▶ リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタルの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022046792
(43)【公開日】2022-03-23
(54)【発明の名称】組織特異的発現のための改変Ｕ６プロモーターシステム
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20220315BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20220315BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220315BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20220315BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20220315BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20220315BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20220315BHJP
C12N 15/869 20060101ALI20220315BHJP
C12N 15/863 20060101ALI20220315BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20220315BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20220315BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220315BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20220315BHJP
A61K 35/763 20150101ALI20220315BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220315BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20220315BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/63 Z
C12N7/01
C12N15/864 100Z
C12N15/861 Z
C12N15/867 Z
C12N15/869 Z
C12N15/863 Z
C12N15/86 Z
A61K31/7105
A61K35/76
A61K35/761
A61K35/763
A61K48/00
A61P21/04
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022005011
(22)【出願日】2022-01-17
(62)【分割の表示】P 2018551837の分割
【原出願日】2017-03-31
(31)【優先権主張番号】62/317,524
(32)【優先日】2016-04-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．プルロニック
３．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
(71)【出願人】
【識別番号】515289842
【氏名又は名称】リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】スコット クエントン ハーパー
(57)【要約】
【課題】組織特異的発現のための改変Ｕ６プロモーターシステムの提供。
【解決手段】本発明は、ＲＮＡ干渉に基づく遺伝子療法のための、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を発現させるための組織特異的プロモーターシステムに関する。これらのシステムでは、ｍｉＲＮＡは、遺伝子発現を阻害するか、またはマイクロＲＮＡを用いて、天然のｍｉＲＮＡ発現を置換する。本発明は、有害な過負荷を回避するために、低レベルでのｍｉＲＮＡの組織特異的発現のための改変Ｕ６プロモーターシステムを提供する。改変Ｕ６プロモーターシステムは、その効力を弱める突然変異を含むＵ６プロモーター配列を含む核酸分子である。
【選択図】図１
【解決手段】本発明は、ＲＮＡ干渉に基づく遺伝子療法のための、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を発現させるための組織特異的プロモーターシステムに関する。これらのシステムでは、ｍｉＲＮＡは、遺伝子発現を阻害するか、またはマイクロＲＮＡを用いて、天然のｍｉＲＮＡ発現を置換する。本発明は、有害な過負荷を回避するために、低レベルでのｍｉＲＮＡの組織特異的発現のための改変Ｕ６プロモーターシステムを提供する。改変Ｕ６プロモーターシステムは、その効力を弱める突然変異を含むＵ６プロモーター配列を含む核酸分子である。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０１６年４月２日に出願された米国仮出願第６２／３１７，５２４号の優先権の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、ＲＮＡ干渉に基づく遺伝子療法のための、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を発現させるための組織特異的プロモーターシステムに関する。これらのシステムでは、ｍｉＲＮＡは、遺伝子発現を阻害するか、またはマイクロＲＮＡを用いて天然のｍｉＲＮＡ発現を置換する。
【0003】
配列表の参照による組み込み
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：５０３９３Ａ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、１，６８４，３９７バイト、ＡＳＣＩＩテキストファイル）を含み、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：５０３９３Ａ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、１，６８４，３９７バイト、ＡＳＣＩＩテキストファイル）を含み、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、様々な疾患の治療のために検討されている、真核細胞における遺伝子調節のメカニズムである。ＲＮＡｉは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）によって媒介される遺伝子発現の転写後制御を表す。天然のｍｉＲＮＡは、同種のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’非翻訳領域と配列相同性及び塩基対を共有する、小さな（２１～２５個のヌクレオチド）、ノンコーディングＲＮＡであるが、コード領域の調節も起こり得る。ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間の相互作用は、標的ｍＲＮＡを分解し、及び／またはｍＲＮＡの翻訳を妨げるように、細胞遺伝子サイレンシング機構を導く。ＲＮＡｉ経路は、Ｄｕａｎ（Ｅｄ．），Ｍｕｓｃｌｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，ＬＬＣ（２０１０）の第７章第７．３節に要約されている。
【0005】
天然のＲＮＡｉ経路についての理解が深まるにつれて、研究者らは、疾患を治療するための標的遺伝子の発現の調節に用いるための人工ｍｉＲＮＡを設計してきた。上記Ｄｕａｎの第７．４節に記載されているように、人工ｍｉＲＮＡはＤＮＡ発現カセットから転写されることができる。標的遺伝子に特異的なｍｉＲＮＡ配列は、細胞中のｍｉＲＮＡのプロセシングを導くために必要とされる配列と共に転写される。アデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターは、筋肉にｍｉＲＮＡを送達するために使用されてきた［Ｆｅｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，８６：９８７－９９７（２００８）］。
【0006】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムの長さは、約４．７ｋｂであり、１４５ヌクレオチドの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を２つ含む。ＡＡＶには、複数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、既知である。例えば、ＡＡＶ－１の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００２０７７に提供されており、ＡＡＶ－２の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）に提供されており、ＡＡＶ－３の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿１８２９に提供されており、ＡＡＶ－４の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１８２９に提供されており、ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０８５７１６に提供されており、ＡＡＶ－６の完全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００ １８６２に提供されており、ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９に提供されており、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供されており、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供されており、ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供されている。ＡＡＶｒｈ．７４血清型のクローニングは、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５，４５（２００７）に記載されている。ＡＡＶ－Ｂ１血清型の単離は、Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．２４（７）：１２４７－５７，２０１６に記載されている。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞染色体組み込みを導くシス作用配列が、ＡＡＶ ＩＴＲ内に含まれる。３つのＡＡＶプロモーター（相対的なマップ位置についてｐ５、ｐ１９、及びｐ４０と命名される）は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のＡＡＶイントロンの差異的スプライシング（ヌクレオチド２１０７及び２２２７における）と相まって、２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）により、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）が生成される。Ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するカプシドタンパク質の生成を担う。単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）において総説されている。
Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）において総説されている。
【0007】
ＡＡＶは、例えば、遺伝子療法において、外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてＡＡＶを魅力的なものにする特有の特徴を有する。培養中の細胞のＡＡＶ感染は非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は無症状性かつ無症候性である。さらに、ＡＡＶは多くの哺乳動物細胞に感染し、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性をもつ。さらに、ＡＡＶは、分裂細胞及び非分裂細胞に徐々に形質導入し、本質的にそれらの細胞寿命の間、転写的に活性な核エピソーム（染色体外因子）として存続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミドにクローニングされたＤＮＡとして挿入され、組換えゲノムの構築を実現可能にする。さらに、ＡＡＶ複製及びゲノムカプシド形成を指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含まれるため、（複製及び構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）ゲノムの内部約４．３ｋｂの一部または全てが外来ＤＮＡで置換され得る。ＡＡＶベクターを作製するために、ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質はトランスで提供されてもよい。ＡＡＶの別の重要な特徴は、それが極めて安定かつ丈夫なウイルスであるということである。ＡＡＶは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件（５６℃～６５℃で数時間）に容易に耐えるため、ＡＡＶの低温保存はそれほど重要ではない。ＡＡＶは、凍結乾燥することさえできる。最後に、ＡＡＶに感染した細胞は、重複感染に耐性を示さない。
【0008】
Ｃ型肝炎ウイルス感染、筋ジストロフィー、神経変性疾患、末梢神経障害、慢性心不全及び心筋梗塞後リモデリング、ならびに癌などの多くの疾患を治療するために、ｍｉＲＮＡ阻害及びｍｉＲＮＡ置換を含むｍｉＲＮＡに基づく療法が用いられてもよい。さらに、ｍｉＲＮＡ指向性の遺伝子発現調節は、ベクターペイロードがタンパク質コード遺伝子である伝統的な遺伝子療法アプローチを改善し得る。全身送達されたＡＡＶベクターは、肝臓に優先的に形質導入し、肝臓活性プロモーターが使用される場合、その器官において高レベルの導入遺伝子の発現をもたらす。本明細書に詳細に記載されるように、肝臓特異的プロモーターが使用される場合、肝臓特異的ｍｉＲ－１２２結合部位の挿入は、肝臓における導入遺伝子の発現を低下させる。
