特開 2022-50154 抗酸化剤およびケルセチン配糖体の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2022050154

(43)【公開日】2022-03-30

(54)【発明の名称】抗酸化剤およびケルセチン配糖体の製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7048 20060101AFI20220323BHJP

   C07H 17/07 20060101ALI20220323BHJP

   A61P 39/06 20060101ALI20220323BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20220323BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20220323BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220323BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20220323BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20220323BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20220323BHJP

   A61P 25/20 20060101ALI20220323BHJP

   A61K 36/28 20060101ALI20220323BHJP

【ＦＩ】

A61K31/7048

C07H17/07

A61P39/06

A61P9/10 101

A61P9/10

A61P9/00

A61P35/00

A61P3/10

A61P3/06

A61P25/28

A61P25/20

A61K36/28

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2020156594

(22)【出願日】2020-09-17

(71)【出願人】

【識別番号】593012228

【氏名又は名称】株式会社希松

(71)【出願人】

【識別番号】507219686

【氏名又は名称】静岡県公立大学法人

(74)【代理人】

【識別番号】100110766

【弁理士】

【氏名又は名称】佐川 慎悟

(74)【代理人】

【識別番号】100165515

【弁理士】

【氏名又は名称】太田 清子

(74)【代理人】

【識別番号】100169340

【弁理士】

【氏名又は名称】川野 陽輔

(74)【代理人】

【識別番号】100195682

【弁理士】

【氏名又は名称】江部 陽子

(74)【代理人】

【識別番号】100206623

【弁理士】

【氏名又は名称】大窪 智行

(72)【発明者】

【氏名】藤浪 未沙

(72)【発明者】

【氏名】小谷野 豊

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 嘉純

(72)【発明者】

【氏名】小松 令以子

(72)【発明者】

【氏名】門脇 航

(72)【発明者】

【氏名】本田 沙理

(72)【発明者】

【氏名】熊澤 茂則

【テーマコード（参考）】

4C057

4C086

4C088

【Ｆターム（参考）】

4C057AA06

4C057BB03

4C057DD03

4C057KK08

4C086AA04

4C086EA11

4C086GA17

4C086MA01

4C086MA04

4C086ZA05

4C086ZA15

4C086ZA36

4C086ZA45

4C086ZB26

4C086ZC33

4C086ZC35

4C088AB26

4C088CA06

4C088ZA05

4C088ZA15

4C088ZA36

4C088ZA45

4C088ZB26

4C088ZC33

4C088ZC35

(57)【要約】

【課題】 酸化反応の進行を効果的に抑制する抗酸化剤を提供する。
【解決手段】 ケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシドまたはその塩を有効成分とする、抗酸化剤。本発明の抗酸化剤は、還元能ないしラジカル消去能力に優れ、高い抗酸化作用を発揮する。よって、酸化ストレスによる老化の進行の抑制、酸化ストレスによる疾病の発症や不健康状態の予防ないし改善、あるいは、酸化による製品の品質劣化の抑制に寄与することができる。
【選択図】 図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシドまたはその塩を有効成分とする、抗酸化剤。

【請求項2】

前記ケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシドまたはその塩が、キンセンカ属から抽出されたものである、請求項１に記載の抗酸化剤。

【請求項3】

キンセンカ属からケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシドまたはその塩を抽出する工程を有する、ケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシドまたはその塩を製造する方法。

【請求項4】

キンセンカ属からケルセチン３－Ｏ－（６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシドまたはその塩を抽出する工程を有する、ケルセチン３－Ｏ－（６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシドまたはその塩を製造する方法。

【請求項5】

前記キンセンカ属が、トウキンセンカ（Calendula officinalis）である、請求項３または請求項４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗酸化剤およびケルセチン配糖体の製造方法に関する。より詳細には、ケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシドまたはその塩を有効成分とする抗酸化剤、ケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシドまたはその塩の製造方法、および、ケルセチン３－Ｏ－（６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシドまたはその塩の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

生体内では、好気呼吸により酸素を利用する過程において、あるいは紫外線や大気汚染物質、放射線、ある種の薬剤、タバコなどの刺激により、種々の活性酸素やフリーラジカルが発生している。活性酸素やフリーラジカルは高い酸化力を持ち、細胞伝達物質として働いたり、殺菌や抗腫瘍など免疫機能を果たす。しかしその一方で、過剰に産生されたものは細胞を傷害し、動脈硬化症、脳梗塞、心疾患、癌、糖尿病、高脂血症、睡眠障害、認知症などの様々な疾患をもたらしたり、老化を亢進する要因となることが報告されている（非特許文献１）。

【0003】

また、生体外においても、例えば、食品や飼料、化粧品、合成樹脂、洗浄剤などでは、空気中の酸素によって含有成分が酸化され、褐変や退色、においや風味の変化、機能低下、栄養価の低下など、品質が劣化することが課題になっている。

