特開 2022-39056 医薬組成物及びその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022039056

(43)【公開日】2022-03-10

(54)【発明の名称】医薬組成物及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/713 20060101AFI20220303BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20220303BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20220303BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20220303BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20220303BHJP

   A61K 9/50 20060101ALI20220303BHJP

   A61K 35/12 20150101ALN20220303BHJP

【ＦＩ】

A61K31/713

A61P35/04

A61K9/08

A61K9/10

A61K47/46

A61K9/50

A61K35/12

【審査請求】未請求

【請求項の数】10

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2020143848

(22)【出願日】2020-08-27

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｅｅｔｉｎｇ－ｓｃｈｅｄｕｌｅ．ｃｏｍ／ｊｃａ２０１９／）で公開された第７８回日本癌学会学術総会の講演予稿集の第１２２０頁、Ｐ３３６７ ウェブサイト掲載日 令和元年９月５日

(71)【出願人】

【識別番号】598015084

【氏名又は名称】学校法人福岡大学

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100145104

【弁理士】

【氏名又は名称】膝舘 祥治

(72)【発明者】

【氏名】櫨川 舞

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C076AA09

4C076AA12

4C076AA16

4C076AA64

4C076BB01

4C076BB11

4C076BB17

4C076BB25

4C076BB27

4C076CC27

4C076CC50

4C076EE57

4C076FF36

4C076FF63

4C076GG42

4C076GG45

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA05

4C086MA52

4C086MA55

4C086NA05

4C086NA13

4C086ZB26

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB34

4C087BB63

4C087MA52

4C087MA55

4C087NA13

4C087ZB26

(57)【要約】

【課題】核酸医薬を標的細胞に送達可能な医薬組成物及びその製造方法を提供する。
【解決手段】医薬組成物は、投与対象に由来するエクソソームと、前記エクソソームに内包されるオリゴヌクレオチドとを含む。また、医薬組成物の製造方法は、投与対象に由来する血液試料からエクソソームを得ることと、得られたエクソソームにオリゴヌクレオチドを内包させることとを含む。
【選択図】図８

【特許請求の範囲】

【請求項1】

投与対象に由来するエクソソームと、前記エクソソームに内包されるオリゴヌクレオチドとを含む医薬組成物。

【請求項2】

前記オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡを含む請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記エクソソームは、投与対象のがん細胞に由来するエクソソームを含む請求項１又は２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記エクソソームは、投与対象の血液試料に由来する請求項１から３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

転移がんの処置に用いられる請求項１から４のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

投与対象に由来する血液試料からエクソソームを得ることと、得られたエクソソームにオリゴヌクレオチドを内包させることとを含む医薬組成物の製造方法。

【請求項7】

前記オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡを含む請求項６に記載の製造方法。

【請求項8】

前記エクソソームは、投与対象のがん細胞に由来するエクソソームを含む請求項６又は７に記載の製造方法。

【請求項9】

前記医薬組成物は、転移がんの処置に用いられる請求項６から８のいずれか１項に記載の製造方法。

【請求項10】

請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の医薬組成物を、対象に投与することを含む、疾患の処置方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、医薬組成物及びその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

エクソソーム（エキソソーム）は、真核細胞においてエンドソーム区画で形成される膜結合性の細胞外小胞である。エクソソームは、タンパク質、核酸等の機能性生体分子を内包して受容細胞に送達することができる。例えば、特許文献１には、生物学的治療剤を含むミルク由来エクソソームが提案されている。また、腫瘍細胞に由来するエクソソームには、特定の臓器を指向する特性があることが知られている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特表２０１９－５３５８３９号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、核酸医薬を標的細胞に送達可能な医薬組成物及びその製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りであり、本発明は以下の態様を包含する。第１態様は、投与対象に由来するエクソソームと、エクソソームに内包されるオリゴヌクレオチドとを含む医薬組成物である。オリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡを含んでいてよい。エクソソームは、投与対象のがん細胞に由来するエクソソームを含んでいてよく、投与対象の血清に由来してよい。また、医薬組成物は、転移がんの処置に用いられてよい。

