（％） ＝ Ａ１ ／ Ｂ１ × １００ ・・・式（１）
Ａ１：被験試料添加時のＯ.Ｄ．４５０－６５０値
Ｂ１：被験試料無添加時（コントロール）のＯ.Ｄ．４５０－６５０値
【0028】
メタノール抽出エキス、酢酸エチル層および化合物１～４のそれぞれについて算出された毛乳頭細胞増殖促進率を、以下の表１に示す。毛乳頭細胞増殖率は、化合物１～４の各濃度についてそれぞれ、３回測定した。その３回の測定値の平均値および標準誤差を、「平均値±標準誤差」として示す。なお、各測定値は、コントロールを１００％とした相対値である。陽性対照として、現在、育毛成分として使用されている硫酸ミノキシジルおよび毛乳頭細胞増殖促進効果が明らかとなっているシナピン酸（非特許文献１５）を用いた。
【表1】
【0029】
上記表１に示されるように、７０％エタノール溶液、酢酸エチル層、メタノール層、エンメイン（化合物１）、ノドシン（化合物３）のそれぞれにおける１０μｍｏｌ／Ｌにおいて、また、イソドカルピン（化合物２）の５μｍｏｌ／Ｌおいて、さらに、シェリンＣ（化合物４）の１μｍｏｌ／Ｌおいて、陽性対照である硫酸ミノキシジルおよびシナピン酸を上回る活性強度を有していた。
実施例２の結果から、エンメイン（化合物１）、イソドカルピン（化合物２）、ノドシン（化合物３）、セリシンＣ（化合物４）は、毛乳頭細胞増殖促進剤の有効成分となり得ることが確認された。これらの化合物１～４は、低濃度で硫酸ミノキシジルおよびシナピン酸を超える毛乳頭細胞増殖促進効果を示している。したがって、エンメイン（化合物１）、イソドカルピン（化合物２）、ノドシン（化合物３）、セリシンＣ（化合物（化合物４）は、硫酸ミノキシジルおよびシナピン酸より毛乳頭細胞増殖促進効果が優れていることがわかる。
実施例２の結果から、エンメイン（化合物１）、イソドカルピン（化合物２）、ノドシン（化合物３）、セリシンＣ（化合物４）は、毛乳頭細胞増殖促進剤の有効成分となり得ることが確認された。これらの化合物１～４は、低濃度で硫酸ミノキシジルおよびシナピン酸を超える毛乳頭細胞増殖促進効果を示している。したがって、エンメイン（化合物１）、イソドカルピン（化合物２）、ノドシン（化合物３）、セリシンＣ（化合物（化合物４）は、硫酸ミノキシジルおよびシナピン酸より毛乳頭細胞増殖促進効果が優れていることがわかる。
【0030】
（実施例３）
実施例３は、実施例１で単離したエンメイン（化合物１）について、ヘアサイクルに関与する増殖因子ＶＥＧＦ遺伝子に対するｍＲＮＡ産生促進試験を行ったものである。産生促進試験は、ｍＲＮＡの発現を評価するｍＲＮＡ発現促進作用試験（リアルタイムＰＣＲ法）により行った。
実施例２で用いたものと同様に、３７℃、５％ＣＯ２下で培養したで培養されたヒト正常毛乳頭細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（０．０５％濃度）によりトリプシン処理した。
処理後の細胞を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ培地を用いて、４．０×１０４細胞／ｍＬの濃度に希釈した。希釈された細胞を、６ウエルのマイクロプレートに、１ｍＬ／ウエルで播種し、４日間培養した。培養後、培地を吸引除去し、ＰＢＳ（－）を用いて洗浄後、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）不含ＤＭＥＭ培地（１ｍＬ）を加え、１日間培養した。
その後、被験試料としてのエンメイン（化合物１）を、２．５μｍｏｌ／Ｌ、５μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、２０μｍｏｌ／Ｌのそれぞれの濃度でＦＢＳ不含ＤＭＥＭに溶解させた試験液を１ｍＬ／ウエルで加え、さらに１日間培養した。
実施例３は、実施例１で単離したエンメイン（化合物１）について、ヘアサイクルに関与する増殖因子ＶＥＧＦ遺伝子に対するｍＲＮＡ産生促進試験を行ったものである。産生促進試験は、ｍＲＮＡの発現を評価するｍＲＮＡ発現促進作用試験（リアルタイムＰＣＲ法）により行った。
