特開 2022-41421 植物発酵物及びその利用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022041421

(43)【公開日】2022-03-11

(54)【発明の名称】植物発酵物及びその利用

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20220304BHJP

   C12N 9/99 20060101ALI20220304BHJP

   C12P 1/04 20060101ALI20220304BHJP

   A61K 8/9789 20170101ALI20220304BHJP

   A61K 36/28 20060101ALI20220304BHJP

   A61K 36/185 20060101ALI20220304BHJP

   A61K 8/9728 20170101ALI20220304BHJP

   A61Q 19/02 20060101ALI20220304BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20220304BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220304BHJP

   A61K 35/744 20150101ALI20220304BHJP

   A61K 35/747 20150101ALI20220304BHJP

   C12R 1/225 20060101ALN20220304BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 E

C12N9/99

C12P1/04 Z

C12N1/20 A

A61K8/9789

A61K36/28

A61K36/185

A61K8/9728

A61Q19/02

A61P17/00

A61P43/00 111

A61K35/744

A61K35/747

C12R1:225

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2020146605

(22)【出願日】2020-09-01

(71)【出願人】

【識別番号】000006884

【氏名又は名称】株式会社ヤクルト本社

(74)【代理人】

【識別番号】110000800

【氏名又は名称】特許業務法人創成国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】倉澤 智子

(72)【発明者】

【氏名】柴田 慎也

(72)【発明者】

【氏名】伊澤 直樹

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 雅彦

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C083

4C087

4C088

【Ｆターム（参考）】

4B064CA02

4B064CD22

4B064DA01

4B065AA30X

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA30

4B065BB26

4B065BD09

4B065BD15

4B065BD18

4B065CA50

4C083AA031

4C083AA032

4C083AA111

4C083AA112

4C083CC02

4C083EE35

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC56

4C087ZA89

4C087ZC20

4C088AB12

4C088AB26

4C088NA05

4C088ZA89

4C088ZC42

(57)【要約】

【課題】アルニカ、ゴレンシ等の植物に由来する素材であって、活性向上のため改良された素材を提供する。
【解決手段】植物又はその処理物を原料とする微生物による発酵物であって、前記植物がアルニカである場合、前記微生物はラクトバチルス ゼアエ（Lactobacillus zeae）に属する微生物、ラクトバチルス ホルデイ（Lactobacillus hordei）に属する微生物、及びペディオコッカス アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）に属する微生物からなる群から選ばれた１種又は２種以上の微生物であり、前記植物がゴレンシである場合、前記微生物はラクトバチルス属（Lactobacillus属）に属する微生物である、該発酵物である。この発酵物は、皮膚外用剤、化粧料への配合素材等として有用である。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

植物又はその処理物を原料とする微生物による発酵物であって、前記植物がアルニカである場合、前記微生物はラクトバチルス ゼアエ（Lactobacillus zeae）に属する微生物、ラクトバチルス ホルデイ（Lactobacillus hordei）に属する微生物、及びペディオコッカス アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）に属する微生物からなる群から選ばれた１種又は２種以上の微生物であり、前記植物がゴレンシである場合、前記微生物はラクトバチルス属（Lactobacillus属）に属する微生物である、該発酵物。

【請求項2】

前記植物はゴレンシであり、前記微生物は、ラクトバチルス マリ（Lactobacillus mali）に属する微生物である、請求項１記載の発酵物。

【請求項3】

請求項１又は２に記載の発酵物を含有する皮膚外用剤。

【請求項4】

美白効果をもたらすために用いられる、請求項３記載の皮膚外用剤。

【請求項5】

前記発酵物は、チロシナーゼ阻害作用を有するものである、請求項３又は４に記載の皮膚外用剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、皮膚外用剤等として有用な植物発酵物に関し、より詳細には、アルニカ又はゴレンシの発酵物、及びこれを含有する皮膚外用剤に関する。