ｍｉＲＮＡ発現の過負荷は、骨格筋、肝臓、及び他の器官において潜在的に毒性である。したがって、遺伝子療法中のｍｉＲＮＡの高発現の毒性を回避する手段としてｍｉＲＮＡ発現を指示する、より弱いプロモーターの開発が必要とされている。例えば、減弱化されたＵ６システムが、肝臓におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）についてのＡＡＶ８媒介性ＲＮＡｉ治療のために開発された。このシステムは現在、ＡＡＶを用いたＲＮＡｉ治療の最初の臨床試験において試験されている。要約すると、この試験を裏付ける前臨床データは、野生型（ＷＴ）Ｕ６プロモーターによって産生されたｓｈＲＮＡがＨＣＶを効果的に破壊したが、マウス及びサルにおいて肝細胞毒性も引き起こしたことを示した。ＷＴ Ｕ６プロモーターの重要な残基を変異させることは、ＨＣＶ破壊の効力を維持しながら、Ｕ６転写を弱め、１６倍少ないｓｈＲＮＡを生じることにより、これを軽減した（Ｓｕｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０：１７３７－４９，２０１２，Ｓａｆｅｔｙ
ａｎｄ Ｅｆｆｉｃａｃｙ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｄｏｓｅｓ ｏｆ ＴＴ０３４ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ，ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌ．ｇｏｖ，Ｊｕｌｙ ８，２０１３）。この例では、標的器官は肝臓であった。本発明は、肝臓を回避することを追い求めたものであり、したがって、遺伝子療法に使用され得る減弱化された骨格筋特異的Ｕ６プロモーターシステムを提供する。
ｍｉＲＮＡ発現の過負荷は、骨格筋、肝臓、及び他の器官において潜在的に毒性である。したがって、遺伝子療法中のｍｉＲＮＡの高発現の毒性を回避する手段としてｍｉＲＮＡ発現を指示する、より弱いプロモーターの開発が必要とされている。例えば、減弱化されたＵ６システムが、肝臓におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）についてのＡＡＶ８媒介性ＲＮＡｉ治療のために開発された。このシステムは現在、ＡＡＶを用いたＲＮＡｉ治療の最初の臨床試験において試験されている。要約すると、この試験を裏付ける前臨床データは、野生型（ＷＴ）Ｕ６プロモーターによって産生されたｓｈＲＮＡがＨＣＶを効果的に破壊したが、マウス及びサルにおいて肝細胞毒性も引き起こしたことを示した。ＷＴ Ｕ６プロモーターの重要な残基を変異させることは、ＨＣＶ破壊の効力を維持しながら、Ｕ６転写を弱め、１６倍少ないｓｈＲＮＡを生じることにより、これを軽減した（Ｓｕｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０：１７３７－４９，２０１２，Ｓａｆｅｔｙ
ａｎｄ Ｅｆｆｉｃａｃｙ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｄｏｓｅｓ ｏｆ ＴＴ０３４ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ，ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌ．ｇｏｖ，Ｊｕｌｙ ８，２０１３）。この例では、標的器官は肝臓であった。本発明は、肝臓を回避することを追い求めたものであり、したがって、遺伝子療法に使用され得る減弱化された骨格筋特異的Ｕ６プロモーターシステムを提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｄｕａｎ（Ｅｄ．），Ｍｕｓｃｌｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，ＬＬＣ（２０１０）
【非特許文献2】Ｆｅｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，８６：９８７－９９７（２００８）
【非特許文献3】Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）
【非特許文献4】Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）
【非特許文献5】Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）
【非特許文献6】Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）
【非特許文献7】Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５，４５（２００７）
【非特許文献8】Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．２４（７）：１２４７－５７，２０１６
【非特許文献9】Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）
【非特許文献10】Ｓｕｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０：１７３７－４９，２０１２
【非特許文献11】Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃａｃｙ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｄｏｓｅｓ ｏｆ ＴＴ０３４ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ，ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌ．ｇｏｖ，Ｊｕｌｙ ８，２０１３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、有害な過負荷を回避するために、低レベルでのｍｉＲＮＡの組織特異的発現のための改変Ｕ６プロモーターシステムを提供する。改変Ｕ６プロモーターシステムは、その効力を弱める突然変異を含むＵ６プロモーター配列を含む核酸分子である。さらに、ｍｉＲＮＡペイロードは、ｍｉＲＮＡ成熟ガイド鎖内の様々な位置に配置された非標的化ｍｉＲＮＡ結合配列を含む。例えば、本発明の核酸分子は、近位配列エレメント内の置換を有する改変Ｕ６プロモーターと、各々肝臓及び心臓におけるｍｉＲＮＡの発現を非標的化するｍｉＲ－１２２及びｍｉＲ－２０８結合部位を含むｍｉＲＮＡ成熟ガイド鎖と、を有する。
【0011】
概念実証研究では、肝特異的なｍｉＲ－１２２標的配列を、ルシフェラーゼまたはＬａｃＺレポーター遺伝子を有するＡＡＶベクターに挿入した。これらのベクターでは、遍在的に活性のあるＵ６プロモーターを用いて、両方の遺伝子の転写を駆動した。ｍｉＲ－１２２部位を欠くＡＡＶベクターは、マウス肝臓において極めて高いレベルのルシフェラーゼまたはＬａｃＺ発現をもたらしたが、それぞれのコード遺伝子中にｍｉＲ－１２２結合部位を有するベクターによって送達された場合、同じ遺伝子の転写は、それぞれ５０倍及び７０倍、軽減された。このようなシステムは、マイクロＲＮＡ発現ベクターに用いられていない（参照ＰＭＩＤ：２１１５０９３８）。
【0012】
本発明は、改変Ｕ６プロモーター配列、少なくとも１つの非標的配列を含むｍｉＲＮＡ成熟ガイド鎖、及び５’末端に５～６つのチミジンを含む核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、少なくとも２つの非標的配列、少なくとも３つの非標的配列、少なくとも４つの非標的配列、少なくとも５つの非標的配列、またはそれ以上を含む。組織特異的ｍｉＲＮＡ結合部位に加えて、ＤＮＡ核酸配列は、５’末端に５つのチミジンを含むか、または５’末端に６つのチミジンを含む、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの転写終結シグナルを含む。ＲＮＡに転写されると、これらのチミジンはウラシルとして転写物に付加される。
【0013】
「非標的配列」は、組織において阻害されることが望まれる任意の組織特異的ｍｉＲＮＡの結合部位である。例えば、本発明は、非標的配列が任意の天然ｍｉＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－２０８、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－１３３、、ｍｉＲ－２９ａ、ｍｉＲ－２９ｂ、またはｍｉＲ－２９ｃの結合部位である核酸配列を提供する。
【0014】
本発明の核酸分子は、減弱化された改変Ｕ６プロモーターを含む。例えば、改変Ｕ６プロモーター配列は、近位配列エレメント（ＰＳＥ）領域または遠位配列エレメント（ＤＳＥ）に少なくとも置換、挿入または欠失を含む。例えば、改変Ｕ６プロモーター配列は、ＰＳＥ配列中のヌクレオチド－６６のシトシンのチミジンへの置換、ヌクレオチド－５７のシトシンのチミジンへの置換、及びヌクレオチド－５２のチミジンのシトシンへの置換を含む。
【0015】
本発明の核酸分子は、目的の遺伝子の発現を阻害し得る任意のｍｉＲＮＡ成熟ガイド鎖を含む。例えば、核酸分子は、ｍｉＤＵＸ４、ｍｉＲＮ－９２、ｍｉＲＮＡ－１７、ｍｉＲＮＡ－１８ａ、ｍｉＲＮＡ－１９ａ、ｍｉＲＮＡ－２０ａ、ｍｉＲＮＡ－１９ｂ－１、ｍｉ－ＲＮＡ－２６ａ、ｍｉＲＮＡ－１２２、ｍｉＲＮＡ－１２６、ｍｉＲＮＡ－３３５、ｌｅｔ－７ａ及びｌｅｔ－７ｂ、ｍｉＲＮＡ－３４（ｍｉＲ－３４ａ）、ｍｉＲＮＡ－１０ｂ、ｍｉＲＮＡ－２０８、ｍｉＲＮＡ－４９９、ｍｉＲＮＡ－１９５、ｍｉＲＮＡ－２９ａ、ｍｉＲＮＡ－２９ｂ、またはｍｉＲＮＡ－２９ｃのｍｉＲＮＡ成熟ガイド鎖を含む。核酸分子は、配列番号１０～１０９１２として示されるｍｉＲＮＡ成熟ガイド鎖のいずれかを含む。本発明の核酸分子は、配列番号１（ｍｉＤＵＸ４－１； ｍｉ４０５）または配列番号２（ｍｉＤＵＸ－４－２； ｍｉ１１５５）の核酸配列を有するｍｉＤＵＸ４の成熟ガイド鎖を含む。
【0016】
本発明の核酸分子は、ｍｉｒ４５０（配列番号１０９７３）、ｍｉ１１５５ｍｉ７０（配列番号８４８２）、ｍｉ１８０（配列番号８３７２）、ｍｉ１８１（配列番号８３７１）、ｍｉ１８２（配列番号８３７０）、ｍｉ１８５（配列番号８３６７）、ｍｉ１８６（配列番号８３６６）、ｍｉ１８７（配列番号８３６５）、ｍｉ３３３（配列番号８２１９）、ｍｉ３３４（配列番号８２１８）、ｍｉ４００（配列番号８１５２）、ｍｉ４０５（配列番号８１４７）、ｍｉ４０７（配列番号８１４５）、ｍｉ１１５５（配列番号７３９７）、ｍｉ１１５６（配列番号７３９６）、ｍｉ１１５７（配列番号７３９５）、ｍｉ１３０８（配列番号７１０８）、ｍｉ１３０９（配列番号７１０７）、ｍｉ１３１０（配列番号７１０６）、ｍｉ１４２０（配列番号６６３３）、ｍｉ１４２２（配列番号６６３１）、ｍｉ１４３１（配列番号６６２２）、ｍｉ１４３４（配列番号６６１９）、ｍｉ１４４４（配列番号６６０９）、ｍｉ１４４５（配列番号６６０８）、ｍｉ１４８５（配列番号６５６８）、ｍｉ１４９２（配列番号６５６１）、ｍｉ１４９３（配列番号６５６０）、ｍｉ１５１９（（配列番号１０９７１）、またはｍｉ１５２０（配列番号１０９７２）のヌクレオチド配列を含むｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖を含む。これらの配列は、ｍｉ４０５及びｍｉ１１５５の成熟ガイド鎖と同様に折り畳まれる。したがって、本発明は、ｍｉｒ－２０８結合部位配列（配列番号５または配列番号６６）及び／またはｍｉｒ－１２２結合部位配列（配列番号６または配列番号６７）が表１の配列に示されたものと同様の位置で上記の成熟ガイド鎖のいずれかのループに挿入されてもよい核酸分子を提供する。
【0017】
例示的な一実施形態では、本発明の核酸分子は、近位配列エレメント内に置換を有する改変Ｕ６プロモーターと、成熟ガイド鎖のループ内あるいは成熟ガイド鎖の５’または３’末端にｍｉＲ－１２２及び／またはｍｉＲ－２０８結合部位を有するｍｉＤＵＸ４の成熟ガイド鎖と、５～６つのチミジンと、を有する。本発明の例示的な核酸分子は、ｍｉＤＵＸ４のｍｉＲＮＡ成熟ガイド鎖と、成熟ガイド鎖のループ内あるいは成熟ガイド鎖の５’または３’末端に挿入された少なくとも１つの非標的配列、例えば、ｍｉＲ－１２２（配列番号５）またはｍｉＲ－２０８（配列番号６）結合部位、例えば、配列番号１０９１３～１０９６８のいずれか１つとして示される核酸配列と、を含む。
【0018】
本発明は、配列番号１、２、または１０９１３～１０９６８のいずれか１つの核酸配列を含む核酸分子を提供する。
【0019】
別の実施形態では、本発明は、本発明の核酸分子のいずれかを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を提供する。ＡＡＶは、任意の血清型、例えば、ＡＡＶ－Ｂ１、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、及びＡＡＶ－１３であり得る。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されている。他の種類のｒＡＡＶ変異体、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶもまた企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。本発明はまた、本発明のＡＡＶのいずれかを含む組成物を提供する。さらに、本発明は、自己相補的ＡＡＶベクターである組換えＡＡＶベクターを提供する。
【0020】
別の実施形態では、本発明は、本発明の核酸分子のいずれかを含むベクターと細胞とを接触させることを含む、細胞における遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。例えば、本発明は、本発明の核酸分子のいずれかを含む組換えＡＡＶと細胞とを接触させることを含む、要求における遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本発明の他の実施形態は、本発明の核酸分子を送達するために、他のベクターまたはプラスミドを、例えば、本発明の核酸分子を送達するために、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウマ関連ウイルス、アルファウイルス、ポックスイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、ワクシニアウイルスを、利用する。
【0021】
本発明は、細胞におけるＤＵＸ４遺伝子の発現を阻害する方法であって、本発明の任意の核酸分子を含む組換えＡＡＶまたは任意の組成物とその細胞を接触させることを含む、方法も提供する。例えば、本発明は、近位配列エレメント内に置換を有する改変Ｕ６プロモーターと、成熟ガイド鎖のループ内あるいは成熟ガイド鎖の５’または３’末端に挿入されたｍｉＲ－１２２及び／またはｍｉＲ－２０８結合部位を有するｍｉＤＵＸ４の成熟ガイド鎖と、５～６つのチミジンとを含む本発明の核酸分子を用いて実施されるか、あるいは本発明の核酸分子は、配列番号１０９１３～１０９６８のいずれか１つの核酸配列を含む。
【0022】
