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特開2022-39526細胞内の高次構造ＲＮＡ中の検出困難な部位にある塩基配列を検出する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022039526
(43)【公開日】2022-03-10
(54)【発明の名称】細胞内の高次構造ＲＮＡ中の検出困難な部位にある塩基配列を検出する方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20180101AFI20220303BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20220303BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20220303BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20220303BHJP
A61K 31/7088 20060101ALN20220303BHJP
A61P 43/00 20060101ALN20220303BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68
C12Q1/6876 Z
C12Q1/02
G01N21/64 F
A61K31/7088
A61P43/00 105
【審査請求】未請求
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020144604
(22)【出願日】2020-08-28
(71)【出願人】
【識別番号】304024430
【氏名又は名称】国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002332
【氏名又は名称】特許業務法人綾船国際特許事務所
(74)【代理人】
【識別番号】100127133
【弁理士】
【氏名又は名称】小板橋 浩之
(72)【発明者】
【氏名】藤本 健造
【テーマコード（参考）】
2G043
4B063
4C086
【Ｆターム（参考）】
2G043AA03
2G043BA16
2G043EA01
2G043FA02
2G043LA03
4B063QA01
4B063QA13
4B063QQ06
4B063QQ07
4B063QQ08
4B063QQ09
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR55
4B063QR56
4B063QR75
4B063QR76
4B063QR77
4B063QR78
4B063QS32
4B063QS34
4B063QX02
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086NA20
(57)【要約】
【課題】 細胞内の高次構造ＲＮＡ中の検出困難な部位にある塩基配列を検出する手段を提供する。
【解決手段】 光架橋性人工核酸プローブを、ＲＮＡ分子中の標的塩基配列と、二重鎖形成させて光架橋する方法であって、光架橋性人工核酸プローブとＲＮＡ分子中の標的塩基配列の二重鎖形成と同時に又は二重鎖形成に先立って、光架橋性人工核酸アシストプローブをＲＮＡ分子と二重鎖形成させて光架橋する工程、を含む、方法。
【選択図】なし
【解決手段】 光架橋性人工核酸プローブを、ＲＮＡ分子中の標的塩基配列と、二重鎖形成させて光架橋する方法であって、光架橋性人工核酸プローブとＲＮＡ分子中の標的塩基配列の二重鎖形成と同時に又は二重鎖形成に先立って、光架橋性人工核酸アシストプローブをＲＮＡ分子と二重鎖形成させて光架橋する工程、を含む、方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
光架橋性人工核酸プローブを、ＲＮＡ分子中の標的塩基配列と、二重鎖形成させて光架橋する方法であって、
光架橋性人工核酸プローブとＲＮＡ分子中の標的塩基配列の二重鎖形成と同時に又は二重鎖形成に先立って、光架橋性人工核酸アシストプローブをＲＮＡ分子と二重鎖形成させて光架橋する工程、を含む、方法。
光架橋性人工核酸プローブとＲＮＡ分子中の標的塩基配列の二重鎖形成と同時に又は二重鎖形成に先立って、光架橋性人工核酸アシストプローブをＲＮＡ分子と二重鎖形成させて光架橋する工程、を含む、方法。
【請求項2】
ＲＮＡ分子中の標的塩基配列が、部分的二重鎖構造の領域内にあり、
標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域の両端のうちの一方には、標的塩基配列を越えて部分的二重鎖構造が続いており、
標的塩基配列を越えて続く部分的二重鎖構造の領域をＡ領域とし、
標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域の両端のうちのもう一方に、ＲＮＡの多分岐構造があり、
上記ＲＮＡの多分岐構造による分岐のうち、標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域に塩基配列上で近い２つの分岐のうちで、１つの分岐の領域をＢ領域とし、もう１つの分岐の領域をＣ領域とし、
上記光架橋性人工核酸アシストプローブとして、以下の：
Ａ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＡ、
Ｂ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＢ、及び
Ｃ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＣ、を含む、請求項１に記載の方法。
標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域の両端のうちの一方には、標的塩基配列を越えて部分的二重鎖構造が続いており、
標的塩基配列を越えて続く部分的二重鎖構造の領域をＡ領域とし、
標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域の両端のうちのもう一方に、ＲＮＡの多分岐構造があり、
上記ＲＮＡの多分岐構造による分岐のうち、標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域に塩基配列上で近い２つの分岐のうちで、１つの分岐の領域をＢ領域とし、もう１つの分岐の領域をＣ領域とし、
上記光架橋性人工核酸アシストプローブとして、以下の：
Ａ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＡ、
Ｂ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＢ、及び
Ｃ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＣ、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＲＮＡ分子中の標的塩基配列が、部分的二重鎖構造の領域内にあり、
標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域の両端に、ＲＮＡの多分岐構造があり、
両端のＲＮＡの多分岐構造のうちの一方のＲＮＡの多分岐構造において、ＲＮＡの多分岐構造による分岐のうち、標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域に塩基配列上で近い２つの分岐のうちで、１つの分岐の領域をＢ領域とし、もう１つの分岐の領域をＣ領域とし、
両端のＲＮＡの多分岐構造のうちのもう一方のＲＮＡの多分岐構造において、ＲＮＡの多分岐構造による分岐のうち、標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域に塩基配列上で近い２つの分岐のうちで、１つの分岐の領域をＢ’領域とし、もう１つの分岐の領域をＣ’領域とし、
上記光架橋性人工核酸アシストプローブとして、以下の：
Ｂ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＢ、
Ｃ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＣ、
Ｂ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＢ’、及び
Ｃ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＣ’、を含む、請求項１に記載の方法。
標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域の両端に、ＲＮＡの多分岐構造があり、
両端のＲＮＡの多分岐構造のうちの一方のＲＮＡの多分岐構造において、ＲＮＡの多分岐構造による分岐のうち、標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域に塩基配列上で近い２つの分岐のうちで、１つの分岐の領域をＢ領域とし、もう１つの分岐の領域をＣ領域とし、
両端のＲＮＡの多分岐構造のうちのもう一方のＲＮＡの多分岐構造において、ＲＮＡの多分岐構造による分岐のうち、標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域に塩基配列上で近い２つの分岐のうちで、１つの分岐の領域をＢ’領域とし、もう１つの分岐の領域をＣ’領域とし、
上記光架橋性人工核酸アシストプローブとして、以下の：
Ｂ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＢ、
Ｃ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＣ、
Ｂ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＢ’、及び
Ｃ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＣ’、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
ＲＮＡの多分岐構造が、ＲＮＡの３分岐構造、又はＲＮＡの４分岐構造である、請求項２～３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
ＲＮＡ分子が細胞内のＲＮＡ分子である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
光架橋性人工核酸プローブを、ＲＮＡ分子中の標的塩基配列と、二重鎖形成させて光架橋することによって、ＲＮＡ分子中の標的塩基配列を検出する方法である、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
光架橋性人工核酸プローブが、検出用標識を備えたプローブである、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
光架橋性人工核酸プローブが、ＦＩＳＨ法用ビーコン型蛍光標識を備えたプローブである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
光架橋性人工核酸プローブが、
以下の式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドがリン酸ジエステル結合によって塩基配列中に導入された光架橋性人工核酸プローブであり、
光架橋性人工核酸アシストプローブが、
以下の式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドがリン酸ジエステル結合によって塩基配列中に導入された光架橋性人工核酸アシストプローブである、請求項１～８のいずれかに記載の方法：
式（Ｉ）：
ただし、式Ｉにおいて、
Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｒ１４は、水酸基、Ｃ１～Ｃ３のアルコキシ基、Ｃ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基、ニトロ基、フッ素原子、フッ化メチル基、又は水素原子であり、
基Ｙは、次の式ＩＩ又は式ＩＩＩで表される基である：
式ＩＩ：
ただし、式ＩＩにおいて、
