特開 2022-48153 ＣＡＲ発現ベクター及びＣＡＲ発現Ｔ細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022048153

(43)【公開日】2022-03-25

(54)【発明の名称】ＣＡＲ発現ベクター及びＣＡＲ発現Ｔ細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/63 20060101AFI20220317BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20220317BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220317BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220317BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20220317BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220317BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20220317BHJP

   C12N 15/24 20060101ALN20220317BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20220317BHJP

【ＦＩ】

C12N15/63 Z ZNA

C12N5/0783

C12N5/10

A61P35/00

A61K35/17 Z

A61P35/02

C12N15/13

C12N15/24

C12N15/62 Z

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2021213604

(22)【出願日】2021-12-28

(62)【分割の表示】P 2020048623の分割

【原出願日】2015-10-06

(31)【優先権主張番号】P 2014208200

(32)【優先日】2014-10-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(71)【出願人】

【識別番号】304020177

【氏名又は名称】国立大学法人山口大学

(74)【代理人】

【識別番号】100107984

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 雅紀

(74)【代理人】

【識別番号】100096482

【弁理士】

【氏名又は名称】東海 裕作

(74)【代理人】

【識別番号】100131093

【弁理士】

【氏名又は名称】堀内 真

(74)【代理人】

【識別番号】100150902

【弁理士】

【氏名又は名称】山内 正子

(74)【代理人】

【識別番号】100141391

【弁理士】

【氏名又は名称】園元 修一

(74)【代理人】

【識別番号】100177714

【弁理士】

【氏名又は名称】藤本 昌平

(72)【発明者】

【氏名】玉田 耕治

(72)【発明者】

【氏名】佐古田 幸美

(72)【発明者】

【氏名】安達 圭志

(57)【要約】

【課題】Ｔ細胞においてキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と共にＴ細胞の免疫機能促進因子を発現し、免疫誘導効果や抗腫瘍活性が高いＣＡＲ発現Ｔ細胞や、かかるＣＡＲ発現Ｔ細胞を作製するためのＣＡＲ発現ベクターを提供することを課題とする。
【解決手段】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸及びＴ細胞の免疫機能促進因子をコードする核酸を含有するＣＡＲ発現ベクターであって、前記免疫機能促進因子をコードする核酸が、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸、ＳＨＰ－１に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸、又はＳＨＰ－２に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸であるＣＡＲ発現ベクターや、前記ＣＡＲ発現ベクターを導入したＣＡＲ発現Ｔ細胞を作製する。
【選択図】図６

【特許請求の範囲】

【請求項1】

明細書に記載の発明。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＣＡＲ発現ベクターや、ＣＡＲ発現ベクターを導入したＣＡＲ発現Ｔ細胞や、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を含有する抗がん剤に関する。

【背景技術】

【0002】

キメラ抗原受容体（Chimeric Antigen Receptor:以下、「ＣＡＲ」ともいう）は、がん細胞の細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体と、Ｔ細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域を融合させた人工的なキメラタンパク質である。図１に示すように、腫瘍反応性を有さない通常の末梢血Ｔ細胞（末梢血Ｔリンパ球）にＣＡＲをコードする遺伝子を導入することにより、ＣＡＲを発現可能なＣＡＲ発現Ｔ細胞（以下、単に「ＣＡＲ－Ｔ細胞」ともいう）を大量に作製することが可能となる。かかるＣＡＲ－Ｔ細胞は腫瘍反応性を有し、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）との相互作用に依存することなくがん細胞の傷害を導くことが可能となる。

【0003】

ＣＡＲ－Ｔ細胞の投与によるがん免疫療法、より具体的には、患者からＴ細胞を採取し、かかるＴ細胞にＣＡＲをコードする遺伝子を導入して増幅し、再度患者に移入する療法（非特許文献１参照）は、現在世界中で臨床試験が進行しており、白血病やリンパ腫などの造血器悪性腫瘍などにおいて有効性を示す結果が得られている。

【0004】

近年、様々なＣＡＲ－Ｔ細胞の研究が進められてきた。例えば、ＣＤ１９抗原結合領域と細胞膜貫通領域と４－１ＢＢ共刺激シグナル領域と、ＣＤ３ζシグナル領域からなるＣＡＲをコードする核酸を含む修飾された自己ヒトＴ細胞を含む医薬組成物（特許文献１参照）や、がん細胞に結合する１つ又は複数のタグ付きタンパク質の配合物と同時に又は別々に被験体に投与される、前記タグ付きタンパク質に結合し、がん細胞死を誘導する１つ又は複数の治療的に有効な抗タグキメラ抗原受容体（ＡＴ－ＣＡＲ）発現Ｔ細胞集団（特許文献２参照）や、ヒト抗体１３９の抗原結合ドメイン、細胞外ヒンジドメイン、細胞膜貫通ドメイン、及び細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体をコードする核酸を含む細胞（特許文献３参照）や、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む細胞であって、該キメラ抗原受容体が抗原結合ドメイン、細胞膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達領域、及び、SEQ ID NO：24のアミノ酸配列を含むＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む細胞（特許文献４参照）や、細胞表面膜上にＣＤ１９特異的キメラ受容体を発現及び保有し、該キメラ受容体が免疫細胞のエフェクター機能のための細胞内シグナリングドメイン、少なくとも１つの細胞膜貫通ドメイン及び少なくとも１つの細胞外ドメインからなり、細胞外ドメインがＣＤ１９特異的受容体を含む、遺伝子工学的に作製されたＣＤ１９特異的Ｔ細胞（特許文献５参照）や、細胞内ドメインとしてグルココルチロイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）の細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードする核酸が導入されたキメラ抗原受容体発現細胞（特許文献６参照）が提案されている。