【背景技術】

【0002】

アルニカは、ヨーロッパ原産の高山植物として知られ、キク科の多年草であり、ハーブや生薬用として広く栽培されている。一方、ゴレンシは、熱帯アジア原産のカタバミ科の常緑小高木であり、その果実はスターフルーツとして広く流通している。従来、植物エキスや発酵物を化粧料等に用いることが行われているが、これらアルニカやゴレンシにつては皮膚外用剤としての利用が報告されている。すなわち、例えば、特許文献１には、皮膚老化防止用組成物に含有せしめる紫外線ダメージ抑制剤として、アルニカエキスを用いることが記載されている。また、例えば、特許文献２には、ゴレンシの葉の８０％エタノール抽出物は、チロシナーゼ阻害作用、メラニン産生抑制作用等を有しており、更に、太陽光に曝された被験者の背部皮膚に塗布することにより、淡色化効果が認められたことが記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特許６３０５７２７号公報

【特許文献2】特開２００４－３５２６５９号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかしながら、従来の方法では、アルニカ又はゴレンシによる活性を十分に引き出すことができなかった。

【0005】

よって、本発明の目的は、アルニカ、ゴレンシ等の植物に由来する素材であって、活性向上のため改良された素材を提供することにある。また、これにより、新規な皮膚外用剤を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究し、本発明を完成するに至った。

【0007】

本発明の第１は、植物又はその処理物を原料とする微生物による発酵物であって、前記植物がアルニカである場合、前記微生物はラクトバチルス ゼアエ（Lactobacillus zeae）に属する微生物、ラクトバチルス ホルデイ（Lactobacillus hordei）に属する微生物、及びペディオコッカス アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）に属する微生物からなる群から選ばれた１種又は２種以上の微生物であり、前記植物がゴレンシである場合、前記微生物はラクトバチルス属（Lactobacillus属）に属する微生物である、該発酵物を提供するものである。

【0008】

本発明に係る発酵物においては、前記植物はゴレンシであり、前記微生物は、ラクトバチルス マリ（Lactobacillus mali）に属する微生物であることが好ましい。

【0009】

本発明の第２は、上記の発酵物を含有する皮膚外用剤を提供するものである。

【0010】

本発明に係る皮膚外用剤においては、該皮膚外用剤は、美白効果をもたらすために用いられることが好ましい。

【0011】

本発明に係る皮膚外用剤においては、前記発酵物は、チロシナーゼ阻害作用を有するものであることが好ましい。

【発明の効果】

【0012】

本発明によれば、アルニカ、ゴレンシ等の植物又はその処理物を原料とし、これを特定の微生物で処理した発酵物であるので、チロシナーゼ阻害活性等、美白効果をもたらす活性に優れている。よって、これにより新規な皮膚外用剤を提供することができる。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本明細書において「アルニカ」は、通常当業者に理解される植物と同義であり、具体的には、キク科ウサギギク属のアルニカ（学名：Ａｒｎｉｃａ ｍｏｎｔａｎａ、和名としてセイヨウウサギギクとも呼ばれる。）を含む意味である。アルニカは、ハーブや生薬用としても広く栽培されており、容易に入手可能である。

【0014】

本明細書において「ゴレンシ」は、通常当業者に理解される植物と同義であり、具体的には、カタバミ科ゴレンシ属のゴレンシ（学名：Ａｖｅｒｒｈｏａ ｃａｒａｍｂｏｌａ、和名として五歛子とも呼ばれる。）を含む意味である。ゴレンシは、熱帯アジア原産の常緑小高木であり、その果実はスターフルーツとして広く流通されており、容易に入手可能である。

【0015】

本発明においては、アルニカ、ゴレンシ等の植物又はその処理物に微生物を作用させて、その微生物による発酵物となす。微生物に作用させる植物体の部位としては、例えばアルニカの場合では、花部、葉部、幹部、地上部、根部、全草、又はこれらの部位の混合物等が挙げられるが、好ましくは花部、葉部、又はこれらの部位の混合物等であり、より好ましくは花部である。一方、例えばゴレンシの場合では、葉部、枝部、花部、果実部、樹皮部、根部、又はこれらの部位の混合物等が挙げられるが、好ましくは葉部、枝部、又はこれらの部位の混合物等であり、より好ましくは葉部である。微生物に作用させる植物体の形状としては、植物原体又はその乾燥物の破砕物、搾汁液、抽出物、又はこれらの混合物等であり、特に限定されない。好ましくは搾汁液、抽出物、又はこれらの混合物等であり、より好ましくは抽出物である。

