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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022045001
(43)【公開日】2022-03-18
(54)【発明の名称】バリオールアミン及びボグリボースの製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20220311BHJP
C12P 13/00 20060101ALI20220311BHJP
C07C 215/42 20060101ALI20220311BHJP
C07C 213/02 20060101ALI20220311BHJP
C12N 15/52 20060101ALN20220311BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12P13/00
C07C215/42
C07C213/02
C12N15/52 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020150449
(22)【出願日】2020-09-08
(71)【出願人】
【識別番号】308032666
【氏名又は名称】協和発酵バイオ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100128381
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 義憲
(74)【代理人】
【識別番号】100140888
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 欣乃
(72)【発明者】
【氏名】纐纈 健人
(72)【発明者】
【氏名】田畑 和彦
(72)【発明者】
【氏名】林 幹朗
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H006
【Ｆターム（参考）】
4B064AE01
4B064BH07
4B064CA02
4B064CA19
4B064CA21
4B064CB27
4B064CB28
4B064CC04
4B064CC06
4B064CC12
4B064CC24
4B064CD02
4B064CD07
4B064CD09
4B064DA01
4B065AA01Y
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BB03
4B065BB15
4B065BB37
4B065BC03
4B065BC26
4B065CA16
4B065CA27
4B065CA44
4H006AA02
4H006AC52
4H006BE23
4H006BJ20
4H006BN10
4H006BN20
4H006BU42
(57)【要約】
【課題】本発明の目的は、バリオールアミンの生合成経路を新規に同定し、微生物発酵法による効率的なバリオールアミン及びボグリボースの製造方法を提供することにある。
【解決手段】本発明の組換え微生物は、２－エピ－バリオロン酸生成活性を有する蛋白質、２－エピ－バリオロンリン酸化活性及び／又は２－エピ－バリオロン－７－リン酸エピメリ化活性を有する蛋白質、並びにバリオロン－７－リン酸アミノ化活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物であり、本発明のバリオールアミンの製造方法は、該微生物を用いる方法であり、それによれば、効率的にバリオールアミンを製造することができる。また本発明のバリオールアミンの製造方法を用いて、簡便にボグリボースを製造することができる。
【選択図】図１
【解決手段】本発明の組換え微生物は、２－エピ－バリオロン酸生成活性を有する蛋白質、２－エピ－バリオロンリン酸化活性及び／又は２－エピ－バリオロン－７－リン酸エピメリ化活性を有する蛋白質、並びにバリオロン－７－リン酸アミノ化活性を有する蛋白質を生産する能力を有する微生物であり、本発明のバリオールアミンの製造方法は、該微生物を用いる方法であり、それによれば、効率的にバリオールアミンを製造することができる。また本発明のバリオールアミンの製造方法を用いて、簡便にボグリボースを製造することができる。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（１）～（３）に記載の蛋白質を生産する能力を有する組換え微生物。
（１）配列番号２、４、６若しくは８で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、セドヘプツロース－７－リン酸を基質として２－エピ－バリオロンを生成する活性（ＶｌａＡ活性）を有する蛋白質
（２）以下の［Ｉ］～［ＩＩＩ］に記載の蛋白質からなる群より選択される少なくとも１の蛋白質
［Ｉ］配列番号１０で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、２－エピ－バリオロンを基質として２－エピ－バリオロン－７－リン酸を生成する活性（ＶｌａＤ活性）及び２－エピ－バリオロン－７－リン酸を基質としてバリオロン－７－リン酸を生成する活性（ＶｌａＢ活性）を有する蛋白質
［ＩＩ］配列番号１２、１４、１６若しくは１８で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、ＶｌａＤ活性を有する蛋白質
［ＩＩＩ］配列番号２０、２２又は２４で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、ＶｌａＢ活性を有する蛋白質
（３）配列番号２６、２８、３０又は３２で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、バリオロン－７－リン酸を基質としてバリオールアミン－７－リン酸を生成する活性（ＶｌａＣ活性）を有する蛋白質
（１）配列番号２、４、６若しくは８で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、セドヘプツロース－７－リン酸を基質として２－エピ－バリオロンを生成する活性（ＶｌａＡ活性）を有する蛋白質
（２）以下の［Ｉ］～［ＩＩＩ］に記載の蛋白質からなる群より選択される少なくとも１の蛋白質
［Ｉ］配列番号１０で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、２－エピ－バリオロンを基質として２－エピ－バリオロン－７－リン酸を生成する活性（ＶｌａＤ活性）及び２－エピ－バリオロン－７－リン酸を基質としてバリオロン－７－リン酸を生成する活性（ＶｌａＢ活性）を有する蛋白質
［ＩＩ］配列番号１２、１４、１６若しくは１８で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、ＶｌａＤ活性を有する蛋白質
［ＩＩＩ］配列番号２０、２２又は２４で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、ＶｌａＢ活性を有する蛋白質
（３）配列番号２６、２８、３０又は３２で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、バリオロン－７－リン酸を基質としてバリオールアミン－７－リン酸を生成する活性（ＶｌａＣ活性）を有する蛋白質
【請求項2】
（２）の［ＩＩ］及び［ＩＩＩ］に記載の蛋白質を生産する能力を有する、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項3】
微生物が、大腸菌である、請求項１又は２に記載の組換え微生物。
【請求項4】
微生物が、６－ホスホフルクトキナーゼの活性が低下又は喪失した大腸菌である、請求項３に記載の組換え微生物。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載の組換え微生物を培地に培養し、培養物中にバリオールアミンを生成、蓄積させ、該培養物からバリオールアミンを採取することを特徴とする、バリオールアミンの製造方法。
【請求項6】
請求項５に記載の製造方法にしたがってバリオールアミンを製造し、得られたバリオールアミンを原料として、還元型アミノ化反応によりボグリボースを生成し、反応液からボグリボースを採取することを特徴とする、ボグリボースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、効率的なバリオールアミン及びボグリボースの製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
バリオールアミンは、強いα－グルコシダーゼ阻害活性を有するアミノ酸である（非特許文献１）。また、バリオールアミンと同様にα－グルコシダーゼ阻害活性を有し、かつ糖尿病治療にも用いられるボグリボースの重要な中間体でもある。
【0003】
バリオールアミンの製造方法としては、化学合成法又は微生物発酵法を利用した方法が知られている。
【0004】
バリオールアミンの化学合成法はこれまで様々な改良が施され、例えば特許文献１に開示されるように、工業化に適した堅牢な製造法となっているものの、多段階の化学反応工程を要する、又は多量の有機溶媒を要するなど、製造効率面及び環境面で課題が残る。
【0005】
微生物発酵法による製造方法としては、非特許文献１で放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｓｕｂｓｐ． ｌｉｍｏｎｅｕｓ ＩＦＯ１２７０３を用いる方法が開示されている。しかし、該手法ではバリオールアミンの生成量が低く（３．５ｍｇ／Ｌ）、かつバリオールアミン類縁体が副生産物として多く蓄積するという課題がある。
【0006】
特許文献２では、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ ＫＣＴＣ９０１５を用い、バリオールアミン類縁体の一種であるバリエナミンの構造を有するサルボスタチンの生合成遺伝子クラスターを強化することで、バリエナミン及びバリオールアミンを生産する方法が開示されている。しかしながら該手法は、非特許文献１と同様に放線菌を宿主として使用しているため、バリオールアミンの生産に必要な培養日数が長く、生産性も低いこと（バリエナミン；５ｍｇ／Ｌ）から、実用化には適していない。
【0007】
Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ ｍｉｒｕｍより同定されたＡｍｉｒ＿２０００は、Ｄ－セドヘプツロース－７－リン酸を基質として、バリオールアミンの前駆体である２－エピ－バリオロンを生成する活性を有することが知られている（非特許文献２）。さらに、該蛋白質をコードする遺伝子を含む遺伝子クラスターが、バリオールアミンの前駆体となりうるバリドキシルアミンＡの合成に関与することが開示されている（非特許文献３）。しかしながら、Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ ｍｉｒｕｍの有するバリオールアミンの生合成系の全容については明らかになっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】特許第４８９５５１０号公報
【特許文献2】国際公開第２０１０／０２４４９３号
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，１９８４，３７，１３０１－１３０７
【非特許文献2】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１２，１３４，１２２１９－１２２２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明の目的は、バリオールアミンの生合成経路を新規に同定し、微生物発酵法による効率的なバリオールアミン及びボグリボースの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明は、以下の１～６に関する。
１．以下の（１）～（３）に記載の蛋白質を生産する能力を有する組換え微生物。
（１）配列番号２、４、６若しくは８で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、セドヘプツロース－７－リン酸を基質として２－エピ－バリオロンを生成する活性（以下、「ＶｌａＡ活性」という）を有する蛋白質
（２）以下の［Ｉ］～［ＩＩＩ］に記載の蛋白質からなる群より選択される少なくとも１の蛋白質［Ｉ］配列番号１０で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、２－エピ－バリオロンを基質として２－エピ－バリオロン－７－リン酸を生成する活性（以下、「ＶｌａＤ活性」という）及び２－エピ－バリオロン－７－リン酸を基質としてバリオロン－７－リン酸を生成する活性（以下、「ＶｌａＢ活性」という）を有する蛋白質
［ＩＩ］配列番号１２、１４、１６若しくは１８で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、ＶｌａＤ活性を有する蛋白質
［ＩＩＩ］配列番号２０、２２若しくは２４で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、ＶｌａＢ活性を有する蛋白質
（３）配列番号２６、２８、３０若しくは３２で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、バリオロン－７－リン酸を基質としてバリオールアミン－７－リン酸を生成する活性（以下、「ＶｌａＣ活性」という）を有する蛋白質
２．（２）の［ＩＩ］及び［ＩＩＩ］に記載の蛋白質を生産する能力を有する、上記１に記載の組換え微生物。
３．微生物が、大腸菌である、上記１又は２に記載の組換え微生物。
４．微生物が、６－ホスホフルクトキナーゼの活性が低下又は喪失した大腸菌である、上記３に記載の組換え微生物。
５．上記１～４のいずれかに記載の組換え微生物を培地に培養し、培養物中にバリオールアミンを生成、蓄積させ、該培養物からバリオールアミンを採取することを特徴とする、バリオールアミンの製造方法。
６．上記５に記載の製造方法でバリオールアミンを製造し、得られたバリオールアミンを原料として、還元型アミノ化反応によりボグリボースを生成し、反応液からボグリボースを採取することを特徴とする、ボグリボースの製造方法。
１．以下の（１）～（３）に記載の蛋白質を生産する能力を有する組換え微生物。
（１）配列番号２、４、６若しくは８で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、セドヘプツロース－７－リン酸を基質として２－エピ－バリオロンを生成する活性（以下、「ＶｌａＡ活性」という）を有する蛋白質
（２）以下の［Ｉ］～［ＩＩＩ］に記載の蛋白質からなる群より選択される少なくとも１の蛋白質［Ｉ］配列番号１０で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、２－エピ－バリオロンを基質として２－エピ－バリオロン－７－リン酸を生成する活性（以下、「ＶｌａＤ活性」という）及び２－エピ－バリオロン－７－リン酸を基質としてバリオロン－７－リン酸を生成する活性（以下、「ＶｌａＢ活性」という）を有する蛋白質
［ＩＩ］配列番号１２、１４、１６若しくは１８で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、ＶｌａＤ活性を有する蛋白質
［ＩＩＩ］配列番号２０、２２若しくは２４で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、ＶｌａＢ活性を有する蛋白質
（３）配列番号２６、２８、３０若しくは３２で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、バリオロン－７－リン酸を基質としてバリオールアミン－７－リン酸を生成する活性（以下、「ＶｌａＣ活性」という）を有する蛋白質
２．（２）の［ＩＩ］及び［ＩＩＩ］に記載の蛋白質を生産する能力を有する、上記１に記載の組換え微生物。
３．微生物が、大腸菌である、上記１又は２に記載の組換え微生物。
４．微生物が、６－ホスホフルクトキナーゼの活性が低下又は喪失した大腸菌である、上記３に記載の組換え微生物。
５．上記１～４のいずれかに記載の組換え微生物を培地に培養し、培養物中にバリオールアミンを生成、蓄積させ、該培養物からバリオールアミンを採取することを特徴とする、バリオールアミンの製造方法。
６．上記５に記載の製造方法でバリオールアミンを製造し、得られたバリオールアミンを原料として、還元型アミノ化反応によりボグリボースを生成し、反応液からボグリボースを採取することを特徴とする、ボグリボースの製造方法。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、新規に同定されたバリオールアミン生合成に関与する蛋白質を発現する微生物を用いて、効率的かつ簡便にバリオールアミンを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【発明を実施するための形態】
【0014】
１．本発明の微生物
本発明の微生物は、以下の（１）～（３）に記載の蛋白質を生産する能力を有する組換え微生物である。
（１）配列番号２、４、６若しくは８で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、セドヘプツロース－７－リン酸を基質として２－エピ－バリオロンを生成する活性（以下、「ＶｌａＡ活性」という）を有する蛋白質
（２）以下の［Ｉ］～［ＩＩＩ］に記載の蛋白質からなる群より選択される少なくとも１の蛋白質。
［Ｉ］配列番号１０で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、２－エピ－バリオロンを基質として２－エピ－バリオロン－７－リン酸を生成する活性（以下、「ＶｌａＤ活性」という）及び２－エピ－バリオロン－７－リン酸を基質としてバリオロン－７－リン酸を生成する活性（以下、「ＶｌａＢ活性」という）を有する蛋白質
［ＩＩ］配列番号１２、１４、１６又は１８で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、ＶｌａＤ活性を有する蛋白質
［ＩＩＩ］配列番号２０、２２又は２４で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、ＶｌａＢ活性を有する蛋白質
（３）配列番号２６、２８、３０又は３２で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、バリオロン－７－リン酸を基質としてバリオールアミン－７－リン酸を生成する活性（以下、「ＶｌａＣ活性」という）を有する蛋白質。
本発明の微生物は、以下の（１）～（３）に記載の蛋白質を生産する能力を有する組換え微生物である。
（１）配列番号２、４、６若しくは８で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、セドヘプツロース－７－リン酸を基質として２－エピ－バリオロンを生成する活性（以下、「ＶｌａＡ活性」という）を有する蛋白質
（２）以下の［Ｉ］～［ＩＩＩ］に記載の蛋白質からなる群より選択される少なくとも１の蛋白質。
［Ｉ］配列番号１０で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、２－エピ－バリオロンを基質として２－エピ－バリオロン－７－リン酸を生成する活性（以下、「ＶｌａＤ活性」という）及び２－エピ－バリオロン－７－リン酸を基質としてバリオロン－７－リン酸を生成する活性（以下、「ＶｌａＢ活性」という）を有する蛋白質
［ＩＩ］配列番号１２、１４、１６又は１８で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、ＶｌａＤ活性を有する蛋白質
［ＩＩＩ］配列番号２０、２２又は２４で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、ＶｌａＢ活性を有する蛋白質
（３）配列番号２６、２８、３０又は３２で表されるアミノ酸配列又はその相同配列からなり、バリオロン－７－リン酸を基質としてバリオールアミン－７－リン酸を生成する活性（以下、「ＶｌａＣ活性」という）を有する蛋白質。
【0015】
本発明の微生物は、上記（２）の蛋白質として、ＶｌａＤ活性及びＶｌａＢ活性の両方を有する蛋白質、すなわち、［Ｉ］に記載の蛋白質、或いは、［ＩＩ］及び［ＩＩＩ］記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物であることが好ましい。
【0016】
本発明の（１）～（３）の蛋白質を生産する能力を有する組換え微生物は、遺伝子改変によって得られる微生物をいい、遺伝子導入、又は、遺伝子変異の導入によって得られる微生物を挙げることができる。ここで、遺伝子導入は、形質転換、トランスフェクション、形質導入等によって、微生物に遺伝子を導入することによって行うことができる。導入される遺伝子は野生型遺伝子であっても変異遺伝子であってもよく、また遺伝子の全長であっても一部であってもよい。また、遺伝子変異の導入は、微生物に元々ある遺伝子を変異剤、紫外線等を用いた突然変異処理によって行うことができ、また、微生物に元々ない変異遺伝子を導入することによって行うこともできる。変異遺伝子とは、野生型の遺伝子の任意の位置における塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加を有する遺伝子をいい、例えば部分特異的変異導入法によって得ることができる。ここで、遺伝子改変の対象となる元株は親株といい、遺伝子導入の対象となる元株は宿主株ともいう。
【0017】
