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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022046703
(43)【公開日】2022-03-23
(54)【発明の名称】治療抗体の適用関連副反応の低減
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20220315BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20220315BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20220315BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20220315BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220315BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20220315BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20220315BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20220315BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220315BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20220315BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20220315BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20220315BHJP
A61P 25/18 20060101ALI20220315BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20220315BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20220315BHJP
A61P 25/20 20060101ALI20220315BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20220315BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20220315BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20220315BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220315BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20220315BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20220315BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46 ZNA
C07K16/18
C07K16/28
A61P25/00
A61P35/00
A61P27/02
A61P31/00
A61P31/12
A61P29/00
A61P9/10
A61P25/28
A61P25/08
A61P25/18
A61P3/00
A61P25/16
A61P25/20
A61P25/02
A61P25/14
A61P1/16
A61K39/395 N
C12N15/13
C12P21/08
【審査請求】有
【請求項の数】21
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2021214446
(22)【出願日】2021-12-28
(62)【分割の表示】P 2019563375の分割
【原出願日】2018-05-16
(31)【優先権主張番号】17171626.9
(32)【優先日】2017-05-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】特許業務法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】フィッシャー，イェンス
(72)【発明者】
【氏名】フレスクゴード，ペル－オーラ
(72)【発明者】
【氏名】イグレシアス，アントニオ
(72)【発明者】
【氏名】ニーヴェーナー，イェンス
(72)【発明者】
【氏名】ヴェーバー，フェリクス
(57)【要約】 （修正有）
【課題】中枢神経系の障害を処置するための治療抗体及びその使用を提供する。
【解決手段】抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター（１）抗体であり、ここで、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター（１）抗体が、脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬ対）、ヒトトランスフェリンレセプター（１）に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬ対）及びエフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域を有し、静脈内適用後の望ましくない体温低下が低減された、個体における抗脳ターゲット処置における使用のための、抗脳ターゲット治療剤が提供される。
【選択図】なし
【解決手段】抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター（１）抗体であり、ここで、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター（１）抗体が、脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬ対）、ヒトトランスフェリンレセプター（１）に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬ対）及びエフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域を有し、静脈内適用後の望ましくない体温低下が低減された、個体における抗脳ターゲット処置における使用のための、抗脳ターゲット治療剤が提供される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
患者における神経障害の処置における使用ための二重特異性抗体であって、
抗体は、
ｉ）Ｆｃ領域と、
ｉｉ）第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位と、
ｉｉｉ）第２の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する１つの結合部位とを含み、
ここで、処置は、投与後の副作用を低減し、ここで、投与は、静脈内、皮下又は筋肉内投与であり、ここで、副作用は、投与関連副作用であり、
ここで、副作用は、血管拡張、気管支収縮、喉頭浮腫、心圧低下および低体温からなる群より選択される１種以上である、
患者における神経障害の処置における使用ための二重特異性抗体。
抗体は、
ｉ）Ｆｃ領域と、
ｉｉ）第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位と、
ｉｉｉ）第２の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する１つの結合部位とを含み、
ここで、処置は、投与後の副作用を低減し、ここで、投与は、静脈内、皮下又は筋肉内投与であり、ここで、副作用は、投与関連副作用であり、
ここで、副作用は、血管拡張、気管支収縮、喉頭浮腫、心圧低下および低体温からなる群より選択される１種以上である、
患者における神経障害の処置における使用ための二重特異性抗体。
【請求項2】
投与が、注入によるものである、請求項１記載の患者における神経障害の処置における使用ための二重特異性抗体。
【請求項3】
処置が、第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する前記結合部位の１つ又は２つを欠く同じ抗体と比較して、投与後の副作用の低減を有する、請求項１又は２記載の患者における神経障害の処置における使用ための二重特異性抗体。
【請求項4】
第１のターゲットへの結合部位が両方とも、抗体重鎖のＮ末端にあり、第２のターゲットへの結合部位が、１つの抗体重鎖のＣ末端にある、請求項１～３のいずれか一項に記載の患者における神経障害の処置における使用ための二重特異性抗体。
【請求項5】
抗体が、
ｉ）第１の抗体軽鎖と第１の抗体重鎖とのペアと、
ｉｉ）第２の抗体軽鎖と第２の抗体重鎖とのペアと、
ｉｉｉ）ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、ｄＡｂフラグメント、ＤｕｔａＦａｂ及びＣｒｏｓｓＦａｂからなる群から選択される更なる抗体フラグメントとを含み、
ここで、ｉ）およびｉｉ）の抗体鎖のペアが、第１のターゲットに特異的に結合し、ｉｉｉ）の更なる抗体フラグメントが、第２のターゲットに特異的に結合する、請求項１～４のいずれか一項に記載の患者における神経障害の処置における使用ための二重特異性抗体。
ｉ）第１の抗体軽鎖と第１の抗体重鎖とのペアと、
ｉｉ）第２の抗体軽鎖と第２の抗体重鎖とのペアと、
ｉｉｉ）ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、ｄＡｂフラグメント、ＤｕｔａＦａｂ及びＣｒｏｓｓＦａｂからなる群から選択される更なる抗体フラグメントとを含み、
ここで、ｉ）およびｉｉ）の抗体鎖のペアが、第１のターゲットに特異的に結合し、ｉｉｉ）の更なる抗体フラグメントが、第２のターゲットに特異的に結合する、請求項１～４のいずれか一項に記載の患者における神経障害の処置における使用ための二重特異性抗体。
【請求項6】
ｉｉｉ）の更なる抗体フラグメントが、ｉ）又はｉｉ）の抗体重鎖のＣ末端に、直接又はペプチドリンカーを介してのいずれかでコンジュゲーションしている、請求項５記載の患者における神経障害の処置における使用ための二重特異性抗体。
【請求項7】
神経障害が、神経障害、アミロイドーシス、ガン、眼の疾患又は障害、ウイルス又は微生物の感染、炎症、虚血性疾患、神経変性疾患、てんかん発作、行動障害、リソソーム蓄積症、レビー小体病、ポストポリオ症候群、Ｓｈｙ－Ｄｒａｅｇｅｒ症候群、オリボポン小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体変性、タウオパシー、アルツハイマー病、核上性麻痺、プリオン病、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト－ヤコブ症候群、クールー病、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ－Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ病、慢性消耗性疾患及び致死的な家族性不眠症、球麻痺、運動ニューロン疾患、神経系不変性障害、カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥレット症候群、メンケス病、コッカイン症候群、ハレルヴォーデン－スパッツ症候群、ラフォラ病、レト症候群、肝臓病変性、レッシュ－ナイハン症候群、ウンベルリッヒ－ランドボルグ症候群、認知症、ピック病、脊髄小脳運動失調症、ＣＮＳ及び／又は脳のガン（体内の他の箇所のガンに起因する脳転移を含む）からなる群より選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の患者における神経障害の処置における使用ための二重特異性抗体。
【請求項8】
第１のターゲットが、ヒトＣＤ２０、ヒトタウタンパク質、リン酸化ヒトタウタンパク質、ヒトグルコセレブロシダーゼ、ヒトアルファ－シヌクレイン及びヒトアミロイドベータタンパク質からなる群より選択され、第２のターゲットが、ヒトトランスフェリンレセプター１である、請求項１～７のいずれか一項に記載の患者における神経障害の処置における使用ための二重特異性抗体。
【請求項9】
第１のターゲットが、ヒトタウタンパク質、リン酸化ヒトタウタンパク質、ヒトグルコセレブロシダーゼ、ヒトアルファ－シヌクレイン及びヒトアミロイドベータタンパク質からなる群より選択され、ここで、神経障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病及びタウオパシーからなる群より選択される、請求項８記載の患者における神経障害の処置における使用ための二重特異性抗体。
【請求項10】
結合部位が、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインペアである、請求項１～９のいずれか一項に記載の患者における神経障害の処置における使用ための二重特異性抗体。
【請求項11】
抗体が、エフェクター機能コンピテントＦｃ領域を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の患者における神経障害の処置における使用ための二重特異性抗体。
【請求項12】
患者への投与時に二重特異性抗体により誘発されるＡＤＣＣが、第１のターゲットに特異的に結合する１つの結合部位及び第２のターゲットに特異的に結合する１つの結合部位のみを有する二価の二重特異性抗体により誘発されるＡＤＣＣより低い、請求項１～１１のいずれか一項に記載の患者における神経障害の処置における使用ための二重特異性抗体。
【請求項13】
ＡＤＣＣが、１０倍以上低い、請求項１２記載の患者における神経障害の処置における使用ための二重特異性抗体。
【請求項14】
副作用が、低体温である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の患者における神経障害の処置における使用ための二重特異性抗体。
【請求項15】
低体温が、治療用量で０．５℃未満の体温低下に低減される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の患者における神経障害の処置における使用ための二重特異性抗体。
【請求項16】
体温の低下が、投与後６０分以内である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の患者における神経障害の処置における使用ための二重特異性抗体。
【請求項17】
ａ）抗体重鎖が、ヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｂ）抗体重鎖が、ヒトサブクラスＩｇＧ４の全長抗体重鎖であるか、
ｃ）抗体重鎖の１つが、突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であり、他の抗体重鎖が、突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｄ）両抗体重鎖が、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｅ）両抗体重鎖が、突然変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、又は
ｆ）両抗体重鎖が、突然変異Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ｈを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であり、ここで、ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドが、一方又は両方の重鎖に、独立して存在し又は存在しないことができ、
ここで、Ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドが、一方又は両方の重鎖に、それぞれ独立して存在し又は存在しないことができる、請求項３～１６のいずれか一項に記載の患者における神経障害の処置における使用ための二重特異性抗体。
ｂ）抗体重鎖が、ヒトサブクラスＩｇＧ４の全長抗体重鎖であるか、
ｃ）抗体重鎖の１つが、突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であり、他の抗体重鎖が、突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｄ）両抗体重鎖が、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｅ）両抗体重鎖が、突然変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、又は
ｆ）両抗体重鎖が、突然変異Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ｈを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であり、ここで、ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドが、一方又は両方の重鎖に、独立して存在し又は存在しないことができ、
ここで、Ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドが、一方又は両方の重鎖に、それぞれ独立して存在し又は存在しないことができる、請求項３～１６のいずれか一項に記載の患者における神経障害の処置における使用ための二重特異性抗体。
【請求項18】
患者における神経障害を処置するための方法であって、
前記患者に二重特異性抗体を投与することを含み、
ここで、抗体は、
ｉ）Ｆｃ領域と、
ｉｉ）第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位と、
ｉｉｉ）第２の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する１つの結合部位とを含み、
ここで、処置は、投与後の副作用を低減し、ここで、投与は、静脈内、皮下又は筋肉内投与であり、ここで、副作用は、投与関連副作用であり、
ここで、副作用は、血管拡張、気管支収縮、喉頭浮腫、心圧低下および低体温からなる群より選択される１種以上である、
方法。
前記患者に二重特異性抗体を投与することを含み、
ここで、抗体は、
ｉ）Ｆｃ領域と、
ｉｉ）第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位と、
ｉｉｉ）第２の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する１つの結合部位とを含み、
ここで、処置は、投与後の副作用を低減し、ここで、投与は、静脈内、皮下又は筋肉内投与であり、ここで、副作用は、投与関連副作用であり、
ここで、副作用は、血管拡張、気管支収縮、喉頭浮腫、心圧低下および低体温からなる群より選択される１種以上である、
方法。
【請求項19】
処置が、第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する前記結合部位の１つ又は２つを欠く同じ抗体と比較して、投与後の副作用の低減を有する、請求項１８記載の方法。
【請求項20】
投与が、注入によるものである、請求項１８又は１９記載の方法。
【請求項21】
注入速度が、≧５０ml/hである、請求項２０記載の方法。
【請求項22】
注入速度が、≧１００ml/hである、請求項２０記載の方法。
【請求項23】
注入速度が、≧１５０ml/hである、請求項２０記載の方法。
【請求項24】
第１のターゲットへの結合部位が両方とも、抗体重鎖のＮ末端にあり、第２のターゲットへの結合部位が、１つの抗体重鎖のＣ末端にある、請求項１８～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
抗体が、
ｉ）一対の第一抗体軽鎖および第一抗体重鎖と、
ｉｉ）一対の第２の抗体軽鎖および第２の抗体重鎖と、
ｉｉｉ）ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、ｄＡｂフラグメント、ＤｕｔａＦａｂおよびＣｒｏｓｓＦａｂからなる群から選択されるさらなる抗体フラグメントとを含み、
ここで、ｉ）およびｉｉ）の一対の抗体鎖が、第１のターゲットに特異的に結合し、ｉｉｉ）のさらなる抗体フラグメントが、第２のターゲットに特異的に結合する、請求項１８～２４のいずれか一項に記載の方法。
ｉ）一対の第一抗体軽鎖および第一抗体重鎖と、
ｉｉ）一対の第２の抗体軽鎖および第２の抗体重鎖と、
ｉｉｉ）ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、ｄＡｂフラグメント、ＤｕｔａＦａｂおよびＣｒｏｓｓＦａｂからなる群から選択されるさらなる抗体フラグメントとを含み、
ここで、ｉ）およびｉｉ）の一対の抗体鎖が、第１のターゲットに特異的に結合し、ｉｉｉ）のさらなる抗体フラグメントが、第２のターゲットに特異的に結合する、請求項１８～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
ｉｉｉ）のさらなる抗体フラグメントが、ｉ）又はｉｉ）の抗体重鎖のＣ末端に、直接又はペプチドリンカーを介してのいずれかでコンジュゲーションしている、請求項２５記載の方法。
【請求項27】
神経障害が、神経障害、アミロイドーシス、ガン、眼の疾患又は障害、ウイルス又は微生物の感染、炎症、虚血性疾患、神経変性疾患、てんかん発作、行動障害、リソソーム蓄積症、レビー小体病、ポストポリオ症候群、Ｓｈｙ－Ｄｒａｅｇｅｒ症候群、オリボポン小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体変性、タウオパシー、アルツハイマー病、核上性麻痺、プリオン病、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト－ヤコブ症候群、クールー病、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ－Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ病、慢性消耗性疾患及び致死的な家族性不眠症、球麻痺、運動ニューロン疾患、神経系不変性障害、カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥレット症候群、メンケス病、コッカイン症候群、ハレルヴォーデン－スパッツ症候群、ラフォラ病、レト症候群、肝臓病変性、レッシュ－ナイハン症候群、ウンベルリッヒ－ランドボルグ症候群、認知症、ピック病、脊髄小脳運動失調症、ＣＮＳ及び／又は脳のガン（体内の他の箇所のガンに起因する脳転移を含む）からなる群より選択される、請求項１８～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
第１のターゲットが、ヒトＣＤ２０、ヒトタウタンパク質、リン酸化ヒトタウタンパク質、ヒトグルコセレブロシダーゼ、ヒトアルファ－シヌクレイン及びヒトアミロイドベータタンパク質からなる群より選択され、第２のターゲットが、ヒトトランスフェリンレセプター１である、請求項１８～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
第１のターゲットが、ヒトタウタンパク質、リン酸化ヒトタウタンパク質、ヒトグルコセレブロシダーゼ、ヒトアルファ－シヌクレイン及びヒトアミロイドベータタンパク質からなる群より選択され、ここで、神経障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病及びタウオパシーからなる群より選択される、請求項１８～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
結合部位が、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインペアである、請求項１８～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
抗体が、エフェクター機能コンピテントＦｃ領域を含む、請求項１８～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
患者への投与時に二重特異性抗体により誘発されるＡＤＣＣが、第１のターゲットに特異的に結合する１つの結合部位及び第２のターゲットに特異的に結合する１つの結合部位のみを有する二価の二重特異性抗体により誘発されるＡＤＣＣより低い、請求項１８～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
ＡＤＣＣが、１０倍以上低い、請求項３２記載の方法。
【請求項34】
副作用が、低体温である、請求項１８～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
低体温が、治療用量で０．５℃未満の体温低下に低減される、請求項１８～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
体温の低下が、投与後６０分以内である、請求項１８～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
ａ）抗体重鎖が、ヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｂ）抗体重鎖が、ヒトサブクラスＩｇＧ４の全長抗体重鎖であるか、
ｃ）抗体重鎖の１つが、突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であり、他の抗体重鎖が、突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｄ）両抗体重鎖が、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｅ）両抗体重鎖が、突然変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、又は
ｆ）両抗体重鎖が、突然変異Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ｈを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であり、ここで、ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドが、一方又は両方の重鎖に、独立して存在し又は存在しないことができ、
ここで、Ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドが、一方又は両方の重鎖に、それぞれ独立して存在し又は存在しないことができる、請求項２５～３６のいずれか一項に記載の患者における神経障害の処置における使用ための二重特異性抗体。
ｂ）抗体重鎖が、ヒトサブクラスＩｇＧ４の全長抗体重鎖であるか、
ｃ）抗体重鎖の１つが、突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であり、他の抗体重鎖が、突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｄ）両抗体重鎖が、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｅ）両抗体重鎖が、突然変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、又は
ｆ）両抗体重鎖が、突然変異Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ｈを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であり、ここで、ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドが、一方又は両方の重鎖に、独立して存在し又は存在しないことができ、
ここで、Ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドが、一方又は両方の重鎖に、それぞれ独立して存在し又は存在しないことができる、請求項２５～３６のいずれか一項に記載の患者における神経障害の処置における使用ための二重特異性抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、中枢神経系の障害を処置するための治療抗体及びその使用に関する。
【0002】
背景
脳卒中、精神疾患、神経変性疾患、神経発達障害及び脳腫瘍を含む中枢神経系（ＣＮＳ）の障害は、世界の主要な障害原因である。従来のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用する努力が重ねられているが、血液脳関門（ＢＢＢ）は、有効な治療法の開発を妨げ続けている。その結果、ＢＢＢ問題を克服するための技術は、大きな注目を受けている（１、２）。今日、開発は、送達能力を反映する治療用量での脳における実質的な取り込み及び関連する活性を実証するのに焦点が当てられている。しかしながら、使用される技術が、医薬品開発に安全性の限界があるかどうかは、必ずしも明らかではない。この疑問に先行して取り組むことは、設計並びにタンパク質及び抗体工学がｍＡｂの脳への安全な送達を容易にすることができる態様を特定するのに重要である。
脳卒中、精神疾患、神経変性疾患、神経発達障害及び脳腫瘍を含む中枢神経系（ＣＮＳ）の障害は、世界の主要な障害原因である。従来のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用する努力が重ねられているが、血液脳関門（ＢＢＢ）は、有効な治療法の開発を妨げ続けている。その結果、ＢＢＢ問題を克服するための技術は、大きな注目を受けている（１、２）。今日、開発は、送達能力を反映する治療用量での脳における実質的な取り込み及び関連する活性を実証するのに焦点が当てられている。しかしながら、使用される技術が、医薬品開発に安全性の限界があるかどうかは、必ずしも明らかではない。この疑問に先行して取り組むことは、設計並びにタンパク質及び抗体工学がｍＡｂの脳への安全な送達を容易にすることができる態様を特定するのに重要である。
【0003】
ＢＢＢ送達は、輸送目的のために脳内皮細胞（ＢＥＣ）上に発現される天然のレセプターを利用する。特に、ヒトトランスフェリンレセプター（ＴｆＲ；ＴｆＲ１とも呼ばれる）が、ＢＢＢにおける顕著な発現のために、ＢＢＢ送達レセプターとして広く研究されてきた（３）。多くのグループが、ＢＢＢを横断する分子の送達のためのレセプター媒介トランスサイトーシス（ＲＭＴ）系としてＴｆＲを探求してきた（４～７）。ＢＢＢの生産的かつ効率的な通過を可能にするために、抗体を操作する近年の努力が、ますます注目されている（８～１１）。
【0004】
治療ターゲットに対する２つの結合部位（すなわち、治療ターゲットに対して二価である）及びＴｆＲに対する１つの結合部位（すなわち、ヒトトランスフェリンレセプター１に対して一価である）を有する二重特異性抗体を使用する脳シャトル（ＢＳ）技術を開発して、完全に機能的な、すなわち、治療ターゲット結合性でかつエフェクター機能コンピテントＩｇＧ構造を有するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の送達を可能にした。これは、１つのＢＳモジュールをｍＡｂの１つの重鎖のＣ末端に融合させることにより達成される。ＢＳモジュールを抗アミロイドベータｍＡｂ（Ａβ ｍＡｂ）に連結することにより、近年、脳暴露、ターゲット結合及び有効性の実質的な改善が実証された（９）。この増強された脳送達は、ＢＳ構築物のＴｆＲとの天然の一価の結合の直接的な結果であると仮定された。
【0005】
ＷＯ第２０１４／０３３０７４号には、血液脳関門上のレセプター（Ｒ／ＢＢＢ）に結合する血液脳関門シャトル及びその使用方法が開示されている。
【0006】
一価分子シャトルを使用する治療抗体の脳浸透及び効力の向上が、Niewoehner et al.（Neuron 81 (2014) 49-60; 9）により開示されている。
【0007】
発明の概要
本発明において、二重特異性治療モノクローナル抗体の適用関連副作用及び反応を低減するための方法が見出された。これは、Ｆｃγレセプター（ＦｃγＲ）への結合を立体的に抑制することにより達成される。一例は、中枢神経系及びヒトトランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）の障害に関連する治療ターゲットに特異的に結合する二重特異性治療抗体である。
本発明において、二重特異性治療モノクローナル抗体の適用関連副作用及び反応を低減するための方法が見出された。これは、Ｆｃγレセプター（ＦｃγＲ）への結合を立体的に抑制することにより達成される。一例は、中枢神経系及びヒトトランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）の障害に関連する治療ターゲットに特異的に結合する二重特異性治療抗体である。
【0008】
近年の研究において、ＴｆＲ（ＴｆＲ１）に対する従来のｍＡｂを使用して、以前に見落とされた責任が明らかにされた。急性の臨床徴候が、投与直後にマウスで観察され、これは、ｍＡｂのエフェクター機能状態に関連していた（１２）。また、これは、１つのＦａｂアームのみがＴｆＲ（ＴｆＲ１）に結合する二重特異性ｍＡｂを使用した場合にも観察された。ただし、ｍＡｂは、ネイティブで完全に活性なエフェクター機能を含んでいた。まとめると、ｍＡｂのエフェクター機能は、観察された急性臨床徴候に直接関連していると考えられる。したがって、明らかな回避戦略は、エフェクターデッド変異体を使用することであろう。しかしながら、特定のｍＡｂについては、ネイティブなエフェクター機能が、作用モード及び最適な治療プロファイルに重要である。
【0009】
ＴｆＲ（ＴｆＲ１）をターゲットとするＢＳ－ｍＡｂのＦｃ領域エフェクター機能が、ｍＡｂがＴｆＲ（ＴｆＲ１）に結合する（かつ同時に治療ターゲットには結合しない）場合にカモフラージュされるが、ｍＡｂがそのＣＮＳターゲットに結合する（かつ同時にＴｆＲ（ＴｆＲ１）には結合しない）場合には、ＢＳ－ｍＡｂのフォーマットに応じて活性に戻る、ネイティブなＩｇＧエフェクター機能の可能性のある初回注入反応（ＦＩＲ）責任に関して、新規なＦｃγＲ－ヒト化マウスモデルにおける脳シャトル－ｍＡｂ（ＢＳ－ｍＡｂ）系の異なるフォーマットのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ評価において、現在見出されている。
【0010】
この理論に拘束されるものではないが、ＦＩＲの観察されたフォーマット依存性は、免疫細胞上に位置するＦｃγＲへのＦｃ領域の結合／接近性に影響を及ぼす立体要因によると推定される。ＴｆＲ（ＴｆＲ１）がＢＳモジュールにより結合される場合、ＢＳ－ｍＡｂの反対側の末端の２つの天然のＦａｂアームは、ＢＳ－ｍＡｂのＦｃ領域のエフェクター細胞上のＦｃγＲへの必要とされる近接を妨げると仮定される。ＢＳ－ｍＡｂがＴｆＲ（ＴｆＲ１）から、例えば、ＣＮＳ実質中に放出され、常在するターゲットがネイティブな治療用ＩｇＧ Ｆａｂに結合すると、重鎖Ｃ末端における遊離ＢＳモジュールはもはや、リクルートされたエフェクター細胞上のＦｃγＲに影響を及ぼさず又は同ＦｃγＲとのＦｃ領域の相互作用を妨げない。
【0011】
このため、本明細書で伝達された教示は、ＢＢＢを横断して安全に輸送することができる完全なエフェクター機能性ｍＡｂの選択及び使用のための基礎を提供する。さらに、この基礎は、脳におけるｍＡｂ取り込みの増強に焦点を当てた将来のＴｆＲ（ＴｆＲ１）ターゲティング療法のための重要な考察に役立つ。本明細書において報告されたデータは、第１の細胞上のそれらの抗原に結合したｍＡｂ間の相互作用及び第２の細胞上のＦｃγＲへの結合における幾何学的形状に関する新規な教示を提供する。それにより、低減された初回注入反応（ＦＩＲ）を有する新規なｍＡｂ設計を提供し及び／又は選択することができる。
【0012】
本発明は、一態様において、疾患／障害の処置における望ましくない投与（注入）関連副作用（例えば、血管拡張、気管支収縮、喉頭浮腫、心圧低下及び特に、Ｆｃ領域エフェクター機能に関連する低体温）の低減のための、第１及び第２の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合し、特異的なフォーマットで（ネイティブな）エフェクター機能を有する、二重特異性抗体の使用に関する。ここで、該抗体は、第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬ対）と、第２の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬ対）と、エフェクター機能コンピテント、例えば、ネイティブなＦｃ領域とを有する。
【0013】
本発明は、一態様において、第１及び第２の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合し、特異的なフォーマットでの（ネイティブな）エフェクター機能を有する、二重特異性抗体を含む疾患の処置のための方法における使用のための治療組成物に関する。ここで、該抗体は、第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬ対）と、第２の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬ対）と、エフェクター機能コンピテント、例えば、ネイティブなＦｃ領域を有する。ここで、治療組成物は、Ｆｃ領域エフェクター機能に関連する望ましくない投与（注入）関連副作用（例えば、血管拡張、気管支収縮、喉頭浮腫、心圧低下及び特に、低体温）を低減させる。
【0014】
本発明は、一態様において、第１及び第２の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合し、特異的フォーマットでの（ネイティブな）エフェクター機能を有する二重特異性抗体を投与することにより、Ｆｃ領域エフェクター機能に関連する望ましくない投与（注入）関連副作用（例えば、血管拡張、気管支収縮、喉頭浮腫、心圧低下及び特に、低体温）を有する疾患を予防し及び／又は治療するのに使用するための、治療用二重特異性抗体を含む、医薬組成物に関する。ここで、該抗体は、第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬ対）と、第２の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬ対）と、エフェクター機能コンピテントＦｃ領域とを有する。
