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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022043776
(43)【公開日】2022-03-16
(54)【発明の名称】ホスファチジルグリセロール特異的な新規酵素
(51)【国際特許分類】
C12N 15/55 20060101AFI20220309BHJP
C12N 9/16 20060101ALI20220309BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20220309BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220309BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220309BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220309BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220309BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220309BHJP
【ＦＩ】
C12N15/55
C12N9/16 D ZNA
C12N15/31
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
【審査請求】有
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020149237
(22)【出願日】2020-09-04
(11)【特許番号】
(45)【特許公報発行日】2021-04-14
(71)【出願人】
【識別番号】505089614
【氏名又は名称】国立大学法人福島大学
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】杉森 大助
(72)【発明者】
【氏名】梶山 聖人
【テーマコード（参考）】
4B050
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B050CC01
4B050DD02
4B050LL05
4B065AA01X
4B065BA21
4B065BC03
4B065CA27
(57)【要約】
【課題】本発明は、基質特異性の高い新規酵素を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明者は、放線菌目に属する微生物からＰＧ特異的な新規ホスホリパーゼＣ（ＰＧ－ＰＬＣ）を見出した。ここで、グリセロールリン酸はキラル中心を有し、１組の鏡像異性体を含む３つの位置異性体（Ｇ１Ｐ、Ｇ２Ｐ、およびＧ３Ｐ；Ｇ１ＰとＧ３Ｐとは鏡像異性体）を有する化合物である。このグリセロールリン酸においても、特定の鏡像異性体のみを分離した試薬は高価である。これに対して、本発明のＰＧ－ＰＬＣを用いることにより、ＰＧを加水分解することでＧ１ＰやＧ３Ｐなどの位置異性体であるグリセロールリン酸を安価に効率的に製造することが可能になる。
【選択図】なし
【解決手段】本発明者は、放線菌目に属する微生物からＰＧ特異的な新規ホスホリパーゼＣ（ＰＧ－ＰＬＣ）を見出した。ここで、グリセロールリン酸はキラル中心を有し、１組の鏡像異性体を含む３つの位置異性体（Ｇ１Ｐ、Ｇ２Ｐ、およびＧ３Ｐ；Ｇ１ＰとＧ３Ｐとは鏡像異性体）を有する化合物である。このグリセロールリン酸においても、特定の鏡像異性体のみを分離した試薬は高価である。これに対して、本発明のＰＧ－ＰＬＣを用いることにより、ＰＧを加水分解することでＧ１ＰやＧ３Ｐなどの位置異性体であるグリセロールリン酸を安価に効率的に製造することが可能になる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ホスファチジルグリセロールに対して基質特異的な加水分解能を有する、ホスホリパーゼＣポリペプチド。
【請求項2】
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の、５６Ｌ，５９ＦＶＧ６１，２０４ＩＰＧＩ２０７，２０９ＡＷ２１０，および３１６ＧＧＦＡ３２０に相当するアミノ酸、および／または
（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の、Ｈ４３，およびＨ４０９に相当するアミノ酸を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の、Ｈ４３，およびＨ４０９に相当するアミノ酸を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項3】
配列番号２で表されるアミノ酸配列の、Ｄ４１、Ｄ１０３、Ｎ１９１、Ｈ３６４、およびＨ４０７に相当するアミノ酸をさらに有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項4】
配列番号２で表されるアミノ酸配列の、４０Ｔ～７５Ｔ、１００Ｔ～１２０Ｌ、１８４Ｐ～１９７Ｖ、２０５Ｐ～２２７Ｋ、２６６Ｆ、２７１Ｌ、２９６Ｙ～２９７Ｙ、３１０Ｌ～３２２Ｓ、３６３Ｓ～３６６Ｔ、３７８Ｒ～３８４Ｒ、４０６Ｇ～４０９Ｈ、および４３２Ｓ～４３５Ｄに相当するアミノ酸をさらに含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項5】
ホスファチジルグリセロールの加水分解能を有するホスホリパーゼＣであって、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）であるポリペプチド。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付与されたアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付与されたアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
【請求項6】
標識をさらに含む、請求項１～５のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項7】
放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目に属する微生物に由来する、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項8】
ホスファチジルグリセロールに対して基質特異的な加水分解能を有するホスホリパーゼＣポリペプチドをコードする、以下の（ａ）～（ｆ）のいずれかであるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列において１もしくは複数個の塩基が欠失、置換または付与された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と同義なコドンを含む塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１で表される塩基配列と少なくとも約８０％の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列において１もしくは複数個の塩基が欠失、置換または付与された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と同義なコドンを含む塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１で表される塩基配列と少なくとも約８０％の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド
【請求項9】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項10】
請求項９に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項11】
ホスファチジルグリセロールに対して基質特異的な加水分解能有するポリペプチドの製造方法であって、請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体から該ポリペプチドを生産する工程を含む、製造方法。
【請求項12】
請求項１～７のいずれか一項に記載のポリペプチドを用いる、ホスファチジルグリセロールの分解方法。
【請求項13】
請求項１～７のいずれか一項に記載のポリペプチドを用いて、ホスファチジルグリセロールからｓｎ－グリセロール－１－リン酸、ｓｎ－グリセロール－３－リン酸、および／またはジアシルグリセリドを製造する方法。
【請求項14】
請求項１～７のいずれか一項に記載のポリペプチドを含有する、ホスファチジルグリセロールを分解するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）の加水分解能を有する新規なタンパク質およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【0002】
基質特異的な酵素の開発は種々の分野において有用である。ところで、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）に関する研究報告例は多数あるが（特開２００６－２２３１１９号公報）、ＰＧ特異的ＰＬＣ（ＰＧ－ＰＬＣ）の報告は本発明者が知る限りない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特開２００６－２２３１１９号公報
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
発明者らは、ホスホリパーゼを探索したところ、放線菌目に属する微生物からＰＧ特異的なＰＬＣ（ＰＧ－ＰＬＣ）を見出した。本発明のＰＧ－ＰＬＣにより、特定のグリセロールリン酸を効率的に得ることも可能になった。
【0005】
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ホスファチジルグリセロールに対して基質特異的な加水分解能を有する、ホスホリパーゼＣポリペプチド。
（項目２）
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の、５６Ｌ，５９ＦＶＧ６１，２０４ＩＰＧＩ２０７，２０９ＡＷ２１０，および３１６ＧＧＦＡ３２０に相当するアミノ酸、および／または
（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の、Ｈ４３，およびＨ４０９に相当するアミノ酸を有する、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
配列番号２で表されるアミノ酸配列の、Ｄ４１、Ｄ１０３、Ｎ１９１、Ｈ３６４、およびＨ４０７に相当するアミノ酸をさらに有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目４）
配列番号２で表されるアミノ酸配列の、４０Ｔ～７５Ｔ、１００Ｔ～１２０Ｌ、１８４Ｐ～１９７Ｖ、２０５Ｐ～２２７Ｋ、２６６Ｆ、２７１Ｌ、２９６Ｙ～２９７Ｙ、３１０Ｌ～３２２Ｓ、３６３Ｓ～３６６Ｔ、３７８Ｒ～３８４Ｒ、４０６Ｇ～４０９Ｈ、および４３２Ｓ～４３５Ｄに相当するアミノ酸をさらに含む、項目３に記載のポリペプチド。
（項目５）
ホスファチジルグリセロールの加水分解能を有するホスホリパーゼＣであって、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）であるポリペプチド。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付与されたアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（項目６）
標識をさらに含む、項目１～５のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目７）
放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目に属する微生物に由来する、項目１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目８）
ホスファチジルグリセロールに対して基質特異的な加水分解能を有するホスホリパーゼＣポリペプチドをコードする、以下の（ａ）～（ｆ）のいずれかであるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列において１もしくは複数個の塩基が欠失、置換または付与された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と同義なコドンを含む塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１で表される塩基配列と少なくとも約８０％の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド
（項目９）
項目８に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
（項目１０）
項目９に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（項目１１）
ホスファチジルグリセロールに対して基質特異的な加水分解能有するポリペプチドの製造方法であって、項目８に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体から該ポリペプチドを生産する工程を含む、製造方法。
（項目１２）
項目１～７のいずれか一項に記載のポリペプチドを用いる、ホスファチジルグリセロールの分解方法。
（項目１３）
項目１～７のいずれか一項に記載のポリペプチドを用いて、ホスファチジルグリセロールからｓｎ－グリセロール－１－リン酸、ｓｎ－グリセロール－３－リン酸、および／またはジアシルグリセリドを製造する方法。
（項目１４）
項目１～７のいずれか一項に記載のポリペプチドを含有する、ホスファチジルグリセロールを分解するための組成物。
（項目１）
ホスファチジルグリセロールに対して基質特異的な加水分解能を有する、ホスホリパーゼＣポリペプチド。
（項目２）
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の、５６Ｌ，５９ＦＶＧ６１，２０４ＩＰＧＩ２０７，２０９ＡＷ２１０，および３１６ＧＧＦＡ３２０に相当するアミノ酸、および／または
（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の、Ｈ４３，およびＨ４０９に相当するアミノ酸を有する、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
配列番号２で表されるアミノ酸配列の、Ｄ４１、Ｄ１０３、Ｎ１９１、Ｈ３６４、およびＨ４０７に相当するアミノ酸をさらに有する、項目２に記載のポリペプチド。
（項目４）
配列番号２で表されるアミノ酸配列の、４０Ｔ～７５Ｔ、１００Ｔ～１２０Ｌ、１８４Ｐ～１９７Ｖ、２０５Ｐ～２２７Ｋ、２６６Ｆ、２７１Ｌ、２９６Ｙ～２９７Ｙ、３１０Ｌ～３２２Ｓ、３６３Ｓ～３６６Ｔ、３７８Ｒ～３８４Ｒ、４０６Ｇ～４０９Ｈ、および４３２Ｓ～４３５Ｄに相当するアミノ酸をさらに含む、項目３に記載のポリペプチド。
（項目５）
ホスファチジルグリセロールの加水分解能を有するホスホリパーゼＣであって、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）であるポリペプチド。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付与されたアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（項目６）
標識をさらに含む、項目１～５のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目７）
放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目に属する微生物に由来する、項目１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目８）
ホスファチジルグリセロールに対して基質特異的な加水分解能を有するホスホリパーゼＣポリペプチドをコードする、以下の（ａ）～（ｆ）のいずれかであるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列において１もしくは複数個の塩基が欠失、置換または付与された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と同義なコドンを含む塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１で表される塩基配列と少なくとも約８０％の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド
（項目９）