Ｒ２１は、水素原子又はＣ１～Ｃ３のアルキル基であり、
式ＩＩＩ：
ただし、式ＩＩＩにおいて、
Ｒ３１は、水素原子又は水酸基である。
以下の式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドがリン酸ジエステル結合によって塩基配列中に導入された光架橋性人工核酸プローブであり、
光架橋性人工核酸アシストプローブが、
以下の式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドがリン酸ジエステル結合によって塩基配列中に導入された光架橋性人工核酸アシストプローブである、請求項１～８のいずれかに記載の方法：
式（Ｉ）：
Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｒ１４は、水酸基、Ｃ１～Ｃ３のアルコキシ基、Ｃ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基、ニトロ基、フッ素原子、フッ化メチル基、又は水素原子であり、
基Ｙは、次の式ＩＩ又は式ＩＩＩで表される基である：
式ＩＩ：
Ｒ２１は、水素原子又はＣ１～Ｃ３のアルキル基であり、
式ＩＩＩ：
Ｒ３１は、水素原子又は水酸基である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞内の高次構造ＲＮＡ中の検出困難な部位にある塩基配列を検出する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞内のＲＮＡに含まれる特定の塩基配列を検出する技術は、分子生物学における基本的な技術の一つである。基本的な技術であると同時に、遺伝子診断、微生物の菌種の検出などの応用においても、直接に利用可能な技術である。このような検出技術として、Fluorescence in situ hybridization法（ＦＩＳＨ法）が知られている。
【0003】
ＦＩＳＨ法では、蛍光標識した核酸を検出用のプローブとして用いて、これを細胞に導入し、標的とする特定の塩基配列と二重鎖形成させて、標的の塩基配列を選択的に検出する。
【0004】
一方で、ＲＮＡは細胞内で、単純な一本鎖状態で存在しているわけではなく、複雑な高次構造を形成していることが知られている。そのため、ＲＮＡ中の特定の塩基配列を、検出用のプローブと二重鎖形成させて、選択的に検出しようとする場合には、ＲＮＡの複雑な高次構造中でどのように配置されているかに依存して、検出されやすい塩基配列や、検出されにくい塩基配列がある。
【0005】
非特許文献１は、大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡについて、複雑な高次構造中のいろいろな部位の塩基配列について、検出用プローブによる検出されやすさを、Ｃｌａｓｓ ＩからＣｌａｓｓＶＩの６段階に分けて評価したことを報告している。
【0006】
特許文献１は、光クロスリンク能を有する光応答性ヌクレオチドアナログを開示しており、この光応答性ヌクレオチドアナログが、光反応性架橋剤として使用できることを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】国際公開ＷＯ２０１４／１５７５６５号
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】ＢＥＲＮＨＡＲＤ ＭＡＸＩＭＩＬＩＡＮ ＦＵＣＨＳ，ｅｔ ａｌ．，“Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｆｏｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌｙ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ”，ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，Ｄｅｃ．１９９８，ｐ．４９７３-４９８２，Ｖｏｌ．６４，Ｎｏ．１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
もし、非特許文献１において、大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの複雑な高次構造中において、最も検出が難しいとされたＣｌａｓｓＶＩに相当する塩基配列の検出を、容易に実現する手段があれば、分子生物学における基本的な技術を大きく前進させる。
【0010】
したがって、本発明の目的は、細胞内の高次構造ＲＮＡ中の検出困難な部位にある塩基配列を検出するための手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者は、後述する手段によって、上記目的を達成できることを見いだして、本発明に到達した。
【0012】
したがって、本発明は次の（１）以下を含む。
（１）
光架橋性人工核酸プローブを、ＲＮＡ分子中の標的塩基配列と、二重鎖形成させて光架橋する方法であって、
光架橋性人工核酸プローブとＲＮＡ分子中の標的塩基配列の二重鎖形成と同時に又は二重鎖形成に先立って、光架橋性人工核酸アシストプローブをＲＮＡ分子と二重鎖形成させて光架橋する工程、を含む、方法。
（２）
ＲＮＡ分子中の標的塩基配列が、部分的二重鎖構造の領域内にあり、
標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域の両端のうちの一方には、標的塩基配列を越えて部分的二重鎖構造が続いており、
標的塩基配列を越えて続く部分的二重鎖構造の領域をＡ領域とし、
標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域の両端のうちのもう一方に、ＲＮＡの多分岐構造があり、
上記ＲＮＡの多分岐構造による分岐のうち、標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域に塩基配列上で近い２つの分岐のうちで、１つの分岐の領域をＢ領域とし、もう１つの分岐の領域をＣ領域とし、
上記光架橋性人工核酸アシストプローブとして、以下の：
Ａ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＡ、
Ｂ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＢ、及び
Ｃ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＣ、を含む、（１）に記載の方法。
（３）
ＲＮＡ分子中の標的塩基配列が、部分的二重鎖構造の領域内にあり、
標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域の両端に、ＲＮＡの多分岐構造があり、
両端のＲＮＡの多分岐構造のうちの一方のＲＮＡの多分岐構造において、ＲＮＡの多分岐構造による分岐のうち、標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域に塩基配列上で近い２つの分岐のうちで、１つの分岐の領域をＢ領域とし、もう１つの分岐の領域をＣ領域とし、
両端のＲＮＡの多分岐構造のうちのもう一方のＲＮＡの多分岐構造において、ＲＮＡの多分岐構造による分岐のうち、標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域に塩基配列上で近い２つの分岐のうちで、１つの分岐の領域をＢ’領域とし、もう１つの分岐の領域をＣ’領域とし、
上記光架橋性人工核酸アシストプローブとして、以下の：
Ｂ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＢ、
Ｃ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＣ、
Ｂ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＢ’、及び
Ｃ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＣ’、を含む、（１）に記載の方法。
（４）
ＲＮＡの多分岐構造が、ＲＮＡの３分岐構造、又はＲＮＡの４分岐構造である、（２）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）
ＲＮＡ分子が細胞内のＲＮＡ分子である、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）
光架橋性人工核酸プローブを、ＲＮＡ分子中の標的塩基配列と、二重鎖形成させて光架橋することによって、ＲＮＡ分子中の標的塩基配列を検出する方法である、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）
光架橋性人工核酸プローブが、検出用標識を備えたプローブである、（６）に記載の方法。
（８）
光架橋性人工核酸プローブが、ＦＩＳＨ法用ビーコン型蛍光標識を備えたプローブである、（７）に記載の方法。
（９）
光架橋性人工核酸プローブが、
以下の式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドがリン酸ジエステル結合によって塩基配列中に導入された光架橋性人工核酸プローブであり、
光架橋性人工核酸アシストプローブが、
以下の式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドがリン酸ジエステル結合によって塩基配列中に導入された光架橋性人工核酸アシストプローブである、（１）～（８）のいずれかに記載の方法：
式（Ｉ）：
ただし、式Ｉにおいて、
Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｒ１４は、水酸基、Ｃ１～Ｃ３のアルコキシ基、Ｃ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基、ニトロ基、フッ素原子、フッ化メチル基、又は水素原子であり、
基Ｙは、次の式ＩＩ又は式ＩＩＩで表される基である：
式ＩＩ：
ただし、式ＩＩにおいて、
Ｒ２１は、水素原子又はＣ１～Ｃ３のアルキル基であり、
式ＩＩＩ：
ただし、式ＩＩＩにおいて、
Ｒ３１は、水素原子又は水酸基である。
（１）
光架橋性人工核酸プローブを、ＲＮＡ分子中の標的塩基配列と、二重鎖形成させて光架橋する方法であって、
光架橋性人工核酸プローブとＲＮＡ分子中の標的塩基配列の二重鎖形成と同時に又は二重鎖形成に先立って、光架橋性人工核酸アシストプローブをＲＮＡ分子と二重鎖形成させて光架橋する工程、を含む、方法。
（２）
ＲＮＡ分子中の標的塩基配列が、部分的二重鎖構造の領域内にあり、
標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域の両端のうちの一方には、標的塩基配列を越えて部分的二重鎖構造が続いており、
標的塩基配列を越えて続く部分的二重鎖構造の領域をＡ領域とし、
標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域の両端のうちのもう一方に、ＲＮＡの多分岐構造があり、
上記ＲＮＡの多分岐構造による分岐のうち、標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域に塩基配列上で近い２つの分岐のうちで、１つの分岐の領域をＢ領域とし、もう１つの分岐の領域をＣ領域とし、
上記光架橋性人工核酸アシストプローブとして、以下の：
Ａ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＡ、
Ｂ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＢ、及び
Ｃ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＣ、を含む、（１）に記載の方法。
（３）
ＲＮＡ分子中の標的塩基配列が、部分的二重鎖構造の領域内にあり、
標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域の両端に、ＲＮＡの多分岐構造があり、
両端のＲＮＡの多分岐構造のうちの一方のＲＮＡの多分岐構造において、ＲＮＡの多分岐構造による分岐のうち、標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域に塩基配列上で近い２つの分岐のうちで、１つの分岐の領域をＢ領域とし、もう１つの分岐の領域をＣ領域とし、