【0015】
本発明は、一態様において、患者における疾患の処置における使用ための二重特異性抗体であって、
二重特異性抗体は、
ｉ）（エフェクター機能コンピテント）Ｆｃ領域と、
ｉｉ）第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位と、
ｉｉｉ）第２の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する１つの結合部位とを含み、
ここで、処置は、投与後の副作用を低減し、
ここで、副作用は、血管拡張、気管支収縮、喉頭浮腫、心圧低下および低体温からなる群より選択される１種以上である、二重特異性抗体に関する。
二重特異性抗体は、
ｉ）（エフェクター機能コンピテント）Ｆｃ領域と、
ｉｉ）第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位と、
ｉｉｉ）第２の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する１つの結合部位とを含み、
ここで、処置は、投与後の副作用を低減し、
ここで、副作用は、血管拡張、気管支収縮、喉頭浮腫、心圧低下および低体温からなる群より選択される１種以上である、二重特異性抗体に関する。
【0016】
すなわち、本発明は、一態様において、患者における疾患の処置における使用ため及び投与後の副作用を低減するための二重特異性抗体であって、
二重特異性抗体は、
ｉ）（エフェクター機能コンピテント）Ｆｃ領域と、
ｉｉ）第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位と、
ｉｉｉ）第２の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する１つの結合部位とを含み、
ここで、副作用は、血管拡張、気管支収縮、喉頭浮腫、心圧低下および低体温からなる群より選択される１種以上である、二重特異性抗体に関する。
二重特異性抗体は、
ｉ）（エフェクター機能コンピテント）Ｆｃ領域と、
ｉｉ）第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位と、
ｉｉｉ）第２の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する１つの結合部位とを含み、
ここで、副作用は、血管拡張、気管支収縮、喉頭浮腫、心圧低下および低体温からなる群より選択される１種以上である、二重特異性抗体に関する。
【0017】
一実施態様において、第１のターゲットに特異的に結合する２つの結合部位及び第２のターゲットに特異的に結合する結合部位は、反対方向に配置される。すなわち、一方は、Ｆｃ領域のＮ末端にコンジュゲーションしており、他方は、Ｆｃ領域のＣ末端にコンジュゲーションしている。
【0018】
一実施態様において、第１の（細胞表面）ターゲットと第２の（細胞表面）ターゲットとは異なる。
【0019】
一実施態様において、第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する結合部位及び第２の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する結合部位は、反対側の末端に位置する（すなわち、第１のターゲットに特異的に結合する結合部位は両方とも／それぞれ、（全長）抗体重鎖のＮ末端にあり、第２のターゲットに特異的に結合する結合部位は、二重特異性抗体の（全長）抗体重鎖の１つのＣ末端にある。
【0020】
一実施態様において、第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する結合部位及び第２の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する結合部位は、二重特異性抗体の反対側の端部に位置する。すなわち、第１のターゲットに特異的に結合する結合部位の一方は、Ｆｃ領域の第１のＮ末端にコンジュゲーションしており、他方は、Ｆｃ領域の第２のＮ末端にコンジュゲーションしており、第２のターゲットに特異的に結合する結合部位は、Ｆｃ領域のＣ末端の一方にコンジュゲーションしている。
【0021】
一実施態様において、投与関連副作用は、注入関連副作用である。一実施態様において、注入関連副作用は、血管拡張、気管支収縮、喉頭浮腫、心圧低下及び低体温である。好ましい一実施態様では、注入関連副作用は、低体温である。
【0022】
一実施態様において、第２の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する結合部位は、ペプチドリンカーにより、第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する結合部位の１つに連結している。一実施態様において、ペプチドリンカーは、配列番号：３７又は３８のアミノ酸配列を有する。
【0023】
一実施態様において、第２の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する結合部位は、Ｆｃ領域内にあり、ここで、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン又はＣＨ４ドメインのいずれかの少なくとも１つの構造ループ領域は、第２の（細胞表面）ターゲットへの前記少なくとも１つの改変ループ領域の結合を可能にする少なくとも１つの改変を含み、ここで、未改変免疫グロブリン定常ドメインは、前記ターゲットに結合しない。
【0024】
一実施態様において、結合部位は、抗体重鎖可変ドメインと抗体軽鎖可変ドメインとのペアである。
【0025】
一実施態様において、二重特異性抗体は、
ｉ）第１の抗体軽鎖と第１の抗体重鎖とのペアと、
ｉｉ）第２の抗体軽鎖と第２の抗体重鎖とのペアと、
ｉｉｉ）ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、ｄＡｂフラグメント、ＤｕｔａＦａｂ及びＣｒｏｓｓＦａｂからなる群から選択される更なる抗体フラグメントとを含み、
ここで、ｉ）およびｉｉ）の抗体鎖のペアは、第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する結合部位を含み、ｉｉｉ）の更なる抗体フラグメントは、第２の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する結合部位を含む。
ｉ）第１の抗体軽鎖と第１の抗体重鎖とのペアと、
ｉｉ）第２の抗体軽鎖と第２の抗体重鎖とのペアと、
ｉｉｉ）ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、ｄＡｂフラグメント、ＤｕｔａＦａｂ及びＣｒｏｓｓＦａｂからなる群から選択される更なる抗体フラグメントとを含み、
ここで、ｉ）およびｉｉ）の抗体鎖のペアは、第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する結合部位を含み、ｉｉｉ）の更なる抗体フラグメントは、第２の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する結合部位を含む。
【0026】
一実施態様において、ｉｉｉ）の更なる抗体フラグメントは、第１の抗体重鎖又は第２の抗体重鎖のいずれかに、直接又はペプチドリンカーを介してのいずれかでコンジュゲーションしている。一実施態様において、ｉｉｉ）の更なる抗体フラグメントは、ｉ）又はｉｉ）の抗体重鎖のＣ末端に、直接又はペプチドリンカーを介してのいずれかでコンジュゲーションしている。一実施態様において、ペプチドリンカーは、配列番号：３７又は３８のアミノ酸配列を有する。一実施態様において、第１の抗体軽鎖及び第２の抗体軽鎖は、同じアミノ酸配列を有し、第１の抗体重鎖及び第２の抗体重鎖は、ヘテロ二量体化に必要な突然変異により異なる。一実施態様において、ヘテロ二量体化に必要な突然変異は、ノブ－ｉｎｔｏ－ホール突然変異である。一実施態様において、ｉｉｉ）の更なる抗体フラグメントにコンジュゲーションしていない抗体重鎖は、ｉ）Ｃ末端リシン残基又はｉｉ）Ｃ末端グリシン－リシンジペプチドを含まない。
【0027】
一実施態様において、第１のターゲットは、脳ターゲットであり、第２のターゲットは、ヒトトランスフェリンレセプターである。一実施態様において、第１のターゲットは、脳ターゲットであり、第２のターゲットは、ヒトトランスフェリンレセプター１である。
【0028】
一実施態様において、脳ターゲットは、ベータ－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、ヒトアミロイドベータ（Ａベータ）、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子レセプター２（ＨＥＲ２）、ヒトタウタンパク質、リン酸化ヒトタウタンパク質、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、ヒトアルファ－シヌクレイン、ヒトＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、デスレセプター６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィンレセプター（ｐ７５ＮＴＲ）及びカスパーゼ６からなる群より選択される。好ましい一実施態様では、脳ターゲットは、ヒトＣＤ２０、ヒトタウタンパク質、リン酸化ヒトタウタンパク質、ヒトアルファ－シヌクレイン及びヒトアミロイドベータタンパク質からなる群より選択される。好ましい一実施態様では、脳ターゲットはヒ、トアミロイドベータタンパク質である。一実施態様において、脳ターゲットは、配列番号：０１～０５から選択される。
【0029】
好ましい一実施態様では、本明細書で報告された全ての態様における二重特異性抗体は、
ｉ）ヒトＣＤ２０、ヒトタウタンパク質、リン酸化ヒトタウタンパク質、ヒトアルファ－シヌクレイン及びヒトアミロイドベータタンパク質からなる群より選択される脳ターゲットに特異的に結合する第１の結合部位を形成する、第１の軽鎖可変ドメイン及び第１の重鎖可変ドメインを含む第１の抗体軽鎖と第１の抗体重鎖とのペアと、
ｉｉ）第１の結合部位と同じ脳ターゲットに特異的に結合する第２の結合部位を形成する、第２の軽鎖可変ドメイン及び第２の重鎖可変ドメインを含む第２の抗体軽鎖と第２の抗体重鎖とのペアと、
ｉｉｉ）ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、ｄＡｂフラグメント、ＤｕｔａＦａｂ及びＣｒｏｓｓＦａｂからなる群より選択され、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に特異的に結合する第３の結合部位を形成する、第３の軽鎖可変ドメイン及び第３の重鎖可変ドメインを含む更なる抗体フラグメントと、
ｉｖ）（ヒトＩｇＧ１サブクラスの）（ヒト）エフェクター機能コンピテントＦｃ領域とを含み、
ここで、ｉｉｉ）の更なる抗体フラグメントは、ｉ）又はｉｉ）の抗体重鎖のＣ末端に、直接又はペプチドリンカーを介してのいずれかでコンジュゲーションしている。
ｉ）ヒトＣＤ２０、ヒトタウタンパク質、リン酸化ヒトタウタンパク質、ヒトアルファ－シヌクレイン及びヒトアミロイドベータタンパク質からなる群より選択される脳ターゲットに特異的に結合する第１の結合部位を形成する、第１の軽鎖可変ドメイン及び第１の重鎖可変ドメインを含む第１の抗体軽鎖と第１の抗体重鎖とのペアと、
ｉｉ）第１の結合部位と同じ脳ターゲットに特異的に結合する第２の結合部位を形成する、第２の軽鎖可変ドメイン及び第２の重鎖可変ドメインを含む第２の抗体軽鎖と第２の抗体重鎖とのペアと、
ｉｉｉ）ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、ｄＡｂフラグメント、ＤｕｔａＦａｂ及びＣｒｏｓｓＦａｂからなる群より選択され、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に特異的に結合する第３の結合部位を形成する、第３の軽鎖可変ドメイン及び第３の重鎖可変ドメインを含む更なる抗体フラグメントと、
ｉｖ）（ヒトＩｇＧ１サブクラスの）（ヒト）エフェクター機能コンピテントＦｃ領域とを含み、
ここで、ｉｉｉ）の更なる抗体フラグメントは、ｉ）又はｉｉ）の抗体重鎖のＣ末端に、直接又はペプチドリンカーを介してのいずれかでコンジュゲーションしている。
【0030】
一実施態様において、更なる抗体フラグメントは、第２の抗原に特異的に結合し、ｉ）又はｉｉ）の重鎖の１つのＣ末端に、ペプチドリンカーを介して融合しているＦａｂフラグメントである。ここで、第２の軽鎖及び第２の重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いに置き換えられており、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に特異的に結合する第３の結合部位を形成する、第３の軽鎖可変ドメイン及び第３の重鎖可変ドメインを含む。
【0031】
一実施態様において、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に特異的に結合する結合部位は、（ａ）配列番号：０６又は０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号：０８又は０９又は１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号：１１、１２又は１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号：１４又は１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：１７又は１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む。
【0032】
一実施態様において、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に特異的に結合する結合部位は、（ａ）配列番号：０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む。
【0033】
一実施態様において、抗体は、トランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に対する結合部位を形成する、配列番号：１９の重鎖可変ドメインと配列番号：２０の軽鎖可変ドメインとの１つペアと、ヒトアミロイドベータタンパク質（Ａベータ）に対する結合部位を形成する、配列番号：２３の重鎖可変ドメインと配列番号：２４の（各）軽鎖可変ドメインとの少なくとも１つ（すなわち、１つ又は２つ）のペアとを含む。
【0034】
一実施態様において、抗体は、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に対する結合部位を形成する、配列番号：１９の重鎖可変ドメインと配列番号：２０の軽鎖可変ドメインとの１つのペアと、それぞれヒトＣＤ２０に対する結合部位を形成する、配列番号：２１の重鎖可変ドメインと配列番号：２２の軽鎖可変ドメインとの２つのペアとを含む。一実施態様において、重鎖可変領域は、Ｋａｂａｔの１１位のアミノ酸残基をロイシン以外の任意のアミノ酸で置き換えることを含む。一実施態様において、置換は、Ｋａｂａｔの１１位のアミノ酸残基を非極性アミノ酸で置き換えることを含む。好ましい一実施態様では、置換は、配列番号：２１の重鎖可変ドメインにおけるＫａｂａｔの１１位のアミノ酸残基を、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン及びフェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸残基で置き換えることを含む。
【0035】
一実施態様において、抗体は、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に対する結合部位を形成する、配列番号：１９の重鎖可変ドメインと配列番号：２０の軽鎖可変ドメインとの１つのペアと、それぞれヒトアルファ－シヌクレインに対する結合部位を形成する、配列番号：２５の重鎖可変ドメインと配列番号：２６の軽鎖可変ドメインとの２つのペアとを含む。
【0036】
一実施態様において、抗体は、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に対する結合部位を形成する、配列番号：１９の重鎖可変ドメインと配列番号：２０の軽鎖可変ドメインとの１つのペアと、それぞれヒトアルファ－シヌクレインに対する結合部位を形成する、配列番号：２７から得られるヒト化重鎖可変ドメインと配列番号：２８から得られるヒト化軽鎖可変ドメインとの２つのペアとを含む。
【0037】
一実施態様において、抗体は、ヒトトランスフェリンレセプターに対する結合部位を形成する、配列番号：１９の重鎖可変ドメインと配列番号：２０の軽鎖可変ドメインとの１つのペアと、それぞれヒトアルファ－シヌクレインに対する結合部位を形成する、配列番号：２９から得られるヒト化重鎖可変ドメインと配列番号：３０から得られるヒト化軽鎖可変ドメインとの２つのペアとを含む。
【0038】
一実施態様において、抗体は、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に対する結合部位を形成する、配列番号：１９の重鎖可変ドメインと配列番号：２０の軽鎖可変ドメインとの１つのペアと、それぞれヒトアルファ－シヌクレインに対する結合部位を形成する、配列番号：３１から得られるヒト化重鎖可変ドメインと配列番号：３２から得られるヒト化軽鎖可変ドメインとの２つのペアとを含む。
【0039】
一実施態様において、抗体は、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に対する結合部位を形成する、配列番号：１９の重鎖可変ドメインと配列番号：２０の軽鎖可変ドメインとの１つのペアと、それぞれヒトアルファ－シヌクレインに対する結合部位を形成する、配列番号：３３から得られるヒト化重鎖可変ドメインと配列番号：３４から得られるヒト化軽鎖可変ドメインとの２つのペアとを含む。
【0040】
一実施態様において、抗体は、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に対する結合部位を形成する、配列番号：１９の重鎖可変ドメインと配列番号：２０の軽鎖可変ドメインとの１つのペアと、それぞれヒトアルファ－シヌクレインに対する結合部位を形成する、配列番号：３５から得られるヒト化重鎖可変ドメインと配列番号：３６から得られるヒト化軽鎖可変ドメインとの２つのペアとを含む。
【0041】
一実施態様において、疾患は、神経障害である。一実施態様において、疾患は、神経障害からなる神経障害、アミロイドーシス、ガン、眼の疾患又は障害、ウイルス又は微生物の感染、炎症、虚血性疾患、神経変性疾患、てんかん発作、行動障害、リソソーム蓄積症、レビー小体病、ポストポリオ症候群、Ｓｈｙ－Ｄｒａｅｇｅｒ症候群、オリボポン小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体変性、タウオパシー、アルツハイマー病、核上性麻痺、プリオン病、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト－ヤコブ症候群、クールー病、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ－Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ病、慢性消耗性疾患及び致死的な家族性不眠症、球麻痺、運動ニューロン疾患、神経系不変性障害、カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥレット症候群、メンケス病、コッカイン症候群、ハレルヴォーデン－スパッツ症候群、ラフォラ病、レト症候群、肝臓病変性、レッシュ－ナイハン症候群、ウンベルリッヒ－ランドボルグ症候群、認知症、ピック病、脊髄小脳運動失調症、ＣＮＳ及び／又は脳のガン（体内の他の箇所のガンに起因する脳転移を含む）からなる群より選択される。一実施態様において、疾患は、アルツハイマー病からなる神経障害、パーキンソン病、ＣＮＳ及び／又は脳のガン（体内の他の箇所のガンに起因する脳転移を含む）並びにタウオパシーからなる群より選択される。一実施態様において、疾患は、アルツハイマー病からなる神経障害、パーキンソン病及びタウオパシーからなる群より選択される。
【0042】
一実施態様において、抗体は、エフェクター機能コンピテントＦｃ領域を含む。一実施態様において、エフェクター機能コンピテントＦｃ領域は、ヒトＦｃガンマレセプターに特異的に結合する／特異的に結合することができるＦｃ領域である。一実施態様において、エフェクター機能コンピテントＦｃ領域は、ＡＤＣＣを誘発することができる。
【0043】
一実施態様において、二重特異性抗体により（注射時／第２の（細胞表面）ターゲットに結合している間）に誘発されるＡＤＣＣは、第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する１つ、すなわち、正確に１つの結合部位及び第２の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する（正確に）１つの結合部位のみを有する、すなわち、第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する結合部位の１つを欠いている、二価の二重特異性抗体により誘発されるＡＤＣＣより低い。一実施態様において、ＡＤＣＣは、１０倍以上低い。
【0044】
一実施態様において、投与は、静脈内、皮下又は筋肉内投与である。
【0045】
一実施態様において、投与関連副作用は、低体温である。一実施態様において、低体温は、二重特異性抗体の治療用量で、０．５℃未満の体温低下に低減される。一実施態様において、体温低下は、投与後６０分以内である。
【0046】
一実施態様において、（ｉ）の）第１の抗体重鎖及び（ｉｉ）の）第２の抗体重鎖は、ヘテロ二量体を形成する。一実施態様において、第１の抗体重鎖及び第２の抗体重鎖は、ヘテロ二量体の形成を支持する突然変異を含む。
【0047】
一実施態様において、
ａ）抗体重鎖は、ヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｂ）抗体重鎖は、ヒトサブクラスＩｇＧ４の全長抗体重鎖でるか、
ｃ）抗体重鎖の１つは、突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であり、他の抗体重鎖は、突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｄ）両抗体重鎖は、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｅ）両抗体重鎖は、突然変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、又は
ｆ）両抗体重鎖は、突然変異Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ｈを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖である。
ａ）抗体重鎖は、ヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｂ）抗体重鎖は、ヒトサブクラスＩｇＧ４の全長抗体重鎖でるか、
ｃ）抗体重鎖の１つは、突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であり、他の抗体重鎖は、突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｄ）両抗体重鎖は、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｅ）両抗体重鎖は、突然変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、又は
ｆ）両抗体重鎖は、突然変異Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ｈを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖である。
【0048】
一実施態様において、
ａ）抗体重鎖は、ヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であるか、
ｂ）抗体重鎖は、ヒトサブクラスＩｇＧ４の抗体重鎖であるか、
ｃ）抗体重鎖の１つは、突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であり、他の抗体重鎖は、突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であるか、
ｄ）両抗体重鎖は、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であるか、
ｅ）両抗体重鎖は、突然変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であるか、又は
ｆ）両抗体重鎖は、突然変異Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ｈを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であり、
ここで、Ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドは存在し又は存在しない。
ａ）抗体重鎖は、ヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であるか、
ｂ）抗体重鎖は、ヒトサブクラスＩｇＧ４の抗体重鎖であるか、
ｃ）抗体重鎖の１つは、突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であり、他の抗体重鎖は、突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であるか、
ｄ）両抗体重鎖は、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であるか、
ｅ）両抗体重鎖は、突然変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であるか、又は
ｆ）両抗体重鎖は、突然変異Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ｈを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であり、
ここで、Ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドは存在し又は存在しない。
【0049】
本発明は、神経障害の処置における、望ましくない投与（注入）関連副作用、例えば、血管拡張、気管支収縮、喉頭浮腫、心圧低下及び特に、Ｆｃ領域エフェクター機能に関連する低体温の低減のための、脳ターゲット及びヒトトランスフェリンレセプター１に特異的に結合し、特異的なフォーマットでネイティブなエフェクター機能を有する二重特異性抗体の使用に関する。ここで、該抗体は、脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプター１に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント、例えば、ネイティブなＦｃ領域を有する。この抗体は、血液脳関門を横断して輸送することができる完全なエフェクター機能性抗体である。
【0050】
この理論に拘束されるものではないが、エフェクター細胞上のヒトＦｃガンマレセプター及び身体の任意のＴｆＲ（ＴｆＲ１）発現細胞上のヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）への治療抗体の同時結合は、その注入後に観察されるアナフィラキシー様反応に少なくとも部分的に関与しているおそれがあると考えられる。ターゲットからの望ましくないＦｃレセプター相互作用を防止する特異的なフォーマットで治療抗体を提供することにより、投与（注入）関連副作用、特に、低体温の発生を低減するか又は防止することさえできる。
【0051】
更に、アナフィラキシー様反応を低減する臨床的利益は、治療抗体のより良好な耐性及び／又はより高い投与（注入）速度又は用量を可能にすることが期待される。
【0052】
本明細書で上記検討されたように、低減された初回注入反応（ＦＩＲ）を有する新規なｍＡｂ設計が提供される。次に、これにより、他の治療用二重特異性抗体フォーマットの投与スキームと比較して、二重特異性治療抗体又は二重特異性治療抗体を含む治療用組成物のより高い用量、より頻繁な投与及び／又はより速い注入速度の適用が可能となる。同様に、本発明によれば、望ましくない投与（注入）関連副作用（例えば、血管拡張、気管支収縮、喉頭浮腫、心圧低下及び特に、低体温）を経験する患者において、投与量、投与頻度及び／又は注入速度を、既存の治療におけるように低減する必要がない。
【0053】
従来の抗体療法では、抗体療法を受けている患者が投与（注入）関連副作用（本明細書において、注入関連反応とも呼ばれる）を経験する場合、注入速度を遅くする必要があり又は重篤な症例では、治療を中断又は完全に中止する必要がある。これは、本発明により回避することができる。軽度又は中等度の注入関連反応（例えば、United States National Cancer Institute（ＮＣＩ）のCommon Terminology Criteria for Adverse Events（ＣＴＣＡＥ）ｖ５．０によるグレード１及び２）を経験している患者については、注入速度を遅くすることができる。重篤な注入関連副作用（例えば、United States National Cancer Institute（ＮＣＩ）のCommon Terminology Criteria for Adverse Events（ＣＴＣＡＥ）ｖ５．０によるグレード３及び４）を経験している患者は、直ちに治療を停止し、最後に中止しなければならない。本発明は、このような副反応を全く回避するために又は少なくともこのような副反応を大幅に減少させるために安全に投与することができる、治療を提供する。
【0054】
したがって、一部の態様では、本発明は、投与（注入）関連副作用（例えば、血管拡張、気管支収縮、喉頭浮腫、心圧低下及び特に、低体温）、特に、グレード１～４（United States National Cancer Institute（ＮＣＩ）のCommon Terminology Criteria for Adverse Events（ＣＴＣＡＥ）ｖ５．０による）、とりわけ、グレード２～４、とりわけ、グレード３及び４の投与（注入）関連副作用を経験するであろう患者を処置するのに使用される。
【0055】
例えば、注入関連副作用のない患者への典型的な注入速度は、一部の抗菌剤については、１２ml/h～４００ml/hであることができる（例えば、輸液を１２ml/hの速度で１回目（及び場合により２回目）の投与で開始することができ、２００ml/hの速度に達するまで、３０分毎に倍増させる。３回目以降の注入は、例えば、２５mg/lの速度で開始して、最高注入速度が４００ml/hに達するまで、３０分毎に倍増させることができる）。従来の抗体療法では、軽度又は中等度の注入関連反応を経験する患者について、この症例では、注入を中断し、後に１２ml/hで再開し、医師の監督下で徐々に増加させることができる。検討されたように、これを、本発明により回避することができる。
【0056】
体温及びサイトカイン放出の投与（注入）に関連する低下を最小限にするために、両方の治療ターゲット結合Ｆａｂアームが、ＦｃγＲリクルートに対する阻害効果を最大限にするのに必要であることが見出された。
【0057】
このため、本明細書で報告された一態様は、静脈内適用後の望ましくない注入関連副作用、例えば、血管拡張、気管支収縮、喉頭浮腫、心圧低下及び特に、低体温の低減を伴う、個体における抗脳ターゲット処置における使用のための、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）（二重特異性）抗体である抗脳ターゲット治療剤である。ここで、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター（１）抗体は、脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域とを有する。
【0058】
本明細書で報告された別の態様は、個体における注入関連副作用、例えば、血管拡張、気管支収縮、喉頭浮腫、心圧低下及び特に、低体温の低減を伴う神経障害を処置するための方法であって、有効量の抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）（二重特異性）抗体の投与を含み、ここで、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）抗体は、脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域を有し、ここで、処置は、注入関連副作用、例えば、血管拡張、気管支収縮、喉頭浮腫、心圧低下及び特に、低体温の低減をもたらす、方法である。
【0059】
一実施態様において、注入関連副作用は、低体温、すなわち、体温低下である。
【0060】
上記された態様で利用される抗体は、本明細書に記載された任意の抗体であることができる。
【0061】
一実施態様において、低体温は、２℃未満の体温低下に低減される。一実施態様において、低体温は、１℃未満の体温低下に低減される。好ましい一実施態様では、低体温は、０．５℃未満の体温低下に低減される。
【0062】
一実施態様において、低体温は、投与後３０分以内である。一実施態様において、低体温は、投与後６０分以内である。一実施態様において、低体温は、投与後１２０分以内である。
【0063】
一実施態様において、低体温は、１℃未満、好ましい一実施態様では、０．５℃未満で投与後６０分以内、好ましい一実施態様では、投与後１２０分以内の体温降下に低減される。
【0064】
一実施態様において、エフェクター機能コンピテントＦｃ領域は、ヒトＦｃガンマレセプターに特異的に結合する／特異的に結合することができるＦｃ領域である。
【0065】
一実施態様において、エフェクター機能コンピテントＦｃ領域は、ＡＤＣＣを誘発することができる。
【0066】
一実施態様において、エフェクター機能コンピテントＦｃ領域は、ヒトＦｃガンマレセプターに特異的に結合する／特異的に結合することができ、ＡＤＣＣを誘発することができるＦｃ領域である。
【0067】
一実施態様において、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体は、
ｉ）第１の抗原に特異的に結合する全長抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖と、
ｉｉ）第１の軽鎖と対合した場合に、第１の抗原に特異的に結合する全長抗体の第２の重鎖と、
ｉｉｉ）第２の抗原に特異的に結合し、ペプチドリンカーを介して、ｉ）又はｉｉ）の重鎖の１つのＣ末端に融合し、ここで、第２の軽鎖及び第２の重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いに置き換えられているＦａｂフラグメントを含み、
ここで、Ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドは存在し又は存在しない、三価の二重特異性抗体である。
ｉ）第１の抗原に特異的に結合する全長抗体の第１の軽鎖及び第１の重鎖と、
ｉｉ）第１の軽鎖と対合した場合に、第１の抗原に特異的に結合する全長抗体の第２の重鎖と、
ｉｉｉ）第２の抗原に特異的に結合し、ペプチドリンカーを介して、ｉ）又はｉｉ）の重鎖の１つのＣ末端に融合し、ここで、第２の軽鎖及び第２の重鎖の定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いに置き換えられているＦａｂフラグメントを含み、
ここで、Ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドは存在し又は存在しない、三価の二重特異性抗体である。
【0068】
好ましい一実施態様では、本明細書で報告された全ての態様における二重特異性抗体は、
ｉ）ヒトＣＤ２０、ヒトタウタンパク質、リン酸化ヒトタウタンパク質、ヒトアルファ－シヌクレイン及びヒトアミロイドベータタンパク質からなる群より選択される脳ターゲットに特異的に結合する第１の結合部位を形成する、第１の軽鎖可変ドメイン及び第１の重鎖可変ドメインを含む第１の抗体軽鎖と第１の抗体重鎖とのペアと、
ｉｉ）第１の結合部位と同じ脳ターゲットに特異的に結合する第２の結合部位を形成する、第２の軽鎖可変ドメイン及び第１の重鎖可変ドメインを含む第２の抗体軽鎖と第２の抗体重鎖とのペアと、
ｉｉｉ）ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、ｄＡｂフラグメント及びＣｒｏｓｓＦａｂからなる群より選択され、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に特異的に結合する第３の結合部位を形成する、第３の軽鎖可変ドメイン及び第３の重鎖可変ドメインを含む更なる抗体フラグメントと、
ｉｖ）（ヒト）エフェクター機能コンピテントＦｃ領域とを含み、
ここで、ｉｉｉ）の更なる抗体フラグメントは、ｉ）又はｉｉ）の抗体重鎖のＣ末端に、直接又はペプチドリンカーを介してのいずれかでコンジュゲーションしており、
ここで、Ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドは存在し又は存在しない。
ｉ）ヒトＣＤ２０、ヒトタウタンパク質、リン酸化ヒトタウタンパク質、ヒトアルファ－シヌクレイン及びヒトアミロイドベータタンパク質からなる群より選択される脳ターゲットに特異的に結合する第１の結合部位を形成する、第１の軽鎖可変ドメイン及び第１の重鎖可変ドメインを含む第１の抗体軽鎖と第１の抗体重鎖とのペアと、
ｉｉ）第１の結合部位と同じ脳ターゲットに特異的に結合する第２の結合部位を形成する、第２の軽鎖可変ドメイン及び第１の重鎖可変ドメインを含む第２の抗体軽鎖と第２の抗体重鎖とのペアと、
ｉｉｉ）ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、ｄＡｂフラグメント及びＣｒｏｓｓＦａｂからなる群より選択され、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に特異的に結合する第３の結合部位を形成する、第３の軽鎖可変ドメイン及び第３の重鎖可変ドメインを含む更なる抗体フラグメントと、