項目８に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
（項目１０）
項目９に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（項目１１）
ホスファチジルグリセロールに対して基質特異的な加水分解能有するポリペプチドの製造方法であって、項目８に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体から該ポリペプチドを生産する工程を含む、製造方法。
（項目１２）
項目１～７のいずれか一項に記載のポリペプチドを用いる、ホスファチジルグリセロールの分解方法。
（項目１３）
項目１～７のいずれか一項に記載のポリペプチドを用いて、ホスファチジルグリセロールからｓｎ－グリセロール－１－リン酸、ｓｎ－グリセロール－３－リン酸、および／またはジアシルグリセリドを製造する方法。
（項目１４）
項目１～７のいずれか一項に記載のポリペプチドを含有する、ホスファチジルグリセロールを分解するための組成物。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図2】図２は、精製ＰＧ－ＰＬＣのＳＤＳ－ＰＡＧＥ（分離ゲル濃度１２％）分析結果を示す。レーンＭ：マーカー、レーン１：精製ＰＧ－ＰＬＣ（０．０３ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌ、０．３μｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ）。
【図3-1】図３－１は、ＰＬＣ活性に対するｐＨの影響を示す。ＰＯＰＧを基質として用い、酵素活性は０．１６Ｍの各種バッファー中、３７℃で測定した。用いたバッファーはＡｃ－Ｎａ（〇）、ＢｉｓＴｒｉｓ－ＨＣｌ（△）、ＭＥＳ－ＮａＯＨ（●）、またはＴｒｉｓ－ＨＣｌ（□）である。
【図4-1】図４－１は、ＰＬＣのｐＨ安定性を示す。精製酵素サンプルを５０ｍＭの各バッファー中、４℃で４時間インキュベートした。残存活性を、ＰＯＰＧを基質として用い、５５℃で０．１６Ｍ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）中で測定した。インキュベーションに用いたバッファーはＡｃ－Ｎａ（□）、ＭＥＳ－ＮａＯＨ（△）、またはＴｒｉｓ－ＨＣｌ（〇）である。
【図4-2】図４－２は、ＰＬＣの温度安定性を示す。精製酵素サンプルを各温度で０．２Ｍ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）中で３０分間インキュベートした。残存活性を、ＰＯＰＧを基質として用い、５５℃で０．２Ｍ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）中で測定した。
【図9-2】図９－２は、３０℃培養の粗タンパク質液（ＣＦＥ）を用いた酵素反応（基質ＰＯＰＧ、反応温度４５℃，緩衝液：０．１６Ｍ ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）。横軸は酵素反応時間、縦軸はＧ３Ｐ生成量を示す。
【図10】ＳｗｉｓｓＭｏｄｅｌを利用したＰＧ－ＰＬＣの予測立体構造に基づく、基質結合に関与すると推定されたアミノ酸残基を示す。当該アミノ酸残基を枠で囲っている。
【発明を実施するための形態】
【0007】
［用語の定義］
本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【0008】
本明細書において「約」は、特に別の定義が示されない限り、示された値±１０％を指す。
【0009】
本明細書において「リン脂質」は、リン酸エステルおよびホスホン酸エステルを有する脂質の総称である。脂質二重膜から成る細胞膜の主成分であり、グリセロールを骨格とするグリセロリン脂質はその１種である。
グリセロリン脂質：
グリセロリン脂質では、グリセロールのｓｎ－１位とｓｎ－２位とに脂肪酸が、ｓｎ－３位にリン酸が結合している。このリン酸に結合するリン脂質親水部分（上記の構造式中のＸ）により、グリセロリン脂質はさらに分類される。最も単純にリン脂質親水部分が水素であればホスファチジン酸（ＰＡ）、コリンであればホスファチジルコリン（ＰＣ）、エタノールアミンであればホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、セリンであればホスファチジルセリン（ＰＳ）、イノシトールであればホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、グリセロールであればホスファチジルグリセロール（ＰＧ）と称される。したがって、本明細書において「ホスファチジルグリセロール」とは、グリセロールのｓｎ－１位とｓｎ－２位とに脂肪酸がエステル結合し、ｓｎ－３位にリン酸がエステル結合し、さらにリン酸にグリセロールが結合したリン脂質を指す。また、特殊な構造を有するリン脂質として「カルジオリピン」（別名ジホスファチジルグリセロール；ＣＬ）が知られている。これは２つのＰＧがそのグリセロールを共有しながら連結しており、四本のアシル鎖に由来する疎水性と２つのリン酸の負電荷を帯びた極性を示す構造を有するリン脂質であり、ＰＧのｐＫａが約３であることからＣＬも同様にｐＨ３以上では５０％以上が負電荷を帯びていると考えられている。
ホスファチジルグリセロール：
グリセロリン脂質：
【化1】
グリセロリン脂質では、グリセロールのｓｎ－１位とｓｎ－２位とに脂肪酸が、ｓｎ－３位にリン酸が結合している。このリン酸に結合するリン脂質親水部分（上記の構造式中のＸ）により、グリセロリン脂質はさらに分類される。最も単純にリン脂質親水部分が水素であればホスファチジン酸（ＰＡ）、コリンであればホスファチジルコリン（ＰＣ）、エタノールアミンであればホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、セリンであればホスファチジルセリン（ＰＳ）、イノシトールであればホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、グリセロールであればホスファチジルグリセロール（ＰＧ）と称される。したがって、本明細書において「ホスファチジルグリセロール」とは、グリセロールのｓｎ－１位とｓｎ－２位とに脂肪酸がエステル結合し、ｓｎ－３位にリン酸がエステル結合し、さらにリン酸にグリセロールが結合したリン脂質を指す。また、特殊な構造を有するリン脂質として「カルジオリピン」（別名ジホスファチジルグリセロール；ＣＬ）が知られている。これは２つのＰＧがそのグリセロールを共有しながら連結しており、四本のアシル鎖に由来する疎水性と２つのリン酸の負電荷を帯びた極性を示す構造を有するリン脂質であり、ＰＧのｐＫａが約３であることからＣＬも同様にｐＨ３以上では５０％以上が負電荷を帯びていると考えられている。
ホスファチジルグリセロール：
【化2】
【0010】
本明細書において「加水分解」とは、Ａ－Ｂ＋Ｈ２Ｏ→Ａ－ＯＨ＋Ｂ－Ｈの反応による結合切断の一様式を指す。加水分解を行う酵素を「加水分解酵素」と言い、その能力を「加水分解能」、その能力の強さ（高さ）を「活性」、「加水分解活性」、または「酵素活性」と言う。加水分解能・活性は、例えば、加水分解される基質の濃度減少を測定するか、加水分解により生じる産物の濃度上昇を測定することで調べられる。
【0011】
本発明において「ホスホリパーゼ」は、グリセロリン脂質を加水分解する酵素を指す。ホスホリパーゼは、グリセロリン脂質を加水分解する部位により分類され、ホスホリパーゼＡ１はグリセロールのｓｎ－１位のエステル結合を分解し、ホスホリパーゼＡ２はグリセロールのｓｎ－２位のエステル結合を分解し、ホスホリパーゼＢはグリセリンのｓｎ－１位およびｓｎ－２位の両方のエステル結合を分解し、いずれも脂肪酸を遊離する。ホスホリパーゼＣは、グリセロールとＸを結ぶホスホジエステル結合のグリセロール骨格側のエステル結合を分解し、ホスホリパーゼＤはホスホジエステル結合のグリセロール骨格とは反対側のエステル結合を分解する。したがって、本明細書において「ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）」は、グリセロリン脂質を加水分解するホスホリパーゼのなかでも、グリセロール骨格に結合したホスホジエステル結合のグリセロール骨格側のエステル結合を分解し、リン酸が結合したリン脂質親水部分（リン酸エステル化合物）、およびジアシルグリセロールを産出する酵素を指す。
ＰＬＣによる加水分解様式：
ＰＬＣによる加水分解様式：
【化3】
【0012】
本明細書においてアミノ酸配列の「同一性」とは、複数のアミノ酸配列を比較したときに、アミノ酸が同一である残基の割合を指す。なお、アミノ酸配列の相同性においては、複数のアミノ酸配列を比較したときに、アミノ酸が同一であるか、またはアミノ酸が同一ではないが同じ性質を持つアミノ酸である場合には相同として扱い、相同な残基の割合を指す。
【0013】
一般に酵素は、化学反応を触媒し、その反応の種類に対する特異性と基質に対する特異性とを有する。本明細書において酵素が「基質特異的」であるとは、その酵素が特定の化学物質に対して選択的に化学反応を触媒すること、つまり酵素が特定の化学物質以外の化学物質に対して化学反応を触媒しないか、触媒の程度が十分に弱いことを意味する。本明細書において、ある酵素またはポリペプチドが「ホスファチジルグリセロールに対して基質特異的」、「ホスファチジルグリセロール特異的」または「ＰＧ特異的」とは、当該酵素またはポリペプチドのｐＨ６．０、５５℃、５分間の条件におけるＰＧの加水分解能を１００％とした場合に、ＰＡ、ＰＥ、ＰＣ、ＣＬ、ＰＳ、およびＰＩからなる群から選択されるＰＧ以外の基質に対する加水分解能が高くとも約３０％以下であることをいう。
【0014】
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、ゲノムあるいはその消化物、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７～１．０Ｍ ＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ－ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ストリンジェントな条件は、通常、完全ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より約５℃～約３０℃、好ましくは約１０℃～約２５℃低い温度であって、特異的なハイブリッドが形成される条件であり、例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている条件が挙げられる。また、例えば、９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件であってもよい。具体的には、例えば、完全ハイブリッドのＴｍ～（Ｔｍ－３０）℃、好ましくはＴｍ～（Ｔｍ－２０）℃の温度範囲で、かつ１×ＳＳＣ（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）、好ましくは０．１×ＳＳＣに相当する塩濃度でハイブリダイズを行う条件が挙げられる。
【0015】
本明細書において「ベクター」または「組換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができる遺伝子構築物をいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。遺伝子を組み込むベクターは特に限定されないが、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージ、プラスミド、またはコスミドのうち遺伝子組換用として構築されたものが適しており、ファージベクターとしては、例えば、大腸菌に属する微生物を宿主とする場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ等が使用できる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴベクター、タカラバイオ社のｐＣｏｌｄ Ｉ～ＩＶ、ｐＣｏｌｄ ＴＦ、プロメガ社のｐＦＮ１８Ａ ＨａｌｏＴａｇ Ｔ７Ｆｌｅｘｉ Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＦＮ１８Ｋ ＨａｌｏＴａｇ Ｔ７Ｆｌｅｘｉ Ｖｅｃｔｏｒ又はｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＩＮ Ｉ、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋等、バチラス・サチリスを宿主とする場合にはｐＷＨ１５２０、ｐＵＢ１１０、ｐＫＨ３００ＰＬＫ等、ブレビバチラスを宿主とする場合にはｐＮＹ３２６、ｐＮＣＭＯ２やｐＮＣ－ＨｉｓＴなど、放線菌を宿主とする場合にはストレプトミセス属ならｐＩＪ６８０、ｐＩＪ７０２、ｐＴＯＮＡ等、ロドコッカス属なら北海道システム・サイエンス社のｐＴｉｐシリーズ、ｐＣＰｉシリーズやｐＮｉｔシリーズなど、酵母、特にサッカロマイセス・セレビジアエを宿主とする場合にはＹＲｐ７、ｐＹＣ１、ＹＥｐ１３等、メタノール資化酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを宿主とする発現系や糸状菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅやＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒを利用した宿主とする発現系なども使用できる。さらに、各種無細胞タンパク質発現系なども使用できる。本発明の組換えベクターは、安全性が確認されているという観点から、遺伝子組換え生物等の第二種使用等のうち産業上の使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令（平成十六年財務省、厚生労働省、農林水産省、経済産業省、環境省令第一号）別表第一号の規定に基づき経済産業大臣が定めるＧＩＬＳＰ遺伝子組換え微生物の、別表第一に掲げられたベクターに、上記の本発明の遺伝子が挿入された組換えベクターが好ましい。プロモーターは宿主中で発現できるものであれば特に限定されない。本発明の組換えベクターは、例えば本発明の遺伝子及び上記のベクターを用いて、当業者に公知の手法で作成することができる。
【0016】
本明細書において「ｓｎ－グリセロール－１－リン酸（Ｇ１Ｐ）」および「ｓｎ－グリセロール－３－リン酸（Ｇ３Ｐ）」は、グリセロールにリン酸が結合した、それぞれ以下の化学式で表される化合物を指す。
ｓｎ－グリセロール－１－リン酸：
ｓｎ－グリセロール－３－リン酸：
Ｇ１ＰおよびＧ３Ｐは鏡像異性体の関係にある。これらは命名法により様々な名前で呼ばれ、Ｇ１Ｐは、Ｌ－グリセロール－１－リン酸またはＤ－グリセロール－３－リン酸とも呼ばれ、Ｇ３ＰはＬ－グリセロール－３－リン酸またはＤ－グリセロール－１－リン酸とも呼ばれる。また、本明細書において「ジアシルグリセロール」（ＤＧ）は、ジグリセリドとも称される、グリセロールの脂肪酸エステルのうちアシル基２個が結合しているものを指す。中でも、以下の化学式で表される１，２－ジアシルグリセロールはリン脂質またはトリグリセリドの生合成の中間体として重要であることが知られている。
ジアシルグリセロール：
（式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ任意のアシル基である）
ｓｎ－グリセロール－１－リン酸：
【化4】
ｓｎ－グリセロール－３－リン酸：
【化5】
Ｇ１ＰおよびＧ３Ｐは鏡像異性体の関係にある。これらは命名法により様々な名前で呼ばれ、Ｇ１Ｐは、Ｌ－グリセロール－１－リン酸またはＤ－グリセロール－３－リン酸とも呼ばれ、Ｇ３ＰはＬ－グリセロール－３－リン酸またはＤ－グリセロール－１－リン酸とも呼ばれる。また、本明細書において「ジアシルグリセロール」（ＤＧ）は、ジグリセリドとも称される、グリセロールの脂肪酸エステルのうちアシル基２個が結合しているものを指す。中でも、以下の化学式で表される１，２－ジアシルグリセロールはリン脂質またはトリグリセリドの生合成の中間体として重要であることが知られている。
ジアシルグリセロール：
【化6】
（式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ任意のアシル基である）
【0017】
上記の用語の定義で記載したように、ＰＬＣは、グリセロール骨格に結合したホスホジエステル結合のグリセロール骨格側のエステル結合を分解し、リン酸が結合したリン脂質親水部分、およびＤＧを産出する。ＰＧをＰＬＣで加水分解すると、例えば以下の反応式のように、ＤＧとグリセロールリン酸とが生じ、グリセロールリン酸として、リン脂質親水部分がホスホ－（３’－ｓｎ－グリセロール）であればＧ３Ｐが生じ、ホスホ－（１’－ｓｎ－グリセロール）であればＧ１Ｐが生じる。
（式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ任意のアシル基である）
【化7】
（式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ任意のアシル基である）
【0018】