両端のＲＮＡの多分岐構造のうちのもう一方のＲＮＡの多分岐構造において、ＲＮＡの多分岐構造による分岐のうち、標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域に塩基配列上で近い２つの分岐のうちで、１つの分岐の領域をＢ’領域とし、もう１つの分岐の領域をＣ’領域とし、
上記光架橋性人工核酸アシストプローブとして、以下の：
Ｂ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＢ、
Ｃ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＣ、
Ｂ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＢ’、及び
Ｃ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＣ’、を含む、（１）に記載の方法。
（４）
ＲＮＡの多分岐構造が、ＲＮＡの３分岐構造、又はＲＮＡの４分岐構造である、（２）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）
ＲＮＡ分子が細胞内のＲＮＡ分子である、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）
光架橋性人工核酸プローブを、ＲＮＡ分子中の標的塩基配列と、二重鎖形成させて光架橋することによって、ＲＮＡ分子中の標的塩基配列を検出する方法である、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）
光架橋性人工核酸プローブが、検出用標識を備えたプローブである、（６）に記載の方法。
（８）
光架橋性人工核酸プローブが、ＦＩＳＨ法用ビーコン型蛍光標識を備えたプローブである、（７）に記載の方法。
（９）
光架橋性人工核酸プローブが、
以下の式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドがリン酸ジエステル結合によって塩基配列中に導入された光架橋性人工核酸プローブであり、
光架橋性人工核酸アシストプローブが、
以下の式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドがリン酸ジエステル結合によって塩基配列中に導入された光架橋性人工核酸アシストプローブである、（１）～（８）のいずれかに記載の方法：
式（Ｉ）：
Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子であり、
Ｒ１４は、水酸基、Ｃ１～Ｃ３のアルコキシ基、Ｃ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基、ニトロ基、フッ素原子、フッ化メチル基、又は水素原子であり、
基Ｙは、次の式ＩＩ又は式ＩＩＩで表される基である：
式ＩＩ：
Ｒ２１は、水素原子又はＣ１～Ｃ３のアルキル基であり、
式ＩＩＩ：
Ｒ３１は、水素原子又は水酸基である。
【発明の効果】
【0013】
本発明によれば、細胞内の高次構造ＲＮＡ中の検出困難な部位にある塩基配列を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図8】図８は、Ｅｃｏ６２７によって染色されたＥ．ｃｏｌｉの蛍光強度について、Ｅｃｏ６２７のみを添加した場合を基準にして、それぞれ記載のアシストプローブの組み合わせを使用した場合の相対的な蛍光強度のグラフである。
【図10】図１０は、Ｅｃｏ６２７によって染色されたＥ．ｃｏｌｉの蛍光強度について、Ｅｃｏ６２７のみを添加した場合を基準にして、それぞれ記載のアシストプローブの組み合わせを使用した場合の相対的な蛍光強度のグラフである。
【図11】図１１は、Ｅｃｏ６２７によって染色されたＥ．ｃｏｌｉの蛍光強度について、Ｅｃｏ６２７のみを添加した場合を基準にして、それぞれ記載のアシストプローブの組み合わせを使用した場合の相対的な蛍光強度のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0015】
具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施の形態に限定されるものではない。
【0016】
［光架橋性人工核酸プローブを、ＲＮＡ分子中の標的塩基配列と、二重鎖形成させて光架橋する方法］
本発明によれば、光架橋性人工核酸プローブとＲＮＡ分子中の標的塩基配列の二重鎖形成と同時に又は二重鎖形成に先立って、光架橋性人工核酸アシストプローブをＲＮＡ分子と二重鎖形成させて光架橋する工程、を含む方法によって、光架橋性人工核酸プローブを、ＲＮＡ分子中の標的塩基配列と、二重鎖形成させて光架橋することができる。
本発明によれば、光架橋性人工核酸プローブとＲＮＡ分子中の標的塩基配列の二重鎖形成と同時に又は二重鎖形成に先立って、光架橋性人工核酸アシストプローブをＲＮＡ分子と二重鎖形成させて光架橋する工程、を含む方法によって、光架橋性人工核酸プローブを、ＲＮＡ分子中の標的塩基配列と、二重鎖形成させて光架橋することができる。
【0017】
［標的塩基配列の一端に多分岐構造を有するＲＮＡ構造における検出］
好適な実施の態様において、ＲＮＡ分子中の標的塩基配列が、部分的二重鎖構造の領域内にあり、
標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域の両端のうちの一方には、標的塩基配列を越えて部分的二重鎖構造が続いており、
標的塩基配列を越えて続く部分的二重鎖構造の領域をＡ領域とし、
標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域の両端のうちのもう一方に、ＲＮＡの多分岐構造があり、
上記ＲＮＡの多分岐構造による分岐のうち、標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域に塩基配列上で近い２つの分岐のうちで、１つの分岐の領域をＢ領域とし、もう１つの分岐の領域をＣ領域とし、
上記光架橋性人工核酸アシストプローブとして、以下の：
Ａ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＡ、
Ｂ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＢ、及び
Ｃ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＣ、を含むものとできる。
好適な実施の態様において、ＲＮＡ分子中の標的塩基配列が、部分的二重鎖構造の領域内にあり、
標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域の両端のうちの一方には、標的塩基配列を越えて部分的二重鎖構造が続いており、
標的塩基配列を越えて続く部分的二重鎖構造の領域をＡ領域とし、
標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域の両端のうちのもう一方に、ＲＮＡの多分岐構造があり、
上記ＲＮＡの多分岐構造による分岐のうち、標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域に塩基配列上で近い２つの分岐のうちで、１つの分岐の領域をＢ領域とし、もう１つの分岐の領域をＣ領域とし、
上記光架橋性人工核酸アシストプローブとして、以下の：
Ａ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＡ、
Ｂ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＢ、及び
Ｃ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＣ、を含むものとできる。
【0018】
［標的塩基配列の両端に多分岐構造を有するＲＮＡ構造における検出］
好適な実施の態様において、ＲＮＡ分子中の標的塩基配列が、部分的二重鎖構造の領域内にあり、
標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域の両端に、ＲＮＡの多分岐構造があり、
両端のＲＮＡの多分岐構造のうちの一方のＲＮＡの多分岐構造において、ＲＮＡの多分岐構造による分岐のうち、標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域に塩基配列上で近い２つの分岐のうちで、１つの分岐の領域をＢ領域とし、もう１つの分岐の領域をＣ領域とし、
両端のＲＮＡの多分岐構造のうちのもう一方のＲＮＡの多分岐構造において、ＲＮＡの多分岐構造による分岐のうち、標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域に塩基配列上で近い２つの分岐のうちで、１つの分岐の領域をＢ’領域とし、もう１つの分岐の領域をＣ’領域とし、
上記光架橋性人工核酸アシストプローブとして、以下の：
Ｂ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＢ、
Ｃ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＣ、
Ｂ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＢ’、及び
Ｃ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＣ’、を含むものとできる。
好適な実施の態様において、ＲＮＡ分子中の標的塩基配列が、部分的二重鎖構造の領域内にあり、
標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域の両端に、ＲＮＡの多分岐構造があり、
両端のＲＮＡの多分岐構造のうちの一方のＲＮＡの多分岐構造において、ＲＮＡの多分岐構造による分岐のうち、標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域に塩基配列上で近い２つの分岐のうちで、１つの分岐の領域をＢ領域とし、もう１つの分岐の領域をＣ領域とし、
両端のＲＮＡの多分岐構造のうちのもう一方のＲＮＡの多分岐構造において、ＲＮＡの多分岐構造による分岐のうち、標的塩基配列が含まれる上記部分的二重鎖構造の領域に塩基配列上で近い２つの分岐のうちで、１つの分岐の領域をＢ’領域とし、もう１つの分岐の領域をＣ’領域とし、
上記光架橋性人工核酸アシストプローブとして、以下の：
Ｂ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＢ、
Ｃ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＣ、
Ｂ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＢ’、及び
Ｃ領域中の塩基配列と二重鎖形成させて光架橋できる塩基配列を有する光架橋性人工核酸アシストプローブＣ’、を含むものとできる。
【0019】
［光架橋性人工核酸プローブによる標的塩基配列の検出］
本発明者は、これまで核酸の二重鎖形成と光架橋技術を鋭意研究してきた。光架橋性の人工塩基を有する人工ヌクレオチドアナログを、天然のヌクレオチド同様に導入して制作された人工核酸をプローブとして使用すると、その塩基配列に依存して二重鎖形成し、光架橋することによって、標的とする特定の塩基配列を検出することができる。この光架橋性人工核酸プローブによる二重鎖形成は、光架橋が形成されることによって不可逆的なものとなるから、エネルギー的に大変に有利な反応となり、検出の感度は高いものとなる。
本発明者は、これまで核酸の二重鎖形成と光架橋技術を鋭意研究してきた。光架橋性の人工塩基を有する人工ヌクレオチドアナログを、天然のヌクレオチド同様に導入して制作された人工核酸をプローブとして使用すると、その塩基配列に依存して二重鎖形成し、光架橋することによって、標的とする特定の塩基配列を検出することができる。この光架橋性人工核酸プローブによる二重鎖形成は、光架橋が形成されることによって不可逆的なものとなるから、エネルギー的に大変に有利な反応となり、検出の感度は高いものとなる。