ｉｖ）（ヒト）エフェクター機能コンピテントＦｃ領域とを含み、
ここで、ｉｉｉ）の更なる抗体フラグメントは、ｉ）又はｉｉ）の抗体重鎖のＣ末端に、直接又はペプチドリンカーを介してのいずれかでコンジュゲーションしており、
ここで、Ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドは存在し又は存在しない。
【0069】
一実施態様において、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に特異的に結合する結合部位は、（ａ）配列番号：０６又は０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号：０８又は０９又は１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号：１１、１２又は１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号：１４又は１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：１７又は１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む。
【0070】
一実施態様において、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に特異的に結合する結合部位は、（ａ）配列番号：０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号：０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む。
【0071】
一実施態様において、抗体は、トランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に対する結合部位を形成する、配列番号：１９の重鎖可変ドメインと配列番号：２０の軽鎖可変ドメインとの１つペアと、ヒトアミロイドベータタンパク質（Ａベータ）に対する結合部位を形成する、配列番号：２３の重鎖可変ドメインと配列番号：２４の軽鎖可変ドメインとの少なくとも１つ（すなわち、１つ又は２つ）のペアとを含む。
【0072】
一実施態様において、抗体は、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に対する結合部位を形成する、配列番号：１９の重鎖可変ドメインと配列番号：２０の軽鎖可変ドメインとの１つのペアと、それぞれヒトＣＤ２０に対する結合部位を形成する、配列番号：２１の重鎖可変ドメインと配列番号：２２の軽鎖可変ドメインとの２つのペアとを含む。一実施態様において、重鎖可変領域は、Ｋａｂａｔの１１位のアミノ酸残基をロイシン以外の任意のアミノ酸で置き換えることを含む。一実施態様において、置換は、Ｋａｂａｔの１１位のアミノ酸残基を非極性アミノ酸で置き換えることを含む。好ましい一実施態様では、置換は、配列番号：２１の重鎖可変ドメインにおけるＫａｂａｔの１１位のアミノ酸残基を、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン及びフェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸残基で置き換えることを含む。
【0073】
一実施態様において、抗体は、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に対する結合部位を形成する、配列番号：１９の重鎖可変ドメインと配列番号：２０の軽鎖可変ドメインとの１つのペアと、それぞれヒトアルファ－シヌクレインに対する結合部位を形成する、配列番号：２５の重鎖可変ドメインと配列番号：２６の軽鎖可変ドメインとの２つのペアとを含む。
【0074】
一実施態様において、抗体は、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に対する結合部位を形成する、配列番号：１９の重鎖可変ドメインと配列番号：２０の軽鎖可変ドメインとの１つのペアと、それぞれヒトアルファ－シヌクレインに対する結合部位を形成する、配列番号：２７から得られるヒト化重鎖可変ドメインと配列番号：２８から得られるヒト化軽鎖可変ドメインとの２つのペアとを含む。
【0075】
一実施態様において、抗体は、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に対する結合部位を形成する、配列番号：１９の重鎖可変ドメインと配列番号：２０の軽鎖可変ドメインとの１つのペアと、それぞれヒトアルファ－シヌクレインに対する結合部位を形成する、配列番号：２９から得られるヒト化重鎖可変ドメインと配列番号：３０から得られるヒト化軽鎖可変ドメインとの２つのペアとを含む。
【0076】
一実施態様において、抗体は、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に対する結合部位を形成する、配列番号：１９の重鎖可変ドメインと配列番号：２０の軽鎖可変ドメインとの１つのペアと、それぞれヒトアルファ－シヌクレインに対する結合部位を形成する、配列番号：３１から得られるヒト化重鎖可変ドメインと配列番号：３２から得られるヒト化軽鎖可変ドメインとの２つのペアとを含む。
【0077】
一実施態様において、抗体は、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に対する結合部位を形成する、配列番号：１９の重鎖可変ドメインと配列番号：２０の軽鎖可変ドメインとの１つのペアと、それぞれヒトアルファ－シヌクレインに対する結合部位を形成する、配列番号：３３から得られるヒト化重鎖可変ドメインと配列番号：３４から得られるヒト化軽鎖可変ドメインとの２つのペアとを含む。
【0078】
一実施態様において、抗体は、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に対する結合部位を形成する、配列番号：１９の重鎖可変ドメインと配列番号：２０の軽鎖可変ドメインとの１つのペアと、それぞれヒトアルファ－シヌクレインに対する結合部位を形成する、配列番号：３５から得られるヒト化重鎖可変ドメインと配列番号：３６から得られるヒト化軽鎖可変ドメインとの２つのペアとを含む。
【0079】
一実施態様において、疾患は、神経障害である。一実施態様において、疾患は、神経障害からなる神経障害、アミロイドーシス、ガン、眼の疾患又は障害、ウイルス又は微生物の感染、炎症、虚血性疾患、神経変性疾患、てんかん発作、行動障害、リソソーム蓄積症、レビー小体病、ポストポリオ症候群、Ｓｈｙ－Ｄｒａｅｇｅｒ症候群、オリボポン小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体変性、タウオパシー、アルツハイマー病、核上性麻痺、プリオン病、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト－ヤコブ症候群、クールー病、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ－Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ病、慢性消耗性疾患及び致死的な家族性不眠症、球麻痺、運動ニューロン疾患、神経系不変性障害、カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥレット症候群、メンケス病、コッカイン症候群、ハレルヴォーデン－スパッツ症候群、ラフォラ病、レト症候群、肝臓病変性、レッシュ－ナイハン症候群、ウンベルリッヒ－ランドボルグ症候群、認知症、ピック病、脊髄小脳運動失調症、ＣＮＳ及び／又は脳のガン（体内の他の箇所のガンに起因する脳転移を含む）からなる群より選択される。一実施態様において、疾患は、アルツハイマー病からなる神経障害、パーキンソン病、ＣＮＳ及び／又は脳のガン（体内の他の箇所のガンに起因する脳転移を含む）並びにタウオパシーからなる群より選択される。一実施態様において、疾患は、アルツハイマー病からなる神経障害、パーキンソン病及びタウオパシーからなる群より選択される。
【0080】
一実施態様において、抗体は、エフェクター機能コンピテントＦｃ領域を含む。一実施態様において、エフェクター機能コンピテントＦｃ領域は、ヒトＦｃガンマレセプターに特異的に結合する／特異的に結合することができるＦｃ領域である。一実施態様において、エフェクター機能コンピテントＦｃ領域は、ＡＤＣＣを誘発することができる。
【0081】
一実施態様において、二重特異性抗体により（注射時／第２の（細胞表面）ターゲットに結合している間）に誘発されるＡＤＣＣは、第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する１つ、すなわち、正確に１つの結合部位及び第２の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する（正確に）１つの結合部位のみを有する、二価の二重特異性抗体により誘発されるＡＤＣＣより低い。一実施態様において、ＡＤＣＣは、１０倍以上低い。
【0082】
一実施態様において、投与は、静脈内、皮下又は筋肉内投与である。
【0083】
一実施態様において、投与関連副作用は、低体温である。一実施態様において、低体温は、二重特異性抗体の治療用量で、０．５℃未満の体温低下に低減される。一実施態様において、体温低下は、投与後６０分以内である。
【0084】
一実施態様において、（ｉ）の）第１の抗体重鎖及び（ｉｉ）の）第２の抗体重鎖は、ヘテロ二量体を形成する。一実施態様において、第１の抗体重鎖及び第２の抗体重鎖は、ヘテロ二量体の形成を支持する突然変異を含む。
【0085】
一実施態様において、全長抗体は、
ａ）ヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体であるか、
ｂ）ヒトサブクラスＩｇＧ４の全長抗体であるか、
ｃ）１つの重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃと、他の各重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃとを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体であるか、
ｄ）両重鎖において突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａと、１つの重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃと、他の各重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃとを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体であるか、
ｅ）両重鎖において突然変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅと、１つの重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃと、他の各重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃとを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体であるか、又は
ｆ）両抗体重鎖は、突然変異Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ｈを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖である。
ａ）ヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体であるか、
ｂ）ヒトサブクラスＩｇＧ４の全長抗体であるか、
ｃ）１つの重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃと、他の各重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃとを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体であるか、
ｄ）両重鎖において突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａと、１つの重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃと、他の各重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃとを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体であるか、
ｅ）両重鎖において突然変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅと、１つの重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃと、他の各重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃとを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体であるか、又は
ｆ）両抗体重鎖は、突然変異Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ｈを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖である。
【0086】
一実施態様において、
ａ）抗体重鎖は、ヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であるか、
ｂ）抗体重鎖は、ヒトサブクラスＩｇＧ４の抗体重鎖であるか、
ｃ）抗体重鎖の１つは、突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であり、他の抗体重鎖は、突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であるか、
ｄ）両抗体重鎖は、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であるか、
ｅ）両抗体重鎖は、突然変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であるか、又は
ｆ）両抗体重鎖は、突然変異Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ｈを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であり、
ここで、Ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドは存在し又は存在しない。
ａ）抗体重鎖は、ヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であるか、
ｂ）抗体重鎖は、ヒトサブクラスＩｇＧ４の抗体重鎖であるか、
ｃ）抗体重鎖の１つは、突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であり、他の抗体重鎖は、突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であるか、
ｄ）両抗体重鎖は、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であるか、
ｅ）両抗体重鎖は、突然変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であるか、又は
ｆ）両抗体重鎖は、突然変異Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ｈを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であり、
ここで、Ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドは存在し又は存在しない。
【0087】
一実施態様において、ヒトエフェクター機能コンピテントＦｃ領域は、配列番号：５７～６０及び６３～６６からなる群より選択される、２つのポリペプチドを含む。
【0088】
一実施態様において、ヒトエフェクター機能コンピテントＦｃ領域は、配列番号：６１の第１のＦｃ領域ポリペプチド及び配列番号：６２の第２のＦｃ領域ポリペプチドを含む。
【0089】
本明細書で使用する場合、「態様」という用語は、本発明の独立した主題を指し、一方、「実施態様」という用語は、独立した主題の更に定義された従属サブ項目を指す。
【0090】
発明の実施態様の詳細な説明
本明細書において、二重特異性治療モノクローナル抗体の適用関連副作用及び反応を低減するための方法が報告される。これは、Ｆｃγレセプター（ＦｃγＲ）への結合を立体的に抑制することにより達成される。一例は、中枢神経系の障害に関連する治療ターゲット及びヒトトランスフェリンレセプター、特に、トランスフェリンレセプター１（ＴｆＲ１）に特異的に結合する、二重特異性治療抗体である。
本明細書において、二重特異性治療モノクローナル抗体の適用関連副作用及び反応を低減するための方法が報告される。これは、Ｆｃγレセプター（ＦｃγＲ）への結合を立体的に抑制することにより達成される。一例は、中枢神経系の障害に関連する治療ターゲット及びヒトトランスフェリンレセプター、特に、トランスフェリンレセプター１（ＴｆＲ１）に特異的に結合する、二重特異性治療抗体である。
【0091】
ヒトトランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）（トランスフェリンレセプター１、ＴｆＲ１）は、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断する抗体（ｍＡｂ）の輸送に有望であることが示されている。しかしながら、末梢ＴｆＲ（ＴｆＲ１）結合性及びＦｃ領域エフェクター機能に関連する安全性の責任が報告されている。脳シャトル－ｍＡｂ（ＢＳ－ｍＡｂ）技術を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び新規なＦｃγＲヒト化マウスモデルにおけるＦｃ領域エフェクター機能の役割を調査した。ネイティブなＩｇＧ１ Ｆｃ領域を有するＴｆＲ（ＴｆＲ１）に対する従来の二価の単特異性ｍＡｂについて、強力な初回注入反応（ＦＩＲ）が観察された。Ｆｃ領域エフェクターデッド構築物を使用すると、全てのＦＩＲが完全に排除された。注目すべきことに、ネイティブなＩｇＧ１ Ｆｃ領域を有する２＋１ ＢＳ－ｍＡｂ構築物について、ＦＩＲが観察されなかった。本明細書で報告された本発明は、Ｃ末端ＢＳモジュールを介したＴｆＲ（ＴｆＲ１）結合が、主に立体障害のために、Ｆｃ領域－ＦｃγＲ相互作用を減弱させるという知見に少なくとも部分的に基づいている。それにもかかわらず、ＢＳ－ｍＡｂは、そのターゲットに結合する場合、エフェクター機能活性を維持する。まとめると、完全なエフェクター機能を有するｍＡｂは、末梢においてステルスモードで輸送することができ、そのターゲットと結合した場合にのみ、脳において活性化することができる。
【0092】
定義
本明細書で使用する場合、重鎖及び軽鎖の全ての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載されているＫａｂａｔナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、本明細書において、「Ｋａｂａｔに従ったナンバリング」と呼ばれる。具体的には、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＫａｂａｔナンバリングシステム（６４７～６６０頁を参照のこと）は、カッパ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用される。Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステム（６６１～７２３頁を参照のこと）は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、これらは、本明細書において、この場合には、「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング」を参照することにより更に分類される）に使用される。
本明細書で使用する場合、重鎖及び軽鎖の全ての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載されているＫａｂａｔナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、本明細書において、「Ｋａｂａｔに従ったナンバリング」と呼ばれる。具体的には、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＫａｂａｔナンバリングシステム（６４７～６６０頁を参照のこと）は、カッパ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用される。Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスナンバリングシステム（６６１～７２３頁を参照のこと）は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、これらは、本明細書において、この場合には、「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従ったナンバリング」を参照することにより更に分類される）に使用される。
【0093】
ノブ－ｉｎｔｏ－ホール二量化モジュール及び抗原操作におけるそれらの使用は、Carter P.; Ridgway J.B.B.; Presta L.G.: Immunotechnology, Volume 2, Number 1, February 1996, pp. 73-73(1)に記載されている。
【0094】
ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に与えられる。
【0095】
本発明を実施するのに有用な方法及び技術は、例えば、Ausubel, F.M. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997)；Glover, N.D., and Hames, B.D., ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (1985)、Oxford University Press; Freshney, R.I. (ed.), Animal Cell Culture - a practical approach, IRL Press Limited (1986)；Watson, J.D., et al., Recombinant DNA, Second Edition, CHSL Press (1992)；Winnacker, E.L., From Genes to Clones; N.Y., VCH Publishers (1987)；Celis, J., ed., Cell Biology, Second Edition, Academic Press (1998)；Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, second edition, Alan R. Liss, Inc., N.Y. (1987)に記載されている。
【0096】
リコンビナントＤＮＡ技術の使用により、核酸の誘導体の生成が可能となる。このような誘導体は、例えば、置換、改変、交換、欠失又は挿入により、個々のヌクレオチド位置又は複数のヌクレオチド位置で改変することができる。改変又は誘導体化は、例えば、部位特異的突然変異誘発により行うことができる。このような改変は、当業者により容易に行うことができる（例えば、Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA; Hames, B.D., and Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, Englandを参照のこと）。
【0097】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が別段の明確な指示をしない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。このため、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、複数のこのような細胞及び当業者に公知のその均等物等を含むことに、留意すべきである。同様に、「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ以上」及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書において互換的に使用することができる。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、互換的に使用することができることにも、留意されたい。
【0098】
「約」という用語は、後に続く数値の＋／－２０％の範囲を指す。一実施態様において、約という用語は、後に続く数値の＋／－１０％の範囲を指す。一実施態様において、約という用語は、後に続く数値の＋／－５％の範囲を指す。
【0099】
本明細書で使用する場合、「決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ）」という用語は、測定する（ｍｅａｓｕｒｅ）及び分析する（ａｎａｌｙｚｅ）という用語も包含する。
【0100】
本明細書で使用する場合、「ドメイン交差（ｄｏｍａｉｎ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）」という用語は、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１フラグメントとその対応する同族抗体軽鎖とのペアにおいて、すなわち、抗体結合アーム（すなわち、Ｆａｂフラグメント）において、少なくとも１つの重鎖ドメインがその対応する軽鎖ドメインにより置換され、その逆もまた同様である点で、ドメイン配列が天然配列から逸脱することを意味する。ドメイン交差には、３つの一般的なタイプ、（ｉ）ＶＬ－ＣＨ１ドメイン配列を有するドメイン交差軽鎖及びＶＨ－ＣＬドメイン配列を有するドメイン交差重鎖フラグメント（又はＶＨ－ＣＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン配列を有する全長抗体重鎖）をもたらすＣＨ１及びＣＬドメインの交差、（ｉｉ）ＶＨ－ＣＬドメイン配列を有するドメイン交差軽鎖及びＶＬ－ＣＨ１ドメイン配列を有するドメイン交差重鎖フラグメントをもたらすＶＨ及びＶＬドメインの交差並びに（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ１ドメイン配列を有するドメイン交差軽鎖及びＶＬ－ＣＬドメイン配列を有するドメイン交差重鎖フラグメントをもたらす完全軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）及び完全ＶＨ－ＣＨ１重鎖フラグメントのドメイン交差（「Ｆａｂ交差」）が存在する（前述のドメイン配列は全て、Ｎ末端からＣ末端方向に示される）。
【0101】
本明細書で使用する場合、対応する重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインに関して「互いに置き換えられている」という用語は、前述のドメイン交差を指す。このように、ＣＨ１及びＣＬドメインが「互いに置き換えられている」場合、項目（ｉ）で言及されたドメイン交差並びに得られる重鎖ドメイン配列及び軽鎖ドメイン配列を指す。したがって、ＶＨ及びＶＬが「互いに置き換えられている」場合、項目（ｉｉ）で言及されたドメイン交差を指し、ＣＨ１及びＣＬドメインが「互いに置き換えられている」場合、ＶＨ１及びＶＬドメインが「互いに置き換えられている」場合、項目（ｉｉｉ）で言及されたドメイン交差を指す。ドメイン交差を含む二重特異性抗体は、例えば、ＷＯ第２００９／０８０２５１号、同第２００９／０８０２５２号、同第２００９／０８０２５３号、同第２００９／０８０２５４号及びSchaefer, W. et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 108 (2011) 11187-11192に報告されている。
【0102】
多重特異性抗体は、上記項目（ｉ）で言及されたＣＨ１及びＣＬドメインのドメイン交差又は上記（ｉｉ）で言及されたＶＨ及びＶＬドメインのドメイン交差を含む、Ｆａｂフラグメントを含む。同じ抗原に特異的に結合するＦａｂフラグメントは、同じドメイン配列であるように構築される。したがって、ドメイン交差を有する２つ以上のＦａｂフラグメントが多重特異性抗体に含まれる場合、前記Ｆａｂフラグメントは、同じ抗原に特異的に結合する。
【0103】
本明細書において、「抗体」という用語は、最も広い意味に使用され、種々の抗体構造を包含し、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び所望の抗原結合活性を示す限りにおいて抗体フラグメントを含むが、これらに限定されない。
【0104】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）」という用語は、Ｆｃレセプター結合により媒介される機能であり、エフェクター細胞の存在下で、本明細書で報告された抗体によるターゲット細胞の溶解を指す。一実施態様において、ＡＤＣＣは、エフェクター細胞、例えば、新鮮に単離されたＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）又はバフィーコートから精製されるエフェクター細胞、例えば、単球もしくはＮＫ（ナチュラルキラー）細胞の存在下で、本明細書で報告された抗体を使用して、ＣＤ１９発現赤血球細胞（例えば、リコンビナントヒトＣＤ１９を発現するＫ５６２細胞）の調製物を処理することにより測定される。ターゲット細胞を５１Ｃｒでラベルし、続けて、抗体と共にインキュベーションする。ラベルされた細胞をエフェクター細胞とインキュベーションし、上清を放出された５１Ｃｒについて分析する。対照は、ターゲット内皮細胞を抗体なしにエフェクター細胞とインキュベーションする。ＡＤＣＣを媒介する初期工程を誘引する抗体の能力を、Ｆｃγレセプター発現細胞、例えば、ＦｃγＲＩ及び／もしくはＦｃγＲＩＩＡをリコンビナント発現する細胞又はＮＫ細胞（本質的にＦｃγＲＩＩＩＡを発現）へのそれらの結合を測定することにより調査する。好ましい一実施態様では、ＮＫ細胞上でのＦｃγＲへの結合を測定する。
【0105】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；ｄＡｂフラグメント；直線抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。
【0106】
「補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）」という用語は、補体の存在下で、本明細書で報告された抗体により誘引される細胞の溶解を指す。ＣＤＣは、一実施態様において、補体の存在下で、本明細書で報告された抗体を使用して、ＣＤ１９発現ヒト内皮細胞を処置することにより測定される。細胞を一実施態様において、カルセインでラベルする。ＣＤＣは、一実施態様において、抗体が３０μg/mlの濃度でターゲット細胞の２０％以上の溶解を誘発する場合に見出される。補体因子Ｃ１ｑへの結合をＥＬＩＳＡにおいて測定することができる。このようなアッセイにおいて、原理的には、ＥＬＩＳＡプレートを一定の濃度範囲の抗体により被覆する。これに、精製ヒトＣ１ｑ又はヒト血清を加える。Ｃ１ｑ結合をＣ１ｑに対する抗体、続けて、ペルオキシダーゼラベルコンジュゲートにより検出する。結合の検出（最大結合Ｂｍａｘ）をペルオキシダーゼ基質ABTS（登録商標）（２，２’－アジノ－ジ－［３－エチルベンズチアゾリン－６－スルホナート（６）］）についての４０５nmでの光学密度（ＯＤ４０５）として測定する。
【0107】
「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域に起因する、それらの生物学的活性を指す。同Ｆｃ領域は、抗体クラスにより変化する。このようなＦｃ領域は、本明細書において、「エフェクター機能コンピテント」と呼ばれる。抗体のエフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合性及び補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化を含む。
【0108】
Ｆｃレセプター結合依存性エフェクター機能は、抗体のＦｃ領域と、造血細胞上の特殊化された細胞表面レセプターであるＦｃレセプター（ＦｃＲ）との相互作用により媒介されることができる。Ｆｃレセプターは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、免疫複合体の食作用による抗体被覆病原体の除去と、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介する、対応する抗体で被覆された赤血球及び種々の他の細胞ターゲット（例えば、腫瘍細胞）の溶解との両方を媒介することが示されている（例えば、Van de Winkel, J.G. and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524を参照のこと）。ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプに対するそれらの特性により定義される。ＩｇＧ抗体に対するＦｃレセプターは、ＦｃγＲと呼ばれる。Ｆｃレセプターの結合性は、例えば、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492；Capel, P.J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34；de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341；及びGessner, J.E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248に記載されている。
【0109】
ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対するレセプター（ＦｃγＲ）の架橋により、食作用、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害及び炎症性メディエーターの放出並びに免疫複合体クリアランス及び抗体産生のレギュレーションを含む、広い各種のエフェクター機能がトリガーされる。ヒトにおいて、３つのクラスのＦｃγＲが特徴付けられている。
【0110】
－ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、高い親和性で単量体ＩｇＧに結合し、マクロファージ、単球、好中球及び好酸球上に発現される。アミノ酸残基Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）のうちの少なくとも１つでのＦｃ領域ＩｇＧにおける改変により、ＦｃγＲＩへの結合が低下する。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４において置換される２３３～２３６位のＩｇＧ２残基により、ＦｃγＲＩへの結合が１０３倍低下し、抗体感作赤血球に対するヒト単球反応が排除された（Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624）。
【0111】
－ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、中程度から低い親和性で複合体化ＩｇＧに結合し、広く発現される。このレセプターは、２つのサブタイプ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢに分けることができる。ＦｃγＲＩＩＡは、殺傷に関与する多くの細胞（例えば、マクロファージ、単球、好中球）上で見出され、殺傷プロセスを活性化可能であると考えられる。ＦｃγＲＩＩＢは、阻害プロセスにおける役割を果たしていると考えられ、Ｂ細胞、マクロファージならびにマスト細胞及び好酸球上で見出される。Ｂ細胞上では、更なる免疫グロブリン産生及び例えば、ＩｇＥクラスへのアイソタイプスイッチングをサプレッションするように機能すると考えられる。マクロファージ上では、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡを介して媒介される食作用を阻害するように機能する。好酸球及びマスト細胞上では、Ｂ型は、ＩｇＥがその別個のレセプターに結合することにより、これらの細胞の活性化をサプレッションするのに役立つことができる。ＦｃγＲＩＩＡに対する結合の低下は、例えば、アミノ酸残基Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２及びＫ４１４（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）のうちの少なくとも１つでの突然変異を有するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体について見出される。
【0112】
－ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、中程度から低い親和性でＩｇＧに結合し、２つのタイプとして存在する。ＦｃγＲＩＩＩＡは、ＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球並びに一部の単球及びＴ細胞上で見出され、ＡＤＣＣを媒介する。ＦｃγＲＩＩＩＢは、好中球上で高発現される。ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の低下は、例えば、アミノ酸残基Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８及びＤ３７６（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）のうちの少なくとも１つでの突然変異を有するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体について見出される。