鏡像異性体を有する化合物では特定の鏡像異性体を分離するためには複雑な操作が必要であり、分離により得られる化合物試薬は一般に高価である。グリセロールリン酸はキラル中心を有し、１組の鏡像異性体を含む３つの位置異性体（Ｇ１Ｐ、ｓｎ－グリセロール－２－リン酸（Ｇ２Ｐ）、およびＧ３Ｐ；Ｇ１ＰとＧ３Ｐとは鏡像異性体）を有する化合物である。このグリセロールリン酸においても、特定の鏡像異性体のみを分離した試薬は高価である。これに対して、本発明のＰＧ－ＰＬＣを用いることにより、ＰＧを加水分解することでＧ１ＰやＧ３Ｐなどの位置異性体であるグリセロールリン酸を安価に効率的に製造することが可能になる。
【0019】
［実施形態］
以下の実施形態では、本発明の好ましい実施形態について述べる。なお、以下に提供される実施形態は、本発明をよりよく理解するために提供されるものであり、本発明の範囲が以下の記載に限定されることを意図したものではないことを理解されたい。
以下の実施形態では、本発明の好ましい実施形態について述べる。なお、以下に提供される実施形態は、本発明をよりよく理解するために提供されるものであり、本発明の範囲が以下の記載に限定されることを意図したものではないことを理解されたい。
【0020】
（ポリペプチド）
１つの局面において本明細書は、ＰＧの加水分解能を有するポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、人工的に合成されたポリペプチドであってもよく、生物由来のポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸を含んでもよい。
１つの局面において本明細書は、ＰＧの加水分解能を有するポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、人工的に合成されたポリペプチドであってもよく、生物由来のポリペプチドであってもよい。ポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸を含んでもよい。
【0021】
１つの実施形態において、本発明のＰＧに含まれる２本のアシル基は、同一のアシル基であってもよく、異なるアシル基であってもよい。また、飽和していても不飽和であってもよい。１つの実施形態において、本発明のＰＧに含まれるアシル基は、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、またはリグノセリン酸などの飽和脂肪酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、ゴンド酸、エルカ酸、またはネルボン酸などの１価不飽和脂肪酸、リノール酸、γ－リノレン酸、ジホモ－γ－リノレン酸、アラキドン酸、またはドコサペンタエン酸などのｎ－６（ω６）系列の多価不飽和脂肪酸、あるいはα－リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、またはドコサヘキサエン酸などのｎ－３（ω３）系列の多価不飽和脂肪酸に由来してもよいが、これらに限定されない（木原章雄，「脂肪酸の多彩な代謝，生理機能と関連疾患」，生化学，８２（７），５９１－６０５，（２０１０））。好ましい実施形態において、アシル基は、パルミチン酸、ステアリン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、ドコサペンタエン酸、またはドコサヘキサエン酸に由来してもよく、特に好ましい実施形態において、アシル基は、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、またはドコサペンタエン酸に由来してもよい。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、そのＰＧに含まれるアシル基が上記のいずれであっても、加水分解能を有し得る。これは、本発明のポリペプチドがＰＬＣであり、ＰＬＣは、アシル基が結合するｓｎ－１位またはｓｎ－２位ではなく、リン酸基が結合するｓｎ－３位のホスホジエステル結合を分解するためである。
【0022】
１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、または（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換または付与されたアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、アミノ酸を欠失、置換または付与する方法は当業者に公知である。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドが含み得る欠失、置換または付与されたアミノ酸の数は、機能が大きく変化しなければ（実質的に同等の機能であれば）、つまり基質特異性が、例えばｐＨ６．０、５５℃、５分間の条件におけるＰＧの加水分解能を１００％とした場合に、この条件における他の基質（ＰＡ、ＰＥ、ＰＣ、ＣＬ、ＰＳ、およびＰＩのうちの１または複数）に対する加水分解能が高くとも３０％以下であれば、１００個以上であってよく、１００個以下、５０個以下、２５個以下であってもよく、好ましくは１０個以下であってよく、さらに好ましくは５個以下である。また、アミノ酸の変異は人為的な変異であってもよく、自然界で発生した変異であってもよい。実際、酵素の機能とそのアミノ酸配列とに着目した酵素工学の分野においては、例えば、短鎖型Ｌ－スレオニン脱水素酵素（約３５０アミノ酸長）に対して１００個以上のアミノ酸変異を加えても基質特異性および比活性は維持され、さらには耐熱性が向上したことが報告されている（Ｎａｋａｎｏ Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｎａｔｉｖｅ ａｎｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＮＡＤ＋－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ａ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ Ｄｅｓｉｇｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｄａｔａ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１８，３７２－３７３２）。
【0023】
１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。同一性は、本発明において意図される基質特異性を有する限りにおいて、少なくとも８０％であってよく、好ましくは少なくとも９０％であってよく、さらに好ましくは、少なくとも９５％であってよい。
【0024】
タンパク質の同一性、相同性の検索の方法は当業者に公知であり、ＮＣＢＩ、ＥＢＩ、ＳＩＢ、またはゲノムネットなどの統合データベース、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、またはＤＤＢＪなどの塩基配列データベース、ＰＩＲ、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ、ＵｎｉＰｒｏｔ、Ｅｎｔｒｅｚ Ｐｒｏｔｅｉｎ、またはＰＲＦなどのタンパク質データベースにおいて、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡなどのソフトウェアを利用して、インターネットを通じて行うことができる。
【0025】
１つの実施形態において、本発明のポリペプチドを使用する際には、本発明のポリペプチドの機能および特性を損なうことなく、本発明のポリペプチドに対してアミノ酸の欠失、置換、または付与を施すことができる。これらのアミノ酸の欠失、置換、および付与は、アミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端、または途中のどこであってもよい。アミノ酸の欠失、置換、および付与は、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをベクターのマルチクローニングサイトに導入する際にベクターの有するタグおよび制限酵素サイトなどが連結された結果、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に付与されたアミノ酸であってもよい。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドにシグナル配列を付与してもよく、ポリペプチドにシグナル配列を付与してポリペプチドの局在を操作する方法は本分野において公知である。用いられるシグナル配列としては、小胞体輸送シグナル、小胞体内腔での保持シグナル、ミトコンドリアへの輸送シグナル、核移行シグナル、膜係留シグナル、分泌シグナル、または細胞膜透過ペプチドなどのシグナルペプチド、ミリストイル化などの脂質修飾を受けるためのシグナル配列、またはグリコシル化などの糖鎖修飾を受けるためのシグナル配列などが挙げられるが、これらに限定されない。細胞膜透過ペプチドとしては、Ｔａｔシグナルペプチド、Ｓｅｃシグナルペプチドなど、ペリプラズム移行シグナルとしてはａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ シグナル、ＰｅｌＢシグナルやＯｍｐＡシグナル（Ｓｉｇｍａ、ｐＦＬＡＧ－ＡＴＳ）など、他Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎペプチド、Ｐｏｌｙａｒｇｉｎｉｎペプチド、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎペプチド、Ｐｅｐ－１ペプチド、ＬＬ－３７ペプチド、またはＰｅｐ－７ペプチド、ＳＫＩＫタグが既知であるが、これらに限定されない（梶原直樹および芝崎太，「細胞膜透過性ペプチド」，日薬理誌，１４１，２２０－２２１（２０１３））。さらに、複数種のシグナルあるいはタグを自由に組み合わせた融合シグナル・タグであっても良い。たとえばＯｍｐＡ／ＰｅｌＢやＳＫＩＫ／ＰｅｌＢなどのようにＯｍｐＡとＰｅｌＢ、ＳＫＩＫとＰｅｌＢ、ＯｍｐＡとＳＫＩＫを融合してもよく、あるいはそれらの逆の順で融合しても良い。
【0026】
本発明のポリペプチドは複数のドメインからなり、本発明のポリペプチドの一部である１または複数個の特定のドメインと標識とを融合したキメラタンパク質を作製することができる。キメラタンパク質の作り方は本分野において公知である。例えば、ＧＦＰとの融合やα―アグルチニンのＣ末端領域とＧＰＩアンカー付加シグナル配列との融合により、細胞膜や細胞壁など細胞表面に提示させることができる。
【0027】
一般に、酵素活性または基質結合に関わる重要なアミノ酸残基を変化させずに、これら以外のアミノ酸残基を変異させることでアミノ酸配列の相同性を低く保ちながら、もとの酵素と類似した、またはさらに向上された機能および特性を有する新規な酵素を作成することができる。このような特性を有するタンパク質・ペプチド・酵素を作成する方法は、本分野において公知である。したがって、このような方法により作製された、アミノ酸配列間の相同性は低くいが、配列番号２で表されるＰＧ－ＰＬＣと類似した特性を有するポリペプチドも、本願の範囲に含まれる。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、基質結合部位を有する。１つの実施形態において、基質結合部位は、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列の、５６Ｌ，５９ＦＶＧ６１，２０４ＩＰＧＩ２０７，２０９ＡＷ２１０，および３１６ＧＧＦＡ３２０に相当するアミノ酸を含んでもよく、または、これらのアミノ酸から選択されてもよい。これらのアミノ酸残基は、疎水性であることから、ＰＧのアシル基に相互作用すると考えられる。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、基質と相互作用する触媒残基を有する。触媒残基は、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列のＨ４３、およびＨ４０９に相当するアミノ酸を含んでもよく、または、これらのアミノ酸から選択されてもよい。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、基質と相互作用する活性中心アミノ酸残基を有する。活性中心アミノ酸残基は、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列の、Ｄ４１、Ｄ１０３、Ｎ１９１、Ｈ３６４、およびＨ４０７に相当するアミノ酸残基を含んでもよく、またはこれらのアミノ酸から選択されてもよく、触媒残基を含んでもよい。基質結合部位は、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列の、４０Ｔ～７５Ｔ、１００Ｔ～１２０Ｌ、１８４Ｐ～１９７Ｖ、２０５Ｐ～２２７Ｋ、２６６Ｆ、２７１Ｌ、２９６Ｙ～２９７Ｙ、３１０Ｌ～３２２Ｓ、３６３Ｓ～３６６Ｔ、３７８Ｒ～３８４Ｒ、４０６Ｇ～４０９Ｈ、および４３２Ｓ～４３５Ｄに相当するアミノ酸を含んでもよく、または、これらのアミノ酸から選択されてもよい。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、１つまたは複数の原核生物由来亜鉛依存性ホスホリパーゼＣシグネチャー（Ｈ－Ｙ－ｘ－［ＧＴ］－Ｄ－［ＬＩＶＭＡＦ］－［ＤＮＳＨ］－ｘ－Ｐ－ｘ－Ｈ－［ＰＡ］－ｘ－Ｎ；Ｋｉｍ，Ｙ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｍｏ２６４２ Ｃｙｃｌｉｃ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｌｉｓｔｅｒｉａ Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ（２０１１））を有してもよい。ここで、本願明細書において、「あるアミノ酸残基に相当するアミノ酸」とは、あるポリペプチドＡと別のポリペプチドＢとを比較する際にポリペプチドＡにおいてあるアミノ酸残基Ａ’が基質との相互作用において重要な残基であった場合に、ポリペプチドＢにおいてアミノ酸残基Ａ’と同様の基質と相互作用するアミノ酸残基Ｂ’を意味する。そのため、例えば、ポリペプチドＡがシグナル配列を含むがポリペプチドＢが含まなかったために、ポリペプチドＡにおけるアミノ酸残基Ａ’の一次構造的位置（つまりＮ末端から数えたときのアミノ酸残基番号）と、これに相当するポリペプチドＢにおけるアミノ酸残基Ｂ’の位置とが異なる場合であっても、基質との相互作用における役割が同様であれば、アミノ酸残基Ｂ’はアミノ酸残基Ａ’に相当するアミノ酸であると言える。さらに、特定の理論に束縛されることを望むものではないが、本発明のポリペプチドにおいて、成熟タンパク質（配列番号２）の一部のアミノ酸配列（配列番号１６）については、種々の放線菌の有するタンパク質間で保存されていると判明しており、基質結合部位、活性中心アミノ酸残基、および触媒残基は、この保存された配列に含まれる。そのため、例えば、本発明のポリペプチドの基質結合部位に属する残基Ａ’について、このアミノ酸残基が保存され、他の放線菌のポリペプチドにおいて、一次構造的位置が異なるが基質結合における役割が同様であるアミノ酸残基Ｂ’が存在することが容易に推測される。つまり、当業者は当該タンパク質の一次構造（アミノ酸配列）から容易に立体構造を予測でき、かなりの精度で構成アミノ酸の空間的位置を予測可能であるため、３次元構造上類似位置に配置されるアミノ酸残基をある程度特定できる。したがって、基質結合部位、活性中心残基、および触媒中心を含む保存された配列に含まれるアミノ酸残基について、原核生物間では、あるいは少なくとも放線菌間では、相当あるいは類似するアミノ酸残基が存在し、配列比較によりこれを見出すことができる。さらには全生物間においても、基質結合部位、活性中心残基、および触媒中心を含むアミノ酸残基が種の近縁性に応じて保存され、あるアミノ酸残基に相当あるいは類似するアミノ酸を見出すことが可能であろう。
【0028】
活性中心アミノ酸残基および基質結合部位を予測する方法は本分野において公知であり、タンパク質のデータベース（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔやＳｗｉｓｓＭｏｄｅｌなど）を利用して構造および／または機能類似タンパク質の立体構造情報を入手し、この構造をもとに、当該タンパク質の構造を予測することができる。これらのデータベースによって入手した構造および／または機能類似タンパク質の立体構造情報には基質あるいは基質類似化合物等や金属イオンなどのリガンドの位置情報や触媒残基情報も含まれるため、対象タンパク質の予測構造においても基質との相互作用部位を推定することができる。また、基質あるいは基質類似化合物等をＡｕｔｏＤｏｃｋ等のソフトウエアを利用してドッキングシミュレーション解析することで基質との相互作用部位を推定する方法も知られている。
【0029】