【0004】

そこで、酸化力の高い物質を消去したり、対象物における酸化反応の進行を抑制したりする活性（抗酸化活性）を有する物質が求められている。例えば、特許文献１には、ネギ属抽出物やタマネギ抽出物に含まれるＳ－１－プロペニルシステインを有効成分とする抗酸化剤が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開第２０２０－０２９５２９号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】吉川敏一、フリーラジカルの医学、京府医大誌、第１２０号、第６巻、第３８１～３９１頁、２０１１年

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、未だ、酸化反応の進行を効果的に抑制する物質は十分に供給されている状況とはいえない。本発明は、係る課題を解決するためになされたものであって、酸化反応の進行を効果的に抑制する抗酸化剤を提供することを目的とする。また、高い抗酸化活性を有するケルセチン配糖体を製造する方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、鋭意研究の結果、キンセンカ属（Calendula）に、ケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシド、および、ケルセチン３－Ｏ－（６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシドが多く含まれることを見出した。また、これらのケルセチン配糖体が高い抗酸化活性を有することを見出した。そこで、これらの知見に基づいて下記の各発明を完成した。

【0009】

（１）本発明に係る抗酸化剤は、ケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシドまたはその塩を有効成分とする。

【0010】

（２）本発明において、ケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシドまたはその塩は、キンセンカ属から抽出されたものであってもよい。

【0011】

（３）本発明に係るケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシドまたはその塩の製造方法は、キンセンカ属からケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシドまたはその塩を抽出する工程を有する。

【0012】

（４）本発明に係るケルセチン３－Ｏ－（６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシドまたはその塩の製造方法は、キンセンカ属からケルセチン３－Ｏ－（６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシドまたはその塩を抽出する工程を有する。

【0013】

（５）本発明において、キンセンカ属の植物は、トウキンセンカ（Calendula officinalis）であってもよい。

【発明の効果】

【0014】

本発明の抗酸化剤は、還元能ないしラジカル消去能力に優れ、高い抗酸化作用を発揮する。よって、酸化ストレスによる老化の進行の抑制、酸化ストレスによる疾病の発症や不健康状態の予防ないし改善、あるいは、酸化による製品の品質劣化の抑制に寄与することができる。また、本発明によれば、有用な化合物であるケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシドやケルセチン３－Ｏ－（６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシドまたはそれらの塩を製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】トウキンセンカ葉エタノール抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。

【図2】ＦＲＡＰ法により測定した、クロロゲン酸（化１）、ケルセチン３－Ｏ－ネオヘスペリジン（化２）、ケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシド（化３）およびケルセチン３－Ｏ－（６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシド（化４）のトロロックス相当量（mol TE/mol）を示す棒グラフである。

【図3】ＡＢＴＳ法により測定した、クロロゲン酸（化１）およびケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシド（化３）のトロロックス相当量（mol TE/mol）を示す棒グラフである。

【図4】ＤＰＰＨ法により測定した、クロロゲン酸（化１）およびケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシド（化３）のトロロックス相当量（mol TE/mol）を示す棒グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下、本発明について詳細に説明する。

【0017】

本発明において、「抗酸化活性」とは、活性酸素やフリーラジカルといった酸化力の強い物質（酸化物質）を消去する活性、もしくは、酸化物質の酸化力を弱める活性、または、対象物における酸化反応の進行を抑制する活性をいう。また、「抗酸化剤」とは、抗酸化活性を有する物質をいう。

【0018】

キンセンカ属は、キク科キンセンカ属に属する植物をいう。キンセンカ属としては、例えば、トウキンセンカ（Calendula officinalis、ポットマリーゴールド、カレンデュラ）や、ヒメキンセンカ（Calendula arvensis、ホンキンセンカ、フユシラズ、フユザキキンセンカ）などを例示することができる。

【0019】

ケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシド（quercetin 3-O-(2"-O-α-rhamnosyl-6''-O-malonyl)-β-D-glucoside）は、下記の化３に示す構造の化合物である。

【化3】

【0020】

ケルセチン３－Ｏ－（６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシド（quercetin 3-O-(6''-O-malonyl)-β-D-glucoside）は、下記の化４に示す構造の化合物である。

【化4】

【0021】

ケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシド（化３）およびその塩、ならびにケルセチン３－Ｏ－（６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシド（化４）およびその塩（以下、化３および化４の化合物ならびにそれらの塩をまとめて、またはいずれかを指して、「本化合物」という場合がある。）は、後述する実施例で示すように高い抗酸化活性を有する。よって、少なくともこの点で有用な物質であり、本化合物は抗酸化剤として用いることができる。

