(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2022053282
(43)【公開日】2022-04-05
(54)【発明の名称】シアニン系色素、標識試薬および検出方法
(51)【国際特許分類】
C09B 23/08 20060101AFI20220329BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20220329BHJP
G01N 21/78 20060101ALI20220329BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20220329BHJP
【ＦＩ】
C09B23/08 CSP
G01N33/543 595
G01N21/78 C
G01N21/64 G
【審査請求】未請求
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2020160036
(22)【出願日】2020-09-24
(71)【出願人】
【識別番号】000206956
【氏名又は名称】大塚製薬株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】397077760
【氏名又は名称】株式会社林原
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(72)【発明者】
【氏名】乾 智惠
(72)【発明者】
【氏名】彼谷 高敏
(72)【発明者】
【氏名】小島 駿
(72)【発明者】
【氏名】村松 新一
(72)【発明者】
【氏名】草野 創
(72)【発明者】
【氏名】矢野 賢太郎
(72)【発明者】
【氏名】永池 宏
(72)【発明者】
【氏名】有安 利夫
【テーマコード（参考）】
2G043
2G054
【Ｆターム（参考）】
2G043AA01
2G043BA14
2G043BA16
2G043CA04
2G043EA01
2G043GA02
2G043GB03
2G043HA15
2G043KA02
2G043KA09
2G043LA02
2G043NA13
2G054AA07
2G054AB04
2G054CA23
2G054EA03
2G054FA12
2G054GA03
2G054GA05
2G054GB02
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ＳＰＦＳを利用した検出方法における標識に好適で、消光が少なく、十分な検出感度が得られるシアニン系色素を提供する。
【解決手段】シアニン系色素は、式（１）で表され、吸収極大波長が６５０ｎｍ以上であり、かつ蛍光極大波長が６７０ｎｍ以上である。
（式（１）において、環Ｚ１および環Ｚ２は、それぞれ単環芳香族炭化水素または縮合多環芳香族炭化水素であり、かつ環Ｚ２の炭素原子数は、環Ｚ１の炭素原子数よりも多く、Ｒ１～Ｒ６、１以上のＲ７および１以上のＲ８のうち少なくとも４つは、親水性基または親水性基を含有する基であり（但し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、アルキルスルホン酸基ではない）、ｌおよびｍは、それぞれ１以上の整数であり、ｎは、１～３の整数である）
【選択図】なし
【解決手段】シアニン系色素は、式（１）で表され、吸収極大波長が６５０ｎｍ以上であり、かつ蛍光極大波長が６７０ｎｍ以上である。
（式（１）において、環Ｚ１および環Ｚ２は、それぞれ単環芳香族炭化水素または縮合多環芳香族炭化水素であり、かつ環Ｚ２の炭素原子数は、環Ｚ１の炭素原子数よりも多く、Ｒ１～Ｒ６、１以上のＲ７および１以上のＲ８のうち少なくとも４つは、親水性基または親水性基を含有する基であり（但し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、アルキルスルホン酸基ではない）、ｌおよびｍは、それぞれ１以上の整数であり、ｎは、１～３の整数である）
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記式（１）で表されるシアニン系色素であって、
吸収極大波長が６５０ｎｍ以上であり、かつ蛍光極大波長が６７０ｎｍ以上である、
シアニン系色素。
（式（１）において、
環Ｚ１および環Ｚ２は、それぞれ単環芳香族炭化水素または縮合多環芳香族炭化水素であり、かつ環Ｚ２の炭素原子数は、環Ｚ１の炭素原子数よりも多く、
Ｒ１～Ｒ６、１以上のＲ７および１以上のＲ８のうち少なくとも４つは、親水性基または親水性基を含有する基であり（ただし、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、アルキルスルホン酸基ではないものとする）、それ以外は、親水性基を含有しない基であり、
ｌおよびｍは、それぞれ１以上の整数であり、
ｎは、１～３の整数であり、
複数のＲ７および複数のＲ８は、それぞれ互いに同一であってもよいし、異なってもよい）
吸収極大波長が６５０ｎｍ以上であり、かつ蛍光極大波長が６７０ｎｍ以上である、
シアニン系色素。
【化1】
環Ｚ１および環Ｚ２は、それぞれ単環芳香族炭化水素または縮合多環芳香族炭化水素であり、かつ環Ｚ２の炭素原子数は、環Ｚ１の炭素原子数よりも多く、
Ｒ１～Ｒ６、１以上のＲ７および１以上のＲ８のうち少なくとも４つは、親水性基または親水性基を含有する基であり（ただし、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、アルキルスルホン酸基ではないものとする）、それ以外は、親水性基を含有しない基であり、
ｌおよびｍは、それぞれ１以上の整数であり、
ｎは、１～３の整数であり、
複数のＲ７および複数のＲ８は、それぞれ互いに同一であってもよいし、異なってもよい）
【請求項2】
前記親水性基は、酸性基である、
請求項１に記載のシアニン系色素。
請求項１に記載のシアニン系色素。
【請求項3】
前記酸性基は、カルボキシル基、スルホン酸基および硫酸エステル基からなる群より選ばれる、
請求項２に記載のシアニン系色素。
請求項２に記載のシアニン系色素。
【請求項4】
前記酸性基は、スルホン酸基である、
請求項３に記載のシアニン系色素。
請求項３に記載のシアニン系色素。
【請求項5】
Ｒ１～Ｒ６のうち少なくとも１つは、－（ＣＨ２）ｊ－Ｌ－Ｘまたは－（ＲＯ）ｊ－Ｌ－Ｘである（Ｘは、被検出物質もしくは被検出物質に特異的に結合できる結合物質と結合する官能基であり、ｊは、それぞれ１～１０の整数であり、Ｒは、アルキレン基であり、Ｌは、連結基である）、
請求項１～４のいずれか一項に記載のシアニン系色素。
請求項１～４のいずれか一項に記載のシアニン系色素。
【請求項6】
ｊは、それぞれ３～６の整数である、
請求項５に記載のシアニン系色素。
請求項５に記載のシアニン系色素。
【請求項7】
Ｘは、スクシンイミジルエステル基、スルホスクシンイミジルエステル基、マレイミド基または４－スルホテトラフルオロフェニルエステル基である、
請求項５または６に記載のシアニン系色素。
請求項５または６に記載のシアニン系色素。
【請求項8】
Ｒ１～Ｒ６のうち少なくとも他の１つは、－（ＣＨ２）ｋ－Ｗ（ｋは、１～１０の整数であり、Ｗは、酸性基である）であり、
Ｒ１～Ｒ６のうち残りは、親水性基を含有しないアルキル基である、
請求項５～７のいずれか一項に記載のシアニン系色素。
Ｒ１～Ｒ６のうち残りは、親水性基を含有しないアルキル基である、
請求項５～７のいずれか一項に記載のシアニン系色素。
【請求項9】
Ｒ７およびＲ８は、それぞれ親水性基または－（ＣＨ２）ｋ－Ｗ（ｋは、１～１０の整数であり、Ｗは、酸性基である）である、
請求項５～７のいずれか一項に記載のシアニン系色素。
請求項５～７のいずれか一項に記載のシアニン系色素。
【請求項10】
前記シアニン系色素は、式（２Ａ）で表される、
請求項１～９のいずれか一項に記載のシアニン系色素。
（式（２Ａ）において、
Ａ１～Ａ４のうち１以上は、式（１）のＲ７であり、
Ａ５～Ａ１０のうち１以上は、式（１）のＲ８であり、
Ａ１～Ａ４およびＡ５～Ａ１０のうち上記以外の残りは、水素原子である）
請求項１～９のいずれか一項に記載のシアニン系色素。
【化2】
Ａ１～Ａ４のうち１以上は、式（１）のＲ７であり、
Ａ５～Ａ１０のうち１以上は、式（１）のＲ８であり、
Ａ１～Ａ４およびＡ５～Ａ１０のうち上記以外の残りは、水素原子である）
【請求項11】
Ａ２、Ａ８およびＡ１０は、スルホン酸基であり、
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｋ－Ｗ（ｋは、１～１０の整数であり、Ｗは、スルホン酸基である）である、
請求項１０に記載のシアニン系色素。
Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｋ－Ｗ（ｋは、１～１０の整数であり、Ｗは、スルホン酸基である）である、
請求項１０に記載のシアニン系色素。
【請求項12】
前記シアニン系色素は、フッ素原子を含まない、
請求項１～１１のいずれか一項に記載のシアニン系色素。
請求項１～１１のいずれか一項に記載のシアニン系色素。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のシアニン系色素と、
前記シアニン系色素で標識された、被検出物質と特異的に結合する結合物質と、
を有する、
標識試薬。
前記シアニン系色素で標識された、被検出物質と特異的に結合する結合物質と、
を有する、
標識試薬。
【請求項14】
検体に含まれる被検出物質の検出方法であって、
前記被検出物質を、請求項１３に記載の標識試薬と結合させる工程と、
前記被検出物質と結合した前記標識試薬におけるシアニン系色素を励起させた際に発せられる蛍光を検出する工程とを有する、
検出方法。
前記被検出物質を、請求項１３に記載の標識試薬と結合させる工程と、
前記被検出物質と結合した前記標識試薬におけるシアニン系色素を励起させた際に発せられる蛍光を検出する工程とを有する、
検出方法。
【請求項15】
前記蛍光の検出は、表面プラズモン共鳴励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）により行う、
請求項１４に記載の検出方法。
請求項１４に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、シアニン系色素、標識試薬および検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
シアニン系色素は、タンパク質、核酸、ホルモンおよび薬物などの生物学的に重要な分子の蛍光標識用の試薬として広範に使用されている。
【0003】
蛍光標識に用いられるシアニン系色素としては、例えばフルオロ置換基を有するシアニン系色素や（例えば特許文献１参照）、インドレン環の３位にアルキレンスルホン酸基を有するシアニン系色素（例えば特許文献２参照）が知られている。
【0004】
ところで、色素を蛍光標識として用いた検出方法には、種々のものがある。中でも、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に測定する方法として、表面プラズモン共鳴励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon field-enhanced Fluorescence Spectroscopy：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）が知られている。これらの方法では、所定の条件で光を金属膜に照射すると表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が生じることを利用するものである。
【0005】
たとえば、ＳＰＦＳでは、被検出物質に特異的に結合できる結合物質（例えば１次抗体）を金属膜上に固定化して、被検出物質を特異的に捕捉するための反応場を形成する。この反応場に被検出物質を含む検体（例えば血液）を提供すると、被検出物質は反応場に補足される。次いで、蛍光物質で標識された結合物質（例えば２次抗体）を反応場に提供すると、反応場に補足された被検出物質は間接的に蛍光物質で標識される。この状態で金属膜に励起光を照射すると、被検出物質を標識する蛍光物質は、ＳＰＲにより増強された電場により励起され、蛍光を放出する。したがって、蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出することが可能となる。ＳＰＦＳでは、ＳＰＲにより増強された電場により蛍光物質を励起するため、高感度に被検出物質を検出することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特表２００８－５３８３８２号公報