本発明は、細胞におけるＤＵＸ４遺伝子の発現を阻害するための医薬の調製のための、本発明の任意の核酸分子を含む組換えＡＡＶまたは本発明の組成物の使用を提供する。医薬を調製するために利用されるＡＡＶまたは組成物は、近位配列エレメント内に置換を有する改変Ｕ６プロモーターと、成熟ガイド鎖のループ内あるいは成熟ガイド鎖の５’または３’末端に挿入されたｍｉＲ－１２２及び／またはｍｉＲ－２０８結合部位を有するｍｉＤＵＸ４の成熟ガイド鎖と、５～６つのチミジンとを含む本発明の核酸分子を含むか、あるいは本発明の核酸分子は、配列番号１０９１３～１０９６８のいずれか１つの核酸配列を含む。
【0023】
本発明はまた、細胞におけるＤＵＸ４遺伝子の発現を阻害するための、本発明の任意の核酸分子を含む組換えＡＡＶまたは本発明の組成物の使用のための組成物を提供する。医薬を調製するために利用されるＡＡＶまたは組成物は、近位配列エレメント内に置換を有する改変Ｕ６プロモーターと、成熟ガイド鎖のループ内あるいは成熟ガイド鎖の５’または３’末端に挿入されたｍｉＲ－１２２及び／またはｍｉＲ－２０８結合部位を有するｍｉＤＵＸ４の成熟ガイド鎖と、５～６つのチミジンとを含む本発明の核酸分子を含むか、あるいは本発明の核酸分子は、配列番号１０９１３～１０９６８のいずれか１つの核酸配列を含む。
【0024】
本発明はさらに、ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡをそれを必要とする動物の骨格筋に送達させる方法を提供し、この方法は、配列番号１０９１３～１０９６８のいずれか１つの核酸配列を含む組換えＡＡＶを動物に投与することを含む。
【0025】
本発明はまた、ＤＵＸ４ ｍｉＤＮＡをコードする核酸分子をそれを必要とする動物の骨格筋に送達させるための、本発明の核酸配列を含む組換えＡＡＶの使用を提供する。本発明は、ＤＵＸ４ ｍｉＤＮＡをコードする核酸分子をそれを必要とする動物の骨格筋に送達させるための、配列番号１０９１３～１０９６８のいずれか１つの核酸配列を含む組成物を提供する。
【0026】
別の実施形態では、本発明は、本発明の任意の核酸分子または任意の組成物を含む組換えアデノ随伴ウイルスを投与することを含む、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを治療する方法を提供する。例えば、本方法は、近位配列エレメント内の置換を有する改変Ｕ６プロモーターと、成熟ガイド鎖のループ内あるいは成熟ガイド鎖の５’または３’末端に挿入されたｍｉＲ－１２２及び／またはｍｉＲ－２０８結合部位を有するｍｉＤＵＸ４の成熟ガイド鎖と、及び５～６つのチミジンとを含む本発明の核酸分子か、あるいは配列番号１０９１３～１０９６８のいずれか１つの核酸配列を有する核酸分子を用いて、実施される。
【0027】
本発明の方法のいずれかにおいて、組換えＡＡＶは、筋肉内注射、経皮輸送、または血流への注射によって投与される
【0028】
本発明は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを治療するための医薬の調製のための、本発明の任意の核酸分子を含む組換えＡＡＶまたは本発明の組成物の使用を提供する。医薬を調製するために利用されるＡＡＶまたは組成物は、近位配列エレメント内に置換を有する改変Ｕ６プロモーターと、成熟ガイド鎖のループ内あるいは成熟ガイド鎖の５’または３’末端に挿入されたｍｉＲ－１２２及び／またはｍｉＲ－２０８結合部位を有するｍｉＤＵＸ４の成熟ガイド鎖と、５～６つのチミジンとを含む本発明の核酸分子を含むか、あるいは配列番号１０９１３～１０９６８のいずれか１つの核酸配列を有する核酸分子を含む。
【0029】
本発明の用途のいずれにおいても、医薬は、筋肉内注射、経皮輸送、または血流への注射による投与のために製剤化される。
【0030】
本発明は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを治療するための、本発明の任意の核酸分子を含む組換えＡＡＶまたは本発明の組成物の使用も提供する。医薬を調製するために利用されるＡＡＶまたは組成物は、近位配列エレメント内に置換を有する改変Ｕ６プロモーターと、成熟ガイド鎖のループ内あるいは成熟ガイド鎖の５’または３’末端に挿入されたｍｉＲ－１２２及び／またはｍｉＲ－２０８結合部位を有するｍｉＤＵＸ４の成熟ガイド鎖と、５～６つのチミジンとを含む本発明の核酸分子を含むか、あるいは配列番号１０９１３～１０９６８のいずれか１つの核酸配列を有する核酸分子を含む。本発明の組成物は、筋肉内注射、経皮輸送、または血流への注射による投与のために製剤化される。
（発明を実施するための形態）
（発明を実施するための形態）
【0031】
本発明は、有害な過負荷を回避するために、低レベルでのｍｉＲＮＡの組織特異的な特異的発現のための改変Ｕ６プロモーターシステムを提供する。改変Ｕ６プロモーターシステムは、改変Ｕ６プロモーター配列、成熟ガイド鎖配列内に挿入された非標的配列を有するｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖を含む核酸分子である。例えば、肝臓特異的ｍｉＲ－１２２の結合部位及び／または心臓特異的ｍｉＲ－２０８の結合部位は、ｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖のループ内あるいはｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖の５’または３’末端に挿入されており、肝臓及び心臓においてｍｉＲＮＡの発現を非標的化する。
【0032】
改変Ｕ６プロモーター
本発明は、改変Ｕ６プロモーターシステムを提供し、これは引き続き標的遺伝子のｍｉＲＮＡ誘導阻害をもたらすか、あるいは標的遺伝子の阻害をもたらし得るｍｉＲＮＡの置換をもたらすか、あるいは転写下にあるｍｉＲＮＡの置換をもたらしてもよい。野生型Ｕ６プロモーター（Ｕ６－１）は、配列番号３として示される。一方、ＰＳＥ領域内に置換を有する減弱化されたＵ６プロモーターは、図１に示されるように配列番号４として示される。
本発明は、改変Ｕ６プロモーターシステムを提供し、これは引き続き標的遺伝子のｍｉＲＮＡ誘導阻害をもたらすか、あるいは標的遺伝子の阻害をもたらし得るｍｉＲＮＡの置換をもたらすか、あるいは転写下にあるｍｉＲＮＡの置換をもたらしてもよい。野生型Ｕ６プロモーター（Ｕ６－１）は、配列番号３として示される。一方、ＰＳＥ領域内に置換を有する減弱化されたＵ６プロモーターは、図１に示されるように配列番号４として示される。
【0033】
改変Ｕ６プロモーターシステムは、野生型Ｕ６プロモーター配列内に少なくとも１つの置換、少なくとも１つの挿入、少なくとも１つの欠失、またはそれらの組み合わせを含む改変Ｕ６プロモーターを含む核酸分子であり、この改変はプロモーター活性を弱めるものである。改変は、遠位配列エレメント（ＤＳＥ）、近位配列エレメント（ＰＳＥ）、またはＴＡＴＡエレメントなどの１つまたは複数のエレメント内にあってもよい。例えば、改変は、ＰＳＥヌクレオチド配列における、置換、挿入、または欠失である。例示的な改変は、野生型Ｕ６－１プロモーターのＰＳＥの、Ｕ６－２プロモーター、Ｕ６－７プロモーター、Ｕ６－８プロモーター、またはＵ６－９プロモーターのＰＳＥヌクレオチド配列での置換であってもよい
【0034】
本発明の一実施形態では、核酸分子は、ＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列がプロモーターの活性を減弱化する置換を有するＵ６ヌクレオチド配列を含む。例えば、野生型Ｕ６プロモーター配列（配列番号３）は、ＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～１０の置換を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～９つの置換を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～８つの置換を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～７つの置換を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～６つの置換を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～５つの置換を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～４つの置換を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～３つの置換を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に５～１０の置換を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に５～９つの置換を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に５～８つの置換を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に５～７つの置換を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に５～６つの置換を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に４～８つの置換を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に４～６つの置換を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に３～６つの置換を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に３～９つの置換を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に２～４つの置換を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に２～３つの置換を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に３～４つの置換を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に３～５つの置換を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に４～５つの置換を、含む。一実施形態では、核酸分子は、ＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に、１つの置換、２つの置換、または３つの置換、４つの置換、５つの置換、６つの置換、７つの置換、８つの置換、９つの置換、または１０の置換を含む。
【0035】
別の実施形態では、野生型Ｕ６プロモーター配列（配列番号３）は、ＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～１０の挿入を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～９つの挿入を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～８つの挿入を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～７つの挿入を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～６つの挿入を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～５つの挿入を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～４つの挿入を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～３つの挿入を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に５～１０の挿入を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に４～８つの挿入を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に６～９つの挿入を、ＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に２～４つの挿入を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に２～３つの挿入を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に３～４つの挿入を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に３～５つの挿入を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に４～５つの挿入を、含む。一実施形態では、核酸分子は、ＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に、１つの挿入、２つの挿入、３つの挿入、４つの挿入、５つの挿入、６つの挿入、７つの挿入、８つの挿入、９つの挿入、または１０の挿入を含む。
【0036】
別の実施形態では、野生型Ｕ６プロモーター配列（配列番号３）は、ＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～１０の欠失を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～９つの欠失を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～８つの欠失を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～７つの欠失を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～６つの欠失を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～５つの欠失を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～４つの欠失を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に１～３つの欠失を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に２～４つの欠失を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に２～３つの欠失を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に３～４つの欠失を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に３～５つの欠失を、あるいはＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に４～５つの欠失を、含む。一実施形態では、核酸分子は、ＰＳＥまたはＤＳＥヌクレオチド配列内に、１つの欠失、２つの欠失、または３つの欠失、４つの欠失、５つの欠失、６つの欠失、７つの欠失、８つの欠失、９つの欠失、または１０の欠失を含む。