【0022】

化３および化４の化合物はそのマロニル基で塩を形成しうるが、本発明においては、これらの塩を用いてもよい。ここで、塩は、「薬理学的に許容される塩」を含み、広義に解釈される。例えば、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等、各種の塩であってよい。金属塩の例としてはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩が挙げられる。アンモニウム塩の例としてはアンモニウム、テトラメチルアンモニウムなどの塩が挙げられる。有機アミン付加塩の例としてはモルホリン付加塩、ピペリジン付加塩が挙げられる。アミノ酸付加塩の例としてはグリシン付加塩、フェニルアラニン付加塩、リジン付加塩、アスパラギン酸付加塩、グルタミン酸付加塩が挙げられる。

【0023】

本化合物は、合成品を用いてもよく、市販の試薬を用いてもよい。または、本化合物を含む動植物等の天然物から抽出、精製等して用いることもでき、本化合物を化学的に合成して用いることもできる。

【0024】

本化合物は、キンセンカ属に多く含まれる。よって、キンセンカ属から抽出することにより、本化合物を効率的に得ることができる。キンセンカ属からの本化合物の抽出は、例えば、抽出溶媒にキンセンカ属の植物体を浸漬することにより行うことができる。具体的には、以下の方法を例示することができる。
≪キンセンカ属の植物体≫
キンセンカ属の植物体は、葉、茎、花、根あるいはこれらを含む全部（全草）など、いずれの部位を用いてもよいが、葉部を含むことが好ましい。また、生育地から採集したものをそのまま用いてもよく、乾燥させてから用いてもよい。また、葉、茎、花、根などの形態のものをそのまま用いてもよく、破片状や粉末状に砕いてから用いてもよい。
≪抽出溶媒≫
キンセンカ属から本化合物を抽出することができれば特に制限はなく、製品の最終用途に応じて適宜設定できる。例えば、溶媒は、水や低級アルコール類（エタノール、プロパノールなど）、グリコール類（グリセリン、１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、１，３－プロパンジオールなど）、これらの混液などの極性溶媒を例示することができる。
≪抽出条件≫
抽出溶媒に植物体を浸漬し、温度１～３０℃あるいは室温で、２～２４時間、静置または攪拌しながら置いておく。

【0025】

上記のように抽出操作を行った後の溶媒には、本化合物が含まれるため、これをそのまま用いてもよく、必要に応じて精製や濃縮あるいは希釈、殺菌などを行ってから用いてもよい。精製は、濾過や遠心分離による植物体残渣の除去や、液体クロマトグラフィーによる分画精製などを行うことができる。また、スプレードライや凍結乾燥などの方法により固体化してから用いてもよい。

【0026】

また、化学合成による場合、例えば、化４は、非特許文献２（Riva, S., Danieli, B., Luisetti, M., A two step efficient chemoenzymic synthesis of flavonoid glycoside malonates, J. Nat. Prod, 59, 618-621 (1996)）に記載の方法で得ることができる。すなわち、当該方法によれば、まず、Candida antarctica由来のリパーゼの触媒下でイソクェルシトリンとマロン酸ジベンジルとを反応させて、イソクェルシトリンのグルコース残基をアシル化する。次に、パラジウム炭素触媒を用いた水素化還元反応を行ってベンジル基を外す。続いて、濾過により触媒を除去し、溶媒を減圧留去すれば、化４を得ることができる。

【0027】

また、非特許文献３（Danieli, B., Bertario, A., Carrea, G., Redigolo, B., Secundo, F., Riva, S., Helv. Chim. Acta, 1993, 73, 2981-2991）に記載の方法により化４を得ることもできる。当該方法によれば、まず、タンパク分解酵素サブチリシンの触媒下でイソクェルシトリンと２－クロロエチルメチルマロン酸とを反応させて、イソクェルシトリンのグルコース残基の最初のヒドロキシ基にメチルマロン酸残基を導入する。次に、エステラーゼ触媒による酵素反応を行ってメトキシカルボニル基を選択的に加水分解する。続いて、逆相ＨＰＬＣにより精製すれば、高純度の化４を得ることができる。

【0028】

本発明において、抗酸化剤は、任意の形態ないし任意の用途で用いることができる。例えば、生体内で抗酸化活性を発揮させる目的で用いることができ、そのような場合には、経口摂取で用いられる医薬品や医薬部外品、健康食品、食品、飲料、飼料の形態、またはこれらに配合して使用される原料ないし添加物とすることができる。また、例えば、皮膚において抗酸化活性を発揮させる目的で用いることができ、そのような場合には、経皮的に用いられる医薬品や医薬部外品（湿布や軟膏など）、化粧品（パックや化粧水、乳液、ジェル、クリーム、リップクリームなど）の形態、またはこれらに配合して使用される原料ないし添加物とすることができる。また、例えば、製品（医薬品や医薬部外品、健康食品、食品、飲料、飼料、化粧品、合成樹脂、洗浄剤など）内において抗酸化活性を発揮させ、当該製品の品質劣化を抑制する目的で用いることができ、そのような場合には、当該製品に配合される原料ないし添加物の形態とすることができる。いずれの形態であっても、本発明の有効成分を配合した上で、常法により製造することができる。製品における有効成分の配合量または生体への投与量も、当該製品の用途や安全性、他の原材料などに応じて適宜設定することができる。