【特許文献2】特表２００７－５１００３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかしながら、ＳＰＦＳを利用した検出方法において、特許文献１および２のシアニン系色素を標識試薬として使用しても、色素間の相互作用や色素と抗体（被検出物質と特異的に結合する結合物質）との間の相互作用により、色素間または色素と抗体との間でエネルギー遷移が生じ、消光しやすいという課題があった。
【0008】
また、色素で抗体を標識する際に、色素が、抗体の抗原認識部位に近づくか、もしくは結合すると、抗体の機能が阻害されやすく、十分な検出感度が得られにくい。そのため、抗体の機能を阻害することなく、色素で標識できることが望まれる。
【0009】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ＳＰＦＳを利用した検出方法における標識に好適なシアニン系色素であって、消光が少なく、十分な検出感度が得られるシアニン系色素および検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、下記のシアニン系色素、標識試薬および検出方法に関する。
【0011】
本発明のシアニン系色素は、下記式（１）で表されるシアニン系色素であって、吸収極大波長が６５０ｎｍ以上であり、かつ蛍光極大波長が６７０ｎｍ以上である。
（式（１）において、
環Ｚ１および環Ｚ２は、それぞれ単環芳香族炭化水素または縮合多環芳香族炭化水素であり、かつ環Ｚ２の炭素原子数は、環Ｚ１の炭素原子数よりも多く、
Ｒ１～Ｒ６、１以上のＲ７および１以上のＲ８のうち少なくとも４つは、親水性基または親水性基を含有する基であり（ただし、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、アルキルスルホン酸基ではないものとする）、それ以外は、親水性基を含有しない基であり、
ｌおよびｍは、それぞれ１以上の整数であり、
ｎは、１～３の整数であり、
複数のＲ７および複数のＲ８は、それぞれ互いに同一であってもよいし、異なってもよい）
【化1】
環Ｚ１および環Ｚ２は、それぞれ単環芳香族炭化水素または縮合多環芳香族炭化水素であり、かつ環Ｚ２の炭素原子数は、環Ｚ１の炭素原子数よりも多く、
Ｒ１～Ｒ６、１以上のＲ７および１以上のＲ８のうち少なくとも４つは、親水性基または親水性基を含有する基であり（ただし、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、アルキルスルホン酸基ではないものとする）、それ以外は、親水性基を含有しない基であり、
ｌおよびｍは、それぞれ１以上の整数であり、
ｎは、１～３の整数であり、
複数のＲ７および複数のＲ８は、それぞれ互いに同一であってもよいし、異なってもよい）
【0012】
本発明の標識試薬は、本発明のシアニン系色素と、前記シアニン系色素で標識された、被検出物質と特異的に結合する結合物質と、を有する。
【0013】
本発明の検出方法は、検体に含まれる被検出物質の検出方法であって、前記被検出物質を本発明の標識試薬と結合させる工程と、前記被検出物質と結合した本発明の標識試薬におけるシアニン系色素を励起させた際に発せられる蛍光を検出する工程とを有する。
【発明の効果】
【0014】
本発明によれば、ＳＰＦＳを利用した検出方法における標識に好適なシアニン系色素であって、消光が少なく、十分な検出感度が得られるシアニン系色素および検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明者らは、シアニン系色素の骨格を「非対称」にすることで、ＳＰＦＳで用いられる励起光源で効率良く励起され得ることを見出した。また、本発明者らは、シアニン系色素に、親水性基を多く導入することで、水系媒体中での色素の分散性を高めて、色素の凝集を抑制しうること、および、（親水性を示す）色素が（疎水性を示す）抗体の抗原認識部位に近づくことによる抗体の機能阻害を抑制しうることを見出した。
【0017】
すなわち、非対称な骨格を有し、かつ親水性基を多く含むシアニン系色素は、色素同士の凝集に起因する消光を抑制するとともに、抗体の機能阻害に起因する検出感度の低下を抑制することができる。以下、本発明の構成について、具体的に説明する。
【0018】
１．シアニン系色素
本発明のシアニン系色素は、ＳＰＦＳで用いられる励起光の波長の範囲に吸収極大を有することが好ましい。具体的には、シアニン系色素の吸収極大波長は、６５０ｎｍ以上であることが好ましく、６５０～６７０ｎｍであることがより好ましい。
本発明のシアニン系色素は、ＳＰＦＳで用いられる励起光の波長の範囲に吸収極大を有することが好ましい。具体的には、シアニン系色素の吸収極大波長は、６５０ｎｍ以上であることが好ましく、６５０～６７０ｎｍであることがより好ましい。
【0019】
また、シアニン系色素の蛍光極大波長は、６７０ｎｍ以上であることが好ましく、６７０～６９０ｎｍであることがより好ましい。
【0020】
シアニン系色素の吸収極大波長および蛍光極大波長は、ＪＩＳＫ０１１５:２００４、ＪＩＳＫ０１２０:２００５に準拠して、それぞれ分光光度計および蛍光分光光度計により測定することができる。
【0021】
シアニン系色素の吸収極大波長および蛍光極大波長は、主に、シアニン系色素の主骨格によって調整されうる。吸収極大波長および蛍光極大波長を上記範囲にする観点では、シアニン系色素の主骨格は、非対称な構造を有することが好ましい。
【0022】
具体的には、シアニン系色素は、下記式（１）で表される。
【化2】
【0023】
式（１）において、環Ｚ１と環Ｚ２は、それぞれ単環芳香族炭化水素または縮合多環芳香族炭化水素である。ただし、環Ｚ２の炭素原子数は、環Ｚ１の炭素原子数よりも多い。
【0024】
単環芳香族炭化水素の例には、ベンゼン環が含まれる。縮合多環芳香族炭化水素の例には、ナフタレン（Ｃ１０）が含まれる。縮合多環芳香族炭化水素の炭素原子数が上記程度であると、疎水性部分が増えすぎないため、疎水性相互作用による凝集を生じにくい。
【0025】
式（１）において、Ｒ１～Ｒ６、１以上のＲ７および１以上のＲ８のうち少なくとも４つ、好ましくは４または５つは、親水性基または親水性基を含有する基である。複数のＲ７および複数のＲ８は、それぞれ互いに同一であってもよいし、異なってもよい。
【0026】
このように、少なくとも４つの親水性基または親水性基を含有する基を有するシアニン系色素は、高い親水性を有する。そのため、水系媒体中で色素同士の凝集（スタッキング）およびそれによる消光を抑制しうる。また、抗体（結合物質）の抗原認識部位は、通常、疎水性を示すが、シアニン系色素は高い親水性を示すため、シアニン系色素が抗体の抗原認識部位に近づきにくい。そのため、色素－抗体間のエネルギー遷移による消光や抗体の機能阻害による検出感度の低下を抑制しうる。
【0027】
親水性基は、酸性基であることが好ましい。酸性基は、特に制限されないが、カルボキシル基、スルホン酸基および硫酸エステル基からなる群より選ばれる基であることが好ましく、スルホン酸基であることがより好ましい。酸性基は、アニオン（例えばＳＯ３
―など）であってもよいし、各種カウンターカチオン（例えばＮａ＋、Ｋ＋などの無機カチオン、あるいはトリエチルアンモニウム塩（ＨＮ＋Ｅｔ３）、ジアザビシクロウンデセニウム塩（ＨＤＢＵ＋）などの有機カチオン）と塩を形成していてもよい。これらの酸性基、特にスルホン酸基は、シアニン系色素に適度な親水性を付与しうる。
【0028】
親水性基を含有する基は、特に制限されないが、－（ＣＨ２）ｋ－Ｗ（ｋは、１～１０の整数であり、Ｗは、酸性基である）、または親水性基を含有するリンカー基でありうる。Ｗで示される酸性基は、前述の酸性基と同様であり、好ましくはスルホン酸基、カルボキシル基であり、より好ましくはスルホン酸基である。
【0029】
親水性基を含有するリンカー基は、結合物質（抗体など）に結合する官能基を有する基であればよく、特に制限されないが、好ましくは－（ＣＨ２）ｊ－Ｌ－Ｘまたは－（ＲＯ）ｊ－Ｌ－Ｘでありうる。
【0030】
Ｘは、タンパク質（後述する被検出物質や被検出物質に特異的に結合できる結合物質）などと結合する官能基である。タンパク質（後述する被検出物質や被検出物質に特異的に結合できる結合物質）などと結合する官能基の例には、ＮＨＳエステル（スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステルなど）、イミドエステル、ＳＴＰエステル（４－スルホテトラフルオロフェニルエステル基など）、ペンタフルオロフェニルエステル、ヒドロキシメチルホスフィンなどのアミン反応性基；マレイミド、ハロ酢酸（ブロモ酢酸またはヨード酢酸）、ピリジルジスルフィド、チオスルフォン、ビニルスルホンなどのスルフヒドリル反応性基が含まれる。中でも、当該官能基は、スクシンイミジルエステル基、スルホスクシンイミジルエステル基、マレイミド基、および４－スルホテトラフルオロフェニルエステル基であることが好ましい。
【0031】
Ｒは、アルキレン基、好ましくは炭素原子数１～４のアルキレン基である。アルキレン基の例には、エチレン基およびプロピレン基が含まれ、好ましくはエチレン基である。
【0032】
ｊは、それぞれ１～１０の整数であり、好ましくは３～６の整数である。
【0033】
Ｌは、連結基である。連結基は、例えば炭素原子、窒素原子、水素原子、硫黄原子からなる群より選ばれる一つ以上を組み合わせた基であり、そのような連結基の例には、－Ｒ－、―Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨＲ－、－ＲＣ（＝Ｏ）－ＮＨＲ－、－Ｓ（＝Ｏ）２―ＮＨＲ－、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨＲ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨＲ－（Ｒは、炭素原子数２～１０のポリアルキレンオキサイド基またはアルキレン基）が含まれる。
【0034】
ただし、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６が親水性基を含有する基である場合、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６は、アルキルスルホン酸基以外の基である。その理由は、以下のように考えられる。
【0035】
色素分子に導入する、スルホン酸基などの親水性基を含有する基の数を増やすことで、色素分子の会合を抑制することができる。しかしながら、結合物質がタンパク質である場合、親水性基を含有する基を増やし過ぎると、タンパク質にラベル化した際にタンパク質の等電点を下げ、タンパク質の生理活性やリガンドに対する結合能などを低下させる恐れがある。したがって、親水性基を含有する基の導入数をなるべく低くしつつ、効果的に色素の分子会合を抑制することが望まれる。分子会合抑制に効果の高い親水性基を含有する基の置換位置は、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ７およびＲ８であることを本発明者らは鋭意検討した結果により見出しており、これらの位置に対して偏りなく親水性基を含有する基を配置することで、分子会合抑制の効果を最大化しうると考えられる。
その上で、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６にアルキルスルホン酸基をさらに導入すると、親水性基過多による結合物質の特性や結合物質のリガンドに対する結合能などの低下につながる恐れがある。あるいは、親水性基の総数を変えずに、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ７およびＲ８に親水性基を含有する基を導入する代わりに、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６にアルキルスルホン酸基を導入したとしても、十分な会合抑制効果が得られにくいと考えられる。
その上で、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６にアルキルスルホン酸基をさらに導入すると、親水性基過多による結合物質の特性や結合物質のリガンドに対する結合能などの低下につながる恐れがある。あるいは、親水性基の総数を変えずに、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ７およびＲ８に親水性基を含有する基を導入する代わりに、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６にアルキルスルホン酸基を導入したとしても、十分な会合抑制効果が得られにくいと考えられる。