【0037】
非標的ｍｉＲＮＡ配列発現
本発明のプロモーターシステムは、ｍｉＲＮＡを非標的化するための結合部位が、ｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖のループ内あるいはｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖の５’または３’末端に挿入されている、ｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖を含む核酸分子である。例えば、骨格筋におけるｍｉＲＮＡ配列の発現を促進し、肝臓及び心臓組織におけるｍｉＲＮＡの発現を非標的化するために、核酸分子は、肝臓特異的ｍｉＲ－１２２の結合部位及び／または心臓特異的ｍｉＲ－２０８の結合部位が、成熟ガイド鎖のループ内またはｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖の５’もしくは３’末端に挿入されている、ｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖を含む。ｍｉＲＮＡ－１２２の結合部位のヌクレオチド配列は、配列番号５として示され、ｍｉＲＮＡ－２０８の結合部位のヌクレオチド配列は、配列番号６として示される。
本発明のプロモーターシステムは、ｍｉＲＮＡを非標的化するための結合部位が、ｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖のループ内あるいはｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖の５’または３’末端に挿入されている、ｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖を含む核酸分子である。例えば、骨格筋におけるｍｉＲＮＡ配列の発現を促進し、肝臓及び心臓組織におけるｍｉＲＮＡの発現を非標的化するために、核酸分子は、肝臓特異的ｍｉＲ－１２２の結合部位及び／または心臓特異的ｍｉＲ－２０８の結合部位が、成熟ガイド鎖のループ内またはｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖の５’もしくは３’末端に挿入されている、ｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖を含む。ｍｉＲＮＡ－１２２の結合部位のヌクレオチド配列は、配列番号５として示され、ｍｉＲＮＡ－２０８の結合部位のヌクレオチド配列は、配列番号６として示される。
【0038】
骨格筋におけるｍｉＲＮＡの発現の非標的化が所望される場合、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－２０６、またはｍｉＲ－１３３の結合部位は、ｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖のループ内に、あるいはｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖の５’または３’末端に挿入される。
【0039】
骨格筋、肝臓、及び／または心臓以外の組織における発現の非標的化が所望される場合、異なるｍｉＲＮＡ転写物についての結合部位が、ｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖内に挿入されてもよい。例えば、ｍｉＲ－１４２結合部位は、造血細胞における転写発現を非標的化するために使用されてもよい。ｍｉＲ－２９ａ、ｍｉＲ－２９ｂ、及び／またはｍｉＲ－２９ｃの結合部位は、正常組織におけるｍｉＲＮＡ発現を非標的化し、腫瘍組織におけるｍｉＲＮＡ発現を標的化するために使用されてもよい。
【0040】
組織中のｍｉＲＮＡ発現を非標的化するために使用されてもよいｍｉＲＮＡ結合配列は、本明細書では集合的に「非標的配列」と称される。本発明の核酸配列は、少なくとも１コピーの非標的配列、または少なくとも２コピーの非標的配列、または少なくとも３コピーの非標的配列、または少なくとも４コピーの非標的配列、または少なくとも５コピーの非標的配列を含む。本発明の核酸分子は、１～５コピーの非標的配列、または１～４コピーの非標的配列、または１～３コピーの非標的配列、または１～２コピーの非標的配列、または２～５コピーの非標的配列、２～４コピーの非標的配列、または２～３コピーの非標的配列、または３～５コピーの非標的配列、または３～４コピーの非標的配列、または４～５コピーの非標的配列を含む。
【0041】
非標的配列は、ｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖のループ内に、あるいはｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖の５’または３’末端に挿入されてもよい。非標的配列の挿入のための例示的な位置は、図４に示され、ｍｉＤＵＸ４の成熟ガイド鎖（ｍｉ４０５（配列番号１０９７３）またはｍｉ１１５５（配列番号１０９７４）、及びｍｉＲ－１２２結合部位（配列番号５または配列番号６６）あるいはｍｉＲ－２０８結合部位（配列番号６または配列番号６７）を含む例示的な核酸は、以下の表１に提供される。
【0042】
ヒト及びマウスゲノムには、２つのｍｉＲ－２０８配列（ｍｉＲ－２０８ａ及びｍｉＲ－２０８ｂ）が存在する。以下の例示的な配列において、５Ｕ（ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター終結配列）の実行を回避するために、結合部位の単一塩基を「ｃ」（太小文字の「ｃ」）に突然変異させた。この変化はｍｉｒ－２０８ｂについて完璧な結合部位を作り出すために含まれたが、ｍｉｒ－２０８ａとはミスマッチを有し得る。
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【0043】
ｍｉ７０（配列番号８４８２）、ｍｉ１８０（配列番号８３７２）、ｍｉ１８１（配列番号８３７１）、ｍｉ１８２（配列番号８３７０）、ｍｉ１８５（配列番号８３６７）、ｍｉ１８６（配列番号８３６６）、ｍｉ１８７（配列番号８３６５）、ｍｉ３３３（配列番号８２１９）、ｍｉ３３４（配列番号８２１８）、ｍｉ４００（配列番号８１５２）、ｍｉ４０５（配列番号８１４７）、ｍｉ４０７（配列番号８１４５）、ｍｉ１１５５（配列番号７３９７）、ｍｉ１１５６（配列番号７３９６）、ｍｉ１１５７（配列番号７３９５）、ｍｉ１３０８（配列番号７１０８）、ｍｉ１３０９（配列番号７１０７）、ｍｉ１３１０（配列番号７１０６）、ｍｉ１４２０（配列番号６６３３）、ｍｉ１４２２（配列番号６６３１）、ｍｉ１４３１（配列番号６６２２）、ｍｉ１４３４（配列番号６６１９）、ｍｉ１４４４（配列番号６６０９）、ｍｉ１４４５（配列番号６６０８）、ｍｉ１４８５（配列番号６５６８）、ｍｉ１４９２（配列番号６５６１）、ｍｉ１４９３（配列番号６５６０）、ｍｉ１５１９（（配列番号１０９７１）、またはｍｉ１５２０（配列番号１０９７２）のヌクレオチド配列を含む、ｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖。これらの配列は、ｍｉｒ４０５及びｍｉｒ１１５５の成熟ガイド鎖と同様に折り畳まれ、ｍｉ４０５及びｍｉ１１５５の成熟ガイド鎖と同様に折り畳まれる。したがって、本発明は、ｍｉｒ－２０８結合部位配列（配列番号５または配列番号６６）、及び／またはｍｉｒ－１２２結合部位配列（配列番号６または配列番号６７）が表１の配列に示されたものと同様の位置で上記の成熟ガイド鎖のいずれかのループに挿入されてもよい核酸分子を提供する。
【0044】
目的のｍｉＲＮＡ
本発明の核酸分子は、組織特異的発現を有することが所望される任意のｍｉＲＮＡ転写配列の成熟ガイド鎖の配列を含み得る。例えば、一実施形態では、ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡの骨格発現が企図される。例示的なＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡ配列は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４７９９９号（ＷＯ ２０１３／０１６３５２）及び米国特許公開第ＵＳ２０１２／２０２２５０３４号に記載されており、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の核酸分子は、組織特異的発現を有することが所望される任意のｍｉＲＮＡ転写配列の成熟ガイド鎖の配列を含み得る。例えば、一実施形態では、ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡの骨格発現が企図される。例示的なＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡ配列は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４７９９９号（ＷＯ ２０１３／０１６３５２）及び米国特許公開第ＵＳ２０１２／２０２２５０３４号に記載されており、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【0045】
ｍｉＤＵＸ４の２つの例は、ｍｉＤＵＸ４－１（ｍｉＤｕｘ４０５、配列番号１）及びｍｉＤＵＸ４－２（ｍｉＤｕｘ１１５５、配列番号２）である。ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡ、及びｍｉＲ－１２２、またはｍｉＲ－２０８のいずれかの結合部位を含む例示的なヌクレオチド配列は、表１及び配列番号１０９１３～１０９６８に提供される。
【0046】
以下のｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－１２４、ｍｉＲ－１４２、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－１７、ｍｉＲ－１８ａ、ｍｉＲ－１９ａ、ｍｉＲ－２０ａ、ｍｉＲ－１９ｂ－１、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－１２６、ｍｉＲ－３３５、ｌｅｔ－７ファミリー：ｌｅｔ－７ａ及びｌｅｔ－７ｂ、ｍｉＲ－３４（ｍｉＲ－３４ａ）、ｍｉＲ－１０ｂ、ｍｉＲ－２０８、ｍｉＲ－４９９、ｍｉＲ－１９５、ｍｉＲ－２９ａ、ｍｉＲ－２９ｂ、及びｍｉＲ－２９ｃのいずれかは、本発明の核酸分子を用いて、発現されてもよい。これらのｍｉＲＮＡのいずれも、所望の組織特異性及び所望の非標的化に応じて、異なる非標的配列と共に使用されてもよい。
【0047】
ＡＡＶ
本発明の組換えＡＡＶゲノムは、本発明の核酸分子、及び核酸分子に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ ＤＮＡは、任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、その組換えウイルスは、ＡＡＶ血清型、ＡＡＶ－Ｂ１、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、及びＡＡＶ－１３を含むが、これらに限定されない。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されている。他の種類のｒＡＡＶ変異体、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶもまた企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上記の背景技術の項で述べたように、種々のＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当該技術分野で既知である。骨格筋特異的発現を促進するために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９が使用されてもよい。
本発明の組換えＡＡＶゲノムは、本発明の核酸分子、及び核酸分子に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶ ＤＮＡは、任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、その組換えウイルスは、ＡＡＶ血清型、ＡＡＶ－Ｂ１、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、及びＡＡＶ－１３を含むが、これらに限定されない。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されている。他の種類のｒＡＡＶ変異体、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶもまた企図される。例えば、Ｍａｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００－１９０９（２０１４）を参照されたい。上記の背景技術の項で述べたように、種々のＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当該技術分野で既知である。骨格筋特異的発現を促進するために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９が使用されてもよい。
【0048】
自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターもまた、本発明における使用のために企図される。ｓｃＡＡＶベクターは、二量体としてパッケージングされた１４５塩基対のＩＴＲの２コピーに加えて２２００塩基対の独特な導入遺伝子配列を含む約２５００塩基対にベクターサイズを減少させることによって、作製される。ｓｃＡＡＶは、発現のために二本鎖ＤＮＡ鋳型へと再び折り畳まれる能力を有する。ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．１６（１０）：１６４８－１６５６，２００８。
【0049】