【0029】

以下、本発明について、各実施例に基づいて説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。本実施例において、単位に用いられるＭはmol/Lを表す。

【実施例0030】

＜実施例１＞化合物の同定
（１）トウキンセンカ葉エタノール抽出物の調製
北海道白老町にて採集したトウキンセンカの全草を風通しのよい室内に７２時間置くことにより、または、４５℃の乾燥機に２８～３２時間置くことにより、乾燥させた後に保存した。この乾燥物から葉部を分別回収し、ミキサーを用いて粉末状にした。得られた葉の乾燥粉末２０ｇに７０％（ｖ／ｖ）エタノール２００ｍＬを加え、スターラーを用いて５００回転／分（ｒｐｍ）、室温にて２４時間攪拌し、抽出液を得た。抽出液を吸引濾過して濾液を回収し、エバポレーターを用いて減圧濃縮し、濃縮液を得た。続いて、濃縮液を２４時間凍結乾燥し、固体状のトウキンセンカ葉エタノール抽出物５．２ｇを得た。

【0031】

（２）化合物の単離および同定
トウキンセンカ葉エタノール抽出物５．２ｇを超純水（MilliQ水）に溶解させて全量を１５０ｍＬとした。酢酸エチル３２５ｍＬを添加し、水層と酢酸エチル層とに分画した。水層２．１６ｇを下記条件の中圧分取液体クロマトグラフに供した。保持時間６０分の第１画分、同８８分の第２画分、同９５分の第３画分および同１０６分の第４画分を分取して、乾燥させ、重量を測定した。
《中圧分取液体クロマトグラフの条件》
カラム：YAMAZEN ULTRAPAK ODS-SM-50D (50μm,φ50×300mm)
溶媒：(A)H₂O(0.1%(v/v) TFA) (B)アセトニトリル(MeCN)(0.1%(v/v) TFA)
勾配：(B)10%(v/v)(15分)→(B)40%(v/v)(150分）→(B)100%(155分）
流速：45mL／分
検出：吸光光度検出器（280nm）

【0032】

［２－１］第１画分の化合物の単離・同定
第１画分（保持時間６０分、乾燥重量１４２．５ｍｇ）を下記条件の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、保持時間１６分の画分を分取した。続いて、当該画分を乾燥させることにより、化合物３０．９ｍｇ（乾燥重量）を単離した。
《ＨＰＬＣの条件》
カラム：SHISEIDO CAPCELLPAK UG120 (5μm,φ20×250mm)
溶媒：H₂O : MeCN = 88 : 12 (v:v)(0.1%(v/v) TFA)
流速：9.6 mL／分
検出：吸光光度検出器（280nm）

【0033】

核磁気共鳴（Nuclear Magnetic Resonance：NMR）装置および液体クロマトグラフィー質量分析計（LC-MS）を用いて当該化合物の構造解析を行った結果、化１に示すクロロゲン酸（chrologenic acid）であることが明らかになった。ＮＭＲおよびＬＣ－ＭＳのデータを以下に示す。

【化1】

【0034】

＜化１のＮＭＲおよびＬＣ－ＭＳデータ＞
¹H NMR: 400 MHz, ¹³C NMR:100MHz (測定溶媒CD₃OD)
¹H NMR: δ(ppm) 2.07 [m, 2H, 2.02 - 2.10], 2.20 [m, 2H, 2.16 - 2.26], 3.73 [dd, 1H, J = 8.5, 3.2 Hz], 4.17 [s, 1H], 5.33[m, 1H, 5.31 - 5.36], 6.26 [d, 1H, J = 15.9 Hz], 6.78[d, 1H, J = 8.2 Hz], 6.95 [dd, 1H, J = 8.2, 2.0 Hz], 7.05 [d, 1H, J = 2.0 Hz], 7.56 [d, 1H, J = 15.9 Hz];
¹³C NMR: δ(ppm) 38.2 [CH₂], 38.78 [CH₂], 71.30 [CH], 71.95 [CH], 73.49 [CH], 76.14 [C], 115.21 [CH], 115.26 [CH], 116.48 [CH], 122.97 [CH], 127.80 [C], 146.77 [CH], 147.08 [CH], 149.54 [CH], 168.68 [C], 177.00 [C].
HR-ESIMS : m/z = 353.0876([M-H]^-)

【0035】

［２－２］第２画分の化合物の単離・同定
第２画分（保持時間８８分、乾燥重量４１．６ｍｇ）を下記条件のＨＰＬＣに供し、保持時間１５．５分の画分を分取した。続いて、当該画分を乾燥させることにより、化合物１．８ｍｇ（乾燥重量）を単離した。
《ＨＰＬＣの条件》
カラム：SHISEIDO CAPCELLPAK UG120 (5μm,φ20×250mm)
溶媒：H₂O : MeCN = 82 : 18 (v:v)(0.1%(v/v) TFA)
流速：9.6 mL／分
検出：吸光光度検出器（280nm）