実施例２で用いたものと同様に、３７℃、５％ＣＯ２下で培養したで培養されたヒト正常毛乳頭細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（０．０５％濃度）によりトリプシン処理した。
処理後の細胞を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ培地を用いて、４．０×１０４細胞／ｍＬの濃度に希釈した。希釈された細胞を、６ウエルのマイクロプレートに、１ｍＬ／ウエルで播種し、４日間培養した。培養後、培地を吸引除去し、ＰＢＳ（－）を用いて洗浄後、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）不含ＤＭＥＭ培地（１ｍＬ）を加え、１日間培養した。
その後、被験試料としてのエンメイン（化合物１）を、２．５μｍｏｌ／Ｌ、５μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、２０μｍｏｌ／Ｌのそれぞれの濃度でＦＢＳ不含ＤＭＥＭに溶解させた試験液を１ｍＬ／ウエルで加え、さらに１日間培養した。
【0031】
培養後、一般的な方法によりｔｏｔａｌＲＮＡを調製した。被験試料無添加で培養した細胞についても、同様にｔｏｔａｌＲＮＡを調製した。それぞれのＲＮＡ量を分光光度計で測定し、０．２μｇ/μＬになるようにｔｏｔａｌＲＮＡを調製した。このｔｏｔａｌＲＮＡを鋳型とし、市販のキットにて、ｃＤＮＡを調製した。このｃＤＮＡを鋳型とし、ヘアサイクルに関与する各種増殖因子であるＶＥＧＦ及び内部標準であるＲＰＬＰ０のｍＲＮＡ発現量を測定した。検出は、リアルタイムＰＣＲ装置（ＣＦＸ Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社製））を用いて、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄｔｍ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社製）によるリアルタイムＰＣＲ反応により行った。
増殖因子ＶＥＧＦのｍＲＮＡ発現量は、ＲＰＬＰ０のｍＲＮＡの発現量で補正した。
なお、増殖因子ＶＥＧＦのｍＲＮＡの発現値は以下の式（２）により算出した。
増殖因子ＶＥＧＦのｍＲＮＡの発現値＝Ａ２／Ｂ２ 式（２）
Ａ２：被験試料添加時の補正値
Ｂ２：被験試料無添加時（コントロール）の補正値
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社製）によるリアルタイムＰＣＲ反応により行った。
増殖因子ＶＥＧＦのｍＲＮＡ発現量は、ＲＰＬＰ０のｍＲＮＡの発現量で補正した。
なお、増殖因子ＶＥＧＦのｍＲＮＡの発現値は以下の式（２）により算出した。
増殖因子ＶＥＧＦのｍＲＮＡの発現値＝Ａ２／Ｂ２ 式（２）
Ａ２：被験試料添加時の補正値
Ｂ２：被験試料無添加時（コントロール）の補正値
【0032】
エンメイン（化合物１）についての増殖因子ＶＥＧＦのｍＲＮＡ発現値を、以下の表２に示す。表２に示すｍＲＮＡ発現値は、それぞれ１点について、コントロールを１とした相対値である。
【表2】
【0033】
上記の表２に示されるように、エンメイン（化合物１）には、被験試料無添加の２倍程度の増殖因子ＶＥＧＦのｍＲＮＡ産生促進効果が認められた。
このように、実施例３の結果から、エンメイン（化合物１）は、増殖因子ＶＥＧＦのｍＲＮＡ産生促進剤の有効成分となり得ることが確認された。
このように、実施例３の結果から、エンメイン（化合物１）は、増殖因子ＶＥＧＦのｍＲＮＡ産生促進剤の有効成分となり得ることが確認された。
【0034】
（実施例４）
実施例４は、実施例２で単離したエンメイン（化合物１）について、ヘアサイクルに関与する増殖因子ＶＥＧＦタンパクに対する産生促進試験を行ったものである。産生促進試験は、ヒト毛乳頭細胞から培地へ分泌されたＶＥＧＦタンパク量をエライザ法にて定量し、評価する方法により行った。