該組換え微生物が有する（１）～（３）に記載の蛋白質のうち、その親株（宿主株）が元来有する蛋白質である場合は、当該蛋白質の発現が増強した微生物もまた、本発明の微生物である。例えば、親株が、元来配列番号２、１０及び２６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を生産する能力を有するＡｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ ｍｉｒｕｍである場合、これらの蛋白質の発現が増強した微生物もまた、本発明の微生物である。また、親株が大腸菌である場合、（２）［ＩＩ］に記載の蛋白質が、例えば配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質のように親株が元来有する蛋白質である場合は、当該蛋白質の発現が増強した微生物もまた、本発明の微生物である。
【0018】
上記（１）に記載の蛋白質としては、以下の［１］～［３］のいずれか１つに記載のＶｌａＡ活性を有する蛋白質が挙げられる。
［１］配列番号２、４、６又は８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［２］配列番号２、４、６又は８で表されるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｌａＡ活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号２、４、６又は８で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｌａＡ活性を有する相同蛋白質。
［１］配列番号２、４、６又は８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［２］配列番号２、４、６又は８で表されるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｌａＡ活性を有する変異蛋白質。
［３］配列番号２、４、６又は８で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｌａＡ活性を有する相同蛋白質。
【0019】
上記（２）［Ｉ］に記載の蛋白質としては、以下の［４］～［６］のいずれか１つに記載の、ＶｌａＤ活性及びＶｌａＢ活性を有する蛋白質が挙げられる。
［４］配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［５］配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｌａＤ活性及びＶｌａＢ活性を有する変異蛋白質。
［６］配列番号１０で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｌａＤ活性及びＶｌａＢ活性を有する相同蛋白質。
［４］配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［５］配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｌａＤ活性及びＶｌａＢ活性を有する変異蛋白質。
［６］配列番号１０で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｌａＤ活性及びＶｌａＢ活性を有する相同蛋白質。
【0020】
上記（２）［ＩＩ］に記載の蛋白質としては、以下の［７］～［９］のいずれか１つに記載のＶｌａＤ活性を有する蛋白質が挙げられる。
［７］配列番号１２、１４、１６又は１８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［８］配列番号１２、１４、１６又は１８で表されるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｌａＤ活性を有する変異蛋白質。
［９］配列番号１２、１４、１６又は１８で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｌａＤ活性を有する相同蛋白質。
［７］配列番号１２、１４、１６又は１８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［８］配列番号１２、１４、１６又は１８で表されるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｌａＤ活性を有する変異蛋白質。
［９］配列番号１２、１４、１６又は１８で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｌａＤ活性を有する相同蛋白質。
【0021】
上記（２）［ＩＩＩ］に記載の蛋白質としては、以下の［１０］～［１２］のいずれか１つに記載のＶｌａＢ活性を有する蛋白質が挙げられる。
［１０］配列番号２０、２２又は２４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［１１］配列番号２０、２２又は２４で表されるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｌａＢ活性を有する変異蛋白質。
［１２］配列番号２０、２２又は２４で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｌａＢ活性を有する相同蛋白質。
［１０］配列番号２０、２２又は２４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［１１］配列番号２０、２２又は２４で表されるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｌａＢ活性を有する変異蛋白質。
［１２］配列番号２０、２２又は２４で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｌａＢ活性を有する相同蛋白質。
【0022】
上記（３）に記載の蛋白質としては、以下の［１３］～［１５］のいずれか１つに記載のＶｌａＣ活性を有する蛋白質が挙げられる。
［１３］配列番号２６、２８、３０又は３２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［１４］配列番号２６、２８、３０又は３２で表されるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｌａＣ活性を有する変異蛋白質。
［１５］配列番号２６、２８、３０又は３２で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｌａＣ活性を有する相同蛋白質。
［１３］配列番号２６、２８、３０又は３２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
［１４］配列番号２６、２８、３０又は３２で表されるアミノ酸配列において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｌａＣ活性を有する変異蛋白質。
［１５］配列番号２６、２８、３０又は３２で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＶｌａＣ活性を有する相同蛋白質。
【0023】
変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失若しくは置換、又は該蛋白質中に人為的にアミノ酸残基を挿入若しくは付加して得られる蛋白質をいう。
【0024】
相同蛋白質とは、自然界に存在する生物が有する蛋白質であって、進化上の起源が同一の蛋白質に由来する一群の蛋白質をいう。相同蛋白質は、互いに構造及び機能が類似している。
【0025】
変異蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１～２０個、好ましくは１～１０個、最も好ましくは１～５個のアミノ酸が欠如、置換、挿入又は付加されていてもよい。
【0026】
欠失、置換、挿入又は付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システイン等が挙げられる。
【0027】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、о－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、о－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
【0028】
上記の変異蛋白質のアミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されているＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮを使用して塩基配列を解析する場合は、パラメータは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。またＢＬＡＳＴＸを使用してアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐ ｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【0029】
上記の変異蛋白質又は相同蛋白質がＶｌａＡ活性、ＶｌａＤ活性及び／若しくはＶｌａＢ活性、又はＶｌａＣ活性を有していることは、例えば以下の方法により確認することができる。例えば、変異蛋白質又は相同蛋白質がＶｌａＡ活性を有していることを確認するためには、まず、後述の方法により、上記活性を確認しようとする変異蛋白質又は相同蛋白質、並びに、上記（２）及び（３）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡを作製する。次に、該組換え体ＤＮＡで、バリオールアミン生成活性を有さない微生物、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株を形質転換して得られる微生物を培養し、得られる培養物から該蛋白質を含む細胞抽出液を調製する。得られた細胞抽出液を基質であるセドヘプツロース－７－リン酸を含む水溶液と接触させる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のバリオールアミンを検出することにより、変異蛋白質又は相同蛋白質が、ＶｌａＡ活性を有することを確認することができる。以下、ＶｌａＤ活性及び／若しくはＶｌａＢ活性、又はＶｌａＣ活性についても同様の方法で確認することができる。
【0030】
親株はいずれの微生物であってもよいが、好ましくは原核生物又は酵母菌株を、より好ましくはエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属若しくはシュードモナス属等に属する原核生物、又はサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属若しくはキャンディダ属等に属する酵母菌株を、最も好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｃｏｄｏｎ ｐｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（メルクミリポア社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０４ ｄａｍ－／ｄｃｍ－、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＭＨ７１－１８ ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ（ＡＴＣＣ９６３７）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４若しくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ－０１１０等の原核生物、又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ若しくはＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ等の酵母菌株を挙げることができる。
【0031】
また親株として、糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する能力を人工的に付与又は強化した育種株も、好適に用いることができる。
【0032】
親株として用いる微生物に、糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する能力を人工的に付与又は強化する方法としては、（ａ）糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する生合成経路を抑制する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法、（ｂ）糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する生合成経路に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、（ｃ）糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する生合成経路に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、及び（ｄ）糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する生合成経路から該目的物質以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法、などを挙げることができ、上記公知の方法は単独又は組み合わせて用いることができる。
【0033】
上記、セドヘプツロース－７－リン酸を生成する能力を付与又は強化する方法の具体例としては、後述の６－ホスホフルクトキナーゼ活性を低下又は喪失させる方法等を挙げることができる。
【0034】
糖からセドヘプツロース－７－リン酸を生成する能力が付与又は強化された微生物であることは、育種株と親株をそれぞれ培地に培養し、セドヘプツロース－７－リン酸の生成量を比較することにより確認することができる。
【0035】
上記（１）～（３）に記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物としては、以下の（４）～（６）に記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもバリオールアミン生成活性が増強された微生物を挙げることができる。
【0036】
（４）以下の［１６］～［１９］のいずれか１つに記載のＶｌａＡ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［１６］上記（１）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［１７］配列番号１、３、５又は７で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［１８］配列番号１、３、５又は７で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶｌａＡ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［１９］配列番号１、３、５又は７で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ＶｌａＡ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［１６］上記（１）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［１７］配列番号１、３、５又は７で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［１８］配列番号１、３、５又は７で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶｌａＡ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［１９］配列番号１、３、５又は７で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ＶｌａＡ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【0037】
（５）以下の［ＩＶ］～［ＶＩ］に記載のＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ。
【0038】
［ＩＶ］以下の［２０］～［２３］のいずれかに記載の、ＶｌａＤ活性及びＶｌａＢ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［２０］上記（２）［Ｉ］に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２１］配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［２２］配列番号９で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶｌａＤ活性及びＶｌａＢ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２３］配列番号９で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ＶｌａＤ活性及びＶｌａＢ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２０］上記（２）［Ｉ］に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２１］配列番号９で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［２２］配列番号９で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶｌａＤ活性及びＶｌａＢ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２３］配列番号９で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ＶｌａＤ活性及びＶｌａＢ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【0039】
［Ｖ］以下の［２４］～［２７］のいずれかに記載のＶｌａＤ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［２４］上記（２）［ＩＩ］に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２５］配列番号１１、１３、１５又は１７で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［２６］配列番号１１、１３、１５又は１７で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶｌａＤ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２７］配列番号１１、１３、１５又は１７で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ＶｌａＤ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２４］上記（２）［ＩＩ］に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２５］配列番号１１、１３、１５又は１７で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［２６］配列番号１１、１３、１５又は１７で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶｌａＤ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２７］配列番号１１、１３、１５又は１７で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ＶｌａＤ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【0040】
［ＶＩ］以下の［２８］～［３１］のいずれかに記載のＶｌａＢ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［２８］上記（２）［ＩＩＩ］に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２９］配列番号１９、２１又は２３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［３０］配列番号１９、２１又は２３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶｌａＢ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［３１］配列番号１９、２１又は２３で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ＶｌａＢ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［２８］上記（２）［ＩＩＩ］に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２９］配列番号１９、２１又は２３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［３０］配列番号１９、２１又は２３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶｌａＢ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［３１］配列番号１９、２１又は２３で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ＶｌａＢ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【0041】