【0113】
Ｆｃレセプターに対するヒトＩｇＧ１における結合部位のマッピング、上記言及された突然変異部位並びにＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＡへの結合を測定するための方法が、Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604に記載されている。
【0114】
本明細書で使用する場合、「Ｆｃレセプター」という用語は、レセプターに関連する細胞質ＩＴＡＭ配列の存在を特徴とする活性化レセプターを指す（例えば、Ravetch, J.V. and Bolland, S., Annu. Rev. Immunol. 19 (2001) 275-290を参照のこと）。このようなレセプターは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＩＡである。「ＦｃγＲに結合しない」という用語は、１０μg/mlの抗体濃度で、本明細書で報告された抗体のＮＫ細胞への結合がＷＯ第２００６／０２９８７９号に報告されている抗ＯＸ４０Ｌ抗体ＬＣ．００１について見出される結合の１０％以下であることを指す。
【0115】
ＩｇＧ４は、ＦｃＲ結合の低下を示すが、他のＩｇＧサブクラスの抗体は、強い結合を示す。ただし、Ｐｒｏ２３８、Ａｓｐ２６５、Ａｓｐ２７０、Ａｓｎ２９７（Ｆｃ炭水化物の喪失）、Ｐｒｏ３２９並びに２３４、２３５、２３６及び２３７、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４及びＨｉｓ４３５は、改変された場合にＦｃＲ結合も減少させる残基である（Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604；Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119；Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324；及びＥＰ第０３０７４３４号）。
【0116】
本明細書において、「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するのに使用される。この用語は、ネイティブな配列のＦｃ領域及び変異型のＦｃ領域を含む。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端に広がっている。ただし、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもよいし又は存在しなくてもよい。本明細書において特に断りない限り、Ｆｃ領域又は定常領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242に記載されており、ＥＵインデックスとも呼ばれる、ＥＵナンバリングシステムに従う。
【0117】
本明細書で報告された方法に使用される抗体は、Ｆｃ領域、一実施態様において、ヒト起源に由来するＦｃ領域を含む。一実施態様において、Ｆｃ領域は、ヒト定常領域の全ての部分を含む。抗体のＦｃ領域は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、Ｃ３活性化及びＦｃレセプター結合に直接関与する。補体系に対する抗体の影響は、特定の条件により決まるが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ領域における規定された結合部位により引き起こされる。このような結合部位は、当技術分野において公知であり、例えば、Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560；Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917；Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344；Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004；Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184；Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168；Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324；及びＥＰ第０３０７４３４号に記載されている。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の抗体は、通常、補体活性化、Ｃ１ｑ結合及びＣ３活性化を示す。一方、ＩｇＧ４は、補体系を活性化せず、Ｃ１ｑに結合せず、Ｃ３を活性化しない。「抗体のＦｃ領域」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン開裂に基づいて定義される。一実施態様において、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域である。
【0118】
「全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「抗体全体」という用語は、ネイティブな抗体構造と実質的に同じ構造を有するか又は本明細書で定義されたＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すのに、本明細書において互換的に使用される。
【0119】
「個体」又は「対象」は、ほ乳類である。ほ乳類は、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えば、サル）、ウサギ並びにげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含むが、これらに限定されない。特定の実施態様では、個体又は対象は、ヒトである。
【0120】
「単離された抗体」は、その本来の環境の成分から分離されているものである。一部の実施態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定された場合、９５％又は９９％より高い純度に精製される。抗体純度を評価するため方法のレビューについては、例えば、Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87を参照のこと。
【0121】
本明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、この集団に含まれる個々の抗体は、自然発生的に生じる変異を含有し又はモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる可能性ある変異型抗体を除いて、同一であり及び／又は同じエピトープに結合する。このような変異体は、一般的には、少量しか存在しない。種々の決定因子（エピトープ）に対する種々の抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の１つの決定因子を対象にする。このため、「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるものではない。例えば、本発明に基づいて使用されるモノクローナル抗体は、各種の技術により調製することができる。同技術は、ハイブリドーマ法、リコンビナントＤＮＡ法、ファージディスプレイ法及びヒト免疫グロブリンローカスの全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない。モノクローナル抗体を調製するためのこのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【0122】
「ネイキッドな抗体」は、異種部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性ラベルにコンジュゲーションしていない抗体を指す。ネイキッドな抗体は、医薬製剤中に存在することができる。
【0123】
「ネイティブな抗体」は、様々な構造を有する、天然の免疫グロブリン分子を指す。例えば、ネイティブなＩｇＧ抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、ジスルフィド結合している、２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖とから構成される。Ｎ末端からＣ末端にかけて、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、続けて、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有し、これにより、第１の定常ドメインと第２の定常ドメインとの間に、ヒンジ領域が配置される。同様に、Ｎ末端からＣ末端にかけて、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、続けて、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類のうちの１つに割り当てることができる。
【0124】
「ネイティブなエフェクター機能」という用語は、様々な構造を有する天然の免疫グロブリン分子、すなわち、ネイティブな抗体に関連するエフェクター機能を指す。
【0125】
「医薬製剤」という用語は、有効であるようにそれに含有される活性成分の生物学的活性を可能にするような形態にあり、この製剤が投与されるであろう対象に許容できない毒性を有する更なる成分を含有しない調製物を指す。
【0126】
「薬学的に許容し得る担体」は、活性成分以外の医薬製剤中の成分を指し、対象に対して毒性を有さない。薬学的に許容し得る担体は、バッファー、賦形剤、安定剤又は保存剤を含むが、これらに限定されない。
【0127】
本明細書で使用する場合、「処置」（及びその文法上のバリエーション、例えば、「処置する」又は「処置すること」）は、処置される個体の本来の経過を変化させる試みにおける臨床的介在を指し、予防又は臨床病理の経過中のいずれかにおいて行うことができる。処置の望ましい効果は、疾患の発生又は再発を予防すること、兆候の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移の予防、疾患の進展速度の低下、疾患状態の改善又は寛解及び緩和又は改善された予後を含むが、これらに限定されない。一部の実施態様では、本発明の抗体は、疾患の進行を遅延させ又は疾患の進展を遅らせるのに使用される。
【0128】
「血液脳関門」（ＢＢＢ）という用語は、末梢循環と脳及び脊髄との間の生理学的障壁を指し、同障壁は、脳毛細血管内皮細胞膜内の密着結合により形成され、非常に小さい分子、例えば、尿素（６０ダルトン）でさえ、脳への分子の輸送を制限する密着障壁を形成する。脳内のＢＢＢ、脊髄内の血液－脊髄関門及び網膜内の血液－網膜関門は、ＣＮＳ内の連続した毛細血管関門であり、本明細書において、まとめて血液－脳関門又はＢＢＢと呼ばれる。また、ＢＢＢは、血液－ＣＳＦ関門（脈絡叢）を包含し、この場合、この関門は、毛細血管内皮細胞よりもむしろ上衣細胞から構成される。
【0129】
「中枢神経系」（ＣＮＳ）という用語は、身体機能を制御する神経組織の複合体を指し、脳及び脊髄を含む。
【0130】
「血液脳関門レセプター」（ＢＢＢＲ）という用語は、ＢＢＢを横断して分子を輸送可能であるか又は外因性の投与された分子を輸送するのに使用される、脳内皮細胞上で発現される細胞外膜連結レセプタータンパク質を指す。ＢＢＲの例は、トランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）、特に、トランスフェリンレセプター１（ＴｆＲ１）、インスリンレセプター、インスリン様成長因子レセプター（ＩＧＦ－Ｒ）、低密度リポタンパク質レセプター（低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質１（ＬＲＰ１）及び低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質８（ＬＲＰ８）を含むが、これらに限定されない）及びヘパリン結合上皮成長因子様成長因子（ＨＢ－ＥＧＦ）を含むが、これらに限定されない。例示的なＢＢＢＲは、ヒトトランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）、特に、トランスフェリンレセプター１（ＴｆＲ１）である。
【0131】
「一価結合実体」という用語は、ＢＢＢＲに特異的かつ一価結合様式で結合可能な分子を指す。本明細書で報告された血液脳シャトルモジュール及び／又はコンジュゲートは、一価結合実体の１つのユニットの存在により特徴付けられる。すなわち、本発明の血液脳シャトルモジュール及び／又はコンジュゲートは、一価結合実体の正確に１つのユニットを含む。一価結合実体は、ポリペプチド、全長抗体、抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖフラグメントを含む）、一本鎖抗体分子、例えば、一本鎖Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等を含むが、これらに限定されない。一価結合実体は、例えば、最新技術、例えば、ファージディスプレイ又は免疫化を使用して操作された足場タンパク質であることができる。また、一価結合実体は、ポリペプチドであることもできる。特定の実施態様では、一価結合実体は、ＣＨ２－ＣＨ３ Ｉｇドメインと、血液脳関門レセプターに向けられた一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）とを含む。ｓｃＦａｂは、リンカーによりＣＨ２－ＣＨ３ ＩｇドメインのＣ末端に結合する。特定の実施態様では、ｓｃＦａｂは、ヒトトランスフェリンレセプター（トランスフェリンレセプター１）に向けられる。
【0132】
「一価結合様式」という用語は、一価結合実体とＢＢＢＲとの間の相互作用が１つの単一エピトープを介して起こる、ＢＢＢＲへの特異的結合を指す。一価結合様式は、単一のエピトープ相互作用点によるＢＢＢＲの任意の二量体化／多量体化を防止する。一価結合様式は、ＢＢＢＲの細胞内選別が変更されることを防止する。
【0133】
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合可能な任意のポリペプチド決定基を指す。特定の実施態様では、エピトープ決定基は、分子の化学的に活性な表面基、例えば、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニルを含み、特定の実施態様では、特定の三次元構造特性及び／又は特定の電荷特性を有することができる。エピトープは、抗体により結合される抗原の領域である。
【0134】
「（ヒト）トランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）」及び「トランスフェリンレセプター１」（ＴｆＲ１）という用語は、本明細書において互換的に使用される。それらは、２つのジスルフィド結合サブユニット（それぞれ約９０，０００Ｄａの見かけの分子量）から構成され、脊椎動物における鉄取り込みに関与する膜貫通糖タンパク質（約１８０，０００Ｄａの分子量を有する）を指す。一実施態様において、本明細書におけるＴｆＲ（ＴｆＲ１）は、Schneider et al.（Nature 311 (1984) 675 - 678）に報告されているアミノ酸配列を含むヒトＴｆＲ（ＴｆＲ１）である。
【0135】
「神経障害」という用語は、ＣＮＳに影響を及ぼし及び／又はＣＮＳに病因を有する疾患又は障害を指す。例示的なＣＮＳ疾患又は障害は、神経障害、アミロイドーシス、ガン、眼の疾患又は障害、ウイルス又は微生物の感染、炎症、虚血性疾患、神経変性疾患、てんかん発作、行動障害及びリソソーム蓄積症を含むが、これらに限定されない。本願の目的で、ＣＮＳは、血液－網膜関門により身体の残りの部分から通常隔離される眼を含むと理解されるであろう。神経障害の特定の例は、神経変性疾患（レビー小体病、ポストポリオ症候群、Ｓｈｙ－Ｄｒａｅｇｅｒ症候群、オリボポン小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体変性、タウオパシー（アルツハイマー病及び核上性麻痺を含むが、これらに限定されない）を含むが、これらに限定されない）、プリオン病（ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト－ヤコブ症候群、クールー病、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ－Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ病、慢性消耗性疾患及び致死的な家族性不眠症を含むが、これらに限定されない）、球麻痺、運動ニューロン疾患及び神経系異変性障害（カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥレット症候群、メンケス病、コッカイン症候群、ハレルヴォーデン－スパッツ症候群、ラフォラ病、レト症候群、肝臓病変性、レッシュ－ナイハン症候群及びウンベルリッヒ－ランドボルグ症候群を含むが、これらに限定されない）、認知症（ピック病及び脊髄小脳運動失調症を含むが、これらに限定されない）、ガン（例えば、ＣＮＳ及び／又は脳のガン、体内の他の箇所のガンに起因する脳転移を含む）を含むが、これらに限定されない。
【0136】
「神経障害剤」という用語は、１種以上の神経障害を処置する薬剤又は治療剤を指す。神経障害剤は、低分子化合物、抗体、ペプチド、タンパク質、１種以上のＣＮＳターゲットの天然リガンド、１種以上のＣＮＳターゲットの天然リガンドの改変版、アプタマー、阻害性核酸（すなわち、小型阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、リボザイム及び低分子又は前述のいずれかの活性フラグメントを含むが、これらに限定されない。例示的な神経障害剤は、抗体、アプタマー、タンパク質、ペプチド、阻害性核酸及び低分子並びに前述のいずれかの活性フラグメントを含むが、これらに限定されない。同活性フラグメントは、それら自体であるか又は、ＣＮＳ抗原又はターゲット分子、例えば、アミロイド前駆体タンパク質もしくはその一部、アミロイドベータ、ベータ－セクレターゼ、ガンマ－セクレターゼ、タウ、アルファ－シヌクレイン、パーキン、ハンチンチン、ＤＲ６、プレセニリン、ＡｐｏＥ、グリオーマもしくは他のＣＮＳガンマーカー及びニューロトロフィン（ただし、これらに限定されない）を特異的に認識し及び／もしくはこれらに作用する（すなわち、阻害する、活性化する又は検出する）かのいずれかである。神経障害剤及び対応する障害の非限定的な例は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、慢性脳損傷（神経形成）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ－２）、抗上皮成長因子レセプター脳ガン（ＥＧＦＲ）－抗体、グリア細胞系統由来神経因子パーキンソン病（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）筋萎縮性側索硬化症、うつ病、脳のリソソーム酵素リソソーム貯蔵障害、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）筋萎縮性側索硬化症、ニューレグリン－１統合失調症、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ）ＨＥＲ２陽性ガンからの脳転移を処置するのに使用することができる。
【0137】
「造影剤」という用語は、その存在及び／又は位置を直接的又は間接的に検出することを可能にする１つ以上の特性を有する化合物を指す。このような造影剤の例は、検出を可能にするラベル実体を組み込んだタンパク質及び低分子化合物を含む。
【0138】
「ＣＮＳ抗原」及び「脳ターゲット」という用語は、抗体又は低分子でターゲット化することができる、脳を含むＣＮＳにおいて発現される、抗原及び／又は分子を指す。このような抗原及び／又は分子の例は、ベータ－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、アミロイドベータ（Ａベータ）、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子レセプター２（ＨＥＲ２）、タウ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ－シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、デスレセプター６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィンレセプター（ｐ７５ＮＴＲ）及びカスパーゼ６を含むが、これらに限定されない。一実施態様において、抗原は、ＢＡＣＥ１である。
【0139】
「特異的に結合する」という用語は、抗原に選択的又は優先的に結合する抗体を指す。結合親和性は、一般的には、標準的なアッセイ、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析又は表面プラズモン共鳴技術（例えば、BIACORE（登録商標）を使用）を使用して決定される。
【0140】
「コンジュゲート」は、１つ以上の異種分子（ラベル、神経障害剤又は細胞傷害剤を含むが、これらに限定されない）にコンジュゲーションした融合タンパク質である。
【0141】
「リンカー」という用語は、本明細書で報告された血液脳関門シャトルモジュール及び／又は融合ポリペプチド及び／又はコンジュゲートの異なる実体を共有結合させる化学リンカー又は一本鎖ペプチドリンカーを指す。リンカーは、例えば、脳エフェクター実体を一価結合実体に結合させる。例えば、一価結合実体が、ＣＨ２－ＣＨ３ Ｉｇ実体及び血液脳関門レセプターに向けられるｓｃＦａｂを含む場合、リンカーは、ｓｃＦａｂをＣＨ３－ＣＨ２ Ｉｇ実体のＣ末端にコンジュゲーションさせる。脳エフェクター実体を一価結合実体にコンジュゲーションさせるリンカー（第１リンカー）及びｓｃＦａｂをＣＨ２－ＣＨ３ ＩｇドメインのＣ末端に結合させるリンカー（第２リンカー）は、同じか又は異なることができる。
【0142】
ペプチド結合により連結された１～２０個のアミノ酸残基から構成される一本鎖ペプチドリンカーを使用することができる。特定の実施態様では、アミノ酸は、２０種の天然アミノ酸から選択される。特定の他の実施態様では、アミノ酸のうちの１つ以上は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリシンから選択される。他の実施態様では、リンカーは、化学リンカーである。特定の実施態様では、リンカーは、少なくとも２５個 アミノ酸残基の長さ、好ましい一実施態様では、３２～５０個 アミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列を有する一本鎖ペプチドリンカーである。一実施態様において、ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎリンカーである。ここで、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン（ｘ＝３、ｎ＝８、９又は１０）又は（ｘ＝４及びｎ＝６、７又は８）、一実施態様において、ｘ＝４、ｎ＝６又は７、好ましい一実施態様では、ｘ＝４、ｎ＝７。一実施態様において、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号：３７）である。一実施態様において、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）６Ｇ２（配列番号：３８）である。
【0143】
コンジュゲーションは、各種の化学リンカーを使用して行うことができる。例えば、一価結合実体又は融合ポリペプチドと脳エフェクター実体とを、各種の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベラート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン ２，６－ジイソシアナート）及びビス活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を使用してコンジュゲーションさせることができる。リンカーは、脳への送達の際のエフェクター実体の放出を容易にする「開裂可能なリンカー」であることができる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al, Cancer Res. 52 (1992) 127-131；ＵＳ第５，２０８，０２０号）を使用することができる。
【0144】
共有コンジュゲーションは、直接又はリンカーを介してのいずれかであることができる。特定の実施態様では、直接コンジュゲーションは、ポリペプチド融合体の構築による（すなわち、ＢＢＢＲ及びエフェクター実体に対する一価結合実体をコードし、単一のポリペプチド（鎖）として発現される２つの遺伝子の遺伝的融合による）。特定の実施態様では、直接コンジュゲーションは、ＢＢＢＲに対する一価結合実体の２つの部分のうちの一方における反応性基と、脳エフェクター実体上の対応する基又はアクセプターとの間の共有結合の形成による。特定の実施態様では、直接コンジュゲーションは、適切な条件下でコンジュゲーションされる他の分子への共有結合を形成する反応性基（非限定的な例として、スルフヒドリル基又はカルボキシル基）を含むように、コンジュゲーションされる２つの分子のうちの一方の改変（すなわち、遺伝子改変）による。非限定的な一例として、所望の反応性基（すなわち、システイン残基）を有する分子（すなわち、アミノ酸）を、例えば、ＢＢＢＲ抗体に対する一価結合実体及び神経学的薬剤と形成されたジスルフィド結合に導入することができる。また、タンパク質への核酸の共有コンジュゲーションのための方法も、当技術分野において公知である（すなわち、光架橋、例えば、Zatsepin et al. Russ. Chem. Rev. 74 (2005) 77-95を参照のこと）。また、コンジュゲーションは、各種のリンカーを使用して行うこともできる。例えば、一価結合実体及びエフェクター実体を、各種の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベラート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン ２，６－ジイソシアナート）及びビス活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を使用してコンジュゲーションさせることができる。ペプチド結合により結合されている１～２０個のアミノ酸残基から構成されるペプチドリンカーも使用することができる。特定のこのような実施態様では、アミノ酸残基は、２０種の天然アミノ酸から選択される。特定の他のこのような実施態様では、アミノ酸残基のうちの１つ以上は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリシンから選択される。リンカーは、脳への送達の際のエフェクター実体の放出を容易にする「開裂可能なリンカー」であることができる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al, Cancer Res. 52 (1992) 127-131；ＵＳ第５，２０８，０２０号）を使用することができる。
【0145】
「注入関連副作用」という用語は、治療抗体による対象の処置に関連する意図しない有害事象を指す。一実施態様において、この注入関連副作用は、血管拡張、気管支収縮、喉頭浮腫、心圧低下及び低体温（静脈内適用後）からなる群より選択される。一実施態様において、このような事象は、治療抗体のｉ．ｖ．投与後２時間以内に体温低下をもたらす低体温である。
【0146】
「エフェクター細胞」という用語は、免疫応答のエフェクター期に関与する免疫細胞を指す。例示的な免疫細胞は、骨髄系又はリンパ系起源の細胞、例えば、リンパ球（例えば、Ｂ細胞及び細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＴ細胞など）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、マスト細胞及び好塩基球を含む。一部のエフェクター細胞は、特定のＦｃレセプターを発現し、特定の免疫機能を行う。一部の実施態様では、エフェクター細胞は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘引可能である。例えば、好中球は、ＡＤＣＣを誘引可能である。例えば、単球、マクロファージは、Ｆｃレセプターを発現し、ターゲット細胞の特異的殺傷及び免疫系の他の成分への抗原の提示又は抗原を提示する細胞への結合に関与する。
【0147】
本明細書において以下に記載されるように、本明細書で使用する場合、「投与後の副作用の低減」という用語は、完全なエフェクター機能性ｍＡｂが有する投与後の副作用（すなわち、立体的に又は何等かの方法で妨害されない抗体は、完全なエフェクター機能を有する）と比較される。特に、実際的な理由で、本発明の二重特異性抗体の副作用の低減は、同じ抗体であるが、第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位を欠いている、特に、第１のターゲットに対する抗体の２つのＦａｂ部分を欠いている抗体と比較して決定することができる。本発明の抗体が比較されるこのような構築物は、例えば、本明細書において、「ｍＢＳ－ｎｏＦａｂ」と表１に示される。
【0148】
組成物及び方法
トランスフェリンレセプター（ＴｆＲ１）に対する抗体及び抗体フラグメントは、レセプター媒介性トランスサイトーシスにより、大きな分子を脳内に輸送するのに使用されてきた（Yu et al., 2011; Niewoehner et al., 2014）。しかしながら、近年の研究から、ＴｆＲ１に対する従来のｍＡｂを使用する、以前に見落とされた責任が明らかにされている（Couch et al., 2013）。投与直後のマウスにおいて、急性の臨床徴候が観察され、これは、ｍＡｂのエフェクター機能状態と関連していた。また、これは、１つのＦａｂアームのみがＴｆＲ１に結合する二重特異性ｍＡｂ（ただし、ｍＡｂがネイティブで完全に活性なエフェクター機能を含んでいたことを条件とする）を使用した場合にも観察された。まとめると、抗体のエフェクター機能は、観察された急性臨床徴候に直接関連するため、明らかな戦略は、エフェクター無効変異体を使用することであろう。しかしながら、特定のｍＡｂについては、ネイティブなエフェクター機能が、作用モード及び最適な治療プロファイルに重要である。ｍＡｂ操作及び注意深いｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ評価により、新規なＦｃγＲ－ヒト化マウスモデルにおいて、ＢＳ－ｍＡｂ系の複数の構築物（脳シャトルモジュール、すなわち、一価抗ＴｆＲ１結合部位の、脳シャトルｍＡｂ（ＢＳ－ｍＡｂ）をもたらす治療モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端におけるＦｃ領域への融合）を比較して、ネイティブなＩｇＧエフェクター機能を使用する可能性のあるＡＩＲ（急性注入反応）責任を評価した。
トランスフェリンレセプター（ＴｆＲ１）に対する抗体及び抗体フラグメントは、レセプター媒介性トランスサイトーシスにより、大きな分子を脳内に輸送するのに使用されてきた（Yu et al., 2011; Niewoehner et al., 2014）。しかしながら、近年の研究から、ＴｆＲ１に対する従来のｍＡｂを使用する、以前に見落とされた責任が明らかにされている（Couch et al., 2013）。投与直後のマウスにおいて、急性の臨床徴候が観察され、これは、ｍＡｂのエフェクター機能状態と関連していた。また、これは、１つのＦａｂアームのみがＴｆＲ１に結合する二重特異性ｍＡｂ（ただし、ｍＡｂがネイティブで完全に活性なエフェクター機能を含んでいたことを条件とする）を使用した場合にも観察された。まとめると、抗体のエフェクター機能は、観察された急性臨床徴候に直接関連するため、明らかな戦略は、エフェクター無効変異体を使用することであろう。しかしながら、特定のｍＡｂについては、ネイティブなエフェクター機能が、作用モード及び最適な治療プロファイルに重要である。ｍＡｂ操作及び注意深いｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ評価により、新規なＦｃγＲ－ヒト化マウスモデルにおいて、ＢＳ－ｍＡｂ系の複数の構築物（脳シャトルモジュール、すなわち、一価抗ＴｆＲ１結合部位の、脳シャトルｍＡｂ（ＢＳ－ｍＡｂ）をもたらす治療モノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端におけるＦｃ領域への融合）を比較して、ネイティブなＩｇＧエフェクター機能を使用する可能性のあるＡＩＲ（急性注入反応）責任を評価した。
【0149】
本発明は、少なくとも部分的に、ＴｆＲ１－ターゲティングＢＳ－ｍＡｂのエフェクター機能がＴｆＲ１に結合している時にマスクされるが、そのＣＮＳターゲットに結合している時には活性な構成に戻るという知見に基づいている。この理論に拘束されるものではないが、この二重挙動は、ＴｆＲ１がＢＳ Ｆａｂ／ＢＳ－ｍＡｂに結合した場合、免疫細胞上でのＦｃ領域とＦｃγＲとの結合の立体障害によることができる。この位置では、ＢＳ－ｍＡｂの対向するＮ末端にある２つのＦａｂアームが、ＢＳ－ｍＡｂのＦｃ領域がエフェクター細胞上のＦｃγＲに必要に近接するのを妨げる。ＢＳ－ｍＡｂがＴｆＲ１からＣＮＳ実質に放出され、常在ターゲットがＮ末端Ｆａｂに結合すると、Ｃ末端における遊離ＢＳ－Ｆａｂは、常在エフェクター細胞上のＦｃγＲとの相互作用をもはや妨害しない。このため、これらのデータから、ＢＢＢを横断して安全に輸送することができる完全なエフェクター機能性ｍＡｂの使用のための基礎が提供される。
【0150】
本発明は、少なくとも部分的に、ｍＡｂがＴｆＲ１に結合している時に、ＴｆＲ１ターゲットＢＳ－ｍＡｂのＦｃ領域エフェクター機能がカモフラージュされるが、ｍＡｂがそのＣＮＳターゲットに結合している時には、活性な構成に戻るという知見に基づいている。
【0151】
本発明は、少なくとも部分的に、両方の治療ターゲット結合Ｆａｂアームが注入関連体温低下及びサイトカイン放出を最少限にするために、ＦｃγＲリクルートに対する阻害効果を最大限にするのに必要とされるという知見に基づいている。
【0152】
このため、本明細書で報告された効果は、ＢＳ－ｍＡｂの二特異性三価フォーマット、すなわち、その重鎖Ｃ末端の１つでＢＳ－Ｆａｂにコンジュゲートしている全長二価単特異性抗体に関連している。この遮蔽効果は、従来の二価二重特異性抗体では観察されない。
【0153】
本明細書で報告された方法は、治療ターゲットとしてのアミロイド－β原線維／プラークに特異的に結合し、ＢＢＢシャトルレセプターとしてのヒトトランスフェリンレセプター１に特異的に結合する、脳シャトルモノクローナル抗体（ＢＳ－ｍＡｂ）（ＢＳ－ｍＡｂ３１と示す）を使用して以下に例示される。ＭＡｂ３１は、Ａβプラークに対して高い見かけの親和性を有するオリゴマー及びフィブリル構造を特異的に認識する抗Ａβ ｍＡｂである（１４）。使用された全ての構築物は、エフェクター無効（Ｐ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）突然変異変異体を除いて、完全なエフェクター機能を有するヒトネイティブＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含有した。これらの構築物は、単に本発明を例示するのに使用され、特許請求の範囲において説明された本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0154】
ＢＳモジュールは、従来の治療ｍＡｂの重鎖又は軽鎖のＣ末端においてＦｃ領域に融合して、脳シャトル－ｍＡｂ（ＢＳ－ｍＡｂ）を生じる。これは、治療効果のためにターゲットに結合するか又はＢＢＢ輸送のためにＴｆＲ１に結合するかのいずれかで２つの異なる構成を有するＢＳ－ｍＡｂの本来の構成を保存する。
【0155】
実験結果
脳シャトル－ｍＡｂは、Ｆｃ領域エフェクター機能を遊離形態で維持し、治療抗原直接ターゲットと結合する。
Ｆｃ領域エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を担う。ＢＳ－ｍＡｂ３１構築物及びｍＡｂ３１ ＩｇＧ対応物のＦｃγＲ結合を下記で概説するように確認した。
脳シャトル－ｍＡｂは、Ｆｃ領域エフェクター機能を遊離形態で維持し、治療抗原直接ターゲットと結合する。
Ｆｃ領域エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を担う。ＢＳ－ｍＡｂ３１構築物及びｍＡｂ３１ ＩｇＧ対応物のＦｃγＲ結合を下記で概説するように確認した。
【0156】
最初の結合研究を、溶液中の抗体（ＢＳ－ｍＡｂ３１及び親ｍＡｂ３１）及び二次元表面上に固定化されたＦｃγＲを使用して行った。これにより、溶液中に遊離したｍＡｂと任意の配向にある固定化ＦｃγＲとの間の相互作用を決定することが可能となる（図１Ａ）。まず、４つの異なるＦｃγＲを固定化ターゲットとして流路に固定化した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのアッセイを使用した。ＳＰＲの結果から、両方の構築物が低及び高親和性レセプターと同様にかつそれに応じて、異なるＦｃγＲに結合することが示された（図１Ｂ及び１Ｃを参照のこと）。ＳＰＲ実験からの結合プロファイルは、異なるＦｃγＲに対する結合親和性の報告された順位と一致する（１３）。
【0157】
次に、異なるヒトＦｃγＲを細胞上で個々に過剰発現させる細胞結合実験を行った。ＢＳ－ｍＡｂ３１及び親ｍＡｂ３１は両方とも、等しく良好に結合し（図１Ｄ及び１Ｅ）、順位は、ＳＰＲデータと一致した。
【0158】
まとめると、レセプターが非拘束様式（ＳＰＲ表面上又はよりネイティブな細胞表面上のいずれか）で提示される場合、これらの２つの構築物（ＢＳ－ｍＡｂ及び親ｍＡｂ）についてのＦｃ領域－ＦｃγＲ相互作用に差異はなかった。このことから、ＦｃγＲ相互作用に関与するＦｃ領域が、ＢＳモジュールがＦｃ領域のＣ末端に融合している場合でも、完全に機能的であることが示される。