【0036】
Ｒ１～Ｒ６、１以上のＲ７および１以上のＲ８のうち上記以外の残りは、親水性基を含有しない基でありうる。親水性基を含有しない基は、特に制限されないが、親水性基を有しないリンカー基、または、親水性基を含有しないアルキル基でありうる。
【0037】
親水性基を含有しないリンカー基は、Ｘが親水性基を有しない以外は上記リンカー基と同じものである。
【0038】
親水性基を含有しないアルキル基は、炭素原子数１～４のアルキル基であることが好ましい。親水性基を含有しないアルキル基の例には、メチル基、エチル基などが含まれる。
【0039】
中でも、Ｒ１～Ｒ６および１以上のＲ７および１以上のＲ８のうち少なくとも１つは、リンカー基（－（ＣＨ２）ｊ－Ｌ－Ｘまたは－（ＲＯ）ｊ－Ｌ－Ｘ）であることが好ましい。特に、Ｒ１～Ｒ６のうち少なくとも１つ、好ましくはＲ１～Ｒ３（またはＲ４～Ｒ６）のうち少なくとも１つ、より好ましくはＲ1もしくはＲ２（またはＲ4もしくはＲ５）が、リンカー基（－（ＣＨ２）ｊ－Ｌ－Ｘまたは－（ＲＯ）ｊ－Ｌ－Ｘ）でありうる。リンカー基がこれらの位置にあると、被検出物質や被検出物質に特異的に結合できる結合物質（抗体など）と結合した状態で励起された際に、シアニン系色素から結合物質へのエネルギー遷移を少なくし、消光をさらに生じにくくしうる。なお、リンカー基のＸは、親水性基を有してもよいし、有しなくてもよい。
【0040】
すなわち、Ｒ１～Ｒ６のうち、
少なくとも１つは、－（ＣＨ２）ｊ－Ｌ－Ｘまたは－（ＲＯ）ｊ－Ｌ－Ｘであり、
それ以外の少なくとも１つは、親水性基または親水性基を含有する基（好ましくは－（ＣＨ２）ｋ－Ｗ）であり、
残りは、親水性基を含有しないアルキル基であり、かつ
Ｒ７およびＲ８は、親水性基または親水性基を含有する基（好ましくは親水性基）であることが好ましい。
少なくとも１つは、－（ＣＨ２）ｊ－Ｌ－Ｘまたは－（ＲＯ）ｊ－Ｌ－Ｘであり、
それ以外の少なくとも１つは、親水性基または親水性基を含有する基（好ましくは－（ＣＨ２）ｋ－Ｗ）であり、
残りは、親水性基を含有しないアルキル基であり、かつ
Ｒ７およびＲ８は、親水性基または親水性基を含有する基（好ましくは親水性基）であることが好ましい。
【0041】
さらに、Ｒ１～Ｒ６のうち、
Ｒ１またはＲ３は、－（ＣＨ２）ｊ－Ｌ－Ｘまたは－（ＲＯ）ｊ－Ｌ－Ｘであり、
それ以外の１または２つは、親水性基を含有する基（好ましくは－（ＣＨ２）ｋ－Ｗ）であり、
残りは、親水性基を含有しないアルキル基であり、かつ
Ｒ７およびＲ８は、親水性基または親水性基を含有する基（好ましくは親水性基）であることが好ましい。
Ｒ１またはＲ３は、－（ＣＨ２）ｊ－Ｌ－Ｘまたは－（ＲＯ）ｊ－Ｌ－Ｘであり、
それ以外の１または２つは、親水性基を含有する基（好ましくは－（ＣＨ２）ｋ－Ｗ）であり、
残りは、親水性基を含有しないアルキル基であり、かつ
Ｒ７およびＲ８は、親水性基または親水性基を含有する基（好ましくは親水性基）であることが好ましい。
【0042】
式（１）において、ｌおよびｍは、それぞれ１以上の整数である。中でも、ｌは、１または２、好ましくは１である。ｍは、１または２である。
【0043】
式（１）において、ｎは、１～３の整数である。ｎが大きいほど、吸収極大波長は長波長化する傾向がある。ＳＰＦＳに適した吸収極大波長に調整しやすい観点では、ｎは、好ましくは２である。
【0044】
式（１）で表されるシアニン系色素は、式（２）で表されることがより好ましい。
【化3】
【0045】
式（２）で表されるシアニン系色素は、式（２Ａ）で表されることがより好ましい。
【化4】
【0046】
式（２Ａ）において、Ａ１～Ａ４のうち１以上は、式（１）のＲ７であり、好ましくは親水性基または親水性基を含有する基である。Ａ５～Ａ１０のうち１以上は、式（１）のＲ８であり、好ましくは親水性基または親水性基を含有する基である。Ａ１～Ａ４およびＡ５～Ａ１０のうち上記以外の残りは、水素原子である。なお、複数のＲ７および複数のＲ８は、同じであってもよいし、異なってもよい。
【0047】
Ｒ７またはＲ８で表される親水性基を含有する基は、上記と同様である。すなわち、親水性基は、酸性基であることが好ましく、スルホン酸基（塩を形成していてもよい）であることがより好ましい。親水性基を含有する基は、－（ＣＨ２）ｋ－Ｗであることが好ましく、－（ＣＨ２）ｋ－Ｗ（ｋは、１～１０の整数、Ｗは、スルホン酸基）であることがより好ましい。
【0048】
中でも、Ａ２、Ａ８およびＡ１０はスルホン酸基であり、かつＲ４は－（ＣＨ２）ｋ－Ｗであること、あるいはＡ２およびＡ１０はスルホン酸基であり、かつＲ１、Ｒ４は－（ＣＨ２）ｋ－Ｗであることが好ましい。
【0049】
シアニン系色素は、親水性を損なわないようにする観点から、フッ素原子を含まないことが好ましい。
【0050】
式（１）で表されるシアニン系色素の例には、以下の表に記載の色素が含まれる。
【0051】
【表1】
【0052】
【表2】
【0053】
【表3】
【0054】
【表4】
【0055】
【表5】
【0056】
【表6】
【0057】
【表7】
【0058】
【表8】
【0059】
【表9】
【0060】
（合成方法）
本発明のシアニン系色素は、式（１ａ）で表される第１化合物と、式（１ｂ）で表される第２化合物と、これらを結合させるための第３化合物とを反応させて得ることができる。
本発明のシアニン系色素は、式（１ａ）で表される第１化合物と、式（１ｂ）で表される第２化合物と、これらを結合させるための第３化合物とを反応させて得ることができる。
【化5】
【化6】
【0061】
式（１ａ）または（１ｂ）のＲ１～Ｒ８、ｌおよびｍは、式（１）のＲ１～Ｒ８、ｌおよびｍとそれぞれ同義である。
【0062】
第３化合物は、第１化合物の複素環と第２化合物の複素環とを結合するポリメチン結合を形成するための化合物であり、公知のもの、例えばＨａｍｅｒ，Ｆ．Ｍ．，“Ｔｈｅ Ｃｙａｎｉｎｅ Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９６４）に記載のものを使用できる。
【0063】
具体的には、置換Ｎ，Ｎ’－ジフェニルホルムアミジンやオルトエステルを使用することができる。例えば、ペンタメチンシアニン系色素を調製する場合（式（１）のｎ＝２の場合）、マロンアルデヒドジアニルを使用することができる。ヘプタメチンシアニン系色素を調製する場合（式（１）のｎ＝３の場合）、グルタコンアルデヒドを使用することができる。
【0064】
上記反応は、１段階で行ってもよいし、多段階で行ってもよい。例えば、式（１ａ）で表される第１の化合物と、第３の化合物（例えば置換Ｎ，Ｎ’－ジフェニルホルムアミジンまたはマロンアルデヒドジアニル）を無水酢酸の存在下で反応させて、２－アニリノビニルまたは４－アニリン－１，３－ブタジエニル第四級塩を形成した後；得られた第四級塩と、式（１ｂ）で表される第２化合物とを反応させて、式（１）で表される化合物を得ることができる。
【0065】
２．標識試薬
本発明の標識試薬は、本発明のシアニン系色素で標識された結合物質である。
本発明の標識試薬は、本発明のシアニン系色素で標識された結合物質である。
【0066】
標識試薬に含まれる結合物質の種類は、被検出物質に特異的に結合することができれば特に限定されない。標識試薬に含まれる結合物質の例には、被検出物質に特異的に結合できる抗体、被検出物質に特異的に結合できる核酸、被検出物質に特異的に結合できる脂質、被検出物質に特異的に結合できる抗体以外のタンパク質および被検出物質に特異的に結合できるアプタマーなどが含まれる。
【0067】
中でも、後述する免疫反応を利用した検出方法において、標識試薬に含まれる結合物質は、被検出物質に特異的に結合することができる抗体もしくはレクチンであることが好ましい。たとえば、被検出物質がＰＳＡ－Ｇｉ（Prostate specific antigen glycoisoform、前立腺特異抗原糖鎖修飾異性体）などの抗原である場合、標識試薬に含まれる結合物質は、ＰＳＡ－Ｇｉに特異的に結合することができるレクチンであることが好ましい。標識試薬に含まれる結合物質の種類は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。
【0068】
結合物質１分子に結合するシアニン系色素の分子の数は、１つであってもよいし、複数であってもよい。検出感度を高める観点では、結合物質１分子に結合するシアニン系色素の分子の数は、複数であることが好ましい。
【0069】
結合物質をシアニン系色素で標識する方法は、特に限定されず、公知の方法から適宜選択されうる。たとえば、結合物質としてのタンパク質とシアニン系色素とを共有結合させる場合は、通常、室温下で、水性緩衝媒体、例えば炭酸水素塩中（ｐＨ９．０）で１時間程度反応させればよい。標識されたタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによって、例えば固定相としてＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）を、溶離液としてホスフェート緩衝剤（ｐＨ７．０）を使用して、未反応の色素から分離することができる。標的生体分子の多重標識のために、色素の量又は濃度と標的材料の比をそれに応じて調節することが好ましい。
【0070】
３．検出方法
本発明のシアニン系色素は、検体に含まれる被検出物質の検出方法における、標識試薬の蛍光物質として使用することができる。すなわち、本発明の検出方法は、被検出物質を本発明の標識試薬と結合させる工程（被検出物質を間接的に標識する工程）と、被検出物質と結合した標識試薬におけるシアニン系色素を励起させた際に発せられる蛍光を検出する工程とを有する。
本発明のシアニン系色素は、検体に含まれる被検出物質の検出方法における、標識試薬の蛍光物質として使用することができる。すなわち、本発明の検出方法は、被検出物質を本発明の標識試薬と結合させる工程（被検出物質を間接的に標識する工程）と、被検出物質と結合した標識試薬におけるシアニン系色素を励起させた際に発せられる蛍光を検出する工程とを有する。
【0071】
被検出物質の種類は、特に制限されないが、核酸、たんぱく質、ホルモン、ペプチド、糖鎖などが含まれる。好ましくはタンパク質でありうる。タンパク質は、例えば病理診断の対象となる疾病に関連する抗原（腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモン、癌の増殖制御因子、転移制御因子、増殖制御因子など）であってよく、例えばＰＳＡ－Ｇｉなどでありうる。
【0072】
蛍光の検出は、任意の方法で行うことができる。中でも、本発明の検出方法では、ＳＰＦＳを利用して、被検出物質を検出する。ＳＰＦＳは、ＳＰＲにより増強された電場によりシアニン系色素を励起して蛍光を放出させるため、一般的な蛍光免疫測定法よりも被検出物質を高感度に検出することができる。また、ＳＰＦＳは、検体として全血など様々な被測定試料を対象とすることができる。
【0073】
本実施の形態に係る被検出物質の検出方法について、具体的に説明する。図１は、本実施の形態に係る被検出物質の検出方法の一例を示すフローチャートである。
【0074】
図１に示されるように、本実施の形態に係る被検出物質の検出方法は、金属膜と、金属膜に固定化された、被検出物質に特異的に結合する結合物質とを含む検出チップを準備する工程（工程Ｓ１０）と、２）金属膜上に検体を提供して、検体に含まれる被検出物質を金属膜上に固定化した結合物質に結合させる工程（一次反応工程；工程Ｓ２０）と、３）結合物質に結合する前または結合した後の被検出物質を、シアニン系色素で標識された（被検出物質と特異的に結合する）結合物質を有する標識試薬と結合させる工程（二次反応工程；工程Ｓ３０）と、４）シアニン系色素で標識された結合物質が被検出物質に結合している状態で、金属膜でＳＰＲが生じるように金属膜に励起光を照射したときに、シアニン系色素から放出される蛍光を検出する工程（工程Ｓ４０）とを含む。
【0075】
（検出チップを準備する工程（工程Ｓ１０））
まず、金属膜と、被検出物質（本実施の形態では、例えばＰＳＡ－Ｇｉなどの腫瘍マーカー）に特異的に結合する結合物質とを含む検出チップを準備する（工程Ｓ１０）。
まず、金属膜と、被検出物質（本実施の形態では、例えばＰＳＡ－Ｇｉなどの腫瘍マーカー）に特異的に結合する結合物質とを含む検出チップを準備する（工程Ｓ１０）。
【0076】
ＳＰＦＳでは、金属膜に励起光を照射したときに生じるエバネッセント波と表面プラズモンとを結合させてＳＰＲを生じさせる。ＳＰＲを生じさせる手法としては、金属膜の一方の面上にプリズムを配置する手法（Kretschmann配置）や、金属膜に回折格子を形成する手法などが知られている。前者の手法を採用したＳＰＦＳは、プリズムカップリング（ＰＣ）－ＳＰＦＳと称され、後者の手法を採用したＳＰＦＳは、格子カップリング（ＧＣ）－ＳＰＦＳと称される。本実施の形態に係る被検出物質の検出方法は、ＰＣ－ＳＰＦＳおよびＧＣ－ＳＰＦＳのどちらを採用してもよい。