【0005】

しかしながら、ＣＡＲ－Ｔ細胞の生体内での生存効率が低い、あるいはＣＡＲ－Ｔ細胞により誘導される内在性Ｔ細胞の活性化や腫瘍局所への集積が不十分という問題や、がん細胞が有する腫瘍免疫回避機構であるＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１経路を介した免疫抑制シグナル及びがん微小環境において分泌されるＴＧＦ－βやＩＬ－１０などの免疫抑制因子によるＣＡＲ－Ｔ細胞の活性阻害という問題はこれまでの技術では解決されていない。そのため、十分な治療効果が認められないがん種や症例が存在しており、さらに効果的なＣＡＲ－Ｔ細胞、及びかかるＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するための発現ベクターの作製が求められている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】米国特許出願公開第２０１４／０１０６４４９号明細書

【特許文献2】特表２０１４－５０４２９４号公報

【特許文献3】特表２０１４－５１６５１０号公報

【特許文献4】特表２０１４－５０７１１８号公報

【特許文献5】特開２０１１－００４７４９号公報

【特許文献6】国際公開第２０１３／０５１７１８号パンフレット

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】中沢洋三 信州医誌 ６１（４）：１９７～２０３（２０１３）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

従来のＣＡＲ－Ｔ細胞においては、ＣＡＲのシグナル伝達領域にＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ３ζなどを含有させることによってＴ細胞の活性化能を高める工夫がされていたが、ＣＡＲ－Ｔ細胞による内在性Ｔ細胞の免疫誘導効果や腫瘍微小環境における免疫抑制機構に対する抵抗性については十分に増強されておらず、固形がんに対してはＣＡＲ－Ｔ細胞による治療効果は未だ達成されていない。そこで、本発明の課題は、Ｔ細胞においてＣＡＲと共にＴ細胞の免疫機能促進因子を発現し、免疫誘導効果や抗腫瘍活性が高いＣＡＲ－Ｔ細胞や、かかるＣＡＲ－Ｔ細胞を作製するためのＣＡＲ発現ベクターを提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

発明者らは、ＣＡＲ－Ｔ細胞を利用したがん免疫療法において、より優れた免疫誘導効果や抗腫瘍活性を達成することを目的として、ＣＡＲ－Ｔ細胞の改良を試みた。その過程で、Ｔ細胞の免疫機能を促進する因子であるサイトカイン、ケモカイン、シグナル制御タンパク質に着目し、ＣＡＲと共に前記Ｔ細胞の免疫機能を促進する因子を発現するベクターを構築した。かかる発現ベクターをＴ細胞に導入したところ、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞よりも優れた免疫誘導効果や抗腫瘍活性を有するＣＡＲ－Ｔ細胞を作製することができることを見いだし、本発明を完成した。

【0010】

すなわち、本発明は以下に開示されるとおりのものである。
（１）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸及びＴ細胞の免疫機能促進因子をコードする核酸を含有するＣＡＲ発現ベクターであって、前記免疫機能促進因子をコードする核酸が、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸、ＳＨＰ－１に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸、又はＳＨＰ－２に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸であることを特徴とするＣＡＲ発現ベクター。
（２）免疫機能促進因子をコードする核酸が、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸であることを特徴とする上記（１）記載のＣＡＲ発現ベクター。
（３）ＣＡＲをコードする核酸とＴ細胞の免疫機能促進因子とをコードする核酸が、自己切断型ペプチドをコードする配列を介して連結されていることを特徴とする上記（２）記載のＣＡＲ発現ベクター。
（４）インターロイキン７をコードする核酸とＣＣＬ１９とをコードする核酸が、自己切断型ペプチドをコードする配列を介して連結されていることを特徴とする上記（２）又は（３）記載のＣＡＲ発現ベクター。
（５）ＣＡＲをコードする核酸が、ＦＩＴＣ又はＣＤ２０を認識する一本鎖抗体のポリペプチドをコードする核酸を含有することを特徴とする上記（１）～（４）のいずれか記載のＣＡＲ発現ベクター。
（６）ＣＡＲをコードする核酸が、ＣＤ８の細胞膜貫通領域のポリペプチドをコードする核酸を含有することを特徴とする上記（１）～（５）のいずれか記載のＣＡＲ発現ベクター。
（７）ＣＡＲをコードする核酸が、ＣＤ２８の細胞内領域、４－１ＢＢの細胞内領域、及びＣＤ３ζの細胞内領域のポリペプチドをコードする核酸を含有することを特徴とする上記（１）～（６）のいずれか記載のＣＡＲ発現ベクター。
（８）以下の（ａ）又は（ｂ）に示すベクターを導入したＣＡＲ発現Ｔ細胞。
（ａ）上記（１）～（７）のいずれか記載のＣＡＲ発現ベクター；
（ｂ）ＣＡＲをコードする核酸及びインターロイキン７をコードする核酸を含有するＣＡＲ発現ベクターと、ＣＡＲをコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有するＣＡＲ発現ベクター；
（９）上記（８）記載のＣＡＲ発現Ｔ細胞と薬学的に許容される添加剤とを含有する抗がん剤。

【発明の効果】

【0011】

本発明のＣＡＲ発現ベクターを用いれば、生存能力、リンパ球集積能力、腫瘍細胞傷害活性を併せ持つＣＡＲ－Ｔ細胞や、がん微細環境での免疫抑制に抵抗性を有するＣＡＲ－Ｔ細胞を作製することが可能となる。かかるＣＡＲ－Ｔ細胞を用いてがん患者への免疫療法を行えば、強力ながん治療効果が期待され、難治性・進行性のがんに対しても有効ながん免疫療法が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】ＣＡＲの構造及びＣＡＲ－Ｔ細胞によるがん免疫療法の基本システムを示す図である。

【図2】ＣＡＲ、インターロイキン７（ＩＬ－７）及びＣＣＬ１９を発現するベクターを表す図である。

【図3】抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現レベルをフローサイトメトリーで確認した結果－１を示す図である。左がＣＡＲ無染色、右がＣＡＲ染色である。

【図4】抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現レベルをフローサイトメトリーで確認した結果－２を示す図である。

【図5】抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現レベルをフローサイトメトリーで確認した結果を示す図である。

【図6】抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の細胞上清中のＩＬ－７及びＣＣＬ１９の濃度について、ＥＬＩＳＡにて測定した結果－１を示す図である。