【0016】

アルニカ、ゴレンシ等の植物又はその処理物に作用させる微生物としては、具体的には、アルニカに作用させる微生物としては、ラクトバチルス ゼアエ（Lactobacillus zeae）、ラクトバチルス ホルデイ（Lactobacillus hordei）、及びペディオコッカス アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）に属する微生物からなる群から選ばれた１種又は２種以上の微生物であることが好ましい。また、ゴレンシに作用させる微生物としては、ラクトバチルス属（Lactobacillus属）に属する微生物であることが好ましく、例えば、ラクトバチルス マリ（Lactobacillus mali）等である。これらの微生物であれば、当該植物又はその処理物の発酵が良好に促進され、且つ、美白効果をもたらす活性に優れている。微生物は、１種類を単独で上記原料との処理に用いてもよく、２種類以上を併用して上記原料との処理に用いてもよい。すなわち、異なる２種類以上の微生物による処理を順次に行ってもよく、異なる２種類以上の微生物を一時に併用して処理を行うようにしてもよく、また、これらの処理を組み合わせてもよい。

【0017】

アルニカ、ゴレンシ等の植物又はその処理物に上記微生物を作用させる際の条件については、当該植物又はその処理物の成分が上記微生物によってなにかしらの変化がもたらされるような条件であればよく、特に制限はないが、例えば、アルニカ、ゴレンシ等の植物又はその処理物に作用させた微生物が初発菌数の２～１００００倍量、典型的には５～１０００倍量、より典型的には１０～１０００倍量に増殖する生育条件であることがより好ましい。生育が乏しいと、発酵が良好に進まない。

【0018】

アルニカ、ゴレンシ等の植物又はその処理物に上記微生物を作用させる際には、その微生物の生育の補助材として、例えばグルコース、フルクトース、ショ糖、オリゴ糖等の糖類、アラニン、アルギニン、トリプトファン、システイン等のアミノ酸類、カゼイン分解物、タンパク分解物等のペプチド類、イーストエキス、肉エキス、ダイズエキス等のエキス類、オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等の脂肪酸を側鎖にもつ界面活性剤あるいは、標準的な乳酸菌用培地構成である、例えばラクトバシラスＭＲＳブロス（Ｄｉｆｃｏ）等を用いてもよい。

【0019】

ただし、アルニカ、ゴレンシ等の植物又はその処理物に由来する成分に加えてその他の成分が残存すると、防腐性、使用感等の観点から、得られる発酵物の品質に影響をきたす場合があるので、発酵に際しては、アルニカ、ゴレンシ等の植物又はその処理物に由来する成分以外の成分を必要以上に配合することは、望ましいとはいえない。よって、上記補助材を用いる場合には、例えば、アルニカ、ゴレンシ等の植物又はその処理物からの由来物１００質量部に対してそれ以外の構成割合を０．００１質量部以上５．０質量部以下とすることが好ましく、０．０１質量部以上０．５質量部以下とすることがより好ましい。一方、アルニカ、ゴレンシ等の植物又はその処理物に由来しない原料を何も添加せずに、上記微生物による処理に供するようにしてもよい。

【0020】

以下、本発明に係る発酵物を得るための、限定されない任意の態様について、更に具体的に説明する。

【0021】

上記微生物に作用させる原料としては、例えば、アルニカ、ゴレンシ等の植物の抽出物を得て、それを原料とすることができる。この場合、例えば植物体の乾燥粉末に対して１０～２００倍量の水や熱水（例えば、逆浸透膜処理水、イオン交換水、水道水、井水、蒸留水、超純水等を用いてもよい。）を加えて加熱処理して熱水抽出物を得て、それをそのまま抽出懸濁液の状態で原料にしたり、任意に水分を蒸発濃縮して原料にしたり、あるいは、フィルター濾過、遠心分離等の固液分離手段によって固形分を除いて上清を得て原料にしたりして、そのような原料に対して、上記微生物を適当な初発濃度接種して、作用させるようにすればよい。