【0077】
上述のとおり、金属膜は、励起光を照射されたときにＳＰＲを生じさせる。金属膜を構成する金属の種類は、ＳＰＲを生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜を構成する金属の例には、金、銀、銅、アルミニウムおよびこれらの合金が含まれ、好ましくは金である。
【0078】
結合物質は、被検出物質に特異的に結合することができ、検体中の被検出物質を捕捉するために、金属膜上に固定化されている。通常、結合物質は、金属膜上の所定の領域（反応場）に均一に固定化されている。
【0079】
金属膜に固定化される結合物質の種類は、被検出物質に特異的に結合することができれば特に限定されず、上記標識試薬に用いられる結合物質と同様のものを用いることができる。たとえば、被検出物質がＰＳＡ－Ｇｉである場合、金属膜に固定化された結合物質は、例えば、ＰＳＡ－Ｇｉに特異的に結合できる抗体（抗ＰＳＡ－Ｇｉ抗体）、ＰＳＡ－Ｇｉに特異的に結合できる核酸、ＰＳＡ－Ｇｉに特異的に結合できる脂質、ＰＳＡ－Ｇｉに特異的に結合できる抗体以外のタンパク質およびＰＳＡ－Ｇｉに特異的に結合できるアプタマーなどが含まれる。また、金属膜に固定化される結合物質の種類は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。
【0080】
被検出物質の検出感度を向上させる観点から、金属膜に固定化する結合物質として、被検出物質の特定の領域に特異的に結合する抗体を採用することが好ましい。
【0081】
結合物質の固定化方法は、特に限定されない。例えば、金属膜上に、結合物質（例えば抗体）を結合させた自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ」という）または高分子膜を形成すればよい。ＳＡＭの例には、ＨＯＯＣ－（ＣＨ２）１１－ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜が含まれる。高分子膜を構成する材料の例には、ポリエチレングリコールおよびＭＰＣポリマーが含まれる。また、結合物質（例えば抗体）に結合可能な反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有する高分子を金属膜に固定化し、この高分子に結合物質（例えば抗体）を結合させてもよい。
【0082】
検出チップは、好ましくは各片の長さが数ｍｍ～数ｃｍの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。
【0083】
図２Ａは、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の検出チップの構成を説明するための断面模式図であり、図２Ｂは、ＧＣ－ＳＰＦＳ用の検出チップの構成を説明するための断面模式図である。説明の便宜上、これらの図において、各構成要素の大きさおよび形状は、正確ではない。また、これらの図では、結合物質として抗体を使用する例を示している。
【0084】
図２Ａに示されるように、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の検出チップ１００は、プリズム１１０、金属膜１２０および結合物質（例えば抗体）１３０（の層）を有する。プリズム１１０は、励起光Ｌ１に対して透明な誘電体からなり、励起光Ｌ１が入射する入射面１１１と、励起光Ｌ１が反射する成膜面１１２と、反射光Ｌ２が出射する出射面１１３とを有する。プリズム１１０の形状は、特に限定されない。図２Ａに示される例では、プリズム１１０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面１１２であり、一方の脚に対応する面が入射面１１１であり、他方の脚に対応する面が出射面１１３である。プリズム１１０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム１１０の材料は、好ましくは、励起光に対する屈折率が１.４～１.６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。金属膜１２０は、プリズム１１０の成膜面１１２上に配置されている。金属膜１２０の形成方法は、特に限定されない。金属膜１２０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、めっきが含まれる。金属膜１２０の厚みは、特に限定されないが、３０～７０ｎｍの範囲内であることが好ましい。
【0085】
図２Ａに示されるように、金属膜１２０においてＳＰＲが生じるようにプリズム１１０を介して金属膜１２０に励起光Ｌ１を照射すると、ＳＰＲにより増強された電場が金属膜１２０近傍に生じる。このとき、金属膜１２０上の結合物質（例えば抗体）１３０に、シアニン系色素１５０を有する標識試薬が結合した被検出物質（例えば抗原）１４０が結合していると、シアニン系色素１５０が増強電場により励起され、蛍光Ｌ３を放出する。
【0086】
図２Ｂに示されるように、ＧＣ－ＳＰＦＳ用の検出チップ２００は、回折格子２１１を形成された金属膜２１０および結合物質（例えば抗体）１３０（の層）を有する。金属膜２１０の形成方法は、特に限定されない。金属膜２１０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、めっきが含まれる。金属膜２１０の厚みは、特に限定されないが、３０～５００ｎｍの範囲内であることが好ましい。回折格子２１１の形状は、エバネッセント波を生じさせることができれば特に限定されない。例えば、回折格子２１１は、１次元回折格子であってもよいし、２次元回折格子であってもよい。例えば、１次元回折格子では、金属膜２１０の表面に、互いに平行な複数の凸条が所定の間隔で形成されている。２次元回折格子では、金属膜２１０の表面に、所定形状の凸部が周期的に配置されている。凸部の配列の例には、正方格子、三角（六方）格子などが含まれる。回折格子２１１の断面形状の例には、矩形波形状、正弦波形状、鋸歯形状などが含まれる。回折格子２１１の形成方法は、特に限定されない。例えば、平板状の基板（不図示）の上に金属膜２１０を形成した後、金属膜２１０に凹凸形状を付与してもよい。また、予め凹凸形状を付与された基板（不図示）の上に、金属膜２１０を形成してもよい。いずれの方法であっても、回折格子２１１を含む金属膜２１０を形成することができる。
【0087】
図２Ｂに示されるように、金属膜２１０（回折格子２１１）においてＳＰＲが生じるように金属膜２１０（回折格子２１１）に励起光Ｌ１を照射すると、ＳＰＲにより増強された電場が金属膜２１０（回折格子２１１）近傍に生じる。このとき、金属膜２１０（回折格子２１１）上の結合物質（例えば抗体）１３０に、シアニン系色素１５０を有する標識試薬が結合した被検出物質１４０が結合していると、シアニン系色素１５０が増強電場により励起され、蛍光Ｌ３を放出する。
【0088】
図３は、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の検出チップの一例を示す断面模式図である。
【0089】
図３に示されるように、検出チップ３００は、入射面１１１、成膜面１１２および出射面１１３を有するプリズム１１０と、プリズム１１０の成膜面１１２に形成された金属膜１２０と、プリズム１１０の成膜面１１２または金属膜１２０上に配置された流路蓋３１０とを有する。図３において、入射面１１１および出射面１１３は、紙面の手前および奥にそれぞれ存在している。検出チップ３００は、さらに、流路３２０と、流路３２０の一端に接続された液体注入部３３０と、流路３２０の他端に接続された貯留部３４０も有する。本実施の形態では、流路蓋３１０は、両面テープなどの接着層３５０を介して金属膜１２０（またはプリズム１１０）に接着されており、接着層３５０は流路３２０の側面形状を規定する役割も担っている。図３では省略しているが、流路３２０内に露出している金属膜１２０の一部の領域（反応場）には、結合物質（抗体）１３０が固定化されている。液体注入部３３０は、液体注入部被覆フィルム３３１により塞がれ、貯留部３４０は、貯留部被覆フィルム３４１により塞がれている。貯留部被覆フィルム３４１には、通気孔３４２が設けられている。
【0090】
流路蓋３１０は、蛍光Ｌ３に対して透明な材料で形成されている。ただし、蛍光Ｌ３の取り出しの妨げにならない限り、流路蓋３１０の一部は蛍光Ｌ３に対して不透明な材料で形成されていてもよい。蛍光Ｌ３に対して透明な材料の例には、樹脂が含まれる。流路蓋３１０は、接着層３５０を用いずに、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより、金属膜１２０（またはプリズム１１０）に接合されていてもよい。この場合は、流路３２０の側面形状は、流路蓋３１０により規定される。
【0091】
液体注入部３３０には、ピペットチップが挿入される。このとき、液体注入部３３０の開口部（液体注入部被覆フィルム３３１に設けられた貫通孔）はピペットチップの外周に隙間なく接触する。このため、ピペットチップから液体注入部３３０内に液体を注入することで流路３２０内に液体を導入することができ、液体注入部３３０内の液体をピペットチップに吸引することで流路３２０内の液体を除去することができる。また、液体の注入および吸引を交互に行うことで、流路３２０内において液体を往復送液することもできる。
【0092】
液体注入部３３０から流路３２０内に流路３２０の容積を超える量の液体が導入された場合、貯留部３４０には流路３２０から液体が流入する。また、流路３２０内において液体を往復送液するときにも、貯留部３４０には液体が流入する。貯留部３４０に流入した液体は、貯留部３４０内で攪拌される。貯留部３４０内で液体が攪拌されると、流路３２０を通過する液体（検体や洗浄液など）の成分（例えば被検出物質や洗浄成分など）の濃度が均一になり、流路３２０内で各種反応が生じやすくなったり、洗浄効果が高まったりする。
【0093】
（１次反応を行う工程（工程Ｓ２０））
次に、検出チップの金属膜上に検体を提供して、検体に含まれる被検出物質を結合物質に結合させる（１次反応；工程Ｓ２０）。
次に、検出チップの金属膜上に検体を提供して、検体に含まれる被検出物質を結合物質に結合させる（１次反応；工程Ｓ２０）。
【0094】
検体を提供する方法は、特に限定されない。たとえば、ピペットチップを先端に装着したピペットを用いて金属膜上に検体を提供すればよい。通常は、１次反応を終えた後、金属膜の表面を緩衝液などで洗浄して、結合物質に結合していない成分を除去する。
【0095】
検体の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液、血清、血漿、リンパ液、組織液、体腔液、脳脊髄液、唾液、胃液、尿、鼻腔粘液、口腔内粘膜液およびこれらの希釈液が含まれる。
【0096】
（２次反応を行う工程（工程Ｓ３０））
次に、検出チップの金属膜上に、上記標識試薬を提供して、結合物質に結合した被検出物質を、シアニン系色素で標識された結合物質を有する標識試薬と結合させる（２次反応、工程Ｓ３０）。
次に、検出チップの金属膜上に、上記標識試薬を提供して、結合物質に結合した被検出物質を、シアニン系色素で標識された結合物質を有する標識試薬と結合させる（２次反応、工程Ｓ３０）。
【0097】
標識試薬を提供する方法は、特に限定されない。例えば、ピペットチップを先端に装着したピペットを用いて金属膜上に標識試薬を提供すればよい。通常は、２次反応を終えた後、金属膜の表面を緩衝液などで洗浄して、被検出物質と結合していない標識試薬を除去する。
【0098】
標識試薬は、本発明の標識試薬であり、シアニン系色素で標識された、被検出物質に特異的に結合する結合物質である。
【0099】
標識試薬に含まれるシアニン系色素は、上記した通り、本発明のシアニン系色素である。標識試薬に含まれる結合物質の種類は、金属膜に固定化される結合物質の種類と同一であってもよいし、異なっていてもよい。標識試薬に含まれる結合物質の種類は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。
【0100】
なお、上記の説明では、金属膜に固定化された結合物質に被検出物質を結合させてから、被検出物質を標識試薬と結合させたが、金属膜に固定化された結合物質に被検出物質を結合させる前に、被検出物質を標識試薬と結合させてもよい。この場合は、検体を金属膜上に提供する前に、検体と標識試薬を混合すればよい。また、金属膜に固定化された結合物質に、被検出物質を結合させる工程と被検出物質を標識試薬と結合させる工程を同時に行ってもよい。この場合は、検体と標識試薬を金属膜上に同時に提供すればよい。