【0159】
次に、抗体がその治療ターゲットと相互作用している場合に、ＢＳ－ｍＡｂ３１構築物が、Ｆｃ領域エフェクター機能を維持するかどうかを調査した。そのターゲットへの結合により、ＦｃγＲ相互作用のための構築物が、溶液中で遊離した状況と比較して、より少ない立体障害、よりネイティブ様コンホメーションを伴って、より規定された、柔軟性のない状態で提示されるであろう（図２Ａ）。したがって、表面及び単球細胞上に被覆されたヒトＡβタンパク質を利用する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイを使用して、ＦｃγＲを提示するエフェクター細胞をシミュレーションした。２つの異なるサイトカインを、細胞傷害性についてのリードアウトとして使用した。ＢＳ－ｍＡｂ３１は、親ｍＡｂ３１に匹敵する効力を有することが見出された（図２Ｂ及び２Ｃを参照のこと）。この理論に拘束されるものではないが、脳シャトル構築物は、その治療ターゲットに結合した場合、ＢＳモジュールからの干渉を防ぐ配向でＦｃ領域を提示する。
【0160】
第２のアッセイである食作用アッセイでは、初代ヒトエフェクター細胞と共に培養された死後アルツハイマー病（ＡＤ）脳組織切片を利用した（１４）。ＡＤ脳切片を異なる濃度のＢＳ－ｍＡｂ３１及び親ｍＡｂ３１と共にプレインキュベーションし、続けて、エフェクター細胞とインキュベーションした。両抗体について、Ａβプラークロードの濃度依存性の減少が観察された（図２Ｄ及び２Ｋを参照のこと）。これらの結果は、ｍＡｂ修飾ＡβプラークのＦｃレセプター／ミクログリア媒介性食作用が脳におけるＡβプラーククリアランスの主なメカニズムであることを確認する当技術分野と一致する（１５～１７）。この理論に拘束されるものではないが、脳シャトル構築物が細胞表面上のその治療ターゲットと結合するか又は脳内のＡβプラークを修飾する場合、ＦｃγＲ結合及びミクログリアリクルートは、融合ＢＳモジュールにより妨害されないと、結論付けることができる。
【0161】
脳シャトルにより、より速い血漿クリアランスにもかかわらず、ｍＡｂ３１の脳におけるｉｎ ｖｉｖｏ効力が改善される。
適切なｉｎ ｖｉｖｏモデルにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏプラーククリアランス効果を説明するために、トランスジェニックアミロイドーシスマウスモデル（APP London: APP V717I）（１８）において、ＢＳ－ｍＡｂ３１構築物の親ｍＡｂ３１に対するプラーク減少特性を調査した。血漿暴露は、ｍＡｂ３１と比較して、ＢＳ－ｍＡｂ３１についてより低かった（図３Ａを参照のこと）。この理論に拘束されるものではないが、ＢＳ構築物のより低い曝露は、末梢におけるＴｆＲ１への結合によるターゲット媒介薬剤沈着（ＴＭＤＤ）によると考えられる。
適切なｉｎ ｖｉｖｏモデルにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏプラーククリアランス効果を説明するために、トランスジェニックアミロイドーシスマウスモデル（APP London: APP V717I）（１８）において、ＢＳ－ｍＡｂ３１構築物の親ｍＡｂ３１に対するプラーク減少特性を調査した。血漿暴露は、ｍＡｂ３１と比較して、ＢＳ－ｍＡｂ３１についてより低かった（図３Ａを参照のこと）。この理論に拘束されるものではないが、ＢＳ構築物のより低い曝露は、末梢におけるＴｆＲ１への結合によるターゲット媒介薬剤沈着（ＴＭＤＤ）によると考えられる。
【0162】
週１回の投与に基づく４か月間の有効性研究を設計し、血漿曝露をシミュレーションした（図３Ｂを参照のこと）。親ｍＡｂ３１については、はるかに高い持続性の曝露が予測された。一方、以前のデータでは、PS2APPトランスジェニックマウスモデルにおいて、ＢＳ－ｍＡｂ３１の脳曝露が、親ｍＡｂ３１よりかなり大きいことも示されている（９）。
【0163】
毎週４か月の投与後の抗Ａβ ｍＡｂ及びその脳シャトル構築物の大脳皮質におけるターゲット結合を調査した。ＢＳ－ｍＡｂ３１により、はるかに多くのプラーク修飾が検出可能であった（図２Ｃ及び２Ｄ）。この４か月間の慢性処置研究では、脳シャトルの血漿曝露がかなり低かったにもかかわらず、ＢＳ－ｍＡｂ３１処置マウスにおいて、媒体対照及び等モル低用量のｍＡｂ３１と比較して、大脳皮質及び海馬におけるＡβアミロイドプラークの顕著な減少が見られた（図２Ｅ及び２Ｆを参照のこと）。改善された効力は、別のアミロイドーシストランスジェニックマウスモデルにおいて以前に示されており、そこでは、一価のＴｆＲ１結合が絶対的に必須であることが実証されていた（９）。
【0164】
まとめると、このデータから、ｍＡｂ３１のＣ末端に付着したＢＳモジュールは、ミクログリア細胞上のＦｃγＲとの相互作用を妨害しないことが示される。それにより、Ａβプラーククリアランスは、治療ＩｇＧの増強された脳暴露により、顕著に改善されたｉｎ ｖｉｖｏ効力とは別に促進される（９）。
【0165】
脳シャトル固有のＴｆＲ１結合様式により、ＦｃγＲとの結合が減弱される。
ＢＳ－ｍＡｂ３１及び抗ＴｆＲ１ ｍＡｂのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＴｆＲ１結合特性を調査した。ＢＳ－ｍＡｂ３１構築物は、Ｃ末端ＢＳモジュールとして抗ＴｆＲ１ Ｆａｂを含有する。ＢＳ－ｍＡｂ３１（図４Ａ）及び二価のネイティブな抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ（図４Ｂ）のＴｆＲ１への結合は異なり、治療実体（ＩｇＧ）及びＦｃ領域が環境に向かって異なる空間的提示をもたらすことが見出された。
ＢＳ－ｍＡｂ３１及び抗ＴｆＲ１ ｍＡｂのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＴｆＲ１結合特性を調査した。ＢＳ－ｍＡｂ３１構築物は、Ｃ末端ＢＳモジュールとして抗ＴｆＲ１ Ｆａｂを含有する。ＢＳ－ｍＡｂ３１（図４Ａ）及び二価のネイティブな抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ（図４Ｂ）のＴｆＲ１への結合は異なり、治療実体（ＩｇＧ）及びＦｃ領域が環境に向かって異なる空間的提示をもたらすことが見出された。
【0166】
構築物がＴｆＲ１に結合した場合のＦｃ領域の機能性を、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイを使用して決定した。このアッセイでは、一方の細胞が、ＴｆＲ１を発現し、他方の細胞（ヒトＮＫ９２）が、ＦｃγＲＩＩＩＡを発現するエフェクター細胞の機能を有する。ＡＤＣＣは、免疫系のエフェクター細胞がターゲット細胞を能動的に溶解する細胞媒介性免疫防御のメカニズムであり、その膜表面抗原は、特異性抗体に結合する。
【0167】
相互作用を、３つの異なるＩｇＧ構築物を使用して分析した。予想されたとおり、完全なエフェクター機能を有する標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ（二価、単特異性）は、強力なＡＤＣＣ応答を生じた。抗ＴｆＲ１ １Ｆａｂ ｍＡｂも、ＡＤＣＣ応答を生じたが、アビッド結合の喪失により、より高い濃度であった（図４Ｃ）。全ての細胞傷害効果は、Ｆｃ領域により媒介された。エフェクター機能を有さない抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ（Ｆｃ領域におけるＰ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異）を使用して確認した。この抗体は、このＡＤＣＣアッセイにおいて効果を有さなかった。興味深いことに、ｍＡｂ３１の重鎖のＣ末端に融合した１つ又は２つのＢＳモジュールを有する２つの脳シャトル構築物は、細胞傷害性を全く有さなかったか又は非常に低レベルであった（図４Ｃ）。最も高いＡＤＣＣ効果を引き起こした標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂの濃度では、抗ＴｆＲ１ １Ｆａｂ ｍＡｂについてはわずかな効果しか検出されなかったが、他の全ての構築物は、検出可能な効果を有さなかった（図４Ｄ）。
【0168】
ｄＢＳ－２Ｆａｂフォーマットについては、劣った脳シャトリング活性が以前に見出されていた（９）ことを指摘しなければならない。
【0169】
これらの結果は、ｄＢＳ－２Ｆａｂ構築物が抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ構築物と同様の見かけのＴｆＲ１結合親和性を有することが以前に示されたように、異なる構築物間の結合強度の差により説明することはできない。両構築物が、２つのＦａｂ結合ＴｆＲ１ドメインを有するためである（９）。
【0170】
このため、脳シャトル構築物中のＦｃ領域は、完全なエフェクター機能を有していても、ＡＤＣＣ応答を誘引するために、特定のＦｃγＲと生産的に結合できなかったことが見出された。
【0171】
エフェクター機能を有する従来の抗ＴｆＲ１ ｍＡｂは、初回注入反応及びサイトカイン誘引を引き起こす。
上記示されたように、ＢＳ－ｍＡｂ構築物は、脳内のそのターゲットと結合すると、そのエフェクター機能を維持する。ここで、ＢＳ抗体がＢＳモジュールを介してＴｆＲ１に結合する場合に、エフェクター機能がどのような結果を有するであろうかを決定した。これは、マウスにおける標準的なＹ型抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ処置が、急性臨床徴候を引き起こす（１２）という、近年の知見を考慮すると特に重要である。
上記示されたように、ＢＳ－ｍＡｂ構築物は、脳内のそのターゲットと結合すると、そのエフェクター機能を維持する。ここで、ＢＳ抗体がＢＳモジュールを介してＴｆＲ１に結合する場合に、エフェクター機能がどのような結果を有するであろうかを決定した。これは、マウスにおける標準的なＹ型抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ処置が、急性臨床徴候を引き起こす（１２）という、近年の知見を考慮すると特に重要である。
【0172】
第一段階では、これをｈｕＦｃγＲトランスジェニックマウス系で試験した。要するに、このモデルを４つのヒト対応物（ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＣＧＲ２Ｃ及びＦＣＧＲ３Ｂ）による２つの活性化低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子（Ｆｃγｒ３及びＦｃγｒ４）の遺伝子ターゲット化置換により産生した（図５Ａ）。これにより、エフェクター機能のトリガーをもたらすヒト／ヒト化ｍＡｂとヒトＦｃγＲとの間の可能性のある相互作用をｉｎ ｖｉｖｏで評価するのに適した系が提供される。このモデルは、初回注入反応（ＦＩＲ）をモニタリングするために遠隔測定温度リードアウトを使用する（図５Ｂ）。既に上記で概説されたように、ＦＩＲをＦｃγＲとの相互作用及びエフェクター免疫細胞のリクルートにより誘引する。このモデルにおける無線記録システムにより、動物が研究中に自由に動くことが可能となる。
【0173】
まず、従来の抗ＴｆＲ１ ｍＡｂの注射により誘引されたＦＩＲを測定した。図５Ｃに示されるように、従来の抗ＴｆＲ１ ｍＡｂの注射により、体温の濃度依存的かつ一過性の低下がもたらされた。同低下は、約２時間以内に正常レベルに戻った。
【0174】
第二に、従来の抗ＴｆＲ１ ｍＡｂの一価形態の注射により誘引されたＦＩＲを決定した。従来の抗ＴｆＲ１ ｍＡｂの一価形態は、ＴｆＲ１に対するＦａｂアームを１つのみ含有する。また、このｍＡｂにより、ＦＩＲが強く誘引された。このため、二価ｍＡｂ結合によるＴｆＲ１の二量体化／多量体化は、体温低下の原因とならないことが見出された。
【0175】
第三に、抗ＴｆＲ１ ｍＡｂを使用してこのモデルで観察されたＦＩＲに対するエフェクター機能の相対的寄与を、ＦｃγＲ結合に必要な残基においてＦｃ領域に突然変異を有するｍＡｂを使用して決定した（２０）。ＦｃγＲ相互作用を欠くＦｃ領域三重突然変異体Ｐ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａは、このモデルにおいて体温低下を示さなかった（図５Ｄ）。このため、Ｆｃ領域が著しいＦＩＲの原因であることが見出された。これは、Ｆｃ領域エフェクター機能排除構築物を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏデータにより裏付けられる（図４Ｃ）。
【0176】
抗ＴｆＲ１ ｍＡｂの投与の応答としての種々のサイトカインのレベルを決定した。特定の細胞シグナル伝達分子は、濃度において強く増加することが見出された（図５Ｅ）。特に、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、ケラチノサイト由来サイトカイン（ＫＣ）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ－２）及びインターフェロンガンマ誘引タンパク質１０（ＩＰ－１０）は、強い応答を示した。これらのサイトカイン応答は、とりわけ、好中球活性化と相関させることができる。温度リードアウト実験において見られるように、除去されたＦｃ領域エフェクター機能を有するＩｇＧ構築物を使用した場合、サイトカイン誘引に対する効果は、実質的に生じなかった（図５Ｅ）。
【0177】
このため、ＴｆＲ１に結合するＩｇＧが末梢におけるエフェクター細胞に接近可能な位置にＦｃ領域を提示し、適応免疫応答を引き起こすことができることが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで見出された。
【0178】
ＴｆＲ１に対する脳シャトル結合様式は、エフェクター機能をサイレンシングし、初回注入反応及びサイトカイン産生を減弱させる。
上記データから、ＢＳモジュールが、その治療ターゲットに結合した場合、ｍＡｂエフェクター機能を損なわないことが実証される（図２及び３）。一方、ＴｆＲ１に結合する従来のｍＡｂは、Ｆｃ領域媒介性エフェクター機能を介してＦＩＲを誘発する場合があることが見出された（図４及び５）。
上記データから、ＢＳモジュールが、その治療ターゲットに結合した場合、ｍＡｂエフェクター機能を損なわないことが実証される（図２及び３）。一方、ＴｆＲ１に結合する従来のｍＡｂは、Ｆｃ領域媒介性エフェクター機能を介してＦＩＲを誘発する場合があることが見出された（図４及び５）。
【0179】
ＴｆＲ１は、末梢細胞上で広く発現されるため、ＢＳモジュールを介してこれらの細胞種に結合するＴｆＲ１の結果を決定した。これを評価するために、３つの異なるＢＳ－ｍＡｂ構築物をｈｕＦｃγＲトランスジェニックマウスに投与した（図６Ａ）。これらは全て、ヒトのネイティブなＩｇＧ１エフェクター機能を有したが、治療的に有効なＦａｂの数（＝結合部位）が異なっていた。
【0180】
予想外に、標準的なＢＳ－ｍＡｂ（図においてｍＢＳ－２Ｆａｂと示される）構築物について、ＦＩＲが観察されなかったことが見出された。このことは、ＢＳ－ｍＡｂがｉｎ ｖｉｖｏにおいて、末梢でＦｃγＲ活性化をトリガーしないことを示す（図６Ｂ）。
【0181】
この理論に拘束されるものではないが、下記のことが推定される。ＢＳ－ｍＡｂがＢＳモジュールを介してＴｆＲ１に結合する場合、ＢＳ－ｍＡｂは、Ｆｃ領域認識に不適切な構成で細胞表面上に提示される（図４Ａ）。構築物のｍＡｂ部分は、細胞表面から伸びる２つのＦａｂアームとは逆向きで提示される。このような構成では、結合したＢＳ－ｍＡｂのＦｃ領域は、隣接するエフェクター細胞上のＦｃγＲに対して逆向きに配置される。ＦｃγＲに対するＦｃ領域の逆向き又は細胞表面から離れて伸びる治療ターゲット結合Ｆａｂアームのいずれかが、ＦｃγＲ相互作用の排除及びＢＳ－ｍＡｂ構築物について観察されるＦＩＲのサイレンシングにおいて役割を果たすと仮定することができる。
【0182】
一方又は両方の治療ターゲット結合ＦａｂアームがｍＡｂ部分に欠損している２つの構築物を設計した（図６Ａ）。これらの構築物は、ｈｕＦｃγＲトランスジェニックマウスに適用された場合、急速かつ強力な体温低下によりスコア化されるように、明らかにＦＩＲを引き起こした（図６Ｂ）。体温低下は、両方のＦａｂアームを欠く構築物（ＢＳ－ｎｏＦａｂ）についてさらに顕著であった。異なる構築物について観察された体温低下を、ＦＩＲの間に誘発されたサイトカインパターンの分析によりさらに実証した。図６Ｃに示されるように、体温低下を引き起こす構築物ＢＳ－ｎｏＦａｂのみが、サイトカインレベルの上昇も示す。これとは対照的に、標準的なＢＳ－ｍＡｂ構築物は、ｈｕＦｃγＲマウスに投与された場合に、サイトカインアップレギュレーションを引き起こさなかった（図６Ｃ）。ＢＳ－ｍＡｂについてのサイトカインプロファイルは、エフェクター無効構築物で得られたプロファイルと同等である（図５Ｄを参照のこと）。このことは、ＩｇＧのＦｃ領域を、ＦｃγＲと結合するのに適した位置に提示することの重要性を示す。
【0183】
このため、ＦＩＲ及びサイトカイン放出を最少限にするために、両方の治療ターゲット結合Ｆａｂアームが、ＦｃγＲリクルートに対する阻害効果を最大化にするのに必要であることが見出された。
【0184】
用量－応答も、ＢＳ－ｍＡｂ構築物について調査し（図６Ｄ）、最高用量（２０mg/kg）で少量かつ一過性の効果が検出可能であった。これは、プラーク形成を減少させる非常に有効な治療用量よりも１０倍高い用量である（図３Ｅ及び３Ｆ）。
【0185】
標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂをＢＳ－ｎｏＦａｂと比較した場合（図６Ｅ）、Ｆｃ領域が逆方向で提示され、ＢＳ－ｎｏＦａｂがアビディティ結合からの寄与を欠く一価状態で結合するとしても、両Ｆａｂアームを欠く構築物により、従来のｍＡｂより強い体温低下が誘引された。
【0186】
抗ＴｆＲ１ ｍＡｂに特異的なサイトカインシグネチャー及び脳シャトル構築物による減少した効果。
種々のｍＡｂ構築物についてのサイトカインプロファイルのより詳細な分析を行った。重要なサイトカインを強調するためにヒートマップを作成した（図７）。特に、２つのサイトカインが、非常に異なって応答した。
種々のｍＡｂ構築物についてのサイトカインプロファイルのより詳細な分析を行った。重要なサイトカインを強調するためにヒートマップを作成した（図７）。特に、２つのサイトカインが、非常に異なって応答した。
【0187】
血管内全身光学イメージングにより、脳シャトル構築物がＲＯＳ産生を減弱させることが示される。
反応性酸素種（ＲＯＳ）は、化学的に反応性の化学種である。標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ及び脳シャトル構築物の末梢投与後、全身をＲＯＳ種の誘引についてスキャンした。図８Ａにおいて、代表的な画像から、抗ＴｆＲ１ ｍＡｂとＢＳ－ｍＡｂ（ｍＢＳ－２Ｆａｂ）構築物との間の差異が示される。データを定量化し、ＢＳ－ｍＡｂ（ｍＢＳ－２Ｆａｂ）は、媒体群と比較して顕著な差を示さなかった（図８Ｂ）。
反応性酸素種（ＲＯＳ）は、化学的に反応性の化学種である。標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ及び脳シャトル構築物の末梢投与後、全身をＲＯＳ種の誘引についてスキャンした。図８Ａにおいて、代表的な画像から、抗ＴｆＲ１ ｍＡｂとＢＳ－ｍＡｂ（ｍＢＳ－２Ｆａｂ）構築物との間の差異が示される。データを定量化し、ＢＳ－ｍＡｂ（ｍＢＳ－２Ｆａｂ）は、媒体群と比較して顕著な差を示さなかった（図８Ｂ）。
【0188】
異なるｍＡｂ構築物の構造モデリングにより、ＦｃγＲとの結合における主な差異が示される。
細胞表面発現ＴｆＲ１におけるｍＡｂターゲット結合又はＢＳモジュール結合のいずれかにより提示される３つの異なる構築物間のＦｃ領域－ＦｃγＲ相互作用を、分子構造情報を使用して分析した。図９に、主な観察結果を要約する。
細胞表面発現ＴｆＲ１におけるｍＡｂターゲット結合又はＢＳモジュール結合のいずれかにより提示される３つの異なる構築物間のＦｃ領域－ＦｃγＲ相互作用を、分子構造情報を使用して分析した。図９に、主な観察結果を要約する。
【0189】
まず、１つの細胞表面上のその治療ターゲットに結合した標準的なＢＳ－ｍＡｂ及び隣接する細胞表面上に提示されるＦｃγＲと結合する可能性をモデリングした（図９Ａ及び９Ｄ）。このモデルにより、ＦｃγＲへの自由なアクセス及びクラスタリングが予測された。同様に、図９Ａ及び９Ｄに、標準的なＩｇＧのＣ末端における更なるＢＳモジュール（抗ＴｆＲ１ ＣｒｏｓｓＦａｂ）の存在により、ＦｃγＲ結合が妨害されないことも示す。
【0190】
第二に、ｉｎ ｖｉｖｏで非常に活性であるＢＳ－ｎｏＦａｂ構築物をモデリングした。この構築物は、ＴｆＲ１に結合している間に、ＦｃγＲに好ましい様式で提示され、そのターゲットに結合した場合に、標準的なｍＡｂと同様の方法でクラスタリングを可能にした（図９Ｂ及び９Ｅ）。
【0191】
第三に、脳シャトル構築物（ＢＳ－ｍＡｂ＝ｍＢＳ－２Ｆａｂ）をモデリングした。このモデルは、治療抗原結合ＦａｂがＦｃγＲに非常に近接して位置し、特に、ＢＳ－ｓｃＦａｂ／ＦｃγＲ複合体の密接なクラスタリングを妨げると考えられるという、本明細書で報告されたｉｎ ｖｉｖｏでの知見を支持することが見出された（図９Ｃ及び９Ｆ）。
【0192】
概要
Ｆｃ領域依存性エフェクター機能は、多くの場合、ＣＮＳ分野における治療効果のための特定のｍＡｂの作用メカニズムの一部である。ｍＡｂは、それらの同族抗原に結合し、次に、免疫細胞の細胞表面上の特異的なＦｃレセプターにより認識される。これらのＦｃレセプターの架橋により、いくつかのエフェクター細胞機能の活性化がもたらされる（２２）。このように、ｍＡｂは、適応免疫系の認識の特異性と自然免疫系の細胞の破壊能力を結びつける、免疫系の２つのアーム間の橋渡しである。エフェクター機能が治療効果に重要である場合がある例は、凝集したアミロイド－β、リン酸化タウタンパク質及びα－シヌクレインがＦｃγＲ結合及びミクログリアによる貪食を介して除去される必要があるアルツハイマー病及びパーキンソン病を含む。ＢＳ－ｍＡｂ構築物は、末梢組織においてＴｆＲ１に結合し、トランスフェリンレセプター１を発現する細胞の表面上で全く異なる配置でｍＡｂを配向させる更なる結合ドメイン（ＢＳモジュール）を含有する（図４Ａ）。
Ｆｃ領域依存性エフェクター機能は、多くの場合、ＣＮＳ分野における治療効果のための特定のｍＡｂの作用メカニズムの一部である。ｍＡｂは、それらの同族抗原に結合し、次に、免疫細胞の細胞表面上の特異的なＦｃレセプターにより認識される。これらのＦｃレセプターの架橋により、いくつかのエフェクター細胞機能の活性化がもたらされる（２２）。このように、ｍＡｂは、適応免疫系の認識の特異性と自然免疫系の細胞の破壊能力を結びつける、免疫系の２つのアーム間の橋渡しである。エフェクター機能が治療効果に重要である場合がある例は、凝集したアミロイド－β、リン酸化タウタンパク質及びα－シヌクレインがＦｃγＲ結合及びミクログリアによる貪食を介して除去される必要があるアルツハイマー病及びパーキンソン病を含む。ＢＳ－ｍＡｂ構築物は、末梢組織においてＴｆＲ１に結合し、トランスフェリンレセプター１を発現する細胞の表面上で全く異なる配置でｍＡｂを配向させる更なる結合ドメイン（ＢＳモジュール）を含有する（図４Ａ）。
【0193】
ＢＳ－ｍＡｂは、ｍＡｂのＦｖ部分によりその治療ターゲットに結合した場合、エフェクター機能を完全に刺激可能であることが、本発明者らによりここで見出された。このため、重鎖上のＣ末端付着ＢＳモジュールにより、Ｆｃ－ＦｃγＲのリクルート及び結合が妨害されない。ＢＳ－ｍＡｂ及び親ｍＡｂは等しく活性である（図２に、例示的な抗Ａβ ｍＡｂについての活性を示す；両抗体は、Ａβのグリア貪食を刺激するのにおいて等しく活性であり、エフェクター機能に直接依存することが示されている（２３））。
【0194】
ＢＳ－ｍＡｂが脳内でその治療効果を促進することができる前に、投与後に、構築物が血流中（全身）を循環するであろう。それにより、多数の細胞種（２４）上で発現されるＴｆＲ１と結合し、ＢＢＢを横断して輸送される。全身循環におけるこのＴｆＲ１の結合は、Ｆｃ領域のエフェクター機能による局所炎症応答を潜在的に生じさせる場合がある。
【0195】
ヒト発現プロファイルを再現する重要なｈｕＦｃγＲを発現する新規なｈｕＦｃγＲトランスジェニックマウスモデルを使用することにより、ヒト／ヒト化ｍＡｂによりトリガーされるＦＩＲを、連続的な温度データ収集を可能にする適合可能な遠隔測定モニタリングシステムに基づいて評価した。ヒト／ヒト化ｍＡｂを調査するためにこのヒト化ＦｃγＲモデルを使用することの重要性は、マウスＦｃγＲとヒトＦｃγＲとの間の固有の差異を反映して、野生型動物において見出されるはるかに低いＦＩＲ応答において実証される。
【0196】
ネイティブなＩｇＧ１ Ｆｃ領域を有する従来の二価抗ＴｆＲ１ ｍＡｂは、強力なＦＩＲを引き起こすことが見出された（図５Ｃを参照のこと）。エフェクター無効変異体が完全に不活性であるため、ＦＩＲ関連体温変化は、Ｆｃ領域－ＦｃγＲ相互作用により駆動されることも見出された。
【0197】
完全にネイティブなヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含むＢＳ－ｍＡｂ構築物は、結合様式に依存して、ＦｃγＲレセプターと完全に相互作用することができることが見出された。ＢＳ－ｍＡｂは、ＣＮＳ血管の管腔部分上でのＴｆＲ１への結合を介して、ＢＢＢにわたる転座を介したＣＮＳへの進入を促進するように設計されている。このため、内皮ＴｆＲ１の結合は、脳常在ターゲットの結合に先行する。したがって、ＢＳ－ｍＡｂ構築物は、広く発現されたＴｆＲ１の末梢結合により、ＦＩＲのような全身性の有害作用を理想的には誘発しないべきである。ＢＢＢの通過後、同じＢＳ－ｍＡｂは、局所的に発現されたターゲット抗原の結合時に、例えば、プラークのミクログリア支援クリアランスのために、完全なエフェクター機能を保存する必要がある。ここで、ＢＳ－ｍＡｂ構築物のｈｕＦｃγＲマウスへの全身投与は、この構築物が末梢においてマウスＴｆＲ１に結合し、完全に機能的なＦｃ領域を有しても、温度リードアウトを使用して測定可能なＦＩＲを誘引しなかったことが見出された（図６Ｂ）。
【0198】
本発明者らにより、立体障害が、この差次的挙動の理由であることを見出された。ネイティブなＦａｂアームを欠く構築物は、Ｃ末端ＢＳがＴｆＲ１に結合する場合、Ｆｃ部分が本来とは異なる配向に起因して反転される場合でも、ＦＩＲを引き起こす能力を回復したことが見出された。
【0199】
ＢＳモジュールの反対側に１つのＦａｂアームのみを含有する構築物は、中間のＦＩＲ効果を示すことが見出された（図６Ｂ）。
【0200】
モデリング法を使用して、標準的なＩｇＧフォーマットでの抗ＴｆＲ１抗体の場合、ターゲット細胞上でのＴｆＲ１へのその抗ＴｆＲ１ Ｆａｂのうちの１つの結合は、その本来の構成におけるＦｃγＲとの相互作用のためのＦｃ領域を示すことが見出された。
【0201】
この理論に拘束されるものではないが、第２の非結合Ｆａｂは、抗体ヒンジ中のジスルフィド架橋により拘束されるため、おそらく、ターゲット細胞に向かって下向きに指向するのに適している。代替的に、第２のＦａｂは、ターゲット細胞上の別のＴｆＲ１レセプターに結合することができる。
【0202】
Ｆｃ－抗ＴｆＲ１ Ｆａｂ Ｃ－末端融合により、４×Ｇ４Ｓ可撓性リンカーを介した抗ＴｆＲ１ ＦａｂのＣ－末端融合がＦｃ－領域のＮ－末端部分と主に関与するＦｃ－領域－ＦｃγＲ相互作用を妨害しないため、妨害されないＦｃγＲ相互作用が可能となる。これは、溶液の場合及び細胞－細胞相互作用の場合又はこの場合のようにターゲット（すなわち、Ａベータプラーク）－細胞相互作用の場合である。このため、ＢＳ－ｍＡｂ Ｆｃ領域とエフェクター細胞上のＦｃガンマレセプターとの相互作用は、そのターゲットと相互作用する場合、Ｃ末端融合脳シャトルモジュール（すなわち、一価抗ＴｆＲ１抗体）により影響されない。
【0203】
この理論に拘束されるものではないが、ＢＳ－ｍＡｂ構築物がＴｆＲ１に結合した場合、状況は異なる。この場合、２つのネイティブなＮ末端治療ターゲット結合Ｆａｂフラグメント（Ｆｃ領域とほぼ同じプレーンである可能性が高いターゲットが存在しない）が、立体障害を形成している。Ｆｃ領域はそれでも、単一のＦｃγＲへの結合を達成することができるが、おそらく、ＦｃγＲの二量体化又は多量体化に必要な更なるＦｃγＲのアプローチが妨げられ、その結果、ＡＤＣＣの形成が阻害される。この概念を図９に概説する。同図には、複数のＦｃγＲ分子の横方向アプローチが、おそらく、ターゲット化されたＩｇＧ－抗ＴｆＲ１ Ｆａｂ Ｃ末端融合複合体に対してより、標準的なＩｇＧ及びＦｃ－抗ＴｆＲ１ Ｆａｂ Ｃ末端融合複合体に対して達成されることが示されている。代替的又は補完的な説明は、カーゴＩｇＧにおける天然のＦａｂがかさ高さのために食細胞カップ内の細胞間のギャップを増加させるため、拡散バリアの外側のホスファターゼを立体的に排除することができないことである（２５、２６）。これにより、下流のキナーゼシグナル伝達の活性化に必要な食細胞カップ内のサブミクロンスケールでのホスファターゼ及びキナーゼの重要な分離が妨げられるであろう。
【0204】
まとめると、従来のｍＡｂのＣ末端におけるＢＳモジュールの付加によっては、Ｆｃ領域及びＦｃγＲ相互作用により媒介されるようなＢＳ－ｍＡｂフォーマットの治療効果は妨害されないことが見出された。また、ＢＳ－ｍＡｂにおいて、ＴｆＲ１がＢＳモジュールに抹消において結合した場合、Ｆｃ領域媒介性エフェクター機能により、ＦＩＲがもたらされる可能性があることも見出された。ＢＳ－ｍＡｂフォーマットのこの有益な特性は、この理論に拘束されるものではないが、ＢＳモジュールの反対側のＮ末端位置における２つの天然ＩｇＧカーゴＦａｂアームにより及ぼされる立体障害による。この固有の特徴により、野生型ＦｃとのＢＳ－ｍＡｂ融合体の更なる開発が可能となり、ついで、これにより、ＦＩＲのリスクなしに、その治療ターゲットにおいてのみ、それらの所望のＦｃγＲ関連薬理学を発揮可能である。
【0205】
医薬製剤
抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター抗体の適用のための医薬製剤であって、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター抗体が脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプターに特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域を有する医薬製剤を、所望の純度を有するこのような抗体を１つ以上の任意の薬学的に許容し得る担体（Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.(ed.)(1980)）と、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で混合することにより調製する。薬学的に許容し得る担体は、一般的には、利用される用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、バッファー、例えば、ホスファート、シトラート及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０個未満 残基）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリ（ビニルピロリドン）；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンを含む）；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成カウンターイオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）並びに／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容し得る担体は、間質性薬剤分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（HYLENEX（登録商標）, Baxter International, Inc.）を更に含む。ｒｈｕＰＨ２０を含む特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法が、ＵＳ第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、１つ以上の更なるグリコサミノグリカナーゼ、例えば、コンドロイチナーゼと組み合わせられる。
抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター抗体の適用のための医薬製剤であって、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター抗体が脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプターに特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域を有する医薬製剤を、所望の純度を有するこのような抗体を１つ以上の任意の薬学的に許容し得る担体（Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.(ed.)(1980)）と、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で混合することにより調製する。薬学的に許容し得る担体は、一般的には、利用される用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、バッファー、例えば、ホスファート、シトラート及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０個未満 残基）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリ（ビニルピロリドン）；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンを含む）；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成カウンターイオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）並びに／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容し得る担体は、間質性薬剤分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（HYLENEX（登録商標）, Baxter International, Inc.）を更に含む。ｒｈｕＰＨ２０を含む特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法が、ＵＳ第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、１つ以上の更なるグリコサミノグリカナーゼ、例えば、コンドロイチナーゼと組み合わせられる。
【0206】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、ＵＳ第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤は、ＵＳ第６，１７１，５８６号及びＷＯ第２００６／０４４９０８号に記載されているものを含み、後者の製剤は、ヒスチジン－アセタートバッファーを含む。
【0207】
また、本明細書における製剤は、治療される特定の適応症に必要な２つ以上の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさず、補完的な活性を有する活性成分を含有することもできる。このような活性成分は、意図する目的に有効な量で組み合わせて適切に存在する。
【0208】
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般的には無菌である。無菌は、例えば、無菌ろ過膜を通したろ過により容易に達成することができる。
【0209】
治療方法及び組成物
一態様において、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体が、脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプター１に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域とを有し、注入関連体温低下が低減され／防止された神経障害を処置するのにおける使用のための、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体が提供される。特定の実施態様では、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体が、脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプター１に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域とを有し、注入関連体温低下が低減され／防止された神経障害の処置方法における使用のための、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体が提供される。特定の実施態様では、本発明は、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体が、脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプター１に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域とを有し、有効量の抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体（ここで、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体は、脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプター１に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域とを有し、ここで、注入関連体温低下が低減され／防止される）を個体に投与することを含む、神経障害を有する個体を処置する方法における使用のための、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター抗体を提供する。１つのこのような実施態様では、この方法は、更に、有効量の少なくとも１種の更なる治療剤を個体に投与することを含む。更なる実施態様では、本発明は、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体が脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプター１に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域とを有し、注入関連体温低下を低減し／防止するのにおける使用のための、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体を提供する。特定の実施態様では、本発明は、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体が脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプター１に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域を有し、有効量の抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体（ここで、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体は、脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプター１に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域とを有る）を個体に投与することを含む、個体における注入関連体温低下を低減する方法における使用のための、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体を提供する。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、好ましくは、ヒトである。