１つの実施形態において、標識は、蛍光分子による標識、放射性物質による標識、金属による標識、酵素による標識、またはタグによる標識であってもよく、阻害剤などのように酵素に結合する化合物やＰＥＧ（ポリエチレングリコール）のように修飾する化合物であってもよく、これらを組み合わせて用いてもよい。また、標識を、結合しても吸着してもコーティングしても良く、その原理としては共有結合や疎水相互作用などを含むあらゆる物理化学的相互作用や反応を利用した付着を含む。１つの実施形態において、蛍光分子による標識は、蛍光顕微鏡観察のためのものであり、ローダミンまたはＦＭ色素などの蛍光分子であってもよく、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質であってもよい。蛍光分子による標識は、リン脂質やタンパク質など様々な生体分子との結合により輝度が変化してもよく、可逆的に退色してもよい。１つの実施形態において、放射性物質による標識は、３Ｈ，１４Ｃ，３２Ｐ，３３Ｐ，３５Ｓ，または１２５Ｉであり、好ましくは３Ｈ，１４Ｃ，または３５Ｓである。１つの実施形態において、金属による標識は電子顕微鏡観察のためのものであり、金、ウラン、タングステン、またはバナジウムを用いた標識であってよい。１つの実施形態において、酵素による標識は、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、またはアルカリフォスファターゼなどによる標識であってよい。１つの実施形態において、タグによる標識は、組換え発現タンパク質の可溶性を高める作用があるＧＳＴタグ、Ｈａｌｏタグ、ＴＦタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、Ｓタグ、Ｅタグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕタグ、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩ、ＣＢＤタグ、ＣＢＰタグ、Ｆｃタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、Ｔｒｘタグ、またはビオチン－ストレプトアビジンタグなどであってよい。
【0030】
本発明のポリペプチドは、ＰＧに対して基質特異的な加水分解能を有してよい。１つの実施形態において、基質特異的な加水分解能は、ｐＨ６．０、５５℃、５分間の条件におけるＰＧの加水分解能を１００％とした場合に、この条件における他の基質に対する加水分解能が３０％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、または０％以下であることにより定められてよい。ここで、他の基質はリン脂質であり、例えば、ＰＡ、ＰＥ、ＰＣ、ＣＬ、ＰＳ、およびＰＩからなる群から選択されてよく、好ましくはＣＬである。さらに好ましい実施形態において、他の基質は、ＰＡ、ＰＥ、ＰＣ、ＣＬ、ＰＳ、およびＰＩを含んでよい。
【0031】
１つの実施形態において、本発明のポリペプチドの至適ｐＨは、約ｐＨ５．５～ｐＨ６．５の範囲である。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドを作用させる際のｐＨの下限はｐＨ４であり、好ましくはｐＨ５．０であり、最大活性と比較して９０％以上の作用を示すｐＨ５．５であれば特に好ましい。上限は、ｐＨ１０であり、好ましくはｐＨ８．５であり、最大活性と比較して９０％以上の作用を示すｐＨ６．５であれば特に好ましい。
【0032】
１つの実施形態において、本発明のポリペプチドの至適温度は、約５３～５７℃である。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドを作用させる際の温度の下限は、３０℃であり、好ましくは３７℃であり、最大活性と比較して８０％以上の作用を示す５０℃であれば特に好ましい。上限は、６７℃であり、好ましくは６５℃であり、最大活性と比較して８０％以上の作用を示す６０℃であれば特に好ましい。
【0033】
１つの実施形態において、本発明のポリペプチドの反応時間は、ＰＧの意図した分解が達成できる範囲で変更してもよい。反応時間は、約１５秒以上、好ましくは約１分以上、更に好ましくは約３分以上である。反応時間の上限は特にないが、好ましくは約３０分以下、更に好ましくは約１５分以下、特に好ましくは約１０分以下であり得る。
【0034】
加水分解能の測定方法は、当業者に公知である。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドによる加水分解能の測定方法としては、加水分解による基質の濃度減少を測定する方法、および加水分解による分解産物の濃度増加を測定する方法が挙げられる。１つの実施形態において、加水分解による分解産物の濃度増加を測定する方法は、分解産物の濃度を測定する方法と、分解産物をさらに分解して濃度を測定する方法を含む。１つの実施形態において、酵素または放射性同位体を用いて分解産物の濃度を測定する方法が挙げられる。１つの実施形態において、ＰＬＣによる分解産物の濃度を酵素を用いて測定する方法としては、例えば、酵素およびトリンダー試薬（ペルオキシダーゼ存在下で、ＴＯＤＢ、ＴＯＯＳ、フェノール、およびハロゲン化フェノール誘導体などが縮合し呈色することを利用した試薬）を用いた方法、モリブデンブルー法、マラカイトグリーン法、およびこれらを改良した方法（ＢＩＯＭＯＬ（登録商標）Ｇｒｅｅｎなど）が知られている。
【0035】
１つの実施形態において、ＰＬＣと基質を含む溶液の組成は当業者により変更され得る。１つの実施形態において、溶液はバッファーを含んでもよく、バッファーは、酢酸バッファー（Ａｃ－Ｎａ）、リン酸バッファー、クエン酸バッファー、クエン酸リン酸バッファー、ホウ酸バッファー、酒石酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓバッファー、ＭＥＳバッファー（ＭＥＳ－ＮａＯＨ）、ＨＥＰＥＳバッファー、またはリン酸バッファーであってよいが、これらに限定されない。１つの実施形態において、溶液は金属イオンまたは金属イオンのキレーターを含んでもよく、金属イオンとしては、Ａｌ３＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｌｉ２＋、Ｎａ＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｌｉ＋、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋、またはＺｎ２＋などであってよいが、これらに限定されない。金属イオンのキレーターとしては、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ＤＴＰＡ、ＨＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＤＴＰＡ、ＧＬＤＡ、ＴＴＨＡ、ＨＩＤＡ、またはＤＨＥＧなどであってよいが、これらに限定されない。１つの実施形態において、溶液は、界面活性剤を含んでもよく、界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１１４、ノニデットＰ４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０、デオキシコール酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０、Ｂｒｉｊｉ３５、およびコール酸ナトリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0036】
１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目に属する微生物のものであってよい。微生物は、放線菌目に属する微生物の中でもＰｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ科に属する微生物が好ましく、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ科に属する微生物の中でもＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ属に属する微生物が特に好ましく、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ属に属する微生物の中でもＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．が好ましい。土壌、湖沼、海、生物の表面や体腔内等から分離した菌株が、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ属に属する微生物であるかどうかは、例えば「Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ 第２版（２００１年）」、「微生物の分類・同定実験法－分子遺伝学・分子生物学的手法を中心に（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ）シュプリンガー・フェアラーク東京、２００１年９月」等に記載の方法、市販の同定検査用製品（例えばＢＩＯＭＥＲＩＥＵＸ社）を使用する方法、「株式会社テクノスルガ・ラボ（静岡県静岡市）」等に委託する方法等により確認すればよい。さらにそれらの菌株が、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．であるかどうかは、「Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ Ｅ．、Ｅｂｅｒｓ Ｊ．：Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ：ｔａｒｎｉｓｈｅｄ ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｔｏｄａｙ，ｎｏｖ，１５２－１５５頁、２００６年」に記載の方法等により判断すればよい。すなわち、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーションで７０％以上の相同性がある、または１６ｓ ｒＲＮＡが９８．５％以上同一であれば同属同種と判断できる。好ましくはＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーションで７０％以上の相同性があれば同属同種と判断することができる。
【0037】
本発明のポリペプチドの分子量を測定する方法は当業者に公知であり、例えば、Ｎａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥやＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いた電気泳動法、ゲルろ過クロマトグラフィー法、ＨＰＬＣ法、質量分析法、超遠心分離装置を用いた沈降平衡法、または動的光散乱（ＤＬＳ）を用いた光散乱法などにより測定できる。本発明のポリペプチドの分子量は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いた電気泳動法で測定した場合、約４９，０００Ｄａ～約５９，０００Ｄａであり得、好ましくは約５２，０００Ｄａ～約５６，０００Ｄａであり得、さらに好ましくは約５４，０００Ｄａであり得る。本発明のポリペプチドの分子量は、シグナル配列を除いたアミノ酸配列である配列番号２から推測した場合、約５１，０００Ｄａ～約６２，０００Ｄａであり得、好ましくは約５４，０００Ｄａ～約５８，０００Ｄａであり得、さらに好ましくは約５６，０００Ｄａであり得る。
【0038】
（ポリヌクレオチド）
１つの局面において本明細書は、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。ＲＮＡの場合、記載の配列からＴがＵに変えられていてもよい。ポリヌクレオチドは、１本鎖であってもよく、２本鎖であってもよい。
１つの局面において本明細書は、上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。ＲＮＡの場合、記載の配列からＴがＵに変えられていてもよい。ポリヌクレオチドは、１本鎖であってもよく、２本鎖であってもよい。
【0039】
１つの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１で表される塩基配列、（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み、ストリンジェントな条件は本明細書で定義されている。１つの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、（ｄ）配列番号１で表される塩基配列において１もしくは複数個の塩基が欠失、置換または付与された塩基配列を含むポリヌクレオチドを含み、塩基を欠失、置換または付与する方法は当業者に公知である。１つの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドが含み得る欠失、置換または付与された塩基の数は、発現されるポリペプチドの機能が大きく変化しなければ（実質的に同等の機能であれば）、つまり基質特異性が、例えばｐＨ６．０、５５℃、５分間の条件におけるＰＧの加水分解能を１００％とした場合に、この条件における他の基質（ＰＡ、ＰＥ、ＰＣ、ＣＬ、ＰＳ、およびＰＩのうちの１または複数）に対する加水分解能が高くとも３０％以下であれば、３００個以上であってよく、３００個以下、２００個以下であってよく、好ましくは１００個以下であってよく、さらに好ましくは１５個以下である。また、塩基の変異は、人為的な変異であってもよく、自然界で発生した変異であってもよい。
【0040】
１つの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、（ｅ）配列番号１で表される塩基配列と同義なコドンを含む塩基配列を含むポリヌクレオチオを含み、このポリヌクレオチドを発現させる生物種のコドン頻度に合わせてアミノ酸配列を変えずに塩基配列を変更することができる。各生物種におけるコドン頻度と塩基配列の変更法は当業者に公知である。１つの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、（ｆ）配列番号１で表される塩基配列と少なくとも約８０％の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む。同一性は、コードされるポリペプチドが本発明において意図される基質特異性を有する限りにおいて、少なくとも８０％であってよく、好ましくは少なくとも９０％であってよく、さらに好ましくは、少なくとも９５％、であってよい。
【0041】
（組換えベクターおよび形質転換体）
１つの局面において本明細書は、ＰＧの加水分解能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターと、組換えベクターを含む形質転換体とを提供する。１つの実施形態において、使用され得るベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、またはトランスポゾンベクターが挙げられるが、これらに限定されない。本発明では、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができさえすれば、どのようなベクターでも使用され得る。
１つの局面において本明細書は、ＰＧの加水分解能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターと、組換えベクターを含む形質転換体とを提供する。１つの実施形態において、使用され得るベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、またはトランスポゾンベクターが挙げられるが、これらに限定されない。本発明では、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができさえすれば、どのようなベクターでも使用され得る。
【0042】
標的遺伝子を含む組換えベクターとして標的細胞に導入する方法としては、リポフェクション法、電気穿孔法、リン酸カルシウム法などによるベクターの導入、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いた遺伝子ノックイン、受精卵核へのＤＮＡ注入による遺伝子ノックイン、相同組換えを用いた遺伝子ノックイン等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0043】
形質転換体として遺伝子導入され得る宿主生物としては、組換えベクターを導入できて標的タンパク質を発現できる生物であれば制限はない。使用され得る宿主生物としては、例えば、放線菌、枯草菌、または大腸菌などの細菌、酵母またはカビなどの真菌、シロイヌナズナなどの植物に由来する培養細胞、あるいは、ＨＥＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＣＨＯ細胞などの哺乳動物由来の培養細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【0044】
（ポリペプチドの製造方法）
１つの局面において本明細書は、ＰＧの加水分解能を有するポリペプチドを製造する方法を提供する。１つの実施形態において、ポリペプチドの製造方法は、形質転換体を培養してポリペプチドを生産させる工程を含む。１つの実施形態において、ポリペプチドの製造方法はさらに、目的のポリペプチドを精製する工程を含む。ポリペプチドを用いた実験法は当業者に公知であり、例えば、大島泰郎ら（編集），「ポストシークエンスタンパク質実験法」，東京化学同人，第１巻～第４巻に記載されている。