【0006】

第２態様は、投与対象に由来する血清からエクソソームを得ることと、得られたエクソソームにオリゴヌクレオチドを内包させることとを含む医薬組成物の製造方法である。オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡを含んでいてよい。エクソソームは、投与対象のがん細胞に由来するエクソソームを含んでいてよい。

【0007】

第３態様は、前記医薬組成物を、対象に投与することを含む疾患の処置方法である。医薬組成物が含むオリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡを含んでいてよい。医薬組成物が含むエクソソームは、投与対象のがん細胞に由来するエクソソームを含んでいてよい。エクソソームは、投与対象の血清に由来してよい。疾患の処置方法は、転移がんの処置に用いられてよい。

【0008】

第４態様は、投与対象に由来するエクソソームと、エクソソームに内包される生物学的治療薬とを含む医薬組成物である。生物学的治療薬は、投与対象に由来するエクソソーム中に天然には存在しないものであってよい。生物学的治療薬は、ペプチドもしくはタンパク質またはオリゴヌクレオチドであってよい。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、核酸医薬を標的細胞に送達可能な医薬組成物及びその製造方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】がん細胞由来のエクソソームの肺への集積性を示す図である。

【図2】がん細胞由来のエクソソームの肺への集積性を示すグラフである。

【図3】がん細胞由来のエクソソームのｓｉＲＮＡの細胞への送達性を示す図である。

【図4】がん細胞由来のエクソソームのｓｉＲＮＡの細胞への送達性を示すグラフである。

【図5】がん細胞由来のエクソソーム製剤の標的タンパク質の発現抑制を示す図である。

【図6】がん細胞由来のエクソソーム製剤の標的タンパク質の発現抑制を示すグラフである。

【図7】がん細胞由来のエクソソーム製剤の肺へのがん転移抑制を示す図である。

【図8】がん細胞由来のエクソソーム製剤の肺へのがん転移抑制を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。ただし、以下に示す実施形態は、本発明の技術思想を具体化するための、医薬組成物及びその製造方法を例示するものであって、本発明は、以下に示す医薬組成物及びその製造方法に限定されない。

【0012】

医薬組成物
医薬組成物は、投与対象に由来するエクソソームと、エクソソームに内包されるオリゴヌクレオチドとを含む。医薬組成物は、エクソソームの由来である投与対象に投与され、投与対象が有する疾患の処置に適用される。オリゴヌクレオチドがエクソソームに内包されていることで、オリゴヌクレオチドの分解が抑制され、生体中での安定性が向上すると共に細胞透過性を向上させることができる。また、エクソソームが投与対象に由来することで低い抗原性を達成でき、高い安全性を担保することができる。

【0013】

医薬組成物の投与対象は、例えば、哺乳動物であってよく、哺乳動物はヒトを含む。また、投与対象は、非ヒト動物であってもよい。さらに投与対象は疾患を有する哺乳動物であってもよい。投与対象における疾患には、がん、悪性黒色腫、眼底黒色腫、乳癌、膵臓癌、大腸癌、骨肉腫等の転移がん等が含まれる。疾患の処置とは、疾患について施される何らかの処置であればよく、例えば、疾患の治療、改善、進行の抑制（悪化の防止）、予防、疾患に起因する症状の緩和等が挙げられる。

【0014】

医薬組成物を構成するエクソソームは、医薬組成物の投与対象に由来する。エクソソームは、例えば、投与対象から採取された生体液試料、投与対象から採取された細胞の培養上清から抽出することができる。生体液試料としては、全血、血漿、血清等の血液試料、尿、涙液、唾液、髄液等を挙げることができる。投与対象から採取された細胞としては、腫瘍細胞、免疫細胞（正常細胞）等が挙げられる。エクソソームは投与対象の血液試料から抽出されることが好ましく、血清から抽出されることがより好ましい。エクソソームの抽出は、例えば、市販のエクソソーム抽出キットを用いて、キットの取扱説明書に準じて行うことができる。