（６）以下の［３２］～［３５］のいずれか１つに記載のＶｌａＣ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
［３２］上記（３）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［３３］配列番号２５、２７、２９又は３１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［３４］配列番号２５、２７、２９又は３１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶｌａＣ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［３５］配列番号２５、２７、２９又は３１で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ＶｌａＣ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［３２］上記（３）に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［３３］配列番号２５、２７、２９又は３１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
［３４］配列番号２５、２７、２９又は３１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＶｌａＣ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
［３５］配列番号２５、２７、２９又は３１で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ＶｌａＣ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【0042】
上記（２）の［ＩＩ］及び［ＩＩＩ］記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物としては、上記（５）の［Ｖ］及び［ＶＩ］記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株を形質転換して得られる、該親株よりもバリオールアミン生成活性が増強された微生物を挙げることができる。
【0043】
上記において、ハイブリダイズするとは、特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズする工程である。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列は、ノーザン又はサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、又はＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。
【0044】
プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡを挙げることができ、プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡを挙げることができる。
【0045】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第４版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２））、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ（１９９４））、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ（１９９７））の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【0046】
また市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を挙げることができる。
【0047】
上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／Ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
【0048】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加又は変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
【0049】
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算した時に、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９及び３１で表される塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。
【0050】
上記（４）～（６）に記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡとは、（４）、（５）及び（６）に記載のＤＮＡを全て含む１つの組換え体ＤＮＡであってもよく、（４）、（５）及び（６）に記載のＤＮＡのうちの１つ又は２つを含む複数の組換え体ＤＮＡの組み合わせであってもよい。このような組換え体ＤＮＡとは、例えば、該ＤＮＡが親株において自律複製可能なＤＮＡであって、上記（４）～（６）のいずれか１以上に記載のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有している発現ベクターに、上記（４）～（６）のいずれか１以上に記載のＤＮＡが組み込まれているＤＮＡである。
【0051】
親株において染色体中への組込が可能なＤＮＡであって、上記（４）～（６）のいずれか１以上に記載のＤＮＡを有するＤＮＡもまた、上記（４）～（６）に記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡである。
【0052】
組換え体ＤＮＡが、親株の染色体ＤＮＡへの組込が可能なＤＮＡである場合は、プロモーターを含有していなくてもよい。
【0053】
細菌等の原核生物を親株として用いる場合は、親株において自律複製可能な組換え体ＤＮＡは、プロモーター、リボソーム結合配列、上記（４）～（６）のいずれか１以上に記載のＤＮＡ、及び転写終結配列により構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【0054】
リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節した組換え体ＤＮＡを用いることが好ましい。
【0055】
また、親株において自律複製可能な組換え体ＤＮＡにおいては、該ＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【0056】
親株にエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＵＣ１１８(いずれもタカラバイオ社製)、ｐＥＴ２１ａ、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもメルクミリポア社製）、ｐＭＡＬ－ｃ５ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ－１、ｐＴｒｃ９９Ａ（いずれもジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製)、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＳＥ２８０（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社製）、ｐＱＥ－３０、ｐＱＥ８０Ｌ（いずれもキアゲン社製）、ｐＥＴ－３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（－）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）]、ｐＴｒＳ３０ ［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９/ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０７）より調整］、ｐＴｒＳ３２［Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９/ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４０８）より調整］、ｐＴＫ３１［ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，２００７，Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ．２０，ｐ６３７８－６３８５］、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８/１２３４３）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＰＡ１（特開昭６３－２３３７９８号公報）等を挙げることができる。
【0057】
上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーターやｉｌｖプロモーター等のアミノ酸生合成に関与する遺伝子のプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、ｔｒｐプロモーターを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターを用いることもできる。
【0058】
親株にコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、又はミクロバクテリウム属に属する微生物等のコリネ型細菌を用いる場合は、例えば、ｐＣＧ１（特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（特開昭５７－１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（特開昭５７－１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも特開昭５８－１０５９９９号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３［いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９６，１７５（１９８４）］等を挙げることがきる。
【0059】
上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、又はミクロバクテリウム属に属する微生物等のコリネ型細菌の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、Ｐ５４－６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，ｐ６７４－６７９（２０００）］を用いることができる。
【0060】
親株に酵母菌株を用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を挙げることができる。
【0061】
上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターを挙げることができる。
【0062】
親株を上記組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる微生物とは、該組換え体ＤＮＡが、親株において自律複製可能なプラスミドとして導入されることにより、又は親株の染色体中に組み込まれることにより、該ＤＮＡが転写され、該ＤＮＡがコードする蛋白質を生産するようになった微生物をいう。
【0063】
上記（４）～（６）に記載のＤＮＡが転写されること、及び該ＤＮＡがコードする蛋白質を生産するようになったことを確認する方法としては、例えば該ＤＮＡの転写量をノーザン・ブロッティングにより、又は該タンパク質の生産量をウエスタン・ブロッティングにより測定し、親株のそれと比較することにより確認することができる。
【0064】
親株を、上記（４）～（６）に記載のＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで形質転換して得られる微生物は、以下の方法で造成することができる。
【0065】
上記（４）のＤＮＡのうち、［１］の配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、及び上記［１６］又は［１７］のＤＮＡのうち配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、配列番号１で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはＡｃｔｉｎｏｓｙｎｅｍａ属、より好ましくはＡｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ ｍｉｒｕｍ ＤＳＭ４３８２７株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、又は該塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた上記微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により取得することができる。
【0066】
同様に、上記（５）のＤＮＡのうち、（２）［Ｉ］の蛋白質をコードするＤＮＡ及び上記［２１］のＤＮＡは、例えば、配列番号９で表される塩基配列に基づいて取得することができる。同様に、上記（６）のＤＮＡのうち、（３）の配列番号２６で表される塩基配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、及び上記［３２］又は［３３］のＤＮＡのうち配列番号２５で表される塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、配列番号２５で表される塩基配列に基づいて取得することができる。
【0067】
上記（４）のＤＮＡのうち、［１］の配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、及び上記［１６］又は［１７］のＤＮＡのうち配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、配列番号３で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはＡｌｌｏｋｕｔｚｎｅｒｉａ属、より好ましくはＡｌｌｏｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂａｔａ ＪＣＭ９９１７株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、又は該塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた上記微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより取得することができる。
【0068】
同様に、上記（５）のＤＮＡのうち、（２）［ＩＩ］の配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、及び上記［２４］又は［２５］のＤＮＡのうち配列番号１１で表される塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、配列番号１１で表される塩基配列に基づいて取得することができる。同様に、上記（５）のＤＮＡのうち、（２）［ＩＩＩ］の配列番号２０で表される塩基配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、及び上記［２８］又は［２９］のＤＮＡのうち配列番１９で表される塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、配列番号１９で表される塩基配列に基づいて取得することができる。同様に、上記（６）のＤＮＡのうち、（３）の配列番号２８で表される塩基配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、及び上記［３２］又は［３３］のＤＮＡのうち配列番２７で表される塩基配列からなるＤＮＡもまた、例えば、配列番号２７で表される塩基配列に基づいて取得することができる。
【0069】
上記（４）のＤＮＡのうち、［１］の配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、及び上記［１６］又は［１７］のＤＮＡのうち配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、配列番号５で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、より好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｒｉｓｐｏｒｕｓ ＮＢＲＣ１００７６０株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、又は該塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた上記微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより取得することができる。
【0070】
同様に、上記（５）のＤＮＡのうち、（２）［ＩＩ］の配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、及び上記［２４］又は［２５］のＤＮＡのうち配列番号１３で表される塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、配列番号１３で表される塩基配列に基づいて取得することができる。同様に、上記（５）のＤＮＡのうち、（２）［ＩＩＩ］の配列番号２２で表される塩基配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、及び上記［２８］又は［２９］のＤＮＡのうち配列番２１で表される塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、配列番号２１で表される塩基配列に基づいて取得することができる。同様に、上記（６）のＤＮＡのうち、（３）の配列番号３０で表される塩基配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、及び上記［３２］又は［３３］のＤＮＡのうち配列番２９で表される塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、配列番号２９で表される塩基配列に基づいて取得することができる。
【0071】
上記（４）のＤＮＡのうち、［１］の配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、及び上記［１６］又は［１７］のＤＮＡのうち配列番号７で表される塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、配列番号７で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ属、より好ましくはＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ ＤＳＭ４３０４６株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、又は該塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた上記微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより取得することができる。
【0072】
同様に、上記（５）のＤＮＡのうち、（２）［ＩＩ］の配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、及び上記［２４］又は［２５］のＤＮＡのうち配列番号１５で表される塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、配列番号１５で表される塩基配列に基づいて取得することができる。同様に、上記（５）のＤＮＡのうち、（２）［ＩＩＩ］の配列番号２４で表される塩基配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、及び上記［２８］又は［２９］のＤＮＡのうち配列番２３で表される塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、配列番号２３で表される塩基配列に基づいて取得することができる。