一態様において、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体が、脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプター１に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域とを有し、注入関連体温低下が低減され／防止された神経障害を処置するのにおける使用のための、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体が提供される。特定の実施態様では、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体が、脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプター１に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域とを有し、注入関連体温低下が低減され／防止された神経障害の処置方法における使用のための、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体が提供される。特定の実施態様では、本発明は、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体が、脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプター１に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域とを有し、有効量の抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体（ここで、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体は、脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプター１に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域とを有し、ここで、注入関連体温低下が低減され／防止される）を個体に投与することを含む、神経障害を有する個体を処置する方法における使用のための、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター抗体を提供する。１つのこのような実施態様では、この方法は、更に、有効量の少なくとも１種の更なる治療剤を個体に投与することを含む。更なる実施態様では、本発明は、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体が脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプター１に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域とを有し、注入関連体温低下を低減し／防止するのにおける使用のための、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体を提供する。特定の実施態様では、本発明は、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体が脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプター１に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域を有し、有効量の抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体（ここで、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体は、脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプター１に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域とを有る）を個体に投与することを含む、個体における注入関連体温低下を低減する方法における使用のための、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体を提供する。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、好ましくは、ヒトである。
【0210】
更なる態様では、本発明は、神経障害を処置するための方法を提供する。一実施態様において、この方法は、このような神経障害を有する個体に、有効量の抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体を投与することを含み、ここで、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体は、脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプター１に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域とを有する。１つのこのような実施態様では、この方法は、更に、有効量の少なくとも１種の更なる治療剤を投与することを含む。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、ヒトであることができる。
【0211】
更なる態様では、本発明は、個体における注入関連体温低下を低減するための方法を提供する。一実施態様において、この方法は、有効量の抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体を個体に投与することを含み、ここで、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体は、脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプター１に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域とを有する。一実施態様において、「個体」は、ヒトである。
【0212】
抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体が、脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプター１に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域とを有する、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体は、治療において単独で又は他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、このような抗体は、少なくとも１種の更なる治療剤と同時投与することができる。
【0213】
抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体が、脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプター１に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域とを有する、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体は、グッド・メディカル・プラクティスに合致する様式で製剤化され、投与され、適用されるであろう。この文脈において考慮すべき要因は、処置される特定の障害、処置される特定のほ乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジューリング及び医師に公知の他の要因を含む。抗体は、対象となる障害を予防し又は治療するのに現在使用されている１つ以上の薬剤と共に製剤化される必要はないが、場合により製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は処置の種類及び上記検討された他の要因により決まる。これらは、一般的には、本明細書に記載されたのと同じ用量及び投与経路又は本明細書に記載された用量の約１～９９％又は経験的／臨床的に適切であると決定される任意の用量及び任意の経路で使用される。
【0214】
疾患の予防又は治療のために、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体が脳ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、ヒトトランスフェリンレセプター１に特異的に結合する１つの結合部位（ＶＨ／ＶＬペア）と、エフェクター機能コンピテント（ネイティブ）Ｆｃ領域を有する、抗脳ターゲット／ヒトトランスフェリンレセプター１抗体の適切な用量（単独で又は１種以上の他の更なる治療剤と組み合わせて使用される場合）は、処置される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的又は治療目的で投与されるかどうか、以前の治療、患者の臨床履歴及び抗体に対する応答並びに主治医の裁量により決まるであろう。抗体は、一度に又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、約１μg/kg～１５mg/kg（例えば、０．５mg/kg～１０mg/kg） 抗体が、例えば、１回以上の別々の投与によるか又は連続注入によるかにかかわらず、患者への投与のための最初の候補用量であることができる。上記言及された要因に応じて、１つの典型的な日量は、約１μg/kg～１００mg/kg以上の範囲にあることができる。数日以上にわたる反復投与のために、状態に応じて、処置は、疾患症状の所望のサプレッションが生じるまで、一般的に維持されるであろう。抗体の１つの例示的な用量は、約０．０５mg/kg～約１０mg/kgの範囲であろう。このため、約０．５mg/kg、２．０mg/kg、４．０mg/kg又は１０mg/kg（又はそれらの任意の組み合わせ）の１回以上の用量を、患者に投与することができる。このような用量は、間欠的に、例えば、毎週又は３週間ごとに投与することができる（例えば、患者が、約２～約２０回又は例えば、約６回の用量の抗体を受け取るように）。最初のより高いロード用量、続けて、１回以上のより低い用量を投与することができる。例示的な用量計画は、約４mg/kgの初期ロード用量を投与し、続けて、約２mg/kg 抗体の週１回維持用量を投与することを含む。ただし、他の用量計画が有用である場合がある。この治療の前進は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニタリングされる。
【0215】
本発明の二重特異性抗体の投与に典型的な注入速度は、５０ml/h～４００ml/h、特に、≧５０ml/h、≧１００ml/h、≧１５０ml/h又は≧２００ml/h；例えば、１００ml/h～４００ml/h、１５０ml/h～４００ml/h又は２００ml/h～４００ml/hである。
【0216】
下記実施例及び図面は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載される。本発明の精神から逸脱することなく、記載された手順を修正することができることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【0217】
【図1-1】図１Ａ～１Ｅは、溶液中で遊離している場合に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦｃγＲ結合及びＦｃ領域機能がＢＳ－ｍＡｂ３１構築物において保存されていることを示す。図１Ａは、遊離溶液中において細胞表面上のＦｃγＲに結合する脳シャトル構築物を図示し、この構造は、ＦｃγＲ、Ｆｃ領域、Ｆａｂ及びＢＳモジュールを含む。図１Ｂは、異なるＦｃγＲ（第１のシグナル）の固定化及び抗Ａベータ抗体ｍＡｂ３１のそれへの結合（第２のシグナル）を示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センソグラムを示す。図１Ｃは、異なるＦｃγＲ（第１のシグナル）の固定化及びＢＳ－抗Ａベータ抗体ｍＡｂ３１（ＢＳ－ｍＡｂ３１）のそれへの結合（第２のシグナル）を示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センソグラムを示す。図１Ｄは、ｈｕＦｃγＲＩ（三角形）又はｈｕＦｃγＲＩＩＩａ（丸）のいずれかへのｍＡｂ３１（白い記号）及びＢＳ－ｍＡｂ３１（黒い記号）の細胞結合を示す。このことから、両構築物が、これら２つのＦｃγＲに匹敵する親和性を有し、高親和性ｈｕＦｃγＲＩにより強いことが実証される。図１Ｅは、ｈｕＦｃγＲＩＩａ（正方形）又はｈｕＦｃγＲＩＩｂ（菱形）のいずれかに対するｍＡｂ３１（白い記号）及びＢＳ－ｍＡｂ３１（黒い記号）の細胞結合を示す。このことから、両構築物が、これら２つの低親和性ｈｕＦｃγＲに匹敵する親和性を有することが示される。
【図1-2】図１Ａ～１Ｅは、溶液中で遊離している場合に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦｃγＲ結合及びＦｃ領域機能がＢＳ－ｍＡｂ３１構築物において保存されていることを示す。図１Ａは、遊離溶液中において細胞表面上のＦｃγＲに結合する脳シャトル構築物を図示し、この構造は、ＦｃγＲ、Ｆｃ領域、Ｆａｂ及びＢＳモジュールを含む。図１Ｂは、異なるＦｃγＲ（第１のシグナル）の固定化及び抗Ａベータ抗体ｍＡｂ３１のそれへの結合（第２のシグナル）を示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センソグラムを示す。図１Ｃは、異なるＦｃγＲ（第１のシグナル）の固定化及びＢＳ－抗Ａベータ抗体ｍＡｂ３１（ＢＳ－ｍＡｂ３１）のそれへの結合（第２のシグナル）を示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センソグラムを示す。図１Ｄは、ｈｕＦｃγＲＩ（三角形）又はｈｕＦｃγＲＩＩＩａ（丸）のいずれかへのｍＡｂ３１（白い記号）及びＢＳ－ｍＡｂ３１（黒い記号）の細胞結合を示す。このことから、両構築物が、これら２つのＦｃγＲに匹敵する親和性を有し、高親和性ｈｕＦｃγＲＩにより強いことが実証される。図１Ｅは、ｈｕＦｃγＲＩＩａ（正方形）又はｈｕＦｃγＲＩＩｂ（菱形）のいずれかに対するｍＡｂ３１（白い記号）及びＢＳ－ｍＡｂ３１（黒い記号）の細胞結合を示す。このことから、両構築物が、これら２つの低親和性ｈｕＦｃγＲに匹敵する親和性を有することが示される。
【図1-3】図１Ａ～１Ｅは、溶液中で遊離している場合に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦｃγＲ結合及びＦｃ領域機能がＢＳ－ｍＡｂ３１構築物において保存されていることを示す。図１Ａは、遊離溶液中において細胞表面上のＦｃγＲに結合する脳シャトル構築物を図示し、この構造は、ＦｃγＲ、Ｆｃ領域、Ｆａｂ及びＢＳモジュールを含む。図１Ｂは、異なるＦｃγＲ（第１のシグナル）の固定化及び抗Ａベータ抗体ｍＡｂ３１のそれへの結合（第２のシグナル）を示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センソグラムを示す。図１Ｃは、異なるＦｃγＲ（第１のシグナル）の固定化及びＢＳ－抗Ａベータ抗体ｍＡｂ３１（ＢＳ－ｍＡｂ３１）のそれへの結合（第２のシグナル）を示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センソグラムを示す。図１Ｄは、ｈｕＦｃγＲＩ（三角形）又はｈｕＦｃγＲＩＩＩａ（丸）のいずれかへのｍＡｂ３１（白い記号）及びＢＳ－ｍＡｂ３１（黒い記号）の細胞結合を示す。このことから、両構築物が、これら２つのＦｃγＲに匹敵する親和性を有し、高親和性ｈｕＦｃγＲＩにより強いことが実証される。図１Ｅは、ｈｕＦｃγＲＩＩａ（正方形）又はｈｕＦｃγＲＩＩｂ（菱形）のいずれかに対するｍＡｂ３１（白い記号）及びＢＳ－ｍＡｂ３１（黒い記号）の細胞結合を示す。このことから、両構築物が、これら２つの低親和性ｈｕＦｃγＲに匹敵する親和性を有することが示される。
【図2-1】図２Ａ～２Ｋは、Ａβターゲット結合に関与する場合に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦｃγＲ結合及びＦｃ領域機能がＢＳ－ｍＡｂ３１構築物において保存されていることを示す。図２Ａは、抗Ａβ ＦａｂアームがＡβに結合した場合に、ＦｃγＲに結合する脳シャトル構築物を図示する。この構築物は、ＦｃγＲ、Ｆｃ領域、Ｆａｂ及びＢＳモジュールを含む。図２Ｂ及び２Ｃは、Ａβ１－４２被覆表面及びＵ９３７単球エフェクター細胞を使用して、ＩＬ－８放出（図２Ｂ）又はＩＰ－１０放出（図２Ｃ）を測定するｍＡｂ３１及びＢＳ－ｍＡｂ３１のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ活性を示す。両構築物は、類似のＡＤＣＣ活性を有する。図２Ｄ～２Ｋは、ヒトＡβプラークの細胞性食作用を示す。ヒトＡＤ脳切片をｍＡｂ３１（図２Ｄ～２Ｇ）又はＢＳ－ｍＡｂ３１（図２Ｈ～２Ｋ）のいずれかと共にプレインキュベーションし、続けて、エフェクター細胞として初代ヒトマクロファージの存在下で細胞培養した。使用された等モル濃度は、初代ヒトマクロファージを含まない、０μg/ml（図２Ｄ及び２Ｈ）、１μg/ml（図２Ｅ及び２Ｉ）、５μg/ml（図２Ｆ及び２Ｊ）及び５μg/ml（図２Ｇ及び２Ｋ）であった。その後、プラークを抗Ａβ抗体でラベルした。データから、両構築物について、類似の濃度依存性食作用活性及びｉｎ ｖｉｔｒｏプラーククリアランスが示される。
【図2-2】図２Ａ～２Ｋは、Ａβターゲット結合に関与する場合に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦｃγＲ結合及びＦｃ領域機能がＢＳ－ｍＡｂ３１構築物において保存されていることを示す。図２Ａは、抗Ａβ ＦａｂアームがＡβに結合した場合に、ＦｃγＲに結合する脳シャトル構築物を図示する。この構築物は、ＦｃγＲ、Ｆｃ領域、Ｆａｂ及びＢＳモジュールを含む。図２Ｂ及び２Ｃは、Ａβ１－４２被覆表面及びＵ９３７単球エフェクター細胞を使用して、ＩＬ－８放出（図２Ｂ）又はＩＰ－１０放出（図２Ｃ）を測定するｍＡｂ３１及びＢＳ－ｍＡｂ３１のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ活性を示す。両構築物は、類似のＡＤＣＣ活性を有する。図２Ｄ～２Ｋは、ヒトＡβプラークの細胞性食作用を示す。ヒトＡＤ脳切片をｍＡｂ３１（図２Ｄ～２Ｇ）又はＢＳ－ｍＡｂ３１（図２Ｈ～２Ｋ）のいずれかと共にプレインキュベーションし、続けて、エフェクター細胞として初代ヒトマクロファージの存在下で細胞培養した。使用された等モル濃度は、初代ヒトマクロファージを含まない、０μg/ml（図２Ｄ及び２Ｈ）、１μg/ml（図２Ｅ及び２Ｉ）、５μg/ml（図２Ｆ及び２Ｊ）及び５μg/ml（図２Ｇ及び２Ｋ）であった。その後、プラークを抗Ａβ抗体でラベルした。データから、両構築物について、類似の濃度依存性食作用活性及びｉｎ ｖｉｔｒｏプラーククリアランスが示される。
【図2-3】図２Ａ～２Ｋは、Ａβターゲット結合に関与する場合に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＦｃγＲ結合及びＦｃ領域機能がＢＳ－ｍＡｂ３１構築物において保存されていることを示す。図２Ａは、抗Ａβ ＦａｂアームがＡβに結合した場合に、ＦｃγＲに結合する脳シャトル構築物を図示する。この構築物は、ＦｃγＲ、Ｆｃ領域、Ｆａｂ及びＢＳモジュールを含む。図２Ｂ及び２Ｃは、Ａβ１－４２被覆表面及びＵ９３７単球エフェクター細胞を使用して、ＩＬ－８放出（図２Ｂ）又はＩＰ－１０放出（図２Ｃ）を測定するｍＡｂ３１及びＢＳ－ｍＡｂ３１のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣ活性を示す。両構築物は、類似のＡＤＣＣ活性を有する。図２Ｄ～２Ｋは、ヒトＡβプラークの細胞性食作用を示す。ヒトＡＤ脳切片をｍＡｂ３１（図２Ｄ～２Ｇ）又はＢＳ－ｍＡｂ３１（図２Ｈ～２Ｋ）のいずれかと共にプレインキュベーションし、続けて、エフェクター細胞として初代ヒトマクロファージの存在下で細胞培養した。使用された等モル濃度は、初代ヒトマクロファージを含まない、０μg/ml（図２Ｄ及び２Ｈ）、１μg/ml（図２Ｅ及び２Ｉ）、５μg/ml（図２Ｆ及び２Ｊ）及び５μg/ml（図２Ｇ及び２Ｋ）であった。その後、プラークを抗Ａβ抗体でラベルした。データから、両構築物について、類似の濃度依存性食作用活性及びｉｎ ｖｉｔｒｏプラーククリアランスが示される。
【図3-1】図３Ａ～３Ｆは、ＢＳ－ｍＡｂ３１構築物についてのｉｎ ｖｉｖｏターゲット結合及びアミロイド－β減少を図示する。図３Ａは、Ｃ５７ＢＬ６オスマウスにおいて行われた薬物動態を示し、血漿曝露は、ｍＡｂ３１と比較してＢＳ－ｍＡｂ３１についてより低かったことを示す。ＢＳ分子のより少ない暴露は、末梢におけるＴｆＲ１への結合による。図３Ｂは、ついで、使用された適切な用量での単回用量ＰＫデータから決定された薬物動態パラメータを使用して、慢性投与プロファイルをシミュレーションしたことを示す。図３Ｃ～３Ｄは、ｍＡｂ３１（図３Ｃ）及びＢＳ－ｍＡｂ３１（図３Ｄ）について、プラーク結合を最後の４ヶ月間の投与後に評価したことを示す。APPLondonをマウスｍＡｂ３１又はＢＳ－ｍＡｂ３１で４ヶ月間処置した。１７．５か月齢で殺処分された未処置動物のプラークロードを、試験開始時のアミロイドーシスのベースラインレベルとしての比較のために示す。図３Ｅ～３Ｆは、プラーク数の強力かつ有意な減少が、媒体及びｍＡｂ３１群で見られる進行性プラーク形成と比較して、大脳皮質（図３Ｅ）及び海馬（図３Ｆ）の両方において、ＢＳ－ｍＡｂ３１による処置後に明らかであることを示す。
【図3-2】図３Ａ～３Ｆは、ＢＳ－ｍＡｂ３１構築物についてのｉｎ ｖｉｖｏターゲット結合及びアミロイド－β減少を図示する。図３Ａは、Ｃ５７ＢＬ６オスマウスにおいて行われた薬物動態を示し、血漿曝露は、ｍＡｂ３１と比較してＢＳ－ｍＡｂ３１についてより低かったことを示す。ＢＳ分子のより少ない暴露は、末梢におけるＴｆＲ１への結合による。図３Ｂは、ついで、使用された適切な用量での単回用量ＰＫデータから決定された薬物動態パラメータを使用して、慢性投与プロファイルをシミュレーションしたことを示す。図３Ｃ～３Ｄは、ｍＡｂ３１（図３Ｃ）及びＢＳ－ｍＡｂ３１（図３Ｄ）について、プラーク結合を最後の４ヶ月間の投与後に評価したことを示す。APPLondonをマウスｍＡｂ３１又はＢＳ－ｍＡｂ３１で４ヶ月間処置した。１７．５か月齢で殺処分された未処置動物のプラークロードを、試験開始時のアミロイドーシスのベースラインレベルとしての比較のために示す。図３Ｅ～３Ｆは、プラーク数の強力かつ有意な減少が、媒体及びｍＡｂ３１群で見られる進行性プラーク形成と比較して、大脳皮質（図３Ｅ）及び海馬（図３Ｆ）の両方において、ＢＳ－ｍＡｂ３１による処置後に明らかであることを示す。
【図3-3】図３Ａ～３Ｆは、ＢＳ－ｍＡｂ３１構築物についてのｉｎ ｖｉｖｏターゲット結合及びアミロイド－β減少を図示する。図３Ａは、Ｃ５７ＢＬ６オスマウスにおいて行われた薬物動態を示し、血漿曝露は、ｍＡｂ３１と比較してＢＳ－ｍＡｂ３１についてより低かったことを示す。ＢＳ分子のより少ない暴露は、末梢におけるＴｆＲ１への結合による。図３Ｂは、ついで、使用された適切な用量での単回用量ＰＫデータから決定された薬物動態パラメータを使用して、慢性投与プロファイルをシミュレーションしたことを示す。図３Ｃ～３Ｄは、ｍＡｂ３１（図３Ｃ）及びＢＳ－ｍＡｂ３１（図３Ｄ）について、プラーク結合を最後の４ヶ月間の投与後に評価したことを示す。APPLondonをマウスｍＡｂ３１又はＢＳ－ｍＡｂ３１で４ヶ月間処置した。１７．５か月齢で殺処分された未処置動物のプラークロードを、試験開始時のアミロイドーシスのベースラインレベルとしての比較のために示す。図３Ｅ～３Ｆは、プラーク数の強力かつ有意な減少が、媒体及びｍＡｂ３１群で見られる進行性プラーク形成と比較して、大脳皮質（図３Ｅ）及び海馬（図３Ｆ）の両方において、ＢＳ－ｍＡｂ３１による処置後に明らかであることを示す。
【図4-1】図４Ａ～４Ｅは、ＴｆＲ１結合ＢＳ－ｍＡｂ３１の配向が隣接する細胞上での生産的なＦｃγＲ相互作用に最適でない位置でのＦｃ領域を示すことを図示する。図４Ａ及び４Ｂは、細胞表面上のＴｆＲ１に結合する脳シャトル構築物（図４Ａ）又は標準的な抗ＴｆＲ１ ＩｇＧ ｍＡｂ（図４Ｂ）の模式図である。ＴｆＲ１、Ｔｆ、ＢＳモジュール、Ｆｃ領域及びカーゴＦａｂ（治療結合部位）。図４Ｃは、異なる構築物の細胞傷害性曲線を示す。抗ＴｆＲ１ ＩｇＧ１抗体により、ＢａＦ３ターゲット細胞のＡＤＣＣは誘発されたが、ＢＳ構築物は、活性が弱かった。標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ（丸）、１つのＦａｂを有する標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ（エラーバー付き正方形）、ＢＳ－２Ｆａｂ三角形、ＢＳ－ｍＡｂ）、ｄＢＳ－ＩｇＧ（三角形）、対照ＩｇＧ（菱形）、標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ ＰＧＬＡＬＡ（エラーバーなし正方形）。図４Ｄは、標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂの最大効果を有する濃度での各構築物についての総細胞傷害性値を示す；１つのＦａｂを有する標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂのみが小さな効果を示すが、他の全ての構築物は、検出可能なＡＤＣＣ活性を有さない。全ての構築物は、完全に機能的なヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含有する。図４Ｅは、ＡＤＣＣアッセイにおいて調査された構築物の模式図を示す。プロットされた値は、平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。＊＊＊＊ｐ＜＝０．０００１（ｔ検定、標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ投与動物と比較）。
【図4-2】図４Ａ～４Ｅは、ＴｆＲ１結合ＢＳ－ｍＡｂ３１の配向が隣接する細胞上での生産的なＦｃγＲ相互作用に最適でない位置でのＦｃ領域を示すことを図示する。図４Ａ及び４Ｂは、細胞表面上のＴｆＲ１に結合する脳シャトル構築物（図４Ａ）又は標準的な抗ＴｆＲ１ ＩｇＧ ｍＡｂ（図４Ｂ）の模式図である。ＴｆＲ１、Ｔｆ、ＢＳモジュール、Ｆｃ領域及びカーゴＦａｂ（治療結合部位）。図４Ｃは、異なる構築物の細胞傷害性曲線を示す。抗ＴｆＲ１ ＩｇＧ１抗体により、ＢａＦ３ターゲット細胞のＡＤＣＣは誘発されたが、ＢＳ構築物は、活性が弱かった。標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ（丸）、１つのＦａｂを有する標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ（エラーバー付き正方形）、ＢＳ－２Ｆａｂ三角形、ＢＳ－ｍＡｂ）、ｄＢＳ－ＩｇＧ（三角形）、対照ＩｇＧ（菱形）、標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ ＰＧＬＡＬＡ（エラーバーなし正方形）。図４Ｄは、標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂの最大効果を有する濃度での各構築物についての総細胞傷害性値を示す；１つのＦａｂを有する標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂのみが小さな効果を示すが、他の全ての構築物は、検出可能なＡＤＣＣ活性を有さない。全ての構築物は、完全に機能的なヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含有する。図４Ｅは、ＡＤＣＣアッセイにおいて調査された構築物の模式図を示す。プロットされた値は、平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。＊＊＊＊ｐ＜＝０．０００１（ｔ検定、標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ投与動物と比較）。
【図4-3】図４Ａ～４Ｅは、ＴｆＲ１結合ＢＳ－ｍＡｂ３１の配向が隣接する細胞上での生産的なＦｃγＲ相互作用に最適でない位置でのＦｃ領域を示すことを図示する。図４Ａ及び４Ｂは、細胞表面上のＴｆＲ１に結合する脳シャトル構築物（図４Ａ）又は標準的な抗ＴｆＲ１ ＩｇＧ ｍＡｂ（図４Ｂ）の模式図である。ＴｆＲ１、Ｔｆ、ＢＳモジュール、Ｆｃ領域及びカーゴＦａｂ（治療結合部位）。図４Ｃは、異なる構築物の細胞傷害性曲線を示す。抗ＴｆＲ１ ＩｇＧ１抗体により、ＢａＦ３ターゲット細胞のＡＤＣＣは誘発されたが、ＢＳ構築物は、活性が弱かった。標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ（丸）、１つのＦａｂを有する標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ（エラーバー付き正方形）、ＢＳ－２Ｆａｂ三角形、ＢＳ－ｍＡｂ）、ｄＢＳ－ＩｇＧ（三角形）、対照ＩｇＧ（菱形）、標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ ＰＧＬＡＬＡ（エラーバーなし正方形）。図４Ｄは、標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂの最大効果を有する濃度での各構築物についての総細胞傷害性値を示す；１つのＦａｂを有する標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂのみが小さな効果を示すが、他の全ての構築物は、検出可能なＡＤＣＣ活性を有さない。全ての構築物は、完全に機能的なヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含有する。図４Ｅは、ＡＤＣＣアッセイにおいて調査された構築物の模式図を示す。プロットされた値は、平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。＊＊＊＊ｐ＜＝０．０００１（ｔ検定、標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ投与動物と比較）。
【図5-1】図５Ａ～５Ｅは、エフェクター機能を有する標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂが初回注入反応及びサイトカイン誘引を誘引することを示す。図５Ａは、ＦｃγＲヒト化マウスモデルの設計の概要を図示する。遺伝子ターゲットＦｃγＲローカス交換。図５Ｂは、マウスの体温変化を皮下に注入されたカプセルを使用する無線システムでモニタリングしたことを図示する。これにより、動物が研究中に自由に動くことが可能であった。図５Ｃは、ＦＩＲをＦｃγＲヒト化マウスにおいて誘発することができ、体温低下により特徴付けられることを示す。標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂは、５mg/kg（丸）及び２０mg/kg（四角形）、媒体対照（三角形）において、用量依存性で一過性の体温低下を誘引した。図５Ｄは、標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ ＰＧＬＡＬＡ（黒丸）により２０mg/kgで体温低下が誘引されないため、ＦＩＲ応答には、完全に活性なエフェクター機能が必要であることを示す。標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ（黒三角形）及び媒体（白三角形）を対照として含めた。図５Ｅは、血液中のサイトカインのパネルを注射の２時間後にモニタリングしたことを示す。標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ（斜線バー）群において、特定のサイトカインが強く増加し、これは、エフェクター機能を有さない群においてほとんど減少した（標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ ＰＧＬＡＬＡ、白色バー）。
【図5-2】図５Ａ～５Ｅは、エフェクター機能を有する標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂが初回注入反応及びサイトカイン誘引を誘引することを示す。図５Ａは、ＦｃγＲヒト化マウスモデルの設計の概要を図示する。遺伝子ターゲットＦｃγＲローカス交換。図５Ｂは、マウスの体温変化を皮下に注入されたカプセルを使用する無線システムでモニタリングしたことを図示する。これにより、動物が研究中に自由に動くことが可能であった。図５Ｃは、ＦＩＲをＦｃγＲヒト化マウスにおいて誘発することができ、体温低下により特徴付けられることを示す。標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂは、５mg/kg（丸）及び２０mg/kg（四角形）、媒体対照（三角形）において、用量依存性で一過性の体温低下を誘引した。図５Ｄは、標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ ＰＧＬＡＬＡ（黒丸）により２０mg/kgで体温低下が誘引されないため、ＦＩＲ応答には、完全に活性なエフェクター機能が必要であることを示す。標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ（黒三角形）及び媒体（白三角形）を対照として含めた。図５Ｅは、血液中のサイトカインのパネルを注射の２時間後にモニタリングしたことを示す。標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ（斜線バー）群において、特定のサイトカインが強く増加し、これは、エフェクター機能を有さない群においてほとんど減少した（標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ ＰＧＬＡＬＡ、白色バー）。
【図5-3】図５Ａ～５Ｅは、エフェクター機能を有する標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂが初回注入反応及びサイトカイン誘引を誘引することを示す。図５Ａは、ＦｃγＲヒト化マウスモデルの設計の概要を図示する。遺伝子ターゲットＦｃγＲローカス交換。図５Ｂは、マウスの体温変化を皮下に注入されたカプセルを使用する無線システムでモニタリングしたことを図示する。これにより、動物が研究中に自由に動くことが可能であった。図５Ｃは、ＦＩＲをＦｃγＲヒト化マウスにおいて誘発することができ、体温低下により特徴付けられることを示す。標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂは、５mg/kg（丸）及び２０mg/kg（四角形）、媒体対照（三角形）において、用量依存性で一過性の体温低下を誘引した。図５Ｄは、標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ ＰＧＬＡＬＡ（黒丸）により２０mg/kgで体温低下が誘引されないため、ＦＩＲ応答には、完全に活性なエフェクター機能が必要であることを示す。標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ（黒三角形）及び媒体（白三角形）を対照として含めた。図５Ｅは、血液中のサイトカインのパネルを注射の２時間後にモニタリングしたことを示す。標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ（斜線バー）群において、特定のサイトカインが強く増加し、これは、エフェクター機能を有さない群においてほとんど減少した（標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ ＰＧＬＡＬＡ、白色バー）。