【0036】

ＮＭＲ装置およびＬＣ－ＭＳを用いて当該化合物の構造解析を行った結果、化２に示すケルセチン３－Ｏ－ネオヘスペリジン（quercetin 3-O-neohesperidin）であることが明らかになった。ＮＭＲおよびＬＣ－ＭＳのデータを以下に示す。

【化2】

【0037】

＜化２のＮＭＲおよびＬＣ－ＭＳデータ＞
¹H NMR: 400 MHz, ¹³C NMR:100MHz (測定溶媒CD₃OD)
¹H NMR: δ(ppm) 0.97 [d, 3H, J = 6.2 Hz], 3.23 [m, 1H], 3.35 [m, 2H, 3.34 - 3.36], 3.55 [m, 2H, 3.52 - 3.58], 3.66 [dd, 1H, J = 7.6, 1.4 Hz], 3.76[m, 2H, 3.72 - 3.77], 4.02[m, 2H 3.99 - 4.06], 5.23 [d, 1H, J = 1.4 Hz], 5.75 [d, 1H, J = 7.6 Hz], 6.18 [d, 1H, J = 2.2 Hz], 6.37 [d, 1H, J = 2.1 Hz], 6.87[d, 1H, J = 7.8 Hz], 7.61[m, 2H, 7.60 - 7.63];
¹³C NMR: δ(ppm) 17.46 [CH₃], 62.57 [CH₂], 69.96 [CH], 71.71 [CH], 72.31 [CH], 72.41 [CH], 74.06 [CH], 78.35 [CH], 78.96 [CH], 80.11 [CH], 94.48 [CH], 99.65 [CH], 100.33[CH], 102.65 [CH], 105.97 [C], 115.98 [CH], 117.19 [CH], 123.22 [C], 123.48 [CH], 134.57 [C], 146.01 [C], 149.56 [C], 158.39 [C], 158.42 [C], 163.22 [C], 165.63 [C], 179.37 [C].
HR-ESIMS: m/z = 609.1462([M-H]^-)

【0038】

［２－３］第３画分の化合物の単離・同定
第３画分（保持時間９５分、乾燥重量５８．９ｍｇ）を下記条件のＨＰＬＣに供し、保持時間１４．３分の画分を分取した。続いて、当該画分を乾燥させることにより、化合物２１．９ｍｇ（乾燥重量）を単離した。
《ＨＰＬＣの条件》
カラム：SHISEIDO CAPCELLPAK UG120 (5μm,φ20×250mm)
溶媒：H₂O : MeCN = 80 : 20 (v:v)(0.1%(v/v) TFA)
流速：9.6 mL／分
検出：吸光光度検出器（280nm）

【0039】

ＮＭＲ装置およびＬＣ－ＭＳを用いて当該化合物の構造解析を行った結果、化３に示すケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシドであることが明らかになった。ＮＭＲおよびＬＣ－ＭＳのデータを以下に示す。

【化3】

【0040】

＜化３のＮＭＲおよびＬＣ－ＭＳデータ＞
¹H NMR: 400 MHz, ¹³C NMR:100MHz (測定溶媒CD₃OD)
¹H NMR: δ(ppm) 1.02 [d, 3H, J = 6.2 Hz], 3.14 [s, 2H], 3.35 [m, 3H, 3.31 - 3.39], 3.56 [t, 1H, J = 11.1 Hz], 3.66 [dd, 1H, J = 7.7, 1.4 Hz], 3.80[dd, 1H, J = 9.5, 3.5 Hz], 4.01[m, 1H], 4.11 [m, 2H, 4.06 - 4.16], 4.28 [dd, 2H, J = 1.8, 11.8 Hz], 5.23 [d, 1H, J = 1.4 Hz], 5.59 [d, 1H, J = 7.6 Hz], 6.18[d, 1H, J = 2.1 Hz], 6.37 [d, 1H, J = 2.1 Hz], 6.87 [d, 1H, J = 9.0 Hz], 7.57[m, 2H, 7.56 - 7.59];
¹³C NMR: δ(ppm) 17.51 [CH₃], 41.60 [CH₂], 64.57 [CH₂], 69.97 [CH], 71.36 [CH], 72.29 [CH], 72.38 [CH], 74.04 [CH], 75.27 [CH], 78.66 [CH], 79.95 [CH], 94.61 [CH], 99.71 [CH], 100.38 [CH], 102.66 [CH], 105.86 [C], 115.91 [CH], 117.28 [CH], 123.29 [C], 123.53 [CH], 134.37 [C], 145.92 [C], 149.46 [C], 158.37 [C], 159.02 [C], 163.13 [C], 165.64 [C], 168.31 [C], 170.15 [C], 179.21 [C].
HR-ESIMS: m/z = 695.1469([M-H]^-)