【0101】
（蛍光を検出する工程（工程Ｓ４０））
次に、ＳＰＦＳにより被検出物質の存在または量を示す蛍光を検出する（工程Ｓ４０）。
次に、ＳＰＦＳにより被検出物質の存在または量を示す蛍光を検出する（工程Ｓ４０）。
【0102】
具体的には、シアニン系色素で標識された（被検出物質と特異的に結合する）結合物質が結合した被検出物質が、金属膜に固定化された結合物質に結合している状態で、金属膜でＳＰＲが生じるように金属膜に励起光を照射し、これによりシアニン系色素から放出される蛍光を検出する。例えば、測定された蛍光値を、予め測定された光学ブランク値で割って、被検出物質の量に相関するシグナル値（Ｓ／Ｎ比）を算出する。あるいは、測定された蛍光値から、予め測定された光学ブランク値を引いて、被検出物質の量に相関するシグナル値を算出してもよい。必要に応じて、予め作成しておいた検量線などにより、シグナル値を被検出物質の量や濃度などに換算してもよい。
【0103】
図２Ａに示されるように、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の検出チップ１００を用いる場合は、励起光Ｌ１は、プリズム１１０を介して金属膜１２０に照射される。これにより、金属膜１２０においてＳＰＲが生じ、金属膜１２０近傍に存在するシアニン系色素１５０は、増強電場により励起され、蛍光Ｌ３を放出する。金属膜１２０に対する励起光Ｌ１の入射角は、金属膜１２０でＳＰＲが生じるように設定されるが、共鳴角または増強角であることが好ましい。ここで「共鳴角」とは、金属膜１２０に対する励起光Ｌ１の入射角を走査した場合に、反射光Ｌ２の光量が最小となるときの入射角を意味する。また、「増強角」とは、金属膜１２０に対する励起光Ｌ１の入射角を走査した場合に、金属膜１２０の上方（プリズム１１０の反対側）に放出される励起光Ｌ１と同一波長の散乱光（プラズモン散乱光）の光量が最大となるときの入射角を意味する。
【0104】
図２Ｂに示されるように、ＧＣ－ＳＰＦＳ用の検出チップ２００を用いる場合は、励起光Ｌ１は、直接金属膜２１０（回折格子２１１）に照射される。これにより、金属膜２１０（回折格子２１１）においてＳＰＲが生じ、金属膜２１０（回折格子２１１）近傍に存在するシアニン系色素１５０は、増強電場により励起され、蛍光Ｌ３を放出する。金属膜２１０に対する励起光Ｌ１の入射角は、金属膜２１０でＳＰＲが生じるように設定されるが、ＳＰＲにより形成される増強電場の強度が最も強くなる角度が好ましい。励起光Ｌ１の最適な入射角は、回折格子２１１のピッチや励起光Ｌ１の波長、金属膜２１０を構成する金属の種類などに応じて適宜設定される。
【0105】
励起光の種類は、特に限定されないが、通常はレーザー光である。たとえば、励起光は、出力が１５～３０ｍＷのレーザー光源から出射されたレーザー光である。出力を１５ｍＷ以上とすることで、蛍光強度を高めて蛍光を適切に検出することができる。また、出力を３０ｍＷ以下とすることで、金属膜に固定化されている結合物質などへの悪影響を抑制することができる。励起光の波長は、使用するシアニン系色素の励起波長に応じて適宜設定される。
【0106】
蛍光の検出器は、検出チップに対して蛍光の強度が最も高い方向に設置されることが好ましい。たとえば、図２Ａに示されるように、ＰＣ－ＳＰＦＳ用の検出チップ１００を用いる場合は、蛍光Ｌ３の強度が最も高い方向は金属膜１２０の法線方向であるので、検出器は、検出チップの直上に設置される。一方、図２Ｂに示されるように、ＧＣ－ＳＰＦＳ用の検出チップ２００を用いる場合は、蛍光Ｌ３の強度が最も高い方向は金属膜１２０の法線に対してある程度傾斜した方向であるので、検出器は、検出チップの直上ではない位置設置される。検出器は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などである。
【0107】
以上の手順により、検体に含まれる被検出物質の存在または量を検出することができる。
【0108】
［効果］
以上のように、本実施の形態に係る、ＳＰＦＳを利用した被検出物質の検出方法では、上記のシアニン系色素を用いる。そのため、消光が少なく、高い感度で被検出物質を検出することができる。
以上のように、本実施の形態に係る、ＳＰＦＳを利用した被検出物質の検出方法では、上記のシアニン系色素を用いる。そのため、消光が少なく、高い感度で被検出物質を検出することができる。
【実施例0109】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0110】
＜実施例１：シアニン系色素１の合成＞
［原料１の合成］
［原料１の合成］
【化7】
【0111】
２Ｌ四つ口フラスコに７－アミノ－１，３－ナフタレンジスルホン酸モノカリウム水和物４３．５ｇ（１２７ｍｍｏｌ）、水６９６ｍｌ、濃塩酸３９．３ｍｌ（４７１ｍｍｏｌ）を仕込んだ。そこに氷冷撹拌下、亜硝酸ナトリウム９．２３ｇ（１３５ｍｍｏｌ）／水２７．７ｍｌ溶液を滴下した。氷浴を外し、室温で５０分間撹拌し、ジアゾニウム塩溶液を調製した。
【0112】
別の２Ｌ四つ口フラスコに無水亜硫酸ナトリウム４０．１ｇ（３１９ｍｍｏｌ）、水８０．２ｍｌを仕込み、室温撹拌、分散下、調製したジアゾニウム塩溶液を滴下し、水１０ｍｌで洗い込んだ。水浴５０℃で１時間撹拌し、さらに水浴６０℃で１時間撹拌した。５Ｌポリエチレン製ジョッキに反応液を移し、氷冷下撹拌し、２－プロパノール１．７Ｌを加え、晶析させた。結晶をろ取し、２－プロパノール１００ｍｌ、アセトニトリル１００ｍｌで結晶を洗浄した。
粗結晶をアセトニトリル２６１ｍｌ中で、３０分間室温撹拌、分散し、結晶をろ取し、アセトニトリル１５０ｍｌで洗浄した。得られた結晶は乾燥させずに、次反応に用いた。得られた原料１の収量は５８．０２ｇ（ｄｒｙ換算重量）、収率１００％、ＬＣ９８．３％であった。
粗結晶をアセトニトリル２６１ｍｌ中で、３０分間室温撹拌、分散し、結晶をろ取し、アセトニトリル１５０ｍｌで洗浄した。得られた結晶は乾燥させずに、次反応に用いた。得られた原料１の収量は５８．０２ｇ（ｄｒｙ換算重量）、収率１００％、ＬＣ９８．３％であった。
【0113】
［原料２の合成］
【化8】
【0114】
１Ｌ四つ口フラスコに原料１を５７．３ｇ（ｄｒｙ換算量、１３６ｍｍｏｌ）、水１７２ｍｌ、濃塩酸１７２ｍｌを仕込み、水浴５０℃で４０分間撹拌した。氷冷下撹拌し、晶析させた。結晶をろ取し、アセトニトリル５０ｍｌで２回、結晶を洗浄後、６０℃で一晩乾燥させた。得られた原料２の収量は２７．７８ｇ、収率５７．４％、ＬＣ９５．５％であった。
【0115】
［原料３の合成］
【化9】
【0116】
１Ｌ四つ口フラスコに原料２を２７．５ｇ（７７．５ｍｍｏｌ）、３－メチル―２-ブタノン１０．０ｇ（１１６ｍｍｏｌ）、メタノール２２０ｍｌ、濃塩酸４．１３ｍｌ（７７．５ｍｍｏｌ）を仕込み、油浴８０℃で２時間加熱撹拌した。２－プロパノール２２０ｍｌを加え、１時間氷冷撹拌し、晶析させた。結晶をろ取し、２－プロパノール６０ｍｌで結晶を洗浄した。６０℃で一晩乾燥し、粗結晶２６．１９ｇを得た。
粗結晶を水５２．４ｍｌとエタノール２１０ｍｌの混液で再結晶した。結晶をろ取し、エタノール５０ｍｌで２回洗浄し、結晶を６０℃で一晩乾燥させた。得られた原料３の収量は１９．７２ｇ、収率６０．８％、ＬＣ９９．３％であった。
粗結晶を水５２．４ｍｌとエタノール２１０ｍｌの混液で再結晶した。結晶をろ取し、エタノール５０ｍｌで２回洗浄し、結晶を６０℃で一晩乾燥させた。得られた原料３の収量は１９．７２ｇ、収率６０．８％、ＬＣ９９．３％であった。
【0117】
［原料４の合成］
【化10】
【0118】
５００ｍｌ四つ口フラスコにＮ，Ｎ’－ジフェニルホルムアミジン塩酸塩２０．０ｇ（７７．３ｍｍｏｌ）、メタノール１２０ｍｌを仕込み、水浴６０℃加熱撹拌、完溶した。水浴を外し、室温撹拌下、水酸化ナトリウム３．２ｇ（７９．６ｍｍｏｌ）／水２０ｍｌ溶液を滴下し、晶析させた。再度水浴６０℃に浸け、３０分間加熱撹拌、分散した。１時間氷冷撹拌後、結晶をろ取、水９０ｍｌで洗浄し、６０℃で一晩乾燥させた。得られた原料４の収量は１３．５６ｇ、収率７８．９％、ＬＣ９９．４％であった。
【0119】
［原料５の合成］
【化11】
【0120】
１２００ｍｌ四つ口フラスコに原料３を１０．０ｇ（２３．９ｍｍｏｌ）、１，４－ブタンサルトン１６．３ｇ（１１９ｍｍｏｌ）、スルホラン５．０ｍｌ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン９．２７ｇ（７１．７ｍｍｏｌ）を仕込み、油浴１３０℃で５時間加熱撹拌した。油浴を外し、室温撹拌下、アセトニトリル２０ｍｌを加え、晶析させた。水浴で冷却下、３０分間撹拌した。結晶をろ取し、アセトニトリル３０ｍｌで洗浄後、６０℃で一晩乾燥し、粗結晶６．７２ｇを得た。
粗結晶を２－プロパノール３４ｍｌ中で、水浴８０℃で加熱撹拌、３０分間分散した。結晶をろ取し、２－プロパノール２５ｍｌで洗浄後、６０℃で一晩乾燥させた。得られた原料５の収量は６．３９ｇ、収率５２．９％、ＬＣ９８．３％であった。
粗結晶を２－プロパノール３４ｍｌ中で、水浴８０℃で加熱撹拌、３０分間分散した。結晶をろ取し、２－プロパノール２５ｍｌで洗浄後、６０℃で一晩乾燥させた。得られた原料５の収量は６．３９ｇ、収率５２．９％、ＬＣ９８．３％であった。
【0121】
［原料６の合成］
【化12】
【0122】
２００ｍｌ四つ口フラスコに２，３，３―トリメチルインドレニン－５－スルホン酸１０．０ｇ（４１．８ｍｍｏｌ）、６－ブロモヘキサン酸エチル１６．８ｇ（７５．２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン５．４ｇ（４１．８ｍｍｏｌ）、スルホラン２ｍｌを仕込み、油浴１４０℃で３時間加熱撹拌した。
【0123】
油浴を外し、室温撹拌下、酢酸エチル５０ｍｌを加えると、オイルが析出した。２０分間水冷撹拌し、上清をデカントにより除いた。残渣に酢酸エチル５０ｍｌを加え、１０分間室温撹拌し、上清をデカントにより除いた。残渣にアセトニトリル５０ｍｌを加え、室温撹拌し、オイルを溶解した。吸引ろ過して、アセトニトリル１０ｍｌで洗い込み、ろ液と洗液を３００ｍｌナスフラスコに受けた。エバポレーターで減圧濃縮し、オイル３０．４０ｇを得た。オイルにアセトニトリル３０ｍｌを加えて溶かし、四級塩溶液とした。
【0124】
２００ｍｌ四つ口フラスコに、無水酢酸６０．５ｍｌ、原料４を１２．１ｇ（５４．３ｍｍｏｌ）を仕込み、室温撹拌下、四級塩溶液を滴下し、アセトニトリル１０ｍｌで洗い込んだ後、水浴６０℃で１時間加熱撹拌した。１Ｌビーカーにイソプロピルエーテル４２２ｍｌを仕込み、室温撹拌しながら反応液を注ぎ入れた。１０分間室温撹拌後、１０分間静置して、上清をデカントした。残渣にイソプロピルエーテル２００ｍｌ加え、同様のデカント操作を繰り返した。
【0125】
残渣にアセトニトリル３０ｍｌを加え、室温撹拌下、アニリン５．７ｍｌ（６２．７ｍｍｏｌ）を滴下し、さらに室温で５０分間撹拌した。室温撹拌下、反応液に酢酸エチル１２０ｍｌを加え、晶析させた。酢酸エチル６０ｍｌを加え、１時間室温撹拌し、さらに酢酸エチル６０ｍｌを加えて、１０分間室温撹拌した。結晶をろ取し、酢酸エチル６０ｍｌで洗浄し、結晶を得た。
粗結晶をエタノール２００ｍｌ中で、３０分間室温撹拌、分散した。結晶をろ取し、エタノール７０ｍｌで洗浄後、６０℃で一晩乾燥した。得られた原料６の収量は１２．４２ｇ、収率５８．２％、ＬＣ８５．９％であった。
粗結晶をエタノール２００ｍｌ中で、３０分間室温撹拌、分散した。結晶をろ取し、エタノール７０ｍｌで洗浄後、６０℃で一晩乾燥した。得られた原料６の収量は１２．４２ｇ、収率５８．２％、ＬＣ８５．９％であった。
【0126】
［原料７の合成］
【化13】
【0127】
２００ｍｌ四つ口フラスコに原料５を６．３ｇ（１２．５ｍｍｏｌ）、原料６を７．０ｇ（１３．７ｍｍｏｌ）、メタノール６３ｍｌを仕込み、室温撹拌下、無水酢酸２．４ｍｌ（２４．９ｍｍｏｌ）を一度に加え、トリエチルアミン６．９ｍｌ（４９．８ｍｍｏｌ）を滴下した。水浴６０℃で４時間加熱撹拌した。さらに、無水酢酸ナトリウム３．０７ｇ（３７．４ｍｍｏｌ）／メタノール３７ｍｌ溶液を滴下後、１０分間同温で加熱撹拌した。水浴６０℃加熱撹拌下、２－プロパノール２４０ｍｌを滴下し、晶析させた。水冷３０分間撹拌後、結晶をろ取し、２－プロパノール７０ｍｌ、アセトン５０ｍｌで洗浄した。
粗結晶をエタノール５０ｍｌ中で、ソニケートした。結晶をろ取し、エタノール５０ｍｌで洗浄した。６０℃で一晩乾燥した。得られた原料７の収量は８．４０ｇ、収率７３．０％、ＬＣ８６．７％であった。