【0015】

ここで本明細書における「エクソソーム」という用語は、「微小胞」、「リポソーム」、「エキソソーム」、「エクソソーム様粒子」、「エクソソーム様小胞」、「脂肪球皮膜」、「ナノベクター」、「アーキソーム」、「ラクトソーム」、「細胞外小胞」、「アルゴソーム」、「アポトーシス小体」、「エピジジモソーム」、「プロミニノソーム」、「プロスタソーム」、「デキソソーム」、「テキソソーム」、「オンコソーム」という用語およびその概念を包含するものである。また、エクソソームの平均粒子径は、例えば２０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であってよい。

【0016】

医薬組成物を構成するエクソソームは、投与対象が有するがん細胞に由来するエクソソームを含むことが好ましい。がん細胞に由来するエクソソームを含むことで、高い臓器指向性を得ることができる。がん細胞に由来するエクソソームには、がん細胞が産生するエクソソームが含まれる。がん細胞は、原発巣の種類によって、転移先がある程度特定されることが知られている。がんの主な転移先は、例えば、メラノーマであれば、肺等であり、眼内黒色腫であれば肝臓等であり、乳がんであれば肺、肝臓、脳、骨等であり、膵がんであれば肝臓等であり、大腸がんであれば肝臓等であり、骨肉腫であれば肺等である。このような高い臓器指向性を有するエクソソームを含む医薬組成物は、転移がんの処置に特に有効であると考えられる。

【0017】

がん細胞に由来するエクソソームの表面には、例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等のテトラスパニン類、インテグリン、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ－１等の接着因子、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、各種受容体、コレステロール、各種抗体、セラミド等が存在していると考えられる。

【0018】

エクソソームに内包されるオリゴヌクレオチドは、投与対象に由来するエクソソームが元々内包し得るオリゴヌクレオチドとは異なるものであって、疾患の処置に用いられるものであれば特に制限されない。オリゴヌクレオチドとしては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ発現ベクター、ｓｈＲＮＡ発現ベクター、ｍｉＲＮＡ発現ベクター、アンチセンス核酸、デコイ核酸、アプタマー、ＣｐＧオリゴ等が挙げられる。オリゴヌクレオチドは、少なくともｓｉＲＮＡを含むことが好ましい。オリゴヌクレオチドの塩基配列は、特に制限されず、医薬組成物の目的等に応じて適宜選択されればよい。オリゴヌクレオチドは、１本鎖であっても、２本鎖であってもよい。

【0019】

ｓｉＲＮＡは、２１から２３塩基対からなる二本鎖ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象に関与しており、ｍＲＮＡを分解することによって配列特異的に標的遺伝子の発現を抑制することができる。ｓｉＲＮＡは二本鎖ＲＮＡであるが、各ＲＮＡ鎖の３’部分が２塩基分突出した構造をとっている。ｓｉＲＮＡはヘアピン状のＲＮＡあるいは長鎖の二本鎖ＲＮＡからダイサーと呼ばれる酵素によって切り出されて産生されることが知られており、その結果としてそれぞれの鎖は５’末端にリン酸基と３’末端にヒドロキシ基を有した構造となっている。ｓｉＲＮＡは、例えば、細胞増殖を抑制する機能、浸潤を抑制する機能、遊走を抑制する機能、免疫を抑制する機能等を有するものであってよい。ｓｉＲＮＡの標的遺伝子としては、例えば、Ｇｌｙｐｃｉａｎ-３、ＣｙｃｌｉｎＢ１等を挙げることができる。