【0041】

［２－４］第４画分の化合物の単離・同定
第４画分（保持時間１０６分、乾燥重量７０．２ｍｇ）を下記条件のＨＰＬＣに供し、保持時間１８．６分の画分を分取した。続いて、当該画分を乾燥させることにより、化合物２８．３ｍｇ（乾燥重量）を単離した。
《ＨＰＬＣの条件》
カラム：SHISEIDO CAPCELLPAK UG120 (5μm,φ20×250mm)
溶媒：H₂O : MeCN = 80 : 20 (v:v)(0.1%(v/v) TFA)
流速：9.6 mL／分
検出：吸光光度検出器（280nm）

【0042】

ＮＭＲ装置およびＬＣ－ＭＳを用いて当該化合物の構造解析を行った結果、化４に示すケルセチン３－Ｏ－（６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシドであることが明らかになった。ＮＭＲおよびＬＣ－ＭＳのデータを以下に示す。

【化4】

【0043】

＜化４のＮＭＲおよびＬＣ－ＭＳデータ＞
¹H NMR: 400 MHz, ¹³C NMR:100MHz (測定溶媒CD₃OD)
¹H NMR: δ(ppm) 3.21 [d, 2H, J = 1.0 Hz], 3.45 [m, 3H, 3.37 - 3.52], 4.12 [dd, 1H, J = 5.2, 12.0 Hz], 4.26[dd, 1H, J = 1.9, 12.0 Hz], 5.12 [d, 1H, J = 7.6 Hz], 6.21[d, 1H, J = 2.1 Hz], 6.40 [d, 1H, J = 2.1 Hz], 6.85 [d, 1H, J = 8.5 Hz], 7.58[dd, 1H, J = 2.2, 8.5 Hz], 7.62[d, 1H, J = 2.2 Hz];
¹³C NMR: δ(ppm) 41.68 [CH₂], 64.95 [CH₂], 71.11 [CH], 75.46 [CH], 75.57 [CH], 77.88 [CH], 94.82 [CH], 99.94 [CH], 104.53 [CH], 105.62 [C], 115.92 [CH], 117.52 [CH], 123.10 [C], 123.38 [CH], 135.45 [C], 145.86 [C], 149.78 [C], 158.48 [C], 159.53 [C], 163.01 [C], 166.04 [C], 168.42 [C], 170.25 [C], 179.43 [C].
HR-ESIMS: m/z = 549.0889([M-H]^-)

【0044】

＜実施例２＞化合物の定量
（１）トウキンセンカ葉エタノール抽出物の調製
実施例１（１）のトウキンセンカ葉部乾燥粉末１．０ｇに７０％（ｖ／ｖ）エタノール２０ｍＬを加え、攪拌子とスターラーとを用いて９００ｒｐｍ、室温にて２時間攪拌し、抽出液を得た。濾紙と漏斗を用いて抽出液を濾過して濾液を回収し、１００ｍＬナスフラスコへ移して、エバポレーターで減圧濃縮し、濃縮物を得た。濃縮物をメタノールに溶解させ、６ｍＬスクリュー管瓶に移してコンビニ・エバポ（バイオクロマト）で再度濃縮し、濃縮物を得た。濃縮物を１８時間凍結乾燥し、固体状のトウキンセンカ葉エタノール抽出物を得て、重量を測定した。同様の操作を３回行ったところ、抽出物の重量はそれぞれ１９５．２７ｍｇ、１８９．２９ｍｇおよび１７０．６７ｍｇであった。

【0045】

（２）検量線の作成
市販の試薬クロロゲン酸（化１）および実施例１（２）[２－２]～［２－４］で得られた化２～４の化合物を１．０ｍｇ／ｍＬとなるようメタノールに溶解した。さらにメタノールを用いて、化１は１００、２５０および１０００μｇ／ｍＬ、化２は２５、５０および１００μｇ／ｍＬ、化３および化４は１００、２５０および５００μｇ／ｍＬとなるよう希釈して、測定試料を調製した。これらの測定試料を下記条件のＨＰＬＣに供してクロマトグラムを得た。当該クロマトグラムにて検出されたピークの面積と試料の濃度とに基づいて、検量線を作成した。
《ＨＰＬＣの条件》
カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120 (5μm,φ4.6×250mm)
溶媒：(A)H₂O(0.1%(v:v) TFA) (B)MeCN(0.1%(v:v) TFA)
勾配：(B)0%(0分)→(B)30%(v:v)(40分）
流速：1.0mL／分
検出：吸光光度検出器（280nm）
注入量：10μL