【0022】

上記微生物による処理は、通常の通気、静置培養に準じた方法で行うことができる。この場合、初発菌数濃度としては、好ましくは１×１０⁴ＣＦＵ／ｍＬ以上５×１０⁷ＣＦＵ／ｍＬ以下であり、より好ましくは１×１０⁵ＣＦＵ／ｍＬ以上１×１０⁷ＣＦＵ／ｍＬ以下である。温度条件としては、２０℃～４０℃、より好ましくは２５℃～３７℃である。処理期間としては１２時間～１０日間、より好ましくは１～３日間である。このような静置培養により、例えば初発菌数の２～１００００倍量、典型的には５～１０００倍量、より典型的には１０～１０００倍量に微生物を増殖させてなる、発酵物を得ることができる。微生物による処理の後には、使用した微生物を含むままで、本発明に係る発酵物となしてもよいが、上述した防腐性、使用感等の観点からは、発酵に使用した微生物の菌体は、フィルター濾過、遠心分離等の固液分離手段によって除き、得られた上清を発酵物となすことが好ましい。また、微生物による処理の後には、その処理物に各種溶媒を加えて、抽出物ないし希釈物を調製し、本発明の発酵物として使用することも可能である。ここで使用する溶媒は、水、エタノール、プロパノール等の低級アルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール等の高級アルコール、１，３-ブチレングリコール、１，３-プロパンジオール、グリセリン等の多価アルコールなど、化粧品に汎用される溶媒があげられるが、これらに限定されたものではなく、単独あるいは二種以上混合して用いることができる。

【0023】

本発明に係る発酵物は、それをそのまま皮膚外用剤として用いてもよく、あるいは皮膚外用剤の製造工程で配合するようにして用いてもよい。具体的には、例えば、乳液、クリーム、クレンジング、マッサージ、サンスクリーン、化粧下地、クリームファンデーション等の形態の化粧料あるいはその原料として、好適に用いられ得る。なお、ここでいう化粧料は、医薬品、医療機器等の品質、有効性及び安全性の確保等に関する法律で定義されている医薬品、医薬部外品、化粧品を含む意味である。

【0024】

また、皮膚外用剤の形態としては、皮膚に作用させる成分を適当な基材部に担持してなる、パック、マスク、ジェル等であってもよい、すなわち、そのような皮膚外用剤の、皮膚に作用させる成分として、好適に用いられ得る。

【0025】

また、本発明の限定されない任意の態様において、上記皮膚外用剤は、美白効果をもたらすために用いられることや、チロシナーゼ阻害作用を有すること等の機能性を表示した製品であってもよい。

【実施例0026】

以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

【0027】

〔１．アルニカ抽出物の調製〕
１－１．植物
アルニカ（学名：Arnica montana）の花部の乾燥物を試験に用いた。

【0028】

１－２．抽出
前培養用のアルニカ抽出物を、次のとおり調製した。すなわち、植物粉末：水＝１：２０（質量比）、となるよう水（逆浸透膜処理水、以下「ＲＯ水」という。）を加え、終濃度が０．２ｗ／ｖ％となるようにグルコースを、及び終濃度が０．１ｗ／ｖ％となるようにイーストエキス（Ｄｉｆｃｏ）を添加し、よく攪拌して懸濁液を調製した。懸濁液を３ｍＬずつ試験管に分注し、アルミキャップをして１２１℃、１５分間オートクレーブにかけて熱水抽出物を得た。

【0029】

本培養用のアルニカ抽出物としては、（１）無添加、及び（２）０．２ｗ／ｖ％グルコース及び０．１ｗ／ｖ％イーストエキス添加の２種類を調製した。すなわち、植物粉末：水＝１：２０（質量比）となるようＲＯ水を加え、上記（１）としては無添加で、又は上記（２）としては終濃度が０．２ｗ／ｖ％となるようにグルコースを、及び終濃度が０．１ｗ／ｖ％となるようにイーストエキス（Ｄｉｆｃｏ）を添加し、よく攪拌して、それぞれ懸濁液を調製した。その懸濁液を１０ｍＬずつ試験管に分注して、シリコ栓をして９８℃、１００分間オートクレーブにかけて熱水抽出物を得た。