【0073】
上記（５）のＤＮＡのうち、（２）［ＩＩ］の配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、及び上記［２４］又は［２５］のＤＮＡのうち配列番号１７で表される塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、配列番号１７で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、より好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、又は該塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた上記微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより取得することができる。
【0074】
上記（６）のＤＮＡのうち、（３）の配列番号３２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、及び上記［３２］又は［３３］のＤＮＡのうち配列番号３１で表される塩基配列からなるＤＮＡは、例えば、配列番号３１で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、より好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｒｃｈｏｒｕｓｉｉ ＮＢＲＣ１３０３２株の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、又は該塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた上記微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより取得することができる。
【0075】
Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ ｍｉｒｕｍ ＤＳＭ４３８２７株、Ａｌｌｏｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂａｔａ ＪＣＭ９９１７株、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｒｉｓｐｏｒｕｓ ＮＢＲＣ１００７６０株、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｒｃｈｏｒｕｓｉｉ ＮＢＲＣ１３０３２株、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ ＤＳＭ４３０４６株、及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（ＮＩＴＥ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ）又はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手することができる。
【0076】
上記（４）のＤＮＡのうち［２］の変異蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１、３、５又は７で表わされる塩基配列からなるＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得することができる。
【0077】
上記（５）のＤＮＡのうち［５］の変異蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号９で表わされる塩基配列からなるＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得することができる。
【0078】
前記（５）のＤＮＡのうち［８］の変異蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１１、１３、１５又は１７で表わされる塩基配列からなるＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得することができる。
【0079】
前記（５）のＤＮＡのうち［１１］の変異蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１９、２１又は２３で表わされる塩基配列からなるＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得することができる。
【0080】
前記（６）のＤＮＡのうち［１４］の変異蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号２５、２７、２９又は３１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡを鋳型としてエラープローンＰＣＲ等に供することにより取得することができる。
【0081】
また、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が挿入されるように設計した塩基配列をそれぞれの５’端に持つ１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲによる部位特異的変異導入法［Ｇｅｎｅ，７７，５１（１９８９）］によっても、上記の変異蛋白質をコードするＤＮＡを取得することができる。
【0082】
また、市販の部分特異的変異導入キットに付属した説明書に従うことによっても、該ＤＮＡを取得することができる。市販の部位特異的変異導入キットとしては、例えば、目的の変異を導入したい位置に変異（欠失、置換、挿入又は付加）を導入することができるＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｂａｓａｌ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を挙げることができる。
【0083】
すなわち、まず、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が導入されるように設計した塩基配列を有するプラスミドを鋳型に、５’側が１５塩基オーバーラップした一対の変異導入用プライマーを設計する。このとき、オーバーラップ部分には目的の変異を含む。次に、該変異導入用プライマーを用いて、目的の変異を導入したい塩基配列を有するプラスミドを鋳型にＰＣＲを行う。これにより得られた増幅断片を大腸菌に形質転換すると、目的の変異が導入された塩基配列を有するプラスミドを得ることができる。
【0084】
上記（４）のＤＮＡのうち［３］の相同蛋白質をコードするＤＮＡ、並びに上記［１８］及び［１９］のＤＮＡは、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１、３、５、又は７で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、または、各種の蛋白質配列データベースに対して配列番号２、４、６、又は８で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて設計することができるプローブＤＮＡ又はプライマーＤＮＡ、及び当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、上記のＤＮＡを取得する方法と同様のサザンハイブリダイゼーション又はＰＣＲを用いた方法等によって取得することができる。
【0085】
上記（５）のＤＮＡのうち［６］の相同蛋白質をコードするＤＮＡ、並びに上記［２２］及び［２３］のＤＮＡは、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号９で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、または、各種の蛋白質配列データベースに対して配列番号１０で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて設計することができるプローブＤＮＡ又はプライマーＤＮＡ、及び当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、上記のＤＮＡを取得する方法と同様のサザンハイブリダイゼーション又はＰＣＲを用いた方法等によって取得することができる。
【0086】
上記（５）のＤＮＡのうち［９］の相同蛋白質をコードするＤＮＡ、並びに上記［２６］及び［２７］のＤＮＡは、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１１、１３、１５、又は１７で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、または、各種の蛋白質配列データベースに対して配列番号１２、１４、１６、又は１８で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて設計することができるプローブＤＮＡ又はプライマーＤＮＡ、及び当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、上記のＤＮＡを取得する方法と同様のサザンハイブリダイゼーション又はＰＣＲを用いた方法等によって取得することができる。
【0087】
上記（５）のＤＮＡのうち［１２］の相同蛋白質をコードするＤＮＡ、並びに上記［３０］及び［３１］のＤＮＡは、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１９、２１、又は２３で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、または、各種の蛋白質配列データベースに対して配列番号２０、２２、又は２４で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて設計することができるプローブＤＮＡ又はプライマーＤＮＡ、及び当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、上記のＤＮＡを取得する方法と同様のサザンハイブリダイゼーション又はＰＣＲを用いた方法等によって取得することができる。
【0088】
上記（６）のＤＮＡのうち［１５］の相同蛋白質をコードするＤＮＡ、並びに上記［３４］及び［３５］のＤＮＡは、例えば、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号２５、２７、２９、又は３１で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を検索し、または、各種の蛋白質配列データベースに対して配列番号２６、２８、３０、又は３２で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて設計することができるプローブＤＮＡ又はプライマーＤＮＡ、及び当該ＤＮＡを有する微生物を用いて、上記のＤＮＡを取得する方法と同様のサザンハイブリダイゼーション又はＰＣＲを用いた方法等によって取得することができる。
【0089】
取得した上記（４）～（６）に記載のＤＮＡは、そのまま、あるいは適当な制限酵素等で切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］、あるいはアプライド・バイオシステムズ３５００ジェネティックアナライザやアプライド・バイオシステムズ３７３０ＤＮＡアナライザ（いずれもサーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
【0090】
ＤＮＡの塩基配列を決定する際に用いることができる宿主細胞としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０８Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＳＴ０４ ｄａｍ－／ｄｃｍ―、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＣＪ２３６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＭＨ７１－１８ ｍｕｔＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＶ１１８４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴＨ２（いずれもタカラバイオ社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２－Ｂｌｕｅ（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２等を挙げることができる。
【0091】
上記のベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ（＋）、ｐＰＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫ（＋）（いずれもアジレント・テクノロジー社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（メルクミリポア社製）、ｐＣＲＩＩ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）、ｐＣＲ－ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）、及びｐＤＩＲＥＣＴ［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，６０６９（１９９０）］等を挙げることができる。
【0092】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３－２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等を挙げることができる。
【0093】
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
【0094】
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより、目的とするＤＮＡを調製することもできる。
【0095】
ここで、該ＤＮＡの塩基配列を宿主での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、該ＤＮＡがコードする蛋白質の発現量を向上させることもできる。本発明の製造方法に用いられる親株におけるコドン使用頻度の情報は、公共のデータベースを通じて入手することができる。
【0096】
上記のようにして調製したＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、本発明の製造方法に用いられる微生物が有する組換え体ＤＮＡを作製することができる。
【0097】
このような組換え体ＤＮＡの例としては、実施例において後述するｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４、ｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１９０－ＳＤＭ＿１９１７６－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４、ｐＴｒｃ９９Ａ－ＷＰ＿０２０５５００１０－ＷＰ＿０２０５５００１４－ＷＰ＿０２０５５００１３－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４、ｐＴｒｃ９９Ａ－ＢＡＬ８８４３５－ＢＡＬ８８４３８－ＢＡＬ８８４３９－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４、ｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１９０－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４、ｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１７６－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４、及びｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＰｔｓＧ－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４等を挙げることができる。
【0098】
組換え体ＤＮＡを親株において自律複製可能なプラスミドとして導入させる方法としては、例えば、上記のカルシウムイオンを用いる方法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法等の方法を挙げることができる。
【0099】
上記の方法で造成した微生物が、上記（１）～（３）に記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物であることは、例えば、親株と造成した微生物をそれぞれ培地に培養し、バリオールアミンの生成量を比較することにより、確認することができる。
【0100】
このような微生物の例としては、実施例において後述するＷ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株、Ｗ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株、Ｗ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１９０－ＳＤＭ＿１９１７６－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株、Ｗ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－ＷＰ＿０２０５５００１０－ＷＰ＿０２０５５００１４－ＷＰ＿０２０５５００１３－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株、Ｗ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－ＢＡＬ８８４３５－ＢＡＬ８８４３８－ＢＡＬ８８４３９－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株、Ｗ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１９０－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株、Ｗ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１７６－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株、及びＷ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＰｔｓＧ－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株を挙げることができる。
【0101】
組換え体ＤＮＡを親株の染色体中に組み込む方法としては、相同組換え法を挙げることができる。相同組換え法としては、例えば導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法を挙げることができる。また、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで頻用される相同組換えを利用した方法としては、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え体ＤＮＡを導入する方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４１－６６４５（２０００）］を挙げることができる。
【0102】
さらに、組換え体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）によって大腸菌がスクロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異ｒｐｓＬ遺伝子を有する大腸菌に野生型ｒｐｓＬ遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性になることを利用した選択法［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５，１３７（２００５）、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，２９０５（２００７）］等を用いて、親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が組換え体ＤＮＡに置換された微生物を取得することができる。
【0103】
本発明の組換え微生物が有する（１）～（３）に記載の蛋白質のうち、その親株（宿主株）が元来有する蛋白質である場合は、当該蛋白質の発現が増強した微生物である。蛋白質の発現が増強した微生物は、該蛋白質をコードする遺伝子の転写量又は該蛋白質の生産量を、突然変異処理法、部分特異的な変異導入、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて、増強させることにより得ることができる。