【0046】

（３）化合物の定量
本実施例２（１）のトウキンセンカ葉エタノール抽出物を１０ｍｇ／ｍＬとなるようメタノールに溶解した後、孔径０．２２μｍのフィルターで濾過して測定試料とした。この測定試料を、本実施例２（２）に記載の条件のＨＰＬＣに供した。当該ＨＰＬＣにより得られたクロマトグラムを図１に示す。図１に示すクロマトグラムでは、保持時間９．４分、１９．６分、２２．５分および２５．４分のピークが、それぞれ、化１、化２、化３および化４に該当する。

【0047】

そこで、上記ピークの面積をそれぞれ算出し、本実施例２（２）の検量線を用いて化１～化４の濃度を決定した。決定した濃度に基づいて、トウキンセンカ葉部乾燥物あたり、および、トウキンセンカ葉エタノール抽出物あたりの化１～化４の含有量について、平均値および標準偏差を算出した。その結果を表１に示す。

【表1】

【0048】

表１に示すように、トウキンセンカ葉部には、クロロゲン酸（化１）、ケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシド（化３）およびケルセチン３－Ｏ－（６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシド（化４）が高い割合で含まれることが明らかになった。

【0049】

＜実施例３＞化合物の抗酸化能の評価
実施例１に記載の方法により製造した化１～化４の化合物の抗酸化能を、ＦＲＡＰ法、ＡＢＴＳ法およびＤＰＰＨ法により評価した。評価にあたっては、表２に示すａ～ｄの４つのサンプルを調製した。標準物質は6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid(トロロックス)を用いた。サンプルａ、ｂ、ｃおよびｄの吸光度をそれぞれＡａ、Ａｂ、ＡｃおよびＡｄで示す。

【表2】

【0050】

（１）ＦＲＡＰ（Ferric Reducing Antioxidant Power）法：鉄イオンに対する還元能
ＦＲＡＰ試薬は、０．３Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ３．６）：１０ｍＭの2,4,6-Tris(2-pyridyl)-1,3,5-triazine（TPTZ）水溶液：２０ｍＭのＦｅＣｌ_３水溶液＝１０：１：１で混合されたものを用いた。

【0051】

まず、トロロックスを５０％（ｖ／ｖ）エタノールに溶解することにより、濃度１２．５、２５、５０、１００および２００μＭのトロロックス溶液を調製した。９６穴プレートにトロロックス溶液（サンプルａ、ｂ）または５０％（ｖ／ｖ）エタノール（サンプルｃ、ｄ）を各３０μＬずつ分注した。続いて、この９６穴プレートに、３７℃で加温したＦＲＡＰ試薬（サンプルａ、ｃ）または０．３Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．６）（サンプルｂ、ｄ）を各１５０μＬずつ分注した。室温、暗所で５分間反応させた後、５９３ｎｍでの吸光度を測定した。続いて、下記の式１によりトロロックス吸光値を算出し、トロロックス溶液の濃度に対してプロットすることにより、検量線を作成した。
式１：トロロックス吸光値= (Ａａ－Ａｂ) －（Ａｃ－Ａｄ）

【0052】

実施例１に記載の方法により製造した化１～４を濃度１０ｍＭになるようにジメチルスルホキシドに溶解し、これをＤＭＳＯ溶液とした。５０％（ｖ／ｖ）エタノールを用いてＤＭＳＯ溶液を希釈することにより、化合物濃度が３０、６０および１２０μＭとなるよう調製し、これを化合物溶液とした。トロロックス溶液を化合物溶液に代えて同様の操作を行い、吸光度を測定した。続いて、下記の式２により化合物吸光値を算出し、検量線を用いて化１～４のトロロックス等価活性（トロロックス相当量）を算出した。同様の試験を３回行い、トロロックス相当量の平均値および標準偏差を算出した。その結果を表３および図２に示す。
式２：化合物吸光値= Ａａ－Ａｃ

【表3】

【0053】

表３および図２に示すように、ケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシド（化３）およびケルセチン３－Ｏ－（６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシド（化４）は、強い抗酸化能を有することで知られるクロロゲン酸よりもトロロックス相当量が顕著に大きかった。特に、ケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシド（化３）のトロロックス相当量は、クロロゲン酸と比較して１．４１倍、ケルセチン３－Ｏ－ネオヘスペリジン（化２）と比較して１．５倍、ケルセチン３－Ｏ－（６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシド（化４）と比較して１．２６倍であり、顕著に高い鉄イオン還元能を有することが明らかになった。

【0054】

（２）ＡＢＴＳ法：ＡＢＴＳラジカルに対する還元能
本実施例３（１）において顕著に高い鉄イオン還元能が示されたケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシド（化３）について、ＡＢＴＳラジカルの消去能を、広く知られた抗酸化物質であるクロロゲン酸（化１）と比較した。ＡＢＴＳ試薬は、７ｍＭの2,2'-azino-bis(3-ethy1benzothiazo1ine-6-su1fonic acid）(ＡＢＴＳ）水溶液と７．３５ｍＭのペルオキソ二硫酸カリウム水溶液とを２：１となるように混和し、常温暗所に１２～１６時間攪拌放置した後、溶液の７３５ｎｍにおける吸光度が０．７±０．０２となるように９９．５％（ｖ／ｖ）エタノールで希釈したものを用いた。