【図7】抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の細胞上清中のＩＬ－７及びＣＣＬ１９の濃度について、ＥＬＩＳＡにて測定した結果－２を示す図である。

【図8】抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の細胞上清中のＩＬ－７及びＣＣＬ１９の濃度について、ＥＬＩＳＡにて測定した結果を示す図である。

【図9】抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を刺激し、３日間、５日間、７日間培養した場合の細胞数を示す図である。

【図10】抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を刺激し、３日間、５日間、７日間培養した場合の生存率を示す図である。

【図11】抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を刺激し、５日間培養した場合の細胞数を示す図である。

【図12】抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞によるＴ細胞遊走試験の結果－１を示す図である。

【図13】抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞によるＴ細胞遊走試験の結果－２を示す図である。

【図14】抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞による樹状細胞遊走試験の結果を示す図である。

【図15】抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞によるＴ細胞遊走試験の結果を示す図である。

【図16】抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞におけるＴ細胞の増殖能力を調べた結果（刺激後５日目）を示す図である。

【図17】抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞におけるＴ細胞の増殖能力を調べた結果（刺激後３日目、７日目）を示す図である。

【図18】抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞におけるＣＤ１２７の発現を調べた結果を示す図である。

【図19】抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞におけるＣＣＲ７の発現を調べた結果を示す図である。

【図20】抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を担がんマウスに投与した場合の腫瘍体積の変化を調べた結果を示す図である。

【図21】抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を担がんマウスに投与した場合のマウス生存率を調べた結果を示す図である。

【図22】Ｐ８１５－ｈＣＤ２０を皮下接種し、その後シクロホスファミドを投与したマウスに抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与した場合のマウス生存率を調べた結果を示す図である。

【図23】Ｐ８１５－ｈＣＤ２０を皮下接種し、その後シクロホスファミドを投与したマウスに抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与した場合のマウスの腫瘍体積を調べた結果を示す図である。

【図24】図２３におけるＣＰＡ＋７×１９のグラフの縦軸の数値を１／１０とした図である。

【図25】Ｐ８１５－ｈＣＤ２０を皮下接種したマウスに抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与した場合の腫瘍組織をＨ＆Ｅ染色して観察した結果を示す図である。

【図26】Ｐ８１５－ｈＣＤ２０を皮下接種したマウスに抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与した場合の腫瘍組織の免疫組織化学分析による結果を示す図である。

【図27】図２６における蛍光染色によって標識されたポジティブ領域を定量した結果を示す図である。

【図28】Ｐ８１５－ｈＣＤ２０を皮下接種したマウスに抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７発現Ｔ細胞、抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ－ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞、又は抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与した場合の腫瘍体積を調べた結果を示す図である。

【図29】（ａ）ＣＡＲとＳＨＰ１(Src homology region2domain-containing phosphatase-1)のドミナントネガティブ変異体を発現するベクターを表す図である。（ｂ）ＣＡＲとＳＨＰ２(Src homology region 2 domain-containingphosphatase-2)のドミナントネガティブ変異体を発現するベクターを表す図である。

【図30】（ａ）抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ－ＳＨＰ１ＤＮ発現Ｔ細胞による細胞傷害活性試験の結果を示す図である。（ｂ）抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ－ＳＨＰ２ＤＮ発現Ｔ細胞による細胞傷害活性試験の結果を示す図である。

【図31】Ｐ８１５－ｈＣＤ２０を抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞及びＦＩＴＣ結合リツキシマブ存在下で混合して腫瘍細胞傷害活性を調べた結果を示す図である。

【図32】Ｐ８１５－ｈＣＤ２０を抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞と混合して腫瘍細胞傷害活性を調べた結果を示す図である。

【図33】Ｐ８１５－ｈＣＤ２０を皮下接種したマウスに抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与してフローサイトメトリーで白血球表面の表現型について、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌを解析した結果を示す図である。

【図34】脾臓の白血球をマイトマイシンＣで処理したＰ８１５－ｈＣＤ２０と共に４日間培養して刺激し、Ｔ細胞の増殖をフローサイトメトリーで調べた結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明のＣＡＲ発現ベクターは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸及びＴ細胞の免疫機能促進因子をコードする核酸を含有するＣＡＲ発現ベクターであって、前記免疫機能促進因子をコードする核酸が、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸、ＳＨＰ－１に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸、又はＳＨＰ－２に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸であるＣＡＲ発現ベクターであれば特に制限されず、キメラ抗原受容体とは、がん細胞の細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体とＴ細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域を、細胞膜貫通領域を介して融合させた人工的なキメラタンパク質を意味する。

【0014】

本発明において、ＣＡＲをコードする核酸としては、ＣＡＲを構成するポリペプチドをコードする核酸であれば特に制限されず、がん細胞の細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体、細胞膜貫通領域、及びＴ細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域のポリペプチドをコードする核酸が含まれる。

【0015】

ＣＡＲにおける一本鎖抗体としては、モノクローナル抗体の抗原結合部位に由来する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（ｓｃＦｖ）からなり、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の間にリンカーペプチドが位置するオリゴ又はポリペプチドを挙げることができる。

【0016】

前記一本鎖抗体が認識するがん細胞の細胞表面抗原としては、がん細胞及びその前駆細胞に特異的に発現する生体分子、細胞のがん化によって新たに発現が認められるようになった生体分子、もしくはがん細胞において正常細胞に比べて発現レベルが増加している生体分子であればよく、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、ＦＩＴＣ、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＥＧＦＲｖａｒｉａｎｔ、ＲＯＲ１、ｃ－Ｍｅｔ、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、メソテリン、ＧＭ２、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ７４、ＣＤ１２３ ＣＤ１３３、ＣＤ１７１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＣＳ１（ＣＤ３１９）、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＢＣＭＡ、ＬｅｗｉｓＹ、ＩｇＧｋａｐｐａ ｃｈａｉｎ、Ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ａｌｐｈａ、ＰＳＣＡ、ＥｐＣＡＭを挙げることができる。