【0020】
なお、光架橋性人工核酸プローブは、二重鎖形成と光架橋形成が達成されれば、あらかじめ結合させていた検出用標識によって、プローブを検出することは容易であるから、光架橋形成の達成度とそれによる検出の感度は、実質的に同様の意義を有する。
【0021】
このような観点から、光架橋性人工核酸プローブを用いれば、二重鎖形成させて光架橋させれば、複雑な高次構造を有するＲＮＡ分子中の標的塩基配列であっても、高感度に検出できると本発明者は予想していた。ところが、このような光架橋性人工核酸プローブを用いても、非特許文献１において、大腸菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの複雑な高次構造中において、最も検出が難しいとされたＣｌａｓｓＶＩに相当する塩基配列となると、十分な高感度を得ることはできなかった。
【0022】
そこで、本発明者は、このような複雑な高次構造のＲＮＡにおける検出困難な部位の構造を解析してみたところ、標的塩基配列の近傍に、多分岐構造を備えた構造となっているという傾向を発見した。多分岐構造とは、例えば、ＲＮＡが分子中で二重鎖構造を形成して、その二重鎖構造が、ある位置から道路の分岐のように多数に分岐している構造をいう。多分岐構造には、例えば、３分岐構造、４分岐構造がある。
【0023】
そして、本発明者は、この多分岐構造が何らかの制約となって、標的塩基配列と光架橋性人工核酸プローブとの二重鎖形成と光架橋形成が抑制されているのではないかとの着想に至った。そのうえで、本発明者は、光架橋性人工核酸プローブと標的塩基配列との二重鎖形成と光架橋形成に際して、これを助ける光架橋性人工核酸アシストプローブを添加して、光架橋性人工核酸アシストプローブとこれに対応する塩基配列との二重鎖形成と光架橋形成を行うことによって、複雑な高次構造のＲＮＡにおける検出困難な部位に位置する標的塩基配列に対しても、十分な高感度をもって検出できることを見いだして、本発明に到達した。
【0024】
本発明者の検討によれば、この光架橋性人工核酸アシストプローブは、標的塩基配列に対してある特定の位置関係を有することが求められる。
【0025】
具体的には、標的塩基配列を含む二重鎖構造部分の一端の近傍に多分岐構造がある場合に、その多分岐構造の複数の分岐のうち、標的塩基配列に近い２つの分岐のそれぞれにおいて、二重鎖形成可能な塩基配列となっている２つの光架橋性人工核酸アシストプローブを使用することが好ましい。また、同時に、標的塩基配列を含む二重鎖構造部分のもう一方の端には、二重鎖構造が続くことになるから、この二重鎖構造にある塩基配列に対して、二重鎖形成可能な塩基配列となっている１つの光架橋性人工核酸アシストプローブを、上記２つの光架橋性人工核酸アシストプローブと同時に使用することが好ましい。
【0026】
また、具体的には、標的塩基配列を含む二重鎖構造部分の両端に多分岐構造がある場合には、それぞれの多分岐構造について、多分岐構造の複数の分岐のうち、標的塩基配列に近い２つの分岐のそれぞれにおいて、二重鎖形成可能な塩基配列となっている２つの光架橋性人工核酸アシストプローブを使用することが好ましい。
【0027】
［高次構造ＲＮＡ中の光架橋性人工核酸プローブの位置］
高次構造ＲＮＡ中において、光架橋性人工核酸プローブが二重鎖形成し、光架橋形成する位置とは、標的塩基配列の位置である。好適な実施の態様において、標的塩基配列の塩基長は、例えば１５～２０塩基、あるいは２０～２５塩基とすることができる。好適な実施の態様において、標的塩基配列は、上記塩基長のうち、例えば１５～２０塩基、あるいは２０～２５塩基の二重鎖形成部分を含む。好適な実施の態様において、標的塩基配列の多分岐の中心に近い端部の塩基が、その近傍の多分岐構造の分岐の中心から、例えば２０～３０塩基目、あるいは３０～４０塩基目となる距離の範囲にある。多分岐構造の分岐の中心からの距離を示す塩基数は、多分岐構造から分岐した２本の鎖の間で形成された最初の塩基対を第１塩基目として数える。例えば、多分岐構造から分岐した直後の２本の鎖の間に、塩基対形成していない塩基配列が続けば、その塩基配列の後に出現する最初の塩基対形成塩基が、第１塩基目となる。
高次構造ＲＮＡ中において、光架橋性人工核酸プローブが二重鎖形成し、光架橋形成する位置とは、標的塩基配列の位置である。好適な実施の態様において、標的塩基配列の塩基長は、例えば１５～２０塩基、あるいは２０～２５塩基とすることができる。好適な実施の態様において、標的塩基配列は、上記塩基長のうち、例えば１５～２０塩基、あるいは２０～２５塩基の二重鎖形成部分を含む。好適な実施の態様において、標的塩基配列の多分岐の中心に近い端部の塩基が、その近傍の多分岐構造の分岐の中心から、例えば２０～３０塩基目、あるいは３０～４０塩基目となる距離の範囲にある。多分岐構造の分岐の中心からの距離を示す塩基数は、多分岐構造から分岐した２本の鎖の間で形成された最初の塩基対を第１塩基目として数える。例えば、多分岐構造から分岐した直後の２本の鎖の間に、塩基対形成していない塩基配列が続けば、その塩基配列の後に出現する最初の塩基対形成塩基が、第１塩基目となる。
【0028】
［光架橋性人工核酸アシストプローブの位置］
高次構造ＲＮＡ中において、光架橋性人工核酸アシストプローブが二重鎖形成し、光架橋形成する対象塩基配列の位置は、上記のＡ領域、Ｂ領域、Ｃ領域のいずれか、あるいは上記のＢ領域、Ｃ領域、Ｂ’領域、Ｃ’領域のいずれかに位置する。
高次構造ＲＮＡ中において、光架橋性人工核酸アシストプローブが二重鎖形成し、光架橋形成する対象塩基配列の位置は、上記のＡ領域、Ｂ領域、Ｃ領域のいずれか、あるいは上記のＢ領域、Ｃ領域、Ｂ’領域、Ｃ’領域のいずれかに位置する。
【0029】
好適な実施の態様において、Ａ領域に位置する対象塩基配列の塩基長は、例えば１５～２０塩基、あるいは２０～２５塩基とすることができる。好適な実施の態様において、Ａ領域に位置する対象塩基配列は、上記塩基長のうち、例えば１５～２０塩基、あるいは２０～２５塩基の二重鎖形成部分を含む。好適な実施の態様において、Ａ領域に位置する対象塩基配列の標的塩基配列に近い端部の塩基が、標的塩基配列のすぐ隣の塩基を第１塩基目とした場合に、例えば２０～３０塩基目、あるいは３０～４０塩基目となる距離の範囲にある。Ａ領域に位置する対象塩基配列は、その内部に非二重鎖構造部分を含んでいてもよい。
【0030】
好適な実施の態様において、Ｂ領域に位置する対象塩基配列の塩基長は、例えば１５～２０塩基、あるいは２０～２５塩基とすることができる。好適な実施の態様において、Ｂ領域に位置する対象塩基配列は、上記塩基長のうち、例えば１５～２０塩基、あるいは２０～２５塩基の二重鎖形成部分を含む。好適な実施の態様において、Ｂ領域に位置する対象塩基配列の多分岐の中心に近い端部の塩基が、その近傍の多分岐構造の分岐の中心から、例えば２０～３０塩基目、あるいは３０～４０塩基目となる距離の範囲にある。Ｂ領域に位置する対象塩基配列は、その内部に非二重鎖構造部分を含んでいてもよい。好適な実施の態様において、Ｂ’領域に位置する対象塩基配列についても、Ｂ領域に位置する対象塩基配列と同様に設けることができる。
【0031】
好適な実施の態様において、Ｃ領域に位置する対象塩基配列の塩基長は、例えば１５～２０塩基、あるいは２０～２５塩基とすることができる。好適な実施の態様において、Ｃ領域に位置する対象塩基配列は、上記塩基長のうち、例えば１５～２０塩基、あるいは２０～２５塩基の二重鎖形成部分を含む。好適な実施の態様において、C領域に位置する対象塩基配列の多分岐の中心に近い端部の塩基が、その近傍の多分岐構造の分岐の中心から、例えば２０～３０塩基目、あるいは３０～４０塩基目となる距離の範囲にある。Ｃ領域に位置する対象塩基配列は、その内部に非二重鎖構造部分を含んでいてもよい。好適な実施の態様において、Ｃ’領域に位置する対象塩基配列についても、Ｂ領域に位置する対象塩基配列と同様に設けることができる。
【0032】
［光架橋性人工ヌクレオシド］
好適な実施の態様において、光架橋性人工核酸プローブは、次の式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドがリン酸ジエステル結合によって塩基配列中に導入された光架橋性人工核酸プローブとすることができる。好適な実施の態様において、光架橋性人工核酸アシストプローブは、次の式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドがリン酸ジエステル結合によって塩基配列中に導入された光架橋性人工核酸アシストプローブとすることができる。
好適な実施の態様において、光架橋性人工核酸プローブは、次の式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドがリン酸ジエステル結合によって塩基配列中に導入された光架橋性人工核酸プローブとすることができる。好適な実施の態様において、光架橋性人工核酸アシストプローブは、次の式（Ｉ）で表される光架橋性人工ヌクレオシドがリン酸ジエステル結合によって塩基配列中に導入された光架橋性人工核酸アシストプローブとすることができる。
【0033】
式（Ｉ）：
【0034】
好適な実施の態様において、Ｒ１１は、例えば、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子とすることができ、好ましくは、シノア基又は水素原子とすることができる。
【0035】
好適な実施の態様において、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素原子とすることができ、好ましくは、シノア基又は水素原子とすることができる。
【0036】
好適な実施の態様において、Ｒ１４は、水酸基、Ｃ１～Ｃ３のアルコキシ基、Ｃ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基、ニトロ基、フッ素原子、フッ化メチル基、又は水素原子とすることができ、好ましくは、ニトロ基又は水素原子とすることができる。
【0037】
好適な実施の態様において、基Ｙは、次の式ＩＩ又は式ＩＩＩで表される基とすることができる。
【0038】
式ＩＩ：
【0039】
好適な実施の態様において、Ｒ２１は、例えば、水素原子又はＣ１～Ｃ３のアルキル基とすることができ、好ましくは、メチル基又は水素原子とすることができる。
【0040】
式ＩＩＩ：
【0041】
好適な実施の態様において、Ｒ３１は、例えば、水素原子又は水酸基とすることができる。
【0042】
［光架橋形成］
光架橋性人工核酸プローブ及び光架橋性人工核酸アシストプローブは、いずれも、それぞれ二重鎖形成した後に、光照射することによって、光架橋を形成することができる。この光架橋は、光架橋性人工核酸プローブ及び光架橋性人工核酸アシストプローブ中に導入された、上記の光架橋性人工ヌクレオシドの光化学反応によって形成される。光架橋性人工ヌクレオシドは、光架橋可能な位置に配置されたピリミジン塩基との間に光架橋を形成できる。ピリミジン塩基としては、例えば、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシンをあげることができ、高次構造ＲＮＡにおいては、好ましくはシトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）をあげることができる。
光架橋性人工核酸プローブ及び光架橋性人工核酸アシストプローブは、いずれも、それぞれ二重鎖形成した後に、光照射することによって、光架橋を形成することができる。この光架橋は、光架橋性人工核酸プローブ及び光架橋性人工核酸アシストプローブ中に導入された、上記の光架橋性人工ヌクレオシドの光化学反応によって形成される。光架橋性人工ヌクレオシドは、光架橋可能な位置に配置されたピリミジン塩基との間に光架橋を形成できる。ピリミジン塩基としては、例えば、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシンをあげることができ、高次構造ＲＮＡにおいては、好ましくはシトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）をあげることができる。
【0043】
光架橋性人工ヌクレオシドの光架橋性人工塩基は、相補的な塩基配列を有する核酸の塩基配列中において、光架橋性人工塩基と相補的な位置にある塩基から１塩基だけ５’末端側に位置する塩基（相補的な位置にある塩基の５’末端側の隣の塩基）との間に、光架橋を形成できる。すなわち、相補的な塩基配列中において、光架橋性人工塩基と相補的な位置にある塩基から１塩基だけ５’末端側の位置が、光架橋可能な位置である。