【0020】

ｍｉＲＮＡは、２０から２５塩基長の機能性核酸である。ｍｉＲＮＡは、機能性のｎｃＲＮＡ（ノンコーディングＲＮＡ）であり、他の遺伝子の発現を調節するという生命現象において重要な役割を担っていると考えられている。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に結合し、翻訳を阻害することによって、標的遺伝子発現を調節すると考えられている。ｍｉＲＮＡは、例えば、細胞増殖を抑制する機能、浸潤を抑制する機能、遊走を抑制する機能、免疫を抑制する機能等を有するものであってよい。ｍｉＲＮＡの標的遺伝子としては、例えば、Ｇｌｙｐｃｉａｎ-３、ＣｙｃｌｉｎＢ１等を挙げることができる。

【0021】

エクソソームに内包されるオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの少なくとも一方を発現するベクターであってもよい。ベクターを用いることで、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの効果をより持続させることができる。

【0022】

エクソソームに内包されるオリゴヌクレオチドは天然型のヌクレオチド残基から構成されていてもよく、非天然型の修飾ヌクレオチド残基を含んで構成されていてもよい。非天然型の修飾ヌクレオチド残基としては、例えば、ヌクレオシド間のホスホジエステル結合を修飾したもの、リボースの２’水酸基を修飾したもの、分子内架橋されたリボースを含むもの、プリン塩基及びピリミジン塩基の少なくとも一方を修飾したもの等が含まれる。ホスホジエステル結合部分の修飾の例としては、例えば、ホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、メチルチオホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化、ペプチド結合置換等が挙げられる。リボースの２’水酸基の修飾の例としては、２’－Ｏ－メチル化、２’－Ｏ－メトキシエチル化、２’－Ｏ－アミノプロピル（ＡＰ）化、２’－フルオロ化、２’－Ｏ－メチルカルバモイルエチル化、３，３－ジメチルアリル化等が挙げられる。リボースの分子内架橋体の例としては、２’位と４’位が架橋したヌクレオチド（２’，４’－ＢＮＡ）が挙げられる。２’，４’－ＢＮＡには、例えば、ＬＮＡとも称されるロックド核酸（α－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ_２－Ｏ－２’）ＢＮＡ又はβ－Ｄ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ_２－Ｏ－２’）ＢＮＡ、ＥＮＡとも称されるエチレンオキシ（４’－（ＣＨ_２）_２－Ｏ－２’）ＢＮＡ）、β－Ｄ－チオ（４’－ＣＨ_２－Ｓ－２’）ＢＮＡ、アミノオキシ（４’－ＣＨ_２－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ（Ｒは、Ｈ又はＣＨ_３）、２’，４’－ＢＮＡＮＣとも称されるオキシアミノ（４’－ＣＨ_２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’）ＢＮＡ（Ｒは、Ｈ又はＣＨ_３）、２’，４’－ＢＮＡＣＯＣ、３’アミノ－２’，４’－ＢＮＡ，５’－メチルＢＮＡ，ｃＥｔ－ＢＮＡとも称される（４’－ＣＨ（ＣＨ_３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ，ｃＭＯＥ－ＢＮＡとも称される（４’－ＣＨ（ＣＨ_２ＯＣＨ_３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ，ＡｍＮＡとも称されるアミド型ＢＮＡ（４’－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ（Ｒは、Ｈ又はＣＨ_３）等が挙げられる。塩基部分の修飾の例としては、ハロゲン化；メチル化、エチル化、ｎ－プロピル化、イソプロピル化、シクロプロピル化、ｎ－ブチル化、イソブチル化、ｓ－ブチル化、ｔ－ブチル化、シクロブチル化等のアルキル化；水酸化；アミノ化；脱アミノ化；デメチル化等が挙げられる。

【0023】

エクソソームに内包されるオリゴヌクレオチドの量は、目的等に応じて適宜選択すればよい。例えば、エクソソームの質量に対して０．１質量％以上２．０質量％以下であればよく、好ましくは、０．２質量％以上１．０質量％以下であってよい。