本発明のＤＮＡプラスミドは、本発明のｒＡＡＶゲノムを含む。ＤＮＡプラスミドは、感染性ウイルス粒子中にｒＡＡＶゲノムを構築するために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠損アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）による感染を許容できる細胞に導入される。パッケージングされるべきＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供されるｒＡＡＶ粒子を産生する技術は、当該技術分野で標準的である。ｒＡＡＶの産生は、以下の構成成分、ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離された（すなわち、その中には存在しない）ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が単一細胞（本明細書中、パッケージング細胞と称される）内に存在することを必要とする。ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、組換えウイルスが由来し得る任意のＡＡＶ血清型に由来してもよく、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、及びＡＡＶ－１３を含むがこれらに限定されない、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来してもよい。偽型ｒＡＡＶの産生は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ ０１／８３６９２に開示されている。
【0050】
パッケージング細胞を作製する方法は、ＡＡＶ粒子産生に必要な全ての構成成分を安定に発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムから分離されたＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにネオマイシン耐性遺伝子等の選択可能なマーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）、または直接的な平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの方法によって、バクテリアプラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルス等のヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模な産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、プラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを用いて、ｒＡＡＶゲノムならびに／またはｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞内に導入する。
【0051】
ｒＡＡＶ産生の一般原則は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）において総説されている。種々のアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）、及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）．Ｓａｍｕｌｓｋｉ
ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ ９５／１３３６５及び対応する米国特許第５，６５８，７７６号、ＷＯ ９５／１３３９２、ＷＯ ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２、米国特許第５，７８６，２１１号、同第５，８７１，９８２号、ならびに同第６，２５８，５９５号に記載されている。上記の文献は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれ、特にｒＡＡＶ産生に関連する文献のこれらのセクションが特に強調される。
ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）、米国特許第５，１７３，４１４号、ＷＯ ９５／１３３６５及び対応する米国特許第５，６５８，７７６号、ＷＯ ９５／１３３９２、ＷＯ ９６／１７９４７、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００、ＷＯ ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）、ＷＯ ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）、ＷＯ ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）、ＷＯ ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）、ＷＯ ９９／１１７６４、Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２、米国特許第５，７８６，２１１号、同第５，８７１，９８２号、ならびに同第６，２５８，５９５号に記載されている。上記の文献は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれ、特にｒＡＡＶ産生に関連する文献のこれらのセクションが特に強調される。
【0052】
したがって、本発明は、感染性ｒＡＡＶを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態では、パッケージング細胞は、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、及びＰｅｒＣ．６細胞（同種の２９３株）等の、安定して形質転換された癌細胞であってもよい。別の実施形態では、パッケージング細胞は、形質転換された癌細胞ではない細胞、例えば、低継代２９３細胞（アデノウイルスのＥ１で形質転換されたヒト胎児腎細胞）、ＭＲＣ－５細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、ＷＩ－３８細胞（ヒト胎児線維芽細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（サル腎細胞）、及びＦＲｈＬ－２細胞（アカゲザル肺細胞）である。
【0053】
本発明の組換えＡＡＶ（すなわち、感染性カプシド化ｒＡＡＶ粒子）は、ｒＡＡＶゲノムを含む。実施形態には、ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡ ｈＤｕｘ．ｍｉ４０５をコードする（配列番号１に示されるＤＮＡによりコードされる）ゲノムを含む「ＡＡＶ．ｍｉＤＵＸ４．４０５」と命名されたｒＡＡＶ、及びＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡ ｈＤｕｘ．ｍｉ１１５５をコードする（配列番号２に示されるＤＮＡによりコードされる）ゲノムを含む「ＡＡＶ．ｍｉＤＵＸ４．１１５５」と命名されたｒＡＡＶが含まれるが、これらに限定されない。例示的な実施形態において、両方のｒＡＡＶのゲノムは、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ ＤＮＡを欠いており、すなわち、ゲノムのＩＴＲの間にＡＡＶ ｒｅｐまたはｃａｐ ＤＮＡは存在しない。本発明の核酸分子を含むように構築されてもよいｒＡＡＶの例は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４７９９９号（ＷＯ ２０１３／０１６３５２）に示されており、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【0054】
ｒＡＡＶは、当該技術分野における標準的な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によって精製されてもよい。ヘルパーウイルスからｒＡＡＶベクターを精製する方法は、当該分野で既知であり、例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（６）：１０３１－１０３９（１９９９），Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９ ４２７－４４３（２００２）、米国特許第６，５６６，１１８号、及びＷＯ９８／０９６５７に記載されている。
【0055】
別の実施形態において、本発明は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物を企図する。本発明の組成物は、薬学的に許容される担体中にｒＡＡＶを含む。組成物はまた、希釈剤及びアジュバント等の他の成分を含んでもよい。許容される担体、希釈剤、及びアジュバントは、レシピエントにとって非毒性であり、好ましくは、用いられる投与量及び濃度で不活性であり、リン酸塩、クエン酸塩、もしくは他の有機酸等の緩衝剤；アスコルビン酸等の抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリジン等のアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトールもしくはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／またはＴｗｅｅｎ、プルロニック、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【0056】
本発明の方法において投与されるｒＡＡＶの力価は、例えば、特定のｒＡＡＶ、投与様式、治療目標、個体、及び標的とされる細胞型（複数可）に依存して異なり、当該技術分野における標準的な方法によって決定され得る。ｒＡＡＶの力価は、１ｍｌ当たり、約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、１×１０１３～約１×１０１４、またはそれ以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲であってもよい。投与量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表されてもよい。
【0057】
インビボまたはインビトロで、ｒＡＡＶを用いて標的細胞に形質導入する方法が、本発明によって企図される。インビボ方法は、本発明のｒＡＡＶを含む組成物の有効用量、または有効な複数用量を、それを必要とする動物（ヒトを含む）に投与する工程を含む。用量が障害／疾患の発症前に投与される場合、その投与は予防的である。用量が障害／疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。本発明の実施形態では、有効用量は、治療される障害／疾患状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和（排除または軽減）する用量であり、疾患／疾病状態への進行を遅らせ、または予防する用量であり、疾患／疾病状態の進行を遅らせ、または予防する用量であり、疾患の範囲を縮小する用量であり、疾患の寛解（部分的または完全な）をもたらす用量であり、及び／または生存を延長させる用量である。本発明の方法を用いた予防または治療のために企図される疾患の例は、ＦＳＨＤである。
【0058】
併用療法もまた、本発明によって企図される。本明細書で使用される組み合わせには、同時治療及び逐次治療の両方が含まれる。本発明の方法と標準的な医療処置（例えば、コルチコステロイド）との組み合わせが、新規療法との組み合わせと同様に、具体的に企図される。
【0059】
有効用量の組成物の投与は、筋肉内、非経口、静脈内、経口、頬側、経鼻、経肺、頭蓋内、骨内、眼内、直腸、または膣を含むが、これらに限定されない当該技術分野において標準的な経路によるものであり得る。本発明のｒＡＡＶのＡＡＶ成分（特に、ＡＡＶ ＩＴＲ及びカプシドタンパク質）の投与経路（複数可）及び血清型（複数可）は、治療される感染及び／もしくは疾患の状態、ならびにＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡを発現する標的細胞／組織（複数可）を考慮して、当業者によって選択及び／または適合され得る。
【0060】
本発明は、本発明の組換えＡＡＶ及び組成物の有効量での局所投与及び全身投与を提供する。例えば、全身投与は、体全体が影響を受けるように循環系への投与である。全身投与には、胃腸管を通じた吸収等の経腸投与、及び注射、注入または移植による非経口投与が含まれる。
【0061】
特に、本発明のｒＡＡＶの実際の投与は、ｒＡＡＶ組換えベクターを動物の標的組織に輸送し得る任意の物理的方法を使用することによって達成されてもよい。本発明による投与には、筋肉、血流、及び／または肝臓への直接の注射が含まれるが、これらに限定されない。リン酸緩衝生理食塩水にｒＡＡＶを単に再懸濁することは、筋組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、ｒＡＡＶと同時投与することができる担体または他の構成成分について既知の制限はない（ただし、ＤＮＡを分解する組成物は、ｒＡＡＶを用いる通常の様式では回避されるべきである）。ｒＡＡＶのカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが、筋肉などの目的の特定の標的組織を標的とするように改変されてもよい。例えば、参照によりその開示内容が本明細書に組み込まれる、ＷＯ ０２／０５３７０３を参照されたい。医薬組成物は、注射可能な製剤として、または経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製されることができる。筋肉内注射及び経皮的輸送の両方のための多数の製剤が既に開発されており、本発明の実施に使用することができる。ｒＡＡＶは、投与及び取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。
【0062】
筋肉内注射の目的で、ゴマ油もしくはピーナッツ油等のアジュバント中、または水性プロピレングリコール中の溶液、ならびに滅菌水溶液が用いられ得る。そのような水溶液は、必要に応じて緩衝化することができ、液体希釈剤は、最初に生理食塩水またはグルコースで等張にすることができる。遊離酸（ＤＮＡが酸性リン酸基を含む）または薬理学的に許容される塩としてのｒＡＡＶの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と水中で好適に混合して調製することができる。ｒＡＡＶの分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中、ならびに油中で調製することができる。通常の保存及び使用条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含む。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準的な技術によって容易に得ることができる。
【0063】
注射用途に好適な薬学的形態には、滅菌水溶液または分散液、及び滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、その形態は無菌でなければならず、容易に注射可能となる程度に流体でなければならない。それは製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの好適な混合物、及び植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散液の場合は必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用により、注射用組成物の長期吸収をもたらすことができる。