１つの局面において本明細書は、ＰＧの加水分解能を有するポリペプチドを製造する方法を提供する。１つの実施形態において、ポリペプチドの製造方法は、形質転換体を培養してポリペプチドを生産させる工程を含む。１つの実施形態において、ポリペプチドの製造方法はさらに、目的のポリペプチドを精製する工程を含む。ポリペプチドを用いた実験法は当業者に公知であり、例えば、大島泰郎ら（編集），「ポストシークエンスタンパク質実験法」，東京化学同人，第１巻～第４巻に記載されている。
【0045】
１つの実施形態において、ポリペプチドの製造に用いる形質転換体は、大腸菌である。大腸菌を培養し、タンパク質を発現させる方法は当業者に公知であり、例えば、中山広樹・西方敬人，「バイオ実験イラストレイテッド１ 分子生物学実験の基礎」，秀潤社などに記載されている。
【0046】
１つの実施形態において、培養した形質転換体からポリペプチドを精製する工程は、培養細胞からポリペプチドを抽出する工程を含んでもよく、さらに、目的のポリペプチドを精製する工程を含んでもよい。１つの実施形態において、細胞により生産されたポリペプチドは、培養液中に分泌されてもよく、細胞質中に分布してもよく、細胞膜上あるいはペリプラズムに分布してもよい。１つの実施形態において、細胞により生産されたポリペプチドは、培養細胞の細胞膜に含まれるＰＧを分解して細胞外またはペリプラズムに分泌されてもよい。１つの実施形態において、ポリペプチドが細胞質中、ペリプラズム、または細胞膜上に分布する場合には、細胞を遠心分離などにより回収した後、ホモジナイザーなどを用いた機械的な破砕法、超音波を用いた破砕法、または乳鉢と乳棒とを用いた破砕法などにより、あるいはリゾチームまたは界面活性剤を用いた化学的な細胞溶解法により細胞を破壊して、遠心分離などにより不要な画分を除去する、または必要な画分を濃縮するなどによりポリペプチドを抽出してもよい。１つの実施形態において、ポリペプチドが培養液中に分泌されている場合には、培養液を回収し、不要な細胞片などを遠心分離により除去することでタンパク質を抽出してもよい。１つの実施形態において、ポリペプチドを抽出する際には、沈殿剤によりポリペプチドを沈殿させて遠心分離する沈殿法を用いて効率的にポリペプチドを抽出してもよい。沈殿剤としては、硫酸アンモニウムなどのカオトロピック塩、ポリエチレングリコールまたはデキストランなどの水溶性ポリマー、トリクロロ酢酸または塩酸などの酸、およびアセトンまたはアルコールなどの有機溶媒が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい沈殿剤は、ポリペプチドを変性させにくい、硫酸アンモニウム、エチレングリコール、またはデキストランであり、さらに好ましくは硫酸アンモニウムである。１つの実施形態において、ポリペプチドを抽出する際には、必要に応じて、界面活性剤を添加してポリペプチドを可溶化してもよい。界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１１４、ノニデットＰ４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０、デオキシコール酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０、Ｂｒｉｊｉ３５、およびコール酸ナトリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0047】
１つの実施形態において、抽出されたポリペプチドは、クロマトグラフィー法により精製されてよい。クロマトグラフィー法の手順は当業者に公知であり、分子のサイズを利用したゲルろ過クロマトグラフィー、電荷を利用した陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性を利用した疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー、ならびに結合親和性を利用した精製するアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。これらのクロマトグラフィー法は、単独で用いられてもよく、組み合わせて用いられてもよい。１つの実施形態において、精製されるポリペプチドがタグなどの標識を有する場合には、そのタグを対象としたアフィニティークロマトグラフィーを用いてもよい。例えば、上記のようにｐＥＴベクターシステムを用いた場合には、発現されたタンパク質には、Ｈｉｓタグ、Ｔ７タグ、Ｓｔｒｅｐタグなどのタグ標識が取り付けられており、これらのタグに対する結合親和性を用いてタンパク質を精製する方法が本分野において公知である。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドを、相互性疎水作用クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、およびゲルろ過クロマトグラフィーを組み合わせて精製してもよい。なお、クロマトグラフィー法についてはカラムを用いても良いし、クロマトグラフィー担体を用いたバッチ法で良い。
【0048】
精製されたポリペプチドの濃度を測定して、上記のポリペプチドの加水分解能の測定法と組み合わせて、ポリペプチドの比活性を測定してもよい。ポリペプチドの濃度測定の方法は当業者に公知であり、吸光光度法（紫外吸光光度法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法、ＷＳＴ法、Ｂｉｕｒｅｔ法、Ｌｏｗｒｙ法、およびＢＣＡ法）、蛍光法、および電気泳動法が挙げられるが、これらに限定されない（鈴木祥夫，「総タンパク質の定量法」，ぶんせき，１，２－９（２０１８））。好ましくは吸光光度法であり、さらに好ましくはＢＣＡ法である。
【0049】
（ポリペプチドの使用方法）
１つの局面において、本発明は、ＰＧの加水分解能を有するポリペプチドの使用方法を提供する。１つの実施形態において、この使用方法は、ポリペプチドを用いてＰＧを分解する方法、およびＰＧからＧ１ＰおよびＧ３Ｐ、およびＤＧを製造する方法を提供する。
１つの局面において、本発明は、ＰＧの加水分解能を有するポリペプチドの使用方法を提供する。１つの実施形態において、この使用方法は、ポリペプチドを用いてＰＧを分解する方法、およびＰＧからＧ１ＰおよびＧ３Ｐ、およびＤＧを製造する方法を提供する。
【0050】
１つの実施形態において、本発明のポリペプチドを用いる方法におけるＰＧは、生物由来であってもよく、生物に由来しないものであってもよい。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、細菌の細胞膜を構成するリン脂質にはＰＧが約１０～２５％程度含まれており、これは真核生物の細胞膜と比較して高い。そのため、細菌の細胞膜に対して本発明のポリペプチドを反応させてグリセロールリン酸を製造することが考えられる。１つの実施形態において、用いられる生物はＰＧを含むものであればあらゆる生物が想定される。例えば、原核生物であっても良く、真核生物であっても良く、また下水余剰汚泥や廃棄農作物、廃棄植物に含まれる生物であっても良く、特に限定されるものではない。例えば、真核生物ではカビ、酵母、キノコなどの、古細菌、真性細菌などの原核生物では、放線菌、枯草菌、または大腸菌などが挙げられるが、好ましくは、扱いの確立されている大腸菌である。大腸菌を多量に得る方法としては、培養液を用いた実験室的な方法だけではなく、再生可能な生物由来の資源であるバイオマスを用いた大腸菌の培養方法が想定される。バイオマスとしては、廃棄紙、家畜糞尿、食品廃棄物、建築廃材、製材工場残材、黒液、および下水汚泥などの廃棄物系バイオマス、稲藁、麦藁、籾殻、農作物の非食部、および林地残材などの未利用バイオマス、ならびにバイオマスとして利用することを目的に栽培されたトウモロコシおよびサトウキビなどの資源作物などが挙げられる。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、大腸菌の細胞膜におけるＰＧのリン脂質親水部分は、主にホスホ－（１’－ｓｎ－グリセロール）型であり、そして、例えば４０℃以上の高温にするなど培養条件を変えることでホスホ－（３’－ｓｎ－グリセロール）型の割合を高められることが報告されている（藤島祐典ら，「海洋細菌に存在するホスファチジルグリセロールの立体異性体」；板橋豊，２００２年度実績報告書「水圏生物におけるＤ型リン脂質の分析法，分布および生理機能」，ｈｔｔｐｓ：／／ｋａｋｅｎ．ｎｉｉ．ａｃ．ｊｐ／ｒｅｐｏｒｔ／ＫＡＫＥＮＨＩ－ＰＲＯＪＥＣＴ－１３４６００８８／１３４６００８８２００２ｊｉｓｓｅｋｉ／）。そのため、大腸菌により合成されたＰＧを本発明のポリペプチドにより加水分解することで、Ｇ１Ｐを効率的に得ることができる。さらに、大腸菌がホスホ－（３’－ｓｎ－グリセロール）型のＰＧを合成する割合を高めるような環境、例えば５０℃の高温条件下などで大腸菌を培養すると総ＰＧの約２５％がホスホ－（３’－ｓｎ－グリセロール）型のＰＧになるため、本発明のポリペプチドによりＰＧを加水分解することにより、Ｇ３Ｐを効率的に得ることもできる。
【0051】
１つの実施形態において、バイオマスから大腸菌を回収する方法は、当業者に公知であり、バイオマス中の液体成分から大腸菌を回収する、およびバイオマスを水で洗い洗浄液から大腸菌を回収するなどが挙げられる。１つの実施形態において、回収した大腸菌からリン脂質を抽出してから、ＰＧの加水分解能を有するポリペプチドとリン脂質を反応させてもよい。一般に、大腸菌からリン脂質を抽出する方法は当業者に公知であり、例えば、クロロホルム・メタノールなどの有機溶媒を用いたＢｌｉｇｈ－Ｄｙｅｒ法、およびＦｏｌｃｈ法などが挙げられる。必要に応じて、薄層クロマトグラフィー、固相抽出、および高速液体クロマトグラフィーなどを施してもよい。他方、１つの実施形態において、リン脂質は大腸菌から抽出されていなくてもよく、さらに、ＰＧの加水分解能を有するポリペプチドも精製されていなくてもよい。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、ＰＧ－ＰＬＣが大腸菌の細胞内に発現された場合、その大腸菌の細胞膜に含まれるＰＧを分解してグリセロールリン酸を製造するとともに、ＰＧ－ＰＬＣが細胞外に分泌される。そして、細胞外に分泌されたＰＧ－ＰＬＣは、他の大腸菌の細胞膜に含まれるＰＧを分解してグリセロールリン酸を製造し得る。したがって、１つの実施形態において、ポリペプチドの精製およびリン脂質の抽出を行うことなく、ポリペプチドを発現させた大腸菌をバイオマス中で増殖させ、これにバイオマス中の同種または異種の大腸菌の細胞膜中のＰＧを切断させ、得られたグリセロールリン酸を回収してもよい。
【0052】
本発明のポリペプチドを用いる方法は、液体中で行われることが好ましく、液体として水相および有機溶媒相が想定され、水相で行われることが好ましい。１つの実施形態において、ポリペプチドとＰＧとを含む溶液の組成は当業者により変更され得る。１つの実施形態において、溶液はバッファーを含んでもよく、バッファーは、酢酸バッファー（Ａｃ－Ｎａ）、リン酸バッファー、クエン酸バッファー、クエン酸リン酸バッファー、ホウ酸バッファー、酒石酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓバッファー、ＭＥＳバッファー（ＭＥＳ－ＮａＯＨ）、ＨＥＰＥＳバッファー、またはリン酸バッファーであってよいが、これらに限定されない。１つの実施形態において、溶液は金属イオンまたは金属イオンのキレーターを含んでもよく、金属イオンとしては、Ａｌ３＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｌｉ２＋、Ｎａ＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｌｉ＋、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋、またはＺｎ２＋などであってよいが、これらに限定されない。金属イオンのキレーターとしては、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ＤＴＰＡ、ＨＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＤＴＰＡ、ＧＬＤＡ、ＴＴＨＡ、ＨＩＤＡ、またはＤＨＥＧなどであってよいが、これらに限定されない。１つの実施形態において、溶液は、界面活性剤を含んでもよく、界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１１４、ノニデットＰ４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０、デオキシコール酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０、Ｂｒｉｊｉ３５、およびコール酸ナトリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0053】
本発明のポリペプチドを用いて製造されたグリセロールリン酸は、原料または他の成分が混在したままであってもよいが、目的や用途に合わせて不純物を含有しないように精製してもよい。グリセロールリン酸の精製方法は、本分野で周知であり、薄層クロマトグラフィー、およびグリセロールリン酸をカルシウムまたはナトリウムとの塩としてからの再結晶化などが挙げられる（特開２０１４－１８９５５２；藤森亮利および高津淑人，「バイオディーゼル生成における使用済みＣａＯ触媒を用いたマテリアルサイクル」，バイオマス科学会議発表論文集，１３（０），１２１－１２２，２０１８）。本発明のポリペプチドを用いて製造されたグリセロールリン酸は、Ｇ１ＰまたはＧ３Ｐの特定の鏡像異性体を多く含むことが予想されるが、本分野で公知の方法により鏡像異性体の純度をさらに高めてもよい。鏡像異性体の光学分割法としては、結晶化法（優先晶出法、ジアステレオマー法、包接錯体法、および優先富化を利用した方法など）、およびキラルカラムを用いたＨＰＬＣ法などが挙げられる。精製されたグリセロールリン酸の鏡像異性体を判別する方法は本分野において公知であり、旋光分散（ＯＲＤ）測定法、円二色（ＣＤ）測定法、エックス線結晶構造解析、および核磁気共鳴装置、などが挙げられる。
【0054】
（ポリペプチドを含有する組成物）
１つの局面において、本発明は、本発明のポリペプチドを含有する、ＰＧを分解するための組成物を提供する。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドを含有する組成物は、キットとして販売されてもよい。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドを含有する組成物は、溶液、溶液の凍結物、または溶液の乾燥物（真空乾燥法、凍結乾燥法、または噴霧乾燥法などによる）であってよく、例えば、ｐＨ緩衝剤、塩、界面活性剤、還元剤、金属キレーター、凍結保護剤（グリセロール、またはエチレングリコールなど）、防腐剤（アジ化ナトリウム、またはチメロサールなど）、およびプロテアーゼ阻害剤などを含んでもよい。好ましくは、ポリペプチドを含むグリセロール溶液、またはポリペプチドを含む凍結乾燥物である。
１つの局面において、本発明は、本発明のポリペプチドを含有する、ＰＧを分解するための組成物を提供する。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドを含有する組成物は、キットとして販売されてもよい。１つの実施形態において、本発明のポリペプチドを含有する組成物は、溶液、溶液の凍結物、または溶液の乾燥物（真空乾燥法、凍結乾燥法、または噴霧乾燥法などによる）であってよく、例えば、ｐＨ緩衝剤、塩、界面活性剤、還元剤、金属キレーター、凍結保護剤（グリセロール、またはエチレングリコールなど）、防腐剤（アジ化ナトリウム、またはチメロサールなど）、およびプロテアーゼ阻害剤などを含んでもよい。好ましくは、ポリペプチドを含むグリセロール溶液、またはポリペプチドを含む凍結乾燥物である。
【実施例0055】
［実施例１：ＰＧ－ＰＬＣ生産菌の獲得を目的としたスクリーニングとＰＧ－ＰＬＣ生産菌の属種決定のための分類学上の同定］
（実験方法）
実験に使用した試薬は以下の通りである。Ｂａｃｔｏ－Ｍａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、型番２１８６３０）、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ＢＳＰ－Ｂ（オリエンタル酵母工業）、Ｌ－α－Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ， Ｅｇｇ（ＰＧ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＰＯＤ、オリエンタル酵母工業株式会社、型番４６２６１００３）、Ｌ－α－ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ（ＧＰＯ、東洋紡株式会社、型番Ｇ３Ｏ－３２１）、４－Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ（４－ＡＡ、ナカライテスク、型番０１９０７）、Ｎ，Ｎ－Ｂｉｓ（４－ｓｕｌｆｏｂｕｔｙｌ）－３－ｍｅｔｈｙｌａｎｉｌｉｎｅ， ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（ＴＯＤＢ、同仁化学研究所、型番ＯＣ２２）、その他、特に記載のない試薬は全て市販特級品を使用した。