【0024】

医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含んでいてもよい。薬学的に許容される担体としては、医薬品の製剤に慣用されている担体であれば、いずれも使用することができる。担体としては、例えば、半固形製剤または液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤またはｐＨ調整剤、無痛化剤などが挙げられる。更に必要に応じて、保存剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、清涼化剤または矯味矯臭剤、消泡剤、粘稠剤等の添加物を含んでいてもよい。

【0025】

液状製剤における溶剤としては、例えば、精製水、エタノール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油などが挙げられる。溶解補助剤としては、例えば、プロピレングリコール、Ｄ－マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。懸濁化剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、カルメロース、ヒドロキシプロピルセルロース、プロピレングリコール、ポビドン、メチルセルロース、モノステアリン酸グリセリンなどが挙げられる。等張化剤としては、例えば、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、塩化ナトリウム、Ｄ－マンニトールなどが挙げられる。緩衝剤またはｐＨ調整剤としては、例えば、リン酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコールなどが挙げられる。

【0026】

保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、ソルビン酸などが挙げられる。抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸などが挙げられる。着色剤としては、例えば、食用色素（例：食用赤色２号若しくは３号、食用黄色４号若しくは５号等）、β－カロテンなどが挙げられる。甘味剤としては、例えば、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、アスパルテームなどが挙げられる。清涼化剤または矯味矯臭剤としては、例えばｌ－メントールまたはハッカ水などが挙げられる。消泡剤としては、例えばジメチルポリシロキサンまたはシリコン消泡剤などが挙げられる。粘稠剤としては、例えばキサンタンガム、トラガント、メチルセルロースまたはデキストリンなどが挙げられる。

【0027】

医薬組成物は、必要に応じて、抗がん剤を含有していてもよく、抗がん剤と併用してもよい。抗がん剤としては、例えば、代謝拮抗剤、分子標的薬、アルキル化剤、植物アルカロイド剤、抗癌性抗生物質、プラチナ製剤、ホルモン剤、生物学的応答調節剤、免疫チェックポイント阻害剤などが挙げられる。

【0028】

抗がん剤のうち、例えば、代謝拮抗剤としてはゲムシタビン、シタラビン、エノシタビン、テガフール、カルモフールなどが挙げられる。分子標的薬としてはイマチニブ、ゲフィチニブ、スニチニブ、セツキシマブなどが挙げられる。アルキル化剤としてはイホスファミド、シクロホスファミド、ダカルバシンなどが挙げられる。植物アルカロイド剤としてはドセタキセル、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチンなどが挙げられる。抗がん性抗生物質としてはピラルビビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ペプロマイシンなどが挙げられる。プラチナ製剤としてはシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンなどが挙げられる。ホルモン剤としてはエキセメスタン、タモキシフェン、プレドニゾロンなどが挙げられる。生物学的応答調節剤としてはインターフェロン、インターロイキンなどが挙げられる。免疫チェックポイント阻害剤としては、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブなどがあげられる。

【0029】

医薬組成物における有効成分の含量は、剤形、投与量等により異なるが、例えば、組成物全体の０．１質量％以上２０質量％以下、又は０．１質量％以上１０質量％以下である。また、医薬組成物の投与用量は、投与対象、疾患、症状、剤形、投与ルート等により適宜選択される。投与用量は、例えば、成人の癌患者に経口投与する場合、有効成分として、１日あたり、通常約０．１ｍｇ以上５００ｍｇ以下、又は約０．５ｍｇ以上１００ｍｇ以下であり、１回又は数回に分けて投与することができる。

【0030】

医薬組成物は、その剤形により非経口または経口投与することができる。非経口投与される剤形としては、例えば、注射剤、点滴剤、点眼剤、経鼻剤、経肺剤などが挙げられる。また、経口投与される剤形としては、例えば、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などの液体状製剤もしくはゼリー剤などの半固形製剤が挙げられる。

【0031】

医薬組成物の製造方法
医薬組成物の製造方法は、投与対象に由来する血液試料からエクソソームを得る第１工程と、得られたエクソソームに所望のオリゴヌクレオチドを内包させる第２工程とを含む。