【0017】

Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域は、前記一本鎖抗体ががん細胞の細胞表面抗原を認識した際に、細胞内にシグナル伝達することが可能な領域であり、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＨＶＥＭ、ＣＤ３ζ、Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ γｃｈａｉｎの細胞内領域のポリペプチドから選択される少なくとも１種又は２種以上を含むことが好ましく、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、及びＣＤ３ζの３種の細胞内領域のポリペプチド含むことがより好ましい。

【0018】

それぞれの細胞内領域のポリペプチドは、２～１０アミノ酸からなるオリゴペプチドリンカー又はポリペプチドリンカーを介して連結されていてもよく、かかるリンカー配列として、グリシン－セリン連続配列を挙げることができる。

【0019】

本発明における細胞膜貫通領域としては、ＣＤ８、Ｔ細胞受容体のα、β鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲ由来の細胞膜貫通領域のポリペプチドを挙げることができ、ヒトＣＤ８細胞膜貫通領域のポリペプチドを好適に挙げることができる。かかる細胞膜貫通領域によって、ＣＡＲがＴ細胞の細胞膜に固定される。

【0020】

前記細胞膜貫通領域には、任意のオリゴペプチド又はポリペプチドからなり、長さが１～１００アミノ酸、好ましくは１０～７０アミノ酸のヒンジ領域を含んでもよい。ヒンジ領域としては、ヒトＣＤ８のヒンジ領域を挙げることができる。

【0021】

また、がん細胞の細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体と細胞膜貫通領域、細胞膜貫通領域とＴ細胞活性化シグナル伝達領域との間には、任意のオリゴペプチド又はポリペプチドからなるスペーサー領域を設けてもよい。スペーサー領域の長さとしては、１～１００アミノ酸、好ましくは１０～５０アミノ酸を挙げることができ、かかるスペーサー領域として、グリシン－セリン連続配列を挙げることができる。

【0022】

本発明において、Ｔ細胞の機能促進因子をコードする核酸としては、ＩＬ－７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸（以下、「本件核酸１」ともいう）、ＳＨＰ－１に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸（以下、「本件核酸２」ともいう）、又はＳＨＰ－２に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸（以下、「本件核酸３」ともいう）であれば特に制限されず、前記本件核酸１～３のそれぞれの核酸を複数含んでいてもよく、具体的には、本件核酸１及び本件核酸２、本件核酸１及び本件核酸３、本件核酸２及び本件核酸３、本件核酸１及び本件核酸２及び本件核酸３を含んだ核酸であってもよい。

【0023】

なお、本件核酸１におけるＩＬ－７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸としては、ＩＬ－７をコードする核酸とＣＣＬ１９をコードする核酸を含んでいればよく、ＩＬ－７をコードする核酸に対してＣＣＬ１９をコードする核酸が上流に配置していても、下流に配置していてもよい。

【0024】

ＳＨＰ１に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸としては、ＳＨＰ１に対して優位に働き、ＳＨＰ１の作用を阻害できるＳＨＰ１の変異体をコードする核酸であれば特に制限されず、ＳＨＰ１のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列からなり、ＳＨＰ１の作用を阻害できる変異体をコードする核酸を挙げることができる。また、ＳＨＰ２に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸としては、ＳＨＰ２に対して優位に働き、ＳＨＰ２の作用を阻害できるＳＨＰ２の変異体をコードする核酸であれば特に制限されず、ＳＨＰ２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列からなり、ＳＨＰ２の作用を阻害できる変異体をコードする核酸を挙げることができる。

【0025】

本発明のＣＡＲ発現ベクターにおいて、キメラ抗原受容体をコードする核酸とＴ細胞の免疫機能促進因子をコードする核酸の間や、本件核酸１、本件核酸２、本件核酸３を複数含む場合における各核酸の間や、本件核酸１におけるＩＬ－７をコードする核酸とＣＣＬ１９をコードする核酸の間には、それぞれの核酸を発現し得る限り、任意の核酸を含んでもよいが、自己切断型ペプチド（２Ａペプチド）、又はＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）をコードする配列、好ましくは２Ａペプチドをコードする配列を介して連結されていることが好ましい。かかる配列を用いて連結することにより、それぞれの核酸を効率よく発現させることが可能となる。

【0026】

２Ａペプチドとは、ウイルス由来の自己切断型ペプチドであり、配列番号１で示されるアミノ酸配列中のＧ－Ｐ間（Ｃ末端から１残基の位置）が小胞体で切断される特徴を有する（Szymczak et al., Expert Opin. Biol. Ther.5(5):627-638(2005)）。そのため、２Ａペプチドを介してその前後に組み込まれた核酸は、細胞内で互いに独立して発現することとなる。

【0027】

前記２Ａペプチドとしては、ピコルナウイルス、ロタウイルス、昆虫ウイルス、アフトウイルス又はトリパノソーマウイルス由来の２Ａペプチドであることが好ましく、配列番号２に示すピコルナウイルス由来の２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）であることがより好ましい。

【0028】

キメラ抗原受容体をコードする核酸は、がん細胞の細胞表面抗原に対する一本鎖抗体、細胞膜貫通領域、及びＴ細胞活性化シグナル伝達領域のポリペプチドをコードする塩基配列に基づき、化学合成する方法や、ＰＣＲによって増幅する方法などの公知の技術によって作製することができる。なお、アミノ酸をコードするための選択されるコドンは、目的の宿主細胞における核酸の発現を最適化するために改変されてもよい。

【0029】

がん細胞の細胞表面抗原に対する一本鎖抗体、細胞膜貫通領域、及びＴ細胞活性化シグナル伝達領域のポリペプチドをコードする塩基配列の情報は、公知の文献やＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）などのデータベースを検索して適宜入手することができる。