【0030】

〔２．ゴレンシ抽出物の調製〕
２－１．植物
ゴレンシ（学名：Averrhoa carambola）の葉の乾燥物を試験に用いた。

【0031】

２－２．抽出
前培養用のゴレンシ抽出物は、アルニカ抽出物と同様にして調製した。

【0032】

本培養用のゴレンシ抽出物としては、（１）無添加、及び（２）０．２ｗ／ｖ％グルコース及び０．１ｗ／ｖ％イーストエキス添加の２種類を、アルニカ抽出物と同様にして調製した。

【0033】

〔３．乳酸菌〕
使用した１３種類の乳酸菌を表１に示す。菌は、－８０℃ＤＭＳＯ保存株をＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）に接種し、至適培養温度にて２０時間培養後、同条件で更に１代継代したものを菌液として、アルニカ抽出物又はゴレンシ抽出物との前培養に供した。なお、使用した１１種類の乳酸菌（Ｎｏ．５およびＮｏ．１０以外）は、いずれも各乳酸菌の属種を代表する基準株を入手して使用した。使用した１３種類の株は、表１に記載した寄託先から入手できる。

【0034】

【表1】

【0035】

［試験例１］
前培養は、前培養用のアルニカ抽出物３ｍＬに菌液を０．５ｖ／ｖ％接種し（初発菌数濃度：およそ２×１０⁶～３×１０⁷ＣＦＵ／ｍＬ）、好気下にて至適温度で４８時間、静置培養した。また、コントロールとして乳酸菌を含まない新鮮なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）を０．５ｖ／ｖ％接種し、同条件で培養した。

【0036】

本培養は、本培養用のアルニカ抽出物１０ｍＬに前培養後の培養物を１ｖ／ｖ％接種し（初発菌数濃度：およそ３×１０⁴～５×１０⁶ＣＦＵ／ｍＬ）、好気下にて至適温度で７２時間、静置培養した。また、未発酵のコントロールとしては、上記乳酸菌を含まない前培養液を１ｖ／ｖ％接種し、同条件で培養した。

【0037】

本培養後、生菌数を確認した。具体的には、本培養後の培養物を原液あるいは０．１ｗ／ｖ％イーストエキスで適宜希釈した液を、スパイラルプレーター EDDY JET2（IUL Instruments）にてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ寒天平板培地に１００μＬ播種し、至適温度で３日間培養後、形成したコロニーをコロニーカウンター ProtoCOL3（SYNBIOSIS）にて計数して、ＣＦＵ（コロニー形成単位）／ｍＬの値を算出した。

【0038】

【表2】

【0039】

その結果、乳酸菌Ｎｏ．１３（Streptococcus thermophilus）は、ＧＹ無添加の場合の前培養後の生菌数が検出されず、ＧＹ添加の場合でも到達生菌数が３×１０²ＣＦＵ／ｍＬに達せずに、アルニカを原料とする発酵物の調製には適さない菌種又は菌株であった。

【0040】

上記以外の乳酸菌９株では、アルニカ抽出物での培養により、生菌数が初発菌数に比べて少なくとも１０倍以上増加していた（乳酸菌Ｎｏ.９のＧＹ無添加の場合を除く）。アルニカ抽出物にグルコース及びイーストエキスを添加したときの影響は、生菌数が増加する傾向（例；乳酸菌Ｎｏ．３）、ほぼ同等（例；乳酸菌Ｎｏ．１０）、抑制する傾向（例；乳酸菌Ｎｏ．１１）と、乳酸菌の種類によって様々であり、一様な傾向はみられなかった。菌の生育に対する影響の程度は、いずれもそれほど顕著ではなかった。

【0041】

以上から、上記乳酸菌９株、すなわち乳酸菌Ｎｏ．２（Lactobacillus pentosus）、乳酸菌Ｎｏ．３（Lactobacillus zeae）、乳酸菌Ｎｏ．４（Lactobacillus mali）、乳酸菌Ｎｏ．６（Lactobacillus fabifermentans）、乳酸菌Ｎｏ．７（Lactobacillus hordei）、乳酸菌Ｎｏ．８（Lactococcus lactis subsp. lactis）、乳酸菌Ｎｏ．９（Leuconostoc pseudomesenteroides）、乳酸菌Ｎｏ．１０（Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides）、及び乳酸菌Ｎｏ．１１（Pediococcus acidilactici）は、アルニカを原料とする発酵物の調製に適することが明らかとなった。