【0032】

第１工程では、医薬組成物の投与対象から血液試料を採取し、採取した血液試料からエクソソームを抽出して得る。投与対象は、例えば、哺乳動物であり、哺乳動物はヒトを含む。また、投与対象は、非ヒト動物であってもよい。さらに投与対象は、腫瘍を有する哺乳動物であってよく、がんを有する哺乳動物であってもよい。第１工程は、投与対象から採取した血液試料に遠心分離等の常法により、血清を得ることを含んでいてよい。血液試料からのエクソソームの抽出は、例えば、市販のエクソソーム抽出キットを用いて、キットの取扱説明書に準じて行うことができる。

【0033】

第２工程では、抽出されたエクソソームに所望のオリゴヌクレオチドを内包させる。内包されるオリゴヌクレオチドの詳細については、既述の通りである。オリゴヌクレオチドのエクソソームへの内包方法としては、例えば、遺伝子導入試薬を用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。好ましくは遺伝子導入試薬を用いる方法である。遺伝子導入試薬は、市販の遺伝子導入試薬から適宜選択すればよい。オリゴヌクレオチドのエクソソームへの内包は、市販の遺伝子導入試薬の取扱説明書に準じて行えばよい。

【0034】

疾患の処置方法
疾患の処置方法は、有効量の前記医薬組成物を、対象に投与することを含む。医薬組成物の詳細および投与方法は既述の通りである。処置の対象は、例えば、哺乳動物であり、哺乳動物はヒトを含む。また、処置の対象は、非ヒト動物であってもよい。また、疾患は、例えば、悪性黒色腫、眼底黒色腫、乳癌、膵臓癌、大腸癌、骨肉腫等の転移がん等であってよい。

【0035】

本発明は、別の態様として、疾患の処置に用いられる医薬組成物の製造における投与対象に由来し、オリゴヌクレオチドを内包するエクソソームの使用、疾患の処置における投与対象に由来し、オリゴヌクレオチドを内包するエクソソームの使用、疾患の処置に使用される投与対象に由来し、オリゴヌクレオチドを内包するエクソソームを包含する。

【実施例0036】

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0037】

実施例１
エクソソームの抽出
６週齢のＣ５７ＢＬ/６マウス（雌性）の顎骨後部の静脈より、アニマルランセット（Ｇｏｌｄｅｎｒｏｄ，５．５ｍｍ）を用いて、１頭あたり１００から３００μＬを採血し、正常マウス由来の血液試料とした。次いで、マウスにマウスメラノーマ高転移株（Ｂ１６／ＢＬ６）を、２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅで皮下移植した。移植から１４日後に、上記と同様にして採血して、がんマウス由来の血液試料を得た。

【0038】

血液試料の採取後、４℃、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心し、５０から１００μＬの血清を採取した。採取した血清を用いてエクソソーム抽出キットＰｕｒｅＥｘｏ^（Ｒ）（コスモバイオ）を用い、以下のようにしてエクソソームを回収した。

【0039】

血清１００から５００μＬに対し、合計が２ｍＬになるようにサンプルバッファーを加えた。ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ、ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ、ＳｏｌｕｔｉｏｎＣを１：１：１となるように各０．３ｍＬずつ取り、均一な層になるまで十分に混合し、サンプルに全量を加えて転倒混和した後、４℃で３０分間静置した。４℃、５，０００×ｇで３分間遠心し、上層と下層をピペットで除く操作を３回行い、エクソソームが抽出されている白い中間層を残して室温で１０分間乾燥させた。１×ＰＢＳを回収した中間層体積の４倍量加え、４０回の激しいピペッティングで再懸濁しボルテックスで混和後、３分間の水平振とうと１０回以上の十分なボルテックスによる混和を３セット繰り返した。４℃、５，０００ｘｇで５分間遠心し上清をＰｕｒｅＥｘｏ^（Ｒ）Ｃｏｌｕｍｎに移した。ＰｕｒｅＥｘｏ^（Ｒ）Ｃｏｌｕｍｎを３，０００ｘｇで５分間遠心し、ろ液を「エクソソーム抽出液」とした。