【0055】

まず、トロロックスを５０％（ｖ／ｖ）エタノールに溶解することにより、濃度３７．５、７５、１５０および３００μＭのトロロックス溶液を調製した。９６穴プレートにトロロックス溶液（サンプルａ、ｂ）または５０％（ｖ／ｖ）エタノール（サンプルｃ、ｄ）を各３０μＬずつ分注した。続いて、この９６穴プレートに、ＡＢＴＳ試薬（サンプルａ、ｃ）または超純水（MilliQ水）（サンプルｂ、ｄ）を各１５０μＬずつ分注した。室温、暗所で５分間反応させた後、７３５ｎｍでの吸光度を測定した。続いて、下記の式３によりトロロックス吸光値を算出し、トロロックス溶液の濃度に対してプロットすることにより、検量線を作成した。
式３：トロロックス吸光値= (Ａｃ－Ａｄ) －（Ａａ－Ａｂ）

【0056】

実施例１に記載の方法により製造した化１および化３を濃度１０ｍＭになるようにジメチルスルホキシドに溶解し、これをＤＭＳＯ溶液とした。５０％（ｖ／ｖ）エタノールを用いてＤＭＳＯ溶液を希釈することにより、化合物濃度が３７．５、７５、１５０および３００μＭとなるよう調製し、これを化合物溶液とした。トロロックス溶液を化合物溶液に代えて同様の操作を行い、吸光度を測定した。続いて、下記の式４により化合物吸光値を算出し、検量線を用いて化１および化３のトロロックス相当量を算出した。同様の試験を３回行い、トロロックス相当量の平均値および標準偏差を算出した。その結果を表４および図３に示す。
式４：化合物吸光値= Ａｃ－Ａａ

【表4】

【0057】

表４および図３に示すように、ケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシド（化３）のトロロックス相当量は、クロロゲン酸（化１）と比較して顕著に大きかった。すなわち、ケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシド（化３）は、顕著に高いＡＢＴＳラジカルの消去能を有することが明らかになった。

【0058】

（３）ＤＰＰＨ法：ＤＰＰＨラジカルに対する還元能
本実施例３（１）において顕著に高い鉄イオン還元能が示されたケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシド（化３）について、ＤＰＰＨラジカルの消去能を、広く知られた抗酸化物質であるクロロゲン酸（化１）と比較した。ＤＰＰＨ試薬は、2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl（ＤＰＰＨ）を９９．５％（ｖ／ｖ）エタノールに０．２０ｍＭとなるよう溶解した後、使用時まで４℃の暗所に保管したものを用いた。

【0059】

まず、トロロックスを５０％（ｖ／ｖ）エタノールに溶解することにより、濃度１２．５、２５、５０および１００μＭのトロロックス溶液を調製した。９６穴プレートにトロロックス溶液（サンプルａ、ｂ）または５０％（ｖ／ｖ）エタノール（サンプルｃ、ｄ）を各１００μＬずつ分注した。続いて、この９６穴プレートに、ＤＰＰＨ試薬（サンプルａ、ｃ）または９９．５％（ｖ／ｖ）エタノール（サンプルｂ、ｄ）を各１００μＬずつ分注した。室温、暗所で３０分間反応させた後、５１７ｎｍでの吸光度を測定した。続いて、上記の式３によりトロロックス吸光値を算出し、トロロックス溶液の濃度に対してプロットすることにより、検量線を作成した。

【0060】

実施例１に記載の方法により製造した化１および化３を濃度１０ｍＭになるようにジメチルスルホキシドに溶解し、これをＤＭＳＯ溶液とした。５０％（ｖ／ｖ）エタノールを用いてＤＭＳＯ溶液を希釈することにより、化合物濃度が１２．５、２５、５０および１００μＭとなるよう調製し、これを化合物溶液とした。トロロックス溶液を化合物溶液に代えて同様の操作を行い、吸光度を測定した。続いて、上記の式４により化合物吸光値を算出し、検量線を用いて化１および化３のトロロックス相当量を算出した。同様の試験を３回行い、トロロックス相当量の平均値および標準偏差を算出した。その結果を表５および図４に示す。

【表5】

【0061】

表５および図４に示すように、ケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシド（化３）のトロロックス相当量は、クロロゲン酸（化１）と比較して顕著に大きかった。すなわち、ケルセチン３－Ｏ－（２″－Ｏ－α－ラムノシル－６″－Ｏ－マロニル）－β－Ｄ－グルコシド（化３）は、顕著に高いＤＰＰＨラジカルの消去能を有することが明らかになった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】