【0044】
光照射による光架橋の形成は、光化学反応であるために、温度、溶媒、塩濃度、ｐＨ等について、広範な条件下で実施することができる。このため、生理的な条件下でも実施することができて、細胞内の条件においても、好適に使用することができる。光架橋形成は、二重鎖形成と同じ条件下で、行うことができる。
【0045】
好適な実施の態様において、光照射は、例えば、３４０ｎｍ～３９０ｎｍの範囲、３６０ｎｍ～３９０ｎｍの範囲の波長を含む光、例えば３８５ｎｍの波長を含む光の照射によって行うことができる。光照射は、例えば０．１秒～６０秒、１秒～３０秒、５秒～１５秒の範囲の照射時間によって行うことができる。光照射は、例えば０℃～４０℃、０℃～３０℃、０℃～２０℃、０℃～１０℃の範囲の温度で行うことができる。
【0046】
［光架橋性人工核酸プローブの標識］
好適な実施の態様において、光架橋性人工核酸プローブによる二重鎖形成と光架橋形成は、ＲＮＡ分子中の標的塩基配列の検出のために、実施することができる。この場合に、光架橋性人工核酸プローブは、検出用の標識を備えるものとすることができる。このような検出用の標識としては、公知の検出用標識を使用することができる。このような検出用の標識として、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、好ましくはＣｙ３、Ｃｙ５をあげることができる。好適な実施の態様において、光架橋性人工核酸プローブは、ＦＩＳＨ法用ビーコン型蛍光標識を備えたプローブとすることができる。好適な実施の態様において、ＦＩＳＨ法用ビーコン型蛍光標識は、蛍光基と消光基のセットからなり、プローブが標的となる塩基配列と二重鎖形成することによって、蛍光基から消光基が隔離されて、消光基の消光作用が働かなくなり、蛍光基からの蛍光が観察可能となる構成を備えている。
好適な実施の態様において、光架橋性人工核酸プローブによる二重鎖形成と光架橋形成は、ＲＮＡ分子中の標的塩基配列の検出のために、実施することができる。この場合に、光架橋性人工核酸プローブは、検出用の標識を備えるものとすることができる。このような検出用の標識としては、公知の検出用標識を使用することができる。このような検出用の標識として、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、好ましくはＣｙ３、Ｃｙ５をあげることができる。好適な実施の態様において、光架橋性人工核酸プローブは、ＦＩＳＨ法用ビーコン型蛍光標識を備えたプローブとすることができる。好適な実施の態様において、ＦＩＳＨ法用ビーコン型蛍光標識は、蛍光基と消光基のセットからなり、プローブが標的となる塩基配列と二重鎖形成することによって、蛍光基から消光基が隔離されて、消光基の消光作用が働かなくなり、蛍光基からの蛍光が観察可能となる構成を備えている。
【0047】
［光架橋性人工核酸アシストプローブの添加］
好適な実施の態様において、上述のように、光架橋性人工核酸アシストプローブによる二重鎖形成と光架橋形成は、光架橋性人工核酸プローブによる二重鎖形成と光架橋形成を、促進する。光架橋性人工核酸アシストプローブによる二重鎖形成と光架橋形成は、光架橋性人工核酸プローブによる二重鎖形成と光架橋形成に先だって行ってもよく、光架橋性人工核酸プローブによる二重鎖形成と光架橋形成と同時に行ってもよい。そのため、被検体となる試料への光架橋性人工核酸アシストプローブの添加は、光架橋性人工核酸プローブの添加に先だって行ってもよく、光架橋性人工核酸プローブの添加と同時に行ってもよく、あるいは光架橋性人工核酸プローブの添加の後に行ってもよい。
好適な実施の態様において、上述のように、光架橋性人工核酸アシストプローブによる二重鎖形成と光架橋形成は、光架橋性人工核酸プローブによる二重鎖形成と光架橋形成を、促進する。光架橋性人工核酸アシストプローブによる二重鎖形成と光架橋形成は、光架橋性人工核酸プローブによる二重鎖形成と光架橋形成に先だって行ってもよく、光架橋性人工核酸プローブによる二重鎖形成と光架橋形成と同時に行ってもよい。そのため、被検体となる試料への光架橋性人工核酸アシストプローブの添加は、光架橋性人工核酸プローブの添加に先だって行ってもよく、光架橋性人工核酸プローブの添加と同時に行ってもよく、あるいは光架橋性人工核酸プローブの添加の後に行ってもよい。
【0048】
好適な実施の態様において、光架橋性人工核酸アシストプローブは、光架橋性人工核酸プローブによる二重鎖形成と光架橋形成を促進するためのものであるから、典型的には、それぞれの光架橋性人工核酸アシストプローブの分子は、光架橋性人工核酸プローブの分子と、同じモル数程度を目安に添加することができるが、これに限られるものではない。好適な実施の態様において、それぞれの光架橋性人工核酸アシストプローブの分子のモル数は、光架橋性人工核酸プローブの分子のモル数に対して、例えば、１／１０～１０／１の範囲、あるいは１／１．５～１．５／１の範囲の比率で添加してもよい。
【0049】
好適な実施の態様において、上述のように、光架橋性人工核酸アシストプローブとして、Ａ領域に位置する対象塩基配列と二重鎖形成し光架橋形成する光架橋性人工核酸アシストプローブと、Ｂ領域に位置する対象塩基配列と二重鎖形成し光架橋形成する光架橋性人工核酸アシストプローブと、Ｃ領域に位置する対象塩基配列と二重鎖形成し光架橋形成する光架橋性人工核酸アシストプローブとの３種類のプローブ分子を、同時にセットとして使用することが好ましい。この３種類の光架橋性人工核酸アシストプローブ分子を用いることで、光架橋性人工核酸プローブの二重鎖形成と光架橋形成の促進作用が、好適に発揮される。好適な実施の態様において、この３種類の光架橋性人工核酸アシストプローブ分子による促進作用を妨げない範囲で、さらに別な種類の光架橋性人工核酸アシストプローブ分子を追加することも本発明の範囲内である。
【実施例0050】
以下に実施例をあげて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示する実施例に限定されるものではない。
【0051】
［実施例１：光架橋性分子ビーコン型プローブによる検出に対する光架橋性アシストプローブによるアシスト効果の検討］
［プローブＯＤＮｓの合成］
実施例で使用したプローブＯＤＮｓの合成を以下のように行った。実施例で使用したプローブは相対蛍光強度が１％であるＥｃｏ６２７領域を標的としている光架橋性分子ビーコン型プローブ、そして標的の高次構造を崩すための光架橋性アシストプローブである（表１参照）。光架橋性分子ビーコン型プローブＥｃｏ１４３７はＳｔｅｍ領域、３’末端に消光基であるＤａｂｃｙｌ、５’末端に蛍光基であるＣｙ３を修飾し、Ｒｏｏｐ領域に３－Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ（ＣＮＶＤ）付加した。光架橋性分子ビーコン型プローブ、光架橋性アシストプローブどちらもＳ化ＯＤＮとした。ＤＮＡ合成は３４００ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用して固相合成法にて実施した。使用したプローブの一覧を、次の表１に示す。
［プローブＯＤＮｓの合成］
実施例で使用したプローブＯＤＮｓの合成を以下のように行った。実施例で使用したプローブは相対蛍光強度が１％であるＥｃｏ６２７領域を標的としている光架橋性分子ビーコン型プローブ、そして標的の高次構造を崩すための光架橋性アシストプローブである（表１参照）。光架橋性分子ビーコン型プローブＥｃｏ１４３７はＳｔｅｍ領域、３’末端に消光基であるＤａｂｃｙｌ、５’末端に蛍光基であるＣｙ３を修飾し、Ｒｏｏｐ領域に３－Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ（ＣＮＶＤ）付加した。光架橋性分子ビーコン型プローブ、光架橋性アシストプローブどちらもＳ化ＯＤＮとした。ＤＮＡ合成は３４００ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用して固相合成法にて実施した。使用したプローブの一覧を、次の表１に示す。
【0052】
【表1】
【0053】
表１において示した相対蛍光強度は、非特許文献１（ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，Ｄｅｃ．１９９８，ｐ．４９７３-４９８２，Ｖｏｌ．６４，Ｎｏ．１２）において示された値を記載した。
【0054】
非特許文献１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １６Ｓ ｒＲＮＡを対象として、高次構造を備えたＲＮＡを多数の領域に分けて、その領域に対する相補的プローブを作成し、プローブがＲＮＡの対応領域へハイブリダイズしたことを、プローブにあらかじめ結合させた蛍光基からの蛍光発光によって検出して、蛍光強度によって各領域におけるハイブリダイズのしやすさを定量化して対比した結果を開示している。
【0055】
上記の表１において、最も左の列には、本実施例で使用した各プローブの名称を記載しており、各プローブの配列は表１の中央の列に示す通りである。本実施例で使用した各プローブは、非特許文献１で同じ領域を認識するものとして記載されている各プローブの名称にならった名称となっており、非特許文献１で使用された各プローブが示した相対蛍光強度（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｐｒｏｂｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）が、上記の表１の最も右の列にそれぞれ記載されている。
【0056】
この相対蛍光強度は、非特許文献１において、Ｅｃｏ１４８２領域を認識するプローブが示した蛍光強度を１００％とした相対値であり、数値が大きいほど、各プローブの認識する領域が、高次構造ＲＮＡ中でハイブリダイズしやすい部位であったこと、すなわち検出しやすい部位であったことを意味する。
【0057】
そして、上記の表１に示されるように、Ｅｃｏ６２７プローブに対応する領域は、非特許文献１の開示によれば、Ｅｃｏ１４８２領域と対比して、約１％の蛍光強度しか示さない領域であり、この領域を検出することは極めて難しい領域であった。なお、表１の相対蛍光強度の数値の隣に、Ｃｌａｓｓ ＩＩ、Ｃｌａｓｓ ＩＩＩ、Ｃｌａｓｓ ＩＶ、Ｃｌａｓｓ Ｖ、Ｃｌａｓｓ ＶＩの分類の記載があるが、非特許文献１において、これらは相対蛍光強度の値に応じて、それぞれの領域の検出困難性を示した指標であり、Ｃｌａｓｓ ＶＩは、高次構造ＲＮＡ中で最も検出困難な領域に分類されることを意味する。
【0058】
表１の配列中に記載されたＤはＣＮＶＤである。ＣＮＶＤは、以下の構造を有する光架橋性の人工ヌクレオシドである。ＣＮＶＤは、ヌクレオシドにおける塩基部分として３－Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅを有しており、ヌクレオシドにおける糖骨格部分としてセリノール（２－アミノ－１，３－プロパンジオール）構造を有している。ＣＮＶＤは、天然のヌクレオシドと同様に、オリゴヌクレオチド配列中に導入することができる。
【0059】
［観察サンプルの調製の準備］
［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ グリセロールストックの調製］
実施例では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標） ＴＯＰ１０ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用した。３７℃に加温したＬＢ液体培地で培養したＥ．ｃｏｌｉを対数増殖期に収集した。培養したＥ．ｃｏｌｉコンピテントセルのグリセロールストック（終濃度２０％）を調製したのち、－８０℃で保管した。
［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ グリセロールストックの調製］