【0030】

たとえば、Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域におけるＣＤ２８、４－１ＢＢ、及びＣＤ３ζの細胞膜貫通領域のポリペプチドをコードする塩基配列の情報は、ＮＣＢＩなどのデータベースを検索して適宜入手することができ、ヒトＣＤ２８については、Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＮＭ＿００６１３９．２（更新日：２０１４年５月１０日）、ヒト４－１ＢＢについては、Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＮＭ＿００１５６１．５（更新日：２０１４年３月１６日）、ヒトＣＤ３ζについては、Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＮＭ＿０００７３４．３（更新日：２０１４年８月１２日）として登録されたものを例示することができる。

【0031】

また、ヒトＣＤ８の細胞膜貫通領域のポリペプチドをコードする塩基配列の情報は、ＮＣＢＩ等のデータベースを検索し適宜入手することができ、Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＮＭ＿００１７６８．６（更新日：２０１４年５月１０日）として登録されたものを例示することができる。

【0032】

さらに、一本鎖抗体のポリペプチドをコードする塩基配列の情報については、標的とする細胞表面抗原を認識するモノクローナル抗体を作製し、かかるモノクローナル抗体のアミノ酸配列をエドマン法などの公知の方法で決定し、かかるアミノ酸配列に基づいて入手することもできる。モノクローナル抗体の作製方法としては、ハイブリドーマを用いて作製する方法や、遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで宿主を形質転換して作製する方法や、トランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで作製する方法を挙げることができる。

【0033】

Ｔ細胞の免疫機能促進因子をコードする核酸である、ＩＬ－７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸、ＳＨＰ－１に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸、又はＳＨＰ－２に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸は、それぞれの塩基配列に基づき、化学合成する方法や、ＰＣＲによって増幅する方法などの公知の技術によって作製することができる。なお、アミノ酸をコードするための選択されるコドンは、目的の宿主細胞における核酸の発現を最適化するために改変されてもよい。

【0034】

ＩＬ－７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸、ＳＨＰ－１に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸、又はＳＨＰ－２に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸の情報は、公知の文献やＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）などのデータベースを検索して適宜入手することができる。

【0035】

ＩＬ－７をコードする核酸としては、本発明のＣＡＲ発現ベクターを導入する細胞の種類に応じて適宜選択でき、たとえば、ヒトＩＬ－７のアミノ酸配列（配列番号３）をコードする核酸を挙げることができ、ＩＬ－７における細胞増殖率の亢進作用を有する限り、配列番号３に示す塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を用いてもよい。

【0036】

ＣＣＬ１９をコードする核酸としては、本発明のＣＡＲ発現ベクターを導入する細胞の種類に応じて適宜選択でき、たとえば、ヒトＣＣＬ１９のアミノ酸配列（配列番号４）をコードする核酸を挙げることができ、ＣＣＬ１９におけるＴ細胞遊走作用を有する限り、配列番号４に示す塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を用いてもよい。

【0037】

ＳＨＰ－１に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸としては、本発明のＣＡＲ発現ベクターを導入する細胞の種類に応じて適宜選択でき、たとえば、ヒトＳＨＰ－１に対するドミナントネガティブ変異体のアミノ酸配列（配列番号５）をコードする核酸を挙げることができ、ＳＨＰ－１に対するドミナントネガティブ変異体におけるＳＨＰ－１の作用を阻害できる限り、配列番号５に示す塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を用いてもよい。なお、配列番号５中、４５３番目のセリンが変異部位である。

【0038】

ＳＨＰ－２に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸としては、本発明のＣＡＲ発現ベクターを導入する細胞の種類に応じて適宜選択でき、たとえば、ヒトＳＨＰ－２に対するドミナントネガティブ変異体のアミノ酸配列（配列番号６）をコードする核酸を挙げることができ、ＳＨＰ－２に対するドミナントネガティブ変異体におけるＳＨＰ－２の作用を阻害できる限り、配列番号６に示す塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を用いてもよい。なお、配列番号６中、４５９番目のセリンが変異部位である。

【0039】

本発明のＣＡＲ発現ベクターとしては直鎖状でも環状でもよく、プラスミドなどの非ウイルスベクターでも、ウイルスベクターでも、トランスポゾンによるベクターでもよい。また、かかるベクターには、プロモーターやターミネーターなどの制御配列や、薬剤耐性遺伝子、レポーター遺伝子など選択マーカー配列を含有していてもよい。プロモーター配列の下流に作動可能にＣＡＲをコードする核酸やＴ細胞の免疫機能促進因子をコードする核酸を配置することで、それぞれの核酸を効率よく転写することが可能となる。また、マーカー遺伝子を含有させることによって、キメラ抗原受容体をコードする核酸の発現を容易に確認することが可能となる。

【0040】

また、本発明のＣＡＲ発現ベクターには、自殺遺伝子をコードする核酸を含んでいてもよく、かかる自殺遺伝子の位置は特に制限されず、ＩＬ－７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、ＳＨＰ－１に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸、又はＳＨＰ－２に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸を発現させるためのプロモーターの下流に２Ａペプチド又はＩＲＥＳをコードする配列を介して上記それぞれの核酸の上流又は下流に配置してもよく、他のプロモーターの下流に配置してもよい。本発明のＣＡＲ発現ベクターに自殺遺伝子をコードする核酸を含ませることによって、がんの治療経過に応じて、たとえば腫瘍が消失した場合に自殺遺伝子の機能を活性化する薬剤を投与し、生体内のＣＡＲ発現Ｔ細胞数を制御することが可能となる。

【0041】

自殺遺伝子としては、以下の文献に記載された単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（HSV-TK）や誘導性カスパーゼ９（inducible caspase 9）などを挙げることができ、かかる遺伝子の機能を活性化する薬剤としては、前者に対してはガンシクロビル、後者に対しては二量体誘導化合物（chemicalinduction of dimerization:CID）であるＡＰ１９０３を挙げることができる（CooperLJ., et. al. Cytotherapy. 2006;8(2):105-17., Jensen M. C. et.al. Biol BloodMarrow Transplant. 2010 Sep;16(9):1245-56., Jones BS. FrontPharmacol. 2014 Nov27;5:254., Minagawa K., Pharmaceuticals (Basel). 2015 May8;8(2):230-49.,Bole-Richard E., Front Pharmacol. 2015 Aug 25;6:174）。