【0064】
滅菌注射溶液は、必要に応じて、必要な量のｒＡＡＶを、上記に列挙した種々の他の成分とともに適切な溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌することにより調製される。一般に、分散液は、滅菌された活性成分を、塩基性分散媒体及び上記に列挙したものから必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製の方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、予め滅菌濾過した活性成分及び任意の追加の所望の成分の溶液からそれらの粉末が得られる。
【0065】
ｒＡＡＶによる形質導入は、インビトロで行うこともできる。一実施形態では、所望の標的筋細胞が対象から取り出され、ｒＡＡＶで形質導入され、対象に再導入される。代替的に、それらの細胞が対象において不適切な免疫応答を惹起しない場合、同一遺伝子型または異種の筋細胞を使用することができる。
【0066】
形質導入、及び形質導入された細胞を対象に再導入するための好適な方法は、当該技術分野において既知である。一実施形態では、例えば、適切な培地中で、ｒＡＡＶを筋細胞と組み合わせ、サザンブロット及び／もしくはＰＣＲ等の従来の技術を用いて、または選択可能なマーカーを用いて、目的のＤＮＡを有する細胞についてスクリーニングすることにより、細胞がインビトロで形質導入され得る。形質導入された細胞は、次いで、薬学的組成物中に製剤化されることができ、その組成物は、種々の技術によって、例えば、筋肉内、静脈内、皮下、及び腹腔内注射によって、または、例えば、カテーテルを使用して平滑筋及び心筋内に注射することによって、対象に導入することができる。
【0067】
本発明のｒＡＡＶによる細胞の形質導入は、ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡの持続的な発現をもたらす。したがって、本発明は、ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡを発現するｒＡＡＶを動物、好ましくはヒトに投与／送達する方法を提供する。これらの方法には、本発明の１つ以上のｒＡＡＶで組織（筋肉等の組織、肝臓及び脳等の器官、ならびに唾液腺等の腺を含むが、これらに限定されない）に形質導入することが含まれる。形質導入は、組織特異的制御エレメントを含む遺伝子カセットを用いて行われてもよい。例えば、本発明の一実施形態は、アクチン及びミオシン遺伝子ファミリーに由来するもの、例えば、ｍｙｏＤ遺伝子ファミリーなどに由来するもの［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：７６１－７６６（１９９１）を参照のこと］、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２に由来するもの［Ｃｓｅｒｊｅｓｉ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１：４８５４－４８６２（１９９１）］、ヒト骨格アクチン遺伝子［Ｍｕｓｃａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、７：４０８９－４０９９（１９８７）］、心筋アクチン遺伝子、筋クレアチンキナーゼ配列エレメント［Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、９：３３９３－３３９９（１９８９）を参照のこと］、及びネズミクレアチンキナーゼエンハンサー（ｍＣＫ）エレメントに由来する制御エレメント、骨格速筋トロポニンＣ遺伝子、遅筋心筋トロポニンＣ遺伝子、及び遅筋トロポニンＩ遺伝子：低酸素誘導性核因子（Ｓｅｍｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８８：５６８０－５６８４（１９９１））、グルココルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）を含むステロイド誘導性エレメント及びプロモーター（Ｍａｄｅｒ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５６０３－５６０７（１９９３）を参照のこと）に由来する制御エレメント、ならびに他の制御エレメントを含むが、これに限定されない、筋肉特異的制御エレメントにより導かれる筋細胞及び筋組織に形質導入する方法を提供する。
【0068】
筋組織は、生命維持に不可欠な器官ではなく、かつ到達しやすいため、インビボでのＤＮＡ送達の魅力的な標的である。本発明は、形質導入された筋線維からのｍｉＲＮＡの持続的な発現を企図する。
【0069】
「筋細胞」または「筋組織」とは、任意の種類の筋肉（例えば、消化管、膀胱、血管、または心組織からの骨格筋及び平滑筋）由来の細胞または細胞群を意味する。筋芽細胞、筋細胞、筋管、心筋細胞、及び心筋芽細胞等の、上記のような筋細胞は、分化または未分化であり得る。
【0070】
「形質導入」という用語は、レシピエント細胞によるＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡの発現をもたらす、本発明の複製欠損ｒＡＡＶを介した、インビボまたはインビトロのいずれかでの、レシピエント細胞へのＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡの投与／送達を意味するように使用される。
【0071】
したがって、本発明は、ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡをコードするｒＡＡＶの有効用量（または本質的に同時に投与される用量、もしくは間隔をあけて投与される用量）を、それを必要とする患者に投与する方法を提供する。
【0072】
ＤＵＸ４及び顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー
筋ジストロフィー（ＭＤ）は、遺伝性疾患群である。この群は、運動及び呼吸を制御する骨格筋の進行性の衰弱及び変性によって特徴付けられる。いくつかの形態のＭＤは幼年期または小児期に発症するが、中年以降まで発症しないものもある。この障害は、筋力の低下（いくつかの形態のＭＤは心筋にも影響を及ぼす）の分布及び程度、発病年齢、進行速度、ならびに遺伝パターンに関して異なる。
筋ジストロフィー（ＭＤ）は、遺伝性疾患群である。この群は、運動及び呼吸を制御する骨格筋の進行性の衰弱及び変性によって特徴付けられる。いくつかの形態のＭＤは幼年期または小児期に発症するが、中年以降まで発症しないものもある。この障害は、筋力の低下（いくつかの形態のＭＤは心筋にも影響を及ぼす）の分布及び程度、発病年齢、進行速度、ならびに遺伝パターンに関して異なる。
【0073】
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）は、顔、肩、及び四肢の筋肉の進行性及び非対称性の衰弱を特徴とする、複合常染色体優性遺伝疾患である。症状は、成人期に典型的に起こり、ほとんどの患者は３０才までに臨床的特徴を示す。患者の約５％が乳幼児または若年者として症状を発症し、彼らは概してより重症である。臨床症状は、軽度（ある程度限定的な筋力低下）から重度（車椅子依存）まで様々であり得る。歴史的に、ＦＳＨＤは、３番目に一般的なＭＤに分類され、全世界で２万人あたり１人に発症している。しかしながら、最近のデータは、ＦＳＨＤがヨーロッパで最も一般的なＭＤであることを示し、世界的な発生率が８，３３３人あたり１人にもなり得ることを示唆している。
【0074】
典型的なＦＳＨＤの症例（ＦＳＨＤ１Ａ、これまでＦＳＨＤと称されてきた）は、ヒト染色体４ｑ３５上の３．３キロベース（ｋｂ）のＤ４Ｚ４反復配列のコピー数を減少させるヘテロ接合性染色体欠失に関連している。簡潔に言えば、正常な個体は、両方の４ｑ３５対立遺伝子上に１１～１００個の縦列反復Ｄ４Ｚ４のコピーを有するのに対し、ＦＳＨＤ患者は、１つの正常な対立遺伝子と、１～１０個の反復配列を含む１つの収縮した対立遺伝子とを有する。加えて、ＦＳＨＤに関連するＤ４Ｚ４の収縮は、特定の疾患許容性染色体４ｑ３５バックグラウンド（４ｑＡと呼ばれる）で起こらなければならない。重要なことに、ＦＳＨＤ関連欠失の結果として、遺伝子が完全に失われるか、または構造的に変異することはない。代わりに、ＦＳＨＤに関連する遺伝的変化は、筋肉を損傷する毒性ＤＵＸ４遺伝子の発現を引き起こす。ＦＳＨＤ２（ＦＳＨＤ１Ｂとしても知られている）は、ＦＳＨＤ１と表現型的に同一であり、ＤＵＸ４の発現と関連し、４ｑＡ染色体バックグラウンドを必要とする。ＦＳＨＤ２は、Ｄ４Ｚ４反復配列の収縮には関連していないが、代わりに、通常４ｑＡでＤＵＸ４遺伝子座の抑制に関与するクロマチン調節因子であるＳＭＣＨＤ１遺伝子の突然変異によって引き起こされる。突然変異したＳＭＣＨＤ１タンパク質は、ヘテロクロマチンを４ｑＡ ＤＵＸ４対立遺伝子に付加することに関与できず、それによってＤＵＸ４遺伝子の発現を可能にする。
【0075】
主要なＦＳＨＤ病因モデルでは、Ｄ４Ｚ４の収縮がＤＵＸ４遺伝子の発現を可能にするエピジェネティックな変化を引き起こすと提案されている。その結果、別様にサイレントなまたはほぼサイレントなＤＵＸ４遺伝子、及びそれが制御する遺伝子（複数可）の異常な過剰発現が、最終的にＦＳＨＤを引き起こす可能性がある。このモデルは、正常な４ｑ３５ Ｄ４Ｚ４反復配列がヘテロクロマチン特性を有するのに対し、ＦＳＨＤに関連するＤ４Ｚ４反復配列は活発に転写されたユークロマチンをより多く示す特徴を含むことを示すデータと一致している。これらの転写許容性のエピジェネティック変化は、完全な一染色体性のＤ４Ｚ４欠失（すなわち、反復配列がゼロ）がＦＳＨＤを引き起こさないという観察と合わせて、Ｄ４Ｚ４反復配列が、ＦＳＨＤの筋肉において異常に発現される、潜在的に筋障害性のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有するという仮説を裏付ける。この概念は、ＤＵＸ４と呼ばれるＤ４Ｚ４局在化ＯＲＦが最初に同定された１９９４年に最初に検討された。しかしながら、その遺伝子座は、発現していない偽遺伝子のいくつかの特徴を有しており、したがってＤＵＸ４はＦＳＨＤ候補として即座に却下された。その後何年間も、ＦＳＨＤ関連遺伝子の探索は主にＤ４Ｚ４反復配列以外に焦点を当てていたが、これらの研究から興味深い候補がいくつか出現したものの、ＦＳＨＤの発症と決定的に関連付けられる単一遺伝子は存在しなかった。この遅い進展により、２００７年にＦＳＨＤ候補としてＤＵＸ４が再登場した。しかし、２０１０年の時点でも、研究者は、候補として他の遺伝子に注目し続けていた。例えば、ＦＳＨＤ領域遺伝子１（ｆｒｇ１）に注目している、Ｗｕｅｂｂｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．，３（４）：３８６－４００（２０１０）を参照のこと。対照的に、Ｗａｌｌａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１７（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ１５１（２００９）、Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１７（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ２００（２００９）、及び２０１０年８月１９日のＳｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ号のＬｅｍｍｅｒｓらの報告は、ＤＵＸ４に注目している。Ｎｅｇｕｅｍｂｏｒ ａｎｄ Ｇａｂｅｌｌｉｎｉ，Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ，２（２）：２７１－２８７（２０１０）は、ＦＳＨＤに関する最近の総説論文である。
【0076】
ＦＳＨＤの病因におけるＤＵＸ４の役割は、以下のように説明することができる。第１に、Ｄ４Ｚ４反復配列は同一のＤＵＸ４コード領域を含み、また、Ｄ４Ｚ４反復配列は、いくつかの類似したマイクロＲＮＡを含む、より小さいセンス及びアンチセンス転写物も有する。過剰発現されたＤＵＸ４転写物及び約５０ｋＤａの全長ＤＵＸ４タンパク質は、ＦＳＨＤ患者からの生検及び細胞株で見出される。これらのデータは、ＦＳＨＤの病因の転写抑制解除モデルと一致する。加えて、偽遺伝子とは異なり、縦列整列したＤ４Ｚ４反復配列は、少なくとも１１種の異なる胎盤哺乳動物種において保存されており（非胎盤動物にはＤ４Ｚ４反復配列がない）、ＤＵＸ４のＯＲＦ内に生じる最大の配列保存であるため、Ｄ４Ｚ４反復配列及びＤＵＸ４は機能的に重要である可能性が高い。第２に、過剰発現されたＤＵＸ４は、組織培養細胞、及びインビボで発達中の下等生物の胚性前駆体に対して毒性を示す。この毒性は、少なくとも部分的には、ＤＵＸ４トランスフェクト細胞におけるカスパーゼ－３の活性化と、２細胞期でＤＵＸ４ ｍＲＮＡを注入された発育停止アフリカツメガエル胚におけるＴＵＮＥＬ陽性核の存在とにより示される、アポトーシス促進性機序によって生じる。これらの知見は、カスパーゼ－３を含むいくつかのアポトーシス促進性タンパク質がＦＳＨＤ患者の筋肉に存在することを示す研究と一致する。アポトーシスを刺激することに加えて、ＤＵＸ４は、筋形成を負に制御し得る。ヒトＤＵＸ４は、潜在的にＰＡＸ３及び／またはＰＡＸ７を妨害することによってインビトロでマウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞の分化を阻害し、ゼブラフィッシュ胚またはアフリカツメガエル胚の前駆細胞に送達されると、発育停止及びいくつかの筋肉マーカーの染色低下を引き起こす。最後に、異常なＤＵＸ４機能は、ＦＳＨＤ患者の筋肉に見られる潜在的に重要な分子変化に直接関連する。具体的には、全長ヒトＤＵＸ４は、約５０ｋＤａの二重ホメオドメイン転写因子をコードし、ＤＵＸ４標的は、ＦＳＨＤ患者の筋肉において上昇したレベルで見出され得る。これらのデータは、ＤＵＸ４が、正常な筋肉の完全性を維持することと矛盾する多数の下流分子変化を触媒することを裏付ける。
【図面の簡単な説明】
【0077】
【0078】