実施例２で用いたものと同様に、３７℃、５％ＣＯ２下で培養されたヒト正常毛乳頭細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（０．０５％濃度）によりトリプシン処理した。処理後
の細胞を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ培地を用いて、４．０×１０４細胞／ｍＬの濃度に希釈した。希釈された細胞を、６ウエルのマイクロプレートに、５００μＬ／ウエルで播種し、４日間培養した。培養後、培地を吸引除去し、ＰＢＳ（－）を用いて洗浄後、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）不含ＤＭＥＭ培地（２００μＬ）を加え、１日間培養した。
その後、被験試料としてのエンメイン（化合物１）を、５μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、２０μｍｏｌ／Ｌのそれぞれの濃度でＦＢＳ不含ＤＭＥＭに溶解させた試験液を２００μＬ／ウエルで加え、さらに１日間培養した。
実施例４は、実施例２で単離したエンメイン（化合物１）について、ヘアサイクルに関与する増殖因子ＶＥＧＦタンパクに対する産生促進試験を行ったものである。産生促進試験は、ヒト毛乳頭細胞から培地へ分泌されたＶＥＧＦタンパク量をエライザ法にて定量し、評価する方法により行った。
実施例２で用いたものと同様に、３７℃、５％ＣＯ２下で培養されたヒト正常毛乳頭細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（０．０５％濃度）によりトリプシン処理した。処理後
の細胞を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ培地を用いて、４．０×１０４細胞／ｍＬの濃度に希釈した。希釈された細胞を、６ウエルのマイクロプレートに、５００μＬ／ウエルで播種し、４日間培養した。培養後、培地を吸引除去し、ＰＢＳ（－）を用いて洗浄後、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）不含ＤＭＥＭ培地（２００μＬ）を加え、１日間培養した。
その後、被験試料としてのエンメイン（化合物１）を、５μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、２０μｍｏｌ／Ｌのそれぞれの濃度でＦＢＳ不含ＤＭＥＭに溶解させた試験液を２００μＬ／ウエルで加え、さらに１日間培養した。
【0035】
培養後、培地上精２００μＬをマイクロチューブにとり、遠心分離（５０００ｒｐｍ／５ｍｉｎ）を行った後、その上精を市販のエライザキットにて培地中の増殖因子ＶＥＧＦタンパク量を測定した。
なお、増殖因子ＶＥＧＦタンパク量産生促進率（％）は、以下の式（３）により算出した
増殖因子ＶＥＧＦタンパク量産生促進率（％）＝Ａ３／Ｂ３×１００ 式（３）
Ａ３：被験試料添加時の増殖因子ＶＥＧＦタンパク量
Ｂ３：被験試料無添加時（コントロール）の増殖因子ＶＥＧＦタンパク量
なお、増殖因子ＶＥＧＦタンパク量産生促進率（％）は、以下の式（３）により算出した
増殖因子ＶＥＧＦタンパク量産生促進率（％）＝Ａ３／Ｂ３×１００ 式（３）
Ａ３：被験試料添加時の増殖因子ＶＥＧＦタンパク量
Ｂ３：被験試料無添加時（コントロール）の増殖因子ＶＥＧＦタンパク量
【0036】
エンメイン（化合物１）についての増殖因子ＶＥＧＦタンパク量産生促進率（％）を、以下の表３に示す。表３に示す増殖因子ＶＥＧＦタンパク量産生促進率（％）は、それぞれ１点について、コントロールを１００％とした相対値である
【表3】
【0037】
上記の表３に示されるように、エンメイン（化合物１）には、被験試料無添加の１．２倍程度の増殖因子ＶＥＧＦタンパク量産生促進効果が認められた。