【0042】

［試験例２］
前培養は、前培養用のゴレンシ抽出物３ｍＬに菌液を０．５ｖ／ｖ％接種し初発菌数濃度：およそ３×１０⁶～３×１０⁷ＣＦＵ／ｍＬ）、好気下にて至適温度で４８時間、静置培養した。また、コントロールとして乳酸菌を含まない新鮮なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）を０．５ｖ／ｖ％接種し、同条件で培養した。

【0043】

本培養は、本培養用のゴレンシ抽出物１０ｍＬに前培養後の培養物を１ｖ／ｖ％接種し（初発菌数濃度：およそ４×１０⁴～２×１０⁶ＣＦＵ／ｍＬ）、好気下にて至適温度で７２時間、静置培養した。また、未発酵のコントロールとしては、上記乳酸菌を含まない前培養液を１ｖ／ｖ％接種し、同条件で培養した。

【0044】

本培養後、生菌数を確認した。具体的には、本培養後の培養物を原液あるいは０．１ｗ／ｖ％イーストエキスで適宜希釈した液を、スパイラルプレーター EDDY JET2（IUL Instruments）にてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ寒天平板培地に１００μＬ播種し、至適温度で３日間培養後、形成したコロニーをコロニーカウンター ProtoCOL3（SYNBIOSIS）にて計数して、ＣＦＵ（コロニー形成単位）／ｍＬの値を算出した。

【0045】

【表3】

【0046】

その結果、乳酸菌Ｎｏ．８（Lactococcus lactis subsp. lactis）及び乳酸菌Ｎｏ．１３（Streptococcus thermophilus）は、培養後の生菌数が検出されずに、ゴレンシを原料とする発酵物の調製には適さない菌種又は菌株であった。

【0047】

上記以外の乳酸菌１１株では、ゴレンシ抽出物での培養により、生菌数が初発菌数に比べて少なくとも１０倍以上増加していた（乳酸菌Ｎｏ.５のＧＹ無添加の場合を除く）。ゴレンシ抽出物にグルコース及びイーストエキスを添加したときの影響は、生菌数が増加する傾向（例；乳酸菌Ｎｏ．５）、ほぼ同等（例；乳酸菌Ｎｏ．７及び１１）、抑制する傾向（例；乳酸菌Ｎｏ．６）と、乳酸菌の種類によって様々であり、一様な傾向はみられなかった。菌の生育に対する影響の程度は、いずれもそれほど顕著ではなかった。

【0048】

以上から、上記乳酸菌１１株、すなわち乳酸菌Ｎｏ．１（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）、乳酸菌Ｎｏ．２（Lactobacillus pentosus）、乳酸菌Ｎｏ．３（Lactobacillus zeae）、乳酸菌Ｎｏ．４（Lactobacillus mali）、乳酸菌Ｎｏ．５（Lactobacillus casei）、乳酸菌Ｎｏ．６（Lactobacillus fabifermentans）、乳酸菌Ｎｏ．７（Lactobacillus hordei）、乳酸菌Ｎｏ．９（Leuconostoc pseudomesenteroides）、乳酸菌Ｎｏ．１０（Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides）、乳酸菌Ｎｏ．１１（Pediococcus acidilactici）、及び乳酸菌Ｎｏ．１２（Pediococcus pentosaceus）は、ゴレンシを原料とする発酵物の調製に適することが明らかとなった。

【0049】

［試験例３］
試験例１において、アルニカ抽出物を用いた培養後の生菌数が１×１０⁶ＣＦＵ／ｍＬ以上を示した８種類の乳酸菌（Ｎｏ．２～４、６～８、１０～１１）を選択して、各乳酸菌による培養物について、チロシナーゼ阻害活性を調べた。

【0050】

具体的には、ＧＹ無添加のアルニカ抽出物による本培養終了後、培養物を３０００ｒｐｍ（１６００×ｇ）で、１０分間遠心し、上清を０．２２μｍフィルターで無菌濾過して発酵上清を得た。発酵上清は、４℃遮光保存の後、測定まで－２０℃で冷凍保存した。表４には、使用した発酵上清又は未発酵のアルニカ抽出物について、ｐＨ測定の結果と、１０５℃で３時間加熱後、デシケーター内にて放冷することにより測定したときの蒸発残留物濃度（ｍｇ／ｍＬ）を示す。