（実験方法）
実験に使用した試薬は以下の通りである。Ｂａｃｔｏ－Ｍａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、型番２１８６３０）、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ＢＳＰ－Ｂ（オリエンタル酵母工業）、Ｌ－α－Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ， Ｅｇｇ（ＰＧ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＰＯＤ、オリエンタル酵母工業株式会社、型番４６２６１００３）、Ｌ－α－ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ（ＧＰＯ、東洋紡株式会社、型番Ｇ３Ｏ－３２１）、４－Ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ（４－ＡＡ、ナカライテスク、型番０１９０７）、Ｎ，Ｎ－Ｂｉｓ（４－ｓｕｌｆｏｂｕｔｙｌ）－３－ｍｅｔｈｙｌａｎｉｌｉｎｅ， ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（ＴＯＤＢ、同仁化学研究所、型番ＯＣ２２）、その他、特に記載のない試薬は全て市販特級品を使用した。
【0056】
目的酵素の生産菌のスクリーニング
（１）培養
１）試験管（Φ１８×１８０ｍｍ）にＩＳＰ２培地５ｍｌとガラスビーズ（Φ４ｍｍ）３粒を入れ、オートクレーブ滅菌（１２１℃，１５ｍｉｎ）した。
２）滅菌した培地にスクリーニング菌株のグリセロールストック懸濁液を１％（ｖ／ｖ）植菌し、２８℃、１６０ｓｐｍ、往復振とう培養を行った。
（１）培養
１）試験管（Φ１８×１８０ｍｍ）にＩＳＰ２培地５ｍｌとガラスビーズ（Φ４ｍｍ）３粒を入れ、オートクレーブ滅菌（１２１℃，１５ｍｉｎ）した。
２）滅菌した培地にスクリーニング菌株のグリセロールストック懸濁液を１％（ｖ／ｖ）植菌し、２８℃、１６０ｓｐｍ、往復振とう培養を行った。
【0057】
（２）ＰＬＣ測定法
ＰＬＣがＰＧに作用すると、ＰＧがラセミ体である場合、ＤＧと、２種のグリセロールリン酸（Ｇ１ＰおよびＧ３Ｐ）が生じる。中でもＧ３Ｐは、グリセロール－３－リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）によって酸化され過酸化水素を生じる。生成した過酸化水素はペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の作用により４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）とＮ，Ｎ－Ｂｉｓ（４－ｓｕｌｆｏｂｕｔｙｌ）－３－ｍｅｔｈｙｌａｎｉｌｉｎｅ，ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（ＴＯＤＢとを定量的に酸化縮合させ赤紫色のキノイミン色素を生成する。この呈色の強度を、５００～６３０ｎｍ、特に５５０ｎｍの吸光度（Ａ５５０）を測定することで、ＰＬＣの加水分解能を測定できることが知られている。この酵素による測定法を用いて、スクリーニング菌株の培養液の上清にＰＧを加水分解するＰＬＣが存在しているか調べた。なお、１ｍｉｎに１μｍｏｌのＧ３Ｐを生成する酵素量を１Ｕと定義した。
ＰＬＣがＰＧに作用すると、ＰＧがラセミ体である場合、ＤＧと、２種のグリセロールリン酸（Ｇ１ＰおよびＧ３Ｐ）が生じる。中でもＧ３Ｐは、グリセロール－３－リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）によって酸化され過酸化水素を生じる。生成した過酸化水素はペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の作用により４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）とＮ，Ｎ－Ｂｉｓ（４－ｓｕｌｆｏｂｕｔｙｌ）－３－ｍｅｔｈｙｌａｎｉｌｉｎｅ，ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（ＴＯＤＢとを定量的に酸化縮合させ赤紫色のキノイミン色素を生成する。この呈色の強度を、５００～６３０ｎｍ、特に５５０ｎｍの吸光度（Ａ５５０）を測定することで、ＰＬＣの加水分解能を測定できることが知られている。この酵素による測定法を用いて、スクリーニング菌株の培養液の上清にＰＧを加水分解するＰＬＣが存在しているか調べた。なお、１ｍｉｎに１μｍｏｌのＧ３Ｐを生成する酵素量を１Ｕと定義した。
【化8】
【0058】
（結果と考察）
ＰＬＣ生産菌の取得と分類学上の同定
（１）スクリーニング計７２菌株した結果、ＮＴ１１５株の培養上清中にＰＧ－ＰＬＣ活性を見い出した。簡易形態観察の結果、ＮＴ１１５株はＩＳＰ２寒天培地上で円形の中央陥没上のコロニーを示し、表面の色調は白色、裏面は茶色を示した。また、微視的観察の結果、気菌糸を形成し、連鎖胞子の観察が見られた。テクノスルガ・ラボ微生物同定システムを用いた、ＤＢ－ＢＡおよび国際塩基配列データベースに対するＢＬＡＳＴ相同性検査を基に解析した分子系統樹において、ＮＴ１１５株はＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ属が構成するクラスター内に含まれたが、既知の種とは異なる分子系統学的位置を示した。よって、今回の１６ＳｒＤＮＡ部分塩基配列解析の結果からは、ＮＴ１１５株はＡｍｙｃｏｌｏｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．と帰属した。また、この結果は、簡易形態観察の結果とも一致した。
ＰＬＣ生産菌の取得と分類学上の同定
（１）スクリーニング計７２菌株した結果、ＮＴ１１５株の培養上清中にＰＧ－ＰＬＣ活性を見い出した。簡易形態観察の結果、ＮＴ１１５株はＩＳＰ２寒天培地上で円形の中央陥没上のコロニーを示し、表面の色調は白色、裏面は茶色を示した。また、微視的観察の結果、気菌糸を形成し、連鎖胞子の観察が見られた。テクノスルガ・ラボ微生物同定システムを用いた、ＤＢ－ＢＡおよび国際塩基配列データベースに対するＢＬＡＳＴ相同性検査を基に解析した分子系統樹において、ＮＴ１１５株はＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ属が構成するクラスター内に含まれたが、既知の種とは異なる分子系統学的位置を示した。よって、今回の１６ＳｒＤＮＡ部分塩基配列解析の結果からは、ＮＴ１１５株はＡｍｙｃｏｌｏｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．と帰属した。また、この結果は、簡易形態観察の結果とも一致した。
【0059】
［実施例２：ＮＴ１１５株が菌体外に分泌生産するＰＬＣの精製］
（実験方法）
Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．ＮＴ１１５株ＰＬＣの精製
（１）培養
試験管（Φ１８×１８０ｍｍ）にＩＳＰ２培地５ｍｌとガラスビーズ（Φ４ｍｍ）３粒を入れ、オートクレーブ滅菌（１２１℃，１５ｍｉｎ）した。冷却後、クリーンベンチ内でＮＴ１１５株の１０％（ｖ／ｖ）グリセロールストック懸濁液５０μｌを植菌し、２８℃，１６０ｓｐｍで２日間往復振とう培養し、前培養液とした。５００ｍｌ容三角フラスコにＩＳＰ２培地１００ｍｌとステンレスコイルを入れたものを１０本用意し、オートクレーブ滅菌した。クリーンベンチ内で培地に前培養液を１％（ｖ／ｖ）植菌し、２８℃，１６０ｒｐｍで７２時間旋回振とう培養した。
（実験方法）
Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．ＮＴ１１５株ＰＬＣの精製
（１）培養
試験管（Φ１８×１８０ｍｍ）にＩＳＰ２培地５ｍｌとガラスビーズ（Φ４ｍｍ）３粒を入れ、オートクレーブ滅菌（１２１℃，１５ｍｉｎ）した。冷却後、クリーンベンチ内でＮＴ１１５株の１０％（ｖ／ｖ）グリセロールストック懸濁液５０μｌを植菌し、２８℃，１６０ｓｐｍで２日間往復振とう培養し、前培養液とした。５００ｍｌ容三角フラスコにＩＳＰ２培地１００ｍｌとステンレスコイルを入れたものを１０本用意し、オートクレーブ滅菌した。クリーンベンチ内で培地に前培養液を１％（ｖ／ｖ）植菌し、２８℃，１６０ｒｐｍで７２時間旋回振とう培養した。
【0060】
（２）硫酸アンモニウム（ＡＳ）分画
（１）の培養液を遠心分離（１８，８００×ｇ，１０ｍｉｎ）し、培養上清を得た。培養上清に２０％飽和となるように飽和ＡＳ水溶液（４℃保存）を加えた。１時間静置した後、生じた沈殿物を遠心分離（１８，８００×ｇ，１０ｍｉｎ）により回収した。
（１）の培養液を遠心分離（１８，８００×ｇ，１０ｍｉｎ）し、培養上清を得た。培養上清に２０％飽和となるように飽和ＡＳ水溶液（４℃保存）を加えた。１時間静置した後、生じた沈殿物を遠心分離（１８，８００×ｇ，１０ｍｉｎ）により回収した。
【0061】
（３）ＰＬＣ活性
以下の実験では、実施例１と同様に酵素反応によりＰＬＣ活性値を算出した。
以下の実験では、実施例１と同様に酵素反応によりＰＬＣ活性値を算出した。
【0062】
（４）ＰＰＧ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
回収した沈殿物を１Ｍ ＡＳ／２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で溶解した（フィルター、遠心分離なし）。
１）表１の条件でＰＰＧ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィーを行った。
Ａ ｓｏｌ．：１Ｍ ＡＳ／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７）
Ｂｓｏｌ．：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７）
Ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ：１５ｍｌ（＝Φ２．５ｃｍ， Ｈ＝３．０ｃｍ）
Ｅｌｕｔｉｏｎ１：ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｏｆ １ ｔｏ ０Ｍ ＡＳ ｗｉｔｈ ４ＣＶ
Ｅｌｕｔｉｏｎ２：１００％ Ｂ ｓｏｌ． ｗｉｔｈ ４ＣＶ
Ｆｒａｃｔｉｏｎ：６ｍｌ
表１：ＰＰＧ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィーの条件
２）各フラクションのＰＬＣ活性（基質；ＰＧ）を測定し、２．５Ｕ／ｍｌ以上の活性を示したフラクションを回収した（ＰＰＧ画分）。
回収した沈殿物を１Ｍ ＡＳ／２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で溶解した（フィルター、遠心分離なし）。
１）表１の条件でＰＰＧ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィーを行った。
Ａ ｓｏｌ．：１Ｍ ＡＳ／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７）
Ｂｓｏｌ．：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７）
Ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ：１５ｍｌ（＝Φ２．５ｃｍ， Ｈ＝３．０ｃｍ）
Ｅｌｕｔｉｏｎ１：ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｏｆ １ ｔｏ ０Ｍ ＡＳ ｗｉｔｈ ４ＣＶ
Ｅｌｕｔｉｏｎ２：１００％ Ｂ ｓｏｌ． ｗｉｔｈ ４ＣＶ
Ｆｒａｃｔｉｏｎ：６ｍｌ
表１：ＰＰＧ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィーの条件
【表1】
２）各フラクションのＰＬＣ活性（基質；ＰＧ）を測定し、２．５Ｕ／ｍｌ以上の活性を示したフラクションを回収した（ＰＰＧ画分）。
【0063】
（５）透析
ＰＰＧ画分を透析膜（三光純薬、セルロースチューブ３６／３２）に移し、サンプル量の１０倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で２回透析（ｂｕｆ交換；１ｈ，１２ｈ）した。
ＰＰＧ画分を透析膜（三光純薬、セルロースチューブ３６／３２）に移し、サンプル量の１０倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で２回透析（ｂｕｆ交換；１ｈ，１２ｈ）した。
【0064】
（６）Ｇｉｇａ Ｃａｐ Ｑ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィー
１）透析内液を回収し、Ｇｉｇａ Ｃａｐ Ｑ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（以下ＧＣＱと略す）にロードした。サンプルはフィルターろ過、遠心分離なしでカラムロードし、表２の条件でＧＣＱカラムクロマトグラフィーを行った。
Ａｓｏｌ．：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）
Ｂ ｓｏｌ．：０．５Ｍ ＮａＣｌ／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）
Ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ：１５ｍｌ（＝Φ２．５ｃｍ， Ｈ＝３．０ｃｍ）
Ｅｌｕｔｉｏｎ：ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｏｆ ０ ｔｏ ０．５Ｍ ＮａＣｌ ｗｉｔｈ １０ＣＶ
Ｆｒａｃｔｉｏｎ：５ｍｌ
表２：Ｇｉｇａ Ｃａｐ Ｑ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィーの条件
２）各フラクションのＰＧ－ＰＬＣ活性を測定し、活性のあったフラクションをＧＣＱ画分とした。
１）透析内液を回収し、Ｇｉｇａ Ｃａｐ Ｑ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（以下ＧＣＱと略す）にロードした。サンプルはフィルターろ過、遠心分離なしでカラムロードし、表２の条件でＧＣＱカラムクロマトグラフィーを行った。
Ａｓｏｌ．：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）
Ｂ ｓｏｌ．：０．５Ｍ ＮａＣｌ／２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）
Ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ：１５ｍｌ（＝Φ２．５ｃｍ， Ｈ＝３．０ｃｍ）
Ｅｌｕｔｉｏｎ：ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｏｆ ０ ｔｏ ０．５Ｍ ＮａＣｌ ｗｉｔｈ １０ＣＶ
Ｆｒａｃｔｉｏｎ：５ｍｌ
表２：Ｇｉｇａ Ｃａｐ Ｑ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムクロマトグラフィーの条件
【表2】
２）各フラクションのＰＧ－ＰＬＣ活性を測定し、活性のあったフラクションをＧＣＱ画分とした。
【0065】
（７）ゲルろ過クロマトグラフィー
Ａｍｉｃｏｎ－３０Ｋ（１５ｍＬ）を用いてＧＣＱ画分を５００μｌまで濃縮した。濃縮サンプルは、０．４５μｍフィルターろ過後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ（Ｓｐｄ ２００ Ｉｎｃ）にロードした。
１）以下の条件と表３に示す条件でカラムクロマトグラフィーを行った。
Ａ ｓｏｌ．：０．１５Ｍ ＮａＣｌ／Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
Ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ：２４ｍｌ（＝Φ１．０ｃｍ， Ｈ＝３０ｃｍ）
Ｅｌｕｔｉｏｎ：０．１５Ｍ ＮａＣｌ ｗｉｔｈ １．５ＣＶ
Ｆｒａｃｔｉｏｎ：０．５ｍｌ
表３：ゲルろ過クロマトグラフィーの条件
２）各フラクションのＰＧ－ＰＬＣ活性を測定し、Ａｍｉｃｏｎ－３０Ｋにより２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）にｂｕｆｆｅｒ交換を行い、精製ＰＧ－ＰＬＣとした。
Ａｍｉｃｏｎ－３０Ｋ（１５ｍＬ）を用いてＧＣＱ画分を５００μｌまで濃縮した。濃縮サンプルは、０．４５μｍフィルターろ過後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ（Ｓｐｄ ２００ Ｉｎｃ）にロードした。
１）以下の条件と表３に示す条件でカラムクロマトグラフィーを行った。