実施例では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標） ＴＯＰ１０ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用した。３７℃に加温したＬＢ液体培地で培養したＥ．ｃｏｌｉを対数増殖期に収集した。培養したＥ．ｃｏｌｉコンピテントセルのグリセロールストック（終濃度２０％）を調製したのち、－８０℃で保管した。
【0060】
［ｂｕｆｆｅｒ調製］
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを次のように調製した。１．０Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．２（終濃度２０ｍＭ）、Ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（終濃度９００ｍＭ）、Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ（０．０１％ｖ／ｖ）を混合した。
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを次のように調製した。１．０Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．２（終濃度２０ｍＭ）、Ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（終濃度９００ｍＭ）、Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ（０．０１％ｖ／ｖ）を混合した。
【0061】
Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを次のように調製した。１ｘＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ（１３０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，１０．８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４，４．２ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４［ｐＨ７．２］）、０．１％ Ｌｏｗ－ｍｅｌｔｉｎｇ－ｐｏｉｎｔ ｔｅｍｐ．ａｇａｒｏｓｅ（０．１％ｖ／ｖ）、Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ（０．０１％ｖ／ｖ）を混合した。
【0062】
［観察サンプルの調製］
各プローブをＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを用いて希釈した溶液を、それぞれ終濃度１．０μＭとなるようにコンピテントセル溶液と混合した。この混合溶液を氷上に１５ｍｉｎ静置したのち、４２℃、４０ｓｅｃのヒートショックを与え、氷上に３ｍｉｎ静置したのち３７℃、４．０ｈのインキュベーションを行ない、ハイブリダイゼーションさせた。光照射は４．０℃下で行なった（波長：３８５ｎｍ／照射時間：３６０ｓｅｃ）。光照射後のサンプル溶液（５．０μＬ）およびＥｍｂｅｄｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（８．０μＬ）をスライドグラス上で混合し、ｒ．ｔ．で１０ｍｉｎ自然乾燥させたのちカバーグラスを載せた。
各プローブをＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを用いて希釈した溶液を、それぞれ終濃度１．０μＭとなるようにコンピテントセル溶液と混合した。この混合溶液を氷上に１５ｍｉｎ静置したのち、４２℃、４０ｓｅｃのヒートショックを与え、氷上に３ｍｉｎ静置したのち３７℃、４．０ｈのインキュベーションを行ない、ハイブリダイゼーションさせた。光照射は４．０℃下で行なった（波長：３８５ｎｍ／照射時間：３６０ｓｅｃ）。光照射後のサンプル溶液（５．０μＬ）およびＥｍｂｅｄｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（８．０μＬ）をスライドグラス上で混合し、ｒ．ｔ．で１０ｍｉｎ自然乾燥させたのちカバーグラスを載せた。
【0063】
［共焦点レーザー顕微鏡による観察］
ＦＩＳＨサンプルの観察には、共焦点レーザー顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｃ２Ｓｉ（ｗｉｔｈ ｕｓｅ Ｔｉ－ｕ））、ニコン画像統合ソフトウェア（ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を使用し、画像撮影には顕微鏡付属のＣＣＤカメラを使用した。観察の条件は以下のように設定した。
励起波長： ５６１ｎｍ、検出波長： ５７３－６１３ｎｍ
対物レンズ： ｘ６０（油浸レンズ）
ＮＩＳ－ＥｌｅｍｅｎｔｓのＣｙ３蛍光画像検出感度（ＨＶ）：５０、閾値（Ｏｆｆｓｅｔ）： －１２７
明視野検出感度（ＨＶ）：１２８、閾値（Ｏｆｆｓｅｔ）： －１２７
ＦＩＳＨサンプルの観察には、共焦点レーザー顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｃ２Ｓｉ（ｗｉｔｈ ｕｓｅ Ｔｉ－ｕ））、ニコン画像統合ソフトウェア（ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を使用し、画像撮影には顕微鏡付属のＣＣＤカメラを使用した。観察の条件は以下のように設定した。
励起波長： ５６１ｎｍ、検出波長： ５７３－６１３ｎｍ
対物レンズ： ｘ６０（油浸レンズ）
ＮＩＳ－ＥｌｅｍｅｎｔｓのＣｙ３蛍光画像検出感度（ＨＶ）：５０、閾値（Ｏｆｆｓｅｔ）： －１２７
明視野検出感度（ＨＶ）：１２８、閾値（Ｏｆｆｓｅｔ）： －１２７
【0064】
［各プローブと標的との位置的情報］
実施例においては、複雑な高次構造を有しており、プローブ親和性が最も低い領域であるＥｃｏ６２７を標的とし、光応答性人工核酸（ＣＮＶＤ）含有プローブ（Ｔａｂｌｅ２．１）の組み合わせによって、ＣＮＶＤ含有ビーコン型プローブで相対Ｃｙ３蛍光強度の増加にどれほど影響が出るのかを検証した。図１に、標的と高次構造を崩す役割の各ノーマル型プローブの位置的情報を示す。
実施例においては、複雑な高次構造を有しており、プローブ親和性が最も低い領域であるＥｃｏ６２７を標的とし、光応答性人工核酸（ＣＮＶＤ）含有プローブ（Ｔａｂｌｅ２．１）の組み合わせによって、ＣＮＶＤ含有ビーコン型プローブで相対Ｃｙ３蛍光強度の増加にどれほど影響が出るのかを検証した。図１に、標的と高次構造を崩す役割の各ノーマル型プローブの位置的情報を示す。
【0065】
図１は、非特許文献１において開示されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １６Ｓ ｒＲＮＡの高次構造予測モデルの全体構造の部分拡大図である。図１中の「６００」、「６５０」、「７５０」は、それぞれ１６ｓＲＮＡの５’末端からの塩基数を示している。Ｅｃｏ６２７プローブのハイブリダイズ対象となる領域を、図１中に示した。同様に、表１に示した各プローブのハイブリダイズ対象となる領域を、図１中に、ぞれぞれのプローブ番号によって示した。非特許文献１にも示されているように、このＥｃｏ６２７プローブのハイブリダイズ対象となる領域は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ １６Ｓ ｒＲＮＡのなかでも、最もハイブリダイズ困難な領域であり、いわゆる分子ビーコン型プローブを用いて検出しようとしても、通常であれば、ほとんど検出することができない領域である。
【0066】
［観察結果と評価］
光応答性人工核酸（ＣＮＶＤ）含有プローブの組み合わせによって、ＣＮＶＤ含有ビーコン型プローブで相対Ｃｙ３蛍光強度の増加にどれほど影響が出るのかを検証した。まず初めに、ビーコン型プローブＥｃｏ６２７のみを加えた場合と、ビーコン型プローブＥｃｏ６２７と高次構造を崩す役割を担うノーマル型プローブ８種類を加えた場合で、どれほど相対Ｃｙ３蛍光強度の増加の影響が出るのかの検討を行った。相対Ｃｙ３蛍光強度は、共焦点レーザー走査顕微鏡により撮影した画像を画像解析ソフトウェアＩｍａｇｅ Ｊを使用して輝度を定量し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌを使用してビーコン型プローブＥｃｏ６２７のみを加えた場合の光照射０秒時点のＣｙ３蛍光強度を基準とし、各光照射時間後のＣｙ３蛍光強度の相対値を算出した。光照射時間はＥｃｏ１４３７シリーズ同様、波長３８５ｎｍで３６０秒間とした。
光応答性人工核酸（ＣＮＶＤ）含有プローブの組み合わせによって、ＣＮＶＤ含有ビーコン型プローブで相対Ｃｙ３蛍光強度の増加にどれほど影響が出るのかを検証した。まず初めに、ビーコン型プローブＥｃｏ６２７のみを加えた場合と、ビーコン型プローブＥｃｏ６２７と高次構造を崩す役割を担うノーマル型プローブ８種類を加えた場合で、どれほど相対Ｃｙ３蛍光強度の増加の影響が出るのかの検討を行った。相対Ｃｙ３蛍光強度は、共焦点レーザー走査顕微鏡により撮影した画像を画像解析ソフトウェアＩｍａｇｅ Ｊを使用して輝度を定量し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌを使用してビーコン型プローブＥｃｏ６２７のみを加えた場合の光照射０秒時点のＣｙ３蛍光強度を基準とし、各光照射時間後のＣｙ３蛍光強度の相対値を算出した。光照射時間はＥｃｏ１４３７シリーズ同様、波長３８５ｎｍで３６０秒間とした。
【0067】
得られた観察の結果を、図２Ａ～図２Ｄに例示して示す。図２Ａ～図２ＤにＥ．ｃｏｌｉのＣＬＳＭ画像（共焦点レーザー顕微鏡画像）を示す。図２Ａ及び図２Ｂは、３８５ｎｍで０秒間（図２Ａ）又は３６０秒間（図２Ｂ）光照射されたＥｃｏ６２７によって染色されたＥ．ｃｏｌｉのＣＬＳＭ画像である。図２Ｃ及び図２Ｄは、３８５ｎｍで０秒間（図２Ｃ）又は３６０秒間（図２Ｄ）光照射されたＥｃｏ６２７及びＥｃｏ５６７（１）～７６３（８）によって染色されたＥ．ｃｏｌｉのＣＬＳＭ画像である。スケールバーは、２０μｍである。
【0068】
図２Ａ～図２ＤのＣＬＳＭ画像から観察されるように、ＦＩＳＨの結果、明視野画像（ＰＣ）において細胞であると定義された範囲にＣｙ３による蛍光発光の凝集が観察されたことから、プローブが細胞内に取り込まれたことが示唆された。また、ビーコン型プローブＥｃｏ６２７と高次構造を崩す役割を担うノーマル型プローブ８種類を加えた場合で光照射によって相対Ｃｙ３蛍光強度の増加が確認されたことから、プローブが標的ＲＮＡに対して結合したということが示唆された。蛍光強度の定量化は、共焦点顕微鏡により得られたＣｙ３蛍光画像の輝度をＩｍａｇｅ Ｊにより定量し、Ｅｘｃｅｌにより解析して行った。定量化により作成したグラフを、図３Ａ～図３Ｂに示す。
【0069】
図３Ａは、３８５ｎｍで０秒間又は３６０秒間光照射されたＥｃｏ６２７によって染色されたＥ．ｃｏｌｉの相対蛍光強度を示すグラフである。図３Ｂは、３８５ｎｍで０秒間又は３６０秒間光照射されたＥｃｏ６２７及びＥｃｏ５６７（１）～７６３（８）によって染色されたＥ．ｃｏｌｉの相対蛍光強度を示すグラフである。
【0070】
図３Ａ及び図３Ｂにおいて、グラフの縦軸の相対蛍光強度は、光架橋性分子ビーコン型プローブＥｃｏ６２７のみを加えた場合の光照射時間０秒時を、「１」として、この相対値によって示した。光架橋性分子ビーコン型プローブＥｃｏ６２７のハイブリダイズによる相補性領域の検出が、光架橋によってどの程度まで高感度化されるか、さらに光架橋性アシストプローブによってどの程度まで高感度化されるかを、容易に把握できるようにするためである。
【0071】
図３Ａに示されるように、光架橋性分子ビーコン型プローブＥｃｏ６２７のみを加えた場合での光照射３６０秒後の相対Ｃｙ３蛍光強度は、光照射０秒後と対比して、７倍へ増加した。蛍光強度が７倍となる増加は大きな増加ではあるけれども、光架橋による高感度化としては期待されるよりも小さい。このことは、光架橋性分子ビーコン型プローブＥｃｏ６２７の検出対象とする領域が、複雑な高次構造を有していて、検出困難な領域であることを意味する。すなわち、非特許文献１において最も検出困難であったとされるＣｌａｓｓ ＶＩと評価された通りに、極めて検出困難である領域であることが確認された。
【0072】