粗結晶をエタノール５０ｍｌ中で、ソニケートした。結晶をろ取し、エタノール５０ｍｌで洗浄した。６０℃で一晩乾燥した。得られた原料７の収量は８．４０ｇ、収率７３．０％、ＬＣ８６．７％であった。
【0128】
［原料８の合成］
【化14】
【0129】
２００ｍｌ四つ口フラスコに水酸化ナトリウム０．３８ｇ（９．６ｍｍｏｌ）、水３６．５ｍｌ、原料７を７．３ｇ（７．３８ｍｍｏｌ）を仕込み、水浴４０℃で１時間加熱撹拌した。同温で加熱撹拌しながら、エタノール１４６ｍｌを滴下し、晶析させた。３０分間水冷撹拌し、氷冷下でさらに３０分間撹拌した。結晶をろ取し、エタノール５０ｍｌで洗浄後、６０℃で一晩乾燥し、粗結晶６．０２ｇを得た。
粗結晶を水１８ｍｌとエタノール９２ｍｌの混液で再結晶した。結晶をろ取し、エタノール４０ｍｌ、アセトン２０ｍｌで洗浄した。６０℃で一晩減圧乾燥した。得られた原料８の収量は４．６３ｇ、収率６３．８％、ＬＣ９４．４％であった。
粗結晶を水１８ｍｌとエタノール９２ｍｌの混液で再結晶した。結晶をろ取し、エタノール４０ｍｌ、アセトン２０ｍｌで洗浄した。６０℃で一晩減圧乾燥した。得られた原料８の収量は４．６３ｇ、収率６３．８％、ＬＣ９４．４％であった。
【0130】
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ＝８．９３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），８．４５（ｔ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，１Ｈ），８．３２（ｔ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ），８．１９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．１７（ｓ，１Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７１（ｓ，１Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．１７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．５８（ｔ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．４５（ｄ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ，１Ｈ），６．１１（ｄ，Ｊ＝１３．７Ｈｚ，１Ｈ），４．３０（ｂｒ，２Ｈ），３．９７（ｂｒ，２Ｈ），２．５７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．１５（ｓ，６Ｈ），１．９０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．８６－１．８０（ｍ，４Ｈ），１．６７（ｓ，６Ｈ），１．５６－１．４６（ｍ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），１．３９－１．３０（ｍ，２Ｈ）
【0131】
［シアニン系色素１の合成］
【化15】
【0132】
５０ｍｌナスフラスコに原料８を１．４４５ｇ（１．４７ｍｍｏｌ）、ＤＭＳＯ７．２ｍｌを仕込み、室温撹拌しながら、ＨＳＴＵ ０．５５ｇ（１．５４ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン４１μｌ（０．２９４ｍｍｏｌ）を加え、３０分間室温撹拌した。ＨＳＴＵ０．１１ｇ（０．２９４ｍｍｏｌ）を追加し、３０分間室温撹拌した。吸引ろ過し、ＤＭＳＯ１ｍｌで洗い込んだ。３００ｍｌナスフラスコにアセトン８２ｍｌを仕込み、室温で撹拌しながら、ろ過した反応液を滴下して、結晶化した。３０分間室温撹拌し、分散した後、結晶をろ取し、アセトン２０ｍｌで洗浄した。デシケーターで一晩室温減圧乾燥し、粗結晶１．７２８ｇを得た。
粗結晶をエタノール１７ｍｌ中、室温で３０分間撹拌して、分散した。結晶をろ取し、エタノール１０ｍｌで洗浄した。結晶を一晩室温で減圧乾燥した。得られたシアニン系色素１の収量は１．５０７ｇ、収率９６．９％、ＬＣ８２．６％であった。
粗結晶をエタノール１７ｍｌ中、室温で３０分間撹拌して、分散した。結晶をろ取し、エタノール１０ｍｌで洗浄した。結晶を一晩室温で減圧乾燥した。得られたシアニン系色素１の収量は１．５０７ｇ、収率９６．９％、ＬＣ８２．６％であった。
【0133】
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ＝８．９３（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ），８．４５（ｔ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ，１Ｈ），８．３２（ｔ，Ｊ＝１３．４Ｈｚ，１Ｈ），８．２０－８．１７（ｍ，２Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），７．７０（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．１７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．５７（ｔ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．４３（ｄ，Ｊ＝１４．５Ｈｚ，１Ｈ），６．１２（ｄ，Ｊ＝１３．４Ｈｚ，１Ｈ），４．３１（ｂｒ，２Ｈ），３．９９（ｂｒ，２Ｈ），２．８２（ｓ，４Ｈ），２．６９（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．５７－２．５２（ｍ，２Ｈ），２．１５（ｓ，６Ｈ），１．８２（ｂｒ，４Ｈ），１．７３－１．６７（ｍ，４Ｈ），１．６７（ｓ，６Ｈ），１．５２－１．４５（ｍ，２Ｈ）
【0134】
＜実施例２：シアニン系色素２の合成＞
［原料９の合成］
［原料９の合成］
【化16】
【0135】
１００ｍｌ四つ口フラスコに２－メチルアセト酢酸エチル１０ｇ（６９．４ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド２０ｍｌを仕込み、１０℃以下に冷却、撹拌下、水素化ナトリウム（６０％オイル分散品）２．７７ｇ（６９．３ｍｍｏｌ）を少しずつ、内温１５℃以下で加えた。３０分間室温で撹拌した後、６－ブロモヘキサン酸エチル１５．５ｇ（６９．５ｍｍｏｌ）を１５℃以下で加えた後、油浴８０℃で１時間加熱撹拌した。室温まで放冷し、イソプロピルエーテル３０ｍｌと１Ｎ塩酸３０ｍｌ加え、分液精製した。有機相を飽和食塩水３０ｍｌで洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。エバポレーターで溶媒を減圧留去し、粗オイル２０．０ｇを得た。減圧蒸留（４ｍｍＨｇ，ｂ．ｐ．１００～１４０℃）し、オイル（原料９）を得た。得られた原料９の収量は１６．９ｇ、収率８５．１％であった。
【0136】
［原料１０の合成］
【化17】
【0137】
５００ｍｌ四つ口フラスコに、原料９を１６．６ｇ（５８．０ｍｍｏｌ）、２５％水酸化ナトリウム水溶液３６ｍｌ（２９０ｍｍｏｌ）、メタノール１１６ｍｌを仕込み、油浴６０℃で２時間加熱撹拌した。４０℃まで冷却し、３Ｎ塩酸１４５ｍｌ（４３５ｍｍｏｌ）を５分間で滴下した。１５分間撹拌した後、イソプロピルエーテル１４０ｍｌを加え、分液精製した。有機相を飽和食塩水７０ｍｌで洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。エバポレーターで減圧留去し、９．２４ｇの粗オイルを得た。減圧蒸留（４ｍｍＨｇ，ｂ．ｐ．１１０～１４５℃）し、オイル（原料１０）を得た。得られた原料１０の収量は７．０ｇ、収率６４．８％であった。
【0138】
［原料１１の合成］
【化18】
【0139】
２００ｍｌ四つ口フラスコに４－ヒドラジノベンゼンスルホン酸８．５ｇ（４５．２ｍｍｏｌ）、原料１０ ７．０ｇ（３７．０ｍｍｏｌ）、酢酸３５ｍｌを仕込み、油浴１３０℃で１時間加熱撹拌した。
エバポレーターで減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、固形物（原料１１）を得た。得られた原料１１の収量は１２．６ｇ、収率９８．８％、ＬＣ７９．０％であった。
エバポレーターで減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、固形物（原料１１）を得た。得られた原料１１の収量は１２．６ｇ、収率９８．８％、ＬＣ７９．０％であった。
【0140】
［原料１２の合成
【化19】
【0141】
１００ｍｌナスフラスコに原料１１ １０ｇ（２９．５ｍｍｏｌ）、無水酢酸ナトリウム２．９ｇ（３５．６ｍｍｏｌ）、メタノール１００ｍｌを仕込み、水浴６０℃で、加熱撹拌し、完溶させた。エバポレーターで減圧留去し、固形物（原料１２）を得た。得られた原料１２の収量は１２．３ｇ、収率１００％、ＬＣ７９．５％であった。
【0142】
［原料１３の合成］
【化20】
【0143】
１００ｍｌナスフラスコに、原料１２を６．５ｇ（１８．０ｍｍｏｌ）、１，４－ブタンサルトン１２．２ｇ（８９．９ｍｍｏｌ）、スルホラン６．５ｍｌを仕込み、油浴１４０℃で５時間加熱撹拌した。６０℃まで冷やし、イソプロピルエーテル５０ｍｌを加え、１５分間撹拌し、上清をデカントした。
残渣に原料４を３．７ｇ（１６．６ｍｍｏｌ）、無水酢酸１１．１ｍｌを加え、室温で１５分間撹拌後、水浴６０℃で１時間加熱撹拌した。アセトン１５０ｍｌ加え、室温で１５分間撹拌後、上清をデカントした。
残渣に原料４を３．７ｇ（１６．６ｍｍｏｌ）、無水酢酸１１．１ｍｌを加え、室温で１５分間撹拌後、水浴６０℃で１時間加熱撹拌した。アセトン１５０ｍｌ加え、室温で１５分間撹拌後、上清をデカントした。
【0144】
残渣にメタノール３０ｍｌを加え、水浴６０℃で加熱撹拌、完溶させた。室温撹拌下、アニリン３．３ｍｌ（３６．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間撹拌した。５００ｍｌビーカーに２－プロパノール３００ｍｌを仕込み、室温撹拌下、反応液を滴下し晶析させた。１５分間室温撹拌後、結晶をろ取し、２－プロパノール２０ｍｌで洗浄した。２００ｍｌ四つ口フラスコに、ろ取物とエタノール５０ｍｌを仕込み、水浴５０℃で１０分間撹拌、分散した。結晶をろ取し、エタノール１０ｍｌで洗い、６０℃で一晩乾燥して、粗結晶７．２６ｇを得た。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、結晶（原料１３）を得た。得られた原料１３の収量は３．０ｇ、収率２１．９％、ＬＣ７９．８％であった。
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、結晶（原料１３）を得た。得られた原料１３の収量は３．０ｇ、収率２１．９％、ＬＣ７９．８％であった。
【0145】
［原料１４の合成］
【化21】
【0146】
１００ｍｌ四つ口フラスコに原料１３を２．０ｇ（２．６２ｍｍｏｌ）、原料５ １．５ｇ（２．９６ｍｍｏｌ）、メタノール２０ｍｌ、無水酢酸０．５ｍｌ（５．２４ｍｍｏｌ）を仕込み、室温撹拌下、トリエチルアミン１．８３ｍｌ（１３．１ｍｍｏｌ）を加えた。水浴６０℃で１時間加熱撹拌した。無水酢酸ナトリウム１．３ｇ（１５．７ｍｍｏｌ）／メタノール１３ｍｌ溶液を加え、同温で３０分間加熱撹拌した。エタノール２０ｍｌを加え、室温まで冷やし、析出した結晶をろ取し、メタノール／エタノール＝１／１（ｖ／ｖ％）２ｍｌで洗浄した。
粗結晶を水４ｍｌとエタノール２０ｍｌの混液で再結晶し、結晶をろ取、エタノール２ｍｌで洗浄した。同様の再結晶操作をさらに９回繰り返した後、結晶を６０℃乾燥した。得られた原料１４の収量は１．３６ｇ、収率４１．１％、ＬＣ８８．８％であった。
粗結晶を水４ｍｌとエタノール２０ｍｌの混液で再結晶し、結晶をろ取、エタノール２ｍｌで洗浄した。同様の再結晶操作をさらに９回繰り返した後、結晶を６０℃乾燥した。得られた原料１４の収量は１．３６ｇ、収率４１．１％、ＬＣ８８．８％であった。
【0147】
［原料１５の合成］
【化22】
【0148】
２０ｍｌナスフラスコに原料１４を１．５０ｇ（１．１９ｍｍｏｌ）、メタノール１５ｍｌ、２５％水酸化ナトリウム水溶液２．８ｍｌ（３.５６ｍｍｏｌ）、純水５．６ｍｌを仕込み、水浴６０℃で１時間加熱撹拌した。エタノール２５ｍｌ加え、室温放冷し、析出した結晶をろ取し、メタノール／エタノール＝１／１（ｖ／ｖ％）１０ｍｌで洗浄した。