【図2A】ＤＵＸ４標的化ｍｉＲＮＡの配列を示す。各パネルにおいて、上の配列はＤＮＡ鋳型を示し、そこから各々のｍｉＲＮＡが転写される。上部パネルにおいて、ＤＮＡ鋳型ｍｉＤＵＸ４．４０５（ｍｉＤＵＸ４－１またはｍｉ４０５）は、配列番号１である。下部パネルでは、ＤＮＡ鋳型ｍｉＤＵＸ４．１１５５（ｍｉＤＵＸ４－２；またはｍｉ１１５５）は、配列番号２である。折り畳まれたｍｉＲＮＡ転写物は、ヘアピン構造として示される。ｍｉＤＵＸ４．４０５折り畳みｍｉＲＮＡは、配列番号８である。ｍｉＤＵＸ４．１１５５折り畳みｍｉＲＮＡは、配列番号９である。成熟ｍｉＤＵＸ４．４０５及びｍｉＤＵＸ４．１１５５配列は、宿主ｍｉＲＮＡプロセシング機構（Ｄｒｏｓｈａ、ＤＧＣＲ８、Ｄｉｃｅｒ、及びＥｘｐｏｒｔｉｎ－５を含む）による標的細胞におけるプロセシングに続いて生じる。灰色で網掛けされた配列は、各ｍｉＲＮＡをＵ６Ｔ６ベクターにクローニングするために使用される制限部位を示す。ＣＴＣＧＡＧはＸｈｏＩ部位であり、ＡＣＴＡＧＴはＳｐｅＩ部位である（ＲＮＡでは、ＣＵＣＧＡＧ及びＡＣＵＡＧＵ、Ｕはウラシル塩基である）。赤色の配列は、最終的にＤＵＸ４標的ｍＲＮＡの切断を触媒するのに役立つ成熟ｍｉＲＮＡアンチセンスガイド鎖を示す。この配列も、この図のｍｉＲＮＡヘアピン部分に下線が引かれている。灰色及び黒色の矢印は、それぞれＤｒｏｓｈａ及びＤｉｃｅｒが触媒する切断部位を示す。番号１３、３５、５３、及び７５は、方向付けのために設けられている。位置３５～５３の間（及び両端を含む）の配列は、位置３９のＡを除いて天然のヒトｍｉｒ－３０ａ配列に由来し、Ｇが正常なｍｉｒ－３０ａ配列である。このヌクレオチドでは、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＲＮＡ折り畳みモデルに基づいて、ｍｉＲＮＡループの折り畳みを促進するためにＡに変更された。骨格の塩基（５’の位置１３及び３’の位置７５）もまた、ｍｉｒ－３０ａ構造及び配列に由来し、ガイド鎖の一次配列に依存していくつかの改変を伴う。具体的には、１３位のヌクレオチドは、１３位と７５位のヌクレオチド間で必要とされるミスマッチを容易にするのに役立つように変化し得る。この膨れた構造は、適切なＤｒｏｓｈａ切断を促進すると仮定される。
【図2B】同上。
【0079】
【図3】改変Ｕ６プロモーターシステムの一例を示す。パネルＡは、ｍｉＤＵＸ４を発現するいくつかのｔＭＣＫシステムを示し、Ｖ５標識ＤＵＸ４を過剰発現するヒト筋芽細胞においてそれらの機能が試験された。代表的なウェスタンは、Ｕ６．ｍｉＤＵＸ４に匹敵するレベルでサイレンシングされたＤＵＸ４タンパク質である、本発明の最良のｔＭＣＫ．ｍｉＤＵＸ４（Ｖａｒ１）を示す。パネルＢは、減弱化されたＵ６プロモーターｍｉＤＵＸ４の開発を示す。ＷＴ Ｕ６プロモーターは、高レベルのｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ発現を駆動し、一方、減弱化されたバージョン（ｗＵ６）は、標的遺伝子サイレンシングに有意な影響を及ぼさずに約１６倍少ない転写物を産生する。ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼがＤＵＸ４配列を含み、ｍｉＤＵＸ４によってサイレンシングされ得るルシフェラーゼアッセイにおいて、ｍｉＤＵＸ４について同様の結果が観察された。
【0080】
【図4】ｍｉＤＵＸ４を心臓及び肝臓で非標的化する戦略を示す。ｍｉｒ－１２２（肝臓）及びｍｉｒ－２０８（心臓）のための完全な結合部位を図に示す。ｍｉｒ－１２２改変ｍｉＤＵＸ４がＤＵＸ４－ルシフェラーゼ標的に対して機能的であるという証拠、ならびに、ｍｉｒ－１２２を発現する肝臓細胞が、ｍｉｒ－１２２結合部位がｍｉＤＵＸ４配列に含まれる場合に、ｍｉＤＵＸ４サイレンシングを阻害し得るという証拠。
【0081】
【図5】ヒトＤＵＸ４ ＤＮＡ配列（配列番号７）を示す。
【発明を実施するための形態】
【0082】
配列
配列番号１（ｍｉＤＵＸ４．４０５またはｍｉＤＵＸ４－１）
配列番号１（ｍｉＤＵＸ４．４０５またはｍｉＤＵＸ４－１）
【0083】
配列番号２（ｍｉＤＵＸ４．１１５５またはｍｉＤＵＸ４－２）
【0084】
配列番号１０～１０９１２、１０９７１、１０９７２、例示的ｍｉＲＮＡ成熟ガイド鎖ヌクレオチド配列
【0085】
配列番号３、野生型Ｕ６－１プロモーター
【0086】
配列番号４、ＰＳＥ領域内に突然変異を有する、減弱化されたＵ６－１プロモーター
【0087】
配列番号５、ｍｉＲ－１２２（５’ ＴＡＴＴＴＡＧＴＧＴＧＡＴ ＡＡＴＧＧＴＧＴＴＴ ３’）の結合部位
【0088】
配列番号６、ｍｉＲＮＡ－２０８（５’ ＡＣＧＡＧＣｃＴＴＴＴ ＧＣＴＣＧＴＣＴＴＡＴ ３’）の結合部位
【0089】
配列番号８、ｍｉＤＵＸ４．４０５（ｍｉＤＵＸ４－１）折り畳みｍｉＲＮＡ
【0090】
配列番号９、ｍｉＤＵＸ４．１１５５（ｍｉＤＵＸ４－２）折り畳みｍｉＲＮＡ
【0091】
配列番号７、ＤＵＸ４遺伝子配列
【0092】
配列番号１０９１３～１０９６８、ｍｉＤＵＸ４の成熟ガイド鎖、及びｍｉＲ－１２２またはｍｉＲ－２０８の結合部位を含む、例示的な核酸配列（表１にも示される）
【0093】
配列番号１０９６９、ｍｉＲ－１２２（５’ ＵＡＵＵＵＡＧＵ ＧＵＧＡＵＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵ ３’）の結合部位
【0094】
配列番号１０９７０、ｍｉＲ－２０８（５’ ＡＣＧＡＧＣｃＵＵＵＵ ＧＣＵＣＧＵＣＵＵＡＵ ３’）の結合部位
【0095】
配列番号１０９７３、ｍｉＤＵＸ４．４０５（ｍｉＤＵＸ４－１）成熟ガイド鎖ヌクレオチド配列
【0096】
配列番号１０９７４、ｍｉＤＵＸ４．１１５５（ｍｉＤＵＸ４－２）成熟ガイド鎖ヌクレオチド配列
【0097】
本明細書中、成熟ガイド鎖配列がＤＮＡ配列として提示される場合、当業者は、このＤＮＡ配列がＲＮＡへの転写のための鋳型として機能し、チミジン塩基がウリジン塩基に変換されることを理解するだろう。実施例
【実施例0098】
したがって、本発明の態様及び実施形態は、以下の実施例により説明される。実施例１は、肝臓及び心臓を非標的化した、減弱化されたプロモーターシステムを記載する。実施例２は、ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ発現の効果を測定するためのルシフェラーゼアッセイを記載する。実施例３は、ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡをコードするｒＡＡＶベクターを記載する。
【0099】
実施例１
肝臓及び心臓を非標的化した、減弱化されたＵ６プロモーターシステム
筋肉は、大過剰量のｍｉＲＮＡベクターによる損傷を受けやすい。したがって、骨格筋特異的ｍｉＲＮＡ発現のための改変Ｕ６プロモーターシステムが開発された。野生型Ｕ６プロモーターを、図１に示されるような近位配列エレメントにおいて変異させた。この突然変異は、Ｓｕｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：１７３７－１７４９，２０１２に記載されているように、肝炎治療のためのＨＣＶ破壊の効力を維持しながら、Ｕ６転写を弱め、ＡＡＶ８において１６倍少ないｓｈＲＮＡ転写を産生する。本実験では、ウミシイタケルシフェラーゼがＤＵＸ４配列を含むルシフェラーゼアッセイを用いて、ｍｉＤＵＸ４を駆動するこの減弱化されたＵ６（ｗＵ６）システムを含む核酸分子が、インビトロで有意なＤＵＸ４サイレンシングを達成した。（図３Ｂ）。
肝臓及び心臓を非標的化した、減弱化されたＵ６プロモーターシステム
筋肉は、大過剰量のｍｉＲＮＡベクターによる損傷を受けやすい。したがって、骨格筋特異的ｍｉＲＮＡ発現のための改変Ｕ６プロモーターシステムが開発された。野生型Ｕ６プロモーターを、図１に示されるような近位配列エレメントにおいて変異させた。この突然変異は、Ｓｕｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：１７３７－１７４９，２０１２に記載されているように、肝炎治療のためのＨＣＶ破壊の効力を維持しながら、Ｕ６転写を弱め、ＡＡＶ８において１６倍少ないｓｈＲＮＡ転写を産生する。本実験では、ウミシイタケルシフェラーゼがＤＵＸ４配列を含むルシフェラーゼアッセイを用いて、ｍｉＤＵＸ４を駆動するこの減弱化されたＵ６（ｗＵ６）システムを含む核酸分子が、インビトロで有意なＤＵＸ４サイレンシングを達成した。（図３Ｂ）。
【0100】
しかしながら、提案された減弱化されたＵ６プロモーターシステムは広範に活性があるので、最高レベルの安全性を達成するために、このプロモーターシステムは、可能な限り骨格筋への発現に限定するように、さらに改変される。骨格筋特異的発現のための１つの選択肢は、ＡＡＶ６ベクターを使用することであり、これは、ＡＡＶ６ベクターが主に、血管送達後に骨格筋、肝臓、及び心臓に形質導入し、他の組織では有意に少ないためである。肝臓及び心臓における発現を避けるために、改変Ｕ６プロモーターシステムは、それらの組織においてｍｉＤＵＸ４を非標的化する。これを行うために、図４に示されるように、ｍｉｒ－１２２及びｍｉｒ－２０８（肝臓及び心臓特異的天然マイクロＲＮＡ）の完全な結合部位が、ｍｉＤＵＸ４転写物内の様々な位置に組み込まれる。以下の実施例２に記載されるＤＵＸ４－ルシフェラーゼ標的を用いて、非標的化ｍｉＤＵＸ４転写物を、それぞれ肝臓及び心臓におけるｍｉＲ－１２２及びｍｉＲ－２０８ＲＩＳＣ複合体によって破壊した。
【0101】
実施例２
ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡの発現の効果のためのルシフェラーゼアッセイ
ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡの存在下で、ＤＵＸ４標的配列の発現をアッセイした。リポフェクタミン２０００トランスフェクションを、９６ウェルの白壁アッセイプレート中の２９３細胞で行った。ＤＵＸ４標的配列を含む２０ｎｇのウミシイタケ－ホタルのプラスミドと、実施例１のＵ６Ｔ６駆動ｍｉＤｕｘ４．４０５またはｍｉＤｕｘ４．１１５５ベクターを含む１８０ｎｇの種々のＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡコード化ベクターとを用いて、１４０，０００個の細胞をトランスフェクトした。２４時間後にルシフェラーゼアッセイを実施した。
ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡの発現の効果のためのルシフェラーゼアッセイ
ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡの存在下で、ＤＵＸ４標的配列の発現をアッセイした。リポフェクタミン２０００トランスフェクションを、９６ウェルの白壁アッセイプレート中の２９３細胞で行った。ＤＵＸ４標的配列を含む２０ｎｇのウミシイタケ－ホタルのプラスミドと、実施例１のＵ６Ｔ６駆動ｍｉＤｕｘ４．４０５またはｍｉＤｕｘ４．１１５５ベクターを含む１８０ｎｇの種々のＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡコード化ベクターとを用いて、１４０，０００個の細胞をトランスフェクトした。２４時間後にルシフェラーゼアッセイを実施した。
【0102】
培地を細胞から除去し、ウェル当たり２０μｌの溶解緩衝液を添加した。５０μｌのルシフェラーゼ基質を添加する前に、プレートをシェーカーに室温で１５分間置いた。最初の読み取りは１０分後に行われた。次に、５０μｌのＳｔｏｐ ａｎｄ Ｇｌｏルシフェラーゼ基質を加え、１０分後に２回目の読み取りを行った。Ｒｅｎｉｌｌａ発現をｆｉｒｅｆｌｙ発現で割ることにより、相対的発現を算出した。次いで、相対的発現を、ｅＧＦＰを標的とする対照ｍｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞の発現に対して正規化した。ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡ ｍｉＤＵＸ４．４０５及びｍｉＤＵＸ４．１１５５は、トランスフェクトされた細胞におけるルシフェラーゼタンパク質発現を減少させるのに最も有効であった。以下の実施例１に記載されるＤＵＸ４－ルシフェラーゼ標的を用いて、非標的化ｍｉＤＵＸ４転写物を、それぞれ肝臓及び心臓におけるｍｉｒ－１２２及びｍｉｒ－２０８ＲＩＳＣ複合体によって破壊される。
【0103】
実施例３
ＤＵＸ４マイクロＲＮＡをコードするｒＡＡＶの産生
ＨＥＫ２９３細胞における３つのプラスミド［ｐＡｄｈｅｌｐｅｒ、ＡＡＶヘルパー、及びｍｉＤＵＸ４を含むｒＡＡＶゲノム、以下に詳細に記載される］の同時トランスフェクションによりｒＡＡＶベクターを産生し、次いで、細胞を回収し、ベクター精製、力価測定、及び品質管理アッセイを行った。
ＤＵＸ４マイクロＲＮＡをコードするｒＡＡＶの産生
ＨＥＫ２９３細胞における３つのプラスミド［ｐＡｄｈｅｌｐｅｒ、ＡＡＶヘルパー、及びｍｉＤＵＸ４を含むｒＡＡＶゲノム、以下に詳細に記載される］の同時トランスフェクションによりｒＡＡＶベクターを産生し、次いで、細胞を回収し、ベクター精製、力価測定、及び品質管理アッセイを行った。
【0104】
プラスミド：ｐＡｄｈｅｌｐｅｒは、アデノウイルス遺伝子Ｅ２Ａ、Ｅ４ ＯＲＦ６、及びＶＡ Ｉ／ＩＩを含み、ＡＡＶヘルパープラスミドは、ＡＡＶ ｒｅｐ２及びｃａｐ６を含み（例えば、ＡＡＶ血清型６調製物については、カプシド遺伝子はｃａｐ６と呼ばれ得る）、ｒＡＡＶプラスミドは、ベクターにパッケージングされる遺伝子エレメントに隣接するＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。ＡＡＶ．ｍｉＤＵＸ４については、これには、ＣＭＶ．ｅＧＦＰレポーター遺伝子の上流にクローニングされるＵ６．ｍｉＤＵＸ４が含まれる。
【0105】
トランスフェクション：ＣａＰＯ４を使用して、４：４：１（１プレートあたり２０μｇのｐＡｄヘルパー：２０μｇのＡＡＶヘルパー：５ｕｇのｒＡＡＶベクタープラスミド）の比で、２９３細胞（Ｃｏｒｎｉｎｇ １０－Ｓｔａｃｋ）にプラスミドをトランスフェクトした。
【0106】
細胞採取：トランスフェクションの４８時間後、細胞を回収し、５×１０６個の細胞／ｍｌの密度で、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ（Ｔ２０Ｍ１Ｎ１５０）中に再懸濁した。細胞を４回の連続凍結／解凍サイクルによって溶解し、細胞溶解物の清澄化の前に、ベンゾナーゼヌクレアーゼ（ＡＩＣ、ストック：２５０Ｕ／ｕｌ）を最終濃度９０Ｕ／ｍｌとなるように加えた。
【0107】
ベクター精製及び力価測定：清澄化した溶解物を、以前に記載されているように（Ｘｉａｏ，Ｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２：２２２４－３２）、イオジキサノール段階勾配精製に供した。４０％イオジキサノール層（ｒＡＡＶを含む）を無塩希釈緩衝液（ｐＨは血清型に応じて異なる）で５倍に希釈し、Ｈｉ－Ｔｒａｐ ＨＰ－Ｑ／Ｓカラムに適用した。ＮａＣｌ塩勾配で溶出して、ピーク１ｍｌ画分（典型的には３～５）をプールし、Ｔ２０Ｍ１Ｎ２００（ｐＨ８．０）で透析し、次いで、滅菌濾過し、０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を補足した。ベクターは－８０℃で保存される。精製されたウイルスを、以前に記載されたように［Ｓｃｈｎｅｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９：４２７－４４３（２００２）］、Ｑ－ＰＣＲを用いて、ｖｇについて力価測定した。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