【0104】
組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法は、親株が有する（１）～（３）に記載の蛋白質をそれぞれコードする遺伝子の転写調節領域及びプロモーター領域、例えば該蛋白質の開始コドンの上流側２００ｂｐ、好ましくは１００ｂｐの塩基配列を有するＤＮＡを試験管内における変異処理、又はエラープローンＰＣＲ等に供することにより該ＤＮＡに変異を導入した後、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する上記（１）～（３）に記載の蛋白質をそれぞれコードする遺伝子と、上記の相同組換え法を用いて置換する方法を挙げることができる。
【0105】
突然変異処理法としては、例えば、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の変異剤を用いる方法（微生物実験マニュアル、１９８６年、１３１頁、講談社サイエンティフィック社）、紫外線照射法等を挙げることができる。ここで、突然変異が導入される親株は、元来（１）～（３）に記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物であってよく、また、上記遺伝子導入によって得られた（１）～（３）に記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物であってよい。
【0106】
部分特異的変異導入方法としては、例えば、親株が有する（１）～（３）に記載の蛋白質をそれぞれコードする遺伝子の転写調節領域及びプロモーター領域、例えば該蛋白質の開始コドンの上流側２００ｂｐ、好ましくは１００ｂｐの塩基配列を有するＤＮＡに、目的の変異（欠失、置換、挿入又は付加）が挿入されるように設計した塩基配列をそれぞれの５’端に持つ１組のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲによる部位特異的変異導入法［Ｇｅｎｅ，７７，５１（１９８９）］によって行うことができる。部分特異的変異導入方法の具体的な手順及び市販の部分特異的変異導入キットは上述のとおりである。ここで、部分特異的変異が導入される親株は、元来（１）～（３）に記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物であってよく、また、上記遺伝子導入によって得られた（１）～（３）に記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物であってよい。
【0107】
２．本発明のバリオールアミンの製造方法
本発明のバリオールアミンの製造方法としては、上記１の微生物を培地に培養し、培養物中にバリオールアミンを生成、蓄積させ、該培養物からバリオールアミンを採取することを特徴とする、バリオールアミンの製造方法を挙げることができる。
本発明のバリオールアミンの製造方法としては、上記１の微生物を培地に培養し、培養物中にバリオールアミンを生成、蓄積させ、該培養物からバリオールアミンを採取することを特徴とする、バリオールアミンの製造方法を挙げることができる。
【0108】
バリオールアミンは、図１に示す構造式を有する化合物であり、物質名が４－アミノ－３，４－ジデオキシ－２－Ｃ－（ヒドロキシメチル）－Ｄ－ｅｐｉ－イノシトールであり、ＣＡＳ番号が８３４６５－２２－９である。バリオールアミンは、α－グルコシダーゼ阻害活性を有し、肥満、糖尿病等の予防、治療薬として有用である。
【0109】
上記１の微生物を培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【0110】
該微生物を培養する培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素原、無機塩類等を含有し、該微生物の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地と合成培地のいずれを用いてもよい。
【0111】
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプン若しくはデンプン加水分解物等の糖、グルコン酸、酢酸若しくはプロピオン酸等の有機酸、又は、グリセロール、エタノール若しくはプロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
【0112】
窒素原としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム又はリン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕、大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等を用いることができる。
【0113】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を使用することができる。
【0114】
培養は、通常、振盪培養又は深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。
【0115】
培養温度は、通常１５～４０℃であり、培養時間は、通常５時間～７日間である。培養中の培養液ｐＨは、通常３．０～９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
【0116】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【0117】
上記の培養により、培養物中にバリオールアミンを生成、蓄積させ、該培養物からバリオールアミンを採取することにより、バリオールアミンを製造することができる。
【0118】
得られたバリオールアミンは、ＨＰＬＣやＬＣ－ＭＳ等を用いて分析することができる。上記の培養物からのバリオールアミンの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
【0119】
３．本発明のボグリボースの製造方法
本発明のボグリボースの製造方法としては、上記２の方法でバリオールアミン製造し、得られたバリオールアミンを原料として、還元型アミノ化反応によりボグリボースを生成し、反応液からボグリボースを採取することを特徴とする、ボグリボースの製造方法を挙げることができる。
本発明のボグリボースの製造方法としては、上記２の方法でバリオールアミン製造し、得られたバリオールアミンを原料として、還元型アミノ化反応によりボグリボースを生成し、反応液からボグリボースを採取することを特徴とする、ボグリボースの製造方法を挙げることができる。
【0120】
ボグリボースは、下記の構造式を有する化合物であり、物質名が（１Ｓ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－５－（１，３－ジヒドロキシプロパン－２－イルアミノ）－１－（ヒドロキシメチル）シクロヘキサン－１，２，３，４－テトラオールであり、ＣＡＳ番号が８３４８０－２９－９である。ボグリボースは、バリオールアミンのアミノ基にグリセリンが縮合した構造を有する化合物である。ボグリボースは、α－グルコシダーゼ阻害活性を有し、糖尿病の治療に用いられる。
【化1】
【0121】
まず、前記２で製造したバリオールアミンを、有機溶媒、好ましくはメタノールに溶解する。次に、酢酸などの有機酸、１，３－ジヒドロキシアセトンダイマー及び２－ピコリンボランを加えて撹拌することにより、ボグリボースを製造することができる。
このとき、撹拌時の温度は１０～５０℃、好ましくは２０～４０℃が望ましい。撹拌時間は１～１０時間、好ましくは２～５時間が望ましい。
このとき、撹拌時の温度は１０～５０℃、好ましくは２０～４０℃が望ましい。撹拌時間は１～１０時間、好ましくは２～５時間が望ましい。
【0122】
得られたボグリボースは、ＨＰＬＣやＬＣ－ＭＳ等を用いて分析することができる。反応液中からのボグリボースの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法によって行うことができる。
【0123】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例0124】
［分析例］
実施例において、バリオールアミンの分析、定量、及び解析は以下に示す手順で行った。
実施例において、バリオールアミンの分析、定量、及び解析は以下に示す手順で行った。
【0125】
（１）Ｆｍｏｃ－Ｃｌを用いた誘導体化
培養後のバリオールアミンを含む培養液を１２０００回転で５分間遠心分離し、得られた培養上清を超純水にて１０倍に希釈した。希釈した培養上清１５μＬと１００ｍＭホウ酸ナトリウム水溶液（ｐＨ９.０）２８５μＬを混合し、さらに、１．５ｍｇ／Ｌのクロロギ酸フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ－Ｃｌ）のアセトン溶液３００μＬを加えて一分間激しく混合した。その後、当該混合液を４０分間静置した。静置後、さらに２５％アセトニトリル／２５０ｍＭ ホウ酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．５）６００μＬを加えて一分間激しく混合し、該溶液を分析サンプルとした。
培養後のバリオールアミンを含む培養液を１２０００回転で５分間遠心分離し、得られた培養上清を超純水にて１０倍に希釈した。希釈した培養上清１５μＬと１００ｍＭホウ酸ナトリウム水溶液（ｐＨ９.０）２８５μＬを混合し、さらに、１．５ｍｇ／Ｌのクロロギ酸フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ－Ｃｌ）のアセトン溶液３００μＬを加えて一分間激しく混合した。その後、当該混合液を４０分間静置した。静置後、さらに２５％アセトニトリル／２５０ｍＭ ホウ酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．５）６００μＬを加えて一分間激しく混合し、該溶液を分析サンプルとした。
【0126】
（２）ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析
分析サンプルは、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析系を用いて以下に示す条件により分析及び定量した。バリオールアミンの標品は、カルボシンス社より購入した。
分析サンプルは、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ分析系を用いて以下に示す条件により分析及び定量した。バリオールアミンの標品は、カルボシンス社より購入した。
【0127】
［ＬＣ分析］
カラム：ＰｏｒｏｓｈｅｌｌＥＣ－Ｃ１８ ２．７μｍ ３．０×１００ｍｍ（アジレント テクノロジーズ社製）
カラム温度：４０℃
移動相：（移動相Ａ）終濃度が０．１％であるギ酸を含む水
（移動相Ｂ）終濃度が０．１％であるギ酸を含むアセトニトリル
流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
移動相Ａと移動相Ｂの混合比：
（ ０～１２分） ８０：２０から１０：９０の勾配
（１２～１４分） １０：９０
（１４～１５分） １０：９０から８０：２０の勾配
（１５～２２分） ８０：２０
カラム：ＰｏｒｏｓｈｅｌｌＥＣ－Ｃ１８ ２．７μｍ ３．０×１００ｍｍ（アジレント テクノロジーズ社製）
カラム温度：４０℃
移動相：（移動相Ａ）終濃度が０．１％であるギ酸を含む水
（移動相Ｂ）終濃度が０．１％であるギ酸を含むアセトニトリル
流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
移動相Ａと移動相Ｂの混合比：
（ ０～１２分） ８０：２０から１０：９０の勾配
（１２～１４分） １０：９０
（１４～１５分） １０：９０から８０：２０の勾配
（１５～２２分） ８０：２０
【0128】
［ＥＳＩ－ＭＳ分析］
シングル四重極ＬＣＭＳシステム Ａｇｉｌｅｎｔ ６１２０(アジレントテクノロジー社製)を組み合わせたシステムを用いた。検出は、バリオールアミンのＦｍｏｃ化体のプロトン付加体の質量に相当するｍ／ｚ ４１６について、シングルイオンモニタリング（ＳＩＭ）により行った。
シングル四重極ＬＣＭＳシステム Ａｇｉｌｅｎｔ ６１２０(アジレントテクノロジー社製)を組み合わせたシステムを用いた。検出は、バリオールアミンのＦｍｏｃ化体のプロトン付加体の質量に相当するｍ／ｚ ４１６について、シングルイオンモニタリング（ＳＩＭ）により行った。
【0129】
［実施例１］バリオールアミン生成活性が増強した微生物の造成１
（１）遺伝子欠損の際にマーカーとして用いるＤＮＡ断片の取得
表１の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、表１の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
（１）遺伝子欠損の際にマーカーとして用いるＤＮＡ断片の取得
表１の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、表１の「鋳型」に記載されたＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
【表1】
【0130】
バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、枯草菌）１６８株のゲノムＤＮＡは定法により調製した。増幅ＤＮＡ断片のｃａｔは、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチル転移酵素）遺伝子の上流約２００ｂｐから下流約１００ｂｐを含む。増幅ＤＮＡ断片のｓａｃＢは、ｓａｃＢ（レバンシュークラーゼ）遺伝子の上流約３００ｂｐから下流約１００ｂｐを含む。配列番号３４及び３６で表わされる塩基配列からなるＤＮＡにはＳａｌＩ認識サイトが付与されている。
【0131】
増幅ＤＮＡ断片のｃａｔ及びｓａｃＢを制限酵素ＳａｌＩで切断し、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ.２（タカラバイオ社製）を用いて連結した。該連結反応液を鋳型とし、配列番号３３及び３５で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、ｃａｔ遺伝子及びｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ（以下、ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
【0132】
（２）ホスホフルクトキナーゼ活性が喪失した大腸菌の造成
ホスホフルクトキナーゼをコードするＤＮＡ（以下、ｐｆｋＡ遺伝子という。）を欠損した大腸菌を、以下の方法で造成した。
ホスホフルクトキナーゼをコードするＤＮＡ（以下、ｐｆｋＡ遺伝子という。）を欠損した大腸菌を、以下の方法で造成した。
【0133】
定法により調製したエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、大腸菌）Ｗ３１１０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表２の「プライマーセット」で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、各ＤＮＡ断片を増幅した。
【表2】
【0134】
ｐｆｋＡ上流１及びｐｆｋＡ上流２は、ｐｆｋＡ遺伝子の開始コドンからその上流約１０００ｂｐを含む。ｐｆｋＡ下流１及びｐｆｋＡ下流２は、ｐｆｋＡ遺伝子の終止コドンからその下流約１０００ｂｐを含む。
【0135】
ｐｆｋＡ上流１、ｐｆｋＡ下流１、及びｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号４３及び４４で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｐｆｋＡ周辺領域にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入された配列からなるＤＮＡ（以下、ｐｆｋＡ：：ｃａｔ－ｓａｃＢという。）断片を得た。
【0136】
ｐｆｋＡ上流２、ｐｆｋＡ下流２を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号４３及び４４で表わされる塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットに用いてＰＣＲを行い、ｐｆｋＡを含まず、ｐｆｋＡ上流とｐｆｋＡ下流が直接連結した配列からなるＤＮＡ（以下、ΔｐｆｋＡという。）断片を得た。
【0137】
ｐｆｋＡ：：ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を、λリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＤ４６［Ｄａｔｓｅｎｋｏ, Ｋ.Ａ., Ｗａｒｎｅｒ, Ｂ.Ｌ., Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ, Ｖｏｌ. ９７. ６６４０－６６４５（２０００）］を保持するエシェリヒア・コリ Ｗ３１１０株に、エレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール耐性、かつスクロース感受性を示した形質転換体（ｐｆｋＡ遺伝子がｐｆｋＡ：：ｃａｔ－ｓａｃＢに置換された形質転換体）を得た。
【0138】
ΔｐｆｋＡ断片を、当該形質転換体にエレクトロポレーション法により導入し、クロラムフェニコール感受性かつスクロース耐性を示した形質転換体（ｐｆｋＡ：：ｃａｔ－ｓａｃＢがΔｐｆｋＡに置換した形質転換体）を得た。さらに、ｐＫＤ４６が脱落した形質転換体を得た。当該微生物をＷ３１１０ΔｐｆｋＡと命名した。
【0139】
（３）バリオールアミン生合成遺伝子群の発現が増強した微生物の造成
Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ ｍｉｒｕｍ由来のバリオールアミン生合成候補遺伝子（ｖｌａＡ及びｖｌａＤＢ）を配置した該遺伝子発現用プラスミド、及び、Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ ｍｉｒｕｍ、Ａｌｌｏｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂａｔａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｒｉｓｐｏｒｕｓ又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｒｃｈｏｒｕｓｉｉ由来のｖｌａＣ遺伝子をそれぞれ配置した各該遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を以下の方法で造成した。
Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ ｍｉｒｕｍ由来のバリオールアミン生合成候補遺伝子（ｖｌａＡ及びｖｌａＤＢ）を配置した該遺伝子発現用プラスミド、及び、Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ ｍｉｒｕｍ、Ａｌｌｏｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂａｔａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｒｉｓｐｏｒｕｓ又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｒｃｈｏｒｕｓｉｉ由来のｖｌａＣ遺伝子をそれぞれ配置した各該遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を以下の方法で造成した。
【0140】
Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ ｍｉｒｕｍ ＤＳＭ４３８２７株を周知の培養方法により培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。配列番号４５及び４６で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、ＶｌａＡ蛋白質Ａｍｉｒ＿２０００（配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【0141】
同様に、配列番号４７及び４８で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＶｌａＤＢ蛋白質Ａｍｉｒ＿２００１（配列番号１０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【0142】
得られたＡｍｉｒ＿２０００をコードするＤＮＡ断片及びＡｍｉｒ＿２００１をコードするＤＮＡ断片の混合物を鋳型に、配列番号４５及び４８で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、両断片を連結した。得られた断片を制限酵素ＳａｃＩ及びＫｐｎＩを用いて切断し、あらかじめ同様の制限酵素で処理した発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１を得た。
【0143】