【図5-4】図５Ａ～５Ｅは、エフェクター機能を有する標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂが初回注入反応及びサイトカイン誘引を誘引することを示す。図５Ａは、ＦｃγＲヒト化マウスモデルの設計の概要を図示する。遺伝子ターゲットＦｃγＲローカス交換。図５Ｂは、マウスの体温変化を皮下に注入されたカプセルを使用する無線システムでモニタリングしたことを図示する。これにより、動物が研究中に自由に動くことが可能であった。図５Ｃは、ＦＩＲをＦｃγＲヒト化マウスにおいて誘発することができ、体温低下により特徴付けられることを示す。標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂは、５mg/kg（丸）及び２０mg/kg（四角形）、媒体対照（三角形）において、用量依存性で一過性の体温低下を誘引した。図５Ｄは、標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ ＰＧＬＡＬＡ（黒丸）により２０mg/kgで体温低下が誘引されないため、ＦＩＲ応答には、完全に活性なエフェクター機能が必要であることを示す。標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ（黒三角形）及び媒体（白三角形）を対照として含めた。図５Ｅは、血液中のサイトカインのパネルを注射の２時間後にモニタリングしたことを示す。標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ（斜線バー）群において、特定のサイトカインが強く増加し、これは、エフェクター機能を有さない群においてほとんど減少した（標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ ＰＧＬＡＬＡ、白色バー）。
【図6-1】図６Ａ～６Ｅは、エフェクター機能を有する抗ＴｆＲ１脳シャトル構築物により、初回注入反応及びサイトカイン誘引が減弱されることを示す。図６Ａは、試験のために操作され、産生された３つの異なる脳シャトル構築物を示す。構築物間の差異は、構築物がＴｆＲ１に結合する場合に、それらがｉｎ ｖｉｖｏでのＦｃγＲ結合にどのように影響を及ぼすかを調査するための、カーゴＦａｂの欠失である。図６Ｂは、３つの構築物を同じ研究において５mg/kgで試験した場合の結果を示す。ｍＢＳ－２Ｆａｂ（ＢＳ－ｍＡｂ；三角形）により、ＦＩＲが誘引されなかった。一方、両カーゴＦａｂを欠く構築物は、最も強い効果（正方形）を有した。１つのカーゴＦａｂ構築物（丸）は、他の２つの構築物の間にあった。図６Ｃは、構築物の注射の２時間後での血液中のサイトカインのパネルについての％ サイトカイン応答を示す。ｍＢＳ－ｎｏＦａｂ（白色バー）のみにより、特定のサイトカインの強い誘引が誘引された。一方、ｍＢＳ－２Ｆａｂ（ＢＳ－ｍＡｂ；斜線バー）は、実質的な効果を有さなかった。図６Ｄは、ＢＳ－ｓＦａｂの２つの用量、５mg/kg（白三角形）及び２０mg/kg（黒丸）並びに媒体群（黒三角形）を比較したものである。ＢＳ－ｓＦａｂについて、２０mg/kgではわずかかつ非常に一時的に体温が低下した。図６Ｅは、ＢＳ－ｎｏＦａｂ構築物と比較して、標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂについての体温低下によりモニタリングされたＦＩＲを示す。興味深いことに、ＢＳ－ｎｏＦａｂ（正方形）により、はるかに強力にＦＩＲが誘引された。媒体群（三角形）を含めた。
【図6-2】図６Ａ～６Ｅは、エフェクター機能を有する抗ＴｆＲ１脳シャトル構築物により、初回注入反応及びサイトカイン誘引が減弱されることを示す。図６Ａは、試験のために操作され、産生された３つの異なる脳シャトル構築物を示す。構築物間の差異は、構築物がＴｆＲ１に結合する場合に、それらがｉｎ ｖｉｖｏでのＦｃγＲ結合にどのように影響を及ぼすかを調査するための、カーゴＦａｂの欠失である。図６Ｂは、３つの構築物を同じ研究において５mg/kgで試験した場合の結果を示す。ｍＢＳ－２Ｆａｂ（ＢＳ－ｍＡｂ；三角形）により、ＦＩＲが誘引されなかった。一方、両カーゴＦａｂを欠く構築物は、最も強い効果（正方形）を有した。１つのカーゴＦａｂ構築物（丸）は、他の２つの構築物の間にあった。図６Ｃは、構築物の注射の２時間後での血液中のサイトカインのパネルについての％ サイトカイン応答を示す。ｍＢＳ－ｎｏＦａｂ（白色バー）のみにより、特定のサイトカインの強い誘引が誘引された。一方、ｍＢＳ－２Ｆａｂ（ＢＳ－ｍＡｂ；斜線バー）は、実質的な効果を有さなかった。図６Ｄは、ＢＳ－ｓＦａｂの２つの用量、５mg/kg（白三角形）及び２０mg/kg（黒丸）並びに媒体群（黒三角形）を比較したものである。ＢＳ－ｓＦａｂについて、２０mg/kgではわずかかつ非常に一時的に体温が低下した。図６Ｅは、ＢＳ－ｎｏＦａｂ構築物と比較して、標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂについての体温低下によりモニタリングされたＦＩＲを示す。興味深いことに、ＢＳ－ｎｏＦａｂ（正方形）により、はるかに強力にＦＩＲが誘引された。媒体群（三角形）を含めた。
【図6-3】図６Ａ～６Ｅは、エフェクター機能を有する抗ＴｆＲ１脳シャトル構築物により、初回注入反応及びサイトカイン誘引が減弱されることを示す。図６Ａは、試験のために操作され、産生された３つの異なる脳シャトル構築物を示す。構築物間の差異は、構築物がＴｆＲ１に結合する場合に、それらがｉｎ ｖｉｖｏでのＦｃγＲ結合にどのように影響を及ぼすかを調査するための、カーゴＦａｂの欠失である。図６Ｂは、３つの構築物を同じ研究において５mg/kgで試験した場合の結果を示す。ｍＢＳ－２Ｆａｂ（ＢＳ－ｍＡｂ；三角形）により、ＦＩＲが誘引されなかった。一方、両カーゴＦａｂを欠く構築物は、最も強い効果（正方形）を有した。１つのカーゴＦａｂ構築物（丸）は、他の２つの構築物の間にあった。図６Ｃは、構築物の注射の２時間後での血液中のサイトカインのパネルについての％ サイトカイン応答を示す。ｍＢＳ－ｎｏＦａｂ（白色バー）のみにより、特定のサイトカインの強い誘引が誘引された。一方、ｍＢＳ－２Ｆａｂ（ＢＳ－ｍＡｂ；斜線バー）は、実質的な効果を有さなかった。図６Ｄは、ＢＳ－ｓＦａｂの２つの用量、５mg/kg（白三角形）及び２０mg/kg（黒丸）並びに媒体群（黒三角形）を比較したものである。ＢＳ－ｓＦａｂについて、２０mg/kgではわずかかつ非常に一時的に体温が低下した。図６Ｅは、ＢＳ－ｎｏＦａｂ構築物と比較して、標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂについての体温低下によりモニタリングされたＦＩＲを示す。興味深いことに、ＢＳ－ｎｏＦａｂ（正方形）により、はるかに強力にＦＩＲが誘引された。媒体群（三角形）を含めた。
【図7-1】図７は、別個のサイトカインパターンが脳シャトル構築物について減少したエフェクター機能を有する標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂにより誘引されることを図示する。図７の左上隅には、基準色（スケール）を示す。ヒートマップは、種々の構築物についての５mg/kg用量での概要を示す。これは、２つのサイトカイン及び種々の構築物についての体温－サイトカイン関係を示す。重要なサイトカインを強調するために、ヒートマップを生成した。特に、２つのサイトカインは、非常に異なって応答した。
【図7-2】図７は、別個のサイトカインパターンが脳シャトル構築物について減少したエフェクター機能を有する標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂにより誘引されることを図示する。図７の左上隅には、基準色（スケール）を示す。ヒートマップは、種々の構築物についての５mg/kg用量での概要を示す。これは、２つのサイトカイン及び種々の構築物についての体温－サイトカイン関係を示す。重要なサイトカインを強調するために、ヒートマップを生成した。特に、２つのサイトカインは、非常に異なって応答した。
【図8-1】図８Ａ～８Ｂは、エフェクター機能を有する標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂにより、脳シャトル構築物を使用して緩和されるＲＯＳ活性化が誘引されることを示す。図８Ａは、全身イメージングを使用したＲＯＳ誘引の検出を示す。図８Ｂは、抗ＴｆＲ１ ｍＡｂのみにより、強力な反応が誘引されることを示すＲＯＳ産生の定量を示す。このことは、ＦＩＲデータと一致する。
【図8-2】図８Ａ～８Ｂは、エフェクター機能を有する標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂにより、脳シャトル構築物を使用して緩和されるＲＯＳ活性化が誘引されることを示す。図８Ａは、全身イメージングを使用したＲＯＳ誘引の検出を示す。図８Ｂは、抗ＴｆＲ１ ｍＡｂのみにより、強力な反応が誘引されることを示すＲＯＳ産生の定量を示す。このことは、ＦＩＲデータと一致する。
【図9-1】図９Ａ～９Ｆは、推定ＦｃγＲ／ＴｆＲ１結合様式の分子モデリングを図示する。図９Ａ及び９Ｄは、標準的なＩｇＧ（場合によりＣ末端抗ＴｆＲ１ ＣｒｏｓｓＦａｂ融合を伴う）を表わす。図９Ｂ及び９Ｅは、ＢＳ－ｎｏＦａｂ（Ｆｃ抗ＴｆＲ１ ＣｒｏｓｓＦａｂ Ｃ末端融合）を表わす。図９Ｃ及び９Ｆは、ＢＳ－ｍＡｂ（ｍＢＳ－２Ｆａｂ；ターゲット化ＩｇＧ抗ｍＴｆＲ１ ＣｒｏｓｓＦａｂ Ｃ末端融合）を表わす。図９Ａ～９Ｃは、エフェクター細胞及びその細胞上のＦｃγＲを上側に、各ターゲット（ＴｆＲ１及びプラークそれぞれ）を下側に有する側面図を示す。図９Ｄ～９Ｆは、エフェクター細胞膜の基底外側上の上面図を示し、図９Ａ～９Ｃに示される複数の複合体が相互作用パートナーの平面において横方向にクラスタリングすることができる程度を近似する。図９Ａ及び９Ｄは、標準的なＩｇＧがその治療ターゲットに結合している間に、エフェクター細胞上での標準的なＩｇＧとＦｃγＲとの相互作用が可能であることを示す。また、図９Ａ及び９Ｄは、標準的なＩｇＧのＣ末端における更なるＢＳモジュール（抗ＴｆＲ１ ＣｒｏｓｓＦａｂ）の存在が、ＦｃγＲ結合を妨害しないことも示す。図９Ｃ及び９Ｆは、ＢＳ－ｍＡｂがＴｆＲに結合している間に、ＢＳ－ｍＡｂとエフェクター細胞上のＦｃγＲとの相互作用が不可能であることを示す。
【図9-2】図９Ａ～９Ｆは、推定ＦｃγＲ／ＴｆＲ１結合様式の分子モデリングを図示する。図９Ａ及び９Ｄは、標準的なＩｇＧ（場合によりＣ末端抗ＴｆＲ１ ＣｒｏｓｓＦａｂ融合を伴う）を表わす。図９Ｂ及び９Ｅは、ＢＳ－ｎｏＦａｂ（Ｆｃ抗ＴｆＲ１ ＣｒｏｓｓＦａｂ Ｃ末端融合）を表わす。図９Ｃ及び９Ｆは、ＢＳ－ｍＡｂ（ｍＢＳ－２Ｆａｂ；ターゲット化ＩｇＧ抗ｍＴｆＲ１ ＣｒｏｓｓＦａｂ Ｃ末端融合）を表わす。図９Ａ～９Ｃは、エフェクター細胞及びその細胞上のＦｃγＲを上側に、各ターゲット（ＴｆＲ１及びプラークそれぞれ）を下側に有する側面図を示す。図９Ｄ～９Ｆは、エフェクター細胞膜の基底外側上の上面図を示し、図９Ａ～９Ｃに示される複数の複合体が相互作用パートナーの平面において横方向にクラスタリングすることができる程度を近似する。図９Ａ及び９Ｄは、標準的なＩｇＧがその治療ターゲットに結合している間に、エフェクター細胞上での標準的なＩｇＧとＦｃγＲとの相互作用が可能であることを示す。また、図９Ａ及び９Ｄは、標準的なＩｇＧのＣ末端における更なるＢＳモジュール（抗ＴｆＲ１ ＣｒｏｓｓＦａｂ）の存在が、ＦｃγＲ結合を妨害しないことも示す。図９Ｃ及び９Ｆは、ＢＳ－ｍＡｂがＴｆＲに結合している間に、ＢＳ－ｍＡｂとエフェクター細胞上のＦｃγＲとの相互作用が不可能であることを示す。
【図9-3】図９Ａ～９Ｆは、推定ＦｃγＲ／ＴｆＲ１結合様式の分子モデリングを図示する。図９Ａ及び９Ｄは、標準的なＩｇＧ（場合によりＣ末端抗ＴｆＲ１ ＣｒｏｓｓＦａｂ融合を伴う）を表わす。図９Ｂ及び９Ｅは、ＢＳ－ｎｏＦａｂ（Ｆｃ抗ＴｆＲ１ ＣｒｏｓｓＦａｂ Ｃ末端融合）を表わす。図９Ｃ及び９Ｆは、ＢＳ－ｍＡｂ（ｍＢＳ－２Ｆａｂ；ターゲット化ＩｇＧ抗ｍＴｆＲ１ ＣｒｏｓｓＦａｂ Ｃ末端融合）を表わす。図９Ａ～９Ｃは、エフェクター細胞及びその細胞上のＦｃγＲを上側に、各ターゲット（ＴｆＲ１及びプラークそれぞれ）を下側に有する側面図を示す。図９Ｄ～９Ｆは、エフェクター細胞膜の基底外側上の上面図を示し、図９Ａ～９Ｃに示される複数の複合体が相互作用パートナーの平面において横方向にクラスタリングすることができる程度を近似する。図９Ａ及び９Ｄは、標準的なＩｇＧがその治療ターゲットに結合している間に、エフェクター細胞上での標準的なＩｇＧとＦｃγＲとの相互作用が可能であることを示す。また、図９Ａ及び９Ｄは、標準的なＩｇＧのＣ末端における更なるＢＳモジュール（抗ＴｆＲ１ ＣｒｏｓｓＦａｂ）の存在が、ＦｃγＲ結合を妨害しないことも示す。図９Ｃ及び９Ｆは、ＢＳ－ｍＡｂがＴｆＲに結合している間に、ＢＳ－ｍＡｂとエフェクター細胞上のＦｃγＲとの相互作用が不可能であることを示す。
【0218】
引用された参考文献のリスト
【表1】
【0219】
本明細書で引用されたこれら及び全ての他の特許及び非特許文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【0220】
実施例
実施例１
脳シャトル構築物
抗体構築物を、ＩｇＧ重鎖及び軽鎖それぞれをコードするｃＤＮＡをほ乳類発現ベクターにクローニングすることにより産生した。全ての抗体定常領域は、使用された抗体に応じて、ヒトであり、可変領域は、ヒト又はラットであった。Ｆｃ Ｃ末端へのＦａｂ融合を重鎖及び軽鎖がＧ４ＳリンカーによりＩｇＧ重鎖の３’末端に、再度Ｇ４Ｓリンカーを介して連結された、一本鎖Ｆａｂ構築物を融合することにより達成した。ノブ－ｉｎｔｏ－ホール技術（Ridgway et al., 1996）を使用して、非対称構築物を得た。構築物をＨＥＫ２９３又はＣＨＯ－Ｋ１細胞中で発現させ、標準的なプロテインＡ親和性、続けて、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製した。抗体調製物を、キャピラリー電気泳動及びＳＥＣによりルーチンに分析し、エンドトキシン含量を測定した。
実施例１
脳シャトル構築物
抗体構築物を、ＩｇＧ重鎖及び軽鎖それぞれをコードするｃＤＮＡをほ乳類発現ベクターにクローニングすることにより産生した。全ての抗体定常領域は、使用された抗体に応じて、ヒトであり、可変領域は、ヒト又はラットであった。Ｆｃ Ｃ末端へのＦａｂ融合を重鎖及び軽鎖がＧ４ＳリンカーによりＩｇＧ重鎖の３’末端に、再度Ｇ４Ｓリンカーを介して連結された、一本鎖Ｆａｂ構築物を融合することにより達成した。ノブ－ｉｎｔｏ－ホール技術（Ridgway et al., 1996）を使用して、非対称構築物を得た。構築物をＨＥＫ２９３又はＣＨＯ－Ｋ１細胞中で発現させ、標準的なプロテインＡ親和性、続けて、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製した。抗体調製物を、キャピラリー電気泳動及びＳＥＣによりルーチンに分析し、エンドトキシン含量を測定した。
【0221】
下記構築物を相応に産生し、本明細書で報告された実施例において使用した。
【0222】
【表2】
【0223】
実施例２
表面プラズモン共鳴によるＦｃγレセプターの結合評価
ＦｃγＲ測定のために、ＳＰＲ捕捉アッセイを使用した。約５０００共鳴単位（RU） 捕捉系（１０μg/ml Penta-His；Quiagen cat. No.34660）を、GE Healthcareにより供給されるアミンカップリングキットを使用することにより、ｐＨ５．０でCM5チップ（GE Healthcare BR-1005-30）上にカップリングした。サンプル及び系バッファーをＰＢＳ－Ｔ＋ｐＨ７．４とした。フローセルを２５℃に設定し、サンプルブロックを１２℃に設定し、ランニングバッファーで２回プライミングした。ＦｃγＲ－Ｈｉｓレセプターを、５μg/ml 溶液を１０μl/分の流量で６０秒間注入することにより捕捉した。結合は、１００nM 抗体サンプルを１０μl/分の流量で１８０秒間注入することにより測定した。表面を１０mM グリシン（ｐＨ１．７）溶液により、１０μl/分の流量で３０秒洗浄することにより再生した。このアッセイにより、ＩｇＧ又はＢＳ－ＩｇＧ構築物のＦｃγＲへの結合を決定した。
表面プラズモン共鳴によるＦｃγレセプターの結合評価
ＦｃγＲ測定のために、ＳＰＲ捕捉アッセイを使用した。約５０００共鳴単位（RU） 捕捉系（１０μg/ml Penta-His；Quiagen cat. No.34660）を、GE Healthcareにより供給されるアミンカップリングキットを使用することにより、ｐＨ５．０でCM5チップ（GE Healthcare BR-1005-30）上にカップリングした。サンプル及び系バッファーをＰＢＳ－Ｔ＋ｐＨ７．４とした。フローセルを２５℃に設定し、サンプルブロックを１２℃に設定し、ランニングバッファーで２回プライミングした。ＦｃγＲ－Ｈｉｓレセプターを、５μg/ml 溶液を１０μl/分の流量で６０秒間注入することにより捕捉した。結合は、１００nM 抗体サンプルを１０μl/分の流量で１８０秒間注入することにより測定した。表面を１０mM グリシン（ｐＨ１．７）溶液により、１０μl/分の流量で３０秒洗浄することにより再生した。このアッセイにより、ＩｇＧ又はＢＳ－ＩｇＧ構築物のＦｃγＲへの結合を決定した。
【0224】
実施例３
初代ヒト細胞の単離及び食作用アッセイ
単球をフィコール密度遠心分離により、バフィーコート（地方血液バンクから取得）からヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得た。非単球の枯渇（ネガティブ選択）によるヒト単球の単離のための単球単離キットＩＩからなるMACS（登録商標）分離（Miltenyi Biotec, Germany #130-091-153）を使用する磁気ラベルにより、単球をＰＢＭＣから単離した。単球を、０．３g/mL ヒトマクロファージコロニー刺激因子（GenScript Z02001）を加えることによりマクロファージに分化させた。分化したヒトマクロファージを、１００U/mL ペニシリン及び１００μg/mL ストレプトマイシン（Gibco #15140-122）を含むRPMI 1640（Gibco #61870-044）培地中で培養した。分化したマクロファージを、凍結切片化した死後ヒトＡＤ脳切片を基質として利用する抗体依存性細胞食作用アッセイにおいてインキュベーションした。大脳皮質領域（ブラーク病期ＶＩ）からのヒトＡＤ脳組織切片を公称厚み２０μmで調製し、除去可能なポリ－Ｄ－リシン被覆２ウェル培養ディッシュ（Biocoat（商標） #40629）上に置いた。脳切片を異なる濃度のGantenerumabで１時間プレインキュベーションし、ＰＢＳで洗浄した後、ヒト初代細胞を０．８～１．５×１０６個/mLで播種し、３７℃、５％ 二酸化炭素で２～３日間培養した。無関係のヒトＩｇＧ１（Serotec, PHP010）抗体を追加の対照として使用した。アミロイドプラークの検出を２％ ホルムアルデヒドで１０分間固定し、洗浄し、AlexaFluor488にコンジュゲートさせたＢＡＰ２により、１０g/mLで室温において１時間染色した後に行った。マクロファージの二重ラベリングを上記されたように、Ａに対する抗体及びGantenerumab並びにＬＡＭＰ２に対するリソソームマーカー抗体（RDI Division of Fitzgerald Industries Intl.）により行った。
初代ヒト細胞の単離及び食作用アッセイ
単球をフィコール密度遠心分離により、バフィーコート（地方血液バンクから取得）からヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得た。非単球の枯渇（ネガティブ選択）によるヒト単球の単離のための単球単離キットＩＩからなるMACS（登録商標）分離（Miltenyi Biotec, Germany #130-091-153）を使用する磁気ラベルにより、単球をＰＢＭＣから単離した。単球を、０．３g/mL ヒトマクロファージコロニー刺激因子（GenScript Z02001）を加えることによりマクロファージに分化させた。分化したヒトマクロファージを、１００U/mL ペニシリン及び１００μg/mL ストレプトマイシン（Gibco #15140-122）を含むRPMI 1640（Gibco #61870-044）培地中で培養した。分化したマクロファージを、凍結切片化した死後ヒトＡＤ脳切片を基質として利用する抗体依存性細胞食作用アッセイにおいてインキュベーションした。大脳皮質領域（ブラーク病期ＶＩ）からのヒトＡＤ脳組織切片を公称厚み２０μmで調製し、除去可能なポリ－Ｄ－リシン被覆２ウェル培養ディッシュ（Biocoat（商標） #40629）上に置いた。脳切片を異なる濃度のGantenerumabで１時間プレインキュベーションし、ＰＢＳで洗浄した後、ヒト初代細胞を０．８～１．５×１０６個/mLで播種し、３７℃、５％ 二酸化炭素で２～３日間培養した。無関係のヒトＩｇＧ１（Serotec, PHP010）抗体を追加の対照として使用した。アミロイドプラークの検出を２％ ホルムアルデヒドで１０分間固定し、洗浄し、AlexaFluor488にコンジュゲートさせたＢＡＰ２により、１０g/mLで室温において１時間染色した後に行った。マクロファージの二重ラベリングを上記されたように、Ａに対する抗体及びGantenerumab並びにＬＡＭＰ２に対するリソソームマーカー抗体（RDI Division of Fitzgerald Industries Intl.）により行った。
【0225】
実施例４
免疫組織化学
ＰＢＳ潅流後に脳を調製し、the brain atlas of Paxinos and Franklinに従って、矢状凍結切片を外側約１．９２～１．６８ミリメートルで切断した。脳を、Leica CM3050 Sクライオスタットを使用して－１５℃で２０ミクロンの公称厚みで切片化し、予冷ガラススライド（Superfrost plus, Menzel, Germany）上に置いた。各脳について、８０ミクロン間隔の３つの切片を同じスライド上に置いた。
免疫組織化学
ＰＢＳ潅流後に脳を調製し、the brain atlas of Paxinos and Franklinに従って、矢状凍結切片を外側約１．９２～１．６８ミリメートルで切断した。脳を、Leica CM3050 Sクライオスタットを使用して－１５℃で２０ミクロンの公称厚みで切片化し、予冷ガラススライド（Superfrost plus, Menzel, Germany）上に置いた。各脳について、８０ミクロン間隔の３つの切片を同じスライド上に置いた。
【0226】
切片をＰＢＳ中において５分間再水和し、続けて、－２０℃に予冷した１００％ アセトンに２分間浸漬した。全ての更なる工程を室温で行った。脳切片を有するスライドをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、Ultra Vブロック（LabVision）中で５分間連続インキュベーションし、続けて、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の２％ 正常ヤギ血清を含むパワーブロック溶液（BioGenex）中で２０分間インキュベーションすることにより、非特異的結合部位をブロッキングした。スライドをＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２％ 正常ヤギ血清中における２０μg/mlの濃度で、Alexa Fluor 555染料（#A-21433, Lot 54699A, Molecular Probes）にコンジュゲーションさせた親和性精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ（重鎖及び軽鎖特異的）である二次抗体と１時間直接インキュベーションした。ＰＢＳで徹底的に洗浄した後、プラーク局在を、パワーブロック溶液（BioGenex）及び１０％ 正常ヒツジ血清を含むＰＢＳ中において、０．５μg/mlで１時間、Alexa Fluor 488染料にコンジュげーションさせたＡベータに対するRoche社内マウスモノクローナル抗体であるＢＡＰ－２とのインキュベーションによる、Ａベータプラークのためのダブルラベリングにより評価した。ＰＢＳ洗浄後、リポフスチンの自己蛍光を５０mM 酢酸アンモニウム（ｐＨ５）中の４mM ＣｕＳＯ４において３０分間インキュベーションすることによるクエンチングにより減少させた。スライドを二重蒸留水ですすいだ後、スライドをConfocal Matrix（Micro Tech Lab, Austria）で包埋した。
【0227】
実施例５
顕微観察及び画像処理
前頭皮質（一次運動皮質の領域）にプラーク含有領域を有する各PS2APP－マウスの脳の各切片から３つの画像を取得した。画像をピンホールが1 Airyに設定されたLeica TCS SP5共焦点システムにより記録した。Alexa Fluor 488染料で免疫ラベルされたプラークを同じスペクトル条件（４８８nm励起及び５００～５５４nmバンドパス発光）で、３０％レーザ出力において、調節された光電子増倍管ゲイン及びオフセット（典型的には、それぞれ７７０Ｖ及び－０％）で捕捉した。組織切片の接近可能な表面上の結合した二次Alexa Fluor 555抗体を、適用した検出抗体の発光波長範囲をカバーする５７０～７２５nmの範囲のウインドウにおいて、５６１nm励起レーザ線で記録した。試験したヒト抗Ａβ抗体についての比較強度測定、特に、レーザ出力、走査速度、ゲイン及びオフセットを可能にするために、画像取得のための機器設定を一定に保った。レーザ出力を３０％に設定し、ＰＭＴゲインの設定を、典型的には、８５０Ｖとし、公称オフセットを０％とした。これにより、同じ設定でかすかに染色されたプラーク及び強く染色されたプラークの両方の視覚化が可能となった。取得周波数を４００Hzとした。共焦点スキャンを水中において、HCX PL APO 20×0.7 IMM UV対物レンズを使用して、５１２×５１２ピクセル解像度で単一光学層として記録し、垂直軸における光学測定深さを相互作用的に制御して、組織切片内でのイメージングを確実にした。前頭皮質の層２～５に位置するアミロイド－βプラークを画像化し、蛍光強度を定量した。
顕微観察及び画像処理
前頭皮質（一次運動皮質の領域）にプラーク含有領域を有する各PS2APP－マウスの脳の各切片から３つの画像を取得した。画像をピンホールが1 Airyに設定されたLeica TCS SP5共焦点システムにより記録した。Alexa Fluor 488染料で免疫ラベルされたプラークを同じスペクトル条件（４８８nm励起及び５００～５５４nmバンドパス発光）で、３０％レーザ出力において、調節された光電子増倍管ゲイン及びオフセット（典型的には、それぞれ７７０Ｖ及び－０％）で捕捉した。組織切片の接近可能な表面上の結合した二次Alexa Fluor 555抗体を、適用した検出抗体の発光波長範囲をカバーする５７０～７２５nmの範囲のウインドウにおいて、５６１nm励起レーザ線で記録した。試験したヒト抗Ａβ抗体についての比較強度測定、特に、レーザ出力、走査速度、ゲイン及びオフセットを可能にするために、画像取得のための機器設定を一定に保った。レーザ出力を３０％に設定し、ＰＭＴゲインの設定を、典型的には、８５０Ｖとし、公称オフセットを０％とした。これにより、同じ設定でかすかに染色されたプラーク及び強く染色されたプラークの両方の視覚化が可能となった。取得周波数を４００Hzとした。共焦点スキャンを水中において、HCX PL APO 20×0.7 IMM UV対物レンズを使用して、５１２×５１２ピクセル解像度で単一光学層として記録し、垂直軸における光学測定深さを相互作用的に制御して、組織切片内でのイメージングを確実にした。前頭皮質の層２～５に位置するアミロイド－βプラークを画像化し、蛍光強度を定量した。
【0228】
実施例６
統計分析
免疫陽性領域をＴＩＦＦ画像として可視化し、ImageJバージョン１．４５（NIH）で蛍光強度及び面積（ピクセルで測定）の定量化のために処理した。定量化のために、バックグラウンド強度５を全ての画像において差し引き、５平方ピクセルより小さい陽性領域をフィルター除去した。選択された等表面の総蛍光強度を単一の個々の陽性領域の強度の合計として決定し、平均ピクセル強度を、総強度を分析されたピクセルの数で割って計算した。平均及び標準偏差値を、Microsoft Excel（Redmond/WA, USA)を使用して、各動物について3つの異なる切片から撮影した９枚の写真から得られた全ての測定等表面から計算した。統計分析を、群比較のためのスチューデントｔ検定又はマン－ホイットニー検定を使用して行った。
統計分析
免疫陽性領域をＴＩＦＦ画像として可視化し、ImageJバージョン１．４５（NIH）で蛍光強度及び面積（ピクセルで測定）の定量化のために処理した。定量化のために、バックグラウンド強度５を全ての画像において差し引き、５平方ピクセルより小さい陽性領域をフィルター除去した。選択された等表面の総蛍光強度を単一の個々の陽性領域の強度の合計として決定し、平均ピクセル強度を、総強度を分析されたピクセルの数で割って計算した。平均及び標準偏差値を、Microsoft Excel（Redmond/WA, USA)を使用して、各動物について3つの異なる切片から撮影した９枚の写真から得られた全ての測定等表面から計算した。統計分析を、群比較のためのスチューデントｔ検定又はマン－ホイットニー検定を使用して行った。
【0229】
実施例７
薬物動態研究
体重平均３０ｇ Ｃ５７ＢＬ６オスマウスを使用して、ｍＡｂ３１及びＢＳ－ｍＡｂ３１両方の薬物動態調査を行った。各抗体を、５及び１０mg/kgそれぞれでマウスに静脈内ボーラス投与した（薬剤あたりにｎ＝３匹のマウス）。Ｋ２ ＥＤＴＡ血漿サンプルを、各マウスについて２週間にわたる完全な血漿薬物動態プロファイルを可能にするために、キャピラリーマイクロサンプリングを使用して、種々の時点で調製した。サンプルを、抗ヒトＣＨ１／ＣＬ１（カッパ）捕捉／検出免疫アッセイを使用して分析し、薬剤の量を決定した。濃度－時間プロファイルを、Pharsight Phoenix 64を使用し、２コンパートメント薬物動態モデルを使用して分析した。ついで、慢性投与プロファイルを、使用された適切な用量での単回用量ＰＫデータから決定された薬物動態パラメータを使用してシミュレーションした。
薬物動態研究
体重平均３０ｇ Ｃ５７ＢＬ６オスマウスを使用して、ｍＡｂ３１及びＢＳ－ｍＡｂ３１両方の薬物動態調査を行った。各抗体を、５及び１０mg/kgそれぞれでマウスに静脈内ボーラス投与した（薬剤あたりにｎ＝３匹のマウス）。Ｋ２ ＥＤＴＡ血漿サンプルを、各マウスについて２週間にわたる完全な血漿薬物動態プロファイルを可能にするために、キャピラリーマイクロサンプリングを使用して、種々の時点で調製した。サンプルを、抗ヒトＣＨ１／ＣＬ１（カッパ）捕捉／検出免疫アッセイを使用して分析し、薬剤の量を決定した。濃度－時間プロファイルを、Pharsight Phoenix 64を使用し、２コンパートメント薬物動態モデルを使用して分析した。ついで、慢性投与プロファイルを、使用された適切な用量での単回用量ＰＫデータから決定された薬物動態パラメータを使用してシミュレーションした。
【0230】
実施例８
ＡＤＣＣアッセイ
トランスフェリンレセプター１発現（ＴｆＲ１＋）ＢａＦ３細胞（DSMZ, #CLPZ04004）を異なる抗体及び抗体融合分子により誘引された抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）実験のためのターゲット細胞として使用した。簡潔に、１×１０４個 ＢａＦ３細胞を、丸底９６ウェルに播種し、場合により、ヒトＮＫ９２エフェクター細胞（高親和性ＣＤ１６クローン７Ａ２Ｆ３；Roche GlycArt）と、示された抗体の存在下又は非存在下で、３：１のエフェクター／ターゲット比で共培養した。４時間のインキュベーション（３７℃、５％ ＣＯ２）後、細胞傷害性を死んだ細胞／死にかけている細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出により測定して評価した。このために、細胞を２５０×ｇで５分間遠心分離し、上清 ５０μlを平底プレートに移した。ＬＤＨ反応混合物（Roche ＬＤＨ反応混合物、cat. no. 11644793001；Roche Diagnostics GmbH） ５０μlを加え、反応物を３７℃、５％ ＣＯ２で２０分間インキュベーションした。続けて、吸光度をTecan Sunriseリーダで波長４９２／６２０nmにおいて測定した。
ＡＤＣＣアッセイ
トランスフェリンレセプター１発現（ＴｆＲ１＋）ＢａＦ３細胞（DSMZ, #CLPZ04004）を異なる抗体及び抗体融合分子により誘引された抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）実験のためのターゲット細胞として使用した。簡潔に、１×１０４個 ＢａＦ３細胞を、丸底９６ウェルに播種し、場合により、ヒトＮＫ９２エフェクター細胞（高親和性ＣＤ１６クローン７Ａ２Ｆ３；Roche GlycArt）と、示された抗体の存在下又は非存在下で、３：１のエフェクター／ターゲット比で共培養した。４時間のインキュベーション（３７℃、５％ ＣＯ２）後、細胞傷害性を死んだ細胞／死にかけている細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出により測定して評価した。このために、細胞を２５０×ｇで５分間遠心分離し、上清 ５０μlを平底プレートに移した。ＬＤＨ反応混合物（Roche ＬＤＨ反応混合物、cat. no. 11644793001；Roche Diagnostics GmbH） ５０μlを加え、反応物を３７℃、５％ ＣＯ２で２０分間インキュベーションした。続けて、吸光度をTecan Sunriseリーダで波長４９２／６２０nmにおいて測定した。
【0231】
全てのサンプルをトリプリケートで試験し、特異的殺傷／ＡＤＣＣは、下記計算及び対照に基づいた。
－ターゲット細胞（＋培地）のみ
－最大ＬＤＨ放出：ターゲット細胞＋３％ Triton-X
－自発的放出：ターゲット細胞＋ＮＫ細胞（Ｅ：Ｔ ３：１）
－％ 特異的ＡＤＣＣ／溶解を、下記項により計算した。
－ターゲット細胞（＋培地）のみ
－最大ＬＤＨ放出：ターゲット細胞＋３％ Triton-X
－自発的放出：ターゲット細胞＋ＮＫ細胞（Ｅ：Ｔ ３：１）
－％ 特異的ＡＤＣＣ／溶解を、下記項により計算した。
【0232】
【数1】
【0233】
実施例９
単球活性化アッセイ
９６ウェル細胞培養プレートをＡβ１－４２ペプチド（Bachem；ＰＢＳ中２０μg/mL）により、一晩被覆し、ついで、抗Ａβ抗体溶液と共に３７℃で１時間インキュベーションした。プレートを洗浄した後、Ｆｃγレセプターをアップレギュレーションするために、４００U/mL インターフェロン－γで一晩予備活性化した１０５個 Ｕ－９３７ヒト単球をウェルあたりに加え、プレートを３７℃／５％ ＣＯ２で２４時間インキュベーションした。翌日、上清を、製造メーカーのプロトコル（R&D Systems）に従って、ＩＬ－８及びＩＰ－１０濃度の決定のためにＥＬＩＳＡプレートに移した。
単球活性化アッセイ
９６ウェル細胞培養プレートをＡβ１－４２ペプチド（Bachem；ＰＢＳ中２０μg/mL）により、一晩被覆し、ついで、抗Ａβ抗体溶液と共に３７℃で１時間インキュベーションした。プレートを洗浄した後、Ｆｃγレセプターをアップレギュレーションするために、４００U/mL インターフェロン－γで一晩予備活性化した１０５個 Ｕ－９３７ヒト単球をウェルあたりに加え、プレートを３７℃／５％ ＣＯ２で２４時間インキュベーションした。翌日、上清を、製造メーカーのプロトコル（R&D Systems）に従って、ＩＬ－８及びＩＰ－１０濃度の決定のためにＥＬＩＳＡプレートに移した。
【0234】
実施例１０
ＦＡＣＳ分析によるＦｃγＲｘ結合の確認
ＩｇＧ及びＢＳ－ＩｇＧが細胞発現ＦｃγＲサブタイプに結合可能であったかどうかを確認するために、ＦｃγＲＩ（ＣＨＯ－Ｋ１＿ｆｌｈＦｃγＲＩ）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＨＯ－Ｋ１＿ｆｌｈＦｃγＲＩＩａ＿ＬＲ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＨＯ－Ｋ１＿ｆｌｈＦｃγＲＩＩｂ）又はＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＨＯ－Ｋ１＿ｆｌｈＦｃγＲＩＩＩａ）を安定に発現する自社生成されたリコンビナントＣＨＯ細胞クローンを使用した。ＣＨＯ細胞を補充ＥＭＤＭ（PAN Biotech）中において、標準的な細胞培養条件に従って増殖させた。１×１０５個 ＣＨＯ細胞／ウェルを９６ウェル丸底プレートに播種し、氷上で４５分間、培地中の異なる濃度の示された抗体変異体と共にインキュベーションした。ヒトＩｇＧ１（Sigma, #I5154）をアイソタイプ対照として使用した。洗浄後、細胞を培地 ２００μlに再懸濁し、１０μg/ml AlexaFluor488コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Jackson, #109-546-006）と共に、氷上で更に４５分間インキュベーションした。ついで、細胞を培地で２回洗浄し、培地 ２００μlに再懸濁し、FACS-Canto-II（BD）において、各ＦｃγＲＩＩへの結合について分析した。
ＦＡＣＳ分析によるＦｃγＲｘ結合の確認
ＩｇＧ及びＢＳ－ＩｇＧが細胞発現ＦｃγＲサブタイプに結合可能であったかどうかを確認するために、ＦｃγＲＩ（ＣＨＯ－Ｋ１＿ｆｌｈＦｃγＲＩ）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＨＯ－Ｋ１＿ｆｌｈＦｃγＲＩＩａ＿ＬＲ）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＨＯ－Ｋ１＿ｆｌｈＦｃγＲＩＩｂ）又はＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＨＯ－Ｋ１＿ｆｌｈＦｃγＲＩＩＩａ）を安定に発現する自社生成されたリコンビナントＣＨＯ細胞クローンを使用した。ＣＨＯ細胞を補充ＥＭＤＭ（PAN Biotech）中において、標準的な細胞培養条件に従って増殖させた。１×１０５個 ＣＨＯ細胞／ウェルを９６ウェル丸底プレートに播種し、氷上で４５分間、培地中の異なる濃度の示された抗体変異体と共にインキュベーションした。ヒトＩｇＧ１（Sigma, #I5154）をアイソタイプ対照として使用した。洗浄後、細胞を培地 ２００μlに再懸濁し、１０μg/ml AlexaFluor488コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Jackson, #109-546-006）と共に、氷上で更に４５分間インキュベーションした。ついで、細胞を培地で２回洗浄し、培地 ２００μlに再懸濁し、FACS-Canto-II（BD）において、各ＦｃγＲＩＩへの結合について分析した。
【0235】
実施例１１
ＦｃγＲヒト化マウスにおける体温研究
ＦｃγＲヒト化マウスを利用して、注入関連副作用を決定した。ｉｎ ｖｉｖｏ体温測定のために、遠隔体温測定システムを使用した。DAS-7006リーダシステムと組み合わせてBMDS IPTT300温度遠隔測定システムを使用した。このチップベースの遠隔測定システムを実験の約２週間前にマウスに埋め込んだ。実験の前に、全ての個体のベースライン体温を測定した。ｉ．ｖ．試験化合物注入後、体温を５分間隔で測定した。
ＦｃγＲヒト化マウスにおける体温研究