Ａ ｓｏｌ．：０．１５Ｍ ＮａＣｌ／Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
Ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ：２４ｍｌ（＝Φ１．０ｃｍ， Ｈ＝３０ｃｍ）
Ｅｌｕｔｉｏｎ：０．１５Ｍ ＮａＣｌ ｗｉｔｈ １．５ＣＶ
Ｆｒａｃｔｉｏｎ：０．５ｍｌ
表３：ゲルろ過クロマトグラフィーの条件
【表3】
２）各フラクションのＰＧ－ＰＬＣ活性を測定し、Ａｍｉｃｏｎ－３０Ｋにより２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）にｂｕｆｆｅｒ交換を行い、精製ＰＧ－ＰＬＣとした。
【0066】
タンパク質濃度の定量
ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用し、取扱説明書に従って５６２ｎｍにおける吸光度（Ａ５６２）を測定し、タンパク質濃度を定量した。
ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用し、取扱説明書に従って５６２ｎｍにおける吸光度（Ａ５６２）を測定し、タンパク質濃度を定量した。
【0067】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
Ｌａｅｍｍｌｉの方法に従い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法を行った。タンパク質バンドの検出には銀染色キット（アプロサイエンス）を使用し、取扱説明書に従って行った。
Ｌａｅｍｍｌｉの方法に従い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法を行った。タンパク質バンドの検出には銀染色キット（アプロサイエンス）を使用し、取扱説明書に従って行った。
【0068】
（結果と考察）
ＩＳＰ２培地で２日間培養した（図１）上清から、ＰＧ－ＰＬＣを２９８１倍まで精製することができ（表４）、比活性は６．１９ Ｕ／ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎとなった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析では分子量は約５４ｋＤａの単一バンドとして検出された（図２）。
表４：ＮＴ１１５株由来ＰＧ－ＰＬＣの精製結果
ＩＳＰ２培地で２日間培養した（図１）上清から、ＰＧ－ＰＬＣを２９８１倍まで精製することができ（表４）、比活性は６．１９ Ｕ／ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎとなった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析では分子量は約５４ｋＤａの単一バンドとして検出された（図２）。
表４：ＮＴ１１５株由来ＰＧ－ＰＬＣの精製結果
【表4】
【0069】
［実施例３：ＰＧ－ＰＬＣの諸特性解析］
（実験方法）
基質特異性試験以外は、実施例１に記載の方法により酵素活性を測定した。基質特異性試験では、基質として１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｐｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＰＯＰＧ）、１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｐｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＰＯＰＣ）、１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｐｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＰＯＰＥ）、１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｐｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｏｌ（ＰＯＰＩ）、１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｐｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ（ＰＯＰＳ）、１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｐｓｐｈａｔｅ（ＰＯＰＡ）ｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎ（ＣＬ）、Ｌ－α－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＰＧ）を使用した。その他にＢＩＯＭＯＬ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ、以下ＢＧと略記）、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（オリエンタル酵母工業、仔ウシ小腸由来、以下ＣＩＡＰと略記）を使用した。酵素反応液に加える酵素液（精製ＰＧ－ＰＬＣサンプル）は０．０５Ｕ／ｍｌ， １．５０Ｕ／ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ以上のものを使用し、基質消費が１０％程度となるように適宜希釈した。
（実験方法）
基質特異性試験以外は、実施例１に記載の方法により酵素活性を測定した。基質特異性試験では、基質として１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｐｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＰＯＰＧ）、１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｐｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＰＯＰＣ）、１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｐｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＰＯＰＥ）、１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｐｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｏｌ（ＰＯＰＩ）、１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｐｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ（ＰＯＰＳ）、１－ｐａｌｍｉｔｏｙｌ－２－ｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｐｓｐｈａｔｅ（ＰＯＰＡ）ｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎ（ＣＬ）、Ｌ－α－ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＰＧ）を使用した。その他にＢＩＯＭＯＬ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ、以下ＢＧと略記）、Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（オリエンタル酵母工業、仔ウシ小腸由来、以下ＣＩＡＰと略記）を使用した。酵素反応液に加える酵素液（精製ＰＧ－ＰＬＣサンプル）は０．０５Ｕ／ｍｌ， １．５０Ｕ／ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ以上のものを使用し、基質消費が１０％程度となるように適宜希釈した。
【0070】
１）酵素反応におけるｐＨ，温度の影響、ｐＨおよび温度安定性試験
酢酸－酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０～５．５，以下Ａｃ－Ｎａと略す）、ＭＥＳ－ＮａＯ（ｐＨ５．５～７．０）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０～９．０）を使用する温度でｐＨ調整し、酵素反応あるいは酵素に及ぼすｐＨおよび温度（図３－１、図３－２）の影響と安定性（図４－１、図４－２）について調べた。
酢酸－酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０～５．５，以下Ａｃ－Ｎａと略す）、ＭＥＳ－ＮａＯ（ｐＨ５．５～７．０）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０～９．０）を使用する温度でｐＨ調整し、酵素反応あるいは酵素に及ぼすｐＨおよび温度（図３－１、図３－２）の影響と安定性（図４－１、図４－２）について調べた。
【0071】
【0072】
３）ＰＬＣの基質特異性試験
各基質とＰＬＣとを反応させ、各基質に対する酵素活性を調べた。酵素反応により生じるグリセロールリン酸など対応するリン酸モノエステルを脱リン酸化酵素であるＣＩＡＰにより遊離した無機リン酸（Ｐｉ）を定量した。ただし、ＰＯＰＡは脱リン酸化酵素処理せず、そのままＰＧ－ＰＬＣによって遊離される無機リン酸（Ｐｉ）を定量した。無機リン酸の定量は、ＢＧ試薬を使用して取扱説明書に従い、６２０ｎｍにおける吸光度（Ａ６２０）を測定して行った。
各基質とＰＬＣとを反応させ、各基質に対する酵素活性を調べた。酵素反応により生じるグリセロールリン酸など対応するリン酸モノエステルを脱リン酸化酵素であるＣＩＡＰにより遊離した無機リン酸（Ｐｉ）を定量した。ただし、ＰＯＰＡは脱リン酸化酵素処理せず、そのままＰＧ－ＰＬＣによって遊離される無機リン酸（Ｐｉ）を定量した。無機リン酸の定量は、ＢＧ試薬を使用して取扱説明書に従い、６２０ｎｍにおける吸光度（Ａ６２０）を測定して行った。
【0073】
（結果と考察）
以下に示す各データは、特に記載がない場合は全て３回試験した結果を平均値±標準偏差（ＳＤ）で示す。
ｐＨ、温度の酵素反応と酵素の安定性への影響
各ｐＨにおけるＰＬＣ活性（３７℃）を調べたところ、弱酸性域ｐＨ５．０～ｐＨ６．０で高い活性を示し、ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）で最も高い活性を示した（図３－１）。ｐＨ６．０で各温度における活性を調べたところ５５℃で最大活性を示し、２０℃では約３０％、７０℃では約４０％の相対活性を示した（図３－２）。基質調製に使用したＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００の曇点は６３℃であることから６０℃以下においてはＰＬＣ活性の特徴を示していると考えられる。
以下に示す各データは、特に記載がない場合は全て３回試験した結果を平均値±標準偏差（ＳＤ）で示す。
ｐＨ、温度の酵素反応と酵素の安定性への影響
各ｐＨにおけるＰＬＣ活性（３７℃）を調べたところ、弱酸性域ｐＨ５．０～ｐＨ６．０で高い活性を示し、ＭＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）で最も高い活性を示した（図３－１）。ｐＨ６．０で各温度における活性を調べたところ５５℃で最大活性を示し、２０℃では約３０％、７０℃では約４０％の相対活性を示した（図３－２）。基質調製に使用したＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００の曇点は６３℃であることから６０℃以下においてはＰＬＣ活性の特徴を示していると考えられる。
【0074】
【0075】
金属イオンの影響
図５－１に示すように、ＥＤＴＡの存在下でも活性を示し、Ｃａ２＋によってわずかに活性が向上し、Ａｌ３＋の存在下で約１．３倍活性が向上した。また、図５－２に示すように試験した条件においてはＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００が最も良好な結果を示した。
図５－１に示すように、ＥＤＴＡの存在下でも活性を示し、Ｃａ２＋によってわずかに活性が向上し、Ａｌ３＋の存在下で約１．３倍活性が向上した。また、図５－２に示すように試験した条件においてはＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００が最も良好な結果を示した。
【0076】
基質特異性
図６に示すようにＰＣ、ＰＥ、ＣＬには全く活性を示さなかった他、ＰＡにも全く活性を示さず（データ示さず）、ＰＧ以外にはほとんど作用しなかったことから本酵素はＰＧ特異的ＰＬＣであると判断できる。
図６に示すようにＰＣ、ＰＥ、ＣＬには全く活性を示さなかった他、ＰＡにも全く活性を示さず（データ示さず）、ＰＧ以外にはほとんど作用しなかったことから本酵素はＰＧ特異的ＰＬＣであると判断できる。
【0077】
［実施例４：ＰＧ－ＰＬＣの配列］
（実験方法）
ペプチドの配列決定
ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりＰＧ－ＰＬＣを泳動後、バンドを切り出し、株式会社アンテグラルにてトリプシン処理およびＬＣ－ＭＳ解析を行い、アミノ酸配列を解析した。ＬＣ－ＭＳ解析により得られたペプチドの配列、およびこれらのペプチド配列と合致するデータベースから得られたタンパク質配列を図７に示す。グレーハイライト部分が本酵素のペプチド配列と一致した配列である。計１１本のペプチド配列が解読され、それらすべてのペプチドのアミノ酸配列がＷＰ＿０３７３６９５１３．１として公共データベースに登録されているＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ由来メタロホスホエステラーゼ中の配列と一致した。
（実験方法）
ペプチドの配列決定
ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりＰＧ－ＰＬＣを泳動後、バンドを切り出し、株式会社アンテグラルにてトリプシン処理およびＬＣ－ＭＳ解析を行い、アミノ酸配列を解析した。ＬＣ－ＭＳ解析により得られたペプチドの配列、およびこれらのペプチド配列と合致するデータベースから得られたタンパク質配列を図７に示す。グレーハイライト部分が本酵素のペプチド配列と一致した配列である。計１１本のペプチド配列が解読され、それらすべてのペプチドのアミノ酸配列がＷＰ＿０３７３６９５１３．１として公共データベースに登録されているＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ由来メタロホスホエステラーゼ中の配列と一致した。
【0078】
アミノ酸配列番号６から配列番号５のフォワードプライマーを、アミノ酸配列番号８から配列番号７のリバースプライマーを設計し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は下記の通りである。
９４℃、１分→（９８℃、１０秒→５５℃、１５秒→６８℃、４５秒）を２５サイクル、６８℃、５分
ＰＣＲによって得られた増幅断片をクローニングベクターｐＭＤ２０（タカラバイオ）に連結し、大腸菌ＤＨ５アルファを形質転換、培養し、組換えプラスミドを回収、精製した。それをＤＮＡシーケンサーで解析することで本酵素遺伝子の一部の塩基配列（配列番号９，１０）を解読した。次に、５’、３’未解読領域を解読するため配列番号１１，１２のプライマーセットによりインバースＰＣＲ（ｉＰＣＲ）を行った。ｉＰＣＲ条件は下記の通りである。
９４℃、１分→（９８℃、１０秒→５７℃、１５秒→６８℃、２．５分）を２５サイクル、６８℃、５分
ｉＰＣＲ反応液をカラム精製し、シーケンスをした。解析結果から、５’、３’未解読領域を解読し、本酵素遺伝子の全長配列（配列番号１、２の配列に、配列番号３、４のシグナル配列が付与されたもの）を解読し、図８に示すアミノ酸配列を得た。図８に示すアミノ酸配列の内、２５アミノ酸からなるシグナル配列を配列番号４、その塩基配列を配列番号３として示し、５１４アミノ酸からなる成熟タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２、その塩基配列を配列番号１として示す。
９４℃、１分→（９８℃、１０秒→５５℃、１５秒→６８℃、４５秒）を２５サイクル、６８℃、５分
ＰＣＲによって得られた増幅断片をクローニングベクターｐＭＤ２０（タカラバイオ）に連結し、大腸菌ＤＨ５アルファを形質転換、培養し、組換えプラスミドを回収、精製した。それをＤＮＡシーケンサーで解析することで本酵素遺伝子の一部の塩基配列（配列番号９，１０）を解読した。次に、５’、３’未解読領域を解読するため配列番号１１，１２のプライマーセットによりインバースＰＣＲ（ｉＰＣＲ）を行った。ｉＰＣＲ条件は下記の通りである。
９４℃、１分→（９８℃、１０秒→５７℃、１５秒→６８℃、２．５分）を２５サイクル、６８℃、５分