【0040】

ｓｉＲＮＡの導入
ｓｉＲＮＡとして、グリピカン３（Ｇｌｙｐｃｉａｎ-３；ＧＰＣ３）に対するｓｉＲＮＡをサーモフィッシャーサイエンティフィックから入手した。血清由来エクソソーム２５０μｇ相当のエクソソーム抽出液に１００ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡと、２μＬの遺伝子導入試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を加え、３０分間３７℃で静置した。これを実施例１のｓｉＲＮＡ導入エクソソーム製剤とした。

【0041】

実験１
がん移植モデルマウス血清由来エクソソームの肺集積性評価
正常マウス由来及びがんマウス由来のエクソソーム抽出液に対して、遺伝子導入試薬とインドシアニングリーン（ＩＣＧ）を各種エクソソームと混合し１２時間静置させ、ＩＣＧ標識エクソソームをそれぞれ得た。がんマウス由来の血液試料を得てから１４日後に、ＩＣＧ標識エクソソームを４００μｇ／ｍｏｕｓｅで、尾静脈内に投与した。投与１日後に、ｉｎ ｖｉｖｏ光イメージング装置Ｃｌａｉｒｖｉｖｏ ＯＰＴ ｐｌｕｓ（島津製作所）を用いて、ＩＣＧ標識エクソソームの体内分布を測定した。肺に対する集積状態を図１及び図２に示す。図１（Ａ）は、正常マウス由来エクソソーム製剤を投与した後の肺の画像であり、図１（Ｂ）はがんマウス由来エクソソーム製剤を投与した後の肺の画像である。図２には、蛍光強度を示す。

【0042】

図１（Ａ）に示すように、正常マウス由来エクソソーム製剤を投与した後の肺にはエクソソームがほとんど集積していなかった。一方、図１（Ｂ）に示すように、がんマウス由来エクソソーム製剤を投与した後の肺にはエクソソームが全体的に分布していた。図２に示されるように、がんマウス由来のエクソソームは、正常マウス由来のエクソソームよりも有意に、肺への集積性が高かった。

【0043】

実験２
エクソソーム製剤の細胞内取り込み評価
蛍光標識したｓｉＲＮＡとして、蛍光色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ^（Ｒ）４８８とｓｉＲＮＡ（ＧＰＣ３）が結合したＡｌｅｘａ４８８－ｓｉＲＮＡ（ＧＰＣ３）を、サーモフィッシャーサイエンティフィックに合成を依頼して入手した。また、血清由来エクソソーム１６６μｇ相当のエクソソーム抽出液に、１６０ｐｍｏｌのＡｌｅｘａ４８８－ｓｉＲＮＡ（ＧＰＣ３）と、２μＬの遺伝子導入試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を加え、３０分間３７℃で静置した。ＰＢＳで２００μＬとして、これを実験２のｓｉＲＮＡ導入エクソソーム製剤とした。

【0044】

２４穴プレートを用い、マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６／ＢＬ６を、ＤＭＥＭに１０％ＦＣＳを添加した細胞培養液５００μＬに５×１０^４ｃｅｌｌｓで播種し、５％ＣＯ_２で２４時間培養した。ｓｉＲＮＡ導入エクソソーム製剤、またはコントロールとしてＰＢＳ、陽性対照としてＡｌｅｘａ４８８－ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を添加した。さらに２４時間培養を継続した後、蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ）、フローサイトメトリー（ＮｏｖｏＣｙｔｅ：ＡＣＥＡＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を用いて、培養細胞中へのｓｉＲＮＡ導入を評価した。結果を図３及び図４に示す。図３（Ａ）はコントロールの蛍光顕微鏡画像であり、図３（Ｂ）はがんマウス由来エクソソーム製剤を添加した培養細胞の蛍光顕微鏡画像である。図４はフローサイトメトリーの結果である。