【0042】

前記ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターを挙げることができ、レトロウイルスベクターを好適に挙げることができ、ｐＭＳＧＶベクター（Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002)）やｐＭＳＣＶベクター（タカラバイオ社製）をより好適に挙げることができる。レトロウイルスベクターを用いれば、導入遺伝子はホスト細胞のゲノムへ取り込まれるため、長期間かつ安定に発現することが可能となる。

【0043】

本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞としては、（ａ）前記本発明のＣＡＲ発現ベクターを導入して得られたＴ細胞や、（ｂ）ＣＡＲをコードする核酸及びインターロイキン７をコードする核酸を含有するＣＡＲ発現ベクター（ＣＡＲ－ＩＬ－７発現ベクター）と、ＣＡＲをコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有するＣＡＲ発現ベクター（ＣＡＲ－ＣＣＬ１９発現ベクター）の少なくとも２つのベクターを導入して得られたＴ細胞であれば特に制限されず、本発明のＣＡＲ発現ベクターや、ＣＡＲ－ＩＬ－７発現ベクターとＣＡＲ－ＣＣＬ１９発現ベクターをＴ細胞に導入する方法としては特に制限されないが、ウイルス感染法、カルシウムリン酸法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法などの公知の方法により導入する方法を挙げることができ、ウイルス感染法を好適に挙げることができる。なお、上記ＣＡＲ－ＩＬ－７発現ベクターは、ＣＡＲをコードする核酸及びインターロイキン７をコードする核酸を含有していればよく、上記ＣＡＲ－ＣＣＬ１９発現ベクターは、ＣＡＲをコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有していればよく、本発明のＣＡＲ発現ベクターと同様に、それぞれの核酸を発現し得る限り、２Ａペプチド、ＩＲＥＳ、又は自殺遺伝子をコードする核酸などの他の核酸を含んでもよい。

【0044】

ウイルス感染法としては、本発明のＣＡＲ発現ベクターとパッケージングプラスミドをＧＰ２－２９３細胞（タカラバイオ社製）、Ｐｌａｔ－ＧＰ細胞（コスモ・バイオ社製）、ＰＧ１３細胞（ATCC CRL-10686）、ＰＡ３１７細胞（ATCC CRL-9078）などのパッケージング細胞にトランスフェクションして組換えウイルスを作製し、かかる組換えウイルスをＴ細胞に感染させる方法を挙げることができ、Retrovirus packagin Kit Eco（タカラ
バイオ社製）などの市販のキットを用いて行ってもよい。

【0045】

Ｔ細胞への本発明のＣＡＲ発現ベクターの導入の確認は、フローサイトメトリー、ノザンブロッティング、サザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲなどのＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティングによってＣＡＲの発現を調べることや、ベクターに挿入されたマーカー遺伝子の発現を調べることによって確認することができる。

【0046】

Ｔ細胞としては、ヒト由来のＴ細胞や、イヌ、ネコ、ブタ、マウスなどの非ヒト哺乳動物由来のＴ細胞を挙げることができる。また、Ｔ細胞は、血液、骨髄液などの体液や、脾臓、胸腺、リンパ節などの組織、もしくは原発腫瘍、転移性腫瘍、がん性腹水などのがん組織に浸潤する免疫細胞から単離、精製して得ることができる。かかるＴ細胞としては、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、ＮＫＴ細胞を挙げることができる。

【0047】

本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞において、発現する一本鎖抗体は細胞外に位置し、かかる一本鎖抗体を備えることによって、ＣＡＲ発現Ｔ細胞はがん細胞の表面上に発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識することが可能となる。

【0048】

また、本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞に、前記本発明のＣＡＲ発現ベクターと共に、自殺遺伝子をコードする核酸を含有するベクターを導入してもよい。

【0049】

本発明の抗がん剤は、本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞と薬学的に許容される添加剤とを含有していれば特に制限されず、前記添加剤としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、細胞培養培地、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール及びこれらの組合せ、安定剤、可溶化剤及び界面活性剤、緩衝剤及び防腐剤、等張化剤、充填剤、並びに潤滑剤を挙げることができる。

【0050】

本発明の抗がん剤は、当業者に既知の方法を用いて、がんの治療を必要とする被験体に投与することができ、投与方法としては、静脈内、腫瘍内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、髄内、心臓内、関節内、滑液嚢内、頭蓋内、髄腔内、及びくも膜下（髄液）への注射を挙げることができる。

【0051】

投与する抗がん剤に含まれる本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞の量は、がんの種類、位置、重症度、治療を受ける被験体の年齢、体重及び状態などに応じて適宜調整できるが、好ましくは、一回の投与において１×１０^４～１×１０^１０個、好ましくは１×１０^５～１×１０^９個、より好ましくは５×１０^６～５×１０^８個を挙げることができる。

【0052】

投与する抗がん剤は、１日４回、３回、２回又は１回、１日おき、２日おき、３日おき、４日おき、５日おき、週１回、７日おき、８日おき、９日おき、週２回、月１回又は月２回独立して投与することができる。

【0053】

本発明の抗がん剤や、後述するがんの治療方法におけるがんとしては、腺がん、扁平上皮がん、腺扁平上皮がん、未分化がん、大細胞がん、小細胞がん、皮膚がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、膣がん、頸部がん、子宮がん、肝臓がん、腎臓がん、膵臓がん、脾臓がん、肺がん、気管がん、気管支がん、結腸がん、小腸がん、胃がん、食道がん、胆嚢がん、精巣がん、卵巣がんなどのがんや、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織及び造血組織のがんのほか、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫などの肉腫や、肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、網膜芽腫などの芽腫や、胚細胞腫瘍や、リンパ腫や、白血病を挙げることができる。