このように、実施例４の結果から、エンメイン（化合物１）は、ＶＥＧＦタンパク量産生促進剤の有効成分となり得ることが確認された。
このように、実施例４の結果から、エンメイン（化合物１）は、ＶＥＧＦタンパク量産生促進剤の有効成分となり得ることが確認された。
【0038】
（実施例５）
実施例５は、実施例２で単離したエンメイン（化合物１）について、細胞の分化・増殖に関与するシグナル伝達分子であるβ―カテニンに対する産生促進試験を行った実施例である。産生促進試験は、ヒト毛乳頭細胞内のβ―カテニン量をウェスタンブロット法にて評価する方法により行った。
実施例２で用いたものと同様に、３７℃、５％ＣＯ２下で培養されたヒト正常毛乳頭細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（０．０５％濃度）によりトリプシン処理した。処理後の細胞を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ培地を用いて、５．０×１０５細胞／ｍＬの濃度に希釈した。希釈された細胞を、７５ｃｍ２培養フラスコに１．０ｍＬ播種し、サブコンフルエントになるまで培養した。培養後、培地を吸引除去、ＰＢＳ（－）を用いて洗浄後、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）不含ＤＭＥＭ培地（１０ｍＬ）加え、１日間培養した。
その後、培地を除去し、被験試料としてのエンメイン（化合物１）を、５μｍｏｌ／Ｌ
、１０μｍｏｌ／Ｌ、２０μｍｏｌ／Ｌのそれぞれの濃度でＦＢＳ不含ＤＭＥＭに溶解させた試験液を１０ｍＬ／ウエルで加え、さらに1日間培養した。
実施例５は、実施例２で単離したエンメイン（化合物１）について、細胞の分化・増殖に関与するシグナル伝達分子であるβ―カテニンに対する産生促進試験を行った実施例である。産生促進試験は、ヒト毛乳頭細胞内のβ―カテニン量をウェスタンブロット法にて評価する方法により行った。
実施例２で用いたものと同様に、３７℃、５％ＣＯ２下で培養されたヒト正常毛乳頭細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（０．０５％濃度）によりトリプシン処理した。処理後の細胞を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ培地を用いて、５．０×１０５細胞／ｍＬの濃度に希釈した。希釈された細胞を、７５ｃｍ２培養フラスコに１．０ｍＬ播種し、サブコンフルエントになるまで培養した。培養後、培地を吸引除去、ＰＢＳ（－）を用いて洗浄後、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）不含ＤＭＥＭ培地（１０ｍＬ）加え、１日間培養した。
その後、培地を除去し、被験試料としてのエンメイン（化合物１）を、５μｍｏｌ／Ｌ
、１０μｍｏｌ／Ｌ、２０μｍｏｌ／Ｌのそれぞれの濃度でＦＢＳ不含ＤＭＥＭに溶解させた試験液を１０ｍＬ／ウエルで加え、さらに1日間培養した。
【0039】
培養後、一般的な方法により細胞溶解液を調製した。被験試料無添加で培養した細胞についても、同様に細胞溶解液を調製した。それぞれの細胞溶解液を市販のＢＣＡタンパク定量キットにて総タンパク量で測定し、総タンパク量を１μｇ／μＬになるように細胞溶解液を調製した。この細胞溶解液２５μＬをポリアクリドゲルに充填し、電気泳動を行った。
電気泳動後、ニトロセルロース膜にブロティングした後、抗β―カテニン抗体および抗β―アクチン抗体をそれぞれ反応させＨＲＰが結合された２次抗体を反応させた。その後ケミルミシステムにてタンパクを蛍光検出し、その蛍光強度を数値化し、β―カテニン量を求めた。
β―カテニン量は、β―アクチン量で補正し算出した。β―カテニン産生促進量は以下の式（４）により算出した。
β―カテニン産生促進量（％）＝Ａ４／Ｂ４×１００ 式（４）