【0051】

【表4】

【0052】

チロシナーゼ阻害活性の測定は、Matsudaらの方法（Matsuda H et. al.；Studies of cuticle drugs from natural sources. III. Inhibitory effect of Myrica rubra on melanin biosynthesis., Biol. Pharm. Bull., 18(8), 1148-1150 (1995)）を一部改変して実施した。具体的には、各乳酸菌による発酵上清又は未発酵のアルニカ抽出物を、９６穴マイクロプレートの各ウェルにそれぞれ５０μＬ入れ（サンプル原液）、各ウェルに３００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）５０μＬを加えて混和した後、室温で１０分間プレインキュベートした。次いで、２７０Ｕ／ｍＬチロシナーゼ溶液（チロシナーゼ：マッシュルーム由来、シグマ アルドリッチ）２５μＬと、０．０６ｗ/ｖ％３，４―Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－Ｌ－ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（Ｌ－ＤＯＰＡ、富士フイルム和光純薬株式会社）２５μＬを、各ウェルに加えて混合し、室温で５分間インキュベート後、ドーパクロム（メラニン生合成の中間体）の極大吸収波長である４７５ｎｍの吸光度を測定した。反応系の最終ボリュームは１５０μＬであり、そのうち発酵上清（サンプル原液）の最終配合割合は５０μＬ／１５０μＬであった。

【0053】

測定した吸光度から、次式により、チロシナーゼ阻害率を算出した。式中、「コントロール」はサンプルの代わりにＲＯ水を加えた反応系を、「ブランク」はチロシナーゼの代わりに５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液を加えた反応系を、それぞれ表す。

【0054】

【数1】

【0055】

試験は、各乳酸菌による発酵上清又は未発酵のアルニカ抽出物について、３回のチロシナーゼ反応試験を行って、その平均と標準偏差を求めた。結果を表５に示す。

【0056】

【表5】

【0057】

その結果、未発酵のアルニカ抽出物ではチロシナーゼ阻害率が－２％（ＳＤ：±４％）であったのに対して、各乳酸菌による発酵物のうち、乳酸菌Ｎｏ．３（Lactobacillus zeae）では１７％（ＳＤ：±３％）であり、乳酸菌Ｎｏ．７（Lactobacillus hordei）では１５％（ＳＤ：±３％）であり、乳酸菌Ｎｏ．１１（Pediococcus acidilactici）では１６％（ＳＤ：±３％）であった。

【0058】

以上から、上記乳酸菌によるアルニカ抽出物の発酵物では、未発酵の抽出物に比べて、チロシナーゼ阻害活性が高められることが明らかとなった。

【0059】

［試験例４］
試験例２において、ゴレンシ抽出物を用いた培養後の生菌数が１×１０⁶ＣＦＵ／ｍＬ以上を示した５種類の乳酸菌（Ｎｏ．４、９～１２）を選択して、試験例３と同様にして発酵上清を調製し、チロシナーゼ阻害活性を調べた。表６には、使用した発酵上清又は未発酵のゴレンシ抽出物について、ｐＨ測定の結果と、１０５℃で３時間加熱後、デシケーター内にて放冷することにより測定したときの蒸発残留物濃度（ｍｇ／ｍＬ）を示す。

【0060】

【表6】

【0061】

試験は、各乳酸菌による発酵上清又は未発酵のゴレンシ抽出物について、３回のチロシナーゼ反応試験を行って、その平均と標準偏差を求めた。結果を表７に示す。

【0062】

【表7】

【0063】

その結果、未発酵のゴレンシ抽出物ではチロシナーゼ阻害率が４５％（ＳＤ：±５％）であったのに対して、乳酸菌Ｎｏ．４（Lactobacillus mali）による発酵物では５８％（ＳＤ：±２％）であった。

【0064】

以上から、上記乳酸菌によるゴレンシ抽出物の発酵物では、未発酵の抽出物に比べて、チロシナーゼ阻害活性が高められることが明らかとなった。