【0054】

本発明の抗がん剤は、他の抗がん剤と併用して用いることができる。他の抗がん剤としては、シクロホスファミド、ベンダムスチン、イオスファミド、ダカルバジンなどのアルキル化薬、ペントスタチン、フルダラビン、クラドリビン、メソトレキセート、５－フルオロウラシル、６－メルカプトプリン、エノシタビンなどの代謝拮抗薬、リツキシマブ、セツキシマブ、トラスツズマブなどの分子標的薬、イマチニブ、ゲフェチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダサチニブ、スニチニブ、トラメチニブなどのキナーゼ阻害剤、ボルテゾミブなどのプロテアソーム阻害剤、シクロスポリン、タクロリムスなどのカルシニューリン阻害薬、イダルビジン、ドキソルビシンマイトマイシンＣなどの抗がん性抗生物質、イリノテカン、エトポシドなどの植物アルカロイド、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチンなどのプラチナ製剤、タモキシフェン、ビカルダミドなどのホルモン療法薬、インターフェロン、ニボルマブ、ペンブロリズマブなどの免疫制御薬を挙げることができ、アルキル化薬又は代謝拮抗薬を好適に挙げることができ、シクロホスファミドを好適に挙げることができる。

【0055】

上記「本発明の抗がん剤と他の抗がん剤と併用して用いる」方法としては、他の抗がん剤を用いて処理し、その後本発明の抗がん剤を用いる方法や、本発明の抗がん剤と他の抗がん剤を同時に用いる方法や、本発明の抗がん剤を用いて処理し、その後他の抗がん剤を用いる方法を挙げることができ、他の抗がん剤を用いて処理し、その後本発明の抗がん剤を用いる方法を好適に挙げることができる。また、本発明の抗がん剤と他の抗がん剤と併用した場合には、がんの治療効果がより向上するとともに、それぞれの抗がん剤の投与回数又は投与量を減らすことで、それぞれの抗がん剤による副作用を低減させることが可能となる。また、本発明の抗がん剤に上記他の抗がん剤を含めてもよい。

【0056】

本発明の別の態様１として、１）本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞を、がんの治療を必要とする患者に投与することを特徴とするがんの治療方法や、２）抗がん剤として使用するための、本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞や、３）本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞の、抗がん剤の調製における使用を挙げることができる。

【0057】

さらに、本発明の別の態様２として、本発明のＣＡＲ発現ベクターを備えている、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を作製するためのキットを挙げることができ、かかるキットとしては、本発明のＣＡＲ発現ベクターを備えていれば特に制限されず、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を作製するための説明書や、本発明のＣＡＲ発現ベクターをＴ細胞に導入するために用いる試薬を含んでいてもよい。

【実施例0058】

［ＩＬ－７及びＣＣＬ１９を発現するＴ細胞の作製］
（Ｔ細胞の免疫機能促進因子の選択）
Ｔ細胞の機能を制御できる分子は少なくとも生体内に数百種類も存在する。発明者らは、ＣＡＲ－Ｔ細胞における更なる抗腫瘍効果を高めるための制御分子として、これまでの知見や経験に基づき、膨大な組み合わせの中からまずはＩＬ－７とＣＣＬ１９を選択し、かつ、それぞれ単独ではなく２つの組み合わせ、すなわちＩＬ－７とＣＣＬ１９との組み合わせを選択し、かかるＴ細胞の免疫機能促進因子とＣＡＲを共に発現するベクターを作製した。

【0059】

なお、前記ＩＬ－７はＴ細胞の生存に必須のサイトカインであり、骨髄、胸腺、リンパ器官・組織のストローマ細胞などの非造血細胞によって産生される。一方、Ｔ細胞自体の産生能力はほとんど認められない。

【0060】

また、前記ＣＣＬ１９は主にリンパ節の樹状細胞やマクロファージから産生され、その受容体であるＣＣＲ７を介してＴ細胞やＢ細胞、成熟した樹状細胞の遊走を惹起する機能を有する。

【0061】

（ＩＬ－７及びＣＣＬ１９を発現する抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ発現ベクターの作製）
抗ＦＩＴＣ ｓｃＦｖ、マウスＣＤ８膜貫通領域、マウスＣＤ２８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ細胞内シグナルモチーフからなる抗ＦＩＴＣ ＣＡＲをコードする抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ ＤＮＡ断片（配列番号７）、配列番号１に示す２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）と、該ペプチドに続く制限酵素サイト（ＭＣＳ）をコードするＦ２Ａ－ＭＣＳ ＤＮＡ断片（配列番号８）、マウスＩＬ－７（ストップコドン無し）と、それに続くＦ２ＡとマウスＣＣＬ１９をコードするＩＬ－７－Ｆ２Ａ－ＣＣＬ１９ ＤＮＡ断片（配列番号９）を人工合成した。配列番号７において、１～８１９番目が抗ＦＩＴＣ ｓｃＦｖ、８２９～１０７４番目がマウスＣＤ８膜貫通領域、１０７５～１１９７番目がマウスＣＤ２８の細胞内領域、１１９８～１３３２番目が４－１ＢＢの細胞内領域、１３３３～１６７４番目がＣＤ３ζの細胞内領域のポリペプチドをコードする配列である。また、配列番号９において、１～４６２番目がＩＬ－７、４６３～５３７番目がＦ２Ａ、５３８～８６４番目がＣＣＬ１９をコードする配列である。

【0062】

ＣＡＲ、ＩＬ－７及びＣＣＬ１９を発現するＣＡＲベクターを作製するために、上記抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ ＤＮＡ断片と上記Ｆ２Ａ－ＭＣＳ ＤＮＡ断片を連結して抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ－Ｆ２Ａ－ＭＣＳコンストラクトを作製した。次に、作製したコンストラクトをｐＭＳＧＶレトロウイルス発現ベクター（Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002)）にクローニングして抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ－Ｆ２Ａ－ＭＣＳを含むｐＭＳＧＶベクターを作製した。かかるｐＭＳＧＶベクターのＭＣＳに、上記ＩＬ－７－Ｆ２Ａ－ＣＣＬ１９ ＤＮＡ断片を、制限酵素（ＮｓｉＩ及びＳａｌＩ）処理及びライゲーションにより挿入し、抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ－Ｆ２Ａ－ＩＬ－７－Ｆ２Ａ－ＣＣＬ１９を含むｐＭＳＧＶベクター（ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現－抗ＦＩＴＣ ＣＡＲベクター）を得た。得られたベクターの配置図を図２に示す。また、コントロールとして抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ ＤＮＡ断片をｐＭＳＧＶレトロウイルス発現ベクターにクローニングし、抗ＦＩＴＣ ＣＡＲを含むｐＭＳＧＶベクター（コントロール抗ＦＩＴＣ ＣＡＲベクター）を作製した。