Ａ４：被験試料添加時の補正値
Ｂ４：被験試料無添加時（コントロール）の補正時値
電気泳動後、ニトロセルロース膜にブロティングした後、抗β―カテニン抗体および抗β―アクチン抗体をそれぞれ反応させＨＲＰが結合された２次抗体を反応させた。その後ケミルミシステムにてタンパクを蛍光検出し、その蛍光強度を数値化し、β―カテニン量を求めた。
β―カテニン量は、β―アクチン量で補正し算出した。β―カテニン産生促進量は以下の式（４）により算出した。
β―カテニン産生促進量（％）＝Ａ４／Ｂ４×１００ 式（４）
Ａ４：被験試料添加時の補正値
Ｂ４：被験試料無添加時（コントロール）の補正時値
【0040】
エンメイン（化合物１）についてのβ―カテニン産生促進量を、以下の表４に示す。表４に示す産生促進量は、それぞれ１点について、コントロールを１とした相対値である。
【表4】
【0041】
上記の表４に示されるように、エンメイン（化合物１）には、被験試料無添加時と比較してβ―カテニン産生促進効果が認められた。
このように、実施例５の結果から、エンメイン（化合物１）は、β―カテニン産生促進剤の有効成分となり得ることが確認された。
このように、実施例５の結果から、エンメイン（化合物１）は、β―カテニン産生促進剤の有効成分となり得ることが確認された。
【0042】
（実施例６）
実施例６は、実施例２で単離したエンメイン（化合物１）について、男性ホルモンの活性化酵素である５α―リダクターゼに対する酵素阻害活性試験を行ったものである。酵素阻害活性試験は、下記の方法による評価を行った。
ここで、４８穴マイクロプレートを使用し、緩衝液には４０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４－Ｋ２ＨＰＯ４ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ６．５（富士フイルム和光純薬（株）社製）を用いて実験を行った。
０．３５ｎｍｏｌのｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ（東京化成（株）社製）と１０ｎｍｏｌのＮＡＤＰＨ（富士フイルム和光純薬（株）社製）との混合溶液を各ウエルに４９０μＬずつ添加し、被験物質（ＤＭＳＯで希釈）を５μＬずつ添加した。室温で２０分間インキュベートした後、１０倍希釈したＳ９ Ｒａｔ Ｌｉｖｅｒ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ（オリエンタル酵母工業（株）社製）を１０μＬずつ添加し、３７℃で３０分間加温して反応させた。反応後、沸騰水浴で２分間加熱し、酵素を失活させた。酵素失活後の溶液５００μＬ／ｗｅｌｌを抜き取り、酢酸エチル５００μＬと混ぜ、遠心分離（１００００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）した。酢酸エチル層３００μＬを取りだし、酢酸エチルを除去してテストステロンを得た。得られたテストステロンを内部標準物質（ｆｌｕｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ
ａｃｅｔａｔｅ ２０μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）含有のアセトニトリル３０μＬで溶かし、ＨＰＬＣにてテストステロン濃度を定量した。
実施例６は、実施例２で単離したエンメイン（化合物１）について、男性ホルモンの活性化酵素である５α―リダクターゼに対する酵素阻害活性試験を行ったものである。酵素阻害活性試験は、下記の方法による評価を行った。
ここで、４８穴マイクロプレートを使用し、緩衝液には４０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４－Ｋ２ＨＰＯ４ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ６．５（富士フイルム和光純薬（株）社製）を用いて実験を行った。