粗結晶を水４ｍｌとエタノール２０ｍｌの混液で再結晶し、結晶をろ取、エタノール２ｍｌで洗浄した。同様の再結晶操作を繰り返し、結晶を６０℃で乾燥した。得られた原料１５の収量は０．４０ｇ、収率２９．９％、ＬＣ３９．１％であった。
粗結晶を水４ｍｌとエタノール２０ｍｌの混液で再結晶し、結晶をろ取、エタノール２ｍｌで洗浄した。同様の再結晶操作を繰り返し、結晶を６０℃で乾燥した。得られた原料１５の収量は０．４０ｇ、収率２９．９％、ＬＣ３９．１％であった。
【0149】
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６） δ＝８．９２（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），８．４３（ｔ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），８．２９（ｔ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１６（ｓ，１Ｈ），７．８６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．６４（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．５９（ｔ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．４３（ｄ，Ｊ＝１４．１Ｈｚ，１Ｈ），６．２１（ｄ，Ｊ＝１３．４Ｈｚ，１Ｈ），４．３０（ｂｒ，２Ｈ），３．９８（ｂｒ，２Ｈ），２．４０（ｂｒ，４Ｈ），２．１４（ｓ，３Ｈ），２．１３（ｓ，３Ｈ），２．１１（ｂｒ，２Ｈ），１．８２（ｂｒ，２Ｈ），１．７３（ｂｒ，４Ｈ），１．６４（ｓ，３Ｈ），１．５５（ｂｒ，４Ｈ），１．３５（ｂｒ，２Ｈ），１．３０－１．４０（ｍ，２Ｈ），０．８１（ｂｒ，１Ｈ），０．５０（ｂｒ，１Ｈ）
【0150】
［シアニン系色素２の合成］
【化23】
【0151】
１０ｍｌナスフラスコに、原料１５を３５０ｍｇ（３１０μｍｏｌ）、ＤＭＳＯ ２８ｍｌ、ＨＳＴＵ ３３４ｍｇ（９３０μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン０．２１ｍｌ（１２４０μｍｏｌ）を仕込み、室温で５時間撹拌した。ＨＳＴＵ １１１ｍｇ（３１０μｍｏｌ）を追加し、さらに１時間室温撹拌した。酢酸エチル４２ｍｌ、イソプロピルエーテル１４ｍｌを順に加え、室温で３０分間撹拌した。析出した結晶をろ取、酢酸エチル１０ｍｌで洗浄した。
粗結晶をＴＨＦ２０ｍｌとともに１時間室温で撹拌、分散した。結晶をろ取し、ＴＨＦ ５ｍｌで洗浄し、デシケーターで減圧乾燥した。得られたシアニン系色素２の収量は０．２２４ｇ、収率６０．０％、ＬＣ５５．８％であった。
粗結晶をＴＨＦ２０ｍｌとともに１時間室温で撹拌、分散した。結晶をろ取し、ＴＨＦ ５ｍｌで洗浄し、デシケーターで減圧乾燥した。得られたシアニン系色素２の収量は０．２２４ｇ、収率６０．０％、ＬＣ５５．８％であった。
【0152】
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）にて、原料１５由来のピークに加え、スクシンイミド由来のピーク（δ＝２．７７（ｓ，４Ｈ））を確認した。
【0153】
＜比較例１：シアニン系色素３の合成＞
［原料１６の合成］
［原料１６の合成］
【化24】
【0154】
１００ｍｌ四つ口フラスコに２，３，３－トリメチル―５－スルホインドレニン５．０ｇ（２０．９ｍｍｏｌ）、１，４－ブタンサルトン４．２７ｇ（３１．３ｍｍｏｌ）、ｍ－クレゾール２．５ｍｌ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン３．６ｍｌ（２０．９ｍｍｏｌ）を仕込み、油浴１３０℃で７時間加熱撹拌した。室温放冷し酢酸エチル２５ｍｌ－水２５ｍｌに溶解し、分液精製した。水相に酢酸エチル２５ｍｌを加え再度抽出した後、水相に硫酸１．０２ｇを加え、さらに酢酸エチル２５ｍｌで抽出した。２００ｍｌナスフラスコに水相を移し、エバポレーターで減圧濃縮した。残渣にアセトニトリル２５ｍｌを加えてエバポレーターで減圧濃縮する操作を３回繰り返し、粗結晶を得た。
粗結晶をアセトニトリル２５ｍｌ中、油浴１１０℃で３０分間加熱撹拌し、結晶を分散した。結晶をろ取し、アセトニトリル２０ｍｌで洗浄し、６０℃で一晩乾燥した。得られた原料１６の収量は５．６１ｇ、収率７１．５％、ＬＣ９５．０％であった。
粗結晶をアセトニトリル２５ｍｌ中、油浴１１０℃で３０分間加熱撹拌し、結晶を分散した。結晶をろ取し、アセトニトリル２０ｍｌで洗浄し、６０℃で一晩乾燥した。得られた原料１６の収量は５．６１ｇ、収率７１．５％、ＬＣ９５．０％であった。
【0155】
［原料１７の合成］
【化25】
【0156】
３００ｍｌ四つ口フラスコに１，１，２－トリメチルベンゾ［ｅ］インドレニン１８．０ｇ（８６．０ｍｍｏｌ）、５－ブロモ吉草酸１５．６ｇ（８６．０ｍｍｏｌ）を仕込み、油浴１１０℃で６時間加熱撹拌した。クロロホルム１４４ｍｌを注ぎ入れ、加熱還流下、３０分間分散した。水冷した後、結晶をろ取し、クロロホルム４０ｍｌで洗浄し、６０℃で一晩乾燥させた。得られた原料１７の収量は１０．３７ｇ、収率３０．９％、ＬＣ９６．８％であった。
【0157】
［原料１８の合成］
【化26】
【0158】
２００ｍｌ四つ口フラスコに原料４を７．２６ｇ（３２．７ｍｍｏｌ）、無水酢酸３６．３ｍｌを仕込み、油浴６０℃で加熱撹拌下、原料１７を８．５ｇ（２１．８ｍｍｏｌ）を加えた後、同温で２．５時間加熱撹拌した。室温放冷し、イソプロピルエーテル１２８ｍｌ加え、室温で３０分間撹拌した後、デカントして上清を除いた。残渣に酢酸エチル１２８ｍｌを加え。室温１５分間撹拌し、デカントして上清を除く操作を２回繰り返した。アセトン４２．５ｍｌ加え、水浴５０℃で加熱撹拌、溶解した。５００ｍｌ四つ口フラスコに酢酸エチル３４０ｍｌを仕込み、室温撹拌下、アセトン溶液を滴下し、晶析させた。水浴５０℃で１５分間加熱撹拌した後、水冷し、デカントして上清を除いた。酢酸エチル２５５ｍｌ加え、水浴５０℃で３０分間加熱撹拌、分散した。結晶をろ取し、酢酸エチル５０ｍｌで洗浄し、粗結晶を得た。
粗結晶を酢酸エチル２５５ｍｌ中、水浴５０℃で３０分間加熱撹拌、分散した。結晶をろ取し、酢酸エチル４０ｍｌで洗浄した。さらに、同様の操作を繰り返し、精製を行った後、結晶を６０℃で一晩乾燥させた。得られた原料１８の収量は８．４３ｇ、収率６８．９％、ＬＣ７７．２％であった。
粗結晶を酢酸エチル２５５ｍｌ中、水浴５０℃で３０分間加熱撹拌、分散した。結晶をろ取し、酢酸エチル４０ｍｌで洗浄した。さらに、同様の操作を繰り返し、精製を行った後、結晶を６０℃で一晩乾燥させた。得られた原料１８の収量は８．４３ｇ、収率６８．９％、ＬＣ７７．２％であった。
【0159】
［原料１９の合成］
【化27】
【0160】
５００ｍｌ四つ口フラスコに原料１８を７．０９ｇ（１２．６ｍｍｏｌ）、原料１６を４．７４ｇ（１２．６ｍｍｏｌ）、アセトニトリル３５．５ｍｌを仕込んだ。室温撹拌下、無水酢酸１．２ｍｌ（１２．６ｍｍｏｌ）を滴下し、さらにトリエチルアミン５．３ｍｌ（３７．８ｍｍｏｌ）を滴下後、水浴６０℃で３時間加熱撹拌した。アセトン１７８ｍｌを加え、室温で１５分間撹拌した後、デカントして上清を除いた。同様の操作をさらにもう１回繰り返した。
残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。メインフラクション回収物をアセトン１３９ｍｌ中、水浴６０℃で３０分間加熱撹拌、分散した。結晶をろ取し、アセトン５０ｍｌで洗浄した後、６０℃で一晩乾燥させた。得られた原料１９の収量は５．１７ｇ、収率５６．８％、ＬＣ８４．０％であった。
残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。メインフラクション回収物をアセトン１３９ｍｌ中、水浴６０℃で３０分間加熱撹拌、分散した。結晶をろ取し、アセトン５０ｍｌで洗浄した後、６０℃で一晩乾燥させた。得られた原料１９の収量は５．１７ｇ、収率５６．８％、ＬＣ８４．０％であった。
【0161】
［原料２０の合成］
【化28】
【0162】
１００ｍナスフラスコに原料１９を１．６ｇ（２．２２ｍｍｏｌ）、ＨＳＴＵ ０．８０ｇ（２．２２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド１６ｍｌを仕込み、室温撹拌下、トリエチルアミン０．３１ｍｌ（２．２２ｍｍｏｌ）加え、１．５時間室温撹拌した。ＨＳＴＵ ０．２０ｇ（０．５５７ｍｍｏｌ）を追加し、室温で４０分間撹拌した。
さらに、１－アミノ－３，６，９，１２，１５，１８－ヘキサオキサヘンイコサン－２１－酸(以下、アミノ－ＰＥＧ６－カルボン酸)０．８６ｇ（２．４４ｍｍｏｌ）を加え、室温１．５時間撹拌後、アミノ－ＰＥＧ６－カルボン酸０．０４ｇ（０．１１３ｍｍｏｌ）追加し、室温３０分間撹拌した。アセトン９６ｍｌを２００ｍｌビーカーに仕込み、室温撹拌下、反応液を滴下し、晶析させた。アセトン６４ｍｌ加え、室温３０分間撹拌し、分散した。ろ取、アセトン２０ｍｌで洗浄した。結晶をアセトン５０ｍｌ中で室温２０分間撹拌、分散した。ろ取、アセトン２０ｍｌで洗浄し、粗結晶を得た。
粗結晶をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。メインフラクション回収物にアセトンを加えて結晶をろ取し、６０℃で一晩乾燥させた。得られた原料２０の収量は０．４２ｇ、収率１７．９％、ＬＣ９８．９％であった。
さらに、１－アミノ－３，６，９，１２，１５，１８－ヘキサオキサヘンイコサン－２１－酸(以下、アミノ－ＰＥＧ６－カルボン酸)０．８６ｇ（２．４４ｍｍｏｌ）を加え、室温１．５時間撹拌後、アミノ－ＰＥＧ６－カルボン酸０．０４ｇ（０．１１３ｍｍｏｌ）追加し、室温３０分間撹拌した。アセトン９６ｍｌを２００ｍｌビーカーに仕込み、室温撹拌下、反応液を滴下し、晶析させた。アセトン６４ｍｌ加え、室温３０分間撹拌し、分散した。ろ取、アセトン２０ｍｌで洗浄した。結晶をアセトン５０ｍｌ中で室温２０分間撹拌、分散した。ろ取、アセトン２０ｍｌで洗浄し、粗結晶を得た。
粗結晶をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。メインフラクション回収物にアセトンを加えて結晶をろ取し、６０℃で一晩乾燥させた。得られた原料２０の収量は０．４２ｇ、収率１７．９％、ＬＣ９８．９％であった。
【0163】
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ＝８．４６（ｔ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ），８．３５（ｔ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ），８．２４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０９－８．０４（ｍ，２Ｈ），７．９６（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８０－７．６１（ｍ，４Ｈ），７．５１（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），６．６３（ｔ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ，１Ｈ），６．４１（ｄ，Ｊ＝１３．８Ｈｚ，１Ｈ），６．３６（ｄ，Ｊ＝１３．８Ｈｚ，１Ｈ），４．２５（ｂｒ，２Ｈ），４．０７（ｂｒ，２Ｈ），３．６８－３．１６（ｍ，２４Ｈ），３．２０－３．１４（ｍ，２Ｈ），２．５２－２．４９（ｂｒ，２Ｈ），２．２２（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．１３（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈｚ），１．９５（ｓ，６Ｈ），１．８１－１．６２（ｂｒ，８Ｈ），１．７０（ｓ，６Ｈ）
【0164】
【化29】
【0165】
２５ｍｌナスフラスコに原料２０を４２０ｍｇ（３９８μｍｏｌ）、ＨＳＴＵ １５７ｍｇ（４３７μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド４．２ｍｌを仕込み、室温撹拌下、トリエチルアミン６１μｌ（４３７μｍｏｌ）を加え、１時間室温撹拌した。ＨＳＴＵ ５０ｍｇ（１３９μｍｏｌ）、トリエチルアミン１９μｌ（１３９μｍｏｌ）を追加し、室温３０分間撹拌した。ＨＳＴＵ ５０ｍｇ（１３９μｍｏｌ）、トリエチルアミン１９μｌ（１３９μｍｏｌ）を追加し、室温１．５時間撹拌した。さらに、ＨＳＴＵ ２９ｍｇ（７９．５μｍｏｌ）、トリエチルアミン１１μｌ（７９．５μｍｏｌ）を追加し、室温１．５時間撹拌した。５０ｍｌナスフラスコに酢酸エチル２１ｍｌ仕込み、室温撹拌下、反応液を滴下し、晶析させた。室温で１５分間撹拌し、分散後、ろ取し、酢酸エチル１５ｍｌで洗浄した。