【0045】

図３及び図４から、がんマウス由来エクソソーム製剤を添加することで、高効率で培養細胞内にｓｉＲＮＡが導入されることがわかる。

【0046】

実験３
エクソソーム製剤による標的タンパク質発現量の評価
実験２で、ｓｉＲＮＡ導入エクソソーム製剤を添加した後、さらに４８時間培養を継続した。培養細胞を回収し、ウェスタンブロットにて標的タンパク質の発現量を評価した。ウェスタンブロットは以下のようにして行った。細胞回収の際に、ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを用いて、細胞溶解液として回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動を行った。その後、ＰＤＶＦ膜（転写膜）にゲル上のタンパクを転写し、一次抗体として目的タンパクに対する抗体を使用し、転写膜上のタンパクと４℃で一晩反応させた。二次抗体としてペルオキシダーゼ（酵素）が標識された一次抗体ＩｇＧに対する抗体を使用し再度転写膜上のタンパクと室温１時間反応させた。最後に基質を加え、二次抗体に標識された酵素が発光することを利用し、転写膜上のタンパクをバンドとして検出し、バンドの面積を算出し、タンパク定量を行った。結果を図５及び図６に示す。

【0047】

図５及び図６から、正常マウス由来エクソソーム製剤、及びがんマウス由来エクソソーム製剤はコントロールに対して有意に、標的タンパク質の発現を抑制した。また、がんマウス由来エクソソーム製剤は、正常マウス由来エクソソーム製剤に対して有意に標的タンパク質の発現を抑制した（ｐ＜０．０５）。

【0048】

実験４
エクソソーム製剤によるがん転移の評価
６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（雌性）にマウスメラノーマ細胞株Ｂ１６／ＢＬ６を２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍoｕｓｅで移植した。移植後１４日目に顎骨後部の静脈より、アニマルランセット（Ｇｏｌｄｅｎｒｏｄ，５．５ｍｍ）を用いて、１匹あたり１００から３００μＬを採血し、がんマウス由来の血液試料とした。上記と同様にして、血液試料からの血清回収、血清からのエクソソーム抽出、エクソソーム抽出液へのｓｉＲＮＡ導入により、がんマウス由来エクソソーム製剤を調製した。また、メラノーマ細胞株を移植していないマウスを用いて同様にして、正常マウス由来エクソソーム製剤を調製した。正常マウス由来エクソソーム製剤としては、ＧＰＣ３に対するｓｉＲＮＡを導入した製剤（ＧＰＣ３＿ｓｉＲＮＡ）と、ネガティブコントロールのｓｉＲＮＡを導入した製剤（ＮＣ＿ｓｉＲＮＡ）を調製した。

【0049】

上記のマウスについて、マウスメラノーマ細胞株の移植から２８日目に腫瘍を切除した。その後３日に１回の割合で、ｓｉＲＮＡ量として２０ｐｍｏｌ／ｍｏｕｓｅのエクソソーム製剤を静脈内に投与した。なお、コントロールにはＰＢＳを投与した。移植から４２日後に開胸して肺におけるコロニー数をカウントした。結果を図７及び図８に示す。図７（Ａ）はコントロール、図７（Ｂ）は正常マウス由来エクソソーム製剤（ＮＣ＿ｓｉＲＮＡ）、図７（Ｃ）は正常マウス由来エクソソーム製剤（ＧＰＣ３＿ｓｉＲＮＡ）、図７（Ｄ）はがんマウス由来エクソソーム製剤（ＧＰＣ３＿ｓｉＲＮＡ）を投与した肺の画像である。

【0050】

図７及び図８から、ＧＰＣ３＿ｓｉＲＮＡを導入したエクソソーム製剤は、コントロールに対して有意に肺転移を抑制することがわかる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】