これに対して、図３Ｂに示されるように、光架橋性分子ビーコン型プローブＥｃｏ６２７と、光架橋性アシストプローブ８種（表１に示したＥｃｏ５６７（１）～Ｅｃｏ７６３（８））とを加えた場合には、光照射３６０秒後の相対Ｃｙ３蛍光強度は、光架橋性分子ビーコン型プローブＥｃｏ６２７のみの光照射０秒後と対比して、３９倍へ増加した。このことから、光架橋性分子ビーコン型プローブＥｃｏ６２７と、光架橋性アシストプローブとを組み合わせることによって、複雑な高次構造を有していて検出困難な領域に対しても、驚くほどの高感度化を達成して、検出可能とできることがわかった。この理由は不明であるが、本発明者は、光架橋性アシストプローブが、光架橋性分子ビーコン型プローブＥｃｏ６２７の標的領域付近の高次構造を変化させて、光架橋性分子ビーコン型プローブＥｃｏ６２７の光架橋が形成可能な状態を作り出したのではないかと考えている。
【0073】
［実施例２：光架橋性アシストプローブの組み合わせとアシスト効果の検討］
［高次構造ＲＮＡ中の領域］
上述のように、実施例１の結果から、本発明者は、光架橋性アシストプローブが、光架橋性分子ビーコン型プローブＥｃｏ６２７の標的領域付近の高次構造を変化させたと考えた。そこで、この高次構造変化の効率的な促進のために、光架橋性アシストプローブの組み合わせとアシスト効果の検討を行った。
［高次構造ＲＮＡ中の領域］
上述のように、実施例１の結果から、本発明者は、光架橋性アシストプローブが、光架橋性分子ビーコン型プローブＥｃｏ６２７の標的領域付近の高次構造を変化させたと考えた。そこで、この高次構造変化の効率的な促進のために、光架橋性アシストプローブの組み合わせとアシスト効果の検討を行った。
【0074】
図１に示す高次構造ＲＮＡは、実際には図示できないほどに、複雑な高次構造を備えているとされているが、本発明者は、図１に示す高次構造ＲＮＡの光架橋性分子ビーコン型プローブＥｃｏ６２７の標的領域付近の構造の本質を、次のような構造へとモデル化して考えた。すなわち、図１において、Ｅｃｏ６２７の標的領域である二重鎖領域があり、標的領域である二重鎖領域の左側に位置する二重鎖領域（Ａ領域）があり、標的領域の右側に位置する３分岐構造があり、３分岐構造の左側の分岐には二重鎖領域（標的領域）があり、３分岐構造の上方に位置する二重鎖領域（Ｂ領域）があり、３分岐構造の下方に位置する二重鎖領域（Ｃ領域）がある。このＡ領域、Ｂ領域、及びＣ領域の配置を、次の図４に示す。
【0075】
本発明者は、各アシストプローブの相補性領域の位置情報から、上記の３つの領域へのアシストプローブによるハイブリダイズと光架橋が、標的領域におけるハイブリダイズと光架橋を容易にするような、高次構造の変化をもたらすとの仮説をたてて、さらに検討を行った。
【0076】
［アシストプローブの組み合わせ］
表１に示したアシストプローブから、３つのプローブの組み合わせを抽出して、５６通りの組み合わせに対して、アシスト効果を検討することとした。この組み合わせを次の表２に示す。表２において、表１に示したプローブ番号で、各プローブを示している。例えば、表２の左端の列の第２行目の欄に「１．２」とあるのは、表１におけるＥｃｏ５６７（１）とＥｃｏ６４５（２）との組み合わせの記載を意味し、表２の左端から２番目の列の第１行目の欄に「３」とあるのは、表１におけるＥｃｏ６１４（３）を意味し、表２の左端から２番目の列の第２行目の欄に「１」とあるのは、表１におけるＥｃｏ５６７（１）とＥｃｏ６４５（２）とＥｃｏ６１４（３）の組み合わせを、組み合わせ番号「１」とすることを意味している。
表１に示したアシストプローブから、３つのプローブの組み合わせを抽出して、５６通りの組み合わせに対して、アシスト効果を検討することとした。この組み合わせを次の表２に示す。表２において、表１に示したプローブ番号で、各プローブを示している。例えば、表２の左端の列の第２行目の欄に「１．２」とあるのは、表１におけるＥｃｏ５６７（１）とＥｃｏ６４５（２）との組み合わせの記載を意味し、表２の左端から２番目の列の第１行目の欄に「３」とあるのは、表１におけるＥｃｏ６１４（３）を意味し、表２の左端から２番目の列の第２行目の欄に「１」とあるのは、表１におけるＥｃｏ５６７（１）とＥｃｏ６４５（２）とＥｃｏ６１４（３）の組み合わせを、組み合わせ番号「１」とすることを意味している。
【0077】
【表2】
【0078】
［実験、観察及び評価］
実施例１においては、光架橋性分子ビーコン型プローブＥｃｏ６２７のみを加えた場合と、光架橋性分子ビーコン型プローブＥｃｏ６２７と光架橋性アシストプローブ８種類とを全て加えた場合とで、対比実験を行っていたところ、この実施例２においては、光架橋性分子ビーコン型プローブＥｃｏ６２７のみを加えた場合と、上記光架橋性アシストプローブの組み合わせ番号１～５６のいずれかの組み合わせと光架橋性分子ビーコン型プローブＥｃｏ６２７とを加えた場合の実験を行った。組み合わせを追加した以外については、実施例１と同様に実験、観察、及び評価を行った。この結果を、次の表３に示す。
実施例１においては、光架橋性分子ビーコン型プローブＥｃｏ６２７のみを加えた場合と、光架橋性分子ビーコン型プローブＥｃｏ６２７と光架橋性アシストプローブ８種類とを全て加えた場合とで、対比実験を行っていたところ、この実施例２においては、光架橋性分子ビーコン型プローブＥｃｏ６２７のみを加えた場合と、上記光架橋性アシストプローブの組み合わせ番号１～５６のいずれかの組み合わせと光架橋性分子ビーコン型プローブＥｃｏ６２７とを加えた場合の実験を行った。組み合わせを追加した以外については、実施例１と同様に実験、観察、及び評価を行った。この結果を、次の表３に示す。
【0079】
表３に、各プローブの組み合わせと、その組み合わせによって検出された相対Ｃｙ３蛍光強度を示す。例えば、組み合わせ１（１．２．３）と記載されている組み合わせは、組み合わせ番号１であって、表１に記載した光架橋性アシストプローブの（１）と（２）と（３）を組み合わせたことを示したものであって、得られた相対蛍光強度が２１．０であったことを示している。
【0080】
【表3】
【0081】
【0082】
表３、図５Ａ及び図５Ｂにおいては、プローブの組み合わせとして、５６通りの組み合わせの結果が示されている。５６通りの組み合わせのうち、より大きな相対Ｃｙ３蛍光強度の増加が得られた組み合わせは以下の通りである。
【0083】
これらの組み合わせのうち、最も高い相対Ｃｙ３蛍光強度が得られた組み合わせは、上述したＡ領域、Ｂ領域、及びＣ領域の３つの領域のそれぞれに対して、相補性領域を有する光架橋性アシストプローブを１つずつ備えた組み合わせであった。この最も高い相対Ｃｙ３蛍光強度が得られた組み合わせにおいては、相対Ｃｙ３蛍光強度３５．５倍という増加が観察された。この３５．５倍という増加は、プローブ８種類を加えた場合と同程度の相対Ｃｙ３蛍光強度であった。この結果より、上記の３つの領域へのアシストプローブによるハイブリダイズと光架橋が、標的領域におけるハイブリダイズと光架橋を容易にするような、高次構造の変化をもたらすとの仮説が、確かなものとなった。すなわち、３つの領域の高次構造を崩すことが標的を蛍光検出するための必要条件であることが明らかとなった。
【0084】
また、さらに結果を詳細に検討すると、最も大きな相対Ｃｙ３蛍光強度の増加が得られた組み合わせ番号１４（Ｅｃｏ５６７（１）、Ｅｃｏ６０３（４）、Ｅｃｏ７４５（７）の組み合わせ）は、Ａ領域をＥｃｏ６０３（４）が、Ｂ領域をＥｃｏ７４５（７）、Ｃ領域をＥｃｏ５６７（１）が、それぞれの領域の構造を崩していると考えられる。特にＥｃｏ７４５（７）は、本発明者の仮説によれば、３分岐構造を崩す役割を担っていると予想されたところ、実際に重要なプローブであることが上記実験結果から明らかとなった。
【0085】
［相対蛍光強度の増加の大きな組み合わせの抜粋と詳細な評価］
相対蛍光強度の増加の大きな組み合わせを抜粋して、実施例１と同様に実験、観察、及び評価と検討を行った。ＣＬＳＭ画像の観察の結果を、実施例１と同様の手法で定量化して作成したグラフを、図６に示す。図６は、Ｅｃｏ６２７によって染色されたＥ．ｃｏｌｉの蛍光強度について、Ｅｃｏ６２７のみを添加した場合を基準にして、それぞれ記載のアシストプローブの組み合わせを使用した場合の相対的な蛍光強度のグラフである。
相対蛍光強度の増加の大きな組み合わせを抜粋して、実施例１と同様に実験、観察、及び評価と検討を行った。ＣＬＳＭ画像の観察の結果を、実施例１と同様の手法で定量化して作成したグラフを、図６に示す。図６は、Ｅｃｏ６２７によって染色されたＥ．ｃｏｌｉの蛍光強度について、Ｅｃｏ６２７のみを添加した場合を基準にして、それぞれ記載のアシストプローブの組み合わせを使用した場合の相対的な蛍光強度のグラフである。
【0086】
図６から、組み合わせ番号１４（Ｅｃｏ５６７（１）、Ｅｃｏ６０３（４）、Ｅｃｏ７４５（７）の組み合わせ）の相対蛍光強度が最も大きな増加を示したことがわかった。この組み合わせ番号１４（Ｅｃｏ５６７（１）、Ｅｃｏ６０３（４）、Ｅｃｏ７４５（７）の組み合わせ）について、各アシストプローブのハイブリダイズ対象となる領域の配置を、図７に示す。
【0087】
［相対蛍光強度の増加の小さな組み合わせの抜粋と詳細な評価］
相対蛍光強度の増加の小さな組み合わせを抜粋して、実施例１と同様に実験、観察、及び評価と検討を行った。ＣＬＳＭ画像の観察の結果を、実施例１と同様の手法で定量化して作成したグラフを、図８に示す。図８は、Ｅｃｏ６２７によって染色されたＥ．ｃｏｌｉの蛍光強度について、Ｅｃｏ６２７のみを添加した場合を基準にして、それぞれ記載のアシストプローブの組み合わせを使用した場合の相対的な蛍光強度のグラフである。
相対蛍光強度の増加の小さな組み合わせを抜粋して、実施例１と同様に実験、観察、及び評価と検討を行った。ＣＬＳＭ画像の観察の結果を、実施例１と同様の手法で定量化して作成したグラフを、図８に示す。図８は、Ｅｃｏ６２７によって染色されたＥ．ｃｏｌｉの蛍光強度について、Ｅｃｏ６２７のみを添加した場合を基準にして、それぞれ記載のアシストプローブの組み合わせを使用した場合の相対的な蛍光強度のグラフである。
【0088】
図８に示されるように、相対蛍光強度は、最も低い組み合わせ４１（３．５．６）で５．１倍という結果となった。このなかで比較的に高い組み合わせ１６（１．５．６）でも、９．４倍であった。
【0089】
これらの組み合わせに共通する点は、上述したＡ領域、Ｂ領域、Ｃ領域の３つの領域に関して、１つの領域に対して、２つのアシストプローブが含まれている点である。最も増加率が低かった組み合わせ４１（Ｅｃｏ６２４（３）、Ｅｃｏ６５０（５）、Ｅｃｏ７３８（６））を例とすると、Ｂ領域に対するアシストプローブとして、Ｅｃｏ６５０（５）、Ｅｃｏ７３８（６）の２つが含まれている。このＥｃｏ６５０（５）、Ｅｃｏ７３８（６）は、ハイブリダイゼーションによるアシストの及ぶ領域が同じ領域となり、一方で、Ｃ領域に対してはほとんどアシストの効果が及ばないことから、全体としてアシストの効率が他の組み合わせよりも低くなったと考えられる。加えて、Ｅｃｏ６５０（５）、Ｅｃｏ７３８（６）は、ほとんど相補鎖となっているため、Ｅｃｏ６５０（５）とＥｃｏ７３８（６）との相補鎖形成的な相互作用も生じて、結果として、ＲＮＡ構造に対して有効に結合するＥｃｏ６５０（５）、Ｅｃｏ７３８（６）の割合が少なくなったことも考えられる。相補鎖の関係だけでなく、アシストプローブ同士が数塩基分被ってしまう組み合わせに関しても、同様の理由で相対Ｃｙ３蛍光強度の増加率が低くなったと考えられる。
【0090】
図９に、組み合わせ番号４１（Ｅｃｏ６２４（３）、Ｅｃｏ６５０（５）、Ｅｃｏ７３８（６））について、各アシストプローブのハイブリダイズ対象となる領域の配置を示す。
【0091】
［実施例３：４つの光架橋性アシストプローブを組み合わせた検討］
［４つめのアシストプローブを追加する組み合わせ番号の選択］
実施例２においては、光架橋性アシストプローブの組み合わせの検討にあたって、３つのアシストプローブの組み合わせを検討した。実施例３では、４つの光架橋性アシストプローブを組み合わせた検討を以下のように行った。
［４つめのアシストプローブを追加する組み合わせ番号の選択］
実施例２においては、光架橋性アシストプローブの組み合わせの検討にあたって、３つのアシストプローブの組み合わせを検討した。実施例３では、４つの光架橋性アシストプローブを組み合わせた検討を以下のように行った。
【0092】