ｉＰＣＲ反応液をカラム精製し、シーケンスをした。解析結果から、５’、３’未解読領域を解読し、本酵素遺伝子の全長配列（配列番号１、２の配列に、配列番号３、４のシグナル配列が付与されたもの）を解読し、図８に示すアミノ酸配列を得た。図８に示すアミノ酸配列の内、２５アミノ酸からなるシグナル配列を配列番号４、その塩基配列を配列番号３として示し、５１４アミノ酸からなる成熟タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２、その塩基配列を配列番号１として示す。
【0079】
［実施例５：異種組換えＰＧ－ＰＬＣの製造および大腸菌ＰＧの分解］
実施例４で得られた、配列番号１に記載のＰＧ－ＰＬＣをコードするＤＮＡを、配列番号１３、１４のプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、ゲル電気泳動し、増幅バンドを切り出し精製した。ＰＣＲ条件は下記の通りである。
９４℃、１分→（９８℃、１０秒→６４℃、１５秒→６８℃、１分１５秒）を２５サイクル、６８℃、５分
同様にｐＥＴ－２４ａ（＋）をＨｉｎｄＩＩＩ消化後にゲル電気泳動し、切り出し精製した。両者を混合し、Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（タカラバイオ）を用いてｐＥＴ－２４ａ（＋）のＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＰＧ－ＰＬＣ／ｐＥＴ－２４ａ（＋）を作成した。そのため、ＰＧ－ＰＬＣ成熟配列のＮ末端側にはマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）由来のＴ７エピトープを含むＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲＧＳＱＦＱＬＲＲＱからなる２１アミノ酸が付加した状態である。
実施例４で得られた、配列番号１に記載のＰＧ－ＰＬＣをコードするＤＮＡを、配列番号１３、１４のプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、ゲル電気泳動し、増幅バンドを切り出し精製した。ＰＣＲ条件は下記の通りである。
９４℃、１分→（９８℃、１０秒→６４℃、１５秒→６８℃、１分１５秒）を２５サイクル、６８℃、５分
同様にｐＥＴ－２４ａ（＋）をＨｉｎｄＩＩＩ消化後にゲル電気泳動し、切り出し精製した。両者を混合し、Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（タカラバイオ）を用いてｐＥＴ－２４ａ（＋）のＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＰＧ－ＰＬＣ／ｐＥＴ－２４ａ（＋）を作成した。そのため、ＰＧ－ＰＬＣ成熟配列のＮ末端側にはマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）由来のＴ７エピトープを含むＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲＧＳＱＦＱＬＲＲＱからなる２１アミノ酸が付加した状態である。
【0080】
ＰＧ－ＰＬＣ／ｐＥＴ－２４ａ（＋）を、Ｚｉｐ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ ＢＬ２１（ＤＥ３）（バイオダイナミクス、品番：ＤＳ２５５）に形質転換し、終濃度５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天培地上で培養し、ＰＧ－ＰＬＣ／ｐＥＴ－２４ａ（＋）／ＢＬ２１（ＤＥ３）を得た。これを、同じくカナマイシンを５０μｇ／ｍＬの終濃度で含むＯｖｅｒｎｉｇｈｔ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｎｓｔａｎｔ ＴＢ ｍｅｄｉｕｍ ５ ｍＬ（液体培地）に植菌し、２０℃あるいは３０℃で１日間培養し、ＰＧ－ＰＬＣを発現させた。２０℃で培養した培養液を遠心分離して培養上清を得、また、３０℃で培養した培養液を遠心分離してＰＧ－ＰＬＣ／ｐＥＴ－２４ａ（＋）／ＢＬ２１（ＤＥ３）菌体と培養上清を回収し得られた菌体を緩衝液に懸濁して超音波破砕し、これを遠心分離して上清を得、粗タンパク質液（ＣＦＥ）とした。
【0081】
空のｐＥＴ－２４ａ（＋）ベクターで形質転換し、培養した組換えＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を遠心分離により回収し、超音波破砕してＥ．ｃｏｌｉ破砕液を得た。この破砕液に、２０℃の培養上清、または３０℃のＣＦＥを混合し、実施例１に記載の加水分解能の測定方法によりＰＧ－ＰＬＣの酵素活性を測定した。そうしたところ、いずれの反応液において時間依存的にＧ３Ｐの濃度が上昇した（図９－１、図９－２）。これにより、Ｅ．ｃｏｌｉ破砕液に含まれるＰＧが当該ＰＧ－ＰＬＣの作用により加水分解され、グリセロールリン酸が生成したことが確認された。この結果は、大腸菌という大量に増殖可能なバイオマスからでもグリセロールリン酸が得られることを示す。
【0082】
［実施例６：触媒（活性）中心部位および基質結合部位の推定］
ＰＧ－ＰＬＣの触媒（活性）中心部位および基質結合部位を推定するために、データベース上の構造および配列が既存のタンパク質をもとにＰＧ－ＰＬＣの３次元的（立体）構造を予測し、これに基づいて酵素の触媒（活性）中心部位および基質結合部位となるアミノ酸を推定した。
ＰＧ－ＰＬＣの触媒（活性）中心部位および基質結合部位を推定するために、データベース上の構造および配列が既存のタンパク質をもとにＰＧ－ＰＬＣの３次元的（立体）構造を予測し、これに基づいて酵素の触媒（活性）中心部位および基質結合部位となるアミノ酸を推定した。
【0083】
まず、タンパク質のドメイン・モチーフのデータベースであるＰｆａｍおよびタンパク質の立体構造・ファミリーのデータベースであるＣＡＴＨを用いて、ＰＧ－ＰＬＣが属するタンパク質ファミリーを調べた。そうしたところ、いずれのデータベースを用いても、ＰＧ－ＰＬＣは金属イオン要求性ホスホエステラーゼに属すると推定され、原核生物由来の亜鉛依存（要求）性ホスホリパーゼＣシグネチャー（Ｈ－Ｙ－ｘ－［ＧＴ］－Ｄ－［ＬＩＶＭＡＦ］－［ＤＮＳＨ］－ｘ－Ｐ－ｘ－Ｈ－［ＰＡ］－ｘ－Ｎ）に属する配列を５つ有していた。さらに、このファミリーに属するタンパク質の３次元的（立体）構造を比較したところ、構造が類似していた。これらの結果から、ＰＧ－ＰＬＣと金属イオン要求性ホスホエステラーゼとでは３次元的（立体）構造に類似性があり、そのため、金属イオン要求性ホスホエステラーゼをモデルにしてＰＧ－ＰＬＣの構造が推定できると考えた。
【0084】
ＰＧ－ＰＬＣの構造を予想するために、タンパク質立体構造のデータベースであるＳｗｉｓｓＭｏｄｅｌを用いてアミノ酸配列の類似した３次元的（立体）構造既知のタンパク質を調べた。そうしたところ、２ｘｍｏという金属イオン要求性ホスホエステラーゼが見出され、２ｘｍｏの立体構造に基づいてＰＧ－ＰＬＣの立体構造モデルを得た。２ｘｍｏの立体構造との比較から、ＰＧ－ＰＬＣにおいてリン酸と相互作用する活性中心残基を推定したところ、Ｄ４１／Ｈ４３／Ｄ１０３／Ｎ１９１／Ｈ３６４／Ｈ４０７／Ｈ４０９のヒスチジン（Ｈ）およびアスパラギン酸（Ｄ）が活性中心残基であると予想され、中でもリン酸との距離が近いＨ４３およびＨ４０９が触媒残基であると推定した。
【0085】
次に、基質結合部位を予想するために、ＰＧ－ＰＬＣの立体構造モデルと、構造既知の４種類のＰＬＣとを比較した。そうしたところ、いずれのＰＬＣもタンパク質の中央付近に酸性アミノ酸の多いポケットを有し、このポケットに基質が結合すると考えられた。さらに、構造既知のＰＧ非特異的ＰＬＣ（例えば、ＰＣ特異的ＰＬＣなど）における基質の位置をＰＧ－ＰＬＣにあてはめ、基質と接触するアミノ酸残基を推定したところ、図１０に得られるアミノ酸残基が基質と接触し、基質結合部位に当たると推定できた（配列番号２で表されるアミノ酸配列の、４０Ｔ～７５Ｔ、１００Ｔ～１２０Ｌ、１８４Ｐ～１９７Ｖ、２０５Ｐ～２２７Ｋ、２６６Ｆ、２７１Ｌ、２９６Ｙ～２９７Ｙ、３１０Ｌ～３２２Ｓ、３６３Ｓ～３６６Ｔ、３７８Ｒ～３８４Ｒ、４０６Ｇ～４０９Ｈ、および４３２Ｓ～４３５Ｄ）。中でも、非極性アミノ酸である５６Ｌ／５９ＦＶＧ６１／２０４ＩＰＧＩ２０７／２０９ＡＷ２１０／３１６ＧＧＦＡ３２０は、ＰＧのアシル基に結合するアミノ酸残基であると考えられる。
【0086】
さらに、これらの基質結合部位、活性中心アミノ酸残基、および触媒残基が放線菌間で保存されている調べるため、配列番号２の部分配列について、種々の放線菌間でＢＬＡＳＴを用いて配列を比較した。そうしたところ、配列番号２の３５～４８８位のアミノ酸（ＡＦＶ・・・ＳＹＮ；配列番号１６）において、２５種を超える放線菌間で高い配列の相同性と類似性が見られ、基質結合部位、活性中心アミノ酸残基、および触媒残基が少なくとも放線菌間で種を超えて保存されていることが示された。また、Ｐｆａｍによる解析では配列番号２の３６～４０９位のアミノ酸がＭｅｔａｌｌｏｐｈｏｓモチーフ（Ｐｆａｍ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ： ＰＦ００１４９）として帰属された。
【配列表フリーテキスト】
【0087】
配列番号１：Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．由来のＰＧ－ＰＬＣの塩基配列
配列番号２：Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．由来のＰＧ－ＰＬＣの成熟タンパク質配列
配列番号３：Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．におけるＰＧ－ＰＬＣのシグナル配列の塩基配列
配列番号４：Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．におけるＰＧ－ＰＬＣのシグナル配列
配列番号５：ＰＧ－ＰＬＣの配列特定のためのフォワードプライマー
配列番号６：配列番号５のプライマーに対応するアミノ酸配列
配列番号７：ＰＧ－ＰＬＣの配列特定のためのリバースプライマー
配列番号８：配列番号７のプライマーに対応するアミノ酸配列
配列番号９：特定されたＰＧ－ＰＬＣの部分塩基配列
配列番号１０：特定されたＰＧ－ＰＬＣの部分アミノ酸配列
配列番号１１：ＰＧ－ＰＬＣの配列特定のためのｉＰＣＲ用プライマー１
配列番号１２：ＰＧ－ＰＬＣの配列特定のためのｉＰＣＲ用プライマー２
配列番号１３：サブクローニングのためのフォワードプライマー
配列番号１４：サブクローニングのためのリバースプライマー
配列番号１５：大腸菌発現の際にＰＧ－ＰＬＣのＮ末端に付与したＭＣＳ由来のＴ７エピトープを含むアミノ酸配列
配列番号１６：ＰＧ－ＰＬＣ中の種間で保存性が高いことが確認された配列
配列番号２：Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．由来のＰＧ－ＰＬＣの成熟タンパク質配列
配列番号３：Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．におけるＰＧ－ＰＬＣのシグナル配列の塩基配列
配列番号４：Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｓｐ．におけるＰＧ－ＰＬＣのシグナル配列
配列番号５：ＰＧ－ＰＬＣの配列特定のためのフォワードプライマー
配列番号６：配列番号５のプライマーに対応するアミノ酸配列
配列番号７：ＰＧ－ＰＬＣの配列特定のためのリバースプライマー
配列番号８：配列番号７のプライマーに対応するアミノ酸配列
配列番号９：特定されたＰＧ－ＰＬＣの部分塩基配列
配列番号１０：特定されたＰＧ－ＰＬＣの部分アミノ酸配列
配列番号１１：ＰＧ－ＰＬＣの配列特定のためのｉＰＣＲ用プライマー１
配列番号１２：ＰＧ－ＰＬＣの配列特定のためのｉＰＣＲ用プライマー２
配列番号１３：サブクローニングのためのフォワードプライマー
配列番号１４：サブクローニングのためのリバースプライマー
配列番号１５：大腸菌発現の際にＰＧ－ＰＬＣのＮ末端に付与したＭＣＳ由来のＴ７エピトープを含むアミノ酸配列
配列番号１６：ＰＧ－ＰＬＣ中の種間で保存性が高いことが確認された配列
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図10】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2021-01-08
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ホスファチジルグリセロールに対して基質特異的な加水分解能を有する、ホスホリパーゼＣポリペプチドであって、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）であるポリペプチド。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上５０個以下のアミノ酸が欠失、置換または付与されたアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１個以上５０個以下のアミノ酸が欠失、置換または付与されたアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項2】
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の、５６Ｌ，５９ＦＶＧ６１，２０４ＩＰＧＩ２０７，２０９ＡＷ２１０，および３１６ＧＧＦＡ３２０に相当するアミノ酸、および／または
（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の、Ｈ４３，およびＨ４０９に相当するアミノ酸を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の、Ｈ４３，およびＨ４０９に相当するアミノ酸を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項3】
配列番号２で表されるアミノ酸配列の、Ｄ４１、Ｄ１０３、Ｎ１９１、Ｈ３６４、およびＨ４０７に相当するアミノ酸をさらに有する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項4】
配列番号２で表されるアミノ酸配列の、４０Ｔ～７５Ｔ、１００Ｔ～１２０Ｌ、１８４Ｐ～１９７Ｖ、２０５Ｐ～２２７Ｋ、２６６Ｆ、２７１Ｌ、２９６Ｙ～２９７Ｙ、３１０Ｌ～３２２Ｓ、３６３Ｓ～３６６Ｔ、３７８Ｒ～３８４Ｒ、４０６Ｇ～４０９Ｈ、および４３２Ｓ～４３５Ｄに相当するアミノ酸をさらに含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項5】
標識をさらに含む、請求項１～４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項6】
放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目に属する微生物に由来する、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項7】
ホスファチジルグリセロールに対して基質特異的な加水分解能を有するホスホリパーゼＣポリペプチドをコードする、以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかであるポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において１個以上１５０個以下の塩基が欠失、置換または付与された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と同義なコドンを含む塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において１個以上１５０個以下の塩基が欠失、置換または付与された塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と同義なコドンを含む塩基配列を含むポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド
【請求項8】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項9】
請求項８に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項10】
ホスファチジルグリセロールに対して基質特異的な加水分解能有するポリペプチドの製造方法であって、請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体から該ポリペプチドを生産する工程を含む、製造方法。
【請求項11】
請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチドを用いる、ホスファチジルグリセロールの分解方法。
【請求項12】
請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチドを用いて、ホスファチジルグリセロールからｓｎ－グリセロール－１－リン酸、ｓｎ－グリセロール－３－リン酸、および／またはジアシルグリセリドを製造する方法。
【請求項13】
請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含有する、ホスファチジルグリセロールを分解するための組成物。