ＦｃγＲヒト化マウスを利用して、注入関連副作用を決定した。ｉｎ ｖｉｖｏ体温測定のために、遠隔体温測定システムを使用した。DAS-7006リーダシステムと組み合わせてBMDS IPTT300温度遠隔測定システムを使用した。このチップベースの遠隔測定システムを実験の約２週間前にマウスに埋め込んだ。実験の前に、全ての個体のベースライン体温を測定した。ｉ．ｖ．試験化合物注入後、体温を５分間隔で測定した。
【0236】
実施例１２
サイトカインアッセイ及び分析
血清サイトカインレベルを、炎症性マーカーの４０プレックス分析を提供するR&DサイトカインアレイパネルＡを使用して評価した。プールした血清 ２００マイクロリットルを群あたりに使用した。このアッセイを製造メーカーのプロトコールに従って行った。分析のために、測定された全ての相対強度を％ 膜内部陽性対照スポットとして表現する。通常、表示された値を、目的の条件からバッファー対照を差し引くことにより生成した。
サイトカインアッセイ及び分析
血清サイトカインレベルを、炎症性マーカーの４０プレックス分析を提供するR&DサイトカインアレイパネルＡを使用して評価した。プールした血清 ２００マイクロリットルを群あたりに使用した。このアッセイを製造メーカーのプロトコールに従って行った。分析のために、測定された全ての相対強度を％ 膜内部陽性対照スポットとして表現する。通常、表示された値を、目的の条件からバッファー対照を差し引くことにより生成した。
【0237】
実施例１３
全身ＲＯＳイメージング
全身ＲＯＳイメージングのために、PerkinElmer IVISスペクトルＣＴを使用した。ＲＯＳ検出を、PerkinElmer炎症プローブを介して行った。簡潔に、マウスに、PerkinElmer炎症プローブを腹腔内に、それらの意図される測定時点の１０分前に注入した。取得の直前に、マウスに試験構築物を注入し、イソフルラン麻酔下で画像化した。画像取得を５分の露光時間、Ｆ１アパーチャ及び媒体ビニングにより行った。
全身ＲＯＳイメージング
全身ＲＯＳイメージングのために、PerkinElmer IVISスペクトルＣＴを使用した。ＲＯＳ検出を、PerkinElmer炎症プローブを介して行った。簡潔に、マウスに、PerkinElmer炎症プローブを腹腔内に、それらの意図される測定時点の１０分前に注入した。取得の直前に、マウスに試験構築物を注入し、イソフルラン麻酔下で画像化した。画像取得を５分の露光時間、Ｆ１アパーチャ及び媒体ビニングにより行った。
【0238】
実施例１４
分子モデリング
ＩｇＧ及びＩｇＧ由来の構造を、PDB ID 1HZH（２７）を有する完全なＩｇＧ結晶構造に基づいて形成した。可変領域の構造を、抗体相同性モデリングプロトコルＭｏＦｖＡｂ（２８）によりモデリングした。Ｆｃ領域－ＦｃγＲ結合様式を、ＦｃγＲＩＩａ（PDB ID 3RY6（２９））との複合体におけるＩｇＧ１のヒトＦｃ領域の結晶構造から採用した。ｍＴｆＲ１ホモダイマーの相同性モデルを、PDB ID 1CX8（３０）（７７％ 配列同一性、８８％ 配列類似性）を有するｈＴｆＲ１細胞外ドメインの３．２Å 結晶構造からモデリングした。抗ｍＴｆＲ１脳シャトルＦａｂのｍＴｆＲ１への結合様式をペプチドマッピング実験により特定されたエピトープ配列に基づいて近似させた。抗体ヒンジコンフォメーション（Ｃα原子のみ）を近年公表された（３１）ＩｇＧ溶液ＮＭＲ状態のセットから採用し、モデルの残り部分との立体衝突を最少限にするように選択された。全ての分子モデルを、Dassault SystemesによるBIOVIA Discovery Studio 4.5を使用して生成し、可視化し、ＧＮＵ画像操作プログラムであるGIMPを使用して配置し、後処理した。
分子モデリング
ＩｇＧ及びＩｇＧ由来の構造を、PDB ID 1HZH（２７）を有する完全なＩｇＧ結晶構造に基づいて形成した。可変領域の構造を、抗体相同性モデリングプロトコルＭｏＦｖＡｂ（２８）によりモデリングした。Ｆｃ領域－ＦｃγＲ結合様式を、ＦｃγＲＩＩａ（PDB ID 3RY6（２９））との複合体におけるＩｇＧ１のヒトＦｃ領域の結晶構造から採用した。ｍＴｆＲ１ホモダイマーの相同性モデルを、PDB ID 1CX8（３０）（７７％ 配列同一性、８８％ 配列類似性）を有するｈＴｆＲ１細胞外ドメインの３．２Å 結晶構造からモデリングした。抗ｍＴｆＲ１脳シャトルＦａｂのｍＴｆＲ１への結合様式をペプチドマッピング実験により特定されたエピトープ配列に基づいて近似させた。抗体ヒンジコンフォメーション（Ｃα原子のみ）を近年公表された（３１）ＩｇＧ溶液ＮＭＲ状態のセットから採用し、モデルの残り部分との立体衝突を最少限にするように選択された。全ての分子モデルを、Dassault SystemesによるBIOVIA Discovery Studio 4.5を使用して生成し、可視化し、ＧＮＵ画像操作プログラムであるGIMPを使用して配置し、後処理した。
【0239】
実施例１５
結合研究
まず、４つの異なるＦｃγＲを固定化ターゲットとして流路に固定化した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのアッセイを使用した。ＳＰＲの結果から、両構築物が低及び高親和性レセプターと同様に、それに従って、異なるＦｃγＲに結合することが示された（図１Ｂ及び１Ｃを参照のこと）。
結合研究
まず、４つの異なるＦｃγＲを固定化ターゲットとして流路に固定化した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのアッセイを使用した。ＳＰＲの結果から、両構築物が低及び高親和性レセプターと同様に、それに従って、異なるＦｃγＲに結合することが示された（図１Ｂ及び１Ｃを参照のこと）。
【0240】
第二に、異なるヒトＦｃγＲを細胞上で過剰発現させる細胞結合実験を行った。ＢＳ－ｍＡｂ３１及び親ｍＡｂ３１の両方が等しく良好に結合し（図１Ｄ及び１Ｅ）、順序は、ＳＰＲデータと一致した。
【0241】
Ａβについての抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイを表面に被覆し、単球細胞を、ＦｃγＲを提示するエフェクター細胞として使用した。２つの異なるサイトカインを細胞傷害性についてのリードアウトとして使用した。ＢＳ－ｍＡｂ３１は、親ｍＡｂ３１に匹敵する効力を有することが見出された（図２Ｂ及び２Ｃを参照のこと）。
【0242】
食作用アッセイにおいて、初代ヒトエフェクター細胞と共に培養された死後アルツハイマー病（ＡＤ）脳組織切片を利用した（１４）。ＡＤ脳切片を異なる濃度のＢＳ－ｍＡｂ３１及び親ｍＡｂ３１と共にプレインキュベーションし、続けて、エフェクター細胞とインキュベーションした。両抗体について、Ａβプラークロードの濃度依存性の減少が観察された（図２Ｄ及び２Ｋを参照のこと）。
【0243】
実施例１６
ｍＡｂ３１の脳におけるｉｎ ｖｉｖｏ有効性
トランスジェニックアミロイドーシスマウスモデル（APP London: APP V717I）（１８）において、ＢＳ－ｍＡｂ３１構築物の親ｍＡｂ３１に対するプラーク減少特性を調査した。血漿暴露は、ｍＡｂ３１と比較して、ＢＳ－ｍＡｂ３１についてより低かった（図３Ａを参照のこと）。
ｍＡｂ３１の脳におけるｉｎ ｖｉｖｏ有効性
トランスジェニックアミロイドーシスマウスモデル（APP London: APP V717I）（１８）において、ＢＳ－ｍＡｂ３１構築物の親ｍＡｂ３１に対するプラーク減少特性を調査した。血漿暴露は、ｍＡｂ３１と比較して、ＢＳ－ｍＡｂ３１についてより低かった（図３Ａを参照のこと）。
【0244】
週１回の投与に基づく４か月間の有効性研究を設計し、血漿曝露をシミュレーションした（図３Ｂを参照のこと）。毎週４か月の投与後の抗Ａβ ｍＡｂ及びその脳シャトル構築物の大脳皮質におけるターゲット結合を調査した。ＢＳ－ｍＡｂ３１により、はるかに多くのプラーク修飾が検出可能であった（図２Ｃ及び２Ｄ）。この４か月間の慢性処置研究では、脳シャトルの血漿曝露がかなり低かったにもかかわらず、ＢＳ－ｍＡｂ３１処置マウスにおいて、媒体対照及び等モル低用量のｍＡｂ３１と比較して、大脳皮質及び海馬におけるＡβアミロイドプラークの顕著な減少が見られた（図２Ｅ及び２Ｆを参照のこと）。このデータから、ｍＡｂ３１のＣ末端に付着したＢＳモジュールは、ミクログリア細胞上のＦｃγＲとの相互作用を妨害しないことが示される。それにより、Ａβプラーククリアランスは、治療ＩｇＧの増強された脳暴露により、顕著に改善されたｉｎ ｖｉｖｏ効力とは別に促進される（９）。
【0245】
実施例１７
ＴｆＲ１結合様式により、ＦｃγＲとの結合が減弱される。
ＢＳ－ｍＡｂ３１及び抗ＴｆＲ１ ｍＡｂのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＴｆＲ１結合特性を調査した。ＢＳ－ｍＡｂ３１構築物は、Ｃ末端ＢＳモジュールとして抗ＴｆＲ１ Ｆａｂを含有する。ＢＳ－ｍＡｂ３１（図４Ａ）及び二価のネイティブな抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ（図４Ｂ）のＴｆＲ１への結合は異なり、治療実体（ＩｇＧ）及びＦｃ領域が環境に向かって異なる空間的提示をもたらすことが見出された。構築物がＴｆＲ１に結合した場合のＦｃ領域の機能性を、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイを使用して決定した。このアッセイでは、一方の細胞が、ＴｆＲ１を発現し、他方の細胞（ヒトＮＫ９２）が、ＦｃγＲＩＩＩＡを発現するエフェクター細胞の機能を有する。ＡＤＣＣは、免疫系のエフェクター細胞がターゲット細胞を能動的に溶解する細胞媒介性免疫防御のメカニズムであり、その膜表面抗原は、特異性抗体に結合する。
ＴｆＲ１結合様式により、ＦｃγＲとの結合が減弱される。
ＢＳ－ｍＡｂ３１及び抗ＴｆＲ１ ｍＡｂのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＴｆＲ１結合特性を調査した。ＢＳ－ｍＡｂ３１構築物は、Ｃ末端ＢＳモジュールとして抗ＴｆＲ１ Ｆａｂを含有する。ＢＳ－ｍＡｂ３１（図４Ａ）及び二価のネイティブな抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ（図４Ｂ）のＴｆＲ１への結合は異なり、治療実体（ＩｇＧ）及びＦｃ領域が環境に向かって異なる空間的提示をもたらすことが見出された。構築物がＴｆＲ１に結合した場合のＦｃ領域の機能性を、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイを使用して決定した。このアッセイでは、一方の細胞が、ＴｆＲ１を発現し、他方の細胞（ヒトＮＫ９２）が、ＦｃγＲＩＩＩＡを発現するエフェクター細胞の機能を有する。ＡＤＣＣは、免疫系のエフェクター細胞がターゲット細胞を能動的に溶解する細胞媒介性免疫防御のメカニズムであり、その膜表面抗原は、特異性抗体に結合する。
【0246】
相互作用を、３つの異なるＩｇＧ構築物を使用して分析した。完全なエフェクター機能を有する標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂは、強力なＡＤＣＣ応答を生じた。抗ＴｆＲ１ １Ｆａｂ ｍＡｂも、ＡＤＣＣ応答を生じたが、アビッド結合の喪失により、より高い濃度であった（図４Ｃ）。全ての細胞傷害効果は、Ｆｃ領域により媒介された。エフェクター機能を有さない抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ（Ｆｃ領域におけるＰ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ突然変異）を使用して確認した。この抗体は、このＡＤＣＣアッセイにおいて効果を有さなかった。興味深いことに、ｍＡｂ３１の重鎖のＣ末端に融合した１つ又は２つのＢＳモジュールを有する２つの脳シャトル構築物は、細胞傷害性を全く有さなかったか又は非常に低レベルであった（図４Ｃ）。最も高いＡＤＣＣ効果を引き起こした標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂの濃度では、抗ＴｆＲ１ １Ｆａｂ ｍＡｂについてはわずかな効果しか検出されなかったが、他の全ての構築物は、検出可能な効果を有さなかった（図４Ｄ）。
【0247】
実施例１８
初回注入反応及びサイトカイン誘引
ＢＳ抗体がＢＳモジュールを介してＴｆＲ１に結合する場合に、エフェクター機能がどのような結果を有するであろうかを決定した。
初回注入反応及びサイトカイン誘引
ＢＳ抗体がＢＳモジュールを介してＴｆＲ１に結合する場合に、エフェクター機能がどのような結果を有するであろうかを決定した。
【0248】
第一段階では、これをｈｕＦｃγＲトランスジェニックマウス系で試験した。要するに、このモデルを４つのヒト対応物（ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＣＧＲ２Ｃ及びＦＣＧＲ３Ｂ）による２つの活性化低親和性マウスＦｃγＲ遺伝子（Ｆｃγｒ３及びＦｃγｒ４）の遺伝子ターゲット化置換により産生した（図５Ａ）。これにより、エフェクター機能のトリガーをもたらすヒト／ヒト化ｍＡｂとヒトＦｃγＲとの間の可能性のある相互作用をｉｎ ｖｉｖｏで評価するのに適した系が提供される。このモデルは、初回注入反応（ＦＩＲ）をモニタリングするために遠隔測定温度リードアウトを使用する（図５Ｂ）。既に上記で概説されたように、ＦＩＲをＦｃγＲとの相互作用の効果及びエフェクター免疫細胞のリクルートにより誘引する。このモデルにおける無線記録システムにより、動物が研究中に自由に動くことが可能となる。
【0249】
まず、従来の抗ＴｆＲ１ ｍＡｂの注射により誘引されたＦＩＲを測定した。図５Ｃに示されるように、従来の抗ＴｆＲ１ ｍＡｂの注射により、体温の濃度依存的かつ一過性の低下がもたらされた。同低下は、約２時間以内に正常レベルに戻った。
【0250】
第二に、従来の抗ＴｆＲ１ ｍＡｂの一価形態の注射により誘引されたＦＩＲを決定した。従来の抗ＴｆＲ１ ｍＡｂの一価形態は、ＴｆＲ１に対するＦａｂアームを１つのみ含有する。また、このｍＡｂにより、ＦＩＲが強く誘引された。
【0251】
第三に、抗ＴｆＲ１ ｍＡｂを使用してこのモデルで観察されたＦＩＲに対するエフェクター機能の相対的寄与を、ＦｃγＲ結合に必要な残基においてＦｃ領域に突然変異を有するｍＡｂを使用して決定した（２０）。ＦｃγＲ相互作用を欠くＦｃ領域三重突然変異体Ｐ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａは、このモデルにおいて体温低下を示さなかった（図５Ｄ）。これは、Ｆｃ領域エフェクター機能排除構築物を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏデータにより裏付けられる（図４Ｃ）。
【0252】
抗ＴｆＲ１ ｍＡｂの投与の応答としての種々のサイトカインのレベルを決定した。特定の細胞シグナル伝達分子は、濃度において強く増加することが見出された（図５Ｅ）。特に、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、ケラチノサイト由来サイトカイン（ＫＣ）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ－２）及びインターフェロンガンマ誘引タンパク質１０（ＩＰ－１０）は、強い応答を示した。これらのサイトカイン応答は、とりわけ、好中球活性化と相関させることができる。温度リードアウト実験において見られるように、除去されたＦｃ領域エフェクター機能を有するＩｇＧ構築物を使用した場合、サイトカイン誘引に対する効果は、実質的に生じなかった（図５Ｅ）。
【0253】
実施例１９
脳シャトル結合様式の効果
ＦＩＲ誘引を評価するために、３つの異なるＢＳ－ｍＡｂ構築物をｈｕＦｃγＲトランスジェニックマウスに投与した（図６Ａ）。これらは全て、ヒトのネイティブなＩｇＧ１エフェクター機能を有したが、治療的に有効なＦａｂの数（＝結合部位）が異なっていた。
脳シャトル結合様式の効果
ＦＩＲ誘引を評価するために、３つの異なるＢＳ－ｍＡｂ構築物をｈｕＦｃγＲトランスジェニックマウスに投与した（図６Ａ）。これらは全て、ヒトのネイティブなＩｇＧ１エフェクター機能を有したが、治療的に有効なＦａｂの数（＝結合部位）が異なっていた。
【0254】
予想外に、標準的なＢＳ－ｍＡｂ構築物について、ＦＩＲが観察されなかったことが見出された。このことは、ｍＢＳ－２Ｆａｂがｉｎ ｖｉｖｏにおいて、末梢でＦｃγＲ活性化をトリガーしないことを示す（図６Ｂを参照のこと）。
【0255】
一方又は両方の治療ターゲット結合ＦａｂアームがｍＡｂ部分に欠損している２つの構築物を設計した（図６Ａを参照のこと）。これらの構築物は、ｈｕＦｃγＲトランスジェニックマウスに適用された場合、急速かつ強力な体温低下によりスコア化されるように、明らかにＦＩＲを引き起こした（図６Ｂ）。体温低下は、両方のＦａｂアームを欠く構築物（ＢＳ－ｎｏＦａｂ）についてさらに顕著であった。異なる構築物について観察された体温低下を、ＦＩＲの間に誘発されたサイトカインパターンの分析によりさらに実証した。図６Ｃに示されるように、体温低下を引き起こす構築物ＢＳ－ｎｏＦａｂのみが、サイトカインレベルの上昇も示す。これとは対照的に、標準的なＢＳ－ｍＡｂ構築物は、ｈｕＦｃγＲマウスに投与された場合に、サイトカインアップレギュレーションを引き起こさなかった（図６Ｃを参照のこと）。ＢＳ－ｍＡｂについてのサイトカインプロファイルは、エフェクター無効構築物で得られたプロファイルと同等である（図５Ｄを参照のこと）。
【0256】
用量－応答も、ＢＳ－ｍＡｂ構築物について調査し（図６Ｄ）、最高用量（２０mg/kg）で少量かつ一過性の効果が検出可能であった。これは、プラーク形成を減少させる非常に有効な治療用量よりも１０倍高い用量である（図３Ｅ及び３Ｆ）。
【0257】
実施例２０
特異的サイトカインシグネチャー
種々のｍＡｂ構築物についてのサイトカインプロファイルのより詳細な分析を行った。重要なサイトカインを強調するためにヒートマップを作成した（図７の左上におけるスケール）。特に、２つのサイトカインが、非常に異なって応答した。
特異的サイトカインシグネチャー
種々のｍＡｂ構築物についてのサイトカインプロファイルのより詳細な分析を行った。重要なサイトカインを強調するためにヒートマップを作成した（図７の左上におけるスケール）。特に、２つのサイトカインが、非常に異なって応答した。
【0258】
血管内全身光学イメージングにより、脳シャトル構築物がＲＯＳ産生を減弱させることが示される。
反応性酸素種（ＲＯＳ）は、化学的に反応性の化学種である。標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ及び脳シャトル構築物の末梢投与後、全身をＲＯＳ種の誘引についてスキャンした。図８Ａにおいて、代表的な画像から、抗ＴｆＲ１ ｍＡｂとｍＢＳ－２Ｆａｂ構築物との間の差異が示される。データを定量化し、ｍＢＳ－２Ｆａｂは、媒体群と比較して顕著な差を示さなかった（図８Ｂ）。
反応性酸素種（ＲＯＳ）は、化学的に反応性の化学種である。標準的な抗ＴｆＲ１ ｍＡｂ及び脳シャトル構築物の末梢投与後、全身をＲＯＳ種の誘引についてスキャンした。図８Ａにおいて、代表的な画像から、抗ＴｆＲ１ ｍＡｂとｍＢＳ－２Ｆａｂ構築物との間の差異が示される。データを定量化し、ｍＢＳ－２Ｆａｂは、媒体群と比較して顕著な差を示さなかった（図８Ｂ）。
【0259】
実施例２１
異なるｍＡｂ構築物の構造モデリング
細胞表面発現ＴｆＲ１におけるｍＡｂターゲット結合又はＢＳモジュール結合のいずれかにより提示される３つの異なる構築物間のＦｃ領域－ＦｃγＲ相互作用を、分子構造情報を使用して分析した。図９に、主な観察結果を要約する。
異なるｍＡｂ構築物の構造モデリング
細胞表面発現ＴｆＲ１におけるｍＡｂターゲット結合又はＢＳモジュール結合のいずれかにより提示される３つの異なる構築物間のＦｃ領域－ＦｃγＲ相互作用を、分子構造情報を使用して分析した。図９に、主な観察結果を要約する。
【0260】
まず、１つの細胞表面上のその治療ターゲットに結合した標準的なＢＳ－ｍＡｂ及び隣接する細胞表面上に提示されるＦｃγＲと結合する可能性をモデリングした（図９Ａ及び９Ｄ）。このモデルにより、ＦｃγＲへの自由なアクセス及びクラスタリングが予測された。同様に、図９Ａ及び９Ｄに、標準的なＩｇＧのＣ末端における更なるＢＳモジュール（抗ＴｆＲ１ ＣｒｏｓｓＦａｂ）の存在により、ＦｃγＲ結合が妨害されないことも示す。
【0261】
第二に、ｉｎ ｖｉｖｏで非常に活性であるＢＳ－ｎｏＦａｂ構築物をモデリングした。この構築物は、ＴｆＲ１に結合している間に、ＦｃγＲに好ましい様式で提示され、そのターゲットに結合した場合に、標準的なｍＡｂと同様の方法でクラスタリングを可能にした（図９Ｂ及び９Ｅ）。
【0262】
第三に、脳シャトル構築物（ＢＳ－ｍＡｂ＝ｍＢＳ－２Ｆａｂ）をモデリングした。このモデルは、治療抗原結合ＦａｂがＦｃγＲに非常に近接して位置し、特に、ＢＳ－ｓｃＦａｂ／ＦｃγＲ複合体の密接なクラスタリングを妨げると考えられるという、本明細書で報告されたｉｎ ｖｉｖｏでの知見を支持することが見出された（図９Ｃ及び９Ｆ）。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図5-4】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-01-27
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
静脈内、皮下又は筋肉内投与による神経障害の処置のための医薬の製造ににおける二重特異性抗体の使用であって、
二重特異性抗体は、
ｉ）Ｆｃ領域と、
ｉｉ）神経障害に関する第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位と、
ｉｉｉ）ヒトトランスフェリンレセプターに特異的に結合する１つの結合部位とを含み、
ここで、処置は、第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位のうち１つを欠いている同じ抗体と比較して、投与後の副作用を低減し、
ここで、副作用は、血管拡張、気管支収縮、喉頭浮腫、心圧低下および低体温からなる群より選択される１種以上であり、
二重特異性抗体は、
ｉ）第１の軽鎖可変ドメイン及び第１の重鎖可変ドメインを含む第１の抗体軽鎖及び第１の抗体重鎖のペアであって、ヒトＣＤ２０、ヒトタウタンパク質、リン酸化ヒトタウタンパク質、ヒトアルファ－シヌクレイン及びヒトアミロイドベータタンパク質からなる群より選択される脳ターゲットに特異的に結合する第１の結合部位を形成するペア、
ｉｉ）第２の軽鎖可変ドメイン及び第２の重鎖可変ドメインを含む第２の抗体軽鎖及び第２の抗体重鎖のペアであって、第１の結合部位と同じ脳ターゲットに特異的に結合する第２の結合部位を形成するペア、
ｉｉｉ）第３の軽鎖可変ドメイン及び第３の重鎖可変ドメインを含む、さらなるＣｒｏｓｓＦａｂ抗体フラグメントであって、ヒトトランスフェリンレセプターに特異的に結合する第３の結合部位を形成する抗体フラグメント、及び
ｉｖ）ヒトＩｇＧ１サブクラスのエフェクター機能コンピテントＦｃ領域
を含み、
ここで、ｉｉｉ）のさらなる抗体フラグメントは、ｉ）又はｉｉ）の抗体重鎖のＣ末端にペプチドリンカーを介してコンジュゲーションしており、そして
ヒトトランスフェリンレセプターに特異的に結合する結合部位は、
（ａ）配列番号：０６又は０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号：０８又は０９又は１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号：１１、１２又は１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号：１４又は１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：１７又は１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、
使用。
二重特異性抗体は、
ｉ）Ｆｃ領域と、
ｉｉ）神経障害に関する第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位と、
ｉｉｉ）ヒトトランスフェリンレセプターに特異的に結合する１つの結合部位とを含み、
ここで、処置は、第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する２つの結合部位のうち１つを欠いている同じ抗体と比較して、投与後の副作用を低減し、
ここで、副作用は、血管拡張、気管支収縮、喉頭浮腫、心圧低下および低体温からなる群より選択される１種以上であり、
二重特異性抗体は、
ｉ）第１の軽鎖可変ドメイン及び第１の重鎖可変ドメインを含む第１の抗体軽鎖及び第１の抗体重鎖のペアであって、ヒトＣＤ２０、ヒトタウタンパク質、リン酸化ヒトタウタンパク質、ヒトアルファ－シヌクレイン及びヒトアミロイドベータタンパク質からなる群より選択される脳ターゲットに特異的に結合する第１の結合部位を形成するペア、
ｉｉ）第２の軽鎖可変ドメイン及び第２の重鎖可変ドメインを含む第２の抗体軽鎖及び第２の抗体重鎖のペアであって、第１の結合部位と同じ脳ターゲットに特異的に結合する第２の結合部位を形成するペア、
ｉｉｉ）第３の軽鎖可変ドメイン及び第３の重鎖可変ドメインを含む、さらなるＣｒｏｓｓＦａｂ抗体フラグメントであって、ヒトトランスフェリンレセプターに特異的に結合する第３の結合部位を形成する抗体フラグメント、及び
ｉｖ）ヒトＩｇＧ１サブクラスのエフェクター機能コンピテントＦｃ領域
を含み、
ここで、ｉｉｉ）のさらなる抗体フラグメントは、ｉ）又はｉｉ）の抗体重鎖のＣ末端にペプチドリンカーを介してコンジュゲーションしており、そして
ヒトトランスフェリンレセプターに特異的に結合する結合部位は、
（ａ）配列番号：０６又は０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号：０８又は０９又は１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号：１１、１２又は１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号：１４又は１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号：１６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；及び（ｆ）配列番号：１７又は１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、
使用。
【請求項2】
投与が、注入によるものである、請求項１記載の使用。
【請求項3】
処置が、第１の（細胞表面）ターゲットに特異的に結合する前記結合部位の１つ又は２つを欠く同じ抗体と比較して、投与後の副作用の低減を有する、請求項１又は２記載の使用。
【請求項4】
神経障害が、神経障害、アミロイドーシス、ガン、眼の疾患又は障害、ウイルス又は微生物の感染、炎症、虚血性疾患、神経変性疾患、てんかん発作、行動障害、リソソーム蓄積症、レビー小体病、ポストポリオ症候群、Ｓｈｙ－Ｄｒａｅｇｅｒ症候群、オリボポン小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体変性、タウオパシー、アルツハイマー病、核上性麻痺、プリオン病、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト－ヤコブ症候群、クールー病、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ－Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ病、慢性消耗性疾患及び致死的な家族性不眠症、球麻痺、運動ニューロン疾患、神経系不変性障害、カナバン病、ハンチントン病、神経セロイドリポフスチン症、アレキサンダー病、トゥレット症候群、メンケス病、コッカイン症候群、ハレルヴォーデン－スパッツ症候群、ラフォラ病、レト症候群、肝臓病変性、レッシュ－ナイハン症候群、ウンベルリッヒ－ランドボルグ症候群、認知症、ピック病、脊髄小脳運動失調症、ＣＮＳ及び／又は脳のガン（体内の他の箇所のガンに起因する脳転移を含む）からなる群より選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項5】
第１のターゲットが、ヒトタウタンパク質、リン酸化ヒトタウタンパク質、ヒトグルコセレブロシダーゼ、ヒトアルファ－シヌクレイン及びヒトアミロイドベータタンパク質からなる群より選択され、ここで、神経障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病及びタウオパシーからなる群より選択される、請求項４記載の使用。
【請求項6】
患者への投与時に二重特異性抗体により誘発されるＡＤＣＣが、第１のターゲットに特異的に結合する１つの結合部位及び第２のターゲットに特異的に結合する１つの結合部位のみを有する二価の二重特異性抗体により誘発されるＡＤＣＣより低い、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項7】
ＡＤＣＣが、１０倍以上低い、請求項６記載の使用。
【請求項8】
副作用が、低体温である、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項9】
低体温が、治療用量で０．５℃未満の体温低下に低減される、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項10】
体温の低下が、投与後６０分以内である、請求項１～９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項11】
ｃ）抗体重鎖の１つが、突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であり、他の抗体重鎖が、突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｄ）両抗体重鎖が、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｅ）両抗体重鎖が、突然変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、又は
ｆ）両抗体重鎖が、突然変異Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ｈを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であり、ここで、ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドが、一方又は両方の重鎖に、独立して存在し又は存在しないことができ、
ここで、Ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドが、一方又は両方の重鎖に、それぞれ独立して存在し又は存在しないことができる、請求項２～１０のいずれか一項に記載の使用。
ｄ）両抗体重鎖が、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｅ）両抗体重鎖が、突然変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、又は
ｆ）両抗体重鎖が、突然変異Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ｈを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であり、ここで、ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドが、一方又は両方の重鎖に、独立して存在し又は存在しないことができ、
ここで、Ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドが、一方又は両方の重鎖に、それぞれ独立して存在し又は存在しないことができる、請求項２～１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項12】
注入速度が、≧５０ml/hである、請求項２記載の使用。
【請求項13】
注入速度が、≧１００ml/hである、請求項２記載の使用。
【請求項14】
注入速度が、≧１５０ml/hである、請求項２記載の使用。
【請求項15】
第１のターゲットへの結合部位が両方とも、抗体重鎖のＮ末端にあり、第２のターゲットへの結合部位が、１つの抗体重鎖のＣ末端にある、請求項１～１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項16】
抗体が、
ｉ）一対の第一抗体軽鎖および第一抗体重鎖と、
ｉｉ）一対の第２の抗体軽鎖および第２の抗体重鎖と、
ｉｉｉ）ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、ｄＡｂフラグメント、ＤｕｔａＦａｂおよびＣｒｏｓｓＦａｂからなる群から選択されるさらなる抗体フラグメントとを含み、
ここで、ｉ）およびｉｉ）の一対の抗体鎖が、第１のターゲットに特異的に結合し、ｉｉｉ）のさらなる抗体フラグメントが、第２のターゲットに特異的に結合する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の使用。
ｉ）一対の第一抗体軽鎖および第一抗体重鎖と、
ｉｉ）一対の第２の抗体軽鎖および第２の抗体重鎖と、
ｉｉｉ）ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、ｄＡｂフラグメント、ＤｕｔａＦａｂおよびＣｒｏｓｓＦａｂからなる群から選択されるさらなる抗体フラグメントとを含み、
ここで、ｉ）およびｉｉ）の一対の抗体鎖が、第１のターゲットに特異的に結合し、ｉｉｉ）のさらなる抗体フラグメントが、第２のターゲットに特異的に結合する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項17】
第１のターゲットが、ヒトＣＤ２０、ヒトタウタンパク質、リン酸化ヒトタウタンパク質、ヒトグルコセレブロシダーゼ、ヒトアルファ－シヌクレイン及びヒトアミロイドベータタンパク質からなる群より選択され、第２のターゲットが、ヒトトランスフェリンレセプター１である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項18】
第１のターゲットが、ヒトタウタンパク質、リン酸化ヒトタウタンパク質、ヒトグルコセレブロシダーゼ、ヒトアルファ－シヌクレイン及びヒトアミロイドベータタンパク質からなる群より選択され、ここで、神経障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病及びタウオパシーからなる群より選択される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項19】
結合部位が、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメインペアである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項20】
患者への投与時に二重特異性抗体により誘発されるＡＤＣＣが、第１のターゲットに特異的に結合する１つの結合部位及び第２のターゲットに特異的に結合する１つの結合部位のみを有する二価の二重特異性抗体により誘発されるＡＤＣＣより低い、請求項１～１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項21】
ａ）抗体重鎖が、ヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｂ）抗体重鎖が、ヒトサブクラスＩｇＧ４の全長抗体重鎖であるか、
ｃ）抗体重鎖の１つが、突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であり、他の抗体重鎖が、突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｄ）両抗体重鎖が、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｅ）両抗体重鎖が、突然変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、又は
ｆ）両抗体重鎖が、突然変異Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ｈを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であり、ここで、ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドが、一方又は両方の重鎖に、独立して存在し又は存在しないことができ、
ここで、Ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドが、一方又は両方の重鎖に、それぞれ独立して存在し又は存在しないことができる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の使用。
ｂ）抗体重鎖が、ヒトサブクラスＩｇＧ４の全長抗体重鎖であるか、
ｃ）抗体重鎖の１つが、突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であり、他の抗体重鎖が、突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｄ）両抗体重鎖が、突然変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ及びＨ４３５Ａを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、
ｅ）両抗体重鎖が、突然変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体重鎖であるか、又は
ｆ）両抗体重鎖が、突然変異Ｔ３０７Ｈ及びＮ４３４Ｈを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗ及び場合によりＳ３５４Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及び場合によりＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であり、ここで、ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドが、一方又は両方の重鎖に、独立して存在し又は存在しないことができ、
ここで、Ｃ末端リシン又はグリシン－リシンジペプチドが、一方又は両方の重鎖に、それぞれ独立して存在し又は存在しないことができる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の使用。
【外国語明細書】