検討において、まず最初に、実施例２の検討において相対Ｃｙ３蛍光強度の増加が最も大きかった組み合わせ番号１４（Ｅｃｏ５６７（１）、Ｅｃｏ６０３（４）、Ｅｃｏ７４５（７）の組み合わせ）と、相対Ｃｙ３蛍光強度の増加が最も小さかった組み合わせ４１（Ｅｃｏ６２４（３）、Ｅｃｏ６５０（５）、Ｅｃｏ７３８（６））を選択した。そして、この組み合わせ番号１４及び４１を元にして、さらに、１つのアシストプローブを加えることによってどのような影響が及ぶのか検討した。
【0093】
実施例２の組み合わせ番号１４に関してはもうすでに、Ａ領域、Ｂ領域、及びＣ領域の全てに対してそれぞれアシストプローブが添加されており、Ｅｃｏ６２７が標的領域へとハイブリダイズと光架橋するために必要と思われる程度に、ＲＮＡ高次構造は崩れていると考えられる。この状態でアシストプローブをさらに追加すると、アシストプローブ同士の相互作用により、むしろ、相対Ｃｙ３蛍光強度が減少する可能性も考えられたために、この点について検討を行った。
【0094】
実施例２の組み合わせ番号４１に関しては、Ａ領域に対するアシストプローブが１つ（Ｅｃｏ６１４（３））、Ｂ領域に対するアシストプローブが２つ（Ｅｃｏ６５０（５）、Ｅｃｏ７３８（６））含まれていた。実施例２の組み合わせ番号４１では、Ｂ領域に対するこの２つのアシストプローブ同士の負の協同性により、相対Ｃｙ３蛍光強度の増加が得られなかったとも考えられた。そこで、実施例２の組み合わせ番号４１に対して、Ｃ領域に対するアシストプローブが加わることでプローブ同士の正の協同性により、相対Ｃｙ３蛍光強度の増加が得られるのかを検討した。また、さらに、Ａ領域、及びＢ領域に対するアシストプローブが加わることにより、負の協同性によって相対Ｃｙ３蛍光強度がさらに減少するのか検討した。
【0095】
実験と評価は、実施例１と同様に行った。
【0096】
［組み合わせ番号１４に対してアシストプローブを追加した検討］
実施例２の組み合わせ番号１４に対して、さらに１つのアシストプローブを追加した実験を行った。ＣＬＳＭ画像の観察の結果を、実施例１と同様の手法で定量化して作成したグラフを、図１０に示す。図１０は、Ｅｃｏ６２７によって染色されたＥ．ｃｏｌｉの蛍光強度について、Ｅｃｏ６２７のみを添加した場合を基準にして、それぞれ記載のアシストプローブの組み合わせを使用した場合の相対的な蛍光強度のグラフである。
実施例２の組み合わせ番号１４に対して、さらに１つのアシストプローブを追加した実験を行った。ＣＬＳＭ画像の観察の結果を、実施例１と同様の手法で定量化して作成したグラフを、図１０に示す。図１０は、Ｅｃｏ６２７によって染色されたＥ．ｃｏｌｉの蛍光強度について、Ｅｃｏ６２７のみを添加した場合を基準にして、それぞれ記載のアシストプローブの組み合わせを使用した場合の相対的な蛍光強度のグラフである。
【0097】
［組み合わせ番号４１に対してアシストプローブを追加した検討］
実施例２の組み合わせ番号４１に対して、さらに１つのアシストプローブを追加した実験を行った。ＣＬＳＭ画像の観察の結果を、実施例１と同様の手法で定量化して作成したグラフを、図１１に示す。図１１は、Ｅｃｏ６２７によって染色されたＥ．ｃｏｌｉの蛍光強度について、Ｅｃｏ６２７のみを添加した場合を基準にして、それぞれ記載のアシストプローブの組み合わせを使用した場合の相対的な蛍光強度のグラフである。
実施例２の組み合わせ番号４１に対して、さらに１つのアシストプローブを追加した実験を行った。ＣＬＳＭ画像の観察の結果を、実施例１と同様の手法で定量化して作成したグラフを、図１１に示す。図１１は、Ｅｃｏ６２７によって染色されたＥ．ｃｏｌｉの蛍光強度について、Ｅｃｏ６２７のみを添加した場合を基準にして、それぞれ記載のアシストプローブの組み合わせを使用した場合の相対的な蛍光強度のグラフである。
【0098】
［４つの光架橋性アシストプローブを組み合わせた実験の評価］
組み合わせ１４（Ｅｃｏ５６７（１）、Ｅｃｏ６０３（４）、Ｅｃｏ７４５（７））に関しては、プローブを追加することでプローブ同士の負の協同性により、相対Ｃｙ３蛍光強度の減少が見られた。Ｅｃｏ６４５（２）を加えた場合では２７．６倍（２２．２％減少）だったのに対して、Ｅｃｏ６１４（３）を加えた場合では１６．５倍（５３．５％減少）、Ｅｃｏ７６３（８）を加えた場合では１７．８倍（４９．９％減少）となった。このような減少率になった原因として、Ｅｃｏ６４５（２）はＥｃｏ７４５（７）と一部相補鎖となるが、標的との位置関係も近く、Ｔ字構造を崩す役割を担っているプローブであるため、それほど負の協同性による相対Ｃｙ３蛍光強度の減少は起こらなかったと考えられる。
組み合わせ１４（Ｅｃｏ５６７（１）、Ｅｃｏ６０３（４）、Ｅｃｏ７４５（７））に関しては、プローブを追加することでプローブ同士の負の協同性により、相対Ｃｙ３蛍光強度の減少が見られた。Ｅｃｏ６４５（２）を加えた場合では２７．６倍（２２．２％減少）だったのに対して、Ｅｃｏ６１４（３）を加えた場合では１６．５倍（５３．５％減少）、Ｅｃｏ７６３（８）を加えた場合では１７．８倍（４９．９％減少）となった。このような減少率になった原因として、Ｅｃｏ６４５（２）はＥｃｏ７４５（７）と一部相補鎖となるが、標的との位置関係も近く、Ｔ字構造を崩す役割を担っているプローブであるため、それほど負の協同性による相対Ｃｙ３蛍光強度の減少は起こらなかったと考えられる。
【0099】
組み合わせ４１（Ｅｃｏ６２４（３）、Ｅｃｏ６５０（５）、Ｅｃｏ７３８（６））に関しては、プローブを追加することで各プローブの協同性が正に働き、相対Ｃｙ３蛍光強度の増加が得られた。こちらの組み合わせに関しても、３つの領域だけでなく標的との位置関係も重要であることがこの結果から示唆された。３つの領域にのみ着目して予測したとすれば、Ｃ領域に対するプローブＥｃｏ５６７（１）およびＥｃｏ７６３（８）を加えることで、３つの領域の構造は崩すことができて、相対Ｃｙ３蛍光強度の増加が得られると考えられる。しかし、実験の結果からはＥｃｏ６４５（２）、Ｅｃｏ７４５（７）を加えた場合には、それぞれ２５．６倍、２３．９倍の相対Ｃｙ３蛍光強度が得られた。このＥｃｏ６４５（２）、Ｅｃｏ７４５（７）は標的との位置関係も近く、３分岐構造を崩す役割を担っているプローブである。よって、３つの領域だけでなく標的との位置関係も近い３分岐構造を崩す役割を担っているプローブの有無も重要であることが示唆された。
【0100】
［実施例４：２つの光架橋性アシストプローブを組み合わせた検討］
実施例２の組み合わせ番号１４（Ｅｃｏ５６７（１）、Ｅｃｏ６０３（４）、Ｅｃｏ７４５（７））と組み合わせ番号４１（Ｅｃｏ６２４（３）、Ｅｃｏ６５０（５）、Ｅｃｏ７３８（６））に対して、１つプローブを減らすことによってどのような影響が及ぶのか検討した。相対蛍光強度増加の大きい組み合わせ番号１４については、標的の高次構造を崩すために必要であろうと予測される３つの領域のうち、どの領域の高次構造を崩すことが重要なのか、２つの領域を崩してしまえば標的とのハイブリダイゼーション効率は大幅に向上するのか、を検討した。相対蛍光強度増加の小さい組み合わせ番号４１に関しては、相補鎖となっており負の協同性が働いているＥｃｏ６５０（５）及びＥｃｏ７３８（６）のどちらか片方のプローブを除いた場合に、相対Ｃｙ３蛍光強度の増加が得られるのかの検討を行った。
実施例２の組み合わせ番号１４（Ｅｃｏ５６７（１）、Ｅｃｏ６０３（４）、Ｅｃｏ７４５（７））と組み合わせ番号４１（Ｅｃｏ６２４（３）、Ｅｃｏ６５０（５）、Ｅｃｏ７３８（６））に対して、１つプローブを減らすことによってどのような影響が及ぶのか検討した。相対蛍光強度増加の大きい組み合わせ番号１４については、標的の高次構造を崩すために必要であろうと予測される３つの領域のうち、どの領域の高次構造を崩すことが重要なのか、２つの領域を崩してしまえば標的とのハイブリダイゼーション効率は大幅に向上するのか、を検討した。相対蛍光強度増加の小さい組み合わせ番号４１に関しては、相補鎖となっており負の協同性が働いているＥｃｏ６５０（５）及びＥｃｏ７３８（６）のどちらか片方のプローブを除いた場合に、相対Ｃｙ３蛍光強度の増加が得られるのかの検討を行った。
【0101】
実験と評価は、実施例１と同様に行った。
【0102】
［組み合わせ番号１４からアシストプローブを減らした検討］
実施例２の組み合わせ番号１４から、１つのアシストプローブを減らした実験を行った。ＣＬＳＭ画像の観察の結果を、実施例１と同様の手法で定量化して作成したグラフを、図１２に示す。図１２は、Ｅｃｏ６２７によって染色されたＥ．ｃｏｌｉの蛍光強度について、Ｅｃｏ６２７のみを添加した場合を基準にして、それぞれ記載のアシストプローブの組み合わせを使用した場合の相対的な蛍光強度のグラフである。
実施例２の組み合わせ番号１４から、１つのアシストプローブを減らした実験を行った。ＣＬＳＭ画像の観察の結果を、実施例１と同様の手法で定量化して作成したグラフを、図１２に示す。図１２は、Ｅｃｏ６２７によって染色されたＥ．ｃｏｌｉの蛍光強度について、Ｅｃｏ６２７のみを添加した場合を基準にして、それぞれ記載のアシストプローブの組み合わせを使用した場合の相対的な蛍光強度のグラフである。
【0103】
［組み合わせ番号４１からアシストプローブを減らした検討］
実施例２の組み合わせ番号４１から、１つのアシストプローブを減らした実験を行った。ＣＬＳＭ画像の観察の結果を、実施例１と同様の手法で定量化して作成したグラフを、図１３に示す。図１３は、Ｅｃｏ６２７によって染色されたＥ．ｃｏｌｉの蛍光強度について、Ｅｃｏ６２７のみを添加した場合を基準にして、それぞれ記載のアシストプローブの組み合わせを使用した場合の相対的な蛍光強度のグラフである。
実施例２の組み合わせ番号４１から、１つのアシストプローブを減らした実験を行った。ＣＬＳＭ画像の観察の結果を、実施例１と同様の手法で定量化して作成したグラフを、図１３に示す。図１３は、Ｅｃｏ６２７によって染色されたＥ．ｃｏｌｉの蛍光強度について、Ｅｃｏ６２７のみを添加した場合を基準にして、それぞれ記載のアシストプローブの組み合わせを使用した場合の相対的な蛍光強度のグラフである。
【0104】
［２つの光架橋性アシストプローブを組み合わせた実験の評価］
組み合わせ番号１４に関しては、アシストプローブを１つ減らすことにより、相対Ｃｙ３蛍光強度の減少が見られた。各組み合わせについて、それぞれ、Ｅｃｏ５６７（１）・Ｅｃｏ６１４（３） ： １２．９倍、Ｅｃｏ５６７（１）・Ｅｃｏ７４５（７） ： １８．１倍、 Ｅｃｏ７４５（７）・Ｅｃｏ６０３（４） ： １１．５倍であった。この結果から、３つの領域のうち１つの領域の高次構造を崩すことができなくなると、３つの領域全てを崩す場合と比較して、相対Ｃｙ３蛍光強度が減少することがわかった。
組み合わせ番号１４に関しては、アシストプローブを１つ減らすことにより、相対Ｃｙ３蛍光強度の減少が見られた。各組み合わせについて、それぞれ、Ｅｃｏ５６７（１）・Ｅｃｏ６１４（３） ： １２．９倍、Ｅｃｏ５６７（１）・Ｅｃｏ７４５（７） ： １８．１倍、 Ｅｃｏ７４５（７）・Ｅｃｏ６０３（４） ： １１．５倍であった。この結果から、３つの領域のうち１つの領域の高次構造を崩すことができなくなると、３つの領域全てを崩す場合と比較して、相対Ｃｙ３蛍光強度が減少することがわかった。
【0105】
組み合わせ番号４１に関しては、アシストプローブを１種類減らすことにより、相対Ｃｙ３蛍光強度の増加が得られた。組み合わせでの増加率を比較すると、Ｅｃｏ６５０（５）を除いた場合では１８．６倍、Ｅｃｏ７３８（６）を除いた場合では１９．１倍に増加した。これに対して、Ｅｃｏ６１４（３）を除いた場合、すなわちＥｃｏ６５０（５）とＥｃｏ７３８（６）の組み合わせの場合では９．６倍とそこまでの増加は得られなかった。これらの結果から、相補鎖となっており負の協同性が働いているＥｃｏ６５０（５）、Ｅｃｏ７３８（６）のどちらか片方のプローブを除くことで、相対Ｃｙ３蛍光強度の増加が得られることがわかった。
【0106】
２つの光架橋性アシストプローブの組み合わせ検討結果より、標的の複雑な高次構造を崩し標的を蛍光検出するためには、３つの領域全ての高次構造を変化させることが必要であることがわかった。また、２種類の組み合わせでＡ領域、Ｂ領域、Ｃ領域のうち３つの領域の重要性は、Ｂ領域が最も重要であり、次にＣ領域、その次にＡ領域であることがこれらの結果からわかった。
【産業上の利用可能性】
【0107】
本発明は、細胞内の高次構造ＲＮＡ中の検出困難な部位にある塩基配列を検出する手段を提供する。本発明は産業上有用な発明である。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