【0063】

（ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現－抗ＦＩＴＣ ＣＡＲベクターを導入したレトロウイルスの作製）
マウスＴ細胞の形質導入のために、レトロウイルスを作製した。リポフェクタミン２０００又は３０００（ライフテクノロジー社製）を用い、上述のＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現－抗ＦＩＴＣ ＣＡＲベクター又はコントロール抗ＦＩＴＣ ＣＡＲベクターと、ｐＣＬ－Ｅｃｏプラスミド（Ｉｍｇｅｎｅｘ社製）をＧＰ２－２９３パッケージング細胞株（タカラバイオ社製）にトランスフェクションすることで、ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現－抗ＦＩＴＣ ＣＡＲベクター又はコントロール抗ＦＩＴＣ ＣＡＲベクターを導入したレトロウイルスを作製した。トランスフェクションから４８時間後に前記レトロウイルスを含有する上清を回収した。

【0064】

前記ＧＰ２－２９３細胞の培養液としては、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを加えたＤＭＥＭを用いた。また、後述の実施例で用いるＴ細胞の培養液としては、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０ｍＭの２－メルカプトエタノール、２ｍＭのＬ－グルタミンを加えたＲＰＭＩ－１６４０を用いた。

【0065】

（マウスＴ細胞の形質導入）
マウスＴ細胞の形質導入のため、脾臓及びリンパ節由来の３×１０⁶個の精製したマウスＴ細胞を、固層化した抗ＣＤ３モノクローナル抗体（３μｇ／ｍｌ）、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）、ＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍｌ）で４８時間活性化した。次に、上述で作製したＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現－抗ＦＩＴＣ ＣＡＲベクター又はコントロール抗ＦＩＴＣ ＣＡＲベクターを導入したレトロウイルスを含有する上清を、２５μｇ／ｍｌのレトロネクチン（登録商標：タカラバイオ社製）でコートしたプレートで活性化させた上述のマウスＴ細胞（１×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）と混合し、１５００ｒｐｍで２時間遠心後、ＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍｌ）の存在下で６時間培養した。培養液からレトロウイルスを除去するため、マウスＴ細胞を回収し、ＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍｌ）を含有する新しい増殖培養液（ＲＰＭＩ）に移し、さらに４２時間培養し、ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現－抗ＦＩＴＣ ＣＡＲベクターを導入したマウスＴ細胞（抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞）又はコントロール抗ＦＩＴＣ ＣＡＲベクターを導入したマウスＴ細胞（抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ発現Ｔ細胞）を得た。

【0066】

（ＩＬ－７及びＣＣＬ１９を発現する抗ＣＤ２０ ＣＡＲ発現ベクターの作製）
上記におけるＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現－抗ＦＩＴＣ ＣＡＲベクターの作製において、配列番号７に示す配列に含まれる抗ＦＩＴＣ ｓｃＦｖ領域の配列を、リツキシマブの配列に基づきライフテクノロジー社が合成した抗ヒトＣＤ２０ ｓｃＦｖ（配列番号１０）の配列に置換した以外は同様の方法で、抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ－Ｆ２Ａ－ＩＬ－７－Ｆ２Ａ－ＣＣＬ１９を含むｐＭＳＧＶベクター（ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現－抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲベクター）を作製した。同様に、上記におけるにおけるコントロール抗ＦＩＴＣ ＣＡＲベクターの作製において、配列番号７に示す配列に含まれる抗ＦＩＴＣ ｓｃＦｖ領域の配列を、上記抗ヒトＣＤ２０ ｓｃＦｖ（配列番号１０）の配列に置換した以外は同様の方法で、抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲを含むｐＭＳＧＶベクター（コントロール抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲベクター）を作製した。かかるＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現－抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲベクター又はコントロール抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲベクターを、上記と同様の方法でマウスＴ細胞へ導入して、抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞又は抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ発現Ｔ細胞を作製した。

【実施例0067】

［フローサイトメトリーによるＣＡＲ発現測定］
（フローサイトメトリー解析）
モデル抗原としてのＦＩＴＣを認識するＣＡＲの発現レベルは２色フローサイトメトリー解析によって行った。作製した抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞をＦＩＴＣ結合デキストランとアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合抗ＣＤ８モノクローナル抗体（５３－６．７Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）の存在下で培養した。フローサイトメトリーはＥＣ８００（ソニー社製）を用い、データ解析はＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ社製）を用いた。

【0068】

また、ヒトＣＤ２０を認識するＣＡＲの発現レベルも２色フローサイトメトリー解析によって行った。作製した抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞をビオチン標識したプロテインＬ及びＡＰＣ結合ストレプトアビジンを用いて解析した。

【0069】

（結果）
結果を図３～５に示す。図３中、左はＣＡＲ無染色（ＦＩＴＣ結合デキストラン不添加）の抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞、右はＣＡＲ染色（ＦＩＴＣ結合デキストラン添加）の抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の結果であり、図４中、「ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ （－）」は形質導入なしのＴ細胞、「Ｃｏｎｔ．」は抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ発現Ｔ細胞、「７×１９」は抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞であり、図５中、「ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ （－）」は形質導入なしのＴ細胞、「Ｃｏｎｔ．」は抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ発現Ｔ細胞、「７×１９」は抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の結果である。また、図中の数値はそれぞれのポピュレーションのパーセンテージを表す。図３～５に示すように抗ＦＩＴＣ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞や抗ヒトＣＤ２０ ＣＡＲ－ＩＬ－７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞において、ＣＡＲの発現が確認された。