０．３５ｎｍｏｌのｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ（東京化成（株）社製）と１０ｎｍｏｌのＮＡＤＰＨ（富士フイルム和光純薬（株）社製）との混合溶液を各ウエルに４９０μＬずつ添加し、被験物質（ＤＭＳＯで希釈）を５μＬずつ添加した。室温で２０分間インキュベートした後、１０倍希釈したＳ９ Ｒａｔ Ｌｉｖｅｒ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ（オリエンタル酵母工業（株）社製）を１０μＬずつ添加し、３７℃で３０分間加温して反応させた。反応後、沸騰水浴で２分間加熱し、酵素を失活させた。酵素失活後の溶液５００μＬ／ｗｅｌｌを抜き取り、酢酸エチル５００μＬと混ぜ、遠心分離（１００００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）した。酢酸エチル層３００μＬを取りだし、酢酸エチルを除去してテストステロンを得た。得られたテストステロンを内部標準物質（ｆｌｕｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ
ａｃｅｔａｔｅ ２０μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）含有のアセトニトリル３０μＬで溶かし、ＨＰＬＣにてテストステロン濃度を定量した。
【0043】
テストステロンのピーク面積と内部標準物質のピーク面積との比を縦軸に、テストステロンの濃度を横軸にして、検量線を作成した。検量線より求めたテストステロン定量値から、以下の式（５）より阻害率（％）を算出した。
阻害率（％）＝（Ａ５－Ｂ５）／（Ｃ５－Ｂ５）×１００ 式（５）
Ａ５：被験物質添加
Ｂ５：被験物質未添加（コントロール）
Ｃ５：酵素未添加
阻害率（％）＝（Ａ５－Ｂ５）／（Ｃ５－Ｂ５）×１００ 式（５）
Ａ５：被験物質添加
Ｂ５：被験物質未添加（コントロール）
Ｃ５：酵素未添加
【0044】
【表5】
【0045】
上記の表５に示されるように、エンメイン（化合物１）は、有意な５α―リダクターゼ酵素阻害活性を有さなかった。すなわち、エンメイン（化合物１）は、男性ホルモンの活性化に影響を与えないことが確認された。
【0046】
（実施例７）
実施例７として、実施例２で単離したエンメインを用いた育毛剤を表６に示す。
実施例７として、実施例２で単離したエンメインを用いた育毛剤を表６に示す。
【表6】
【0047】
実施例７に示すように、エンメインを有効成分とする毛乳頭細胞増殖促進効果、ＶＥＧＦ産生促進効果、β―カテニン産生促進効果を有する育毛剤が調製できる。
【0048】
（実施例８）
実施例８として、実施例２で単離したエンメインを用いた育毛剤を以下の表７に示す。
実施例８として、実施例２で単離したエンメインを用いた育毛剤を以下の表７に示す。
【表7】
【0049】
実施例８に示すように、エンメインを有効成分とする毛乳頭細胞増殖促進効果、ＶＥＧＦ産生促進効果、β―カテニン産生促進効果を有する育毛剤が調製できる。
【0050】
（実施例９）
実施例９として、実施例２で単離したエンメインを用いた毛髪洗浄剤を以下の表８に示す。
実施例９として、実施例２で単離したエンメインを用いた毛髪洗浄剤を以下の表８に示す。
【表8】
【0051】
実施例９に示すように、エンメインを有効成分とする毛乳頭細胞増殖促進効果、ＶＥＧＦ産生促進効果、β―カテニン産生促進効果を有する毛髪洗浄剤が調製できる。
【産業上の利用可能性】
【0052】
本発明によれば、副作用の懸念も少なく、男女問わず使用でき、男性ホルモンの活性化に影響を与えることなく、優れた毛乳頭細胞増殖促進効果、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）産生促進効果、β―カテニン産生促進効果を有する発毛促進剤の提供ができる。
【図1】