続いて、Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ ｍｉｒｕｍ ＤＳＭ４３８２７ 株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号４９及び５０で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＶｌａＣ蛋白質Ａｍｉｒ＿１９９６（配列番号２６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩを用いて切断し、あらかじめ同様の制限酵素で処理した発現ベクターｐＳＴＶ２９（タカラバイオ社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＳＴＶ２９－Ａｍｉｒ＿１９９６を得た。
【0144】
同様に、定法により調製したＡｌｌｏｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂａｔａ ＪＣＭ９９１７株染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号５１及び５２で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＶｌａＣ蛋白質ＳＤＭ＿１９２６４（配列番号２８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。得られた断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩを用いて切断し、あらかじめ同じ制限酵素で処理した発現ベクターｐＳＴＶ２９（タカラバイオ社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＳＴＶ２９－ＳＤＭ＿１９２６４を得た。
【0145】
同様に、定法により調製したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｒｉｓｐｏｒｕｓ ＮＢＲＣ１００７６０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号５３及び５４で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＶｌａＣ蛋白質ＷＰ＿０２０５５００１８（配列番号３０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩを用いて切断し、あらかじめ同様の制限酵素で処理した発現ベクターｐＳＴＶ２９（タカラバイオ社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＳＴＶ２９－ＷＰ＿０２０５５００１８を得た。
【0146】
同様に、定法により調製したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｒｃｈｏｒｕｓｉｉ ＮＢＲＣ１３０３２株株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号５５及び５６で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＶｌａＣ蛋白質ＫＵＮ１５３６６（配列番号３２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩを用いて切断し、あらかじめ同様の制限酵素で処理した発現ベクターｐＳＴＶ２９（タカラバイオ社製）に連結することにより、発現プラスミドｐＳＴＶ２９－ＫＵＮ１５３６６を得た。
【0147】
ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＳＴＶ２９、上記で造成したｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１、ｐＳＴＶ２９－Ａｍｉｒ＿１９９６、ｐＳＴＶ２９－ＳＤＭ＿１９２６４、ｐＳＴＶ２９－ＷＰ＿０２０５５００１８及びｐＳＴＶ２９－ＫＵＮ１５３６６を用いて、上記（２）で造成したＷ３１１０株ΔｐｆｋＡを形質転換することで、表３に示す６種類の組換え微生物を造成した。
【表3】
【0148】
（４）バリオールアミンの製造
上記（３）で得られたＷ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ，ｐＳＴＶ２９株、Ｗ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１，ｐＳＴＶ２９株、Ｗ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１，ｐＳＴＶ２９－Ａｍｉｒ＿１９９６株、Ｗ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１，ｐＳＴＶ２９－ＳＤＭ＿１９２６４株、Ｗ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１，ｐＳＴＶ２９－ＷＰ＿０２０５５００１８株及びＷ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１，ｐＳＴＶ２９－ＫＵＮ１５３６６株をそれぞれＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、１００ｍｇ/Ｌのアンピシリン及び３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１８時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を生産培地［グルコース２０ｇ/Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ/Ｌ、カザミノ酸５ｇ/Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ/Ｌ、クエン酸１ｇ/Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ/Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ/Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ/Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ/Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ/Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ７．２に調製した後オートクレーブし、炭素源及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後に混合した）］が４ｍＬ入った太型試験管に０．０８ｍＬ植菌し、３０℃で７時間培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、さらに３０℃で４１時間、振盪培養した。
上記（３）で得られたＷ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ，ｐＳＴＶ２９株、Ｗ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１，ｐＳＴＶ２９株、Ｗ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１，ｐＳＴＶ２９－Ａｍｉｒ＿１９９６株、Ｗ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１，ｐＳＴＶ２９－ＳＤＭ＿１９２６４株、Ｗ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１，ｐＳＴＶ２９－ＷＰ＿０２０５５００１８株及びＷ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１，ｐＳＴＶ２９－ＫＵＮ１５３６６株をそれぞれＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、１００ｍｇ/Ｌのアンピシリン及び３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１８時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を生産培地［グルコース２０ｇ/Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ/Ｌ、カザミノ酸５ｇ/Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ/Ｌ、クエン酸１ｇ/Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ/Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ/Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ/Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ/Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ/Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ７．２に調製した後オートクレーブし、炭素源及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後に混合した）］が４ｍＬ入った太型試験管に０．０８ｍＬ植菌し、３０℃で７時間培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、さらに３０℃で４１時間、振盪培養した。
【0149】
培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を除去し、上清に含まれるバリオールアミンをＦｍｏｃ(東京化成工業社製)にて誘導体化し、ＨＰＬＣ－ＭＳにて分析した。
【0150】
結果を表４に示す。
【表4】
【0151】
表４に示すように、Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ ｍｉｒｕｍに由来するＶｌａＡ（Ａｍｉｒ＿２０００）、ＶｌａＤＢ（Ａｍｉｒ＿２００１）及びＶｌａＣ（Ａｍｉｒ＿１９９６）蛋白質の活性が増強した微生物を用いることで、バリオールアミンを製造できることが分かった。また、Ａｍｉｒ＿１９９６の代替として、Ａｌｌｏｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂａｔａ由来ＳＤＭ＿１９２６４、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｒｉｓｐｏｒｕｓ由来ＷＰ＿０２０５５００１８、又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｒｃｈｏｒｕｓｉｉ由来ＫＵＮ１５３６６を用いることでもバリオールアミンの製造が可能であり、特にＡｌｌｏｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂａｔａ由来ＳＤＭ＿１９２６４を用いた場合に、高いバリオールアミン生産性を示すことが分かった。
【0152】
［実施例２］バリオールアミン生成活性が増強した微生物の造成２
（１）バリオールアミン生合成遺伝子群の発現が増強した微生物の造成
Ａｌｌｏｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂａｔａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｒｉｓｐｏｒｕｓ又はＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ由来のバリオールアミン生合成候補遺伝子（ｖｌａＡ及びｖｌａＤＢ、或いは、ｖｌａＡ、ｖｌａＤ及びｖｌａＢ）、並びに、Ａｌｌｏｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂａｔａ由来のｖｌａＣ遺伝子を配置した該遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を以下の方法で造成した。
（１）バリオールアミン生合成遺伝子群の発現が増強した微生物の造成
Ａｌｌｏｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂａｔａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｒｉｓｐｏｒｕｓ又はＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ由来のバリオールアミン生合成候補遺伝子（ｖｌａＡ及びｖｌａＤＢ、或いは、ｖｌａＡ、ｖｌａＤ及びｖｌａＢ）、並びに、Ａｌｌｏｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂａｔａ由来のｖｌａＣ遺伝子を配置した該遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を以下の方法で造成した。
【0153】
実施例１（３）で取得したＡｌｌｏｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂａｔａ ＪＣＭ９９１７株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号５７及び５８で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＶｌａＣ蛋白質ＳＤＭ＿１９２６４（配列番号２８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。得られた断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩを用いて切断し、あらかじめ同様の制限酵素で処理した発現ベクターｐＴｒＳ３１に連結することにより、発現プラスミドｐＴｒＳ３１－ＳＤＭ＿１９２６４を得た。
【0154】
続いて、配列番号５９及び６０で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、ｐＴｒＳ３１－ＳＤＭ＿１９２６４を鋳型にＰＣＲを行い、トリプトファン生合成遺伝子群のプロモーター領域（Ｐｔｒｐ）配列とＳＤＭ＿１９２６４をコードするＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片（Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４）を増幅した。
【0155】
得られたＰｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ (タカラバイオ社製)を用いて、実施例１（３）で造成した発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１のＸｂａＩ及びＰｓｔＩ部位に導入することにより、発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を得た。
【0156】
次に、実施例１（３）で取得したＡｌｌｏｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂａｔａ ＪＣＭ９９１７株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号６１及び６２で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＶｌａＡ蛋白質ＳＤＭ＿１８９３５（配列番号４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【0157】
同様に、配列番号６３及び６４で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＶｌａＤ蛋白質ＳＤＭ＿１９１９０（配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）とＶｌａＢ蛋白質ＳＤＭ＿１９１７６（配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【0158】
また、上記で造成した、ｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を鋳型として、配列番号６５及び６６で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ｐＴｒｃ９９Ａ配列とＰｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を含むＤＮＡ断片を増幅した。
【0159】
上記で得られたＳＤＭ＿１８９３５をコードするＤＮＡ断片、ＳＤＭ＿１９１９０とＳＤＭ＿１９１７６をコードするＤＮＡ断片、及び、ｐＴｒｃ９９Ａ配列とＰｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を含むＤＮＡ断片を、Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ (タカラバイオ社製)を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１９０－ＳＤＭ＿１９１７６－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を得た。
【0160】
次に、実施例１（３）で取得したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｒｉｓｐｏｒｕｓ ＮＢＲＣ１００７６０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号６７及び６８で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＶｌａＡ蛋白質ＷＰ＿０２０５５００１０（配列番号６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【0161】
同様に、配列番号６９及び７０で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＶｌａＤ蛋白質ＷＰ＿０２０５５００１４（配列番号１４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）とＶｌａＢ蛋白質ＷＰ＿０２０５５００１３（配列番号２２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【0162】
上記で得られたＷＰ＿０２０５５００１０をコードするＤＮＡ断片、ＷＰ＿０２０５５００１４とＷＰ＿０２０５５００１３をコードするＤＮＡ断片、及び、上述のｐＴｒｃ９９Ａ配列とＰｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を含むＤＮＡ断片を、Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ (タカラバイオ社製)を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ－ＷＰ＿０２０５５００１０－ＷＰ＿０２０５５００１４－ＷＰ＿０２０５５００１３－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を得た。
【0163】
次に、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ ＤＳＭ４３０４６株を周知の方法で培養し、該微生物の染色体ＤＮＡを単離した。当該染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号７１及び７２で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＶｌａＡ蛋白質ＢＡＬ８８４３５（配列番号８で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【0164】
同様に、配列番号７３及び７４で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＶｌａＤ蛋白質ＢＡＬ８８４３８（配列番号１６で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）とＶｌａＢ蛋白質ＢＡＬ８８４３９（配列番号２４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【0165】
上記で得られたＢＡＬ８８４３５をコードするＤＮＡ断片、ＢＡＬ８８４３８とＢＡＬ８８４３９をコードするＤＮＡ断片、及び、上述のｐＴｒｃ９９Ａ配列とＰｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を含むＤＮＡ断片を、Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ (タカラバイオ社製)を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ－ＢＡＬ８８４３５－ＢＡＬ８８４３８－ＢＡＬ８８４３９－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を得た。
【0166】