改変Ｕ６プロモーター配列、少なくとも１つの非標的配列を含むｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖、及び５’末端に５～６つのチミジンを含む、核酸分子。
(項目２)
前記非標的配列が、ｍｉＲＮＡ－１２２またはｍｉＲＮＡ ２０８の結合部位である、項目１に記載の核酸分子。
(項目３)
前記改変Ｕ６プロモーター配列が、近位配列エレメント（ＰＳＥ）領域または遠位配列エレメント（ＤＳＥ）に少なくとも置換、挿入または欠失を含む、項目１または２に記載の核酸分子。
(項目４)
前記改変Ｕ６プロモーター配列が、ＰＳＥ配列中のヌクレオチド－６６のシトシンのチミジンへの置換、ヌクレオチド－５７のシトシンのチミジンへの置換、及びヌクレオチド－５２のチミジンのシトシンへの置換を含む、項目１または２に記載の核酸分子。
(項目５)
前記ｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖が、ｍｉＤＵＸ４、ｍｉＲＮ９２、ｍｉＲＮＡ－１７、ｍｉＲＮＡ－１８ａ、ｍｉＲＮＡ－１９ａ、ｍｉＲＮＡ－２０ａ、ｍｉＲＮＡ－１９ｂ－１、ｍｉ－ＲＮＡ－２６ａ、ｍｉＲＮＡ－１２６、ｍｉＲＮＡ－３３５、ｌｅｔ－７ａ 及びｌｅｔ－７ｂ、ｍｉＲＮＡ－３４、ｍｉＲ－３４ａ、ｍｉＲＮＡ－１０ｂ、ｍｉＲＮＡ－２０８、ｍｉＲＮＡ－４９９、ｍｉＲＮＡ－１９５、ｍｉＲＮＡ－２９ａ、ｍｉＲＮＡ－２９ｂ、またはｍｉＲＮＡ－２９ｃである、項目１～４のいずれか１項に記載の核酸分子。
(項目６)
前記ｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖が、配列番号８４８２、配列番号８３７２、配列番号８３７１、配列番号８３７０、配列番号８３６７、配列番号８３６６、配列番号８３６５、配列番号８２１９、配列番号８２１８、配列番号８１５２、配列番号８１４７、配列番号８１４５、配列番号７３９７、配列番号７３９６、配列番号７３９５、配列番号７１０８、配列番号７１０７、配列番号７１０６、配列番号６６３３、配列番号６６３１、配列番号６６２２、配列番号６６１９、配列番号６６０９、配列番号６６０８、配列番号６５６８、配列番号６５６１、配列番号６５６０、配列番号１０９７１、または配列番号１０９７２のヌクレオチド配列を含む、項目１～４のいずれか１項に記載の核酸分子。
(項目７)
前記ｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖がｍｉＤＵＸ４である、項目１～４のいずれか１項に記載の核酸分子。
(項目８)
配列番号１、２、または１０９１３～１０９６８のいずれか１つの核酸配列を含む、項目１～４のいずれか１項に記載の核酸分子。
(項目９)
項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
(項目１０)
前記ベクターが、プラスミド、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウマ随伴ウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、またはワクシニアウイルスである、項目９に記載のベクター。
(項目１１)
項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、組換えアデノ随伴ウイルス。
(項目１２)
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ６、ＡＡＶ ｒｈ．７４、またはＡＡＶ－Ｂ１である、項目１１に記載の組換えアデノ随伴ウイルス。
(項目１３)
項目９もしくは１０に記載のベクターまたは項目１１もしくは１２に記載の組換えアデノ随伴ウイルスを含む、組成物。
(項目１４)
細胞内の遺伝子の発現を阻害する方法であって、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物と前記細胞を接触させることを含む、方法。
(項目１５)
細胞におけるＤＵＸ４遺伝子の発現を阻害する方法であって、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物と前記細胞を接触させることを含む、方法。
(項目１６)
ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡをそれを必要とする動物の骨格筋に送達する方法であって、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物を前記動物に投与することを含む、方法。
(項目１７)
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを治療する方法であって、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物を投与することを含む、方法。
(項目１８)
前記組換えアデノ随伴ウイルスが、筋肉内注射、経皮輸送、血流への注射、または肝臓への注射によって投与される、項目１４～１７のいずれか１項に記載の方法。
(項目１９)
細胞内の遺伝子の発現を阻害するための医薬の調製のための、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物の使用。
(項目２０)
細胞内のＤＵＸ４遺伝子の発現を阻害するための医薬の調製のための、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物の使用。
(項目２１)
ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡをそれを必要とする動物の骨格筋へ送達するための医薬の調製のための、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物の使用。
(項目２２)
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを治療するための医薬の調製のための、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物の使用。
(項目２３)
前記医薬が、筋肉内注射、経皮輸送、または血流への注射のために製剤化される、項目１９～２２のいずれか１項に記載の使用。
(項目２４)
細胞内の遺伝子の発現を阻害するための、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物を含む、組成物。
(項目２５)
細胞内のＤＵＸ４遺伝子の発現を阻害するための、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物を含む、組成物。
(項目２６)
ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡをそれを必要とする動物の骨格筋へ送達するための、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物を含む、組成物。
(項目２７)
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを治療するための、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物を含む、組成物。
(項目２８)
前記組成物が、筋肉内注射、経皮輸送、または血流への注射のために製剤化される、項目２４～２７のいずれか１項に記載の組成物。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
改変Ｕ６プロモーター配列、少なくとも１つの非標的配列を含むｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖、及び５’末端に５～６つのチミジンを含む、核酸分子。
(項目２)
前記非標的配列が、ｍｉＲＮＡ－１２２またはｍｉＲＮＡ ２０８の結合部位である、項目１に記載の核酸分子。
(項目３)
前記改変Ｕ６プロモーター配列が、近位配列エレメント（ＰＳＥ）領域または遠位配列エレメント（ＤＳＥ）に少なくとも置換、挿入または欠失を含む、項目１または２に記載の核酸分子。
(項目４)
前記改変Ｕ６プロモーター配列が、ＰＳＥ配列中のヌクレオチド－６６のシトシンのチミジンへの置換、ヌクレオチド－５７のシトシンのチミジンへの置換、及びヌクレオチド－５２のチミジンのシトシンへの置換を含む、項目１または２に記載の核酸分子。
(項目５)
前記ｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖が、ｍｉＤＵＸ４、ｍｉＲＮ９２、ｍｉＲＮＡ－１７、ｍｉＲＮＡ－１８ａ、ｍｉＲＮＡ－１９ａ、ｍｉＲＮＡ－２０ａ、ｍｉＲＮＡ－１９ｂ－１、ｍｉ－ＲＮＡ－２６ａ、ｍｉＲＮＡ－１２６、ｍｉＲＮＡ－３３５、ｌｅｔ－７ａ 及びｌｅｔ－７ｂ、ｍｉＲＮＡ－３４、ｍｉＲ－３４ａ、ｍｉＲＮＡ－１０ｂ、ｍｉＲＮＡ－２０８、ｍｉＲＮＡ－４９９、ｍｉＲＮＡ－１９５、ｍｉＲＮＡ－２９ａ、ｍｉＲＮＡ－２９ｂ、またはｍｉＲＮＡ－２９ｃである、項目１～４のいずれか１項に記載の核酸分子。
(項目６)
前記ｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖が、配列番号８４８２、配列番号８３７２、配列番号８３７１、配列番号８３７０、配列番号８３６７、配列番号８３６６、配列番号８３６５、配列番号８２１９、配列番号８２１８、配列番号８１５２、配列番号８１４７、配列番号８１４５、配列番号７３９７、配列番号７３９６、配列番号７３９５、配列番号７１０８、配列番号７１０７、配列番号７１０６、配列番号６６３３、配列番号６６３１、配列番号６６２２、配列番号６６１９、配列番号６６０９、配列番号６６０８、配列番号６５６８、配列番号６５６１、配列番号６５６０、配列番号１０９７１、または配列番号１０９７２のヌクレオチド配列を含む、項目１～４のいずれか１項に記載の核酸分子。
(項目７)
前記ｍｉＲＮＡの成熟ガイド鎖がｍｉＤＵＸ４である、項目１～４のいずれか１項に記載の核酸分子。
(項目８)
配列番号１、２、または１０９１３～１０９６８のいずれか１つの核酸配列を含む、項目１～４のいずれか１項に記載の核酸分子。
(項目９)
項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
(項目１０)
前記ベクターが、プラスミド、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウマ随伴ウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、またはワクシニアウイルスである、項目９に記載のベクター。
(項目１１)
項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、組換えアデノ随伴ウイルス。
(項目１２)
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ６、ＡＡＶ ｒｈ．７４、またはＡＡＶ－Ｂ１である、項目１１に記載の組換えアデノ随伴ウイルス。
(項目１３)
項目９もしくは１０に記載のベクターまたは項目１１もしくは１２に記載の組換えアデノ随伴ウイルスを含む、組成物。
(項目１４)
細胞内の遺伝子の発現を阻害する方法であって、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物と前記細胞を接触させることを含む、方法。
(項目１５)
細胞におけるＤＵＸ４遺伝子の発現を阻害する方法であって、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物と前記細胞を接触させることを含む、方法。
(項目１６)
ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡをそれを必要とする動物の骨格筋に送達する方法であって、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物を前記動物に投与することを含む、方法。
(項目１７)
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを治療する方法であって、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物を投与することを含む、方法。
(項目１８)
前記組換えアデノ随伴ウイルスが、筋肉内注射、経皮輸送、血流への注射、または肝臓への注射によって投与される、項目１４～１７のいずれか１項に記載の方法。
(項目１９)
細胞内の遺伝子の発現を阻害するための医薬の調製のための、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物の使用。
(項目２０)
細胞内のＤＵＸ４遺伝子の発現を阻害するための医薬の調製のための、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物の使用。
(項目２１)
ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡをそれを必要とする動物の骨格筋へ送達するための医薬の調製のための、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物の使用。
(項目２２)
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを治療するための医薬の調製のための、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物の使用。
(項目２３)
前記医薬が、筋肉内注射、経皮輸送、または血流への注射のために製剤化される、項目１９～２２のいずれか１項に記載の使用。
(項目２４)
細胞内の遺伝子の発現を阻害するための、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物を含む、組成物。
(項目２５)
細胞内のＤＵＸ４遺伝子の発現を阻害するための、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物を含む、組成物。
(項目２６)
ＤＵＸ４ ｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡをそれを必要とする動物の骨格筋へ送達するための、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物を含む、組成物。
(項目２７)
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを治療するための、項目１～８のいずれか１項に記載の核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスまたは項目１３に記載の組成物を含む、組成物。
(項目２８)
前記組成物が、筋肉内注射、経皮輸送、または血流への注射のために製剤化される、項目２４～２７のいずれか１項に記載の組成物。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【外国語明細書】