２ｍｌエッペンドルフチューブ２本に結晶を分けて入れ、酢酸エチルを加え、ソニケートした。遠沈（１０，０００ｒｐｍ、５分間）して結晶を集め、上清をデカントで除いた。同様の操作を２回繰り返し、さらに洗い溶媒をイソプロピルエーテルに変え、同様の操作を３回繰り返した。デシケーター中、室温で８時間減圧乾燥した。得られたシアニン系色素３の収量は０．３８４ｇ、収率８３．７％、ＬＣ７８．９％であった。
２ｍｌエッペンドルフチューブ２本に結晶を分けて入れ、酢酸エチルを加え、ソニケートした。遠沈（１０，０００ｒｐｍ、５分間）して結晶を集め、上清をデカントで除いた。同様の操作を２回繰り返し、さらに洗い溶媒をイソプロピルエーテルに変え、同様の操作を３回繰り返した。デシケーター中、室温で８時間減圧乾燥した。得られたシアニン系色素３の収量は０．３８４ｇ、収率８３．７％、ＬＣ７８．９％であった。
【0166】
１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ＝８．４６（ｔ，Ｊ＝１３．１Ｈｚ，１Ｈ），８．３６（ｔ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ），８．２５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．１０－８．０５（ｍ，２Ｈ），７．８９（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．８０－７．６２（ｍ，４Ｈ），７．５２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６２（ｔ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，１Ｈ），６．４１（ｄ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ，１Ｈ），６．３６（ｄ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ，１Ｈ），４．２５（ｂｒ，２Ｈ），４．０９（ｂｒ，２Ｈ），３．７０（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），３．５０－３．４４（ｍ，２０Ｈ），３．３６－３．３１（ｂｒ，２Ｈ），３．１７（ｍ，２Ｈ），２．９１（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ），２．８０（ｓ，４Ｈ），２．５２－２．４９（ｂｒ，２Ｈ），２．１５（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．９５（ｓ，６Ｈ），１．８０－１．６７（ｂｒ，８Ｈ），１．７１（ｓ，６Ｈ）
【0167】
＜比較例２＞
Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ社製Ｓｕｌｆｏ－Ｃｙａｎｉｎｅ５（スルホシアニン５ ＮＨＳエステル、ＣＡＳ ＲＮ(R) ２２３０２１２－２７－６）
Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ社製Ｓｕｌｆｏ－Ｃｙａｎｉｎｅ５（スルホシアニン５ ＮＨＳエステル、ＣＡＳ ＲＮ(R) ２２３０２１２－２７－６）
【化30】
【0168】
＜比較例３＞
Ｂｉｏｔｉｕｍ社製ＣＦ６６０Ｃ（ＣＡＳ ＲＮ（登録商標） １１６４２３９－２５－１）
Ｂｉｏｔｉｕｍ社製ＣＦ６６０Ｃ（ＣＡＳ ＲＮ（登録商標） １１６４２３９－２５－１）
【0169】
ＣＦ６６０Ｃの構造は、ＮＭＲ(核磁気共鳴）およびＬＣ／ＭＳ(液体クロマトグラフィー質量分析計）の測定結果から［化３１］の構造を推定した。
ＮＭＲは、ＥＣＺ４００（ＪＥＯＬ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ社製）を用いて、試料を重メタノール（ＣＤ３ＯＤ）に溶解し測定を行った。ＬＣ／ＭＳは、Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００／Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ （サーモフィッシャー社製）を使用し、Ｉｎｅｒｔ Ｓｕｓｔａｉｎ Ｓｗｉｆｔ Ｃ８（２．１×３０ｍｍ）（ＧＬサイエンス社製）カラムと移動相として０．０１Ｍ酢酸アンモニウムバッファーおよびメタノールを用いて測定を行った。
ＮＭＲは、ＥＣＺ４００（ＪＥＯＬ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ社製）を用いて、試料を重メタノール（ＣＤ３ＯＤ）に溶解し測定を行った。ＬＣ／ＭＳは、Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００／Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ （サーモフィッシャー社製）を使用し、Ｉｎｅｒｔ Ｓｕｓｔａｉｎ Ｓｗｉｆｔ Ｃ８（２．１×３０ｍｍ）（ＧＬサイエンス社製）カラムと移動相として０．０１Ｍ酢酸アンモニウムバッファーおよびメタノールを用いて測定を行った。
【化31】
【0170】
１．吸収極大波長および蛍光極大波長の測定
上記準備したシアニン系色素１～２の蛍光極大波長は、ＨＩＴＡＣＨＩ製蛍光分光光度計Ｆ７１００を用いて測定を行った。ＰＢＳ溶液中に色素を１μＭの濃度になるように調整した。シアニン系色素１、２、３、５については６６０ｎｍの励起波長を用いて、シアニン系色素４については６４０ｎｍの励起波長を用いて、６００～８００ｎｍをスキャンし、蛍光強度が最大であった波長を蛍光極大波長とした。吸収極大波長は色素濃度が１０～４０μＭになるように調整し、ＨＩＴＡＣＨＩ製分光光度計Ｕ－００８０Ｄを用いて２００～８００ｎｍの範囲をスキャンし、吸収極大波長を測定した。その結果を、表１０に示す。
上記準備したシアニン系色素１～２の蛍光極大波長は、ＨＩＴＡＣＨＩ製蛍光分光光度計Ｆ７１００を用いて測定を行った。ＰＢＳ溶液中に色素を１μＭの濃度になるように調整した。シアニン系色素１、２、３、５については６６０ｎｍの励起波長を用いて、シアニン系色素４については６４０ｎｍの励起波長を用いて、６００～８００ｎｍをスキャンし、蛍光強度が最大であった波長を蛍光極大波長とした。吸収極大波長は色素濃度が１０～４０μＭになるように調整し、ＨＩＴＡＣＨＩ製分光光度計Ｕ－００８０Ｄを用いて２００～８００ｎｍの範囲をスキャンし、吸収極大波長を測定した。その結果を、表１０に示す。
【0171】
２．標識試薬の調製
＜標識試薬１～５の調製＞
シアニン系色素をＷＦＡ(Wisteria Floribunda Lectin)溶液に添加し、室温で1時間反応させた。反応後、遠心式限外ろ過（Millipore社製）により精製し、次いで、GE Healthcare社製Superdex（商標）200 Increaseカラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーで精製し、蛍光色素標識ＷＦＡ溶液を得た。
＜標識試薬１～５の調製＞
シアニン系色素をＷＦＡ(Wisteria Floribunda Lectin)溶液に添加し、室温で1時間反応させた。反応後、遠心式限外ろ過（Millipore社製）により精製し、次いで、GE Healthcare社製Superdex（商標）200 Increaseカラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーで精製し、蛍光色素標識ＷＦＡ溶液を得た。
【0172】
３．ＳＰＦＳを利用した測定および評価
＜試験１～５＞
（検出チップの準備）
図３に示される構成の検出チップ３００を準備した。流路３２０内に露出している金（Ａｕ）薄膜（金属膜１２０）の特定の領域（反応部）に、抗ＰＳＡ－Ｇｉ抗体を固定化した。
＜試験１～５＞
（検出チップの準備）
図３に示される構成の検出チップ３００を準備した。流路３２０内に露出している金（Ａｕ）薄膜（金属膜１２０）の特定の領域（反応部）に、抗ＰＳＡ－Ｇｉ抗体を固定化した。
【0173】
（本測定）
１）０．５ｎｇ／ｍＬのＰＳＡ－Ｇｉを含む検体を、ピペットチップにより、上記検出チップ３００の液体注入部３３０から流路３２０内に導入し、往復送液させた（１次反応）。液体注入部３３０から流路３２０内の検体を除去した後、流路３２０内を洗浄液で１回洗浄した。
２）次いで、表１に示される標識試薬（表１で示されるシアニン系色素で標識されたＷＦＡ）を、液体注入部３３０から流路３２０内に導入し、往復送液させた（２次反応）。液体注入部３３０から流路３２０内の標識試薬を除去した後、流路３２０内を洗浄液で３回洗浄した。
３）そして、この状態で、ＳＰＦＳにより蛍光値を測定した。すなわち、金属膜１２０に対する励起光の入射角が増強角となるようにプリズム１１０側から金属膜１２０に励起光（レーザー光）を照射し、そのときに放出される蛍光を検出し、シグナル値Ｓを得た。
１）０．５ｎｇ／ｍＬのＰＳＡ－Ｇｉを含む検体を、ピペットチップにより、上記検出チップ３００の液体注入部３３０から流路３２０内に導入し、往復送液させた（１次反応）。液体注入部３３０から流路３２０内の検体を除去した後、流路３２０内を洗浄液で１回洗浄した。
２）次いで、表１に示される標識試薬（表１で示されるシアニン系色素で標識されたＷＦＡ）を、液体注入部３３０から流路３２０内に導入し、往復送液させた（２次反応）。液体注入部３３０から流路３２０内の標識試薬を除去した後、流路３２０内を洗浄液で３回洗浄した。
３）そして、この状態で、ＳＰＦＳにより蛍光値を測定した。すなわち、金属膜１２０に対する励起光の入射角が増強角となるようにプリズム１１０側から金属膜１２０に励起光（レーザー光）を照射し、そのときに放出される蛍光を検出し、シグナル値Ｓを得た。
【0174】
（ブランク測定）
上記１）の工程で、ＰＳＡ－Ｇｉを含む検体に代えて、１質量％のＢＳＡ溶液をブランクサンプルとして用いた以外は上記と同様の測定を行い、シグナル値Ｎを得た。
上記１）の工程で、ＰＳＡ－Ｇｉを含む検体に代えて、１質量％のＢＳＡ溶液をブランクサンプルとして用いた以外は上記と同様の測定を行い、シグナル値Ｎを得た。
【0175】
（評価）
得られたシグナル値Ｓをシグナル値Ｎで割って、Ｓ／Ｎ比を算出した。そして、検出感度を、以下の基準で評価した。
〇：Ｓ／Ｎ比が１００以上
△：Ｓ／Ｎ比が３０以上１００未満
×：Ｓ／Ｎ比が３０未満
得られたシグナル値Ｓをシグナル値Ｎで割って、Ｓ／Ｎ比を算出した。そして、検出感度を、以下の基準で評価した。
〇：Ｓ／Ｎ比が１００以上
△：Ｓ／Ｎ比が３０以上１００未満
×：Ｓ／Ｎ比が３０未満
【0176】
測定結果を、表１０に示す。
【0177】
【表10】
【0178】
表１０に示されるように、式（１）で表される構造を有し、親水性基の数が４以上であるシアニン系色素（実施例１および実施例２）を用いた場合、Ｓ／Ｎ比が高く、感度が良好であることがわかる。
【0179】
これに対し、親水性基の数が４未満であるシアニン系色素（比較例１、２および３）を用いた場合、Ｓ／Ｎ比は低く、感度が低いことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【0180】
本発明によれば、ＳＰＦＳを利用した検出方法に有用なシアニン系色素であって、消光が少なく、十分な検出感度が得られるシアニン系色素および検出方法を提供することができる。
【符号の説明】
【0181】
１００、２００、３００ 検出チップ
１１０ プリズム
１１１ 入射面
１１２ 成膜面
１１３ 出射面
１２０ 金属膜
１３０ 結合物質（抗体）
１４０ 被検出物質（抗原）
１５０ シアニン系色素
２１０ 金属膜
２１１ 回折格子
３１０ 流路蓋
３２０ 流路
３３０ 液体注入部
３３１ 液体注入部被覆フィルム
３４０ 貯留部
３４１ 貯留部被覆フィルム
３４２ 通気孔
３５０ 接着層
Ｌ１ 励起光
Ｌ２ 反射光
Ｌ３ 蛍光
１１０ プリズム
１１１ 入射面
１１２ 成膜面
１１３ 出射面
１２０ 金属膜
１３０ 結合物質（抗体）
１４０ 被検出物質（抗原）
１５０ シアニン系色素
２１０ 金属膜
２１１ 回折格子
３１０ 流路蓋
３２０ 流路
３３０ 液体注入部
３３１ 液体注入部被覆フィルム
３４０ 貯留部
３４１ 貯留部被覆フィルム
３４２ 通気孔
３５０ 接着層
Ｌ１ 励起光
Ｌ２ 反射光
Ｌ３ 蛍光
【図1】
【図2】
【図3】