上記で造成したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４、ｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１９０－ＳＤＭ＿１９１７６－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４、ｐＴｒｃ９９Ａ－ＷＰ＿０２０５５００１０－ＷＰ＿０２０５５００１４－ＷＰ＿０２０５５００１３－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４、及びｐＴｒｃ９９Ａ－ＢＡＬ８８４３５－ＢＡＬ８８４３８－ＢＡＬ８８４３９－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を用いて、実施例１（２）で造成したＷ３１１０株ΔｐｆｋＡを形質転換することで、表５に示す４種類の組換え微生物を新たに造成した。
（２）バリオールアミンの製造
上記（１）で造成したＷ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株、Ｗ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１９０－ＳＤＭ＿１９１７６－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株、Ｗ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－ＷＰ＿０２０５５００１０－ＷＰ＿０２０５５００１４－ＷＰ＿０２０５５００１３－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株、及びＷ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－ＢＡＬ８８４３５－ＢＡＬ８８４３８－ＢＡＬ８８４３９－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株を、それぞれＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、１００ｍｇ/Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１８時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を生産培地［グルコース２０ｇ/Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ/Ｌ、カザミノ酸５ｇ/Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ/Ｌ、クエン酸１ｇ/Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ/Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ/Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ/Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ/Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ/Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ７．２に調製した後オートクレーブし、炭素源及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後に混合した）］が４ｍＬ入った太型試験管に０．０８ｍＬ植菌し、３０℃で７時間培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、さらに３０℃で４１時間、振盪培養した。
【表5】
（２）バリオールアミンの製造
上記（１）で造成したＷ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株、Ｗ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１９０－ＳＤＭ＿１９１７６－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株、Ｗ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－ＷＰ＿０２０５５００１０－ＷＰ＿０２０５５００１４－ＷＰ＿０２０５５００１３－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株、及びＷ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－ＢＡＬ８８４３５－ＢＡＬ８８４３８－ＢＡＬ８８４３９－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株を、それぞれＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、１００ｍｇ/Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１８時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を生産培地［グルコース２０ｇ/Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ/Ｌ、カザミノ酸５ｇ/Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ/Ｌ、クエン酸１ｇ/Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ/Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ/Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ/Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ/Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ/Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ７．２に調製した後オートクレーブし、炭素源及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後に混合した）］が４ｍＬ入った太型試験管に０．０８ｍＬ植菌し、３０℃で７時間培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、さらに３０℃で４１時間、振盪培養した。
【0167】
培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を除去し、上清に含まれるバリオールアミンをＦｍｏｃ(東京化成工業社製)にて誘導体化し、ＨＰＬＣ－ＭＳにて分析した。
【0168】
結果を表６に示す。
【表6】
【0169】
表６より、Ａｍｉｒ＿２０００の代替として、Ａｍｉｒ＿２０００の相同蛋白質であるＡｌｌｏｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂａｔａ由来ＳＤＭ＿１８９３５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｒｉｓｐｏｒｕｓ由来ＷＰ＿０２０５５００１０又はＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ由来ＢＡＬ８８４３５を、Ａｍｉｒ＿２００１の代替として、Ａｍｉｒ＿２００１の相同蛋白質であるＡｌｌｏｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂａｔａ由来ＳＤＭ＿１９１９０及びＳＤＭ＿１９１７６、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｒｉｓｐｏｒｕｓ由来ＷＰ＿０２０５５００１４及びＷＰ＿０２０５５００１３、又は、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ由来ＢＡＬ８８４３８及びＢＡＬ８８４３９を用いた場合にも、バオールアミンを製造できることが分かった。
【0170】
［実施例３］Ｗ３１１０野生株を宿主とするバリオールアミン生産菌の造成
（１）バリオールアミン生合成遺伝子群の発現が増強した微生物の造成
上記、実施例２（２）で造成したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株を形質転換することで、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を新たに造成した。
（１）バリオールアミン生合成遺伝子群の発現が増強した微生物の造成
上記、実施例２（２）で造成したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株を形質転換することで、Ｗ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を新たに造成した。
【0171】
（２）バリオールアミンの製造
上記実施例２（１）で造成したＷ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株、及び上記で造成したＷ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株を、それぞれＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、１００ｍｇ/Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１８時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を生産培地［グルコース２０ｇ/Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ/Ｌ、カザミノ酸５ｇ/Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ/Ｌ、クエン酸１ｇ/Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ/Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ/Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ/Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ/Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ/Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ７．２に調製した後オートクレーブし、炭素源及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後に混合した）］が４ｍＬ入った太型試験管に０．０８ｍＬ植菌し、３０℃で７時間培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、さらに３０℃で４１時間、振盪培養した。
上記実施例２（１）で造成したＷ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株、及び上記で造成したＷ３１１０／ｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株を、それぞれＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、１００ｍｇ/Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１８時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を生産培地［グルコース２０ｇ/Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ/Ｌ、カザミノ酸５ｇ/Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ/Ｌ、クエン酸１ｇ/Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ/Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ/Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ/Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ/Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ/Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ７．２に調製した後オートクレーブし、炭素源及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後に混合した）］が４ｍＬ入った太型試験管に０．０８ｍＬ植菌し、３０℃で７時間培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、さらに３０℃で４１時間、振盪培養した。
【0172】
培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を除去し、上清に含まれるバリオールアミンをＦｍｏｃ(東京化成工業社製)にて誘導体化し、ＨＰＬＣ－ＭＳにて分析した。
【0173】
結果を表７に示す。
【表7】
【0174】
表７より、Ｗ３１１０野生株を宿主として用いた場合も、バリオールアミンの製造が可能であることが分かった。
【0175】
［実施例４］バリオールアミン生産におけるＶｌａＤ又はＶｌａＢの有効性評価
（１）バリオールアミン生合成遺伝子群の発現が増強した微生物の造成
Ａｌｌｏｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂａｔａ由来ｖｌａＡ、ｖｌａＣ、及び、ｖｌａＤ若しくはｖｌａＢを配置した該遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を以下の方法で造成した。
（１）バリオールアミン生合成遺伝子群の発現が増強した微生物の造成
Ａｌｌｏｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂａｔａ由来ｖｌａＡ、ｖｌａＣ、及び、ｖｌａＤ若しくはｖｌａＢを配置した該遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を以下の方法で造成した。
【0176】
実施例１（３）で取得したＡｌｌｏｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂａｔａ ＪＣＭ９９１７株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号６１及び６２で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＶｌａＡ蛋白質ＳＤＭ＿１８９３５（配列番号４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【0177】
同様に、配列番号６３及び７５で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして、当該染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＶｌａＤ蛋白質ＳＤＭ＿１９１９０（配列番号１２で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【0178】
また、実施例２（１）で取得したｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を鋳型として、配列番号６５及び６６で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ｐＴｒｃ９９Ａ配列とＰｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を含むＤＮＡ断片を増幅した。
【0179】
上記で得られたＳＤＭ＿１８９３５をコードするＤＮＡ断片、ＳＤＭ＿１９１９０をコードするＤＮＡ断片、及び、ｐＴｒｃ９９Ａ配列とＰｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を含むＤＮＡ断片を、Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ (タカラバイオ社製)を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１９０－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を得た。
【0180】
次に、実施例１（３）で取得したＡｌｌｏｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂａｔａ ＪＣＭ９９１７株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号７６及び６４で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＶｌａＢ蛋白質ＳＤＭ＿１９１７６（配列番号２０で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【0181】
上記で得られたＳＤＭ＿１８９３５をコードするＤＮＡ断片、ＳＤＭ＿１９１７６をコードするＤＮＡ断片、及び、ｐＴｒｃ９９Ａ配列とＰｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を含むＤＮＡ断片を、Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ (タカラバイオ社製)を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１７６－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を得た。
【0182】
上記で造成したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１９０－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４及びｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１７６－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を用いて、実施例１（２）で造成したＷ３１１０株ΔｐｆｋＡを形質転換することで、表８に示す２種類の組換え微生物を新たに造成した。
【表8】
【0183】
（２）バリオールアミンの製造
上記実施例２（１）で造成したＷ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１９０－ＳＤＭ＿１９１７６－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株、並びに、上記で造成したＷ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１９０－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株及びＷ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１７６－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株を、それぞれＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、１００ｍｇ/Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１８時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を生産培地［グルコース２０ｇ/Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ/Ｌ、カザミノ酸５ｇ/Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ/Ｌ、クエン酸１ｇ/Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ/Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ/Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ/Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ/Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ/Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ７．２に調製した後オートクレーブし、炭素源及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後に混合した）］が４ｍＬ入った太型試験管に０．０８ｍＬ植菌し、３０℃で７時間培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、さらに３０℃で４１時間、振盪培養した。
上記実施例２（１）で造成したＷ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１９０－ＳＤＭ＿１９１７６－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株、並びに、上記で造成したＷ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１９０－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株及びＷ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１７６－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株を、それぞれＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、１００ｍｇ/Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１８時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を生産培地［グルコース２０ｇ/Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ/Ｌ、カザミノ酸５ｇ/Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ/Ｌ、クエン酸１ｇ/Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ/Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ/Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ/Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ/Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ/Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ７．２に調製した後オートクレーブし、炭素源及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後に混合した）］が４ｍＬ入った太型試験管に０．０８ｍＬ植菌し、３０℃で７時間培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、さらに３０℃で４１時間、振盪培養した。
【0184】
培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を除去し、上清に含まれるバリオールアミンをＦｍｏｃ(東京化成工業社製)にて誘導体化し、ＨＰＬＣ－ＭＳにて分析した。
【0185】
結果を表９に示す。
【表9】
【0186】
表９より、ＶｌａＤ蛋白質ＳＤＭ＿１９１９０又はＶｌａＢ蛋白質ＳＤＭ＿１９１７６どちらか一方を欠失した場合でも、バリオールアミンの生産が可能であることが分かった。
【0187】
［実施例５］リン酸化酵素の代替検討
（１）バリオールアミン生合成遺伝子群の発現が増強した微生物の造成
実施例４で造成したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１９０－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４上の、リン酸化酵素として機能するＶｌａＤ蛋白質ＳＤＭ＿１９１９０を大腸菌由来のＰｔｓＧに置換した該遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を以下の方法で造成した。
（１）バリオールアミン生合成遺伝子群の発現が増強した微生物の造成
実施例４で造成したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１９０－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４上の、リン酸化酵素として機能するＶｌａＤ蛋白質ＳＤＭ＿１９１９０を大腸菌由来のＰｔｓＧに置換した該遺伝子発現用プラスミドを有する大腸菌を以下の方法で造成した。
【0188】
実施例１（３）で取得したＡｌｌｏｋｕｔｚｎｅｒｉａ ａｌｂａｔａ ＪＣＭ９９１７株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号６１及び６２で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＶｌａＡ蛋白質ＳＤＭ＿１８９３５（配列番号４で表わされるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。
【0189】
次に、定法により調製したエシェリヒア・コリ Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号７７及び７８で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ＰｔｓＧ（配列番号１８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質）をコードするＤＮＡ断片を増幅した。なお、ＰｔｓＧはＶｌａＤ蛋白質ではないが、ＶｌａＤ蛋白質活性を有する蛋白質である。
【0190】
また、実施例２（１）で取得したｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を鋳型として、配列番号６５及び６６で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしてＰＣＲを行い、ｐＴｒｃ９９Ａ配列とＰｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を含むＤＮＡ断片を増幅した。
【0191】
上記で得られたＳＤＭ＿１８９３５をコードするＤＮＡ断片、ＰｔｓＧをコードするＤＮＡ断片、及び、ｐＴｒｃ９９Ａ配列とＰｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を含むＤＮＡ断片を、Ｉｎ－ＦｕｓｉｏｎＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ (タカラバイオ社製)を用いて連結することにより、発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＰｔｓＧ－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４を得た。
【0192】
上記で造成したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＰｔｓＧ－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ１９２６４を用いて、実施例１（２）で造成したＷ３１１０株ΔｐｆｋＡを形質転換することで、Ｗ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＰｔｓＧ－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株を新たに造成した。
【0193】
（２）バリオールアミンの製造
実施例４（１）で造成したＷ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１９０－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株、及び上記で造成したＷ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＰｔｓＧ－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株を、それぞれＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、１００ｍｇ/Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１８時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を生産培地［グルコース２０ｇ/Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ/Ｌ、カザミノ酸５ｇ/Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ/Ｌ、クエン酸１ｇ/Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ/Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ/Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ/Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ/Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ/Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ７．２に調製した後オートクレーブし、炭素源及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後に混合した）］が４ｍＬ入った太型試験管に０．０８ｍＬ植菌し、３０℃で７時間培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、さらに３０℃で４１時間、振盪培養した。
実施例４（１）で造成したＷ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＳＤＭ＿１９１９０－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株、及び上記で造成したＷ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－ＳＤＭ＿１８９３５－ＰｔｓＧ－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株を、それぞれＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、１００ｍｇ/Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１８時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を生産培地［グルコース２０ｇ/Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ/Ｌ、カザミノ酸５ｇ/Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ/Ｌ、クエン酸１ｇ/Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ/Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ/Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ/Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ/Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ/Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ７．２に調製した後オートクレーブし、炭素源及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後に混合した）］が４ｍＬ入った太型試験管に０．０８ｍＬ植菌し、３０℃で７時間培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、さらに３０℃で４１時間、振盪培養した。
【0194】
培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を除去し、上清に含まれるバリオールアミンをＦｍｏｃ(東京化成工業社製)にて誘導体化し、ＨＰＬＣ－ＭＳにて分析した。
【0195】
結果を表１０に示す。
【表10】
【0196】
表１０より、ＶｌａＤ蛋白質ＳＤＭ＿１９１９０の代替として、大腸菌由来のＰｔｓＧを用いることができることを示した。
【0197】
［実施例６］ボグリボースの製造方法
（１）中間体バリオールアミンの製造
実施例２（１）で造成したＷ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株をＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、１００ｍｇ/Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１８時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を生産培地［グルコース２０ｇ/Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ/Ｌ、カザミノ酸５ｇ/Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ/Ｌ、クエン酸１ｇ/Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ/Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ/Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ/Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ/Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ/Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ７．２に調製した後オートクレーブし、炭素源及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後に混合した）］が５０ｍＬ入ったバッフル付き三角フラスコ（３００ｍＬ容量）に１ｍＬ植菌し、３０℃で７時間培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、さらに３０℃で１７、２５、又は４１時間、振盪培養した。
（１）中間体バリオールアミンの製造
実施例２（１）で造成したＷ３１１０ΔｐｆｋＡ／ｐＴｒｃ９９Ａ－Ａｍｉｒ＿２０００－Ａｍｉｒ＿２００１－Ｐｔｒｐ－ＳＤＭ＿１９２６４株をＬＢプレート上で３０℃にて一晩培養し、１００ｍｇ/Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬが入った太型試験管に植菌して、３０℃で１８時間、振盪培養した。その後、得られた培養液を生産培地［グルコース２０ｇ/Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇ/Ｌ、カザミノ酸５ｇ/Ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ/Ｌ、クエン酸１ｇ/Ｌ、リン酸二水素カリウム１４ｇ/Ｌ、リン酸水素二カリウム１６ｇ/Ｌ、チアミン塩酸塩１０ｍｇ/Ｌ、硫酸第一鉄七水和物５０ｍｇ/Ｌ、硫酸マンガン五水和物１０ｍｇ/Ｌ（グルコース及び硫酸マグネシウム七水和物以外については、水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ７．２に調製した後オートクレーブし、炭素源及び硫酸マグネシウム七水和物含有水溶液は別途調製した後オートクレーブし、それぞれ冷却後に混合した）］が５０ｍＬ入ったバッフル付き三角フラスコ（３００ｍＬ容量）に１ｍＬ植菌し、３０℃で７時間培養した後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、さらに３０℃で１７、２５、又は４１時間、振盪培養した。
【0198】
培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を除去し、培養液上清に含まれるバリオールアミンをＦｍｏｃ(東京化成工業社製)にて誘導体化し、ＨＰＬＣ－ＭＳにて分析した。その結果、培養２４時間で２２．６ｍｇ／Ｌ、３２時間で５２．９ｍｇ／Ｌ、４８時間で１２２ｍｇ／Ｌのバリオールアミンを生産したことを確認した。
【0199】
（２）バリオールアミンの精製
上記（１）で取得したバリオールアミンを含む培養液から、バリオールアミンを単離、精製した。
上記（１）で取得したバリオールアミンを含む培養液から、バリオールアミンを単離、精製した。
【0200】
バリオールアミンを１１．４ｍｇ含有する培養後の培養液を遠心分離（５０００ｇ、１５分間）し、培養上清を得た。該培養上清をマイレクスフィルターユニット３３ｍｍ（メルクミリポア）でろ過滅菌した後、６Ｍの塩酸を用いて得られた濾液のｐＨを３．０に調整した。続いて、上記で得られた濾液をカチオン交換樹脂マラソンＣレジン１０ｍＬ（ダウケミカル社）に通液し、バリオールアミンを吸着させた後、水で洗浄してから０．５Ｍのアンモニア水を用いてバリオールアミンを溶出した。さらに、該溶出液をアニオン交換樹脂ＰＡ４１２レジン１０ｍＬ（三菱ケミカル社）に通液した。水で溶出した約７０ｍＬの溶出液を減圧濃縮機にて溶媒留去し、粗抽出物８９．４ｍｇを得た。ＬＣ－ＭＳ分析により、粗抽出物中にバリオールアミンが２．３ｍｇ含まれることを確認した。
【0201】
（３）バリオールアミンのＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析
以下に示す条件でＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析を実施し、粗精製したバリオールアミンが標品（カルボシンス社製）と一致することを確認した。
以下に示す条件でＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析を実施し、粗精製したバリオールアミンが標品（カルボシンス社製）と一致することを確認した。
【0202】
［ＬＣ］
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０－ＵＧ５ ４．６×１５０ｍｍ（野村化学社）
カラム温度：３０℃
移動相：（移動相Ａ）０．１ｖｏｌ％ギ酸－蒸留水
（移動相Ｂ）０．１ｖｏｌ％ギ酸‐アセトニトリル
流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
移動相Ａと移動相Ｂの混合比：２：９８
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０－ＵＧ５ ４．６×１５０ｍｍ（野村化学社）
カラム温度：３０℃
移動相：（移動相Ａ）０．１ｖｏｌ％ギ酸－蒸留水
（移動相Ｂ）０．１ｖｏｌ％ギ酸‐アセトニトリル
流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
移動相Ａと移動相Ｂの混合比：２：９８
【0203】
［ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ］
分析にはトリプル四重極ＬＣＭＳ－８０４０(島津製作所)を用いた。バリオールアミンのプロトン付加体に相当するｍ／ｚ１９４をコリジョンエナジー－２５ｅＶで開裂させることで、ＭＳ／ＭＳスペクトルを得た。
分析にはトリプル四重極ＬＣＭＳ－８０４０(島津製作所)を用いた。バリオールアミンのプロトン付加体に相当するｍ／ｚ１９４をコリジョンエナジー－２５ｅＶで開裂させることで、ＭＳ／ＭＳスペクトルを得た。
【0204】
取得したバリオールアミンの粗抽出物を標品と比較した結果、スペクトルパターンが一致し、取得した化合物が確かにバリオールアミンであることを確認した。
【0205】
（４）バリオールアミンを用いたボグリボースの合成
取得したバリオールアミンと１，３－ジヒドロキシアセトンを用いた還元的アミノ化反応により、ボグリボースを合成した。
取得したバリオールアミンと１，３－ジヒドロキシアセトンを用いた還元的アミノ化反応により、ボグリボースを合成した。
【0206】
取得したバリオールアミンの粗抽出物０．９２ｍｇをメタノール（和光純薬）５４０μＬに溶解した。酢酸（和光純薬）６０μＬを加えた後、１，３－ジヒドロキシアセトンダイマー（東京化成）４．３ｍｇ、２－ピコリンボラン（純正化学）を加え、３０℃にて３時間撹拌した。
【0207】
得られた反応液を、実施例５（３）に記載の方法にてＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。ボグリボースのプロトン付加体に相当するｍ／ｚ２６８をコリジョンエナジー－２５ｅＶで開裂させることで、ＭＳ／ＭＳスペクトルを得た。
【0208】
分析結果をボグリボース標品（東京化成社製）の分析結果と比較した結果、保持時間及びＭＳスペクトルパターンが一致したことから、ボグリボースが合成されていることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【0209】
本発明により、新規に同定されたバリオールアミン生合成に関与する蛋白質を発現する微生物を用いた、効率的かつ簡便なバリオールアミン及びボグリボースの製造方法が提供される。
【図1】
【配列表】